KR102609021B1 - 아데노바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 조절가능한 주요 후기 프로모터 및 외인성 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그와 같은 아데노바이러스 벡터를 포함하는 세포, 및 그와 같은 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

아데노바이러스 벡터
본 발명은 조절가능한 주요 후기 프로모터 및 외인성 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그와 같은 아데노바이러스 벡터를 포함하는 세포, 및 그와 같은 벡터를 사용하는 방법에 관한 것이다.
아데노바이러스는, 널리 이해된 유전학 및 조직 배양내 고수율로 성장하기 위한 능력을 갖는, 생명공학에서 매력적이고 다용도 도구이다. 아데노바이러스의 복제 사이클은, 초기 및 후기 둘 모두를 포함하여, 고도로 복잡하다. 초기부터 후기까지 전이는 바이러스 게놈에서 주요 후기 프로모터 (MLP)의 활성화 및 DNA 복제 이후 발생하는 것으로 간주된다. MLP는 모든 바이러스 후기 전사체의 발현을 구동시키고, 세포 단백질의 최대 30%를 바이러스 구조적 단백질로 전환시킬 수 있다. 유도성 발현을 제공하기 위한 원위치 MLP로의 변형이 이전에 실증되지 않았던 것은, 주로 바이러스 DNA 폴리머라제 코딩 서열이 대향하는 DNA 가닥에 있기 때문이다.
아데노바이러스가 수많은 응용에 대하여 유용한 실험실 도구인 반면, 이들이 매우 생산적이라는 사실은 이들이 제조 작업 흐름에서 사용되면, 즉 이들이 하류 처리 동안 제거되어야 하는 바이러스 입자의 상당한 양을 생성한다면 주요 문제를 나타낸다. 예를 들어, 아데노바이러스가 단백질 발현 목적, 또는 다른 바이러스-유사 입자의 생산, 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)의 대규모 제조를 위하여 이전에 사용된 경우, 생산 방법의 마지막에 온전한 아데노바이러스 입자의 존재는 매우 바람직하지 않다.
포유동물 세포에서 단백질을 제조하기 위한 능력은, 최적의 단백질 가공, 폴딩 및 당화를 제공하는, 이들 시스템에서 현재 생산되고 있는 많은 고가 재조합 단백질로, 점점 더 매력적이다. 이것은 강한 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 전초기 프로모터의 제어 하에서 요구된 이식유전자를 인코딩하는 플라스미드의 일시적 형질감염을 이용하여 빈번하게 달성된다. 그러나, 다른 유기체내 일부 바이러스 시스템 (예컨대 곤충 세포내 배큘로바이러스)에 비교하여, 이 방법은 상대적으로 비효율적이어서, 종종 총 세포 단백질 질량의 3%를 드물게 초과하는 가변성 단백질 수율을 실증한다.
이의 유전자 발현 및 수명 주기에 관한 다량의 지식과 커플링된, 아데노바이러스 게놈의 광범위한 특성규명은 재조합 단백질 수율을 상당히 개선하는 것에서 이상적인 후보 플랫폼으로 이 바이러스를 만든다. 하나의 주요 이점은 포유동물 세포의 기계장치를 활동적으로 이용하기 위한, 그리고 세포 단백질의 생산을 억제시키기 위한 바이러스의 능력에 의해 실증된다.
그러나, 세포 단백질의 생산 억제에 더하여, 상당한 세포 자원은 바이러스에 의해 사용되어 바이러스 구조적 단백질을 생산한다. 생산된 캡시드 단백질의 양은, 예를 들어, 막대하고 총 세포 단백질의 최대 30%이도록 계산되어 왔고, 생산 후 이들 단백질 및 어셈블리된 바이러스 입자 제거는 도전적이다.
재조합 단백질과 유사하게, 아데노-관련 바이러스 입자에 대한 요구는, 망막 장애 및 혈우병의 치료에서 최근 임상 성공으로 인해, 상당히 증가하고 있다. 종래에, AAV의 생산은 2개의 상이한 경로를 통해 달성되었다. 초기에, AAV는 야생형 (WT) 아데노바이러스 혈청형 5를 사용하여 생성되면서 Rep 및 Cap 유전자 그리고 AAV 게놈을 인코딩하는 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 이것은 바이러스 복제를 촉진시켰던 트랜스로 WT 아데노바이러스가 수많은 인자를 제공하도록 하였다. 그러나, 이 접근법에 수많은 제한이 있다: 예를 들어, AAV의 각각의 배치는 순수한 생성물을 제공하기 위해 Ad5 입자로부터 분리되어야 하고 모든 Ad5가 제거된 것을 보장하는 것은 도전적이다. 또한, 생산 동안 세포가 AAV 보다는 아데노바이러스 입자의 생산에 거대한 자원을 바친다는 사실은 또한 바람직하지 않다.
더욱 최근에, 아데노바이러스계 시스템은 AAV 생산에 필요한 아데노바이러스 게놈의 섹션을 인코딩하는 플라스미드로 대체되어 왔다. 이것이 최종 바이러스 제조에서 존재하고 있는 아데노바이러스 입자에 대해 관심의 일부를 해결하는 반면, 수많은 쟁점이 남아있다. 이들은 생산 세포주에 형질감염을 위하여 충분한 플라스미드를 사전-제조하기 위한 요건 및 본질적으로 형질감염 자체의 비효율적인 방법을 포함한다. 이들 시스템으로부터 수율은 또한 Ad5 기초 접근법을 사용하는 것보다 더 낮다. 발명자들은 후기 아데노바이러스 유전자의 전사가 주요 후기 프로모터에 리프레서 요소의 삽입에 의해 조절 (예를 들면 억제)될 수 있다는 것을 현재 알아내었다. 후기 유전자의 "스위칭 오프" 발현으로, 세포의 단백질-제조 능력은 원하는 재조합 단백질의 생산을 향해 전환될 수 있다. 중요하게는, 본 발명에 따라 아데노바이러스 게놈에서 주요 후기 프로모터의 전략적 침묵화는 바이러스가 세포에서 이의 DNA를 여전히 복제시키게 하여, 광범위한 응용에 대하여 전사될 수 있는 바이러스 게놈의 수 천의 DNA 카피를 제공한다.
본 발명은 광범위의 이점을 제공한다. 예를 들어, 바이러스 후기 유전자가 여전히 발현되는 비교할만한 시스템에 비교하여 증가된 수율에서 특이적 재조합 단백질의 생산을 향한 세포의 단백질 생산 능력을 유도하는데 사용될 수 있다. 게다가, 바이러스 구조적 단백질의 생산을 "스위치 오프"시키기 위한 능력은 바이러스 입자가 단백질-생산 공정 동안 생산되지 않거나 본질적으로 생산되지 않는 것을 의미한다. 결과적으로, 경제적 절감은 정제된 단백질로부터 바이러스 입자를 제거하기 위한 필요성에서 감소로 인해 실시될 수 있다.
본 발명은 또한 AAV의 Rep 및 Cap 단백질이 아데노바이러스 게놈의 복제 유지에 의해 AAV 입자를 만들도록 요구되는 높은 발현 수준을 제공하기 위해 아데노바이러스 내에서 인코딩될 수 있는 AAV 입자를 제조하기 위한 단순, 비용-효율적인 방식을 제공하는 이점, 뿐만 아니라 최종 AAV 제조에서 생산 아데노바이러스 입자를 예방하는 이점을 갖는다.
MPL의 일부 변형은 이전에 보고되어 왔다. 이들은 MLP의 카피 제조 및 발현 수준 분석 (El-Mogy, 2012)를 위한 다른 플라스미드에서 또는 이의 발현을 조절하기 위한 부위의 삽입을 위해 아데노바이러스 게놈 대상체의 E1 영역 내에서 (Molin, 1998) 어느 한쪽 배치를 포함한다. 다른 작업은 두 기초 연구 (Concino 등, 1983; Concino 등, 1984)를 위하여 그리고 세포에서 트랜스-보수 인자를 갖는 세포에서만 바이러스가 선택적으로 성장되도록 하기 위해 MLP TATA 박스의 돌연변이를 포함하여 왔다. 중요하게는, 후자 접근법은 주요 후기 프로모터의 활성이 세포에서 존재하고 있는 보수 단백질 인자에 전적으로 의존적인 시스템을 제공하고, 따라서 이 인자가 없는 세포에서 MLP는 활성이 없다. 본 발명은, 그러나, 이의 반대를 제공하고, 여기에서 MLP는 리프레서가 결합되지 않은 세포에서 전체 발현 활성 수준을 유지하여, 바이러스 수명 주기에 대한 최소 방해로 높은 수준 바이러스 복제를 제공한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 바이러스는 따라서 억압되지 않은 경우 완전하게 활동적이지만, 리프레서의 존재 또는 부재에 따라, 억압될 수 있다. 리프레서 결합 부위는 이전에 아데노바이러스 게놈에서 이의 발현의 조절을 위하여 원위치 MLP에 성공적으로 삽입되지 않았다. 현행 발명자들은 이 시스템을 추가로 개선시켜 주요 후기 프로모터 자체의 제어 하에서 리프레서 단백질 코딩 서열을 배치시켰다. 이 접근법에서, 주요 후기 프로모터가 자신을 자기-억압하는 것은 주요 후기 프로모터가 바이러스의 구조적 단백질을 전사하려고 노력하는 경우, 이의 고유 활성을 억압시킬 수 있는 리프레서를 또한 전사시킬 것이고, 그것에 의해 MLP 활성을 예방하는 음성 피드백 루프를 제공하고 MLP 발현의 단단한 조절을 제공하기 때문이다.
따라서 본 발명의 목적은 재조합 단백질의 증가된 수율을 제공하는, 그리고 비-아데노바이러스 바이러스 및 바이러스-유사 입자를 제공하는데 사용될 수 있는 아데노바이러스 벡터 시스템을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 아데노바이러스-감염된 세포에서 이식유전자 생성물의 생산 방법을 제공하는 것이고, 이는 단백질, 비-아데노바이러스 입자 또는 바이러스-유사 입자일 수 있는 정제된 생성물로부터 바이러스 입자를 제거하기 위한 필요성을 감소시킨다.
일 구현예에서, 본 발명은 억압성 주요 후기 프로모터 (MLP)를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공하고, 여기서 상기 MLP는 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 조절 또는 제어할 수 있는 하나 이상의 리프레서 요소를 포함하고, 리프레서 요소의 하나 이상은 MLP TATA 박스의 하류에 삽입된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 억압성 주요 후기 프로모터 및 외인성 이식유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다:
(a) 다수의 아데노바이러스 초기 유전자, 및
(b) 주요 후기 프로모터 (MLP)의 제어 하에서 다수의 아데노바이러스 후기 유전자, 및
(c) 이식유전자,
여기서 상기 MLP는 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 조절 또는 제어할 수 있는 하나 이상의 리프레서 요소를 포함한다.
바람직하게는, 리프레서 요소에 결합할 수 있는 리프레서 단백질을 인코딩하는 유전자는 아데노바이러스 게놈 내에서 인코딩된다.
바람직하게는, 이식유전자는 이의 5'-UTR에서 트리파타이트 리더 (TPL)을 포함한다.
바람직하게는, 리프레서 요소의 존재는 아데노바이러스 E2B 단백질의 생산에 영향을 주지 않는다.
바람직하게는, 리프레서 단백질은 MLP로부터 전사된다.
바람직하게는, 하나 이상의 리프레서 요소는 MLP TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이 삽입된다.
아데노바이러스는 현대 과학 연구에서 가장 통상적으로 조사된 및 개척된 바이러스이다. 백신접종, 유전자 요법, 바이러스요법의 분야에서, 및 또한 생물학적 시스템 이해를 위한 복합 도구로서 유용성을 알아내었다 (McConnell 등, 2004).
바이러스의 아데노비리다에 계열은 1953년에 감염된 소아의 아데노이드로부터 먼저 단리된 이중가닥 DNA 바이러스이다 (Rowe 등, 1953). 상기 계열은 인간, 새 및 양서류를 포함하는 매우 다양한 숙주를 감염시키는 많은 종으로 이루어지고 이들이 감염시키는 광범위한 숙주를 반영하기 위해 4개의 속으로 분할된다.
마스타데노비리다에는 포유동물 숙주를 감염시키는 25개의 독특한 아데노바이러스 종으로 이루어진다. 이 속 내에서 현재 인간을 감염시키는 아데노바이러스의 7개의 뚜렷한 종이 있다. 이들은 인간 아데노바이러스 A-G로서 문자로 표시된다. 이들 종 내에서 1-57로 넘버링되는 다중 혈청형은 확인되었고 모두는 바이러스 학명 국제 위원회에 의해 독립적인 균주로서 인지된다:
종 A: 12, 18, 31
종 B: 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55
종 C: 1, 2, 5, 6, 57
종 D: 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 53, 54, 56
종 E: 4
종 F: 40, 41
종 G: 52
아데노바이러스는 이코사헤드론 정점으로부터 돌출하는 12개의 섬유와 이십면체 캡시드를 가진 소형 (대략 90 nm 직경) 비-외피보유한 바이러스이다. 바이러스는 240 헥손 삼량체, 12 펜톤 오량체, 60 IIIa 단량체, 12 섬유 삼량체, 60 VII 육량체, 80 IX 삼량체 뿐만 아니라 2 말단 반복 단백질 및 다중 코어 단백질로 이루어진다. 많은 후자는 세포내이입된 바이러스 캡시드의 단백질분해 절단 및 세포내 이동조절에 필수적이다.
아데노바이러스의 DNA 게놈은 혈청형에 의존적인 길이가 다양하지만 길이가 전형적으로 34-36 킬로염기이다. 아데노바이러스 혈청형 5 게놈은 일반적으로 각각의 말단에서 103개의 염기쌍 말단 반복부 및 58% GC 함량을 가진 35938개의 염기쌍이다. 게놈은 캡시드 구조 내에서 및 다수의 복제 사이클에 대하여 선형이지만 게놈 복제 동안 핵 내에서 팬-핸들 원형 구조를 형성할 수 있다.
아데노바이러스에 대한 세포 부착의 방법은 혈청형에 의존하여 다양하다. (혈청형 2 및 5를 포함하는) 아데노바이러스 종 C는 세포 융합막의 성분 (Honda 등, 2000)인 세포 표면 콕사키 및 아데노바이러스 수용체 (CAR) (Tomko 등, 1997)에 결합하는 그것의 섬유 도메인을 통해 세포에 부착하는 것으로 밝혀졌다. 이 초기 상호작용은 고친화도이고 상피성 세포에서 풍부한 세포 표면 인테그린 (αVβ3 & αVβ5)와 바이러스 펜톤 사이 더 낮은 친화도 상호작용으로 이어진다 (Wickham 등, 1993). 세포 표면에 흡수 이후 비리온은 세포내이입되고 저조하게 정의된 단계에서 바이러스 캡시드는 엔도좀에서 사이토졸로 탈출한다. 사이토졸 내에서 아데노바이러스 캡시드는 미세소관 네트워크에 결합하고 핵공 복합체와 캡시드 상호작용 이후 핵 내강에 DNA가 전달되는 핵에 다이네인 의존적 기전을 통해 수송된다 (Trotman 등, 2001; Kelkar 등, 2004).
아데노바이러스 유전학, 전사 및 번역에 대한 우리의 이해는 아데노바이러스 종 C 혈청형 5를 사용하는 바이러스학 연구에서 주로 유래된다. 아데노바이러스 게놈으로부터 유전자 전사의 순차적인 방법은 복제 방법의 각각의 단계에서 바이러스의 단백질 요건을 반영한다. 아데노바이러스 게놈으로부터 전사는 따라서 각각의 바이러스 프로모터로부터 전사의 개시의 타이밍에 의존적인 초기 및 후기 사건으로 분할된다 (도 1). 바이러스 게놈으로부터 생산된 제1 단백질은 E1A 단백질이다. E1A 전사 단위는 6-36 kDa 범위의 다중 단백질을 차례로 생산하는 대안적인 스플라이싱을 통해 다중 mRNA 분자를 생산한다. E1A 단백질은 감염된 세포 내에서 2개의 주요한 역할을 갖는다. 첫째, 이들은 세포를 세포 사이클의 S 상에 진입하도록 유도하여 바이러스 게놈의 효율적인 복제를 허용한다. 둘째, 이들은 상호활성화를 통해 바이러스 게놈 내에서 다른 초기 프로모터의 전사를 유도한다. 이들 프로모터는 E1B, E2, E3, E4 및 E5 단백질의 생산을 제어한다. E1A 발현은 VA RNA 및 E1B 및 E3 단백질 생산으로 바로 이어진다. 이들 단백질 및 RNA 분자는 항-바이러스 반응의 발달 예방을 돕는다. 바이러스 복제에서 이들 초기 사건은 세포내 환경 형상화를 도와 패키징 전 바이러스 게놈의 복제를 허용한다. 후기 전사 사건은 후기 영역 1-5를 전사시키는 단일 프로모터 (주요 후기 프로모터)로부터 주로 유래되는 세포 용해에 필수적인 단백질 및 구조적 단백질의 생산을 포함한다. 세포 용해는 초기 유전자로서 이의 표지화에도 불구하고 감염에서 그리고 주요 후기 프로모터로부터 단지 생산되는 E3-11.6K 단백질 (또한 일명 아데노바이러스 사망 단백질)에 의존적이다 (Tollefson 등, 1996).
아데노바이러스 유전자는, 스플라이싱 사건의 범위로부터 유도된 다중 단백질 동형체로, 초기 (E1-4) 및 후기 (L1-5) 전사체로 분할된다. 초기 영역은 E1, E2, E3 및 E4로 분할된다. E1은 바이러스 복제에 도움이 되는 세포 사이클의 상으로 세포 전이 그리고 세포자멸사 억제 및 세포 분할 촉진에 필수적이다. E2 영역은, DNA 결합 단백질 (E2A), 말단 단백질 및 DNA 폴리머라제 (E2B)를 함유하는, DNA 게놈의 복제를 주로 책임진다. E3은 숙주 반응의 면역 조절에 관여된 유전자를 함유하고 E4는 세포 경로 예컨대 비-상동성 말단 연결 (NHEJ) 조절 및 p53 열화를 매개하기 위한 E1B-55K와 복합화에 관여된 유전자의 범위를 함유한다.
아데노바이러스 후기 유전자 모두는 동일한 프로모터, 주요 후기 프로모터로부터 전사되고 모두는 트리-파타이트 리더 서열로부터 집합적으로 형성하는 3개의 엑손을 함유하는 동일한 5' mRNA 말단을 공유한다. 후기 유전자는 바이러스 입자의 일부 (예를 들면 헥손 및 섬유)를 형성하거나 이의 어셈블리 (예를 들면 100K 단백질)에 관여하였던 대략 13개 단백질의 발현을 허용하는 일련의 스플라이스 사건에 의해 발현된다.
아데노바이러스 벡터는 계열 아데노비리다에의 바이러스의 게놈으로부터 유래되거나 상기에 기초하는 벡터이다. 바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 A, B, C, D, E, F 또는 G로부터 인간 아데노바이러스이다. 더욱 바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 B 또는 C 또는 D로부터 인간 아데노바이러스이다. 더더욱 바람직하게는, 아데노바이러스는 그룹 B 또는 C로부터 인간 아데노바이러스이다.
아데노바이러스 벡터는 다수의 아데노바이러스 초기 유전자를 포함한다 (도 1).
E1A 단백질은 E1A 영역에서 핵 내에 아데노바이러스 게놈으로부터 제1 유전자 전사 사건의 번역 생성물이다. 이 초기 전사는 E1A 프로모터 내에서 강한 구성적으로 활동적인 향상제 요소에 의해 유도되고 E1A mRNA의 상당한 양이 생산되도록 한다. 이들은 세포 사이클 진행을 또한 유도할 수 있는 E1B 단백질과 전환을 유도할 수 있는 아데노바이러스 게놈에서 단백질의 2 세트 중 하나이다. E1A 및 E1B 유전자는 바이러스 복제에 필수적이다.
E2 유전자는 아데노바이러스 게놈에서 2 섹션: E2A 및 E2B 영역으로 분할되고, 둘 모두는 바이러스 복제에 필요하다. E2B는 바이러스 게놈 DNA의 증폭에 근본적으로 필요한 DNA 폴리머라제 유전자를 함유한다. 유사하게, 이 영역은 또한 바이러스 게놈 복제의 개시에 필요한 말단 단백질을 함유한다. 말단 단백질은 바이러스 게놈 DNA의 말단에 공유결합된다. E2A 영역은 DNA 복제에 필요한 DNA 결합 단백질을 함유한다. 모든 E2 유전자는 바이러스 복제에 근본적으로 필요하다.
E3 유전자는 바이러스 감염에 대한 숙주 면역 반응 및 세포 조절에 주로 관여되지만, 그러나, 생명공학 응용에 사용된 다수의 바이러스가, 전부가 아니라도, 시험관내 많기 때문에, 이들 바이러스 중에서 유전자는 바이러스 복제 효율 감소 없이 제거될 수 있다. 다수의 E3 유전자는 바이러스 복제에 필수적이지 않다. 그러나, 일부 유전자 예컨대 아데노바이러스 사망 단백질 (ADP)는 효율적인 복제 및 바이러스 생산에 필요하다.
아데노바이러스 게놈의 E4 영역은 바이러스 제어를 돕는 그리고 세포를 조절하여 효율적인 바이러스 복제 및 생산을 확보하는 단백질 생산에 주로 관여되는 E1 영역과 유사하다. 상기 영역은 수많은 다른 별개의 기능 중에서 비-상동성 말단 연결 및 세포자멸사 예방을 도울 수 있는 6개의 열린 해독틀 (ORFs)를 포함한다. 바이러스 복제에 대한 각각의 E4 전사체의 상대적 중요성은 필수적인 일부로 가변성인 반면 기타는 바이러스 성장 동력학 및 생산의 효과가 거의 없이 결실 또는 변형될 수 있다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 아데노바이러스가 배치되는 세포의 핵에서 바이러스 게놈을 복제할 수 있기 위해 충분한 아데노바이러스 초기 유전자를 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 다수의 아데노바이러스 후기 유전자를 포함한다 (도 1).
바이러스 후기 유전자는 5개의 주요 전사체 계열 일명 L1-L5로 분할된다. 이들 전사체는 주로 바이러스 어셈블리 및 바이러스의 구조적 단백질에 관여되는 단백질을 인코딩한다. 바이러스 복제 동안 이들은 세포 단백질 함량의 30-40%만큼 많이 나타낼 수 있다 (Garnier, 1994; Ginsberg, 1984).
전사체의 L1 시리즈는 13.6K, 52K, 및 PIIIa 단백질에 대하여 인코딩한다. 이들 단백질 모두는 바이러스 어셈블리 및 입자 생산에 관여된다. L1 유전자는 게놈 DNA 복제가 아닌 성공적인 바이러스 어셈블리에 필요하다
전사체의 L2 시리즈는 펜톤 염기, pVII, V, pX 단백질에 대하여 인코딩한다. 이들은 바이러스 캡시드의 구조적 일부를 형성하고 입자가 정확하게 어셈블리하는데 필요하다. 펜톤 염기는 감염 동안 세포 표면에의 바이러스 부착에 중요한 RGD 모티프를 함유한다. L2 유전자는 게놈 DNA 복제가 아닌 성공적인 바이러스 어셈블리에 필요하다
전사체의 L3 시리즈는 pVI, 헥손, 및 프로테아제 단백질에 대하여 인코딩한다. 헥손 단백질은 바이러스 캡시드의 주요 성분이고 혈청형 사이 항원성으로 다양하다. 프로테아제 단백질은 세포 진입 및 바이러스 캡시드 성숙에 관여된다. L3 유전자는 게놈 DNA 복제가 아닌 성공적인 바이러스 어셈블리에 필요하다
전사체의 L4 시리즈는 100K, 33K, 22K, pVII 단백질을 인코딩한다. 이들 단백질은 기능의 범위에서 관여된다. 100K 단백질은 바이러스 헥손 어셈블리 및 핵 도입의 도움 모두에서 관여되고 뿐만 아니라 세포 mRNA 번역의 cap-독립적인 번역으로의 이동에 역할을 할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 100K 단백질은 바이러스 게놈 내에서부터 보다는 세포 내에서 트랜스로 제공될 수 있다. 22K 단백질은 바이러스 캡시드화에 관여된다. L4 유전자는 게놈 DNA 복제가 아닌 성공적인 바이러스 어셈블리에 필요하다. 그러나, 100K 단백질은 트리파타이트 리더 (TPL) 서열을 함유하는 그들 전사체를 향해 세포 단백질 번역 이동에 도움을 줄 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 일 구현예에서, 100K 단백질의 발현은 MLP에 의해 제어될 수 있다. 100K 단백질은 일 구현예에서 MLP의 제어 하에서가 아닌 바이러스 게놈에서 또 다른 위치로 이전될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 100K 단백질은 별도 바이러스로 이전될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 100K 단백질은 세포의 염색체로 이전될 수 있거나 DNA 형질감염 또는 전기천공에 의해 트랜스로 제공할 수 있다.
L5는 섬유 유전자를 인코딩한다. 섬유는 세포 표면에의 부착에서 그리고 바이러스 세포 감염 매개에서 관여된 바이러스 구조적 단백질이다. 섬유 단백질은 바이러스 입자 형성에 대하여 상당한 과잉의 이의 요건으로 생산된다. 본 발명의 구현예는 이들이 바이러스 복제 동안 생산된 가장 풍부한 단백질의 일부임에 따라 섬유 또는 헥손 (L3) 단백질 어느 한쪽의 최소 하나를 침묵화시킬 수 있다. L5 유전자는 게놈 DNA 복제가 아닌 성공적인 바이러스 어셈블리에 필요하다
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 또 다른 포유동물 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 생산하기 위해 세포에서 아데노바이러스가 포장될 수 있도록 충분한 아데노바이러스 후기 유전자를 포함한다. 바이러스 게놈은 주요 후기 프로모터로부터 생성된 적어도 하나의 후기 전사체를 함유할 것이다. 일부 단백질은 트랜스로 제거 및 제공될 수 있고 기타는 숙주 세포 염색체에 이전될 수 있다.
야생형 아데노바이러스 게놈에서, 단일 주요 후기 프로모터 (MLP)는 아데노바이러스 후기 전사체, L1-L5의 평행한 전사의 촉진을 책임진다 (도 1). 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 또한 MLP를 포함한다. MLP는 이들 후기 전사체의 5'-말단에 위치한다.
다중 mRNAs는 3'-스플라이스 및 폴리(A) 부위의 차별적인 사용을 통해 후기 전사체로부터 생산된다. 이들 전사체의 모두는 트리파타이트 리더 (TPL) 서열을 함유한다.
도 2는 주요 후기 프로모터의 주석을 단 서열을 도시한다. 프로모터에서 핵심 특징은 수많은 전사 인자 결합 부위를 포함한다. 이것은 CAAT 박스, UPE 박스, TATA 박스, MAZ/SP1 결합 부위, 전사의 +1 위치, 및 INR 요소, 그리고 R1 영역, DE1 및 DE2 하위-영역을 함유하는 향상제 영역을 포함한다. 이들 특징은 주요 후기 프로모터 활성에 대하여 가변 정도로 중요한 것으로 밝혀졌다. 변형 또는 결실되면 프로모터 활성을 상당히 감소시킨다고 알려진 핵심 특징은 TATA 박스, INR 요소, R 영역 및 DE1 및 DE2 영역이다. TATA 박스는 가장 중요한 단일 특성으로 간주되고, 전사 개시는 TATA 서열 자체의 마지막 염기 후 28번째 염기쌍에서 발생한다.
야생형 Ad5 MLP의 뉴클레오타이드 서열은 아래 제공된다:
cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaagggggtgggggcgcgttcgtcctca (서열번호: 1)
TATA 박스는 상기 서열에서 밑줄치고 (진하게) 최종 염기는 전사 개시의 위치 (즉 +1 위치)를 나타낸다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터에서, MLP는 하나 이상의 리프레서 요소를 포함한다. 리프레서 요소(들)은 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 조절 또는 제어할 수 있다. 바람직하게는, 리프레서 요소(들)은 하류 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 억압할 수 있다.
하나 이상의 리프레서 요소는 MLP에서 존재할 수 있다. 바람직하게는, 1, 2, 3 또는 4 리프레서 요소; 더욱 바람직하게는 1 또는 2가 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 (바람직하게는 하나의) 리프레서 요소는 MLP의 TATA 박스의 하류에 위치한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 (바람직하게는 하나의) 리프레서 요소는 MLP의 TATA 박스의 상류에 위치한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 (바람직하게는 하나의) 리프레서 요소는 MLP의 TATA 박스의 상류에 위치하고 하나 이상의 (바람직하게는 하나의) 리프레서 요소는 MLP의 TATA 박스의 하류에 위치한다.
바람직하게는, 하나 이상의 리프레서 요소 모두는 +1 전사 출발 부위의 상류에 배치된다. 더욱 바람직하게는, 하나 이상의 리프레서 요소는 MLP TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이 삽입된다. 더더욱 바람직하게는, 하나 이상의 리프레서 요소의 출발은 TATA 박스의 하류에 27개 뉴클레오타이드 미만, 더욱 바람직하게는 20개 뉴클레오타이드 미만, 및 더더욱 바람직하게는 10개 뉴클레오타이드 미만 배치된다.
리프레서는 DNA 결합 단백질이다. 리프레서는 어느 한쪽으로 DNA에 결합할 것이고 직접적으로 전사 개시에 필요한 전사 인자의 동원을 억제할 것이거나, 리프레서는 전사 개시에 필요한 전사 인자를 결합으로부터 예방하는 DNA에서 핵심 풋프린트 복사로 전사의 개시를 입체적으로 방해할 것이다. 리프레서는 어느 한쪽으로 이의 DNA 결합을 가능하게 하거나, 예방하는 리프레서 단백질에서 형태적 이동을 야기시키는 소분자에 의해 조절될 수 있다. 리프레서는 활성제가 아니다.
리프레서에 의해 조절된 프로모터는 전형적으로 생물 또는 비생물 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도된다.
본 발명의 맥락에서 리프레서로서 사용될 수 있는 단백질의 예는 테트라사이클린 리프레서, 락토스 리프레서, 엑디손 리프레서, 랫트 글루코코르티코이드 수용체, 인간 에스트로겐 수용체, 알코올 탈수소효소 I (alcA), 메탈로티오네인 (금속 이온을 결합 및 격리시키는 단백질), 살리실산, 에틸렌 및 벤조티아디아졸 (BTH)를 포함한다.
바람직하게는, 리프레서는 테트라사이클린 리프레서, 락토스 리프레서 또는 엑디손 리프레서이다. 가장 바람직하게는, 리프레서는 Tet 리프레서 단백질 (TetR)이다.
TetR 결합 부위는 야생형 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, TetR 결합 부위는 소수의 서열 변화 편입에 의해 하나 이상의 개선에 적용되었다. 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있는 바람직한 버전은 하기 서열을 갖는다:
tccctatcagtgatagaga (서열번호: 2)
TetR 단백질 또는 TetR 단백질의 유도체를 결합시키는 리프레서 요소의 대안적인 버전은 또한 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있고 다만 TetR 리프레서 단백질은 사용된 TetR 결합 서열 변이체에 결합한다. 일부 리프레서/결합 부위 변이체는 서로에 대하여 야생형 친화도보다 더 많이 가질 것이고; 이들은 본 발명의 구현예에서 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에서, TetR 단백질의 DNA 서열은 하기이다:
Atgtcgcgcctggacaaaagcaaagtgattaactcagcgctggaactgttgaatgaggtgggaattgaaggactcactactcgcaagctggcacagaagctgggcgtcgagcagccaacgctgtactggcatgtgaagaataaacgggcgctcctagacgcgcttgccatcgaaatgctggaccgccatcacacccacttttgccccctggagggcgaatcctggcaagattttctgcggaacaatgcaaagtcgttccggtgcgctctgctgtcccaccgcgatggcgcaaaagtgcacctgggcactcggcccaccgagaaacaatacgaaaccctggaaaaccaactggctttcctttgccaacagggattttcactggagaatgccctgtacgcactatccgcggtcggccactttaccctgggatgcgtcctcgaagatcaggagcaccaagtcgccaaggaggaaagagaaactcctaccactgactcaatgcctccgctcctgagacaagccatcgagctgttcgaccaccagggtgctgaacctgcatttctgttcgggcttgaactgattatctgcggcctggagaaacagttgaagtgcgagtcgggatcctag (서열번호: 3)
또는 거기에 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 그리고 TetR 단백질에 대하여 코딩하는 서열.
본 발명의 일 구현예에서, TetR 단백질의 아미노산 서열은 하기이다:
MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGS (서열번호: 4)
또는 거기에 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 그리고 TetR 단백질을 인코딩하는 서열.
TetR이 리프레서 요소 (예를 들면 리프레서 결합 부위)에 결합되는 경우, 전사의 단단한 억제가 수득된다. 그러나, 독시사이클린의 존재 하에서, 억제는 경감되고, 따라서 연관된 프로모터가 전체 전사 활성을 되찾게 한다. 독시사이클린은 테트라사이클린보다 바람직하다.
리프레서 요소는 MLP 서열의 변형에 의해 MLP 속에 도입될 수 있다. 리프레서 요소는 MLP 서열 속에 리프레서 요소의 삽입에 의해; 리프레서 요소 서열을 창출하기 위해 MLP 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환에 의해; 또는 신규한 서열의 삽입/결실의 조합에 의해 도입될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, TATA 박스와 MLP의 DNA 전사의 +1 위치 사이 거리는 유지되지만 (+/- 5%), 리프레서 결합 부위는 둘 사이 삽입된다. 이 영역 내에서, MAX/SP1 결합 부위가 있다. 이 부위는 MLP 발현에 근본적이지 않고 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 대체될 수 있다. 도 3은 TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이 영역이 테트라사이클린 리프레서 단백질 (TetR)에 대한 결합 부위로 대체된 본 발명의 구현예를 도시한다.
일부 아데노바이러스 벡터에서, MLP 서열의 것에 반대편인 DNA 가닥의 섹션은 (바이러스 DNA 폴리머라제를 인코딩하는) 초기 바이러스 단백질 E2B를 인코딩한다. 그들의 게놈을 복제하는 그러한 아데노바이러스 벡터의 능력을 유지시키기 위해, MLP 서열에 실시되는 변형이 E2B 단백질의 생산, 안정성 또는 효능에 상당히 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 확보하는 것이 필요하다.
아데노바이러스 혈청형 5에서, MLP는 E2B 폴리머라제 엑손 2의 중간에서 거주한다. 이와 같이, 본 발명의 일 구현예에서, MLP 속에 리프레서 요소 (예를 들면 리프레서 결합 부위)의 삽입은 대향하는 DNA 가닥에서 DNA 폴리머라제 코딩 서열의 코딩 프레임을 유지시켜야 하거나 MLP 서열에 실시되는 변형이 E2B 단백질의 생산, 안정성 또는 효능에 상당히 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 확보해야 한다.
바람직하게는, MLP 서열에 대한 일부 또는 모든 변화는 침묵의 변화이다, 즉 이들은 E2B 코돈을 변화시키지 않는다. 다른 구현예에서, MPL에 대한 일부 또는 모든 변화는 보존적 변화이다, 즉 하나 이상의 E2B 코돈은 이들이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산을 인코딩하도록 변화된다.
유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에서 정의된다. 이들 계열은 염기성 측쇄 (예를 들면 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들면 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄 (예를 들면 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 무극성 측쇄 (예를 들면 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄 (예를 들면 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들면 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 가진 아미노산을 포함한다.
따라서, E2B 단백질 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 같은 측 사슬 계열로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고 변경된 E2B 단백질은 기능 또는 활성에서 임의의 상당한 손실에 대하여 시험될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, TetR 결합 부위는 TATA 박스와 +1 위치 사이 MLP 속에 배치된다. 도 2는 DNA 폴리머라제의 코딩 서열을 도시한다. MLP TATA 박스와 +1 위치 사이 영역에서, DNA 폴리머라제의 아미노산 코딩 서열은 ENERAPTP (서열번호: 18)이다. 도 3은 이 영역 속에 TetR 결합 부위의 전략적 배치가 서열 ESLSLIGT (서열번호: 5)를 창출한다는 것을 도시한다. 이 서열은 DNA 폴리머라제의 해독틀을 유지하고 뿐만 아니라 유사한 측쇄를 가진 것에 대하여 교환되기 위해 야생형 아미노산의 60% 초과를 허용한다. 중요하게는, TetR 결합 부위의 서열은 비-기능성 DNA 폴리머라제를 유사하게 창출할 부정확하게 배치되면 대향하는 DNA 가닥에서 정지 코돈을 함유한다.
본 발명의 일 구현예에서, 따라서, TetR 결합 부위의 반대편 가닥의 서열은 ESLSLIGT (서열번호: 5)이거나 상기를 인코딩하는 서열을 포함한다. 바람직하게는, DNA 폴리머라제는 서열번호: 5의 서열을 포함한다.
생산된 E2B mRNA 또는 단백질의 양에서 일부 손실은, E2B 단백질의 아미노산 서열에서 일부 변화할 수 있는 것처럼, 용인될 수 있다. 숙련가는 최초 비변형된 바이러스에 비교하여 표준 조건 하에서 변형된 아데노바이러스 벡터의 바이러스 역가 평가에 의해 단순히 복제하기 위한 바이러스의 능력에 관하여 E2B 유전자 서열에서 변화의 효과를 쉽게 평가할 수 있을 것이다. 25% 미만, 바람직하게는 10% 미만 및 더욱 바람직하게는 1% 미만만큼 바이러스 역가를 감소시키는 변화는 E2B 단백질의 생산, 안정성 또는 효능에 상당히 부정적으로 영향을 주지 않는 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 다른 아데노바이러스 벡터에서, E2B 유전자는 MLP에서 변형이 E2B 단백질의 생산에 영향을 주지 않도록 아데노바이러스 벡터에서 다른 곳에 배치된다.
TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이 하나의 TetR 결합 부위를 함유하는 변형된 MLP의 예는 아래 제공된다:
Cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaaggtccctatcagtgatagagactca (서열번호: 6)
TATA 박스는 밑줄치고 TetR 결합 부위는 진하게 표시된다.
TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이 하나의 TetR 결합 부위 그리고 UPE 요소와 TATA 박스 사이 TATA 박스의 상류에 제2 부위를 함유하는 변형된 MLP의 예는 아래 표시된다:
Cgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgactccctatcagtgatagagaactataaaaggtccctatcagtgatagagactca (서열번호: 7)
TATA 박스는 밑줄치고 TetR 결합 부위는 진하게 표시된다.
리프레서 요소(들)에 결합하는 리프레서는 (세포에) 외인성으로 응용될 수 있거나; 세포 또는 미토콘드리아 게놈 (또는 세포 내에서 플라스미드 또는 벡터) 내에서 인코딩될 수 있거나; 아데노바이러스 게놈 내에서 인코딩될 수 있다. 바람직하게는, 리프레서는 아데노바이러스 게놈 내에서 유전자에 의해 인코딩된다.
더욱 바람직하게는, 리프레서 유전자는 하나 이상의 바이러스 초기 발현 영역 또는 후기 유전자 발현 영역 내에서 위치한다. 더더욱 바람직하게는, 리프레서 유전자는 바이러스 후기 영역에서 위치한다. 더더욱 바람직하게는 리프레서는 리프레서에 의해 조절되는 MLP로부터 전사되는 후기 전사체에서 위치한다. 시스템은 그것에 의해 자기-억압성이다.
일 구현예에서, 리프레서 단백질을 인코딩하는 유전자는 독립적인 프로모터 (즉 아데노바이러스 주요 초기 프로모터 또는 주요 후기 프로모터가 아닌 프로모터)의 제어 하에 있다. 바람직하게는, 리프레서 단백질을 인코딩하는 유전자는 강한 프로모터 (예를 들면 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터)의 제어 하에 있다. 더더욱 바람직하게는, 리프레서 단백질은 결합하는 MLP의 제어 하에 있다.
바람직하게는, 리프레서 단백질을 인코딩하는 mRNA는 이의 5'-UTR에서 트리파타이트 리더 (TPL) 서열을 포함한다. TPL은 모든 후기, 그러나 초기가 아닌, 바이러스 mRNA에 존재하는 5' 미번역된 서열이다. TPL은 세포질에서 mRNA 수송 및 축적을 촉진시키고 세포 단백질에 대한 선호에서 후기 바이러스 단백질의 선택적 번역을 책임진다.
Ad5 리더 서열은 번역후 변형 동안 3 엑손의 스플라이싱에 의해 형성된 201 bp이다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 적어도 하나의 이식유전자를 포함한다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 핵심 기능은 이식유전자 생성물의 생산을 촉진시키는 것이다.
아데노바이러스 감염 동안 mRNAs의 최대 90%는 바이러스 게놈으로부터일 수 있고 이들은 바이러스 출력을 최대화하기 위해 우선적으로 번역될 수 있다. 바이러스 특이적 mRNA의 선택적 생산은 바이러스 DNA 폴리머라제의 증폭 및 후기 mRNA 전사체의 생산을 향한 이동의 조합으로 실시된다. 바이러스 DNA 게놈의 복제는 전사가 발생하도록 DNA 템플레이트의 수천의 더 많은 카피를 허용한다. 후기 전사체의 5' 말단에서 트리-파타이트 리더의 존재와 커플링된, 이 활성은 후기 mRNA의 선택적 발현을 허용한다. 이것은 트리파타이트 리더가, 정상 번역 공정에서 고활성인 반면, cap-독립적인 번역이 세포 내에서 작동되는 경우 또한 선택적으로 번역되기 때문이다. 다중 바이러스 단백질은 이 공정에 관여된다.
바람직하게는, 이식유전자는 아데노바이러스 초기 영역 중 하나 내에서 삽입된다. 더욱 바람직하게는, 이식유전자는 아데노바이러스 E1 영역 내에서 삽입된다. 더더욱 바람직하게는, E1A 및 E1B 유전자는 아데노바이러스 게놈으로부터 결실되고 이식유전자는 이 영역에 삽입된다. 바람직하게는, 이식유전자는 이의 5'UTR에서 TPL 서열을 포함한다. 이는 이식유전자가 cap-독립적인 방식으로 발현된다.
이식유전자는 임의의 원하는 DNA 서열일 수 있다. 1 초과 이식유전자 (예를 들면 2, 3, 4, 또는 5 이식유전자)가 있을 수 있다. 이식유전자(들)의 DNA 서열은 코딩 또는 비-코딩 서열일 수 있다. 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 바람직하게는, DNA 서열은 폴리펩타이드, 더욱 바람직하게는 치료적 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 경우에, 이식유전자는 다중 단백질을 인코딩할 것이다. 바람직하게는, 이식유전자는 하나 이상의 전사 및/또는 번역 제어 요소 (예를 들면 향상제, 프로모터, 종결자 서열, 등)과 작동가능하게 연관된다.
이식유전자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 인간 유전자 또는 이의 변형된 형태일 수 있거나 인간 세포를 감염시키는 바이러스로부터 단백질을 인코딩한다.
바람직한 치료적 폴리펩타이드의 예는 항체, CAR-T 분자, scFV, BiTEs, DARPins 및 T-세포 수용체 그리고 인간 바이러스 병원체로부터 항원을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), 예를 들면 DRD1이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 면역요법 표적, 예를 들면 CD19, CD40 또는 CD38이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 인간 시력 또는 망막 기능에 관여된 유전자의 기능화 카피, 예를 들면 RPE65 또는 REP이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 인간 혈액 생산에 관여된 유전자의 기능화 카피이거나 혈액 성분, 예를 들면 인자 IX, 또는 베타 및 알파 지중해빈혈 또는 겸상 세포 빈혈에 관여된 것이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 면역 기능에 관여된 유전자의 기능화 카피 예컨대 중증 복합성 면역-결핍 (SCID) 또는 아데노신 데아미나제 결핍 (ADA-SCID)에서의 것이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 세포의 증식을 증가시키는/감소시키는 단백질, 예를 들면 성장 인자 수용체이다. 일부 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 이온 통로 폴리펩타이드이다. 일부 바람직한 구현예에서, 치료적 폴리펩타이드는 면역 관문 분자이다. 바람직하게는, 면역 관문 분자는 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체 상과 (예를 들면 CD27, CD40, OX40, GITR 또는 CD137)의 구성원 또는 B7-CD28 상과 (예를 들면 CD28, CTLA4 또는 ICOS)의 구성원이다. 일부 구현예에서 인코딩된 폴리펩타이드는 면역 관문 분자는 PD1, PDL1, CTLA4, Lag1 또는 GITR이다.
일부 구현예에서 이식유전자는 바이러스 폴리펩타이드 또는 이의 다중 예컨대 항원성으로 중요한 CMV 오량체를 인코딩한다.
다른 구현예에서, 이식유전자 또는 이식유전자들은 아데노바이러스 이외의 바이러스의 구조 또는 복제에 관여된 단백질을 인코딩할 것이다.
대부분의 백신은 하기 바이러스 단백질의 집합으로 구성된다: 어느 한쪽 바이러스-유사 입자 (VLP), 불활성화된 바이러스 입자 또는 생약독화 바이러스. VLP는 전적으로 단백질로 전형적으로 구성되는 이점을 갖고 그 자체로 최초 바이러스의 잠재적 병원성을 갖지 않는다. 이들은 또한 그들의 구조가 최초 바이러스와 동일하고 불활성화 공정에 의해 변경되지 않는 불활성화된 바이러스 입자보다 이점을 갖는다. 수많은 VLP는 HPV, 간염 B 및 말라리아 백신 RTSS를 포함하는 성공적인 백신인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 포유동물 시스템에서 생산은 종종 VLP를 상업적으로-생존가능한 생성물로 만들도록 요구된 것보다 더 낮다. 이의 예는 간염 B 백신 VLP가 효모에서 제조되는 관찰이다. 포유동물 세포에서 다량으로 VLP를 생성하기 위한 시스템은 따라서 적절한 폴딩 및 당화를 확보하는데 바람직하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이식유전자는 VLP를 생산하기 위해 세포에서, 또는 외부에서 어셈블리할 단백질을 인코딩할 것이다. 이들 VLP는 유용한 백신 생성물을 만들 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이식유전자는 파보비리다에 (예를 들면 아데노-관련 바이러스), 레트로비리다에 (예를 들면 HIV), 플라비비리다에 (예를 들면 간염 C 바이러스) 및 오토믹소비리다에 (예를 들면 인플루엔자 바이러스), 및/또는 칼리시비리다에 (예를 들면 노로바이러스)로부터 단백질을 인코딩할 것이다. 바람직한 구현예에서, 이식유전자는 노로바이러스 VP1 또는 간염 B HBsAG를 인코딩할 것이다.
재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)는 많은 방식에서 재조합 단백질 생산 또는 유전자 요법 응용에 대하여 세포에 이식유전자의 전달을 위한 이상적 벡터이다. 이들은 광범위의 숙주를 감염시킬 수 있고, 숙주 세포에 최소 독성을 발휘하면서, 강력한 및 지속된 이식유전자 발현 프로파일을 유도할 수 있다. AAV는 이의 천연 수명 주기의 완료를 위해 헬퍼 기능을 요구하는 헬퍼-의존적 DNA 파보바이러스이다. 이들 헬퍼 기능은 백시니아 바이러스, 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스로 공-감염을 포함하는 많은 제제에 의해 제공될 수 있다. 헬퍼 제제 및 기능의 부재 하에서, AAV 감염은 AAV 바이러스 게놈이 숙주 세포 염색체 속에 통합되는 잠재적 상에 진입한다. 후속으로, 헬퍼 바이러스의 존재 하에서, 통합된 AAV 프로바이러스는 구조되어 바이러스 복제, 사전형성된 단백질 캡시드에서 패키징 및 감염성 비리온의 생산을 허용한다.
DNA 전달을 위한 생명공학으로서 AAV 사용에 대한 현행 접근법에서, AAV는 표적 세포 속에 전달을 위하여 관심의 이식유전자로 바이러스 rep 및 cap 코딩 서열 영역을 대체하도록 조작된다. 바이러스 캡시드의 복제, 통합 및 발현에 필요한 rep 및 cap 유전자 서열은 숙주 게놈으로부터 이들 유전자를 안정적으로 발현시키도록 조작되는 DNA 발현 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 세포주에 의해 트랜스로 공급된다.
rAAV 생산의 전통적 방법은 2개의 DNA 벡터의 공-형질감염을 포함한다: 1) rAAV 서열을 함유하는 플라스미드; 및 2) AAV rep 및 cap 서열을 함유하는 플라스미드. 후속으로, 헬퍼 기능은 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스로 감염에 의해 트랜스로 제공될 수 있다. 효율적인 rAAV 생산에 필요한 rep 단백질의 양은 불확실하다. Rep78/68용 번역 개시 코돈의 감쇠가 높은 수준의 rAAV 생산을 초래한다는 것이 보고된 반면 (Li 등, 1997 J. Virol. 71:5236-5243), 기타는 AAV rep의 전사를 책임지는 p5 프로모터의 강한 바이러스 프로모터, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 긴 말단 반복부 (HIV LTR)로 교환이 rAAV의 높은 수준의 생산을 초래하였다는 것이 보고되었다 (참고 US 5,658,776). 논의된 방법이, rAAV를 생산하기 위해, 2개 플라스미드의 공-형질감염 및 헬퍼 바이러스 예를 들면 아데노바이러스로 공-감염을 요구하였기 때문에, 재현성 및 배치 변동은 상당히 문제있다. 추가적으로, rAAV는 하류 및 산업적 응용을 위하여 헬퍼 제제 (예를 들면 아데노바이러스)로부터 정제되도록 요구된다. 최종 제제는 또한 이것이 그와 같은 AAV 생성물에 대한 인간 반응에 영향을 줄 수 있기 때문에 헬퍼 바이러스 단백질, 특히 헬퍼 바이러스로부터 항원인 것이 없어야 한다.
rAAV의 생산에 필요한 제2 방법은 생산자 세포주 속에 3개의 DNA 플라스미드 벡터의 공-형질감염을 포함한다. 시스 플라스미드는 하기를 함유한다: 1) rAAV ITR 및 이식유전자; 2) AAV rep 및 cap을 인코딩하는 트랜스 DNA 플라스미드; 및 3) 헬퍼 바이러스 (예를 들면 아데노바이러스)로부터 서열을 인코딩하는 트랜스 DNA 플라스미드. 이 방법이 헬퍼 바이러스 입자로부터 오염 없음의 이점을 갖는 한편, 상당히 큰 크기로 3개의 DNA 플라스미드의 공-형질감염은 불량한 재현성 및 rAAV 바이러스 역가 수율에서 실질적인 저하를 초래한다.
제3 방법은 rep 및 cap 유전자 서열이 숙주 세포 게놈 속에 통합되는 rAAV 패키징 세포주의 작제물을 포함한다. 전형적으로, rAAV는 AAV ITR 및 이식유전자를 인코딩하는 DNA 시스 플라스미드의 형질감염, 이어서 헬퍼 제제의 도입 (예를 들면 헬퍼 아데노바이러스로 감염)에 의해 이 방법으로부터 생산된다. 대안적으로, 시스 DNA AAV ITRS 및 이식유전자 (예를 들면 하이브리드 Ad/AAV)를 운반하는 헬퍼 바이러스는 rAAV의 생산을 위하여 생산자 세포주 속에 도입될 수 있다 (참고 US 5,856,152).
이 방법의 약점은 AAV rep 및 cap이 안정적으로 통합되고 충분한 양으로 발현되는 생산자 세포주의 복합 조작을 요구하는 것이다. 추가적으로, 시스 DNA 서열의 전달을 위한 헬퍼 바이러스 (예를 들면 AAV ITRS 및 이식유전자)의 사용은 헬퍼 바이러스로부터 오염을 초래하고 하류 정제를 요구한다. 게다가, 세포주에서 AAV rep 단백질의 독성은 보고되었고 구성적 발현은 항-증식 및 세포 사망을 초래한다 (Yang 등, 1994 J. Virol. 68(8), 4847-4856). 추가적으로, Rep 단백질은 또한 이의 자체 전사의 억압을 위하여 음성 피드백 루프를 도입한다고 보고되었다 (Beaton 등, 1989 J. Virol. 63,450-4454). 발현된 Rep에 패키징 세포주의 변형에 의해 AAV rep 독성을 회피하기 위한 다른 시도는 유도성 전사 시스템을 사용하여 왔다 (참고 US 5,837,484 및 Ogasawara 등, 1999 J. Virol. 80, 2477-2480). 전형적으로, 이들 안정한 시스템은 이들을 상업적으로 확장가능한 시스템으로 만들기 위한 AAV의 요구된 수준을 산출하는데 실패하였다.
rAAV의 제4 생산 방법은 AAV rep 및 cap 유전자의 전달을 위한 헬퍼 제제 (예를 들면 헬퍼 아데노바이러스)의 사용을 포함한다. 이 방법에서, 재조합 아데노바이러스는 헬퍼 바이러스의 게놈 속에 (전형적으로, 재조합 아데노바이러스의 E1 영역에서) 삽입되는 rep 및 cap 유전자를 포함한다. 이들은 시스 AAV DNA 서열 (예를 들면 AAV ITR 및 이식유전자)를 함유할 수 있는 패키징 세포주 속에 감염을 위하여 후속으로 사용되거나 시스 DNA 플라스미드는 형질감염의 방법에 의해 도입될 수 있다 (Zhang 등, 2001 Gene. Ther. 8(9), 704-712). 이 방법의 상당한 약점은 rAAV 생산의 전통적 방법의 것과 유사하고, 여기에서 어려운 및 고비용의 정제 단계는 헬퍼 바이러스로부터 오염 및 최종 생성물로부터 임의의 단백질 (특히 구조적 단백질)의 제거에 필요하다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터에서 하나 이상의 이식유전자는 AAV Rep-Cap 폴리펩타이드를 인코딩한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 이식유전자는 AAV 게놈을 인코딩한다. 바람직하게는, AAV 게놈은 개재 서열을 가진 AAV로부터 5' 및 3' ITR 서열을 포함하거나 상기로 이루어진다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 이식유전자는 관심의 서열을 측접하는 ITR를 가진 AAV 게놈 및 AAV로부터 Rep-Cap 폴리펩타이드를 인코딩한다. Rep 또는 Cap 또는 하위-전사체 또는 이의 영역은 본 발명의 구현예에서 개별적으로 인코딩될 수 있다.
아데노바이러스 바이러스 벡터는 추가적으로, 비제한적으로, 리포터 유전자, 제한 효소 부위, 프로모터, 폴리-아데닐화 신호, 비-번역된 영역, 향상제 및 절연제로 이루어진 군으로부터 선택된, 하나 이상의 다른 요소를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 추가적으로 하나 이상의 다중-제한 효소 부위를 포함한다. 이들 부위는 가장 바람직하게는 유형 II일 것이고 어느 한쪽으로 길이가 6개 또는 8개 염기쌍일 것이다.
본 발명은 또한, 하나 이상의 생리학적으로-허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 아데노바이러스 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 바이러스 입자와 함께 사용을 위한 적당한 생리학적으로-허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 예는 당해 기술에 공지되어 있다. 바람직하게는, 조성물은 수성 완충 용액에서 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 아데노바이러스 입자를 포함한다. 바람직하게는, 수성 완충 용액은 MgCl2 및/또는 글리세롤을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 키트를 제공하고, 여기서 상기 키트는 추가적으로 (i) 바이러스 벡터가 세포를 감염시키게 하고 이의 게놈을 복제시키게 하는 세포주, 여기서 상기 세포주는 바이러스 벡터의 MLP를 억압시킬 것임 및 (ii) 바이러스 벡터의 작제를 돕기 위한 하나 이상의 DNA 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적 성분을 포함한다.
바람직하게는, 키트는 이식유전자의 삽입용 부위를 함유하는 바이러스 벡터를 함유하는 플라스미드를 포함할 것이다. 더욱 바람직하게는 2개의 플라스미드가 있다: 바이러스 벡터의 쉬운 조작을 허용하기 위한 셔틀 플라스미드 및 바이러스 벡터 플라스미드. 셔틀 플라스미드는 어느 한쪽으로 상동성 재조합이 최종 바이러스 벡터를 창출하도록 하기 위해 바이러스 벡터에 상동성의 영역, 또는 셔틀 플라스미드로부터 바이러스 벡터 플라스미드까지 DNA의 셔틀링을 허용하기 위해 바이러스 벡터와 양립가능한 제한 부위를 함유할 것이다.
키트는 또한 바이러스 입자의 정제용 물질 예컨대 바이러스 입자의 정제 및 밀도 밴딩에 관여된 것들, 예를 들면 하나 이상의 원심분리기 튜브, 벤조나제, 투석 버퍼, 투석 카셋트를 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 바이러스 벡터 (바람직하게는 아데노바이러스 벡터) 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다:
Aggccagcacgaaggaggctaagtgggaggggtagcggtcgttgtccactagggggtccactcgctccagggtgtgaagacacatgtcgccctcttcggcatcaaggaaggtgattggtttgtaggtgtaggccacgtgaccgggtgttcctgaaggggggctataaaaggtccctatcagtgatagagactcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctgaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcatccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagcttggtggcaaacgacccgtagagggcg (서열번호: 8)
또는 거기에 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열.
일부 구현예에서, 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열 또는 거기에 동일성을 갖는 서열은 서열 tccctatcagtgatagaga (서열번호: 2)를 포함한다 (즉 리프레서 요소는 변경되지 않는다).
다른 구현예에서, 상기 언급된 뉴클레오타이드 서열 또는 거기에 동일성을 갖는 서열은 상기 진하게 표시된 것에 상이한 리프레서 요소를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 포유동물 세포를 제공한다. 세포는 단리된 세포일 수 있고, 예를 들면 이들은 살아있는 동물에서 존재하지 않는다. 포유동물 세포의 예는 인간, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이, 토끼, 당나귀, 말, 양, 소 및 유인원에서 임의의 장기 또는 조직으로부터의 것을 포함한다. 바람직하게는, 세포는 인간 세포이다. 세포는 일차 또는 불멸화 세포일 수 있다. 바람직한 인간 세포는 HEK293, HEK293T, HEK293A, PerC6, 911, HeLa 및 COS 세포를 포함한다.
HEK-293 세포는 E1A 및 E1B 단백질을 함유하도록 변형되었고 이는 E1A 및 E1B 영역의 결실을 갖는 바이러스의 창출이 트랜스-상보성에 의해 이 세포주에서 성장되도록 한다. 유사하게, PerC6 및 911 세포는 유사한 변형을 함유하고 또한 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 인간 세포는 HEK293, HEK293T, HEK293A, PerC6 또는 911이다. 다른 바람직한 세포는 CHO 및 VERO 세포를 포함한다.
아데노바이러스 벡터는 몇 개의 방법에 의해 생산될 수 있고, 이의 가장 흔한 것은, 박테리아 및 효모를 포함하는, 어느 한쪽 포유동물 세포 또는 미생물에서 아데노바이러스 플라스미드의 상동성 재조합을 포함한다. 2개의 플라스미드, 일명 셔틀 플라스미드 및 아데노바이러스 (또한 일명 백본) 플라스미드는 두 플라스미드로부터 서열을 편입시키는 DNA 분자 속에 재조합된다. 이 DNA 분자는 그 다음 포유동물 패키징 세포주 속에 형질감염되어 아데노바이러스 입자를 생성할 수 있다.
MLP가 TetR 단백질에 의해 조절되는 본 발명의 구현예에서, 바이러스는 리프레서 단백질을 억제시킬 그리고 그것에 의해 MLP 프로모터에서 리프레서 요소/부위에 결합을 예방할 독시사이클린의 존재 하에서 회수된다. 이는 높은 역가로 아데노바이러스의 생산을 허용해야 한다.
단백질 생산 또는 바이러스 단백질의 발현을 위하여, 독시사이클린의 부재 하에서, 아데노바이러스 (예를 들면 HEK-293 세포)에 의해 감염될 수 있는 임의의 세포주 속에 바이러스로 감염은 발현된 TetR 리프레서 단백질이 MLP 리프레서 요소에 결합하게 할 것이고 그것에 의해 바이러스 후기 유전자 발현의 생산을 떨어뜨리고 바이러스 입자 생산을 예방한다.
TetR 단백질은, 어느 한쪽 일시적으로 또는 안정적으로, 감염된 세포주 내에서 제공될 수 있거나, 바이러스 자체 내에서 인코딩될 수 있다. MLP의 제어 하에서 그 다음 각각의 게놈 복제가 있다면, MLP의 활성화가 피드백 루프를 제공할 것이고, 추가로 임의의 잠재적 신규 바이러스 후기 유전자 발현을 떨어뜨린다.
추가 구현예에서, 본 발명은 변형된 포유동물 세포의 생산 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
(a) 포유동물 세포를 본 발명의 아데노바이러스 벡터로 감염시키는 단계,
그것에 의하여 상기 포유동물 세포는 그 다음 아데노바이러스 벡터를 포함한다.
더욱 추가 구현예에서, 본 발명은 이식유전자 생성물의 생산 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 포유동물 세포를 본 발명의 아데노바이러스 벡터로 감염시키는 단계;
(b) 이식유전자가 발현되도록 하는 조건 하에 배양 배지에서 감염된 포유동물 세포를 배양시키는 단계; 및
(c) 세포로부터 또는 세포 배양 배지로부터 이식유전자 생성물을 단리 또는 정제시키는 단계.
감염된 포유동물 세포의 배양을 위한 적당한 조건은 당해 기술에 공지되어 있다.
이식유전자 생성물 발현 수준은 100kDa L4/eIF48 단백질의 공-발현에 의해 개선될 수 있다. 게다가, 리프레서 단백질은 리프레서로서 활성일 필요가 있다 (예를 들면 독시사이클린은 리프레서 단백질이 TetR이면 존재하지 않는다).
본 발명의 방법은 바람직하게는 시험관내 또는 생체외 수행된다.
본 명세서에 제시된 각각의 참고문헌의 개시내용은 이의 전체가 참고로 본 명세서에 구체적으로 편입된다.
도 1은 아데노바이러스 게놈의 개략도를 도시하고 주요 초기 및 후기 발현 영역을 도시한다. MLP는 또한 도시된다. 스플라이스 패턴은 점선으로 표시된다.
도 2는 야생형 아데노바이러스 혈청형 5의 주요 후기 프로모터 영역의 주석을 단 서열 (서열번호: 12-14)를 도시한다.
도 3은 아데노바이러스 혈청형 5의 변형된 주요 후기 프로모터 영역의 주석을 단 서열 (서열번호: 15-17)을 도시한다.
도 4는 Ad5 리프레서 돌연변이체 주요 후기 프로모터로부터 GFP 리포터의 발현을 위하여 작제된 플라스미드 벡터의 개략도를 도시한다.
도 5는 MLP 프로모터로부터 GFP 리포터 유전자를 발현시키는 플라스미드 벡터를 도시한다.
도 6은 TETR 단백질에 의한 리프레서 돌연변이체 MLP의 전사 억압을 도시한다.
도 7은, TETR 단백질을 안정적으로 발현시키는 세포주인, HEK293 T-Rex Flp 세포내 억압에서 MLP 리프레서 Ad5의 예를 도시한다.
도 8은, 구성적 CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터의 제어 하에서, TETR 발현 플라스미드 (pTETR)로 형질감염된 293Ad 세포내 억압에서 MLP 리프레서 Ad5의 예를 도시한다.
도 9는, TETR 단백질을 안정적으로 발현시키는 세포주인, 293 T-Rex Flp 세포에서 억압된 MLP 돌연변이체 Ad5의 바이러스 게놈 복제를 도시한다.
도 10은 저 MOI에서 HEK293 세포의 TET1b 변형된 MLP 변이체 감염이 있는 Ad5를 도시한다. A) HEK293 세포는 MOI 0.1에서 CMV 프로모터의 제어 하에서 그리고 독시사이클린 0.2μg/mL 또는 DMSO 존재 하에서 EGFP를 발현시키는 E1/E3 Ad5 또는 Ad5 TET1b MLP로 형질도입되었다. 형광 현미경검사로 감염후 6일째의 이미지. HEK293 세포는 게이팅된 모집단 (B) 내에서 EGFP 양성 세포의 백분율을 결정하기 위해 유동-세포측정 분석을 위하여 또한 수확되었다. 삼중 생물학적 반복의 평균 ± SD로서 데이터.
도 11은 TET01b 변형된 MLP가 있는 Ad5로부터 EGFP 발현을 도시한다. A) CMV 프로모터로부터 Ad5 TPL을 인코딩하는 EGFP의 플라스미드 발현. 프로모터 없는 플라스미드로부터 또는 Ad5 TPL과 무관하게 CMV 프로모터의 제어 하에서 EGFP를 발현시키는 플라스미드 DNA로 형질감염된 HEK293 세포. 형질감염후 48시간 유세포분석에 의해 결정된 EGFP 발현. B) DMSO 또는 독시사이클린 0.2ug/mL로 처리된 T-Rex Flp 세포에서 CMV 프로모터의 제어 하에서 (Ad5 TPL과 무관하게) EGFP를 발현시키는 MLP TET01b 변형된 Ad5. 감염후 24시간, 48시간 및 72시간 유세포분석에 의한 세포 분석. C) HEK293내 MLP 변형된 Ad5 또는 플라스미드 DNA로부터 CMV 프로모터의 제어 하에서 EGFP 발현. HEK293 세포는, 독시사이클린 또는 DMSO의 존재 하에서, CMV 프로모터의 제어 하에 (Ad5 TPL과 무관하게) EGFP를 발현시키는 MLP 변형된 Ad5 또는 EGFP를 발현시키는 CMV 프로모터 플라스미드로 형질도입에 앞서 TETR을 발현시키는 플라스미드로 형질감염되었다. 세포는 형질도입후 48시간 유세포분석을 위하여 수확되었다. D) DMSO 또는 독시사이클린 0.2μg/mL의 존재 하에서, Ad5 TPL을 인코딩하는 EGFP를 발현시키는 MLP 변형된 Ad5로 형질도입된 pTETR 형질감염된 HEK293 세포의 형광 현미경검사 이미지. 감염후 48시간 이미지. MFI (중앙 형광 강도). 평균 ± SD로서 데이터.
도 12는 HEK293 세포내 TERA-CMV-EGFP 또는 E1/E3 Ad5-CMV-EGFP 감염으로부터 아데노바이러스 구조적 단백질의 웨스턴 블랏 검출을 도시한다. A) TERA 또는 E1/E3 Ad5는 MOI 100 또는 1000에서 HEK293을 형질도입하는데 사용되었다. 바이러스는 세포 용해물 (좌측 블랏) 또는 성장 배지 (우측 블랏)으로부터 수확되었다. B) 독시사이클린의 용량 단계적 확대로 배양된 그리고 MOI 10 또는 MOI 100 (C)에서 TERA 또는 E1/E3 결실된 Ad5로 형질도입된 HEK293 세포로부터 성장 배지의 웨스턴 블랏 분석. 감염후 72시간에서 수확된 그리고 자동화 웨스턴 기계 (Wes Simple Western)으로 항-Ad5 항체를 사용하여 검출된 모든 바이러스 샘플.
도 13은 HEK293 세포내 TERA의 바이러스 복제 및 DNA를 도시한다. A) HEK293 세포는, MOI 1, 10 또는 100에서, CMV EGFP 발현 카셋트를 인코딩하는, TERA 또는 E1/E3 Ad5로 감염되었고, 총 DNA는 QPCR 분석을 위하여 감염후 지시된 시점에서 수확되었다. B) CMV EGFP 발현 카셋트를 인코딩하는, TERA 또는 E1/E3 Ad5는 독시사이클린 0.5μg/mL 또는 DMSO의 존재 하에, MOI 10 또는 100에서 HEK293을 감염시키는데 사용되었다. 총 DNA는 QPCR 분석을 위하여 감염후 지시된 시점에서 수확되었다.
도 14는 HEK293 세포내 TERA로부터 리포터 EGFP 발현을 도시한다. A) HEK293 세포는 또한 CMV 프로모터의 제어 하에서 EGFP를 발현시키는 플라스미드 DNA (분지 PEI를 사용하는 ~7.0x 104 세포당 0.75ug) 또는 E1/E3 Ad5 (MOI 10) 및, (Ad5 TPL과 무관하게) CMV 프로모터로부터 EGFP를 발현시키는 TERA (MOI 10)으로 형질도입되었다. HEK293 세포는 유동 세포측정 분석을 위하여 형질도입후 24시간 및 48시간에서 수확되었다. B) DMSO 또는 독시사이클린 0.5ug/mL의 존재 하에서, CMV 프로모터 하에 EGFP를 발현시키는 TERA로 MOI 100에서 감염된 HEK293 세포. 형질도입후 72시간 세포 용해물로부터 수확된 그리고 자동화 웨스턴 블랏 기계 (Wes Simple Protein)에 의한 항-Ad5 및 항-EGFP 항체를 사용하여 검출된 바이러스.
도 15는 HEK293 세포내 BiTE의 TERA 발현을 도시한다. A) HEK293 세포는 MOI 10에서 (Ad5 TPL과 무관하게) CMV의 제어 하에서 EGFP를 발현시키는 TERA 또는 E1/E3 Ad5로 형질도입되었다. 형질도입후 48시간에서 수확된 그리고 자동화 웨스턴 (Wes Simple Protein)을 사용하여 BiTE 발현을 위해 항-6x His 항체로 (5μL) 탐색된 배양 배지. B) 각각의 샘플로부터 화학발광신호는 추가로 정량화되었고 검출된 피크 및 곡선하 면적에 기초하여 상대 발현 강도를 제공하기 위해 작도되었다. C) 총 DNA는 바이러스 감염된 HEK293 세포로부터 시점 0시간, 24시간, 48시간, 72시간 수확되었고 QPCR로 게놈 정량화되었다. D) BiTE를 발현시키기 위해 조작된 TERA 또는 E1/E3 Ad5로 형질도입된 HEK293 세포로부터 아데노바이러스 단백질의 검출. 형질도입후 48시간에 수확된 그리고 자동화 웨스턴 (Wes Simple Protein)을 사용하여 Ad5 주요 구조적 단백질을 위해 항-Ad5 항체로 (5μL) 탐색된 배양 배지. E) HEK293 세포는 MOI 10에서 CMV 프로모터의 제어 하에서 그리고 Ad5 TPL을 인코딩하는 BiTE를 발현시키는 TERA 또는 플라스미드 DNA (분지 PEI를 사용하여 ~7.0x 104 세포당 0.75μg)으로 형질도입되었다. 형질도입된 세포로부터 성장 배지는 형질도입후 명시된 시점 24시간, 48시간, 및 72시간에서 수확되었고 항-6x His 항체를 사용하여 BiTE 발현을 위해 (5μL) 탐색되었다.
도 16은 TERA가 있는 HEK293 세포내 rAAV 벡터 생산을 도시한다. A) DMSO 또는 독시사이클린 0.5μg/mL의 존재 하에서, HEK293 세포는 rAAV 게놈을 인코딩하는 TERA 또는 E1/E3 Ad5의 MOI 100 또는 500으로 형질도입, AAV ITR에 의해 측접된 CMV-EGFP 발현 카셋트, 또는 삼중 플라스미드 형질감염을 통한 헬퍼가 없는 생산에 앞서 AAV Rep 및 Cap 유전자를 발현시키는 플라스미드로 형질감염되었다. 세포 용해물 및 성장 배지로부터, 총 재조합 바이러스는 형질도입후 72시간 추출되었고 DNase I 저항성 게놈은, 두 rAAV 및 아데노바이러스에 의해 공유된, CMV 프로모터 서열 또는 아데노바이러스 게놈의 섬유 서열에 대한 프로브 세트 및 QPCR 프라이머에 의해 정량화되었다. 총 게놈 캡슐화된 아데노바이러스/웰은 각각의 샘플로부터 게놈 캡슐화된 아데노바이러스의 삭감에 의해 결정된 총 게놈 캡슐화된 rAAV/웰을 따라 작도된다. B) 각각의 명시된 rAAV 생산 방법으로부터 배양 배지 (5μL)는 자동화 웨스턴 블랏 기계 (Wes Simple Protein)을 사용하여 항-Ad5 항체를 가진 아데노바이러스 캡시드 단백질에 대하여 탐색되었다. C) DMSO의 존재 하에, MOI 500에서 TERA-AAV 형질도입 또는 헬퍼가 없는 형질감염 방법에 의해 생산된 rAAV 캡시드 또는 바이러스 입자 (VP)는 ELISA에 의해 결정되었다. 형질도입의 지점에서 세포당 생산된 바이러스 입자로서 제시된 그리고 QPCR 분석에 의해 결정된 총 캡슐화된 rAAV 게놈과 함께 작도된 데이터. E) rAAV 캡시드로부터 결정된 게놈 캡슐화된 rAAV의 백분율은 표시된다. F) DMSO 또는 독시사이클린 0.5μg/mL의 존재 하에, MOI 500에서 HEK293 세포의 TERA-AAV 형질도입을 사용하여 rAAV 생산으로부터 수확된 감염성 배양 배지는 1:100 희석에서, 독시사이클린 0.5μg/mL의 존재 하에, 신선한 HEK293의 감염에 사용되었다. 감염후 24시간 및 96시간 형광 현미경검사에 의해 이미지화된 세포 단일층. G) 감염성 아데노바이러스 오염화는, 조직 배양 감염량 50 (TCID50) 검정에 의해, DMSO의 존재 하에, MOI 100 및 500에서 TERA 형질도입 또는 E1/E3 Ad5 또는, 헬퍼가 없는 형질감염의 방법에 의해 생산된 rAA 샘플로부터 결정되었다. MOI 100 또는 500에서, AAV 생산에 TERA의 사용으로부터 아데노바이러스 오염화는 E1/E3 Ad5 대조군에 대해 결정된 백분율 감염성 아데노바이러스로서 제시된다.
실시예
본 발명은 하기 실시예로 추가로 설명되고, 달리 언급되지 않는 한, 여기에서 부 및 백분율은 중량 기준이고 도는 섭씨이다. 이들 실시예가, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내면서, 단지 예시로서 주어지는 것이 이해되어야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 필수적인 특성을 확인할 수 있고, 이의 취지 및 범위로부터 이탈 없이, 다양한 용법 및 조건에 적응하기 위해 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 실시할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 나타난 및 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에 명백할 것이다. 그와 같은 변형은 또한 첨부된 청구항들의 범위 내에 해당하는 의도이다.
물질 및 방법
아데노바이러스 벡터의 클로닝 및 생산에 사용된 방법은 아래와 같았다.
원핵 시스템에서 플라스미드 증폭
에스케리치아 콜라이 (E. 콜라이)의 형질전환은 플라스미드의 증폭 및 원하는 최종 DNA 클론에 대한 후속적인 스크리닝을 허용하였다. DNA 형질전환은 빙상에서 E. 콜라이 세포 해동, 이어서 형질전환당 5-100 ng의 DNA의 첨가에 의해 수행되었다. 세포는 20 분 동안 얼음에서 인큐베이션되었고 이어서 37 ℃에서 3 분 열-충격 받았다. LB 배지 (0.9 mL/샘플)은 각각의 튜브에 첨가되었고 추가로 15 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션되었다. 샘플은 어느 한쪽으로 선택 항생제를 함유하는 영양소 한천 플레이트에 부어졌거나 100 μL의 각각의 샘플은 빠져나가 개별 콜로니를 단리시켰다.
성공적으로 형질전환된 클론은 증폭되었고 성장 배지에서 적절한 항생제를 사용하는 항생제 내성을 사용하여 선택되었다. 어느 한쪽 카나마이신 (50 μg/mL, Kanamycin Sulfate, Invitrogen, UK) 또는 암피실린 (50 μg/mL, Ampicillin Sodium salt, Sigma Aldrich)를 함유하는 플레이트 및 박테리아성 배양 액체배지는 Lennox LB 액체배지 베이스 (20 g/L) 및 Lennox LB 한천 (32 g/L) (Invitrogen, UK), 각각을 사용하여 제조되었다. 형질전환 후 배양 플레이트상에 수득된 단일 박테리아성 콜로니는 취득되었고 Sanyo 궤도 인큐베이터 (SANYO Electric Biomedical Co. Ltd, USA)를 사용하여 진탕 (200 rpm)하면서 37 ℃에서 액체배지 (5 mL 미니-프렙 또는 250 mL 맥시-프렙)에 밤새 성장되었다.
플라스미드는 QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, UK)를 사용하는 미니-프렙 또는 Qiagen High Speed Maxi-prep kit (Qiagen, UK)를 사용하여 맥시-프렙에 의해 정제되었다. 플라스미드 클론은 선택되었고 진단 제한 소화 및 DNA 서열분석에 의해 확인되었다.
박테리아성 세포
다수의 작은 (<10 Kb) DNA 작제물에 대하여, DH5αE. 콜라이 박테리아 (Invitrogen)은 플라스미드를 증폭시키는데 사용되었다. 더 큰 (>10 Kb) 작제물에 대하여, XL10 Gold Ultracompetent E. 콜라이 박테리아 (Stratagene)은 DNA를 증폭시키는데 사용되었다. 이들 세포는 열-충격 처리를 통해 큰 DNA 플라스미드의 효율적인 전달을 허용하기 위해 그리고 작은 플라스미드 라이브러리용 선택에 대해 편중을 감소시키기 위해 조작되었다. 핵심 제한 부위에서 DAM 및 DMC 메틸화가 없었던 성장하는 DNA로, JM110 E. 콜라이 (Stratagene)은 사용되었다. 이들 세포는 메틸 트랜스퍼라제 효소에서 결핍이고 고순도 메틸 결핍된 DNA가 증폭되도록 한다. DNA 분자의 재조합을 위하여, BJ5183 E. 콜라이 세포는 사용되었다. 이들 세포는 상동성 영역에서 이중-가닥 절단의 효율적인 복구를 허용하는 RecET 동족체의 발현 및 엔도뉴클레아제 I의 돌연변이 둘 모두로 인해 2개의 DNA 분자 사이 재조합을 허용한다. 모든 균주는 Lennox LB 배지에서 또는 LB 한천 플레이트 상에서 37 ℃에 성장되었다.
DNA 제한 소화 (예비적 및 정성적)
제한 엔도뉴클레아제는 진단 소화 패턴을 생성하는데 또는 점착성 (비-뭉툭한) 단부 또는 평활 말단을 가진 DNA 분자를 생산하는데 사용되어, 어느 한쪽 뭉툭한 또는 양립가능한 돌출부를 가진 다른 DNA 분자와 DNA 단편의 후속적인 결찰을 허용하였다. 모든 소화는 제조자에 의해 명시된 조건에 따라 수행되었다 (효소는 New England Biolabs, UK 또는 Promega, UK로부터 구매되었다). 소화가 분자공학 목적을 위하여 수행된 경우, 정확한 크기의 DNA 단편은 겔 전기영동에 의해 시각화되었고 큰 단편 (>8 Kb) (Qiagen, UK)에 대하여 QIAEX II Gel Extraction Kit 그리고 작은 단편 (Qiagen, UK)에 대하여 MinElute Gel Extraction Kit를 사용하여 절단된 겔 밴드로부터 어느 한쪽 정제되었거나, 상이한 크기의 단편을 분해하는데 불필요하였던 경우, 소화 반응 (QIAquick PCR Purification Kit)로부터 직접적으로 정제되었다. HyperLadder™ I (Bioline Ltd, UK)는 1-10 Kb 범위의 단편용 분자량 마커로서 사용되었다. 더 큰 DNA 단편에 대하여 Lambda Hind3 소화 사다리는 사용되었다 (New England Biolabs, UK). 1 Kb 미만 단편에 대하여 100 염기쌍 사다리는 사용되었다 (New England Biolabs, UK).
DNA 결찰
공여체 (삽입물) 및 수령체 (벡터) DNA는 상보성 염기-짝짓기에 대하여 양립가능한 돌출부를 생성하는 단일 또는 이중 (지향성 클로닝용) 제한 효소(들)로 소화되었다. 소화된 삽입물은 겔-정제 또는 정화되었고, 반면 벡터는 벡터 재-결찰에서 비롯하는 배경 오염을 감소시키기 위해 2 μL의 송아지 창자 알칼리성 포스파타제 (37 ℃, 1 시간) (Invitrogen, UK)로 처리에 의해 탈-인산화되었다. 벡터는 그 다음 제조자의 프로토콜을 사용하는 MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, UK) 또는 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, UK)를 사용하여 정제되었다. 모든 정제된 DNA는 뉴클레아제가 없는 물에서 용출되었다. 결찰 반응은 제조자의 프로토콜에 따라 T4 DNA Ligase (New England Biolabs, UK)를 사용하여 준비되었다.
열충격 활성화 세포
열충격 DNA 활성화 E. 콜라이 세포는 4 시간 동안 37 ℃에서 진탕된 5 mL 2xYT 브로스 배지 (16 g/L 박토 트립톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L NaCl, 5M NaOH로 pH 7.0) 속에 E. 콜라이의 단일 콜로니 접종에 의해 생산되었다. 이것은 200 mL 사전-가온된 2xYT 배지로 이전되었다. 배양물이 OD 480을 달성하였던 경우 세포는 10 분 동안 4 ℃에서 스윙아웃 원심분리기에 3000 rpm으로 펠릿화되었다. 세포는 총 80 mL 차가운 TFBI1 (30 mM KC2H3O2 (아세트산칼륨), 100 mM RbCl, 10 mM CaCl2·2H2O, 50 mM MnCl2·4H2O, 15% v/v 글리세롤, 0.2 M CH3COOH를 사용하여 pH 5.8로 조정됨, 필터 멸균)에 재-현탁되었다. 세포는 상기와 같이 회전되었고 8mL의 TFBI2 (10 mM MOPS, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl2·2H2O, 15% v/v 글리세롤, 5 M KOH를 사용하여 pH 6.6으로 조정됨, 필터 멸균)에 재-현탁되었다. 100 μl의 세포는 사전-냉각된 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브 속에 피펫팅되었고 드라이아이스에서 냉동되었다. 튜브는 그 다음 장기간 저장을 위하여 -80 ℃로 이전되었다.
폴리머라제 사슬 반응 (클로닝)
폴리머라제 사슬 반응 (PCR)은 분자 조작, 서열분석 또는 스크리닝 절차 (Sigma-Genosys, UK로부터 구매됨)용 요건에 따라 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행되었다. 벡터 조작 및 분자 특성규명 목적을 위하여 이용된 프라이머 서열은 아래 기재된다.
DNA 템플레이트로부터 PCR 증폭에 의해 생성된 DNA 단편의 하위-클로닝을 위하여, 고 충실도 AccuPrime™ Pfx 교정 DNA 폴리머라제 (Invitrogen, UK)는 사용되었다. PCR에 의한 특이적 DNA 서열의 존재에 대한 일상적인 스크리닝을 위하여, PCR SuperMix (Invitrogen, UK)는 사용되었다. 프라이머는 10 μM에서 탈이온화된, 뉴클레아제 없는 물에 용해되었고; 0.8-1 μL의 각각의 정방향 및 역방향 프라이머는 PCR 반응당 사용되었다. 반응은 효소 및 시약의 공급자에 의해 제공된 권고된 프로토콜에 따라 수행되었다. 필요한 경우, 프라이머 농도는 다양하였고 어닐링 온도의 구배는 최적의 반응 조건을 결정하기 위해 실행되었다. PCRs는 PTC-225 Peltier Thermal Cycler DNA Engine Tetrad (MJ Research, USA)를 사용하여 수행되었다.
아가로스 겔 전기영동
0.5 x TAE 완충액 (1 L내 4.84 g 트리스-베이스, 1.09 g 빙초산, 0.29 g EDTA)에서 에티듐 브로마이드 (Sigma-Aldrich, UK) (0.5 μg/mL)를 함유하는 1% (w/v) 아가로스 (Invitrogen, UK) 겔 상에서 DNA의 크기 분별화는, 상기 기재된 상업적으로 입수가능한 분자량 마커에 상대적 비교로, DNA의 시각화 및 크기 추정을 가능하게 하였다. PCR 반응 또는 제한 소화로부터 단편 또는 정제된 플라스미드로부터 DNA 분자는 수평 DNA 전기영동 겔 탱크 (Bio-Rad Laboratories Ltd, UK)에서 겔 전기영동 (10 볼트/cm 겔 길이, 30-120 분)에 적용되었다. DNA 밴드는 자외선 하에서 겔 및 형광 이미지화 시스템 (AlphaImager, Alpha Innotech Corporation, USA)를 사용하여 시각화되었다.
이중가닥 데옥시리보핵산 정량화
DNA는 Nanodrop (Thermo Scientific, UK) 분광측정기를 사용하여 정량화되었다. 분석에 앞서 장비는 증류수를 사용하여 바탕처리되었고 그 다음 배경 판독은 DNA가 용해된 용액 (TE, EB 또는 H2O)를 사용하여 수행되었다. 샘플은 3중으로 시험되었고 데이터는 제조자의 지시에 따라 ND-1000v 3.1.0 소프트웨어를 사용하여 해석되었다. DNA의 최종 양은 나노그램/마이크로리터로서 표시되었다.
아데노바이러스 회복을 위한 인산칼슘 형질감염
어느 한쪽 재조합 아데노바이러스 게놈 DNA 또는 야생형 아데노바이러스 게놈을 함유하는 SwaI-선형화된 아데노바이러스 플라스미드는 리포펙타민 2000 형질감염을 사용하여 HEK-293 세포 속에 형질감염되었다. HEK-293 세포는 이들이 형질감염의 시간에 70-80% 융합성이도록 형질감염에 24 시간 앞서 6-웰 플레이트의 웰들에 씨딩되었다. 각각의 웰에 대하여, 100ul Opti-MEM Reduced Serum Media (Thermo Fisher Scientific)에 현탁된 리포펙타민 2000은 총 DNA 질량 대 리포펙타민 2000의 1:2 비로 DNA 용액 (100 μL Opti-MEM Reduced Serum Media내 2.5 μg)과 혼합되었고 실온에서 인큐베이션된 다음 Gibco® (Thermo Fisher Scientific UK)로부터 10% 우태 혈청 (FBS)가 있는 DMEM에서 성장되고 있는 부착성 HEK-293에 적가되었다.
리포펙타민 2000 형질감염 복합체를 함유하는 배양 배지는 형질감염후 4시간에 제거되었다. 2% FCS를 함유하는 신선한 DMEM 배지는 각 웰에 첨가되었다. 세포병리적 효과 (CPE)는 형질감염후 12 일과 15 일 사이 성공적으로 형질감염된 세포를 함유하는 웰들에서 관측되었다. 바이러스 스톡은 96 웰 플레이트 속에 연속으로 10-배 희석되었다. 단일 클론은 취득되었고 감염성 상청액이 수집된 그리고 추가 증폭 및 바이러스 생산을 위한 종자 스톡으로서 저장된 10 cm 접시에서 증폭되었다.
세슘 클로라이드 구배상의 밴딩에 의한 바이러스 생산 및 정제
단일 바이러스 클론은 각각의 정제를 위한 대략 15-25 융합성 175 cm2 단일층을 사용하여, 5% FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양된 HEK-293 세포에서 증폭되었다. 바이러스-패킹된 세포를 함유하는 HEK-293 단일층은 온화한 진탕으로 수확되었고 (감염후 72 시간, CPE가 관측가능하였지만 감염된 세포는 용해되지 않았던 경우) 펠릿화된 세포는 감염성 상청액 (16 mL, 3개의 밴딩 칼럼에서 수용된 용적)에 재-현탁되었고, 그 다음 3개의 냉동-해동 사이클에 의해 용해되어 바이러스 입자를 방출시켰다. 용해된 세포 및 자유 바이러스 입자를 함유하는 혼합물은 245 g (10 분, 4 ℃)에서 원심분리되었다. 혼합물은 빙상에서 60 분 동안 인큐베이션되었고, 이어서 800 g (10 분, 4 ℃)에서 원심분리되었다. 펠릿은 폐기되었고 (바이러스 입자를 함유하는) 상청액은 세슘 클로라이드 (CsCl) 구배를 함유하는 원심분리기 튜브 (Ultra-clearTM Beckman Centrifuge tubes, Beckman Coulter UK Ltd)상에 장입되었다. 구배는 원심분리되었다 (회전자 유형 SW40 TI가 있는 Beckman L8-70M Ultracentrifuge를 사용하여 감속 없이 25,000 rpm, 10 ℃, 120분) (Beckman Coulter, Inc, USA). 2개의 별개의 밴드는 원심분리 후 수득되었다: '비어있는' 바이러스 입자를 함유하는 칼럼에서 더 높은 희미한 밴드, 및 온전한 감염성 바이러스 입자를 함유하는 더 두꺼운, 불투명한 낮은 밴드. 바이러스는 18-게이지 바늘로 바이러스 밴드의 수준 아래 튜브의 천공 및 주사기 속에 원하는 밴드의 추출에 의해 수확되었다.
CsCl은 후속으로, 초기 투석용 3-15 mL 투석 카셋트 (Pierce Slide-A-Lyzer® Dialysis Cassette, Pierce Biotechnology, Inc., USA)를 사용하여, pH 7.8에서 50 mM HEPES, 1x PBS, 0.1 g/L CaCl2, 0.2 g/L (초기 투석) 또는 0.1 g/L (최종 투석) MgCl2 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액 (500 mL, 4 ℃)내 연속적인 투석에 의해 제거되었고 그 후 바이러스는 회복되었고 30 분 동안 실온에서 벤조나제 DNA 뉴클레아제 (6 μL/mL, Novagen, UK)에 의해 처리되었다. 바이러스는 후속으로 CsCl 구배 원심분리에 의해 재-밴딩되었고 0.5-3 mL 카셋트 (Pierce Slide-A-Lyzer® Dialysis Cassette, Pierce Biotechnology, Inc., USA)를 사용하는 최종 투석 완충액에서 밤새 투석되었다. 각각의 투석을 위하여, 완충액은 변화되었고 1 시간 및 2 시간 후 신선한 완충액으로 대체되었고, 이어서 밤새 투석되었다. 최종 투석 후 수득된 바이러스는 분취되었고 즉시 -80 ℃에서 저장되었다.
아데노바이러스 정량화를 위한 이중-가닥 DNA 측정
아데노바이러스 DNA 농도는 PicoGreen 검정 (Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Reagent, Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 결정되었다. 상기 검정은 이중-가닥 DNA (dsDNA)용 형광 핵산 프로브를 함유하여, 아데노바이러스 게놈 함량의 정량화를 허용한다. 바이러스 모액의 적절한 희석 (10 내지 100-배)는 실시되었고 1 x TE (30 μL)내 0.5 % 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 및 1 x TE 완충액 (255 μL)를 함유하는 용액에 이전되었다 (15 μL). 샘플은 56 ℃ (30 분)에서 인큐베이션되어 바이러스 입자를 붕괴시켰다. Quant-iT™ PicoGreen® Kit에서 제공된 박테리오파아지 람다 DNA의 알려진 농도의 6개의 4-배 연속 희석은 수행되어 (1 μg/mL에서 최고 농도), 알려지지 않은 샘플내 DNA 함량이 계산되는 것으로부터 표준 곡선 (마지막 표준 바탕)의 작제를 허용하였다. PicoGreen 시약은 1 x TE 완충액에서 200-배 희석되었다. 100 μL의 희석된 시약은 각각의 표준 또는 알려지지 않은 샘플을 위하여 블랙 96-웰 플레이트의 웰들 (Corning, UK)에 배치되었다. 50 μL의 적절하게 희석된 표준 및 샘플은 반복하여 웰들에 첨가되었다. 플레이트는, 분석용 'Fluorescein 485/535 nm, 1 초' 프로그램을 사용하여, Wallac 1420 Victor2 다중-표지 계수기에서 판독되었다. 각각의 샘플에서 존재하는 바이러스 입자의 수는 1 μg의 DNA가 대략 2.7 x 1010 아데노바이러스 입자와 같다는 것에 근거하여 계산되었다.
조직 배양 감염량 50 (TCID50) 방법을 사용하는 아데노바이러스 제제의 플라크 형성 단위의 계산
조직 배양 감염량 50 (TCID50) 방법 (Karber, 1931)은 감염성 바이러스 입자, 또는 플라크 형성 단위 (pfu)의 수를 추정하는데 사용되었고, 바이러스 제제의 10-배 연속으로 희석된 샘플로 감염 후 HEK-293 세포내 세포병리적 효과 (CPE)의 발달에 기초한다. 이 방법은 QBiogene (France)로부터 이용가능한 AdEasy 비-복제 바이러스 플랫폼용 매뉴얼에서 전부 기재된다.
아데노바이러스 제제
모든 아데노바이러스는 HEK-293 세포에서 성장되었고, 상기 기재된 바와 같이 CsCl 구배에서 이중 밴딩에 의해 정제되었다. 바이러스 입자 (vp) 수는 PicoGreen 검정의 변형된 버전 (Invitrogen, Paisley, UK) (Mittereder 등 1996)을 사용하여 DNA 함량 측정에 의해 결정되었다. 감염성은 KRBER 통계 방법 (Karber, 1931)로 TCID50 시스템을 사용하여 계산되었고 아데노바이러스 역가 (TCID50 단위/mL)를 추정하는데 사용되었고 플라크 형성 단위/mL (pfu/mL)를 결정하기 위해 정정되었다.
세포주의 유지
HEK293 인간 배아 신장 세포는 European Collection of Cell Cultures (Porton Down, UK)로부터 수득되었고, 가습된 인큐베이터에서 5 % CO2내 37 ℃에 페니실린 (25 U/mL) 및 스트렙토마이신 (10 mg/mL)를 포함하는 10 % FCS (PAA Laboratories, Yeovil, UK)를 가진 DMEM 배지에서 유지되었다.
Ad5용 실시간 (정량적) PCR (Q-PCR)
아데노바이러스 입자의 측정용 Q-PCR 방법론은 이전에 기재되었다 (Green 등, 2004). 간단히, 감염된 세포 또는 조직 샘플로부터 바이러스 DNA는 포유동물 게놈 Genelute DNA 추출 키트 (Sigma)를 사용하여 추출되었다. 반응은 제조자의 프로토콜에 따라 Applied Biosystems 마스터 믹스를 사용하여 수행되었다. 사이클은 아래와 같았다: 94 ℃ 10 분, 그 다음 94 ℃ 30 초, 60 ℃ 1 분에서 40 회. Ad5 섬유 표적화용 프라이머 서열은 하기이었다: 정방향 프라이머 - 5' TGG CTG TTA AAG GCA GTT TGG 3' (서열번호: 9) (Ad5 32350-32370 뉴클레오타이드) 및 역방향 프라이머 - 5' GCA CTC CAT TTT CGT CAA ATC TT 3' (서열번호: 10) (Ad5 32433-32411 nt) 및 TaqMan 프로브- 5' TCC AAT ATC TGG AAC AGT TCA AAG TGC TCA TCT 3' (서열번호: 11) (Ad5 32372-32404 nt), 6-카복시플루오레세인으로 5' 말단에서 그리고 6-카복시테트라메틸로다민으로 3' 말단에서 이중 라벨링됨. 결과는 Sequence Detection System 소프트웨어 (Applied Biosystems)로 분석되었다. 조직 및 세포용 표준 곡선은 상기 기재된 바와 같이 바이러스 입자의 알려진 농도의 연속 희석으로 세포 용해물 또는 조직 균질물의 샘플 스파이킹 이어서 Q-PCR에 의해 별도로 각각의 샘플의 추출 및 분석에 의해 제조되었다.
바이러스 게놈 DNA 추출
아데노바이러스 게놈 수의 결정이 필요한 경우, 바이러스 DNA는 어느 한쪽 용해 용액 C (Sigma, UK) 또는 루시퍼라제 검정 시스템으로부터 용해 용액 (Promega, UK)에서 제조된 세포 용해물 또는 배양 상청액으로부터 추출되었다. 샘플은 프로테이나제 K (1 mg/mL)로 처리되었고 56 ℃에서 20 분 동안 인큐베이션되어 바이러스 캡시드 단백질을 분해시켰고, 이어서 70 ℃에서 20 분 인큐베이션되었다. 총 세포 DNA 추출은 그 다음 제조자의 지시에 따라 Genelute 포유동물 DNA 추출 키트 (Sigma-Aldrich, UK)를 사용하여 수행되었다.
발광법에 의한 MLP 활성 측정
세포는 12 웰 플레이트에서 3중으로 씨딩되었다. 24 시간 후 플라스미드 DNA (0.5 μg)은 50 μL의 HBS 완충액에 첨가되었고 또한 50 μL 멸균 HBS내 2.5 μL DOTAP 시약 (Roche)와 혼합되었다. 복합체는 실온에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 100 μL의 형질감염 혼합물은 각 웰에 첨가되었고 37 ℃에 4시간 동안 인큐베이션되었다. 세포는 PBS로 세정되었고 2 % 소태아 혈청 (FCS) (PAA Laboratories, Yeovil, UK)를 함유하는 DMEM으로 인큐베이션되었다. 형질감염 24 시간 후 배지는 제거되었고 150 μL의 리포터 세포 용해 완충액 (Promega)는 세포에 첨가되었다. 세포는 그 다음 -80℃에 1시간 동안 냉동된 다음 해동되었다. 루시페린 (25 μL) (Promega, Southampton, UK)는 25 μL 분취액의 세포 용해물에 첨가되었고 상대 발광은 발광법 (Lumat LB9507, Berthold Technologies, Redbourn, UK)에 의해 측정되었다.
바이러스 감염
세포는 상기 기재된 조건, 또는 임의의 그와 같은 세포주에 대하여 양호한 조건을 사용하여 배양되고, 여기에서 본 발명의 바이러스 이내에 이식유전자는 발현되어야 한다. 바이러스는 1-1000의 MOI, 더욱 바람직하게는 1-100의 MOI 및 더욱 바람직하게는 또한 10-100의 MOI에서 세포의 배양 상청액에 첨가된다.
단백질 발현 측정
세포 내에서 후기 단백질의 발현의 수준 또는 이식유전자 발현 수준은 웨스턴 블랏 또는 효소-결합 면역흡착법 (ELISA)를 통해 측정된다. 실시된 방법은 측정되고 있는 생성물이 세포내이거나 세포의 외부에서 분비되는지에 좌우된다. 전자에 대하여, 단백질의 수준은 세포 용해물을 창출하기 위한 세포 용해 이어서 웨스턴 블랏 또는 ELISA에 의해 측정된다. 분비된 물질에 대하여, 상청액은 웨스턴 블랏 또는 ELISA에 의해 즉시 분석된다.
웨스턴 블랏 프로토콜이 사용되면, 하기 접근법은 실시된다. 30 μg의 단백질은 QuantiPro BCA 검정 (Sigma Aldrich, cat: QPBCA-1KT)를 사용하여 정량화 후 10% 폴리아크릴아미드 겔상에 장입된다. 겔은 160 V로 1시간 동안 실시되고 그 다음 단백질은 밤새 4 ℃에 30V로 니트로셀룰로스 막에 블랏팅된다. 니트로셀룰로스 막은 (아래 기재된) Ponceau 용액으로 염색되어 동일 장입 및 샘플의 이전을 확인하고 그 다음 2시간 (E1A) 또는 밤새 (Aldolase A) 동안 5 % 밀크 분말 (Fluka, Sigma Aldrich)를 사용하여 차단된다. 막은 그 다음 PBS, 0.1 % Tween 20으로 2회, 및 그 다음 PBS로 1회 세정된다. 아데노바이러스 후기 단백질의 억압 수준 검출을 위하여, 항-헥손 웨스턴 블랏은 사용된다. 헥손 (AbCam, Cambridge, UK, cat number: Ab8249)를 인식하는 일차 항체는 1시간 동안 PBS에서 2.5 % 밀크 분말의 1:500 희석으로 첨가된다. 막은 상기와 같이 세정된다. 이차 항-토끼 HRP 표지된 항체는 1시간 동안 2.5 % 밀크 분말의 1:1000 희석으로 첨가된다. 막은 상기와 같이 세정되고 그 다음 1 분 동안 0.125 mL/cm2로 ECL 웨스턴 블랏팅 검출 시약 (Amersham, GE Healthcare)에서 중탕된다. 블랏은 화학발광검출을 사용하여 1, 5 및 10 분 동안 Alpha Innotech 겔 문서화 시스템에서 시각화된다. 분자량은 이중 색상 분자량 사다리 (Bio-Rad)에 대해 계산된다.
Ponceau 염색
니트로셀룰로스 막에 폴리-아크릴아미드 겔로부터 단백질의 성공적인 이전을 확인하기 위해 그리고 동일 장입 및 이전을 확보하기 위해, 막은 차단에 앞서 Ponceau S 용액 (탈이온화된 증류된 H2O로 구성된 5 % v/v 아세트산내 0.1 % w/v Ponceau S)로 2 분 동안 염색된다. 얼룩은 그 다음 제거되고 2회 PBS에서 간단히 세정된 다음 이미지화된다. 막은 그 다음 PBS 0.1 % Tween 20으로 2회 및 그 다음 PBS로 1회 세정되어 차단에 앞서 모든 잔존 얼룩을 제거한다.
웨스턴 블랏에 의한 단백질 수준 평가 보다는, ELISA는 사용될 수 있다. 이것을 하기 위해, 연구되어야 하는 샘플은 코팅 완충액 (cat. 28382 Thermofisher)에서 먼저 희석된다. 전형적으로, 샘플은 플레이트 상에서 상이한 농도 예컨대 1:10; 1:100; 1:500으로 코팅되어 최적의 검출 범위를 결정한다. 표준 곡선은 인접한 웰들에 희석 이어서 2-배 연속 희석에 의해 4μg/ml의 최고 표준 지점에서 웰들 코팅 및 검출되어야 하는 단백질의 미리 만들어진 양 사용에 의해 창출된다. 예를 들어, 0.2mg/ml의 표준 단백질은 196μl의 비-형질감염된 배양 배지 및 1.8ml의 코팅 완충액과 4μl를 요구한다. 이것은 1.5 ml 튜브에 1ml의 재구성된 표준 및 1ml의 코팅 완충액 첨가에 의한 2-배 연속 희석을 수행함으로써 8-지점 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. 100 마이크로리터의 각각의 표준은 그 다음 ELISA 플레이트에 반복하여 첨가된다. 100 마이크로리터의 각각의 샘플은 면역-마이크로플레이트의 웰에 첨가된다. 100 마이크로리터의 코팅 완충액은 무-항원 대조군으로서 1개의 웰에 첨가된다. 100 마이크로리터의 양성 대조군 샘플은, 이용가능하면, 포함된다. 플레이트는 4 ℃에서 밤새 인큐베이션된다. 플레이트는 PBS-T (0.1% Tween)로 3회 세정된다. 200μL의 차단 완충액은 웰당 첨가되고 (2% BSA를 가진 최초 코팅 완충액) 플레이트는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션된다. 플레이트는 PBS-T (0.1% tween)로 3회) 세정된다. 일차 항체 (1#)는 요구된 희석으로 희석제 용액에 첨가되고 50 μL는 각 웰에 첨가된다. 플레이트는 실온에서 1-2 시간 동안 인큐베이션된다. 플레이트는 PBS-T (0.1% tween)로 3회 세정된다. HRP-표지된 이차 항체는 요구된 희석으로 희석제 용액에 첨가된다. 50 마이크로리터는 각 웰에 첨가된다. 플레이트는 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션된다. 플레이트는 PBS-T (0.1% tween)로 3회 세정된다 플레이트는 PBS로 1회 세정된다. 50 마이크로리터의 3,3' 5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)는 각 웰에 첨가된다. 그 다음 색상이 발현되도록 기다리는 것 그리고 걸린 시간을 기록하는 것이 필요하다. 50 마이크로리터의 정지 용액 (1 M HCl)은 첨가된다. 데이터 취득은 450nm에서 플레이트 판독기로 플레이트 흡광도 판독에 의해 달성된다.
VLP 생산 측정
세포 이식유전자 발현 수준 또는 후기 단백질의 발현의 수준으로부터 VLP 생산의 수준은 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏 또는 ELISA를 통해 그러나 VLP 표면에서 에피토프를 인식하는 항체를 사용하여 측정된다.
실시예 1: Ad5 리프레서 돌연변이체 주요 후기 프로모터로부터 GFP 리포터의 발현용 플라스미드 벡터의 작제물
GFP 리포터 유전자가 야생형 Ad5 MLP (pMLPwt-GFP), 리프레서 돌연변이체 MLPs (pMLP-TET01a-GFP; pMLP-TET01b-GFP; pMLP-TET02-GFP) 또는 내부 프로모터가 저수준 기준선 전사 결정을 위하여 존재하지 않았던 대조군 작제물 (pMCS-GFP)에 의해 전사된 5개의 발현 작제물은 창출되었다. 벡터는 도 4에서 도시된다.
실시예 2: MLP 프로모터로부터 GFP 리포터 유전자의 발현
GFP 리포터 유전자가 야생형 Ad5 MLP (pMLPwt-GFP), 리프레서 돌연변이체 MLPs (pMLP-TET01a-GFP; pMLP-TET01b-GFP; pMLP-TET02-GFP) 또는 내부 프로모터가 저수준 기준선 전사 결정을 위하여 존재하지 않았던 대조군 작제물 (pMCS-GFP)에 의해 전사된 5개의 발현 작제물은 창출되었다. HEK293 세포는 형질감염 전 24-시간, 3e4 세포/웰의 밀도로 조직 배양 처리된 48-웰 플레이트에 씨딩되었다. HEK293 세포는 총 DNA 질량 대 PEI의 1:3 비로 분지형 PEI (25kDA)를 사용하여 플라스미드 pMLPwt-GFP; pMLP-TET01a-GFP; pMLP-TET01b-GFP; pMLP-TET02-GFP; pMCS-GFP로 형질감염되었다. 형질감염은 3중으로 수행되었고 세포는 유세포분석에 의한 분석용 형질감염후 24 시간, 48 시간 및 72 시간에 수확되었다. 데이터는 GFP 양성 세포의 MFI (평균 형광 강도)로서 도 5에서 제시된다. 오차 막대는 삼중 생물학적 복제물의 SD를 표시한다. 스튜던트-시험에 의한 데이터 NS p>0.05.
실시예 3: TETR 단백질에 의한 리프레서 돌연변이체 MLP의 전사 억압
GFP 리포터 유전자가 야생형 Ad5 MLP (pMLPwt-GFP), 리프레서 돌연변이체 MLP (pMLP-TET01a-GFP; pMLP-TET01b-GFP; pMLP-TET02-GFP) 또는 내부 프로모터가 저수준 기준선 전사 결정을 위하여 존재하지 않았던 대조군 작제물 (pMCS-GFP)에 의해 전사된 5개의 발현 작제물은 창출되었다. 야생형 Ad5 MLP (pMLPwt-GFP), 리프레서 돌연변이체 MLP (pMLP-TET01a-GFP; pMLP-TET01b-GFP; pMLP-TET02-GFP) 또는 GFP 리포터를 발현시키는 대조군 작제물은, 독시사이클린 0.2μg/ml 또는 DMSO로 처리된 HEK293 세포에서, 총 DNA 질량의 1:1 비로, 구성적 CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터의 제어 하에서, TETR 발현 플라스미드 (pTETR)로 공-형질감염되었다. HEK293 세포는 형질감염 전 24-시간, 3e4 세포/웰의 밀도로 조직 배양 처리된 48-웰 플레이트에 씨딩되었다. 형질감염은 총 DNA 질량 대 PEI의 1:3 비로 분지형 PEI (25kDA)를 사용하여 3중으로 수행되었고 세포는 형질감염후 24, 48 및 72 시간에 유세포분석에 의해 분석되었다. 데이터는 Ad5 MLP 야생형 (pMLPwt-GFP)의 활성에 대해 비교된 그리고 배경 발현 신호를 위한 프로모터 없는 대조군 작제물에 대해 정규화된 GFP 양성 세포에서 MFI (평균 형광 강도)의 백분율 억압으로서 도 6에서 제시된다. 평균 ± SD NS p>0.05; *p≤0.05; **p≤0.01; ***p≤0.001; ****P≤0.0001; 짝짓기되지 않은, 2개 꼬리의 스튜던트로서 데이터.
실시예 4: HEK293 T-Rex Flp 세포내 억압의 Ad5 MLP 리프레서
리프레서 서열을 편입시키기 위한 분자 클로닝 방법에 의해 조작된 아데노바이러스는 HEK293 세포에서 회수되었다. MLP 리프레서 서열 MLP-TET01a, MLP-TET01b, TET02 또는 야생형 MLP를 가진 Ad5 게놈은 SwaI 제한 효소로 제한 소화에 의해 박테리아성 플라스미드 DNA로부터 절단제거되어 5' 및 3' 측접하는 Ad5 ITR 서열을 방출시켰다. HEK293 세포는 24-시간 1e5 세포/플레이트의 밀도로 10-cm 조직 배양 플레이트에 씨딩되었고, 총 DNA 질량 대 리포펙타민 2000의 1:2 비로 리포펙타민 2000을 사용하여, MLP 리프레서 Ad5 또는 Ad5 MLPwt 게놈을 함유하는 10μg의 DNA로 형질감염되었다. 바이러스는, 전형적으로, 형질감염 후 10-15 일 바이러스 감염 및 세포질 효과의 관찰을 따라 수확되었다. 293 T-Rex Flp 세포는 24-시간 동안 4e4 세포/웰의 밀도로 48-웰 조직 배양 처리된 플레이트에 씨딩되었고 독시사이클린 0.2μg/ml 또는 DMSO의 존재 하에서 아데노바이러스 Ad5-MLP-TET01a, Ad5-MLP-TET01b, Ad5-MLP-TET02 또는 표준 E1-E3 결실된 Ad5 (Ad5-MLPwt)로 형질도입되었고 감염후 10-일 광학 미스카피에 의해 이미지화되었다. 도 7에서 도시된 데이터는 3중 생물학적 복제물을 나타낸다. 막대 = 250μm.
실시예 5: 구성적 CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터의 제어 하에서, TETR 발현 플라스미드 (pTETR)로 형질감염된 293Ad 세포내 억압의 Ad5 MLP 리프레서
리프레서 서열 MLP-TET01b를 편입시키기 위한 분자 클로닝 방법에 의해 조작된 아데노바이러스는 HEK293 세포에서 회수되었다. MLP 리프레서 서열 MLP-TET01b를 가진 Ad5 게놈은 SwaI 제한 효소로 제한 소화에 의해 박테리아성 플라스미드 DNA로부터 절단제거되어 5' 및 3' 측접하는 Ad5 ITR 서열을 방출시켰다. HEK293 세포는 24-시간 동안 1e5 세포/플레이트의 밀도로 10-cm 조직 배양 플레이트에 씨딩되었고, 총 DNA 질량 대 리포펙타민 2000의 1:2 비로 리포펙타민 2000을 사용하여, MLP 리프레서 Ad5를 함유하는 10ug의 DNA로 형질감염되었다. 바이러스는, 전형적으로, 형질감염 후 10-15 일 바이러스 감염 및 세포질 효과의 관찰을 따라 수확되었다. HEK293 세포는 10-cm 조직 배양 플레이트에서 씨딩되었고 아데노바이러스 Ad5-MLP-TET01b로 감염에 앞서, 총 DNA 질량 대 리포펙타민 2000의 1:2 비로 리포펙타민 2000을 사용하여 pTETR (5μg) 또는 스터퍼 DNA로 형질감염되었다. 결과는 도 8에서 도시된다. 감염후 24, 48, 72 및 96 시간 광학 현미경에 의해 이미지화된 데이터.
실시예 6: 293 T-Rex Flp 세포내 억압된 MLP 돌연변이체 Ad5의 바이러스 게놈 복제
리프레서 서열을 편입시키기 위한 분자 클로닝 방법에 의해 조작된 아데노바이러스는 HEK293 세포에서 회수되었다. MLP 리프레서 서열 MLP-TET01a, MLP-TET01b, TET02 또는 야생형 MLP를 가진 Ad5 게놈은 SwaI 제한 효소로 제한 소화에 의해 박테리아성 플라스미드 DNA로부터 절단제거되어 5' 및 3' 측접하는 Ad5 ITR 서열을 방출시켰다. 293 T-Rex Flp 세포는 24-시간 동안 1e5 세포/플레이트의 밀도로 10-cm 조직 배양 플레이트에 씨딩되었고 총 DNA 질량 대 리포펙타민 2000의 1:2 비로 리포펙타민 2000을 사용하여 MLP 리프레서 Ad5 또는 Ad5 MLPwt 게놈을 함유하는 10μg의 DNA로 형질감염되었다. 바이러스는, 전형적으로 형질감염 후 10-15 일 바이러스 감염 및 세포질 효과의 관찰을 따라 수확되었다. 293 T-Rex Flp 세포는 24-시간 동안 4e4 세포/웰의 밀도로 48-웰 조직 배양 처리된 플레이트에 씨딩되었고 독시사이클린 0.2ug/ml 또는 DMSO의 존재 하에서 아데노바이러스 Ad5-MLP-TET01a, Ad5-MLP-TET01b, Ad5-MLP-TET02 또는 표준 E1-E3 결실된 Ad5 (Ad5-MLPwt)로 형질도입되었다 293 T-Rex Flp 세포는 독시사이클린 또는 DMSO의 존재 하에서 MLP 돌연변이체 또는 MLP-wt Ad5로 감염되었다. 총 바이러스 및 세포 DNA는 감염후 10-일 수확되었다. 바이러스 게놈 카피는 TaqMan® 프로브를 사용하여 QPCR에 의해 정량화되었다. Ad5의 알려진 역가는 표준 곡선 생성에 사용되었고 데이터는 감염을 위하여 사용된 초기 바이러스 장입 위에서 게놈 카피의 증가로서 제시된다 (도 9). 3중 생물학적 복제물을 대표하고 평균 ± SEM P≤.01; 짝짓기되지 않은, 2개 꼬리의 스튜던트로서 데이터.
실시예 7: MLP 억압은 HEK293 세포 단일층에 걸쳐 확산된 아데노바이러스를 차단시킨다
아데노바이러스 생산 및 바이러스 확산 억제에 관한 MLP 억압의 효과를 결정하기 위해, 야생형 MLP 또는 TET01b 변형을 가진 아데노바이러스는, EGFP 개시 코돈에 융합된 Ad5 TPL과 무관하게, EGFP 리포터를 발현시키기 위해 조작되었다. EGFP 리포터는 바이러스 E1 결실된 영역으로부터 그리고 CMV 프로모터의 제어 하에서 발현되었다. EGFP를 발현시키는 아데노바이러스는 MOI 1로 독시사이클린 또는 DMSO로 처리된 Flp-In T-REx 293 세포의 단일층을 감염시키는데 사용되었고 EGFP 발현은 형광 현미경검사 및 유세포분석에 의해 6일째에 모니터링되었다. 바이러스 확산 즉 세포 단일층을 걸쳐 EGFP 발현이 야생형 MLP를 가진 대조군 아데노바이러스에서 억제되지 않는 반면, MLP TET01b를 가진 아데노바이러스의 바이러스 확산은 독시사이클린의 부재 하에 Flp-In T-REx 293 세포에서 차단되어, 비리온 복제의 억압을 표시하였다 (도 10a).
감염 후 6-일, 세포는 게이팅된 모집단 내에서 EGFP 발현 세포의 상대 비를 결정하기 위해 유세포분석으로 수확되었다. 형광 현미경검사로부터 결과와 함께, EGFP를 발현시키는 세포의 분율은 대조군 아데노바이러스로 감염 이후 독시사이클린 또는 DMSO로 처리된 Flp-In T-REx 293 세포에서 비교할만하였다 (도 10b). 그러나, EGFP 양성 세포의 모집단이 대조군 바이러스에 비교된 독시사이클린으로 처리된 세포에서 MLP TET01b 변형된 아데노바이러스로 감염으로부터 더 낮은 반면, 짐작컨대 감염성 및 복제에서 변동으로 인해, DMSO로 처리된 세포는 EGFP 발현 세포의 상당히 더 낮은 대중적임을 보여주어, EGFP가 제1 라운드 감염으로부터 바이러스에 의해 형질도입된 세포로부터 단지 발현된다는 것을 나타내었다.
실시예 8: MLP 억압은 Ad5 TPL 엑손 1-2-3을 함유하는 EGFP의 발현을 향상시켰다
EGFP의 개시 코돈에 Ad5 TPL 엑손의 융합이 유전자 발현에 영향을 주는지를 결정하기 위해, CMV 프로모터의 제어 하에서, 리더 서열과 무관하게, 발현 EGFP에 조작된 플라스미드는 HEK293 세포에 형질감염되었고 EGFP 발현은 감염후 48 시간에 유세포분석에 의해 결정되었다. 결과는 도 11a에서 도시된다. 프로모터 없는 대조군 플라스미드가 EGFP의 배경 수준을 보여준 반면, TPL 서열을 함유하는 플라스미드로부터 EGFP 발현의 수준에서 유의미한 차이는 없었다.
단백질 발현이 MLP 억압 이후 증가되는지를 평가하기 위해, Ad5 TPL과 무관하게, CMV 프로모터로부터 EGFP 리포터를 발현시키는 MLP TET01b 변형된 아데노바이러스는 MOI 10에서 독시사이클린 또는 DMSO로 처리된 Flp-In T-REx 293 세포에 감염되었고, EGFP 발현은 감염후 24, 48 및 72-시간 유세포분석에 의해 측정되었다. 결과는 도 11b에서 도시된다. TPL을 함유하는 EGFP를 발현시키는 MLP TET01b 아데노바이러스가 TPL 서열이 부족한 EGFP에 비교된 중앙 형광 강도 (MFI)에서 증가를 보여준 반면, DMSO 처리된 세포에서 감염으로부터 아데노바이러스 MLP의 억압은 독시사이클린으로 처리된 세포 속에 바이러스 감염에 비교된 EGFP 발현에서 추가 ~2-배 증가를 초래하였고, 이는 비리온 생산을 가능하게 한다.
유사하게, EGFP 발현에서 ~3-배 증가는 아데노바이러스 MLP가 리프레서 TETR의 일시적 발현에 의해 억압된 경우 HEK293 세포에서 관측되었다 (참고 도 11c-11D). CMV 프로모터로부터 TETR을 발현시키는 플라스미드는 독시사이클린 또는 DMSO로 처리된 HEK293 세포에 형질감염되었다. 후속으로, 세포는 CMV 프로모터로부터 (TPL 엑손과 무관하게) EGFP를 발현시키는 그리고 MLP TET01b 변형을 함유하는 아데노바이러스로 감염되었거나 EGFP를 전사시켰던 CMV 발현 플라스미드와 리포펙타민을 사용하여 형질감염되었다. EGFP 발현은 바이러스 및 플라스미드로 형질도입후 48-시간 유세포분석에 의해 결정되었다. 결과는, EGFP 발현 아데노바이러스 또는 플라스미드 DNA로 형질도입된 HEK293 세포로부터, MFI에 의해 결정된 경우, EGFP 발현의 비교할만한 수준을 보여주었다. 그러나, EGFP 발현에서 ~3-배 증가는 DMSO로 처리된 세포에서 TPL 엑손과 MLP TET01b 변형된 아데노바이러스 발현 EGFP로 감염으로부터 관측되었을 뿐이고, 이는 TETR에 의해 Ad MLP TET01b의 억압을 허용하여, 이 효과가 TPL 엑손 없이 EGFP 코딩 서열에서 관측되지 않았음에 따라 cap-독립적인 번역에 의해 단백질 생산을 향상시키는 것을 나타내었다.
실시예 9: 테트라사이클린-구동 억압 아데노바이러스 (TERA)에 의한 MLP 자기-억압이 아데노바이러스 구조적 단백질의 생산을 억제시킨다
MLP TET01b 변형을 가진 아데노바이러스는, TERA를 작제하기 위해, 바이러스의 E3-결실된 영역의 위치, 바이러스 내부 MLP의 직접적인 제어 하에 스플라이스 수용체 서열로부터 리프레서 TETR을 발현시키기 위해 추가로 조작되었다. 결과는 도 12에서 도시된다.
TERA로부터 바이러스 구조적 단백질의 억압을 평가하기 위해, 결실된 대조군 아데노바이러스 E1/E3 또는 TERA는 MOI 100 또는 1000에서 독시사이클린 또는 DMSO의 존재 하에 HEK293 세포의 감염을 위하여 사용되었다. 세포 용해물 및 성장 배지로부터 아데노바이러스 캡시드 단백질은 감염 후 72-시간 웨스턴 블랏에 의해 항-Ad5 항체를 사용하여 탐색되었다. 아데노바이러스 구조적 단백질의 비교할만한 수준은 독시사이클린이 세포 용해물 및 배양 배지 둘 모두로부터 성장 배지에서 존재하였던 경우 TERA 및 대조군 바이러스로부터 검출되었다. 그러나, 처리된 DMSO 그룹에서, TERA로부터 구조적 단백질은 블랏으로부터 검출불가능하였다. 짐작컨대, 독시사이클린의 부재 하에서, HEK293 세포 속에 TERA 감염은 이의 자체 MLP의 자기-억압을 위해 바이러스 MLP 전사된 TETR의 생산 및 캡시드 단백질의 생산에서의 차단을 가능하게 하였다.
HEK293 세포에서 TERA의 생산을 평가하기 위한 독시사이클린 용량-단계적 확대 연구에서, 야생형 MLP 또는 TERA를 가진 대조군 아데노바이러스는 0.1, 0.2, 0.5 및 1.0 μg/mL의 DMSO 또는 독시사이클린 용량으로 처리된, MOI 10 및 100에서 HEK293 세포의 감염을 위하여 사용되었다. 결과는 도 12b-12d에서 도시된다. Ad5 주요 구조적 단백질의 비교할만한 수준은 DMSO 또는 독시사이클린으로 처리된 세포에서 대조군 아데노바이러스 감염에 대하여 검출되었고, 반면 TERA로부터 발현된 캡시드 단백질은, 평가된 두 MOI에 대하여 일관된, 최대 0.5 μg/mL 독시사이클린의 증가 용량으로 증가와 함께 증가되었다.
실시예 10: TERA 바이러스 복제는 E1/E3 결실된 아데노바이러스 및 MLP 억압 향상된 DNA 복제에 비교할만하다
TERA의 바이러스 복제를 평가하기 위해, 대조군 E1/E3 결실된 아데노바이러스 또는 TERA는 독시사이클린의 존재 하에서, MOI 1, 10 및 100에 HEK293 세포의 단일층을 감염시키는데 사용되었고, 총 게놈 DNA는 바이러스 감염후 시점 0, 24, 48 및 72-시간에 성장 배지 및 세포 용해물로부터 추출되었다. 아데노바이러스 게놈 DNA의 존재도는 QPCR에 의해 결정되었다. 결과는 도 13에서 도시된다.
평가된 모든 3개의 감염 MOI에 대하여, TERA의 바이러스 복제는 대조군 아데노바이러스에 비교할만 하였고, 여기에서 바이러스 게놈의 상대 존재비는 빈틈없이 24시간에, 감염후 72시간에 총 바이러스 게놈의 >4-로그 증가로, 증가되었다.
MLP 억압 동안 TERA의 게놈 복제는 QPCR에 의해 추가로 평가되었다. 바이러스 TERA 또는 대조군 E1/E3 결실된 아데노바이러스는 10 및 100의 MOI에 독시사이클린 또는 DMSO의 존재 하에서 HEK293 세포 감염을 위하여 사용되었고 총 게놈 DNA는 QPCR에 의해 바이러스 게놈 정량화 감염후 시점 0, 24, 48, 72, 및 96-시간에 수확되었다. 유사하게, TERA의 바이러스 복제가 대조군 바이러스에 비교할만 하였던 반면, TERA로부터 DNA 복제는 독시사이클린으로 배양된 세포 속에 감염에 비교된 DMSO 대조군 그룹으로 처리된 HEK293 세포에서 감염후 24-시간 후 상당히 증가되었다. 짐작컨대, 바이러스 MLP의 억압은 이의 복제 생활-주기의 완료로부터 TERA를 억제시켰고, 그것에 의해 지수적 바이러스 게놈 증폭을 가능하게 하였다.
실시예 11: TERA는 EGFP 리포터의 발현을 향상시켰다
CMV 프로모터의 제어 하에서 TERA로부터 EGFP 리포터 발현을 평가하기 위해, EGFP를 발현시키기 위해 조작된 TERA는, Ad5 TPL 엑손과 무관하게, HEK293 세포를 감염시키는데 사용되었고 EGFP 발현은 E1/E3 대조군 아데노바이러스로부터 발현 및 CMV 발현 플라스미드로 일시적 형질감염의 방법에 비교된다.
결과는 도 14에서 도시된다.
E1/E3 아데노바이러스 및 TERA가 CMV 플라스미드 벡터로부터 발현에 비교된 EGFP 발현 증가를 나타내었던 반면, Ad5 TPL 엑손을 함유하는 EGFP를 발현시키는 TERA는 TPL 엑손 없이 E1/E3 대조군 벡터 및 TERA 둘 모두로부터 관측된 수준 위로 생산을 향상시켰다. 짐작컨대, 바이러스로 인코딩된 TETR에 의해 TERA MLP의 자기-억압은 Ad5 후기 mRNA 전사체의 억압 및 우세한 TPL EGFP mRNAs의 cap-독립적인 번역의 가능화를 초래하였다.
추가적으로, 웨스턴 블랏은, 독시사이클린의 존재 하에서, 대조군 E1/E3 아데노바이러스 및 TERA를 사용하는 EGFP 발현이 아데노바이러스 단백질 오염과 동반되었다는 것을 확인하였다. 대조적으로, 독시사이클린의 부재는 TERA내 Ad5 구조적 단백질의 억압을 가능하게 하면서 EGFP 발현은 유지되었다.
실시예 12: TERA는 이중-특이적 T-세포 연관체 (BiTE)의 생산을 향상시켰다
플라스미드 DNA로부터 일시적 발현의 방법에 대해 TERA를 사용하는 모델 분비성 단백질의 생산을 비교하기 위해, TERA 및 플라스미드 벡터 (pCMV-BiTE)는 CMV 프로모터의 제어 하에서 종양 특이적 항원 EpCAM에 대해 이중-특이적 T-세포 연관체 (BiTE)를 발현시키기 위해 조작되었다. 결과는 도 15에서 도시된다.
Ad5 TPL 엑손 또는 플라스미드 pCMV-BiTE를 함유하는 BiTE를 발현시키는 바이러스 TERA는 MOI 10에서 HEK293 세포 또는 웰당 0.75μg DNA, 각각을 형질도입하는데 사용되었고, 형질도입후 시점 24, 48 및 72-시간에 성장 배지로부터 단백질 수확되었고 항-6x His 항체를 사용하여 탐색되었다. 웨스턴 블랏은 수확의 모든 3개의 시점에서 CMV 발현 플라스미드 사용으로부터 생산에 비교된 TERA로부터 발현하는 BiTE에서 유의미한 증가를 보여주었다.
도 15d는 E1/E3 결실된 아데노바이러스에 비교된 TERA로부터 발현된 BiTE 단백질의 웨스턴 블랏 검출을 보여주었다. 독시사이클린의 부재 하에서 배양된, HEK293 세포는 MOI 10에서 (Ad5 TPL 엑손과 무관하게) CMV 프로모터의 제어 하에서 아데노바이러스 E1/E3-결실된 또는 TERA-발현 BiTE로 감염되었고 BiTE 단백질 발현은 성장 배지로부터 감염후 48-시간에 측정되었다. TERA는 대조군 아데노바이러스에 비교된 BiTE의 생산 증가를 나타냈지만; BiTE 생산에서 ~2-배 증가는 Ad5 TPL 엑손을 함유하는 BiTE를 발현시키는 TERA로 감염으로부터 관측되었다. 추가적으로, 바이러스 구조적 단백질이 E1/E3 결실된 바이러스 대조군으로 감염으로부터 검출되었던 반면, 바이러스 캡시드 단백질은 TERA에 의해 감염 이후 검출불가능하였다. 바이러스 게놈 DNA의 증폭은 유지되고 QPCR 분석에 의해 대조군 바이러스에 비교할만한 것으로 확인되었다.
실시예 13: TERA는 Ad5 입자 오염물질이 없는 rAAV의 생산을 향상시킨다
헬퍼-기능의 전달을 위한 TERA 및 rAAV 바이러스 벡터 생산을 위한 rAAV DNA의 사용을 평가하기 위해, E1/E3 결실된 대조군 아데노바이러스 및 TERA는 바이러스 E1 결실된 영역에서 변형되어 CMV 프로모터의 제어 하에서 EGFP 발현 카셋트를 측접하는 AAV2 ITR, rAAV 게놈을 인코딩하였다. 결과는 도 16에서 도시된다.
rAAV 인코딩 EGFP 이식유전자는 확립된 헬퍼가 없는 삼중 형질감염 방법에 의해, 또는 대조군 E1/E3 결실된 아데노바이러스 또는 TERA로 감염을 통해 생산되었다. HEK293 세포는 1) rAAV 게놈 인코딩 EGFP, 2) AAV2 Rep 및 Cap, 및 3) Ad5 헬퍼를 인코딩하는 플라스미드로 삼중-형질감염되었거나, 독시사이클린 또는 DMSO의 존재 하에서, AAV2 Rep 및 Cap를 인코딩하는 플라스미드, 및 대조군 E1/E3 결실된 아데노바이러스 또는 TERA로 형질도입되었다. 재조합 바이러스는 형질도입후 72-시간 세포 용해물 및 성장 배지로부터 수확되었고, 캡슐화된 아데노바이러스 및 rAAV로부터, 바이러스 게놈은 아데노바이러스 DNA 인코딩 섬유에 대한 프라이머 및 프로브 세트, 또는 rAAV 및 아데노바이러스 둘 모두에 의해 인코딩된 CMV 프로모터를 사용하여 QPCR에 의해 정량화되었다.
도 16c는 세포 용해물 및 성장 배지로부터 캡슐화된 아데노바이러스 게놈의 정량화를 도시한다. 아데노바이러스의 유의미한 수준이 DMSO 및 독시사이클린, 각각으로 처리된 HEK293 세포에서 대조군 아데노바이러스 및 TERA로 감염 이후 검출되었던 반면, 아데노바이러스의 존재는, TERA 또는 헬퍼가 없는 생산 방법으로 형질도입된 경우, 독시사이클린 없이, HEK293 세포로부터 검정의 검출 범위 및 최저 표준 아래이었다. 대조적으로, 모든 샘플로부터 재조합 바이러스의 유의미한 수준은, 아데노바이러스 및 rAAVs 둘 모두에서 존재하는, 인코딩된 CMV 프로모터에 대한 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 QPCR 검정에 의해 검출되었다 (도 16d).
인코딩된 CMV 프로모터에 대한 바이러스 정량화 사용된 QPCR 프라이머 및 프로브가 rAAV 및 아데노바이러스 전달 벡터 모두를 검출하였기 때문에, 각각의 생산 방법 및 조건으로부터 총 rAAV는 검출된 전체적인 아데노바이러스 입자 오염의 삭감에 의해 결정되었다 (도 16a). E1/E3 결실된 아데노바이러스는 삼중 형질감염에 의해 헬퍼가 없는 생산 시스템에 비교할만한 또는 그 위이었던 rAAV를 생산하였고, 이는 또한 아데노바이러스 오염의 유의미한 수준과 동반되었다. 대조적으로, 독시사이클린의 부재 하에서, TERA-AAV로 감염된 HEK293 세포는 QPCR 검출의 한계를 넘는 아데노바이러스 오염으로 헬퍼가 없는 플라스미드 형질감염에 비교된 rAAV에서 ~5-배 증가를 산출하였다. (도 16b) 성장 배지에서 아데노바이러스 입자 오염은 Ad5 캡시드 단백질에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블랏에 의해 추가로 확인되었다. QPCR 분석으로부터 결과와 함께, 아데노바이러스 구조적 단백질은 독시사이클린 없이 HEK293 세포에서 TERA (MOI 100 및 500)으로 감염 또는 헬퍼가 없는 생산 방법으로부터 검출불가능하였고, 반면 아데노바이러스 단백질은, 활동적인 MLP를 가능하게 하는, 독시사이클린의 존재 하에서 TERA 감염으로부터 그리고 E1/E3 대조군 바이러스로부터 쉽게 검출되었다.
캡슐화된 rAAV 게놈을 가진 rAAV 입자를 결정하기 위해, 헬퍼가 없는 플라스미드 형질감염의 방법으로부터, 또는 플라스미드 Rep 및 Cap 형질감염된 HEK293 세포 속에 TERA 감염을 통해 생산된 rAAV 캡시드는 정량화되었다. 도 16E는 형성된-AAV2 바이러스 캡시드에 대한 ELISA 및 QPCR에 의한 rAAV 게놈의 정량화, 각각에 의해 결정된 총 rAAV2 캡시드 및 DNase-I 저항성 게놈 캡슐화된 입자를 도시한다. 도 16F는 세포 기준으로 TERA MOI 500 감염이, 헬퍼가 없는 생산 방법에 비교된, rAAV2 캡시드 및 DNase-I 저항성 게놈 캡슐화된 rAAVs의 상당히 더 많은 양을 생산하였다는 것을 도시한다. 전반적으로, 헬퍼가 없는 rAAV2 생산 및 TERA는 총 rAAV2 캡시드 입자의 ~30% 및 ~50%, 각각에 상당하는 게놈 캡슐화된 입자를 생산하였다.
독시사이클린의 부재 하에서 배양된, HEK293 세포내 rAAV 생산에서 TERA의 사용으로부터 아데노바이러스 입자 오염은 웨스턴 블랏 및 QPCR을 통해 검출불가능하였다. 도 16h는 헬퍼 없음의 방법에 의한 rAAV의 생산 이후 감염성 아데노바이러스 오염을 도시하고, 대조군 E1/E3 아데노바이러스 또는 TERA에 의한 감염은 HEK293 세포에서 조직 배양 감염량 50 검정 (TCID50)에 의해 결정되었다. 도 16g에서 나타낸 바와 같이, 독시사이클린의 존재 하에서 TERA 감염의 방법에 의해 생산된 미정제 rAAV로 HEK293 세포의 형질도입은 초기 EGFP 발현 및 아데노바이러스 CPE 세포 형태를 초래한다. 완전한 대조로, 독시사이클린의 부재는, 짐작컨대 rAAV 게놈의 제2-가닥 DNA 합성에 필요한 시간 및 rAAV로부터 발현된, EGFP 리포터 및 온전한 세포 단일층의 지연된 발현으로부터 보여진 바와 같이 MLP 및 아데노바이러스 자기-억압을 가능하게 한다. 추가적으로, 감염성 아데노바이러스가 아데노바이러스 부족한 rAAV2 헬퍼가 없는 생산 방법에 의해 검출되지 않았던 반면, MOI 100 및 500에서 TERA 감염에 의한 rAAV 생산은 대조군 E1/E3 아데노바이러스를 사용하는 rAAV2 생산에 비교된 0.0003% (>2e6 배 억압) 및 0.007%, 각각의 수준에서 감염성 아데노바이러스 오염을 나타낸다. 전반적으로, MLP 자기-억압을 가능하게 하기 위한 독시사이클린의 부재 하에서, MOI 100 및 500에서 HEK293 세포내 TERA 감염은, E1/E3 결실된 대조군 아데노바이러스로 감염에 비교된, ~3 x 106 및 ~1.5 x 104 배, 각각만큼 아데노바이러스 오염을 감소시켰다.
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Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys 130 135 140 Val Leu Glu Asp Gln Glu His Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr 145 150 155 160 Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro Pro Leu Leu Arg Gln Ala Ile Glu Leu 165 170 175 Phe Asp His Gln Gly Ala Glu Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu 180 185 190 Ile Ile Cys Gly Leu Glu Lys Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser 195 200 205 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Opposite TetR binding site <400> 5 Glu Ser Leu Ser Leu Ile Gly Thr 1 5 <210> 6 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MLP <400> 6 cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgaccgggtg 60 ttcctgaagg ggggctataa aaggtcccta tcagtgatag agactca 107 <210> 7 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MLP <400> 7 cgccctcttc ggcatcaagg aaggtgattg gtttgtaggt gtaggccacg tgactcccta 60 tcagtgatag agaactataa aaggtcccta tcagtgatag agactca 107 <210> 8 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence in viral vector or other sequence <400> 8 aggccagcac gaaggaggct aagtgggagg ggtagcggtc gttgtccact agggggtcca 60 ctcgctccag ggtgtgaaga cacatgtcgc cctcttcggc atcaaggaag gtgattggtt 120 tgtaggtgta ggccacgtga ccgggtgttc ctgaaggggg gctataaaag gtccctatca 180 gtgatagaga ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tggggtgagt 240 actccctctg aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt gtcagtttcc aaaaacgagg 300 aggatttgat attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag ggtggccgca tccatctggt 360 cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tggtggcaaa cgacccgtag agggcg 416 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad5 fiber forward primer <400> 9 tggctgttaa aggcagtttg g 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ad5 fiber reverse primer <400> 10 gcactccatt ttcgtcaaat ctt 23 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan probe <400> 11 tccaatatct ggaacagttc aaagtgctca tct 33 <210> 12 <211> 173 <212> PRT <213> Human adenovirus type 5 <400> 12 Ile Ala Lys Leu Leu Ser Asn Ala Leu Tyr Gly Ser Phe Ala Thr Lys 1 5 10 15 Leu Asp Asn Lys Lys Ile Val Phe Ser Asp Gln Met Asp Ala Ala Thr 20 25 30 Leu Lys Gly Ile Thr Ala Gly Gln Val Asn Ile Lys Ser Ser Ser Phe 35 40 45 Leu Glu Thr Asp Asn Leu Ser Ala Glu Val Met Pro Ala Phe Gln Arg 50 55 60 Glu Tyr Ser Pro Gln Gln Leu Ala Leu Ala Asp Ser Asp Ala Glu Glu 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Arg Ala Pro Thr Pro Phe Tyr Ser Pro Pro Ser Gly 85 90 95 Thr Pro Gly His Val Ala Tyr Thr Tyr Lys Pro Ile Thr Phe Leu Asp 100 105 110 Ala Glu Glu Gly Asp Met Cys Leu His Thr Leu Glu Arg Val Asp Pro 115 120 125 Leu Val Asp Asn Asp Arg Tyr Pro Ser His Leu Ala Ser Phe Val Leu 130 135 140 Ala Trp Thr Arg Ala Phe Val Ser Glu Trp Ser Glu Phe Leu Tyr Glu 145 150 155 160 Glu Asp Arg Gly Thr Pro Leu Glu Asp Arg Pro Leu Lys 165 170 <210> 13 <211> 390 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 13 cactaggggg tccactcgct ccagggtgtg aagacacatg tcgccctctt cggcatcaag 60 gaaggtgatt ggtttgtagg tgtaggccac gtgaccgggt gttcctgaag gggggctata 120 aaagggggtg ggggcgcgtt cgtcctcact ctcttccgca tcgctgtctg cgagggccag 180 ctgttggggt gagtactccc tctgaaaagc gggcatgact tctgcgctaa gattgtcagt 240 ttccaaaaac gaggaggatt tgatattcac ctggcccgcg gtgatgcctt tgagggtggc 300 cgcatccatc tggtcagaaa agacaatctt tttgttgtca agcttggtgg caaacgaccc 360 gtagagggcg ttggacagca acttggcgat 390 <210> 14 <211> 390 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 14 atcgccaagt tgctgtccaa cgccctctac gggtcgtttg ccaccaagct tgacaacaaa 60 aagattgtct tttctgacca gatggatgcg gccaccctca aaggcatcac cgcgggccag 120 gtgaatatca aatcctcctc gtttttggaa actgacaatc ttagcgcaga agtcatgccc 180 gcttttcaga gggagtactc accccaacag ctggccctcg cagacagcga tgcggaagag 240 agtgaggacg aacgcgcccc cacccccttt tatagccccc cttcaggaac acccggtcac 300 gtggcctaca cctacaaacc aatcaccttc cttgatgccg aagagggcga catgtgtctt 360 cacaccctgg agcgagtgga ccccctagtg 390 <210> 15 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MLP <400> 15 Ala Lys Glu Arg Ala Asp Arg Asp Lys Asn Gln Thr Leu Arg Ser Ile 1 5 10 15 Ala Lys Leu Leu Ser Asn Ala Leu Tyr Gly Ser Phe Ala Thr Lys Leu 20 25 30 Asp Asn Lys Lys Ile Val Phe Ser Asp Gln Met Asp Ala Ala Thr Leu 35 40 45 Lys Gly Ile Thr Ala Gly Gln Val Asn Ile Lys Ser Ser Ser Phe Leu 50 55 60 Glu Thr Asp Asn Leu Ser Ala Glu Val Met Pro Ala Phe Gln Arg Glu 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Gln Gln Leu Ala Leu Ala Asp Ser Asp Ala Glu Glu Ser 85 90 95 Glu Ser Leu Ser Leu Ile Gly Thr Phe Tyr Ser Pro Pro Ser Gly Thr 100 105 110 Pro Gly His Val Ala Tyr Thr Tyr Lys Pro Ile Thr Phe Leu Asp Ala 115 120 125 Glu Glu Gly Asp Met Cys Leu His Thr Leu Glu Arg Val Asp Pro Leu 130 135 140 Val Asp Asn Asp Arg Tyr Pro Ser His Leu Ala Ser Phe Val Leu Ala 145 150 155 160 <210> 16 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MLP <400> 16 aggccagcac gaaggaggct aagtgggagg ggtagcggtc gttgtccact agggggtcca 60 ctcgctccag ggtgtgaaga cacatgtcgc cctcttcggc atcaaggaag gtgattggtt 120 tgtaggtgta ggccacgtga ccgggtgttc ctgaaggggg gctataaaag gtccctatca 180 gtgatagaga ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tggggtgagt 240 actccctctg aaaagcgggc atgacttctg cgctaagatt gtcagtttcc aaaaacgagg 300 aggatttgat attcacctgg cccgcggtga tgcctttgag ggtggccgca tccatctggt 360 cagaaaagac aatctttttg ttgtcaagct tggtggcaaa cgacccgtag agggcgttgg 420 acagcaactt ggcgatggag cgcagggttt ggtttttgtc gcgatcggcg cgctccttgg 480 480 <210> 17 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MLP <400> 17 ccaaggagcg cgccgatcgc gacaaaaacc aaaccctgcg ctccatcgcc aagttgctgt 60 ccaacgccct ctacgggtcg tttgccacca agcttgacaa caaaaagatt gtcttttctg 120 accagatgga tgcggccacc ctcaaaggca tcaccgcggg ccaggtgaat atcaaatcct 180 cctcgttttt ggaaactgac aatcttagcg cagaagtcat gcccgctttt cagagggagt 240 actcacccca acagctggcc ctcgcagaca gcgatgcgga agagagtgag tctctatcac 300 tgatagggac cttttatagc cccccttcag gaacacccgg tcacgtggcc tacacctaca 360 aaccaatcac cttccttgat gccgaagagg gcgacatgtg tcttcacacc ctggagcgag 420 tggaccccct agtggacaac gaccgctacc cctcccactt agcctccttc gtgctggcct 480 480 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA polymerase coding sequence between MLP TATA box and +1 <400> 18 Glu Asn Glu Arg Ala Pro Thr Pro 1 5

Claims (31)

  1. 억압성 주요 후기 프로모터 (MLP) 및 다수의 아데노바이러스 후기 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터로서, 상기 MLP가 상기 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 조절 또는 제어할 수 있는 하나 이상의 리프레서 요소를 포함하고, 상기 하나 이상의 리프레서 요소가 MLP TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이에 삽입되는, 아데노바이러스 벡터.
  2. 하기를 포함하는, 아데노바이러스 벡터로서:
    (a) 다수의 아데노바이러스 초기 유전자, 및
    (b) 주요 후기 프로모터 (MLP)의 제어 하의 다수의 아데노바이러스 후기 유전자, 및
    (c) 이식유전자,
    상기 MLP는 상기 아데노바이러스 후기 유전자의 전사를 조절 또는 제어할 수 있는 하나 이상의 리프레서 요소를 포함하고, 상기 하나 이상의 리프레서 요소가 MLP TATA 박스와 전사의 +1 위치 사이에 삽입되는, 아데노바이러스 벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리프레서 요소가 리프레서 단백질에 의해 결합될 수 있는 것인, 아데노바이러스 벡터.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리프레서 요소에 결합할 수 있는 리프레서 단백질을 인코딩하는 유전자가 상기 아데노바이러스 게놈 내에서 인코딩되는, 아데노바이러스 벡터.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 리프레서 단백질이 상기 MLP의 제어 하에서 전사되는, 아데노바이러스 벡터.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 리프레서 단백질이 테트라사이클린 리프레서, 락토스 리프레서 또는 엑디손 리프레서인, 아데노바이러스 벡터.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리프레서 요소가 서열번호: 2에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 테트라사이클린 리프레서 결합 부위인, 아데노바이러스 벡터.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, MLP의 뉴클레오타이드 서열이 서열번호: 6 또는 7에서 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 아데노바이러스 벡터.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 리프레서 요소가 아데노바이러스 E2B 단백질의 생산에 영향을 주지 않는, 아데노바이러스 벡터.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 L4 100K 단백질을 인코딩하고 상기 L4 100K 단백질이 상기 MLP의 제어 하에 있지 않는, 아데노바이러스 벡터.
  11. 제 2 항에 있어서, (A) 상기 이식유전자가 상기 아데노바이러스 초기 영역 중 하나 내에서 삽입되거나; (B) 상기 이식유전자가 이의 5'-UTR 내 트리파타이트 리더 (TPL)를 포함하거나; (C) 상기 이식유전자가 치료적 폴리펩타이드를 인코딩하거나; (D) 상기 이식유전자가 바이러스-유사 입자를 생산하기 위해 세포 내에서 또는 외부에서 어셈블리할 수 있는 바이러스 단백질을 인코딩하거나; 또는 (E) 상기 이식유전자가 AAV Rep 폴리펩타이드, AAV Cap 폴리펩타이드, AAV Rep-Cap 폴리펩타이드를 인코딩하고/하거나 상기 이식유전자가 AAV 게놈을 인코딩하는, 아데노바이러스 벡터.
  12. 하나 이상의 생리학적으로-허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 아데노바이러스 벡터를 포함하는 아데노바이러스 입자를 포함하는, 조성물.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 아데노바이러스 벡터를 포함하는 키트로서, 상기 키트가 추가적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적 성분을 포함하는, 키트:
    (i) 세포주로서, 상기 아데노바이러스 벡터가 상기 세포주의 세포를 감염시키게 하고 상기 아데노바이러스의 게놈을 복제시키게 하는 세포주로서, 상기 세포주는 상기 아데노바이러스 벡터의 MLP를 억압시키는, 세포주 및
    (ii) 상기 아데노바이러스 벡터의 작제에 일조하기 위한 하나 이상의 DNA 플라스미드.
  14. 삭제
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 아데노바이러스 벡터를 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  16. 하기 단계를 포함하는, 변형된 포유동물 세포의 생산 방법으로서,
    (a) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 아데노바이러스 벡터로 포유동물 세포를 감염시키는 단계이되, 그것에 의하여 상기 포유동물 세포는 그 다음에 상기 아데노바이러스 벡터를 포함하는 것인, 단계,
    상기 방법은 생체외 수행되는 것인, 방법.
  17. 하기 단계를 포함하는, 이식유전자 생성물의 생산 방법으로서:
    (a) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 아데노바이러스 벡터로 포유동물 세포를 감염시키는 단계로서, 상기 아데노바이러스 벡터는 이식유전자를 포함하는 것인, 단계;
    (b) 상기 이식유전자가 발현되는 조건 하에 배양 배지에서 상기 감염된 포유동물 세포를 배양시키는 단계; 및
    (c) 상기 세포로부터 또는 상기 세포 배양 배지로부터 이식유전자 생성물을 단리 또는 정제시키는 단계,
    상기 방법은 생체외 수행되는 것인, 이식유전자 생성물의 생산 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
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