DE69735274T2

DE69735274T2 - Verfahren zur herstellung von rekombinanten viren

Info

Publication number: DE69735274T2
Application number: DE69735274T
Authority: DE
Inventors: Helène LEBLOIS-PREHAUD; Michel Perricaudet; Emmanuelle Vigne; Patrice Yeh
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: Centelion SAS
Priority date: 1996-11-22
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2017-11-19
Also published as: AU731106B2; JP4686670B2; NO323937B1; CZ293947B6; NO992464L; US6387670B1; ES2260803T3; HUP0001762A2; IL129686A; ATE317908T1; HUP0001762A3; US20030022356A1; BR9713388A; NO992464D0; CA2271438C; CA2271438A1; NO2013009I1; BR9713388B1; WO1998022607A1; KR20000057202A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Viren. Sie betrifft auch Konstruktionen, die zur Durchführung dieses Verfahrens verwendet werden, die Produzentenzellen und die so hergestellten Viren. Diese Viren sind als Klonierungsvektor und/oder Expressionsvektor von Genen in vitro, ex vivo oder in vivo verwendbar.
Die Vektoren viralen Ursprungs werden in großem Umfang für die Klonierung, den Transfer und die Expression von Genen in vitro (zur Produktion von rekombinanten Proteinen, zur Durchführung von Durchmusterungstests, zur Untersuchung der Genregulation, usw.), ex vivo oder in vivo (für die Schaffung von Tiermodellen oder in therapeutischen Ansätzen) verwendet. Unter diesen Viren kann man insbesondere die Adenoviren, die Adeno-assoziierten Viren (AAV), die Retroviren, die Herpesviren und die Vaccina nennen.
Die Familie der Adenoviridae ist bei den Säugetieren und den Vögeln weit verbreitet und umfasst mehr als Hundert unterschiedliche Serotypen von Viren ohne Hülle mit zweikettiger DNA, die ein Capsid mit Ikosaedersymmetrie besitzen (Horwitz. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, Herausg. Virology, 3. Ausg., Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149–2171). Zusätzlich zu seiner Unschädlichkeit besitzt das Adenovirus einen sehr großen Zelltropismus. Im Gegensatz zum Retrovirus, dessen Zyklus von der Zellteilung abhängig ist, kann es die Zellen in aktiver Teilung wie ruhende Zellen infizieren und behält sein Genom in episomaler Form. Darüber hinaus kann es mit erhöhten Titern (10¹¹ kbE/ml) produziert werden. Mit diesen wichtigen Trümpfen macht man daraus einen Vektor der Wahl zur Klonierung und zur Expression von heterologen Genen. Die Adenoviren der Gruppe C, insbesondere des Typs 2 und 5, sowie die Hunde-Adenoviren des Typs CAV-2, deren Molekularbiologie am besten bekannt ist, sind die Quelle für die derzeit verwendeten Vektoren.
Das Adenovirus besitzt ein lineares Genom mit 36 kb, das an jedem seiner Enden durch invertierte Sequenzwiederholungen ((ITR) mit 103 bp terminiert ist, umfassend einen Replikationsursprung sowie ein Encapsidationssignal, das nahe bei der linken ITR liegt (Shenk, Adenoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, Herausg. Virology, Philadelphia: Raven Herausg., 1996: 2111–2148). Im Verlauf der viralen Zyklen exprimieren sich drei Genfamilien:

– Die "immediate-early"-Gene (E1, E2, E3 und E4), die in der Regulation der zellulären Gene impliziert sind, erlauben insbesondere den Eintritt der Zelle in die Phase S (E1A) und die Inhibierung der Apoptose (E1B). Sie greifen auch in die Regulation der frühen oder späten viralen Gene auf dem Niveau der Transkription, des Spleißens oder des Transports der Messenger-RNA ein (E1A, E2A, E4). Sie spielen auch eine Rolle in der Replikation und in der Hemmung der Immunantwort.
– Die "delayed-early"-Gene (pIX und IVa2) sind mit der Regulierung der Transkription der späten bzw. "late" Gene (IVa2) oder dem Zusammenfügen des Virion (pIX) verbunden.
– Die späten bzw. "late" Gene (L1 bis L5) sind Transkripte des starken Promotors (MLP). Ein primäres Transkript mit 28 kb erlaubt es, Transkripte zu erzeugen, die den verschiedenen Strukturproteinen (Kern-, Penton-, Hexon-) und Nicht-Strukturproteinen entsprechen, die an der Zusammenfügung und der Reifung von Viruspartikeln durch alternatives Spleißen und Verwendung der fünf Polyadenylierungsstellen beteiligt sind.

Adenovirale Vektoren wurden für die Klonierung und die Expression von Genen in vitro (Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York, 11724, S. 187), für die Schaffung transgener Tiere (WO 95/22616), für den Transfer von Genen in Zellen ex vivo (WO 95/14785; WO 95/06120) oder auch für den Transfer von Genen in Zellen in vivo (siehe insbesondere WO 93/19191, WO 94/24297, WO 94/08026) verwendet.
Was die Adeno-assoziierten Viren (AAV) angeht, so handelt es sich um Viren mit einer DNA mit relativ verringerter Größe, die sich in das Genom der Zellen integrieren, die sie infizieren, und zwar in stabiler Art und relativ ortsspezifisch. Sie sind fähig, ein breites Spektrum an Zellen zu induzieren, ohne einen Effekt auf das Wachstum, die Morphologie oder die Zelldifferenzierung zu induzieren. Im Übrigen scheinen sie nicht in Pathologien beim Menschen verwickelt zu sein. Das Genom der AAV wurde kloniert, sequenziert und charakterisiert. Es umfasst ungefähr 4700 Basen und enthält an jedem Ende eine invertierte Wiederholungsregion (ITR) mit etwa 145 Basen, die für das Virus als Replikationsursprung dient. Der Rest des Genoms ist in zwei essentielle Regionen aufgeteilt, die die Einkapselungsfunktionen bzw. Encapsidationsfunktionen tragen: Der Teil links des Genoms, der das REP-Gen enthält, das in der viralen Replikation und der Expression der viralen Gene impliziert ist; der Teil rechts des Genoms, der das CAP-Gen enthält, das für die Capsidproteine des Virus codiert.
Die Verwendung von Vektoren, die von AAV stammen, für den Transfer von Genen in vitro und in vivo, wurde in der Literatur beschrieben (siehe insbesondere WO 91/18088, WO 93/09239, US 4 797 368 , US 5139 941 , EP 488 528 ).
Was die Retroviren betrifft, so handelt es sich um integrative Viren, die selektiv die Zellen in Teilung infizieren. Sie bilden beispielsweise Vektoren von Interesse für Anwendungen bei Krebs oder Restenose. Das Genom der Retroviren umfasst im Wesentlichen zwei LTR, eine Einkapselungssequenz bzw. Encapsidationssequenz und drei kodierende Regionen (gag, pol und env). Die Konstruktion von rekombinanten Vektoren und ihre Verwendung in vitro oder in vivo wurde in der Literatur umfangreich beschrieben: siehe insbesondere Breakfield et al., New Biologist, 3 (1991), 203; EP 453 242 , EP 178 220 , Bernstein et al., Genet. Eng., 7 (1985), 235; McCormich, BioTechnology, 3 (1985), 689, usw.
Für ihre Verwendung als rekombinante Vektoren wurden verschiedene Konstruktionen, die von den Viren abgeleitet sind, hergestellt, die verschiedene Gene von Interesse einbauen. In jeder dieser Konstruktionen wurde das virale Genom derart modifiziert, dass das Virus zur autonomen Replikation in der infizierten Zelle unfähig gemacht wird. So sind die Konstruktionen, die im Stand der Technik beschrieben sind, Viren, die bezüglich bestimmter Regionen ihres Genoms, die für die Replikation essentiell sind, defekt sind. Was insbesondere die Adenoviren angeht, so weisen die Konstruktionen der ersten Generation eine Deletion in/der Region E1 auf, die für die virale Replikation essentiell ist, auf dem Niveau der die heterologen DNA-Sequenzen insertiert sind (Levrero et al., Gene, 101 (1991), 195; Gosh-Choudhury et al., Gene, 50 (1986), 161). Um die Eigenschaften des Vektors zu verbessern, wurde im Übrigen vorgeschlagen, andere Deletionen oder Modifikationen im Genom des Adenovirus zu schaffen. So wurde in die Mutante tsl25 eine thermoempfindliche Punktmutation eingeführt, die es möglich macht, das Bindungsprotein für DNA (DBP) mit 72 kDa, das durch die Region E2 codiert wird, zu inaktivieren (Van der Vliet et al., 1975). Andere Vektoren enthalten eine Deletion einer anderen Region, die für die Replikation und/oder die Virusvermehrung essentiell ist, die Region E4. Adeno-virale Vektoren, in denen die Regionen E1 und E4 deletiert sind, besitzen ein Transkriptions-Grundrauschen und eine Expression von viralen Genen, die sehr reduziert sind. Solche Vektoren sind zum Beispiel in den Anmeldungen WO 94/28152, WO 95/02697, WO 96/22378 beschrieben. Im Übrigen wurden auch Vektoren beschrieben, die eine Modifikation auf dem Niveau des Gens IVa2 tragen (WO 96/10088). Außerdem wurden auch Vektoren, die "Adenovirus-Minimum" oder "Pseudo-Adenovirus" (oder auch AdΔ) genannt werden, und nur Regionen, die in cis für die Produktion des Virus notwendig sind (ITR-Sequenzen und Einkapselungssequenzen) notwendig sind, enthalten und frei von jeder kodierenden viralen Sequenz sind, beschrieben (WO 94/12649, WO 94/28152, WO 95/02697), obgleich ihre Produktion sehr schwierig bleibt, wie im Folgenden erläutert wird.
Was AAV angeht, so sind die beschriebenen Vektoren allgemein frei von der Gesamtheit der kodierenden Regionen Rep und Cap, die durch Nukleinsäuren von Interesse ersetzt sind.
In den rekombinanten Vektoren, die von Retroviren stammen, sind im Allgemeinen die Gene gag, pol und env deletiert, ganz oder teilweise, und durch eine heterologe Nukleinsäure von Interesse ersetzt. Im Übrigen können die rekombinanten Retroviren Modifikationen auf dem Niveau der LTR, um die Transkriptionsaktivität zu unterdrücken, sowie ausgedehnte Enkapsidationssequenzen, die einen Teil des Gens gag enthalten, enthalten (Bender et al., J. Virol., 61 (1987), 1639).
Im Hinblick auf ihr defektives Merkmal für die Replikation impliziert die Produktion dieser verschiedenen Virusrekombinanten die Möglichkeit, die deletierten Funktionen des Genoms zu transkomplementieren. Die Transkomplementation ist genau der Ursprung der Hauptschwierigkeiten für die Produktion dieser Viren und insbesondere den Eintrag der Transkomplementationsfunktionen.
Diesbezüglich wurden zwei Ansätze entwickelt. Der erste beruht auf der Konstruktion von transkomplementierenden Linien, die Encapsidationslinien genannt werden. Der zweite beruht auf der Verwendung von Helfer-Adenoviren oder Helfer-Plasmiden.
Es wurden verschiedene Enkapsidationslinien von defektiven Viren konstruiert. Diese Linien bzw. Stämme sind fähig, die Defizienzfunktionen in dem viralen Vektor zu produzieren. Im Allgemeinen enthalten diese Linien in ihrem Genom integriert die Region(en), die im viralen Genom deletiert ist (sind) (E1, E2 und/oder E4 zum Beispiel für das Adenovirus; gag, pol und/oder env für das Retrovirus, rep und/oder cap für das AAV).
Eine der Linien, die für die Produktion von defektivem Adenovirus bekannt sind, ist zum Beispiel die Linie 293, in der ein Teil des Genoms des Adenovirus integriert wurde. Genauer ausgedrückt, die Linie 293 ist eine humane embryonale Zelllinie, die das linke Ende (etwa 11 bis 12 %) des Genoms des Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) enthält, umfassend die linke ITR, die Encapsidationsregion, der Region E1, die E1a und E1b enthält, die Region, die für das Protein pIX codiert, und einen Teil der Region, die für das Protein pIVa2 codiert. Dieser Stamm ist fähig, rekombinante Adenoviren, die bezüglich der Region E1 defektiv sind, d.h. von der Region E1 ganz oder teilweise frei sind, zu transkomplementieren und virale Stammlösungen mit erhöhten Titern zu produzieren. Diese Linie ist auch fähig, bei zulässiger Temperatur (32 °C) Virusbestände zu produzieren, die außerdem die thermosensible E2-Mutation enthalten. Andere Zelllinien, die fähig sind, die Region E1 zu komplementieren, wurden beschrieben, basierend insbesondere auf humanen Lungenkarzinomzellen A549 (WO 94/28152) oder auf humanen Retinoblasten (Hum. Gen. Ther., (1996), 215). Im Übrigen wurden auch Linien beschrieben, die fähig sind, mehrere Adenovirusfunktionen zu transkomplementieren. Man kann insbesondere Stämme bzw. Linien, die die Regionen E1 und E4 komplementieren (Yeh et al., J. Virol., 70 (1996), 559; Cancer Gen. Ther., 2 (1995), 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther., 6 (1995), 1575) und Stämme bzw. Linien, die die Regionen E1 und E2 komplementieren (WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/27071), nennen.
Für die Produktion von defektiven bzw. defekten Retroviren wurden verschiedene Linien beschrieben, die im Allgemeinen fähig sind, die Gene gag, pol und env zu exprimieren. Solche Linien sind zum Beispiel die Linie PA317 ( ZS 4 861 719 ), die Linie PsiCRIP (WO 90/02806), die Linie GP+envAm-12 (WO 89/07150), die Linie BOSC (WO 94/19478), usw. Um rekombinante Retroviren zu konstruieren, die eine Nukleinsäure von Interesse enthalten, wird ein Plasmid, das insbesondere LTR, die Encapsidationssequenz und die genannte Nukleinsäure enthält, konstruiert, dann verwendet, um eine Encapsidationslinie, wie sie unten beschrieben wird, zu transfizieren, wobei die defizienten retroviralen Funktionen in trans in das Plasmid eingebracht werden können. Die produzierten rekombinanten Viren werden dann durch klassische Techniken gereinigt.
Die Verwendung von Stämmen kann jedoch bestimmte Nachteile zeigen. So ist es schwierig, teuer und beschränkend auf industriellem Niveau solche Linien zu konstruieren und zu validieren. In der Tat müssen diese Stämme stabil und mit industriellen Verwendungen kompatibel sein. Darüber hinaus ermöglichen die beschriebenen Stämme es nur schwer, die Produktion von replikativen kontaminierenden Viren (RCA) auszuweiten. Im Übrigen ermöglichen diese Stämme bis heute keine zufrieden stellende industrielle Verwendung, keine Transkomplementation von stark defektiven viralen Genomen, wie zum Beispiel Adenoviren-Minimum, wie sie oben beschrieben wurden. Tatsächlich besitzt das Adenovirus ein Genom, das in verschiedene Transkriptionseinheiten organisiert ist, dessen räumlich-zeitliche Regulation sehr kompliziert ist. Die Transkomplementation eines Adenovirus, bei dem alle kodierenden viralen Sequenzen deletiert sind, indem jede Transkriptionseinheit getrennt von einer Zelllinie exprimiert wird, konnte bis heute nicht in zufrieden stellender Weise realisiert werden. So wurde nur ein geringer Anteil des Genoms, das den Regionen E1, E4, pIX und drei Proteinen, die durch E2 codiert werden (po, DBP und p-TP) in konstitutiver Art von Zelllinien exprimiert. Der Rest des Genoms entspricht der Haupteinheit der späten Transkription (MLTU), die alle Messenger der strukturellen und nicht-strukturellen Proteine aus einem primären Transkript mit 28 kb produziert, und nach der Replikation des Genoms aktiv ist. Zur Erzeugung der Adenoviren-Minimum ist demnach die Transkomplementierung dieser Regionen unverzichtbar. Diese Linien ermöglichen es darüber hinaus nicht mehr, stark erhöhte Titer an rekombinanten Retroviren zu erhalten.
Der zweite Ansatz besteht darin, mit dem viralen defektiven Genom eine Konstruktion (Plasmid oder Adenovirus), die die Komplementierungsfunktionen beiträgt, zu kotransfizieren. Im Allgemeinen werden insbesondere die defektiven rekombinanten AAV zur Co-Transfektion präpariert, und zwar in einer Zelllinie, die durch ein humanes Hilfsvirus (zum Beispiel ein Adenovirus) infiziert ist, eines Plasmids, das eine Nukleotidsequenz von Interesse flankiert von zwei inversen Wiederholungsregionen (ITR) von AAV enthält, und eines Plasmids, das Komplementierungsfunktionen (Gene rep und cap) von AAV trägt. Varianten wurden in den Anmeldungen WO 95/14771; WO 95/13365; WO 95/13392 oder WO 95/06743 beschrie ben. Der Nachteil der Verwendung eines Helfer-Adenovirus beruht hauptsächlich auf den Rekombinationsrisiken, die zwischen dem adenoviralen Vektor und dem Helfer-Adenovirus entstehen, und in der Schwierigkeit, die Rekombinante des Helfers während der Produktion und der Reinigung von Virusbeständen abzutrennen. Der Nachteil der Verwendung eines Helfer-Plasmids, zum Beispiel eines Plasmids Rep/cap basiert auf den erhaltenen Transfektionsniveaus, die es ermöglichen, erhöhte Virus-Titer zu erzeugen.
In der Anmeldung WO 96/09074 wurde auch ein Baculovirus-Vektor beschrieben, der die ITR-Sequenzen (integrative terminale Wiederholung) des AAV derart enthält, dass seine Integration ermöglicht wird. Das Baculovirus, wie es in dieser Anmeldung beschrieben wird, umfasst gegebenenfalls das Gen rep von AAV, um eine Exzision und Insertion der DNA in das Genom der Target-Zellen zu erleichtern.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt nun ein neues Produktionssystem für Viren, das es erlaubt, diese Unzulänglichkeiten zu lindern. Das erfindungsgemäße System beruht auf der Verwendung eines Baculovirus, um die Komplementierungsfunktionen beizutragen.
Das erfindungsgemäße System erlaubt es in besonders vorteilhafter Weise, sich von der Verwendung von etablierten Komplementierungslinien freizumachen, RCA-Probleme zu vermeiden, und hoch defektive Genome zu Transkomplementieren. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße System auf jede Zelle anwendbar, die durch das gewünschte Virus oder durch ein Baculovirus infizierbar ist, und bietet so eine große Anwendungsbreite.
Eine erste Aufgabe der Erfindung beruht in einem Verfahren zur Herstellung von rekombinanten defekten Viren, nach dem man in eine Population kompetenter Zellen das Genom des rekombinanten defekten Virus und ein Baculovirus einführt, das alle Funktionen oder einen Teil der Funktionen enthält, die zur Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms notwendig sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert demnach auf der Verwendung eines Baculovirus zur Einbringung der komplementierenden Funktionen. Es sind verschiedene Ansätze möglich. Man kann zunächst kompetente Zellen verwenden, die keine Transkomplementationsfunktion des rekombinanten defekten Genoms exprimieren. In diesem Fall ist es möglich, entweder ein Baculovirus zu verwenden, das die Gesamtheit der Funktionen enthält, die zur Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms notwendig sind, oder mehrere Baculoviren zu verwenden, von denen jedes eine oder mehrere der Funktionen trägt, die zur Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms notwendig sind. Es ist auch möglich, eine Population kompetenter Zellen zu verwenden, die fähig sind, schon eine oder mehrere Funktionen des rekombinanten defekten Genoms (Encapsidationslinie) zu transkomplementieren. In diesem Fall trägt das verwendete Baculovirus oder tragen die verwendeten Baculoviren allein die Funktionen, die für die Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms notwendig sind, die für die kompetenten Zellen nicht schon transkomplementiert sind.
Wie oben angegeben wurde, sind die Vorzüge des erfindungsgemäßen Systems im Hinblick auf eine Industrialisierung (keine Notwendigkeit von Linien, keine von RCA, usw.) und im Hinblick auf Anwendungen (Produktion von rekombinanten Viren, die jeden Deletionstyp tragen und insbesondere von hoch defekten rekombinanten Adenoviren) zahlreich. Außerdem wird die erhaltene virale Präparation in dem Maße, wie das Baculovirus in den humanen Zellen repliziert, nicht durch das Baculovirus kontaminiert. Darüber hinaus, da das Baculovirus entfernt phylogenetisch mit den Adenoviren verwandt ist, gibt es keine Risiken der Rekombination oder Transkomplementation zwischen den beiden. Dieses System erlaubt es demnach, in vorteilhafter Weise konzentrierte Bestände an defektem Virus zu erzeugen, die frei von RCA sind. Dieses System ist für die Produktion von rekombinanten defekten Adenoviren besonders vorteilhaft.
Die Baculoviren sind Hüllviren mit zweisträngier kreisförmiger DNA, die für Wirbellose spezifisch ist. Ihr Prototyp, AcNPV, hat ein Genom aus 133 kb. Es wird häufig als Expressionsvektor von Eukaryoten-Genen in Insektenzellen, ausgehend von zwei starken Promotoren, verwendet. [Polyhedrin (Ph) und P10], (King und Possee, The baculovirus expression system. Loncon: Chapman & Hall, 1992). AcNPV ist fähig, bestimmte Säugerzellen zu infizieren, allerdings wird das Genom weder transkribiert noch translatiert. Vor kurzem haben Hoffmann et al., (PNAS 92 (1995), 10099) gezeigt, dass hepazytäre Zellen durch ein gereinigtes rekombinantes Baculovirus, das das Gen LacZ exprimiert, transduziert werden können. Selbst bei einer Infektions-Multiplizität von Tausend wurde keine Zelltoxizität beschrieben, und die in diesem Artikel beschriebene Transfektionswirksamkeit ist für eine MOI von 100 etwa 50 %.
Die Anmelderin hat nun gezeigt, dass es möglich ist, verschiedene Zelltypen mit einem rekombinanten Baculovirus zu infizieren. Die Anmelderin hat insbesondere gezeigt, dass es möglich war, Zellen humanen Ursprungs, wie immortalisierte Embryozellen, mit einem rekombinanten Baculovirus zu infizieren. Die Anmelderin hat auch gezeigt, dass es möglich ist, eine stark erhöhte Transduktionswirksamkeit (> 80 %) zu erhalten. Die Anmelderin hat auch gezeigt, dass es möglich ist, in ein Baculovirus Komplementationsfunktionen eines Adenovirus einzuführen, und diese Funktionen in einer Population kompetenter Zellen zu exprimieren. Die Anmelderin konnte auch zeigen, dass das Baculovirus einen inerten Vektor darstellt, der vorteilhafterweise für den Transfer und die Expression von Komplementationsfunktionen von Viren in Säugerzellen, insbesondere humane Säugerzellen, verwendet werden kann. Andere Vorzüge des erfindungsgemäßen Systems sind insbesondere (i) die große Klonierungskapazität, die es ermöglicht, ein ganzes adenovirales Genom zu komplementieren, und (ii) die fortgeschrittene Entwicklung der Technologie des Baculovirus.
Das Baculovirus, das die Komplementationsfunktionen des Virus trägt, wird im Folgenden auch als Helfer-Baculovirus bezeichnet. Es kann verschiedene Komplementationsfunktionen des Virus enthalten.
So kann das Helfer-Baculovirus die Region E1 des Adenovirus enthalten. Ein Baculo-E1 kann zur Produktion von Adenoviren der ersten Generation, das heißt, Adenoviren, die bezüglich der Region E1 defekt sind (AdΔE1), verwendet werden, welchen Status E3 es auch immer hat (d.h. AdΔE1.ΔE3-defekt bzw. defektiv oder nicht). Die Produktion von defekten bzw. defektiven rekombinanten Adenoviren der ersten Generation (bezüglich der Region E1 und gegebenenfalls E3-defekt) bildet eine erste besonders vorteilhafte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wie oben angegeben wurde, wurden verschiedene Linien in der Literatur beschrieben, die fähig sind, die Funktion E1 zu transkomplementieren (Zellen 293, Zellen A549, Zellen 911, usw.). Es existieren jedoch Homologiezonen zwischen der Region, die die Transkomplementationsfunktionen trägt, die in das Genom der Linie integriert ist, und der DNA des rekombinanten Virus, das man produzieren möchte. Aufgrund dieser Tatsache können im Verlauf der Produktion verschiedene Rekombinations-Ereignisse auftreten, die replikative virale Partikel produzieren, und zwar insbesondere Adenoviren des Typs E1+. Es handelt sich um ein einfaches Rekombinations-Ereignis, gefolgt von einem Brechen des Chromosoms oder einer doppelten Rekombination. Diese zwei Modifikationstypen führen dazu, dass die Region E1, die im Zell-Genom enthalten ist, wieder in ihren ursprünglichen Lokus im Inneren des adenoviralen Genoms integriert wird. Im Übrigen wird unter Berücksichtigung der erhöhten Titer an rekombinantem Vektor, die durch die Linie 293 produziert werden (über 10¹²), die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass diese Rekombinations-Ereignisse stattfinden. Tatsächlich wurde festgestellt, dass viele Chargen an defekten rekombinanten adenoviralen Vektoren durch virale replikative Partikel kontaminiert waren, was für pharmazeutische Verwendungen einen wichtigen Nachteil bilden kann. In der Tat würde das Vorliegen solcher Partikel in therapeutischen Zusammensetzungen in vivo eine Virusvermehrung und eine unkontrollierte Verbreitung mit den Gefahren einer Entzündungsreaktion, einer Rekombination, usw. induzieren. Die kontaminierten Chargen können demnach nicht in der Human-Therapie eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung erlaubt es, diese Nachteile zu lindern. In der Tat wird nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens des Genoms des rekombinanten Adenovirus, das bezüglich der Region E1 und gegebenenfalls E3 defekt ist, in die kompetenten Zellen eingeführt, diese Zellen werden in gleichzeitiger Art oder nicht gleichzeitiger Art durch ein Baculovirus, das die Region E1 enthält, infiziert; die Region E1 des Adenovirus, die im Baculovirus vorhanden ist, und das Genom des defekten rekombinanten Adenovirus enthalten keine Homologiezone (Überlappung), die für das Auftreten einer Rekombination empfindlich ist. Nach dieser Ausführungsform ist es somit möglich, schnell, ohne etablierte Linie, Bestände an rekombinanten Adenoviren der ersten Generation, die frei von RCA sind, zu produzieren. Wie nachfolgend angegeben wird, können außerdem die so erzeugten Bestände an rekombinanten Adenoviren, die frei von RCA sind, als Ausgangsmaterial für eine neue Produktion durch Co-Infektion in den kompetenten Zellen mit einem Baculovirus verwendet werden.
Das Helfer-Baculovirus kann auch einen Teil der Region E2 des Adenovirus oder die ganze Region E2 des Adenovirus, insbesondere die Region E2a und/oder E2b, enthalten. Ein Baculo-E2 kann in kompetenten Zellen eingesetzt werden, um Adenoviren zu produzieren, die bezüglich der Region E2 defekt sind (Ad-ΔE2), und die gegebenenfalls bezüglich der Region E3 defekt sind (Ad-ΔE2, ΔE3). Außerdem kann das Baculo-E2 in kompetenten Zellen, die fähig sind, die Region E1 des Adenovirus zu komplementieren, die Produktion von rekombinanten Adenoviren erlauben, die bezüglich der Regionen E1 und E2 (Ad-ΔE1, ΔE2) und gegebenenfalls E3 (Ad-ΔE1, ΔE2, ΔE3) defekt sind. Darüber hinaus kann das Baculo-E2 in kompetenten Zellen, die fähig sind, die Regionen E1 und E4 des Adenovirus zu komplementieren (zum Beispiel in den Zellen IGRP2), die Produktion von rekombinanten Adenoviren ermöglichen, die bezüglich der Regionen E1, E2 und E4 (Ad-ΔE1, ΔE2, ΔE4) und gegebenenfalls E3 (Ad-ΔE1, ΔE2, ΔE3, ΔE4) defekt sind.
Das Helfer-Baculovirus kann auch die Region E4 (ganz oder teilweise) des Adenovirus enthalten. Ein Baculo-E4 kann verwendet werden, um in kompetenten Zellen Adenoviren zu produzieren, die bezüglich der Region E4 defekt sind (Ad-ΔE4) und gegebenenfalls bezüglich der Region E3 (Ad-ΔE4, ΔE3) defekt sind. In kompetenten Zellen, die fähig sind, die Region E1 des Adenovirus zu komplementieren, kann das Baculo-E4 außerdem die Produktion von rekombinanten Adenoviren ermöglichen, die bezüglich der Regionen E1 und E4 (Ad-ΔE1, ΔE4) und gegebenenfalls E3 (Ad-ΔE1, ΔE4, ΔE3) defekt bzw. defektiv sind.
Das Helfer-Baculovirus kann auch die Regionen E1 und E4 (ganz oder teilweise) des Adenovirus enthalten. Ein Baculo-E1, E4 kann eingesetzt werden, um in kompetenten Zellen Adenoviren zu produzieren, die bezüglich der Regionen E1 und E4 (Ad-ΔE1, ΔE4) und gegebenenfalls E3 (Ad-ΔE1, ΔE4, ΔE3) defekt sind, wie es in 1 dargestellt ist.
Um Viren zu erzeugen, die bezüglich der Regionen E1 und E4 defekt sind, ist es außerdem auch möglich, zwei Helfer-Baculoviren zu verwenden, wobei das eine die Funktion E1, das andere die Funktion E4, ganz oder teilweise, exprimiert.
In derselben Art kann das Helfer-Baculovirus die Regionen E1, E2 und E4 (ganz oder teilweise) und gegebenenfalls die Regionen, die die späten Gene (L1–L5) tragen, enthalten.
Das Helfer-Baculovirus kann auch die Region Rep und/oder Cap des AAV enthalten. Ein Baculo-Rep/Cap ermöglicht es demnach, ein AAV-Genom, das frei von jeder kodierenden viralen Sequenz ist, in einer kompetenten Zelllinie zu komplementieren (5).
Das Baculovirus kann auch die Regionen gag, pol und/oder env eines Retrovirus enthalten. Ein Baculo-gag/pol/env ermöglicht es demnach, in einer Linie kompetente Zellen ein retrovirales Genom, das frei von jeglicher viral kodierender Sequenz ist, zu komplementieren. Es ist auch möglich, ein Baculovirus zu verwenden, das die Regionen gag/pol enthält, und ein zweites Baculovirus zu verwenden, das die Region env enthält.
Allgemein ist es bevorzugt, dass das Genom des defekten rekombinanten Virus und die Komplementationsregionen, die im Baculovirus vorhanden sind, keine Überlappung aufweisen. Dies ermöglicht es tatsächlich, die Gefahren der Rekombination und auch der Erzeugung von RCA zu vermeiden. Dies ist besonders für die Erzeugung von Adenoviren der ersten Generation von Bedeutung (Ad-ΔE1). In diesem Fall wird die Region E1, die in das Baculovirus eingeführt ist, derart definiert, dass sie keine Sequenz besitzt, die sie mit dem rekombinanten Genom gemeinsam hat. Dazu ist es zum Beispiel möglich, eine größere Region des rekombinanten Genoms zu deletieren als die komplementierende insertierte Region in dem Baculovirus, wie es in den Beispielen dargestellt ist. Dies ist für die Erzeugung des Adenovirus Ad-ΔE1, ΔE4 auch von Vorteil.
So wird in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das Genom des defekten rekombinanten Virus in die kompetenten Zellen eingeführt, diese Zellen werden in gleichzeitiger Art oder nicht durch ein Baculovirus infiziert, das alle Funktionen oder einen Teil der Funktionen, die für die Komplementierung des defekten Genoms erforderlich sind, enthält, wobei die Komplementationsfunktionen, die in dem Baculovirus vorliegen, und das Genom des defekten rekombinanten Virus keine Homologiezone enthalten, die eine Rekombination ergeben kann. Vorteilhafterweise ist das virale Genom ein Genom von rekombinantem Adenovirus, das bezüglich der Region E1 defekt ist, und vorzugsweise trägt das Baculovirus eine Region des Adenovirus, die fähig ist, die Region E1 zu transkomplementieren. Nach einer anderen Variante ist das virale Genom ein Genom des rekombinanten Adenovirus, das bezüglich der Regionen E1 und E4 defekt ist, und das Baculovirus trägt zwei Adenovirus-Regionen, die die genannten Regionen transkomplementieren können, oder es werden zwei Baculoviren verwendet, das eine trägt eine Region des Adenovirus, die die Region E1 transkomplementieren kann, und das andere eine Region des Adenovirus, die die Region E4 transkomplementieren kann, und zwar ohne Homologiezonen mit dem defekten Adeno-viralen Genom.
Nach einem besonderen Durchführungsmodus wird die Gesamtheit der kodierenden Regionen des Adenovirus durch ein oder mehrere Baculovirus-Helfer getragen. Nach einer ganz besonderen Ausführungsform verwendet man ein einziges Helfer-Baculovirus, das die Gesamtheit der kodierenden Regionen des Adenovirus enthält. Ein solches Helfer-Baculovirus ist demnach verwendbar, um die rekombinanten Minimum-Adenoviren zu transkomplementieren. Ein derartiges Virus kann insbesondere die Gesamtheit eines adenoviralen Genoms mit Ausnahme der Encapsidationsregion und gegebenenfalls der ITRs enthalten, wie es in den Beispielen dargestellt ist.
Herstellung der Komplementationsfunktionen
Die Komplementationsfunktionen, die in das Helfer-Baculovirus eingeführt werden, können aus Viren unterschiedlicher Serotypen stammen.
Wenn es sich um Adenoviren handelt, so existieren davon tatsächlich verschiedene Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften etwas variieren, die aber eine vergleichbare genetische Organisation zeigen. Insbesondere stammen die Komplementationsfunktionen, die für die Konstruktion der Baculoviren gemäß der Erfindung verwendet werden, von einem Adenovirus humanen oder tierischen Ursprungs.
Was die Adenoviren menschlichen Ursprungs angeht, so kann man vorzugsweise die nennen, die der Gruppe C zugeordnet sind. Noch bevorzugter verwendet man unter den verschiedenen Serotypen des humanen Adenovirus im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die Adenoviren des Typs 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5). Es ist auch möglich, die Regionen zu verwenden, die vom Adenovirus Typ 7 oder 12 stammen, die zu den Gruppen A und B gehören. Unter den verschiedenen Adenoviren tierischen Ursprungs verwendet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Adenoviren vom Hund und insbesondere alle Stämme der CAV2-Adenoviren [zum Beispiel Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800)]. Andere Adenoviren tierischen Ursprungs sind insbesondere in der Anmeldung WO 94/26914 genannt, die hier durch Bezugnahme aufgenommen gilt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt die Komplementationsfunktion aus einem Genom des humanen Adenovirus der Gruppe C. In bevorzugter Art stammt sie aus dem Genom eines Adenovirus Ad2 oder Ad5.
Die Regionen, die unterschiedliche Komplementationsfunktionen tragen, können ausgehend von einem adenoviralen Genom durch enzymatischen Verdau nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. Diese Regionen können gegebenenfalls durch Verringerung ihrer Größe oder durch Ersetzen bestimmter Regulationselemente (Promotor, Enhancer, usw.) durch heterologe Elemente modifiziert werden. Allgemein werden diese Regionen wie folgt hergestellt. Die DNA eines Adenovirus wird durch Zentrifugieren mit Cäsiumchloridgradienten gereinigt oder in vitro, ausgehend von einem Procaryotenplasmid (WO 96/25506) oder Eucaryotenplasmid (WO 95/03400) erhalten. Die DNA wird dann durch geeignete Restriktionsenzyme gespalten und die erhaltenen Fragmente, die die gesuchten Komplementationsfunktionen tragen, werden identifiziert und selektiert. Die Wahl der verwendeten Restriktionsenzyme hängt von den gesuchten Komplementationsfunktionen ab. Sie wird dann durch die Restriktionskarten und die veröffentlichten Sequenzen der adenoviralen Genome gelenkt. So kann die Region E1 in Form von Fragmenten isoliert werden, die die Leseraster E1A und E1B stromabwärts des Promotors E1A tragen. Die Region E4 kann in Form von Fragmenten isoliert werden, die die Gesamtheit der Leseraster oder nur einen Teil dieser und vorzugsweise die Phasen ORF3 oder ORF6 oder ORF6-ORF6/7 tragen.
Ähnliche Methodologien werden durchgeführt, um die Komplementationsregionen von AAV und rekombinanten Viren herzustellen. So können die Regionen rep und/oder cap von AAV durch enzymatischen Verdau, ausgehend von der isolierten viralen DNA verschiedener Serotypen von AAV, erhalten werden. Es handelt sich vorzugsweise um AAV-2. Für die Retroviren können die Regionen gag, pol und/oder env gleichermaßen nach den klassischen Techniken der Molekularbiologie, ausgehend von verschiedenen Retrovirustypen wie zum Beispiel MoMuLV ("Murine Moloney Leukemia Virus" = Maus-Moloney-Leukämievirus; auch MoMLV genannt), MSV ("Murine Moloney Sarcoma Virus" = Maus-Moloney-Sarcoma- virus), HaSV ("Harvey Sarcoma Virus"); SNV ("Spleen Necrosis Virus" = Milznekrosevirus); RSV ("Rous Sarcoma Virus" = Ruß-Sarcomavirus) oder auch dem Friend-Virus erhalten werden.
Konstruktion des Helfer-Baculovirus
Die Fragmente, die die Komplementationsregionen tragen, werden dann in einen Plasmidvektor, der ihre Manipulation (Verdau plus "fines", PCR, Anfügungen von Regulationssequenzen, usw.) zulässt, zum Beispiel in einem Procaryoten- oder Eucaryoten-Organismus, kloniert. Das erhaltene Endfragment, das für die Komplementationsfunktion(en) codiert, wird dann in das Helfer-Baculovirus eingeführt, indem die klassischen Techniken der Molekularbiologie genutzt werden. Genau ausgedrückt, das Fragment wird zwischen zwei homologe Sequenzen in eine Region des Genoms eines Baculovirus kloniert, dann wird das resultierende Fragment oder Plasmid mit dem Genom eines Baculovirus in Insektenzellen co-transfiziert (klassischerweise Sf9- und Sf21, Zellen von Spodoptera frugiperda, aber auch Tn-368 und High-Five^(TM) BTI-TN-5B1-4 (Gibco), Zellen von Trichopulsia ni, oder jede andere Insektenzelle, die für Baculovirus durchlässig ist und für seine Produktion verwendbar ist). Die homologe Rekombination zwischen dem Plasmid oder Fragment und dem Genom des Baculovirus erzeugt das gewünschte rekombinante Baculovirus, das nach klassischen Methoden gewonnen und gereinigt werden kann (siehe insbesondere King und Possee: the baculovirus expression system. London: Chapman & Hall, 1992). Für die Konstruktion von rekombinanten Baculoviren sind verschiedene Kits im Handel, die Shuttle-Vektoren tragen; diese können nach den Empfehlungen der Hersteller verwendet werden. Man kann insbesondere die Shuttle-Vektoren pBAC, die von der Firma Clontech vertrieben werden, die Vektoren pAc (Verne et al., Bio/Technology, 6 (1988), 47, Pharmingen, USA), die Vektoren pBlue-Bac (Invitrogen) und auch die Vektoren pBSV (Boehringer) verwenden. Die Komplementationsfunktionen können so in verschiedenen Stellen des Baculovirus und insbesondere in den Lokus des Gens des Polyhedrins oder des Gens p10 insertiert werden. Im Übrigen können verschiedene Baculovirusstämme verwendet werden, wie zum Beispiel insbesondere AcNPV oder Bombyx mori (Maeda et al., Nature, 315 (1988), 592). Andererseits kann das verwendete Baculovirus zur Verbesserung/Veränderung seines Tropismus modifiziert werden. Es ist in der Tat möglich, den Tropismus der viralen Vektoren zu modulieren, indem ihre Oberflächenproteine modifiziert werden, um (i) ihn durch Fusion viraler Proteine mit einem spezifischen Liganden (leichte Kette von Immunglobulin, Gastrin-Releasing-Peptid) zu beschränken, oder (ii) durch Bildung von Pseudotypen mit einem heterologen viralen Glycoprotein zu erweitern [G des Virus des Stomatite Vésiculeuse (VSV)], [Liu et al., J. Virol., 70(4) (1996), 2497; Michael et al., Gene Ther., 2 (1995), 660]. Vor kurzem wurde gezeigt, dass das Oberflächenglycoprotein des Baculovirus (gp64), das an das gp120 des HIV-Virus fusioniert ist, fähig ist, sich am Rezeptor CD4 zu fixieren (Boublik et al., Bio/Technology, 13 (1995), 1079). Diese Modifikation des gp64 beeinträchtigt die Lebensfähigkeit des Baculovirus in Insektenzellen nicht. Ein mit G von VSV analoger Aufbau müsste es ermöglichen, den Tropismus des Baculovirus für die Säugerzellen zu verbessern, und somit die Wirksamkeit der Transduktion der Huh7-Zellen sowie anderer Zelllinien zu verbessern.
Im Helfer-Baculovirus sind die Komplementationsfunktionen vorteilhafterweise unter die Kontrolle eines heterologen Promotors (d.h. mit einer anderen Herkunft als dem Baculovirus), der in den kompetenten Zellen funktionell ist, gestellt. Es hat tatsächlich den Anschein, dass die Promotoren des Baculovirus es nicht erlauben, ausreichende Expressionslevel der Komplementationsfunktionen in den anderen Zellen als den Insektenzellen zu erhalten, und demnach sind sie nicht die am geeignetesten für die Anwendungen der Erfindung. Der Promotor kann zuerst der eigene Promotor (homologer Promotor) der Komplementationsfunktionen des Virus sein (Promotor E1A, E4, E2, MLP für das Adenovirus, Promotoren P5 oder P19 des AAV, Promotor der LTR des RSV, usw.). Es kann sich auch um jeden Promotor anderen Ursprungs handeln, der in der verwendeten kompetenten Zelle funktionell ist. Zu diesem Zweck kann man zum Beispiel die Promotoren von Genen nennen, die in dieser Zelle exprimiert werden, oder ubiquitäre bekannte Promotoren, wie zum Beispiel der Promotor des Gens PGK, der Promotor des Immediate-Early-Gens des CMV, der Promotor des TK-Gens des Herpesvirus oder auch der Promotor der LTR des RSV. Es kann sich auch um reguläre Promotoren wie zum Beispiel den Promotor des Virus MMTV, einen Promotor, der auf Hormone reagiert, zum Beispiel vom GRE5-Typ, oder einen durch Tetracyclin regulierten Promotor (WO) handeln. Vorteilhafterweise handelt es sich um einen homologen Promotor, ubiquitär, stark oder induzierbar.
Demnach betrifft ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Baculovirus, das in sein Genom eine Nukleinsäure eines Virus insertiert hat, die für eine Komplementationsfunktion codiert, und unter die Kontrolle eines heterologen Promotors gestellt ist. Insbesondere ist die Komplementationsfunktion ein Protein, das zur Produktion des Virus erforderlich ist und dessen codierende Region in den viralen defekten Genom inaktiv ist (mutiert, deletiert, usw.). Für die Adenoviren wird die Komplementationsfunktion insbesondere ganz oder teilweise unter den Funktionen, die durch die Regionen E1, E2, E4, L1–L5, pIX und IVa2 des Adenovirus codiert werden, ausgewählt, und zwar einzeln oder als Kombination. Für das AAV handelt es sich um Funktionen, die durch die Regionen Rep und/oder Cap codiert werden; und für das Retrovirus durch gag, pol und/oder env codiert werden. Vorteilhafterweise entspricht die Nukleinsäure einer Region eines viralen Genoms, das die Region enthält, die für die gewählte Komplementationsfunktion codiert.
Es handelt sich insbesondere um ein Fragment eines Adenovirus vom Serotyp Ad2 oder Ad5, MoMLV oder AAV-2. In besonders bevorzugter Weise umfasst die Nuleinsäure auch die Promotorregion, die natürlicherweise für die Expression der gewählten Komplementationsfunktionen verantwortlich ist.
Als besonderes Beispiel betrifft die vorliegende Erfindung ein Baculovirus, das die Region E1 eines Adenovirus ganz oder teilweise enthält. Es handelt sich insbesondere um ein Baculovirus, das die Region E1a, E1b oder E1a und E1b enthält. Die Region E1 ist auf der Ebene der Nukleotide 104 (Promotor E1a) bis 4070 (polyA E1b) des Ad5 lokalisiert. Die TATA-Box des Promotors E1a befindet sich insbesondere auf der Ebene des Nukleotids 470, das Codon ATG von E1a auf dem Niveau des Nukleotids 560, und das Stopp-Codon E1b auf dem Niveau des Nukleotids 3511. Als genaues Beispiel kann man ein Baculovirus nennen, das ein Fragment 391–3511 enthält. Dieses Helfer-Baculovirus ist besonders an die Produktion von rekombinanten Adenoviren angepasst, die bezüglich der Region E1 defekt sind, und eine größere Deletion als dieses Fragment 391–3511 tragen. Es ist insbesondere an die Produktion eines Adenovirus der ersten Generation ohne RCA angepasst, das eine Deletion in der Region E trägt, die die Nukleotide 383–3512 einschließlich abdeckt.
Ein anderes besonders Beispiel für das Baculovirus gemäß der Erfindung enthält zum Beispiel die Regionen E1 und E4 des Adenovirus ganz oder teilweise. Die Region E4 des Adenovirus besteht aus 7 offenen Leserastern, ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 und ORF6/7 genannt. Unter den Proteinen, die durch diese verschiedenen ORFs codiert werden, scheinen die, die durch ORF3 und ORF6 produziert werden, die "Replikation" des Virus und demnach die Transkomplementation eines Adenovirus, das bezüglich der Region E4 defekt ist, selbst in seiner Integralität, zuzulassen. Demnach enthält das Helfer-Baculovirus der Erfindung vorteilhafterweise die gesamte Region E4 oder nur einen Teil dieser, der wenigstens das Raster ORF3 oder ORF6 enthält. Die verschiedenen Teile der Region E4 können durch enzymatischen Verdau erhalten oder nach Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, modifiziert werden. Insbesondere das Leseraster ORF6 kann aus der Region E4 in Form eines Fragments BglII-PvuII, das den Nukleotiden 34115–33126 entspricht, isoliert werden, und die Leseraster ORF6-ORF6/7 können in Form eines BglII-BglII-Fragments, das den Nukleotiden 34115–32490 des Genoms von Ad5 entspricht, aus der Region E4 isoliert werden. Das Baculovirus kann auch die Gesamtheit der Leseraster ORF1-ORF7 (zum Beispiel in Form eines Fragments von 32800–35826 oder 32811–35614 oder 32811–35640) enthalten. Es ist selbstverständlich, dass andere Fragmente auf der Basis der publizierten Sequenzen der adenoviralen Genome bestimmt werden können. Die Verwendung eines Baculovirus, das eine reduzierte Einheit der Region E4 trägt, ist vorteilhaft, denn es erlaubt die Transkomplementation eines adenoviralen defekten Genoms, das eine größere Deletion der Region E4 trägt, dem nach ohne Homologiezone, und demnach die Vermeidung jeder Rekombinationsmöglichkeit.
Nach einer ersten Ausführungsform wird die Nukleinsäure, die für die Komplementationsfunktion(en) codiert, in Form eines Expressionskassette in das Helfer-Baculovirus eingeführt. Diese Ausführungsform ist am einfachsten durchzuführen. Sie ist besonders an die Produktion von rekombinanten Adenoviren, die bezüglich der Immediate-Early-Gene defekt sind, und für die Produktion von rekombinanten defekten Retroviren und AAV angepasst.
Nach einer anderen Ausführungsform wird die Nukleinsäure, die für die Komplementationsfunktion(en) codiert, in Form einer exzisierbaren Kassette in das Helfer-Baculovirus eingeführt, wobei in der kompetenten Zelle ein replikatives Molekül erzeugt wird. Die Replikation der Kassette in der Zelle erlaubt es vorteilhafterweise, die Zahl der komplementierenden Gene zu erhöhen und somit die Produktionsniveaus des Systems zu verbessern. Diese Ausführungsform ist insbesondere an die Produktion von rekombinanten Adenoviren angepasst, die hoch defekt sind, insbesondere bezüglich der Struktur-Gene defekt sind. Diese Ausführungsform ist besonders an die Produktion von Adenovirus-"Minimum" angepasst. In der Tat ist die Menge an Struktur-Protein ein limitierender Faktor für die Produktion von bedeutenden Titern an hoch defekten Adenoviren (Typ Adenovirus-Minimum). Diese Ausführungsform erlaubt es zum ersten Mal, die intrazellulären Spiegel an transkomplementanten Proteinen, speziell an Strukturproteinen des Adenovirus (codiert durch die Regionen L1 bis L5) beträchtlich zu erhöhen, und zwar bis zu Spiegeln, die mit der Transkomplementation von Adenovirus-Minimum kompatibel sind.
Demnach hat die Anmelderin gezeigt, dass es möglich ist, rekombinante Baculoviren zu konstruieren, die eine heterologe Region enthalten, die in einer Zelle ausgeschnitten werden kann, vorzugsweise in induzierbarer und regulierbarer Art, um ein kreisförmiges und replikatives Molekül (des episomalen Typs) zu erzeugen.
Die Exzision wird vorteilhafterweise durch einen ortsspezifischen Rekombinationsmechanismus erreicht und die Replikation in der Zelle wird durch einen Replikations-Ursprung, der vom Stadium der Zellteilung unabhängig ist, gewährleistet.
Bevorzugter wird die ortsspezifische Rekombination, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, mit Hilfe von zwei spezifischen Sequenzen erhalten, die fähig sind, in Gegenwart eines spezifischen Proteins, allgemein als Rekombinase bezeichnet, zu rekombinieren. Diese spezifischen Sequenzen, die in geeigneter Orientierung angeordnet sind, umfassen im Baculovirus die Sequenzen, die für die Komplementationsfunktionen codieren. Gegenstand der Erfindung ist auch ein rekombinantes Baculovirus, das in sein Genom wenigstens eine DNA-Region insertiert hat, die durch zwei Sequenzen eingefasst wird, die eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung positioniert sind, wobei die DNA-Region wenigstens einen Replikations-Ursprung, der in den kompetenten Zellen funktionell ist, und eine Nukleinsäure, die für eine Komplementationsfunktion eines Virus codiert, enthält.
Die Sequenzen, die die Rekombination erlauben und die im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden, umfassen im Allgemeinen 5 bis 100 Basenpaare, und bevorzugter weniger als 50 Basenpaare. Sie können zu verschiedenen Strukturklassen gehören und insbesondere zu der Familie der Rekombinase des Bacteriophagen P1 und der Resolvase eines Transposons.
Unter den Rekombinasen, die zu der Familie der Integrase des Bacteriophagen I gehören, kann man insbesondere die Integrase der Lambda-Phagen (Landy et al., Science, 197 (1977), 1147), P22 und F80 (Leong et al., J. Biol. Chem., 260 (1985), 4468), HP1 von Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem., 267 (1992), 6859), die Cre-Integrase des Phagen P1, die Integrase des Plasmids pSAM2 ( EP 350 341 ) oder auch die FLP-Rekombinase des 2 μm-Plasmids der Hefe Saccharomyces cerevisiae nennen.
Unter den Rekombinasen, die zu der Familie des Transposons Tn3 gehören, kann man insbesondere die Resolvase des Transposons Tn3 oder der Transposone gd, Tn21 und Tn522 (Stark et al., 1992), die Gin-Invertase des Bacteriophagen mu oder auch die Resolvase der Plasmide, wie zum Beispiel die des Fragments par von RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol., 12 (1994), 131) nennen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Sequenzen, die die ortsspezifische Rekombination erlauben, in den rekombinanten Baculoviren der vorliegenden Erfindung von einem Bacteriophagen. Bevorzugter handelt es sich um Bindungssequenzen (Sequenzen attP und attB) eines Bacteriophagen oder abgeleitete Sequenzen. Diese Sequenzen sind fähig, spezifisch untereinander in Gegenwart einer Rekombinase, die Integrase genannt wird, zu rekombinieren. Als genaue Beispiele kann man insbesondere die Bindungssequenzen der Phagen Lambda, P22, F80, P1, HP1 von Haemophilus influenzae oder auch des Plasmids pSAM2 oder 2 μm nennen.
Noch bevorzugter werden die Sequenzen, die die ortsspezifische Rekombination ermöglichen, durch das Rekombinationssystem des Phagen P1 dargestellt. Der Phage P1 besitzt eines Rekombinase mit dem Namen Cre, die spezifischerweise eine Nukleotidsequenz mit 34 Basenpaaren erkennt, welche lox P-Stelle genannt wird (Sternberg et al., J. Mol. Biol., 150 (1981), 467). Diese Sequenz besteht aus zwei Palindromsequenzen mit 13 pb, die durch eine konservierte Sequenz mit 8 bp getrennt sind. Die ortsspezifische Rekombination wird vorteilhafterweise erhalten, indem die LoxP-Sequenzen oder abgeleitete Sequenzen und die Rekombinase Cre verwendet werden.
Der Ausdruck abgeleitete Sequenz umfasst Sequenzen, die durch Modifikation(en) der oben genannten Rekombinationssequenzen erhalten werden, wobei die Fähigkeit zur spezifischen Rekombination in Gegenwart der geeigneten Rekombinase konserviert wird. So kann es sich um reduzierte Fragmente dieser Sequenzen oder im Gegensatz dazu um durch Addition weitere Sequenzen (Restriktionsstellen, usw.) vergrößerte Sequenzen handeln. Es kann sich auch um Varianten handeln, die durch Mutation(en), insbesondere durch Punktmutation(en), erhalten wurden.
Nach einem besonders bevorzugten Modus der Erfindung sind die Sequenzen, die eine ortsspezifische Rekombination ermöglichen, demnach LoxP-Sequenzen des Bacteriophagen P1, und die Rekombination wird in Gegenwart des Proteins Cre erreicht. Diesbezüglich kann die Rekombination durch direktes Inkontaktbringen der kompetenten Zellen mit der Rekombinase Cre oder durch Expression des Gens, das für die Rekombinase Cre codiert, in den kompetenten Zellen erreicht werden. Vorteilhafterweise wird die Rekombinase Cre in der Zelle durch Induktion der Expression des entsprechenden Gens erreicht. So wird das Gen, das für die Rekombinase codiert, vorteilhafterweise unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt oder in regulierbarer Form konstruiert. Diesbezüglich verwendet man vorteilhafterweise eine Fusion zwischen Cre und der Bindungsdomäne der Steroidhormone (Östradiol, Progesteron, usw.), die die Regulierung der Aktivität von Cre und demnach die Induktion des Rekombinations-Ereignisses ermöglicht (Metzger et al., PNAS, 92 (1995), 6991). Allgemeiner ausgedrückt, die Expression der Rekombinase kann durch jeden starken Promotor, der reguliert ist oder nicht, kontrolliert werden. Die Expressionskassette kann in die kompetenten Zellen transfektiert werden oder in das Genom der kompetenten Zellen integriert werden, wie es in den Beispielen erläutert wird. Dieses System ermöglicht es demnach, replikative Moleküle zu erzeugen, die in den kompetenten Zellen erhöhte Level der Komplementfunktion des Virus, insbesondere des Adenovirus, produzieren. Dieser Konstruktionstyp ist besonders an die Komplementation von hoch defekten Genomen und insbesondere von adenoviralen Genomen, die bezüglich der späten Gene defekt sind, angepasst. So wird eine besondere erfindungsgemäße Konstruktion durch ein Baculovirus dargestellt, das in sein Genom wenigstens eine DNA-Region insertiert hat, die von zwei LoxP-Sequenzen umrahmt ist, die direkt orientiert sind, wobei die DNA-Region wenigstens einen Replikations-Ursprung, der in den kompetenten Zellen funktionell ist, und eine Nukleinsäure, die für eine Komplementationsfunktion eines Adenovirus codiert, enthält. Vorteilhafterweise enthalten die Komplementationsfunktionen Immediate-Early-Gene, die in den Re gionen E1, E2 und E4 ganz oder teilweise vorliegen. Noch bevorzugter enthalten die Komplementationsfunktionen ganz oder teilweise Immediate-Early-Gene und Delayed-Early-Gene. Vorzugsweise ermöglichen die Komplementationsfunktionen die Komplementation eines rekombinanten Adenovirus, das frei von jeder codierenden viralen Sequenz ist. Insbesondere bestehen die Komplementationsfunktionen aus der Gesamtheit des Adeno-viralen Genoms, mit Ausnahme der ITRs und der Packungsregion. Nach einer besondere Variante bestehen die Komplementationsfunktionen aus einem vollständigen Adeno-viralen Genom, das auf jeden Fall frei von der Packungsregion ist (Ad.Psi-). Dieses Genom enthält insbesondere die ITRs, die nach Exzision zur Replikation des Genoms in den kompetenten Zellen dienen.
Zur Gewährleistung der Replikation des episomalen Moleküls enthält dieses demnach einen Replikations-Ursprung, der in den verwendeten kompetenten Zellen funktionell ist. Dieser Replikations-Ursprung besteht vorzugsweise aus eigenen ITR-Sequenzen des Adenovirus, die eine wichtige Amplifikation des Moleküls erlauben. Es kann sich auch um einen Replikations-Ursprung handeln, der vorzugsweise eine Amplifikation der viralen DNA mit einem Faktor über 20 in der kompetenten Zelle ermöglicht. Als Beispiel kann man den Ursprung OriP/EBNA1 des EBV-Virus oder die Region E2 des Papillomvirus nennen. Es ist klar, dass die ITR-Sequenzen des Adenovirus eine bevorzugte Ausführungsform bilden.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Helfer-Baculovirus oder werden die Helfer-Baculoviren im Allgemeinen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) eingesetzt, die es erlaubt, eine große Population der Zellen zu infizieren, ohne die zelluläre Lebensfähigkeit signifikant zu schädigen. Im Allgemeinen liegt diese insbesondere zwischen 10 und 1 000. MOI entspricht der Anzahl der viralen Partikel pro Zelle. MOI kann leicht von einem Fachmann als Funktion der verwendeten kompetenten Zellen auf der Basis von im Wesentlichen zwei Kriterien eingestellt werden: die Infektionswirksamkeit und die eventuelle Toxizität. Vorteilhafterweise ist die MOI, die für das Helfer-Baculovirus verwendet wird, zwischen 20 und 500.
Einführung des viralen Genoms
Wie oben angegeben wurde, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Einführung des Helfer-Baculovirus und des rekombinanten viralen Genoms in kompetente Zellen. Dabei kann das Genom des rekombinanten defekten Adenovirus auf verschiedene Arten in die kompetente Zelle eingeführt werden.
Es kann sich zunächst um ein gereinigtes rekombinantes defektes Adenovirus handeln, das vorzugsweise frei von RCA ist. In diesem Fall werden die kompetenten Zellen durch defektes rekombinantes Adenovirus und durch das Helfer-Baculovirus infiziert. Die Infektion durch rekombinantes Adenovirus erlaubt es, das entsprechende Genom in die kompetente Zelle einzuführen, das dann amplifiziert und enkapsidiert wird, um so Bestände mit erhöhtem Titer zu produzieren, die frei von RCA sind. Dieser Durchführungsmodus ist besonders interessant, um Viren der ersten Generation (Ad-ΔE1; Ad-ΔE1, ΔE3) zu erzeugen. In der Tat sind diese Viren schwer mit erhöhten Titern oder Kontamination durch RCA zu produzieren. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird es nun möglich, ausgehend von einem rekombinanten defekten Adenovirus der ersten Generation durch Co-Infektion mit einem Baculovirus, der die Region E1 enthält, in einer kompetenten Zelle konzentrierte Bestände erhöhter Qualität zu erhalten. Diese Ausführungsform ist auch für die Produktion von Viren vorteilhaft, die in zwei oder drei essentiellen Regionen ihres Genoms (insbesondere E1, E2, E4) defekt sind. Allgemein ist diese Ausführungsform vorteilhaft, denn die Infektionswirksamkeit durch das Adenovirus ist stark erhöht (über der Transfektionswirksamkeit durch die DNA) und erlaubt es, konzentrierte Bestände zu erzeugen. In dieser Ausführungsform werden das rekombinante Adenovirus und das rekombinante Baculovirus in Infektionsmultiplizitäten (MOI) verwendet, die es zulassen, dass eine große Population in der Zelle infiziert wird, ohne dass die zelluläre Lebensfähigkeit in signifikanter Art geschädigt wird. Die MOI, die für das Baculovirus verwendet wird, ist die oben genannte (zwischen 10 und 1 000). Was das Adenovirus angeht, so liegt sie vorzugsweise zwischen 1 und 1 000, bevorzugter zwischen 1 und 500, noch bevorzugter zwi schen 1 und 100. Die für das Adenovirus verwendete MOI wird ebenfalls als Funktion des gewählten Zelltyps angepasst. Die Spanne der MOI kann von einem Fachmann leicht bestimmt werden, indem zum Beispiel ein Adenovirus und ein Baculovirus, die einen unterschiedlichen Gen-Marker enthalten, verwendet werden, um die Wirksamkeit der Infektion und eine eventuelle Kompetition zu messen. Bevorzugter ist die MOI des Adenovirus unter 50, zum Beispiel zwischen 1 und 20.
Nach einer anderen besonders vorteilhaften Ausführungsform wird das Genom des rekombinanten defekten Adenovirus in Form von DNA eingeführt. In diesem Fall wird das Genom durch Transfektion, gegebenenfalls in Gegenwart eines Mittels, das die Transfektion erleichtert (Lipide, Calciumphosphat, usw.), eingeführt. Das so eingeführte rekombinante Genom kann in vitro nach verschiedenen Techniken und insbesondere bei E. coli (WO 96/25506) oder in einer Hefe (WO 95/03400) hergestellt werden. Diese Ausführungsform ist besonders nützlich, um eine erste Charge an rekombinantem defekten Virus, das frei von RCA ist, zu erzeugen, das dann wiederum verwendet werden kann, um Bestände mit erhöhtem Titer nach der vorstehenden Ausführungsform zu produzieren.
Das Genom des rekombinanten defekten Adenovirus kann eingeführt werden, indem ein anderes rekombinantes Baculovirus verwendet wird. Nach dieser Ausführungsform wird das Genom des rekombinanten defekten Adenovirus in vitro hergestellt, zum Beispiel wie es oben angegeben ist, dann in ein Baculovirus in Form einer exzisierbaren Kassette in die kompetente Zelle eingeführt. Nach dieser Ausführungsform werden die kompetenten Zellen mit einem Baculovirus, das das Genom des rekombinanten defekten Adenovirus trägt, und einem oder mehreren Helfer-Baculoviren (die Komplementationsfunktionen tragen) in Kontakt gebracht. Diese Ausführungsform ist für die Produktion von rekombinanten hoch defekten Adenoviren besonders vorteilhaft. Dank dieses Systems ist es in der Tat möglich, in die Population kompetenter Zellen auf einmal rekombinantes hoch defektes Genom und entsprechende Komplementationsfunktionen einzuführen.
Demnach umfasst ein erfindungsgemäßes Verfahren die Co-Infektion der kompetenten Zellen mit einem Baculovirus, das das Genom des rekombinanten defekten Adenovirus trägt, und mit einem Helfer-Baculovirus oder mehreren Helfer-Baculoviren, die die Komplementationsfunktionen tragen. Die in dieser Ausführungsform verwendeten MOI liegen für jedes der verwendeten Baculoviren zwischen 10 und 1 000.
Im Stand der Technik wurden zwei Konstruktionstypen für die Produktion von Adenovirus-Minimum verwirklicht: (1) Das Transgen (β-Galactosidase) kloniert zwischen die ITR, die von einer einmal vorkommenden Restriktionsstelle begrenzt sind, oder (2) die ITR, die rechts und links in direkter Orientierung in 5' des Transgens kloniert sind (Fisher et al., Virology, 217 (1996), 11; Kumar-Singh et al., Hum. Mol. Genet., 5 (1996), 913). Adenoviren-Minimum wurden in den Zellen 293 durch Transfektion der linearisierten (1) oder ringförmigen (2) DNA produziert, wobei die viralen Proteine, die für die Replikation und Enkapsidation des Mini-Genoms notwendig sind, in trans durch ein Helfer-Virus beigetragen werden (Ad-ΔE1). Die Adenoviren-Minimum verhalten sich wie interferierende defekte Partikel (DI) und werden progressiv im Verlauf sukzessiver Passagen amplifiziert. Das Hauptproblem, das sich durch Verwendung dieser Methodologie stellt, ist die Trennung der zwei Typen von Partikeln, die produziert werden und die für die Kontamination der Bestände durch das Helfer-Virus verantwortlich sind, und die sehr schwachen Titer der Adenovirus-Minimum, die so erhalten werden (unter 10⁸ kbE/ml).
Die vorliegende Anmeldung erlaubt es erstmals, Adenovirus-Minimum zu erzeugen, indem ein Baculovirus verwendet wird, um das Adeno-virale Mini-Genom abzugeben, und ein Baculovirus verwendet wird, um die Gesamtheit der Transkomplementationsfunktionen (komplementierendes Genom) beizusteuern.
Das rekombinante adenovirale Genom wird vorteilhafterweise zwischen zwei Sequenzen, die eine ortsspezifische Rekombination in den kompetenten Zellen erlauben, in das Baculovirus eingeführt, wie es für das Helfer-Baculovirus beschrieben ist.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt insbesondere ein Produktionssystem für Adenovirus-Minimum, indem ein Baculovirus zur Abgabe des Adeno-viralen Mini-Genoms mit Hilfe des Systems loxP/Cre und ein Baculovirus zum Beisteuern der Gesamtheit der Transkomplementationsfunktionen (kompementierendes Genom), ebenfalls mit Hilfe eines Systems Cre/loxP, verwendet wird (siehe 2 bis 4).
Nach einer anderen Ausführungsform ist das ortsspezifische Rekombinationssystem, das zur Abgabe der Komplementationsfunktionen verwendet wird, unterschiedlich zu dem, das zur Abgabe des Genoms des rekombinanten Adenovirus verwendet wird. Das System LoxP/Cre kann insbesondere eingesetzt werden, um das Adeno-virale defekte Genom abzugeben, und das System AttP/AttB kann zur Abgabe der Komplementationsfunktion(en) verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es demnach, einen adenoviralen Vektor zu konstruieren, bei dem alle viralen codierenden Sequenzen deletiert sind und der nur die ITRs und das Encapsidationssignal trägt (Adenovirus-Minimum). Dieser Vektor kann theoretisch bis zu 37 kb exogene Sequenz akkomodieren, während die Klonierungskapazität der derzeitigen Vektoren 8,5 kb nicht übersteigt. Es ist demnach möglich, Gene großer Größe, wie zum Beispiel das Gen von Dystrophin (14 kb), mit all seinen Regulationselementen (Promotor, Enhancer, Introns, ...) zu klonieren, um eine optimale Expression im Zielgewebe zu erreichen. Darüber hinaus wird das Fehlen jeder immunogenen viralen Sequenz die Expressionsdauer des Transgens in den ruhenden Geweben erhöhen.
Das Genom des AAV oder des defekten Retrovirus kann auch in Form eines Virus, eines Genoms oder eines Plasmids nach den unten beschriebenen Techniken eingeführt werden.
Kompetente Zellen
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in verschiedenen Zelltypen durchgeführt werden. Im Sinne der Erfindung versteht man unter "kompetente Zelle" eine Zelle, die für die zu produzierende Infektion durch das Baculovirus oder das Virus permissiv ist und einen produktiven viralen Zyklus für das letztgenannte ermöglicht. Die Fähigkeit, Zellen mit diesen Viren zu infizieren, kann bestimmt werden, indem die rekombinanten Viren verwendet werden, die ein Marker-Gen exprimieren, wie zum Beispiel das Gen LacZ von E. coli. Es handelt sich vorzugsweise um eine Säugerzelle, noch bevorzugter um eine Zelle humanen Ursprungs. Die verwendeten kompetenten Zellen können ruhende Zellen oder Zellen in aktiver Teilung, etablierte Linien oder Primärkulturen sein. Es handelt sich vorzugsweise um Säugerzellen, die mit einer industriellen Verwendung kompatibel sind, das heißt, ohne anerkannten pathogenen Charakter, die kultivierbar sind und gegebenenfalls unter geeigneten Bedingungen lagerfähig sind. Vorzugsweise sind die verwendeten Zellen hepatische Zellen, Muskelzellen, Fibroblasten, Embryozellen, Nervenzellen, Epithalzellen (Lungenzellen) oder Augenzellen (Retinazellen). Als nicht limitierendes Beispiel kann man die Zellen 293 oder jede abgeleitete Zelle, die eine zusätzliche Komplementationsfunktion enthält (293E4, 293E2a, usw.), die Zellen A549, die Zellen HuH7, Die Zellen Hep3B, die Zellen HepG2, humane Retinoblastenzellen (HER, 911), die HeLa-Zellen, die Zellen 3T3 oder auch die Zellen KB nennen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können das Genom des rekombinanten Virus und das Baculovirus in die Population kompetenter Zellen in gleichzeitiger oder zeitlich beabstandeter Art eingeführt werden. Vorteilhafterweise werden die Zellen auf einmal mit dem rekombinanten Genom und dem Helfer-Baculovirus in Kontakt gebracht. Im Fall eines Systems, das replikative Moleküle in vivo erzeugt, wird die Rekombinase vorher, gleichzeitig oder als letztes eingeführt oder exprimiert.
Die Produktion der Viren führt im Allgemeinen zur Lyse der Zellen. Die produzierten Viren können demnach nach Lyse geerntet werden, und zwar nach bekannten Reinigungsverfahren. Sie können dann auf verschiedenen Wegen entsprechend der beabsichtigten Verwendung konditioniert werden. Um jedes Risiko einer Verunreinigung des Virusbestands durch eventuelle Spuren an Baculovirus, das die kompetenten Zellen nicht penetriert hat (Helfer-Baculovirus oder Baculovirus, das das rekombinante virale Genom beisteuert) zu vermeiden, es ist möglich, die folgenden Techniken anzuwenden:

– Es ist möglich, die Adenoviren durch Chromatographie nach dem Verfahren, das in der Anmeldung FR 96/08164 beschrieben ist, zu reinigen. Diese Technik erlaubt es, das Adenovirus von jedem eventuellen Rest-Baculovirus abzutrennen.
– Es ist auch möglich, organische Lösungsmittel (z.B. Ether, Chloroform) auf die Bestände an gereinigtem Adenovirus wirken zu lassen. In der Tat ist das Baculovirus ein Virus mit Hülle (Glycoproteinhülle), demnach sehr empfindlich gegenüber jedem organischen Lösungsmittel (das die Lipide seiner Hülle extrahiert); im Gegensatz hat das Adenovirus keine Hülle und dieselben Lösungsmittel haben keinen Effekt auf es.
– Es ist noch möglich, durch Reinigung an CsCl-Gradienten das eventuelle restliche Baculovirus und das rekombinante Virus durch Dichte zu trennen.

Diese drei Verfahren können unabhängig oder in Kombination verwendet werden. Darüber hinaus kann auch jedes andere Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, verwendet werden.
Verwendung der Viren
Die so produzierten Viren können für die Klonierung, den Transfer und die Expression von Genen von Interesse in vitro, ex vivo oder in vivo verwendet werden. Solche Gene von Interesse sind zum Beispiel Gene, die codieren für Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine : Interleukine, Interferone, TNF, ect. ( FR 9203120 ), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter und ihre Vorstufen oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, usw.; Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE, usw. (WO 94/25073); Dystrophin oder Mini-Distrophin (WO 93/06223), Tumorsuppressorgene: p53, Rb, RapIA, DCC, k-rev, usw., (WO 94/24297), die Gene, die für Faktoren codieren, die bei der Koagulation beteiligt sind: Faktoren VII, VIII, IX, usw.; die Suizidgene: Thyminkinase, Cytosindesaminase, usw.; oder auch ein natürliches oder künstliches Immunglobulin ganz oder teilweise (Fab, ScfV, usw. (WO 94/29446). Das Gen von Interesse kann auch ein Gen oder eine Antisens-Sequenz sein, deren Expression in der Zielzelle es ermöglicht, die Expression von Genen oder die Transkription von zellulären mRNA zu kontrollieren. Derartige Sequenzen können zum Beispiel Transkripte von zellulärer mRNA in komplementäre RNA in der Zelle sein und so ihrer Translation in Proteine blockieren, und zwar nach der Technik, die in dem Patent EP 140 308 beschrieben ist. Das Gen von Interesse kann im Hinblick auf die Herstellung von Vaccinen auch ein Gen sein, das für ein antigenes Peptid codiert, das fähig ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Es kann sich inbesondere um spezifische antigene Peptide des Epstein-Barr-Virus, des HIV-Virus, des Hepatitis B-Virus ( EP 185 573 ), des Virus der Pseudo-Wut oder auch um spezifische Tumorproteine ( EP 259 212 ) handeln. Das Gen kann die ganze DNA (gDNA, cDNA, usw.) sein, die für ein Produkt von Interesse codiert, einschließlich möglicherweise der geeigneten Expresionssignale (Promotor, Terminator, usw.), sein.
Diese Viren können in vitro für die Produktion dieser rekombinanten Proteine verwendet werden. Sie können auch eingesetzt werden, immer in vitro, um den Wirkmechanismus dieser Proteine zu untersuchen, und um die Regulierung der Expression von Genen oder die Aktivität von Promotoren zu untersuchen. Sie können auch in vivo für die Schaffung von Tiermodellen oder transgenen Tieren verwendet werden. Sie können auch für den Transfer und die Expression von Genen in vivo beim Tier und beim Menschen in Ansätzen zur Gentherapie oder in zellulären Ansätzen verwendet werden.
Die vorliegende Anmeldung wird mit Hilfe von Beispielen, die folgen, näher beschrieben werden, wobei diese nur als erläuternd und nicht als limitierend anzusehen sind.
Legende der Figuren
1: Produktionsschema für ein rekombinantes defektes Adenovirus der dritten Generation (defekt bezüglich der Funktionen E1 und E4), wobei ein Baculo-E1, E4 verwendet wird.
2–4: Schema der Produktion eines Adenovirus-Minimum, die ein erstes Baculovirus zur Einführung des defekten Adeno-viralen Genoms und ein zweites Baculovirus zur Einführung der Komplementationsfunktionen verwendet.
5: Schema der Herstellung eines rekombinanten AAV, das bezüglich der Funktionen Rep und Cap effektiv ist, wobei ein Baculo-Rep/Cap verwendet wird.
Beispiele
1. Verwendete Zellen
Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Zellen können aus jeder Zelllinie oder Zellpopulation stammen, die durch ein Adenovirus oder ein AAV oder ein Retrovirus oder durch ein Baculovirus infizierbar ist, die zur Verwendung zu diesem therapeutischen Zweck kompatibel ist. Dabei handelt es sich vorzugsweise um eine Säugerzelle, insbesondere eine humane. Man kann insbesondere nennen:
Die Zellen der Linie 293:
Die Linie 293 ist eine humane embryonale Zelllinie, die das linke Ende (ungefähr 11–12 %) des Genoms des Adenovirus, Serotyp 5 (Ad5), enthält, die die linke ITR, die Enkapsidationsregion, die Region E1, die E1a, E1B einschließt, die Region, die für das Protein pIX codiert, und einen Teil der Region, die für das Protein pI-Va2 codiert, umfasst (Graham et al., J. Gen. Virol.. 36 (1977), 59). Diese Linie ist fähig, rekombinante Adenoviren, die bezüglich der Region E1 defekt sind, d.h. ganz oder teilweise frei von der Region E1 sind, zu transkomplementieren und Virusbestände mit erhöhten Titern zu produzieren.
Die Zellen der Linie A549
Zellen, die die Region E1 des Adenovirus komplementieren, wurden ausgehend von A549-Zellen konstruiert (Ilmler et al., Gene Ther., (1996), 75). Diese Zellen enthalten ein Fragment, das bezüglich der Region E1 beschränkt ist, die frei von der linken ITR ist, und unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt ist.
Die Zellen der Linie HER
Die humanen Embryoretinazellen (HER) können durch ein Adenovirus infiziert werden (Byrd et al., Oncogene, 2 (1988), 477). Enkapsidationszellen des Adenovirus, hergestellt ausgehend von diesen Zellen, wurden zum Beispiel in der Anmeldung WO 94/28152 oder in dem Artikel von Fallaux et al., (Hum. Gene Ther. (1996), 215) beschrieben. Man kann insbesondere die Linie 911 nennen, die die Region E1 des Genoms des Adenovirus Ad5 von Nukleotid 79 bis Nukleotid 5789 in das Genom der HER-Zellen integriert enthalten. Diese Zelllinie erlaubt die Produktion von Viren, die bezüglich der Region E1 defekt sind.
Die IGRP2-Zellen
Die IGRP2-Zellen sind Zellen, die ausgehend von 293-Zellen durch Integration einer funktionellen Einheit der Region E4 unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors erhalten werden. Diese Zellen ermöglichen die Produktion von Viren, die bezüglich der Regionen E1 und E4 defekt sind (Yeh et al., J. Virol., (1996), 70).
Die VK-Zellen
Die VK-Zellen ((VK2-20 und VK10-9) sind Zellen, die ausgehend von den 293-Zellen durch Integration der Integralität der Region E4 unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors und der Region, die für das Protein pIX codiert, erhalten werden. Diese Zellen erlauben die Produktion von Viren, die bezüglich der Regionen E1 und E4 defekt sind (Krougliak et al., Hum. Gene Ther., 6 (1995), 1575).
Die Zellen 293E4
Die Zellen 293E4 sind Zellen, die ausgehend von den Zellen 293 durch Integration der Integralität der Region E4 erhalten werden. Diese Zellen erlauben die Produktion von Viren, die bezüglich der Regionen E1 und E4 defekt sind (WO 95/02697); Cancer Gene Ther. (1995), 322).

– Die Zellen Sf9 und Sf21 sind embryonale Zellen von Lepitopteren. Diese Zellen sind in den Sammlungen (Nr. CRL-1711 ATCC) ebenso wie ihre Kulturbedingungen zugänglich. Sie sind auch im Handel verfügbar (Gibco). Siehe auch King und Possee: The baculovirus expression system, London: Chapman & Hall, 1992.

Humane hepatocytäre Zellen
Die Zellen HepG2 und Hep3B und HuH7 sind humane Linien, die von Leberkarzinomen stammen. Sie sind in den Hinterlegungssammlungen zugänglich und ihre Eigenschaften wurden zum Beispiel in den Patenten UR 4 393 133 und US 4 393 133 beschrieben.

– Humane Zelllinie KB: Stammt aus einem humanen Epidermkarzinom; diese Linie ist bei der ATCC zugänglich (Ref: CCL17) ebenso die Bedingungen, die ihre Kultur ermöglichen.
– Humane Hela-Zelllinie: stammt aus einem humanen Epithelkarzinom; diese Linie ist bei der ATCC zugänglich (Ref: CCL2) ebenso die Bedingungen, die ihre Kultur zulassen.
– Zelllinie W162: Diese Zellen sind Vero-Zellen, die in ihr Genom integriert die Region E4 des Adenovirus Ad2 enthalten. Diese Zellen wurden von Weinberg et al., (PNAS 80 (1983) 5383) beschrieben.

2. Infektion von humanen Zellen durch ein rekombinantes Baculovirus
Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit der Baculoviren, Zellen humanen Ursprungs zu infizieren.
Humane Zellen (insbesondere 293-Zellen davon abgeleitet) werden mit verschiedenen Verdünnungen einer Lösung von rekombinanten Baculovirus, das das Gen LacZ unter der Kontrolle der LTR des RSV exprimiert, infiziert. 48 Stunden nach der Infektion wird das Auftreten von blauen Zellen bewiesen, was die Infizierbarkeit dieser Zellen durch ein Baculovirus beweist.
3. Konstruktion von Baculovirus, das die Region E1 des Adenovirus eines entsprechenden defekten Adenovirus exprimiert
3-1 Klonierung von zwei Expresionskassetten von E1
Das Plasmid AE2 stammt aus der Klonierung in PCRII (Invitrogen) des Produkts der PCR, die an pBREI mit den Oligonukleotiden
5'-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' und 5'-GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3' durchgeführt wurde: Dieses PCR-Produkt enthält die Nukleotide 3198 bis 3511 von Ad5, das heißt das 3'-Ende der Region E1B. Das Plasmid pBREI enthält die Nukleotide 1 bis 5788 von Ad5, kloniert in pBR322, deletiert etwa Nukleotide 1300 bis 2300.
Das Plasmid AE3 stammt aus der Klonierung des NotI-KpnK-Fragments von AE2, das das PCR-Produkt enthält, in pCDNA3 (Invitrogen), verdaut durch NotI-KpnI. Es enthält die Nukleotide 3198 bis 3511 von Ad5, gefolgt von Polyadenylierungsstelle von BGH.
Das Plasmid AE4 stammt aus der Klonierung des GrlII-PvuII-Fragments von AE3 in pBREI. AE4 ist ein Plasmid, das die folgende Expressionskassette von E1 enthält:

– Nukleotide: bis 3511 von Ad5, das heißt linke ITR, Enkapsidationssequenzen, Promotor E1A, Gen E1A, Promotor E1B, Gen E1B;
– PolyA des Rinderwachstumshormons (BGH), das aus pCDNA3 stammt.

pBREI wurde durch BstNI verdaut, dann durch T4-DNA-Polymersase verdaut, um das 5'-Ende aufzufüllen, dann durch XbaI verdaut. Das so erzeugte Fragment, das die Nukleotide 391 bis 1339 von Ad5 enthielt, wurde in Pic20H, das durch SmaI-XbaI (Stelle nicht methyliert) verdaut war, eingeführt, um das Plasmid AE5 zu erzeugen.
Das Plasmid AE6 stammt aus der Klonierung des EcoRI-SmaI-Fragments von AE5 in AE4, das durch EcoRI-SmaI verdaut war. AE6 ist ein Plasmid, das die folgende Expressionskassette von E1 enthält:

– Nukleotide 391 bis 3511 von Ad5, das heißt "reduzierter" Promotor von E1A, Gen E1A, Promotor E1B, Gen E1B;
– PolyA des Rinderwachstumshormons (BGH), das aus pCDNA3 stammt.

3-2 Klonierung dieser zwei Kassetten E1 in ein Baculovirus
Die EcoRI-SphI-Fragmente (5'-Ende von SphI wurde vorher durch Verdau mit T4-DNA-Polymerase geglättet) der Plasmide AE4 und AE6 werden in das Plasmid pAcSG2 (Pharmingen) zwischen die Stellen EcoRI und EcoRV kloniert. Dies erzeugt die Plasmide AE14 bzw. AE15. In den beiden Fällen wird die Region E1 in den Lokus des Gens des Polyhedrins eingeführt (Gen + Promotor des Polyhedrins sind deletiert).
Die Plasmide AE14 und 15 werden mit der DNA des Baculovirus BaculoGold, abgeleitet vom Stamm AcNPV (Pharmigen), in die Insektenzellen Sf9 co-transfiziert, um die zwei entsprechenden rekombinanten Baculoviren BacAE14 und BacAE15 zu erzeugen, die Träger der zwei Expressionskassetten von E1 integriert in den Lokus des Gens des Polyhedrins, sind.
3-3 Klonierung eines rekombinanten Adenovirus, das eine neue Deletion E1 trägt
Das Plasmid tCO1 (WO 96/10088) wurde durch BstXI verdaut, dann durch die T4-DNA-Polymerase verdaut, um das 3'-Ende zu eliminieren, danach durch Rsal verdaut. Das so erzeugte Fragment, das die Nukleotide 3513 bis 4607 von Ad5 enthält, wurde in pBS-SK+ (Stratagene) eingeführt, das durch EcoRV linearisiert und durch Kälber-alkalische Phosphatase verdaut worden war, um so das Plasmid AE0 zu erzeugen.
Das Plasmid pMA37 wird durch Ligation der folgenden Fragmente erhalten:

– EcoRN-NsiI von pXL2756, das sacB enthält. Das pXL2756 besitzt das Gegenselektionsgen SaB, das von den Stellen EcoRI und KpnI befreit ist, das Gen für Kanamycinresistenz, eine Mehrfach-Klonierungsstelle und einen Replikations-Ursprung ColE1.
– NdeI-NsiI von pCOI (enthält die Adenosequenzen),
– SalI (5'-Ende, aufgefüllt durch T4-DNA-Polymerase)-Asel von pXL2756 (Kanamycinresistenzvektor).

pMA37 enthält demnach:

– das Gen für Resistenz gegen Kanamycin,
– das Gen SacB, das den Bakterien, die es exprimieren, Empfindlichkeit gegen Saccharose verleiht,
– die Sequenzen 1 bis 382 (HinfI) von Ad5, gefolgt von den Sequenzen 3446 bis 4415 (NsiI) von Ad5; es gibt kein Transgen.

Das Plasmid AE11 wurde durch Einführung des XhoI-NsiI-Fragments von AE0 in pMA37, verdaut durch SalI-NsiI, konstruiert. Es enthält demnach:

– das Gen für Resistenz gegen Kanamycin,
– das Gen SacB, das den Bakterien, die es exprimieren, Empfindlichkeit gegen Saccharose verleiht,
– die Sequenzen 1 bis 382 (HinfI) von Ad5, gefolgt von den Sequenzen 3513 bis 4415 (NsiI) von Ad5; es gibt kein Transgen.

Ausgehend vom Plasmid AE11 werden dann die Suizid-Shuttle-Vektoren konstruiert (durch Insertion des Transgens von Interesse), die die Konstruktion von rekombinanten Adenoviren durch Rekombination in E. coli erlauben. AE11 enthält keine Sequenz, die zu dem Plasmid AE6 homolog ist. Die Plasmide AE11 und AE4 haben die Sequenzen 1 bis 382 (HinfI) von Ad5 stromaufwärts von E1A gemeinsam, aber es gibt keine Homologie stromabwärts der Kassette E1 zwischen diesen zwei Plasmiden. So kann es keine Erzeugung von RCA durch homologe Rekombination zwischen einem Adenoträger der Deletion E1, die in AE11 vorliegt (das heißt, 382–3513), und den Baculoviren BacAE14 oder BacAE15 geben.
3-4 Konstruktion eines rekombinanten Adenovirus der ersten Generation
Zu einer ersten Zeit wird ein Bestand BacAE14 oder 15 nach klassischen Techniken hergestellt. Dann werden die kompetenten Zellen (zum Beispiel HuH7) durch 5 μg Plasmid pXL2822, verdaut durch PacI, transfiziert (das Plasmid pXL2822 enthält das ganze Ad5, deletiert bezüglich E1 (382–3446 oder 382–3513) und E3 (28592–30470) und trägt eine Kassette CMV-βGal), und gleichzeitig oder nicht bei einem MOI-Wert zwischen 10 und 1 000 durch BacAE14 oder 15 infiziert. Wenn die Zellen lysiert sind, wird der Transfektions-Überstand geerntet, dann auf "frische" kompetente Zellen, die vorher oder gleichzeitig mit BacAE14 oder 15 (MOI 10 bis 1 000) infiziert wurden, angewendet, um das Adenovirus Ad2822 und so bis zum Erhalt eines Bestands an Ad2822 zu amplifizieren. Der Ablauf der Amplifikation des Ad2822 wird durch das Vorliegen des lacZ in diesem Virus erleichtert. Bei jeder Amplifikation wird der Überstand auf W162 pseudo-titriert. Das Genom des Virus wird während der Amplifikationen analysiert, um seine Integrität zu beweisen. Schließlich weist diese Strategie den Vorteil auf, dass sie kein RCA in den so produzierten Adenovirus-Beständen erzeugen kann. Dieses Fehlen einer Kontamination wird ebenfalls bewiesen.
4. Konstruktion eines Adenovirus, das die Regionen E1 und E4 des Adenovirus exprimiert
4-1 Kontruktion des Baculovirus E1, E4 (Bac.E1–E4)
Das verwendete Protokoll ist das folgende: Die Regionen E1 und E4 werden in Umkehrorientierung im Lokus des Gens des Polyhedrins (Ph) in den Schaukelvektor pBacPAK8 (Clontech, USA) kloniert, um pBacE1–E4 zu erhalten. Das rekombinante Baculovirus wird dann nach klassischen Techniken zur Co-Transfektion von BacE1 bis E4 und der DNA des Baculovirus BacPAK6 in den Zellen Sf9 isoliert (Kitts und Possee, Biotechniques, 14(5) (1993), 810). Das Vorliegen von E1 und E4 im Genom der rekombinanten Baculoviren wird dann durch PCR, ausgehend von infizierten Sf9-Zellen, bewiesen. Die Transkription von E1 und E4 in den mit dem gereinigten rekombinierten Baculovirus infizierten Huh7-Zellen wird durch RT-PCR, ausgehend von cytoplasmischer RNA, analysiert.
Zur Konstruktion des Baculovirus E1–E4 können verschiedene Fragmente, die E1 tragen, eingeführt werden. Die in diesem Beispiel verwendeten Fragmente sind die, die in Beispiel 3 für die Konstruktion des Baculovirus-E1 beschrieben wurden, das die Regionen E1 unter Kontrolle ihres geeigneten Promotors enthält (reduzierter Promotor E1a und Promotor E1b). Die verwendeten Fragmente E4 sind die folgenden:

– Fragment MaeII-MscI 32720–35835, das die Integralität von E4 trägt,
– Fragment BglII-PvuII 34115–33126, das das Raster ORF6 trägt,
– Fragment BglII-BglII 34115–32490, das die Raster ORF7-ORF6/7 trägt,
– Fragment PvuII-AluI 34801–334329, das das Raster ORF3 trägt.

Diese Fragmente werden alternativ unter die Kontrolle des Promotors E4 oder verschiedener Promotoren, insbesondere Promotor HSV-TK, CMV oder von LTR-RSV, gestellt.
Die oben angegebenen Positionen beziehen sich auf die Sequenz des Wild-Adenovirus Ad5, wie sie publiziert und auf der Basis der Daten zugänglich ist. Obgleich bestimmte geringere Variationen zwischen den verschiedenen Adenovirus-Serotypen existieren können, sind diese Positionen allgemein auf andere Serotypen und insbesondere auf Ad2, Ad7, Ad12 und AdCAV-2 übertragbar.
4-2 Transkomplementation von AdΔE1ΔE4-LacZ durch Bac.E1–E4
Die Produktion des Adenovirus AdΔE1ΔE4-LacZ wird durch Einführung des Baculovirus E1, E4, hergestellt in Beispiel 4-1, und des Adeno-viralen Genoms, das bezüglich E1 und E4 defekt ist (siehe 1) in die kompetenten Zellen erhalten. Die optimalen Bedingungen zur Produktion von AdΔE1ΔE4-LacZ in den kompetenten Zellen durch Transkomplementation durch gereinigtes Bac.E1–E4 werden analysiert. Der Titer von AdΔE1ΔE4 wird als Transduktionseinheiten der β-Galactosidase (t.d.u.) in der Linie W162 angegeben und die erreichte Transkomplementationswirksamkeit wird mit derjenigen der Encapsidationslinie IGRP2 verglichen.
5. Konstruktion eines Baculovirus, das die Gesamtheit des Genoms des Adenovirus komplementiert
Obgleich die gleichzeitige Expression von mehreren Proteinen, die bis zu 13 kb Sequenz darstellen können, ausgehend von einem einzelnen Virus, beschrieben wurde (Belyaev und Roy, NAR 21 (1993), 1219), ist die maximale Klonierungskapazität des Baculovirus nicht sehr gut beschrieben. Dieses Beispiel zeigt nun, dass es möglich ist, das Genom des Adenovirus, das bezüglich seines Enkapsidationssignals deletiert ist (Ad.Psi-) und das durch zwei loxP-Stellen [loxP-ITR-ITR bis E4 –loxP] begrenzt ist, in das Baculovirus zu klonieren. Die Infektion kompetenter Zellen, die die Rekombinase Cre in induzierbarer oder nicht induzierbarer Art exprimieren (Linie Cre oder Cre-ER, siehe Beispiel 7) durch dieses rekombinante Baculovirus und die Aktivierung der Rekombinase Cre, erlauben die Exzision und die Zirkularisierung des Adeno-viralen Genoms. Dieses ist dann auch fähig, die frühen Gene zu transduzieren, zu replizieren und die späten Gene zu aktivieren, ist aber unfähig, enkapsidiert zu werden, und dient demnach als Helfer für die Produktion eines Adenovirus-Minimum (siehe 2–4). In diesem System beruht die Produktion von Adenoviren-Minimum auf der Co-Infektion durch zwei Baculoviren und der Durchführung von zwei Rekombinations-Ereignissen zwischen den loxP-Stellen. Dieser Ansatz bietet den Vorteil, dass er keine Adenoviralen Partikel aus dem Helfer-Virus produziert.
Die Konstruktion des Genoms Ad.Psi- wird bei E. coli durchgeführt. Dazu wird das vollständige Genom des Adenovirus Ad5 in einem Prokaryoten-Klonierungsvektor kloniert, und zwar mit ITR-Verknüpfungen. Die Sequenz Psi wird durch enzymatische Spaltung und Ligation oder durch ortsspezifische Mutagenese deletiert. Eine LoxP-Sequenz wird dann an beiden Seiten des Adeno-viralen Genoms in paralle ler Orientierung eingeführt. Die resultierende Konstruktion [loxP-ITR-ITR·ΔPsi an E4 –loxP] wird dann in einen Schaukelvektor kloniert, der die Rekombination mit einem Baculovirus nach der in Beispiel 3 beschriebenen Strategie erlaubt. Das erhaltene rekombinante Baculovirus, BacAd.Psi- genannt, wird dann nach klassischen Methoden isoliert.
6. Konstruktion eines Baculovirus, das das Genom des rekombinanten defekten Adenovirus in exzisierbarer Form enthält.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Baculovirus, das das Genom des defekten rekombinanten Adenovirus in die kompetenten Zellen einbringen kann. Genauer ausgedrückt, das rekombinante Adenovirus ist für die Gesamtheit der codierenden Regionen defektiv und behält nur die ITR- und Psi-Regionen (Adenovirus-Minimum oder AdΔ) zurück.
6-1 Konstruktion eines Mini-Genoms (AdΔ) in E. coli
Ein Plasmid p[loxP-(ITR-ITR-Psi-P·CMV-LacZ-pA)-loxP] wird konstruiert. Dazu wird eine Kopie der ITR-Sequenz des Adenovirus durch enzymatischen Verdau isoliert und/oder durch PCR amplifiziert, dann oberhalb der ITR-Psi-Sequenz, die im Shuttle-Vektor des Adenovirus pGY63 enthalten ist, kloniert. Dieser Vektor stammt von pCOI (WO 96/10088) und besitzt das Gen LacZ unter der Kontrolle des Immediate-Early-Promotors des Cytomegalovirus (P.CMV), terminiert durch das Polyadenylierungssignal des Virus SV40 (pA), kloniert zwischen die ITR-Psi-Sequenz und das Gen, das für pIX codiert. Die Region (ITR-ITR-Psi-P·CMV-LacZ-pA) dieses Vektors (entsprechend einem Genom des Adenovirus-Minimum) wird dann durch enzymatischen Verdau isoliert, danach zwischen die LoxP-Stellen in die Mehrfach-Klonierungsstelle des Plasmids pBS246 (Gibco) kloniert, um das Plasmid p[loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP] zu erzeugen. Das Vermögen, Mini-Genome von Adenovirus, ausgehend von einer ringförmigen DNA, zu produzieren und sie dann einzukapseln, wird dann durch Transfektion dieses Plasmids in die Linie IGRP2, die durch Ad.ΔE1ΔE4 infiziert ist, das die Rekombinase Cre exprimiert (AdCre), getestet. Die Adenovirus-Minimum werden durch einige aufeinander folgende Passagen des Überstands der Transfektion in die Linie IGRP2 amplifiziert. Sie werden dann durch isopyogene Zentrifugation mit Cäsiumchloridgradienten gereinigt und durch Pseudo-Titration in die Linie W162 quantifiziert. Es ist selbstverständlich, dass das Gen LacZ in einfacher Weise durch jede andere Nukleinsäure von Interesse ersetzt werden kann, wobei die klassischen Techniken der Molekularbiologie verwendet werden.
6-2 Klonierung eines Mini-Genoms, das in einem Baculovirus exzisierbar ist
Die Konstruktion, die das Mini-Genom AdΔ, begrenzt durch die zwei loxP-Stellen, trägt, das oben beschrieben wurde, wird im Lokus P10 des Baculovirus in den Schaukelvektor pAcUW1 (Pharmingen, USA) kloniert. Das Baculovirus Bac.AdΔ wird dann produziert und isoliert, und zwar durch die klassischen Techniken der Co-Transfektion in den vorstehend genannten Sf9-Zellen, und durch seinen Phänotypbereich (weiß) nach Färbung mit X-Gal selektioniert. Dieses Baculovirus trägt demnach ein hoch defektes Adeno-virales Genom, das durch zwei loxP-Regionen in direkter Orientierung eingerahmt wird.
6-3 Produktion des AdΔ durch Transkomplementation mit dem Baculovirus BacAdPsi-
Kompetente Zellen werden gleichzeitig mit dem Baculovirus BacAdPsi^– (in Beispiel 5 beschrieben), das die Transkomplementationsfunktionen der Gesamtheit des adenoviralen Genoms trägt, und mit dem Baculovirus Bac.AdΔ, das das Genom des Pseudo-Adenovirus (oben beschrieben) trägt, co-infiziert. Die Rekombinase Cre wird durch Zusatz des Proteins in das Kulturmedium oder durch Transfektion der Zellen mit einem Plasmid oder einem Virus (Baculovirus), das Cre exprimiert, oder durch Expression einer Kassette, die stabil integriert in das Genom der Zelllinie ist (wie in Beispiel 7 beschrieben) eingebracht. Das Adenovirus-Minimum wird durch aufeinander folgende Passagen der Kulturüberstände der Zellen, die durch BacAd.Psi- und durch den Überstand co-infiziert sind, amplifiziert, dann gereinigt und titriert, und zwar nach den vorstehend beschriebenen Techniken. Diese Technik erlaubt es, als einzelnes Virus AdΔ zu erhalten, das seine Isolierung und seine Reinigung durch klassische Verfahren ermöglicht. Außerdem sind die erhaltenen Titer mit einer industriellen Verwendung kompatibel.
7. Konstruktion einer Linie, die das Protein Cre exprimiert
Eine Linie, die Cre in induzierbarer oder nicht induzierbarer Art exprimiert, wird konstruiert, um die Wirksamkeit der Rekombination zwischen den loxP-Stellen im erfindungsgemäßen Baculovirus (zum Beispiel Bac.AdΔ und BacAd.Psi-) zu erhöhen und die Expression von Cre zu kontrollieren. In dieser Konstruktion wird Cre allein oder in Form eines C-terminalen Fusionsproteins mit der Bindungsdomäne des Rezeptors an Östradiol (ER) (Metzger et al., 1996, vorgenannt) unter Kontrolle eines ubiquitären Promotors, vorzugsweise eines starken, induzierbaren oder nicht induzierbaren, exprimiert. Insbesondere sind die verwendeten Promotoren der Promotor pGRE5, der Promotor des Metallothionins, der Promotor SV40 oder der Promotor des Gens HSV-TK.
Um diese Cre-Linien zu konstruieren, werden die kompetenten Zellen durch zwei Plasmide co-transfiziert, der eine enthält die Expressionskassette Cre (Cre oder Cre-ER) und der andere die eines Selektionsmarkers (Neo). Klone, die gegen G418 resistent sind, werden selektioniert, die Cre-Aktivität in diesen Klonen wird durch Transfektion des Plasmids p(P.CMV-loxP-ATG-stop-pA-LoxP-LacZ) getestet. Dieses Plasmid enthält das Gen LacZ, das durch Einführung einer Folge von Stopp-Codons in die drei Leseraster und des Signals zur Beendigung der Transkription und der Polyadenylierung des Virus SV40, begrenzt durch zwei loxP-Stellen, zwischen dem Promotor P.CMV) und dem Anfang des LacZ inaktiviert ist. Die Expression von Cre in den Klonen in Gegenwart des Inducers oder nicht (Östradiol) wird dann durch die β-Galactosidase-Aktivität gezeigt, die durch Rekombination zwischen den zwei loxP-Stellen induziert wird. Mehrere Klone, die stabil das Fusionsprotein Cre-ER oder das Protein Cre allein, ausgehend von den Promotoren und den kompetenten Zellen, die nachfolgend genauer angegeben werden, werden so selektiert. Diese Klone sind für die Produktion des erfindungsgemäßen Virus einsetzbar.

Claims

Verfahren zur Herstellung von rekombinanten defekten Viren, nach dem man in eine Population kompetenter Zellen das Genom des rekombinanten defekten Virus und ein Baculovirus einführt, das alle Funktionen oder einen Teil der Funktionen enthält, die zur Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms notwendig sind, wobei der restliche Teil der Funktionen durch die kompetente Zelle eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Baculovirus die Gesamtheit der Funktionen enthält, die für die Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms notwendig sind.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Baculovirus einen Teil der Funktionen, die für die Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms notwendig sind, enthält, wobei der andere Teil durch die kompetente Zelle eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Funktionen, die zur Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms erforderlich sind, durch mehrere Baculoviren eingebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante defekte Virus ein rekombinantes defektes Adenovirus ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom des rekombinanten Adenovirus bezüglich einer Funktion oder mehrerer Funktionen, ausgewählt unter E1, E2, E3, E4, L1–L5, pIX und IVa2, defekt ist und das Baculovirus die Gesamtheit der Funktionen, die für die Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms erforderlich sind, enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom des rekombinanten Adenovirus bezüglich einer Funktion oder mehrerer Funktionen, ausgewählt unter E1, E2, E3, E4, L1–L5, pIX und IVa2, defekt ist, das Baculovirus einen Teil der Funktionen, die zur Transkomplementation des rekombinanten defekten Genoms erforderlich sind, enthält, wobei der andere Teil der Funktionen durch ein anderes Baculovirus oder mehrere andere Baculoviren und/oder durch die kompetente Zelle eingebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Helfer-Baculovirus die ganze Region E1 des Adenovirus oder einen Teil der Region E1 des Adenovirus enthält, was die Komplementation eines Genoms von rekombinantem Adenovirus, das bezüglich der Region E1 defekt ist, erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Helfer-Baculovirus einen Teil der Region E2 des Adenovirus oder die ganze Region E2 des Adenovirus enthält, was die Komplementation eines Genoms von rekombinantem Adenovirus, das bezüglich der Region E2 defekt ist, erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Helfer-Baculovirus einen Teil der Region E4 des Adenovirus oder die ganze Region E4 des Adenovirus trägt, was die Komplementation eines Genoms von rekombinantem Adenovirus, das bezüglich der Region E4 defekt ist, erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Helfer-Baculovirus einen Teil der Regionen E1 und E4 des Adenovirus oder die ganzen Regionen E1 und E4 des Adenovirus enthält, was die Komplementation eines Genoms von rekombinantem Adenovirus, das bezüglich der Regionen E1 und E4 defekt ist, erlaubt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Genom von rekombinantem Adenovirus frei von jeder codierenden viralen Region ist und das Helfer-Baculovirus die Gesamtheit der Funktionen enthält, die seine Komplementation erlauben.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Baculovirus die Gesamtheit eines Adeno-viralen Genoms mit Ausnahme der Einkapselungsregion und gegebenenfalls der ITRs enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Komplementationsfunktionen, die in dem Baculovirus und dem Genom des rekombinanten defekten Virus vorliegen, keine Homologiezone enthalten, die geeignet ist, zu einer Rekombination zu führen.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass ein Genom von rekombinantem Adenovirus, das bezüglich der Region E1 und gegebenenfalls E3 defekt ist, in die kompetenten Zellen eingeführt wird, wobei diese Zellen in gleichzeitiger Art oder nicht durch ein Baculovirus infiziert werden, das die Region E1 enthält, wobei die Adenovirus-Region E1, die im Baculovirus und dem Genom des rekombinanten defektiven Adenovirus vorliegt, keine Homologiezone enthält, die geeignet ist, zu einer Rekombination zu führen.
Rekombinantes Helfer-Baculovirus nach Anspruch 1, das in sein Genom eine Nukleinsäure insertiert hat, die für eine Komplementationsfunktion codiert, für die Produktion von rekombinanten defekten AAVs, welche die Regionen Rep und Cap des AAV unter der Kontrolle des heterologen Promotors enthalten.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 1, das in sein Genom eine Nukleinsäure, die für eine Komplementationsfunktion codiert, ausgewählt unter allen Funktionen oder einem Teil der Funktionen, die durch die Regionen gag, pol und env eines Retrovirus codiert werden, einzeln oder in Kombination, unter der Kontrolle des heterologen Promotors insertiert enthält.
Baculovirus nach einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor durch die Promotorregion gebildet wird, die natürlicher Weise für die Expression der Komplementationsfunktionen verantwortlich ist.
Baculovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein zellulärer oder stark viraler, regulierter oder nicht-regulierter, Promotor ist.
Baculovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure auf der Ebene des Locus des Polyhedrins oder des Locus p10 eingeführt ist.
Baculovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in einer excisierbaren Kassette, in die kompetente Zelle eingeführt wird.
Rekombinantes Baculovirus nach einem der Ansprüche 16 und 17, umfassend in sein Genom insertiert wenigstens eine DNA-Region, die von zwei Sequenzen flankiert wird, die eine ortsspezifische Rekombination ermöglichen und in direkter Orientierung positioniert sind, wobei die DNA-Region wenigstens einen Replikationsursprung, der in den kompetenten Zellen funktionell ist, und eine Nukleinsäure, die für eine Komplementationsfunktion eines Virus codiert, enthält, wobei die Sequenzen, die eine ortsspezifische Rekombination ermöglichen, LoxP-Sequenzen des Bacteriophagen P1 sind und die Rekombination in Gegenwart des Proteins Cre erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante defekte Genom durch Infektion mit einem Adenovirus, das das Genom enthält, in die Zelle eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante defekte Genom durch Transfektion in die Zelle eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante defekte Genom mit einem rekombinanten Baculovirus, der sich von dem Baculovirus unterscheidet, der die Komplementationsfunktionen trägt, in die Zelle eingeführt wird.
Rekombinantes Baculovirus nach einem der Ansprüche 16 bis 21, das in sein Genom wenigstens eine DNA-Region flankiert von zwei Sequenzen, die eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung positioniert sind, insertiert enthält, wobei die DNA-Region wenigstens einen Replikationsursprung, der in den kompetenten Zellen funktionell ist und ein rekombinantes defektes Adenovirusgenom enthält, welches im Wesentlichen die ITR-Regionen, die Einkapselungssequenz und die Nukleinsäure von Interesse enthält.
Verfahren zur Herstellung von rekombinanten defekten Adenoviren, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Population von kompetenten Zellen mit einem Baculovirus nach Anspruch 22 und mit einem Baculovirus nach Anspruch 26 infiziert, man die Zelle in Gegenwart der Rekombinase bringt, die die ortsspezifische Rekombination ermöglicht, man die produzierten Adenoviren gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Population der kompetenten Zellen eine Population von hepatischen Zellen, Muskelzellen, Fibrobblasten, Embryonalzellen, Epithelzellen (insbesondere pulmonalen), Augenzellen (insbesondere Bindehautzellen) oder Nervenzellen ist.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Population von kompetenten Zellen ausgewählt ist unter den Zellen 293 oder jeder abgeleiteten Zelle, die eine supplementäre Komplementationsfunktion enthält, A549, HuH7, Hep3B, HepG2, HER, 911, HeLa oder KB.