SK286900B6 - Spôsob prípravy rekombinantných vírusov a rekombinantný vírus - Google Patents

Spôsob prípravy rekombinantných vírusov a rekombinantný vírus Download PDF

Info

Publication number
SK286900B6
SK286900B6 SK666-99A SK66699A SK286900B6 SK 286900 B6 SK286900 B6 SK 286900B6 SK 66699 A SK66699 A SK 66699A SK 286900 B6 SK286900 B6 SK 286900B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
baculovirus
genome
recombinant
region
defective
Prior art date
Application number
SK666-99A
Other languages
English (en)
Other versions
SK66699A3 (en
Inventor
H�L�Ne Leblois-Prehaud
Michel Perricaudet
Emmanuelle Vigne
Patrice Yeh
Original Assignee
Gencell Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9497899&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK286900(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gencell Sa filed Critical Gencell Sa
Publication of SK66699A3 publication Critical patent/SK66699A3/sk
Publication of SK286900B6 publication Critical patent/SK286900B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pens And Brushes (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Opísaný je spôsob prípravy defektných rekombinantných vírusov spočívajúci v tom, že sa do populácie kompetentných buniek zavedie genóm defektného rekombinantného vírusu a bakulovírus obsahujúci všetky alebo niektoré funkcie nutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného vírusu. Ďalej je opísaný rekombinantný bakulovírus na uskutočňovanie tohto spôsobu a tiež výsledný vírus.

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka spôsobu prípravy rekombinantných vírusov. Týka sa tiež konštruktov potrebných na uskutočnenie takéhoto spôsobu, prípravy buniek a vírusu pripraveného týmto spôsobom. Tieto vírusy sa môžu použiť ako vektory na klonovanie a/alebo expresiu génov in vitro, ex vivo alebo in vivo.
Doterajší stav techniky
Vektory vírusového pôvodu sa široko využívajú na klonovanie, prenos a expresiu génov in vitro (na prípravu rekombinantných proteínov, na uskutočňovanie skríningu a testov, na výskum regulácie génov a podobne), ex vivo alebo in vivo (na vytvárame zvieracích modelov, na terapeutické použitie). K takýmto vírusom patria najmä adenovírusy, adeno-asociované vírusy (AAV), retrovírusy, herpetické vírusy alebo vírus vakcínie.
Vírusová čeľaď Adenoviridae je značne rozšírená u cicavcov a vtákov a patrí do nej viac ako sto sérotypov, ktoré sú tvorené dvojvláknovou DNA bez obalu a vytvárajú kapsidu s ikozaedrickou symetriou (Horwitz, In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Third edition ed. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Okrem toho, že sú bezpečné, majú adenovírusy tiež široký bunkový tropizmus. Na rozdiel od retrovírusov, ktorých životný cyklus závisí od bunkového delenia, môžu infikovať tak aktívne sa deliace bunky, ako aj bunky v pokoji a ich genóm sa udržuje v epizomálnej forme. Navyše môžu byť produkované vo veľmi vysokom titri (10ir pfu/ml). Tieto hlavné vlastnosti z nich robia zvlášť výhodný vektor na klonovanie a expresiu heterológnych génov. Skupina C adenovírusov, najmä typy 2 a 5, a tiež psí adenovírus typu CAV-2, ktorého molekulárna biológia je najlepšie známa, sú zdrojom dnes bežne používaných vektorov.
Adenovírus má lineárny genóm s veľkosťou 36 kb, ktorý je na každom konci ukončený invertovanou terminálnou repetíciou (ITR), čo je sekvencia s veľkosťou 103 bp obsahujúca replikačný počiatok, a obsahuje tiež enkapsidačný signál situovaný v blízkosti ľavej ITR (Shenk, Adenoviridae: The viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Third edition ed. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2111-2148). V priebehu životného cyklu vírusu sa exprimujú tri rodiny génov:
- Bezprostredne skoré gény („immediate-early genes“, El, E2, E3 a E4), ktoré sa zúčastňujú na regulácii bunkových génov, najmä umožňujú vstup bunky do S fázy bunkového cyklu (E1A) a inhibujú apoptózu (E1B). Podieľajú sa tiež na regulácii skorých alebo neskorých vírusových génov na úrovni transkripcie, zostrihu alebo transportu (E1A, E2A, E4) mRNA (messenger RNA). Hrajú tiež úlohu pri replikácii a pri vzniku imunitnej odpovede.
- Oneskorené skoré gény („delayed-early genes“, pIX a IVa2) sú spojené s reguláciou transkripcie neskorých génov (IVa2) alebo s vytváraním viriónov (pIX).
- Neskoré gény („late genes“, L1 až L5) sa transkribujú zo silného promótora (MLP). Primárny transkript s veľkosťou 28 kb umožňuje vytvárať transkripty zodpovedajúce rôznym štruktúrnym proteínom (jadrový proteín, pentón, hexón) a neštruktúmym proteínom, ktoré sa podieľajú na vytváraní a zrení vírusových častíc tak, že dochádza k alternatívnemu zostrihu s využitím 5-polyadenylačného miesta.
Adenovírusové vektory sa využili na klonovanie a expresiu génov in vitro (Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York 11724, p. 187), na vytvorenie transgénnych zvierat (WO95/22616), na prenos génov do buniek ex vivo (WO95/14785); W095/06120) a na prenos génov do buniek in vivo (pozri najmä WO93/19191, WO94/24297, W094/08026).
Čo sa týka adeno-asociovaných vírusov, AAV, sú to relatívne malé DNA vírusy, ktoré sa integrujú do genómu infikovaných buniek stálym a relatívne lokálne-špecifickým spôsobom. Sú schopné infikovať široké spektrum buniek bez toho, aby nejako ovplyvnili bunkový rast, diferenciáciu a morfológiu. Zdá sa, že sa doteraz u nich neprejavili žiadne patologické účinky na človeka. Genóm AAV bol klonovaný, sekvenovaný a opísaný. Obsahuje asi 4700 bp a na každom konci má úsek invertovanej terminálnej repetície (ITR) s veľkosťou 145 bp, ktorý slúži ako replikačný počiatok pre vírus. Zvyšok genómu je rozdelený do dvoch nevyhnutných častí, ktoré nesú enkapsidačnú funkciu: ľavá časť genómu obsahuje gén rep, ktorý sa zúčastňuje na vírusovej replikácii a expresii vírusových génov a pravá časť genómu obsahuje gén cap, kódujúci proteíny vírusovej kapsidy.
Použitie vektorov odvodených od AAV na prenos génov in vitro a in vivo už bolo opísané (pozri predovšetkým WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 4488 528).
Retrovírusy sú integratívne vírusy, ktoré selektívne infikujú deliace sa bunky. Predstavujú preto zaujímavé vektory na použitie napríklad pri liečbe rakoviny alebo restenóz. Genóm retrovírusov sa skladá z dvoch LTR, enkapsidačnej sekvencie a troch kódujúcich úsekov (gag, pol a env). Konštrukcia rekombinantných vektorov a ich použitie in vitro a in vivo už bola podrobne opísaná (pozri napríklad Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP453242, EP 178220, Berstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689).
SK 286900 Β6
Z vírusov sa už pripravili rôzne konštrukty na použitie ako rekombinantné vektory obsahujúce rôzne požadované gény. V každom z týchto konštruktov sa vírusový genóm modifikoval tak, aby vírus nebol schopný autonómnej replikácie v infikovaných bunkách. Takže doteraz známe konštrukty zodpovedajúce doterajšiemu stavu techniky sú vírusy, ktoré sú defektné v určitej oblasti svojho genómu, ktorá je nevyhnutná na replikáciu. Konkrétne čo sa týka adenovírusov, prvá generácia konštruktov mala deléciu v úseku E1 alebo deletovaný celý úsek El, ktorý je nevyhnutný na vírusovú replikáciu, a to v mieste, kde bola vložená heterológna sekvencia DNA (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Okrem toho, na zlepšenie vlastností takéhoto vektora sa navrhlo vytvoriť iné delécie alebo modifikácie adenovírusového genómu. Tak sa napríklad vniesla teplotné senzitívna mutácia do mutanta tsl25, čo umožnilo inaktivovať DNA väzbový proteín (DBP) s veľkosťou 72 kD (Van der Vliet et al., 1975). Iné vektory obsahujú delécie iných oblastí nevyhnutných na vírusovú replikáciu a/alebo šírenie, a síce oblasti E4. Adenovírusové vektory, ktoré majú odstránené oblasti El a E4, majú značne redukovaný transkripčný „šum“, a tiež expresiu vírusových génov. Takéto vektory sú napríklad opísané v patentových prihláškach WO94/28152, WO95/02697, WO96/22378. Boli tiež opísané vektory nesúce modifikácie na úrovni génu IVa2 (W096/10088). Okrem toho boli tiež opísané (WO94/12649, WO94/28152, WO95/02697) tzv. „minimálne adenovírusy“ alebo „pseudoadenovírusové“ vektory (alternatívne AdA), ktoré obsahujú len úseky nevyhnutné v cis na produkciu vírusu (ITR a enkapsidačná sekvencia) a nemajú žiadnu vírusovú kódujúcu sekvenciu, hoci príprava takýchto vektorov je ťažká, ako bude vysvetlené ďalej.
Čo sa týka AAV, opisovaným vektorom všeobecne chýba celá kódujúca oblasť Rep a Cap, ktoré sú nahradené požadovanou nukleovou kyselinou.
V rekombinantných vektoroch odvodených od retrovirusov sú všeobecne odstránené gag, pol a env, buď čiastočne alebo úplne, a sú nahradené heterológnou sekvenciou požadovanej nukleovej kyseliny. Okrem toho rekombinantné retrovírusy môžu obsahovať modifikácie na úrovni LTR na potlačenie transkripčnej aktivity a na úrovni veľkej enkapsidačnej sekvencie, obsahujúcej časť génu gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
Vzhľadom na ich defektný charakter vo vzťahu k replikácii, príprava týchto rôznych rekombinantných vírusov zahŕňa možnosť transkomplementácie funkcií odstránených z genómu. A práve transkomplementácia, zvlášť poskytovanie transkomplementačných funkcií, je zdrojom hlavných ťažkostí pri príprave týchto vírusov.
Vyvinuli sa dva prístupy riešenia tohto problému. Prvý je založený na konštrukcii transkomplementačných línií, čiže v podstate enkapsidačných línií. Druhý prístup je založený na použití pomocného („helper“) adenovírusu alebo pomocného plazmidu.
Skonštruovali sa rôzne enkapsidačné línie rôznych defektných vírusov. Tieto línie sú schopné poskytnúť funkciu, ktorá chýba vírusovému vektoru. Všeobecne tieto línie obsahujú vo svojom genóme integrované úseky odstránené z vírusového genómu (teda napríklad El, E2 a/alebo E4 pri adenovírusoch, gag, pol a/alebo env pri retrovírusoch a rep a/alebo cap pri AAV).
Jedna línia známa tým, že produkuje defektné adenovírusy, je línia 293, do ktorej sa integrovala časť adenovírusového genómu. Podrobnejšie povedané, línia 293 je línia buniek ľudských embryonálnych obličiek, ktorá obsahuje ľavý koniec (asi 11 až 12 %) genómu adenovírusu sérotypu 5 (Ad5), ktorý obsahuje ľavú ITR, enkapsidačný úsek, úsek El vrátane Ela a Elb, úsek kódujúci proteín pIX a časť úseku kódujúceho proteín pIVa2. Táto línia je schopná transkomplementovať rekombinantný adenovírus defektný v úseku El, ktorému chýba buď celý úsek E1, alebo jeho časť, a produkovať vírus s vysokým titrom. Táto línia je tiež schopná produkovať v permisívnej teplote (32 °C) vírus, obsahujúci navyše teplotné senzitívnu mutáciu E2. Sú opísané aj ďalšie bunkové línie schopné komplementovať El, založené na ľudských bunkách pľúcneho karcinómu A549 (WO94/28152) alebo ľudských retinoblastoch (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Sú tiež opísané línie schopné komplementovať niekoľko funkcií adenovírusu. Treba uviesť najmä línie komplementujúce úseky El a E4 (Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559; Cancer Gen. Ther. (1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575 a línie komplementujúce úseky El a E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/27071).
Sú tiež opísané rôzne línie produkujúce defektné retrovírusy, všeobecne schopné exprimovať gény gag, pol a env. K takýmto líniám patrí napríklad línia PA317 (US 4,861,719), línia PsiCRIP (W090/02806), línia GP+envAm-12 (W089/07150) alebo línia BOSC (WO94/19478) a ďalšie. Na konštrukciu rekombinantných retrovirusov obsahujúcich požadovanú nukleovú kyselinu, je potrebné skonštruovať plazmid obsahujúci najmä LTR, enkapsidačné sekvencie a danú nukleovú kyselinu, a potom použiť tento konštrukt na transfekciu enkapsidačnej línie, ako už bolo opísané, schopnej poskytnúť v trans retrovírusové funkcie chýbajúce plazmidu. Produkované retrovírusy sa potom purifikujú zvyčajnou technikou.
Použitie línií má určité nevýhody. Tak napríklad je náročné, nákladné a veľmi obmedzujúce konštruovať a overovať takéto línie v priemyselnom meradle. Pritom tieto línie by mali byť zlučiteľné s priemyselným využitím. Okrem toho, tieto línie sotva zabránia produkcii replikujúcich sa kontaminujúcich vírusov (RCA). Navyše tieto línie neumožňujú v súčasnosti komplementovať v miere dostatočnej na priemyselné využitie
SK 286900 Β6 vysoko defektné vírusy, ako sú napríklad minimálne adenovírusy opísané skôr. Adenovírusy majú genóm organizovaný do rôznych transkripčných jednotiek, ktoré majú veľmi zložitú časopriestorovú reguláciu. Preto doteraz nebola možná dostatočná transkomplementácia adenovírusov, z ktorých boli odstránené všetky vírusové kódujúce sekvencie tým, že by sa separátne exprimovali všetky transkripčné jednotky buď konštitutívnym, alebo podmieneným spôsobom pomocou bunkovej línie. Takže doteraz sa konštitutívne exprimovali pomocou bunkových línií len malé úseky genómu zodpovedajúce úsekom El, E4, a pIX, a trom proteínom kódovaným E2 (pol, DBP, p-TP). Zvyšok genómu zodpovedá hlavnej neskorej transkripčnej jednotke (MLTU), ktorá produkuje všetky transkripty pre štruktúrne a neštruktúme proteíny primárneho transkriptu s veľkosťou 28 kb a aktivuje sa po replikácii genómu. Na vytvorenie minimálneho adenovírusu je transkomplementácia týchto úsekov nevyhnutná.
Druhý prístup spočíva v spoločnej transfekcii (kotransfekcii) defektným vírusovým genómom a konštruktom (plazmidom alebo adenovírusom) poskytujúcim komplementačné funkcie. Všeobecne sa najmä defektné rekombinantné AAV pripravujú v bunkovej línii infikovanej ľudským pomocným vírusom (napríklad adenovírusom) kotransfekciou plazmidom obsahujúcim požadovanú nukleovú sekvenciu ohraničenú dvoma úsekmi invertovanej terminálnej repetície (ITR) z AAV a plazmidom nesúcim AAV komplementačné funkcie (gény rep a cap). Varianty sú opísané v prihláškach WO95/14771; WO95/13365; WO95/13395 alebo WO95/06743. Nevýhoda použitia pomocného adenovírusu spočíva hlavne vo zvýšenom riziku rekombinácie medzi adenovírusovým vektorom a pomocným adenovírusom a tiež v náročnosti oddeliť rekombinant od pomocného vírusu v priebehu produkcie a purifikácie vírusových kmeňov. Nevýhoda použitia pomocného plazmidu, napríklad plazmidu Rep/cap, spočíva v získanom stupni transfekcie, ktorý neumožňuje produkovať vysoké titre vírusu.
Podstata vynálezu
Predložený vynález poskytuje nový systém na produkciu vírusov, ktorý umožňuje prekonať uvedené nevýhody. Systém podľa vynálezu je založený na tom, že na poskytnutie komplementačných funkcií sa používa bakulovírus.
Produkčný systém podľa vynálezu umožňuje zaobísť sa, a to zvlášť výhodným spôsobom, bez použitia zavedených komplementačných línií, vyhnúť sa problémom s RCA a transkomplementovať vysoko defektné genómy. Okrem toho je systém podľa vynálezu použiteľný pre každú bunku schopnú infekcie požadovaným vírusom a bakulovírusom, a teda ponúka veľmi flexibilné použitie.
Prvý predmet vynálezu teda spočíva v spôsobe prípravy defektných rekombinantných vírusov, podľa ktorého sa do populácie kompetentných buniek zavedie genóm defektného rekombinantného vírusu a bakulovírus obsahujúci všetky alebo niektoré funkcie nutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu. Spôsob podľa vynálezu je teda založený na použití bakulovírusu na zaistenie komplementačných funkcií. Existujú rôzne prístupy. Predovšetkým sa môžu použiť kompetentné bunky, ktoré neexprimujú žiadnu transkomplementačnú funkciu defektného rekombinantného genómu. V tomto prípade sa môže použiť buď bakulovírus obsahujúci všetky funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu, alebo niekoľko bakulovírusov, z ktorých každý nesie jednu alebo viac funkcií nevyhnutných na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu. Môže sa tiež použiť populácia kompetentných buniek, ktoré sú už samé schopné transkomplementovať jednu alebo viac funkcií defektného rekombinantného genómu (enkapsidačné línie). V tomto prípade použitý(-é) bakulovírus(-y) zaistia len funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu, ktoré ešte nie sú transkomplementované kompetentnými bunkami.
Ako sa už uviedlo, mnohé výhody systému podľa vynálezu sú významné tak na priemyselnú využiteľnosť (žiadna potreba línií, žiadne kontaminujúce vírusy, RCA a podobne), ako aj na aplikácie (produkcia rekombinantných vírusov nesúcich akýkoľvek typ delécie, najmä vysoko defektných rekombinantných adenovírusov). Navyše, keďže sa bakulovírus nereplikuje v ľudských bunkách, získané vírusové prípravky nie sú kontaminované bakulovírusom. Okrem toho je bakulovírus fylogenetický od adenovírusov veľmi vzdialený, teda medzi týmito vírusmi nie je žiadne riziko rekombinácie alebo transkomplementácie. Tento systém teda umožňuje produkovať výhodným spôsobom koncentrované kmene defektných vírusov, bez RCA. Systém je najvýhodnejší najmä na produkciu defektných rekombinantých adenovírusov.
Bakulovírusy sú opuzdrené, cirkuláme dvojvláknové DNA vírusy špecifické pre stavovce. Ich prototyp, AcNVP, má genóm s veľkosťou 133 kb. Využíva sa ako vektor na expresiu eukaryotických génov v hmyzích bunkách, začína dvoma silnými promótormi (polyhedrm (Ph) a P10), (King a Possee, The baculovirus expression systém. London: Chapman a Halí, 1992). AcNPV je schopný infikovať niektoré cicavčie bunky, ale genóm sa ani transkribuje, ani translatuje. Nedávno Hoíman a kol. (PNAS 92 (1992) 10099) ukázali, že hepatocyty sa môžu in vitro transdukovať purifikovaným rekombinantným bakulovírusom expiimujúcim gén LacZ. Bunková toxicitasa nezistila , ani pri násobku infekcie 1000, a účinnosť transfekcie opísaná v tomto článku je približne 50 % pri MOI100.
Pôvodca teraz ukázal, že rekombinatnými bakulovírusmi sa dajú infikovať rôzne bunkové typy. Pôvodca konkrétne ukázal, že rekombinantnými bakulovírusmi sa dajú infikovať bunky ľudského pôvodu, ako sú imortalizované embryonálne bunky. Pôvodca tiež ukázal, že sa dá získať veľmi vysoká účinnosť transdukcie (viac ako 80 %). Pôvodca ďalej ukázal, že sa do bakulovírusu dajú zaviesť funkcie na komplementáciu adenovírusu a exprimovať tieto funkcie v populácii buniek. Pôvodca teda poskytol dôkaz, že bakulovírus tvorí inertný vektor, ktorý sa môže výhodne použiť na prenos a expresiu vírusových komplementačných funkcií do cicavčích, najmä ľudských buniek. Ďalšími výhodami systému vynálezu sú najmä:
(i) veľká klonovacia kapacita, ktorá umožňuje komplementovať celý adenovírusový genóm, a (ii) pokročilý rozvoj technológie bakulovírusov.
Bakulovírus nesúci funkcie na komplementáciu vírusu sa v nasledujúcom texte označuje tiež ako pomocný bakulovírus. Môže obsahovať rôzne funkcie na komplementáciu vírusu.
Tak pomocný bakulovírus môže obsahovať úsek E1 adenovírusu. Bakulo-El sa môže použiť na produkciu prvej generácie adenovirusov, t. j. adenovirusov defektných v úseku E1 (AdAEl), bez ohľadu na stav ich E3 (t. j. defektne AdAEl,ΔΕ3, či nie). Produkcie prvej generácie defektných rekonibinantých adenovirusov (defektných v úseku E1 a prípadne E3), tvoria prvú zvlášť výhodnú aplikáciu spôsobu podľa vynálezu. Akosa už uviedlo, v literatúre sú opísané rôzne línie, ktoré sú schopné transkomplementácie funkcie E1 (bunky 293, bunky 911, a podobne). Ale medzi úsekom nesúcim transkomplementačné funkcie, ktoré sú integrované do genómu línie, a DNA rekombinantného vírusu, ktorú je žiaduce produkovať, existujú rôzne oblasti homológie. Preto môžu nastať v priebehu produkcie rôzne rekombinácie, vytvárajúce replikatívne vírusové častice, najmä typu E1+ adenovirusov. Môže to byť jediná rekombinantná udalosť nasledovaná zlomom chromozómu, alebo dvojitá rekombinácia. Tieto dva typy modifikácie vedú k reintegrácii úseku E1 obsiahnutého v bunkovom genóme do jeho počiatočného lokusu v adenovírusovom genóme. Navyše pri daných vysokých titroch rekombinantného vektora, ktoré produkuje línia 293 (väčšie ako 1012), je pravdepodobnosť, že tieto rekombinantné javy nastanú, vysoká. Skutočne sa pozorovalo, že početné série defektných rekombinantých adenovirusových vektorov prvej generácie boli kontaminované replikatívnymi vírusovými časticami, ktoré tak môžu predstavovať hlavnú nevýhodu na farmaceutické využitie. Výskyt takýchto častíc v terapeutických prípravkoch by skutočne mohol vyvolať in vivo nekontrolované rozmnožovanie vírusu a jeho šírenie s rizikom zápalovej reakcie, rekombinácie a podobne. Kontaminované série sa potom nemôžu použiť v humánnej terapii.
Predložený vynález umožňuje prekonať tieto nevýhody. V jednom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sa genóm rekombinantného adenovírusu defektného v úseku El, prípadne E3, zavedie do kompetentných buniek, tieto bunky sa infikujú, simultánne alebo inak, bakulovírusom obsahujúcim úsek El, pričom úsek El adenovírusu prítomný v bakulovíruse a genóm defektného rekombinantného adenovírusu neobsahujú žiadnu oblasť homológie (prekryvu) schopnú vyvolať rekombináciu. Podľa tohto uskutočnenia sa teda dajú rýchlo produkovať, bez potreby zavedenej línie, kmene prvej generácie rekombinantých adenovirusov bez RCA. Okrem toho, ako je uvedené ďalej, kmene takto vzniknutých rekombinantných adenovirusov bez RCA, sa môžu použiť ako počiatočný materiál na novú produkciu spoločnou infekciou kompetentných buniek bakulovírusom.
Pomocný bakulovírus môže tiež obsahovať úsek E2 adenovírusu, úplný alebo čiastočný, najmä úsek E2 a/alebo E2b. Bakulo-E2b sa môže použiť na produkciu adenovirusov defektných v úseku E2 (Ad-AE2) a prípadne v úseku E3 (Ad-AE2 a ΔΕ3) v kompetentných bunkách. Navyše v kompetentných bunkách schopných komplementácie úseku El adenovírusu môže bakulo-E2 umožniť produkciu rekombinantých adenovirusov defektných v úsekoch El a E2 (Ad-ΔΕΙ a ΔΕ2) a pripadne E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ2,ΔΕ3). Podobne v kompetentných bunkách schopných komplementácie úsekov El a E4 adenovírusu (napríklad v bunkách IGRP2) môže bakulo-E2 umožniť produkciu rekombinantých adenovirusov defektných v úsekoch El, E2 a E4 (Ad-ΔΕ1,ΔΕ2,ΔΕ4) a prípadne E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ2,ΔΕ3,ΔΕ4).
Pomocný bakulovírus môže tiež obsahovať úsek E4 (úplný alebo časť) adenovírusu. Bakulo-E4 sa môže použiť na produkciu, adenovirusov defektných v úseku E4 (Ad-AE4) a prípadne v úseku E3 (Αύ-ΔΕ4,ΔΕ3) v kompetentných bunkách. Navyše v kompetentných bunkách schopných komplementácie úseku El adenovírusu môže bakulo-E4 umožniť produkciu rekombinantých adenovirusov defektných v úsekoch El a E4 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4) a prípadne E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4,ΔΕ3).
Pomocný bakulovírus môže tiež obsahovať úseky El a E4 (úplné alebo časti) adenovírusu. Bakulo-El a E4 sa môže použiť na to, aby v kompetentných bunkách produkoval adenovírusy defektné v úsekoch El a E4 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4) a prípadne E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4.ΔΕ3), ako je uvedené na obrázku 1.
Okrem toho sa na prípravu vírusov defektných v úsekoch El a E4 môžu tiež použiť dva pomocné bakulovírusy, jeden úplne alebo čiastočne exprimujúci funkciu El a druhý funkciu E4.
Rovnako môže pomocný bakulovírus obsahovať úseky El, E2 a E4 (úplne alebo časti) a prípadne úseky nesúce neskoré gény (L1 až L5).
Pomocný bakulovírus môže tiež obsahovať úseky AAV Rep a/alebo Cap. Bakulo-Rep/Cap tak umožňuje komplementovať v línii kompetentných buniek genóm AAV, ktorý postráda akúkoľvek kódujúcu vírusovú sekvenciu (obrázok 5).
Bakulovírus môže tiež obsahovať úseky gag, pol a/alebo env retrovírusu. Bakulo-gag/pol/env tak umožňuje komplementovať v línii kompetentných buniek retrovírusový genóm postrádajúci akúkoľvek kódujúcu vírusovú sekvenciu.
Môže sa použiť aj bakulovírus obsahujúci úseky gag/pol a druhý bakulovírus obsahujúci úsek env.
Všeobecne je výhodné, keď sa genóm defektného rekombinantného vírusu a komplementačné úseky prítomné v bakulovíruse neprekrývajú. To skutočne umožňuje vyhnúť sa rizikám rekombinácie, a tak vzniku RCA. To je zvlášť dôležité na vznik prvej generácie adenovírusov (Ad-ΔΕΙ). V tomto prípade je úsek E1 zavedený do bakulovírusu definovaný tak, že nemá žiadnu spoločnú sekvenciu s rekombinantým genómom. Aby sa tak stalo, je možné napríklad odstrániť z rekombinantného genómu úsek väčší ako komplementačný úsek vložený do bakulovírusu, ako je ukázané v príkladoch. To je výhodné tiež na vznik adenovírusu Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4.
Teda v určitom uskutočnení vynálezu sa genóm defektného rekombinantného vírusu zavedie do kompetentných buniek, tieto bunky sa infikujú, súčasne či inak, bakulovírusom obsahujúcim všetky alebo niektoré funkcie nevyhnutné na komplementárnu defektného genómu, pričom komplementačné funkcie prítomné v bakulovíruse a genóme defektného rekombinantného vírusu neobsahujú žiadnu oblasť homológie schopnú vyvolať rekombináciu. Výhodne je vírusový genóm rekombinantný adenovirusový genóm defektný v úseku E1 a bakulovírus nesie úsek adenovírusu schopný transkomplementácie úseku El. Podľa iného variantu je vírusový genóm rekombinantný adenovirusový genóm defektný v úsekoch El a E4 a bakulovírus nesie dva adenovírusové úseky schopné transkomplementácie uvedených úsekov alebo sa použijú dva bakulovirusy, jeden nesúci úsek adenovírusu schopný transkomplementácie úseku El a druhý úsek adenovírusu schopný transkomplementácie úseku E4, bez úseku homológie s defektným adenovírusovým genómom.
Podľa špecifického uskutočnenia vynálezu všetky kódujúce úseky adenovírusu nesie jeden alebo viaceré pomocné bakulovirusy. Podľa iného uskutočnenia sa použije len jeden pomocný bakulovírus obsahujúci všetky kódujúce úseky adenovírusu. Takýto pomocný bakulovírus sa môže teda použiť na transkomplementáciu minimálneho rekombinantného adenovírusu. Takýto bakulovírus môže obsahovať konkrétne celý adenovírusový genóm s výnimkou enkapsidačného úseku a prípadne ITR, ako je ukázané v príkladoch.
Príprava komplementačných funkcii
Komplementačné funkcie zavedené do pomocného bakulovírusu môžu pochádzať z vírusov rôznych sérotypov.
Čo sa týka adenovírusov, existujú rôzne sérotypy, ktorých štruktúra a vlastnosti sa líšia, ale ktoré prejavujú porovnateľné genetické usporiadanie. Konkrétne komplementačné funkcie použité na konštrukciu bakulovírusov podľa vynálezu pochádzajú z adenovírusu ľudského alebo zvieracieho pôvodu.
Čo sa týka adenovírusov ľudského pôvodu, môžu sa spomenúť najmä adenovírusy zaradené do skupiny C. Výhodne sa v rámci predloženého vynálezu medzi rôznymi sérotypmi ľudských adenovírusov uprednostňuje použitie adenovírusu typu 2 alebo 5 (Ad2 alebo Ad5). Môžu sa tiež použiť úseky pochádzajúce z adenovírusu typu 7 alebo 12, patriacich do skupín A a B. Medzi rôznymi adenovirusmi zvieracieho pôvodu sa v rámci vynálezu uprednostňuje použitie adenovírusov psieho pôvodu, najmä všetkých kmeňov adenovírusov CAV2 (kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800). Ďalšie adenovírusy zvieracieho pôvodu sú konkrétne uvedené v prihláške WO94/26914, na ktorú sa týmto odkazuje.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu pochádza komplementačná funkcia z genómu ľudského adenovírusu skupiny C. Výhodne pochádza z genómu adenovírusu Ad2 alebo Ad5.
Úseky nesúce rôzne komplementačné funkcie sa môžu získať z adenovírusového genómu enzýmovým štiepením odborníkom známymi metódami. Tieto úseky sa môžu voliteľne modifikovať tak, aby sa zmenšila ich veľkosť, alebo aby sa nahradili určité regulačné prvky (promótor, zosilňovač a podobne) heterológnymi prvkami. Všeobecne sa tieto úseky pripravia nasledujúcim spôsobom: DNA adenovírusu sa purifikuje centrifugáciou v gradiente chloridu cézneho alebo sa získa in vitro z prokaryotického (WO96/25506) alebo eukaryotického (W095/03400) plazmidu. DNA sa potom štiepi príslušnými reštrikčnými enzýmami a identifikujú a vyberú sa získané fragmenty nesúce požadované komplementačné funkcie. Výber použitých reštrikčných enzýmov závisí od požadovaných reštrikčných funkcií. Výber sa teda riadi reštrikčnými mapami a publikovanými sekvenciami adenovírusových genómov. Tak sa môže izolovať úsek El vo forme fragmentov nesúcich všetky čítacie rámce E1A a E1B v smere od promótora E1A. Úsek E4 sa môže izolovať vo forme fragmentov nesúcich celé čítacie rámce alebo len ich časť, výhodne rámce ORF3 alebo ORF6, alebo ORF6-ORF6/7.
Podobné metódy sa použili na prípravu komplementačných úsekov AAV a rekombinantných retrovírusov. Úseky AAV rep a/alebo cap sa tak môžu získať enzýmovým štiepením z vírusovej DNA izolovanej z rôznych sérotypov AAV. To je výhodne AAV-2. Pri retrovírusoch sa môžu úseky gag, pol a/alebo env získať tiež obvyklými technikami molekulárnej biológie z rôznych retrovírusov, ako sú najmä MoMuLV („Mu
SK 286900 Β6 rine Moloney Leukaemia Vírus“, vírus myšej Moloneyovej leukémie, tiež nazývaný MoMLV), MSV („Murine Moloney Sarcoma Vírus“, vírus myšieho Moloneyho sarkómu), HaSV („Harvey sarcoma Vírus“, vírus Harveyovho sarkómu); SNV („Spleen Necrosis Vírus“, vírus nekrózy sleziny), RSV („Rous Sarcoma Vírus“, vírus Rousovho sarkómu), alebo Friendov vírus.
Konštrukcia pomocného bakulovírusu
Fragmenty nesúce komplementačné úseky sa potom subklonujú do plazmidového vektora umožňujúceho ich ďalšiu manipuláciu (jemnejšie štiepenie, PCR, pridanie regulačných sekvencií a podobne), napríklad v prokaryotickom alebo eukaryotickom organizme. Získaný konečný fragment kódujúci komplementačnú funkciu(e) sa potom vnesie do pomocného bakulovírusu s použitím zvyčajných techník molekulárnej biológie. Fragment sa špecificky klonuje medzi dve sekvencie homológne k úseku genómu bakulovírusu, a potom sa výsledný fragment alebo plazmid kotransfekuje s genómom bakulovírusu do hmyzích buniek (zvyčajne buniek Sf9 a SF21 (Spodoptera frugiperda), ale tiež buniek Tn-368 a High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Gibco) (Trichopulsia) alebo do akejkoľvek hmyzej bunky permisívnej pre bakulovírusy a schopnej použitia na ich produkciu). Homologickou rekombináciou medzi plazmidom alebo fragmentom a genómom bakulovírusu vzniká požadovaný rekombinantný bakulovírus, ktorý sa môže znovu získať a puiifikovať bežnými metódami (pozri najmä King a Possee: The Baculovirus Expression Systém. London: Chapman a Halí, 1992). Na konštrukciu rekombinantých bakulovírusov sú komerčne dostupné rôzne súpravy obsahujúce kyvadlové vektory a môžu sa použiť podľa odporúčania výrobcov. Najmä je možné použiť kyvadlové vektory dodávané spoločnosťou Clontech, vektory pAc (Verne et al., Bio/Technology, 6 (1988) 47, Pharmingen, USA), vektory pBlue-Bac (Invitrogen) alebo vektory pBSV (Boehringer). Komplementačné funkcie sa teda môžu vložiť na rôzne miesta bakulovírusu, hlavne do lokusu polyhedrínového génu alebo génu p 10. Okrem toho sa môžu použiť rôzne kmene bakulovírusov, ako je konkrétne AcNPV alebo Bombyx mori (Maeda et al., Náture, 315 (1988) 592). Ďalej sa môže použiť bakulovírus modifikovaný, aby sa zvýšil/zmenil jeho tropizmus. Tropizmus vírusových vektorov sa môže modulovať modifikáciou ich povrchových proteínov tak, že sa (i) obmedzí fúzia vírusových proteínov so špecifickým ligandom (ľahký reťazec imunoglobulínu, peptid uvoľňujúci gastrín), alebo (ii) rozšíri tvorením pseudotypov s heterológnym vírusovým glykoproteínom (G vírusu pľuzgierikovej stomatitídy, „Vesicular Stomatitis Vírus“ (VSV)), (Liu et al„ J. Virol 70(4) (1996) 2497; Michael et al., Gene Ther. 2 (1995) 660). Nedávno sa dokázalo, že povrchový glykoproteín bakulovírusu (gp64) fuzovaný s gpl20 vírusu HIV sa viazal na receptor CD4 (Boublik et al., Bio/Technology, 13 (1995) 1079). Táto modifikácia gp64 neovplyvňuje životaschopnosť bakulovírusu v hmyzích bunkách. Podobný konštrukt s G z VSV by umožnil zosilniť tropizmus bakulovírusu k cicavčím bunkám, a teda zvýšiť transdukčnú účinnosť buniek Huh7, ako aj iných bunkových línií.
Pri pomocných vírusoch sú komplementačné funkcie výhodne umiestnené tak, že sú pod kontrolou heterológneho promótora (t. j. iného pôvodu ako bakulovírusového), ktorý je funkčný v kompetentných bunkách. Skutočne sa zdá, že bakulovírusové promótory neumožňujú získať postačujúce hladiny expresie komplementačných funkcií v bunkách iného ako hmyzieho pôvodu, a nie sú preto najvhodnejšie na aplikácie vynálezu. Promótor môže byť predovšetkým doterajší promótor (homologícký promótor) komplementačných funkcií vírusu (El A, E4, E2, MLP promótor adenovírusu, P5 alebo P19 promótory z AAV, LTR promótor z RSV, a podobne). Môže to byť tiež akýkoľvek promótor odlišného pôvodu, ktorý je funkčný v použitých kompetentných bunkách. Na tento účel možno spomenúť napríklad promótory génov exprimovaných v tejto bunke alebo známe bežné promótory, ako je napríklad promótor génu PGK, skorý promótor CMV, promótor génu TK herpesvírusu alebo alternatívne LTR promótor z RSV. Môže to byť tiež regulovaný promótor, ako napríklad promótor vírusu MMTV, promótor odpovedajúci na hormóny, napríklad typu GRE5, alebo promótor regulovaný tetracyklínom. Výhodne to je indukovateľný alebo silný, bežný homologícký promótor.
Ďalší predmet predloženého vynálezu sa týka rekombinantného bakulovírusu, ktorý obsahuje vo svojom genóme vloženú nukleovú kyselinu kódujúcu komplementačnú funkciu vírusu umiestnenú pod kontrolu heterológneho promótora. Konkrétnejšie, komplementačná funkcia je proteín nevyhnutný na produkciu uvedeného vírusu, ktorého kódujúci úsek je v defektom vírusovom genóme inaktívny (mutovaný, deletovaný a podobne). Pri adenovírusoch sa komplementačná funkcia vyberá hlavne zo všetkých alebo niektorých funkcií kódovaných úsekmi El, E2, E4, L1 až L5, pIX a IVa2 adenovírusu, samotných alebo v kombinácii. Pri AAV sú to funkcie kódované úsekmi Rep a/alebo Cap a pri retrovírusoch gag, pol a/alebo env. Nukleová kyselina výhodne zodpovedá úseku vírusového genómu obsahujúcemu úsek kódujúci vybratú komplementačnú funkciu. Je to zvlášť fragment genómu adenovírusu sérotypu Ad2 alebo Ad5, MoMLV alebo AAV-2. Zvlášť výhodne obsahuje nukleová kyselina tiež úsek promótora, ktorý je prirodzene zodpovedný za expresiu vybratej komplementačnej funkcie.
Ako špecifický príklad predloženého vynálezu sa dá uviesť bakulovírus obsahujúci celý alebo časť úseku El adenovírusu. Je to hlavne bakulovírus obsahujúci úsek Ela, Elb alebo Ela a Elb. Úsek El adenovírusu je lokalizovaný na úrovni nukleotidov 104 (promótor Ela) až 4070 (polyA Elb) z Ad5. Konkrétne je TATA
SK 286900 Β6 box promótora Ela lokalizovaný na úrovni nukelotidu 470, ATG kodón Ela na úrovni nukleotidu 560 a stop kodón na úrovni nukleotidu 3511. Ako presný príklad sa môže spomenúť bakulovírus obsahujúci fragment 391 až3511. Tento pomocný bakulovírus je zvlášť vhodný na produkciu rekombinantých adeno vírusov defektných v úseku El, nesúcich deléciu väčšiu, ako je tento fragment 391 až 3511. Je vhodný hlavne na produkciu prvej generácie adenovírusov bez RCA nesúcich deléciu v úseku El pokrývajúcu nukleotidy 383 až 3512 vrátane.
Ďalším špecifickým príkladom vynálezu je bakulovírus, ktorý obsahuje napríklad všetky alebo niektoré úseky El a E4 adenovírusu. Úsek E4 adenovírusu sa skladá zo 7 otvorených čítacích rámcov označených ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 a ORF6/7. Zdá sa, že z proteínov kódovaných týmito rôznymi ORF, tie proteíny, ktoré sú tvorené ORF3 a ORF6, umožňujú „replikáciu“ vírusu, a teda transkomplementáciu adenovírusov defektných v úseku alebo dokonca v celom E4. Teda výsledný pomocný bakulovírus podľa vynálezu výhodne obsahuje celý úsek E4 alebo len jeho časť obsahujúcu aspoň rámec ORF3 alebo ORF6. Rôzne časti úseku E4 sa môžu získať enzýmovým štiepením alebo modifikovať odborníkom známymi metódami. Konkrétne čítací rámec ORF6 sa môže izolovať z úseku E4 vo forme fragmentu BglII-PvuI, zodpovedajúcemu nukleotidom 34115 až 33126 z genómu Ad5. Bakulovírus môže tiež obsahovať celé čítacie rámce ORF1-ORF7 (napríklad vo forme fragmentu 32800 až 35826 alebo 32811 až 35614 alebo 32811 až 35640). Je jasné, že ďalšie fragmenty sa môžu určiť na základe publikovaných sekvencií adenovirusových genómov. Použitie bakulovírusov nesúcich redukovanú jednotku úseku E4 je výhodné, lebo umožňuje transkomplementáciu defektného adenovírusového genómu nesúceho väčšiu deléciu úseku E4, teda bez oblasti homológie, a zabráni akejkoľvek možnosti rekombinácie.
Podľa prvého uskutočnenia vynálezu sa nukleová kyselina kódujúca komplementačnú frinkciu(e) zavedie do pomocného bakulovírusu vo forme expresnej kazety. Toto uskutočnenie je najjednoduchšie na použitie. Je výhodné hlavne na produkciu rekombinantných adenovírusov defektných v skorých génoch a na produkciu defektných rekombinantých AAV a retrovírusov.
Podľa ďalšieho uskutočnenia sa nukleová kyselina kódujúca komplementačnú funkciu(e) zavedie do pomocného bakulovírusu vo forme vyštiepiteľnej kazety vytvárajúcej replikatívnu molekulu v kompetentnej bunke. Replikácia kazety v bunke umožňuje výhodne zvýšiť počet kópií komplementujúcich génov, a tak zvýšiť produkčné hladiny systému. Toto uskutočnenie je vhodné hlavne na produkciu veľmi vysoko defektných rekombinantých adenovírusov, defektných konkrétne v štruktúrnych génoch. Toto uskutočnenie je zvlášť vhodné na produkciu „minimálnych“ adenovírusov. Kvantita štruktúrneho proteínu je skutočne limitujúcim faktorom produkcie vysokých titrov vysoko defektných adenovírusov (typu minimálneho adenovírusu). Toto uskutočnenie po prvýkrát umožňuje podstatne zvýšiť intraceluláme hladiny transkomplementačných proteínov, najmä štruktúrnych proteínov adenovírusu (kódovaných úsekmi LI až L5), až na hladiny kompatibilné s transkomplementáciou minimálnych adenovírusov.
Pôvodca teda ukázal, že je možné konštruovať rekombinantné bakulovírusy obsahujúce heterológny úsek, ktorý sa dá v bunke vyštiepiť, výhodne indukovateľným a regulovaným spôsobom, aby vznikla cirkuláma a replikatívna molekula (epizomálneho typu).
Excízia (vyštiepenie) sa výhodne uskutočňuje miestne špecifickým rekombinačným mechanizmom a replikácia v bunke je vyvolaná replikačným počiatkom nezávisle od stavu bunkového delenia.
Výhodnejšia sa miestne špecifická rekombinácia použitá v spôsobe podľa vynálezu získa pomocou dvoch špecifických sekvencií, ktoré sú schopné vzájomnej rekombinácie v prítomnosti špecifického proteínu, všeobecne nazývaného rekombináza. Tieto špecifické sekvencie usporiadané v príslušnej orientácii ohraničujú v bakuloviruse sekvencie kódujúce komplementačné funkcie. Predmetom vynálezu je teda tiež rekombinantný bakulovírus obsahujúci vložený do svojho genómu aspoň jeden úsek DNA ohraničený dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne-špecifickú rekombináciu a umiestnený v priamej orientácii. Uvedený úsek DNA obsahuje aspoň jeden replikačný počiatok funkčný v kompetentných bunkách a nukleovú kyselinu kódujúcu komplementačnú funkciu vírusu.
Sekvencie umožňujúce rekombináciu, ktoré sa použijú podľa vynálezu, všeobecne obsahujú od 5 do 100 bázových párov, výhodnejšie menej ako 50 bázových párov. Môžu patriť do rôznych štruktúrnych skupín, hlavne do rodiny rekombinázy P1 bakteriofága alebo resolvázy transpozómu.
Z rekombináz patriacich do rodiny integrázy bakteriofága 1 sa môžu uviesť hlavne integráza fágov lambda (Landy et al., Science, 167 (1997) 1147), P22 a F80 (Leon et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 z Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), integráza Cre fága Pl, integráza plazmidu pSAM2 (EP 350 341) alebo rekombináza FLP plazmidu 2 pm z kvasiniek Saccharomyces cerevisiae.
Z rekombináz patriacich do rodiny transpozónu Tn3 sa môžu uviesť hlavne resolváza transpozónu Tn3 alebo transpozónov gd, Tn21 a Tn522 (Stark et al., 1992); invertáza Gin bakteriofága mu alebo resolváza plazmidov, ako je fragment par z RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol., 12 (1994) 131).
Podľa výhodného uskutočnenia pochádzajú sekvencie umožňujúce miestne-špecifickú rekombináciu v rekombinantných bakulovírusoch podľa predloženého vynálezu z bakteriofága. Výhodnejšie sú to pripája cie sekvencie (sekvencie attP a attB) z bakteriofága alebo odvodenej sekvencie. Tieto sekvencie sú schopné špecifickej rekombinácie so sebou navzájom v prítomnosti rekombinázy nazývanej integráza. Ako špecifické príklady sa môžu uviesť hlavne sekvencie na pripojenie fágov lambda, P22, F80, PI, HP1 z Haemophilus influenzae alebo z plazmidu pS AM2 alebo 2 pm.
Ešte výhodnejšie sú sekvencie umožňujúce miestne-špecifickú rekombináciu, ktoré predstavuje rekombinačný systém fága PI. Fág PI má rekombinázu nazývanú Cre, ktorá špecificky rozpoznáva nukleotidovú sekvenciu 34 bázových párov nazývanú miesto loxP (Stemberg et al., J. Mol. Biol. 150 (1981) 467). Táto sekvencia je zložená z dvoch palmdromických sekvencií s veľkosťou 13 bp oddelených konzervatívnou sekvenciou s veľkosťou 8 bp. Miestne špecifická rekombinácia sa výhodne získa s použitím sekvencií LoxP alebo odvodených sekvencií a rekombinázy Cre.
Termín odvodená sekvencia zahŕňa sekvencie získané modifikáciou (modifikáciami) uvedených rekombinantých sekvencií, pričom sa zachováva kapacita špecifickej rekombinácie v prítomnosti príslušnej rekombinázy. Môže teda zahŕňať redukované fragmenty týchto sekvencií alebo naopak fragmenty rozšírené pridaním iných sekvencií (reštrikčné miesta a podobne). Môže tiež zahŕňať varianty získané mutáciou (mutáciami), hlavne bodovou mutáciou (bodovými mutáciami).
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú preto sekvencie umožňujúce miestne-špecifickú rekombináciu sekvencie LoxP bakteriofága PI a rekombinácia sa získa v prítomnosti proteínu Cre. Z tohto hľadiska sa môže rekombinácia dosiahnuť tak, že sa kompetentné bunky privedú do priameho kontaktu s rekombinázou Cre alebo expresiou génu kódujúceho rekombinázu Cre v kompetentných bunkách. Výhodne sa rekombináza Cre produkuje v bunke indukciou expresie zodpovedajúceho génu. Gén kódujúci rekombinázu sa výhodne umiestni pod kontrolu indukovateľného promótora alebo sa konštruuje v regulovateľnej forme. Z tohto hľadiska sa dá výhodne použiť fúzia medzi Cre a väzbovou doménou steroidného hormónu (estradiol, progesterón a podobne) umožňujúcou reguláciu aktivity Cre, a teda vyvolanie rekombinácie (Metzger et al., PNAS 92 (1995) 6991). Všeobecnejšie sa expresia rekombinázy môže kontrolovať každým silným promótorom, regulovaným alebo iným. Expresná kazeta sa môže transfekovať do kompetentných buniek alebo integrovať do genómu kompetentných buniek, ako je ukázané v príkladoch.
Tento systém teda umožňuje vytvárať replikatívne molekuly, ktoré produkujú v kompetentných bunkách vysokú úroveň vírusovej, hlavne adenovírusovej, komplementačnej funkcie. Tento typ konštruktu je zvlášť vhodný na komplementárnu vysoko defektných genómov, hlavne adenovirusových genómov defektných v neskorých génoch. Špecifický konštrukt podľa vynálezu predstavuje bakulovírus obsahujúci vložený do svojho genómu aspoň jeden úsek DNA ohraničený dvoma sekvenciami LoxP umiestnenými v priamej orientácii, pričom uvedený úsek DNA obsahuje aspoň jeden replikačný počiatok funkčný v kompetentných bunkách a jednu nukleovú kyselinu kódujúcu komplementačnú funkciu adenovírusu. Komplementačné funkcie výhodne obsahujú všetky alebo niektoré zo skorých génov prítomných v úsekoch El, E2 a E4. Ešte výhodnejšie zahŕňajú komplementačné funkcie všetky alebo niektoré zo skorých génov a z neskorých skorých génov. Výhodne umožňujú komplementačné funkcie komplementáciu rekombinantného adenovírusu, ktorému chýba akákoľvek kódujúca vírusová sekvencia. Komplementačné funkcie konkrétne zahŕňajú celý adenovírusový genóm s výnimkou ITR a zbaľovacieho úseku. Podľa špecifického variantu komplementačné funkcie zahŕňajú kompletný adenovírusový genóm, ktorému chýba zbaľovací úsek (Ad.Psi-). Tento genóm obsahuje hlavne úseky ITR, ktoré slúžia na replikáciu genómu v kompetentných bunkách po excízii.
Aby sa vyvolala replikácia epizomálnej molekuly, obsahuje táto molekula replikačný počiatok funkčný v použitých kompetentných bunkách. Tento replikačný počiatok výhodne zahŕňa aktuálne sekvencie ITR adenovírusu, ktoré umožňujú podstatnú amplifikáciu molekuly. Môže to byť tiež iný replikačný počiatok umožňujúci výhodne viac ako 20-násobnú amplifikáciu vírusovej DNA v kompetentnej bunke. Ako príklad sa môže uviesť počiatok OriP/EBNAl vírusu EBV alebo úsek E2 papilomavírusu. Pritom sa rozumie, že sekvencia ITR adenovírusu predstavuj e výhodné uskutočnenie.
Na uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu sa pomocný bakulovírus (bakulovírusy) všeobecne používa v mnohonásobku infekcie („Multiplicity of Infection“, MOI), čo umožňuje, že sa infikuje veľká populácia buniek bez významného zhoršenia životaschopnosti buniek. Všeobecne je hodnota MOI najlepšie medzi 10 a 1000. MOI zodpovedá počtu vírusových častíc na bunku. Odborník môže MOI ľahko upraviť v závislosti od použitých kompetentných buniek, v podstate na základe dvoch kritérií: infekčná účinnosť a možná toxicita. Výhodne sa používa MOI pomocného bakulovírusu medzi 20 a 500.
Vnesenie vírusového genómu
Ako sa už uviedlo, spôsob podľa vynálezu zahŕňa vnesenie pomocného bakulovírusu a rekombinantného vírusového genómu do kompetentných buniek. Z tohto hľadiska sa môže genóm defektného rekombinantného adenovírusu vniesť do kompetentnej bunky rôznymi spôsobmi.
Predovšetkým môže ísť o purifikovaný defektný rekombinantný adenovírus, výhodne bez RCA. V tomto prípade sa kompetentné bunky infikujú defektným rekombinantným adenovírusom a pomocným bakulovírusom. Infekcia rekombinantým adenovírusom umožňuje zaviesť do kompetentnej bunky zodpovedajúci ge
SK 286900 Β6 nóm, ktorý sa potom amplifíkuje a enkapsiduje, aby produkoval kmene vo vysokom titri, a to bez RCA. Toto uskutočnenie je výhodné najmä na tvorbu prvej generácie vírusov (Ad-ΕΔΙ; Ad-AE1,AE3). V skutočnosti je ťažké produkovať tieto vírusy vo vysokých titroch bez kontaminácie RCA. Spôsobom podľa vynálezu je teraz možné začať s prvou generáciou defektného rekombinantného adenovírusu a spoločnou infekciou kompetentnej bunky bakulovirusom obsahujúcim úsek El získať koncentrované kmene vysokej kvality. Toto uskutočnenie je tiež výhodné na produkciu vírusov defektných v dvoch alebo troch základných úsekoch svojho genómu (hlavne El, E2, E4). Toto uskutočnenie je všeobecne výhodné, pretože účinnosť infekcie adenovírusom je veľmi vysoká (väčšia ako účinnosť transfekcie DNA) a preto umožňuje vytvoriť koncentrované kmene. V tomto uskutočnení sa rekombinantný adenovírus a rekombinantné bakulovírusy použijú v násobku infekcie (MOI) umožňujúcom infikovať veľkú populáciu buniek bez toho, aby sa významne zhoršila ich životaschopnosť. MOI použitý pre bakulovírus je rovnaký, ako už bolo uvedené (medzi 10 a 1000). Čo sa týka adenovírusov, je výhodne medzi 1 a 1000, výhodnejšie medzi 1 a 500, ešte výhodnejšie medzi 1 a 100. MOI použitý pre adenovírus sa tiež upraví podľa vybratého bunkového typu. Rozsah MOI môže odborník ľahko určiť napríklad s použitím adenovírusu a bakulovírusu obsahujúceho oddelený gén markéru, aby sa stanovila účinnosť infekcie a prípadne akákoľvek kompetícia. Výhodnejšie je MOI adenovírusu menší ako 50, napríklad medzi 1 a 20.
V ďalšom zvlášť výhodnom uskutočnení vynálezu sa genóm defektného rekombinantného adenovírusu vnesie vo forme DNA. V tomto prípade sa genóm zavedie transfekciou, voliteľne v prítomnosti činidla uľahčujúceho transfekciu (lipidy, fosforečnan vápenatý a podobne). Rekombinantný genóm pripravený in vitro sa môže zaviesť rôznymi technikami, hlavne napríklad v E. coli (WO96/25506) alebo v kvasinke (W095/03400). Toto uskutočnenie je zvlášť užitočné na vytvorenie prvého radu defektného rekombinantného vírusu bez RCA, ktorý sa môže ďalej použiť na produkciu kmeňov s vysokým titrom podľa predchádzajúceho uskutočnenia.
Genóm defektného rekombinantného adenovírusu sa môže zaviesť tiež s použitím ďalšieho rekombinantného bakulovírusu. Podľa tohto uskutočnenia sa genóm defektného rekombinantného bakulovírusu pripraví in vitro, napríklad ako bolo uvedené, a potom sa zavedie do bakulovírusu vo forme kazety schopnej excízie v kompetentnej bunke. Podľa tohto uskutočnenia sa kompetentné bunky privedú do prítomnosti bakulovírusu nesúceho gén defektného rekombinantného adenovírusu a jedného alebo viacerých pomocných bakulovírusov (nesúcich komplementačné funkcie). Toto uskutočnenie je zvlášť výhodné na produkciu vysoko defektných rekombinantých adenovírusov. Na základe tohto systému je skutočne možné vniesť do populácie kompetentných buniek veľké množstvo oboch vysoko defektných rekombinantných genómov a zodpovedajúce komplementačné funkcie.
Vzhľadom na to, spôsob podľa vynálezu teda zahŕňa koinfekciu kompetentných buniek bakulovirusom nesúcim genóm defektného rekombinantného adenovírusu a jedným alebo niekoľkými pomocnými bakulovírusmi nesúcimi komplementačné funkcie. Hodnoty MOI použité v tomto uskutočnení sú tiež medzi 10 a 1000 pre každý použitý bakulovírus.
V doterajšom stave techniky sa pripravili dva typy konštruktov na produkciu minimálnych adenovírusov:
(1) transgén (β-galaktozidáza) klonovaný medzi ITR, ohraničený jedným reštrikčným miestom alebo (2) pravá a ľavá ITR klonovaná v priamej orientácii 5' od Otransgénu (Fisher et al., Virology 217 (1996) 11; Kumar-Singhet al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 913).
Minimálne adenovírusy sa produkovali v bunkách 293 transfekciou linearizovanej (1) alebo cirkulámej (2) DNA, vírusové proteíny nevyhnutné na replikáciu a na enkapsidáciu minigenómu poskytol v trans pomocný vírus (AdAEl). Minimálne adenovírusy sa správajú ako interferujúce defektné (ID) častice a amplifikujú sa progresívne v priebehu postupných pasáží. Hlavný problém tejto metodológie je separácia dvoch typov vytváraných častíc zodpovedných za kontamináciu kmeňov pomocným vírusom a veľmi nízke titre takto získaných minimálnych adenovírusov (menej ako 109 pfu/ml).
Predložená prihláška vynálezu umožňuje po prvýkrát vytvoriť minimálne adenovírusy s použitím bakulovírusu, ktorý dodá adenovírusový minigenóm, a bakulovírusu, ktorý poskytne všetky transkomplementačné funkcie (komplementujúci genóm).
Rekombinantný adenovírusový genóm sa výhodne vloží do bakulovírusu medzi dve sekvencie umožňujúce miestne špecifickú rekombináciu v bunkách kompetentných pre pomocný bakulovírus, ako už bolo opísané.
Predložená prihláška opisuje hlavne systém na produkciu minimálneho adenovírusu s použitím bakulovírusu na dodanie adenovírusového minigenómu pomocou systému loxP/Cre a bakulovírusu na poskytnutie všetkých transkomplementačných funkcií (komplementujúci genóm), tiež pomocou systému Cre/loxP (pozri obrázky 2 až 4).
Podľa ďalšieho uskutočnenia sa na dodanie komplementačných funkcií použije miestne-špecifický rekombinačný systém odlišný od systému použitého na dodanie genómu rekombinantých adenovírusov. Konkrétne sa na dodanie defektného adenovírusového genómu môže použiť systém LoxP/Cre a na dodanie komplementačnej funkcie(í) systém AttP/AttB.
Spôsob podľa vynálezu tak umožňuje konštruovať adenovírusový vektor zbavený všetkých kódujúcich vírusových sekvencií a obsahujúci len ITR a enkapsidačný signál (minimálne adenovírusy). Tento vektor môže teoreticky pojať až 37 kb exogénnej sekvencie, zatiaľ čo klonovacia kapacita súčasných vektorov nepresahuje 8,5 kb. To teda umožňuje klonovať gény s veľkosťou ako je gén dystrofínu (14 kb) so všetkými ich regulačnými prvkami (promótor, zosilňovač, intróny a podobne) tak, aby sa získala optimálna expresia v cieľovom tkanive. Navyše, neprítomnosť akejkoľvek imunogénnej vírusovej sekvencie by mala zvýšiť trvanie expresie transgénu v pokojovom tkanive.
Genóm AAV alebo defektného retrovírusu sa tiež môže zaviesť vo forme vírusu, genómu alebo plazmidu niektorým z už opísaných spôsobov.
Kompetentné bunky
Spôsob podľa vynálezu sa môže uskutočňovať s rôznym typom buniek. Na účely vynálezu sa pod „kompetentnou bunkou“ chápe bunka permisívna k infekcii bakulovírusom a vírusom, ktorý sa má tvoriť, a umožňujúca produktívny vírusový cyklus tohto vytváraného vírusu. Kapacita infekcie buniek týmito vírusmi sa môže určiť použitím rekombinantných vírusov exprimujúcich markérový gén, ako je gén LacZ E. coli. Je to výhodne cicavčia bunka, ešte výhodnejšie bunka ľudského pôvodu. Použité kompetentné bunky môžu byť pokojové bunky alebo aktívne sa deliace bunky, zavedené stabilizované línie alebo primáme kultúry. Sú to výhodne cicavčie bunky zlúčiteľné s priemyselným využitím, t. j. bez známeho patogénneho charakteru, schopné kultivácie, a ak je nutné, schopné uchovávania v patričných podmienkach. Výhodne sa použijú bunky pečene, svalové, fibroblastové, embryonálne, nervové, epitelové (pľúcne) alebo očné (retinálne) bunky. Ako neobmedzujúci príklad možno uviesť bunky 293 alebo akúkoľvek odvodenú bunku obsahujúcu prídavnú komplementačnú funkciu (293E4, 293E2a, a podobne), bunky A549, bunky HuH7, bunky Hep3B, bunky HepG2, bunky ľudského retinoblastómu (HER, 911), bunky HeLa, bunky 3T3 alebo bunky KB.
Na uskutočnenie spôsobu podľa vynálezu sa môže genóm rekombinantného vírusu a bakulovírusu vniesť do populácie kompetentných buniek súčasne alebo časovo oddelene. Výhodne sa bunky privedú do kontaktu tak s rekombinantným genómom, ako i s pomocným bakulovírusom. V prípade systému tvoriaceho replikatívne molekuly in vivo sa vnesie tiež rekombináza alebo sa exprimuje vopred, súčasne alebo postupne.
Produkcia vírusov všeobecne vedie k lýze buniek. Tvorené vírusy sa môžu po bunkovej lýze získavať známymi puriíikačnými metódami. Potom sa môžu rôznymi spôsobmi zbaľovať v závislosti od požadovaného použitia. Navyše, aby sa zabránilo riziku kontaminácie vírusového kmeňa možnou prímesou bakulovírusov, ktoré neprenikli do kompetentných buniek (pomocný bakulovírus alebo bakulovírus poskytujúci rekombinantný vírusový genóm), môžu sa aplikovať nasledujúce techniky:
- adenovírusy sa môžu purifikovať chromatografiou podľa metódy opísanej v prihláške FR96/08164. Táto technika umožňuje separovať adenovírus od akéhokoľvek možného reziduálneho bakulovírusu;
- na kmene purifikovaného adenovírusu sa môžu nechať pôsobiť organické rozpúšťadlá (napríklad éter, chloroform). V skutočnosti je bakulovírus opuzdrený vírus (má glykoproteínový obal), a preto je veľmi citlivý na akékoľvek organické rozpúšťadlo (ktoré extrahuje lipidy z jeho obalu); na rozdiel od toho adenovírus nie je opuzdrený a rovnaké rozpúšťadlá na neho neúčinkujú;
- akýkoľvek reziduálny bakulovírus a rekombinantný vírus sa môžu separovať podľa hustoty purifikáciou na gradiente CsCl.
Tieto tri metódy sa môžu použiť nezávisle alebo spoločne. Navyše sa môže tiež použiť akákoľvek ďalšia odborníkovi známa metóda.
Použitie vírusov
Takto pripravené vírusy sa môžu použiť na klonovanie, prenos a expresiu génov in vitro, ex vivo alebo in vivo. Také požadované gény sú napríklad gény kódujúce enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF a podobne (FR 9203120), rastové faktory, neurotransmitery alebo ich prekurzory v systéme enzýmov, trofické faktory: BDNF, CNTT, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, a podobne, apolipoproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, a podobne (WO94/25073), dysttofín alebo minidystrofín (WO 93/06223), nádorové supresorové gény: p53, Rb, Rapl A, DCC, k-rev, a podobne (WO94/24297), gény kódujúce faktory zapojené do koagulácie: faktory VII, VIII, IX a podobne, samovražedné gény: tymidínkinázu, cytozíndeaminázu a podobne, alebo celý či časť prirodzeného syntetického imunoglobulínu (Fab, ScFV, a podobne, WO94/29446), a podobne. Požadovaný gén môže byť tiež gén alebo „antisense“ (s opačnou orientáciou) sekvencia, ktorých expTesia v cieľovej bunke umožňuje riadiť expresiu génov alebo transkripciu bunkových mRNA. Takéto sekvencie sa môžu v cieľovej bunke transkribovať napríklad do RNA komplementárnych k bunkovým mRNA, a tak blokovať ich transláciu na proteín podľa techniky opísanej v patente EP 140 308. Požadovaný gén môže byť tiež gén kódujúci antigénny peptid, schopný vyvolať imunitnú odpoveď, na produkciu vakcín. Môžu to byť hlavne antigénne peptidy špecifické pre vírus Epstein-Barrovej, vírus HľV, vírus hepatitídy B (EP 185 573), vírus pseudorabies alebo peptidy špecifické pre nádory (EP 259 212). Gén môže byť každá DNA (gDNA, cDNA a podobne) kódujúca požadovaný produkt, potenciálne zahŕňajúca prí slušné expresné signály (promótor, terminátor a podobne).
Takéto vírusy sa môžu použiť in vitro na tvorbu týchto rekombinantných proteínov. Môžu sa tiež použiť in vitro na štúdium mechanizmov pôsobenia týchto proteínov alebo na štúdium regulácie expresie génov alebo aktivity promótorov. Môžu sa použiť aj in vivo na vytvorenie zvieracích modelov alebo transgénnych zvierat. Ďalej sa môžu použiť aj na prenos a expresiu génov in vivo, u zvierat alebo ľudí, v postupoch génovej alebo bunkovej terapie.
Predložený vynález bude podrobnejšie opísaný a vysvetlený pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré treba považovať za ilustračné a neobmedzujúce.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: schematické znázornenie produkcie tretej generácie defektného rekombinantného adenovírusu (defektného vo funkciách E1 a E4) s použitím bakulo-El, E4.
Obrázky 2 až 4: schematické znázornenie produkcie minimálneho adenovírusu s použitím prvého bakulovírusu na zavedenie neúplného adenovírusového genómu a druhého bakulovírusu na zavedenie komplementačných funkcií.
Obrázok 5: schematické znázornenie produkcie rekombinantného AAV defektného vo funkcii Rep a Cap s použitím bakulo-Rep/Cap.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Použité bunky
Bunky použité v rámci vynálezu sa môžu získať z akejkoľvek bunkovej línie alebo populácie schopnej infekcie adenovírusom alebo AAV, alebo retrovírusom, alebo bakulovírusom, kompatibilnej s použitím na liečebné účely. Výhodne je to cicavčia, hlavne ľudská bunka. Konkrétne sa môžu spomenúť:
- Bunky línie 293:
Línia 293 je bunková línia ľudských embryonálnych obličiek obsahujúca ľavý koniec (približne 11-12 %) genómu adenovírusu sérotypu 5 (Ad5), obsahujúci ľavú ITR, enkapsidačnú oblasť, oblasť E1 vrátane Ela, E2b, oblasť kódujúcu proteín pIX a časť oblasti kódujúcej proteín pIVa2 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59, 1977). Táto línia je schopná transkomplementácie rekombinantných adenovírusov defektných v oblasti El, inými slovami takých, ktorým chýba celá alebo časť oblasti El, a produkuje kmene vírusov s vysokými titrami.
- Bunky línie A549
Bunky komplementujúce oblasť El adenovírusu sa skonštruovali z buniek A549 (Imler et al., Gene Ther., 75, 1966). Tieto bunky obsahujú reštrikčný fragment oblasti El, ktorému chýba ľavá ITR, umiestnený pod kontrolu indukovateľného promótora.
- Bunky línie HER
Bunky ľudskej embryonálnej retiny (HER) sa môžu infikovať adenovírusom (Byrd et al., Oncogene, 2, 477,1988). Adenovírusové enkapsidačné bunky pripravené z týchto buniek sú opísané napríklad v patentovej prihláške WO94/28152 alebo v článku Fallauxe a kol., (Hum. Gene. Ther., 215, 1996). Konkrétne sa môže uviesť línia 911 obsahujúca oblasť El genómu adenovírusu Ad5, od nukleotidu 79 k nukleotidu 5789, táto oblasť je integrovaná do genómu buniek HER. Táto bunková línia umožňuje produkciu vírusov defektných v oblasti El.
- Bunky IGRP2
Bunky IGRP2 sú bunky získané z buniek 293 integráciou funkčnej jednotky oblasti E4 pod kontrolu indukovateľného promótora. Tieto bunky umožňujú produkciu vírusov defektných v oblastiach El a E4 (Yeh et al., J. Virol., 70, 1966).
- Bunky VK
Bunky VK (VK2-20 a VK10-9) sú bunky získané z buniek 293 integráciou celej oblasti E4 pod kontrolu indukovateľného promótora a oblasti kódujúcej proteín pIX. Tieto bunky umožňujú produkciu vírusov defektných v oblastiach El a E4 (Krougliak et al., Hum. Gene Ther., 6,1575,1995).
- Bunky 293E4
Bunky 293E4 sú bunky získané z buniek 293 integráciou celej oblasti E4. Tieto bunky umožňujú produkciu vírusov defektných v oblastiach El a E4 (WO95/02697, Cancer Gene Ther., 322,1995).
Bunky Sf9 a SÍ21 sú bunky embryonálnych Lepidopter. Tieto bunky sú sprístupnené v zbierkach (v ATCC pod číslom CRL-1711), spoločne s podmienkami ich kultivácie. Sú tiež komerčne dostupné (Gibco). Pozri tiež Kong a Possee: The baculovirus expression systém, London: Chapman a Halí, 1992.
SK 286900 Β6
-Ľudské hepatocyty
Bunky HepG2 a Hep3B a HuH7 sú ľudské línie pochádzajúce z karcinómu pečene. Sú sprístupnené v depozitných zbierkach a ich vlastnosti sú opísané napríklad v patentoch US 4 393 133 a 4 393 133.
-Ľudská bunková línia KB
Línia KB pochádza z ľudského epidermoidného karcinómu. Línia, ako aj podmienky umožňujúce jej pestovanie, je prístupná v ATCC (číslo CCL17).
-Ľudská bunková línia HeLa
Táto línia pochádza z karcinómu ľudského epitelu. Línia, ako aj podmienky umožňujúce jej pestovanie, je prístupná v ATCC (číslo CCL2).
-Bunková línia W162
Sú to bunky Vero obsahujúce oblasť E4 adenovírusu Ad2 integrovanú do svojho genómu. Tieto bunky opísal Weinberg a kol. (PNAS, 80,5383, 1983).
Príklad 2
Infekcia ľudských buniek rekombinantným bakulovírusom
Tento príklad opisuje kapacitu bakulovírusov infikovať bunky ľudského pôvodu.
Ľudské bunky (hlavne 293 alebo ich deriváty) sa infikujú rôznymi riedeniami roztoku rekombinantného bakulovírusu exprimujúceho gén LacZ pod kontrolou RSV LTR. 48 hodín po infekcii sa objavujú modré bunky, čo dokazuje, že tieto bunky sa dajú infikovať bakulovírusom.
Príklad 3
Konštrukcia bakulovírusov exprimujúcich oblasť E1 adenovírusu a zodpovedajúceho defektného adenovírusu
3-1. Klonovanie dvoch kaziet na expresiu E1
Plazmid AE2 sa získa z klonovania v PCRII (Invitrogen) produktu PCR (polymerázová reťazová reakcia) uskutočňovanej na pBREl s oligonukleotidmi 5'-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' a 5'-GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3', tento produkt PCR obsahuje nukleotidy 3198 až 3511 z Ad5, t. j. 3' koniec oblasti E1B. Plazmid pBREl obsahuje nukleotidy 1 až 5788 a Ad5 klonované do pBR322 zbaveného zhruba nukleotidov 1300 až 2300.
Plazmid AE3 pochádza z klonovania fragmentu Notl-KpnI z AE2, obsahujúceho produkt PCR, do pCDNA3 (Invitrogen) naštiepeného s Notl-KpnI. Obsahuje nukleotidy 3198 až 3511 a Ad5 nasledované polyadenylačným miestom BGH.
Plazmid AE4 pochádza z klonovania fragmentu BglII-PvuI z AE3 do pBREl. AE4 je plazmid obsahujúci nasledujúcu E1 expresnú kazetu:
- nukleotidy 1 až 3511 z Ad5, t. j. ľavú ITR, enkapsidačné sekvencie, promótor E1A, gén E1A, promótor E1B, génElB
- polyA z hovädzieho rastového hormónu (BGH) získaného z pCDNA3.
pBREl sa štiepil s BstNI, potom reagoval s T4 DNA polymerázou, aby sa doplnil prečnievajúci 5' koniec, a potom sa štiepil s Xbal. Takto vzniknutý fragment obsahujúci nukleotidy 391 až 1339 z Ad5 sa vložil do pic20H naštiepeného so Smal-Xbal (nemetylované miesto) a vznikol plazmid AE5.
Plazmid AE6 pochádza z klonovania fragmentu EcoRI-Smal z AE5 do AE4 štiepeného s EcoRI-Smal. AE6 je plazmid obsahujúci nasledujúcu expresnú kazetu El:
- nukleotidy 391 až 3511 z Ad5, t. j. „redukovaný“ promótor z El A, gén El A, promótor E1B, gén E1B,
- polyA z hovädzieho rastového hormónu (BGH) získaného z pCDNA3.
3-2. Klonovanie dvoch kaziet El do bakulovírusu
Fragmenty EcoRI-Sphl (Sphl prečnievajúci 5' koniec sa vopred zatupil opracovaním s T4 DNA polymerázou) z plazmidov AE4 a AE6 sa klonovali do plazmidu pAcSG2 (Pharmingen) medzi miesta EcoRI a EcoRV. Tak vznikli plazmidy AE14 a AE15. V oboch prípadoch je oblasť El zavedená do lokusu polyhedrínového génu (polyhedrínový gén + odstránený polyhedrínový promótor).
Plazmidy AE14 a 15 sa spoločne s DNA bakulovírusu BaculoGold pochádzajúceho z kmeňa AcNPV (Pharmingen) transfekovali (kotransfekovali) do hmyzích buniek Sf9, aby vznikli dva zodpovedajúce rekombinantné bakulovírusy BacAE14 a BacAE15, nesúce dve kazety na expresiu El integrované do lokusu polyhedrínového génu.
3-3. Klonovanie rekombinantného adenovírusu nesúceho novú deléciu El
Plazmid pCOl (W096/10088) sa naštiepil BstXI, potom sa opracoval s T4 DNA polymerázou, aby sa odstránil prečnievajúci 3 '-koniec, a potom sa štiepil Rsal. Takto vzniknutý fragment obsahujúci nukleotidy 3513 až 4607 z Ad5 sa zaviedol do pBS-SK+ (Stratagene) linearizovaného s EcoRV, a potom sa štiepil teľacou alkalickou fosfatázou za vzniku plazmidu AE0.
SK 286900 Β6
Plazmid pMA37 sa získal ligáciou fragmentov:
- EcoRV-Nsil z pXL2756, obsahujúci sacB. pXL2756 má protiselekčný gén SacB bez miest EcoRI a KpnI, gén rezistencie na kanamycín, mnohopočetné klonovacie miesto a replikačný počiatok ColEl,
- Ndel-Nsil z pCOl (obsahujúci adeno sekvencie),
- Sali (prečnievajúci 5' koniec doplnený T4 DNA polymerázou),
- Asel z pXL2756 (vektor rezistentný na kanamycín).
pMA37 teda obsahuje:
- gén rezistencie na kanamycín
- gén SacB prepožičiavajúci citlivosť na sacharózu baktériám, ktoré ho exprimujú,
- sekvencie 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 nasledované sekvenciami 3446 až 4415 (Nsil) z Ad5, nie je prítomný žiadny transgén.
Plazmid ΑΕΙ 1 sa zostrojil zavedením fragmentu Xhol-Nsil z AEO do pMA37 štiepeného Sall-Nsil. Obsahuje teda:
- gén rezistencie na kanamycín,
- gén SacB prepožičiavajúci citlivosť na sacharózu baktériám, ktoré ho exprimujú,
- sekvencie 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 nasledované sekvenciami 3513 až 4415 (Nsil) z Ad5, nie je prítomný žiadny transgén.
Z plazmidu AE11 sa potom konštruovali samovražedné kyvadlové vektory (vložením požadovaného transgénu) umožňujúce konštrukciu rekombinantných adenovírusov rekombináciou v E. coli. ΑΕΙ 1 neobsahuje sekvencie homologické s plazmidom AE6. Plazmidy AE11 a AE4 majú spoločné sekvencie 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 proti smeru od E1A, ale medzi týmito dvoma plazmidmi nie je žiadna homológia v smere od kazety El. Tak tu nemôže vznikať RCA homologickou rekombináciou medzi adenovírusom nesúcim deléciu El existujúcu v ΑΕΙ 1 (t. j. 382 až 3515) a bakulovirusmi BAc AE14 alebo BacAE15.
3-4. Konštrukcia prvej generácie rekombinantných adenovírusov
Najskôr sa zvyčajnými technikami pripravil kmeň BacAE14 alebo 15. Ďalej sa kompetentné bunky (napríklad HuH7) transfekovali 5 pg plazmidu pXL2822 štiepeného PacI (plazmid pXL2822 obsahuje celý Ad5 s odstránenou oblasťou El (382 až 3446 alebo 382 až 3513) a E3 (28592 až 30470) a nesie kazetu CMVPGal), a infikovali, súčasne alebo inak, pri MOI10 až 1000, BacAE14 alebo 15. Po lýze buniek sa zozbieral transfekčný supematant a použil sa na „čerstvé“ kompetentné bunky vopred alebo súčasne infikované BacAE14 alebo 15 (MOI 10 až 1000), aby sa amplifikoval adenovírus Ad2822, a tak ďalej, pokiaľ sa nezískal kmeň Ad2822. Sledovanie amplifikácie Ad2822 je uľahčené prítomnosťou lacZ v tomto víruse. Pri každej amplifikácií sa teda supematant pseudotitroval na W162. Genóm vírusu sa analyzoval v priebehu amplifikácií, aby sa kontrolovala jeho integrita. Táto stratégia má tú výhodu, že v takto tvorenom adenovírusovom kmeni nevznikajú RCA. Neprítomnosť kontaminácie sa tiež ešte overuje.
Príklad 4
Konštrukcia bakulovírusu exprimujúceho oblasti El a E4 (Bac.El-E4)
Použitý protokol je nasledujúci: oblasti El a E4 sa klonovali v opačnej orientácii k lokusu polyhedrínového (Ph) génu do kyvadlového vektora pBacPAK8 (Clontech, USA) za vzniku pBacEl-E4. Rekombinantný bakulovírus sa potom izoloval pomocou zvyčajných techník kotransfekcií pBacEl-E4 a DNA bakulovírusu BacPAKó do buniek Sf9 (Kittsa Possee, Biotechniques, 14(5), 810, 1993). Výskyt El a E4 v genóme rekombinantných bakulovírusov sa potom kontroloval PCR s použitím infikovaných buniek Sf9. Transkripcia El a E4 v bunkách Huh7 infikovaných purifikovaným rekombinantým bakulovírusom sa analyzovala RT-PCR s použitím cytoplazmatických RNA.
Na konštrukciu bakulovírusu E1-E4 sa môžu zaviesť rôzne fragmenty nesúce El. V tomto príklade sa použili fragmenty, ktoré sú opísané v príklade 3, na konštrukciu bakulovírusu-El, obsahujúceho oblasti El pod kontrolou ich vlastného promótora (redukovaný promótor Ela a promótor Elb). Použité fragmenty E4 sú nasledujúce:
- fragment Maell-MscI 32720 až 35835 nesúci celú E4,
- fragment BglII-PvuI 34115 až 33126 nesúci rámec ORF6,
- fragment BglII-BglII 34115 až 32490 nesúci rámce ORF6-ORF6/7,
- fragment PvuII-AluI 34801-334329 nesúci rámec ORF3.
Tieto fragmenty sú umiestnené alternatívne pod kontrolu promótora E4 alebo iných promótorov, konkrétne HSV-TK alebo promótora CMV alebo RSV-LTR.
Uvedené pozície sa vzťahujú na sekvenciu divého typu Ad5 adenovirusu, ako je publikovaná a prístupná v banke dát. Aj keď môžu existovať niektoré menšie odchýlky medzi rôznymi adenovírusovými sérotypmi, tieto pozície sú všeobecne prenosné na iné sérotypy, konkrétne na Ad2, Ad7, Adl2 a Ad CAV-2.
SK 286900 Β6
4-2. Transkomplementácia AdAElAE4-LacZ s Bac.El-E4
Produkcia adenovírusu AdAElAE4-LacZ sa získala zavedením bakulovírusu El, E4 pripraveného v príklade 4-1, a adenovírusového genómu defektného v El a E4 do kompetentných buniek (pozri obrázok 1). Analyzovali sa optimálne podmienky na produkciu AdAElAE4-LacZ v kompetentných bunkách transkomplementáciou s purifikovaným Bac.El-E4. Titer AdAElAE4 sa určil ako počet transdukčných jednotiek (t.d.u.) β-galaktozidázy v línii W162 a získaná transkomplementačná účinnosť sa porovnala s účinnosťou enkapsidačnej línie IGRP2.
Príklad 5
Konštrukcia bakulovírusu komplementujúceho celý adenovírusový genóm
Aj keď súčasná expresia niekoľkých proteínov, ktoré môžu predstavovať sekvenciu s veľkosťou až 13 kb, jedným vírusom už bola publikovaná (Belyaev a Roy, NAR, 21,1219, 1993), maximálna klonovacia kapacita nie je dostatočne doložená. Tento príklad teraz ukazuje, že je možné klonovať do bakulovírusu adenovírusový genóm s odstráneným enkapsidačným signálom (Ad.Psi-), ktorý je ohraničený dvoma miestami loxP (loxP-ITR-ITR až E4-loxP). Infekcia kompetentných buniek exprimujúcich rekombinázu Cre indukovateľným alebo iným spôsobom (línia Cre alebo Cre-ER, pozri príklad 7) týmto rekombinantým bakulovírusom a aktivácia rekombinázy Cre umožňuje excíziu a cirkularizáciu adenovírusového genómu. Ten je potom schopný transdukcie skorých génov, replikácie a aktivácie neskorých génov, ale neschopný enkapsidácie, a teda slúži ako pomocník na produkciu minimálneho adenovírusu (pozri obrázky 2-4). V tomto systéme je produkcia minimálnych adenovírusov založená na spoločnej infekcii dvoma bakulovírusmi a realizácii dvoch rekombinantých javov medzi dvoma miestami loxP. Tento prístup má tú výhodu, že nevznikajú adenovírusové častice z pomocného vírusu.
Konštrukcia genómu Ad.Psi- sa uskutočnila v E. coli. S týmto cieľom sa kompletný genóm adenovírusu Ad5 klonoval do prokaryotického klonovacieho vektora s pripojenými ITR. Sekvencia Psi sa odstránila enzymatickým štiepením a ligáciou alebo miestne cielenou mutagenézou. Na každú stranu adenovírusového genómu sa potom zaviedla sekvencia LoxP v paralelnej orientácii. Výsledný konštrukt (loxP-ITR-ITR, APsi až E4-loxP) sa potom klonoval do kyvadlového vektora umožňujúceho rekombináciu s bakulovírusom podľa stratégie opísanej v príklade 3. Získaný rekombinantný bakulovirus, nazvaný BacAd.Psi-, sa potom izoloval bežnými metódami.
Príklad 6
Konštrukcia bakulovírusu obsahujúceho genóm defektného rekombinantného adenovírusu v odstrániteľnej forme
Tento príklad opisuje konštrukciu bakulovírusu, ktorý umožňuje poskytnúť genóm defektného rekombinantného adenovírusu v kompetentných bunkách. Konkrétnejšie je rekombinantný vírus defektný v celej kódujúcej oblasti a obsahuje len oblasti ITR a Psi (minimálny adenovirus, alebo AdA).
6-1. Konštrukcia minigenómu (AdA) v E. coli
Zostrojil sa plazmid p(loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP). S týmto cieľom sa izolovala sekvencia kópie sekvencie ITR adenovírusu enzýmovým štiepením a/alebo sa amplifikovala pomocou PCR, a potom sa klonovala proti smeru sekvencie ITR-Psi obsiahnutej v kyvadlovom vektore z adenovírusu pGY63. Tento vektor pochádza z pCOl (W096/10088) a má gén LacZ pod kontrolou skorého promótora cytomegalovírusu (P.CMV) ukončený polyadenylačným signálom vírusu SV40 (pA), klonovaným medzi sekvenciu ITR-Psi a gén kódujúci pIX. Oblasť (ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA) tohto vektora (zodpovedajúca minimálnemu adenovírusovému genómu) sa potom izolovala enzýmovým štiepením a klonovala medzi miesta LoxP do mnohopočetného klonovacieho miesta plazmidu pBS246 (Gibco) za vzniku plazmidu p(loxP-(ITRITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP). Kapacita produkcie adenovírusových minigenómov z cirkulámej DNA a ich enkapsidácia sa potom testovla transfekciou tohto plazmidu do línie IGRP2 infikovanej s Ad.AElAE4 exprimujúcim rekombinázu Cre (AdCre). Minimálne adenovírusy sa amplifíkovali niekoľkými postupnými pasážami supematantu z transfekcie línie IGRP2. Potom sa purifíkovali centrifiigáciou v izopyknickom gradiente chloridu cézneho a kvantifíkovali pseudotitráciou línie W162. Rozumie sa, že gén LacZ sa môže ľahko nahradiť akoukoľvek požadovanou nukleovou kyselinou zvyčajnými technikami molekulárnej biológie.
6-2. Klonovanie odstrániteľného minigenómu do bakulovírusu
Opísaný konštrukt nesúci minigenóm AdA ohraničený dvoma miestami loxP sa klonoval do lokusu P10 bakulovírusu kyvadlového vektora pAcUWl (Pharmingen, USA). Bakulovirus Bac-AdA sa potom produkoval a izoloval zvyčajnou technikou kotransfekcie do už uvedených buniek Sf9, a vyberal sa podľa svojho fágového fenotypu (biely) po označení s X-Gal. Tento bakulovirus preto nesie vysoko defektný adenovírusový genóm, ohraničený dvoma oblasťami loxP v priamej orientácii.
6-3. Produkcia AdA transkomplementáciou s bakulovírusom BacAdPsi’
Kompetentné bunky sa súčasne spoločne infikovali (koinfikovali) bakulovírusom BacAdPsi' (opísaným v príklade 5), nesúcim transkomplementačné funkcie celého adenovírusového genómu, a bakulovírusom Bac.AdA nesúcim genóm PseudoAdenovírusu (už opísaným). Rekombináza Cre sa zaistila buď pridaním proteínu do kultivačného média, alebo transfekciou buniek plazmidom alebo vírusom (bakulovírusom) exprimujúcim Cre, alebo expresiou kazety trvalo integrovanej do genómu línie (ako je opísané v príklade 7). Minimálny adenovírus sa amplifikoval postupným pasážovaním supematantu tkanivovej kultúry buniek spoločne infikovaných s BacAd.Psi’ a so supematantom, a potom sa purifikoval a titroval pomocou uvedených techník. Táto technika umožňuje získať AdA ako jediný vírus, čo umožňuje jeho izoláciu a purifikáciu bežnými metódami. Okrem toho, získané titre sú zlučiteľné s priemyselným využitím.
Príklad 7
Konštrukcia línie exprimujúcej proteín Cre
Aby sa zvýšila účinnosť rekombinácie medzi miestami loxP v bakulovíruse podľa vynálezu (napríklad Bac.AdA and BacAd.Psi’) a aby sa kontrolovala expresia Cre, vytvorili sa línie exprimujúce Cre indukovateľným alebo iným spôsobom V tomto konštrukte sa Cre exprimuje samotný alebo vo forme fuzneho proteínu C-koncovej časti s väzbovou doménou estradiolového receptora (ER) (Metzger et al., 1996, už citovaný) pod kontrolou bežného promótora, výhodne silného indukovateľného promótora alebo iného. Výhodnejšie promótory sú promótor pGRE5, promótor metalotionínu, promótor SV40 alebo promótor génu HSV-TK.
Aby sa vytvorili tieto línie Cre, kotransfekovali sa kompetentné bunky dvoma plazmidmi, z ktorých jeden obsahuje expresnú kazetu Cre (Cre alebo Cre-ER) a druhý markér na selekciu (Neo). Vybrali sa rezistentné klony G418, aktivita Cre v týchto klonoch sa testovala transfekciou plazmidu p(P.CMV-loxP-ATG-stop-pA-LoxP-LacZ). Tento plazmid obsahuje gén LacZ inaktivovaný zavedením medzi promótor (P.CMV) a začiatok LacZ, množstvo stopovacích kodónov v troch čítacích rámcoch, signál na termináciu transkripcie a polyadenylačný signál vírusu SV40 ohraničený dvoma miestami loxP. Expresia Cre v klonoch v prítomnosti či neprítomnosti induktora (estradiol) sa potom odhaľovala aktivitou β-galaktozidázy vyvolanou rekombináciou medzi dvoma miestami loxP. Vybralo sa teda niekoľko klonov trvalo exprimujúcich fiizny proteín Cre-ER alebo samotný proteín Cre bez promótorov a špecifikovanej kompetentnej bunky. Tieto klony sa môžu použiť na produkciu vírusov podľa vynálezu.
Kompetentná bunka Promótor HSV-TK Promótor SV40 Promótor MMTV Promótor GRE5
Rekombináza Cre Cre-ER Cre Cre-ER Cre Cre-ER Cre Cre-ER
293 č. 1 č. 7 č. 13 č. 19 č. 25 č. 31 č. 37 č. 43
IGRP2 č. 2 č. 8 č. 14 č. 20 č. 26 č. 32 č. 38 č. 44
Huf7 č. 3 č. 9 č. 15 č. 21 č. 27 č. 33 č. 39 č. 45
HepG2 č. 4 č. 10 č. 16 č. 22 č. 28 č. 34 č. 40 č. 46
HER č. 5 č. 11 č. 17 č. 23 č. 29 č. 35 č. 41 č. 47
Vero č. 6 č. 12 č. 18 č. 24 č. 30 č. 36 č. 42 č. 48
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (37)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob prípravy defektných rekombinantných vírusov, vyznačujúci sa tým, že do populácie kompetentných buniek sa vnesie genóm defektného rekombinantného vírusu a bakulovírus obsahujúci všetky alebo niektoré funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu, pričom ostatné funkcie sú poskytnuté kompetentnou bunkou.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že bakulovírus obsahuje všetky funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu.
  3. 3. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že bakulovírus obsahuje niektoré funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu, pričom zvyšné funkcie poskytuje kompetentná bunka.
  4. 4. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu poskytuje niekoľko bakulovírusov.
  5. 5. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že defektný rekombinantný vírus je defektný rekombinantný adenovírus.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že genóm rekombinantného adenovírusu je defektný v jednej alebo niekoľkých funkciách vybratých z El, E2, E3, E4, LI až L5, pIX a ľVa2, a bakuloví
    SK 286900 Β6 rus obsahuje všetky funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že genóm rekombinantného adenovírusu je defektný v jednej alebo niekoľkých funkciách vybratých z El, E2, E3, E4, LI až L5, pIX a IVa2, a bakulovírus obsahuje niektoré funkcie nevyhnutné na transkomplementáciu defektného rekombinantného genómu, pričom zvyšné funkcie poskytuje jeden alebo niekoľko bakulovírusov a/alebo kompetentná bunka.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že pomocný bakulovírus obsahuje časť alebo celý úsek El adenovírusu umožňujúci komplementárnu rekombinantného adenovírusového genómu defektného v úseku El.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že pomocný bakulovírus obsahuje časť alebo celý úsek E2 adenovírusu umožňujúci komplementáciu rekombinantného adenovírusového genómu defektného v úseku E2.
  10. 10. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že pomocný bakulovírus obsahuje časť alebo celý úsek E4 adenovírusu umožňujúci komplementáciu rekombinantného adenovírusového genómu defektného v úseku E4.
  11. 11. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že pomocný bakulovírus obsahuje časti alebo celé úseky El a E4 adenovírusu umožňujúce komplementáciu rekombinantného adenovírusového genómu defektného v úsekoch El a E4.
  12. 12. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že rekombinantnému adenovírusovému genómu chýba celá vírusová kódujúca oblasť a pomocný bakulovírus obsahuje všetky funkcie umožňujúce jej komplementáciu.
  13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že bakulovírus obsahuje celý adenovírusový genóm okrem enkapsidačného signálu a prípadne úsekov ITR.
  14. 14. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že komplementačné funkcie prítomné v bakulovíruse a genóm defektného rekombinantného vírusu neobsahujú úsek homológie, ktorý by bol schopný vyvolať rekombináciu.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že rekombinantný adenovírusový genóm defektný v úseku El a prípadne v E3 sa vnesie do kompetentných buniek, a tieto bunky sa infikujú, súčasne alebo nie, bakulovírusom obsahujúcim úsek El, pričom adenovírusový úsek El prítomný v bakulovíruse a genóm defektného rekombinantného adenovírusu neobsahujú úsek homológie, ktorý by bol schopný vyvolať rekombináciu.
  16. 16. Rekombinantný bakulovírus na použitie v spôsobe podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že komplementačná funkcia je vybratá zo všetkých alebo niektorých funkcií kódovaných adenovírusovými úsekmi El, E2, E4, LI až L5, pIX a IVa2, samostatne alebo v kombináciách, a je pod kontrolou heterológneho promótora.
  17. 17. Rekombinantný bakulovírus na použitie v spôsobe podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že komplementačná funkcia je vybratá zo všetkých alebo niektorých funkcií kódovaných úsekmi Rep a Cap z AAV, samostatne alebo v kombináciách, a je pod kontrolou heterológneho promótora.
  18. 18. Rekombinantný bakulovírus na použitie v spôsobe podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že komplementačná funkcia je vybratá zo všetkých alebo niektorých funkcií kódovaných úsekmi gag, pol, a env retrovírusov, samostatne alebo v kombináciách, a je pod kontrolou heterológneho promótora.
  19. 19. Bakulovírus podľa nároku 17 alebo 18, vyznačujúci sa tým, že promótorom je promótorový úsek prirodzene zodpovedajúci za expresiu komplementačných funkcií.
  20. 20. Bakulovírus podľa nároku 17 alebo 18, vyznačujúci sa tým, že promótor je silný bunkový alebo vírusový promótor, regulovaný alebo nie.
  21. 21. Bakulovírus podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že komplementačná funkcia obsahuje úsek El adenovírusového genómu alebo len jeho časť, ktorá obsahuje aspoň úsek Ela.
  22. 22. Bakulovírus podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že komplementačná funkcia obsahuje úsek E4 adenovírusového genómu alebo len jeho časť, ktorá obsahuje aspoň rámec ORF3 alebo ORF6.
  23. 23. Bakulovírus podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že obsahuje všetky kódujúce úseky adenovírusového genómu.
  24. 24. Bakulovírus podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že obsahuje úplný adenovírusový genóm, ktorému chýba enkapsidačný úsek.
  25. 25. Bakulovírus na použitie v spôsobe podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že je to bakulovírus kmeňa AcNPV.
  26. 26. Bakulovírus na použitie v spôsobe podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina kódujúca komplementačnú funkciu sa vnesie na úroveň polyhedrínového lokusu alebo lokusu plO.
  27. 27. Bakulovírus na použitie v spôsobe podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že nukleová kyselina kódujúca komplementačnú funkciu sa vnesie vo forme kazety, ktorá je schopná vyštiepenia v kompetentných bunkách.
  28. 28. Rekombinantný bakulovírus podľa niektorého z nárokov 16 až 18, ktorý obsahuje vložený vo svojom
    SK 286900 Β6 genóme aspoň jeden úsek DNA obklopený dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne-špecifickú rekombináciu umiestnenými v priamej orientácii, pričom uvedený úsek DNA obsahuje aspoň jeden replikačný počiatok funkčný v kompetentných bunkách a nukleovú kyselinu kódujúcu komplementačnú funkciu vírusu.
  29. 29. Bakulovírus podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že sekvencie umožňujúce miestnešpecifickú rekombináciu sú sekvencie LoxP bakteriofága PI, a rekombinácia sa dosiahne v prítomnosti proteínu Cre.
  30. 30. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že defektný rekombinantný genóm sa vnesie do bunky infekciou adenovírusom, ktorý obsahuje uvedený genóm.
  31. 31. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že defektný rekombinantný genóm sa vnesie do bunky transfekciou.
  32. 32. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že defektný rekombinantný genóm sa vnesie do bunky rekombinantným bakulovírusom, ktorý je odlišný od bakulovírusu nesúceho komplementačné funkcie.
  33. 33. Rekombinantný bakulovírus podľa niektorého z nárokov 16 až 27, ktorý obsahuje vložený vo svojom genóme aspoň jeden úsek DNA obklopený dvoma sekvenciami umožňujúcimi miestne-špecifickú rekombináciu umiestnenými v priamej orientácii, pričom uvedený úsek DNA obsahuje aspoň jeden replikačný počiatok funkčný v kompetentných bunkách a defektný adenovírusový genóm.
  34. 34. Bakulovírus podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že defektný rekombinantný adenovírusový genóm obsahuje nevyhnutne úseky ITR, enkapsidačnú sekvenciu a požadovanú nukleovú kyselinu.
  35. 35. Spôsob prípravy defektných rekombinantých adenovirusov, vyznačujúci sa tým, že sa populácia kompetentných buniek infikuje bakulovírusom podľa nároku 28 a bakulovírusom podľa nároku 33, bunky sa uvedú do prítomnosti rekombinázy umožňujúcej miestne-špecifickú rekombináciu a potom sa získajú produkované adenovírusy.
  36. 36. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že populácia kompetentných buniek je populácia buniek pečene alebo svalových buniek, fibroblastov, embryonálnych alebo epitelových buniek, zvlášť pľúcnych, buniek oka, zvlášť retiny, alebo nervových buniek.
  37. 37. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že populácia kompetentných buniek sa vyberie z buniek 293 alebo akýchkoľvek odvodených buniek, obsahujúcich ďalšie komplementačné funkcie, A549, HuH7, Hep3B, HepG2, HER, 911, HeLa alebo KB.
SK666-99A 1996-11-22 1997-11-18 Spôsob prípravy rekombinantných vírusov a rekombinantný vírus SK286900B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9614278A FR2756297B1 (fr) 1996-11-22 1996-11-22 Procede de production de virus recombinants
PCT/FR1997/002073 WO1998022607A1 (fr) 1996-11-22 1997-11-18 Procede de production de virus recombinants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK66699A3 SK66699A3 (en) 2000-02-14
SK286900B6 true SK286900B6 (sk) 2009-07-06

Family

ID=9497899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK666-99A SK286900B6 (sk) 1996-11-22 1997-11-18 Spôsob prípravy rekombinantných vírusov a rekombinantný vírus

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6387670B1 (sk)
EP (1) EP0946741B1 (sk)
JP (1) JP4686670B2 (sk)
KR (1) KR100719645B1 (sk)
AT (1) ATE317908T1 (sk)
AU (1) AU731106B2 (sk)
BR (1) BR9713388B1 (sk)
CA (1) CA2271438C (sk)
CZ (1) CZ293947B6 (sk)
DE (1) DE69735274T2 (sk)
ES (1) ES2260803T3 (sk)
FR (1) FR2756297B1 (sk)
HU (1) HU224713B1 (sk)
IL (1) IL129686A (sk)
NO (2) NO323937B1 (sk)
SK (1) SK286900B6 (sk)
WO (1) WO1998022607A1 (sk)
ZA (1) ZA9710516B (sk)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000073480A1 (en) * 1999-05-27 2000-12-07 Genovo, Incorporated Compositions and methods for production of recombinant virus using a carrier vector derived from a nonmammalian virus
US6793926B1 (en) * 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
AU5448400A (en) * 1999-05-28 2000-12-18 Mount Sinai School Of Medicine, The A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors
GB9919409D0 (en) 1999-08-18 1999-10-20 Univ Oxford Brookes Baculovirus expression system
EP1572943B1 (en) * 2002-08-29 2015-04-22 The Board of Trustees of The Leland S. Stanford Junior University Circular nucleic acid vectors, and methods for making and using the same
GB0702695D0 (en) * 2007-02-12 2007-03-21 Ark Therapeutics Ltd Production of vectors
GB0702694D0 (en) * 2007-02-12 2007-03-21 Ark Therapeutics Ltd Vectors
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
CN102006924B (zh) * 2008-03-05 2013-12-25 科学与工业研究委员会 聚合物杂化膜
EP2287323A1 (en) 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
EP2553105B1 (en) * 2010-04-01 2014-12-17 Weidong Xiao Compositions and methods for the production of recombinant virus vectors
BR112012026095A2 (pt) 2010-04-14 2015-09-15 Emd Millipore Corp métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos.
US9677088B2 (en) 2012-05-09 2017-06-13 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
AU2013279284A1 (en) 2012-06-21 2015-01-29 Association Institut De Myologie Widespread gene delivery of gene therapy vectors
WO2015031686A1 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Amgen Inc. High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells
CA2942776C (en) 2014-03-17 2023-01-24 Adverum Biotechnologies, Inc. Polyneucleotide cassette and expression vector for expression of a gene in cone cells using truncated m-opsin promoter
CN114480502A (zh) 2015-03-02 2022-05-13 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
WO2019104307A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 Coda Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for neurological diseases
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US11306329B2 (en) 2018-02-19 2022-04-19 City Of Hope Adeno-associated virus compositions for restoring F8 gene function and methods of use thereof
EP3917566A4 (en) 2019-01-31 2022-10-26 Oregon Health & Science University METHODS OF USING DIRECTED, TRANSCRIPTION-DEPENDENT EVOLUTION OF AAV CAPSIDS
US20220348635A1 (en) 2019-08-21 2022-11-03 Coda Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for neurological diseases
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
WO2022076556A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy disorders including limb girdle 2i (lgmd2i)
WO2023212294A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof
AU2023260823A1 (en) 2022-04-29 2024-11-14 Broadwing Bio Llc Bispecific antibodies and methods of treating ocular disease
WO2023212293A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof
WO2024227154A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Broadwing Bio Llc Complement component 3 (c3)-specific antibodies and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0441897A4 (en) * 1988-11-14 1992-06-24 Us Health Parvovirus capsids
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
JPH10506530A (ja) * 1994-09-23 1998-06-30 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 哺乳類細胞において外来遺伝子を発現する非哺乳類ｄｎａウイルスの使用

Also Published As

Publication number Publication date
ZA9710516B (en) 1998-06-10
EP0946741B1 (fr) 2006-02-15
JP4686670B2 (ja) 2011-05-25
CZ182299A3 (cs) 1999-08-11
IL129686A0 (en) 2000-02-29
BR9713388B1 (pt) 2009-01-13
DE69735274T2 (de) 2006-10-12
KR100719645B1 (ko) 2007-05-17
HUP0001762A3 (en) 2002-01-28
WO1998022607A1 (fr) 1998-05-28
US20030022356A1 (en) 2003-01-30
AU731106B2 (en) 2001-03-22
AU5226198A (en) 1998-06-10
IL129686A (en) 2005-12-18
DE69735274D1 (de) 2006-04-20
NO992464L (no) 1999-06-23
EP0946741A1 (fr) 1999-10-06
BR9713388A (pt) 2000-03-21
US6387670B1 (en) 2002-05-14
ES2260803T3 (es) 2006-11-01
SK66699A3 (en) 2000-02-14
KR20000057202A (ko) 2000-09-15
CA2271438C (fr) 2010-10-26
CZ293947B6 (cs) 2004-08-18
FR2756297B1 (fr) 1999-01-08
HUP0001762A2 (hu) 2000-09-28
NO2013009I1 (no) 2013-04-29
NO992464D0 (no) 1999-05-21
HU224713B1 (en) 2006-01-30
JP2001503993A (ja) 2001-03-27
CA2271438A1 (fr) 1998-05-28
NO323937B1 (no) 2007-07-23
ATE317908T1 (de) 2006-03-15
FR2756297A1 (fr) 1998-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6387670B1 (en) Method for producing recombinant virus
EP1226264B1 (en) Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
US6878549B1 (en) Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
JP4190028B2 (ja) 欠陥組換えアデノウイルスベクター及び遺伝子治療での使用
SK174297A3 (en) Recombinant adenoviruses, use thereof for preparing aavs, complementary cell line, and pharmaceutical compositions containing said adenoviruses
SK99097A3 (en) Cells for the production of recombinant adenoviruses
US20090098599A1 (en) Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
JP2002526031A (ja) 機能的ゲノム適用にライブラリーを使用される遺伝子機能に関する高度処理能力スクリーニング法
AU2437200A (en) Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
MXPA99004449A (en) Method for producing recombinant virus
AU7560500A (en) Modified adenoviral vectors for use in gene therapy
EP1083228A1 (en) Modified adenoviral vectors for use in gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change of owner's name

Owner name: CENTELION, VITRY SUR SEINE, FR

Effective date: 20110120

TB4A Correction of name

Owner name: CENTELION (SAS), VITRY SUR SEINE, FR

PC4A Assignment and transfer of rights

Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., ANTONY, FR

Free format text: FORMER OWNER: CENTELION (SAS), VITRY SUR SEINE, FR

Effective date: 20130701

Owner name: SANOFI, PARIS, FR

Free format text: FORMER OWNER: AVENTIS PHARMA S.A., ANTONY, FR

Effective date: 20130401

SPCF Filing of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: ALIPOGEN TIPARVOVEK; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/12/791/001 20121025

Spc suppl protection certif: 5009-2013

Filing date: 20130423

MK4A Patent expired

Expiry date: 20171118