CZ182299A3 - Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus - Google Patents

Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus Download PDF

Info

Publication number
CZ182299A3
CZ182299A3 CZ991822A CZ182299A CZ182299A3 CZ 182299 A3 CZ182299 A3 CZ 182299A3 CZ 991822 A CZ991822 A CZ 991822A CZ 182299 A CZ182299 A CZ 182299A CZ 182299 A3 CZ182299 A3 CZ 182299A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
baculovirus
genome
recombinant
defective
region
Prior art date
Application number
CZ991822A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ293947B6 (cs
Inventor
Hélene Leblois-Prehaud
Michel Perricaudet
Emmanuelle Vigne
Patrice Yeh
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9497899&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ182299(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ182299A3 publication Critical patent/CZ182299A3/cs
Publication of CZ293947B6 publication Critical patent/CZ293947B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pens And Brushes (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

(57) Anotace:
Řešení se týká způsobu přípravy rekombinantního viru. Způsob je založen na použití bakuloviru, který poskytuje komplementační funkce. Vynález se také týká konstruktů potřebných k provádění tohoto způsobu, produkčních buněk a také výsledného viru.
CZ 1822-99 A3 • · · ·
• ·
.. ..7(//^-77 • · · · φφφ · φφφ φφφ
176 948/HK
Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy rekombinantních vírů. Týká se také konstruktů potřebných k provádění takového způsobu, přípravy buněk a viru připraveného tímto způsobem. Tyto viry mohou být použity jako vektory pro klonování a/nebo expresi genů in vitro, ex vivo nebo in vivo.
Dosavadní stav techniky
Vektory virového původu jsou široce využívány pro klonování, přenos a expresi genů in vitro (pro přípravu rekombinantních proteinů, pro provádění screeningu a testů, pro výzkum regulace genů apod.), ex vivo nebo in vivo (pro vytváření zvířecích modelů, pro terapeutické použití). K takovým virům patří zejména adenoviry, adeno-asocióvané viry (AAV), retroviry, herpetické viry nebo virus vákcinie.
Virová čeleď Adenoviridae je široce rozšířena u savců a ptáků a patří do ní více než sto sérotypů virů, které jsou tvořeny dvoj řetězcovou DNA bez obalu a vytvářejí kapsidu s ikosahedrickou symetrií (Horwitz, In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Third edition ed. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Kromě toho, že jsou bezpečné, mají adenoviry ještě široký buněčný třopismus. Na rozdíl od retrovírů, jejichž životní cyklus je závislý na buněčném dělení, mohou infikovat jak aktivně se dělící buňky tak i klidové buňky, a jejich genom je udržován v episomické formě. Navíc mohou být‘ produkovány ve velmi vysokém titru (1011 pfu/ml). Tyto hlavní vlastnosti z nich činí zvláště • 4 4 4 4 4 4· ·· • 4 · 4 4 4 4
44444 444 4
4 44444 444 výhodný vektor pro klonování a expresi heterologních genů. Skupina C adenovirů, zvláště typy 2 a 5, a také psí adenovirus .typu CAV-2, jehož molekulární biologie je nejlépe známa, jsou zdroji vektorů dnes běžně používaných.
Adenovirus má lineární genom velikosti 36 kb, který je zakončen na každém konci invertovanou terminální repeticí (ITR), což je sekvence velikosti 103.bp obsahující replikační počátek,. a obsahuje také enkapsidační signál situovaný v blízkosti levé ITR (Shehk, Adenoviridae: The Viruses and Thelr Replicaťion. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Philadelphia: Raven publishers, 1996: 2111-2148).
V průběhu životního cyklu viru jsou exprimovány tři rodiny genů:
- Bezprostředně časné geny (immediate-early genes, El, E2, E3 a E4), které se účastní: regulace buněčných genů, zejména umožňují vstup buňky do S fáze buněčného cyklu (E1A) a inhibují apoptózu (E1B). : Podílejí se také ne regulaci časných nebo pozdních virových genů na úrovni transkripce, sestřihu nebo transportu (E1A, E2A, E4) mRNA (messenger RNA). Hrají také roli při replikaci a při úniku imunitní odpovědi.
Opožděně časné geny (delayed-early genes, pIX a IVa2) jsou spojeny s regulací transkripce pozdních genů (IVa2) nebo s vytvářením virionů (pIX).
Pozdní geny (latě ' genes, Ll až L5 transkribovány ze silného promotoru (MLP) transkřipt velikosti 28 kb umožňuje vytvářet odpovídající různým strukturním proteinům (jaderný protein, penton, hexon) a hestrukturním proteinům podílejícím se na vytváření a' , zrání virových částic, k alternativnímu sestřihu s využitím místa.
j sou
Primární transkripty tak, že dochází 5-polyadenylačního ·· 9 «· ···· 9· 99 • 9 '99 · 9 9 · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9.99 · ' · ·.· 9 9 · 999999
9 · · · 9 9
9999 999 99 999 99 99
Adenovirové vektory byly využity pro klonování'a expresi genů in vitro (Gluzman et al.Cold Spring Harbor, New York 11724, p. 1.87), pro' vytvoření transgenních zvířat (WO95/22616), pro přenos genů do buněk ex vivo (WO95/14785; W095/06120) a pro přenos genů do. buněk in vivo (viz zejména W.093/19191, WO94/24297, W094/08026) .
Pokud se týká adeno-asociovaných virů. AAV, jsou to relativně malé DNA. viry, které se integrují do genomu buněk, které infikují, stálým a relativně mí stně-specifickým způsobem. Jsou schopny infikovat'široké spektrum buněk, aniž by nějak ovlivnily buněčný růst, diferenciaci a morfologii. Zdá se, že se dosud u· nich neprojevily žádné patologické účinky- na člověka.' Genom AAV byl klonován, sekvencován a popsán. Obsahuje asi 4700 baží a na každém konci má úsek invertované terminálni repetice (ITR) velikosti 145 bp, který slouží jako replikační počátek pro · virus. Zbytek genomu je rozdělen do dvou nezbytných' částí nesoucích enkapsidační funkci;·levá část genomu obsahuje gen'rep účastnící se virové replikace ' a exprese virových genů a pravá ; část genomu obsahuje gen cap, kódující- proteiny virové kapsidy.
Použití vektorů odvozených od AAV pro. přenos genů in vitro a in vivo bylo; již popsáno (zvláště viz WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528).
Retroviry jsou integrativní viry, které selektivně infikují dělící se buňky. Představují proto zajímavé vektory pro použití např. v léčbě rakoviny . nebo restenóz. Genom retrovirů se skládá ze dvou LTR, enkapsidační sekvence a tří kódujících úseků (gag, pol a env). Konstrukce rekombinantních vektorů a jejich použití in vitro a in vivo bylo již podrobně popsáno, viz např. Breakfield et al·., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. . Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnologý 3' (1985) 689) .
Z virů již byly připraveny různé konstrukty pro použiti jako rekombinantní vektory obsahující různé požadované geny. V každém z těchto konstruktů byl virový genom modifikován aby tak, virus
161) bylo replikace konstrukty nebyl schopen autonomní v infikovaných buňkách. Takže dosud známé odpovídající dosavadnímu stavu techniky jsou viry, které jsou defektní v určité oblasti svého genomu, která je nezbytná pro replikaci. Konkrétně pokud se týká adenovirů, první generace konstruktů měla deleci v úseku El nebo deletovaný celý úsek El, který je nezbytný pro . virovou replikaci, a to v místě, kde byla vložena heterologní sekvence DNA ((Levrero et al., Gene 101 (1991) 195/ Gosh-Choudhury- et al.', Gene 50 (1986)
Kromě toho pro zlepšení vlastností takového vektoru navrženo vytvořit jiné delece nebo modifikace adenovirového genomu. Tak byla např. vnesena teplotně senzitivní mutace do mutanta tsl25, což umožnilo inaktivovat DNA vazebný protein (DBP) velikosti 72 kD (Van der Viiet et al., 1975). Jiné vektory obsahují delece jiných .oblastí nezbytných pro virovou replikaci a/nebo šíření, a sice oblasti E4. Adenovirové vektory, které- mají odstraněné oblasti El a E4, mají značně redukovaný transkripční šum, a také expresi virových genů. Takové vektory byly např. popsány v patentových přihláškách WO94/28152, : WO95/02697,
WO96/22378. Byly také popsány vektory nesoucí modifikace na úrovni genu IVa2 (W096/10088) . Kromě toho byly také popsány (WO94/12649, WO94/28152, WO95/02697) tzv. minimální adenoviry. nebo pseudoadenovirové vektory (alternativně AdA) obsahující po'uze úseky nezbytné v cis pro produkci viru (ITR a enkapsidační sekvence) a postrádající jakoukoliv virovou kódující sekvenci, ačkoliv příprava takových vektorů je obtížná, jak bude vysvětleno dále. - - .
····
Pokud se týká AAV, popisované vektory obecně postrádají celou kódující oblast Rep a Cap, , ' které ·' jsou nahrazeny požadovanou nukleovou kyselinou.
V rekombinantních vektorech odvozených z retrovirů jsou obecně odstraněny geny gag, pol a env·, buďto částečně nebo úplně, a jsou nahrazeny heterologní sekvencí požadované nukleové kyseliny. Kromě toho rekombinantní retroviry mohou obsahovat modifikace na úrovni LTR k potlačení transkripční aktivity a- na úrovni velké enkapsidační' sekvence, obsahující část genu gag (Bender et al.,. J. Viro.l. .61 (1987) 1639) .
Vzhledem k jejich defektnímu charakteru ve vztahu k replikací, příprava těchto různých rekombinantních virů zahrnuje možnost transkomplementace. funkcí odstraněných z genomu. A právě transkomplementace je zdrojem hlavních potíží . při přípravě těchto virů, zvláště' pak poskytování transkomplementačních funkcí.
Byly vyvinuty dva přístupy řešení tohoto problému. První je založen na konstrukci transkomplementačních linií,· čili v podstatě enkapsídačních linií. Druhý přístup je založen na použiti pomocného (helper) plazmidu.
, Byly zkonstruovány různé defektních virů. Tyto linie jsou schopné poskytnout funkci, která chybí virovému vektoru. Obecně tyto linie obsahují, integrované ve svém genomu, úseky odstraněné z virového genomu (tedy např. El, E2 a/nebo E4 u adenovirů,· gag, pol a/nebo env u retrovirů a rep a/nebo cap u AAV).
.Jedna linie, známá tím, že produkuje defektní adenoviry, je linie 293, do které byla integrována část adenovirového genomu. Podrobněji řečeno, linie 293 je linie buněk lidských embryonálních ledvin, která obsahuje levý konec (asi 11 až adenovirů nebo pomocného enkapsidační linie různých
%) genomu adenovirů sérotypu 5 (Ad5) , obsahující levou
A A • A • « » * ► · • · ·
ITR, enkapsidační úsek, úsek El,' včetně. Ela a Elb, úsek kódující protein pIX a část úseku kódujícího protein pIVa2. Tato linie· je schopna transkomplementovat rekombinantní adenovirus defektní v úseku El, čili postrádající buď celý úsek El nebo jeho část, a produkovat virus s vysokým titrem. Tato- linie, je také schopna produkovat v permisivní teplotě (32 °C) virus, obsahující navíc teplotně sensitivní mutaci
E2. Byly popsány i další buněčné linie· schopné komplementovat El,, založené na lidských buňkách plicního karcinomu A54 9 (WO94/28152) nebo lidských retinoblastech (Hum. Gen. Ther. (1996) 215) . Byly také popsány linie schopné komplementovat několik funkcí adenovirů. Zejména je třeba uvést linie komplementuj ící úseky El a E4 (Yeh et al. , J. Virol. 70 (1996) 559/ Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) a linie komplementující úseky
El a E2 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/27071).
Byly také- popsány různé linie produkující defektní retroviry, obecně schopné exprimovat geny gag, . pol a env. K takovým liniím patří např. linie PA317 (US 4,861,719), linie PsiCRIP (W090/02806), linie GP+envAm-12 (W089/07150) nebo linie BOSC (WO94/19478) a další. Pro konstrukci' rekombinantních retrovirů obsahujících požadovanou nukleovou kyselinu, je třeba zkonstruovat plazmid obsahující, zejména LTR,· enkapsidační sekvence a danou.nukleovou kyselinu, a pak užít tento konstrukt pro transfekci enkapsidační linie, jak byla popsána výše, schopné poskytnout v trans, retrovirové funkce chybějící v plazmidu. Produkované retroviry jsou pak purifikovány obvyklou technikou. Použití linií však má určité nevýhody. Tak např.· je obtížné, drahé a značně omezující konstruovat a ověřovat takové linie v průmyslovém, měřítku. Přitom tyto linie by vskutku měly' být .slučifelné s průmyslovým využitím. Kromě • » · · · · ·· ·· • · 9 9 9 9 9
9 999 · · · · • · . · 9 999 999
9 9 9 9
9 9 99 · · · 9 toho. tyto linie, sotva zamezí produkci replikujících se kontaminujících virů (RCA) . 'Navíc tyto linie v současné době neumožňují komplementovat v měřítku dostatečném pro průmyslové využití vysoce defektní viry, jako jsou např. minimální adenoviry popsané výše.' Skutečně adenoviry mají genom organizovaný do. různých transkripčních jednotek, jejichž časoprostorová regulace je velice složitá. Nebylo proto dosud možné provádět dostatečně transkomplementaci adenovirů, ve kterých byly odstraněny všechny virové kódující sekvence, tím, že by se separátně exprimovaly vš.echny transkripční jednotky · buďto konstitutivním nebo podmíněným způsobem, pomocí buněčné linie. Takže dosud pouze malé úseky genomu odpovídající úsekům El, E4 a. pIX, a třem proteinům kódovaným E2 (pol, DBP, p-TP) byly konstitutivně exprimovánv pomocí buněčných linií. Zbytek genomu odpovídá hlavní· pozdní jednotce (MLTU), která produkuje v&echny pro ' strukturní i nestrukturní proteiny z primárního transkriptu velikosti 28 kb a je aktivována po replikaci genomu. Pro vytvoření minimálního adenovirů je .transkomplementace těchto.úseků nezbytná.
Druhý přístup spočívá ve : společné transfekci (kotransfekci) . defektním virovým genomem a konstruktem (plazmidem nebo adenovirem) poskytujícím komplementační funkce.' Obecně se připravují zejména defektní rekombinantní
AAV v buněčné ' linii infikované lidským pomocným . virem kotransfekci plazmidem obsahujícím sekvenci ohraničenou dvěma úseky invertované terminální repetice (ITR) z AAV a plazmidem nesoucím AAV komplementační funkce (geny rep a cap). Varianty byly popsány v přihláškách WO95/14771; WO95/13365; WO95/13392 nebo WO95/06743. Nevýhoda použití pomocného adenovirů spočívá hlavně ve zvýšeném riziku rekombinace mezi;, adenovirovým transkripční transkripty (například adenovirem) požadovanou nukleovou
0· · ·« ···· ·» ·· ♦ ··· ·'··' · · ♦ · • ····«·· · · · • · « · · ·······<
• · · · · · · ···· ··· ·· ··· .·· ·* • . 8 .
vektorem a pomocným adenovirem, a také v obtížnosti oddělit rekombinantu od pomocného viru během produkce a purifikace virových' . kmenů. . Nevýhoda použiti pomocného plazmidu, například plazmidu Rep/cap, spočívá v získaném stupni transfekce, který neumožňuje produkovat vysoké titry viru.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nový systém pro produkci virů, který umožňuje překonat výše zmíněné nevýhody. Systém podle vynálezu je založen na tom, . že pro poskytnutí komplementačních.funkcí se používá bakulovirus.
Produkční systém podle vynálezu, umožňuje obejít se, a to obzvláště výhodným způsobem, ' bez použití zavedených komplementačních linií, vyhnout' se problémům . s RCA a transkomplementovat vysoce defektní genomy. Kromě toho je systém podle' vynálezu použitelný pro každou buňku schopnou infekce požadovaným virem a bakulovirem, a tedy nabízí velmi flexibilní použití.
První předmět vynálezu tedy spočívá ve způsobu přípravy defektních rekombinantních virů, podle kterého je zaveden do populace kompetentních buněk genom defektního rekombinantního viru ' a bakulovirus obsahuj ící všechny nebo' některé funkce nutné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu.
Způsob vynálezu je tudíž založen na použití ’bakuloviru' pro .zajištění komplementačních funkcí. Jsou možné různé přístupy. Především je možné použít kompetentní buňky,' které neexprimují žádnou transkomplementační funkci defektního rekombinantního genomu. V tomto případě je možné použít buď bakulovirus obsahující všechny funkce nezbytné pro transkomplementaci^ defektního rekombinantního genomu nebo
9· ·· 9999
9 9 9 9 9 9 ·9
9 9
999
9 9 9
9 9
9 9
999 9·9
9
99 •několik bakulqvirů, z nichž' každý nese jednu' nebo více funkcí nezbytných pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu. Je také možné použít populaci kompetentních ' buněk, které jsou samy již schopné transkomplementovat jednu nebo více funkcí defektního rekombinantního genomu (enkapsidační linie). V tomto případě použitý(-é) bakulovirus(-y) zajistí pouze funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu, které , ještě nejsou transkomplementovány kompetentními buňkami.
Jak bylo již uvedeno - výše, mnohé výhody systému ' podle vynálezu jsou významné jak pro průmyslovou využitelnost (žádná potřeba linií,, žádné kontaminující viry, RCA, apod.), tak .pro aplikace (produkce rekombinantnich virů nesoucích jakýkoliv typ delece, zejména vysoce defektních rekombinantnich adenovirů). Navíc, jelikož se bakulovirus nereplikuje v lidských buňkách, získané virové přípravky nejsou bakulovirem kontaminovány. Kromě .toho je bakulovirus fylogeneticky od adenovirů velmi vzdálený, tudíž mezi těmito viry není žádné riziko rekombinace nebo transkomplementace. Tento', systém tedy umožňuje produkovat výhodným způsobem koncentrované kmeny defektních virů, bez RCA. Systém je nejvýhodnější zejména pro produkci defektních rekombinantních adenovirů.
Bakuloviry jsou opouzdřené,. cirkulární'dvoj řetězcové DNA viry specifické pro obratlovce. Jejich prototyp, AcNPV, má genom velikostí 133 kb. Je široce používán jako vektor pro expresi eukaryotických genů v hmyzích buňkách, začínající dvěma silnými promotory [polyhedrin ' (Ph) a. P10], (King a Possee, The baculovirus expression systém. London:'Chapman & Ha'11, 1992) . AcNPV je schopný infekce některých savčích buněk, ale genom není ani transkribován ani translatován. Nedávno Hofmann et al. (PNAS 92 (.1995) 10099) ukázali, že ···· • · · « • « ·· · ·· « ♦« · • · · · ··· · ·· · • *·· · » · ······ « · ♦ · · · · ···· ··· »· ··« ·· -·· hepatocyty mohou být in vitro transdukovány purifikovaným rekombinantním bakulovirem exprimujícím gen LacZ. Buněčná toxicita nebyla popsána, ani při násobku infekce 1000, a účinnost transfekce popsaná v tomto článku je přibližně 50 % pro MOI 100.
Původce nyní ukázal, že je možné infikovat různé buněčné typy rekombinantnimi bakuloviry. Původce konkrétně ukázal, že rekombinantním! bakuloviry bylo možné infikovat buňky lidského původu, jako jsou imortalizovaně embryonální buňky. Původce' ukázal také, že je možné získat velmi vysokou účinnost transdukce (> 80 %) . Původce také ukázal, že je možné do bakuloviru zavést funkce pro.komplementaci adenovirů a exprimovat tyto funkce v-populaci kompetentních' buněk. Původce tedy poskytl důkaz, že bakulovirus tvoři inertní vektor, který může být výhodně použitý pro přenos á expresi virových, komplementační ch funkcí do savčíc-h, zejména' lidských buněk. Dalšími výhodami systému vynálezu jsou zejména:
i) velká klonovací kapacita, která umožňuje komplementovat celý adenovirový genom, a ii) pokročilý rozvoj- technologie bakulovirů.
Bakulovirus nesoucí -funkce pro komplementaci viru je v následujícím textu označován také,jako pomocný bakulovirus. Může.obsahovat různé funkce pro komplementaci viru.
Tak pomocný ' bakulovirus může obsahovat úsek El adenovirů. Bakulo-El může být použit pro produkcí první generace adenovirů, tj . adenovirů defektních pro úsek El (AdAEl), bez ohledu na. stav jejich E3 (tj . defektní AdůEl, ΔΕ3, či nikoliv). Produkce první generace defektních rekombinantních adenovirů (defektních v úseku El a případně' E3) tvoří první obzvláště výhodnou aplikaci způsobu podle vynálezu. Jak je uvedeno výše, v literatuře byly popsány různé linie, které jsou. schopné transkomplementace funkce El
0
0 00
0000
(buňky 293, buňky A'549, buňky 911,. apod.). Ale mezi . úsekem nesoucím transkomplementační funkce, které jsou- integrovány do genomu linie, a DNA' rekombinantního. viru, kterou je žádoucí produkovat, existují různé oblasti homologie. Proto mohou nastat během produkce různé rekombinace, vytvářející repl.ikativní virové částice, . zejména' typu E1+ adenovirů. Může to být jediná rekombinantní událost následované zlomem chromozomu, nebo dvojitá rekombinace. Tyto dva typy modifikace vedou k reintegraci úseku El obsaženého v buněčném genomu' do jeho počátečního lokusu. v adenovirovém genomu. Navíc při. daných vysokých titrech rekombinantního vektoru, které jsou.'.produkovány linií 293 (větší než 1012) , je vysoká pravděpodobnost, že tyto rekombinantní jevy .nastanou, Bylo vskutku pozorováno, že četné série defektních rekombinantních adenovirových vektorů první generace byly kontaminovány replikativními virovými částicemi, které tak mohou představovat hlavní nevýhodu pro farmaceutické použití. Výskyt takových částic v terapeutických přípravcích by vskutku mohl vyvolat in vivo nekontrolované rozmnožování viru a jeho síření s rizikem zánětlivé reakce, rekombinace apod. Kontaminované série pak nemohou být použity v humánní terapii.
Předkládaný vynález umožňuje .překonat tyto nevýhody. Vskutku v jednom provedení způsobu podle vynálezu je. genom rekombinantního adenovirů defektního v úseku El, a případně ,E3/ zaveden do kompetentních buněk, tyto buňky jsou infikovány, simultánně či jinak, bakulovirem obsahujícím úsek El, přičemž úsek El adenovirů přítomný v bakuloviru a genom defektního rekombinantního adenovirů neobsahují žádnou oblast homologie (překryvu) schopnou vyvolat rekombinaci. Podle tohoto provedení je tedy možné rychle produkovat, bez potřeby zavedené linie, kmeny první generace rekombinantních ·· ·· ···· • · • ·
.· ·· ·· * · • · · ··· ··· • ♦ ·· ·· adenovirů prostých RGA. Kromě toho, jak je uvedeno níže, kmeny takto vzniklých rekombinantních adenovirů prostých RGA, mohou být použity jako' počáteční materiál pro novou produkci společnou infekcí kompetentních. buněk' bakulovirem.·
Pomocný bakulovirus může také' obsahovat úsek E2 adenoviru, úplný nebo částečný, zejména úsek E2 a/nebo E2b. Bakulo-E2 může být použit pro produkci, adenovirů defektních v úseku E2 (Ad-AE2) a případně v úseku E3 (Αύ-ΔΕ2,ΔΕ3) v kompetentních buňkách. Navíc' v kompetentních buňkách schopných komplementace úseku El adenoviru může bakulo-E2 umožnit produkci rekombinantních adenovirů defektních v úsecích El a E2 (Ad-ΔΕΙ, ΔΕ2) a případně E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ2, ΔΕ3) . Podobně v kompetentních buňkách schopných komplementace úseků El' a E4 adenoviru (například v buňkách IGRP2). může. bakulo-E2 umožnit produkci rekombinantních adenovirů defektních v úsecích El, E2 a E4 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ2,ΔΕ4) a případně E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ2,ΔΕ3,ΔΕ4) . .
Pomocný bakulovirus může také obsahovat úsek E4 (úplný nebo část) adenoviru. Bakulo-E4 může být použit pro produkci, adenovirů defektních v úseku E4 (Ad-áE4) a případně v úseku E3 (Αύ-ΔΕ4,ΔΕ3) v kompetentních buňkách. Navíc v kompetentních .buňkách schopných komplementace úseku El adenoviru může bakulo-E4 umožnit produkci rekombinantních adenovirů defektních v úsecích El a . E4 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4) a případně E3 (Ad-ΔΕΙ, ΔΕ4, ΔΕ3) . '·
Pomocný bakulovirus může také obsahovat úseky El a E4 (úplné nebo části) adenoviru. Baculo-El, E4 může být použit k tomu, aby v kompetentních buňkách produkoval adenoviry defektní v úsecích El a E4 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4) a případně E3 (Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4,ΔΕ3) , jak je uvedeno na obrázku 1.
4444 . 4 4
Kromě toho je - také možné, aby vznikly viry - ďefektní v úsecích El a ,E4, použít dva 'pomocné bakuloviry, 'jeden exprímující funkci El a druhý funkci E4, úplně nebo částečně.
Stejně tak může pomocný bakulovirus obsahovat úseky El, E2 a E4 (úplné nebo části), a případně úseky nesoucí pozdní geny (LI až L5) .
Pomocný bakulovirus může také obsahovat úseky AAV Rep a/nebo Cap. Bakulo-Rep/Cap tak umožňuje - komplementovat v linii kompetentních buněk genom AAV postrádající jakoukoliv kódující vírovou sekvenci (obrázek 5).
Bakulovirus může také obsahovat úseky gag, pol a/nebo env retroviru. Bakulo-gag/pol/env tak umožňuje komplementovat v linii kompetentních buněk retrovirový . genom postrádající jakoukoliv kódující virovou sekvenci.
Je také možné použít bakulovirus obsahující úseky gag/pol a druhý bakulovirus obsahující úsek env.
Obecně je výhodné, když se genom defektního rekombinantního viru a komplementační úseky - přítomné v bakuloviru nepřekrývají. To vskutku umožňuje vyhnout se. rizikům rekombinace, a tak vzniku RCA. To je obzvláště důležité pro· vznik první generace adenovirů (Ad-ΔΕΙ). V tomto případě je úsek El zavedený do bakuloviru definován tak, že nemá žádnou společnou sekvenci s rekombinantním genomem. Tiby se tak stalo,, je možné například odstranit z rekombinantního genomu úsek větší . než- komplementační úsek vložený do bakuloviru, jak je ukázáno v příkladech. To je výhodné také pro vznik adenoviru Ad-ΔΕΙ,ΔΕ4.
Tedy v určitém provedení vynálezu je genom defektního rekombinantního viru zaveden, do kompetentních buněk, tyto buňky, jsou infikovány, současně či jinak, . bakulovirem obsahujícím všechny nebo některé funkce -nezbytné pro komplementaci . defektního genomu, přičemž komplementační ·· * ··, ···· ·· ·· • ··· · ·· · ·· · • · · »..··* · * · · • · · * · » · ··· ··· • · ·.·.· ♦ · ···· ··· ·· ··· ·· ·· funkce přítomné v bakuloviru a genomu defektního rekombinantního viru neobsahují žádnou oblast homologie schopnou vyvolat rekombinaci. 'Výhodně je virový genom rekombinantní adenovirový genom defektní v úseku El a bakulovirus nese úsek adenoviru schopný transkomplementace úseku El. Podle jiné varianty.je virový genom rekombinantní adenovirový genom defektní v úsecích El a E4 a bakulovirus nese dva adenovirové úseky schopné . transkomplementace uvedených úseků nebo jsou. použity dva bakuloviry, jeden nesoucí úsek adenoviru schopný transkomplementace- úseku El a druhý úsek adenoviru schopný transkomplementace úseku E.4', bez úseků homologie s defektním adenovirovým genomem.
Podle specifického provedení vynálezu jsou všechny kódující úseky adenoviru neseny jedním nebo více pomocnými bakuloviry. Podle -jiného provedení je použit pouze jeden pomocný bakulovirus obsahující všechny kódující úseky adenoviru. Takový pomocný bakulovirus může být tedy použit pro transkomplementaci· minimálního rekombinantního adenoviru, Takový bakulovirus .může obsahovat konkrétně celý adenovirový. genom, s výjimkou enkapsidačního úseku a případně ITR, jak je ukázáno v příkladech.
Příprava komplementačních funkcí
Komplementační funkce zavedené do pomocného bakuloviru mohou pocházet z virů různých sérotypů.
Co se týče adenovirů, existují různé sérotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší, ale které projevují srovnatelné genetické uspořádání. Konkrétně komplementační funkce použité pro konstrukci bakulovirů podle vynálezu pocházejí z adenoviru lidského nebo zvířecího původu.
4* 44
4 4 4 4
444 4 444
4 444 444
4 4
444 44 44 ·· » ·· • · ·· · ·
4 · · • 4 · · · • 4 4 ·
4444 444 44
Co se týče adenovirů lidského původu, mohou být zmíněny zejména adenoviry zařazené do skupiny C. Výhodněji se mezi různými sérotypy lidských adenovirů preferuje použití adenoviru typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5) v rámci předkládaného vynálezu. Je také možné-použít úseky pocházející z adenoviru typu 7 nebo 12, patřících do skupin A a B. Mezi různými adenoviry zvířecího původu se preferuje použití ade.novirů psího původu, zejména všech kmenů adenovirů CAV2 [kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)] v rámci vynálezu. Další adenoviry zvířecího původu jsou 'konkrétně uvedeny v přihlášce WO94/26914, na kterou se tímto odkazuje.
Ve výhodném provedení vynálezu pochází komplementační funkce z genomu lidského adenoviru skupiny C. Výhodněji pochází z genomu adenoviru Ad2 nebo Ad5.
Úseky nesoucí různé komplementační funkce mohou být z adenovirového genomu získány enzymovým štěpením metodami odborníkům známými. Tyto úseky mohou ' být volitelně modifikovány tak, aby se zmenšila jejich velikost nebo aby se nahradily určité regulační prvky (promotor, zesilovačapod.) heterologními prvky. Obecně jsou·· tyto úseky připraveny následujícím způsobem: DNA adenoviru se purifikuje stočením v gradientu chloridu česného nebo je získána in vitro z prokaryotického (WO96/25506) nebo eukaryotického (W095/03400) plazmidú. D.NA je poté štěpena příslušnými restrikčními enzymy a získané fragmenty nesoucí požadované komplementační funkce jsou identifikovány a vybrány. Výběr použitých res.trikčních enzymů závisí na požadovaných restrikčních funkcích. Výběr se tedy řídí restrikčními' mapami a publikovanými sekvencemi adenovirových genomů. Tak může být izolován úsek El ve formě fragmentů nesoucích všechny čtecí rámce E1A a ElB.po. směru od promotoru E1A. Úsek E4 může být izolován ve formě fragmentů nesoucích celé čtecí rámce nebo ··· · « ·« ··«· > · · » · · · ·
I · Λ ft · · ·· ·«· ·· ·· • · · « ·«« .··
p.ouze jejich část, výhodně rámce 0RF3 nebo 0RF6 nebo ORF6-ORF6/7 .
Podobné metody jsou použity pro. ' přípravu komplementačních úseků AAV a rekombinantních retrovirů. 'Tak mohou být úseky AAV rep a/nebo cap získány enzymovým·štěpením z virové DNA izolované z různých sérotypú AAV. To je výhodně AAV-2. U . retrovirů mohou být úseky gag, pol a/nebo env získány také obvyklými technikami molekulární biologie z různých typů retrovirů, jako ' zejména' MoMuLV (Murine Moloney Leukaemia .Virus, virus- myší Moloneyovy. leukemie; také nazýván ' MoMLV), MSV (Murine Moloney Sarcoma Virus, sarkomu) sarkomu) virus- myšího Moloneyova Virus, virus Harveyova
Virus, virus nekrózy sleziny), RSV
HaSV (Harvey Sarcoma SNV (Spleen Necrosis (Rous Sarcoma Virus,: virus Rousova sarkomu) nebo Friendův .'virus .
Konstrukce pomocného bakuloviru
Fragmenty nesoucí komplementační úseky jsou - pak subklonovány do. plazmidovéhoL vektoru umožňujícího jejich •další manipulaci (jemnější štěpení, PCR, přidání regulačních sekvencí, apod.), například v prokaryotickém nebo eukaryotickém organismu. Získaný konečný fragment kódující komplementační funkci(e) je poté vnesen do pomocného bakuloviru za použití obvyklých technik'molekulární biologie. Specificky je fragment klonován mezi dvě sekvence' homologni k úseku genomu bakuloviru, a poté je výsledný fragment nebo plazmid kotransfekován s genomem bakuloviru do hmyzích buněk (obvykle buněk S.f9 and Sf21 (Spodoptera frugiperda) , ale také buněk Tn-368 a High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Gibco)(Trichopulsia) nebo do jakékoliv jiné hmyzí, buňky permisivní pro bakuloviry a schopné použití' pro jejich produkci). Homologni rekombina-ce
9 9
9 ····
9« 9999
9 9 • · 999
9 ·
9 9
999
9 9
9 9
999 999
9
99 mezi plazmidem nebo fragmentem a genomem bakuloviru dává vznik požadovanému rekombinantnímu bakuloviru, který může být znovu získán a purifikován obvyklými metodami (viz zejména King ' a Possee: The Baculovirus Expression System. London: Chapman & Halí, 1992). Pro konstrukci rekombinantních bakulovirů jdou komerčně dostupné různé soupravy obsahující kyvadlové vektory a mohou být použity podle doporučení výrobců. Zejména je možné použít kyvadlové vektory dodávané společností Clontech, vektory pAc (Verne et al., Bio/Technology, 6 (1988) 47, Pharmingen, USA), vektory pBlue-Bac (Invitrogen) nebo vektory. pBSV (Boehringer). Komplementační funkce mohou být tedy 'vloženy na různá místa bakuloviru, zejména do lokusu polyhedrinového genu nebo genu plO. Kromě toho mohou být použity různé' kmeny bakulovirů, jako je konkrétně AcNPV nebo Bombyx moři .(Maeda et al., Nátuře, 315 (1988) 592) . Dále· může být použitý bakulovirus modifikován, aby se zvýšil/změnil jeho tropismus. Je vskutku možné modulovat.tropismus virových vektorů modifikací jejich povrchových proteinů tak, že se
i) omezí fúzí .virových· proteinů se specifickým ligandem (lehký řetězec imunoglobulinu, peptid uvolňující gastrín)/ nebo' r ' ' ii) rozšíří tvořením pseudotypů s heterologním vírovým glykoproteinem [G viru puchýřkové -stomatitidy, Vesicular Stomatitis Virus (VSV)] , [Liu et al/, J. Virol 70(4) (1996)
2497; Michael et al., Gene Ther. 2 (1995) 660], Nedávno bylo prokázáno., že povrchový glykóprotein bakuloviru (gp64) fúzovaný s gpl20 viru HIV byl schopný vázat se na receptor CD4 (Boublik et al., Bio/Technology, 13 (1995) 1079). Tato modifikace gp64 neovlivňuje životaschopnost bakuloviru ve hmyzích buňkách. Podobný konstrukt s G z VSV by umožnil zesílit tropismus bakuloviru pro savčí buňky, a tudíž zvýšit ·· * ·· ···· ·» ·· · ·· · · · · ·· * « · · · ··· · · · · . · ·· · ·· ··· ··· • ».···- · · transdukční účinnost buněk Huh7, jakož i' jiných buněčných linií. U pomocných virů jsou komplementační funkce výhodně umístěny tak, že jsou pod kontrolou heterologního promotoru (tj . - jiného původu, než bakulovirovéhd), ' který' je funkční v kompetentních buňkách. Opravdu se zdá,· že bakulovirové promotory neumožňují získat postačující hladiny exprese kompíementačních funkcí v buňkách jiných než hmyzího původu, a nejsou proto nej vhodnější pro aplikace vynálezu. Promotor může být především dosavadní promotor (homologní promotor) kompíementačních funkcí viru (E1A, E4, E2, MLR promotor pro adenovirus, P5 nebo P19 promotory z AAV, LTR promotor z.RSV, apod. ) . Může to také být jakýkoliv promotor odlišného původu, který je,funkční v použitých kompetentních buňkách. Pro tento účel mohou být zmíněny například promotory genů exprimované v této buňce nebo známé běžné promotory, jako je například promotor genu PGK, časný promotor CMV, promotor genu TK herpesviru nebo alternativně LTR promotor z RSV. Může to být také regulovaný promotor, jako například promotor viru MMTV, promotor odpovídající na hormony, například typu' GRE5, nebo promotor regulovaný tetracyklinem. Výhodně- to , je indukovatelný nebo silný, běžný homologní promotor.
Další' předmět předkládaného vynálezu se ' týká rekombinantního bakuloviru obsahujícího, vloženou do svého genomu, nukleovou kyselinu -kódující komplementační funkci viru umístěnou pod kontrolu heterologního promotoru. Konkréntěji, komplementační funkce je protein nezbytný- pro produkcí uvedeného vitu, -jehož kódující úsek je inaktivní (mutovaný, deletovaný apod.) v defektním virovém genomu. Pro adenoviry je komplementační funkce vybrána zejména ze všech nebo některých funkcí kódovaných úseky El, E2, E4, LI až L5, pIX a' IVa2 adenoviru, samotného nebo v kombinaci.. Pro AAV ·· 9 ·· ···· •••4 4 4 4 • · · 4 · 4 ·
9 9 9 4 4 4 • 4 4 4 4 •••4 999 44 999 jsou to funkce kódované úseky Rep a/nebo Cap a p.ro retroviry gag, pol a/nebo env. Výhodně nukleové kyselina odpovídá úseku virového genomu Obsahujícímu . úsek kódující vybranou komplementační funkci. Je' to obzvláště fragment genomu adenoviru sérotypu Ad2 nebo- Ad5, MoMLV nebo AAV-2. Obzvláště výhodně obsahuje nukleová kyselina také úsek promotoru, který je přirozeně zodpovědný za expresi vybrané komplementační funkce.
Jakožto specifický příklad předkládaného vynálezu lze uvést bakulovirus . obsahující celý nebo část úseku El adenoviru. Je to zejména bakulovirus obsahující úsek Ela', Elb nebo Ela a Elb; Úsek El adenoviru je lokalizovaný na úrovni nukleotidů 104 (promotor Ela) až' 4070 (polyA Elb) z Ad5. Konkrétně je TATA box promotoru Ela lokalizován na úrovni nukleotidu '470, ATG kodon Ela na úrovni nukleotidu 560 a stopovací kodon na úrovni nukleotidu 3511. Jako přesný příklad může být zmíněn bakulovirus obsahující fragment 391 až 3511. Tento pomocný bakulovirus je obzvláště vhodný pro produkci rekombinantních.adenovirů defektních v úseku El, nesoucích deleci větší než je tento' fragment 391 až 3511. Je zejména vhodný pro produkci první generace adenovirů bez RCA' nesoucích deleci v úseku El pokrývající nukleotidy 383 až 3512 včetně.
Dalším specifickým příkladem vynálezu je bakulovirus, který obsahuje například všechny nebo některéúseky El a E4 adenoviru. Úsek E4 adenoviru se skládá ze 7 otevřených čtecích rámců označených ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, QRF3/4, ORF6 a- ORF.6/7, Zdá se, že- z proteinů kódovaných těmito různými ORF, ty proteiny, které jsou tvořené ORF3 a ORF6, umožňují· replikaci viru, a tudíž transkomplementaci adenovirů defektních v úseku . E4, .dokonce v celém. Tudíž výsledný pomocný bakulovirus podle vynálezu výhodně obsahuje celý úsek
·· ···· • .· • ··· • « • 4 » · · ·
E4 nebo pouze jeho část obsahující alespoň rámec ORF3 nebo ORF6. Různé části úseku E4 mohou být získány enzymovým štěpením nebo modifikovány metodami odborníkům známými. Konkrétně čtecí rámec ORF6 může být izolován z úseku E4 ve formě fragmentu BglII-PvuII, odpovídajícímu nukleotidům 34115 až , 33126, a čtecí rámce ORF6-ORF6/7 mohou, být izolovány z úseku E4 ve formě fragmentu BglII-BglII odpovídajícímu nukleotidům 34115 až 32490 z genomu Ad5. Baculovirus může také obsahovat celé čtecí rámce ÓRF1-ORF7 (například ve formě fragmentu 32800 až. 35826 nebo 32811 až. 35614 nebo 32811 až 35640). Rozumí se, že další fragmenty mohou být určeny na základě publikovaných sekvencí adenovirových genomů. .Použití bakulovirů nesoucích redukovanou jednotku úseku E4 je výhodné, -protože Umožňuje transkomplementaci defektního adenovirového genomu nesoucího větší deleci úseku E4, tudíž bez . oblasti homologie, a tedy zabrání jakékoliv možnosti rekombinace.
Podle prvního provedení vynálezu je zavedena nukleová. kyselina kódující komplementační funkci(e) do pomocného bakuloviru vé formě expresní kazety. Toto provedení je nej snadnější pro použití. Je zejména výhodné pro produkci rekombinantních adenovirů defektních v časných genech a pro produkci defektních rekombinantních AAV a retrovírů.
Podle dalšího provedení je zavedena nukleová kyselina kódující' komplementační funkci(e) do pomocného bakuloviru ve formě vystřihnutelné kazety vytvářející replikativní molekulu v kompetentní' buňce. Replikace kazety v.buňce umožňuje výhodně zvýšit počet kopií komplementuj ících genů,- a tak zvýšit produkční hladiny systému. Toto provedení je zejména vhodné pro produkci velmi vysoce defektních rekombinantních adenovirů, defektních konkrétně ve strukturních genech. Toto provedení je obzvláště vhodné pro produkci, minimálních
21 • · · • · ·· • · ' • · • · ·· · · ··· ·· ··· • · · • · · · · • · · • · • · · · · • ·· ·· • · · • · · • · · · · · · • · ·· ··
adenovirů. Kvantita strukturního proteinu je vskutku
limituj ící faktor pro produkci vysokých titrů vysoce
defektních adenovirů (typu minimálního adenoviru) Toto
provedení umožňuje poprvé podstatně zvýšit intracelulární hladiny transkomplementačních proteinů, zejména strukturních proteinů adenoviru (kódovaných úseky LI až L5), až na hladiny kompatibilní s transkomplementací minimálních adenovirů.
Původce tedy ukázal, že je možné konstruovat rekombinantní bakuloviry obsahující heterologní usek, který je možné v buňce vystřihnout, výhodně indukovatelným a regulovaným způsobem, aby vznikla cirkulární a replikativní molekula (epizomálního typu). .
Excise , (vystřižení) se· výhodně provádí místněspecifickým rekombinačním mechanismem a replikace v buňce je vyvolána replikačním počátkem nezávisle na stavu buněčného dělení.
Výhodněji je místně-specifická rekombinace použitá podle způsobu vynálezu získána pomocí dvou specifických sekvencí, které jsou schopné rekombinace se sebou navzájem, v přítomnosti specifického proteinu,'-, obecně' nazývaného rekombináza. Tyto specifické sekvence uspořádané, v příslušné orientaci ohraničují v bakuloviru sekvence kódující komplementační funkce. Tedy předmětem vynálezu je také rekombinantní bakulovirus obsahující, vložený do svého genomu, alespoň jeden úsek DNA ohraničený dvěma sekvencemi umožňujícími místně-specifiekou rekombinaci,· a umístěný v přímé orientaci, uvedený úsek DNA obsahuje alespoň jeden řeplikační počátek. funkční v kompetentních buňkách a nukleovou kyselinu kódující komplementační funkci viru.
Sekvence umožňující rekombinaci, které jsou použity podle vynálezu, obecně obsahují od 5 do ' 100 párů ba.zí, výhodněji méně než 50 párů baží. Mohou patřit do různých
0 0 0 0 0 0 0 ·
0 0 0 0
0 0 0 · ·
0 0 0 0 strukturních skupin, zejména . do rodiny rekombinázy Pl baktériofága nebo resolvázy transpozonu.
Z rekombináz patřících do . rodiny integrázy baktériofága 1 mohou být uvedeny zejména integráza · fágů lambda (Landy et al ., Science, 197 (1977) 1147), P22 a F80 (Leong et al. , J. Biol. Chem. 260.' (-1985) 4468), HP1 z Haemophilus influenzae (Hauser et al.,. J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), integráza Cre z fága Pl, integráza plazmidu pSAM2 (EP 350 341) nebo rekombináza FLP plazmidu 2 pm z kvasinek Saccharomyces cerevisiae.
Z rekombináz patřících do rodiny transpozonu Tn^ mohou být: uvedeny zejména resolváza transpozonu Tn3 transpozonu. gd, Tn21 a Tn522 (Stark.et al. , 1992);
Gin z bacteriofága mu nebo resolváza plazmidů, fragment par z RP4 (Abert et al., Mol. Microb.iol., 12 (1994)
131) .
_ nebo invertáza jako je
Podle výhodného provedení sekvence umožňující místněspecifickou rekombinací v rekombinantních bakulovirech předkládaného vynálezu pocházejí z baktériofága.. Výhodněji to jsou připojovací sekvence · (sekvence attP. a attB) z. baktériofága, nebo odvozené sekvence. Tyto sekvence jsou schopné specifické rekombinace se sebou navzájem v přítomnosti rekombinázy nazývané integráza. Jako specifické příklady mohou být uvedeny zejména sekvence pro připojení fágů lambda, P22, F80,. Pl, HP1 z Haemophilus influenzae nebo z plazmidu pSAM2, nebo 2pm.
Ješt-ě výhodněji jsou sekvence umožňující místněspecifickou rekombinací představované rekombinačním systémem fága Pl. Fág Pl má rekombinázu nazývanou Cre, která specificky rozpoznává nukleotidovou sekvenci 34 párů baží nazývanou místo loxP (Sternberg et al., J. Mol. Biol. 150 (1981) 467). Tato sekvence je složena ze dvou palindromických ··
• 4 4 · • 4 4 4
444 444 '4 sekvencí o 13 bp oddělených konzervativní sekvencí o 8 bp. Místně-specifická rekombinace je výhodně získána za použití sekvencí LoxP nebo odvozených sekvencí a rekombinázy Cre.
Termín odvozená ' sekvence zahrnuje - sekvence získané modifikací (modifikacemi) rekombinantních sekvencí · výše uvedených, přičemž zachovává kapacitu specifické rekombinace v přítomnosti příslušné rekombinázy.· Může tedy zahrnovat redukované fragmenty těchto sekvencí nebo naopak fragmenty rozšířené přidáním jiných sekvencí (restrikční místa apod.). Může také zahrnovat varianty získané mutací (mutacemi), zejména bodovou mutací (bodovými mutacemi).
Ve výhodném provedení vynálezu jsou proto sekvence umožňující místně specifickou rekombinaci sekvence LoxP bakteriofága Pl a rekombinace je získána v. přítomnosti proteinu Cre. Z tohoto hlediska může být rekombinace dosaženo tak, - že se kompetentní buňky přivedou do. přímého kontaktu s rekombinázou Cre nebo expresí genu kódujícího rekombinázu Cre v kompetentních buňkách. Výhodně je rekombináza Cre produkována v buňce indukcí, exprese odpovídajícího genu. Tak je gen .kódující rekombinázu- výhodně umístěn pod kontrolu indukovatelného promotoru nebo konstruován v regulovatelné formě. Z tohoto hlediska je výhodně použita fúze mezi -Cre a vazebnou doménou steroidního hormonu (esťradiol, progesteron, apod.) umožňující regulaci aktivity Cre, a tudíž vyvolání rekombinace (Metzger et al. , PNAS' 92 (1993) 6991). Obecněji může být exprese rekombinázy kontrolována každým silným promotorem, regulovaným nebo jiným. Expresní- kazeta může být transfekována do kompetentních buněk nebo integrována do genomu kompetentních buněk, jak je ukázáno v příkladech.
. Tento systém tedy umožňuje vytvářet replikativní molekuly,, které produkují v kompetentních buňkách vysokou
9 9
9 · · » · « *
9 9
9 9 99 úroveň virové, zejména adenovirové, komplementační funkce. Tento typ konstruktu je obzvláště vhodný pro .komplementaci vysoce defektních genomú, zejména adenovirových ' genomu defektních v pozdních genech. Tak je -specifický konstrukt podle vynálezu představován bakulovirem. obsahujícím, vložený do svého genomu,- alespoň jeden úsek DNA ohraničený dvěma sekvencemi LoxP umístěnými v přímé orientaci, přičemž uvedený úsek DNA obsahuje alespoň jeden replikační počátek funkční v kompetentních buňkách a jednu nukleovou kyselinu kódující komplementační funkci adenoviru. Komplementační funkce výhodně obsahují všechny nebo některé z časných genů přítomných v úsecích El, E2 a E4 . Ještě výhodněji , zahrnují komplementační funkce všechny nebo některé z časných genů a z pozdních časných genů. Výhodně umožňují komplementační funkce komplementaci rekombinantního adenoviru postrádajícího jakoukoliv kódující virovou sekvenci. Komplementační funkce konkrétně zahrnují celý adenovirový genom s výjimkou ITR a sbalovacího (pakážovacího.) úseku·. Podle specifické varianty komplementační funkce zahrnují kompletní- adenovirový- genom, který ale postrádá sbalovací úsek (Ad.Psi-). ' Tento genom obsahuje zejména úseky ITR, které slouží pro replikaci genomu v kompetentních buňkách po excisi.
Aby se vyvolala replikace epizomální molekuly, obsahuje proto tato molekula replikační počátek funkční v použitých kompetentních- -buňkách. Tento replikační počátek výhodně zahrnuje aktuální sekvence ITR adenoviru, -které .umožňuj.! podstatnou amplifikaci molekuly. Může to být také jiný replikační počátek umožňující výhodně amplifikaci virové DNA v kompetentní buňce faktorem větším než 20. Jako příklad může být uveden počátek OriP/EBNAl viru EBV nebo úsek E2 papiloma viru. Přitom se rozumí, že sekvence ITR adenoviru představuje výhodné provedení.
• · ···
Pro provádění způsobu podle vynálezu se pomocný bakulovirus (bakuloviry) obecně používá v mnohonásobku infekce („Multiplicity of Infection, . MOI) umožňující, že je infikována velká populace buněk, bez významného zhoršení životaschopnosti buněk. Obecně je hodnota MOI nejlépe mezi 10 a 1000. MOI odpovídá počtu virových částic na buňku. MOI může být snadno' upravena odborníkem v závislosti na použitých kompetentních buňkách,· v podstatě na základě dvou kritérií: infekční účinnost a možná toxicita. Výhodně je MOI použitá pro pomocný bakulovirus mezi 20 a 500.. »
Vnesení virového genomu
Jak je uvedeno výše, způsob -podle vynálezu zahrnuje vnesení' pomocného bakuloviru a rekombinantního virového genomu do kompetentních buněk.. Z tohoto hlediska může být genom defektního rekombinantního adenoviru vnesen do kompetentní buňky různými způsoby.
Především se může jednat o purifikovaný defektní rekombinantní adenovirus, výhodně bez RCA. V tomto případě jsou kompetentní buňky infikovány defektním rekombinantním adenovirem a pomocným bakulovirem. Infekce rekombinantním adenovirem umožňuje zavést do kompetentní buňky odpovídající genom, který je -poté amplifikován - a enkapsidován, aby produkoval kmeny ve vysokém titru, a - to bez RCA./ Toto provedení je zejména výhodné pro tvoření první generace virů (Ad-ΔΕΙ; Ad-ΔΕΙ,ΔΕ3). Je vskutku obtížné tyto viry produkovat ve vysokých titrech bez kontaminace s RCA. Způsobem podle vynálezu je nyní možné začít s první generací defektního rekombinantního adenoviru a společnou infekcí kompetentní buňky bakulovirem obsahujícím úsek El získat koncentrované kmeny vysoké kvality. Toto provedení je . také výhodné pro « 00 0090 •900 0 0·
0 0 0000
0 0 0 0 ·
0 0 0 0
0000 000 00 ·00
0·
0 0 0
0 0 0
000 000 0 ·
0 0 0 produkci virů defektních ve dvou nebo třech základních úsecích svého genomu- (zejména El,‘ E2, E4). Obecně - je· toto provedení výhodné, protože účinnost infekce adenovirem je velmi vysoká (větší než účinnost t.ransfekce DNA) , a proto umožňuje vytvořit koncentrované kmeny. V tomto provedení jsou použity rekombinantní adenovirus a rekombinantní bakuloviry v násobku infekce (MOI) umožňujícím infikovat velkou populaci buněk aniž by se významně zhoršila jejich životaschopnost. MOI použitá pro bakulovirus je tatáž jak byla. uvedena výše (mezi 10 a 1000) . Co se týče adenovirů, je výhodně mezi 1 a 1000, výhodněji mezi .1 a 500, ještě výhodněji mezi 1 a 100. MOI použitá pro adenovirus : j e také upravena podle vybraného buněčného typu. Rozsah MOI může být snadno určen odborníkem za použití například adenovirů a bakuloviru obsahujícího oddělený gen markéru, aby' se stanovila účinnost infekce a případně jakákoliv kompetice. Výhodněji ' je · MOI adenovirů menší než 50, například mezi 1 a 20.
V dalším obzvláště výhodném provedení vynálezu je genom defektního rekombinantního adenovirů vnesen ve formě DNA. V tomto případě je genom zaveden transfekci, volitelně v přítomnosti činidla usnadňujícího transfekci (lipidy, fosforečnan vápenatý apod. ) . Tak zavedený -rekombinantní genom může být připraven in vitro různými technikami, zejména např, v E. coli (WO96/25506) nebo v kvasince (W095/03400) . Toto provedení je obzvláště užitečné pro vytvoření první řady defektního rekombinantního viru bez-RCA, která může být opět dále použita pro produkci kmenů ' s vysokým titrem podle předchozího provedení.
Genom defektního rekombinantního. adenovirů může být také zaveden za použití dalšího rekombinantního bakuloviru. Podle tohoto provedení je genom defektního rekombinantního adenovirů připraven in vitro, například jak je uvedeno výše,
• to » ···· -· · ·· to· · · · · • · ·· · · · · • ··* ··* • to to·# toto a poté je zaveden do bakuloviru ve formě kazety schopné excise v kompetentní buňce. Podle tohoto provedení jsou kompetentní buňky přivedeny do přítomnosti bakuloviru nesoucího genom defektního rekombinantního adenovirů a jednoho nebo' více pomocných bakulovirů (nesoucích komplementační, funkce). Toto provedení je obzvláště výhodné pro produkci vysoce defektních rekombinantních adenovirů. Na •základě, tohoto systému je opravdu možné vnést do populace kompetentních buněk velké množství obou vysoce defektních rekombinantních genomů a odpovídající komplementační funkce.
Vzhledem k tomu způsob podle vynálezu tedy zahrnuje koinfekci kompetentních buněk bakulovirem nesoucím genom defektního rekombinantního adenovirů a jedním nebo několika pomocnými bakuloviry nesoucími komplementační funkce. Hodnoty MOI použité v tomto provedení jsou, také mezi 10 a 100Ό pro každý použitý bakulovirus.
V dosavadním stavu techniky byly připraveny dva typy. konstruktů pro produkci minimálních adenovirů:
1) transgen (β-galaktosidáza) klonovaný mezi' ITR, ohraničený jedinečným restrikčním místem nebo
2) pravá a levá ITR klonovaná v přímé orientaci v 5' od transgenu (Fisher et al., Virology 217 (1996) 11; Kumar-Singh et al., Hum. Mol. Genet. -5 (1996) '913).
Minimální adenoviry byly produkovány v buňkách , 293 transfekci linearizovné (1) nebo cirkulární (2) DNA, virové proteiny nezbytné pro replikaci a pro enkapsidaci minigenomu byly poskytnuty v trans pomocným virem (ΑάΔΕΙ). Minimální adenoviry se chovají jako interferující defektní (ID) částice a jsou progresivně amplifikovány během postupných pasáží. Hlavní problém předložený touto metodologií je separace dvou typů vytvářených . částic zodpovědných za kontaminaci kmenů
·
000 • * 0 ' 0
0 • 000 0
0 0 00 000 pomocným virem a velmi nízké, titry minimálních adenovirů takto získaných (méně než IQ8· pfu/ml) .
Předkládaná přihláška vynálezu umožňuje poprvé vytvořit minimální adenoviry. za použiti bakuloviru, který dodá adenovirový minigenom, a bakuloviru, který poskytne všechny transkomplementační· funkce (komplementující genom).
Rekombinantní adenovirový genom je výhodně · vložen do bakuloviru mezi dvě sekvence umožňující mísťně-specifickou rekombinaci v kompetentních buňkách, jak bylo již popsáno pro pomocný bakulovirus.
Předkládaná přihláška, popisuje zejména systém pro produkci minimálního adenovirů za použití bakuloviru pro dodání adenovirového mini.genomu ,s pomocí systému loxP/Cre a. bakuloviru pro poskytnutí všech transkomplementačních funkcí (komplementující genom), také s pomocí systému Cre/loxP (viz'obrázky'2 až 4).
Podle dalšího provedení je mí stně-specifický rekombinační systém použitý pro dodání komplementačních funkcí odlišný od systému použitému pro dodání genomu rekombinantních adenovirů. Konkrétně systém LoxP/Cre může být použit pro dodání defektního adenovirového genomu a systém AttP/AttB pro dodání komplementační funkce(i)/
Způsob podle . vynálezu tak umožňuje konstruovat adenovirový vektor· zbavený všech kódujících virových sekvencí a obsahující pouze ITR a enkapsidační signál (minimální adenoviry). Tento vektor může teoreticky pojmout až 37. kb exogenní sekvence, zatímco klonovací .kapacita současných vektorů nepřesahuje 8,5 kb. To tedy umožňuje klonovat geny velké velikosti jako je gen dystrofinu (14 kb) se všemi jejich regulačními prvky (promotor, zesilovač, introny apod.) tak, aby se získala optimální, exprese v cílové tkáni. Navíc ♦
·· · ·
9999
9 9 999 9 ’ 9
9 9
999
99
9 9 · • · · * •·9 999
9 ( 99 99 nepřítomnost jakékoliv imunogenní virové sekvence by měla zvýšit trvání exprese transgenu v klidové tkáni.
Genom AAV nebo defektního retroviru může.být také zaveden ve formě viru, genomu nebo plazmidu některým ze způsobů popsaných výše.
Kompetentní buňky
Způsob podle vynálezu se může provádět s různým typem buněk. Pro účely vynálezu se kompetentní buňkou rozumí buňka permisivní k infekci bakulovirem a virem, který.se má tvořit, a umožňující produktivní virový cyklus pro tento vytvářený virus. Kapacita infekce buněk těmito viry může být určena za použití rekombinantních virů . exprimujicich markerový gen, jako je gen LacZ v E. coli. Je to výhodně savčí buňka, ještě výhodněji buňka lidského původu'. Použité kompetentní buňky .'mohou být klidové buňky nebo aktivně se dělící buňky, zavedené stabilizované l.inie nebo primární kulturyJsou to výhodně savčí buňky slučitelné s průmyslovým využitím, tj . bez známého- patogenního' charakteru, schopné kultivace, a je-li to nutné, schopné uschování v patřičných podmínkách. Výhodně jsou použité buňky jaterní, svalové,' fibroblastové, embryonální, nervové, epitelové (plicní) nebo oční (retinální) buňky.- Jako neomezující příklad mohou být uvedeny buňky 293 nebo jakákoliv odvozená buňka obsahující přídatnou komplementační funkci (293E4, 293E2a, apod.), buňky A549, buňky HuH7, buňky Hep3B, buňky HepG2, buňky lidského retinoblastomu (HER, 911), buňky HeLa,- buňkyj3T3 nebo buňky KB.·
Pro provádění způsobu podle vynálezu může být genom rekombinantního viru a bakuloviru vnesen do populace kompetentních buněk současně nebo časově oddělen. Výhodně » · · · ··» · · · · « » · · · »« «·«··· • · · ♦ · · · «·· »«· .»· ··· ·· · · jsou buňky přivedeny do kontaktu jak s rekombinantním genomem, tak s pomocným bakulovirem. V případě systému tvořícího replikativní molekuly in vivo je vnesena také rekombináza ' nebo je exprimována předem, současně nebo postupně.
Produkce virů obecně vede k lýzi buněk. Tvořené viry mohou být' tudíž sklízeny po buněčné lýzi známými purifikačními metodami. Mohou být poté různými způsoby sbalovány v závislosti na požadovaném použití. Navíc, aby se zabránilo riziku ; kontaminace virového kmene možnou příměsí bakulovirů, které nepronikly do kompetentních buněk (pomocný bakulovirus nebo bakulovirus poskytující rekombinantní virový genom), je možné aplikovat následující techniky:
- je možně puřifikovat adenoviry chromatografií podle metody popsané v přihlášce FR96/08164. Tato technika umožňuje separovat ádenovirus od jakéhokoliv možného- reziduálního bakuloviru; .
- je také možné nechat působit na kmeny purifikovaného adenovirů organická rozpouštědla' (například éter, chloroform). Vskutku, bakulovirus je opouzdřený virus' (má glykoproteinový obal),.a je proto velice citlivý na jakékoliv organické rozpouštědlo (které extrahuje lipidy z jeho obalu); na' rozdíl od toho ádenovirus není opouzdřen a stejná rozpouštědla ne něj neúčinkují;.
- je také možné separovat podle hustoty purifikací na gradientu CsCl jakýkoliv reziduální - bakulovirus a rekombinantní virus.
Tyto tři metody . mohou být použity nezávi.sle . nebo společně. Navíc může být také použita jakákoliv další metoda odborníkovi známá.
' AA · ······ • AAA · · ·
A A A A···
A · A · · · ·
AAA·· •AAA AAA A· ···
Použití virů '
Viry takto připravené mohou být použity pro klonování, přenos a exprese genů: in vitro, ex vivo nebo in vivo. Takové požadované geny jsou například geny kódující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny·: interleukiny, -interferony, TNF apod. (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitery nebo jejich prekurzory v syntéze enzymů, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF,- bFGF, NT3,' NT5, apod., apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE, apod. (WO94/25073), dystrofin nebo minidýstrofin (WO93/06223), nádorové supresorové. geny: p'53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, apod. (WO94/24297), geny kódující faktory zapojené do koagulace: faktory VII, -Vílí, IX apod., sebevražedné geny: tymidinkinázu, cytosindeaminázu apod., nebo celý či část přirozeného nebo syntetického imunoglobulinu (Fab, ScFV, apod., WO94/29446), apod. Požadovaný gen může být také gen nebo antisense'' (s opačnou orientací) sekvence, jejichž •exprese v cílové buňce umožňuje řídit expresi genů nebo transkripci buněčných mRNA. ' Takové sekvence mohou být v cílové ' buňce transkribovány například do. RNA komplementárních k buněčným mRNA, a tak blokovat jejich translaci do proteinu, podle techniky popsané v patentu EP 140 308. Požadovaný gen může být také gen, kódující antigenní peptid, schopný vyvolat ' imunitní odpověď, pro produkci vakcín. Mohou to být zejména antigenni peptidy specifické pro virus' Epstein-Barrové, virus HIV, virus hepatitidy B (EP 185 573), virus pseudorabies nebo peptidy specifické pro nádory (EP 259 212) . Gen může být každá DNA (gDNA, c.DNA apod.) kódující požadovaný produkt, potenciálně zahrnující příslušné expresní signály (promotor, terminátor apod.) A A · ·
A · · ·
AAA ··· • · AA ·· • ·φφ ·· ··*· • · ···
9 · • 9 9
999
99
9 9 · • · 9 9
9 9 9' 999 ·
9 9 9
Takové viry mohou být použity in vitro pro tvorbu těchto rekombinantních proteinů. Mohou být také použity in vitro ke studování mechanismů působení těchto proteinů nebo ke studování regulace exprese genů nebo aktivity promotorů. Mohou být také použity in. vivo pro vytvoření zvířecích modelů nebo transgenních zvířat.'Mohou být použity také pro přenos a expresi genů in vivo, u. zvířat nebo u lidí, v postupech genové nebo buněčné terapie.
Předkládaný vynález bude detailněji popsán a vysvětlen pomocí následujících příkladů, ' které je .třeba považovat za ilustrativní a neomezující.
Popis·obrázků
Obrázek 1:. schematické znázornění .produkce třetí generace defektního rekombinantniho adenovirů (defektního ve funkcích El a E4) za použití bakulo-El,. E4.
.Obrázky minimálního k zavedení bakuloviru k
z.
až schematické adenovirů za použití neúplného adenovirového zavedení komplementačních znázornění produkce prvního bakuloviru genomu a- druhého funkcí.
Obrázek 5: schematické znázornění produkce rekombinantniho AAV defektního ve funkci Rep a Cap za použití bakulo-Rep/Cap.
4 4444
4444
4 4
444 444
4
4 44
Příklady provedení vynálezu
Pří klad .1 '
Použité buňky
Buňky použité ' v rámci vynálezu mohou být získány z jakékoliv buněčné linie nebo populace schopné infekce adenovirem nebo AAV' nebo' retrovirem nebo bakulo virem, kompatibilní s použitím pro léčebné účely. Výhodně to je savčí, zejména lidská, buňka. Konkrétněji se mohou zmínit:
- Buňky linie 293:
Linie 293 je buněčná linie lidských embryonálních ledvin obsahující levý konec, (přibližně 11-12%) genomu adenoviru sérotypu 5 (Ad5)., obsahující levý ITR, ' enkapsidační oblast, oblast El, včetně Ela, Elb, oblast kódující protein pIX a část oblasti kódující protein pIVa2 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59, 1977). Tato linie jě schopná transkomplementace 'rekombinantních adenovirů . defektních v oblasti El, jinými slovy postrádajících celou nebo část oblasti El,, a produkuje kmeny virů s vysokými titry.
- Buňky linie A54 9
Buňky komplementujicí oblast El adenoviru byly. konstruovány z buněk A549.· (Imler et. al., Gene Ther., 75, 1966). Tyto buňky obsahují restrikční fragment oblasti El, postrádající levý ITR, umístěný pod kontrolu indukovatelného promotoru.
- Buňky linie HER
Buňky lidské embryonální retiny (HER) mohou být infikovány adenovirem (Byrd et al., Oncogene, 2, 477, 1988) .
Adenovirové enkapsidační buňky připravené z těchto buněk byly popsány například v patentové přihlášce WO94./28152 nebo v článku Fallauxe et al. (Hum. Gene Ther., 215, 1996).
4404
4
0 · 44 0 • 0 4
0 0 400
0 0 04 ·4
0 4 4
Konkrétně může být uvedena linie 911 obsahující oblast El genomu adenoviru Ad5, od nukleotidu 79 k nukleotidu 5789, tato oblast je integrována do genomu buněk HER. Tato buněčná linie umožňuje produkci virů defektních v oblasti El. .
- Buňky IGRP2.
Buňky IGRP2 jsou buňky získané z buněk 293 integrací funkční jednotky oblasti E4 pod kontrolu indukovatelného promotoru. Tyto buňky umožňují produkci virů defektních v oblastech El a E4 (Yeh et al., J. . Virol., 70, 1966).
- Buňky VK
Buňky VK (VK2-20 a VK10-9) jsou buňky získané z buněk 293 integrací celé oblasti E4 pod kontrolu indukovatelného promotoru' a oblasti kódující protein pIX. Tyto buňky umožňují produkci virů defektních v oblastech El a E4 (Krougliak et al., Hum. Gene Ther., 6, 1575, 1995) .
- Buňky 293E4
Buňky 2.93E4 jsou buňky získané z buněk 293 integrací celé oblasti E4. Tyto buňky umožňují- produkci virů defektních v oblastech El a E4' (WO95/02697, Cancer Gene Ther., 322, 1995) .
- Buňky Sf9 a Sf21 jsou buňky embryonálních Lepidopter. Tyto buňky jsou zpřístupněné ve sbírkách (v ATCC pod č. CRL-1711), společně s -podmínkami jejich kultivace.- Jsou také komerčně dostupné (Gibco). Viz 'také Kong a Possee: The baculovirus expression systém,' London:. Chapman and Hal'1, 1992 .
- Lidské hepatocyty
Buňky HepG2 a Hep3B a HuH7 jsou lidské linie pocházející z karcinomů jater. Jsou zpřístupněné v depozitních sbírkách a jejich vlastnosti byly popsány například v patentech US 4 393 133 a 4 393 133.
99 9 9
9 99
9» «19
9 9 9
9 9 9
999 999
- 9 9·
99
- Lidská buněčná linie KB
Linie KB pochází z lidského epidermoidního karcinomu, je přístupná v ATCC (č. CCL17), jakož i podmínky umožňující její pěstování.
- Lidská buněčná linie Hela
Tato linie pochází z karcinomu lidského epitelu, je přístupná v ATCC (č. CCL2), jakož i podmínky umožňující její pěstování.
- Buněčná·linie W162
Tyto buňky jsou buňky Věro obsahující oblast E4 adenovirů Ad2 integrovanou do svého genomu. Tyto buňky byly popsány Weinbergem. et a.l., (PNAŠ, 80, 5383, 1983) .
Příklad 2
Infekce lidských buněk rekombinantním bakulovirem
Tento příklad, popisuje kapacitu bakulovirů infikovat buňky lidského původu.
Lidské buňky (zejména 293 nebo jejích deriváty)' jsou infikovány různými, ředěními ' roztoku ' rekombinantního bakuloviru exprimujícího gen LacZ pod kontrolou RSV ' LTR. 48 hodin po infekci se objevují modré buňky, což dokazuje, že tyto buňky lze infikovat bakulovirem.
Příklad 3
Konstrukce bakulovirů . exprimujících .oblast El adenovirů a odpovídajícího defektního adenovirů
3-1. Klonování dvou kazet pro expresi El
Plazmid AE2 je získán' z klonování v PCRII (Invitrogen) produktu PCR (polymerázová řetězová reakce) prováděné, na «Φ .
• · · φφφφ · «ΦΦΦ « Φ · • · · ΦΦ
Φ Φ Φ Φ
Φ Φ Φ • Φ ΦΦΦ
ΦΦ Φ*
Φ Φ Φ Φ
Φ. Φ Φ Φ
ΦΦΦ ΦΦΦ Φ Φ
ΦΦ ΦΦ pBREl s oligonukleotidy a 5'-GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3 nukleotidy 3198 až 3511 z Ad5,
5'-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' tento produkt PCR obsahuje t j . 3' konec oblasti E1B.
plazmid pBREl obsahuje nukleotidy 1 až 5788 a Ad5 klonované do pBR322, zbaveného zhruba nukleotidů 1300 až 2300.
Plazmid AE3 pochází z klonování fragmentu Nótl-Kpnl z AE2, obsahujícího produkt PCR, do pCDNA3. (Invitrogen) naštěpeného- s Notl-Kpnl. Obsahuje nukleotidy 3198' až 3511 a Ad5 následované polyadenylačním místem BGH.
Plazmid AE4 pochází z klonování fragmentu BglII-PvuII z AE3 do pBREl. AE4 je plazmid obsahující následující El expresní kazetu:
- nukleotidy 1 až 3511 z Ad5, tj. levý ITR, enkapsidační sekvence, promotor E1A, gen E1A, promotor E1B, gen E1B
- polyA z bovinního růstového hormonu (BGH) získaného z pCDNA3.
- pBREl byl naštěpen s BstNI, a poté reagoval s T4 DNA polymerázou, aby se doplnil přečnívající 5' konec, a pak se štěpil s Xbal. Takto vzniklý fragment obsahující nukleotidy 391 až· 1339 z Ad5- byl vložen do pic20H naštěpeného, s Smal-Xbal (nemetylované místo) z avzniku plazmidu AE5.
Plazmid AE6 pochází z klonování fragmentu EcoRI-Smal z AE5' do AE4 štěpeného s EcoRI-Smal. AE6 je plazmid obsahující následující expresní kazetu El:
nukleotidy 391 až' 3511 z Ad5, tj. „redukovaný promotor z E1A, gen E1A, promotor E1B, gen E1B,
- polyA z bovinního růstového hormonu (BGH) získaného z pCDNA3. · '
3-2. Klonování dvou kazet El do bakuloviru
Fragmenty EcoRI-Sphl (Sphl přečnívající 5' konec byl předem zatupen digescí s T4. DNA polymerázou) z plazmidu AE4 «· · ·« ···« ·· ·?
·····.· <! · · · • · · ···-·,- · · · · • · ·· · »· ··· ··· • · · · · -· · ···· »·· ·· ··· »· ·· a AE6 jsou klonovány do plazmidu pAcSG2 (Pharmingen) mezi místa EcoRI' a EcoRV. Tak - vznikají plazmidy AE14 a AE15.
V obou případech je . oblast El zavedena .do lokusu polyhedrinového genu (polyhedrinový gen + odstraněný polyhedrinový promotor).
Plazmidy AE14 a 15 jsou společně transfekovány (kotransfekovány) s DNA bakuloviru BaculoGold pocházejícího z kmene AcNPV (Pharmingen) do hmyzích buněk Sf9, aby vznikly dva odpovídající rekombínantní bakuloviry BacAE14 a BacAE14, » nesoucí dvě. kazety pro expresi El integrované do lokusu polyhedrinového genu.
3-3. Klonování rekombinantního adenoviru nesoucího novou deleci El
Plazmid pCOl (WW096/10088) se štěpil BstXI, a poté s T4 DNA polymerázou, aby se odstranil přečnívající 3' konec, a pak byl štěpen Rsal. Takto vzniklý fragment obsahující nukleotidy 3513 až ' 4607. z Ad5 byl zaveden do pBS-SK+ (Stratagene) linearizovaného s EcoRV, . a poté se štěpil telecí alkalickou fosfatázou za vzniku plazmidu AEÓ.·
Plazmid pMA37 se získal ligací fragmentů:
EcoRV-Nsil z pXL2756, obsahující sacB. pXL2756 má protiselekční gen SacB . bez míst- EcoRI rezistenci . ke kanamycinu, mnohočetné a replikační počátek ColEl,
-Ndel-Nsil z pCOT (obsahující adeno sekvence)
- Sáli ’ (přečnívající - 5' konec doplněný T4 DNA a KpnI, gen pro klonovací místo polymerázou)
-Asel z pXL2756 (vektor rezistentní na kanamycin).
pMA37 tedy obsahuje:
- gen rezistence ke kanamycinu ·
9 9
9 9
9 · 9 • · • · · ·
- gen,SacB propůjčující citlivost k sacharóze bakteriím, které jej exprimují ‘
- sekvence 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 následované sekvencemi 3446 až 4415 (Nsil) z Ad5, není přítomen žádný transgen.
Plazmid-AEll byl sestrojen zavedením- fragmentu Xhol-Nsil z AEO do pMA37 štěpeného Sall-Nsil. Obsahuje tedy:
- gen rezistence' na kanamycin
- gen SacB propůjčující citlivost k sacharóze bakteriím, které jej exprimují
- sekvence 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 následované sekvencemi 3513 až 4415 (Nsil) z Ad5, není přítomen žádný transgen.
Z plazmidu AEll jsou poté konstruovány sebevražedné vektory (vložením požadovaného transgenu) konstrukci rekombinantních adenovirů 'rekombinací v E. coli. AE11 neobsahuje sekvence homologní . s plazmidem AE6. Plazmidy AE11 a AE4 mají společné, sekvence 1 až 382 (Hinfl) z Ad5 v protisměru od EIA, ale' není zde žádná homologie po směru od kazety El mezi těmito dvěma plazmidy. Tak zde ’ nemůže vznikat RCA homologní rekombinací mezi adenovirem nesoucím deleci El existujíxí v AE11 (tj. 382 až -3513) a bakuloviry BacAE14 nebo BacAElS. ;' kyvadlově umožňuj ící
3-4. Konstrukce'první generace rekombinantních adenovirů
Nejdříve je obvyklými technikami připraven kmen BavAE14 nebo 15. Dále jsou kompetentní buňky (například HuH7) transfekovány 5 ^g plazmidu pXL2822 štěpeného' PacI (plazmid pXL2822 obsahuje celý Ad5 s. odstraněnou oblastí El (382 až 3446 nebo 382. až 3513) aE3 (28592' až' 30470) a nese kazetu CMV-PGal) , a infikovány, současně nebo jinak, při MOI 10 až 1000, BacAE14 nebo 15, Když -jsou,buňky lyžovány, sesbírá se transfekční supernatant, a pak-- se použije na „čerstvé kompetentní buňky předem nebo současně infikované BacAE14
• 4 • · nebo 15 (ΜΟΙ 10 až 1000), aby se amplifikoval adenovirus Ad2822, a tak dále, dokud se nezíská kmen Ad2822. Sledování amplifikace Ad2822 je usnadněno přítomností lacZ v tomto viru. Při každé amplifikaci je tedy supernatant pseudotitrován na W162. Genom viru se analyzuje- během amplifikaci, aby ' se - kontrolovala jeho integrita. -Tato strategie má konečně tu výhodu,' že v takto tvořeném adenovirovém kmeni nevznikají RCA. Nepřítomnost kontaminace se také ještě ověřuje. 'i
Příklad 4
Konstrukce bakuloviru exprimujícího oblasti El a' E4 (Bac.El-E4) \
Použitý protokol je následující: oblasti El a E4 se klonují v opačné orientaci k lokusu polyhedrinového (Ph) genu do kyvadlového vektoru pBacPAK8 (Clontech, USA) za vzniku pBacEl-E4. Rekombinantni bakulovirus se poté izoluje kotransfekcí Sf9 pomocí obvyklých technik bakuloviru BacPAK6 do buněk Biotechniques, ' 14(5) , 810, 1993) .
pBacEl-E4 (Kittsa a DNA Possee,
Výskyt El a E4 v genomu rekombinantních bakuloviru se poté kontroluje PCR za použití infikovaných buněk Sf9. Transkripce El a E4 v -buňkách Huh7 infikovaných purifikovaným rekombinantním bakulovirem se analyzuje RT-PCR za použití cytoplazmatických RNA.
Pro konstrukci bakuloviru E1-E4 mohou být zavedeny různé fragmenty nesoucí El. Fragmenty použité' v-tomto příkladě jsou ty, které · jsou popsané v příkladu 3 pro konstrukci .bakuloviru-El, obsahující oblasti El pod kontrolou jejích vlastního promotoru (redukovaný promotor Ela a promotor Elb).
- Použité fragmenty E4 jsou následující:
- fragment Maell-MscI 32720 až 35835 nesoucí celou E4 • · • ·
- fragment BglII-PvuII 34115 až 33126 nesoucí rámec ORF6
- fragment BglII-BglII 34115 až 32490 nesoucí rámce ORF6-ORF6/7
- fragment PvuII-AluI 34801-334329 nesoucí rámec ORF3
Tyto fragmenty jsou umístěny alternativně pod kontrolu promotoru E4 nebo jiných promotorů, ' konkrétně HSV-TK nebo promotoru CMV nebo RSV-LTR.
Pozice udané výše ‘se vztahují na sekvenci divokého - typu Ad5 adenoviru, jak je publikována a přístupná v databázi. Ačkoliv mohou existovat některé menší odchylky mezi různými adenovirovými sérotypy, tyto pozice jsou obecně přenosné na jiné sérotypy, konkrétně na Ad2, Ad7, Adl2 a Ad CAV-2.
4-2 Transkomplementace AdÁElAE4-LacZ s Bac.El-E4.Produkce adenoviru AdAElAE4-LacZ se získá zavedením bakuloviru El, E4 připraveného v příkladu 4-1 a adenovirového genomu defektního v El a E4 .do kompetentních buněk (viz obrázek 1) .' Analyzují se optimální podmínky pro produkci AdAElAE4-LacZ v kompetentních buňkách transkomplementací s purifikovaným Bac.E1-E4 . Titr AdAElAE4 se určuje jako počet transdukčních jednotek (t.d.u.) .β-galaktosidázy v linii W162 a získaná ' transkomplementační účinnost je srovnána s účinností enkapsidační linie IGRP2.
Příklad 5
Konstrukce bakuloviru komplementujícího celý adenovirové genom
Ačkoliv byla publikována současná exprese několika proteinů, které mohou představovat až sekvenci o velikosti 13 kb, jedním virem (Belyaev a Roy, NAR, 21, 1219, 1993), maximální klonovací kapacita není dostatečně doložena. Tento • · • · · ·
44
I 4 4 4 » 4 4 4
444 444 příklad nyní ukazuje, že je možné klonovat adenovirový genom s odstraněným enkapsidačním signálem (Ad.Psi-), který je ohraničený dvěma místy LoxP [ losP-ITR-ITR až E4-loxP], do bakuloviru. Infekce kompetentních buněk exprimujících rekombinázu Cre, indukovatelným nebo jiným způsobem, (linie Cre . nebo Cre-ER, viz' příklad 7), tímto rekombinantním bakulovirem, a aktivace rekombinázy' · Cre umožňuje excisi a cirkularizaci adenovirového genomu. Ten je poté schopný transdukce časných genů, replikace a aktivace pozdních genů, ale neschopný enkapsidace, a tudíž slouží jako pomocník pro produkci minimálního adenoviru (viz obrázky- 2-4). V tomto systému je produkce minimálních adenovirů založena na společné infekci dvěma- bakuloviry a realizaci 2 rekombinantních jevů mezi dvěma místy loxP. Tento přístup má výhodu, že nevznikají adenovirové částice z. pomocného viru.
Konstrukce genomu Ad.Psi- se provádí v E. coli. Za tím účelem se kompletní genom adenoviru Ad5 klonuje do prokaryotického klonovacího vektoru, s připojenými ITR. Sekvence Psi je odstraněna enzymatickým štěpením a ligací, nebo místně cílenou mutagenezí. Sekvence LoxP je poté zavedena ne každou stranu adenovirového genomu, v paralelní orientaci. Výsledný konstrukt [loxP-ITR-ITR, APsi až E4-loxP] je poté klonován do kyvadlového vektoru umožňujícího rekombinaci s bakulovirem podle strategie popsané v příkladu 3. Získaný rekombinantní bakulovirus,. .nazvaný BacAd.Psi-,· je poté izolován pomocí obvyklých metod.
• · · • · · ·*···· · ·
9 99 9 9 9 9 9 9
9 ' 9 9 999 9 99
9 9 9 9 9 9 999
9 9 9 9 9 9
999 9 99 9 9 9 9 9 9 ' 9 9 · ·
Příklad 6
Konstrukce bakuloviru obsahujícího genom defektního rekombinantního adenoviru v odstranitelné formě
Tento příklad popisuje konstrukci bakuloviru, který umožňuje poskytnout genom adenoviru v kompetentních rekombinantní virus defektní a obsahuje pouze oblasti ITR a Psi (minimální adenovirus, nebo Adá) .
:defektního buňkách. pro celou rekombinantního Konkrétněji je kódující oblast
6-1. Konstrukce minigenomu (Adň) v E. coli
Sestrojí se plazmid p[loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)loxP].· Za tím účelem se izoluje sekvence kopie sekvence ITR adenoviru enzymovým štěpením a/nebo se amplifikuje pomocí PCR, a pak se klonuje v protisměru sekvence ITR-Psi obsažené v kyvadlovém vektoru z adenoviru pGY63. Tento vektor pochází z pCOl (W096/10088) a má gen LacZ pod kontrolou časného promotoru cytomegaloviru (P.CMV) zakončený polyadenylačním signálem viru SV40 (pA)', klonovaným mezi sekvenci ITR-Psi' a gen kódující pIX. Oblast (ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA) tohoto vektoru ' (odpovídající minimálnímu adenovirovému genomu) je poté izolována enzymovým štěpením a klonována mezi místa LoxP do mnohočetného klonovacího místa plazmidů pBS246 (Gibco) za vzniku plazmidů p [loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP] . Kapacita produkce adenovirových minigenomů z cirkulární DNA a jejich enkapsidace se poté testuje transfekcí tohoto plazmidů do linie IGRP2 infikované s Ad.AElAE4 exprimujícím rekombinázu Cre (AdCre). Minimální adenoviry se amplifikují několika postupnými pasážemi supernatantu z, transfekce linie IGRP2. Pak jsou purifikovány , stočením v.izopyknickém gradientu chloridu česného.- a kvantifikovány pseudotitrací •4 4444 44 44 • 4 4 4 4 4
4444 4 44 4
44 444444
4 4 '4 4
44.-444 .44 4 4 linie W162. Rozumí se, že gen LacZ může být snadno nahrazen jakoukoliv požadovanou nukleovou kyselinou obvyklými technikami molekulární biologie.
6-2. Klonování odstranitelného minigenomu do bakuloviru
Konstrukt nesoucí minigenom Adá. ohraničený dvěma místy loxP popsaný výše se klonuje do lokusu P10 bakuloviru do kyvadlového vektoru pAcUWl . (Pharmingen, USA) . Bakulovirus Bac.Adá se poté produkuje a izoluje obvyklou technikou kotransfekce do výše uvedených buněk Sf9,. a vybírá podle svého fágového fenotypu (bílý) po označení s X-Gal. Tento bakulovirus proto nese vysoce defektní adenovirový genom, ohraničený dvěma oblastmi loxP v přímé orientaci.
6-3. Produkce Adá transkomplementací s bakulovirem BacAdPsi”
Kompetentní ' buňky se současně společně infikuji (koinfikují) bakulovirem BacAdPsi- (popsaným v příkladu 5), nesoucí transkomplementační funkce celého adenoviro.vého genomu, a bakulovirem Bac.Adá nesoucím genom PseudoAdenoviru (popsaným výše). Rekombináza Cre je- zajištěna buď přidáním proteinu do . kultivačního média nebo transfekcí buněk s plazmidem nebo virem (bakulovirem) exprimujícím Cre, nebo expresí kazety trvale integrované do genomu linie (jak je popsáno v příkladu 7) . Minimální adenovirus se amplifikuje postupnou pasáží supernatantu tkáňové kultury buněk společně infikovaných ' s. BacAd.Psi- a se súpernatantem, a poté se purifikuje a titru-je. pomocí technik uvedených výše. Tato technika umožňuje získat- Adá jako jediný virus, což umožňuje jeho izolaci a purifikaci obvyklými technikami. Kromě toho získané titry' jsou slučitelné s průmyslovým použitím.
· • ·« 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
999* 9 99 9
99 999999
9 9 9
999 ·9 99
Příklad 7
Konstrukce linie exprimující protein Cre
Tvoří se linie exprimující Cre, indukovatelným způsobem nebo jinak, aby se zvýšila účinnost rekombinace mezi místy loxP v bakuloviru vynálezu (například Bac.Adá and BacAd.Psi-) a aby se kontrolovala exprese Cre. V.tomto konstruktu je Cre exprimován. samotný nebo ve formě fúzního proteinu C-koncové části s vazebnou doménou estradiol.ového receptoru : (ER) (Metzger et al., ' 1996, citovaný výše) pod kontrolou běžného promotoru, .výhodně silného promotoru indukovatelného nebo jiného. Výhodněji použité promotory jsou promotor pGRE5, promotor metalothioninu, promotor SV40. nebo promotor genu HSV-TK.
Aby . se vytvořily tyto linie Cre, kotransfekuji se kompetentní buňky dvěma plazmidy, kdy-, jeden' obsahuje expresní kazetu Cre (Cre nebo Cre-ER) a druhý markér pro selecí (Neo). Vybírají se klony G418 rezistentní, aktivita Cre v těchto, klonech se testuje transfekci plazmidů ρ(P.CMV-loxP-ATG-stoppA-LoxP-LacZ) . Tento plazmid obsahuje gen LacZ inaktivovaný zavedením mezi promotor (P.CMV) a začátek LacZ, řadu stopovacích kodonů .ve třech čtecích rámcích, signál pro terminaci transkripce a- polyadenylační signál viru SV40 ohraničený dvěma' místy loxP. Exprese Cre ve klonech, v přítomnosti či nepřítomnosti induktoru (estradiol), se poté odhaluje aktivitou β-galaktosidázy vyvolanou rekombinaci mezi dvěma místy loxP. Vybírá ' se tedy několik klonů trvale exprimujících fúzní protein' Cr.e-ER nebo samotný protein Cre bez promotorů a níže specifikované kompetentní- buňky. Tyto klony mohou být použity pro produkci virů podle vynálezu.
0 0 ······ ·· 0·
000 0 «0 0 00 0
0 0 0 000 · 0 0 0
0 00 0 00 ·00 000
0 0 0 0 0 0 «··· 0 00 0 0 000 00 0 0
Kompetentní buňka Promotor HSV-TK Promotor SV40 Promotor MMTV Promotor GRE5
Rekombináza Cre Cre- ER Cre Cre- ER Cre Cre- ER. Cre Cre- ER
2 9'3 č. 1 č. 7 č. 13 č. 19 Č. 2 5 / č. 31 č. 37 č. 43
IGRP2 č. 2 Č. 3 Č. 14 č. 20 č. 26 č. 32 č. 38 č. 44
Huf7 č. 3 č. 9 č. 15 č. 21 č. 27 č. 33 č. 3 9 č. 45
HepG2 č. 4 ě. 10 č. 16 č. 22 č. 28 č. 34 č. 4 0 č. 46
HER č. 5 č. 11 č. 17 Č. 23 č. 29 č. 35 č, 41 č. 47
Věro č. 6 č. 12 č. 18 č. 24 č. 30 č. 36 č.' 42 č. 48
• « · ·
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (29)

1. Způsob přípravy defektních rekombinantních virů vyznačující se tím, že genom defektního rekombinantniho viru a bakulovirus obsahující všechny nebo některé funkce nezbytné pro. transkomplementaci defektního rekombinantniho genomu se vnesou do populace kompetentních buněk.
2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje všechny funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantniho genomu.
3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje některé funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního ' rekombinantniho genomu, přičemž zbylé funkce poskytuje kompetentní buňka.
4. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantniho genomu.poskytuje několik-bakulovirů.
5. Způsob, podle nároku 1 vyznačující se tím,
I že defektní rekombinantní.virus je defektní rekombinantní adenovirus.
6. Způsob podle nároku 5 vyznačuj ící se tím, že genom rekombinantniho adenovirů je defektní v jedné nebo několika funkcích vybraných z El, E2, E3, Έ4, Ll až
L5, pIX a IVa2, a bakulovirus obsahuje všechny funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantniho genomu.
·« ··*· • ·<
• · · · ·
7. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že genom rekombinantního ad.enoviru je defektní v jedné nebo několika funkcích vybraných z El, E2, E3, E4, LI až
L5, pIX a ' IVa2, a bakulovirus obsahuje některé funkce nezbytné pro transkomplementaci defektního rekombinantního genomu, přičemž' zbylé funkce poskytuje jeden nebo několik bakulovirů a/nebo kompetentní buňka.
8 .. Způsob podle nároku 5 v y z n a č u j i c i se tím, že pomocný bakulovirus obsahuje celý nebo část úseku El z adenovirů, což umožňuje' komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úseku El.
9. Způsob podle nároku 5, vyznačuj ící se tím, že pomocný bakulovirus obsahuje celý- nebo část úseku E2 z adenovirů, což umožňuje komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úseku E2.
10. Způsob podlenároku 5 vy z n a ču jící setím, že pomocný bakulovirus obsahuje celou nebo část úseku E4 z adenovirů, což umožňuje- komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úseku E4.
11. Způsob podle nároku 5vyznačující se tlm, že pomocný bakulovirus obsahuje celé nebo části úseků El a E4 z adenovirů, což umožňuje komplementaci rekombinantního adenovirového genomu defektního v úsecích El a E4.
12. Způspb podle nároku 5vyznač-u-jící' se tím, žé řekombinantní adenovirový genom postrádá některý •0 0000
0 0 0000 000
0 0 0
0 0 000
0 0 0
0 0 9
0 0 0 0 0
00 00 0 0 0 0
0 0 0 0
900 000
0 0
0 0 0 0 z kódujících virových obsahuje všechny funkce úseků a umožňuj ící pomocný bakulovirus jeho komplemetaci.
13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje celý adenovirový genom kromě enkapsidačního úseku a.případně úseků ITR.
14. Způsob podle nároku lv'yznačující se tím, že komplementační funkce přítomné v bakuloviru a genom defektního rekombinantního viru neobsahují úsek homologie, který by byl schopen vyvolat rekombinaci.
15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že rekombinantní adenovirový genom defektní v úseku El a případně v E3 se vnese do kompetentních buněk, a tyto buňky jsou infikovány, současně nebo jinak, bakulovirem obsahujícím úsek El, přičemž adenovirový úsek El přítomný v bakuloviru a genom defektního rekombinantního viru .neobsahují úsek homologie, který by byl schopen vyvolat rekombinaci.
16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že bakulovirus obsahuje fragment 391 až 3511 adenovirů AdS, a v genomu rekombinantního adenovirů defektního v úseku El je rozsáhlá delece.
17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že bakulovirus ' obsahuje fragment 391 až 3511 adenovirů Ad5, a v genomu rekombinantního adenovirů defektního v úseku El je delece zasahující nukleotidy 383 až 3512 včetně.
•4 ····
4 9 ·· 44« 999·
9 9 9 9499 9 99 9
9 9999 99 999 999
9 9 9 9 9 9 9
9999 999 99 999 99 99
18. Rekombinantní bakulovirus, který obsahuje, a sice vloženou do svého genomu, nukleovou kyselinu kódující komplementační funkci defektního viru umístěnou tak, že je řízena heťerologním promotorem.
19. Bakulovirus podle nároku 18, kde komplementační funkce je vybrána ze všech nebo některých, a to buď sama nebo v kombinacích, funkcí kódovaných adenovirovými úseky El, E2, E4, LI až L5, pIX a IVa2.
20. Bakulovirus podle nároku 18, kde komplementační funkce je vybrána ze všech nebo některých, a to buď sama nebo v kombinacích, funkcí kódovaných úseky Rep a Cap z AAV.
21. Bakulovirus podle nároku 18, kde komplementační funkce je vybrána ze všech nebo některých, a to buď sama nebo v kombinacích, funkcí kódovaných úseky gag, pol a env retrovirů.
22. Bakulovirus podle nároku 18, kde nukleová kyselina kódující komplementační’ funkci je DNA odpovídající fragmentu genomu viru, který obsahuje odpovídající úsek.
23. Bakulovirus podle nároku 22, kde nukleová kyselina kódující, komplementační funkci je ' DNA odpovídající fragmentu genomu adenovirů sérotypu Ad2 nebo Ad5.
24. Bakulovirus podle nároku 18, kde promotorem je promotorový úsek přirozeně odpovídající za expresi komplemetačních funkcí.
99 9999
25.
26.
27 .
28 .
29.
31.
32 .
Bakulovirus podle· nároku 18, buněčný nebo virový promotor, jiný.
kde promotor je buďto regulovaný ·· 99
9 9 9
9 9 9
999 999
9 9
9 9 9 9 silný
CZ19991822A 1996-11-22 1997-11-18 Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus CZ293947B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9614278A FR2756297B1 (fr) 1996-11-22 1996-11-22 Procede de production de virus recombinants
PCT/FR1997/002073 WO1998022607A1 (fr) 1996-11-22 1997-11-18 Procede de production de virus recombinants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ182299A3 true CZ182299A3 (cs) 1999-08-11
CZ293947B6 CZ293947B6 (cs) 2004-08-18

Family

ID=9497899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19991822A CZ293947B6 (cs) 1996-11-22 1997-11-18 Způsob přípravy rekombinantních virů a rekombinantní virus

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6387670B1 (cs)
EP (1) EP0946741B1 (cs)
JP (1) JP4686670B2 (cs)
KR (1) KR100719645B1 (cs)
AT (1) ATE317908T1 (cs)
AU (1) AU731106B2 (cs)
BR (1) BR9713388B1 (cs)
CA (1) CA2271438C (cs)
CZ (1) CZ293947B6 (cs)
DE (1) DE69735274T2 (cs)
ES (1) ES2260803T3 (cs)
FR (1) FR2756297B1 (cs)
HU (1) HU224713B1 (cs)
IL (1) IL129686A (cs)
NO (2) NO323937B1 (cs)
SK (1) SK286900B6 (cs)
WO (1) WO1998022607A1 (cs)
ZA (1) ZA9710516B (cs)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003501042A (ja) * 1999-05-27 2003-01-14 ジェノボ， インコーポレイテッド 非哺乳動物ウイルス由来のキャリアベクターを使用する、組換えウイルスの産生のための組成物および方法
US6793926B1 (en) * 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
AU5448400A (en) * 1999-05-28 2000-12-18 Mount Sinai School Of Medicine, The A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors
GB9919409D0 (en) 1999-08-18 1999-10-20 Univ Oxford Brookes Baculovirus expression system
JP2006515162A (ja) 2002-08-29 2006-05-25 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 環状核酸ベクター、ならびに同ベクターの作製法および使用法
GB0702694D0 (en) * 2007-02-12 2007-03-21 Ark Therapeutics Ltd Vectors
GB0702695D0 (en) * 2007-02-12 2007-03-21 Ark Therapeutics Ltd Production of vectors
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
CA2717354C (en) * 2008-03-05 2017-10-31 Council Of Scientific & Industrial Research Hybrid membrane comprising chitosan, hydroxy ethyl cellulose, and montmorillonite
EP2287323A1 (en) 2009-07-31 2011-02-23 Association Institut de Myologie Widespread gene delivery to the retina using systemic administration of AAV vectors
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
CN102884196B (zh) * 2010-04-01 2015-05-06 肖卫东 重组病毒载体的结构及其制备
KR101549296B1 (ko) 2010-04-14 2015-09-01 이엠디 밀리포어 코포레이션 고역가 고순도 바이러스 스톡의 생산 방법 및 이의 사용 방법
WO2013170078A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
TWI698240B (zh) 2012-05-15 2020-07-11 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
JP6417322B2 (ja) 2012-06-21 2018-11-07 アソシアシオン・アンスティテュ・ドゥ・ミオロジーＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｄｅ Ｍｙｏｌｏｇｉｅ 遺伝子治療ベクターの広範な遺伝子送達
WO2015031686A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Amgen Inc. High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells
KR102288849B1 (ko) 2014-03-17 2021-08-12 애드베룸 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 원추세포에서 증강된 유전자 발현을 위한 조성물 및 방법
CN114480502A (zh) 2015-03-02 2022-05-13 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
US10538571B2 (en) 2017-11-27 2020-01-21 Coda Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for neurological diseases
EP3746101A4 (en) 2018-02-01 2022-03-23 Homology Medicines, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RESTORING PAH GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF
US10610606B2 (en) 2018-02-01 2020-04-07 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof
US11306329B2 (en) 2018-02-19 2022-04-19 City Of Hope Adeno-associated virus compositions for restoring F8 gene function and methods of use thereof
KR102585324B1 (ko) 2018-05-08 2023-10-10 주식회사 뉴라클제네틱스 항-fam19a5 항체의 아데노-연관 바이러스(aav) 전달
CN113924115A (zh) 2019-01-31 2022-01-11 俄勒冈健康与科学大学 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法
WO2021035179A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Coda Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for neurological diseases
TW202140791A (zh) 2020-01-13 2021-11-01 美商霍蒙拉奇醫藥公司 治療苯酮尿症之方法
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
GB202013940D0 (en) 2020-09-04 2020-10-21 Synpromics Ltd Regulatory nucleic acid sequences
IL301955A (en) 2020-10-07 2023-06-01 Asklepios Biopharmaceutical Inc Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21
IL316615A (en) 2022-04-29 2024-12-01 Broadwing Bio Llc Bispecific antibodies and methods for treating eye disease
WO2023212293A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Complement factor h related 4-specific antibodies and uses thereof
WO2023212294A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Broadwing Bio Llc Angiopoietin-related protein 7-specific antibodies and uses thereof
WO2024227154A1 (en) 2023-04-28 2024-10-31 Broadwing Bio Llc Complement component 3 (c3)-specific antibodies and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU631159B2 (en) * 1988-11-14 1992-11-19 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Parvovirus capsids
US5559099A (en) * 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
JPH10506530A (ja) * 1994-09-23 1998-06-30 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 哺乳類細胞において外来遺伝子を発現する非哺乳類ｄｎａウイルスの使用

Also Published As

Publication number Publication date
KR100719645B1 (ko) 2007-05-17
DE69735274D1 (de) 2006-04-20
DE69735274T2 (de) 2006-10-12
ZA9710516B (en) 1998-06-10
HUP0001762A3 (en) 2002-01-28
EP0946741B1 (fr) 2006-02-15
ATE317908T1 (de) 2006-03-15
NO323937B1 (no) 2007-07-23
CZ293947B6 (cs) 2004-08-18
CA2271438A1 (fr) 1998-05-28
SK286900B6 (sk) 2009-07-06
EP0946741A1 (fr) 1999-10-06
CA2271438C (fr) 2010-10-26
KR20000057202A (ko) 2000-09-15
BR9713388B1 (pt) 2009-01-13
SK66699A3 (en) 2000-02-14
NO992464L (no) 1999-06-23
AU5226198A (en) 1998-06-10
JP4686670B2 (ja) 2011-05-25
US20030022356A1 (en) 2003-01-30
HUP0001762A2 (hu) 2000-09-28
ES2260803T3 (es) 2006-11-01
FR2756297A1 (fr) 1998-05-29
FR2756297B1 (fr) 1999-01-08
NO2013009I1 (no) 2013-04-29
US6387670B1 (en) 2002-05-14
BR9713388A (pt) 2000-03-21
HU224713B1 (en) 2006-01-30
WO1998022607A1 (fr) 1998-05-28
IL129686A (en) 2005-12-18
NO992464D0 (no) 1999-05-21
IL129686A0 (en) 2000-02-29
AU731106B2 (en) 2001-03-22
JP2001503993A (ja) 2001-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU731106B2 (en) Method for producing recombinant virus
EP1226264B1 (en) Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
SK99097A3 (en) Cells for the production of recombinant adenoviruses
JP2002507897A (ja) 遺伝子治療で用いるべきヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム
US20090098599A1 (en) Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
JP2002526031A (ja) 機能的ゲノム適用にライブラリーを使用される遺伝子機能に関する高度処理能力スクリーニング法
US20100008947A1 (en) Porcine adenovirus e1 and e4 regions
SK174297A3 (en) Recombinant adenoviruses, use thereof for preparing aavs, complementary cell line, and pharmaceutical compositions containing said adenoviruses
AU2437200A (en) Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
MXPA99004449A (en) Method for producing recombinant virus
WO2000073424A1 (en) A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors
AU7560500A (en) Modified adenoviral vectors for use in gene therapy
EP1083228A1 (en) Modified adenoviral vectors for use in gene therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20171118