JP2021522273A - Cns変性のための遺伝子治療法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、2018年4月27日に出願された米国仮特許出願第62/664,006号に対する優先権の利益を主張するものであり、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ROPA_009_01WO_ST25.txtである。テキストファイルは254KBであり、2019年4月29日に作成され、EFS−Webを介して電子的に提出される。
本開示は、概して、パーキンソン病などの中枢神経系変性に関連する障害の治療のための遺伝子治療および/または遺伝子編集に関する。詳細には、本開示は、エクスビボおよびインビボの両方でのニューロンにおける遺伝子治療または遺伝子修復のための組成物および方法を提供する。
様々な遺伝子は、パーキンソン病(PD)などの中枢神経系変性の障害に関与している。これらの遺伝子は、PARK2、PINK1(PARK6)、DJ−1(PARK7)、LRRK2、アルファ−シヌクレイン、およびDJ−1を含む。Creed et al.(2018)Mov Disord.33:717−729(非特許文献1)、Blesa et al.(2014)Front.Neuroanat.8:1−12(非特許文献2)、Alcalay et al.(2010)Arch Neurol.67:1116−1122(非特許文献3))。PRKNとしても知られるPARK2は、常染色体劣性若年性PDであるPDの形態に関与している。広範な試みにもかかわらず、中枢神経系変性についての遺伝子治療に成功したという報告はほとんどない。
本開示は、一部、中枢神経系変性を治療、予防、阻害、または遅延するための組成物および方法を提供する。詳細には、本発明者らは、パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む組換え遺伝子治療ベクターの様々な実施形態およびそれに関連する方法を開示する。
HuBAプロモーター、導入遺伝子、WPRE(x)、およびpAグロビン−Oc、
CMVプロモーター、TPL−eMLP 5’エンハンサー、導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAグロビン−Oc、
Synプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Bt
CBAプロモーター、導入遺伝子、およびpAGH−Bt、
EF1aプロモーター、導入遺伝子、およびpAグロビン−Oc、
HuBAプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt、
Synプロモーター、導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs、
CaMKIIaプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Hs、
CMVおよびTPLプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、ならびにpAGH−Hs、
HuBAプロモーター、導入遺伝子、およびpAGH−Hs、
CMVおよびTPLプロモーター、eMPL、導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、ならびにpAGH−Bt、
EF1αプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Bt、
Synプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc、
CaMKIIaプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc、
CBAプロモーター、導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs、
CBAプロモーター、導入遺伝子、3’UTR(グロビン)、およびpAグロビン−Oc、
CaMKIIaプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt、
EF1aプロモーター、導入遺伝子、R2V17、3’グロビン、およびpAGH−Hs、
CMVプロモーター、導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs、または
CMVプロモーター、導入遺伝子、およびpAGH−Hs
を5’から3’の順序で含み、
任意で、導入遺伝子は、PARK2をコードする。
HuBAプロモーター、導入遺伝子、WPRE(x)、およびpAグロビン−Oc、
CMVプロモーター、TPL−eMLP 5’エンハンサー、導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAグロビン−Oc、
Synプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Bt
CBAプロモーター、導入遺伝子、およびpAGH−Bt、
EF1aプロモーター、導入遺伝子、およびpAグロビン−Oc、
HuBAプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt、
Synプロモーター、導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs、
CaMKIIaプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Hs、
CMVおよびTPLプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、ならびにpAGH−Hs、
HuBAプロモーター、導入遺伝子、およびpAGH−Hs、
CMVおよびTPLプロモーター、eMPL、導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、ならびにpAGH−Bt、
EF1aプロモーター、導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Bt、
Synプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc、
CaMKIIaプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc、
CBAプロモーター、導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs、
CBAプロモーター、導入遺伝子、3’UTR(グロビン)、およびpAグロビン−Oc、
CaMKIIaプロモーター、導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt、
EF1aプロモーター、導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs、
CMVプロモーター、導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs、または
CMVプロモーター、導入遺伝子、およびpAGH−Hs
を5’から3’の順序で含む発現カセットを含み、
任意で、導入遺伝子は、PARK2をコードする。
本開示は、一部、例えば、パーキンソン病の治療における中枢神経系変性を治療、予防、阻害、または遅延するための組成物および方法を提供する。詳細には、本発明者らは、パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK 2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子、またはその機能的断片もしくはバリアントを含む組換え遺伝子治療ベクターの様々な実施形態を開示する。本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「導入遺伝子」という用語は、互換的に使用され、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば表1に開示されるタンパク質のいずれか、をコードするポリヌクレオチド配列を指す。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料を本発明の実施に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に参照される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照は、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が、支配するであろう。加えて、本明細書に記載される材料、方法、および実施例は例示的であり、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「AAV」という用語は、アデノ随伴ウイルスまたはその組換えベクターの標準的な略称である。アデノ随伴ウイルスは、特定の機能が共感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞中でのみ増殖する一本鎖DNAパルボウイルスである。AAVの一般的な情報およびレビューは、例えば、Carter,1989,Handbook of Parvoviruses,Vol.1,pp.169−228、およびBerns,1990,Virology,pp.1743−1764,Raven Press,(New York)に見出すことができる。これらのレビューに記載される同じ原理が、遺伝子レベルであっても、様々な血清型が構造的および機能的にかなり密接に関連していることが周知であるため、レビューの公開日後に特徴付けられる追加のAAV血清型に適用されることが完全に予想される。(例えば、Blacklowe,1988,pp.165−174 Parvoviruses and Human Disease,J.R.Pattison,ed.、およびRose,Comprehensive Virology 3:1−61(1974)を参照されたい)。例えば、すべてのAAV血清型は、明らかに、相同rep遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を示し、全ては、AAV2に発現されるものなどの3つの関連するカプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーション、および「逆方向末端反復配列」(ITR)に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。同様の感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が同様の制御下にあることを示唆する。
いくつかの実施形態では、野生型PARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG 7、VMAT2、またはGBAタンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列は、CMVプロモーターと作動可能に連結される。本開示は、他のプロモーター配列の使用をさらに企図する。本開示の実施形態において有用なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターホスホグリセートキナーゼ(PGK)プロモーター、またはCMVエンハンサー、ならびにニワトリベータアクチンプロモーターおよびウサギベータグロビン遺伝子(CAG)の一部からなるプロモーター配列が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、プロモーターは、合成プロモーターであり得る。例示的な合成プロモーターは、Schlabach et al.Synthetic design of strong promoters.Proc Natl Acad Sci U S A.2010 Feb 9;107(6):2538−2543に提供される。
いくつかの事例では、本開示のベクターは、エンハンサー、イントロン、ポリAシグナル、2Aペプチドコード化配列、WPRE(ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素)、およびHPRE(B型肝炎転写後調節要素)からなる群から選択される1つ以上の制御性要素をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「必要とする患者」または「必要とする対象」という用語は、本明細書に開示される組換え遺伝子治療ベクターまたは遺伝子編集システムによる治療または改善に適している疾患、障害、または状態のリスクがあるか、またはそれに罹患している、患者または対象を指す。必要とする患者または対象は、例えば、中枢神経系分解に関連する障害と診断される患者または対象であり得る。対象は、PARK2、PARK6、PARK7、LRRK2、もしくはα−シヌクレインの遺伝子またはタンパク質中の変異または機能不全を有し得る。「対象」および「患者」は、本明細書において互換的に使用される。本明細書に記載される方法によって治療される対象は、成人または子供であり得る。対象は、年齢の範囲がある場合がある。対象は、パーキンソン病、例えば、早期発症パーキンソン病のリスクがあると特定された人物であり得る。
有効用量の組成物の投与は、限定されないが、全身、局所、直接的注入、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む、当該技術分野における標準的な経路によって行われ得る。いくつかの事例では、投与は、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む。投与は、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入によって実行され得る。本発明のrAAV(特に、AAV ITRおよびカプシドタンパク質)の投与経路およびAAV成分の血清型(複数可)は、治療される障害および修復されたおよび/または外因的に提供される遺伝子を発現する標的細胞/組織(複数可)を考慮して当業者によって選択および/または適合され得る。
本明細書で使用される場合、遺伝子編集システムは、配列特異的に内因性標的遺伝子または遺伝子座を編集することができる1つ以上のタンパク質またはポリヌクレオチドを含むシステムである。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、1つ以上のジンクフィンガー結合ドメインおよび酵素ドメインを含むタンパク質を含むタンパク質系遺伝子制御システムである。いくつかの実施形態では、タンパク質系遺伝子制御システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)ドメインおよび酵素ドメインを含むタンパク質を含む。かかる実施形態は、本明細書において「TALEN」と称される。
ジンクフィンガー系システムは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよび酵素ドメインの2つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーDNA結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」、または「ZFP」は、1つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でDNAと結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインであり、結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域であり、その構造は亜鉛イオンの配位によって安定化される。ジンクフィンガードメインは、標的DNA配列と結合することにより、酵素ドメインの活性を配列の近くに導き、したがって、標的配列の近くの内因性標的遺伝子の修飾を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的に任意の所望される配列と結合するように設計することができる。したがって、切断または組み換えが所望される標的DNA配列(例えば、表1に参照される標的遺伝子内の標的遺伝子座)を含む標的遺伝子座を特定した後、1つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、標的遺伝子座内の1つ以上の標的DNA配列と結合することができる。細胞におけるジンクフィンガー結合ドメインおよび酵素ドメインを含む融合タンパク質の発現は、標的遺伝子座の修飾をもたらす。
TALEN系は、TALエフェクターDNA結合ドメインおよび酵素ドメインを含むタンパク質を含む。これらは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメイン(DNA鎖を切断するヌクレアーゼ)に融合することによって作製される。上述のFokI制限酵素は、TALEN系遺伝子制御システムでの使用に好適な例示的な酵素ドメインである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子編集システムは、CRISPR(クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復)/Cas(CRISPR関連)ヌクレアーゼシステムである。そのような実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、CRISPR関連エンドヌクレアーゼ(「Cas」エンドヌクレアーゼ)であり、核酸ガイド分子は、ガイドRNA(gRNA)である。
いくつかの実施形態では、部位特異的修飾ポリペプチドは、Casタンパク質である。様々な種のCas分子は、本明細書に記載される方法および組成物に使用することができ、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.アウレウス(S.aureus)、N.メニンギティディス(N.meningitidis)、S.サーモフィルス(S.thermophiles)、アシドボラックス・アベナ(Acidovorax avenae)、アクチノバチルス・プレウロニューモニア(Actinobacillus pleuropneumoniae)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus suis)、アクチノミセス種(Actinomyces sp.)、シクリフィルスデニトリフィカンス(Cycliphilusdenitrificans)、アミノモナス・パウシボランス(Aminomonas paucivorans)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・スミシイ(Bacillus smithii)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス種(Bacteroides sp.)、ブラストピレルラ・マリナ(Blastopirellula marina)、ブラディリゾビウム種(Bradyrhizobium sp.)、ブレビバチルス・ラテロスポクサス(Brevibacillus laterospoxus)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンジダタス・プニセイスピリルム(Candidatus puniceispirillum)、クロストリジウム・セルロリティカム(Clostridium cellulolyticum)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・アコレンス(Corynebacterium accolens)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheria)、コリネバクテリウム・マツルショッティ(Corynebacterium matruchotii)、ディノロセオバクター・シバエ(Dinoroseobacter shibae)、ユウバクテリウム・ドリクム(Eubacterium dolichum)、ガンマプロテオバクテリウム(Gammaproteobacterium)、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・スプトム(Haemophilus sputomm)、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicobacter canadensis)、ヘリコバクター・シナエディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytropus)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、リステリア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア科の細菌(Listeriaceae bacterium)、メチロシスティス種(Methylocystis sp.)、メチロシナス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)、モビルンカス・ムリエリス(Mobiluncus mulieris)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、ナイセリア・フラベッセンス(Neisseria flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)、ナイセリア種(Neisseria sp.)、ナイセリア・ワズワーシイ(Neisseria wadsworthii)、ニトロソモナス種(Nitrosomonas sp.)、パルビバクラム・ラバメンティボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナテューテンス(Phascolarctobacterium succinatutens)、ラルストニア・シジジイ(Ralstonia syzygii)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドブラム種(Rhodovulum sp.)、シモンシエラ・ムエレリ(Simonsiella muelleri)、スフィンゴモナス種(Sphingomonas sp.)、スポロラクトバチルス・ビネア(Sporolactobacillus vineae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ストレプトコッカス種(Streptococcus sp.)、サブドリグラヌルム種(Subdoligranulum sp.)、ティストレラ・モビリス(Tistrella mobilis)、トレポネマ種(Treponema sp.)、またはバーミネフロバクター・エイセニア(Verminephrobacter eiseniae)に由来するCas分子を含む。
a)ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
b)二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両鎖を切断し、一実施形態では2つのニッカーゼ活性の存在である二本鎖切断(double stranded break)を作成する能力、
c)エンドヌクレアーゼ活性、
d)エキソヌクレアーゼ活性、および/または
e)ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の螺旋構造をほどく能力。
いくつかの実施形態では、Casポリペプチドは、Casポリペプチドの1つ以上の特性を変更するように操作される。例えば、いくつかの実施形態では、Casポリペプチドは、変更された酵素特性、例えば、変更されたヌクレアーゼ活性(天然に存在するまたは他の参照Cas分子と比較して)または変更されたヘリカーゼ活性を含む。いくつかの実施形態では、操作されたCasポリペプチドは、そのサイズを変更する変化、例えば、Casポリペプチドの別の性質に有意な影響を及ぼすことなく、そのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作されたCasポリペプチドは、PAM認識に影響を及ぼす変更を含む。例えば、操作されたCasポリペプチドを変更して、対応する野生型Casタンパク質によって認識されるPAM配列以外のPAM配列を認識することができる。
本開示は、部位特異的修飾ポリペプチドを特定の標的DNA配列に誘導するガイドRNA(gRNA)を提供する。gRNAは、DNA標的化セグメントおよびタンパク質結合セグメントを含む。gRNAのDNA標的化セグメントは、標的DNA配列中の配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、gRNAのDNA標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション(すなわち、塩基対合)を介して配列特異的様式で標的DNAと相互作用し、DNA標的化セグメントのヌクレオチド配列は、gRNAが結合するであろう標的DNA内の位置を決定する。gRNAのDNA標的化セグメントは、標的DNA配列内の任意の所望の配列とハイブリダイズするために(例えば、遺伝子操作によって)修飾することができる。
a)変更、例えば、リン酸ジエステル骨格結合における非結合リン酸酸素および/または1つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の置換、
b)変更、例えば、リボース糖の成分、例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルの置換、
c)リン酸部分の「デホスホ」リンカーへの大規模な置換、
d)天然に存在する核酸塩基の修飾または置換、
e)リボース−リン酸骨格の置換または修飾、
f)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分抱合、および
g)糖の修飾。
パーキン導入遺伝子バリアントの評価
一連のプラスミドベクターを生成して、パーキン導入遺伝子バリアントの発現を評価した。発現カセット(図1)は、CMV最初期(IE)エンハンサー/プロモーターおよび5’UTR、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)と連結したパーキン導入遺伝子2A、3’UTR、ならびにウサギグロビンポリアデニル化配列(ポリA)を5’から3’の順序で含んだ。パーキン導入遺伝子について、ヒトPRKN(WT)の野生型配列または4つのコドン最適化バリアント(CO1〜CO4)のうちの1つを試験した。野生型およびコドン最適化パーキン導入遺伝子の配列は、配列番号27、35、36、37、および38に提供した。
CO4パーキン導入遺伝子の発現のためのカセットの選択
他の制御要素を評価するために、ヘルパーフリーAAVパッケージ化システムで使用するための、導入プラスミドの形態で様々なAAV発現カセットを構築した。AAV発現カセット(図7)は、AAV2の5’ITR、CMVエンハンサー(Enh)またはエンハンサーなし、表5から選択したプロモーター、表6から選択した5’非翻訳領域(UTR)、パーキン導入遺伝子バリアントCO4(配列番号38)、表7から選択した3’非翻訳領域、表8から選択したポリアデニル化配列(ポリA)、およびAAV2の3’ITRを5’から3’の順序で含む。カセットおよび様々な要素の図を図8に提供する。インビトロ試験における導入遺伝子発現の検出のために、表10に列挙される配列の各々のパーキン導入遺伝子上の開始コドンの後に、N末端フラグ/HAタグ(配列番号81)をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号80)を挿入した。
パーキンAAV遺伝子治療のインビボおよび臨床治験
AAVベクターは、実施例2の構築物1〜20、特に表11の構築物1、7、11、および15からのAAVベクターゲノムのパッケージングによって生成した。試験はラットで実施し、1つ以上の構築物を非ヒト霊長類(NHP)で試験するために選択した。用量設定研究を実施し、観察したタンパク質発現および毒性の測定によって臨床治験の開始用量を決定した。
インビトロ試験
組換えカセットをヒト神経芽腫細胞株(SH−SY5Y)で試験した。(Jiang et al.Extracellular dopamine induces the oxidative toxicity of SH−SY5Y cells.Synapse.2008 Nov;62(11):797−803.doi:10.1002/syn.20554を参照されたい)。試験した目的の遺伝子は、パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK 2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子である。
インビボ試験
目的の遺伝子における1つ以上の既知の変異の組み合わせを有するげっ歯類または非ヒト霊長類を、その目的の遺伝子のための組換え遺伝子治療ベクターで治療した。試験した目的の遺伝子は、パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK 2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子である。
臨床試験
早期発症パーキンソン病のパーキン型の診断は、主に早期発症パーキンソン症(年齢40歳未満)の個体、特に常染色体劣性遺伝が疑われる場合に考えられる。パーキンタンパク質をコードする遺伝子であるPRKN(以前はPARK2と呼ばれていた)は、病原性バリアントが早期発症パーキンソン病のパーキン型を引き起こすことが知られている主要な遺伝子である。早期発症パーキンソン病のパーキン型の診断は、PRKNの両方の対立遺伝子上で病原性バリアントが同定された場合にのみ確認することができる(すなわち、個体は、同じ病原性対立遺伝子に対してホモ接合性であるか、または2つの異なる病原性対立遺伝子に対してヘテロ接合性の化合物である)。バリアント検出頻度は、家族歴および発症年齢によって異なる。
Claims (131)
- E3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2)、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)、アルファ−シヌクレイン(SCNA)、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)、シナプス小胞アミン輸送体(VMAT2)、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含み、
前記導入遺伝子のポリヌクレオチドが、真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結される、
組換え遺伝子治療ベクター。 - 前記導入遺伝子が、前記PARK2をコードし、前記導入遺伝子のポリヌクレオチド配列が、配列番号35〜38のうちの1つと少なくとも95%の同一性を共有する、請求項1に記載のベクター。
- 前記プロモーター配列が、表5から選択される、請求項1または請求項2に記載のベクター。
- 前記発現カセットが、CMVエンハンサーをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記発現カセットが、表6から選択される5’非翻訳領域(UTR)をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記発現カセットが、表7から選択される3’非翻訳領域をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記発現カセットが、表8から選択されるポリアデニル化配列(ポリA)をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記導入遺伝子が、コドン最適化されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記発現カセットが、配列番号39〜58のいずれか1つと少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記発現カセットが、
HuBAプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(x)、およびpAグロビン−Oc;
CMVプロモーター、TPL−eMLPエンハンサー、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAグロビン−Oc;
Synプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(r)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Bt;
CBAプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAGH−Bt;
EF1αプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAグロビン−Oc;
HuBAプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt;
Synプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;
CaMKIIaプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Hs;
CMVプロモーター、TPL−eMLP5’エンハンサー、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Hs;
HuBAプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAGH−Hs;
CMVおよびTPLプロモーター、eMPL、前記導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、ならびにpAGH−Bt;
EF1αプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Bt;
Synプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc;
CaMKIIaプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc;
CBAプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;
CBAプロモーター、前記導入遺伝子、3’UTR(グロビン)、およびpAグロビン−Oc;
CaMKIIaプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt;
EF1αプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;
CMVプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;または
CMVプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAGH−Hs
を5’から3’の順序で含み、
任意で、前記導入遺伝子が、PARK2をコードする、
請求項1〜9のいずれか一項に記載のベクター。 - アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項1〜10のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記発現カセットに隣接する2つのAAV逆方向末端反復(ITR)を含む、請求項11に記載のベクター。
- 前記AAVが、血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、またはAAVrh74を有する、請求項11または12に記載のベクター。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、自己相補的AAVまたは一本鎖AAVを含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記AAVが、野生型AAVまたは修飾AAVである、請求項11〜14のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記AAVが、野生型VP1、VP2、またはVP3カプシドタンパク質と少なくとも95%の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項11〜15のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- パーキンソン病(PD)に関連する遺伝子中に変異を含むドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法であって、
前記ニューロンを、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクターと接触させること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、前記ニューロンが、前記PARK2、PINK1、DJ−1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAを発現し、
任意で、前記ニューロンが、PARK2遺伝子中に変異を含み、前記発現カセットが、PARK2をコードする、方法。 - 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ/または減少した量のレビー小体を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のモノアミンオキシダーゼを発現する、請求項18または19に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加した量のドーパミンを産生および/または放出する、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加したマイトファジーを受ける、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現されるモノアミンオキシダーゼの量と比較して、より少ない量のモノアミンオキシダーゼを発現し、
任意で、前記の、より少ない量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンにおいて発現される前記量より少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、または少なくとも80%低い、
請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および/または放出されるドーパミンの量と比較して、増加した量のドーパミンを産生および/または放出し、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンによって産生および/または放出される前記量よりも少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きい、
請求項18〜23のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンが受けるオートファジーの量と比較して、増加した量のオートファジーを受け、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンが受ける前記量よりも少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きい、
請求項18〜24のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンが、初代チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンである、請求項18〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、パーキンソン病と診断された対象から得られた細胞から調製された人工多能性幹細胞から生成されている、請求項18〜26のいずれか一項に記載の方法。
- パーキンソン病(PD)に罹患しているかまたはそのリスクがある対象において、前記PDを治療またはその発症を阻害する方法であって、
請求項1〜16のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与すること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターの投与が、前記対象における前記パーキンソン病を治療またはその発症を阻害する、方法。 - 前記PDが、早期発症PD、任意で、早期発症常染色体劣性PDである、請求項28に記載の方法。
- 前記対象が、PARK2遺伝子中に変異を含む、請求項28または請求項29に記載の方法。
- 前記PARK2が、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 投与するステップが、全身、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップが、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップが、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入を含む、請求項32に記載の方法。
- 前記投与するステップが、脳の黒質の緻密部に直接的に注入することを含む、請求項32に記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記対象の脳または脳脊髄液(CSF)に前記組換え遺伝子治療ベクターを導入することを含む、請求項28〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x109〜1x1014のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項28〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x109〜1x1014のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象の脳に投与される、請求項28〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x109〜1x1014のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象のCSFに投与される、請求項28〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x107〜1x109のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項28〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、成人である、請求項28〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、子供である、請求項28〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数よりも多い、請求項28〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミンのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミンのレベルよりも大きい、請求項28〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、そのように治療されない対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数と比較して増加する、請求項28〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象のドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項28〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 方法によって治療される対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項28〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップ後の前記対象のCSFにおけるPRKNのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象のCSFにおけるPRKNのレベルよりも大きい、請求項28〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップ前の前記対象の統一パーキンソン病評価尺度(UPDRS)スコアが、前記投与するステップ前の前記対象のUPDRSスコアと比較して改善される、請求項28〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象の前記CSFにおけるPRKNのレベルが、そのように治療されない対象の前記CSFにおけるPRKNのレベルと比較して増加する、請求項28〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象の前記UPDRSスコアが、そのように治療されない対象の前記UPDRSスコアと比較して改善される、請求項28〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象のニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ/または減少した量のレビー小体を含む、請求項28〜51のいずれか一項に記載の方法。
- パーキンソン病(PD)に関連する遺伝子中に変異を含むドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法であって、
前記変異遺伝子が、パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子であり、
前記ニューロンを、前記変異遺伝子の野生型バージョンによって発現される野生型タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え遺伝子治療ベクターと接触させること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、前記ニューロンが、前記野生型タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片を発現する、方法。 - 前記野生型PARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAタンパク質が、それぞれ、配列番号1〜9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記遺伝子が、前記PARK2遺伝子であり、前記野生型PARK2タンパク質が、配列番号10〜17のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号18〜26に示されるPARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、95%、または99%の同一性を有する配列を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記遺伝子が、前記PARK2遺伝子であり、前記ポリヌクレオチドが、配列番号27〜34のいずれかに示されるPARK2アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、95%、または99%の同一性を有する配列を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、請求項53〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項53〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVが、血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、またはAAVrh74を有する、請求項59に記載の方法。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、自己相補的AAVを含む、請求項59または請求項60に記載の方法。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、一本鎖AAVを含む、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVが、野生型AAVまたは修飾AAVである、請求項59〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVが、野生型VP1、VP2、またはVP3カプシドタンパク質と少なくとも95%の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項59〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、以下の
a.真核生物で活性なプロモーター配列と、
b.前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列と
を5’から3’の順序で含むポリヌクレオチドを含み、
前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、前記真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結されている、
請求項53〜64のいずれか一項に記載の方法。 - 前記組換え遺伝子治療ベクターが、
hSYN1(ヒトシナプシン)、INA(アルファ−インターネキシン)、NES(ネスチン)、TH(チロシンヒドロキシラーゼ)、FOXA2(フォークヘッドボックスA2)、CaMKII(カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII)、およびNSE(ニューロン特異的エノラーゼ)プロモーターからなる群から任意で選択される、ニューロン特異的プロモーター、
CMV、CAG、UBC、PGK、EF1−アルファ、GAPDH、SV40、HBV、およびニワトリベータアクチン、ヒトベータアクチンプロモーターからなる群から選択されるユビキタスプロモーター、
エンハンサー、
イントロン、
ポリAシグナル、
2Aペプチドをコードする配列、ならびに
WPRE(ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素)
のうちの1つ以上をさらに含む、請求項53〜65のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ/または減少した量のレビー小体を含む、請求項53〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のモノアミンオキシダーゼを発現する、請求項53〜67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加した量のドーパミンを産生および/または放出する、請求項53〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、増加したマイトファジーを受ける、請求項53〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンにおいて発現されるモノアミンオキシダーゼの量と比較して、より少ない量のモノアミンオキシダーゼを発現し、
任意で、前記の、より少ない量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンにおいて発現される前記量より少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、または少なくとも80%低い、
請求項53〜70のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンによって産生および/または放出されるドーパミンの量と比較して、増加した量のドーパミンを産生および/または放出し、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンによって産生および/または放出される前記量よりも少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きい、
請求項53〜71のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していないニューロンが受けるオートファジーの量と比較して、増加した量のオートファジーを受け、
任意で、前記増加した量が、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触していない前記ニューロンが受ける前記量よりも少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍大きい、
請求項53〜72のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ニューロンが、初代チロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロンである、請求項53〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ニューロンが、パーキンソン病と診断された対象から得られた細胞から調製された人工多能性幹細胞から生成されている、請求項53〜74のいずれか一項に記載の方法。
- 野生型パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含み、
前記ポリヌクレオチドが、真核生物で活性なプロモーターと作動可能に連結され、前記組換え遺伝子治療ベクターで形質導入されたニューロンが、前記野生型タンパク質、またはその機能的バリアントもしくは断片を発現する、
組換え遺伝子治療ベクター。 - 前記野生型PARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAタンパク質が、それぞれ、配列番号1〜9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項76に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記遺伝子が、前記PARK2遺伝子であり、前記野生型PARK2タンパク質が、配列番号10〜17のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項76に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号18〜26に示されるPARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、95%、または99%の同一性を有する配列を含む、請求項76に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記遺伝子が、前記PARK2遺伝子であり、前記ポリヌクレオチドが、配列番号27〜34のいずれかに示されるPARK2アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、95%、または99%の同一性を有する配列を含む、請求項76に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記ポリヌクレオチドが、コドン最適化されている、請求項76に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)である、請求項76〜81のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記rAAVが、血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、またはAAVrh74を有する、請求項82に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 自己相補的AAVまたは一本鎖AAVを含む、請求項76〜83のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記AAVが、野生型AAVまたは修飾AAVである、請求項76〜83のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- 前記AAVが、野生型VP1、VP2、またはVP3カプシドタンパク質と少なくとも95%の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項76〜85のいずれか一項に記載の組換え遺伝子治療ベクター。
- パーキンソン病(PD)に罹患しているかまたはそのリスクがある対象において、前記PDを治療またはその発症を阻害する方法であって、
野生型パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK 2)、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)、アルファ−シヌクレイン(SCNA)、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)タンパク質またはその機能的バリアントもしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子治療ベクターを前記対象に投与すること、を含み、
前記組換え遺伝子治療ベクターの投与が、前記対象における前記パーキンソン病を治療またはその発症を阻害する、方法。 - 前記PDが、早期発症PD、任意で、早期発症常染色体劣性PDである、請求項87に記載の方法。
- 前記対象が、PARK2遺伝子、PINK1遺伝子、LRRK2遺伝子、SCNA遺伝子、c−Rel遺伝子、ATG7遺伝子、VMAT2、またはGBA遺伝子中に変異を含む、請求項87または請求項88に記載の方法。
- 前記PARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAタンパク質が、それぞれ、配列番号1〜9に示されるアミノ酸配列を含む、請求項87〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列が、前記PARK2遺伝子をコードし、前記野生型PARK2タンパク質が、配列番号10〜17のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項87〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号18〜26に示されるPARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、95%、または99%の同一性を有する配列を含む、請求項87〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記配列が、前記PARK2遺伝子をコードし、前記ポリヌクレオチドが、配列番号27〜34のいずれかに示されるPARK2アイソフォームポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、95%、または99%の同一性を有する配列を含む、請求項87〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PARK2、PINK1、LRRK2、SCNA、c−Rel、ATG7、VMAT2、またはGBAタンパク質、またはその機能的バリアントもしくは断片をコードする前記配列が、コドン最適化され、任意で、前記配列が、配列番号35〜38のうちのいずれかを含む、請求項87〜93のいずれか一項に記載の方法。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)である、請求項87〜94のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVが、血清型AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVrh10、またはAAVrh74を有する、請求項95に記載の方法。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、自己相補的AAVまたは一本鎖AAVを含む、請求項95または請求項96に記載の方法。
- 前記AAVが、野生型AAVまたは修飾AAVである、請求項95〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVが、野生型VP1、VP2、またはVP3カプシドタンパク質と少なくとも95%の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項95〜98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え遺伝子治療ベクターが、以下の
a.真核生物で活性なプロモーター配列と、
b.前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列と
を5’から3’の順序で含むポリヌクレオチドを含み、
前記野生型タンパク質またはその機能的断片もしくはバリアントをコードする配列が、前記真核生物で活性なプロモーター配列と作動可能に連結されている、
請求項95〜99のいずれか一項に記載の方法。 - 前記組換え遺伝子治療ベクターが、
hSYN1(ヒトシナプシン)、INA(アルファ−インターネキシン)、NES(ネスチン)、TH(チロシンヒドロキシラーゼ)、FOXA2(フォークヘッドボックスA2)、CaMKII(カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII)、およびNSE(ニューロン特異的エノラーゼ)プロモーターからなる群から任意で選択される、ニューロン特異的プロモーター、
CMV、CAG、UBC、PGK、EF1−アルファ、GAPDH、SV40、HBV、およびニワトリベータアクチン、ヒトベータアクチンプロモーターからなる群から選択されるユビキタスプロモーター、
エンハンサー、
イントロン、
ポリAシグナル、
2Aペプチドをコードする配列、ならびに
WPRE(ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素)のうちの1つ以上をさらに含む、請求項101に記載の方法。 - 前記組換え遺伝子治療ベクターが、
HuBAプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(x)、およびpAグロビン−Oc;
CMVプロモーター、TPL−eMLPエンハンサー、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAグロビン−Oc;
Synプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(r)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Bt;
CBAプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAGH−Bt;
EF1αプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAグロビン−Oc;
HuBAプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt;
Synプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;
CaMKIIaプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Hs;
CMVプロモーター、TPL−eMLPエンハンサー、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Hs;
HuBAプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAGH−Hs;
CMVおよびTPLプロモーター、eMPL、前記導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、ならびにpAGH−Bt;
EF1αプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(r)、およびpAGH−Bt;
Synプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc;
CaMKIIaプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAグロビン−Oc;
CBAプロモーター、前記導入遺伝子、WPRE(x)、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;
CBAプロモーター、前記導入遺伝子、3’UTR(グロビン)、およびpAグロビン−Oc;
CaMKIIaプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、およびpAGH−Bt;
EF1αプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;
CMVプロモーター、前記導入遺伝子、R2V17、3’UTR(グロビン)、およびpAGH−Hs;または
CMVプロモーター、前記導入遺伝子、およびpAGH−Hs
を5’から3’の順序で含み、
任意で、前記導入遺伝子が、PARK2をコードする、
請求項101に記載の方法。 - 投与するステップが、全身、非経口、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内投与を含む、請求項87〜102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップが、静脈内、大脳、脳脊髄、髄腔内、大槽内、被殻内、海馬内、線条体内、または脳室内注入を含む、請求項103に記載の方法。
- 前記投与するステップが、トレンデレンブルグ傾斜での髄腔内注入を含む、請求項103に記載の方法。
- 前記投与するステップが、脳の黒質の緻密部に直接的に注入することを含む、請求項103に記載の方法。
- 前記投与するステップが、前記対象の脳または脳脊髄液(CSF)に前記組換え遺伝子治療ベクターを導入することを含む、請求項87〜106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x109〜1x1014のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項87〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x109〜1x1014のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象の脳に投与される、請求項87〜108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x109〜1x1014のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象のCSFに投与される、請求項87〜108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の体重1キログラムあたり1x107〜1x109のベクターゲノム(vg/kg)の前記遺伝子治療ベクターが、前記対象に投与される、請求項87〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、成人である、請求項87〜111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、子供である、請求項87〜112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数よりも多い、請求項87〜113のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップ後の前記対象におけるドーパミンのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象におけるドーパミンのレベルよりも大きい、請求項87〜114のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数が、そのように治療されない対象におけるドーパミン作動性ニューロンの数と比較して増加する、請求項87〜115のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象のドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項87〜116のいずれか一項に記載の方法。
- 方法によって治療される対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルが、そのように治療されない対象の前記黒質におけるドーパミンのレベルと比較して増加する、請求項87または請求項117に記載の方法。
- 前記投与するステップ後の前記対象のCSFにおけるPRKNのレベルが、前記投与するステップ前の前記対象のCSFにおけるPRKNのレベルよりも大きい、請求項87〜118のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与するステップ前の前記対象の統一パーキンソン病評価尺度(UPDRS)スコアが、前記投与するステップ前の前記対象のUPDRSスコアと比較して改善される、請求項87〜119のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象の前記CSFにおけるPRKNのレベルが、そのように治療されない対象の前記CSFにおけるPRKNのレベルと比較して増加する、請求項87〜120のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法によって治療される対象の前記UPDRSスコアが、そのように治療されない対象の前記UPDRSスコアと比較して改善される、請求項87〜121のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象のニューロンが、前記組換え遺伝子治療ベクターと接触した後に、減少した量のアルファ−シヌクレインを発現し、かつ/または減少した量のレビー小体を含む、請求項87〜112のいずれか一項に記載の方法。
- 変異パーキン(PRKN)遺伝子を有するドーパミン作動性ニューロンの変性または死を阻害する方法であって、
a.Casタンパク質、またはCasタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
b.ガイドRNA(gRNA);および
c.機能的パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む修復鋳型
を含む遺伝子編集システムと、前記ニューロンとを接触させること、を含み、
前記遺伝子編集システムが、前記ニューロン内の内因性遺伝子を修復するか、または前記ニューロンのゲノム内に機能的遺伝子を挿入することが可能である、方法。 - 前記遺伝子編集システムのうちの少なくとも1つの構成要素が、組換えAAVによって送達される、請求項124に記載の方法。
- 前記遺伝子編集システムが、組換えAAVによって送達される、請求項124に記載の方法。
- 細胞の遺伝子編集システムであって、
a.Casタンパク質、またはCasタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
b.ガイドRNA(gRNA);および
c.機能的パーキンソンタンパク質2のE3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2)遺伝子、PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)遺伝子、タンパク質デグリカーゼDJ−1(DJ−1)遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)遺伝子、アルファ−シヌクレイン(SCNA)遺伝子、がん原遺伝子c−Rel(c−Rel)遺伝子、ユビキチン様修飾因子活性化酵素(ATG7)遺伝子、シナプス小胞アミントランスポーター(VMAT2)遺伝子、またはグルコセレブロシダーゼ(GBA)遺伝子、またはその機能的バリアントもしくは断片を含む修復鋳型
を含み、
前記遺伝子編集システムが、前記細胞内の内因性遺伝子を修復するか、または前記細胞のゲノム内に機能的遺伝子を挿入することが可能である、
遺伝子編集システム。 - 前記遺伝子編集システムのうちの少なくとも1つの構成要素が、組換えAAVによって送達される、請求項127に記載の遺伝子編集システム。
- 組換えAAVによって送達される、請求項127に記載の遺伝子編集システム。
- 前記細胞が、エクスビボニューロンである、請求項127〜129のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
- 前記細胞が、対象の細胞である、請求項127〜130のいずれか一項に記載の遺伝子編集システム。
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