KR100719645B1 - 재조합 바이러스 생성방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 바이러스 생성방법에 관한 것이다. 이 방법은 상보적 기능을 제공하기 위한 배큘로바이러스의 사용을 기초로 한다. 이는 또한 이러한 방법을 실행하기 위해서 사용되는 작제물, 생성 세포 및 생성된 바이러스에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 바이러스의 생성방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 방법을 수행하기 위해 사용되는 작제물, 생성 세포 및 이렇게 하여 생성된 바이러스에 관한 것이다. 이들 바이러스는 시험관내, 생체외 또는 생체내 유전자 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터로서 사용될 수 있다.
바이러스 기원의 벡터는 시험관내 (재조합 단백질의 생성, 스크리닝 시험의 수행, 유전자 조절의 연구 등을 위해), 생체외 또는 생체내 (동물 모델의 생성을 위해 또는 치료 접근법에서) 유전자 클로닝, 전달 및 발현을 위해 널리 사용된다. 이러한 바이러스 중에서, 특히 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 허프스바이러스 또는 박시니아 바이러스가 언급될 수 있다.
아데노비리데 과는 포유동물 및 조류에 널리 분포되어 있고, 20면체 대칭의 캡시드를 지니는 100 이상의 상이한 항원형의 비인벨롭핑 이본쇄 DNA 바이러스를 포함한다 [참조문헌: Horwitz, In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, ed. Virology. Third edition ed. Philadelphia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171]. 안전성 외에도, 아데노바이러스는 매우 광범위한 세포 친화성을 지닌다. 사이클이 세포 분열에 의존하는 레트로바이러스와 달리, 아데노바이러스는 무활동 세포와 같이 활발히 분열하는 세포를 감염시킬 수 있고 이의 게놈은 에피솜 형태로 유지된다. 또한, 아데노바이러스는 높은 역가 (1011 pfu/ml)로 생성될 수 있다. 아데노바이러스의 이러한 주요 장점은 이종 유전자의 클로닝 및 발현을 위해 가장 바람직한 벡터를 만든다. 그룹 C 아데노바이러스, 특히 유형 2 및 5, 및 분자 생물학이 가장 잘 알려져 있는 CAV-2-유형 개 아데노바이러스가 현재 사용되는 벡터원이다.
아데노바이러스는 이의 각각의 말단에서 103 bp의 역 말단 반복 (ITR) 서열로 종결하는 36 kb의 선형 게놈을 지니고 복제 기원 및 좌측 ITR 가까이에 위치하는 캡시드화 시그널을 포함한다 [참조문헌: Shenk, Adenoviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM Howley PM, ed. Virology. Philadelphia: Raven publishers, 1996: 2111-2148]. 3 부류의 유전자가 바이러스 사이클 동안 발현된다:
- 특히 세포의 S 기로의 돌입 (E1A) 및 아폽토시스의 억제 (E1B)를 허용하는 세포 유전자의 조절에 수반되는 즉시-초기 유전자 (E1, E2, E3 및 E4). 이들은 또한 메신저 RNA의 전사, 스플라이싱 또는 수송 수준에서의 초기 또는 후기 바이러스 유전자의 조절에 수반된다 (E1A. E2A. E4). 이들은 또한 복제 및 면역 반응 탈출에 있어 역할을 한다.
- 지연된 초기 유전자 (pIX 및 IVa2)는 후기 유전자 (IVa2)의 전사 조절 또는 비리온의 구성 (pIX)에 연관되어 있다.
- 후기 유전자 (L1 내지 L5)는 강한 프로모터 (MLP)로부터 전사된다. 28 kb의 1차 전사체는 추가의 스플라이싱 및 5 개의 폴리아데닐화 부위의 사용에 의해서 다양한 구조 단백질 (코어, 펜톤, 헥톤) 및 바이러스 입자의 구성 및 성숙에 참여하는 비구조적 단백질에 상응하는 전사체를 생성함을 가능하게 한다.
아데노바이러스 벡터는 시험관내 유전자의 클로닝 및 발현 [참조문헌: Gluzman et al., Cold Spring Harbor, New York 11724, p. 187], 트랜스제닉 동물의 생성 (WO95/22616), 생체외 세포로의 유전자 전달 (WO95/14785; WO95/06120) 또는 생체내 세포로의 유전자 전달 (특히 WO93/19191, WO94/24297, WO94/08026 참조)을 위해 사용되었다.
아데노-수반 바이러스 (AAV)에 관하여, 이들은 감염하는 세포의 게놈으로 안정하고 상대적으로 부위-특이적인 방식으로 통합되는 상대적으로 작은 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 생장, 형태 또는 분화에 어떠한 효과도 유도하지 않으면서 광범위한 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 인간의 병리에 수반되는 것 같지 않다. AAV의 게놈은 클로닝되고 서열화되고 특성화되어 왔다. 이것은 4700 개의 염기를 포함하고 각 말단에 바이러스를 위한 복제 기원으로서 제공되는 약 145 개 염기의 역 말단 반복 영역 (ITR)을 포함한다. 나머지 게놈은 캡시드화 기능을 운반하는 2 개의 필수 영역으로 분류된다: 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 수반되는 rep 유전자를 함유하는 게놈의 좌측부; 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 우측부.
시험관내 및 생체내 유전자 전달을 위해 AAV로부터 유도된 벡터의 사용이 참조에 기재되어 있다 (특히 WO91/18088; WO93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528 참조).
레트로바이러스에 관하여, 이들은 분열하는 세포를 선택적으로 감염시키는 통합성 바이러스이다. 그러므로, 이들은 예를 들면, 암 또는 재협착증 적용을 위한 해당 벡터를 구성한다. 레트로바이러스의 게놈은 본질적으로 2 개의 LTR, 캡시드화 서열 및 3 개의 암호화 영역 (gag, pol 및 env)을 포함한다. 재조합 벡터의 작제 및 이의 시험관내 또는 생체내 사용이 문헌에 널리 기재되어 있다 (특히 Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1995) 689 등을 참조).
재조합 벡터로서의 용도를 위해, 해당 다양한 유전자를 포함하는 바이러스로부터 유도된 다양한 작제물이 제조되어 왔다. 이들 작제물 각각에서, 감염된 세포에서 자발적으로 복제할 수 없는 바이러스를 제조하기 위해서 바이러스 게놈이 변형된다. 따라서, 선행 기술에 기재된 작제물은 복제에 필수적인 게놈의 특정 영역이 결손인 바이러스이다. 특히, 아데노바이러스에 관하여, 제 1 세대 작제물은 이종 DNA 서열이 삽입된 수준으로 바이러스 복제에 필수적인 E1 영역의/영역내 결실을 나타낸다 [참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161]. 또한, 벡터의 성질을 증진시키기 위해서, 아데노바이러스 게놈내 기타 결실 또는 변형을 생성함이 제안되었다. 따라서, 열-민감성 점 돌연변이는 ts125 돌연변이체로 도입되고, E2 영역에 의해서 암호화되는 72 kDa DNA 결합 단백질 (DBP)을 불활성화함을 가능하게 한다 (Van der Vliet et al., 1975). 기타 벡터는 바이러스 복제 및/또는 증식에 필수적인 다른 영역, E4 영역의 결실을 포함한다. E1 및 E4 영역이 결실된 아데노바이러스 벡터는 매우 감소된 전사 배경 노이즈 및 바이러스 유전자 발현을 지닌다. 이러한 벡터가 예를 들면, 출원 WO94/28152, WO95/02697, WO96/22378에 기재되어 있다. 또한, IVa2 유전자의 수준으로 변형을 운반하는 벡터가 또한 기재되어 있다 (WO96/10088). 또한, 하기에 설명되는 바와 같이 생성이 매우 어려운 상태이지만, 바이러스 생성을 위해 필수적인 영역 (ITR 및 캡시드화 서열)만을 시스로 함유하고 암호화 바이러스 서열이 부족한 소위 "최소 아데노바이러스" 또는 "슈도-아데노바이러스" 벡터 (또는 Ad△)가 또한 기재되어 있다 (WO94/12649, WO94/28152, WO95/02697).
AAV에 관하여, 기재된 벡터는 일반적으로 해당 핵산에 의해서 대체된 전체 암호화 영역 Rep 및 Cap가 부족하다.
레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자가 일반적으로, 완전히 또는 부분적으로 결실되고, 해당 이종 핵산 서열에 의해서 대체된다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 전사 활성을 억압하기 위한 LTR의 수준으로의 변형 및 gag 유전자의 일부를 포함하는 거대 캡시드화 서열을 포함할 수 있다 (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639).
복제에 관한 바이러스의 결손 특성을 가정하여 볼때, 이러한 다양한 재조합 바이러스의 생성은 게놈으로부터 결실된 기능을 트랜스상보할 가능성을 수반한다. 트랜스상보는 명확하게 이들 바이러스 생성, 특히 상보 기능 제공에 대한 주요 난점의 근원이다.
두가지 접근법이 이에 관하여 전개되어 왔다. 제 1 접근법은 트랜스상보 세포주, 즉, 캡시드화 세포주의 작제를 기초로 한다. 제 2 접근법은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헬퍼 플라스미드의 사용을 기초로 한다.
결손 바이러스의 다양한 캡시드화 세포주가 작제되어 왔다. 이들 세포주는 바이러스 벡터에 없는 기능을 생성할 수 있다. 일반적으로, 이들 세포주는 이의 게놈으로 통합되어 바이러스 게놈으로부터 결실된 영역 (예를 들면, 아데노바이러스에 대한 E1, E2 및/또는 E4; 레트로바이러스에 대한 gag, pol 및/또는 env, AAV에 대한 rep 및/또는 cap)을 포함한다.
결손 아데노바이러스의 생성에 대해서 공지된 세포주 중의 하나는 예를 들면, 아데노바이러스 게놈의 일부가 통합된 세포주 293이다. 좀더 명확하게, 세포주 293은 좌측 ITR, 캡시드화 영역, E1a와 E1b를 포함하여 E1 영역, 단백질 pIX를 암호화하는 영역 및 단백질 pIVa2를 암호화하는 영역의 일부를 포함하는, 항원형 5 아데노바이러스 (Ad5) 게놈의 좌측 말단을 함유하는 인간 배 신장 세포주이다. 이 세포주는 E1 영역이 결손인, 즉, 전부 또는 일부의 E1 영역이 부족한 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보할 수 있고 고 역가의 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. 이러한 세포주는 또한 복제 허용 온도 (32 ℃)에서 추가로 열-민감성 E2 돌연변이를 포함하는 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. E1 영역을 상보할 수 있는 기타 세포주가 특히 인간 폐 암종 세포 A549 (WO94/28152) 또는 인간 망막아세포 [참조문헌: Hum. Gen. Ther. (1996) 215]를 기초로 하여 기재되어 있다. 또한, 아데노바이러스에서 여러 기능을 트랜스상보할 수 있는 세포주가 또한 기재되어 있다. 특히, E1 및 E4 영역을 상보하는 세포주 [참조문헌: Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559; Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575]와 E1 및 E2 영역을 상보하는 세포주 (WO94/28152, WO95/02697, WO95/27071)가 언급될 수 있다.
다양한 세포주가 또한 일반적으로 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있는 결손 레트로바이러스의 생성에 대해서 기재되어 있다. 이러한 세포주는 예를 들면, PA317 세포주 (US 4,861,719), PsiCRIP 세포주 (WO90/02806), GP+envAm-12 세포주 (WO89/07150), BOSC 세포주 (WO94/19478) 등이다. 해당 핵산, 특히 LTR을 포함하는 플라스미드, 캡시드화 서열을 포함하는 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서, 핵산을 작제한 다음, 이것을 플라스미드에 없는 레트로바이러스의 기능을 트랜스로 제공할 수 있는 상기와 같은 캡시드화 세포주를 형질감염시키기 위해서 사용한다. 이어서 생성된 재조합 레트로바이러스를 통상적인 기술에 의해서 정제한다.
그러나, 세포주의 사용은 약간의 단점을 지닌다. 따라서, 이러한 세포주를 산업적 수준에서 작제하고 유효화함은 어렵고 비용이 많이 들며 제한적이다. 사실상, 이러한 세포주는 안정하고 산업적 용도에 걸맞아야 한다. 또한, 기재된 세포주는 복제 오염 바이러스 (RCA)의 생성을 피하는 것을 거의 가능하게 하지 못한다. 또한, 이러한 세포주는 현재에는 산업적 용도를 위해 만족스러운 방식으로, 예를 들면, 상기의 최소 아데노바이러스와 같은 매우 고도로 결손인 바이러스 게놈이 트랜스상보하도록 하지 못한다. 사실상, 아데노바이러스는 시공의 조절이 매우 복잡한 다양한 전사 단위로 조직화된 게놈을 지닌다. 세포주를 사용하여 각각의 전사 단위를 개별적으로, 구성 방식 또는 조건부 방식으로 발현함으로써 모든 암호화 바이러스 서열이 결실된 아데노바이러스의 트랜스상보를 만족스럽게 수행함이 본 발명에 이르기 까지는 가능하지 않았다. 따라서, E1, E4 및 pIX 영역, 및 E2에 의해서 암호화되는 3가지 단백질 (pol, DBP 및 p-TP)에 상응하는 게놈의 적은 비율만이 세포주를 사용하여 구조적으로 발현되었다. 게놈의 나머지는 28 kb의 1차 전사체로부터의 구조 및 비구조 단백질을 위한 모든 메신저를 생성하고 게놈 복제 후에 활성화되는 주요 후기 전사 단위 (MLTU)에 상응한다. 본 발명에 이르러, 최소 아데노바이러스를 생성하기 위해서, 이러한 영역의 트랜스상보가 필수적이다. 이들 세포주는 매우 높은 재조합 레트로바이러스 역가를 수득함을 가능하게 하지 않는다.
제 2 접근법은 상보 기능을 제공하는 작제물 (플라스미드 또는 아데노바이러스)을 결손 바이러스 게놈으로 공형질감염시킴에 있다. 특히, 결손 재조합 AAV는 일반적으로 인간 헬퍼 바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스)에 의해서 감염된 세포주에서 2 개의 AAV 역 말단 반복 (ITR) 영역에 의해서 접해지는 해당 핵산 서열을 함유하는 플라스미드 및 AAV 상보 기능을 운반하는 플라스미드 (rep 및 cap 유전자)의 공형질감염에 의해서 제조된다. 변이체가 출원 WO95/14771; WO95/13365; WO95/13392 또는 WO95/06743에 기재되어 있다. 헬퍼 아데노바이러스를 사용함의 단점은 주로 아데노바이러스 벡터와 헬퍼 아데노바이러스간 재조합의 위험이 증가한다는 것과 및 바이러스 스톡의 생성 및 정제 동안 헬퍼로부터 재조합체를 분리하는 것이 어렵다는 데에 있다. 헬퍼 플라스미드, 예를 들면, 플라스미드 Rep/cap를 사용함의 단점은 높은 바이러스 역가를 생성함을 가능하게 하지 못하는, 수득된 형질감염 수준에 있다.
본 출원에는 이러한 단점을 극복함을 가능하게 하는 바이러스의 생성을 위한 신규 시스템이 기재되어 있다. 본 발명의 시스템은 상보 기능을 제공하기 위해서 배큘로바이러스의 사용을 기초로 한다.
본 발명에 따른 생성 시스템은 특히 유리한 방식으로 RCA의 문제를 피하고 매우 결손인 게놈을 상보하기 위해서 성립된 상보 세포주를 사용하지 않고 수행함을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 시스템은 원하는 바이러스 및 배큘로바이러스에 의해서 감염될 수 있는 세포에 적용할 수 있고, 이렇게 하여 대단한 사용의 융통성을 제공한다.
그러므로, 본 발명의 제 1 주제는 결손 재조합 게놈의 상보를 위해 필수적인 기능 전부 또는 일부를 포함하는 결손 재조합 바이러스 및 배큘로바이러스의 게놈이 컴피턴트 세포군으로 도입됨에 따른 결손 재조합 바이러스의 생성 방법에 있다.
그러므로, 본 발명의 방법은 상보 기능을 제공하기 위해서 배큘로바이러스의 사용을 기초로 한다. 다양한 접근법이 가능하다. 무엇보다도 결손 재조합 게놈의 트랜스상보의 어떠한 기능도 발현하지 않는 컴피턴트 세포를 사용함이 가능하다. 이러한 경우에, 각각 결손 재조합 게놈의 트랜스상보에 필수적인 하나 이상의 기능을 운반하는 결손 재조합 게놈 또는 여러 배큘로바이러스의 트랜스상보에 필수적인 모든 기능을 포함하는 배큘로바이러스를 사용함이 가능하다. 결손 재조합 게놈의 하나 이상의 기능을 트랜스상보할 수 있는 컴피턴트 세포군 (캡시드화 세포주)을 사용함이 또한 가능하다. 이러한 경우에, 사용된 배큘로바이러스는 컴피턴트 세포에 의해서 트랜스상보되지 않은 결손 재조합 게놈의 트랜스상보에 필수적인 기능만을 제공할 것이다.
상기에 지적된 바와 같이, 본 발명의 시스템의 장점은 산업화 (세포주가 필요없고 RCA가 없는 등) 및 적용 (일부 유형의 결실을 운반하는 재조합 바이러스 및 특히 매우 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성)의 견지에서 많다. 또한, 배큘로바이러스는 인간 세포에서 복제되지 않으므로, 수득된 바이러스 제조물은 배큘로바이러스에 의해서 오염되지 않는다. 또한, 배큘로바이러스가 아데노바이러스로부터 계통발생론적으로 매우 거리가 멀므로, 둘 사이 재조합 또는 트랜스상보의 위험이 없다. 그러므로, 이러한 시스템은 유리한 방식으로 RCA가 없는 결손 바이러스의 농축된 스톡을 생성함을 가능하게 한다. 이러한 시스템은 결손 재조합 아데노바이러스의 생성이 가장 특히 유리하다.
배큘로바이러스는 무척추동물에 특이적인 인벨로핑 환형 이본쇄 DNA 바이러스이다. 이의 원형 AcNPV는 133 kb의 게놈을 갖는다. 이것은 2 개의 강한 프로모터 [폴리헤드린 (Ph) 및 P10]부터 시작하는, 곤충 세포의 진핵세포 유전자의 발현을 위한 벡터로서 널리 사용된다 [참조문헌: King and Possee, The baculovirus expression system. London: Chapman & Hall, 1992]. AcNPV는 일부 포유동물 세포를 감염시킬 수 있지만, 게놈은 전사되거나 해독되지 않는다. 최근에, Hofmann 등 (PNAS 92 (1995) 10099)은 시험관내에서 간세포가 LacZ 유전자를 발현하는 정제된 재조합 배큘로바이러스에 의해서 형질도입될 수 있음을 예시하였다. 1000의 다수 감염에도 불구하고 어떠한 세포 독성도 보고되지 않았고 이 논문에 기재된 형질감염 효율은 MOI 100에 대해 약 50 %이다.
출원인은 본 발명에 이르러 재조합 배큘로바이러스로 다양한 세포 유형을 감염시킴이 가능함을 예시하였다. 특히, 출원인은 재조합 배큘로바이러스로 불멸화된 배 세포와 같은 인간 기원의 세포를 감염시킴이 가능함을 예시하였다. 출원인은 또한 매우 높은 형질도입 효율 (80 % 이상)을 수득함이 가능함을 예시하였다. 출원인은 또한 아데노바이러스의 상보를 위한 기능을 배큘로바이러스로 도입하고 이 기능을 컴피턴트 세포군에서 발현시킴이 가능함을 예시하였다. 본 출원인은 이렇게 하여 배큘로바이러스가 포유동물, 특히 인간 세포로의 바이러스 상보 기능의 전달 및 발현을 위해 유리하게 사용될 수 있는 불활성 벡터를 구성함을 예시하는 것을 가능하게 했다. 본 발명 시스템의 다른 장점은 특히 (i) 전체 아데노바이러스 게놈을 상보함을 가능하게 하는 거대 클로닝 능력과 (ii) 배큘로바이러스 기술의 진보된 발전이다.
바이러스 상보를 위한 기능을 운반하는 배큘로바이러스가 또한 헬퍼 배큘로바이러스에 이어지는 본문에 또한 나타나 있다. 이것은 바이러스 상보를 위한 다양한 기능을 포함할 수 있다.
따라서, 헬퍼 배큘로바이러스는 아데노바이러스 E1 영역을 포함할 수 있다. 배큘로-E1은 제 1 세대 아데노바이러스, 즉, E3의 상태 (즉, 결손 Ad△E1, △E3 등)에 무관하게 E1 영역이 결손인 아데노바이러스의 생성을 위해서 사용될 수 있다. 제 1 세대 결손 재조합 아데노바이러스 (E1 및 가능하게 E3 영역이 결손)는 본 발명 방법의 제 1의 특히 유리한 적용을 구성한다. 상기에 지적된 바와 같이, E1 기능을 트랜스상보할 수 있는 다양한 세포주 (세포주 293, 세포주 A549, 세포주 911 등)가 문헌에 기재되어 있다. 그러나, 동질성의 다양한 영역이 세포주의 게놈으로 통합된 트랜스상보 기능을 운반하는 영역과 생성함이 바람직한 재조합 바이러스의 DNA 사이에 존재한다. 이로 인하여, 생성 도중, 다양한 재조합 사건이 일어나고, 복제 바이러스 입자, 특히 유형 E1 + 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 이것은 단일 재조합 사건에 이은 염색체의 붕괴 또는 이중 재조합일 수 있다. 이들 두 유형의 변형은 세포 게놈에 함유된 E1 영역을 아데노바이러스 게놈내 초기 로커스로 재통합시키도록 한다. 또한, 세포주 293에 의해서 생성된 고 역가 (1012 이상)의 재조합 벡터가 부여되고, 발생된 이들 재조합 사건의 개연성은 높다. 사실상, 제 1 세대 결손 재조합 아데노바이러스 벡터의 다수 뱃치가 복제 바이러스 입자에 의해서 오염됨이 관찰되었고, 이는 약학적 용도에 대한 주요 단점을 구성할 수 있다. 사실상, 치료 조성물내 이러한 입자의 존재는 생체내 염증 반응, 재조합 등의 위험이 있는 비조절 바이러스 증식 및 산포를 유도한다. 그러므로, 오염된 뱃치는 인간 치료에 사용되어서는 안된다.
본 발명은 이러한 단점을 극복함을 가능하게 한다. 사실상, 본 발명의 일양태에 따라서, E1, 및 가능하게 E3 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스의 게놈이 컴피턴트 세포로 도입되고, 이들 세포가 E1 영역을 포함하는 배큘로바이러스, 배큘로바이러스에 존재하는 아데노바이러스 E1 영역, 및 재조합을 일으킬 수 있는 상동성 (중복) 영역을 포함하지 않는 결손 재조합 아데노바이러스의 게놈으로 동시 에 감염되거나 감염되지 않는다. 이러한 양태에 따라서, 성립된 세포주 없이 RCA를 함유하지 않는 제 1 세대 재조합 아데노바이러스의 스톡을 쉽게 생성함이 가능하다. 또한, 하기에 지적되는 바와 같이, 이렇게 하여 생성된, RCA를 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스의 스톡이 컴피턴트 세포에서 배큘로바이러스로의 공형질감염에 의한 새로운 생성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
헬퍼 배큘로바이러스는 또한 아데노바이러스의 E2 영역, 특히 E2a 및/또는 E2b 영역을 완전히 또는 부분적으로 포함할 수 있다. 배큘로-E2가 컴피턴트 세포에서 E2 영역 (Ad-△E2), 및 가능하게 E3 영역 (Ad-△E2, △E3)이 결손인 아데노바이러스를 생성하기 위해서 사용될 수 있다. 또한, 아데노바이러스의 E1 영역을 상보할 수 있는 컴피턴트 세포에서, 배큘로-E2는 E1 및 E2 (Ad-△E1,△E2), 및 가능하게 E3 (Ad-△E1,△E2,△E3) 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성을 허용할 수 있다. 또한, 아데노바이러스의 E1 및 E4 영역을 상보할 수 있는 컴피턴트 세포에서 (예를 들면, IGRP2 세포에서), 배큘로-E2는 E1, E2 및 E4 (Ad-△E1,△E2,△E4), 및 가능하게 E3 (Ad-△E1,△E2,△E3,△E4) 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성을 허용할 것이다.
헬퍼 배큘로바이러스는 또한 아데노바이러스의 E4 영역 (완전히 또는 부분적으로)을 포함할 수 있다. 배큘로-E4는 컴피턴트 세포에서 E4 영역 (Ad-△E4), 및 가능하게 E3 영역 (Ad-△E4,△E3)이 결손인 아데노바이러스를 생성하기 위해서 사용될 수 있다. 또한, 아데노바이러스의 E1 영역을 상보할 수 있는 컴피턴트 세포에서, 배큘로-E4는 E1 및 E4 (Ad-△E1,△E4), 및 가능하게 E3 (Ad-△E1,△E4,△E3) 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성을 허용할 수 있다.
헬퍼 배큘로바이러스는 또한 아데노바이러스의 E1 및 E4 영역 (완전히 또는 부분적으로)을 포함할 수 있다. 배큘로-E1,E4는 도 1에 도시된 바와 같이 컴피턴트 세포에서 E1 및 E4 (Ad-△E1,△E4), 가능하게 E3 (Ad-△E1,△E4,△E3) 영역이 결손인 아데노바이러스를 생성하기 위해서 사용될 수 있다.
또한, E1 및 E4 영역이 결손인 바이러스를 생성하기 위해서, 하나가 E1 기능을 발현하고, 다른 하나가 E4 영역을 완전히 또는 부분적으로 발현하는 2 개의 헬퍼 배큘로바이러스를 사용함이 가능하다.
동일한 방식으로, 헬퍼 배큘로바이러스는 E1, E2 및 E4 영역 (완전히 또는 부분적으로), 및 가능하게 후기 유전자 (L1-L5)를 운반하는 영역을 포함할 수 있다.
헬퍼 배큘로바이러스는 또한 AAV Rep 및/또는 Cap 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 배큘로-Rep/Cap는 컴피턴트 세포주에서 암호화 바이러스 서열이 부족한 AAV 게놈을 상보함을 가능하게 한다 (도 5).
배큘로바이러스는 또한 레트로바이러스의 gag, pol 및/또는 env 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 배큘로-gag/pol/env는 컴피턴트 세포주에서 암호화 바이러스 서열이 부족한 레트로바이러스 게놈을 상보함을 가능하게 한다.
gag/pol 영역을 포함하는 배큘로바이러스와 env 영역을 함유하는 제 2 배큘로바이러스를 사용함이 또한 가능하다.
일반적으로, 결손 재조합 바이러스의 게놈 및 배큘로바이러스에 존재하는 상 보 영역이 중복되지 않는 것이 바람직하다. 이것은 사실상 재조합 및 이에 따른 RCA의 생성의 위험을 피함을 가능하게 한다. 이것은 제 1 세대 아데노바이러스 (Ad-△E1)의 생성에 특히 중요하다. 이 경우에, 배큘로바이러스로 도입된 E1 영역은 이것이 재조합 게놈을 갖는 통상의 서열을 지니지 않도록 규정된다. 이를 수행하기 위해서, 예를 들면, 실시예에 설명된 바와 같이, 배큘로바이러스로 삽입된 상보 영역보다 더 큰 영역을 재조합 게놈으로부터 결실시킴이 가능하다. 이것은 또한 Ad-△E1,△E4 아데노바이러스의 생성에 유리하다.
따라서, 본 발명 방법의 특정 양태에서, 결손 재조합 바이러스의 게놈이 컴피턴트 세포로 도입되고, 이들 세포가 결손 게놈의 상보에 필수적인 기능 전부 또는 일부, 배큘로바이러스 및 재조합을 일으킬 수 있는 상동성 영역을 포함하지 않는 결손 재조합 바이러스의 게놈에 존재하는 상보 기능을 포함하는 배큘로바이러스로 동시에 감염되거나 감염되지 않는다. 유리하게는, 바이러스 게놈은 E1 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스 게놈이고 배큘로바이러스는 E1 영역을 트랜스상보할 수 있는 아데노바이러스의 영역을 운반한다. 다른 변법에 따라서, 바이러스 게놈은 E1 및 E4 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스 게놈이고, 배큘로바이러스는 영역을 트랜스상보할 수 있는 2 개의 아데노바이러스 영역을 운반하거나 결손 아데노바이러스 게놈과 상동 영역이 없이 하나가 E1 영역을 트랜스상보할 수 있고 다른 하나가 E4 영역을 트랜스상보할 수 있는 2 개의 배큘로바이러스가 사용된다.
특정 양태에 따라서, 아데노바이러스의 모든 암호화 영역은 하나 이상의 배큘로바이러스에 의해서 수행된다. 좀더 특정한 양태에 따라서, 아데노바이러스의 모든 암호화 영역을 포함하는 하나의 헬퍼 배큘로바이러스만이 사용된다. 따라서, 이러한 헬퍼 배큘로바이러스가 최소 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 배큘로바이러스는 실시예에 설명된 바와 같이, 캡시드화 영역, 및 가능하게 ITR을 제외하고는, 특히 하나의 아데노바이러스 게놈 전체를 포함할 수 있다.
상보 기능의 제조
헬퍼 배큘로바이러스로 도입된 상보 기능은 상이한 항원형의 바이러스로부터 유도될 수 있다.
아데노바이러스에 관하여, 구조 및 성질이 다소 다양하지만 비할만한 유전적 조직을 나타내는 다양한 항원형이 존재한다. 좀더 특이적으로, 본 발명에 따른 배큘로바이러스의 작제에 사용된 상보 기능은 인간 또는 동물 기원의 아데노바이러스로부터 유도될 수 있다.
인간 기원의 아데노바이러스에 관하여, 바람직하게는 C 그룹으로 분류된 것들이 언급될 수 있다. 더욱 바람직하게, 다양한 인간 아데노바이러스 항원형 중에서, 유형 2 또는 5의 아데노바이러스 (Ad2 또는 Ad5)의 사용이 본 발명의 프레임워크 내에서 바람직하다. 그룹 A 및 B에 속하는 유형 7 또는 12 아데노바이러스로부터 유도된 영역을 사용함이 가능하다. 동물 기원의 다양한 아데노바이러스 중에서, 개 기원의 아데노바이러스, 특히 CAV2 아데노바이러스의 모든 균주 [예를 들면, 맨하탄 또는 A26/61 균주 (ATCC VR-800)]의 사용이 본 발명의 프레임워크 내에서 바람직하다. 동물 기원의 다른 아데노바이러스가 특히 본원에 참조로 인용 된 출원 WO94/26914에 언급되어 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 상보 기능은 그룹 C 인간 아데노바이러스 게놈으로부터 유도된다. 좀더 바람직하게, 이것은 Ad2 또는 Ad5 아데노바이러스의 게놈으로부터 유도된다.
다양한 상보 기능을 운반하는 영역이 아데노바이러스 게놈으로부터 당해분야에 공지된 방법에 따른 효소적 절단에 따라서 수득될 수 있다. 이들 영역은 이의 크기를 감소시키거나 특정 조절 요소 (프로모터, 인핸서 등)를 이종 요소로 대체하기 위해서 임의로 변형될 수 있다. 일반적으로, 이들 영역은 하기와 같이 제조된다: 아데노바이러스의 DNA는 세슘 클로라이드 구배 원심분리에 의해서 정제되거나 시험관내에서 원핵세포 (WO96/25506) 또는 진핵세포 (WO95/03400) 플라스미드로부터 수득된다. 이어서 DNA가 적합한 제한 효소로 절단되고 원하는 상보 기능을 운반하는 수득된 분획이 동정되고 선별된다. 사용된 제한 효소의 선택은 원하는 상보 기능에 달려 있다. 이어서 이것은 제한 지도 및 아데노바이러스 게놈의 공개된 서열에 의해서 인도된다. 따라서, E1 영역은 E1A 프로모터의 하류에 E1A 및 E1B의 모든 판독 프레임을 운반하는 단편의 형태로 분리될 수 있다. E4 영역은 판독 프레임 전부 또는 일부만, 바람직하게는 프레임 ORF3 또는 ORF6 또는 ORF6-ORF6/7을 운반하는 단편의 형태로 분리될 수 있다.
유사한 방법이 AAV 및 재조합 레트로바이러스 상보 영역을 제조하기 위해서 사용된다. 따라서, AAV rep 및/또는 cap 영역이 바이러스 AAV 항원형으로부터 분리된 바이러스 DNA로부터의 효소 절단에 의해서 수득될 수 있다. 이것은 바람직 하게는 AAV-2이다. 레트로바이러스에 대해서, gag, pol 및/또는 env 영역이 또한 다양한 유형의 레트로바이러스, 예를 들면, 특히 MoMuLV (마우스 몰로니 백혈병 바이러스), MSV (마우스 몰로니 육종 바이러스), HaSV (하비 육종 바이러스); SNV (비장 괴사 바이러스), RSV (루스 육종 바이러스) 또는 프렌즈 바이러스로부터 통상의 분자 생물학적 기술에 따라서 수득될 수 있다.
헬퍼 배큘로바이러스의 작제
이어서 상보 영역을 운반하는 단편을 예를 들면, 원핵 또는 진핵 기관에서 이의 조작 (미세한 소화, PCR, 조절 서열의 첨가 등)을 허용하는 플라스미드 벡터로 서브클로닝한다. 상보 기능을 암호화하는 수득된 최종 단편이 통상의 분자 생물학적 기술을 사용하여 헬퍼 배큘로바이러스로 도입된다. 좀더 상세하게, 단편을 배큘로바이러스 게놈의 영역에 상동성인 두 서열 사이에 클로닝한 다음 생성된 단편 또는 플라스미드를 배큘로바이러스 게놈과 함께 곤충 세포 (통상적으로 Sf9 및 Sf21, 스포토프테라 프루기페르다 (spodoptera frugiperda) 세포, 또한 Tn-368 및 High-FiveTM BTI-TN-5B1-4 (Gibco), 트리코풀시아 니 (trichopulsia ni) 세포 또는 배큘로바이러스에 허용되고 이의 생성을 위해 사용될 수 있는 기타 곤충 세포)로 공형질감염시킨다. 플라스미드 또는 단편과 배큘로바이러스 게놈간 상동성 재조합이 통상적인 방법에 의해서 회수되거나 정제될 수 있는 원하는 재조합 배큘로바이러스를 생성한다 [참조문헌: King and Possee: the baculovirus expression system. London: Chapman & Hall, 1992]. 재조합 배큘로바이러스의 작제를 위해서, 셔틀 벡터를 포함하는 다양한 키트가 시판되고 제조자의 권장에 따라 사용될 수 있다. 특히, Clontech사에 의해서 시판되는 셔틀 벡터 pBAC, 벡터 pAc [참조문헌: Verne et al., Bio/Technology 6 (1988) 47, Pharmacia, USA], 벡터 pBlue-Bac (Introgen) 또는 벡터 pBSV (Boehringer)를 사용함이 가능하다. 따라서, 상보 기능은 배큘로바이러스의 상이한 부위로, 특히 폴리헤드린 유전자 또는 p10 유전자의 로커스로 삽입될 수 있다. 또한, 특히 AcNPV 또는 Bombyx mori와 같은 다양한 배큘로바이러스 균주가 사용될 수 있다 [참조문헌: Maeda et al., Nature 315 (1988) 592]. 또한, 사용된 배큘로바이러스는 이의 친화성을 증진/변화시키기 위해서 변형될 수 있다. 사실상, (i) 바이러스 단백질과 특정 리간드 (이뮤노글로불린 경쇄, 가스트린-방출 펩티드)의 융합에 의해서 이를 제한하기 위해서 또는 (ii) 이것을 이종 바이러스 당단백질 (소포성 구내염 바이러스 (VSV)의 G)로의 슈도형의 형성에 의해서 확대하기 위해서 표면 단백질을 변형시킴으로써 바이러스 벡터의 친화성을 조절함이 가능하다 [참조문헌: Liu et al., J. Virol 70 (4) (1996) 2497; Michael et al., Gene Ther. 2 (1995) 660]. 최근에, HIV 바이러스의 gp120과 융합된 배큘로바이러스 표면 당단백질 (gp64)이 CD4 수용체에 결합할 수 있음이 예시되었다 [참조문헌: Boulik et al., Bio/Technology 13 (1995) 1079]. gp64의 이러한 변형은 곤충 세포에서 배큘로바이러스의 생존력에 영향을 미치지 않는다. VSV의 G를 갖는 유사한 작제물은 포유동물 세포에 대한 배큘로바이러스의 친화성을 증진시키고 이에 따라 Huh7 세포 및 기타 세포주의 형질도입 효율을 증가시킴을 가능하게 해야 한다.
헬퍼 배큘로바이러스에서, 상보 기능은 유리하게 컴피턴트 세포에서 기능성 인 이종 프로모터 (즉, 배큘로바이러스로부터의 상이한 기원)의 조절하에 배치된다. 사실상 배큘로바이러스 프로모터는 곤충 세포가 아닌 세포에서 충분한 수준의 상보 기능 발현을 수득함을 가능하게 하지 않고 이에 따라 본 발명 적용에 가장 적합하지는 않는 것으로 보인다. 프로모터는 무엇보다도 바이러스 상보 기능의 실제 프로모터 (상동성 프로모터) (아데노바이러스의 E1A, E4, E2, MLP 프로모터, AAV의 P5 또는 P19 프로모터, RSV의 LTR 프로모터 등)일 수 있다. 이것은 또한 사용된 컴피턴트 세포에서 기능성인 상이한 기원의 프로모터일 수 있다. 이러한 효과로, 예를 들면, 이러한 세포에서 발현되는 프로모터, 또는 공지된 팬재성 프로모터, 예를 들면, PGK 유전자, CMV의 즉시-초기 프로모터, 허프스바이러스의 TK 유전자의 프로모터, 또는 RSV의 LTR 프로모터가 언급될 수 있다. 이것은 또한 조절된 프로모터, 예를 들면, MMTV 바이러스의 프로모터, 호르몬에 반응하는 프로모터, 예를 들면, GRE5 유형, 또는 테트라사이클린에 의해 조절되는 프로모터 (WO)일 수 있다. 유리하게, 이것은 유도가능하거나 강한 팬재성, 상동성 프로모터이다.
따라서, 본 발명의 다른 주제는 게놈에 삽입되어 이종 프로모터의 조절하에 배치된 바이러스의 상보 기능을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 배큘로바이러스에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 상보 기능은 암호 영역이 결손 바이러스 게놈에서 불활성인 (돌연변이되거나 결실되는 등) 바이러스 생성에 필수적인 단백질이다. 아데노바이러스에 대해서, 상보 기능은 좀더 상세하게 아데노바이러스의 E1, E2, E4, L1-L5, pIX 및 IVa2 영역에 의해서 암호화되는 기능 전부 또는 일부 중에서 단독으로 또는 조합하여 선택된다. AAV에 대해서, 상보 기능은 Rep 및/또 는 Cap 영역에 의해서 암호화되는 기능이고; 레트로바이러스에 대해서, gag, pol 및/또는 env에 의해서 암호화되는 기능이다. 유리하게, 핵산은 선택된 상보 기능을 암호화하는 영역을 포함하는 바이러스 게놈의 영역에 상응한다. 특히, 이것은 항원형 Ad2 또는 Ad5, MoMLV 또는 AAV-2의 아데노바이러스 게놈의 단편이다. 특히 바람직한 방식으로, 핵산은 또한 자연적으로 선택된 상보 기능의 발현을 책임지는 프로모터 영역을 포함한다.
특정 예로써, 본 발명은 아데노바이러스의 E1 영역 전부 또는 일부를 포함하는 배큘로바이러스에 관한 것이다. 좀더 상세하게, 이것은 E1a, E1b 또는 E1a 및 E1b 영역을 포함하는 배큘로바이러스이다. 아데노바이러스의 E1 영역은 Ad5의 뉴클레오티드 104 (프로모터 E1a)에서 4070 (폴리A E1b)의 수준에 위치한다. 특히, E1a 프로모터의 TATA 박스는 뉴클레오티드 470의 수준에 위치하고, E1a의 ATG 코돈은 뉴클레오티드 560의 수준에 위치하며, 중단 코돈 E1b는 뉴클레오티드 3511의 수준에 위치한다. 명확한 예로써 단편 391에서 3511을 포함하는 배큘로바이러스가 언급될 수 있다. 이러한 헬퍼 배큘로바이러스는 E1 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성에 특히 적합하고, 이러한 391에서 3511 단편보다 더 큰 결실을 운반한다. 특히, RCA 없이 뉴클레오티드 383에서 3512를 포함하는 E1 영역에 결실을 운반하는 제 1 세대 아데노바이러스의 생성이 적합하다.
본 발명에 따른 배큘로바이러스의 특정한 예는 예를 들면, 아데노바이러스의 E1 및 E4 영역 전부 또는 일부를 포함한다. 아데노바이러스의 E4 영역은 ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 및 ORF6/7로 나타내는 7 개의 개방 판독 프레임으 로 이루어진다. 이러한 다양한 ORF에 의해서 암호화된 단백질 중에서, ORF3 및 ORF6에 의해서 생성된 것들이 바이러스 "복제" 및 이에 따라 전체적으로도 E4 영역이 결손인 아데노바이러스의 트랜스상보를 허용하는 것으로 보인다. 결과적으로, 본 발명의 헬퍼 배큘로바이러스는 유리하게 모든 E4 영역 또는 적어도 ORF3 또는 ORF6 프레임을 포함하는 일부만을 포함한다. E4 영역의 다양한 부분은 당해분야 기술자들에게 공지된 방법에 따라 효소적 절단에 의해서 수득되거나 변형될 수 있다. 특히 판독 프레임 ORF6은 뉴클레오티드 Ad5 게놈의 34115에서 33126에 상응하는 BglII-PvuII 단편의 형태로 E4 영역으로부터 분리될 수 있고, 판독 프레임 ORF6-ORF6/7은 뉴클레오티드 34115에서 32490에 상응하는 BglII-BglII 단편의 형태로 E4 영역으로부터 분리될 수 있다. 배큘로바이러스는 또한 판독 프레임 ORF1-ORF7의 전체를 포함할 수 있다 (예를 들면, 32800에서 35826 또는 32811에서 35614 또는 32811에서 35640의 형태로). 기타 단편이 아데노바이러스 게놈의 성립된 서열을 기준으로 결정될 수 있음이 이해된다. E4 영역의 감소된 단위를 운반하는 배큘로바이러스의 사용은 이것이 E4 영역의 더 큰 결실을 운반하는 결손 아데노바이러스 게놈의 트랜스상보를 허용하고 따라서 상동 영역이 없으며, 이에 따라 재조합의 가능성을 피하도록 하므로 유리하다.
제 1 양태에 따라서, 상보 기능을 암호화하는 핵산은 발현 카세트의 형태로 헬퍼 배큘로바이러스로 도입된다. 이러한 양태가 사용하기에 가장 용이하다. 이것은 즉시-초기 유전자가 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성 및 결손 재조합 AAV 및 레트로바이러스의 생성에 특히 적합하다.
다른 양태에 따라서, 상보 기능을 암호화하는 핵산은 절단가능한 카세트의 형태로 헬퍼 배큘로바이러스로 도입되고, 컴피턴트 세포에 복제 분자를 생성한다. 세포내 카세트의 복제는 유리하게 상보 유전자의 카피 수를 증가시키고 이에 따라 시스템의 생성 수준을 증진시킴을 가능하게 한다. 이러한 양태는 매우 고도로 결손인, 특히 구조 유전자가 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성에 특히 적합하다. 특히, 이러한 양태는 "최소" 아데노바이러스의 생성에 특히 적합하다. 사실상, 구조 단백질의 양은 고도로 결손인 아데노바이러스 (최소 아데노바이러스형)의 생성에 대한 제한 인자이다. 이러한 양태는 처음으로 트랜스상보 단백질, 특히 아데노바이러스의 구조 단백질 (L1에서 L5 영역에 의해서 암호화됨)의 세포내 수준을 최소 아데노바이러스의 트랜스상보와 상용되는 수준까지 상당히 증가시킴을 가능하게 한다.
따라서, 출원인은 환형 및 복제 분자 (에피솜 형태)를 제조하기 위해서 세포에 절단될 수 있는 이종 영역을 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 바람직하게는 유도가능한 조절된 방식으로 작제함이 가능함을 예시한다.
절단은 유리하게 부위-특이적 재조합 매커니즘에 의해서 수행되고, 세포내 복제는 세포 분열과 상관없이 복제 기원에 의해서 일어난다.
좀더 바람직하게, 본 발명 방법에 따른 부위-특이적 재조합은 일반적으로 리콤비나제라고 불리는 특정 단백질의 존재하에 서로 재조합할 수 있는 2 개의 특정 서열에 의해서 수득된다. 적합한 배향으로 배열된 이러한 특정 서열은 배큘로바이러스에서 상보 기능을 암호화하는 서열의 측면에 위치한다. 따라서, 본 발명의 주제는 또한 게놈에 삽입된, 부위-특이적 재조합을 허용하고 직접 배향으로 위치하는 2 개의 서열이 측면에 위치하며, 컴피턴트 세포에서 기능을 띠는 적어도 하나의 복제 기원 및 바이러스의 상보 기능을 암호화하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 DNA 영역을 포함하는 재조합 배큘로바이러스이다.
본 발명의 프레임워크에 사용되는 재조합을 허용하는 서열은 일반적으로 5 내지 100 개의 염기쌍, 좀더 바람직하게는 50 개의 염기쌍을 포함한다. 이들은 상이한 구조적 부류, 특히 P1 박테리오파지의 리콤비나제 또는 트랜스포존의 리솔바제의 패밀리에 속한다.
박테리오파지 1 인테그라제 패밀리에 속하는 리콤비나제 중에서, 특히 파지 람다 [참조문헌: Landy et al., Science 197 (1977) 1147], P22 및 F80 [참조문헌: Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468]의 파지 람다, 헤모필러스 인플루엔제 (Haemophilus influenzae)의 HP1 [참조문헌: Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859], P1 파지의 Cre 인테그라제, 플라스미드 pSAM2의 인테그라제 (EP 350 341) 또는 효모 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)의 플라스미드 2 ㎛의 FLP 리콤비나제가 언급될 수 있다.
Tn3 트랜스포존 패밀리에 속하는 리콤비나제 중에서, 특히 Tn3 트랜스포존 또는 gd의 리솔바제, Tn21 및 Tn522 트랜스포존 (Stark et al., 1992); mu 박테리오파지의 Gin 인버타제 또는 RP4의 단편 par의 리솔바제와 같은 플라스미드의 리솔바제 [참조문헌: Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131]가 언급될 수 있다.
바람직한 양태에 따라서, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스에서, 부위-특이적 재조합을 허용하는 서열이 박테리오파지로부터 유도된다. 좀더 바람직하게, 이들은 박테리오파지 또는 유도된 서열의 부착을 위한 서열 (attP 및 attB 서열)이다. 이러한 서열은 인테그라제라 불리는 리콤비나제의 존재하에 서로 특이적으로 재조합할 수 있다. 특정 예로써, 특히 파지 람다, P22, F80, P1, 헤모필러스 인플루엔제의 HP1 또는 플라스미드 pSAM2 또는 2 ㎛의 부착을 위한 서열이 언급될 수 있다.
훨씬 더 바람직하게, 부위-특이적 재조합을 허용하는 서열이 P1 파지의 재조합 시스템에 의해서 제시된다. P1 파지는 lox P 부위라고 불리는 34 개의 염기쌍의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 Cre라 불리는 리콤비나제를 지닌다 [참조문헌: Sternberg et al., J. Mol. Biol. 150 (1981) 467]. 이들 서열은 8 bp의 보존 서열에 의해서 분리된 13 bp의 두개의 회문 서열로 이루어진다. 부위-특이적 재조합은 유리하게 LoxP 서열 또는 유도된 서열, 및 Cre 리콤비나제를 사용하여 수득된다.
용어 유도된 서열이란 상기의 재조합 서열의 변형에 의해서 수득된, 적합한 리콤비나제의 존재하에 특이적으로 재조합하는 능력을 지니는 서열을 포함한다. 따라서, 이것은 이들 서열의 감소된 단편 또는 상반되게 기타 서열 (제한 부위 등)의 첨가에 의해서 신장된 단편을 포함한다. 이것은 또한 돌연변이, 특히 점 돌연변이에 의해서 수득된 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라서, 부위-특이적 재조합을 허용하는 서열은 P1 박테리오파지의 LoxP 서열이고 재조합은 Cre 단백질의 존재하에 수득된다. 이에 관하여, 재조합은 컴피턴트 세포를 Cre 리콤비나제와 직접 접촉시킴으로써 또는 컴피턴트 세포에 Cre 리콤비나제를 암호화하는 유전자의 발현에 의해서 수득될 수 있다. 유리하게, Cre 리콤비나제는 상응하는 유전자의 발현을 유도함으로써 세포내에 생성된다. 따라서, 리콤비나제를 암호화하는 유전자는 유리하게 유도가능한 프로모터의 조절하에 배치되거나 조절가능한 형태로 작제된다. 이에 관하여, 유리하게 Cre와 Cre의 활성이 조절되게 하고 이에 따라 재조합 사건이 유도되게 하는 스테로이드 호르몬 (에스트라디올, 프로게스테론 등) 결합 도메인 간의 융합이 사용된다 [참조문헌: Metzger et al., PANS 92 (1995) 6991]. 좀더 일반적으로, 리콤비나제의 발현은 강한 프로모터에 의해서 통제되거나 조절될 수 있다. 발현 카세트는 실시예에 예시된 바와 같이, 컴피턴트 세포로 형질감염될 수 있거나 컴피턴트 세포 게놈으로 통합될 수 있다.
그러므로, 이러한 시스템은 컴피턴트 세포에서 상보 기능을 생성하는 복제 분자, 높은 수준의 바이러스, 특히 아데노바이러스를 생성함을 가능하게 한다. 이러한 유형의 작제물은 특히 고도로 결손인 게놈, 특히 후기 유전자가 결손인 아데노바이러스의 상보에 적합하다. 따라서, 본 발명에 따른 특정 작제물은 게놈으로 삽입된, 직접 배향으로 위치한 2 개의 LoxP 서열이 측면에 위치하며, 컴피턴트 세포에서 기능을 띠는 적어도 하나의 복제 기원 및 바이러스의 상보 기능을 암호화하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 DNA 영역을 포함하는 배큘로바이러스에 의해서 제시된다. 유리하게, 상보 기능은 E1, E2 및 E4 영역에 존재하는 즉시-초기 유전자 전부 또는 일부를 포함한다. 훨씬 더 바람직하게, 상보 기능은 지연-초기 유전자 및 즉시-초기 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다. 바람직하게, 상보 기능은 일부 암호화 바이러스 서열이 부족한 재조합 아데노바이러스의 상보를 허용한다. 특히, 상보 기능은 ITR 및 패킹 영역을 제외하고는 아데노바이러스 게놈 전체로 이루어진다. 특정 변이체에 따라서, 상보 기능은 패킹 영역 (Ad.Psi-)이 부족한 완전한 아데노바이러스 게놈으로 이루어진다. 이러한 게놈은 특히 절단 후 컴피턴트 세포에 게놈의 복제를 제공하는 ITR을 포함한다.
그러므로, 에피솜 분자의 복제를 일으키기 위해서, 에피솜 분자는 사용된 컴피턴트 세포에서 기능성인 복제 기원을 함유한다. 이러한 복제 기원은 바람직하게 분자의 실질적인 증폭을 허용하는 아데노바이러스의 실제 ITR 서열로 이루어진다. 이것은 또한 바람직하게는 컴피턴트 세포내 바이러스 DNA의 20 개 이상의 인자에 의한 증폭을 허용하는 다른 복제 기원일 수 있다. 예로써, EBV 바이러스의 기원 OriP/EBNA1 또는 파필로마 바이러스의 E2기원이 언급될 수 있다. 아데노바이러스의 ITR 서열이 바람직한 양태를 구성함이 이해된다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해서, 헬퍼 배큘로바이러스는 일반적으로 세포 생존력을 현저하게 손상시키지 않으면서 거대 세포군이 감염되도록 하는 감염의 중복도 (MOI)에 사용된다. 일반적으로, 이것은 좀더 상세하게 10 내지 1000이다. MOI는 세포당 바이러스 입자의 수에 상응한다. MOI는 사용된 컴피턴트 세포에 따라 당해분야 기술자들에 의해서, 특히 두 기준: 감염 효율 및 가능한 독성을 기초로 하여 용이하게 조정될 수 있다. 유리하게, 헬퍼 배큘로바이러스에 사용되는 MIO는 20 내지 500이다.
바이러스 게놈의 도입
상기에 지적된 바와 같이, 본 발명의 방법은 컴피턴트 세포로의 헬퍼 배큘로바이러스 또는 재조합 바이러스 게놈의 도입을 포함한다. 이에 관하여, 결손 재조합 아데노바이러스의 게놈은 다양한 방식으로 컴피턴트 세포로 도입될 수 있다.
이것은 무엇보다도 유리하게 RCA를 함유하지 않는 정제된 결손 재조합 아데노바이러스일 수 있다. 이러한 경우에, 컴피턴트 세포는 결손 아데노바이러스 및 헬퍼 배큘로바이러스로 감염된다. 재조합 아데노바이러스로의 감염은 상응하는 게놈이 컴피턴트 세포로 도입된 다음, RCA를 함유하지 않으면서 높은 역가로 스톡을 생성하기 위해서 증폭되고 캡시드화됨을 가능하게 한다. 이러한 양태는 제 1 세대 바이러스 생성에 특히 유리하다 (Ad-△E1; Ad-△E1,△E3). 사실상, 이러한 바이러스는 RCA로의 오염없이 높은 역가로 생성하기 어렵다. 본 발명 방법에 따라서, 제 1 세대 결손 재조합 아데노바이러스로 시작하여, 컴피턴트 세포에서 E1 영역을 포함하는 배큘로바이러스로의 공형질감염에 의해서 농축된 스톡을 높은 역가로 수득함이 가능하다. 이러한 양태는 또한 이들 게놈의 2 또는 3의 필수 영역 (특히 E1, E2, E4)에 결손인 바이러스 생성에 유리하다. 일반적으로, 이러한 양태는 아데노바이러스로의 효율이 매우 높고 (DNA로의 형질감염 효율의 이상으로), 이에 따라 농축된 스톡을 생성함을 가능하게 하므로 유리하다. 이러한 양태에서, 재조합 아데노바이러스 및 재조합 배큘로바이러스는 세포 생존력을 현저하게 손상시키지 않으면서 거대 세포군이 감염되도록 하는 감염의 중복도 (MOI)로 사용된다. 배큘로바이러스에 대해서 사용되는 MOI는 상기에 언급된 바이다 (10 내지 1000). 아데노바이러스에 관하여, 이는 유리하게 1 내지 1000, 바람직하게 1 내지 500, 훨씬 더 바람직하게 1 내지 100이다. 아데노바이러스에 대해 사용되는 MOI는 또한 선택된 세포 유형에 따라서 조정된다. MOI 범위는 예를 들면, 감염 및 경쟁의 효율을 측정하기 위해서 분리된 마커 유전자를 포함하는 아데노바이러스 및 배큘로바이러스를 사용하여 당해분야 기술자들에 의해서 쉽게 측정될 수 있다. 좀더 바람직하게, 아데노바이러스의 MOI는 50 이하, 예를 들면, 1 내지 20 이다.
다른 특히 유리한 양태에 따라서, 결손인 재조합 아데노바이러스의 게놈은 DNA의 형태로 도입된다. 이러한 경우에, 게놈은 임의로 형질감염-촉진제 (지질, 칼슘 포스페이트 등)의 존재하에 형질감염에 의해서 도입된다. 이렇게 하여 도입된 재조합 게놈이 시험관내에서 다양한 기술에 따라, 특히 이. 콜라이 (WO96/25506) 또는 효모 (WO95/03400)에서 제조될 수 있다. 이러한 양태는 RCA를 함유하지 않는 결손 재조합 바이러스의 제 1 뱃치의 생성에 특히 유리하고, 상기 양태에 따라 높은 역가로 스톡을 생성하기 위해서 사용될 수 있다.
결손 재조합 아데노바이러스의 게놈은 또한 다른 재조합 배큘로바이러스를 사용하여 도입될 수 있다. 이러한 양태에 따라서, 결손 재조합 아데노바이러스의 게놈이 시험관내에, 예를 들면, 상기에 지적된 바와 같이 제조된 다음 배큘로바이러스로 컴피턴트 세포에서 절단될 수 있는 카세트의 형태로 도입된다. 이러한 양태에 따라서, 컴피턴트 세포는 결손 재조합 아데노바이러스 게놈을 운반하는 배큘로바이러스 및 하나 이상의 헬퍼 배큘로바이러스 (상보 기능을 운반)의 존재하에 놓인다. 이러한 양태는 고도로 결손인 재조합 아데노바이러스의 생성에 특히 유리하다. 이러한 시스템 덕택에, 사실상 높은 역가의 고도로 결손인 재조합 게놈 및 상응하는 상보 기능을 컴피턴트 세포군으로 도입함이 가능하다.
이에 관하여, 본 발명 방법은 결손 재조합 아데노바이러스 게놈을 운반하는 배큘로바이러스 및 상보 기능을 운반하는 하나 이상의 배큘로바이러스로의 컴피턴트 세포의 공감염을 포함한다. 이러한 양태에 사용되는 MOI 값은 또한 사용되는 각각의 배큘로바이러스에 대해서 10 내지 1000이다.
두 유형의 작제물이 최소 아데노바이러스 생성을 위해 선행 기술에서 제조되었다: (1) 고유 제한 부위에 접하는, ITR 사이에 클로닝된 트랜스진 (β-갈락토시다제) 또는 (2) 트랜스진의 5'에서 직접 배향으로 클로닝된 우측 및 좌측 ITR [참조문헌: Fisher et al., Virology 217 (1996) 11; Kumar-Singh et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 913]. 최소 아데노바이러스가 선형 (1) 또는 환형 (2) DNA의 형질감염에 의해서 세포 293에서 생성되고, 복제 및 미니게놈 캡시드화에 필수적인 바이러스 단백질이 헬퍼 바이러스 (Ad△E1)에 의해서 트랜스로 제공된다. 최소 아데노바이러스는 간섭하는 결손 (ID) 입자처럼 행동하고 연속 계대접종 동안 점진적으로 증폭된다. 이러한 방법의 사용에 의해 제기되는 주요 문제는 헬퍼 바이러스 및 이렇게 하여 생성된 매우 낮은 역가 (108 pfu/ml)의 최소 아데노바이러스에 의한 스톡의 오염을 책임지는 생성된 두 유형의 입자의 분리이다.
본 출원은 처음으로 아데노바이러스의 미니게놈을 운반하는 배큘로바이러스와 모든 트랜스상보 기능 (상보 기능)을 제공하는 배큘로바이러스를 사용하여 최소 아데노바이러스를 생성함을 가능하게 한다.
재조합 아데노바이러스 게놈은 헬퍼 배큘로바이러스에 기재된 바와 같이 유리하게 배큘로바이러스로 컴피턴트 세포에 부위-특이적 재조합을 허용하는 두 서열 사이에 도입된다.
본 출원은 특히 loxP/Cre 시스템의 보조로 아데노바이러스 미니게놈을 운반하는 배큘로바이러스와 Cre/loxP 시스템의 보조로 모든 트랜스상보 기능 (상보 기능)을 제공하는 배큘로바이러스를 사용하는 최소 아데노바이러스의 생성을 위한 시스템에 대해서 기재한다 (도 2 내지 4 참조).
다른 양태에 따라서, 상보 기능을 운반하기 위해서 사용된 부위-특이적 재조합 시스템은 재조합 아데노바이러스의 게놈을 운반하기 위해서 사용되는 것과 상이하다. 특히, LoxP/Cre 시스템은 결손 아데노바이러스 게놈을 운반하기 위해서 사용될 수 있고 AttP/AttB 시스템은 상보 기능을 운반하기 위해서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명 방법은 모든 암호화 바이러스 서열이 결실되고 ITR 및 캡시드화 시그널만을 함유하는 아데노바이러스 벡터 (최소 아데노바이러스)를 작제함을 가능하게 한다. 이러한 벡터는 이론적으로 37 kb 이하의 외인성 서열을 수용할 수 있는 반면에 본 벡터의 클로닝 능력은 8.5 kb를 초과하지 않는다. 따라서, 표적 조직에 최적 발현을 수득하기 위해서 모든 조절 요소 (프로모터, 인핸서, 인트론 등)를 갖는 디스트로핀 유전자 (14 kb)와 같은 큰 크기의 유전자를 클로닝함을 가능하게 한다. 또한, 면역원성 바이러스 서열의 부재는 무활동 조직에서 트랜스진의 발현 기간을 증가시켜야 한다.
AAV 또는 결손 레트로바이러스의 게놈은 또한 상기의 기술에 따라서 바이러스, 게놈 또는 플라스미드의 형태로 도입될 수 있다.
컴피턴트 세포
본 발명의 방법은 다양한 세포 유형에서 수행될 수 있다. 본 발명의 목적상, "컴피턴트 세포"는 배큘로바이러스 및 생성될 바이러스에 의해 감염이 허용되는 세포를 의미하는 것으로 이해된다. 이들 바이러스로 세포를 감염시키는 능력은 이. 콜라이 LacZ 유전자와 같은 마커 유전자를 발현시키는 재조합 바이러스를 사용하여 측정될 수 있다. 이것은 바람직하게는 포유동물 세포, 훨씬 더 바람직하게는 인간 기원의 세포이다. 사용된 컴피턴트 세포는 무활동 세포 또는 활발하게 분열하는 세포, 주화 세포주 또는 1차 배양물일 수 있다. 이들은 유리하게 산업적 용도에 적합한, 즉, 공지된 병리 특성이 없고, 배양될 수 있으며, 경우에 따라 적합한 조건 하에서 저장되는 포유동물 세포이다. 유리하게, 사용된 세포는 간세포, 근육세포, 섬유아세포, 배세포, 신경세포, 상피세포 (폐) 또는 안세포이다. 비제한적인 예로써, 세포 293 또는 추가의 상보 기능 (293E4, 293E2a 등)을 포함하는 유도된 세포, A549 세포, HuH7 세포, Hep3B 세포, HepG2 세포, 인간 안구아세포 (HER, 911), HeLa 세포, 3T3 세포 또는 KB 세포가 언급될 수 있다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해서, 재조합 바이러스 및 배큘로바이러스의 게놈은 컴피턴트 세포군으로 동시에 또는 시간 간격을 두어 도입될 수 있다. 유리하게, 세포는 재조합 게놈 및 헬퍼 배큘로바이러스와 접촉한다. 생체내에 복제 분자를 생성하는 시스템의 경우에, 리콤비나제는 미리, 동시에 또는 후속적으로 도 입되거나 발현된다.
바이러스의 생성은 일반적으로 세포의 용해를 유발한다. 그러므로, 생성된 바이러스는 공지된 정제 방법에 따라 세포 용해 후에 수득될 수 있다. 이어서 이들은 목적하는 용도에 따라서 다양한 방식으로 포장될 수 있다. 또한, 컴피턴트 세포로 침투되지 않는 가능한 미량의 배큘로바이러스 (헬퍼 배큘로바이러스 또는 재조합 바이러스 게놈을 제공하는 배큘로바이러스)로의 바이러스 스톡 오염의 위험을 피하기 위해서, 하기의 기술을 적용함이 가능하다:
- 아데노바이러스를 출원 FR96/08164에 기재된 방법에 따른 크로마토그래피에 의해 정제함이 가능하다. 이러한 기술은 아데노바이러스를 가능한 잔존하는 배큘로바이러스로부터 분리함을 가능하게 한다;
- 또한 유기 용매 (예를 들면, 에테르, 클로로포름)가 정제된 아데노바이러스의 스톡에 작용하도록 함이 가능하다. 사실상, 배큘로바이러스는 인벨로핑 바이러스 (당단백질 인벨로프)이고 따라서 유기 용매 (지질을 인벨로프로부터 추출함)에 매우 민감성이다; 대조적으로, 아데노바이러스는 인벨로핑 되지 않고, 동일한 용매는 이에 영향을 미치지 않는다;
- 또한, CsCl 구배 정제에 의해서, 밀도에 의해 잔존하는 배큘로바이러스 및 재조합 바이러스를 분리함이 가능하다.
이들 3 가지 방법은 독립적으로 또는 공동으로 사용될 수 있다. 또한, 당해분야 기술자들에게 공지된 방법이 또한 사용될 수 있다.
바이러스의 용도
이렇게 하여 생성된 바이러스는 시험관내, 생체외 또는 생체내 유전자의 클로닝, 전달 및 발현에 사용될 수 있다. 이러한 해당 유전자는 예를 들면, 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터류킨, 인터페론, TNF, 등 (FR 9203120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이의 합성 효소의 전구체, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등, 아포리포 단백질: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (WO94/25073), 디스트로핀, 또는 미니디스트로핀 (WO93/06223): 종양 억제 인자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등 (WO94/24297), 혈액응고에 수반되는 인자: 인자 VII, VIII, IX 등을 암호화하는 유전자, 자살 유전자: 티미딘 키나제, 시토신 디아미나제 등, 또는 천연 또는 인공 이뮤노글로불린 (Fab, ScFv 등, WO94/29446)을 암호화하는 유전자 등이다. 해당 유전자는 또한 표적 세포내 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절함을 가능하게 하는 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고, 이렇게 하여 특허 EP 140 308에 기재된 기술에 따라 단백질로의 해독을 저해할 수 있다. 해당 유전자는 또한 백신의 생성을 위해 면역 반응을 생성할 수 있는 항원 펩티드를 암호화하는 유전자일 수 있다. 이것은 특히 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, 헤파티티스 B 바이러스 (EP 185 573), 슈도라비스 (pseudorabies) 바이러스에 특이적이거나 종양 (EP 259 212)에 특이적인 항원 펩티드일 수 있다. 유전자는 잠재적으로 적합한 발현 시그널 (프로모터, 종결자 등)을 포함하는 해당 산물을 암호화하는 DNA (gDNA, cDNA 등)일 수 있다.
이들 바이러스는 이러한 재조합 단백질의 생성을 위해 시험관내에서 사용될 수 있다. 이들은 또한 시험관내에서 이들 단백질의 기능 메커니즘을 연구하기 위해서, 유전자 발현 또는 프로모터의 활성의 조절을 연구하기 위해서 사용될 수 있다. 이들은 또한 생체내에서 동물 모델 또는 트랜스진 동물의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이들은 또한 생체내, 동물 또는 인간에서, 유전자 또는 세포 치료 절차에 유전자의 전달 및 발현을 위해 사용될 수 있다.
본 출원은 설명적이고 비제한적인 것으로 생각되는 하기의 실시예의 도움으로 좀더 상세하게 기재될 것이다.
도 1: 배큘로-E1,E4를 사용하는 제 3 세대 결손 재조합 아데노바이러스 (E1 및 E4 기능이 결손임)의 생성의 개략도.
도 2 내지 4: 상보 기능을 도입하는 결손 아데노바이러스 게놈 및 제 2 배큘로바이러스를 유도하기 위해서 제 1 배큘로바이러스를 사용하는 최소 아데노바이러스 생성의 개략도.
도 5: 배큘로-Rep/Cap를 사용하는 Rep 및 Cap 기능이 결손인 재조합 AAV 생성의 개략도.
1. 사용된 세포
본 발명의 프레임워크 내에 사용되는 세포를 치료용으로 적합한 아데노바이러스 또는 AAV 또는 레트로바이러스에 의해서 또는 배큘로바이러스에 의해서 감염 될 수 있는 세포주 또는 세포군으로부터 수득할 수 있다. 이는 좀더 바람직하게 포유동물 세포, 특히 인간 세포이다. 좀더 상세하게 하기의 것들이 언급될 수 있다:
- 293 세포주의 세포:
293 세포주는 항원형 5 아데노바이러스 (Ad5) 게놈의 좌측 말단 (약 11 내지 12 %)을 함유하고, 좌측 ITR, 캡시드화 영역, E1a와 E1b를 포함하는 E1 영역, pIX 단백질을 암호화하는 영역 및 pIVa2 단백질을 암호화하는 영역의 일부를 포함하는 인간 배 신장 세포주이다 [참조문헌: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]. 이러한 세포주는 E1 영역이 결손인, 즉, E1 영역 전부 또는 일부가 부족한 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보할 수 있고 높은 역가의 바이러스 스톡을 생성할 수 있다.
- A549 세포주의 세포:
아데노바이러스의 E1 영역을 상보하는 세포가 A549 세포로부터 작제된다 [참조문헌: Imler et al., Gene Ther. (1996) 75]. 이들 세포는 유도가능한 프로모터의 조절하에 배치된, 좌측 ITR이 부족한 E1 영역의 제한된 단편을 함유한다.
- HER 세포주의 세포:
인간 배 망막 (HER) 세포가 아데노바이러스로 감염될 수 있다 [참조문헌: Byrd et al., Oncogene 2 (1988) 477]. 이들 세포로부터 제조된 아데노바이러스 캡시드화 세포가 출원 WO94/28152 또는 Fallaux 등 [참조문헌: Hum. Gene Ther. (1996) 215]에 의한 논문에 기재되어 있다. 좀더 상세하게, HER 세포의 게놈으로 통합된, 뉴클레오티드 79에서 뉴클레오티드 5789의 Ad5 아데노바이러스 게놈의 E1 영역을 포함하는 911 세포주가 언급될 수 있다. 이러한 세포주는 E1 영역이 결손인 바이러스의 생성을 허용한다.
- IGRP2 세포:
IGRP2 세포는 유도가능한 프로모터 조절하의 E4 영역의 기능성 단위의 통합에 의해서 세포 293으로부터 수득된 세포이다. 이러한 세포는 E1 및 E4 영역이 결손인 바이러스의 생성을 허용한다 [참조문헌: Yeh et al., J. Virol (1996) 70].
- VK 세포:
VK 세포 (VK2-20 및 VK10-9)는 유도가능한 프로모터의 조절하의 전체 E4 영역과 단백질 pIX를 암호화하는 영역의 통합에 의해 세포 293으로부터 수득된 세포이다. 이러한 세포는 E1 및 E4 영역이 결손인 바이러스의 생성을 허용한다 [참조문헌: Krougliak et al., Hum. Gene Ther. 6 (1995) 1575].
- 293E4 세포
293E4 세포는 전체 E4 영역의 통합에 의해 세포 293으로부터 수득된 세포이다. 이들 세포는 E1 및 E4 영역이 결손인 바이러스의 생성을 허용한다 [참조: WO95/02697; Cancer Gene Ther. (1995) 322].
- Sf9 및 Sf21 세포는 배 레피돕테라 세포이다. 이들 세포는 컬렉션 (No. CRL-1711 ATCC) 및 이의 배양 조건에서 접근가능하다. 이들은 또한 시판된다 (Gibco) [참조문헌: King and Possee: The baculovirus expression system, London: Chapman and Hall, 1992].
- 인간 간세포:
HepG2와 Hep3G 및 HuH7은 간암종으로부터 유도된 인간 세포주이다. 이들은 기탁 컬렉션에서 접근가능하고 이의 성질은 예를 들면, 특허 US4,393,133과 US 4,393,133에 기재되어 있다.
- 인간 상피 암종으로부터 유도된 인간 세포주 KB: 이 세포주는 ATCC (ref. CCL 17) 및 이의 배양을 허용하는 조건에서 접근가능하다.
- 인간 상피의 암종으로부터 유도된 인간 세포주 Hela: 이 세포주는 ATCC (ref. CCL2 참조) 및 이의 배양을 허용하는 조건에서 접근가능하다.
- 세포주 W162: 이들 세포는 이의 게놈에 통합된, Ad2 아데노바이러스의 E4 영역을 포함하는 Vero 세포이다. 이들 세포가 Weinberg 등에 의해 기재되어 있다 [참조문헌: PNAS 80 (1983) 5383].
2. 재조합 배큘로바이러스로의 인간 세포의 감염
본 실시예는 인간 기원의 세포를 감염시키는 배큘로바이러스의 능력에 대해 기재한다.
인간 세포 (특히 293 또는 이의 유도체)를 RSV LTR의 조절하에 LacZ 유전자를 발현하는 다양한 희석의 재조합 배큘로바이러스의 용액으로 감염시킨다. 감염 48 시간 후, 배큘로바이러스에 의한 이들 세포의 감염능을 입증하는 청색 세포의 출현이 나타난다.
3. 아데노바이러스의 E1 영역 및 상응하는 결손 아데노바이러스 영역을 발현하는 배큘로바이러스의 작제
3-1. E1의 발현을 위한 두 카세트의 클로닝
플라스미드 AE2를 올리고뉴클레오티드 5'-TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' 및 5'-GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3'로의 pBRE1에서 수행된 PCR 산물의 PCRII (Invitrogen)에서의 클로닝으로부터 수득하고; 이러한 PCR 산물은 Ad5의 뉴클레오티드 3198에서 3511, 즉, E1B 영역의 3' 말단을 함유한다. 플라스미드 pBRE1은 뉴클레오티드 1300에서 2300이 대략적으로 결실된, pBR322로 클로닝된 Ad5가 뉴클레오티드 1에서 5788을 함유한다.
플라스미드 AE3은 PCR 산물을 함유하는, AE의 NotI-KpnI 단편의 NotI-KpnI으로 분해된 pCDNA3 (Invitrogen)으로의 클로닝으로부터 유도된다. 이것은 Ad5의 뉴클레오티드 3198에서 3511에 이어 BGH의 폴리아데닐화 부위를 함유한다.
플라스미드 AE4는 AE3의 BglII-PvuII 단편의 pBRE1로의 클로닝으로부터 유도된다. AE4는 하기의 E1 발현 카세트를 함유하는 플라스미드이다:
- Ad5의 뉴클레오티드 1에서 3511, 즉, 좌측 ITR, 캡시드화 서열, E1A 프로모터, E1A 유전자, E1B 프로모터, E1B 유전자,
- pCDNA3으로부터 수득된 소 생장 호르몬 (BGH)의 폴리A.
pBRE1을 BstNI으로 분해한 다음 돌출 5' 말단을 채우기 위해서 T4 DNA 폴리머라제로 분해한 후, XbaI로 분해한다. Ad5의 뉴클레오티드 391에서 1399를 함유하는 이렇게 하여 생성된 단편을 플라스미드 AE5를 생성하기 위해서 SmaI-XbaI (비 메틸화 부위)으로 분해된 pic20H로 도입한다.
플라스미드 AE6는 AE의 EcoRI-SmaI 단편의 EcoRI-SmaI으로 분해된 AE4로의 클로닝으로부터 유도된다. AE6은 하기의 E1 발현 카세트를 함유하는 플라스미드이다:
- Ad5의 뉴클레오티드 391에서 3511, 즉, E1A의 "감소된" 프로모터, E1A 유전자, E1B 프로모터, E1B 유전자,
- pCDNA3으로부터 수득된 소 생장 호르몬 (BGH)의 폴리A.
3-2. 이들 두 E1 카세트의 배큘로바이러스로의 클로닝
플라스미드 AE4 및 AE6의 EcoRI-SphI 단편 (미리 T4 DNA 폴리머라제로의 분해에 의해 무디게 만들어진 SphI 돌출 5' 말단)을 EcoRI과 EcoRV 부위간 플라스미드 pAcSG2 (Pharmingen)로 클로닝한다. 이것은 플라스미드 AE14 및 AE15 각각을 생성한다. 두 경우 모두, E1 영역이 폴리헤드린 유전자의 로커스 (폴리헤드린 유전자 + 폴리헤드린 프로모터가 결실됨)로 도입된다.
플라스미드 AE14 및 AE15는 폴리헤드린 유전자의 로커스로 통합된 E1의 발현을 위한 두 카세트를 운반하는 2 개의 상응하는 재조합 배큘로바이러스 BacAE14 및 BacAE15를 생성하기 위해서 Sf9 곤충 세포에 AcNPV 균주 (Pharmingen)로부터 유도된 배큘로바이러스 BaculoGold의 DNA로 공형질감염시킨다.
3-3. 신규 E1 결실을 운반하는 재조합 아데노바이러스의 클로닝
플라스미드 pCO1 (WO96/10088)을 BstXI으로 분해한 다음 돌출 3' 말단을 제거하기 위해서 T4 DNA 폴리머라제로 분해한 후 RsaI으로 분해한다. 이렇게 하여 생성된 뉴클레오티드 3513에서 4607을 함유하는 단편을 EcoRV로 선형화된 pBS-SK+로 도입한 다음 송아지 알칼리성 포스파타제로 분해하여 플라스미드 AE0을 생성한다.
플라스미드 pMA37을 하기의 단편의 라이게이션에 의해서 수득한다:
- sacB를 함유하는 pXL2756의 EcoRV-NsiI. pXL2756은 이의 EcoRI 및 KpnI 부위를 함유하지 않는 상대-선별 유전자 SacB, 카나마이신 내성 유전자, 다수 클로닝 부위 및 복제 기원 ColE1을 지닌다.
- pCO1의 NdeI-NsiI (아데노 서열 함유)
- SalI (T4 DNA 폴리머라제로 채워진 돌출 5' 말단)-pXL2756의 AseI (카나마이신-내성 벡터).
그러므로, pMA37은 하기를 함유한다:
- 카나마이신 내성 유전자,
- 이를 발현하는 세균에 대한 수크로스 민감성을 부여하는 SacB 유전자,
- Ad5의 서열 1에서 382 (HinfI)에 이은 Ad5의 서열 3446에서 4415 (NsiI); 트랜스진은 없다.
플라스미드 AEl1은 AE0의 XhoI-NsiI 단편을 SalI-NsiI로 분해된 pMA37로 도입함으로써 작제된다. 따라서, 이것은 하기를 함유한다:
- 카나마이신 내성 유전자,
- 이를 발현하는 세균에 수크로스 민감성을 부여하는 SacB 유전자,
- Ad5의 서열 1에서 382 (HinfI)에 이은 Ad5의 서열 3513에서 4415 (NsiI); 트랜스진은 없다.
이어서 플라스미드 AE11로부터 이. 콜라이에서의 재조합에 의한 재조합 아데노바이러스의 작제를 허용하는 자살 셔틀 벡터 (해당 트랜스진의 삽입에 의해)가 작제된다. AE11은 플라스미드 AE6과 상동성인 어떠한 서열도 함유하지 않는다. 플라스미드 AEl1 및 AE4는 통상의 서열에 E1A의 Ad5 상류의 1에서 382 (HinfI)를 지니지만, 이들 두 플라스미드간 E1 카세트의 상동성 하류는 없다. 따라서, AE11 (즉, 382에서 3513) 및 배큘로바이러스 BacAE14 또는 BacAE15에 존재하는 E1 결실을 운반하는 아데노간 상동성 재조합에 의한 RCA의 생성은 존재하지 않을 수 있다.
3-4. 제 1 세대 재조합 아데노바이러스의 작제
첫번째의 예로, BacAE14 또는 15의 스톡이 통상의 기술에 따라서 제조된다. 다음, 컴피턴트 세포 (예를 들면, HuH7)를 PacI로 분해된 플라스미드 pXL2822 5 ㎍으로 형질감염시키고 (플라스미드 pXL2822는 모두 E1 (382에서 3446 또는 382에서 3513) 및 E3 (28592에서 30470)가 결실된 Ad5를 포함하고 카세트 CMV-βGal을 운반한다), BacAE14 또는 15로 10 내지 1000의 MOI로 동시에 감염시키거나 감염시키지 않는다. 세포가 용해되었을 때, 형질감염 상등액을 수득한 다음, 아데노바이러스 Ad2822를 증폭하기 위해서 Ad2822가 수득될 때까지 BacAE14 또는 15 (MOI 10 내지 1000) 등으로 사전에 또는 동시에 감염된 "신선한" 컴피턴트 세포에 적용시킨다. Ad2822 증폭의 모니터링이 이러한 바이러스내 lacZ의 존재에 의해서 촉진된다. 이러한 증폭시, 상등액은 W162에서 슈도적정된다. 바이러스의 게놈이 통합성을 검사하기 위해서 증폭 도중 분석된다. 마지막으로, 이러한 전략은 이렇게 하여 생성된 아데노바이러스 스톡에서 RCA를 생성하지 않는 장점을 지닌다. 이러한 오염의 부재가 또한 입증된다.
4. 아데노바이러스의 E1 및 E4 영역을 발현하는 배큘로바이러스의 작제
4-1. 배큘로바이러스 E1, E4 (Bac.E1-E4)의 작제
사용된 프로토콜은 하기와 같다: E1 및 E4 영역을 셔틀 벡터 pBacPAK8 (Clontech, USA)로 폴리헤드린 (Ph) 유전자의 로커스로의 역 배향으로 클로닝하여 pBacE1-E4를 생성한다. 재조합 배큘로바이러스를 pBacE1-E4 및 배큘로바이러스 BacPAK6의 DNA의 Sf9 세포로의 공형질감염에 의해서 분리한다 [참조문헌: Kitts and Possee, Biotechniques 14(5) (1993) 810]. 재조합 배큘로바이러스의 게놈내 E1 및 E4의 존재를 감염된 Sf9 세포를 사용하여 PCR에 의해서 검사한다. 정제된 재조합 배큘로바이러스로 감염된 Huh7 세포내 E1 및 E4의 전사가 원형질 RNA를 사용하여 RT-PCR에 의해서 분석된다.
E1-E4 배큘로바이러스의 작제를 위해서, E1을 운반하는 다양한 단편이 도입될 수 있다. 본 실시예에 사용된 단편은 자신의 프로모터 (감소된 E1a 프로모터 및 E1b 프로모터)의 조절하에 E1 영역을 함유하는, 배큘로바이러스-E1의 작제를 위해 실시예 3에 기재된 것들이다. 사용된 E4 단편은 하기와 같다:
- 전체 E4를 운반하는 단편 MaeII-MscI 32720에서 35835,
- 프레임 ORF6을 운반하는 단편 BglII-PuvII 34115에서 33126,
- 프레임 ORF6-ORF6/7을 운반하는 단편 BglII-BglII 34115에서 32490,
- 프레임 ORF3을 운반하는 단편 PvuII-AluI 34801에서 334329.
이들 단편은 또한 E4 프로모터 또는 상이한 프로모터, 특히 HSV-TK 또는 CMV 프로모터 또는 RSV-LTR 프로모터의 조절하에 배치된다.
상기에 부여된 위치는 데이터베이스 상에서 성립되고 접근가능한 야생형 Ad5 아데노바이러스의 서열을 의미한다. 일부 소수 변이가 다양한 아데노바이러스 혈청형 사이에 존재할 수 있지만, 이러한 위치는 일반적으로 기타 항원형, 특히 Ad2, Ad7, Ad12 및 Ad CAV-2에 대해 트랜스포존성이다.
4-2. Bac.E1-E4로의 Ad△E1△E4-LacZ의 트랜스상보
아데노바이러스 Ad△E1△E4-LacZ의 생성이 컴피턴트 세포로의 실시예 4-1에서 제조된 E1, E4 배큘로바이러스, 및 E1 및 E4이 결손인 아데노바이러스 게놈의 도입에 의해서 수득된다. 컴피턴트 세포에서 정제된 Bac. E1-E4로의 트랜스상보에 의한 Ad△E1△E4-LacZ의 생성을 위한 최적 조건이 분석된다. Ad△E1△E4 역가를 W162 세포주내 β-갈락토시다제 형질도입 단위 (t.d.u.)의 수로서 측정하고 수득된 트랜스상보 효율을 캡시드화 세포주 IGRP2의 효율과 비교한다.
5. 아데노바이러스 게놈 전체를 상보하는 배큘로바이러스의 작제
단일 바이러스로부터 13 kb 이하의 서열을 나타낼 수 있는 여러 단백질의 동시 발현이 보고되었지만 [참조문헌: Belyaev and Roy, NAR 21 (1993) 1219], 배큘로바이러스의 최대 클로닝 능력은 기록되지 않았다. 본 실시예는 캡시드화 서열 (Ad.Psi-)이 결실된 아데노바이러스 게놈을 클로닝하고 두 loxP 부위 [loxP-ITR-ITR에서 E4-loxP]에 의해서 배큘로바이러스와 근접함이 가능하다는 것을 예시한다. 이러한 재조합 배큘로바이러스 및 리콤비나제 Cre의 활성화에 의한 유도가능한 방 식으로 리콤비나제 Cre를 발현하거나 발현하지 않는 컴피턴트 세포의 감염 (Cre 또는 Cre-ER 세포주, 실시예 7 참조)은 아데노바이러스 게놈의 절단 및 원형화를 허용한다. 원형화는 초기 유전자를 형질도입하고 후기 유전자를 복제하고 활성화할 수 있지만 캡시드화 될 수 없고, 이에 따라 최소 아데노바이러스의 생성을 위한 헬퍼를 제공할 수 없다 (도 2-4 참조). 이러한 시스템에서, 최소 아데노바이러스의 생성은 두 배큘로바이러스에 의한 공-감염 및 loxP 부위 사이 2 개의 재조합 사건의 인식을 기초로 한다. 이러한 접근법은 헬퍼 바이러스로부터 아데노바이러스 입자를 생성하지 않는 장점을 지닌다.
Ad.Psi- 게놈의 작제가 이. 콜라이에서 수행된다. 이를 위해서, Ad5 아데노바이러스의 완전한 게놈은 부착된 ITR을 원핵세포 클로닝 벡터로 클로닝한다. Psi 서열이 효소적 절단 및 라이게이션에 의해서 또는 부위-지향성 돌연변이유발에 의해서 결실된다. 이어서 LoxP 서열을 평행 배향으로 아데노바이러스 게놈의 부위에 도입한다. 생성된 작제물 [loxP-ITR-ITR,△Psi에서 E4 - loxP]을 실시예 3에 기재된 전략에 따라 배큘로바이러스로의 재조합을 허용하는 셔틀 벡터로 클로닝한다. BacAd.Psi-라고 불리는 수득된 재조합 배큘로바이러스를 통상적인 방법에 따라서 분리한다.
6. 결손 재조합 아데노바이러스의 게놈을 절단 가능한 형태로 포함하는 배큘로바이러스의 작제
본 실시예는 컴피턴트 세포에 결손 재조합 아데노바이러스의 게놈을 제공함을 가능하게 하는 배큘로바이러스의 작제에 대해 기재한다. 좀더 상세하게, 재조 합 아데노바이러스는 암호화 영역 전체가 결손이고, ITR과 Psi 영역 (최소 아데노바이러스 또는 Ad△)만을 보유한다.
6-1. 이. 콜라이에서 미니게놈 (Ad△)의 작제
플라스미드 p [loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP]를 작제한다. 이를 위해서, 아데노바이러스의 ITR의 카피를 효소 절단에 의해서 분리하고/하거나 PCR에 의해서 증폭한 다음 아데노바이러스 pGY63의 셔틀 벡터에 함유된 ITR-Psi 서열의 상류로 클로닝한다. 이러한 벡터는 pCO1 (WO96/10088)로부터 유도되고 ITR-Rsi 서열과 pIX를 암호화하는 유전자 사이에 클로닝되는, SV40 바이러스 (pA)의 폴리아데닐화 시그널로 종결되는 사이토메갈로바이러스 (p.CMV)의 즉시-초기 프로모터의 조절하에 LacZ 유전자를 지닌다. 이러한 벡터의 영역 (ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA) (최소 아데노바이러스 게놈에 상응)를 효소 절단에 의해서 분리하고, 플라스미드 p [loxP-(ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA)-loxP]를 생성하기 위해서 LoxP 부위 사이에 플라스미드 pBS246 (Gibco)의 다수 클로닝 부위로 클로닝한다. 환형 DNA로부터 아데노바이러스 미니게놈을 생성하고 이를 캡시드화하는 능력을 리콤비나제 Cre (AdCre)를 발현하는 Ad.△E1△E4로 감염된 IGRP2 세포주로의 형질감염에 의해서 시험한다. 최소 아데노바이러스를 IGRP2 세포주에서의 형질감염으로부터의 상등액의 수회의 연속 계대접종에 의해서 증폭시킨다. 이어서 이들을 이소픽닉 세슘 클로라이드 구배 원심분리에 의해서 정제하고 W162 세포주에서 슈도적정에 의해서 정량한다. LacZ 유전자는 통상적인 분자 생물학 기술에 의해서 기타 해당 핵산에 의해 쉽게 대체될 수 있다.
6.2. 배큘로바이러스로의 절단가능한 미니게놈의 클로닝
상기의 2 개의 loxP 부위에 의해서 근접되는 미니게놈 Ad△를 운반하는 작제물을 배큘로바이러스의 P10 로커스에서 셔틀 벡터 pAcUW1 (Pharmingen, USA)로 클로닝한다. 배큘로바이러스 Bac.Ad△을 생성하고 상기의 Sf9 세포로의 공형질감염의 통상적인 기술에 의해서 분리한 다음, X-Gal로 염색한 후 파지 표현형 (백색)에 의해서 선별한다. 그러므로, 이러한 배큘로바이러스는 직접 배향의 2 개의 loxP 영역이 측면에 위치하는 고도로 결손인 아데노바이러스 게놈을 운반한다.
6-3. 배큘로바이러스 BacAdPsi-로의 트랜스상보에 의한 Ad△의 생성
컴피턴트 세포를 아데노바이러스 게놈 전체의 트랜스상보 기능을 운반하는 배큘로바이러스 BacAdPsi- (실시예 5에 기재)와 슈도아데노바이러스의 게놈을 운반하는 배큘로바이러스 Bac.Ad△ (상기)로 동시에 공-감염시킨다. 리콤비나제 Cre를 단백질을 배양 배지로 첨가함으로써, 또는 세포를 Cre를 발현하는 플라스미드 또는 바이러스 (배큘로바이러스)로 형질감염시킴으로써, 또는 세포주 게놈으로 안정하게 통합된 (실시예 7에 기재) 카세트의 발현에 의해 제공한다. 최소 아데노바이러스를 BacAd.Psi-와 상등액으로 공-감염된 세포의 배양 상등액의 연속 계대접종에 의해서 증폭한 다음 상기의 기술에 따라서 정제하고 적정한다. 이러한 기술은 통상적인 기술에 의한 분리 및 정제를 허용하는 Ad△를 단독 바이러스로서 수득함을 가능하게 한다. 또한, 수득된 역가는 산업적 용도에 적합하다.
7. Cre 단백질을 발현하는 세포주의 작제
유도가능한 방식으로 Cre를 발현하거나 발현하지 않는 세포주를 본 발명의 배큘로바이러스내 loxP 부위 (예를 들면, Bac.Ad△ 및 BacAd.Psi-)간 재조합의 효율을 증가시키고 Cre의 발현을 조절하기 위해서 작제한다. 이러한 작제시, Cre는 편재성 프로모터, 바람직하게는 유도가능하거나 유도가능하지 않은 강한 프로모터의 조절하에, 단독으로 또는 에스트라디올 수용체 (ER) 결합 도메인 (Metzger et al., 1996)을 갖는 C-말단 융합 단백질의 형태로 발현된다. 좀더 상세하게, 사용된 프로모터는 pGRE5 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, SV40 프로모터 또는 HSV-TK 유전자의 프로모터이다.
이러한 Cre 세포주를 작제하기 위해서, 컴피턴트 세포를 하나가 Cre 발현 카세트 (Cre 또는 Cre-ER)를 함유하고 다른 하나가 선별 마커 (Neo)를 위한 것을 함유하는 두 플라스미드로 공형질감염시킨다. G418 내성 클론을 선택하고, 이러한 클론에서의 Cre 활성을 플라스미드 p(P.CMV-loxP-ATG-중단-pA-LoxP-LacZ)의 형질감염에 의해서 시험한다. 이러한 플라스미드는 프로모터 (P.CMV)와 LacZ의 개시부 사이에 3 개의 판독 프레임내 연속된 중단 코돈과 전사 종결을 위한 시그널과 2 개의 loxP 부위에 의해서 근접된 SV40 바이러스의 폴리아데닐화 시그널을 도입함으로써 불활성화된 LacZ 유전자를 함유한다. 인듀서 (에스트라디올)의 존재하에 클론내 Cre의 발현은 2 개의 loxP 부위간 재조합에 의해서 도입된 β-갈락토시다제 활성에 의해 나타난다. 따라서, 융합 단백질 Cre-ER 또는 단백질 Cre만을 프로모터 및 하기에 기재된 컴피턴트 세포로부터 안정하게 발현시키는 여러 클론이 선별된다. 이들 클론은 본 발명에 따른 바이러스의 생성을 위해 사용될 수 있다.
| 컴피턴트 세포 | HSV-TK 프로모터 | SV 40 프로모터 | MMTV 프로모터 | GRE5 프로모터 | ||||
| 리콤비나제 | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER | Cre | Cre-ER |
| 293 | #1 | #7 | #13 | #19 | #25 | #31 | #37 | #43 |
| IGRP2 | #2 | #8 | #14 | #20 | #26 | #32 | #38 | #44 |
| Huf7 | #3 | #9 | #15 | #21 | #27 | #33 | #39 | #45 |
| HepG2 | #4 | #10 | #16 | #22 | #28 | #34 | #40 | #46 |
| HER | #5 | #11 | #17 | #23 | #29 | #35 | #41 | #47 |
| Vero | #6 | #12 | #18 | #24 | #30 | #36 | #42 | #48 |
Claims (46)
- 결손 재조합 바이러스의 게놈과, 상기 결손 재조합 바이러스 게놈에서 결실된 기능을 트랜스상보하는데 필수적인 기능을 포함하는 배큘로바이러스를 컴피턴트 세포군으로 도입시킴으로써 결손 재조합 바이러스를 생성하는 방법으로서, 상기에서 결손 재조합 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노-수반 바이러스이며 바이러스 복제 또는 캡슐화에 요구되는 영역이 결실된, 결손 재조합 바이러스의 생성방법.
- 제 1 항에 있어서, 배큘로바이러스가 결손 재조합 게놈의 트랜스상보에 필수적인 모든 기능을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 배큘로바이러스가 결손 재조합 게놈의 트랜스상보에 필수적인 기능의 일부를 포함하고 나머지가 컴피턴트 세포에 의해서 제공됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 결손 재조합 게놈의 트랜스상보에 필수적인 기능이 여러 배큘로바이러스에 의해서 제공됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 결손 재조합 바이러스가 결손 재조합 아데노바이러스임을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스의 게놈이 E1, E2, E3, E4, L1-L5, pIX 및 IVa2 중에서 선택된 하나 이상의 기능이 결손이고 배큘로바이러스가 결손 재조합 게놈의 트랜스상보에 필수적인 모든 기능을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스의 게놈이 E1, E2, E3, E4, L1-L5, pIX 및 IVa2 중에서 선택된 하나 이상의 기능이 결손이고 배큘로바이러스가 결손 재조합 게놈의 트랜스상보에 필수적인 기능의 일부를 포함하고 기능의 나머지가 하나 이상의 다른 배큘로바이러스 또는 컴피턴트 세포에 의해서 제공됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 헬퍼 배큘로바이러스가 E1 영역 결손 재조합 아데노바이러스 게놈의 상보를 허용하는 아데노바이러스 E1 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 헬퍼 배큘로바이러스가 E2 영역 결손 재조합 아데노바이러스 게놈의 상보를 허용하는 아데노바이러스 E2 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 헬퍼 배큘로바이러스가 E4 영역 결손 재조합 아데노바이러스 게놈의 상보를 허용하는 아데노바이러스 E4 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 헬퍼 배큘로바이러스가 E1 및 E4 영역 결손 재조합 아데노바이러스 게놈의 상보를 허용하는 아데노바이러스 E1 및 E4 영역을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스 게놈이 암호화 바이러스 영역이 부족하고 헬퍼 배큘로바이러스가 이의 상보를 허용하는 모든 기능을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 배큘로바이러스가 캡시드화 영역이 결실된 아데노바이러스 게놈 전체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 배큘로바이러스에 존재하는 상보 기능과 결손 재조합 바이러스의 게놈이 재조합을 일으킬 수 있는 상동성 영역을 포함하지 않음을 특징으로 하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, E1 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스 게놈이 컴피턴트 세포로 도입되고, 이들 세포가 E1 영역을 포함하는 배큘로바이러스, 배큘로바이러스에 존재하는 아데노바이러스 E1 영역 및 재조합을 일으킬 수 있는 상동성 영역을 포함하지 않는 결손 재조합 아데노바이러스의 게놈으로 감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 배큘로바이러스가 Ad5 아데노바이러스의 단편 391에서 3511을 포함하고 E1 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스의 게놈이 더 큰 결실을 운반함을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 배큘로바이러스가 Ad5 아데노바이러스의 단편 391에서 3511을 포함하고 E1 영역이 결손인 재조합 아데노바이러스의 게놈이 뉴클레오티드 383에서 3512를 포함하는 결실을 운반함을 특징으로 하는 방법.
- 게놈에 삽입된, 이종 프로모터의 조절하에 배치된 결손 바이러스의 상보 기능을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 배큘로바이러스로서, 상기에서 결손 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노-수반 바이러스이고, 상기 이종 프로모터는 아데노바이러스의 E1A, E4, E2 또는 MLP 프로모터, AAV의 P5 또는 P19 프로모터, RSV의 LTR 프로모터, PGK 유전자의 프로모터, CMV의 즉시-초기 프로모터, 허프스바이러스의 TK 유전자의 프로모터, MMTV 바이러스의 프로모터, pGRE5 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 또는 SV40 프로모터이며, 상기 상보기능은 아데노바이러스의 E1, E2, E4, L1-L5, pIX 및 IVa2 영역에 의해 단독으로 또는 조합하여 암호화된 기능, AAV의 Rep 및 Cap 영역에 의해 단독으로 또는 조합하여 암호화된 기능, 및 레트로바이러스의 gag, pol 및 env 영역에 의해 단독으로 또는 조합하여 암호화된 기능 중에서 선택되는 재조합 배큘로바이러스.
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- 제 18 항에 있어서, 상보 기능을 암호화하는 핵산이 항원형 Ad2 또는 Ad5 아데노바이러스 게놈의 단편에 상응하는 DNA로 이루어짐을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
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- 제 22 항에 있어서, 상보 기능이 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, 또는 E1a 영역을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 일부를 포함함을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 제 22 항에 있어서, 상보 기능이 아데노바이러스 게놈의 E4 영역 전체, 또는 개방 판독 프레임(Open Reading Frame, ORF) ORF3 또는 ORF6을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 일부를 포함함을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 제 22 항에 있어서, 아데노바이러스 게놈의 암호화 영역 전부를 포함함을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 제 28 항에 있어서, 캡시드화 영역이 부족한 완전한 아데노바이러스 게놈을 포함함을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 제 18 항에 있어서, AcNPV 균주임을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 제 18 항에 있어서, 핵산이 폴리헤드린 로커스 또는 p10 로커스 내로 도입됨을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 제 18 항에 있어서, 핵산이 컴피턴트 세포에서 절단될 수 있는 카세트 형태로 도입됨을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 게놈에 삽입된, 부위-특이적 재조합을 허용하고 직접 배향으로 위치하는 두 서열이 측면에 위치하며, 컴피턴트 세포에서 기능을 띠는 적어도 하나의 복제 기원 및 바이러스의 상보 기능을 암호화하는 핵산을 포함하는 적어도 하나의 DNA 영역을 포함하는 재조합 배큘로바이러스로서, 상기에서 바이러스는 아데노바이러스 또는 아데노-수반 바이러스이며, 상기 부위-특이적 재조합을 허용하는 서열이 P1 박테리오파지의 LoxP 서열 또는 트랜스포존의 리솔바제 서열이고, 상기 재조합은 Cre 단백질의 존재하에 수행되는 재조합 배큘로바이러스.
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- 제 5 항에 있어서, 결손 재조합 게놈이 게놈을 포함하는 아데노바이러스로의 감염에 의해서 세포로 도입됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 결손 재조합 게놈이 형질감염에 의해 세포 중으로 도입됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 결손 재조합 게놈이 상보 기능을 운반하는 배큘로바이러스와 구별되는 재조합 배큘로바이러스로 세포에 도입됨을 특징으로 하는 방법.
- 게놈에 삽입된, 부위-특이적 재조합을 허용하고 직접 배향으로 위치하는 두 서열이 측면에 위치하며, 컴피턴트 세포에서 기능을 띠는 적어도 하나의 복제 기원 및 결손 아데노바이러스 게놈을 포함하는 적어도 하나의 DNA 영역을 포함하는 재조합 배큘로바이러스로서, 상기에서 상기 부위-특이적 재조합을 허용하는 서열이 P1 박테리오파지의 LoxP 서열 또는 트랜스포존의 리솔바제 서열이고, 상기 재조합은 Cre 단백질의 존재하에 수행되는 재조합 배큘로바이러스.
- 제 38 항에 있어서, 결손 재조합 아데노바이러스 게놈이 필수적으로 ITR 영역, 캡시드화 서열 및 해당 핵산을 포함함을 특징으로 하는 배큘로바이러스.
- 컴피턴트 세포군을 제 33 항에 따른 배큘로바이러스와 제 38 항에 따른 배큘로바이러스로 감염시키고, 상기 세포군을 부위-특이적 재조합을 허용하는 리콤비나제의 존재하에 둔 다음, 생성된 아데노바이러스를 회수하는 것을 특징으로 하는 결손 재조합 아데노바이러스의 생성방법.
- 제 1 항에 있어서, 컴피턴트 세포군이 간세포, 근육세포, 섬유아세포, 배세포, 상피세포, 안세포, 또는 신경 세포군임을 특징으로 하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 컴피턴트 세포군이 세포 293 또는 추가의 상보 기능을 포함하는 유도 세포 A549, HuH7, Hep3B, HepG2, HER, 911, HeLa 또는 KB 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, ITR이 결실된 방법.
- 제 15 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스 게놈의 E3 영역이 추가적으로 결손인 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상피세포가 폐 상피세포인 방법.
- 제 41 항에 있어서, 안세포가 망막세포인 방법.
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