CN112501207B - 外源基因可控表达的腺病毒包装方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域,具体而言,涉及一种外源基因可控表达的腺病毒包装载体。该方法所采用的腺病毒包装载体具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒;所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因;当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。本发明创造性的将阻遏型操作子整合到腺病毒载体中,可以降低病毒包装过程中外源基因表达,从而排除外源基因的影响,提升特定病毒的产量。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体而言,涉及一种外源基因可控表达的腺病毒包装方法。
背景技术
病毒载体可将遗传物质带入细胞,原理是利用病毒具有高亲和性结合细胞表面受体,并传送其基因组进入某些类型细胞,进行感染的分子机制。广泛应用于基础研究、基因疗法或疫苗。
腺病毒特别适于用作病毒载体。腺病毒是无包膜病毒,直径约90nm~100nm,包含核衣壳和线性双链DNA基因组。病毒核衣壳包含五邻体衣壳体和六邻体衣壳体。一种独特的纤维与各五邻体基质相关,并且帮助病毒经由宿主细胞表面的柯萨奇病毒-腺病毒受体而附着到宿主细胞上。已识别出超过50种的腺病毒血清型菌株,其中大多数引起人类的呼吸道感染、结膜炎和胃肠炎。腺病毒通常作为宿主细胞核中的游离基因成分复制,而不是整合到宿主基因组中。腺病毒的基因组包含4个早期转录单位(E1、E2、E3和E4),其主要具有调节功能,并为宿主细胞复制病毒作准备。基因组还包含5个晚期转录单位(L1、L2、L3、L4和L5),其转录包括五邻体(L2)、六邻体(L3)、支架蛋白(L4)和纤维蛋白(L5)在内的结构蛋白,其中结构蛋白受单个启动子的控制。基因组的每一末端都包含病毒复制所必需的末端反向重复(ITR)序列。
目前病毒载体的研究都集中在感染能力、特异性、包装容量等方面,而对于包装的外源基因(gene of interest,GOI)对于病毒的影响关注很少,在实践中,有相当一部分外源基因是无法获得有效的病毒颗粒。这是因为,在病毒包装过程中,一方面,外源基因通常由强启动子驱动,其表达对细胞状态,病毒的包装,出毒等过程都有无法预料的影响。
发明内容
本发明涉及一种腺病毒包装载体,具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒;
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因;
当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种腺病毒包装载体系统,其包括如上所述的腺病毒包装载体以及框架载体。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种腺病毒的包装方法,所述方法将包含如上所述的腺病毒包装载体系统转入宿主细胞,并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
无需判断外源基因是否对腺病毒产生影响,因为没有阻遏物的时候,阻遏系统不会发挥作用,也不会影响目的基因的表达。当发现出毒明显低于平均水平的时候,配合包含阻遏蛋白表达的辅助质粒即可进行抑制外源基因的病毒包装过程,从而排除外源基因的影响,提升特定病毒的产量,无需重新构建新的穿梭载体,节省了大量的时间以及人力和物力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1~图5依次为本发明一个实施例中pcDNA3.1-CymR、CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO载体的质粒图谱;
图6为本发明一个实施例中CymR-CuO在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图7为本发明一个实施例中CMV-TrpO质粒图谱;
图8为本发明一个实施例中色氨酸操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图9为本发明一个实施例中EF1a-ToxO质粒图谱;
图10为本发明一个实施例中白喉毒素抑制子调控系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图11为本发明一个实施例中SFH-LacO质粒图谱;
图12为本发明一个实施例中乳糖操作子系统在慢病毒载体中的阻遏效率验证结果;
图13为本发明一个实施例中TrpO元件相对于CMV的TATA Box的插入位置示意图;
图14为本发明一个实施例中TrpO元件不同插入位置对阻遏效率的影响;
图15为本发明一个实施例中CuO元件相对于CMV的TATA Box的插入位置示意图;
图16为本发明一个实施例中CuO元件不同插入位置对阻遏效率的影响;
图17为本发明一个实施例中腺病毒载体表达CMV-NLS-iCre基因的荧光结果图;
图18为本发明一个实施例中腺病毒载体表达CMV-NLS-iCre基因的滴度检测结果;
图19~图21依次为本发明一个实施例中pShuttle-CMV-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP、pShuttle-CMV-TrpO-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP和pShuttle-CMV-CuO-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP的质粒图谱。
图22为本发明原理示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种腺病毒包装载体,具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒;
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子、阻遏型操作子以及任选的目的基因;
当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达。
本发明通过阻遏型操作子使得目的基因的表达可被调控,从而实现选择性地抑制外源基因在腺病毒包装细胞中的表达,避免外源基因对腺病毒包装与生产的负面影响,提高病毒的生产效率和滴度,同时在靶细胞中不降低外源基因的表达水平,不影响治疗效果或研究外源基因的功能。
在本发明中术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体优选为质粒。
在一些实施方式中,所述阻遏型操作子选自色氨酸操作子和/或Cumate-CuO可调控系统。
在一些实施方式中,所述阻遏型操作子具有一个或多个拷贝。
在一些实施方式中,所述氨酸操作子中的TrpO元件在所述基因表达盒的插入位置距离所述启动子的TATA BOX小于等于18个核苷酸,例如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个核苷酸。
在一些实施方式中,所述Cumate-CuO可调控系统中的CuO元件的插入位置距离所述启动子的TATA BOX 40~50个核苷酸,例如41、42、43、44、45、46、47、48、49个核苷酸。
上述阻遏型操作子元件和启动子的TATA BOX之间的距离是指该元件的5’端的第一个核苷酸(不含)到TATA BOX 3’端的第一个核苷酸(不含)的核苷酸个数。
需要说明的是,一般认为TATA BOX后8个核苷酸以内(含第8个核苷酸)都属于启动子核心区域。所以优选TrpO元件与启动子的TATA BOX之间的距离大于8个核苷酸,当该元件与该8个核苷酸有重叠序列时可以距离TATA BOX更近。
“启动子”为指导RNA聚合酶结合并由此启动RNA合成的DNA序列。本发明所使用的启动子允许在各种各样的细胞和组织类型中表达;或者可以为无细胞特异性启动子,或者可为“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子,其允许分别在种类受限的细胞和组织类型中表达。在具体实施方案中,可取的是使用细胞、细胞类型、细胞谱系或组织特异性表达控制序列,以实现所需多核苷酸序列的细胞类型特异性、细胞谱系特异性或组织特异性表达(例如,仅在细胞类型、细胞谱系或组织的子群中或在特定发育阶段表达编码多肽的核酸)。
组织特异性启动子的示例性实例包括但不限于:B29启动子(B细胞表达)、runt转录因子(CBFa2)启动子(干细胞特异性表达)、CD14启动子(单核细胞表达)、CD43启动子(白细胞和血小板表达)、CD45启动子(造血细胞表达)、CD68启动子(巨噬细胞表达)、CYP4503A4或ALB启动子(肝细胞表达)、肌间线蛋白启动子(肌肉细胞表达)、弹性蛋白酶I启动子(胰腺泡细胞表达)、内皮糖蛋白启动子(内皮细胞表达)、成纤维细胞特异性蛋白I启动子(FSPl)启动子(成纤维细胞表达)、纤连蛋白启动子(成纤维细胞表达)、fms-相关的酪氨酸激酶I(FLTl)启动子(内皮细胞表达)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形胶质细胞表达)、胰岛素启动子(胰腺细胞表达)、整合蛋白-α-2b(ITGA2B)启动子(巨核细胞)、胞内粘着分子2(ICAM-2)启动子(内皮细胞)、干扰素-β(IFN-β)启动子(造血细胞)、角蛋白5启动子(角化细胞表达)、肌红蛋白(MB)启动子(肌肉细胞表达)、成肌分化I(MYOD1)启动子(肌肉细胞表达)、肾病蛋白启动子(足细胞表达)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白2(OG-2)启动子(成骨细胞表达)、3-酮酸CoA转移酶2B(Oxct2B)启动子(单倍体精细胞表达)、表面活化蛋白B(SP-B)启动子(肺细胞表达)、突触蛋白启动子(神经细胞表达)、Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASP)启动子(造血细胞表达)。
在一些实施方式中,所述启动子为无细胞特异性的启动子。示例性的无细胞特异性的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)极早期启动子,病毒性猿猴病毒40(SV40)(例如,早期或晚期)、莫罗尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子,劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子,牛痘病毒的H5、P7.5和Pll启动子,延长因子l-α(EFla)启动子,早期生长应答I(EGRl)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、3_磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、真核生物翻译起始因子4A 1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDa-β成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人R0SA26基因座(Irions et al.,(2007)Nature Biotechnology25,1477-1482)、泛激素C启动子(UBC),磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子,巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子,以及β-肌动蛋白启动子。无细胞特异性的启动子能使得所述基因表达盒具有更好的通用性及表达效率。
在一些优选的实施方式中,所述启动子是CMV、EF1a、SFH、CAG启动子、CBh、UBC、SFFV、SV40、RSV、mCMV、GAPDH、PGK、CASI、SMVP、GUSB(hGBp)或UCOE。
在一些实施方式中,所述阻遏型操作子下游插入有目的基因;
且当所述目的基因表达时会对病毒包装产生负面影响。
在本发明中,“对病毒包装产生负面影响”是指降低病毒的包装效率,减缓或阻碍腺病毒出毒,或直接杀伤包装细胞。另一方面,目的基因如果能大量转录与翻译也会占用细胞过多的RNA转录、蛋白质翻译相关的酶类与资源,从而间接抑制了重组病毒各功能基因的转录与翻译。两个方面的影响降低了重组病毒在包装细胞中的生产效率,无法获得足够的病毒滴度。
在一些实施方式中,所述目的基因对包装细胞产生细胞毒性。
在一些实施方式中,所述目的基因选自自杀基因、细胞凋亡基因(或称细胞程序性死亡基因)和癌基因。
常见的自杀基因系统有以下几种可以为tk-GCV系统、CD-5-FC系统、gpt-6-TX系统、P450 2BI-CPA系统等。
细胞凋亡基因在本申请中也可用细胞程序性死亡基因所替代,以下非限制性地列出下述基因:Bcl-2基因、P53基因、细胞色素C基因、凋亡蛋白激活因子1基因(apoptoticproteaseactivating factor 1,Apaf-1)、Caspase家族蛋白基因等。
Caspase家族蛋白优选可以分为启动Caspase(Caspase8、9、10)和执行Caspase(Caspase 3、6、7)。
癌基因主要的类型包括:酪氨酸激酶(如src)、其他蛋白激酶(如raf)、G蛋白(如ras)、生长因子(如Sis)、生长因子受体(如ErbB),以及位于细胞核内的蛋白(如转录因子MYC)。
在一些实施方式中,所述目的基因为细胞周期相关基因。例如Caspase家族蛋白基因和MAPK信号通路相关基因。
在一些实施方式中,所述目的基因直接抑制病毒的复制和/或组装。
在一些实施方式中,所述目的基因选自iCre基因或Caspase 8基因。
在一些实施方式中,所述的腺病毒包装载体还包含报告基因、增强子、内部核糖体进入位点、终止子和多腺苷酸化信号中的至少一种。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种腺病毒包装载体系统,其包括如上所述的腺病毒包装载体以及框架载体。
如上所述的腺病毒包装载体作为穿梭载体使用。
在一些实施方式中,所述腺病毒包装载体系统基于Adeasy系统或AdMAX系统。
AdMax系统通常为两质粒系统,组成为穿梭质粒(例如pHBAd系列,包括包括过表达、干扰等类型)和骨架质粒(例如pBHGlox(delta)E1,3Cre)。AdMax系统通过Cre-loxP重组酶系统,使共转染到细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒(腺病毒基因组质粒)在重组酶的作用下产生重组腺病毒,获得的病毒滴度更高。
AdEasy包装系统主要的特点是利用Cre/loxP系统在大肠杆菌中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程,获得环状的重组腺病毒基因组,并且具有在细菌中复制的必需元件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染293细胞,避免了双质粒共转染得到重组腺病毒。
根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种腺病毒的包装方法,所述方法将包含如上所述的腺病毒包装载体系统转入宿主细胞,并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。
在一些实施方式中,所述宿主细胞为HEK-293细胞或其能够提供腺病毒E1区的衍生株。
在一些实施方式中,所述衍生株选自HEK-293A、HEK-293S、HEK-293SG、HEK-293SGGD、HEK-293T、HEK-293T/17SF、HEK-293H、HEK-293E、HEK-293-6E、HEK-293F、HEK-293FT、HEK-293FTM、AAV-293以及GP2-293中的至少一种。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1阻遏型操作子的选择
本发明共测试了4种转录调控系统:CymR-CuO、色氨酸操作子、白喉毒素抑制子调控系统、乳糖操作子。
首先通过在慢病毒载体(该载体为穿梭载体,单独转染细胞使用可作为通用真核载体使用,其结论不局限于慢病毒)上引入这四个系统的顺式作用元件,测试是否在真核系统中有抑制外源基因表达的效果。
一、质粒转染
质粒转染293T的方法,具体包括:
1、转染前一天,将293T细胞接种到培养皿中;转染前一小时取出细胞培养皿,弃去原有细胞培养基,加入Opti-MEM培养基,将细胞放回培养箱;制备转染试剂和质粒的复合物,包括以下步骤:
2、将待转染的一种或多种质粒根据需要等比例混合溶于Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置后得到质粒稀释液。
3、将转染试剂溶于Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置后得到转染试剂稀释液;将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中,边加边轻轻混匀后在室温放置15-25min,使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体;取出细胞培养皿,将准备好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养皿中,放回培养箱;
4、5-8小时后吸去培养基,用PBS溶液洗涤后加入新鲜完全培养基培养,其中色氨酸操作子组需更换含有0.3mM色氨酸的完全培养基,白喉毒素抑制子系统需要加入二价铁离子。
二、不同阻遏型操作子系统的验证
1.CymR-CuO系统
CymR-CuO系统是一类可调控的表达系统。其原理如下:
CymR蛋白在Cumate(枯酸)不存在的情况下,可以特异性的和CuO元件结合,从而抑制基因的转录。在Cumate存在的情况下,结合了Cumate的CymR将脱离CuO元件,从而使基因正常表达。
本发明构建了CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO一系列启动子载体,证实了CuO元件配合CymR载体(pcDNA3.1-CymR)可以有效抑制基因的表达。其中pcDNA3.1-CymR的质粒图谱如图1所示,CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO启动子载体的质粒图谱依次如图2~5所示。
将带有CuO原件的慢病毒载体分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-CymR共转293T细胞,24小时后荧光拍照,可以看到,在CymR蛋白的作用下,CMV-CuO、EF1a-CuO、SFH-CuO、CAG-CuO启动子的表达效率均有明显的抑制(图6)。
2.色氨酸操作子系统
在Trp repressor(TrpR)蛋白在色氨酸存在的情况下,可以特异性的和TrpO元件结合,从而抑制基因的转录。该系统在原核细胞中发现,长期以来用作基因调控的讲解示范,但是由于哺乳动物细胞培养中色氨酸是必须的,所以该系统并没有在真核细胞中得以应用。
本发明构建了CMV-TrpO、EF1a-TrpO、SFH-TrpO、CAG-TrpO等一系列启动子载体,证实了TrpO元件配合TrpR载体(pcDNA3.1-TrpR)在色氨酸的存在下可以有效抑制基因的表达。其中CMV-TrpO质粒图谱如图7所示,EF1a-TrpO、SFH-TrpO、CAG-TrpO启动子载体的质粒图谱的设计方式可在图7的基础上参考图2~5,不再赘述。
带有TrpO原件的载体分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-TrpR共转293T细胞,同时添加0.3mM的色氨酸,24小时后荧光拍照,可以看到,在TrpR蛋白的作用下,CMV-TrpO、EF1a-TrpO、SFH-TrpO、CAG-TrpO启动子的表达效率均有明显的抑制(图8)。
3.白喉毒素抑制子调控系统
白喉毒素抑制子DtxR蛋白可以特异性的和ToxO元件结合,从而抑制基因的转录。本发明构建了CMV-ToxO、EF1a-ToxO、SFH-ToxO、CAG-ToxO等一系列启动子载体,分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-DtxR共转293T细胞并加入二价铁离子的情况下,没有发现目的基因受到明显的抑制作用(图10)。
其中EF1a-ToxO的质粒图谱如图9所示,CMV-ToxO、SFH-ToxO、CAG-ToxO启动子载体的质粒图谱的设计方式可在图9的基础上参考图2~5,不再赘述。
4.乳糖操作子系统
乳糖操作子抑制蛋白LacI可以特异性的和LacO元件结合,从而抑制基因的转录。在IPTG存在的情况下则与之结合并发生构象变化,丧失结合能力,下游基因开始表达。乳糖操作子在原核细胞中广泛用于外源基因的诱导表达。
本发明构建了CMV-LacO、EF1a-LacO、SFH-LacO、CAG-LacO等一系列启动子载体,分别与pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-LacI共转293T细胞,没有发现目的基因受到明显的抑制作用(图12)。
其中SFH-LacO的质粒图谱如图11所示,CMV-LacO、EF1a-LacO、CAG-LacO启动子载体的质粒图谱的设计方式可在图11的基础上参考图2~5,不再赘述。
三、阻遏型操作子元件的插入位置优化
1.TrpO元件
TrpO元件相对于CMV的TATA Box距离不同,发明人设计了两个启动子,如图13所示,质粒配合pcDNA3.1-TrpR共同转染(加入0.1mM色氨酸),48小时后观察荧光,实验显示,距离TATA Box的位置不同,会产生不同的抑制效果(见图14),本发明后续均使用抑制效果更好的TrpO v2启动子序列。
2.CuO元件
CuO元件相对于CMV的TATA Box距离不同,设计了3个启动子,如图15所示,质粒配合pcDNA3.1-CymR共同转染,48小时后观察荧光,实验显示,CuO元件距离TATA Box的位置不同,会产生不同的抑制效果(见图16),本发明后续均使用抑制效果更好的CuO v1启动子序列。
实施例2 ADV病毒包装与病毒滴度检测
一、HEK-293-CMV-CymR和HEK-293-CMV-TrpR稳定细胞株的构建
此实施例构建了HEK-293-CMV-CymR和HEK-293-CMV-TrpR稳定细胞株,具体包括:
将pcDNA3.1-CymR或pcDNA3.1-TrpR利用MfeI和BstBI(NEB公司)进行双酶切线性化;酶切4~6小时后,利用回收试剂盒(QIAGEN公司)对线性化条带进行回收,回收完成后,测浓度及琼脂糖凝胶确认;
质粒转染前一天选取状态良好的HEK 293细胞,消化后收集细胞,计数后按照2×105个/孔铺于24孔板,摇匀,放置37℃、5%CO2培养箱培养。转染前换液:质粒转染前1小时将前一天铺好的24孔板从培养箱中拿出,弃去原培养基,每孔加入0.5mL预热好的Opti-MEM培养基,然后放入5%CO2培养箱待转染。将待转染的线性化的质粒(pcDNA3.1-CymR或pcDNA3.1-TrpR)溶于Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置;将转染试剂与Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置;将转染试剂混匀液滴加到质粒混匀液中,边加边轻轻混匀后在室温放置15-25分钟;取出细胞培养板,将准备好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中,避免细胞吹起,放回培养箱;
转染48小时后,加入G418(400ug/ml)进行筛选,经鉴定混合克隆表达CymR或TrpR;将此混合克隆细胞按照有限稀释法挑选pcDNA3.1-CymR或pcDNA3.1-TrpR稳定表达的HEK-293单克隆细胞。
二、ADV病毒包装
此实施例为一种腺病毒的包装方法,为腺病毒AdEasy系统,具体包括:
1、穿梭质粒重组
将带有外源基因(CMV-NLS-iCre)的穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的质粒(pAdEasy)进行重组,经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒。所述穿梭质粒为:pShuttle-CMV-iCre-3xFlag-P2A-sfGFP、pShuttle-CMV-CuO-iCre-3xFlag-P2A-sfGFP或者pShuttle-CMV-TrpO-iCre-3xFlag-P2A-sfGFP。具体步骤如下:
1.1、将穿梭质粒(pShuttle-CMV-iCre-3xFlag-P2A-sfGFP、pShuttle-CMV-CuO-iCre-3xFlag-P2A-sfGFP或者pShuttle-CMV-TrpO-iCre-3xFlag-P2A-sfGFP)用PmeI(NEB公司)进行线性化酶切;
1.2、酶切4~6小时后,利用回收试剂盒(QIAGEN公司)对线性化条带进行回收,回收完成后,测浓度及琼脂糖凝胶确认;
1.3、将BJ5183感受态细胞从-80℃拿出,迅速置于冰上,5分钟待菌块融化后,将目的质粒(1.1和1.2处理得到线性化后的穿梭质粒)与pAdEasy共同加入BJ5183感受态细胞中,轻轻混匀后,冰上静置25-30分钟,42℃水浴热激90s,立即放置冰上2分钟;向离心管中加入800ul不含抗生素的无菌培养基,37℃,200rpm振荡培养60分钟;3000rpm离心1分钟收集菌体,留取100μl上清重悬菌体,均匀涂布于含有卡纳(Kana)抗性的筛选平板上,正面放置10min,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养箱培养12-16小时;
1.4、挑取10-20个单克隆菌落,小量质粒抽提后进行Pac I酶切鉴定,鉴定到重组阳性的克隆即为我们要的重组质粒。
1.5、将重组好的质粒参考1.1和1.2的进行线性化处理用于下步的转染
2、重组后质粒的转染
2.1、铺板:质粒转染前一天选取状态良好的HEK 293或者pcDNA3.1-CymR或pcDNA3.1-TrpR稳定表达的HEK-293细胞,消化后收集细胞,计数后按照1×106个/孔铺于6孔板,摇匀,放置37℃、5%CO2培养箱培养。
2.2、转染前换液:质粒转染前1小时将前一天铺好的6孔板从培养箱中拿出,弃去原培养基,每孔加入1.5mL预热好的Opti-MEM培养基,然后放入5%CO2培养箱待转染。
2.3、配置转染体系:(6孔板的每个孔)
将待转染的线性化的病毒穿梭质粒溶于Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置;将转染试剂与Opti-MEM培养基,轻轻混匀,静置;将转染试剂混匀液滴加到质粒混匀液中,边加边轻轻混匀后在室温放置15-25分钟;
2.4、取出细胞培养板,将准备好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中,避免细胞吹起,放回培养箱;
3、病毒扩增
将转好后的细胞,3~5天更换一次培养基,注意观察病毒出毒,出毒后进行病毒扩增;其中色氨酸操作子组(pShuttle-CMV-TrpO-iCre-3xFlag-P2A-sfGFP)需更换含有0.3mM色氨酸的完全培养基。
4、病毒收毒及纯化
准备好50ml离心管,用1ml的移液器吸取细胞上清液来回吹打皿细胞,使细胞完全脱落,将细胞及上清全部收集到50ml的离心管中,利用液氮进行反复冻融后,4000rpm离心10分钟,取上清,用0.22μm的滤器过滤病毒,分装到病毒管中,-80℃保存。
三、腺病毒滴度检测
采用腺病毒滴度检测试剂盒进行腺病毒检测,其原理是腺病毒可以感染并且在HEK293细胞中复制,表达一种特殊的外壳蛋白Hexon,利用免疫染色方法检测阳性细胞,被病毒感染的阳性细胞会被染成褐色,计数阳性细胞,利用公式计算腺病毒滴度。具体包括:
1、选取状态良好的HEK293细胞,铺板,37℃、5%CO2培养1小时;
2、准备好10倍梯度稀释的病毒样品,每孔逐滴加入100μl病毒样品,混匀后置于37℃、5%CO2培养箱感染2天;
3、轻轻的去除培养液,沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇,-20℃固定20分钟;
4、使用PBS轻轻的冲洗细胞3次,每次5分钟;
5、使用1%BSA的PBS,37℃封闭1小时;
6、加入anti-Hexon抗体溶液至每个孔中,37℃孵育1小时;
7、使用PBS轻轻的冲洗细胞3次,每次5min;
8、加入辣根过氧化物酶标记的二抗至每孔,37℃孵育1小时;
9、使用PBS轻轻的冲洗细胞3次,每次5min。
10、加入1×DAB工作液至每孔,室温孵育5-10分钟
11、弃DAB,使用PBS清洗2次,每孔加入1mlPBS。
12、每孔随机选择5个视野,使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。
13、计算每孔阳性细胞的平均个数和腺病毒滴度。
实施例3 ADV病毒载体表达CMV-NLS-iCre基因
在病毒生产中我们发现CMV-NLS-iCre基因构建到普通ADV载体中得到的病毒颗粒无法进行有效的出毒扩增。使用CMV-CuO和CMV-TrpO启动子配合抑制蛋白表达的稳定株,可以有效解决出毒问题(图17、图18)。
本实施例所采用的质粒pShuttle-CMV-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP、pShuttle-CMV-TrpO-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP和pShuttle-CMV-CuO-iCre-3×Flag-P2A-sfGFP的质粒图谱依次如图19、图20、图21所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种腺病毒包装载体,具有两个ITR片段及插入两个ITR片段之间的基因表达盒,
所述基因表达盒包含顺次连接的启动子CMV、阻遏型操作子以及目的基因,当所述目的基因表达时会对病毒包装产生负面影响,其中,所述目的基因选自自杀基因、细胞凋亡基因和癌基因,或者,所述目的基因为细胞周期相关基因,或者,所述目的基因直接抑制病毒的复制和/或组装,
当有阻遏物存在时,所述阻遏型操作子能够阻遏其下游目的基因的表达,
所述阻遏型操作子选自色氨酸操作子TrpO元件或Cumate-CuO可调控系统的CuO元件,
所述TrpO元件插入到所述基因表达盒的启动子中形成CMV-TrpO v2,所述CMV-TrpO v2的序列如下所示:
cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagaactagttaactagtacgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgactctac;,
所述CuO元件插入到所述基因表达盒的启动子中形成CMV-CuO v1,所述CMV-CuO v1的序列如下所示:
Cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgttgaaaacaaacagacaatctggtctgtttgtattataagtaaggactagt。
2.根据权利要求1所述的腺病毒包装载体,所述目的基因对包装细胞产生细胞毒性。
3.根据权利要求1所述的腺病毒包装载体,所述目的基因选自iCre基因或Caspase 8基因。
4.根据权利要求1~3任一项所述的腺病毒包装载体,所述腺病毒包装载体还包含报告基因、增强子、内部核糖体进入位点、终止子和多腺苷酸化信号中的至少一种。
5.腺病毒包装载体系统,其包括权利要求1~4任一项所述的腺病毒包装载体以及框架载体。
6.根据权利要求5所述的包装载体系统,所述腺病毒包装载体系统基于Adeasy系统或AdMAX系统。
7.一种腺病毒的包装方法,将包含权利要求5或6项所述的腺病毒包装载体系统转入宿主细胞,并于所述阻遏物存在的前提下进行包装。
8.根据权利要求7所述的包装方法,所述阻遏型操作子为所述色氨酸操作子TrpO元件,阻遏物为TrpR蛋白,色氨酸存在, 或者,
所述阻遏型操作子为所述Cumate-CuO可调控系统的CuO元件,阻遏物为CymR蛋白,枯酸不存在。
9.根据权利要求7所述的包装方法,所述宿主细胞为HEK-293细胞或其能够提供腺病毒E1区的衍生株。
10.根据权利要求9所述的包装方法,所述衍生株选自HEK-293A、HEK-293S、HEK-293SG、HEK-293SGGD、HEK-293T、HEK-293T/17SF、HEK-293H、HEK-293E、HEK-293-6E、HEK-293F、HEK-293FT、HEK-293FTM、AAV-293以及GP2-293中的至少一种。
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