JP2004508041A - 組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする親細胞、それらの生成方法、およびその使用 - Google Patents

Abstract

この発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする親細胞に関するものである。上記細胞は、少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質を発現するための第１補助コンストラクトの少なくとも１つのコピー、および少なくともひとつのＡＡＶキャップタンパク質を発現するための他の補助コンストラクトの少なくとも１つのコピーを含んでいる。この発明はまた、親細胞における少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質および１つのＡＡＶキャップタンパク質を発現するための補助コンストラクト、ＡＡＶに関して非相同的である少なくとも１つの核酸を含むベクターコンストラクト、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする親細胞を生成する方法、およびｒＡＡＶを生成する親細胞の使用に関するものである。

Description

この発明は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする親細胞に関するものであり、少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質の安定な発現のための第１ヘルパーコンストラクトの少なくとも１つのコピーおよび少なくとも１つのＡＡＶキャップタンパク質の安定な発現のための他のヘルパーコンストラクトの少なくとも１つのコピーを含む。この発明は、さらに、親細胞における少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質およびＡＡＶキャップタンパク質の安定な発現のためのヘルパーコンストラクト、ＡＡＶに非相同的である１つ以上の核酸を含むベクターコンストラクト、および組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする親細胞を生成する方法、ならびにｒＡＡＶを生成する親細胞の使用に関するものである。
【０００１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルスファミリーに属する。このウイルスファミリーは、約５ｋｂの線状のかつ一本鎖のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を含む、約１８−３０ｎｍの直径の、正二十面体の、外被に覆われていないキャプシドを特徴とする。ＡＡＶの、特に欠陥パルボウイルス（デペンドウイルス）のサブグループの効率的な複製には、親細胞がヘルパーウイルスに、たとえばアデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスに同時感染することが必要である。適当なヘルパーウイルスの非存在下で、ＡＡＶは、潜伏状態になり、ウイルスゲノムは、親細胞のゲノムへの永久の（安定な）組込みが可能である。この特性があるため、ＡＡＶは、哺乳類細胞のための形質導入ベクターとして特に興味深くなる。２つのほぼ１４５ｂｐの長さの逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、一般にベクターの機能には十分である。それらは、親細胞ゲノムへの複製、パッケージングおよび組込みに必要な信号を宿している。組換え型ＡＡＶ粒子（ｒＡＡＶ粒子）へのパッケージングとしては、非構造性ウイルスタンパク質（レップタンパク質）のためのおよび構造性タンパク質（キャップタンパク質）のための遺伝子を宿しているヘルパープラスミド、およびＡＡＶのＩＴＲによってフランキング（隣接）された、パッケージングされるべき遺伝子を宿しているベクタープラスミドは、パッケージングに適する細胞、たとえばＨｅＬａまたは２９３の細胞へ形質移入され、それらは、次に適当なヘルパーウイルスに感染される。ｒＡＡＶ粒子を含むライセート（可溶化液）が、数日後に得られる。
【０００２】
アデノ随伴ウイルスのキャプシドは、本来１：１：１０の割合で、３つのタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３で構成される。ＡＡＶキャプシド遺伝子は、ＡＡＶゲノムの右端に位置決めされ、かつ異なる開始コドンおよびその発現のための１つのスプライスドナー（供与体）および２つのスプライス受容部位を用いて同じ翻訳領域内で配列を重複することによってコード化される。ＶＰ１遺伝子は、ＶＰ２遺伝子配列全体を含み、ＶＰ２遺伝子配列は、今度は特異性Ｎ末端領域を持つＶＰ３配列全体を含む。重複している翻訳領域が、３つのＡＡＶキャプシドタンパク質の全てをコードする（遺伝情報に指定する）という事実は、異なる割合ではあるが、キャプシドタンパク質全てが必ず発現する原因である。
【０００３】
様々なＡＡＶ血清型が公知であり、そのうちヒトＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は最もよく分析されてきた。すべての血清型は、体細胞遺伝子治療にとって有利な特性を備えたウイルスベクターである。絶対必要な利点は、より大きなレップタンパク質Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８の存在下でのウイルスＤＮＡの細胞ゲノムへの安定な組込み、細胞分裂を起こしていない細胞（休止細胞）を感染させる能力、高い力価（ｍｌにつき１０^１３―１０^１４の粒子）までの精製を可能にするウイルスキャプシドの安定性、低い病原性、および組換え型ＡＡＶベクターにウイルス遺伝子および遺伝子産物が全くないことである。生体内での応用において、いかなるＡＡＶ特異性遺伝子産物への細胞の免疫応答も観察されない理由を説明するのは、正確にいえば最後に述べた局面であり、それゆえＡＡＶと共に移入された治療遺伝子の長期発現（一年より長い）が可能である。これは、ＡＡＶベクターが、特定的には遺伝子治療において用いるのに非常に適する理由である。そのような使用のために、一般に複製欠陥ウイルスが発生されてきたが、それらのウイルスは、所望の標的細胞を感染させかつそれら内でコード化された核酸を細胞へ移入させることはできるが、もはやそれら自体この細胞内では複製しない。これは、たとえば、遺伝子コード化構造性タンパク質等のウイルス複製に重要である遺伝子を欠失させることによって、かつ適当な場合に、移入されるべき外来性核酸をそれらのもとの場所に組み入れることによって達成される。遺伝子治療において使用するのに適するより大量の複製できないウイルスを生成するためには、細胞においてもはや複製することができないウイルスの欠陥を代償するために、欠失された遺伝子が「輸送」中のいわゆるヘルパー遺伝子として提供される必要がある。
【０００４】
ＡＡＶをウイルス形質導入ベクターとして用いるためには、一般により大量の組換え型ＡＡＶ粒子を有する必要がある。これらの大量のｒＡＡＶ粒子を生成するのに適している方法は、真核生物細胞に２つの組換え型ＡＡＶプラスミドを同時形質移入すること、および引き続いてヘルパーウイルスに感染することである（Ｃｈｉｏｒｉｎｉ（チオリーニ）Ｊ．Ａ．他（１９９５）Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）６、１５３１）。第１ｒＡＡＶプラスミド（＝ベクターコンストラクト）は、移入されるべきであり、かつ２つのＩＴＲ領域によって結合される、すなわちフランキングされる外来性核酸を含む。第２組換え型ＡＡＶプラスミド（＝ヘルパープラスミド）は、粒子（レップおよびキャップ遺伝子）を生成するのに必要なＡＡＶ遺伝子を含む。ヘルパーコンストラクトにＩＴＲ領域がないことは、ＡＡＶ粒子にレップおよびキャップ遺伝子をパッケージングしかつそれゆえ望ましくない野生型ＡＡＶが発生するのを防ぐことを意図している。許容的な、すなわち利用できる適当な細胞は、いずれも組換え型ＡＡＶコンストラクトのためのおよび適当なヘルパーウイルスのためのものであるが、引き続いて２つのＡＡＶコンストラクトを形質移入される。形質移入された細胞（＝産生株細胞）が、たとえば適当なヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスに感染することに続いて、ＡＡＶ遺伝子の発現、移入された外来性核酸の複製およびパッケージング、ならびに組換え型ＡＡＶ粒子の組み立てが行なわれる。ｒＡＡＶ粒子は、ＩＴＲ領域によって両側でフランキングされる外来性核酸を、１本鎖ＤＮＡの形で含む。同時に、ヘルパーウイルスは、これらの細胞内で複製し、それは、ヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスの場合には、数日後、溶解（＝破壊）および、それに関連して、感染された細胞死で終了する。結果として生じるｒＡＡＶ粒子、およびヘルパーウイルスは、この場合、細胞培養の上澄みへ部分的に放出されるか、あるいは溶解した細胞の構造に付着されたままになる。哺乳類細胞のための一般的な形質導入ベクターとしてのＡＡＶの使用は、たとえばＭｕｚｙｃｚｋａ（ムージカ）Ｎ．（１９９２）細菌学および免疫学における現在のトピック、１５８、９７で概説されている。
【０００５】
ｒＡＡＶ粒子の生成における重大な欠点は、複製適格野生型ＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）が同時発生すること、およびヘルパーウイルス、たとえばアデノウイルスの存在である。しかしながら、たとえば遺伝子治療における組換え型ＡＡＶ粒子の使用についての安全性の目的のために、標本にヘルパーウイルスおよび野生型ＡＡＶが本来ないことが必要であるのは、たとえばヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスは、感染された細胞を溶解し、かつさらにアデノウイルスタンパク質との細胞免疫応答を生じるからである。しかも、アデノウイルスは、ヒトには病原性であり、非特異性コリーザ（鼻感冒）の症状を生じる。野生型ＡＡＶは、ヘルパーウイルスの存在下では、体内で複製しかつ広がってもよい。しかも、そのような条件下では、レップおよびキャップ遺伝子が発現されるだろうし、そのレップおよびキャップ遺伝子は、今度は同じ細胞内でｒＡＡＶゲノムを増幅し、かつ新たなｒＡＡＶ粒子となるだろう。これによって、体中にｒＡＡＶゲノムが広がることになるかもしれない。
【０００６】
遺伝子治療の助けを借りて、遺伝子欠陥を補正するのみならず、治療の一部として正常なまたは病気になった細胞へ新規の機能を伝達することもできる。したがって、多数の細胞型に外来性核酸を導入するために、今まで、さまざまなベクター系が開発されてきた。それらのウイルス系の中で、ＡＡＶは、最も有望なベクター系であると理解されているのは、それは広い親細胞の向性を有し、かつ優先的に染色体１９へ配列特異性で組み込まれるからである（Ｋｏｔｉｎ（コーチン）（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）５、７９３−８０１）。このように最近は、生体内では、ｒＡＡＶを投与することによって、うまく形質導入された細胞内で特異性免疫応答または炎症反応を生じることなく、長いＡＡＶ媒介遺伝子が発現されることになるということを種々の動物モデル系を用いて示すことができるようになってきた（Ｄａｌｙ（ダリー）他（１９９９）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）１０、８５−９４；Ｈｅｒｚｏｇ（エルゾーク）他（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（自然医学）５、５６−６３；Ｌｏ（ロー）他（１９９９）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）１０、２０１−２１３；Ｓｎｙｄｅｒ（スナイダー）他（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（自然医学）５、６４−７０）。
【０００７】
説明した動物実験の成功に促進されて、フランキングＩＲＴなしのＡＡＶゲノム全体のコピーを含み、かつ自然ウイルスプロモーターの制御下でレップおよびキャップ遺伝子を有するＨｅＬａベースパッケージング細胞系が発生されてきた。ウイルスプロモーターｐ５、ｐ１９およびｐ４０は、ヘルパーウイルス感染の非存在下で不活性である（Ｉｎｏｕｅ（井上）およびＲｕｓｓｅｌｌ（ラッセル）（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ウイルス学ジャーナル）７２、７０２４−７０３１；Ｇａｏ（高）他（１９９８）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）９、２３５３−２３６２）。ヘルパーウイルス感染後、ＡＡＶ遺伝子の発現は、これらの安定して形質移入されたＨｅＬａ細胞内で誘発される。これらの細胞系の利点は、ｒＡＡＶ粒子を、大規模にかつ複製できるように生成することができるということであり、それは特に商業生産工程には必要である（Ａｌｌｅｎ（アレン）他（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）７１、６８１６−６８２２；Ｗａｎｇ（ワング）他（１９９８）Ｊ．Ｖｉｏｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）７２、５４７２−５４８０）。
【０００８】
これらの細胞系の使用の１つの欠点は、野生型ＡＡＶが発生するのにベクターゲノムに関する組換え事象が１つだけ必要であるという事実であるが、それはそのような細胞系が、非常に大きな危険のため遺伝子治療での使用に適さない理由である。
【０００９】
よって、この発明は、パッケージングの形の親細胞、および産生株細胞、ならびにｒＡＡＶを生成するのに適しかつｒＡＡＶを大規模に生成することを可能にするヘルパーおよびベクターコンストラクトを提供する目的に基づいているが、同時に野生型ＡＡＶの発生が本来妨げられる。
【００１０】
驚いたことに、ｒＡＡＶ粒子の高収率は、ＡＡＶのレップおよびキャップ遺伝子が機能上分離しており、かつキャップ遺伝子が、相同プロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０の制御下にあるＨｅＬａベースのパッケージング細胞系の助けを借りて、ただしｒｃＡＡＶ粒子が同時に形成されることなく達成することができることがわかってきた。この点については、機能上分離しているレップおよびキャップ遺伝子が、一過性に、言い換えれば、エピゾーム（遺伝子副体）で存在し、形質移入され、かつ細胞ゲノムの同じ部位で、たとえばコンカテマー（鎖状体）として、または細胞ゲノムの異なる部位で一体化することが可能である。利点は、各々の場合、少なくとも２つの独立した組換え事象が、ｒｃＡＡＶ粒子の再構成に必要であるということである。
【００１１】
行なわれてきた実験中、とりわけキャップ遺伝子発現コンストラクトが使用されたが、それはキャップ遺伝子の発現に絶対的に必要であるプロモーターＰ４０とは別に、さらにプロモーターＰ５およびＰ１９の制御配列を含む。この点については、キャップタンパク質の強い発現が、プロモーターＰ４０の制御下ではもっぱらキャップ遺伝子のクローニングを経て達成されるが、この発現はもはや調節されることができず（恒常的であり）、かつそれゆえヘルパーウイルスのいずれかによってもはや誘発されることができないということを立証することが可能であった。Ｐ４０のプロモーター領域のみで構成されるが、Ｐ５よびＰ１９で構成されないそのようなキャップ発現コンストラクトは、親細胞に安定して組み込まれなかった。この現象は、恒常的に発現されるキャップタンパク質の親細胞に対する毒性によって説明される。
【００１２】
したがって、この発明の目的のために生成されかつ使用されたキャップタンパク質のための発現コンストラクトは、そのプロモータ機能は、転写の開始に関連して無傷のままであったが、これらのコンストラクトはいかなるレップタンパク質も発現することができなかったというように、突然変異誘発によって改変されるプロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０の領域を有する。このように、第２源から（＝輸送中に）２つの大きなレップタンパク質Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８を提供することが、プロモータＰ４０のアデノウイルス誘発性のトランス活性化に必要だった。それからキャップ発現コンストラクトの助けを借りて、親細胞のゲノムへの安定な組込みを達成することが可能であった。したがって、これらのコンストラクトには、ヘルパーウイルスの非存在下で、いかなる毒性量のキャップタンパク質も発現されず、かつそれにもかかわらず、ヘルパーウイルスによって誘発できる非常に強いキャップタンパク質の発現が保証されるという利点がある。
【００１３】
よって、この発明の一局面は、第一には、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする親細胞であって、少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質の発現のための第１ヘルパーコンストラクトの少なくとも１つのコピー、および少なくとも１つのＡＡＶキャップタンパク質の発現のためのさらなるヘルパーコンストラクトの少なくとも１つのコピーを含む。この場合、レップタンパク質およびキャップタンパク質をコードする核酸は、機能上互いに分離しており、かつ自然ＡＡＶ制御配列に操作結合される。これらは、特定的には自然ＡＡＶプロモーターである。
【００１４】
第１の好ましい実施例では、親細胞は、ベクターコンストラクトの少なくとも１つのコピーをさらに含む。そのような親細胞を、以下産生株細胞とも呼ぶ。
【００１５】
さらに好ましい実施例では、親細胞は、さらに、ヘルパーウイルスの少なくとも１つの遺伝子産物のための核酸コンストラクトのおよび／またはｒＡＡＶを生成するのに必要である細胞遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むことを特徴とする。
【００１６】
この発明は、ヘルパーウイルス非依存性のｒＡＡＶ産生株細胞をさらに含む。これは、産生株細胞に加えて、ヘルパーウイルスの、ｒＡＡＶを生成するのに必要な遺伝子および／または調節された細胞ヘルパー遺伝子を含み、それゆえこれらの細胞は、ｒＡＡＶを生成するためにヘルパーウイルスに感染される必要がない。
【００１７】
レップタンパク質およびキャップタンパク質をコードする核酸の、３つの自然ＡＡＶ制御配列との、特に自然ＡＡＶプロモーターとの操作結合の結果、大量のｒＡＡＶが得られるが、同時に野生型ＡＡＶの発生が本来妨げられる。
【００１８】
好ましい実施例では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５および／またはＡＡＶ６から選択される。この発明によって同様に含まれるのは、これらの血清型のキャプシド突然変異体である。キャプシド突然変異体は、この発明の目的のために、ＡＡＶ粒子が突然変異したキャプシドを含んでもよいということを意味している。これは、１つ以上のアミノ酸の突然変異、１つ以上の欠失および／または挿入を含んでもよい。対応する例は、次の参考文献から、熟練した研究者に公知である：ＷＯ　９９／６７３９３、Ｇｒｉｆｍａｎ（グリフマン）Ｍ．他（２００１）Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ　分子治療）３（６）：９６４−７５、Ｗｕ（ウー）Ｐ．他（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）７４（１８）：８６３５−４７、Ｃｈａｎｄｌｅｒ（チャンドラー）ＬＡ他（２０００）Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ．（分子治療）２（２）：１５３−６０、Ｈｉｒａｔｅ（平手）ＲＫおよびＲｕｓｓｅｌｌ（ラッセル）ＤＷ（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）７４（１０）：４６１２−２０、Ｇｉｒｏｄ（ジロ）Ａ他（１９９９）Ｎａｔ　Ｍｅｄ．（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　自然医学）５（１２）：１４３８、Ｇｉｒｏｄ（ジロ）Ａ他（１９９９）Ｎａｔ　Ｍｅｄ．（自然医学）５（９）：１０５２−６またはＢａｒｔｌｅｔｔ（バートレット）ＪＳ他（１９９９）Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　自然生物工学）１７（２）：１８１−６．　用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、この発明の目的のために、同意語として用いられており、かつある長さのアミノ酸の重合体に関するものである。これらの用語は、同様に、たとえばグリコシル化、アセチル化またはリン酸化等の翻訳後の改変ステップを経てきたタンパク質も含む。
【００１９】
用語「核酸」、「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、この発明の目的のために、ある長さのヌクレオチドの重合体形を意味し、その用語は、分子の一次構成にのみ関するものである。したがって、この用語は、改変されたポリヌクレオチド、たとえばメチル化されたまたは保護された（＝キャップされた）ポリヌクレオチドとちょうど同じ量の一本鎖および二重鎖ＤＮＡ分子を包含している。
【００２０】
用語「遺伝子」および「遺伝子配列」は、少なくとも１つの翻訳領域を含み、かつ転写および翻訳によって特定のタンパク質を生成する能力を有するポリヌクレオチドに関連している。
【００２１】
用語「制御配列」は、ゲノム領域を意味し、それが結合される遺伝子の転写を調節する。この発明で説明したような転写的な制御配列は、少なくとも１つの転写的な活性プロモーターを含むが、転写の１つ以上のエンハンサーおよび／またはターミネーターを含んでもよい。
【００２２】
用語「操作結合される」は、２つ以上の構成成分の配置に関連している。構成成分は互いに接続されるので、それらは、それらの機能を協調して果たすことができるようになっている。たとえば、転写的な制御配列またはプロモーターは、もし転写的な制御配列またはプロモーターが、それぞれコード配列の転写を調節するかまたは開始するなら、コード配列に操作結合される。転写されるべき遺伝子に操作結合されるプロモーターは、一般的にはコード配列へのシスエレメントと呼ばれるが、転写されるべき遺伝子のすぐ近傍に必ずしも位置する必要はない。
【００２３】
「機能上独立した単位」または「機能上分離している」という表現は、２つ以上の遺伝子が重複していないことを意味し、用語「遺伝子」はコード配列のみならず対応するプロモーターも包含している。特定的には、これは、レップおよびキャップ遺伝子についてはそれについて野生型ＡＡＶゲノムでは、レップ遺伝子のコード配列が、キャップ遺伝子のコード配列およびキャッププロモーター（Ｐ４０）と重複しているが−その２つの遺伝子はもはや重複していないことを意味している。これは、たとえば共同で用いられるコード配列の両方の部分によって達成され、かつｐ４０プロモーターは複製される（たとえば１Ａ図を参照されたい）。これはゲノムにおける遺伝子の異なる配置を意味してもよい。１つの可能性は、遺伝子が、異なる部位でゲノムへ組み込まれようと、異なるプラスミドまたはそれらの混合物上に位置しようと、ゲノムの異なる場所に位置しているということである。第２の可能性は、遺伝子はまた、各遺伝子がそれ自体のプロモーターによって制御されているが、同じＤＮＡ分子、たとえば染色体またはプラスミド上に並んで位置しているということである。この型の配置は、たとえば異なるＤＮＡ分子上の２つの遺伝子が一緒に形質移入されるとき起こりうる。その形質移入中、これらの分子はコンカテマー（鎖状体）を形成してもよく、そのコンカテマーは、次にゲノムに１つの部位で組み込まれるが、まだ機能上独立した単位を形成している。
【００２４】
この発明の目的のために使用されているような表現「組換え型」は、自然に求められる単位と比較して、改変される遺伝子単位のことをいう。この用語のアデノ随伴ウイルスへの応用は、そのウイルスが、クローニング、制限および／または結合ステップの組み合わせによって発生されてきた、かつアデノ随伴ウイルスにおいて自然に生じていない１つ以上の核酸を宿していることを意味している。
【００２５】
この発明のために使用されているような用語「自然プロモーター」および「相同プロモーター」は、プロモーターのまたは制御配列の遺伝子単位が、それが比較される単位の残りとして同じ生物体に由来していることを意味している。逆に、「非相同プロモーター」または「不自然プロモーター」は、プロモーターが、その自然コード配列から分離されてきたこと、および他のコード配列に操作結合されてきたことを意味している。
【００２６】
細胞におけるタンパク質の「安定な発現」は、タンパク質をコードするＤＮＡが、親細胞のゲノムに組み込まれ、かつそれゆえ細胞分裂上で娘細胞に安定して伝達されることを意味している。「安定な発現」はまた、ＤＮＡがエピゾームで存在しており、かつ独立した複製によって安定したままであることを意味してもよい。これは、たとえば、開始タンパク質（たとえば、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＥＢＮＡ１）および複製基点（たとえば、ＳＶ４０ｏｒｉ、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）ｏｒｉＰ）で構成される公知の、特にウイルスの複製系によって達成される。たとえばプラスミド等のエピゾームは、ある条件下では、次の世代に伝えられてもよいが、親細胞においてエピゾームで存在する遺伝子材料は、染色体性に組み込まれた材料より早く失われる。たとえば、興味のあるヌクレオチドのすぐ近傍に選択可能マーカーを組み込むことを経て、興味のある遺伝子材料の維持および伝達を組み込むことが可能であり、それゆえヌクレオチドを宿している親細胞を淘汰圧下で保つことができる。
【００２７】
用語「ペルパーコンストラクト」は、この発明の目的のために、ＡＡＶレップ遺伝子および／またはＡＡＶキャップ遺伝子のいずれかを含む組換え型ＡＡＶプラスミドを意味している。
【００２８】
用語「ベクターコンストラクト」は、この発明によれば、ＩＴＲ領域によって結合される外来性ＤＮＡ（＝導入遺伝子）を宿している組換え型ＡＡＶプラスミドを意味している。
【００２９】
用語「パッケージング細胞」は、この発明の目的のために、１つ以上のヘルパーコンストラクトを含むが、ベクターコンストラクトを含まない親細胞を意味している。
【００３０】
用語「産生株細胞」は、この発明の目的のために、１つ以上のヘルパーコンストラクトおよび１つ以上のベクターコンストラクトの両方を含む親細胞を意味している。この産生株細胞は、それがヘルパーウイルスに感染することが、ｒＡＡＶの生成に必要であるなら、ヘルパーウイルス依存性であってもよい。しかしながら、産生株細は、もしその細胞が、たとえば１つ以上の誘発性プロモーターの制御下で、ｒＡＡＶ生成を誘発するのに必要な遺伝子を宿しているなら、ヘルパー非依存性であってもよいし、かつそれゆえｒＡＡＶの生成のためのヘルパーウイルスに感染される必要がない。
【００３１】
用語「ベクター細胞」は、この発明の目的のために、１つ以上のベクターコンストラクトを含むが、ヘルパーコンストラクトを含まない親細胞を意味している。
【００３２】
組換え型アデノ随伴ウイルスをパッケージングするこの発明の親細胞を生成するのに用いられる１種のヘルパーコンストラクトは、少なくとも１つのレップタンパク質をコードする核酸配列を含み、そこでレップタンパク質は、タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０、特にＲｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０、特定的にはＲｅｐ６８およびＲｅｐ５２を意味している。他のヘルパーコンストラクトは、核酸配列を含み、それは公知のキャップタンパク質の少なくとも１つをコードし、そこでキャップタンパク質は、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３である。これらのタンパク質のための遺伝子、およびそれらのＩＴＲ配列を、クローンの形で一般に入手可能である野生型ＡＡＶから単離することができる。このように、たとえば、クローンｐＳＭ６２０は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ（サミュルスキー）他（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　米国国立科学アカデミー予稿集）７９、２０７７によって説明されている；クローンｐＡＶ１は、Ｌａｕｇｈｌｅｎ（ローレン）他（１９８３）Ｇｅｎｅ（遺伝子）２３、６５によって説明されており、かつクローンｓｕｂ２０１は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ（サミュルスキー）（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）６１、３０９６によって説明されている。
【００３３】
この発明の好ましい実施例では、レップタンパク質およびキャップタンパク質の発現のためのヘルパーコンストラクトは、機能上独立した単位として、親細胞のゲノムに組み込まれる。このことが野生型ＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）の形成を効果的に防ぐのは、野生型ウイルスを形成するためには、全くまれではあるが、各細胞分裂で１０^−７、言い換えると合計１０^−１４ の周波数を持つ２つの組換え事象が必要となるであろうからである。事実、２×１０^１０のゲノム粒子を含む組換え型ウイルス標本においては、いかなるｒｃＡＡＶも検出可能ではない。
【００３４】
さらなる好ましい実施例では、レップタンパク質の発現は、自然ＡＡＶプロモーターＰ５によって制御され、かつキャップタンパク質の発現は、自然ＡＡＶプロモーターＰ４０によって、特定的には自然ＡＡＶプロモーターＰ１９およびＰ４０によって、特に自然ＡＡＶプロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０によって制御される。
【００３５】
上記の実験から、レップ発現のための非相同プロモーターの使用では、ｒＡＡＶの高収率が適切に調節されなかったことがわかった（Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ（ヘンシェル）Ｃ．他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）６８、７１６９−７１７７；Ｙａｎｇ（ヤング）Ｑ．他（１９９４）Ｊ．Ｖｉｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）６８、４８４７−４８５６）。この発明の最も好ましい実施例では、キャップ発現プラスミドが、ヘルパーウイルス感染またはヘルパーウイルス遺伝子産物とレップタンパク質発現との両方に依存する調節された発現を可能にするために、ＡＡＶプロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０を含むのは、この配置は、自然溶解性のＡＡＶ生活環が最もよく反映されたものであるからである。この配置は、厳密に調節されるキャップタンパク質の発現に非常に適していることがわかった。大量のキャップタンパク質を発現する非相同プロモーターを用いる数多くの研究が、この発明の目的のために、今まで文献で発表されてきた（Ｇａｏ（高）他（１９９８）上記参照、Ｇｒｉｍｍ（グリム）Ｄ．（１９９８）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）９、２７４５−２７６０）が、自然プロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０が、キャップタンパク質発現のために使用されたのは、Ｐ４０プロモーターがもはや他のプロモーターＰ５およびＰ１９の自然環境にないとき、それは恒常的なプロモーターとして働くということがわかってきたからである。自然ＡＡＶ制御配列の使用は、キャップ遺伝子の調節された発現に必要な転写因子は、それらの調節機能を発揮するために、自然プロモーター領域に全ての結合部位を見つけ出すことを保証することを可能にした。
【００３６】
更なる好ましい実施例では、親細胞におけるレップタンパク質およびキャップタンパク質の発現は、互いに依存して調節される。このアプローチは、第１の場所では、弱いキャップの発現が、安定な細胞系にｒＡＡＶを効率的にパッケージングするのに必要であることがわかったので選択されたが、さもなければ、大量のキャップは、細胞に対して毒性効果を持つからである。比較すると、強いキャップの発現は、パッケージング時に起こらなければならない。恒常的な非相同プロモーターは、同時にこれらの２つの判定基準に従うことはできない。これは誘発性非相同プロモーターを用いることによって改良されうるが、実施においては、そのようなプロモーターによる正確な時間的調整およびキャップ発現力を実現するのは非常に困難である。自然相同プロモータを使用することで、ヘルパーウイルス遺伝子産物および／または細胞ヘルパー遺伝子ならびにＲｅｐによって、キャップの発現が活性化に結び付けられ、かつそれゆえ野生型の状況におけるように正確に時間的制御を提供する。レップタンパク質およびキャップタンパク質をコードする核酸の転写は、自然制御配列によって、特定的には自然ＡＡＶポリＡ信号によってとりわけ有利に終了される。ＡＡＶキャップおよびレップ遺伝子の転写を終了させる相同配列の使用は、転写の開始と同じようにして、ＡＡＶベクター系によって生成されるｒＡＡＶ粒子の量を増加させる。
【００３７】
親細胞として、哺乳類細胞、特定的にはヒト子宮頚癌細胞、特にＨｅＬａ細胞を用いるのが適当である。ＨｅＬａ細胞は、ＡＡＶのＰ５プロモーターがＨｅＬａ細胞において実質的に不活性であるのでとりわけ有利であるということがわかってきており、かつそれゆえ、ＡＡＶレップタンパク質のための発現カセットが、それらのゲノムに、自然調節エレメントの制御下で安定して組み込まれることが可能であり、それゆえレップタンパク質は、これらの細胞においていかなる毒性効果ももたない（Ｃｌａｒｋｅ（クラーク）他（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）６、１２２９−１３４１；Ｔａｍａｙｏｓｅ（玉寄）他（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（ヒト遺伝子治療）７、５０７−５１３；Ｉｎｏｕｅ（井上）＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（ラッセル）（１９９８）上記参照、Ｇａｏ（高）他（１９９８）上記参照）。
【００３８】
この発明の更なる局面は、親細胞における少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質の安定な発現のための第１ヘルパーコンストラクトに関するものであり、レップタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶの自然制御配列に、特に自然ＡＡＶプロモーターＰ５に操作結合され、かつ親細胞における少なくとも１つのＡＡＶキャップタンパク質の安定な発現のための第２ヘルパーコンストラクトに関するものであり、キャップタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶの自然制御配列に、好ましくは自然ＡＡＶプロモーターＰ４０に、特定的には自然ＡＡＶプロモーターＰ１９およびＰ４０に、特に自然ＡＡＶプロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０に操作結合される。
【００３９】
レップおよびキャップを異なる発現単位に分離する利点は、キャップ遺伝子またはキャップ発現単位の代わりに、異なるＡＡＶ血清型のキャップ遺伝子またはキャップ発現単位を用いることによって、異なる血清型のＡＡＶ粒子を生成することが可能であるということであり、同じレップ遺伝子または同じレップ発現単位、および同じベクターコンストラクトを使用することが可能である。したがって、このことは、同じベクターコンストラクトの異なるＡＡＶ血清型を使用することがさまざまな理由のために意図されているなら、努力を最小にする。
【００４０】
この発明の更なる局面は、ヘルパーコンストラクトを含み、少なくとも１つのレップタンパク質をコードする核酸配列であり、レップタンパク質は、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０であるが、Ｒｅｐ７８でない。というのは、驚いたことに、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０および３つのキャップタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３とは別に、ＡＡＶベクターのパッケージングには、Ｒｅｐ６８のさらなる発現のみで十分であることを立証するのが可能になってきたからである。これらのＲｅｐ７８欠損ヘルパーコンストラクトの利点は、パッケージング細胞に対して通常毒性がある最も大きいレップタンパク質が全然発現されないということである。レップタンパク質の中では、Ｒｅｐ７８が、細胞工程、たとえば転写等に対して最も大きい抑制活性を有することがさらにわかってきた。したがって、このヘルパーコンストラクトを使用すると、Ｒｅｐ７８がないために、パッケージング効率を増加させることが可能である。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８の両方とも、自然系においてはｐ５プロモーターによって発現される。Ｒｅｐ７８欠損ヘルパーコンストラクトの使用が有利であるさらなる理由は、Ｒｅｐ６８は、Ｒｅｐ７８と比較して、アデノウイルス感染細胞におけるＡＡＶプロモーターＰ１９およびＰ４０のより強いトランス活性化因子を表しているからである（Ｈｏｅｒｅｒ（ヘーラー）他（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）６９、５４８５−５４９６；Ｗｅｇｅｒ（ウエガー）他（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）７１、８４３７−８４４７）。したがって、このＲｅｐ７８欠損ヘルパーコンストラクトの使用によって、より小さいＲｅｐタンパク質Ｒｅｐ４０およびＲｅｐ５２のおよびキャプシドタンパク質の発現が強まり、かつそれゆえ所望のより高いパッケージング効率がもたらされる。
【００４１】
Ｒｅｐ７８欠損ヘルパーコンストラクトｐＵＣ“Ｒｅｐ６８，５２，４０Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（図１２を参照）は、介在配列（イントロン配列）の欠失を含めて、ヌクレオチド２０１からヌクレオチド４４９７まで、およびヌクレオチド６５８からヌクレオチド４４６０までのＡＡＶ配列を、細菌性発現プラスミドＵＣ１９へクローニングすることによって生成され、ｐＵＣ１９配列におけるレップタンパク質のための結合部位は欠失された（図６を参照されたい）。この方策の使用を経て、２つのレップ遺伝子および少なくとも２つのキャップ遺伝子は、各々が転写を終了するためのそれ自体のポリＡ配列を持つが、継続的に配置されている。第１部位（ＡＡＶ配列ヌクレオチド２０１からヌクレオチド４４９７まで）から始まって、レップタンパク質Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０、ならびにキャップタンパク質ＶＰ２およびＶＰ３を発現することが可能であり、一方第２部位（ＡＡＶ配列ヌクレオチド６５８からヌクレオチド４４６０）から始まって、レップタンパク質Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０、ならびにキャップタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が発現される。したがって、全体的に見て、Ｒｅｐ７８を除いて、ＡＡＶ−２タンパク質の全てがコード化される。
【００４２】
同様にＲｅｐ７８欠損ヘルパーコンストラクトｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（図１３を参照）は、上記ＡＡＶ配列（介在配列の欠失を含むｎｔ２０１−２３１０；ｎｔ６５８−４４６０）を、細菌性発現プラスミドＰＵＣ１９へ同様にクローニングすることによって生成された（図６を参照されたい）。もう１度、ｐＵＣ１９配列におけるＲｅｐタンパク質のための結合部位は欠失された。レップ遺伝子は、このようにして部分的に複製された。このようにして生成されたヘルパーコンストラクトは、ポリＡ配列を１つだけ含み、それゆえ全てのｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ（リボ核酸））転写物は、同じ３’端部を有する。第１部位（ＡＡＶ配列ヌクレオチド２０１からヌクレオチド２３１０まで）から始まって、レップタンパク質Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０を発現することが可能であり、一方第２部位（ＡＡＶ配列ヌクレオチド６５８からヌクレオチド４４６０）から始まって、レップタンパク質Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０、ならびにキャップタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が発現される。したがって、全体的に見て、Ｒｅｐ７８を除いて、ＡＡＶ−２タンパク質の全ても、このベクターコンストラクトによってコード化される。
【００４３】
レップタンパク質Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０を発現するためのヘルパーコンストラクトｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７は、ヘルパーコンストラクトｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７のキャップ遺伝子（ヌクレオチド２２０３から４４１０）からＡＡＶヌクレオチド２９４５から４０４６を欠失させることによって生成される。機能キャップタンパク質を、この欠失のためにもはや発現することはできない。
【００４４】
この発明の更なる局面は、ＡＡＶに非相同的でありかつＩＴＲ配列によってフランキングされる１つ以上の核酸を含むベクターコンストラクトであり、５’に位置するＩＴＲ配列は、Ｃパリンドローム（回文構造）の領域に結失を有する。
【００４５】
ベクターコンストラクトは、ＡＡＶ配列１−６０／８３−１９１（左ＩＴＲとしてΔＣアームＩＴＲ−その説明については下記参照）および４４９８ないし４６７１（右ＩＴＲとして）を含む。
【００４６】
ＡＡＶ−２のＩＴＲ配列は、１４５塩基対の長さであるが、大きなパリンドローム（Ａ）および２つのより小さなパリンドローム（ＢおよびＣ）で構成されることが公知である。Ｔ形ヘアピン構造についてのＩＴＲ配列の第１の１２５塩基（たとえば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ（ムジカ）Ｎ．（１９９２）上記を参照されたい）。この場合には、末端配列が、２つの構成の一方にあることが可能である。「フリップ」とも呼ばれているこの第１の構成では、Ｂパリンドロームは、３’端部により近く、かつ「フロップ」とも呼ばれている第２の構成では、Ｃパリンドロームは、３’端部により近い（Ｓｖｉｖｓｔａｖａ（スヴィブスタバ）Ａ．他（１９８３）Ｖ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）４５（２）、５５５も参照されたい）。この２つの構成は、組換え事象を経てそれらの構成を頻繁に変化させるが、それは、対応するベクターコンストラクトの不安定化をもたらす。
【００４７】
驚いたことに、５’フランキングＩＴＲ配列内での欠失は、ヌクレオチド６１から８２までの領域において、好ましい実施例では８０ヌクレオチド、特定的には４０ヌクレオチド、特に２２ヌクレオチドを含むが、これらのベクターコンストラクトの安定性をもたらすことが今ではわかってきているのは、フリップフロップ配向間の構成の変化はもはや可能ではないからである（図８を参照されたい）。
【００４８】
驚いたことに、５’ＩＴＲ配列のＣパリンドロームにそのような欠失を有するベクターコンストラクトを、無傷のＩＴＲ配列を持つベクターコンストラクトとちょうど同じくらい効率的にパッケージングすることができることがさらにわかってきている。
【００４９】
したがって、この発明は、さらに、ＡＡＶに非相同的でありかつＩＴＲ配列によってフランキングされる１つ以上の核酸を含むベクターコンストラクトに関するものであり、５’に位置するＩＴＲ配列は、Ｃパリンドロームの領域に結失を有する。
【００５０】
この発明のさらなる局面は、さらに、５’に位置するＩＴＲ配列がＣパリンドロームの領域に結失を有するベクターコンストラクトを含むベクター細胞である。
【００５１】
この発明のさらなる局面は、ＡＡＶに非相同的である１つ以上の核酸、特定的にはサイトカイン、特定的にはＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１２および／またはＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）および／または同時刺激分子から選択されるタンパク質、特定的にはＢ７、特にＢ７．１および／またはＢ７．２をコードする核酸を含むベクターコンストラクトに関するものである。しかしながら、この発明によれば、非相同的な核酸配列として、いかなる翻訳または他に非翻訳核酸配列を使用することも可能である。好ましくは、１つ以上の非相同的な核酸配列は、熟練した研究者に公知の従来のクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（サムブロック）他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）：研究室マニュアル、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（コールドスプリングハーバー研究室）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）によって複製欠損ベクターコンストラクトに導入される。さらに、適当な核酸配列は、ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎｅ（リンホタクティン）等のケモカイン（炎症性細胞遊走因子）、ランテス（好酸球走化性物質）、ＭＣＰ−１またはＭｉｐ１α、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ１、ＩＬ６，インターフェロンγまたはＩＬ−１０等のサイトカイン、または、たとえばＩＣＯＳに対して、またＩＣＯＳレセプター（受容体）に対して作られた抗体、抗体断片または一本鎖抗体、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（結合基）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＩＬ−１、たとえばＨｅｒ−２／ｎｅｗ等の腫瘍抗原に対して作られたＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−α、ウイルス抗原またはＩｇＥに対して；さらにＩＣＯＳ　ＦＣ等の可溶性のレセプター形に対して作られたＧＤ３またはＣＡ１２５、ＩＣＯＳ−リガンドＦＣ、ＣＤ４０Ｌ　ＦＣ、ＢＣＬ−Ｘファミリーのタンパク質等アポトーシス誘発分子に対して作られたＴＮＦ−αレセプターＦＣ、ＢＡＸ、ＢＡＤまたはカスパーゼ、パーフォリン等のネクローシス（懐死）誘発ペプチド、たとえば細菌に由来する毒素、ＨＰＶ　Ｅ６またはＨＰＶ　Ｅ７等のウイルス腫瘍抗原、Ｂリンパ腫特異性のイデオタイプ抗体等の非ウイルス腫瘍抗原、ＢＣＲＡ−１、ＣＡ−１２５、α―フェクトプロテイン（胎児タンパク質）、ＣＥＡ、ｐ５３、および因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸ等の凝固因子のためのコード（翻訳）配列である。
【００５２】
非翻訳配列は、さらにリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡとしての使用に適する。
【００５３】
Ｗ０　９８／０６７４６は、ＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝操作されたメラノーマ（黒色腫）をワクチンとして用いることができるということを開示している。Ｗ０　９４／１６７１６は、少なくとも１つのサイトカイン、たとえばＧＭ−ＣＳＦまたはＢ７および／または１つの腫瘍関連抗原を用いる癌治療における組換えウイルスの使用を開示している。Ｂ７遺伝子は、この場合には、いわゆるＢ７．１遺伝子のことをいう。Ｗ０　９４／０４１９６は、サイトカインを、かつさらにＢ７．１をも意味しているＢ７をコードする腫瘍症を治療するＤＮＡコンストラクトを開示している。Ｗ０　９２／０００９２は、Ｂ７．１をコードする核酸配列を開示しており、Ｗ０　９４／０３４０８およびＷ０　９５／０６７３８は、Ｂ７．２をコードする核酸配列を開示しており、かつＥＰ−Ｂ１−０　１８８　４７９は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列を開示している。
【００５４】
ベクターコンストラクトに関連してＢ７．２を使用することがとりわけ有利であったのは、生体外では、インターフェロンγまたはＩＬ１２と対照的に、Ｂ７．１に関連して、Ｂ７．２タンパク質はＴリンパ球の活性化に対して抑制効果があることが調査によりわかってきたからである（Ｒｕｄｙ（ルディ）他（１９９７）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　国際免疫学）９、８５３）。ＧＭ−ＣＳＦをコードする第２核酸の存在下で、Ｂ７分子の腫瘍退縮性効果を上げることは可能である（ここではＢ７．１またはＢ７．２を使用することが可能である）。
【００５５】
したがって、この発明のさらなる局面は、ＡＡＶに非相同的である１つ以上の核酸、特定的にはサイトカイン、特定的にはＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１２および／またはＧＭ−ＣＳＦおよび／または同時刺激分子から選択されるタンパク質、特定的にはＢ７、特にＢ７．１および／またはＢ７．２をコードする核酸を含むベクターコンストラクトに関するものである。取り扱いが比較的容易なため、ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸配列およびＢ７をコードする核酸配列の両方を含むいわゆる二重ベクターを特に優先する（図７を参照されたい）。二重ベクターの使用は、特定的にはパッケージング動作の数を減じる。驚いたことに、この発明の二重ベクターは、２つの個々のベクターとの同時感染がそうであるように、２つの外来性核酸の比較的効率的な発現を可能にする（同様に図７を参照されたい）。特定的には、非相同的な核酸は、ＡＡＶのＩＴＲ配列によってフランキングされ、かつその発現は、ＡＡＶに非相同的なプロモーターおよび／またはエンハンサーによって、特定的にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主な前初期エンハンサー／プロモーター（ＭＩＥＰ）によって調節される。適当なプロモーターは、ＡＡＶに非相同的であり、かつ真核生物細胞、好ましくは哺乳類細胞において活性である全てのプロモーターである。その例は、ＳＶ４０プロモーターである（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（サミュルスキー）他（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）６３、３８２２）、上述したＣＭＶエンハンサー／プロモーター（Ｖｉｎｃｅｎｔ（ビンセント）他（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ（ワクチン）９０、３５３）またはレトロウイルスのＬＴＲプロモーター（Ｌｉｐｋｏｗｓｋｉ（リプコフスキー）他（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　分子および細胞生物学）１８、３９８８）。しかしながら、ＣＭＶ　ＭＩＥＰは、その非常に強い発現のために特に好ましく、それは最小の変動しか受けない。
【００５６】
この発明の更なる局面は、組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージングおよび／または生成のための親細胞を作成する方法であって、次のステップを含む：
（ａ）レップヘルパーコンストラクトおよびキャップヘルパーコンストラクトの生成、
（ｂ）親細胞へのレップヘルパーコンストラクトの導入、
（ｃ）レップヘルパーコンストラクトを含む親細胞の選択、
（ｄ）選択された親細胞への、キャップヘルパーコンストラクトの導入、および
（ｅ）レップヘルパーコンストラクトおよびキャップヘルパーコンストラクトを含むパッケージング細胞の選択。
【００５７】
レップヘルパーコンストラクトおよびキャップヘルパーコンストラクトの導入の配列もまた、逆にすることができる。同様に、レップヘルパーコンストラクトのおよびキャップヘルパーコンストラクトの導入が、本来同時に起こることが可能である。
【００５８】
さらなる可能性は、ｒＡＡＶのヘルパーウイルス非依存性のパッケージング細胞を生成することであり、次の更なるステップを含む：
（ｅ／ｄ）　産生株細胞への、ヘルパーウイルスの少なくとも１つのヘルパー遺伝子および／または１つの調節された細胞ヘルパー遺伝子の導入、および
（ｆ／ｅ）　１つ以上のヘルパー遺伝子を含むベクター細胞の選択。
【００５９】
この種類の細胞には、ヘルパーウイルス感染がｒＡＡＶ生成に必要であるという利点がある；それどころか、ｒＡＡＶ生成を、たとえばヘルパー遺伝子のプロモーターを誘発することによって開始することができるだろう。ヘルパー遺伝子は、この点については、ＡＡＶのヘルパーウイルスの遺伝子および／または細胞遺伝子であり、それらの遺伝子産物は、ＡＡＶ複製に必要であるか、または後者を促進する。たとえばアデノウイルスにおいては、ヘルパー遺伝子は、Ｅ１Ｂ、Ｅ４、Ｅ２ＡおよびＶＡである。Ｅ１Ａは、ＡＡＶのｐ５プロモーターのトランス活性化に必要である。Ｅ１ＢおよびＥ４遺伝子産物は、この点については、ＡＡＶのｍＲＮＡの蓄積を高めるのに役立つ。Ｅ２ＡおよびＶＡ遺伝子産物は、ＡＡＶのｍＲＮＡスプライシングおよび翻訳を強めるのに役立つ。この発明によれば、ヘルパー遺伝子として含まれるのは、また単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ヘルパー遺伝子である。好ましい実施例では、これらは７つの複製遺伝子ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ９、ＵＬ２９、ＵＬ３０、ＵＬ４２およびＵＬ５２であり、８および５２はＨＳＶヘリカーゼープライマーゼ複合体を形成し、ＵＬ２９は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をコードし、ＵＬ４２は、二重鎖ＤＮＡ結合タンパク質をコードし、ＵＬ３０は、ＨＳＶ　ＤＮＡポリメラーゼをコードし、かつ最後にＵＬ９は、ＨＳＶの複製開始点を結合させるタンパク質をコードする（Ｗｅｉｎｄｌｅｒ（ヴァィンドラー）ＦＷおよびＨｅｉｌｂｒｏｎｎ（ハイルブロン）Ｒ（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）６５．（５）：２４７６−８３）。個々のヘルパー遺伝子、たとえばアデノウイルス型５（Ａｄ５）の代わりに、ヘルパーウイルスを使用することがとりわけ有利であるのは、このことは、ヘルパーウイルスの存在下でＡＡＶ複製の自然状況に最も近づくからであり、かつそれゆえｒＡＡＶ粒子のパッケージングは非常に効率的である。他のヘルパーウイルスの例は、ヘルパーウイルスまたはワクシニアウイルスである。
【００６０】
この発明の１つの構成成分は、ｒＡＡＶベクター細胞の生成であり、次のステップを含む：
（ａ）ベクターコンストラクトの生成、
（ｂ）親細胞へのベクターコンストラクトの導入、および
（ｃ）ベクターコンストラクトを含むベクター細胞の次の選択。
【００６１】
さらなる可能性は、ヘルパーウイルス非依存性ｒＡＡＶベクター細胞を生成することであり、次のさらなるステップを含む：
（ｄ）産生株細胞への、ヘルパーウイルスの少なくとも１つのヘルパー遺伝子および／または１つの調節された細胞ヘルパー遺伝子の導入、および
（ｅ）１つ以上のヘルパー遺伝子を含むベクター細胞の選択。
【００６２】
このヘルパーウイルス非依存性のベクター細胞の利点は、ヘルパーウイルス非依存性のパッケージング細胞の利点に対応する。
【００６３】
この発明のさらなる局面は、ｒＡＡＶ産生株を生成する方法に関するものであり、次のステップを含む：
（ａ）上述したような、パッケージング細胞の生成、
（ｂ）パッケージング細胞への、少なくとも１つのベクターコンストラクトの導入、および
（ｃ）１つ以上のベクターコンストラクトを含む産生株細胞の選択。
【００６４】
産生株を生成するさらなる可能性は、次のステップから成る：
（ａ）上述したような、ベクター細胞の生成、
（ｂ）ベクター細胞への、上述した少なくとも１つのヘルパーコンストラクトの導入；複数のヘルパーコンストラクトに関しては、これは一緒にまたは経時的に起こりうる、および
（ｃ）１つ以上のヘルパーコンストラクトを含む産生株の選択。
【００６５】
この発明のさらなる局面は、ヘルパーウイルス非依存性のｒＡＡＶ産生株細胞の生成に関するものであり、次のさらなるステップを含む：
（ｄ）産生株細胞への、ヘルパーウイルスの少なくとも１つのヘルパー遺伝子および／または１つの調節された細胞ヘルパー遺伝子の導入、および
（ｅ）１つ以上のヘルパー遺伝子を含む産生株細胞の選択。
【００６６】
このヘルパーウイルス非依存性の産生株細胞の利点は、ヘルパーウイルス非依存性のパッケージング細胞の利点に対応する。
【００６７】
コンストラクトの導入は、一般的に、この発明の目的のための形質移入を意味する。しかも、コンストラクトが、親細胞のゲノムへ永久に組み込まれない可能性があり、このことは、一般的に、一過性形質移入と呼ばれる。しかしながら、これに代わるものとして、コンストラクト、特定的にはベクターコンストラクトは、親細胞のゲノムへ安定して組み込まれることもでき、または（たとえばＳＶ４０ラージＴ抗原／ＳＶ４０ｏｒｉまたはＥＢＮＡ１／ＥＢＶｏｒｉＰからの複製系を用いて）安定なエピゾームコピーとして保持されることもできる。そのような組み込まれたコンストラクトは、親細胞ゲノムのＤＮＡ複製に従って複製され、かつ引き続いて娘細胞に伝えられる。
【００６８】
この発明の方法の特定の実施例においては、１つ以上のコンストラクトの、特定的には１つ以上のベクターコンストラクトの導入は、ウイルスに感染することによって起こる。この点については、組換え型ウイルスが優先され、たとえばｒＡＡＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスおよび／またはファージ、特にバクテリオファージを使用することが可能である。
【００６９】
組込み事象を用いる細胞についての事前選択は、さらに、安定して組み込まれたコンストラクトを持つ細胞を選択するためのパッケージング、ベクターおよび／または産生株細胞を生成する上記方法に適している。たとえば、形質移入されるべきレップまたはキャップヘルパーコンストラクトを、１０：１の比でレポーターコンストラクトと混合することができ、かつ親細胞へ共同で導入し、たとえば同時形質移入することができる。これに続いて、レポーターについて選択が行なわれるのは、レポーターコンストラクトが組み込まれた細胞はまた、高い確率で、それぞれのヘルパーコンストラクトを組み込んだと想定することができるからである。
【００７０】
適当な細胞を、各々の場合に、タンパク質発現の検出によって、たとえばウエスタンブロッティングによって選択することができる。細胞におけるコンストラクト特異性核酸の定量検出は、たとえば定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはサザンまたはノーザンブロッティングによって、同様に適当であろう。
【００７１】
適当な細胞を検出する好ましいやり方はまた、パッケージングについて欠けているコンストラクトを特定の細胞へ導入することによって、かつヘルパーウイルスに感染することでパッケージングを開始することによって、ｒＡＡＶのこれらの細胞へのパッケージングを直接検出することである。
【００７２】
レップまたはキャップヘルパーコンストラクトを含むパッケージング細胞にとっては、各々の場合に、他のヘルパーコンストラクトのための、およびたとえばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などのカラーマーカーを導入遺伝子として有するベクターコンストラクトのための必要性がある。比較すると、レップおよびキャップヘルパーコンストラクトを有するパッケージング細胞にはベクターコンストラクトのみが必要である。レップおよびキャップヘルパーコンストラクトは、ベクター細胞に必要である。ヘルパーコンストラクトもベクターコンストラクトもどちらも、産生株細胞には必要でない。これらの細胞は、引き続いて誘発されて、ウイルスヘルパー遺伝子の導入によって、特定的にはヘルパーウイルスに感染することによってｒＡＡＶを生成することができる。これと対照的に、ヘルパーウイルス非依存性のパッケージング、ベクトルまたは産生株細胞は、それらが必要なヘルパー遺伝子の全てを既に含んでいる限りヘルパー遺伝子の導入を必要としないか、あるいはわずかなヘルパー遺伝子の導入のみを必要としている。これらの細胞には、ｒＡＡＶ生成を開始するために、単にヘルパー遺伝子を誘発する必要があるにすぎない。
【００７３】
引き続いて、ＡＡＶの力価は、従来の方法によって決定されることができ、それから最適なキャップまたはキャップ／レップの発現の手段として役立つ。この手順は、適当な細胞の選択において、発現される絶対量についてのみならず、キャップ発現のレップ発現との最適な比について選択がなされるという利点がある。しかも、この方法には、この場合、無傷のレップおよびキャップ遺伝子についてさらに選択がなされるという利点があるのは、ｒＡＡＶのパッケージングにはもはや適さないタンパク質をまだ生成しているレップおよび／またはキャップの突然変異体は、上述の他の検出方法では同定されないであろうからである。
【００７４】
この発明のさらなる局面は、ｒＡＡＶを生成するための、レップヘルパーコンストラクトおよび／またはキャップヘルパーコンストラクトのおよび／またはベクターコンストラクトの、および／またはパッケージング細胞の、ベクター細胞のまたは産生株細胞の、特定的にはヘルパーウイルス非依存性の産生株細胞の使用に関するものである。
【００７５】
ｒＡＡＶベクターコンストラクトは、ＡＡＶに非相同的である１つ以上の核酸を含む。既に上述したように、ＧＮ−ＣＳＦおよびＢ７．１および／またはＢ７．２が、非相同的な核酸として用いられる場合には、パッケージング動作から生じ、かつ２つの免疫賦活性遺伝子を宿しているｒＡＡＶ粒子を、種々の腫瘍症、たとえばメラノーマまたは卵巣癌の治療にとって効率的な形質導入ベクターとして用いることができる。
【００７６】
以下の図面および説明は、この発明をより詳細に説明することを意図しているが、それを制限するものではない。
【００７７】
図の説明
図１Ａは、野生型ＡＡＶと比較したこの発明のいくつかのヘルパーコンストラクトの図式による表示を示している。自然ＡＡＶプロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０は、ＡＡＶゲノムの主なイントロン（“Ｉ”）およびＡＡＶゲノムの自然ポリＡ（アデニル酸）信号（“ｐＡ”）のように示されている。コード配列は、ＡＡＶのレップ遺伝子およびキャップ遺伝子についても示されている。
【００７８】
図１Ｂは、３つの異なるベクターコンストラクトの図式による表示を示しており、左および右フランキング（側方）端部でのＩＴＲを示している。名称「ＣＭＶ」は、サイトメガロウイルスの主な初期プロモーターを表している。名称「Ｉ」は、プロメガ社のｐＣＩプラスミドに存在するイントロンを示している。名称「ｐＡ」は、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のポリＡ信号を示している。略語「ＧＦＰ」は、緑色蛍光タンパク質を表し、「Ｂ７．２」は、免疫同時刺激タンパク質Ｂ７．２を表し、「ＧＭ−ＣＳＦ」は、顆粒球／マイクロファージコロニー刺激因子を表し、かつ「ｎＬａｃＺ」は、酵素β―ガラクトシダーゼの核局在形を表している。
【００７９】
図２は、ウエスタンブロッティング実験によって、安定なレップ細胞系の同定を示している。ＨｅＬａ細胞には、レップヘルパーコンストラクト（Ｐ５　Ｒｅｐ）を形質移入されたが、Ｒｅｐの発現は、自然ＡＡＶプロモーターＰ５およびＰ１９によって制御された。ハイグロマイシン選択マーカーは、図示したレップヘルパーコンストラクトへ１：１９の比で形質移入されたが、示していない。引き続いて、いくつかの耐ハイグロマイシン細胞クローンを取り上げ、かつレップ発現を、アデノウイルスをヘルパーウイルスとして誘発した（レーン１−８）。細胞タンパク質の全量を、特異性レップ抗血清を用いて、ウエスタンブロッティングによって単離しかつ分析した。番号７８／６８／５２／４０は、レップタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０のことをいう。「Ｍ」は、分子量基準を表し、「＋」は、ポジティブコントロール（正の対照）を表し、かつ「−」は、ネガティブコントロール（負の対照）を表す。
【００８０】
図３は、種々のコンストラクトから始まるキャップ遺伝子の誘発性発現を示している。低いゾーンに示されたキャップヘルパーコンストラクトを用いて、レップ発現細胞系Ｒ８４を形質移入した。細胞を、引き続いてアデノウイルス（ＭＯＩ５）に感染させた（レーン１ないし４および「＋」で標識されているｗｔ）か、または制御として感染させなかった（レーン１ないし４および「−」で標識されているｗｔ）。７２時間後、細胞タンパク質全体の含有量を、キャップタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の発現のためのウエスタンブロッティング分析によって調査した。
【００８１】
図４は、アデノウイルス感染後、安定なパッケージング細胞系Ｃ９７におけるレップおよびキャップタンパク質の誘発性発現を示している。Ｃ９７細胞またはＨｅＬａ制御細胞を、アデノウイルス（ＭＯＩ５）に感染させるかあるいは制御として感染させなかった。感染の７２時間の後、細胞タンパク質全体を、それに特異的な抗体を用いて、キャップおよびレップタンパク質の存在について、ウエスタンブロッキングによって抽出しかつ分析した。アデノウイルス感染の後、パッケージング細胞系Ｃ９７において、４つのレップタンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０がはっきりわかり、かつより小さい程度までキャップタンパク質ＶＰ１およびＶＰ２が、かつより大きい程度までキャップタンパク質ＶＰ３がはっきりわかった。
【００８２】
図５は、Ｃ９７細胞における組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の複製を示しており、ｒＡＡＶ複製中間体は、あらかじめｒＡＡＶおよびアデノウイルス（ＭＯＩ５）に感染されるＣ９７細胞から単離される低分子量ＤＮＡとして検出されている。典型的には、感染の７２時間後、完全な細胞変性効果を観察することが可能であり、かつ細胞をこのとき集めた。細胞構成成分を除去するために、細胞の半分を、低分子量ＤＮＡを単離するために用い（第１増幅ラウンド）、かつ細胞の他の半分を、また３回凍結しかつ解凍し、それから遠心分離した。それから上澄みは、無傷のヘルパーウイルスを失活させるために、３０分間５６度で処理した。引き続いて、上澄みを用いて、新たなヘルパーウイルス（ＭＯＩ５）と共に、新鮮なＣ９７細胞を感染させた。明瞭な細胞変性効果は、再度観察可能であり、かつ低分子量ＤＮＡが単離された（第２増幅ラウンド）。元のＡＡＶ系統の感染価を得るために、第１および第２増幅ラウンドから単離したＤＮＡを、ＡＡＶゲノムの複製中間体の存在について、この発明のベクターコンストラクトをプローブとして用いて、サザンブロッテリングによって分析した。
【００８３】
図６は、さらなるヘルパーコンストラクトを図示しており、その全ては、クローニングベクターｐＵＣ１９に由来する。
【００８４】
図７は、単一および二重発現ベクターを図示している。
図８は、「Δ（Ｃアーム）」と呼ばれるＣパリンドロームの構成フリップ、フロップおよび欠失を有するＡＡＶベクターコンストラクトの５’に位置するＩＴＲ配列を図示している。
【００８５】
図９は、図８からの種々の構成の５’に位置するＩＴＲ配列のヌクレオチド配列を図示している。
【００８６】
図１０は、欠失があるおよび欠失のない５’に位置するＩＴＲ配列の、および３’に位置するＩＴＲ配列のヌクレオチド配列を示している。
【００８７】
図１１は、フリップ配向構成に５’に位置するＩＴＲ配列［ｐＡＡＶ（Ｂ７．２＋ＧＭ−ＣＳＦ）］を持つベクターコンストラクトと比較して、欠失した５’に位置するＩＴＲ配列［ｐＡＡＶ−（Ｂ２．７ｆｒｅｅ＋ＧＭ−ＣＳＦ）］を持つベクターコンストラクトの等しく効率的なパッケージングを図示している。
【００８８】
図１２は、ｐＵＣ“Ｒｅｐ６８，５２，４０Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７と呼ばれるレップ７８欠損ヘルパープラスミドを図示している。
【００８９】
図１３は、ｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７と呼ばれるさらなるレップ７８欠損ヘルパープラスミドを図示している。
【００９０】
例
１．プラスミド構成
この発明の目的のために用いられるプラスミド（ベクターコンストラクト、ヘルパーコンストラクト）を、上記のサムブロック他（１９９８）で参照することができる標準クローニング技術を応用して生成した。これらのプラスミドの機能的に関連している部位を、図１ないし３、６、７、１２および１３に図式による表示で示す。プラスミドＰ５Ｒｅｐ（図１Ａ）を、ＡＡＶゲノムのヌクレオチド２３００−４１７０で構成されるＤＮＡ断片を欠失させることによって生成した。（Ｒｕｆｆｉｎｇ（ラフィング）他（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 一般ウイルス学ジャーナル）７５、３３８５−３３９２（遺伝子バンク目録Ｎｏ．ＡＦ　０４３３０３）。Ｐ５ＲｅｐΔ３７を、Ｐ５ＲｅｐからＡＡＶ塩基４４６１−４４９７を欠失させることによって得た。プラスミドＰ５Ｐ１９Ｐ４０Ｃａｐ（図１Ａ）を、ヌクレオチド３５０ないし６５０および１０４５ないし１７００間のＤＮＡ部位を欠失させることによって得た。Ｐ５Ｐ１９Ｐ４０ＣａｐΔ３７を、Ｐ５Ｐ１９Ｐ４０ＣａｐからＡＡＶ塩基４４６１−４４９７を欠失させることによって得た。図３に示されるプラスミド１−４は、ＡＡＶゲノムの種々の欠失を含んでいる。プラスミド１は、ＡＡＶゲノムのＢｃ１Ｉ切断部位とＨｉｎｄＩＩＩ切断部位との間の配列を欠いている。プラスミド２は、ＮｒｕＩ切断部位とＢｓｔＥＩＩ切断部位との間の配列を欠いており、プラスミド３は、ＢａｍＨＩ切断部位とＢｓｔＥＩＩ切断部位との間の配列を欠いている。プラスミド４は、第１図から、プラスミドＰ５Ｐ１９Ｐ４０Ｃａｐに対応する。ｒＡＡＶ−Ｂ７．２−ＧＭ−ＣＳＦ（コロニー刺激因子）およびｒＡＡＶ―ＧＦＰを、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ）社（ドイツ）のｐＣＩプラスミドを用いて作成し、それからＩＴＲ配列を有するｐＵＳ１９ベースのプラスミドへ伝達する（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１０９０を参照されたい）。同様に制御として使用したベクターコンストラクトｎＬａｃＺは、参照文献（Ｂｅｒｔｒａｎ（ベルトラン）他（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）７０、６７５９−６７６６）において既に説明されている。
【００９１】
２．種々のベクターコンストラクトのパッケージング
特定のベクトルコンストラクトの５’に位置するＩＴＲにおけるＣパリンドロームの欠失の、外来性ＤＮＡ（＝導入遺伝子）の発現に対する影響、およびこれらのベクターコンストラクトのｒＡＡＶへのパッケージングを調査するために、形質移入およびパッケージングの比較実験を行なった。この目的のために、ベクターコンストラクトのいくつかのクローンには、無傷の５’−ＩＴＲ（たとえばｐＡＡＶ−（Ｂ７．２／ＧＭ−ＣＳＦ）−図１１を参照）、および５’−ＩＴＲ（ΔＣアーム−たとえばｐＡＡＶ−（Ｂ７．２ｆｒｅｅ／ＧＭ−ＣＳＦ））−図９および１１を参照）のＣパリンドロームに欠失があるベクターコンストラクトのクローンを、ＨｅＬａ−ｔ細胞へ、各々の場合、４×１０^５ のＨｅＬａ−ｔ細胞毎に６μｇのプラスミドを用いて形質移入した。その形質移入の４０時間後、Ｂ７．２発現細胞の比率を、ＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器）分析によって求め、かつ細胞培養上澄み内のＧＭ−ＣＳＦの発現を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着決定法）技術によって見出した。表に示される値は、各々の場合、同じプラスミド型の４つの異なるクローンの複製の平均値を表す。第１実験では、未知の理由のため、達成された形質移入率は、第２実験の効率の約１００倍未満にすぎなかった。このことは、実験１で細胞培養上澄み内のＧＭ−ＣＳＦについて求めた値が、実験２におけるより低い２つの対数単位であった理由を説明している。したがって、実験１における細胞の約４０％のみ形質移入することが可能であったが、一方実験２における細胞のほとんど全ては、タンパク質Ｂ７．２を発現した。
【００９２】
【表１】

【００９３】
表１から明らかなように、２つのベクタープラスミドに関して達成された形質移入効率は、等しく良好で、それゆえ５’に位置するＩＴＲのＣパリンドロームでの欠失は、ＩＴＲ間でクローン化された、導入遺伝子のための発現カセットの発現強度にマイナスの効果を及ぼす。
【００９４】
引き続いて、同じベクタープラスミドを使用して、ｒＡＡＶへのパッケージングについての実験を行なった。この目的のため、各々の場合、４μｇのベクタープラスミドには、１２μｇのヘルパープラスミド（ｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７−図６を参照）を、１０^６ ＨｅＬａ−ｔ細胞へ形質移入した。同様に、この場合、既に上述したように、形質移入効率は、２つの対数単位によって変わることが観察された。２日後、その細胞を、Ａｄ−５（ＭＯＩ２）に感染させた。感染の３日後、その細胞は、繰り返し凍結および解凍することによって、３ｍｌの細胞培養液内で分裂され、細胞成分は、遠心分離によって小球形にされ、かつｒＡＡＶライセート（可溶化液）は、１０分間６０度でインキュベート（保温）されて、ヘルパーウイルスを失活させた。実験１における５００μｌのライセート（低い形質移入率）および実験２における５μｌおよび２５μｌのライセートを用いて、３×１０^５ の照射された（１００Ｇｙ）ＨｅＬａ―ｔ細胞を感染させた。感染の４０時間後、Ｂ７．２発現細胞の割合を、いずれもＦＡＣＳ分析によって求め、かつ細胞培養上澄み内のＧＭ−ＣＳＦの発現を、ＥＬＩＳＡ技術によって見出した。以下の表２に示される値は、各々の場合、同じプラスミド型の４つの異なるクローンの複製からの平均値を示している。
【００９５】
【表２】

【００９６】
表２から明らかであるように、非常に大量のｒＡＡＶは、両方のベクタープラスミドを用いて得られ、かつ５’に位置するＩＴＲのＣパリンドロームに欠失があるベクタープラスミドを用いて得られたｒＡＡＶの量は、ベクタープラスドＢ７．２／ＧＭ−ＣＳＦを用いて得られた量よりさらに大きい。
【００９７】
３．ヘルパーコンストラクトの生成
ＡＡＶ塩基１９０ないし１０６０を、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）によって、野生型ＡＡＶのＤＮＡから増幅した。このための５’プライマーを、独自のＸｂａＩ切断部位が位置１９９へ導入されるように選択した。それからＰＣＲ断片を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、かつ同じようにして切断したベクターｐＵＣ１９へクローン化した。全ての重要なＰ５プロモーターエレメントがヘルパーコンストラクトに存在することを保証するために、ＡＡＶゲノムにおける位置１９９を選択した。配列決定検査の後、野生型ＡＡＶのＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＳｎａＢＩで切断し、かつ挿入断片を、引き続き、中間体のＢａｍＨＩおよびＳｍａＩ位置へクローン化した。基本のヘルパーコンストラクトｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”を、このようにして得た（図６）。このヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶ配列２０１ないし４４９７を含み、一方ベクターコンストラクトは、ＡＡＶ配列１ないし１９１および１−６０／８３−１９１（左ＩＴＲ）および４４９８ないし４６７１（右ＩＴＲ）を宿している（図７を参照されたい）。いかなる相同ＡＡＶ配列の重複もプラスミド上に存在しないことがこのようにして保証された。次に，ＡＡＶレップおよびキャップ遺伝子の最適な発現には必要ではないΔ３７塩基を、ｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”におけるＡＡＶゲノムの３’端部から欠失した。結果として生じるヘルパーコンストラクトは、ｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”Δ３７と呼ばれ、かつ位置２０１から４４６０までの最小にされたＡＡＶ配列を含む（図６）。
【００９８】
それからｐＵＣ１９のベクター背骨におけるレップ結合部位（ＲＢＳ）（配列：５’−ＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣ−３を含めた位置６８４ないし７０８）を、この位置での非相同組換えを避けるために欠失させた。コンストラクトは、ｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７と名付けられる（図６を参照されたい）。いくつかのプラスミドでは、レップ遺伝子（Ｐ５およびＰ１９プロモーター）における３つのＲＢＳが、個々にかつ種々の組み合わせで、レップタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、さらに突然変異された（図６）。
【００９９】
さらなるヘルパーコンストラクトにおいては、６３８の塩基対の長さのいわゆる機能分離配列（ｆｓ）を、レップ遺伝子とキャップ遺伝子との間に挿入した。この目的のために、最初に、ＡＡＶ配列１６９１ないし２３２８は、それはレップＣ末端およびＰ４０に不可欠なキャップ配列および全ての制御配列を含むＡＡＶのＰ４０プロモーターを含むが、スプライスされたレップバージョン（位置２３２９）のための終止コドンの後ろで二重化されかつクローン化された。この結果、ＡＡＶのＰ４０プロモーターが生じ、それはキャップ遺伝子を制御し、レップ遺伝子の後ろで二重にされかつ挿入された。それからＰ４０プロモーターを、レップアミノ酸配列を変化させることなく、レップ遺伝子において破壊した。このことは、Ｐ４０ＴＡＴＡボックスの突然変異によって保証された。必要なクローニングステップについての全変化は、次のＡＡＶヌクレオチドにあったが、それによってレップおよびキャップのアミノ酸配列を変化させることはなかった：１６９３（Ｔ→Ａ）、１６９４（Ｔ→Ｇ）、２３３０（Ｇ→Ｃ）、２３３１（Ｇ→Ｔ）、２３３２（Ｇ→Ａ）、１６２５（Ｃ→Ｔ）、１６２８（Ａ→Ｇ）、１８２６（Ａ→Ｃ）、１８２７（Ａ→Ｔ）および１８２８（Ｇ→Ｃ）。結果として生じるヘルパーコンストラクトは、ｐＵＣ“ｒｅｐ／ｆｓ／ｃａｐ”Δ３７と呼ばれる（図６）。
【０１００】
さらなる配列を、同じようにｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７へ挿入し、結果としてｐＵＣ“ｒｅｐ／ｆｓ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７と呼ばれるヘルパーコンストラクトが生じた。
【０１０１】
さらなるレップ７８欠損ヘルパーコンストラクトを、ＡＡＶヌクレオチド１９０７ないし２２２７を欠失させることによって生成したが、それらのヌクレオチドは、二重鎖突然変異誘発によって、ヘルパーコンストラクトｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（図６を参照）におけるレップイントロン（介在配列）に対応し、その結果中間物としてプラスミドｐＵＣＡＡＶスプライスが生じた。プラスミドｐＵＣＡＡＶスプライスを、制限酵素ＮｄｅＩで直線化し、エキソヌクレアーゼ（ポリヌクレオチド末端加水分解酵素）、たとえばリョクトウヌクレアーゼ（核酸分解酵素）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ベーリンガー）マンハイム社、ドイツ）で処理し、次に制限酵素ＳｐｈＩと混合した。このようにして得られた４２２２ｂｐの長さの断片は、ベクター断片との結合によって接続されて、レップ７８欠損ヘルパーコンストラクトｐＵＣ“Ｒｅｐ６８，５２，４０Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（１０６５７ｂｐ）（図１２を参照）を与えた。このベクター断片を、制限酵素ＮｒｕＩおよびＳｐｈＩで処理した後に、たとえば、６４３５ｂｐの長さで得られるｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（図６を参照）を用いて得ることができる。
【０１０２】
同じベクター断片を、さらなる７８欠損ヘルパーコンストラクトｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（図１３を参照）を生成するためにさらに使用することができる。この目的のために、中間ｐＵＣＡＡスプライスを、制限酵素ＡｓｅＩ、ＢｓｒＢＩおよびＳｐｈＩで処理した。１８０８ｂｐの長さのＢｓｒＢＩ−ＳｐｈＩ断片は、６４３５ｂｐの長さのベクター断片との結合によって接続されて、８２４３ｂｐの合計長さの上記ヘルパーコンストラクトｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７を与えた。このクローニング方策を経て、両方のレップ７８欠損ヘルパーコンストラクトにおけるレップ遺伝子が、部分的に複製された。したがって両方のレップ遺伝子によるレップタンパク質Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０の増強された発現が可能となる。最後に、ＡＡＶのＤＮＡ部位２９４６−４０４９を、Ａｐａ１による消化および再結合によって、このコンストラクトから欠失させることができ、その結果レップ発現プラスミドｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７が生じ、それはＲｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をもっぱらコード化する。上述のかつ図６に図式的に示したヘルパープラスミドは全て、ほぼ匹敵するパッケージング能力を有する。
【０１０３】
【表３】

【０１０４】
Ｒｅｐ７８欠損ヘルパーコンストラクトは、ヘルパーコンストラクトおよびベクターコンストラクトを逐次形質移入（下の表４に示されている実験１および３、ならびに表５のさらなる実験）すると、Ｒｅｐ７８コード化ヘルパーコンストラクトと比較して、ほぼ等しく良好なパッケージング効率を示している。実験２では、同時形質移入が行なわれたため、他の実験条件が選択され、かつそれゆえ実験２は、いずれのパッケージング効率に関しても、実験１および３と比較することができない。
【０１０５】
【表４】

【０１０６】
この発明のレップヘルパーコンストラクトｐ５ＲｅｐΔ３７（４つのレップタンパク質全てをコード化するが、キャップタンパク質はコード化しない）およびｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８ΔＣａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（レップタンパク質Ｒｅｐ６８、５２および４０をもっぱらコードする）を、キャップコンストラクトｐ５ｐ１９ｐ４０ＣａｐΔ３７と共に、１：１の比で、適当なパッケージング細胞へ同時形質移入することで、引き続いてベクターコンストラクトを逐次または同時形質移入しかつアデノウイルスに重感染すると、レップとキャップ両方をコードする単一ヘルパーコンストラクトが細胞（ｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７、ｐＵＣ“Ｒｅｐ６８，５２，４０Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７、ｐＵＣ“Ｒｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７）へ形質移入されるときのように、匹敵するｒＡＡＶ力価を再度達成することができるようになっている。これについてのデータを表５に示す。驚いたことに、今までは、このようにして生成されたｒＡＡＶライセートにはすこしもｒｃＡＡＶ汚染物質が見つけられなかった。
【０１０７】
【表５】

【０１０８】
形質移入実験の目的のため、４μｇのベクターコンストラクト（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ）には、１２μｇのヘルパーコンストラクトを、１×１０^６ ＨｅＬａ−ｔ細胞へ同時形質移入した。（ｓｅｑ）によって指定される実験の場合においてのみ、最初１６μｇのヘルパーコンストラクトがあり、１日後には逐次形質移入された１６μｇのベクターコンストラクトがあった。レップおよびキャップが、別々のヘルパー遺伝子（ｐ５ＲｅｐΔ３７、ｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８ΔＣａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７およびｐ５ｐ１９ｐ４０ＣａｐΔ３７）として形質移入されるパッケージング混合物では、レップおよびキャップは、１：１の比で同時形質移入される（言い換えれば、８μｇのレップと８μｇのキャップ）。（第１）形質移入の２日後、細胞は、Ａｄ−５（ＭＯＩ（感染効率）２）に感染された。３日後、細胞は、凍結／解凍溶解によって培養液内で分裂され、細胞成分は小球状にされ、かつｒＡＡＶライセートは、１０分間６０度で熱失活された。ライセートの種々の希釈を用いて、３×１０^５ の照射されたＨｅＬａ−ｔ細胞（１００Ｇｙ）を感染させた。細胞をｒＡＡＶに感染させた４０分後、それらの細胞を、ＦＡＣＳのフローにおいてＧＦＰ発現について分析し（以下参照）、かつｒＡＡＶ未精製ライセートの伝達力価を、それから求めた。各ヘルパーコンストラクトを、少なくとも５つの独立した実験で検査した。
【０１０９】
４．三重の形質移入および逐次形質移入に最適なレップ／キャップ比
別々のレップおよびキャップ発現プラスミドを使用して、１：１のレップ／キャップ比を選択することは絶対的には必要ないので、次のプラスミドの組み合わせについて、最適なレップ：キャップ比を求めた。
【０１１０】
ｐ５ＲｅｐΔ３７のｐ５ｐ１９ｐ４０ＣａｐΔ３７との組み合わせ、およびｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８ΔＣａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７のｐ５ｐ１９ｐ４０ＣａｐΔ３７との組み合わせを、各々の場合、ベクタープラスミドｐＡＡＶ（Ｂ７．２ｆｒｅｅ／ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて検査した。第一に、三重形質移入（３つのプラスミド全てを同時に形質移入すること）において、および第二に、逐次形質移入（最初２つのＡＡＶヘルパープラスミドを、かつ１日後そのベクタープラスミドを形質移入する）において、これを調査した。
【０１１１】
３つのプラスミド全ての３重形質移入の場合には、ヘルパープラスミドとベクタープラスミドとの最適比を、常に４：１として選択した。それから最適なレップ：キャップ比を、ヘルパープラスミドについて決定した。１２：１から１：１２までのレップ：キャップ比を、４つの組み合わせ全てに対して検査した。表６に編集したレップ：キャップ比は、最終的に最適だとわかった（約１０の個々の実験の平均値）。
【０１１２】
【表６】

【０１１３】
それから各々の場合、最適なレップ：キャップ比（表６を参照）での種々のプラスミドの組み合わせを、それらのパッケージング効率の点で互いに比較した。ヘルパープラスミドｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７に同じベクタープラスミドを逐次形質移入することは、参照パッケージング（＝１００％）として役立った。その結果を、１０の個々の実験の平均値として表７に編集する。
【０１１４】
【表７】

【０１１５】
別々のレップーキャップヘルパープラスミドを用いて、参照プラスミドｐＵＣ“ｒｅｐ／ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（１．３ないし１．６倍に等しい１３２ないし１６２％）を用いるよりより高いパッケージング効率を達成することができることは表７から明らかである。ベクタープラスミドを逐次形質移入することにおけるｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８ΔＣａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７のｐ５ｐ１９ｐ４０ＣａｐΔ３７との組み合わせのみ、粒子の生成の著しい減少を示している（７０％パッケージング効率）。
【０１１６】
別々のヘルパープラスミドとの４つの混合物のいずれにおいてもｗｔＡＡＶが検出可能でないことも重要であるが、一方参照プラスミドは、ｒＡＡＶの力価と比較して、０．０１％の領域で大量のｒｃＡＡＶをまだ生成している。
【０１１７】
このように、この発明のヘルパープラスミドを用いて、より高いパッケージング効率を達成することもｒｃＡＡＶの形成を妨げることもいずれも可能であった。
【０１１８】
５．細胞培養
ＨｅＬａ開始細胞およびそれから由来する全てのパッケージング細胞系を、１０％のウシ胎児血清を含んでいるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）における単層細胞培養として維持してきた。さらに、種々の選択試薬を用いて、形質移入された細胞から安定な細胞系を得た。この点については、ハイグロマイシンＢを５００μｇ／ｍｌの濃度で使用し、ネオマイシンを８００μｇ／ｍｌの濃度で使用し、かつ／またはピューロマイシンを１μｇ／ｍｇの濃度で使用した。細胞を５％Ｃｏ_２ 雰囲気において３７度で培養した。形質移入を、従来のリン酸カルシウム沈殿技術（Ｃａ_３ （ＰＯ_４ ）_２ ）、およびＱｉａｇｅｎ（キアゲン）社（ヒルデン、ドイツ）のキットを用いて得たエンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡの助けを借りて行なった。組み込まれるべきプラスミドおよび抵抗性プラスミドの同時形質移入の後安定な細胞系を得るために、２つのプラスミドについて２０：１の混合比を選択した。
【０１１９】
６．安定なレップ発現細胞系の生成
レップコード化プラスミドを、ＩＴＲ配列をもたないが他のＡＡＶ調節エレメントの全てを持つＡＡＶ２のゲノムから、キャップコード化配列の欠失によって生成した（図１）。引き続いて、ＨｅＬａ細胞には、レップ発現コンストラクトを形質移入し、かつアデノウイルス感染後レップタンパク質を発現した細胞クローンを、第２図に示されるように、ウエスタンブロッティングによって同定した。単一クローンを選択し、かつヘルパーウイルスの存在下で挿入されたｒＡＡＶゲノムを複製するその能力を、詳細に特徴づけた。レップ細胞系の同定およびレップタンパク質の機能性の証明の後、この細胞系を用いて、キャップヘルパーコンストラクトをその細胞系へ挿入した。
【０１２０】
７．安定なキャップ細胞系を生成するの適しているヘルパーコンストラクトの同定
キャップタンパク質の発現が、自然ＡＡＶ調節エレメントによって制御されるいくつかのプラスミドを作成した。第一に、Ｐ５プロモーターの制御下でキャップ遺伝子を構成するプラスミドを作成した。このプラスミドによって、ヘルパーウイルスがアデノウイルスに感染した後のみ、キャップタンパク質の発現が検出可能となるが、検出可能な量のタンパク質は比較的少ない。したがって、Ｐ５プロモーターとＰ１９プロモーターとの間のＤＮＡ配列が欠失された第２プラスミドを作成した。このプラスミドは、キャップタンパク質のみならず、Ｐ１９レップタンパク質もまた発現した。このキャップ発現プラスミドを用いて、非常に少ない量のキャップタンパク質のみが、ヘルパーウイルス感染後検出可能であった。引き続いて、第３図に図式的に示している一連のキャッププラスミド全体を作成した。これらのプラスミド全てによって、著しくキャップタンパク質が発現され、かつ達成したタンパク質の量は、ＩＴＲ配列を除外すると（図３の「ｗｔ」参照）、ＡＡＶゲノム全体を含んでいるプラスミドからのタンパク質の量と匹敵した。第１図に示されるようなプラスミドＰ５Ｐ１９Ｐ４０Ｃａｐを、次の実験全てについて使用したのは、それは、さまざまな実験で、他のキャップコンストラクト（図３を参照せよ）よりわずかに多い量のキャップタンパク質を常に提供したからである。
【０１２１】
８．レップおよびキャップタンパク質を発現する安定な細胞系の生成
レップタンパク質を安定して発現しかつ例５で説明した細胞系には、引き続いてプラスミドＰ５Ｐ１９Ｐ４０Ｃａｐを形質移入した。アデノウイルス感染後、それから発現された大量のレップおよびキャップの両方を同定した（図４を参照されたい）。それから選択した細胞系におけるレップタンパク質とキャップタンパク質の機能性を、増幅２ラウンドに関して、感染性の実験で調査した。第５図の実験結果からは、レップタンパク質とキャップタンパク質はいずれも、選択した細胞系において機能的であり、かつ感染性ｒＡＡＶはこれらの細胞に形成されることが明らかである。これらのデータからは、この細胞系を、ｒＡＡＶ系統についての感染価を得るために用いることができるということがさらにわかる。ゲノムのＤＮＡに関してのサザンブロッティング実験からは、レップおよびキャップ発現カセットが、２つの異なる染色体部位で完全に一体化されることがわかった。
【０１２２】
９．このパッケージング細胞系を用いるｒＡＡＶの一過性生成
ベクターコンストラクトが一過性形質移入実験で提供されると、この発明のこのパッケージング細胞系に関して、ｒＡＡＶのどれくらい高い割合が達成されるかについての決定を引き続いて行った。したがって、ＧＦＰかＢ７．２−ＧＭ−ＣＳＦ（図１Ｂ）のいずれかをコードするベクターコンストラクトを、安定な細胞系へ形質移入した。２４ないし４８時間後、アデノウイルスを、５の感染効率（ＭＯＩ５）で加えた。ウイルスライセートを、７２時間後に得てかつ精製し、かつＨｅＬａ細胞を伝達するために用いた。ベクタープラスミドおよびアデノウイルスヘルパー機能が存在するとき、Ｃ９７細胞は実際ｒＡＡＶを生成することができるということを、９つの独立した実験で示すことが可能であった。その結果を表８にまとめる。
【０１２３】
【表８】

【０１２４】
この発明の細胞系の重大な利点は、いかなる野生型ＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）も期待することができないというということである。ｒｃＡＡＶの混入を検出しようとする数多くの試みがなされてきたが、今まで、これらの細胞系から生成されたウイルス系統にはいかなるｒｃＡＡＶ粒子も検出することができなかった。これには、ｍｌにつき約５×１０^７ の伝達粒子を持つ１−２ｍｌのウイルスを検査する必要があった。
【０１２５】
１０．安定な産生株細胞系の生成
この発明は、次のステップでは、ｒＡＡＶを生成する安定な細胞系を生成することであり、それらはｒＡＡＶの生成のためのベクターコンストラクトの形質移入をもはや必要とせず、そういうわけでｒＡＡＶを大規模に生成することができる。この目的のために、複数の独立した形質移入ステップで、ベクターコンストラクトをＣ９７細胞に形質移入した。ｒＡＡＶゲノムに存在している外来性ＤＮＡの発現後、最初にクローンをスクリーニング（選別）した。第二に、レップおよびキャップの発現によるウイルス収率に関しても、クローン間で選択をした。スクリーニング後、ベクターコンストラクトＧＦＰについて、７２のクローンを同定し、ベクターコンストラクトＢ７．２−ＧＭ−ＣＳＦについて３１のクローンを、ベクターコンストラクトｎＬａｃＺについて３４のクローンを同定したが、それらのクローンは、アデノウイルスの感染後のみ種々のオーダーでｒＡＡＶを形成することができた。その結果を表９に示す。
【０１２６】
【表９】

【０１２７】
１１．さらなるパッケージング細胞系の生成
（４つのレップタンパク質の全てをコードする）ヘルパープラスミドｐ５ＲｅｐΔ３７および上述したｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８ΔＣａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７（Ｒｅｐ７８欠損）を、各々の場合、（３つのキャプシドタンパク質をコードする）ｐ５ｐ１９ｐ４０ＣａｐΔ３７および下記のネオマイシン抵抗性遺伝子プラスミドと組み合わせて用いて、ＡＡＶ−２ベクターについてさらなるパッケージング細胞系を生成した。
【０１２８】
ＨｅＬａ−ｔ細胞には、約１０％の集密で、レップ、キャップおよび抵抗性遺伝子プラスミドの各々１つを同時形質移入し（１０：１０：１の比で）、かつその細胞を、それらがほぼ１００％の集密に達するまでさらに培養した。形質移入の４８時間後、抗菌選択Ｇ４１８を開始した。１００％の細胞の集密に達した後、細胞を、トリプシン処理し、かつ各々が１０％の集密の１０の細胞プール（貯蔵所）に播いた。これらの細胞プールを、第１パッケージング実験を始める前に、（１００％の集密に達した後その都度細胞を継代して）さらに約４週間培養した。
【０１２９】
各プールから複製を生成した。さらに、１つの複製を培養し、かつ関連した複製には、１０％の集密で、ＡＶ−ＧＦＰベクタープラスミドを形質移入し、かつ２４時間後、その複製をＡｄＶに感染させた。７２時間後、そのｒＡＡＶベクターを、番号１２および１３の例「ｒＡＡＶの生成」および「ウイルス滴定」で説明するように、収集しかつ滴定した。ｒＡＡＶベクターのパッケージングに関して、１０のプールの最も効率的なものをこのようにして同定した。
【０１３０】
２つの新たなパッケージング細胞系（Ｒｅｐ７８遺伝子があるものおよびないもの）の各々について１つのプールを、さらに引き続いてクローン化した。最初に、１００−１０００細胞の約２５０のプールを、パッケージング実験でスクリーニング（選別）した。また最もよかったプールをさらにクローン化し、次のステップで（細胞系につき）１０の細胞の約１０００のプールを分析した。その最良のプールを、最終的に単細胞クローン化した。パッケージング細胞系につき約１００の単細胞クローンを分析した。最後に、Ｒｅｐ７８コード化細胞系（ＳＨと名付けた）の３つの単細胞クローン、およびＲｅｐ７８欠損パッケージング細胞系（ＤＪ）の４つの単細胞クローンの結晶を取り出した。Ｇ４１８の非存在下でかつそれゆえさらなる淘汰圧なしに、これらのクローンを４０の継代について培養した。予め説明したように、約２週間毎に、７つのクローンを用いてパッケージング実験を行なった。使用したベクタープラスミドは、ｐＡＡＶ−ＧＦＰまたはｐＡＡＶ−（Ｂ７．２／ＧＭ−ＣＳＦ）であった。この一連の実験では、ヘルパーウイルスとしてＡｄＶのみを使用した。このことから、７つのクローン全てが、それらのパッケージング効率を、培養時間中ずっと保持しており、かつそれゆえＡＡＶ遺伝子の安定な組込みがあると想定することができるということが明らかになった。７つのクローンの全ては、アデノウイルスをヘルパーとしての使用して、１×１０^７ ｔＰ／ｍｌの領域でほぼ匹敵するパッケージング効率を達成した。
【０１３１】
１２．ｒＡＡＶの生成
ｒＡＡＶを生成するために、パッケージング細胞には、ベクタープラスミドを形質移入し、かつ４８時間後、その細胞をアデノウイルスに感染させた（ＭＯＩ５）。産生株細胞系をアデノウイルスのみに感染させた。アデノウイルス感染の７２時間後、細胞および上澄みを収集したが、細胞は５分間１５００ｒｐｍでの遠心分離によって遠心沈殿され、かつ上澄みの一部には、ｍｌにつき約１０^７の細胞が再縣濁された。上澄みの残りの部分を、３０分間５６度で処理し、それから使用されるまで凍結した。細胞縣濁を、３回「凍結／解凍」周期にさらしたが、凍結動作は−８０度で起こり、かつ解凍動作は３７度で起こった。それから細胞のかけらを、５分間、微量遠心管での遠心分離によって全力で除去した。残りのアデノウイルスを、３０分間５６度で、インキュベーション（保温）によって失活させた。このことから結果として生じる上澄みを、さらなる精製のためのウイルス系統として、この発明の目的のために使用した。
【０１３２】
１３．ウイルス滴定
ウイルス系統は、形質導入に機能上適している力価に常に達した。ＨｅＬａ細胞を、リン酸緩衝食塩水内で、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ^ＴＭ（ドイツ、Ｓｒａｇｅｎｅ（ストラジーン）社から通常購入することができる）内での紫外光（３５Ｊ／ｍ^２ ）で処理した。照射後すぐに、細胞をｒＡＡＶ縣濁にさらした。異なる比例した量の形質導入された細胞を得るために、所与の標本の異なる量を常に使用した。それから公知の標的細胞の数から始めて、形質導入単位の数を計算によって求めた。形質導入された細胞の割合は、高い形質導入率ではもはや線状挙動を示していなかったが、１０％以下の形質導入率が選択されたときには、ほぼ線状だった。１２穴の板で滴定を行ない、１穴につき２×１０^５ のＨｅＬａ細胞を感染させた。これらの感染を、５００μｌの緩衝液内で行なった。
【０１３３】
さらに、この発明の目的のために用いられるいくつかのウイルス系統を、特別な感染検査を用いて滴定したが、２つのパッケージング細胞増幅ラウンドを、標本の感染価を求めるために行なった。この検査の詳細を、たとえば、Ｃｌａｒｋ（クラーク）他（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ（遺伝子治療）３、１１２４−１２３２で参照することができる。この目的のために、ウイルス系統を無血清の培養液内で連続的に希釈し、それから定量のアデノウイルス（ＭＯＩ５）と共に、公知の量の初期ウイルス系統を含んでいる部分を、この発明の目的のために、パッケージング細胞系Ｃ９７を形質導入するのに使用した。７２時間後、細胞および上澄みを、収集し、３回「凍結／解凍」周期にさらし、細胞の一部を除去するために遠心沈殿させ、アデノウイルスを失活させるために５６度で処理し、それから新鮮なアデノウイルスと共に、新鮮なＣ９７細胞が入った細胞培養皿上に置いた。更に３日後、それらの細胞を収集し、かつそれらのＤＮＡを、標準プロトコルを用いてハート溶解によって単離した（Ｈｉｒｔ（ハート）（１９６７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　分子生物学ジャーナル）２６、３６５−３６９）。レップおよびキャップを含んでいる感染性粒子を同定するために、ＤＮＡを、アガロースゲル内で、その大きさに従って分角し、ブロットし、かつｒＡＡＶ複製形状の同定のためのベクターコンストラクトの一部か野生型ＡＡＶゲノムの一部のいずれかを含んでいるプローブ（探針）と共にインキュベートした。
【０１３４】
ベクター標本のさらなる滴定を行って、ゲノムの力価を決定した。結果として生じるウイルス縣濁を、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素）Ｉで処理し、それから３０分間６８度で、５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を添加してインキュベートし、かつキャプシドに捕捉されているＤＮＡを、０．５％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）内のプロテイナーゼ（タンパク質分解酵素）Ｋ（０．５ｍｇ／ｍｌ）との次のインキュベーションによって遊離した。それからＤＮＡを、フェノール／クロロフォルム抽出によって精製し、引き続いてエタノール沈殿し、かつドットブロット装置を用いて、ナイロン膜上にブロットし、それからｒＡＡＶまたは野生型ＡＡＶにとって特異的であるプローブとハイブリッド形成した。ゲノム粒子と感染性粒子との比は、各々の場合、調査した標本に依存して、１００ないし１０００：１であった。
【０１３５】
ヘルパーウイルスアデノウイルス型５は、この発明の目的のために使用されたが、プラーク精製によって得られた。ＨｅＬａ細胞での複製および二重ＣｓＣｌ勾配遠心分離による精製後、ｍｌにつき必要な数のプラーク形成単位（ＰＦＵ）（ＰＦＵ／ｍｌ）を得るために、アデノウイルスをＨｅＬａ細胞上で再度滴定した。使用前、結果として生じたウイルス系統の小さい部分を、野生型ＡＡＶの存在に対して検査したが、これは常に「ノー」であった。
【０１３６】
１４．タンパク質およびＤＮＡ分析
低分子量ＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを、標準単離方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（サムブロック）他（１９８９）上記参照；Ｈｉｒｔ（ハート）（１９６７）上記参照）を用いて単離した。ゲノムＤＮＡのサザンブロッティング分析のために、１５μｇのＤＮＡを、必要な制限酵素と混合し、それからその混合物を、アガロースゲル内で分角し、かつＤＮＡを、真空ブロッター（ドイツ　エルランゲン、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）を用いて、ナイロン膜へ伝達した。ハート溶解によって得られたＤＮＡを用いたとき、１０^５ の細胞に対応する量を各レーンに負荷した。ＡＡＶゲノムのために使用したプローブは、１．５ｋｂのＨｉｎｃＩＩキャップ特異性の断片または６５５ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｓｔＥＩＩレップ特異性の断片であった。この発明の目的のために用いられるｒＡＡＶゲノムのために使用したプローブは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターに対応する試料であった。プローブは、ドイツのマンハイムのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（ベーリンガー）社のキットとして通常得ることができるジゴキシゲニンで標識されていて、かつ製造説明書に従って使用された。アルカリホスファターゼ抱合型の抗ジゴキシゲニン抗体を、検出のために使用し、それに引き続いて基板ＣＤＰ　Ｓｔａｒ^ＴＭとのインキュベーションおよびオートラジオグラフィーを行なった。ドットブロット実験のために、試料を、上記真空ブロッターを用いて、０．４ＮのＮａＯＨの最終濃度に調整し、かつ膜へ伝達した。
【０１３７】
タンパク質の分析のために、試料を、１００ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含むＬａｅｍｌｉ（レムリ）試料緩衝液内で再縣濁し、それからＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分析される前に１５分間煮沸した。それからタンパク質を、液体伝達系（ドイツ、Ｓｉｇｍａ（シグマ）社）か半乾燥系（ドイツ、Ｈｏｆｅｒ（ホーファー）社）のいずれかを用いてブロットした。検出は、レップ特異性抗体３０３．９を用いておよびキャップ特異性抗体Ｂ１を用いて行なわれた（Ｗｉｓｔｕｂａ（ウィストゥバ）他（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（ウイルス学ジャーナル）７１、１３４１−１３５３）。
【０１３８】
１５．ＦＡＣＳ分析
Ｂ７．２に対して作られた商業的に入手可能なＦＩＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）抱合型抗体（米国、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ファルミンゲン）インターナショナル社）を用いて、Ｂ７．２発現を調査した。非特異性の染色を防止するために、Ｂ７・２抗体を持つニセ形質導入された細胞のアイソタイプ制御抗体染色を行なった。細胞を、３０分間氷上の抗体と共にインキュベートし、それからそれらを分析する前にリン酸緩衝食塩水内で２回インキュベートした。その抗体染色を、Ｄ１０緩衝液内で行ない、かつその細胞を、Ｄ１０緩衝液内で洗浄ステップ後再縣濁し、かつＦＡＣＳ分析した。蛍光を、４８８ｎｍの消光波長および５３０±１５ｎｍの発光波長で、Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ベクトンデッキンソン）社のＦＡＣＳバンテージフローサイトメーター（流動細胞計測器）を用いて行なった。陽性細胞の特性は、蛍光輝度が制御細胞の９９％より大きい部分として規定された。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
野生型ＡＡＶと比較したこの発明のいくつかのヘルパーコンストラクトの図式による表示を示している。
【図１Ｂ】
３つの異なるベクターコンストラクトの図式による表示を示しており、左および右フランキング（側方）端部でのＩＴＲを示している。
【図２】
ウエスタンブロッティング実験によって、安定なレップ細胞系の同定を示している。
【図３】
種々のコンストラクトから始まるキャップ遺伝子の誘発性発現を示している。
【図４】
アデノウイルス感染後、安定なパッケージング細胞系Ｃ９７におけるレップおよびキャップタンパク質の誘発性発現を示している。
【図５】
Ｃ９７細胞における組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の複製を示しており、ｒＡＡＶ複製中間体は、あらかじめｒＡＡＶおよびアデノウイルス（ＭＯＩ５）に感染されるＣ９７細胞から単離される低分子量ＤＮＡとして検出されている。
【図６】
さらなるヘルパーコンストラクトを図示しており、その全ては、クローニングベクターｐＵＣ１９に由来する。
【図７】
単一および二重発現ベクターを図示している。
【図８】
「Δ（Ｃアーム）」と呼ばれるＣパリンドロームの構成フリップ、フロップおよび欠失を有するＡＡＶベクターコンストラクトの５’に位置するＩＴＲ配列を図示している。
【図９】
図８からの種々の構成の５’に位置するＩＴＲ配列のヌクレオチド配列を図示している。
【図１０】
欠失があるおよび欠失のない５’に位置するＩＴＲ配列の、および３’に位置するＩＴＲ配列のヌクレオチド配列を示している。
【図１１】
フリップ配向構成に５’に位置するＩＴＲ配列［ｐＡＡＶ（Ｂ７．２＋ＧＭ−ＣＳＦ）］を持つベクターコンストラクトと比較して、欠失した５’に位置するＩＴＲ配列［ｐＡＡＶ−（Ｂ２．７ｆｒｅｅ＋ＧＭ−ＣＳＦ）］を持つベクターコンストラクトの等しく効率的なパッケージングを図示している。
【図１２】
ｐＵＣ“Ｒｅｐ６８，５２，４０Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７と呼ばれるレップ７８欠損ヘルパープラスミドを図示している。
【図１３】
ｐＵＣ“ΔＲｅｐ７８Ｃａｐ”（ＲＢＳ）Δ３７と呼ばれるさらなるレップ７８欠損ヘルパープラスミドを図示している。

Claims (29)

1. 少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶキャップタンパク質の発現のためのヘルパーコンストラクトの少なくとも１つのコピーを含む組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする親細胞において、レップタンパク質およびキャップタンパク質をコードする（遺伝情報に指定する）核酸は、機能上分離しており、かつ自然ＡＡＶ制御配列、特定的には自然ＡＡＶプロモーターに操作結合されることを特徴とする親細胞。
2. 組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６からおよび／またはＡＡＶのキャプシド突然変異体から選択されることを特徴とする請求項１に記載の親細胞。
3. ベクターコンストラクト（産生株細胞）の少なくとも１つのコピーをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の親細胞。
4. ヘルパーウイルスの少なくとも１つの遺伝子産物のための核酸コンストラクトのおよび／またはｒＡＡＶの生成に必要である細胞遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれかに記載の親細胞。
5. レップタンパク質およびキャップタンパク質をコードする核酸は、２つの異なるヘルパーコンストラクト上に位置することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の親細胞。
6. レップタンパク質のおよびキャップタンパク質の発現のためのヘルパーコンストラクトは、２つの異なる部位で、親細胞のゲノムに組み込まれることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の親細胞。
7. レップタンパク質の発現は、自然ＡＡＶプロモーターＰ５によって制御されることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の親細胞。
8. キャップタンパク質の発現は、自然ＡＡＶプロモーターＰ４０によって、特定的には自然ＡＡＶプロモーターＰ１９およびＰ４０によって、特に自然ＡＡＶプロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０によって制御されることを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の親細胞。
9. 親細胞におけるレップタンパク質およびキャップタンパク質の発現は、互いに依存して調節されることを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載の親細胞。
10. レップタンパク質およびキャップタンパク質をコードする核酸の転写の終了は、自然制御配列によって、特定的には自然ＡＡＶポリＡ信号によって制御されることを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載の親細胞。
11. 親細胞は、哺乳類細胞、特定的にはヒト子宮頚癌細胞、特にＨｅＬａ細胞であることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれかに記載の親細胞。
12. 親細胞における少なくとも１つのＡＡＶレップタンパク質の発現のためのヘルパーコンストラクトにおいて、レップタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶの自然制御配列に、特定的には自然ＡＡＶプロモーターＰ５に操作結合されることを特徴とするヘルパーコンストラクト。
13. レップタンパク質は、レップ６８、レップ５２および／またはレップ４０であって、レップ７８ではないことを特徴とする、少なくとも１つのレップタンパク質をコードする核酸配列を含む請求項１２に記載のヘルパーコンストラクト。
14. 親細胞における少なくとも１つのＡＡＶキャップタンパク質の発現のためのヘルパーコンストラクトにおいて、キャップタンパク質をコードする核酸は、ＡＡＶの自然制御配列に、好ましくは自然ＡＡＶプロモーターＰ４０に、特定的には自然ＡＡＶプロモーターＰ１９およびＰ４０に、特に自然ＡＡＶプロモーターＰ５、Ｐ１９およびＰ４０に操作結合されることを特徴とするヘルパーコンストラクト。
15. ＡＡＶに非相同的でありかつＩＴＲ配列によってフランキング（隣接）される１つ以上の核酸を含むベクターコンストラクトにおいて、５’に位置するＩＴＲ配列はＣパリンドローム（回文構造）の領域に結失を有することを特徴とするベクターコンストラクト。
16. ５’に位置するＩＴＲ配列の欠失は、Ｃパリンドロームの１５０ヌクレオチド、好ましくは８０ヌクレオチド、特定的には４０ヌクレオチド、特に２２ヌクレオチドに達することを特徴とする請求項１５に記載のベクターコンストラクト。
17. ＡＡＶに非相同的な１つ以上の核酸、特定的にはサイトカイン、特定的にはＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１２および／またはＧＭ−ＣＳＦ（コロニー刺激因子）および／または同時刺激分子から選択されるタンパク質、特定的にはＢ７、特にＢ７．１および／またはＢ７．２をコードする核酸を含むベクターコンストラクトであって、それらの核酸は、特定的にはＡＡＶのＩＴＲ配列によってフランキングされ、かつ非相同的な核酸の発現は、ＡＡＶに非相同的であるプロモーターによっておよび／またはエンハンサーによって、特定的にはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ＭＩＥＰによって制御されるベクターコンストラクト。
18. 組換え型アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のパッケージングおよび／または生成のための親細胞を作成する方法であって、次のステップを含む：
    （ａ）請求項１１または１２に記載のレップヘルパーコンストラクトおよび請求項１３に記載のキャップヘルパーコンストラクトの生成、
    （ｂ）親細胞へのレップヘルパーコンストラクトの導入、
    （ｃ）レップヘルパーコンストラクトを含む親細胞の選択、
    （ｄ）ステップ（ｃ）から選択された親細胞への、キャップヘルパーコンストラクトの導入、および
    （ｅ）レップヘルパーコンストラクトおよびキャップヘルパーコンストラクトを含む親細胞の選択。
19. キャップヘルパーコンストラクトは、レップヘルパーコンストラクトの前に親細胞へ導入されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. レップヘルパーコンストラクトおよびキャップヘルパーコンストラクトは、実質上同じ時間に親細胞へ導入されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
21. 少なくとも１つのキャップヘルパーコンストラクト、少なくとも１つのレップヘルパーコンストラクト、少なくとも１つのベクターコンストラクトおよび／または少なくとも１つのヘルパー遺伝子は、親細胞へ導入されることを特徴とする請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法。
22. コンストラクトおよび／または遺伝子は、形質移入され、特定的には安定して形質移入されることを特徴とする請求項１８ないし２１に記載の方法。
23. コンストラクトおよび／または遺伝子は、ウイルス、特定的には組換え型ウイルス、特にｒＡＡＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ファージおよび／またはバクテリオファージと共に、親細胞へ導入されることを特徴とする請求項１８ないし２１のいずれかに記載の方法。
24. 組込み事象を用いる細胞についての事前選択は、特定的には、コンストラクトおよび／または遺伝子の１つを持つレポーターコンストラクトの親細胞への共同導入、ならびにレポーターについての次の選択によって行なわれることを特徴とする請求項１８ないし２３のいずれかに記載の方法。
25. コンストラクトおよび／または遺伝子を含んでいる親細胞の選択は、タンパク質の発現の検出によって、特定的にはウエスタンブロッティングによって起こることを特徴とする請求項１８ないし２４のいずれかに記載の方法。
26. コンストラクトおよび／または遺伝子を含んでいる親細胞の選択は、特異性核酸の検出によって、特定的にはサザンブロッティング、ノーザンブロッティングおよび／または定量ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）によって起こることを特徴とする請求項１８ないし２４のいずれかに記載の方法。
27. コンストラクトおよび／または遺伝子を含んでいる親細胞の選択は、ｒＡＡＶ粒子形成の検出によって起こり、ｒＡＡＶ粒子形成にとって欠けているコンストラクトは、親細胞へ導入されかつ／またはヘルパーウイルスに感染されることを特徴とする請求項１８ないし２４のいずれかに記載の方法。
28. 請求項１ないし１１のいずれかに記載の親細胞のおよび／または請求項１２または１３に記載の少なくとも１つのレップヘルパーコンストラクトの、および請求項１４に記載の少なくとも１つのキャップヘルパーコンストラクトのおよび／または請求項１５ないし１７のいずれかに記載のベクターコンストラクトのｒＡＡＶを生成するための使用。
29. 細胞、特定的には免疫賦活性遺伝子、特にＧＮ−ＣＳＦ（コロニー刺激因子）、Ｂ７．１および／またはＢ７．２へ遺伝子を移入するための、請求項２８に記載のｒＡＡＶの使用。

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