KR20230043181A - 파킨을 코딩하는 aav 벡터 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은, 일부 측면에서, 트랜스진을 대상체에게 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 인간 파킨 또는 그의 부분을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 발현 구축물 (예를 들어, 발현 구축물을 함유하는 벡터)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 신경변성 질환 (예를 들어, 파킨슨병)의 치료를 필요로 하는 대상체에게 이러한 발현 구축물을 투여함으로써 신경변성 질환 (예를 들어, 파킨슨병)을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

파킨을 코딩하는 AAV 벡터 및 그의 용도

관련 출원

본 출원은 35 U.S.C. 119(e) 하에 2020년 8월 3일에 출원된 표제 "AAV VECTORS ENCODING PARKIN AND USES THEREOF"의 미국 가출원 일련 번호 63/060,353의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

파킨 (PRKN)은 세포로부터 손상된 미토콘드리아의 클리어런스를 매개하고 또한 아폽토시스를 억제함으로써 세포 생존에서 소정의 역할을 하는 E3 유비퀴틴 리가제이다. PRKN에서의 돌연변이는 미토콘드리아 기능장애를 유발하고, 뉴런 사멸, 파킨슨병 (PD), 및 종양발생으로 이어지는 것으로 관찰되었다.

본 개시내용의 측면은 트랜스진을 대상체에게 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 부분적으로 코돈-최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된 인간 파킨 (PRKN) 단백질을 발현하도록 구성된 발현 구축물 (예를 들어, 벡터)에 기초한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발현 구축물은 대상체에게 투여되었을 때 CNS 질환 (예를 들어, 파킨슨병)의 1종 이상의 징후 또는 증상을 감소시킨다.

따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 파킨 단백질을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산에 기초하며, 여기서 인간 파킨 단백질은 코돈-최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된다.

일부 실시양태에서, 인간 파킨 단백질은 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 코돈-최적화된 핵산 서열은 서열식별번호: 4에 제시된 핵산 서열을 포함하지 않는다.

일부 실시양태에서, 발현 구축물은 코돈-최적화된 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, 또는 JeT 프로모터이다.

일부 실시양태에서, 발현 구축물은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR)에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, AAV ITR은 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, 및 AAV6 ITR로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터 또는 바큘로바이러스 벡터이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 또는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 세포이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 (i) 캡시드 단백질; 및 (ii) 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및/또는 비-뉴런 세포를 형질도입한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 또는 rAAV를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 발현 구축물 (예를 들어, rAAV)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스진을 중추 신경계의 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투여는 CNS 조직 내로의 직접 주사이다. 일부 실시양태에서, 투여는 말초 투여이다. 일부 실시양태에서, 말초 투여는 정맥내 주사이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, rAAV, 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 투여는 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 뇌내 주사, 실질내 주사, 척수강내 주사, 대수조내 (ICM) 주사 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS에 대한 직접 주사는 대류 증진 전달 (CED)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 말초 주사를 포함하며, 임의로 여기서 말초 주사는 정맥내 주사이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 PRKN 유전자에서 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, PRKN 유전자에서의 돌연변이는 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입, 또는 스플라이스 부위 돌연변이를 포함한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 5'에서 3' 순서로 5' AAV ITR; CMV 인핸서; CBA 프로모터; 서열식별번호: 2 또는 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 PRKN 단백질을 코딩하는 트랜스진; WPRE; 소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일; 및 3' AAV ITR을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV); 및 5'에서 3' 순서로 5' AAV ITR; CMV 인핸서; CBA 프로모터; 서열식별번호: 2 또는 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 PRKN 단백질을 코딩하는 트랜스진; WPRE; 소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일; 및 3' AAV ITR을 포함하는 핵산을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다.

일부 실시양태에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV9 캡시드 단백질이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드를 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 바큘로바이러스 벡터를 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 1종 이상의 아데노-연관 바이러스 rep 단백질 및/또는 1종 이상의 아데노-연관 바이러스 cap 단백질을 코딩하는 제1 벡터; 및 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.

일부 실시양태에서, 제1 벡터는 플라스미드이고, 제2 벡터는 플라스미드이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포이다.

일부 실시양태에서, 제1 벡터는 바큘로바이러스 벡터이고, 제2 벡터는 바큘로바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 세포는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 곤충 세포는 SF9 세포이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 1종 이상의 아데노-연관 바이러스 rep 단백질 및/또는 1종 이상의 아데노-연관 cap 단백질을 코딩하는 제1 벡터, 및 서열식별번호: 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 세포에 전달하는 단계; 세포를 rAAV의 패키징을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 rAAV의 수집을 위해 배양된 숙주 세포 또는 배양 배지를 수거하는 단계를 포함하는, rAAV를 생산하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 투여는 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함한다.

일부 실시양태에서, 직접 주사는 뇌내 주사, 실질내 주사, 척수강내 주사, 대수조내 주사 또는 그의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS에 대한 직접 주사는 대류 증진 전달 (CED)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 말초 주사를 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초 주사는 정맥내 주사이다.

일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 세포를 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터 또는 rAAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 미토콘드리아 기능장애를 교정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 접촉시키는 것은, 세포에서 산화성 스트레스를 감소시키고/거나 세포에서 미토파지를 증가시키기에 충분한 양의 단리된 핵산, 벡터, 또는 rAAV의 양과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 PRKN 유전자에서 1개 이상의 돌연변이, 삽입, 또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 시험관내 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체 내 세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체 내 세포를 접촉시키는 단계는 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산, 벡터, 또는 rAAV를 임의의 적합한 경로 (예를 들어, 본원에 기재된 투여 경로 중 1종 이상)를 통해 투여하는 것에 의한다. 일부 실시양태에서, 접촉이 발생한 후, 미토콘드리아 기능장애는 접촉 전의 세포에서의 미토콘드리아 기능장애에 비해 세포에서 적어도 1% (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 10-25%, 25-50%, 50-75%, 75-90%, 또는 90% 초과)만큼 감소된다.

도 1은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 인간 파킨-코딩 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드의 한 실시양태를 도시한 개략도를 보여준다.
도 2a-2b는 코돈-최적화된 파킨 핵산 벡터 optParkA 및 optParkB로 형질감염된 HeLa 세포에서의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 보여준다. 도 2a는 mRNA 발현을 보여준다. 도 2b는 형질감염된 세포에서의 optParkA 및 opt ParkB 단백질 발현을 보여준다.
도 3은 형질감염된 HeLa 세포에서의 optParkB 단백질 국재화를 보여준다.
도 4a-4b는 optParkB로 형질감염된 HeLa 세포에 대한 미토콘드리아 스트레스 검정을 보여준다. 도 4a는 검정의 개략도를 보여준다. 도 4b는 메나디온 투여 후 시험관내 검정의 결과를 보여준다.

본 개시내용은 부분적으로 대상체에서 1종 이상의 유전자 생성물 (예를 들어, CNS 질환과 연관된 유전자 생성물)의 발현을 위한 조성물 및 방법을 기초로 한다. 유전자 생성물은 단백질, 단백질의 단편 (예를 들어, 부분), CNS 질환-연관 유전자를 억제하는 간섭 핵산 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 CNS 질환-연관 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 단백질 단편이다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 CNS 질환-연관 유전자를 억제하는 간섭 핵산 (예를 들어, shRNA, siRNA, miRNA, amiRNA 등)이다.

CNS 질환-연관 유전자는 CNS 질환, 예를 들어 파킨슨병 (PD)과 유전적으로, 생화학적으로 또는 기능적으로 연관된 유전자 생성물을 코딩하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, GBA1 유전자 (GBA1, 이는 단백질 Gcase를 코딩함), 또는 파킨 유전자 (PRKN, 이는 파킨 단백질을 코딩함)에서 돌연변이를 갖는 개체는 GBA1 또는 PRKN에서 돌연변이를 갖지 않는 개체와 비교하여 증가된 PD 발생 위험을 갖는 것으로 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발현 카세트는 PD-연관 유전자 (또는 그의 코딩 서열) (예를 들어, 파킨 단백질)의 야생형 또는 비-돌연변이체 형태를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 발현 카세트는 야생형 PRKN 단백질 및 1종 이상의 추가의 PD-연관 단백질을 코딩한다. PD-연관 유전자의 예가 표 1에 열거된다.

표 1: PD-연관 유전자의 예

단리된 핵산 및 벡터

단리된 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 개시내용은, 일부 측면에서, 1종 이상의 PD-연관 유전자, 예를 들어 파킨 단백질 (예를 들어, PRKN 유전자의 유전자 생성물)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)을 제공한다. "파킨 단백질"은 다양한 조건 (예를 들어, 미토콘드리아의 탈분극 또는 표피 성장 인자 신호전달)에 반응하여 매우 다양한 단백질을 유비퀴틴화할 수 있는 E3 유비퀴틴 리가제이다. 인간에서, PRKN 유전자는 염색체 6 상에 위치한다. 일부 실시양태에서, 인간 PRKN 유전자는 NCBI 참조 서열 BAA25751 (서열식별번호: 1)에 의해 나타내어지는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 코돈-최적화된 인간 파킨 코딩 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 코돈-최적화된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호: 4에 제시된 핵산 서열 (예를 들어, 야생형 PRKN)을 포함하지 않는다.

유전자 생성물은 자연 발생 유전자의 코딩 부분 (예를 들어, cDNA)에 의해 또는 자연 발생 유전자의 변이체 (예를 들어, 자연 발생 유전자의 돌연변이체 또는 말단절단된 버전)에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 인간 PRKN 유전자에 의해 코딩된 단백질 (또는 그의 단편)이다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 표 1에 열거된 또 다른 유전자, 예를 들어 MAPT 유전자에 의해 코딩된 단백질 (또는 그의 단편)이다. 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 표 1에 열거된 유전자의 단편 (예를 들어, 부분), 예컨대 인간 PRKN 유전자의 단편이다. 단백질 단편은 표 1에 열거된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 99%를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 단편은 표 1에 열거된 유전자에 의해 코딩된 단백질의 50% 내지 99.9% (예를 들어, 50% 내지 99.9%의 임의의 값)를 포함한다.

발현 구축물은 1개 이상의 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 프로모터)를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 프로모터, 예를 들어 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 내인성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 (예를 들어, CNS-특이적 프로모터) 등이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터 (CBA 프로모터), CAG 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Alexopoulou et al., (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2]에 기재된 바와 같음), 또는 JeT 프로모터 (예를 들어, 문헌 [Tornφe et al., (2002) Gene 297(1-2):21-32]에 기재된 바와 같음)이다.

본 개시내용의 측면은 대상체의 CNS 세포 (예를 들어, 뉴런 또는 비-뉴런 세포)에서 1종 이상의 트랜스진을 발현하도록 구성된 구축물에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 구축물 (예를 들어, 유전자 발현 벡터)은 뉴런-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질 코딩 서열을 포함한다. 뉴런-특이적 프로모터의 예는 시냅신 I 프로모터, 칼슘/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II 프로모터, 튜불린 알파 I 프로모터, 뉴런-특이적 엔올라제 프로모터, 및 예를 들어 문헌 [Hioki et al., Gene Therapy volume 14, pages872- 882(2007)]에 기재된 바와 같은 혈소판-유래 성장 인자-베타 쇄 프로모터를 포함한다.

일부 실시양태에서, 발현 구축물은 모노시스트론이다 (예를 들어, 발현 구축물은 단일 프로모터의 제어 하에 단일 유전자 생성물, 예를 들어 단백질, 또는 다중 유전자 생성물을 코딩함). 일부 실시양태에서, 발현 구축물은 폴리시스트론이다 (예를 들어, 발현 구축물은 각각 상이한 프로모터의 제어 하에 2개의 별개의 유전자 생성물, 예를 들어 2개의 상이한 단백질 또는 단백질 단편을 코딩함). 폴리시스트론 발현 벡터는 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 프로모터를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 발현 카세트는 전사 인자 결합 서열, 인트론 스플라이스 부위, 폴리(A) 부가 부위, 인핸서 서열, 리프레서 결합 부위, 또는 상기의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 추가의 조절 서열을 포함한다. 다중 유전자 생성물을 코딩하는 발현 카세트와 관련하여, 핵산 서열은 제1 유전자 생성물 및 제2 유전자 생성물을 코딩할 수 있으며, 이는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. IRES 부위의 예는 예를 들어 문헌 [Mokrejs et al., (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제1 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열 및 제2 유전자 생성물을 코딩하는 핵산 서열은 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 의해 분리된다. 자기-절단 펩티드의 예는 T2A, P2A, E2A, F2A, BmCPV 2A, 및 BmIFV 2A, 및 문헌 [Liu et al., (2017) Sci Rep. 7: 2193]에 기재된 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 자기-절단 펩티드는 T2A 펩티드이다.

병리학적으로, PD 및 고셔병과 같은 장애는 주로 α-시뉴클레인 (α-Syn) 단백질로 구성된 단백질 응집체의 축적과 연관된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 핵산은 α-Syn 단백질의 발현을 감소시키거나 방지하는 억제 핵산을 포함한다. 억제 핵산을 코딩하는 서열은 발현 벡터의 비번역 영역 (예를 들어, 인트론, 5'UTR, 3'UTR 등)에 위치할 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제 핵산은 발현 구축물의 인트론, 예를 들어 제1 유전자 생성물을 코딩하는 서열 상류의 인트론에 위치한다. 억제 핵산은 이중 가닥 RNA (dsRNA), siRNA, 마이크로 RNA (miRNA), 인공 miRNA (amiRNA), 또는 RNA 압타머일 수 있다. 일반적으로, 억제 핵산은 표적 RNA (예를 들어, mRNA)의 약 6 내지 약 30개 (예를 들어, 6 및 30을 포함한 그 사이의 임의의 정수)의 인접 뉴클레오티드에 결합한다 (예를 들어, 혼성화한다). 일부 실시양태에서, 억제 핵산 분자는 miRNA 또는 amiRNA, 예를 들어 SNCA (α-시뉴클레인 단백질을 코딩하는 유전자), MAPT (예를 들어, 타우 단백질을 코딩하는 유전자), 또는 APP (예를 들어, 아밀로이드-베타 단백질을 코딩하는 유전자)를 표적화하는 miRNA이다. 일부 실시양태에서, miRNA는 그것이 혼성화하는 SNCA mRNA, MAPT mRNA, 또는 APP mRNA의 영역과 어떠한 미스매치도 포함하지 않는다 (예를 들어, miRNA는 "완벽함"). 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 shRNA (예를 들어, SNCA, MAPT, 또는 APP를 표적화하는 shRNA)이다. 일부 실시양태에서, 억제 핵산은 miR-155 스캐폴드 및 SNCA 또는 TMEM106B 표적화 서열을 포함하는 인공 miRNA (amiRNA)이다.

일부 실시양태에서, 억제 핵산은 인공 마이크로RNA (amiRNA)이다. 마이크로RNA (miRNA)는 전형적으로 식물 및 동물에서 발견되는 작은 비-코딩 RNA를 지칭하고, 유전자 발현의 전사 및 번역후 조절에서 기능한다. miRNA는 RNA 폴리머라제에 의해 전사되어 1차-miRNA로 지칭되는 헤어핀-루프 구조를 형성하고, 이는 후속적으로 효소 (예를 들어, 드로샤, 파샤, 스플라이세오솜 등)에 의해 프리-miRNA 헤어핀 구조로 프로세싱되고, 이는 이어서 다이서에 의해 프로세싱되어 miRNA/miRNA* 듀플렉스 (여기서 *는 miRNA 듀플렉스의 패신저 가닥을 나타냄)를 형성하고, 이어서 그 중 1개의 가닥은 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 억제 RNA는 SNCA, MAPT, 또는 APP를 표적화하는 miRNA이다.

인공 마이크로RNA (amiRNA)는 프리-mRNA의 천연 표적화 영역을 관심 표적화 영역으로 대체하기 위해 천연 miRNA를 변형시킴으로써 유래된다. 예를 들어, 자연 발생, 발현된 miRNA는 스캐폴드 또는 백본 (예를 들어, 1차-miRNA 스캐폴드)으로서 사용될 수 있으며, 줄기 서열은 관심 유전자를 표적화하는 miRNA의 것에 의해 대체된다. 인공 전구체 마이크로RNA (프리-amiRNA)는 통상적으로 1개의 단일의 안정한 작은 RNA가 우선적으로 생성되도록 프로세싱된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 scAAV 벡터 및 scAAV는 amiRNA를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, amiRNA의 1차-miRNA 스캐폴드는 1차-MIR-21, 1차-MIR-22, 1차-MIR-26a, 1차-MIR-30a, 1차-MIR-33, 1차-MIR-122, 1차-MIR-375, 1차-MIR-199, 1차-MIR-99, 1차-MIR-194, 1차-MIR-155, 1차-MIR-451, 1차-MIR-14, 1차-MIR145, 1차-MIR 7-2 및 1차-MIR-155로 이루어진 군으로부터 선택된 1차-miRNA로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, amiRNA는 예를 들어 문헌 [Fowler et al., Nucleic Acids Res. 2016 Mar 18; 44(5): e48]에 기재된 바와 같은, SNCA, MAPT, 또는 APP를 표적화하는 핵산 서열 및 eSIBR amiRNA 스캐폴드를 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산은 그 자체로, 또는 벡터의 일부로서 존재할 수 있다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 플라스미드)이다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터는 단일-가닥 (예를 들어, 단일-가닥 DNA)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바큘로바이러스 벡터 (예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체병 (AcNPV) 벡터)이다.

전형적으로, rAAV 벡터 (예를 들어, rAAV 게놈)는 2개의 AAV 역전된 말단 반복부 (ITR) 서열이 플랭킹된 트랜스진 (예를 들어, 각각 하기: 프로모터, 인트론, 인핸서 서열, 단백질 코딩 서열, 억제 RNA 코딩 서열, 폴리A 테일 서열 등 중 1개 이상을 포함하는 발현 구축물)을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 트랜스진은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 2개의 ITR 서열 각각은 전장 ITR (예를 들어, 대략 145 bp 길이이고, 기능적 Rep 결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 함유함)이다. 일부 실시양태에서, AAV ITR은 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, 및 AAV6 ITR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, rAAV 벡터의 ITR 중 1개는 말단절단된다 (예를 들어, 단축되거나 또는 전장이 아님). 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR은 기능적 말단 분해 부위 (trs)가 결여되고, 자기-상보적 AAV 벡터 (scAAV 벡터)의 생산에 사용된다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 ITR은 예를 들어 문헌 [McCarty et al., (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8]에 기재된 바와 같은 ΔITR이다.

본 개시내용의 측면은 야생형 AAV ITR에 비해, 예를 들어 야생형 AAV2 ITR (예를 들어, 서열식별번호: 5)에 비해 1개 이상의 변형 (예를 들어, 핵산 부가, 결실, 치환 등)을 갖는 ITR을 포함하는 단리된 핵산 (예를 들어, rAAV 벡터)에 관한 것이다. 일반적으로, 야생형 ITR은 자기-어닐링되어 2개의 교차 아암 (각각 B/B' 및 C/C'로 지칭되는 서열에 의해 형성됨), 보다 긴 줄기 영역 (서열 A/A'에 의해 형성됨), 및 "D" 영역으로 지칭되는 단일-가닥 말단 영역으로 이루어진 회문식 이중-가닥 T-형상의 헤어핀 구조를 형성하는 125개의 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 일반적으로, ITR의 "D" 영역은 A/A' 서열에 의해 형성된 줄기 영역과 rAAV 벡터의 트랜스진을 함유하는 삽입물 사이에 위치한다 (예를 들어, ITR의 말단에 대해 ITR의 "내부"에 위치하거나 또는 rAAV 벡터의 트랜스진 삽입물 또는 발현 구축물의 근위에 위치함).

본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터는, 예를 들어, 문헌 [Francois, et al., 2005. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno- Associated Virus Type 2 p5 Element. J Virol]에 기재된 바와 같은 "TRY" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TRY 서열은 ITR (예를 들어, 5' ITR) 및 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터의 발현 구축물 (예를 들어, 트랜스진 코딩 삽입물) 사이에 위치한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터를 포함하는 바큘로바이러스 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 바큘로바이러스 벡터는 예를 들어 문헌 [Urabe et al., (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43 및 Smith et al., (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896]에 기재된 바와 같은 아우토그라파 칼리포르니카 핵 다각체병 (AcNPV) 벡터이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 포유동물 세포, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 HEK293T 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 곤충 세포, 예를 들어 SF9 세포 (예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf21 세포의 클론 분리주)이다.

rAAV

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 핵산을 코딩하는 트랜스진을 포함하는 재조합 AAV (rAAV) (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV 벡터)에 관한 것이다. 용어 "rAAV"는 일반적으로 1종 이상의 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 rAAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 자기-상보적 rAAV (scAAV)이다.

본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 그의 변이체로부터 선택된 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, rAAV는 AAV9의 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 비-인간 숙주로부터의 캡시드 단백질, 예를 들어 레서스 AAV 캡시드 단백질, 예컨대 AAVrh.10, AAVrh.39 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 야생형 캡시드 단백질의 변이체인 캡시드 단백질, 예컨대 그것이 유래되는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 초과 (예를 들어, 15, 20, 25, 50, 100개 등)의 아미노산 치환 (예를 들어, 돌연변이)을 포함하는 캡시드 단백질 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV는 문헌 [Albright et al., Mol Ther. 2018 Feb 7;26(2):510-523]에 기재된 바와 같은 키메라 캡시드 단백질 (예를 들어, 2종 이상의 AAV 상이한 캡시드 단백질로부터의 서열을 포함하는 캡시드 단백질), 예를 들어 AAV1RX를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질 변이체는, 예를 들어 문헌 [Rosario et al., Mol Ther Methods Clin Dev. 2016; 3: 16026]에 기재된 바와 같은 AAV TM6 캡시드 단백질이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 야생형 캡시드 단백질의 변이체인 캡시드 단백질, 예컨대 그것이 유래되는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개 초과 (예를 들어, 15, 20, 25, 50, 100개 등)의 아미노산 치환 (예를 들어, 돌연변이)을 포함하는 캡시드 단백질 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡시드 단백질 변이체는 그것이 유래되는 야생형 AAV 캡시드 단백질과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본 개시내용은, 부분적으로, 1종 이상의 PD-연관 유전자 생성물 (예를 들어, 인간 파킨)을 코딩하는 트랜스진, 및 중추 신경계 (CNS) 내의 세포, 예를 들어 뉴런 세포 (예를 들어, 성상세포) 또는 비-뉴런 세포 (예를 들어, 소교 세포, 혈관주위 대식세포, 맥락총 대식세포, 수막 대식세포, 수막 수지상 세포, 및/또는 수막 과립구)를 표적화하는 캡시드 단백질을 함유하는 rAAV에 기초한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는, 특히 CSF 공간 내로 도입되거나 또는 뇌 실질 내로 직접 도입되는 경우, CNS를 통해 용이하게 확산된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 rAAV는 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 가로지를 수 있는 캡시드 단백질을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, rAAV는 AAV9 혈청형, AAVrh.10 혈청형, 또는 AAV1RX 혈청형을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. rAAV의 생산은, 예를 들어 문헌 [Samulski et al., (1989) J Virol. 63(9):3822-8 및 Wright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706]에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 rAAV (예를 들어, rAAV 캡시드 입자를 형성하기 위해 AAV 캡시드 단백질에 의해 캡시드화된 재조합 rAAV 게놈을 포함함)는 바큘로바이러스 벡터 발현 시스템 (BEVS)에서 생산된다. BEVS를 사용한 rAAV의 생산은, 예를 들어 문헌 [Urabe et al., (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43, Smith et al., (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896], 미국 특허 번호 8,945,918, 미국 특허 번호 9,879,282, 및 국제 PCT 공개 WO 2017/184879에 기재되어 있다. 그러나, rAAV는 임의의 적합한 방법을 사용하여 (예를 들어, 재조합 rep 및 cap 유전자를 사용하여) 생산될 수 있다.

제약 조성물

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 또는 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 제거하지 않고 비교적 비-독성인 물질, 예컨대 담체 또는 희석제를 지칭하며, 예를 들어 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 또는 그것이 함유되어 있는 조성물의 성분 중 임의의 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 개체에게 투여될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 본 발명 내에서 유용한 화합물을 그의 의도된 기능을 수행할 수 있도록 환자 내에 또는 환자에게 운반 또는 수송하는데 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 담체, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 본 발명의 실시에 사용되는 제약 조성물에 포함될 수 있는 추가의 성분은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)]에 기재되어 있다.

본원에 제공된 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)은 경장 (예를 들어, 경구), 비경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 척수강내, 피하, 뇌실내, 경피, 피내, 직장, 질내, 복강내, 국소 (분말, 연고, 크림, 및/또는 점적제에 의하는 것과 같음), 점막, 비강, 협측, 설하를 포함한 임의의 경로에 의해; 기관내 점적주입, 기관지 점적주입, 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 경구 스프레이, 비강 스프레이, 및/또는 에어로졸로서 투여될 수 있다. 구체적으로 고려되는 경로는 경구 투여, 정맥내 투여 (예를 들어, 전신 정맥내 주사), 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국부 투여, 및/또는 이환 부위로의 직접 투여이다. 일반적으로, 가장 적절한 투여 경로는 작용제의 성질 (예를 들어, 위장관 환경에서의 그의 안정성), 및/또는 대상체의 상태 (예를 들어, 대상체가 경구 투여를 견딜 수 있는지 여부)를 비롯한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 제약 조성물은 대상체의 눈에 대한 국소 투여에 적합하다.

방법

파킨슨병은 대상체의 세포 (또는 세포 환경)에서의 미토콘드리아 기능장애 및 산화성 스트레스와 연관되었다. 예를 들어, 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 복합체 I의 결핍이 PD 환자에서 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 미토콘드리아 기능장애는 세포 또는 대상체에서 하기 유전자: SNCA, LRRK2, PRKN, PINK1 또는 ATP13A2 중 1종 이상에서의 돌연변이에 의해 유발된다. PRKN은 신호전달 또는 프로테아솜 분해를 위한 표적 단백질을 유비퀴틴화하는 시토졸 E3 유비퀴틴 리가제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 파킨은 미토파지를 통해 생물발생 및 분해를 조절함으로써 건강한 미토콘드리아를 유지시키는 기능을 한다. PRKN에서의 특정 돌연변이는, 예를 들어 문헌 [Park et al., Curr. Neurol Neurosci. Rep. 2018; 18(5): 21]에 기재된 바와 같이, 이러한 과정을 방해하고, 미토콘드리아 조절이상 및 산화성 스트레스의 증가를 발생시킨다.

본 개시내용은 부분적으로 세포 또는 대상체에서 미토콘드리아 기능장애 및/또는 산화성 스트레스를 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 기초한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 투여함으로써 세포 또는 대상체에서 미토콘드리아 기능장애를 감소시키는 (예를 들어, 세포 또는 대상체에서 산화성 스트레스를 감소시키는) 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 본 개시내용의 조성물을 투여하는 것은 세포 또는 대상체에서 미토콘드리아 기능장애 또는 산화성 스트레스를 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, 100% 또는 그 초과만큼 감소시킨다 (예를 들어, 미토콘드리아 기능장애 또는 산화성 스트레스를 특징으로 하지 않는 대상체에 비해, 또는 조성물의 투여 전의 대상체에서의 미토콘드리아 기능장애 또는 산화성 스트레스의 수준에 비해). 미토콘드리아 기능 및 산화성 스트레스의 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 미토콘드리아 기능은 산소 소모, 총 에너지 대사의 정량화를 위한 발광 ATP 검정, 및 대사 활성의 결정을 위한 MTT 또는 알라마르 블루에 의해 측정된다. 일부 실시양태에서, 산화성 스트레스는 DNA/RNA 손상, 지질 과산화, 및 단백질 산화/니트로화의 수준에 의해, 또는 반응성 산소 종을 직접 측정함으로써 측정된다.

본 개시내용의 측면은 CNS-연관 질환을 치료하기 위한 대상체에서의 1종 이상의 CNS 질환-연관 유전자 생성물의 발현을 위한 조성물에 관한 것이다. 1종 이상의 CNS 질환-연관 유전자 생성물은 1종 이상의 단리된 핵산 또는 rAAV 벡터에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 1종 이상의 (1, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과의) 유전자 생성물을 코딩하는 단일 벡터 (예를 들어, 단리된 핵산, rAAV 등)를 투여한다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 복수의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과의) 벡터 (예를 들어, 단리된 핵산, rAAV 등)를 투여하고, 여기서 각각의 벡터는 상이한 CNS 질환-연관 유전자 생성물을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 표적 세포에 전달되는 트랜스진은 1종 이상의 PD-연관 단백질, 예를 들어 인간 파킨 및/또는 APP, MAPT, 또는 α-시뉴클레인을 표적화하는 1종 이상의 억제 핵산을 코딩한다.

일부 측면에서, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산, rAAV 등)은 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 1종 초과의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5종, 또는 그 초과의) 벡터 (예를 들어, rAAV)를 투여하고, 각각의 벡터는 상이한 트랜스진을 코딩한다 (예를 들어, 제1 rAAV는 인간 파킨 단백질을 코딩하고, 제2 rAAV는 GBA1 단백질 또는 억제 핵산을 코딩함).

본 개시내용은 부분적으로 파킨슨병을 치료하기 위한 대상체에서의 PD-연관 유전자 생성물의 발현을 위한 조성물에 기초한다. 본원에 사용된 "치료하다" 또는 "치료하는"은 (a) 파킨슨병의 발병을 예방 또는 지연시키는 것; (b) 파킨슨병의 중증도를 감소시키는 것; (c) 파킨슨병에 특징적인 증상의 발생을 감소 또는 예방하는 것; (d) 및/또는 파킨슨병에 특징적인 증상의 악화를 예방하는 것을 지칭한다. 파킨슨병의 징후 및 증상은, 예를 들어 시뉴클레인 단백질의 축적, 진전, 느린 움직임 (운동완만), 경직 근육 (강직), 손상된 자세 및 균형, 언어 변화 및 서체 변화를 포함한다.

본 개시내용은, 부분적으로, 함께 (예를 들어, 상승작용적으로) 작용하여 파킨슨병을 치료하는, 대상체에서 PD-연관 유전자 생성물의 조합물의 발현을 위한 조성물에 기초한다.

따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용은 부분적으로 고셔병을 치료하기 위한 대상체에서의 1종 이상의 CNS-질환 연관 유전자 생성물의 발현을 위한 조성물에 기초한다. 일부 실시양태에서, 고셔병은 뉴런병증성 고셔병, 예를 들어 제2형 고셔병 또는 제3형 고셔병이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 PD 또는 PD 증상을 갖지 않는다.

따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용은 뉴런병증성 고셔병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 뉴런병증성 고셔병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상염색체 열성 소아 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 PARK2 돌연변이를 갖는 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 특발성 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 산발성 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 비정형 파킨슨증을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 다계통 위축 (MSA)을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 진행성 핵상 마비 (PSP)를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 피질기저 증후군 (CBS)을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 루이 소체 치매 (DLB)를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 약물-유발 파킨슨증을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 혈관 파킨슨증 (VP)을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 파킨슨병을 갖거나 또는 파킨슨병이 발병할 위험이 있는 대상체는 인간 PRKN에서 1개 이상의 돌연변이, 치환, 삽입, 또는 결실을 갖는 것을 특징으로 한다.

인간 PRKN (또는 인간 파킨 단백질)에서의 돌연변이의 예는 c.81G>T, A42P, 엑손 2 결실, 엑손 2 중복, 255delA, 202-3delAG, A46P, Q34R, D53E, 엑손 30 40 bp del, 엑손 3 결실, R128K, 엑손 3-4 결실, 엑손 5-6 결실, 엑손 6 결실, T240M, R275W, R256C, I298L, 엑손 8 결실, P437A, 255delA, 엑손 3 40 bp 결실, R256C + 엑손 2-4 결실, 255delA+엑손 2-4 결실, 255delA +R275W, R42P + R275W, 202delAG + 엑손 3-4 결실, R42P + 엑손 3 결실, 엑손 3 40bp 결실, 엑손 3 40bp 결실 +엑손 4 결실, 엑손 3 결실 + 엑손 5 결실, 엑손 3 40bp 결실 +R275W, 엑손 3 결실 +엑손 12 결실, 엑손 3 40bp 결실 + G430D, 엑손 3-4 결실, G430D, 엑손 4 결실 + R275W, 엑손 4 결실+ R366Q, R275W + G430D, 엑손 7-8 중복, 엑손 10 결실, R275W +C212Y, C253W, R256C, R275W, 및 D280N, 엑손 7 돌연변이, 또는 그의 조합을 포함한다.

대상체는 전형적으로 포유동물, 바람직하게는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1개월 내지 10세의 연령 (예를 들어, 1개월, 2개월, 3개월, 4,개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 24개월, 3세, 4세, 5세, 6세, 7세, 8세, 9세, 10세, 또는 그 사이의 임의의 연령)이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 2세 내지 20세이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 30세 내지 100세이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 55세 초과이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용의 조성물은 CNS-연관 질환을 치료하는데 유용하다. CNS-연관 질환은 신경변성 질환, 시뉴클레인병증, 타우병증, 또는 리소솜 축적 질환일 수 있다. 신경변성 질환 및 그의 연관 유전자의 예가 표 2에 열거된다.

"시뉴클레인병증"은 1) (예를 들어, 건강한 대상체, 예를 들어 시뉴클레인병증을 갖지 않는 대상체에 비해) 대상체에서의 알파-시뉴클레인 (SNCA의 유전자 생성물)의 감소된 발현 또는 활성 또는 2) 독성 "기능 획득" 표현형을 발생시키는, (예를 들어, 건강한 대상체, 예를 들어 시뉴클레인병증을 갖지 않는 대상체에 비해) 대상체에서의 알파-시뉴클레인 (SNCA의 유전자 생성물)의 증가된 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 시뉴클레인병증 및 그의 연관 유전자의 예가 표 3에 열거된다.

"타우병증"은 1) (예를 들어, 타우병증을 갖지 않는 건강한 대상체에 비해) 대상체에서의 타우 단백질의 감소된 발현 또는 활성, 또는 2) "기능 획득" 표현형을 발생시키는, (예를 들어, 타우병증을 갖지 않는 건강한 대상체에 비해) 대상체에서의 타우 단백질의 증가된 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 지칭한다. 타우병증 및 그의 연관 유전자의 예가 표 4에 열거된다.

"리소솜 축적 질환"은 1) 대상체의 리소솜에서의 독성 세포 생성물의 비정상적 축적 또는 2) 리소솜에서의 특정 세포 생성물 (예를 들어, 리소솜 효소, 지질, 대사물 등)의 결핍 또는 비정상적 축적을 유발하는 대상체의 리소솜에서 발현되는 유전자 생성물의 부재를 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 리소솜 축적 질환 및 그의 연관 유전자의 예가 표 5에 열거된다.

일부 실시양태에서, 조성물은, 예를 들어 대상체의 뇌 및/또는 척수 내로의 직접 주사에 의해 대상체의 CNS에 직접 투여된다. CNS-직접 투여 양식의 예는 뇌내 주사, 뇌실내 주사, 수조내 주사, 실질내 주사, 척수강내 주사, 및 상기의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS 내로의 직접 주사는 대상체의 중뇌, 선조체 및/또는 뇌 피질에서 트랜스진 발현 (예를 들어, 인간 파킨 단백질의 발현)을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, CNS 내로의 직접 주사는 대상체의 척수 및/또는 CSF에서 트랜스진 발현 (예를 들어, 인간 파킨 단백질의 발현)을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS로의 직접 투여는 rAAV에 의한 대상체의 CNS 세포의 감염을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체의 CNS로의 직접 투여는 대상체의 CNS 세포에서 rAAV에 의해 코딩된 트랜스진 (예를 들어, 인간 PRKN 등)의 발현을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 소교 세포이다.

일부 실시양태에서, 대상체의 CNS에 대한 직접 주사는 대류 증진 전달 (CED)을 포함한다. 대류 증진 전달은 뇌의 외과적 노출 및 뇌의 표적 영역 내로의 직접적인 작은-직경 카테터의 배치, 이어서 대상체의 뇌로의 직접적인 치료제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 rAAV)의 주입을 수반하는 치료 전략이다. CED는, 예를 들어 문헌 [Debinski et al., (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27]에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 말초로, 예를 들어 말초 주사에 의해 투여된다. 말초 주사의 예는 피하 주사, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 복강내 주사, 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 말초 주사는 동맥내 주사, 예를 들어 대상체의 경동맥 내로의 주사이다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 말초적으로 및 대상체의 CNS에 직접적으로 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 대상체에게 조성물은 동맥내 주사 (예를 들어, 경동맥 내로의 주사) 및 실질내 주사 (예를 들어, CED에 의한 실질내 주사)에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, CNS에 대한 직접 주사 및 말초 주사는 동시이다 (예를 들어, 동일한 시간에 일어남). 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 전에 (예를 들어, 1분 내지 1주, 또는 그 초과 전에) 이루어진다. 일부 실시양태에서, 직접 주사는 말초 주사 후에 (예를 들어, 1분 내지 1주, 또는 그 초과 후에) 이루어진다.

대상체에게 투여되는 본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)의 양은 투여 방법에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 rAAV는 약 10⁹ 게놈 카피 (GC)/kg 내지 약 10¹⁴ GC/kg (예를 들어, 약 10⁹ GC/kg, 약 10¹⁰ GC/kg, 약 10¹¹ GC/kg, 약 10¹² GC/kg, 약 10¹² GC/kg, 또는 약 10¹⁴ GC/kg)의 역가로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 CSF 공간에 대한 주사에 의해 또는 실질내 주사에 의해 높은 역가 (예를 들어, rAAV의 >10¹² 게놈 카피 GC/kg)가 투여된다.

본 개시내용에 의해 기재된 바와 같은 조성물 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 벡터 또는 rAAV를 포함하는 조성물)은 대상체에게 1회 또는 다수회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20회 또는 그 초과) 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체에게 예를 들어 주입 펌프를 통해 연속적으로 (예를 들어, 만성적으로) 투여된다.

표 2: 신경변성 질환의 예

표 3: 시뉴클레인병증의 예

표 4: 타우병증의 예

표 5: 리소솜 축적 질환의 예

실시예

실시예 1: rAAV 벡터

세포, 예컨대 삼중-플라스미드 형질감염을 위한 HEK293 세포 또는 바큘로바이러스-기반 생산을 위한 SF9 세포를 사용하여 AAV 벡터를 생성한다. ITR 서열은 인간 PRKN 단백질 (예를 들어, 서열식별번호: 2 또는 3), 3' 폴리A 신호, 및 번역후 신호, 예컨대 WPRE 요소를 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터/인핸서 요소를 포함하는 발현 구축물에 플랭킹된다. 도 1은 인간 파킨을 코딩하는 rAAV 벡터를 코딩하는 플라스미드의 한 실시양태를 보여준다.

실시예 2: 검정

일부 실시양태에서, 핵산 조성물 (예를 들어, 본 출원 전반에 걸쳐 기재된 1종 이상의 핵산)에 의해 코딩된 단백질 (예를 들어, PRKN 단백질)의 발현 및/또는 활성은 1종 이상의 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 하기 단락은 핵산 및/또는 단백질 발현 및/또는 활성을 평가하는데 사용될 수 있는 검정의 비제한적 예를 제공한다.

a. mRNA 및 단백질 발현 검정

리포펙타민 2000을 사용하여 50ng 플라스미드 DNA/웰의 플라스미드 L00310 (서열식별번호: 2를 포함함, 또한 optParkA로도 지칭됨) 및 L00311 (서열식별번호: 3을 포함함, 또한 optParkB로도 지칭됨)로 HeLa 세포를 형질감염시켰다. 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. optParkA 및 optParkB의 mRNA 및 단백질 발현을 측정하였다. mRNA 발현 측정을 위해, 세포를 용해시키고, 셀즈-투-씨티(cells-to-ct) 키트를 사용하여 cDNA를 제조하였다. qRT-PCR 검정은 SYBR 그린을 사용하여 수행하였다 (도 2a). qRT-PCR 검정을 위한 역방향 프라이머는 optParkA 및 optParkB에 대해 상이하였다. 단백질 발현 측정을 위해, 세포를 용해시키고, 압캠(Abcam) 인간 파킨 단순 단계 ELISA 키트를 사용하여 검정하였다 (도 2b). 결과는 optParkB 단백질 발현이 optParkA의 2배 초과임을 보여준다.

b. 단백질 국재화 검정

리포펙타민 2000을 사용하여 100ng L00311(optParkB)로 HeLa 세포를 형질감염시키고, 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 미토콘드리아에 대해 염색하고, 고정시키고, 핵 및 파킨에 대해 염색하였다. 도 3의 결과는 염색된 세포 핵을 세포의 중심에서 큰 둥근 구역으로, 미토콘드리아를 담회색으로 보여준다. optParkB 단백질 (도 3에서 별표 "*"로 표시된, 세포질 내의 더 짙은 회색 구역)은 형질감염된 세포의 세포질에 국재화된다.

c. 미토콘드리아 스트레스 검정

리포펙타민 2000을 사용하여 웰당 10ng L00311 (optParkB)로 HeLa 세포를 형질감염시키고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포에 메나디온을 48시간째에 투여하고, 형질감염 72시간 후에 MTT 검정을 완료하였다 (도 4a). 결과는 10ng 파킨으로 형질감염된 HeLa 세포가 60uM 메나디온 용량에서 더 낮은 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다 (도 4b). 5ng 또는 20ng 파킨 형질감염에 의해 유의차는 관찰되지 않았다. 50ng 파킨 형질감염에서는 세포 독성이 관찰되었다.

등가물

본 발명의 적어도 한 실시양태의 여러 측면을 이와 같이 기재하였지만, 다양한 변경, 변형, 및 개선이 용이하게 이루어질 것임이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 인지되어야 한다. 이러한 변경, 변형, 및 개선은 본 개시내용의 일부인 것으로 의도되고, 본 발명의 취지 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 상세한 설명 및 도면은 단지 예이다.

본 발명의 여러 실시양태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 기능을 수행하고/거나 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 수득하기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 각각의 이러한 변경 및/또는 변형은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 구성이 예시적인 것으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 구체적 적용 또는 적용들에 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 실시양태는 단지 예로서 제시되고, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 등가물의 범주 내에서, 본 발명은 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 본원에 기재된 각각의 개별 특색, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 2개 이상의 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특색, 시스템, 물품, 물질, 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는다면, 본 발명의 범주 내에 포함된다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 단수형은, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "및/또는"은 이와 같이 연결된 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다", 즉 일부 경우에는 합동으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용되는 경우에, 한 실시양태에서는, B가 없는 A (B 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서는, A가 없는 B (A 이외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서는, A 및 B 둘 다 (다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.

명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 다수의 또는 열거된 요소 중 적어도 하나를 포함할 뿐만 아니라 하나 초과를 포함하고, 임의로 추가의 열거되지 않은 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 대조적으로 명백하게 나타내어진 유일 용어, 예컨대 "중 오직 하나" 또는 "중 정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 때, "로 이루어진"은 다수의 또는 열거된 요소 중 정확히 하나의 요소를 포함한다는 것을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에 사용된 용어 "또는"은 "어느 하나", "중 하나", "중 오직 하나" 또는 "중 정확히 하나"와 같은 배타성의 용어가 선행될 때 오직 배타적 대안 (즉, "하나 또는 다른 것, 그러나 둘 다는 아님")을 나타내는 것으로 해석될 것이다. "본질적으로 이루어진"은 청구범위에 사용될 때 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 그의 통상의 의미를 가질 것이다.

요소 또는 요소들과 관련하여 "포함하는", "갖는", "비롯한" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용한 본 발명의 임의의 측면 또는 실시양태의 본원에서의 기재는 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 그러한 특정한 요소 또는 요소들로 "이루어지거나", "본질적으로 이루어지거나", 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 측면 또는 실시양태에 대한 지지를 제공하는 것으로 의도된다 (예를 들어, 특정한 요소를 포함하는 것으로 본원에 기재된 조성물은 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥에 의해 명백하게 모순되지 않는 한, 그러한 요소로 이루어진 조성물을 또한 기재하는 것으로 이해되어야 함).

하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서 요소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인되는 요소 이외의 요소가 임의로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는 (및 임의로 B 이외의 요소를 포함하는), 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A; 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는 (및 임의로 A 이외의 요소를 포함하는), 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B; 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.

청구범위에서, 뿐만 아니라 상기 명세서에서, 모든 연결 어구, 예컨대 "포함하는", "비롯한", "보유하는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "수용하는" 등은 개방형인 것으로, 즉 포함하나 이에 제한되지는 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 오직 연결 어구 "로 이루어진" 및 "로 본질적으로 이루어진"만이 각각 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같은 폐쇄형 또는 반-폐쇄형 연결 어구일 것이다.

청구범위에서 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하여 청구범위 요소를 수식하는 것은 그 자체로 한 청구범위 요소의 또 다른 것에 대한 임의의 우선순위, 우위 또는 순서, 또는 방법의 행위가 수행되는 시간적 순서를 내포하는 것이 아니라, 단지 특정 명칭을 갖는 한 청구범위 요소를 (서수 용어의 사용이 없다면) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소와 구별하여 청구범위 요소를 구별하기 위한 라벨로서 사용된다.

또한, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행동을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행동의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 행동이 언급된 순서로 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다.

서열

일부 실시양태에서, 1종 이상의 유전자 생성물 (예를 들어, 제1, 제2 및/또는 제3 유전자 생성물)을 코딩하는 발현 카세트는 서열식별번호: 1-5 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다 (또는 이를 갖는 펩티드를 코딩한다). 일부 실시양태에서, 유전자 생성물은 서열식별번호: 1-5 중 어느 하나의 부분 (예를 들어, 단편)을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나 또는 그에 의해 코딩된다.

>인간 파킨 아미노산 서열 (서열식별번호: 1)

>인간 파킨 핵산 서열; 코돈-최적화됨 (서열식별번호: 2)

>인간 파킨 핵산 서열; 코돈-최적화됨 (서열식별번호: 3)

>인간 파킨 야생형 핵산 서열 (서열식별번호: 4)

>야생형 AAV2 ITR 핵산 서열 (서열식별번호: 5)

SEQUENCE LISTING <110> PREVAIL THERAPEUTICS, INC. <120> AAV VECTORS ENCODING PARKIN AND USES THEREOF <130> P1094.70015WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/060,353 <151> 2020-08-03 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Val Phe Val Arg Phe Asn Ser Ser His Gly Phe Pro Val Glu 1 5 10 15 Val Asp Ser Asp Thr Ser Ile Phe Gln Leu Lys Glu Val Val Ala Lys 20 25 30 Arg Gln Gly Val Pro Ala Asp Gln Leu Arg Val Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Glu Leu Arg Asn Asp Trp Thr Val Gln Asn Cys Asp Leu Asp Gln Gln 50 55 60 Ser Ile Val His Ile Val Gln Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gln Glu Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Gly Gly Asp Asp Pro Arg Asn Ala Ala Gly Gly Cys Glu 85 90 95 Arg Glu Pro Gln Ser Leu Thr Arg Val Asp Leu Ser Ser Ser Val Leu 100 105 110 Pro Gly Asp Ser Val Gly Leu Ala Val Ile Leu His Thr Asp Ser Arg 115 120 125 Lys Asp Ser Pro Pro Ala Gly Ser Pro Ala Gly Arg Ser Ile Tyr Asn 130 135 140 Ser Phe Tyr Val Tyr Cys Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Gln Pro Gly 145 150 155 160 Lys Leu Arg Val Gln Cys Ser Thr Cys Arg Gln Ala Thr Leu Thr Leu 165 170 175 Thr Gln Gly Pro Ser Cys Trp Asp Asp Val Leu Ile Pro Asn Arg Met 180 185 190 Ser Gly Glu Cys Gln Ser Pro His Cys Pro Gly Thr Ser Ala Glu Phe 195 200 205 Phe Phe Lys Cys Gly Ala His Pro Thr Ser Asp Lys Glu Thr Ser Val 210 215 220 Ala Leu His Leu Ile Ala Thr Asn Ser Arg Asn Ile Thr Cys Ile Thr 225 230 235 240 Cys Thr Asp Val Arg Ser Pro Val Leu Val Phe Gln Cys Asn Ser Arg 245 250 255 His Val Ile Cys Leu Asp Cys Phe His Leu Tyr Cys Val Thr Arg Leu 260 265 270 Asn Asp Arg Gln Phe Val His Asp Pro Gln Leu Gly Tyr Ser Leu Pro 275 280 285 Cys Val Ala Gly Cys Pro Asn Ser Leu Ile Lys Glu Leu His His Phe 290 295 300 Arg Ile Leu Gly Glu Glu Gln Tyr Asn Arg Tyr Gln Gln Tyr Gly Ala 305 310 315 320 Glu Glu Cys Val Leu Gln Met Gly Gly Val Leu Cys Pro Arg Pro Gly 325 330 335 Cys Gly Ala Gly Leu Leu Pro Glu Pro Asp Gln Arg Lys Val Thr Cys 340 345 350 Glu Gly Gly Asn Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Phe Cys Arg Glu Cys 355 360 365 Lys Glu Ala Tyr His Glu Gly Glu Cys Ser Ala Val Phe Glu Ala Ser 370 375 380 Gly Thr Thr Thr Gln Ala Tyr Arg Val Asp Glu Arg Ala Ala Glu Gln 385 390 395 400 Ala Arg Trp Glu Ala Ala Ser Lys Glu Thr Ile Lys Lys Thr Thr Lys 405 410 415 Pro Cys Pro Arg Cys His Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Gly Cys Met 420 425 430 His Met Lys Cys Pro Gln Pro Gln Cys Arg Leu Glu Trp Cys Trp Asn 435 440 445 Cys Gly Cys Glu Trp Asn Arg Val Cys Met Gly Asp His Trp Phe Asp 450 455 460 Val 465 <210> 2 <211> 1395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgattgttt tcgtcagatt caatagttcc cacgggttcc ctgtcgaggt ggacagtgat 60 actagcatct tccagctgaa agaagtggtg gcgaagcggc agggagttcc tgcagaccaa 120 ctgagggtca ttttcgccgg caaggagctg aggaacgatt ggactgtgca gaactgtgac 180 cttgatcagc agagtatcgt tcacatagtg cagcgcccgt ggaggaaggg gcaggagatg 240 aacgcaacgg gcggggacga ccccagaaat gctgcggggg gttgcgagcg ggaacctcag 300 tctctgactc gggtggacct gtctagctct gtgctcccag gtgatagcgt tggcctcgct 360 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335 Arg Arg Lys Asp Ser Ser Glu Glu Ser Asp Ser Ser Glu Glu Ser Asp 340 345 350 Ile Asp Ser Glu Ala Ser Ser Ala Phe Phe Met Ala Lys Lys Lys Thr 355 360 365 Pro Pro Lys Arg Glu Arg Lys Pro Ser Gly Gly Ser Ser Arg Gly Asn 370 375 380 Ser Arg Pro Gly Thr Pro Ser Ala Glu Gly Gly Ser Thr Ser Ser Thr 385 390 395 400 Leu Arg Ala Ala Ala Ser Lys Leu Glu Gln Gly Lys Arg Val Ser Glu 405 410 415 Met Pro Ala Ala Lys Arg Leu Arg Leu Asp Thr Gly Pro Gln Ser Leu 420 425 430 Ser Gly Lys Ser Thr Pro Gln Pro Pro Ser Gly Lys Thr Thr Pro Asn 435 440 445 Ser Gly Asp Val Gln Val Thr Glu Asp Ala Val Arg Arg Tyr Leu Thr 450 455 460 Arg Lys Pro Met Thr Thr Lys Asp Leu Leu Lys Lys Phe Gln Thr Lys 465 470 475 480 Lys Thr Gly Leu Ser Ser Glu Gln Thr Val Asn Val Leu Ala Gln Ile 485 490 495 Leu Lys Arg Leu Asn Pro Glu Arg Lys Met Ile Asn Asp Lys Met His 500 505 510 Phe Ser Leu Lys Glu 515 <210> 13 <211> 3793 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 tctcattaga agtgaggcgg ggccggccaa atcgaatgga caccgggtaa ttagcagggt 60 tacccagata ctccagcacc tctttcccgt cggccgtgta cctgccattc acgtccatgc 120 cattgatggc cagcactgca tgacccactg cagaggtgaa gctaacggtc agcgaaggtg 180 cagcccgggg attccgccga ggggacaagg gacccgacac aacccctttt cccccaaccc 240 cgcacctaca accagcccac ttctacagca ctggggccct cccacccccg cacccgccac 300 gggcccgagc ctagcccacc tcggatgccg tcccgctggc cgaaagcaac caacacacgc 360 tcatcgtgta gcttgagcag cagatccagc ggataactga aagttttctc agcctcagcc 420 cgtggcgcgt agctgtccaa ctggtaaatc aagccgccag ctttgttcac cacatacaca 480 ctaaaaatcg ccatcgctgc cttgccgctc ggaaactggt attcagcctc tacccgacgg 540 cccctccccg gaaccgcatc acagcacttg ccgccggccc caccccagcc tcctcctcct 600 cctcctcctc ctcccgcgcc ccccgtgcag ccacctgctg cacttgcgca ctgggagcga 660 cacgctcggg cataagtagt gccgaaaagt tagctgccga gacctggtgg attgcttttc 720 gtttatcagt gcaggaaaac agcgctatag tactgcgtca caactagcgc agactccggc 780 agtatttagg cggtgcggct tgggaactag aatccacttc ctgtcttccg cctcaggcta 840 gagggcgagc gcttcgccgt gggacttctt ctgcctggct ccgcctcttg ccccggaagt 900 actcacagcg gacggtggtt tttgggcccg tttctgagca gcgcttcctt tttgtccgac 960 atcttgacga ggctgcggtg tctgctgcta ttctccgagc ttcgcaatgg taagcttcag 1020 gggtgtgaag tcgccggcgt tcttgggttt gaggactcag tggggagagc cttcggcggg 1080 agcgctcctt ggcctgccgg cctcggttgc agggcgggcg cggttattgc ttggcccatg 1140 tgctctggtg gtggagtttg cgggggctga gggcgcagta ttaggggact ttggcgctat 1200 ttgaggacct ggttgcattc ccgctgccct cctacagccg cctaaggacg acaagaagaa 1260 gaaggacgct ggaaagtcgg ccaagaaaga caaagaccca gtgaacaaat ccgggggcaa 1320 ggccaaaaag aaggtagaaa taagacctct ctgaaagaga ctaggggtaa ctctctcgta 1380 atcctctagt aataggtaac ttgtatagta agtggttttt caggtgtaga tttctagagt 1440 caaaatgtga gagtttatct tcccgtcacc actcgttctt tttcccatta ggatcatgaa 1500 aatgggtctg ttgtgcgaag tgtctgccgc tgtgcctgct gtgttatttt taactgatct 1560 agtggggctc ggcccctgtt tgaaggccaa aaacgtgtcg gtgttttttt tttgtttttg 1620 ttttagtaat gtgtaattta tccttgataa cggtggaaca gatttctctg acgcagatta 1680 ctcgagaggg aaagggtgct tctgccagaa atactaactt gtttctgttt tgttttggtg 1740 agcagaagtg gtccaaaggc aaagttcggg acaagctcaa taacttagtc ttgtttgaca 1800 aagctaccta tgataaactc tgtaaggaag ttcccaacta taaacttata accccagctg 1860 tggtctctga gagactgaag attcgaggct ccctggccag ggcagccctt caggagctcc 1920 ttagtaaagg tgaggggtgt atcctacatg tgtgtttttg taggttaaat tgtcttgacc 1980 atgttaagca tcttcagtgg ttttgctgga aaagcagaat taaaaaaaaa aagcgtggct 2040 tgaccattgg ctgttagtaa tgtaattctg acgtcttact cctgatcctg agatgaattc 2100 tcagggttct tagccacttt tgtgccgtgg accctgtggc agtttagtga agcccaagga 2160 tcttttatgt ttcgagtaaa tggatgcata gaattacagg gacaaccgtt tttgaaataa 2220 ttagattact attttgaaac aactttgaaa atgtttaaaa cctttatggt aaatattttg 2280 ttgatgtatt aaattttaaa accagaaatt tagtacggtc tactcagtag tatggtctga 2340 ttaccataat tccacaataa taaggctcag ctaactatag tgactgaacg tctataattc 2400 tagcactttg ggaggccaag gcgggtgaat caacggaggt caggagttaa agaccagcct 2460 ggccaatatg gtgaaaacct gctctactga aagttagctg gacgtggggg cacacgtctg 2520 taatcccagc tactcaggat gctgaggcat gaggatccct tgaacccagg agatggaggt 2580 ggcagtgagc cgagatgaca ccactgcact ccagccttag tgacagcaaa agactgtctc 2640 agaaaggggg ggggggtgga agataatgga gccctaattt aaaggaaaag taaggataga 2700 tgatccgtta aaaacttgga ttctcggtta ccgaacgtca gattaagcaa ttctggagcc 2760 aggtgcagtg gtacccttgt atttctagct acttgggagg ccaaagcagg aggatcattt 2820 gagccaagga gttttaagac cattctgggc acctctgaga gaactctgtc tttttgtttt 2880 ccttttcttt aaatagagat gcggttttgc catgttgccc aggctggtct cctgggctca 2940 agagatccac ctgtccaaag tgctgggatt acaggcatga gcctctgcac ccggccaaaa 3000 caaaccttac tagagtctca ttctgttgcc caggttggag tgcggagggg cagtcttggc 3060 tcaatgcaac caccaattcc tgggttcagg tggtcctcac ctcagcttcc caagtagctg 3120 gaattacaag catgtgccac catgcccagc taatttttgt atttttggta gagatggggt 3180 ttcaccttgt tggccaggct ggtgtgcaac tccttacctc aagctatctg cccgtctcca 3240 cctcccaaag cagtgggatt ataagcatga gccaccgcgc ccagccaaaa accttactag 3300 tttctattgt agcatctgtt aagcatctca tcgtgctatt ctctccccct aggacttatc 3360 aaactggttt caaagcacag agctcaagta atttacacca gaaataccaa gggtggagat 3420 gctccagctg ctggtgaaga tgcatgaata ggtgagtagg aatgtgtggg ctcatggtgt 3480 aggaggtaga tacaaagctt tatggttctg attcttttaa ttttttttta caggtccaac 3540 cagctgtaca tttggaaaaa taaaacttta ttaaatcaaa tgaatgagta tgtctgtttc 3600 ctaagaaaga caatgataaa gaatttggtg gaaggtataa taggggtttg ttgactttgc 3660 ttttagcctc atggtagttg gtagagagca tgattagctt ttttctgtat gtgactgctt 3720 cttcattgct gcagcttcag ttttgaattg atgtctgaaa ggaaataaag ggttaacacg 3780 atgatgaagg gtg 3793 <210> 14 <211> 6762 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 ggacggccga gcggcagggc gctcgcgcgc gcccactagt ggccggagga gaaggctccc 60 gcggaggccg cgctgcccgc cccctcccct ggggaggctc gcgttcccgc tgctcgcgcc 120 tgcgccgccc gccggcctca ggaacgcgcc ctcttcgccg gcgcgcgccc tcgcagtcac 180 cgccacccac cagctccggc accaacagca gcgccgctgc caccgcccac cttctgccgc 240 cgccaccaca gccaccttct cctcctccgc tgtcctctcc cgtcctcgcc tctgtcgact 300 atcaggtgaa ctttgaacca ggatggctga gccccgccag gagttcgaag tgatggaaga 360 tcacgctggg acgtacgggt tgggggacag gaaagatcag gggggctaca ccatgcacca 420 agaccaagag 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atcttagcaa cgtccagtcc aagtgtggct caaaggataa 2160 tatcaaacac gtcccgggag gcggcagtgt gcaaatagtc tacaaaccag ttgacctgag 2220 caaggtgacc tccaagtgtg gctcattagg caacatccat cataaaccag gaggtggcca 2280 ggtggaagta aaatctgaga agcttgactt caaggacaga gtccagtcga agattgggtc 2340 cctggacaat atcacccacg tccctggcgg aggaaataaa aagattgaaa cccacaagct 2400 gaccttccgc gagaacgcca aagccaagac agaccacggg gcggagatcg tgtacaagtc 2460 gccagtggtg tctggggaca cgtctccacg gcatctcagc aatgtctcct ccaccggcag 2520 catcgacatg gtagactcgc cccagctcgc cacgctagct gacgaggtgt ctgcctccct 2580 ggccaagcag ggtttgtgat caggcccctg gggcggtcaa taattgtgga gaggagagaa 2640 tgagagagtg tggaaaaaaa aagaataatg acccggcccc cgccctctgc ccccagctgc 2700 tcctcgcagt tcggttaatt ggttaatcac ttaacctgct tttgtcactc ggctttggct 2760 cgggacttca aaatcagtga tgggagtaag agcaaatttc atctttccaa attgatgggt 2820 gggctagtaa taaaatattt aaaaaaaaac attcaaaaac atggccacat ccaacatttc 2880 ctcaggcaat tccttttgat tcttttttct tccccctcca tgtagaagag ggagaaggag 2940 aggctctgaa agctgcttct gggggatttc aagggactgg gggtgccaac cacctctggc 3000 cctgttgtgg gggtgtcaca gaggcagtgg cagcaacaaa ggatttgaaa cttggtgtgt 3060 tcgtggagcc acaggcagac gatgtcaacc ttgtgtgagt gtgacggggg ttggggtggg 3120 gcgggaggcc acgggggagg ccgaggcagg ggctgggcag aggggagagg aagcacaaga 3180 agtgggagtg ggagaggaag ccacgtgctg gagagtagac atccccctcc ttgccgctgg 3240 gagagccaag gcctatgcca cctgcagcgt ctgagcggcc gcctgtcctt ggtggccggg 3300 ggtgggggcc tgctgtgggt cagtgtgcca ccctctgcag ggcagcctgt gggagaaggg 3360 acagcgggta aaaagagaag gcaagctggc aggagggtgg cacttcgtgg atgacctcct 3420 tagaaaagac tgaccttgat gtcttgagag cgctggcctc ttcctccctc cctgcagggt 3480 agggggcctg agttgagggg cttccctctg ctccacagaa accctgtttt attgagttct 3540 gaaggttgga actgctgcca tgattttggc cactttgcag acctgggact ttagggctaa 3600 ccagttctct ttgtaaggac ttgtgcctct tgggagacgt ccacccgttt ccaagcctgg 3660 gccactggca tctctggagt gtgtgggggt ctgggaggca ggtcccgagc cccctgtcct 3720 tcccacggcc actgcagtca ccccgtctgc gccgctgtgc tgttgtctgc cgtgagagcc 3780 caatcactgc ctatacccct catcacacgt cacaatgtcc cgaattccca gcctcaccac 3840 cccttctcag taatgaccct ggttggttgc aggaggtacc tactccatac tgagggtgaa 3900 attaagggaa ggcaaagtcc aggcacaaga gtgggacccc agcctctcac tctcagttcc 3960 actcatccaa ctgggaccct caccacgaat ctcatgatct gattcggttc cctgtctcct 4020 cctcccgtca cagatgtgag ccagggcact gctcagctgt gaccctaggt gtttctgcct 4080 tgttgacatg gagagagccc tttcccctga gaaggcctgg ccccttcctg tgctgagccc 4140 acagcagcag gctgggtgtc ttggttgtca gtggtggcac caggatggaa gggcaaggca 4200 cccagggcag gcccacagtc ccgctgtccc ccacttgcac cctagcttgt agctgccaac 4260 ctcccagaca gcccagcccg ctgctcagct ccacatgcat agtatcagcc ctccacaccc 4320 gacaaagggg aacacacccc cttggaaatg gttcttttcc cccagtccca gctggaagcc 4380 atgctgtctg ttctgctgga gcagctgaac atatacatag atgttgccct gccctcccca 4440 tctgcaccct gttgagttgt agttggattt gtctgtttat gcttggattc accagagtga 4500 ctatgatagt gaaaagaaaa aaaaaaaaaa aaaaggacgc atgtatcttg aaatgcttgt 4560 aaagaggttt ctaacccacc ctcacgaggt gtctctcacc cccacactgg gactcgtgtg 4620 gcctgtgtgg tgccaccctg ctggggcctc ccaagttttg aaaggctttc ctcagcacct 4680 gggacccaac agagaccagc ttctagcagc taaggaggcc gttcagctgt gacgaaggcc 4740 tgaagcacag gattaggact gaagcgatga tgtccccttc cctacttccc cttggggctc 4800 cctgtgtcag ggcacagact aggtcttgtg gctggtctgg cttgcggcgc gaggatggtt 4860 ctctctggtc atagcccgaa gtctcatggc agtcccaaag gaggcttaca actcctgcat 4920 cacaagaaaa aggaagccac tgccagctgg ggggatctgc agctcccaga agctccgtga 4980 gcctcagcca cccctcagac tgggttcctc tccaagctcg ccctctggag gggcagcgca 5040 gcctcccacc aagggccctg cgaccacagc agggattggg atgaattgcc tgtcctggat 5100 ctgctctaga ggcccaagct gcctgcctga ggaaggatga cttgacaagt caggagacac 5160 tgttcccaaa gccttgacca gagcacctca gcccgctgac cttgcacaaa ctccatctgc 5220 tgccatgaga aaagggaagc cgcctttgca aaacattgct gcctaaagaa actcagcagc 5280 ctcaggccca attctgccac ttctggtttg ggtacagtta aaggcaaccc tgagggactt 5340 ggcagtagaa atccagggcc tcccctgggg ctggcagctt cgtgtgcagc tagagcttta 5400 cctgaaagga agtctctggg cccagaactc tccaccaaga gcctccctgc cgttcgctga 5460 gtcccagcaa ttctcctaag 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ggctccagac acacagcctg tgcttttgga gctgagatca 6360 ctcgcttcac cctcctcatc tttgttctcc aagtaaagcc acgaggtcgg ggcgagggca 6420 gaggtgatca cctgcgtgtc ccatctacag acctgcagct tcataaaact tctgatttct 6480 cttcagcttt gaaaagggtt accctgggca ctggcctaga gcctcacctc ctaatagact 6540 tagccccatg agtttgccat gttgagcagg actatttctg gcacttgcaa gtcccatgat 6600 ttcttcggta attctgaggg tggggggagg gacatgaaat catcttagct tagctttctg 6660 tctgtgaatg tctatatagt gtattgtgtg ttttaacaaa tgatttacac tgactgttgc 6720 tgtaaaagtg aatttggaaa taaagttatt actctgatta aa 6762

Claims (55)

1. 인간 파킨 단백질 (PRKN)을 코딩하는 발현 구축물을 포함하는 단리된 핵산으로서, 여기서 인간 PRKN 단백질은 코돈-최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 단리된 핵산.
2. 제1항에 있어서, 인간 PRKN 단백질이 서열식별번호: 1에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 부분을 포함하는 것인 단리된 핵산.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인간 PRKN 단백질을 코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열이 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 것인 단리된 핵산.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구축물이 코돈-최적화된 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 것인 단리된 핵산.
5. 제4항에 있어서, 프로모터가 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터인 단리된 핵산.
6. 제5항에 있어서, 프로모터가 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터, CAG 프로모터, 또는 JeT 프로모터인 단리된 핵산.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 구축물이 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역전된 말단 반복부 (ITR)에 플랭킹된 것인 단리된 핵산.
8. 제7항에 있어서, AAV ITR이 AAV1 ITR, AAV2 ITR, AAV3 ITR, AAV4 ITR, AAV5 ITR, 및 AAV6 ITR로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 것인 단리된 핵산.
9. 제8항에 있어서, AAV ITR이 AAV2 ITR인 단리된 핵산.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
11. 제10항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
12. 제10항에 있어서, 바이러스 벡터이고, 임의로 여기서 바이러스 벡터는 재조합 AAV (rAAV) 벡터 또는 바큘로바이러스 벡터인 벡터.
13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
14. 제13항에 있어서, 포유동물 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 또는 곤충 세포이고, 임의로 인간 세포인 숙주 세포.
15. (i) 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 핵산 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 벡터
    를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
16. 제15항에 있어서, 캡시드 단백질이 혈액-뇌 장벽을 가로지를 수 있는 것인 rAAV.
17. 제16항에 있어서, 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질 또는 그의 변이체인 rAAV.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 중추 신경계 (CNS)의 뉴런 세포 및/또는 비-뉴런 세포를 형질도입하는 rAAV.
19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 벡터, 제13항 또는 제14항의 숙주 세포, 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV를 포함하는 조성물.
20. 제19항에 있어서, 제약 조성물이고, 여기서 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
21. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 트랜스진을 중추 신경계의 세포에 전달하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 투여가 CNS 조직 내로의 직접 주사인 방법.
23. 제21항에 있어서, 투여가 말초 투여이고, 임의로 여기서 말초 투여는 정맥내 주사인 방법.
24. 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 벡터, 제13항 또는 제14항의 숙주 세포, 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV, 또는 제19항 또는 제20항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 투여가 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함하며, 임의로 여기서 직접 주사는 뇌내 주사, 실질내 주사, 척수강내 주사, 대수조내 (ICM) 주사 또는 그의 임의의 조합인 방법.
26. 제25항에 있어서, 대상체의 CNS에 대한 직접 주사가 대류 증진 전달 (CED)을 포함하는 것인 방법.
27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 말초 주사를 포함하고, 임의로 여기서 말초 주사는 정맥내 주사인 방법.
28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 PRKN 유전자에서 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
29. 제28항에 있어서, PRKN 유전자에서의 돌연변이가 뉴클레오티드 치환, 결실, 또는 스플라이스 부위 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
30. 5'에서 3' 순서로
    (a) 5' AAV ITR;
    (b) CMV 인핸서;
    (c) CBA 프로모터;
    (d) 서열식별번호: 2 또는 3의 핵산 서열에 의해 코딩된 PRKN 단백질을 코딩하는 트랜스진;
    (e) WPRE;
    (f) 소 성장 호르몬 폴리A 신호 테일; 및
    (g) 3' AAV ITR
    을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터.
31. (i) AAV 캡시드 단백질; 및
    (ii) 제30항의 rAAV 벡터
    를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
32. 제31항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 AAV9 캡시드 단백질인 rAAV.
33. 제30항의 rAAV 벡터를 포함하는 플라스미드.
34. 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 바큘로바이러스 벡터.
35. (i) 1종 이상의 아데노-연관 바이러스 rep 단백질 및/또는 1종 이상의 아데노-연관 바이러스 cap 단백질을 코딩하는 제1 벡터; 및
    (ii) 서열식별번호: 2 또는 3에 제시된 핵산 서열을 포함하는 제2 벡터
    를 포함하는 세포.
36. 제35항에 있어서, 제1 벡터가 플라스미드이고, 제2 벡터가 플라스미드인 세포.
37. 제35항에 있어서, 포유동물 세포이고, 임의로 여기서 포유동물 세포는 HEK293 세포인 세포.
38. 제35항에 있어서, 제1 벡터가 바큘로바이러스 벡터이고, 제2 벡터가 바큘로바이러스 벡터인 세포.
39. 제38항에 있어서, 곤충 세포이고, 임의로 여기서 곤충 세포는 SF9 세포인 세포.
40. (i) 1종 이상의 아데노-연관 바이러스 rep 단백질 및/또는 1종 이상의 아데노-연관 cap 단백질을 코딩하는 제1 벡터, 및 서열식별번호: 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 세포에 전달하는 단계;
    (ii) 세포를 rAAV의 패키징을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
    (iii) rAAV의 수집을 위해 배양된 숙주 세포 또는 배양 배지를 수거하는 단계
    를 포함하는, 제31항 또는 제32항의 rAAV를 생산하는 방법.
41. 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 제31항 또는 제32항의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는, 파킨슨병을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법.
42. 제41항에 있어서, 투여가 대상체의 CNS에 대한 직접 주사를 포함하고, 임의로 여기서 직접 주사는 뇌내 주사, 실질내 주사, 척수강내 주사, 대수조내 주사 또는 그의 임의의 조합인 방법.
43. 제42항에 있어서, 대상체의 CNS에 대한 직접 주사가 대류 증진 전달 (CED)을 포함하는 것인 방법.
44. 제41항에 있어서, 투여가 말초 주사를 포함하고, 임의로 여기서 말초 주사는 정맥내 주사인 방법.
45. 세포를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 미토콘드리아 기능장애를 교정하는 방법.
46. 제45항에 있어서, 접촉시키는 것이, 세포에서 산화성 스트레스를 감소시키고/거나 세포에서 미토파지를 증가시키기에 충분한 양의 단리된 핵산, 벡터, 또는 rAAV의 양과 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인 방법.
48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 PRKN 유전자에서 1개 이상의 돌연변이, 삽입, 또는 결실을 포함하는 것인 방법.
50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 시험관내 세포인 방법.
51. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체 내 세포인 방법.
52. 제51항에 있어서, 대상체 내 세포를 접촉시키는 것이 대상체에게 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 핵산, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 rAAV를 말초 주사를 통해 투여하는 것에 의하며, 임의로 여기서 말초 주사는 정맥내 주사인 방법.
53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 발생한 후, 미토콘드리아 기능장애가 접촉 전의 세포에서의 미토콘드리아 기능장애에 비해 세포에서 적어도 1%만큼 감소되는 것인 방법.
54. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-인간 포유동물인 방법.
55. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.

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