EP1315798A2 - Wirtszellen zur verpackung von rekombinantem adeno-assoziiertem virus (raav), verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung - Google Patents

Wirtszellen zur verpackung von rekombinantem adeno-assoziiertem virus (raav), verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendung

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EP1315798A2
EP1315798A2 EP01967320A EP01967320A EP1315798A2 EP 1315798 A2 EP1315798 A2 EP 1315798A2 EP 01967320 A EP01967320 A EP 01967320A EP 01967320 A EP01967320 A EP 01967320A EP 1315798 A2 EP1315798 A2 EP 1315798A2
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EP
European Patent Office
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rep
aav
host cell
helper
cap
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01967320A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Joan Bertran
Ulrich Moebius
Markus HÖRER
Bernd Rehberger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medigene AG
Original Assignee
Medigene AG
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1315798A2 publication Critical patent/EP1315798A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
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    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Definitions

  • rAAV recombinant adeno-associated virus
  • the present invention relates to a host cell for packaging recombinant adeno-associated virus (rAAV), the at least one copy of a first helper construct for the stable expression of at least one AAV Rep protein and at least one copy of another helper construct for the stable expression of at least one AAV cap -Proteins contains.
  • the invention further relates to helper constructs for the stable expression of at least one AAV Rep protein and AAV cap protein in a host cell, a vector construct which has one or more nucleic acids which are heterologous to AAV and methods for producing a host cell for packaging recombinant adeno-associated virus ( rAAV) and the use of the host cell for the production of rAAV.
  • the adeno-associated virus belongs to the parvovirus family. This virus family is characterized by an icosahedral, uncoated capsid with a diameter of approximately 18-30 nm, which contains a linear and single-stranded DNA of approximately 5 kb.
  • AAV adeno-associated virus
  • helper viruses for example with adenoviruses, herpes viruses or vaccinia viruses.
  • AAV inverted Terminal Repeats
  • ITR Inverted Terminal Repeats
  • rAAV particles recombinant AAV particles
  • Rep proteins non-structural viral proteins
  • Cap proteins structural viral proteins
  • a vector plasmid which carries the packaging genes flanked by the AAV ITRs carry transfected into cells suitable for packaging, eg HeLa or 293 cells, which are then infected with a suitable helper virus. After a few days, a lysate containing rAAV particles is obtained.
  • the capsid of the adeno-associated viruses naturally consists in a proportion of 1: 1: 10 from the three proteins VP1, VP2 and VP3.
  • the AAV capsid genes are located at the right end of the AAV genome and are encoded by overlapping sequences within the same open reading frame (ORF), using different start codons and a splice donor and two splice acceptor sites for their expression.
  • the VPl gene contains the entire VP2 gene sequence, which in turn contains the entire VP3 gene sequence with a specific N-terminal region. The fact that the overlapping reading frames code for all three AAV capsid proteins is responsible for the obligatory expression of all capsid proteins, albeit in different proportions.
  • AAV serotype 2 human AAV serotype 2
  • All serotypes represent virus vectors with advantageous properties for somatic gene therapy.
  • AAV vectors are therefore particularly well suited for use in gene therapy.
  • replication-deficient viruses have generally been developed which, although they infect a desired target cell and can transmit the nucleic acid encoded therein, to the cell, but no longer reproduce in this cell. This is achieved, for example, by deleting genes important for virus replication, such as the genes coding for the structural proteins, and, if appropriate, incorporating the foreign nucleic acid to be transmitted in their place.
  • the deleted genes must be made available as so-called helper genes in “trans” in order to compensate for the defect in a virus that is no longer capable of replication in the cell.
  • a suitable method for producing these large amounts of rAAV particles is the co-transfection of a eukaryotic cell with two recombinant AAV plasmids and subsequent infection with a helper virus (Chiorini JA et al. (1995) Human Gene Therapy, 6, 1531).
  • the second recombinant AAV plasmid contains the AAV genes which are required for the production of the particles (rep and cap genes).
  • the absence of the ITR regions in the helper construct is said to prevent the packaging of the rep and cap genes in the AAV particle and thus the formation of undesired wild-type AAN.
  • Suitable cells which are permissive, ie accessible, for both the recombinant AAN constructs and for a suitable helper virus are then transfected with the two AAN constructs.
  • the transfected cells production cells
  • adenovirus as a suitable Hei- fervirus
  • the expression of AAV genes the replication of the transferred foreign nucleic acid and the packaging and assembly of the recombinant AAV particles takes place.
  • the rAAV particles contain the foreign nucleic acid, flanked on both sides by the ITR regions, in the form of single-stranded DNA.
  • AAV as a general transduction vector for mammalian cells is given, for example, by Muzyczka N. (1992) Current Topics in Microbiology and Immunology, 158, 97.
  • rAAV particles A major disadvantage in the production of rAAV particles is the concomitant formation of replication-competent wild-type AAV (rcAAV) and the presence of helper viruses, for example adenovirus.
  • helper viruses for example adenovirus.
  • helper viruses for example adenoviruses as helper viruses lyse the infected cells and also cause cellular immune responses to adenoviral proteins.
  • adenoviruses are pathogenic for humans, they cause unspecific cold symptoms. Wild-type AAV can multiply in the presence of a helper virus and spread throughout the body.
  • rep and cap genes would be expressed under such conditions, which in turn would amplify rAAV genomes in the same cell and lead to new rAAV particles. This could spread the rAAV genomes throughout the body.
  • HeLa-based packaging cell lines were developed which had copies of the entire AAV genome without the flanking ITRs and in which the rep and cap genes were under the control of the native viral promoters.
  • the viral promoters P5, P19 and P40 are not active in the absence of helper virus infection (Inoue and Russell (1998) J. Virol. 72, 7024-7031; Gao et al. (1998) Human Gene Therapy 9, 2353-2362 ).
  • helper virus infection the expression of AAV genes is induced in these stably transfected HeLa cells.
  • the advantage of these cell lines is that rAAV particles can be formed on a large scale and reproducibly, which is particularly necessary for a commercial production process (Allen et al. (1997) J. Virol. 71, 6816-6822; Wang et al. (1998) J. Virol. 72, 5472-5480).
  • a disadvantage of using these cell lines is the fact that only a recombination event with the vector genome is required for the development of wild-type AAV, which is why such cell lines are not suitable for use in gene therapy due to the unmanageable risk.
  • the present invention is therefore based on the object to provide host cells in the form of packaging and production cells, as well as helper and vector constructs suitable for the production of rAAV, which allow the production of rAAV on a large scale, but thereby the formation of wild-type AAV in is essentially prevented.
  • a cap gene expression construct which, in addition to the promoter P40 which is absolutely necessary for the expression of the cap gene, additionally contains the regulatory sequences of the promoters P5 and P19.
  • fervirus is inducible.
  • Such a cap expression construct which had only the promoter region of P40, but not of P5 and P19, was not stably integrated in the host cells. This phenomenon is explained by the toxicity of the constitutively expressed cap protein for the host cell.
  • One object of the invention is therefore initially a host cell for packaging recombinant adeno-associated virus (rAAV) containing at least one copy of a first helper construct for expressing at least one AAV Rep protein and at least one copy of another helper construct for expressing at least one AAV cap protein ,
  • rAAV adeno-associated virus
  • the nucleic acids coding for the Rep protein and the Cap protein are functionally separated from one another and operatively linked to the natural regulatory sequences of AAV. These are in particular AAV's natural promoters.
  • the host cell additionally contains at least one copy of a vector construct.
  • a host cell is also referred to below as a production cell.
  • the host cell additionally contains at least one copy of a nucleic acid construct for at least one gene product of a helper virus and / or a cellular gene which is necessary for the production of rAAV.
  • the invention further includes a helper virus independent production cell of rAAV. In addition to the production cell, this contains the genes of a helper virus necessary for the production of rAAV and / or regulated cellular helper genes, so that these cells do not have to be infected with helper viruses for the production of rAAV.
  • nucleic acids coding for the Rep protein and the Cap protein are operatively linked to the three natural regulatory sequences of AAV, in particular to the natural promoters of AAV, means that large amounts of rAAV are obtained, but the Development of wild-type AAV is essentially prevented.
  • the adeno-associated virus is selected from the serotypes AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 and / or AAV6.
  • Capsid mutants of these serotypes are also included according to the invention.
  • capsid mutants are understood to mean that the AAV particles can contain a mutated capsid. This can include a mutation of one or more amino acids, one or more deletions and / or insertions.
  • Corresponding examples are known to the person skilled in the art from the following references: WO 99/67393, Grifinan M. et al. (2001) Mol Ther. 3 (6): 964-75, Wu P. et al.
  • protein and “polypeptide” are used synonymously in the context of the present invention and refer to a polymer of amino acids of any length. These terms also include proteins that have undergone post-translational modification steps, such as glycosylation, acetylation, or phosphorylation.
  • nucleic acid DNA
  • genes or “gene sequences” refer to a polynucleotide which has at least one open reading frame and which has the ability to form a certain protein by transcription and translation.
  • regulatory sequence is understood to mean a genomic region which regulates the transcription of a gene to which it is linked.
  • Transcriptionally regulatory sequences include at least one transcriptionally active promoter , but can also include one or more enhancers and / or terminators of the transcription.
  • operatively linked refers to the arrangement of two or more components. Because the components are related, they are allowed to perform their function in a coordinated manner.
  • a transcriptional regulatory sequence or promoter is operative with the coding sequence when the transcriptionally regulatory sequence or the promoter regulates or starts the transcription of the coding sequence.
  • a promoter operatively linked to a gene to be transcribed is generally referred to as a "cis" element to the coding sequence, but he is not necessarily in close proximity to the gene to be transcribed.
  • the terms “functionally independent units” or “functionally separate” mean that two or more genes do not overlap, the term “gene” also encompassing the corresponding promoter in addition to the coding sequence.
  • the two genes no longer overlap .
  • this is achieved by duplicating both parts of the coding sequence used together and the p40 promoter (see, for example, FIG. 1A).
  • This can mean different arrangements of the genes in a genome.
  • the genes can be located at different locations in the genome, be it integrated at different locations in the genome or localized on different plasmids or a mixture of these.
  • the genes can also be located side by side on the same DNA molecule, for example a chromosome or a plasmid, but each gene is controlled from its own promoter. Such an arrangement is likely, for example, when two genes are transfected together on different DNA molecules. These molecules can form concatems during transfection, which then integrate at one point in the genome, but still form functionally independent units.
  • telomere a genetic entity that is altered from that entity found naturally.
  • adeno-associated virus it means that the virus carries nucleic acid (s) which were produced by a combination of cloning, restriction and / or ligation steps and which do not naturally occur in the adeno-associated virus.
  • naturally promoter or “homologous promoter” as used in the context of the invention mean that the genetic unit of the promoter or the regulatory sequence comes from the same organism as the rest of the unit with which it is compared. Conversely, a “heterologous” or “non-natural promoter” means that the promoter has been separated from its natural coding sequence and has been operatively linked to another coding sequence.
  • the stable expression of a protein in a cell means that the DNA coding for the protein is integrated into the genome of the host cell and is therefore passed on to the daughter cells in a stable manner during cell division.
  • stable expression can mean that the DNA is episomal and is kept stable by an independent replication. This is achieved, for example, by known, in particular viral, replication systems consisting of an initiator protein (eg SV40 large T antigen, EBNA 1) and an origin of replication (eg SV40 ori, EBV oriP)
  • an initiator protein eg SV40 large T antigen, EBNA 1
  • an origin of replication eg SV40 ori, EBV oriP
  • helper constructs is understood to mean recombinant AAV plasmids which contain either the AAV rep genes and / or the AAV cap genes.
  • packet cell is understood to mean a host cell which contains one or more helper constructs but no vector construct.
  • the term “production cell” is understood to mean a host cell which contains both one or more helper constructs and one or more vector constructs.
  • This production cell can be dependent on the helper virus if it is infected with a helper virus in order to produce rAAV However, it can also be independent of helper virus if the cell carries the genes necessary for inducing rAAV production, for example under the control of one or more inducible promoters, and thus does not have to be infected with helper virus for the production of rAAV.
  • vector cell is understood to mean a host cell which contains one or more vector constructs but no helper construct.
  • the one helper constructs which are used for the production of the host cell according to the invention for packaging recombinant adeno-associated virus contain nucleic acid sequences coding for at least one Rep protein, the proteins Rep 78, Rep 68, Rep 52 and Rep 40, especially Rep 68, Rep 52 and Rep 40, especially Rep 68 and Rep52 can be understood.
  • the other helper constructs contain nucleic acid sequences which code for at least one of the known cap proteins, the cap proteins being the proteins VP1, VP2 and VP3.
  • the genes for these proteins and the ITR sequences can be isolated from wild-type AAV, which are generally available in the form of clones. For example, the clone pSM620 in Samulski, et al. (1982) Proc.
  • helper constructs for expressing the Rep protein and the Cap protein are integrated into the genome of the host cell as functionally independent units. This effectively prevents the formation of wild-type AAN (rcAAV), because two recombination events would be necessary for the formation of wild-type viruses, which are quite rare with a frequency of 10 "7 per cell division, ie a total of 10 " 14 . In fact, no rcAAV could be detected in a recombinant virus preparation containing 2x 10 10 genomic particles.
  • the expression of the Rep protein by the natural AAV promoter P5 and the expression of the cap protein by the natural AAV promoter P40 in particular by the natural AAV promoters P19 and P40, especially by the natural AAV promoters P5 , P19 and P40 controlled.
  • the cap expression plasmid contains the AAV promoters P5, P19 and P40 in order to allow regulated expression depending on both helper virus infection or helper virus gene products and on rep protein expression, since this arrangement best reflects the natural lytic AAV life cycle. This arrangement proved to be very suitable for strictly regulated cap protein expression.
  • the expression of the Rep protein and the Cap protein in the host cell are regulated dependent on one another.
  • This approach was chosen because it was found that for efficient packaging of rAAV in stable cell lines, weak cap expression is required first, since otherwise high amounts of cap have a toxic effect on the cells.
  • strong cap expression must occur at the time of packaging.
  • a constitutive, heterologous promoter cannot meet both of these criteria at the same time. Although this can be improved by using inducible, heterologous promoters, the exact time regulation and the level of cap expression by such promoters are extremely difficult to implement in practice.
  • the expression of Cap is coupled to the activation by helper virus gene products and / or cellular helper genes and Rep and is therefore controlled in time exactly as in the wild-type situation.
  • the transcription of the nucleic acids coding for the Rep proteins and the cap proteins is particularly advantageously terminated by the natural regulatory sequences, in particular by the natural AAV poly-A signal. Similar to the initiation of transcription, the use of the homologous sequences to terminate the transcription of the AAV cap and rep genes increases the amount of rAAV particles produced by the AAV vector system.
  • a mammalian cell in particular a human cervical carcinoma cell, in particular a HeLa cell, is suitably used as the host cell.
  • HeLa cells have proven to be particularly advantageous because the AAV P5 promoter in HeLa cells is almost inactive and it is therefore possible to stably integrate an expression cassette for the AAV Rep protein into their genome under the control of the natural regulatory elements, so that the Rep protein is not toxic in these cells (Clarke et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1229-1341; Tamayose et al. (1995) Human Gene Therapy 7, 507-513; Inoue & Russell (1998 ) supra, Gao et al. (1998) supra).
  • first helper construct for the stable expression of at least one AAV Rep protein in a host cell
  • the nucleic acid coding for the Rep protein being operable with the natural regulatory sequences of AAV, in particular with the natural AAV promoters P5 and P19 are connected
  • a second helper construct for the stable expression of at least one AAV cap protein in a host cell, the nucleic acid coding for the cap protein being operatively linked to the natural regulatory sequences of AAV, preferably using the natural AAV promoter P40 , in particular with the natural AAV promoters P19 and P40, especially with the natural AAV promoters P5, P19 and P40.
  • An advantage of the separation of rep and cap into different expression units is that by replacing the cap gene or the cap expression unit with a cap gene or a cap expression unit of another AAV serotype, an AAV particle of another serotype is generated can be used, wherein the same rep gene or the same rep expression unit and the same vector construct can be used. This therefore minimizes the effort if, for various reasons, different AAV serotypes are to be used for the same vector construct.
  • Another object of the present invention is a helper construct containing nucleic acid sequences coding for at least one Rep protein, the Rep proteins being Rep 68, Rep 52 and / or Rep 40, but not Rep 78, because it was surprisingly found that in addition to Rep 52, Rep 40 and the three cap proteins VP1, VP2 and VP3 the additional expression of only Rep 68 is sufficient for packaging AAV vectors.
  • the advantage of these Rep 78 deficient helper constructs is that the largest Rep protein, which is most toxic to the packaging cells, is not expressed at all. It was also found that Rep 78 has the greatest inhibitory activity on cellular processes, such as transcription, among the Rep proteins. Therefore, when using this helper construct, the packaging efficiency can be increased due to the absence of Rep 78.
  • Rep 68 and Rep 78 are expressed in the natural system by the p5 promoter.
  • the use of the Rep 78-deficient helper construct is also advantageous because, compared to Rep 78 in Adeno virus-infected cells, Rep 68 is the stronger transactivator of the AAV promoters P19 and P40 (Hörer et al. (1995) J. Virol. 69, 5485 -5496; Weger et al. (1997) J. Virol. 71, 8437-8447). Therefore, the use of this Rep 18-deficient helper construct leads to an increased expression of the smaller Rep proteins Rep 40 and Rep 52 as well as the capsid proteins and thus the desired higher packaging efficiency.
  • the AAV sequences from nucleotide 201 to nucleotide 4497 including the deletion of the intron sequence and from nucleotide 658 to nucleotide 4460 were used cloned into the bacterial expression plasmid pUC19, the binding sites for the Rep protein in the pUC19 sequence being deleted (cf. FIG. 6).
  • two rep and at least two cap genes, each with its own poly (A) sequence are arranged one behind the other for the termination of the transcription.
  • Rep proteins Rep 68 and Rep 40 and cap proteins VP2 and VP3 can be expressed from the first section (AAV sequence nucleotide 201 to nucleotide 4497), while starting from the second section (AAV sequence nucleotide 658 to nucleotide 4460) the Rep proteins Rep 52 and Rep 40 and the cap proteins VP1 VP2 and VP3 are expressed. All AAV-2 proteins with the exception of Rep 78 are encoded.
  • the AAV sequences mentioned (nt 201-2310; nt 658-4460 including the deletion of the intron sequence) were also incorporated into the bacterial expression plasmid pUC19 cloned (see FIG. 6).
  • the binding sites for the Rep protein in the pUC19 sequence were again deleted. In this way, the rep gene was partially duplicated.
  • the resulting helper construct contains only one poly (A) sequence, so that all mRNA transcripts have the same 3 'end.
  • the Rep proteins Rep 68 and Rep 40 can be expressed starting from the first section (AAV sequence nucleotide 201 to nucleotide 2310), while starting from the second section (AAV sequence nucleotide 658 to nucleotide 4460) the Rep proteins Rep 52 and Rep 40 and the cap proteins VP1, VP2 and VP3 are expressed. All in all, this vector construct also encodes all AAV-2 proteins with the exception of Rep 78.
  • helper construct pUC " ⁇ Rep78 ⁇ Cap” (RBS) ⁇ 37 for expression of the Rep proteins Rep68, Rep52 and Rep40, the AAV nucleotides 2945 to 4046 from the cap gene (nucleotides 2203 to 4410) of the helper construct pUC " ⁇ Rep78Cap” (RBS ) Deleted ⁇ 37. This deletion means that functional cap proteins can no longer be expressed.
  • the present invention furthermore relates to vector constructs containing one or more nucleic acids which are heterologous to AAV and which are derived from ITR Sequences are flanked, the 5'-localized ITR sequence having a deletion in the region of the C-palindrome.
  • vector constructs contain the AAV sequences 1-60 / 83-191 ( ⁇ C arm ITR as left ITR - explanation in the following) and 4498 to 4671 (as right ITR).
  • the AAV-2 ITR sequences which are 145 base pairs long, are composed of one large palindrome (A) and two smaller palindromes (B and C).
  • the first 125 bases of the ITR sequence form a hairpin structure in a T-shape (see e.g. Muzyczka, N. (1992), supra).
  • the terminal sequence can be in one of two configurations. In the first configuration, also called “flip”, the B palindrome is closer to the 3 'end and in the second configuration, also called "flop", the C palindrome is closer to the 3' end (see also Svivstava, A. et al. (1983) J. Virol. 45 (2), 555).
  • the two configurations frequently change their configuration due to a recombination event, which destabilizes the corresponding vector constructs.
  • a deletion within the 5'-flanking ITR sequence which in a preferred embodiment comprises 80 nucleotides, in particular 40 nucleotides, especially 22 nucleotides in the range from nucleotide 61 to 82, brings about stabilization of these vector constructs, because a change of configuration between flip-flop orientations is no longer possible (see FIG. 8).
  • vector constructs which have such a deletion in the C-palindrome of the 5'-ITR sequence can be packaged just as efficiently as vector constructs with intact ITR sequences.
  • Another object of the present invention is therefore a vector construct containing one or more nucleic acids which are heterologous to AAV and are flanked by ITR sequences, the 5'-localized ITR sequence having a deletion in the region of the C-palindrome.
  • the present invention furthermore relates to a vector cell containing a vector construct, the 5 '-located ITR sequence having a deletion in the region of the C-palindrome.
  • Another object of the present invention relates to a vector construct containing one or more nucleic acids heterologous to AAV, in particular a nucleic acid coding for a protein selected from a cytokine, in particular IL2, IL4, IL12 and / or GM-CSF (granulocyte-macrophage-colony-stimulating) Factor) and / or a co-stimulating molecule, in particular B7, especially B7.1 and / or B7.2.
  • a cytokine in particular IL2, IL4, IL12 and / or GM-CSF (granulocyte-macrophage-colony-stimulating) Factor
  • B7 especially B7.1 and / or B7.2
  • any coding or non-coding nucleic acid sequence can be used as the heterologous nucleic acid sequence.
  • one or more heterologous nucleic acid sequence (s) are introduced into a replication-deficient vector construct by conventional cloning techniques known to those skilled in the art (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
  • nucleic acid sequences are coding sequences for chemokines such as lymphotactin, Rantes, MCP-1 or Mip l ⁇ , cytokines such as IL12, IL7, IL18, IL2, GM-CSF, IL1, IL6, interferon ⁇ or IL-10, or antibodies, Antibody fragments or single-stranded antibodies, for example directed against ICOS, also against the ICOS receptor, CD40, CD40 ligands, VEGF, IL-1, TNF, against tumor antigens such as Her-2 / neu, GD3 or CA125, against viral antigens or against IgE; furthermore against soluble receptor forms such as ICOS FC, ICOS ligand FC, CD40L FC, TNF- ⁇ receptor FC, against apoptosis inducing molecules such as proteins of the BCL-X family, BAX, BAD or caspases, necrosis-inducing peptides such as perforins, toxins, for example
  • non-coding sequences are suitable for use as ribozymes or antisense RNAs.
  • a genetically modified melanoma cell line which expresses GM-CSF can be used as a vaccine.
  • WO 94/16716 discloses the use of a recombinant virus in cancer therapy using at least one cytokine, for example GM-CSF or B7 and / or a tumor-associated antigen.
  • the B7 gene here refers to the so-called B7.1 gene.
  • WO 94/04196 discloses a DNA construct for the treatment of tumor diseases which codes for a cytokine and also for B7, here also B7.1.
  • WO 92/00092 is a nucleic acid sequence coding for B7.1
  • WO 94/03408 and WO 95/06738 is a nucleic acid sequence coding for B7.2 and from EP-B1-0 188 479 a nucleic acid sequence is coding for GM-CSF known.
  • B7.2 is particularly advantageous because in vitro studies have shown that, in contrast to interferon ⁇ or IL12, the B7.2 protein in connection with B7.1 has an inhibitory effect on the activation of T Lymphocytes (Rudy et al. (1997) Int. Immunol., 9, 853).
  • the tumor-destroying effect of a B7 molecule can be increased.
  • Another object of the present invention is therefore the aforementioned vector construct containing one or more nucleic acids heterologous to AAV, in particular a nucleic acid coding for a protein selected from a cytokine, in particular IL2, IL4, IL12 and / or GM-CSF and / or one co-stimulating molecule, in particular B7, especially B7.1 and / or B7.2.
  • a cytokine in particular IL2, IL4, IL12 and / or GM-CSF and / or one co-stimulating molecule
  • B7 especially B7.1 and / or B7.2.
  • so-called double vectors which contain both the nucleic acid sequence coding for GM-CSF and the nucleic acid sequence coding for B7 are particularly preferred (cf. FIG. 7).
  • the use of double vectors in particular reduces the number of packaging processes.
  • the double vectors according to the invention allow a comparable efficient expression of both foreign nucleic acids as the co-infection with two single vectors (cf. also FIG. 7).
  • the heterologous nucleic acids are flanked by AAV ITR sequences and their expression is regulated by a promoter and / or enhancer heterologous to AAV, in particular by the major immediate early enhancer / promoter (MIEP) of the cytomegalovirus (CMN).
  • MIEP major immediate early enhancer / promoter
  • CMN cytomegalovirus
  • Suitable promoters are all promoters which are heterologous to AAN and which are active in eukaryotic cells, preferably mammalian cells. These are, for example, the SN40 promoter (Samulski et al. (1989) J. Nirol.
  • the CMV-MIEP is particularly preferred due to its very strong expression, which is subject to only the slightest fluctuations.
  • Another object of the present invention is a process for the production of a host cell for packaging and / or production of recombinant adeno-associated virus (rAAV), which comprises the steps:
  • Rep helper construct and the Cap helper construct can also be reversed.
  • a Rep helper construct and a cap helper construct can be introduced essentially simultaneously.
  • helper virus-independent packaging cell can be produced from rAAV, comprising the additional steps
  • helper gene of the helper viruses and / or a regulated cellular helper gene into the production cell (f / e) selection of a vector cell containing the helper gene (s).
  • helper genes are understood to mean the genes of the AAV helper viruses and / or cellular genes whose gene products are necessary for the replication of the AAV or promote it.
  • the helper genes are E1A, E1B, E4, E2A and VA.
  • El A is required for the transactivation of the AAV p5 promoter.
  • the gene products E1B and E4 serve to increase the AAV mRNA accumulation.
  • the gene products E2A and VA serve to enhance AAV mRNA splicing and translation.
  • Herpes simplex virus (HSV) helper genes are also included according to the invention as helper genes. According to a preferred embodiment, these are the 7 replication genes UL5, UL8, UL9, UL29, UL30, UL42 and UL52. UL 5, 8 and 52 form the HSV helicase-primase complex, UL29 codes for the single-stranded DNA binding protein, UL42 for a double-stranded DNA binding protein, UL30 codes for the Finally, HSV DNA polymerase and UL9 codes for a protein which binds the HSV origin of replication (see Weindler FW and Heilbronn R (1991) J Virol. 65. (5): 2476-83).
  • HSV Herpes simplex virus
  • helper virus instead of the individual helper genes, for example the adenovirus type 5 (Ad5), is particularly advantageous because this comes as close as possible to the natural situation of AAV multiplication in the presence of helper viruses and thus the packaging of rAAV particles very efficiently is.
  • helper viruses are, for example, herpes viruses or vaccinia viruses.
  • a component of the invention is the production of a vector cell from rAAV, comprising the steps:
  • helper virus independent vector cell of rAAV can be produced, comprising the additional steps
  • helper virus-independent vector cell correspond to those of the helper virus-independent packaging cell.
  • the present invention further relates to a method for producing a production cell of rAAV, which comprises the steps:
  • Another way to manufacture a production cell consists of the steps:
  • Another object of the invention relates to the production of a helper virus-independent production cell of rAAV, which comprises the additional steps:
  • introducing constructs is generally understood to mean transfection.
  • the construct cannot be permanently integrated into the genome of the host cell, which is generally referred to as transient transfection.
  • the construct, in particular the vector construct can also be stably integrated into the genome of the host cell or can be retained as a stable episomal copy (using a replication system, for example from SV40 large T antigen / SV40 ori or EBNA 1 / EBV oriP) ,
  • a replication system for example from SV40 large T antigen / SV40 ori or EBNA 1 / EBV oriP
  • the construct (s), in particular the vector construct (s), are introduced by infection with viruses.
  • Recombinant viruses are preferred here, where, for example, rAAV, adenoviruses, herpes viruses, vaccinia viruses, baculoviruses and / or phages, in particular bacteriophages, can be used.
  • a preselection for cells with integration events is appropriate for the above-mentioned methods for producing packaging, vector and / or production cells for the selection of cells with stably integrated constructs.
  • a 10: 1 reporter construct can be added to the Rep or Cap helper construct to be transfected and introduced together, for example co-transfected, into the host cell.
  • a selection is then made with regard to the reporter, since it can be assumed that the respective helper construct has also been integrated with high probability into cells in which the reporter construct has been integrated.
  • the corresponding cells can be selected in each case by detecting the protein expression, for example using a Western emblot.
  • the quantitative detection of a construct-specific nucleic acid in the cells would also be suitable, for example via a quantitative polymerase chain reaction (PCR), a Southern or Northern blot.
  • PCR quantitative polymerase chain reaction
  • a preferred form of detection for suitable cells is also the direct detection of the packaging of rAAV in these cells, in that missing constructs for the packaging are introduced into the respective cell and the packaging is initiated by infection with a helper virus.
  • the other helper construct and a vector construct for example with a color marker such as GFP as the transgene, are required.
  • a vector construct is required for a packaging cell with Rep and Cap helper constructs.
  • Rep and cap helper constructs are required for a vector cell.
  • a helper nor a vector construct is necessary for a production cell.
  • These cells can then be introduced by introducing the viral helper genes, in particular especially induced by infection with a helper virus for rAAV production.
  • the helper virus-independent packaging, vector or production cells do not require the introduction of helper genes, provided that they already contain all the necessary helper genes or only the introduction of individual helper genes. For these cells, only the helper genes need to be induced to start rAAV production.
  • the AAV titer can then be determined using customary methods, which then serves as a measure for optimal cap or cap / rep expression.
  • This procedure has the advantage that the selection of the corresponding cells not only selects for absolute expression amounts, but also for the optimal ratio of cap to rep expression.
  • this method has the advantage that a selection for intact Rep and Cap genes is also carried out here, since mutants of Rep and / or Cap which still form protein, but which are no longer suitable for packaging rAAV, are used in the other mentioned detection methods would not be recognized.
  • Another object of the invention relates to the use of a Rep helper construct and / or a cap helper construct and / or a vector construct, or a packaging cell, a vector cell or a production cell, in particular a Herfer virus-independent production cell for the production of rAAV.
  • the rAAV vector constructs contain one or more nucleic acids heterologous to AAV.
  • GM-CSF and B7.1 and / or B7.2 are used as the heterologous nucleic acid, as already described above
  • the rAAV particle resulting from the packaging process which carries the two immunostimulatory genes, can be used as efficient transduction vector for the treatment of various tumor diseases, for example melanoma or ovarian cancer, can be used.
  • the figures and the examples below are intended to explain the invention in more detail, but without restricting it.
  • Figure 1A shows a schematic representation of some helper constructs according to the invention in comparison to wild-type AAV.
  • the natural AAV promoters P5, P19 and P40 are shown as well as the "major intron” of the AAV genome (“I”) and the natural poly (A) signal of the AAV genome (“pA”) coding sequences for the rep and cap genes of AAV shown.
  • FIG. 1B shows a schematic representation of three different vector constructs, the ITRs being shown at the left and right flanking ends.
  • CMV stands for the "major early promoter” of the cytomegalovirus.
  • I indicates an intron which is contained in the plasmid pCI from Promega.
  • pA indicates the poly (A) signal of the Simian Virus 40 (SV40).
  • GFP green fluorescent protein
  • B7.2 for the immuno-stimulatory protein B7.2
  • GM-CSF for granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • NLacZ stands for the nuclear localized form of the enzyme ß-galactosidase.
  • FIG. 2 shows the identification of the stable Rep cell lines by means of a Western blot experiment.
  • HeLa cells were transfected with the Rep helper construct (P5 Rep), the Rep expression being controlled by the natural AAV promoters P5 and P19.
  • the selection marker hygromycin which was transfected 1:19 to the Rep helper construct shown, is not shown.
  • several hygromycin-resistant cell clones were picked and the Rep expression with adenovirus induced as helper virus (lane 1-8).
  • the total amount of cellular protein was obtained and analyzed by Western blot with using a specific Rep antiserum.
  • the numbers 78/68/52/40 refer to the Rep proteins Rep 78, Rep 68, Rep 52 and Rep 40.
  • "M” stands for the molecular weight standard, "+" for positive control and "-" for negative control.
  • FIG. 3 shows the inducible cap gene expression starting from various constructs.
  • the cap helper constructs shown in the lower area were used to transfect the Rep expressing cell line R84. Subsequently, the cells were not infected with adenovirus (MOI5) (lanes 1 to 4 and wt marked with "+”) or as a control (lanes 1 to 4 and wt marked with "-"). After 72 hours, the total cellular protein content was examined by Western blot analysis for the expression of the three cap proteins VP1, VP2 and VP3.
  • MOI5 adenovirus
  • FIG. 4 shows the inducible expression of the Rep and Cap proteins in the stable packaging cell line C97 after adenovirus infection.
  • C97 cells or HeLa control cells were either infected with adenovirus (MOI5) or not infected as a control.
  • Whole cell protein was extracted 72 hours after infection and analyzed for its presence by Western blot using antibodies specific for the Cap and Rep proteins.
  • the four Rep proteins, Rep 78, Rep 68, Rep 52 and Rep 40, the cap proteins VP1 and VP2 and, to a greater extent, the cap protein VP3 can be clearly recognized in the packaging cell line C97 ,
  • FIG. 5 shows the replication of recombinant AAV (rAAV) in C97 cells, the rAAV replication intermediates being detected as low molecular weight DNA isolated from C97 cells which had previously been infected with rAAV and adenovirus (MOI5).
  • rAAV recombinant AAV
  • MOI5 adenovirus
  • the supernatant was then used to infect fresh C97 cells with new helper viruses (MOI5).
  • MOI5 new helper viruses
  • a clear cytopathic effect was again observed, whereby DNA with a low molecular weight was isolated (second round of amplification).
  • the isolated DNA from the first and second rounds of amplification was analyzed by Southern blot, the vector construct according to the invention being used as a probe for the presence of the replication intermediates of the AAV genomes in order to obtain an infectious titer of an original AAV stock.
  • FIG. 6 schematically shows further helper constructs, all of which are derived from the cloning vector pUC19.
  • Figure 7 shows schematically single and double expression vectors.
  • FIG. 8 schematically shows the 5 '-located ITR sequence of the AAV vector constructs with the configurations flip, flop and deletion of the C-palindrome, which is designated as " ⁇ (C-arm)".
  • FIG. 9 schematically shows the nucleotide sequence of the 5 ′ -located ITR sequence of the different configurations from FIG. 8.
  • FIG. 10 shows the nucleotide sequence of the 5 '-located ITR sequence with and without deletion and of the 3' -located ITR sequence.
  • FIG. 11 schematically shows the equally efficient packaging of a vector construct with a deleted 5 '-located ITR sequence [ ⁇ AAV- (B7.2free + GM-CSF)] compared to a vector construct with a 5' -located ITR sequence in a flop orientation Configuration [( ⁇ AAV- (B7.2 + GM-CSF)].
  • FIG. 12 shows schematically a Rep 78-deficient helper plasmid with the designation pUC "Rep68,52,40Cap” (RBS) ⁇ 37.
  • FIG. 13 schematically shows a further Rep 78-deficient helper plasmid with the designation pUC " ⁇ Rep78Cap” (RBS) ⁇ 37.
  • Plasmid P5 Rep (Fig. 1A) was prepared by deleting a DNA fragment containing nucleotides 2300-4170 of the AAV genome. (Ruffing et al. (1994) J. Gen. Virol. 75, 3385-3392 (Gene Bank Accession No. AF 043303). P5 Rep ⁇ 37 was obtained from P5 Rep by deleting the AAV bases 4461-4497.
  • Plasmid P5P19P40Cap ( 1A) was obtained by deleting the DNA segment between nucleotides 350 to 650 and 1045 to 1700.
  • P5P19P40Cap ⁇ 37 was obtained from P5P19P40Cap by deleting AAV bases 4461-4497.
  • Plasmids 1-4, which are shown in FIG contain various deletions of the AAV genome. Plasmid 1 lacks the sequence between the Bell and Hindlll cleavage sites of the AAV2
  • Plasmid 2 lacks the sequence between the Nrul and BstEII cleavage sites
  • plasmid 3 lacks the sequence between the Ba HI and BstEII cleavage sites.
  • Plasmid 4 corresponds to plasmid P5P19P40Cap from FIG. 1A.
  • the vector constructs for rAAV-B7.2-GM-CSF and rAAV-GFP were constructed using the pCI plasmid from Promega (Germany) and then converted into a pUC19-based plasmid which had the ITR sequences (cf. PCT / EP00 / 01090).
  • the vector construct nLacZ which is also used as a control, has already been described in the literature (Bertran et al. (1996) J. Virol. 70, 6759-6766). Packaging of various vector constructs
  • AAV bases 190 to 1060 were amplified from wild-type AAV DNA by means of PCR.
  • the 5 'primer was chosen so that a unique Xbal interface was introduced at position 199.
  • the PCR fragment was cut with Xbal and BamHI and cloned into the similarly cut vector pUC19.
  • Position 199 in the AAV genome was chosen to ensure that all important P5 promoter elements are present in the helper construct.
  • wild-type AAV DNA was cut with BamHI and SnaBI and the insert fragment was then cloned into the BamHI and Smal position of the intermediate. In this way, the basic helper construct pUC "rep / cap" was obtained (FIG. 6).
  • This helper construct contains the AAV sequences 201 to 4497, while the vector construct carries the AAV sequences 1 to 191 or 1-60 / 83-191 (left ITR) and 4498 to 4671 (right ITR) (see FIG. 7) , In this way it was ensured that there were no homologous AAV sequence overlaps on the plasmids. ⁇ 37 bases were then deleted from the 3 ′ end of the AAV genome in pUC “rep / cap”, which bases are not required for optimal expression of the AAV Rep and cap genes. The resulting helper construct is designated pUC "rep / cap” ⁇ 37 and contains the minimalized AAV sequence from positions 201 to 4460 (FIG. 6).
  • the Rep binding site (RBS) in the vector backbone pUC19 was then deleted in order to avoid non-homologous recombination at this position.
  • the construct is called pUC "rep / cap” (RBS) ⁇ 37 (see FIG. 6).
  • the three RBS in the Rep gene (P5 and P19 promoter) were also mutated plasmids individually and in various combinations without changing the amino acid sequences of the Rep protein (FIG. 6).
  • a so-called “functional separation” sequence (fs) of 638 base pairs in length was introduced between the Rep and Cap genes.
  • the AAV sequence 1691 to 2328 which contains the Rep C terminus or the AAV P40 promoter including cap sequences and all the regulatory sequences essential for P40, was doubled and placed behind the stop codon for the spliced Rep - Versions (heading 2329) Complained.
  • the P40 promoter in the rep gene was subsequently destroyed without changing the Rep amino acid sequence. This was ensured by mutating the P40 TATA box.
  • the further Rep 78-deficient helper constructs were produced by deleting the AAV nucleotides 1907 to 2227, which correspond to the rep intron, in the helper construct pUC "rep / cap” (RBS) ⁇ 37 (cf. FIG. 6) by double-strand mutagenesis , whereby the plasmid pU-
  • CAAV splice was obtained as an intermediate.
  • the plasmid pU-CAAN splice was linearized with the restriction enzyme ,del, treated with an exonuclease, for example mung bean ⁇ uclease (Boehringer Mannheim, Germany) and then mixed with the restriction enzyme SphI.
  • the thus obtained fragment with a length of 4222 bp was connected with a nector fragment to the Rep78-deficient helper construct pUC "Rep68,52,40Cap” (RBS) ⁇ 37 (10657 bp) by ligation (cf. FIG. 12).
  • pUC "rep / cap” (RBS) ⁇ 37 (cf. FIG. 6) can be used to obtain this nector fragment, which is obtained after treatment with the restriction enzymes Nrul and SphI in a length of 6435 bp.
  • the same nector fragment can also be used to produce another Rep78-deficient helper construct ⁇ UC " ⁇ Rep78Cap” (RBS) ⁇ 37 (see FIG. 13).
  • the intermediate pU-CAANSpl substrate was treated with the restriction enzymes Asel, BsrBI and SphI.
  • the 1808 bp BsrBI-Sphl fragment was digested with the 6435 bp nector fragment for said helper construct pUC " ⁇ Rep78Cap” (RBS) ⁇ 37 with a total length of 8243 bp
  • Rep78-deficient helper constructs show, in sequential transfection of helper and vector construct (experiments 1 and 3, shown in table 4 below, and a further experiment in table 5), approximately equally good packaging efficiencies compared to rep78-encoding helper constructs.
  • experiment 2 co-transfections were carried out, which means that different experimental conditions were selected, and therefore experiment 2 cannot be compared with experiments 1 and 3 in terms of packaging efficiency.
  • Table 4
  • Rep helper constructs p5Rep ⁇ 37 encodes all 4 Rep proteins, but no cap) or ⁇ UC “ ⁇ Rep78 ⁇ Cap” (RBS) ⁇ 37 (codes exclusively for the Rep proteins Rep68, 52 and 40) together with the cap construct p5pl9p40Cap ⁇ 37 in a ratio of 1 : 1 co-transfected into suitable packaging cells
  • subsequent sequential or simultaneous transfection of a vector construct and overinfection with adenoviruses can in turn achieve comparable rAAV titers, as if a single helper construct which codes for both rep and cap are transfected into the cells ( pUC "rep / cap” (RBS) ⁇ 37, pUC "Rep68,52,40Cap” (RBS) ⁇ 37, pUC " ⁇ Rep78Cap” (RBS) ⁇ 37).
  • Table 5 Surprisingly, no rcAAV impurities have so far been found in rAAV lysates
  • the cells Two days after (the first) transfection, the cells were infected with Ad-5 (MOI2). Three days later, the cells in the medium were disrupted by freeze / thaw lysis, cell components were pelleted and the rAAV lysate was heat-inactivated at 60 ° C. for 10 min. 3 ⁇ 10 5 irradiated HeLa-t cells (100 Gy) were infected with various dilutions of the lysate. 40 hours after infection of the cells with rAAV, the cells were analyzed in the FACS flow (see below) for GFP expression and the transducing titers of the rAAV crude lysates were determined from this. Each helper construct was tested in at least five independent experiments.
  • Vector plasmid pAAV- (B7.2free / GM-CSF) tested. This was examined on the one hand in a triple transfection (transfection of all three plasmids simultaneously), on the other hand in a sequential transfection, in which the two AAV helper plasmids and - one day later - the vector plasmid were transfected.
  • helper plasmids according to the invention, both higher packaging efficiencies were achieved and the formation of rcAAV was prevented.
  • the HeLa parent cells and all packaging cell lines derived therefrom were kept as "monolayer" cell cultures in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), which had 10% fetal calf serum.
  • various selection agents were used in order to stabilize the transfected cells
  • hygromycin B in a concentration of 500 ⁇ g / ml
  • neomycin in a concentration of 800 ⁇ g / ml
  • puromycin in a concentration of 1 ⁇ g / ml were used C. in a 5% CO atmosphere.
  • the transfections were carried out using conventional calcium phosphate precipitation techniques (Ca 3 (PO 4 ) 2 ) and endotoxin-free plasmid DNA, which were carried out using kits from Company Qiagen (Hilden, Germany), for stable
  • a Rep-coding plasmid was produced by removing the cap-coding sequences from the genome of AAV2, which had no ITR sequences but all other AAV regulatory elements (FIG. 1). HeLa cells were then transfected with the Rep expression construct, and cell clones which replicated the Rep protein
  • plasmids were constructed in which the expression of the cap protein was controlled by the natural AAV regulatory elements.
  • a plasmid was constructed that had the cap gene under the control of the P5 promoter. This plasmid resulted in detectable expression of cap protein only after helper virus infection with adenovirus, but the detectable levels of protein were comparatively low.
  • a second plasmid was therefore constructed in which the DNA sequences between the P5 and the P19 promoter were removed. This plasmid not only expressed the Cap proteins, but also the P19 Rep protein. With the help of this cap expression After helper virus infection, plasmids could only be detected in a very small amount of cap protein.
  • cap plasmids were then constructed, which are shown schematically in FIG. 3. All of these plasmids led to a significant cap protein expression, the protein amounts obtained being comparable to the protein amount of a plasmid which contained the entire AAV genome with the exception of the ITR sequences (cf. FIG. 3 "wt").
  • the plasmid P5P19P40Cap as shown in FIG. 1, was used for all subsequent experiments because, in a wide variety of experiments, it always delivered slightly higher amounts of cap protein than the other cap proteins.
  • the cell line stably expressing the Rep protein described in Example 5 was then transfected with the plasmid P5P19P40Cap. Subsequently, a cell clone was identified, which according to adenovirus
  • a decisive advantage of the cell line according to the invention is that no wild-type AAV (rcAAV) is to be expected. Numerous attempts have been made to detect rcAAV contamination, but no rcAAV particles have so far been detected in virus stocks made from these cell lines. 1-2 ml of virus were tested with about 5 x 10 7 transducing particles / ml.
  • a next step stable cell lines for the production of rAAV should be produced, which no longer require transfection of the vector construct for the rAAV production and thus allow a large-scale production of rAAV.
  • several independent Common transfection steps transfected vector constructs in C97 cells.
  • clones were screened for the expression of the foreign DNA contained in the rAAV genomes.
  • a selection between the clones was also made with regard to the virus yield by means of rep and cap expression.
  • helper plasmids p5Rep ⁇ 37 (coding for all 4 Rep proteins) and pUC " ⁇ Rep78 ⁇ Cap” (RBS) ⁇ 37 (Rep78-deficient) in combination with p5pl9p40Cap ⁇ 37 (coding for the 3 capsid proteins) and a neomycin resistance gene plasmid were described as follows Packaging cell lines made for AAV-2 vectors.
  • HeLa-t cells were co-transfected at approx. 10% confluence with a rep, cap and resistance gene plasmid (in a ratio of 10: 10: 1) and for as long cultivated further until the cells reached confluency of almost 100%.
  • Antibiotic selection G418 was started 48h after the transfection. After reaching 100% cell confluence, the cells were trypsinized and seeded in 10 cell pools, each with 10% confluence. These cell pools were further cultivated for about 4 weeks (with each passenger - cell formation after reaching 100% confluence) before a first packaging experiment was started.
  • Replicas were made from each pool. A replica was cultivated further, the associated replica was at 10% confluence with a
  • packaging cells were transfected with a vector plasmid and infected 48 hours later with adenovirus (MOI 5).
  • Production cell lines were only infected with adenovirus.
  • the cells and the supernatant were harvested 72 hours after the adenovirus infection, the cells being centrifuged off by centrifugation at 1500 rpm for 5 min and approximately 10 7 cells / ml being resuspended in part of the supernatant.
  • the remaining part of the supernatant was treated at 56 ° C for 30 min and then frozen until use.
  • the cell suspension was subjected to a three "freeze-thaw" cycle, the freezing process being carried out at -80 ° C. and the thawing process at 37 ° C. Subsequently, cell debris was removed
  • HeLa cells were exposed to UV light (35 J / m 2 ) in a Stratalinker TM (commonly available from the
  • virus stocks used in the context of this invention were titrated using a special infection test, with two rounds of amplification of the packaging cells being carried out in order to determine the infectious titer of the preparations. Details of this experiment can be found, for example, in Clark et al. (1996) Gene Therapy 3, 1124-1232.
  • the virus stocks were serially diluted in serum-free medium, and then portions containing known volumes of the starting virus stocks were used to transduce the packaging cell line C97 in the context of this invention together with a constant amount of adenovirus (MOI5). After 72 hours the cells and the supernatant were harvested, subjected to a three "freeze-thaw” cycle, centrifuged to remove cell parts, treated at 56 ° C.
  • DNA encapsulated was encapsulated by subsequent incubation with ProteinaseK (0.5 mg / ml) in 0.5% SDS released.
  • the DNA was then purified via a phenol / chloroform extraction, then subjected to ethanol precipitation and blotted onto a nylon membrane using a dot blot apparatus, and then hybridized with probes that were specific for rAAV or wild-type AAV.
  • the ratio between genomic particles and infectious particles was 100 to 1000 to 1, depending on the preparation that was examined.
  • the adenovirus type 5 helper virus used in the present invention was obtained by piaquer cleaning. After propagation in HeLa cells and purification via double CsCl gradient centrifugation, adenovirus was titrated again on HeLa cells in order to obtain the required number of plaque-forming units (PFU) per ml (PFU / ml) , Before use, a small subset of the virus stocks obtained was tested for the presence of wild-type AAV, but this was always negative. 4.
  • PFU plaque-forming units
  • the probes were labeled with digoxigenin, which is conventionally available as a kit from Boehringer Mannheim, Germany, and was used according to the manufacturer's instructions.
  • digoxigenin which is conventionally available as a kit from Boehringer Mannheim, Germany, and was used according to the manufacturer's instructions.
  • An alkaline phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody was used for the detection, followed by an incubation with the substrate CDP
  • the samples were resuspended in Laemli sample buffer, which had 100 mM DTT, and then boiled for 15 min before they were analyzed in an SDS-PAGE.
  • the proteins were then blotted using either a "liquid transfer system” (Sigma, Germany) or a “semi-dry system” (Höfer, Germany).
  • the proof was provided with the rep specific antibody 303.9 and the cap-specific antibody B1 (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1353).
  • B7.2 expression was examined using a commercially available FITC-conjugated antibody which was directed against B7.2 (company Pharmingen International, USA).
  • an isotype control antibody and the staining of mock-transduced cells with a B7.2 antibody were carried out.
  • the cells were incubated with the antibody on ice for 30 min, then incubated twice in phosphate buffered saline before being analyzed.
  • the antibody staining was carried out in DIO buffer, the cells were resuspended in DIO buffer after the washing steps and subjected to FACS analysis.
  • the fluorescence was carried out with a "Beckton Dickinson FACS Vantage flow cytometer" at an extinction wavelength of 488 nm and an emission wavelength of 530 ⁇ 15 nm.
  • the proportion of positive cells was defined as the part whose fluorescence intensity was greater than 99% of the control cells.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), die mindestens eine Kopie eines ersten Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Rep-Proteins und mindestens eine Kopie eines weiteren Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Cap-Proteins enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung Helferkonstrukte zur Expression wenigstens eines AAV Rep-proteins und AAV Cap-Proteins in einer Wirtszelle, Vektorkonstrukte, welche ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren aufweisen sowie Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV) und die Verwendung der Wirtszelle zur Herstellung von rAAV.

Description

Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), die mindestens eine Kopie eines ers- ten Helferkonstruktes zur stabilen Expression mindestens eines AAV Rep- Proteins und mindestens eine Kopie eines weiteren Helferkonstruktes zur stabilen Expression mindestens eines AAV Cap-Proteins enthält. Weiterhin betrifft die Erfindung Helferkonstrukte zur stabilen Expression wenigstens eines AAV Rep- Proteins und AAV Cap-Proteins in einer Wirtszelle, ein Vektorkonstrukt, welches ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren aufweist sowie Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno- assoziiertem Virus (rAAV) und die Verwendung der Wirtszelle zur Herstellung von rAAV.
Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) gehört zur Familie der Parvoviren. Diese Virusfamilie ist gekennzeichnet durch ein icosaedrisches, nicht umhülltes Capsid mit einem Durchmesser von ca. 18-30 nm, das eine lineare und einzelsträngige DNA von ca. 5 kb enthält. Für eine effiziente Vermehrung von AAV, insbesondere der Untergruppe der defekten Parvoviren (Dependoviren) ist eine gleichzeitige Infektion der Wirtszelle mit Helferviren, beispielsweise mit Adenoviren, Herpes- viren oder Vacciniaviren erforderlich. In Abwesenheit eines geeigneten Helfervirus geht AAV in einen Latenzzustand über, wobei das Virusgenom in der Lage ist, dauerhaft (= stabil) in das Genom der Wirtszelle zu integrieren. Diese Eigenschaft von AAV macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant. Für die Vektorfunktion genügen im allgemeinen die beiden ca. 145 bp langen invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITR: „Inverted Terminal Repeats"). Sie tragen die notwendigen Signale für Replikation, Verpackung und Integration in das Wirtszellgenom. Zur Verpackung in rekombinante AAV- Partikel (rAAV-Partikel) wird ein Helferplasmid, das die Gene für die nicht strukturellen viralen Proteine (Rep-Proteine) und für die strukturellen viralen Proteine (Cap-Proteine) trägt, sowie ein Vektorplasmid, welches die zu verpa- ckenden Gene flankiert von den AAV ITRs trägt in für die Verpackung geeignete Zellen, z.B. HeLa- oder 293-Zellen transfiziert, die danach mit einem geeigneten Helfervirus infiziert werden. Nach einigen Tagen wird ein Lysat erhalten, das rAAV-Partikel enthält.
Das Capsid der Adeno-assoziierten Viren besteht natürlicherweise in einem Anteil von 1:1:10 aus den drei Proteinen VP1, VP2 und VP3. Die AAV-Capsid Gene sind am rechten Ende des AAV-Genoms lokalisiert und werden durch überlappende Sequenzen innerhalb desselben offenen Leserahmens (ORF) kodiert, wobei für ihre Expression verschiedene Startcodons sowie eine Spleißdonor- und zwei Spleißakzeptorstellen verwendet werden. Das VPl-Gen enthält die gesamte VP2- Gensequenz, welche wiederum die gesamte VP3 -Gensequenz mit einem spezifischen N-terminalen Bereich enthält. Die Tatsache, daß die überlappenden Leserahmen für alle drei AAV-Capsid Proteine kodieren, ist für die obligatorische Expression aller Capsid Proteine, wenn auch zu unterschiedlichen Anteilen, verant- wortlich.
Es sind verschiedene AAV-Serotypen bekannt, von denen der menschliche AAV- Serotyp 2 (AAV2) am besten analysiert ist. Alle Serotypen stellen Virusvektoren mit vorteilhaften Eigenschaften für die somatische Gentherapie dar. Die wesentli- chen Vorteile sind die stabile Integration viraler DNA in das zelluläre Genom in Gegenwart der großen Rep-Proteine Rep 68 und Rep 78, die Fähigkeit Zellen zu infizieren, die sich nicht in der Zellteilung befinden (= ruhende Zellen), die Stabilität des Viruscapsids, was die Aufreinigung zu hohen Titern (1013 - 1014 Partikel pro ml) ermöglicht, die geringe Pathogenität sowie das komplette Fehlen viraler Gene und Genprodukte im rekombinanten AAV -Vektor. Gerade der letztgenannte Aspekt erklärt, warum keine zelluläre Immunantwort gegen AAV spezifische Genprodukte in in vivo Anwendungen beobachtet wird, so daß Langzeitexpressionen (länger als ein Jahr) von mit AAV übertragenen therapeutischen Genen möglich sind. Daher sind AAV-Vektoren besonders für die Verwendung in der Gentherapie sehr gut geeignet. Für einen solchen Einsatz wurden im allgemeinen replikationsdefiziente Viren entwickelt, die zwar eine gewünschte Zielzelle infizieren und die in ihnen kodierte Nukleinsäure auf die Zelle übertragen können, sich in dieser Zelle jedoch nicht mehr selbst vermehren. Dies wird beispielsweise dadurch erreicht, daß man für die Virusvermehrung wichtige Gene, wie die für die Strukturproteine kodierenden Gene, deletiert und gegebenenfalls an deren Stelle die zu übertragende fremde Nukleinsäure einbaut. Bei der Herstellung größerer, für die gentherapeutische Verwendung geeigneter Mengen von nicht vermehrungsfähigen Viren müssen die deletierten Gene als sogenannte Helfergene in „trans" zur Verfügung gestellt werden, um den Defekt bei einem nicht mehr vermehrungsfähigen Virus in der Zelle zu kompensieren.
Für die Verwendung von AAV als viralen Transduktionsvektor werden im allgemeinen größere Mengen an rekombinanten AAV -Partikeln benötigt. Ein geeignetes Verfahren zur Herstellung dieser großen Mengen an rAAV-Partikeln ist die Co-Transfektion einer eukaryotischen Zelle mit zwei rekombinanten AAV- Plasmiden und anschließender Infektion mit einem Helfervirus (Chiorini J.A. et al. (1995) Human Gene Therapy, 6, 1531). Das erste rAAV-Plasmid (= Vektor- konstrukt) enthält die zu übertragende fremde Nukleinsäure, welche von den beiden ITR-Regionen begrenzt, d.h. flankiert wird. Das zweite rekombinante AAV- Plasmid (= Helferplasmid) enthält die AAV-Gene, die für die Herstellung der Partikel benötigt werden (rep- und cap-Gene). Das Fehlen der ITR-Regionen im Helferkonstrukt soll die Verpackung der rep- und cap-Gene im AAV-Partikel und damit die Entstehung von unerwünschtem Wildtyp-AAN verhindern. Anschließend werden geeignete Zellen, die sowohl für die rekombinanten AAN- Konstrukte als auch für ein geeignetes Helfervirus permissiv, d.h. zugänglich sind, mit den beiden AAN-Konstrukten transfiziert. Nach Infektion der transfizierten Zellen (= Produktionszellen), mit beispielsweise Adenovirus als geeignetem Hei- fervirus, erfolgt die Expression von AAV-Genen, die Replikation der übertragenen fremden Nukleinsäure und die Verpackung sowie der Zusammenbau der rekombinanten AAV-Partikel. Die rAAV-Partikel enthalten die fremde Nukleinsäure, beidseitig flankiert von den ITR-Regionen, in Form von einzelsträngiger DNA. Gleichzeitig repliziert das Helfervirus in diesen Zellen, was im Falle von Adenoviren als Helferviren nach einigen Tagen mit der Lyse (= Zerstörung) und damit verbunden dem Tod der infizierten Zellen endet. Die entstandenen rAAV-Partikel sowie die Helferviren werden hierbei teilweise in den Zellkulturüberstand freigesetzt oder bleiben mit Strukturen der lysierten Zellen verhaftet. Eine Übersicht über die Verwendung von AAV als allgemeiner Transduktionsvektor für Säugerzellen gibt beispielsweise Muzyczka N. (1992) Current Topics in Microbiology and Immunology, 158, 97.
Ein wesentlicher Nachteil bei der Herstellung von rAAV-Partikeln ist die beglei- tende Entstehung von replikationskompetenten Wildtyp- AAV (rcAAV) und die Anwesenheit von Helferviren, beispielsweise Adeno virus. Im Hinblick auf die Sicherheit bei der Verwendung rekombinanter AAV-Partikel beispielsweise in der Gentherapie, ist es jedoch notwendig, daß die Präparationen im wesentlichen frei von Helferviren und Wildtyp-AAV sind, weil zum Beispiel Adenoviren als Hel- ferviren die infizierten Zellen lysieren und außerdem zelluläre Immunantworten gegen adenovirale Proteine verursachen. Zudem sind Adenoviren für den Menschen pathogen, sie rufen unspezifische Erkältungssymptome hervor. Wildtyp- AAV können sich bei der Anwesenheit eines Helfervirus vermehren und sich im Körper ausbreiten. Zudem würden unter solchen Bedingungen rep- und cap-Gene exprimiert, welche wiederum rAAV-Genome in derselben Zelle amplifizieren und zu neuen rAAV-Partikeln fuhren würden. Hierdurch könnten sich die rAAV- Genome im gesamten Körper ausbreiten.
Mit Hilfe der somatischen Gentherapie können neben der Korrektur genetischer Defekte auch neue Funktionen auf normale oder erkrankte Zellen im Rahmen einer Therapie übertragen werden. So wurden bisher verschiedenste Vektorsysteme entwickelt, um fremde Nukleinsäuren in eine Vielzahl von Zelltypen einzubringen. Unter den viralen Systemen wird AAV als das vielversprechendste Vektorsystem verstanden, weil es einen breiten Wirtszelltropismus besitzt und sequenzspezifisch bevorzugt in Chromosom 19 integriert (Kotin (1994) Human Gene Therapy 5, 793-801). So konnte in jüngster Zeit an Hand verschiedener Tiermodellsysteme gezeigt werden, daß die in vivo Verabreichung von rAAV zu einer langen AAV-vermittelten Genexpression f hrt, ohne dabei in den erfolgreich transduzierten Zellen spezifische Immunantworten oder Entzündungsreaktionen hervorzurufen (Daly et al. (1999) Human Gene Therapy 10, 85-94; Herzog et al. (1999) Nature Medicine 5, 56-63; Lo et al. (1999) Human Gene Therapy 10, 201- 213; Snyder et al. (1999) Nature Medicine 5, 64-70).
Ermutigt durch die Erfolge der beschriebenen Tierversuche wurden HeLa- basierende Verpackungszelllinien entwickelt, die Kopien des gesamten AAV- Genoms ohne die flankierenden ITRs aufwiesen und in denen sich die rep- und cap-Gene unter der Kontrolle der nativen viralen Promotoren befanden. Die viralen Promotoren P5, P19 und P40 sind in der Abwesenheit von Helfervirus- Infektion nicht aktiv (Inoue und Russell (1998) J. Virol. 72, 7024-7031; Gao et al. (1998) Human Gene Therapy 9, 2353-2362). Nach Helfervirus-Infektion wird in diesen stabil transfizierten HeLa-Zellen die Expression von AAV Genen induziert. Der Vorteil dieser Zelllinien liegt darin, daß in großem Maßstab und reproduzierbar rAAV-Partikel gebildet werden können, was insbesondere für einen kommerziellen Herstellungsprozeß notwendig ist (Allen et al. (1997) J. Virol. 71, 6816-6822; Wang et al. (1998) J. Virol. 72, 5472-5480).
Ein Nachteil bei der Verwendung dieser Zelllinien ist die Tatsache, daß nur ein Rekombinationsereignis mit dem Vektorgenom für die Entstehung von Wildtyp- AAV erforderlich ist, weshalb solche Zelllinien für den Einsatz in der Gentherapie aufgrund des unüberschaubaren Risikos nicht in Frage kommen. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Wirtszellen in Form von Verpackungs- und Produktionszellen, sowie für die Herstellung von rAAV geeignete Helfer- und Vektorkonstrukte bereitzustellen, welche die Produktion von rAAV in großem Maßstab erlauben, dabei aber die Entstehung von Wildtyp-AAV im wesentlichen verhindert wird.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich mit Hilfe einer HeLa- basierten Verpackungszelllinie, in der die rep- und cap-Gene von AAV funktioneil getrennt sind sowie das cap-Gen unter der Kontrolle der homologen Promoto- ren P5, P19 und p40 stehen hohe Ausbeuten an rAAV-Partikeln erzielen lassen, ohne daß dabei jedoch rcAAV -Partikel gebildet werden. Dabei können die fiinkti- onell getrennten rep- und cap-Gene transient, also episomal, transfiziert vorliegen, an derselben Stelle beispielsweise als Konkatemere oder an verschiedenen Stellen in das zelluläre Genom integrieren. Der Vorteil liegt darin, daß für die Rekonsti- tuierung von rc AAV-Partikel jeweils mindestens zwei unabhängige Rekombinationsereignisse notwendig sind.
Im Rahmen der durchgeführten Versuche wurde u. a. ein cap-Gen Expressions- konstrukt verwendet, das neben dem für die Expression des cap-Gens unbedingt benötigten Promotor P40 zusätzlich die regulatorischen Sequenzen der Promotoren P5 und P19 enthält. In diesem Zusammenhang konnte festgestellt werden, daß durch die Klonierung des cap-Gens ausschließlich unter der Kontrolle des Promotors P40 zwar eine starke Expression des Cap-Proteins erreicht wird, diese aber nicht mehr regulierbar (= konstitutiv) und somit auch nicht mehr durch Hel- ferviren induzierbar ist. Ein derartiges cap-Expressionskonstrukt, welches nur die Promotorregion von P40, nicht aber von P5 und P19 aufwies, wurde in den Wirtszellen nicht stabil integriert. Erklärt wird dieses Phänomen mit der Toxizität des konstitutiv exprimierten Cap-Proteins für die Wirtszelle.
Somit wurden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Expressionskonstrukte für das Cap-Protein hergestellt und verwendet, in denen die Promotorregionen der Promotoren P5, P19 und P40 durch Mutagenese derart verändert wurden, daß zwar die Promotorfunktion hinsichtlich des Starts der Transkription intakt blieb, durch diese Konstrukte aber kein Rep-Protein exprimiert werden konnte. So mußten für die Adenovirus-induzierbare Transaktivierung des Promotors P40 die beiden großen Rep-Proteine Rep 68 und Rep 78 von einer zweiten Quelle (= in trans) zur Verfügung gestellt werden. Mit Hilfe solcher Cap- Expressionskonstrukte konnte nun die stabile Integration in das Genom der Wirtszellen erreicht werden. Diese Konstrukte besitzen somit den Vorteil, daß in Abwesenheit eines Helfervirus keine toxischen Mengen an Cap-Protein exprimiert werden und dennoch eine sehr starke, durch Helferviren induzierbare Cap- Proteinexpression gewährleistet ist.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher zunächst eine Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV) enthaltend mindestens eine Kopie eines ersten Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Rep-Proteins und mindestens eine Kopie eines weiteren Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Cap-Proteins. Dabei sind die für das Rep- Protein und das Cap-Protein kodierenden Nukleinsäuren funktioneil voneinander getrennt sowie operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV verbunden. Dies sind insbesondere die natürlichen Promotoren von AAV.
In einer ersten bevorzugten Ausfuhrungsform enthält die Wirtszelle zusätzlich mindestens eine Kopie eines Vektorkonstruktes. Eine solche Wirtszelle wird im folgenden auch als Produktionszelle bezeichnet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die Wirtszelle zusätzlich mindestens eine Kopie eines Nukleinsäurekonstrukts für mindestens ein Genprodukt eines Helfervirus und/oder eines zellulären Gens, das für die Produktion von rAAV notwendig ist. Ferner beinhaltet die Erfindung eine Helfervirus-unabhängige Produktionszelle von rAAV. Diese enthält zusätzlich zur Produktionszelle die zur Herstellung von rAAV notwendigen Gene eines Helfervirus und/oder regulierte zelluläre Helfergene, so daß diese Zellen zur Produktion von rAAV nicht mit Helferviren infiziert werden müssen.
Dadurch daß die für das Rep-Protein und das Cap-Protein kodierenden Nukleinsäuren operativ mit den drei natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, insbesondere mit den natürlichen Promotoren von AAV, verbunden sind, wird erreicht, daß große Mengen an rAAV erhalten werden, dabei aber die Entstehung von Wildtyp-AAV im wesentlichen verhindert wird.
Gemäß einer bevorzugten Auslührungsform ist der Adeno-assoziierte Virus (AAV) ausgewählt aus dem Serotypen AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 und/oder AAV6. Erfindungsgemäß eingeschlossen sind ebenfalls Kapsidmutanten dieser Serotypen. Unter Kapsidmutanten wird im Rahmen dieser Erfindung verstanden, dass die AAV-Partikel ein mutiertes Kapsid enthalten können. Dieses kann eine Mutation einer oder mehrerer Aminosäuren, eine oder mehrere Deletio- nen und/oder Insertionen umfassen. Entsprechende Beispiele sind für den Fach- mann aus folgenden Literaturstellen bekannt: WO 99/67393, Grifinan M. et al. (2001) Mol Ther. 3(6):964-75, Wu P. et al. (2000) J Virol 74(18):8635-47, Chandler LA et al. (2000), Mol Ther. 2(2): 153-60, Hirate RK and Russell DW (2000) J Virol. 74(10):4612-20, Girod A et al. (1999) Nat Med. 5(12):1438, Girod A et al. (1999) Nat Med. 5(9): 1052-6 oder in Bartlett JS et al. (1999) Nat Biotech- nol. 17(2):181-6.
Die Begriffe „Protein" und „Polypeptid" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym gebraucht und beziehen sich auf ein Polymer von Aminosäuren beliebiger Länge. Diese Begriffe schließen ebenso Proteine mit ein, die posttranslationale Modifikationsschritte durchlaufen haben, wie beispielsweise Glykosylierung, Acetylierung oder Phosphorylierung. Unter den Begriffen „Nukleinsäure", „DNA" und „Polynukleotide" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind polymere Formen von Nukleotiden jeder Länge zu verstehen, wobei sich der Begriff nur auf die Primärstruktur des Moleküls bezieht. Daher sind einzel- und doppelsträngige DNA-Moleküle ebenso von diesem Begriff umfaßt wie modifizierte Polynukleotide wie beispielsweise methylierte oder geschützte (= capped) Polynukleotide.
Die Begriffe „Gene" bzw. „Gensequenzen" beziehen sich auf ein Polynukleotid, das mindestens einen offenen Leserahmen aufweist und das die Fähigkeit besitzt, durch Transkription und Translation ein bestimmtes Protein zu bilden.
Unter dem Begriff „regulatorische Sequenz" wird eine genomische Region verstanden, welche die Transkription eines Genes, mit dem es verbunden ist, regu- liert. Transkriptioneil regulatorische Sequenzen, so wie sie in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, schließen wenigstens einen transkriptioneil aktiven Promotor ein, können aber auch einen oder mehrere Enhancer und/oder Terminatoren der Transkription umfassen.
Der Begriff „operativ verbunden" bezieht sich auf die Anordnung von zwei oder mehr Komponenten. Da die Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, wird ihnen erlaubt, ihre Funktion in einer koordinierten Weise auszuüben. Beispielsweise ist eine transkriptioneil regulatorische Sequenz oder ein Promotor operativ mit der kodierenden Sequenz verbunden, wenn die transkriptionell regu- latorische Sequenz bzw. der Promotor die Transkription der kodierenden Sequenz reguliert bzw. startet. Ein operativ mit einem zu transkribierenden Gen verbundener Promotor wird generell als „cis"-Element zu der kodierenden Sequenz bezeichnet, aber er befindet sich nicht notwendigerweise in direkter räumlicher Nähe zu dem zu transkribierenden Gen. Unter den Ausdrücken „funktionell unabhängige Einheiten" oder „funktioneil getrennt" wird verstanden, daß zwei oder mehrere Gene nicht überlappen, wobei der Begriff "Gen" neben der kodierenden Sequenz auch den entsprechenden Promoter umfaßt. Konkret heißt dies für das rep und das cap Gen - für die im Wildtyp AAV-Genom die kodierende Sequenz das rep-Gens mit der kodierenden Sequenz des cap-Gens und dem cap-Promoter (p40) überlappt -, dass beide Gene nicht mehr überlappen. Beispielsweise gelingt dies dadurch, dass beide Teile der gemeinsam verwendeten kodierenden Sequenz und der p40 Promoter dupliziert werden (siehe beispielsweise Fig. 1 A). Dies kann verschiedene Anordnungen der Gene in einem Genom bedeuten. Zum einen können die Gene an verschiedenen Orten im Genom lokalisiert sein, sei es an verschiedenen Stellen in das Genom integriert oder auf unterschiedlichen Plasmiden lokalisiert oder eine Mischung aus diesen. Zum anderen können die Gene auch nebeneinander auf dem selben DNA- Molekül, beispielsweise einem Chromosom oder einem Plasmid, lokalisiert sein, wobei jedoch jedes Gen von seinem eigenen Promotor aus kontrolliert wird. Eine derartige Anordnung ist zum Beispiel dann wahrscheinlich, wenn zwei Gene auf unterschiedlichen DNA-Molekülen gemeinsam transfiziert werden. Diese Moleküle können während der Transfektion Konkatemere bilden, die dann an einer Stelle in das Genom integrieren, jedoch nach wie vor funktioneil unabhängige Einheiten bilden.
Der Ausdruck „rekombinant", so wie er im Rahmen dieser Erfindung gebraucht ist, bezieht sich auf eine genetische Einheit, die gegenüber jener Einheit, die natürlicherweise gefunden wird, verändert ist. Wenn der Begriff auf ein Adeno- assoziiertes Virus angewendet wird, bedeutet dies, daß das Virus Nukleinsäure/n trägt, die durch eine Kombination von Klonierungs-, Restriktions- und/oder Liga- tionsschritten hergestellt wurde/n und die natürlicherweise nicht in dem Adeno- assoziierten Virus vorkommt/vorkommen.
Die Begriffe „natürlicher Promotor" bzw. „homologer Promotor", so wie sie im Rahmen der Erfindung gebraucht werden, bedeuten, daß die genetische Einheit des Promotors bzw. der regulatorischen Sequenz aus dem gleichen Organismus stammt wie der Rest der Einheit, mit dem sie verglichen wird. Umgekehrt bedeutet ein „heterologer" oder „nicht natürlicher Promotor", daß der Promotor von seiner natürlichen kodierenden Sequenz getrennt wurde und operativ mit einer anderen kodierenden Sequenz verbunden wurde.
„Die stabile Expression" eines Proteins in einer Zelle bedeutet, daß die für das Protein kodierende DNA in das Genom der Wirtszelle integriert ist und daher stabil bei der Zellteilung auf die Tochterzellen weitergegeben wird. Ferner kann "stabile Expression" bedeuten, dass die DNA episomal vorliegt und durch eine eigenständige Replikation stabil gehalten wird. Dies gelingt beispielsweise durch bekannte, insbesondere virale Replikationssysteme bestehend aus einem Initiator- Protein (z. B. SV40 large T-Antigen, EBNA 1) und einem Replikationsursprung (z. B. SV40 ori, EBV oriP). Obwohl auch Episomen, wie beispielsweise Plasmi- de, unter bestimmten Bedingungen an die nächste Generation weitergegeben werden können, geht genetisches Material, das episomal in der Wirtszelle vorliegt, schneller verloren als chromosomal integriertes Material. Beispielsweise ist es möglich, die Aufrechterhaltung und Weitergabe des interessierenden genetischen Materials durch den Einbau eines selektierbaren Markers in unmittelbarer Nähe zu dem interessierenden Polynukleotid einzubauen, so daß die Wirtszellen, die das Polynukleotid tragen, unter Selektionsdruck gehalten werden können.
Unter dem Begriff „Helferkonstrukte" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung rekombinante AAV-Plasmide verstanden, die entweder die AAV rep- Gene und/oder die AAV cap-Gene enthalten.
Unter dem Begriff „ Vektorkonstrukt" wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes AAV-Plasmid verstanden, das fremde DNA (= Transgen), die von ITR-Regionen begrenzt wird, tragen. Unter dem Begriff „Verpackungszelle" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle verstanden, die zwar ein oder mehrere Helferkonstrukte, aber kein Vektorkonstrukt enthält.
Unter dem Begriff „Produktionszelle" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle verstanden, die sowohl ein oder mehrere Helferkonstrukte, als auch ein oder mehrere Vektorkonstrukte enthält. Diese Produktionszelle kann Helfervirus-abhängig sein, wenn sie zur Herstellung von rAAV mit einem Helfervirus infiziert werden muß. Sie kann jedoch auch Helfervirus-unabhängig sein, wenn die Zelle die notwendigen Gene für die Induktion der rAAV-Produktion beispielsweise unter der Kontrolle eines oder mehrerer induzierbarer Promotoren trägt und somit für die Produktion von rAAV nicht mit Helfervirus infiziert werden muß.
Unter dem Begriff „Vektorzelle" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle verstanden, die zwar ein oder mehrere Vektorkonstrukte, aber kein Helferkonstrukt enthält.
Die einen Helferkonstrukte, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus verwendet werden, enthalten Nukleinsäuresequenzen kodierend für mindestens ein Rep-Protein, wobei unter Rep-Proteinen die Proteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40, insbesondere Rep 68, Rep 52 und Rep 40, vor allem Rep 68 und Rep52 verstanden werden. Die anderen Helferkonstrukte enthalten Nukleinsäuresequenzen, die für wenigstens eines der bekannten Cap-Proteine kodieren, wobei die Cap-Proteine die Proteine VP1, VP2 und VP3 sind. Die Gene für diese Proteine sowie die ITR- Sequenzen können aus Wildtyp-AAV isoliert werden, die in Form von Klonen allgemein erhältlich sind. So ist beispielsweise der Klon pSM620 bei Samulski, et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 2077; der Klon pAVl bei Laughlen et al. (1983), Gene 23, 65 und der Klon sub201 bei Samulski (1987) J. Virol. 61, 3096 beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Helferkonstrukte zur Expression des Rep-Proteins und des Cap-Proteins als funktio- nell unabhängige Einheiten in das Genom der Wirtszelle integriert. Dadurch wird die Bildung von Wildtyp-AAN (rcAAV) wirkungsvoll verhindert, weil zur Bildung von Wildtypviren zwei Rekombinationsereignisse notwendig wären, die mit einer Häufigkeit von je 10"7 pro Zellteilung, also insgesamt mit 10"14 durchaus selten sind. In der Tat konnte in einer rekombinanten Viruspräparation, die 2x 1010 genomische Partikel enthielt, kein rcAAV nachgewiesen werden.
In einer weiteren bevorzugten Aus__ührungsform wird die Expression des Rep- Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P5 und die Expression des Cap- Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P40, insbesondere durch die natürlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem durch die natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 kontrolliert.
Vorhergehende Versuche hatten gezeigt, daß die Verwendung heterologer Promotoren für die Rep-Expression nicht zu einer adäquaten Regulation für eine hohe Ausbeute an rAAV führte (Hölscher C. et al. (1994) J. Virol. 68, 7169-7177; Y- ang Q. et al. (1994) J. Virol. 68, 4847-4856). In der bevorzugtesten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Cap-Expressionsplasmid die AAV Promotoren P5, P19 und P40, um eine regulierte Expression in Abhängigkeit sowohl von Helfervirus-Infektion oder von Helfervirus-Genprodukten als auch von Rep-Protein Expression zu erlauben, da diese Anordnung am besten den natürli- chen lytischen AAV-Lebenszyklus widerspiegelt. Diese Anordnung erwies sich für eine strikt regulierte Cap-Protein Expression als sehr geeignet. Obwohl bisher in der Literatur zahlreiche Studien publiziert sind, die heterologe Promotoren für die Expression großer Mengen an Cap-Proteinen verwendeten (Gao et al. (1998), supra, Grimm D. (1998) Human Gene Therapy 9, 2745-2760) wurden im Rahmen dieser Erfindung die natürlichen Promotoren P5, P19 und P40 für die Cap-Protein Expression verwendet, weil festgestellt wurde, daß der P40 Promotor, wenn er sich nicht mehr in der natürlichen Umgebung der weiteren Promotoren P5 und P19 befindet, als konstitutiver Promotor wirkt. Durch die Verwendung der natürlichen AAV-Regulationssequenz konnte sichergestellt werden, daß Transkriptionsfaktoren, die für die regulierte Expression der cap-Gene benötigt werden, alle Bindestellen in der natürlichen Promotorregion vorfinden, um ihre regulatorischen Funktionen auszuüben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Expression des Rep- Proteins und des Cap-Proteins in der Wirtszelle voneinander abhängig reguliert. Dieser Ansatz wurde gewählt, weil herausgefunden wurde, daß für eine effiziente Verpackung von rAAV in stabilen Zelllinien zunächst eine schwache Cap- Expression erforderlich ist, da andernfalls hohe Cap-Mengen toxisch auf die Zellen wirken. Zum Zeitpunkt der Verpackung muß hingegen eine starke Cap- Expression erfolgen. Diese beiden Kriterien kann ein konstitutiver, heterologer Promotor nicht gleichzeitig erfüllen. Dies kann zwar durch die Verwendung von induzierbaren, heterologen Promotoren verbessert werden, die exakte zeitliche Regulation sowie die Cap-Expressionsstärke durch derartige Promotoren sind in der Praxis jedoch äußerst schwer umzusetzen. Durch die Verwendung der natürlichen homologen Promotoren ist die Expression von Cap an die Aktivierung durch Helfervirus-Genprodukte und/oder zelluläre Helfergene sowie Rep gekoppelt und somit zeitlich genau wie in der Wildtyp-Situation gesteuert.
Besonders vorteilhaft erfolgt die Termination der Transkription der für die Rep- Proteine und die Cap-Proteine kodierenden Nukleinsäuren durch die natürlichen regulatorischen Sequenzen, insbesondere durch das natürliche AAV Poly-A- Signal. Ahnlich wie bei der Initiation der Transkription verstärkt auch die Verwendung der homologen Sequenzen zur Termination der Transkription der AAV cap- und rep-Gene die Menge der durch das AAV- Vektorsystem produzierten rAAV-Partikel. Geeigneterweise wird als Wirtszelle eine Säugetierzelle, insbesondere eine menschliche Zervixkarzinomzelle, vor allem eine HeLa-Zelle verwendet. HeLa- Zellen haben sich als besonders vorteilhaft erwiesen, weil der AAV P5 Promotor in HeLa-Zellen nahezu inaktiv ist und es deshalb möglich ist, in ihr Genom stabil eine Expressionskassette für das AAV Rep-Protein unter der Kontrolle der natürlichen regulatorischen Elemente zu integrieren, so daß das Rep-Protein in diesen Zellen nicht toxisch wirkt (Clarke et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1229- 1341; Tamayose et al. (1995) Human Gene Therapy 7, 507-513; Inoue & Russell (1998) supra, Gao et al. (1998) supra).
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung betreffen ein erstes Helferkon- strukt zur stabilen Expression wenigstens eines AAV Rep-Proteins in einer Wirtszelle, wobei die für das Rep-Protein kodierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, insbesondere mit den natürli- chen AAV Promotoren P5 und P19 verbunden ist, sowie ein zweites Helferkon- strukt zur stabilen Expression wenigstens eines AAV Cap-Proteins in einer Wirtszelle, wobei die für das Cap-Protein kodierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, vorzugsweise mit dem natürlichen AAV Promotor P40, insbesondere mit den natürlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem mit den natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 verbunden ist.
Vorteilhaft an der Trennung von rep und cap in unterschiedliche Expressionseinheiten ist, dass durch Austausch des cap-Gens bzw. der cap-Expressionseinheit durch ein cap-Gen bzw. eine cap-Expressionseinheit eines anderen AAV-Serotyps ein AAV-Partikel eines anderen Serotyps generiert werden kann, wobei dasselbe rep-Gen bzw. dieselbe rep-Expressionseinheit und dasselbe Vektorkonstrukt verwendet werden kann. Dies minimiert somit den Aufwand, wenn man aus verschiedensten Gründen unterschiedliche AAV-Serotypen für dasselbe Vektorkon- strukt verwenden will. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Helferkonstrukt enthaltend Nukleinsäuresequenzen kodierend für mindestens ein Rep-Protein, wobei die Rep-Proteine Rep 68, Rep 52 und/oder Rep 40, nicht aber Rep 78 sind, weil überraschenderweise festgestellt werden konnte, daß neben Rep 52, Rep 40 sowie den drei Cap-Proteinen VP1, VP2 und VP3 die zusätzliche Expression nur des Rep 68 für die Verpackung von AAV Vektoren ausreichend ist. Der Vorteil dieser Rep 78-defizienten Helferkonstrukte liegt darin, daß das größte Rep-Protein, das für die Verpackungszellen am meisten toxisch ist, überhaupt nicht exprimiert wird. Ferner wurde herausgefunden, daß Rep 78 unter den Rep-Proteinen die größte hemmende Aktivität auf zelluläre Abläufe wie beispielsweise die Transkription besitzt. Daher kann bei Verwendung dieses Helferkonstruktes aufgrund der Abwesenheit von Rep 78 die Verpackungseffizienz gesteigert werden. Sowohl Rep 68 als auch Rep 78 werden im natürlichen System durch den Promotor p5 exprimiert. Die Verwendung des Rep 78-defizienten Helferkonstrukts ist weiterhin deshalb vorteilhaft, weil Rep 68 im Vergleich zu Rep 78 in Adeno virusinfizierten Zellen den stärkeren Transaktivator der AAV Promotoren P19 und P40 darstellt (Hörer et al. (1995) J. Virol. 69, 5485-5496; Weger et al. (1997) J. Virol. 71, 8437-8447). Daher führt die Verwendung dieses Rep 18-defizienten Helferkonstruktes zu einer gesteigerten Expression der kleineren Rep-Proteine Rep 40 und Rep 52 sowie der Capsidproteine und damit der gewünschten höheren Verpackungseffizienz.
Für die Herstellung des Rep 78-defizienten Helferkonstruktes pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37 (vgl. Fig. 12) wurden die AAV Sequenzen von Nukleotid 201 bis Nukleotid 4497 einschließlich der Deletion der Intronsequenz sowie von Nukleotid 658 bis Nukleotid 4460 in das bakterielle Expressionsplas- mid pUC19 kloniert, wobei die Bindestellen für das Rep-Protein in der pUC19- Sequenz deletiert wurden (vgl. Fig. 6). Durch Anwendung dieser Strategie sind zwei rep- sowie wenigstens zwei cap-Gene mit jeweils einer eigenen Poly(A)- Sequenz für die Termination der Transkription hintereinander angeordnet. Ausge- hend vom ersten Abschnitt (AAV-Sequenz Nukleotid 201 bis Nukleotid 4497) können die Rep-Proteine Rep 68 und Rep 40 sowie die Cap-Proteine VP2 und VP3 exprimiert werden, während ausgehend vom zweiten Abschnitt (AAV- Sequenz Nukleotid 658 bis Nukleotid 4460) die Rep-Proteine Rep 52 und Rep 40 sowie die Cap-Proteine VP1 VP2 und VP3 exprimiert werden. Insgesamt werden damit alle AAV-2 Proteine mit Ausnahme von Rep 78 kodiert.
Für die Herstellung des ebenfalls Rep 78-defizienten Helferkonstrukts pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 (vgl. Fig. 13) wurden die genannten AAV- Sequenzen (nt 201-2310; nt 658-4460 einschließlich der Deletion der Intronsequenz) ebenfalls in das bakterielle Expressionsplasmid pUC19 kloniert (vgl. Fig. 6). Dabei wurde wiederum die Bindestellen für das Rep-Protein in der pUC19- Sequenz deletiert. Auf diese Weise wurde das rep-Gen partiell dupliziert. Das so entstandene Helferkonstrukt enthält nur eine Poly(A)-Sequenz, so daß alle mRNA-Transkripte dasselbe 3 '-Ende besitzen. Ausgehend vom ersten Abschnitt (AAV-Sequenz Nukleotid 201 bis Nukleotid 2310) können die Rep-Proteine Rep 68 und Rep 40 exprimiert werden, während ausgehend vom zweiten Abschnitt (AAV-Sequenz Nukleotid 658 bis Nukleotid 4460) die Rep-Proteine Rep 52 und Rep 40 sowie die Cap-Proteine VP1 VP2 und VP3 exprimiert werden. Insgesamt werden damit auch durch dieses Vektorkonstrukt alle AAV-2 Proteine mit Ausnahme von Rep 78 kodiert.
Zur Herstellung eines Helferkonstruktes pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS)Δ37 zur Expression der Rep-Proteine Rep68, Rep52 und Rep40 wurden die AAV-Nukleotide 2945 bis 4046 aus dem cap-Gen (Nukleotide 2203 bis 4410) des Helferkonstrukts pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 deletiert. Durch diese Deletion können keine fiinkti- onellen Cap-Proteine mehr exprimiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Vektorkonstrukte ent- haltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, die von ITR- Sequenzen flankiert werden, wobei die 5'-lokalisierte ITR-Sequenz eine Deletion im Bereich des C-Palindroms aufweisen.
Diese Vektorkonstrukte enthalten die AAV-Sequenzen 1-60/83-191 (ΔC-Arm ITR als linken ITR - Erklärung hierzu im folgenden) und 4498 bis 4671 (als rechten ITR).
Es ist bekannt, daß die ITR-Sequenzen von AAV-2, welche 145 Basenpaare lang sind, aus einem großen Palindrom (A) und zwei kleineren Palindromen (B und C) aufgebaut sind. Dabei bilden die ersten 125 Basen der ITR-Sequenz eine Haarnadelstruktur in T-Form (siehe z.B. Muzyczka, N. (1992), supra). Hierbei kann die terminale Sequenz in einer von zwei Konfigurationen vorliegen. Bei der ersten Konfiguration, auch „Flip" genannt, ist das B-Palindrom näher am 3 '-Ende und bei der zweiten Konfiguration, auch „Flop" genannt, ist das C-Palindrom näher am 3'-Ende (siehe auch Svivstava, A. et al. (1983) J. Virol. 45(2), 555). Dabei wechseln die beiden Konfigurationen durch ein Rekombinationsereignis häufig ihre Konfiguration, was eine Destabilisierung der entsprechenden Vektorkonstrukte bewirkt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine Deletion innerhalb der 5'- flankierenden ITR-Sequenz, die in einer bevorzugten Ausführungsform 80 Nukleotide, insbesondere 40 Nukleotide, vor allem 22 Nukleotide im Bereich von Nukleotid 61 bis 82 umfaßt, eine Stabilisierung dieser Vektorkonstrukte bewirkt, weil eine Konfigurationswechsel zwischen Flip-Flop-Orientierungen nicht mehr möglich ist (vgl. Fig. 8).
Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, daß sich Vektorkonstrukte, die eine derartige Deletion im C-Palindrom der 5'-ITR-Sequenz aufweisen, ebenso effizient verpacken lassen wie Vektorkonstrukte mit intakten ITR-Sequenzen. Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Vektorkonstrukt, enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, die von ITR-Sequenzen flankiert werden, wobei die 5'-lokalisierte ITR-Sequenz eine Deletion im Bereich des C-Palindroms aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Vektorzelle, enthaltend ein Vektorkonstrukt, wobei die 5 '-lokalisierte ITR-Sequenz eine Deletion im Bereich des C-Palindroms aufweist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Vektorkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, insbesondere eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein ausgewählt aus einem Zytokin, insbesondere IL2, IL4, IL12 und/oder GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender Faktor) und/oder ein co-stimulierendes Molekül, insbesondere B7, vor allem B7.1 und/oder B7.2. Als heterologe Nukleinsäuresequenz kann gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch jede beliebige kodierende wie auch nicht kodierende Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Vorzugsweise wird eine oder mehrere heterologe Nukleinsäuresequenz(en) in ein replikationsdefizientes Vektorkonstrukt durch herkömmliche, dem Fachmann bekannte Klonierungstechniken eingebracht (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.).
Weitere geeignete Nukleinsäuresequenzen sind kodierende Sequenzen für Che- mokine wie Lymphotactin, Rantes, MCP-1 oder Mip lα, Cytokine wie IL12, IL7, IL18, IL2, GM-CSF, IL1, IL6, Interferon γ oder IL-10, oder Antikörper, Antikörperfragmente oder Einzelstrang-Antikörper, beispielsweise gerichtet gegen ICOS, ferner gegen den ICOS-Rezeptor, CD40, CD40-Liganden, VEGF, IL-1, TNF- , gegen Tumor- Antigene wie beispielsweise Her-2/neu, GD3 oder CA125, gegen virale Antigene oder gegen IgE; des weiteren gegen lösliche Rezeptorformen wie ICOS FC, ICOS-Ligand FC, CD40L FC, TNF-α Rezeptor FC, gegen Apoptose- induzierende Moleküle wie Proteine der BCL-X-Familie, BAX, BAD oder Caspa- sen, Necrose-induzierende Peptide wie Perforine, Toxine, beispielsweise abgeleitet von Bakterien, viralen Tumorantigenen wie HPV E6 oder E7, nicht-viralen Tumorantigenen wie B Lymphom-spezifische Idiotyp- Antikörper, BCRA-1, CA 125, α-Fetoprotein, CEA, p53 sowie Blutgerinnungsfaktoren wie Faktor VIII oder Faktor IX.
Des weiteren eignen sich nicht kodierende Sequenzen zum Einsatz als Ribozyme oder Antisense-RNAs.
Aus der WO 98/06746 ist bekannt, daß eine gentechnisch veränderte Melanom- Zelllinie, die GM-CSF exprimiert, als Vaccine verwendet werden kann. Aus der WO 94/16716 ist die Verwendung eines rekombinanten Virus in der Krebstherapie unter Verwendung mindestens eines Zytokins, beispielsweise GM-CSF oder B7 und/oder eines tumor-assoziierten Antigens bekannt. Das B7-Gen bezieht sich hierbei auf das sogenannte B7.1-Gen. In der WO 94/04196 ist ein DNA-Konstrukt zur Behandlung von Tumorerkrankungen offenbart, das für ein Zytokin und des weiteren für B7 kodiert, wobei auch hier B7.1 gemeint ist. Aus der WO 92/00092 ist eine Nukleinsäuresequenz kodierend für B7.1, aus der WO 94/03408 bzw. WO 95/06738 ist eine Nukleinsäuresequenz kodierend für B7.2 und aus der EP-B1-0 188 479 ist eine Nukleinsäuresequenz kodierend für GM-CSF bekannt.
In Verbindung mit dem Vektorkonstrukt ist die Verwendung von B7.2 besonders vorteilhaft, weil in vitro Untersuchungen gezeigt haben, daß im Gegensatz zu In- terferon γ oder IL12 das B7.2 Protein im Zusammenhang mit B7.1 inhibitorische Wirkung auf die Aktivierung von T-Lymphozyten besitzt (Rudy et al. (1997) Int. Immunol., 9, 853). In Anwesenheit einer zweiten Nukleinsäure, die für GM-CSF kodiert, kann die tumorzerstörende Wirkung eines B7-Moleküls (wobei hier B7.1 oder B7.2 verwendet werden können) gesteigert werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das genannte Vektorkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, insbesondere eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein ausgewählt aus einem Zy- tokin, insbesondere IL2, IL4, IL12 und/oder GM-CSF und/oder einem co- stimulierenden Molekül, insbesondere B7, vor allem B7.1 und/oder B7.2. Aufgrund der einfacheren Handhabbarkeit sind sogenannte Doppelvektoren, die sowohl die Nukleinsäuresequenz kodierend für GM-CSF wie auch die Nukleinsäuresequenz kodierend für B7 enthalten, besonders bevorzugt (vgl. Fig. 7). Die Verwendung von Doppelvektoren reduziert insbesondere die Zahl der Verpa- ckungsvorgänge. Überraschenderweise erlauben die erfindungsgemäßen Doppelvektoren eine vergleichbar effiziente Expression beider fremder Nukleinsäuren wie die Co-Infektion mit zwei Einzelvektoren (vgl. ebenfalls Fig. 7). Insbesondere werden die heterologen Nukleinsäuren von AAV ITR-Sequenzen flankiert, und ihre Expression wird von einem zu AAV heterologen Promotor und/oder Enhan- cer, insbesondere von dem Major Immediate Early Enhancer/Promotor (MIEP) des Cytomegalovirus (CMN) reguliert. Als Promotoren eignen sich alle zu AAN heterologen Promotoren, die in eukaryotischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, aktiv sind. Dies sind beispielsweise der SN40-Promotor (Samulski et al. (1989) J. Nirol. 63, 3822), der genannte CMN-Enhancer/Promotor (Vincent et al. (1990) Vaccine, 90, 353) oder der LTR-Promotor von Retroviren (Lipkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 3988). Der CMV-MIEP ist jedoch aufgrund seiner sehr starken Expression, die nur geringsten Schwankungen unterworfen ist, besonders bevorzugt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren-zur_Her- stellung einer Wirtszelle zur Verpackung und/oder Produktion von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), das die Schritte umfaßt:
(a) Herstellung eines Rep-Helferkonstruktes sowie eines Cap-Helferkon- struktes,
(b) Einbringen des Rep-Helferkonstruktes in eine Wirtszelle, (c) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt enthaltenden Wirtszelle,
(d) Einbringen des Cap-Helferkonstruktes in die selektionierte Wirtszelle und
(e) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt und das Cap-Helferkonstrukt enthaltenden Verpackungszelle.
Die Reihenfolge des Einbringens von Rep-Helferkonstrukt und Cap- Helferkonstrukt kann auch umgekehrt sein. Ebenso kann das Einbringen eines Rep-Helferkonstrukts und eines Cap-Helferkonstrukts im wesentlichen gleichzeitig erfolgen.
Ferner kann eine Helfervirus-unabhängige Verpackungszelle von rAAV hergestellt werden, umfassend die zusätzlichen Schritte
(e/d) Einbringen von mindestens einem Helfergen der Helferviren und/oder einem regulierten zellulären Helfergen in die Produktionszelle (f/e) Selektion einer das/die Helfergen/e enthaltenden Vektorzelle.
Eine derartig Zelle hätte den Vorteil, daß zur rAAV-Produktion keine Helfervirus- Infektion notwendig ist, sondern die rAAV-Produktion beispielsweise durch Induktion der Promotoren der Helfergene initiiert werden könnte. Unter Helferge- nen werden dabei die Gene der Helferviren von AAV und/oder zelluläre Gene verstanden, deren Genprodukte für die Replikation der AAV notwendig sind bzw. diese fördern. Bei Adenoviren beispielsweise sind die Helfergene E1A, E1B, E4, E2A und VA. El A ist dabei für die Transaktivierung des AAV p5 Promotors erforderlich. Die Genprodukte E1B und E4 dienen hierbei zur Verstärkung der AAV mRNA-Akkumulation. Die Genprodukte E2A und VA dienen der Verstärkung des AAV mRNA-Spleißens sowie der Translation. Ferner sind als Helfergene erfindungsgemäß Herpes Simplex Virus (HSV) Helfergene eingeschlossen. Gemäß einer bevorzugten Auslnhrungsform sind dies die 7 Replikationsgene UL5, UL8, UL9, UL29, UL30, UL42 und UL52. UL 5, 8 und 52 bilden den HSV Helikase-Primase Komplex, UL29 kodiert für das Einzelstrang-DNA Bindungsprotein, UL42 für ein Doppelstrang-DNA Bindungsprotein, UL30 kodiert für die HSV DNA Polymerase und UL9 kodiert schließlich für ein Protein, welches den HSV Replikationsursprung bindet (siehe Weindler FW and Heilbronn R (1991) J Virol. 65.(5):2476-83). Die Verwendung des Helfervirus an Stelle der einzelnen Helfergene, beispielsweise des Adenovirus-Typ 5 (Ad5), ist besonders vorteilhaft, weil dies der natürlichen Situation der AAV- Vermehrung in Gegenwart von Helferviren am nächsten kommt und somit die Verpackung von rAAV-Partikeln sehr effizient ist. Andere Helferviren sind beispielsweise Herpesviren oder Vacciniavi- ren.
Ein Bestandteil der Erfindung ist die Herstellung einer Vektorzelle von rAAV, umfassend die Schritte:
(a) Herstellung eines Vektorkonstruktes,
(b) Einbringen des Vektorkonstruktes in eine Wirtszelle und
(c) die anschließende Selektion einer das Vektorkonstrukt enthaltenden Vek- torzelle.
Ferner kann eine Helfervirus-unabhängige Vektorzelle von rAAV hergestellt werden, umfassend die zusätzlichen Schritte
(d) Einbringen von mindestens einem Helfergen der Helferviren und/oder ei- nem regulierten zellulären Helfergen in die Produktionszelle
(e) Selektion einer das/die Helfergen/e enthaltenden Vektorzelle.
Die Vorteile dieser Helfervirus-unabhängigen Vektorzelle entsprechen denen der Helfervirus-unabhängigen Verpackungszelle.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Produktionszelle von rAAV, das die Schritte umfaßt:
(a) Herstellung einer Verpackungszelle wie zuvor beschrieben
(b) Einbringen mindestens eines Vektorkonsrukts in die Verpackungszelle (c) Selektion einer das/die Vektorkonstrukte enthaltenden Produktionsszelle. Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung einer Produktionszelle besteht aus den Schritten:
(a) Herstellung einer Vektorzelle wie zuvor beschrieben
(b) Einbringen mindestens eines zuvor beschriebenen Helferkonstrukts in eine Vektorzelle; bei mehreren Helferkonstrukten kann dies gemeinsam oder sequentiell erfolgen,
(c) Selektion einer das/die Helferkonstrukte enthaltenden Produktionszelle.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Herstellung einer Helfervirus- unabhängigen Produktionszelle von rAAV, das die zusätzlichen Schritte umfaßt:
(d) Einbringen von mindestens einem Helfergen der Helferviren und/oder einem regulierten zellulären Helfergen in die Produktionszelle
(e) Selektion einer das/die Helfergen/e enthaltenden Produktionszelle.
Die Vorteile dieser Helfervirus-unabhängigen Produktionszelle entsprechen denen der Helfervirus-unabhängigen Verpackungszelle.
Unter Einbringen von Konstrukten wird im Rahmen dieser Erfindung im allgemeinen eine Transfektion verstanden. Dabei kann das Konstrukt nicht dauerhaft in das Genom der Wirtszelle integriert vorliegen, was generell als transiente Transfektion bezeichnet wird. Alternativ dazu kann das Konstrukt, insbesondere das Vektorkonstrukt, aber auch stabil in das Genom der Wirtszelle integriert werden oder als stabile episomale Kopie erhalten bleiben (mittels Replikationssystem z. B. aus SV40 large T-Antigen/SV40 ori oder EBNA 1/EBV oriP). Derartige integ- rierte Konstrukte werden gemäß der DNA-Replikation des Wirtszellgenoms vermehrt und anschließend auf die Tochterzellen weitergegeben.
In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt das Einbringen des Konstruktes/der Konstrukte, insbesondere des/der Vektorkon- strukte durch Infektion mit Viren. Hierbei sind rekombinante Viren bevorzugt, wobei beispielsweise rAAV, Adenoviren, Herpesviren, Vacciniaviren, Baculovi- ren und/oder Phagen, insbesondere Bakteriophagen verwendet werden können.
Des weiteren bietet sich für die oben genannten Verfahren zur Herstellung von Verpackungs-, Vektor- und/oder Produktionszellen zur Selektion von Zellen mit stabil integrierten Konstrukten eine Vorselektion auf Zellen mit Integrationsereignissen an. Beispielsweise kann man dem zu transfizierenden Rep- oder Cap- Helferkonstrukt ein Reporterkonstrukt in dem Verhältnis 10 : 1 beimischen und gemeinsam in die Wirtszelle einbringen, beispielsweise kotransfizieren. Anschlie- ßend erfolgt eine Selektion bezüglich des Reporters, da man annehmen kann, daß in Zellen, in denen das Reporterkonstrukt integriert hat, auch das jeweilige Hel- ferkonstrukt mit hoher Wahrscheinlichkeit integriert wurde.
Die Selektion der entsprechenden Zellen kann jeweils über den Nachweis der Proteinexpression beispielsweise mittels Westemblot erfolgen. Ebenfalls geeignet wäre der quantitative Nachweis einer Konstrukt-spezifischen Nukleinsäure in den Zellen, beispielsweise über eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einen Southern- oder Northernblot.
Eine bevorzugte Nachweisform für geeignete Zellen ist auch der direkte Nachweis der Verpackung von rAAV in diesen Zellen, indem für die Verpackung fehlende Konstrukte in die jeweilige Zelle eingebracht werden und die Verpackung durch Infektion mit einem Helfervirus initiiert wird.
Für die Verpackungszelle enthaltend das Rep- oder Cap-Helferkonstrukt wird jeweils das andere Helferkonstrukt sowie ein Vektorkonstrukt, beispielsweise mit einem Farbmarker wie GFP als Transgen, benötigt. Für eine Verpackungszelle mit Rep- und Cap-Helferkonstrukten ist hingegen nur ein Vektorkonstrukt erforderlich. Für eine Vektorzelle werden Rep- und Cap-Helferkonstrukte benötigt. Für eine Produktionszelle ist weder ein Helfer- noch ein Vektorkonstrukt notwendig. Diese Zellen können anschließend durch einbringen der viralen Helfergene, insbe- sondere durch Infektion mit einem Helfervirus zur rAAV-Produktion induziert werden. Im Gegensatz dazu benötigen die Helfervirus-unabhängigen Verpa- ckungs-, Vektor- oder Produktionszellen kein Einbringen von Helfergenen, sofern sie bereits sämtliche notwendigen Helfergene beinhalten bzw. nur das Einbringen einzelner Helfergene. Für diese Zellen müssen lediglich die Helfergene induziert werden, um die rAAV-Produktion zu starten.
Anschließend kann der AAV-Titer nach gängigen Methoden bestimmt werden, der dann als Maß für eine optimale Cap- bzw. Cap/Rep-Expression dient. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, daß bei der Selektion der entsprechenden Zellen nicht nur auf absolute Expressionsmengen selektioniert wird, sondern auch auf das optimale Verhältnis der Cap zu Rep Expression. Zudem hat dieses Verfahren den Vorteil, daß hier zusätzlich eine Selektion auf intakte Rep und Cap-Gene erfolgt, da Mutanten von Rep und/oder Cap, die zwar noch Protein bilden, das sich jedoch nicht mehr für eine Verpackung von rAAV eignet, bei den anderen erwähnten Nachweisverfahren nicht erkannt würden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Rep- Helferkonstrukts und/oder eines Cap-Helferkonstrukts und/oder eines Vektorkon- struktes, beziehungsweise einer Verpackungszelle, einer Vektorzelle oder einer Produktionszelle, insbesondere einer Herfervirus-unabhängigen Produktionszelle zur Herstellung von rAAV.
Die rAAV-Vektorkonstrukte enthalten eine oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren. Für den Fall, daß als heterologe Nukleinsäure, wie bereits oben beschrieben, GM-CSF und B7.1 und/oder B7.2 verwendet werden, kann das aus dem Verpackungsvorgang resultierende rAAV-Partikel, das die beiden im- munstimulatorischen Gene trägt, als effizienter Transduktionsvektor zur Behandlung verschiedener Tumorerkrankungen, beispielsweise Melanom oder Ovarkar- zinom, verwendet werden. Die Figuren und die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch einzuschränken.
Beschreibung der Figuren
Figur 1A zeigt eine schematische Darstellung einiger erfindungsgemäßer Helferkonstrukte im Vergleich zu Wildtyp-AAV. Die natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 sind ebenso gezeigt, wie das „Major Intron" des AAV-Genoms („I") und das natürliche Poly(A)-Signal des AAV-Genoms („pA"). Weiterhin sind die kodierenden Sequenzen für das rep- und das cap-Gen von AAV gezeigt.
Figur 1B zeigt eine schematische Darstellung drei verschiedener Vektorkonstrukte, wobei die ITR's am linken und rechten flankierenden Ende gezeigt sind. Die Bezeichnung „CMV" steht für den „major early promotor" des Cytomegalovirus. Die Bezeichnung „I" weist auf ein Intron hin, das in dem Plasmid pCI der Firma Promega enthalten ist. Die Bezeichnung „pA" weist auf das Poly(A)-Signal des Simian Virus 40 (SV40) hin. Die Abkürzung „GFP" steht für grünes Fluoreszenzprotein (eng : green fluorescent protein), „B7.2" für das Immun-co- stimulatorische Protein B7.2, „GM-CSF" für Granulozyten/Makrophagen- Kolonie-stimulierenden Faktor, und „nLacZ" steht für die nuklear lokalisierte Form des Enzyms ß-Galaktosidase.
Figur 2 stellt die Identifizierung der stabilen Rep-Zelllinien mittels Western-Blot Experiment dar. HeLa-Zellen wurden mit dem Rep-Helferkonstrukt (P5 Rep) transfiziert, wobei die Rep-Expression durch die natürlichen AAV Promotoren P5 und P19 kontrolliert ist. Nicht dargestellt ist der Selektionsmarker Hygromycin, der zu dem gezeigten Rep-Helferkonstrukt im Verhältnis 1 :19 transfiziert wurde. Anschließend wurden mehrere Hygromycin-resistente Zeilklone gepickt und die Rep-Expression mit Adeno virus als Helfervirus induziert (Spur 1-8). Die gesamte zellulläre Proteinmenge wurde gewonnen und mittels Western-Blot unter Ver- wendung eines spezifischen Rep-Antiserums analysiert. Die Zahlen 78/68/52/40 beziehen sich auf die Rep-Proteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. „M" steht für Molekulargewichtsstandard, „+" für Positivkontrolle und „-" für Negativkontrolle.
Figur 3 zeigt die induzierbare cap-Genexpression ausgehend von verschiedenen Konstrukten. Die im unteren Bereich dargestellten Cap-Helferkonstrukte wurden verwendet, um die Rep exprimierende Zellinie R84 zu transfizieren. Anschließend wurden die Zellen mit Adenovirus (MOI5) (Spuren 1 bis 4 und wt mit „+" ge- kennzeichnet) oder zur Kontrolle nicht infiziert (Spuren 1 bis 4 und wt mit „-" gekennzeichnet). Nach 72 Stunden wurde der gesamte zelluläre Proteingehalt mittels Western-Blot Analyse auf die Expression der drei Cap-Proteine VP1, VP2 und VP3 untersucht.
Figur 4 zeigt die induzierbare Expression der Rep- und Cap-Proteine in der stabilen Verpackungszelllinie C97 nach Adenovirus-Infektion. C97-Zellen oder HeLa- Kontrollzellen wurden entweder mit Adenovirus (MOI5) infiziert oder als Kontrolle nicht infiziert. 72 Stunden nach der Infektion wurde gesamtzelluläres Protein extrahiert und mittels Western-Blot unter Verwendung von für die Cap- und Rep-Proteine spezifischen Antikörpern auf deren Anwesenheit analysiert. Nach Adenovirus-Infektion sind in der Verpackungszelllinie C97 deutlich die vier Rep- Proteine, Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40 sowie in geringerem Anteil die Cap-Proteine VP1 und VP2 sowie in größerem Anteil das Cap-Protein VP3 deutlich zu erkennen.
Figur 5 zeigt die Replikation von rekombinantem AAV (rAAV) in C97-Zellen, wobei der Nachweis der rAAV-Replikationsintermediate als DNA mit niedrigem Molekulargewicht erfolgte, die aus C97-Zellen isoliert wurde, die zuvor mit rAAV und Adenovirus (MOI5) infiziert wurden. Typischerweise konnte 72 Stun- den nach der Infektion ein vollständiger zytopathischer Effekt beobachtet werden, wobei die Zellen zu diesem Zeitpunkt gesammelt wurden. Die Hälfte der Zellen wurde verwendet, um DNA mit einem niedrigen Molekulargewicht zu isolieren (erste Runde der Amplifikation), und die andere Hälfte der Zellen wurde dreimal eingefroren und wieder aufgetaut, sowie anschließend abzentrifugiert, um Zellbestandteile zu entfernen. Anschließend wurde der Überstand bei 56°C für 30 min behandelt, um intakte Helferviren zu inaktivieren. Anschließend wurde der Überstand verwendet, um frische C97-Zellen zusammen mit neuen Helferviren (MOI5) zu infizieren. Es konnte wieder ein deutlicher zytopathischer Effekt beobachtet werden, wobei DNA mit einem niedrigen Molekulargewicht isoliert wurde (zweite Runde der Amplifikation). Die isolierte DNA aus der ersten und zweiten Amplifikationsrunde wurde mittels Southern-Blot analysiert, wobei das erfindungsgemäße Vektorkonstrukt als Sonde für die Anwesenheit der Replikation- sintermediate der AAV-Genome verwendet wurde, um einen infektiösen Titer eines Original AAV-Stocks zu erhalten.
Figur 6 zeigt schematisch weitere Helferkonstrukte, die alle von dem Klonie- rungsvektor pUC19 abgeleitet sind.
Figur 7 zeigt schematisch Einzel- und Doppel-Expressionsvektoren.
Figur 8 zeigt schematisch die 5 '-lokalisierte ITR-Sequenz der AAV Vektorkonstrukte mit den Konfigurationen Flip, Flop und Deletion des C-Palindroms, die als "Δ(C-Arm)" bezeichnet ist.
Figur 9 zeigt schematisch die Nukleotidabfolge der 5 '-lokalisierten ITR-Sequenz der unterschiedlichen Konfigurationen aus Figur 8.
Figur 10 zeigt die Nukleotidabfolge der 5 '-lokalisierten ITR-Sequenz mit und ohne Deletion sowie der 3 '-lokalisierten ITR-Sequenz. Figur 11 zeigt schematisch die ebenso effiziente Verpackung eines Vektorkonstruktes mit deletierter 5 '-lokalisierter ITR-Sequenz [ρAAV-(B7.2free+GM-CSF)] im Vergleich zu einem Vektorkonstrukt mit einer 5 '-lokalisierten ITR-Sequenz in Flop-Orientierung Konfiguration [(ρAAV-(B7.2+GM-CSF)].
Figur 12 zeigt schematisch ein Rep 78-defiziente Helferplasmid mit der Bezeichnung pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37.
Figur 13 zeigt schematisch ein weiteres Rep 78-defiziente Helferplasmid mit der Bezeichnung pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37.
Beispiele
1. Plasmidkonstruktion
Die Plasmide (Vektorkonstrukt, Helferkonstrukte), die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, wurden unter Anwendung von Standardklonierungstechniken, wie sie bei Sambrook et al. (1989), supra nachzulesen sind, hergestellt. Die funktionell relevanten Ausschnitte dieser Plasmide sind in den schematischen Darstellungen der Figuren 1 bis 3, 6, 7, 12 und 13 gezeigt. Das Plasmid P5 Rep (Fig. 1A) wurde durch Deletion eines DNA-Fragments hergestellt, das die Nukleotide 2300-4170 des AAV-Genoms enthielt. (Ruffing et al. (1994) J. Gen. Virol. 75, 3385-3392 (Gene Bank Accession No. AF 043303). P5 RepΔ37 wurde durch Deletion der AAV-Basen 4461 - 4497 aus P5 Rep gewonnen. Das Plasmid P5P19P40Cap (Fig. 1A) wurde durch Deletion des DNA- Abschnitts zwischen den Nukleotiden 350 bis 650 und 1045 bis 1700 erhalten. P5P19P40CapΔ37 wurde durch Deletion der AAV-Basen 4461 - 4497 aus P5P19P40Cap gewonnen. Die Plasmide 1-4, die in der Fig. 3 gezeigt sind, enthalten verschiedene Deletionen des AAV-Genoms. Plasmid 1 fehlt die Sequenz zwischen der Bell- und der Hindlll-Schnittstelle des AAV2-
Genoms. Plasmid 2 fehlt die Sequenz zwischen der Nrul- und der BstEII- Schnittstelle, Plasmid 3 fehlt die Sequenz zwischen der Ba HI- und der BstEII-Schnittstelle. Plasmid 4 entspricht dem Plasmid P5P19P40Cap aus Fig. 1A. Die Vektorkonstrukte für rAAV-B7.2-GM-CSF und rAAV-GFP wurden mit Hilfe des pCI-Plasmids der Firma Promega (Deutschland) konstruiert und anschließend in ein pUC19-basiertes Plasmid, welches die ITR-Sequenzen aufwies, überführt (vgl. PCT/EP00/01090). Das ebenfalls zur Kontrolle verwendete Vektorkonstrukt nLacZ ist bereits in der Literatur beschrieben (Bertran et al. (1996) J. Virol. 70, 6759-6766). Verpackung verschiedener Vektorkonstrukte
Um den Einfluß der Deletion des C-Palindroms im 5 'lokalisierten-ITR von bestimmten Vektorkonstrukten auf die Expression der Fremd-DNA (=Transgene) sowie die Verpackung dieser Vektorkonstrukte in rAAV zu untersuchen, wurden vergleichende Transfektions- und Verpackungsexperimente durchgeführt. Hierfür wurden mehrere Klone eines Vektorkonstruktes mit intaktem 5'-ITR (beispielsweise pAAV-(B7.2/GM-CSF) - vgl. Fig. 11) und Klone eines Vektorkonstruktes mit einer Deletion im C- Palindrom des 5'-ITR (ΔC-Ann - beispielsweise pAAV-(B7.2free/GM-
CSF) - vgl. Fig. 9 und 11)) in HeLa-t Zellen transfiziert, wobei je 6 μg Plasmid für 4x105 HeLa-t Zellen verwendet wurde. 40 Stunden nach Transfektion wurde sowohl der Anteil an B7.2 exprimierenden Zellen mittels FACS-Analyse, als auch die Expression von GM-CSF im Kulrur- überstand mittels ELISA-Technik ermittelt. Die in der Tabelle angegebenen Werte stellen Mittelwerte aus Duplikaten zu je 4 verschiedenen Klonen desselben Plasmidtyps dar. Im ersten Experiment wurde aus unbekannten Gründen nur eine Transfektionsrate erreicht, welche etwa um den Faktor hundert unterhalb der Effizienz des zweiten Experiments lag. Dies erklärt, warum in Experiment 1 die ermittelten Werte für GM-CSF in den
Zellkultur-Überständen um zwei logarithmische Stufen niedriger lagen als in Experiment 2. Dadurch konnten in Experiment 1 nur etwa 40% der Zellen transfiziert wurden, während in Experiment 2 nahezu alle Zellen das Protein B7.2 exprimierten. Tabelle 1
Wie aus Tabelle 1 deutlich zu entnehmen ist, werden mit beiden Vek- torplasmiden gleich gute Transfektionseffizienzen erzielt, so daß die Deletion im C-Palindrom des 5 '-lokalisierten ITR keinen negativen Einfluß auf die Expressionsstärke der zwischen die ITRs klonierten Expressionskassetten für die Transgene besitzt.
Anschließend wurden mit den gleichen Vektorplasmiden Versuche zur Verpackung in rAAV durchgeführt. Hierfür wurden je 4 μg Vektorplasmid mit 12 μg Helferplasmid (pUC"rep/cap"(RBS)Δ37 - vgl. Fig. 6) in 106 HeLa-t Zellen transfiziert. Dabei wurde ebenfalls beobachtet, wie bereits oben beschrieben, daß die Transfektionseffizienzen um zwei logarithmische Stufen variierten. Nach zwei Tage wurden die Zellen mit Ad-5 (MOI2) infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Zellen in 3 ml Zellkulturmedium durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen aufgeschlossen, die Zellbestandteile durch Zentrifugation pelletiert und das rAAV- Lysat 10 min bei 60°C inkubiert, wodurch Helferviren inaktiviert wurden. Mit 500 μl Lysat in Experiment 1 (niedrige Transfektionsrate) bzw. 5 sowie 25 μl Lysat in Experiment 2 wurden 3x105 bestrahlte (100 Gy) HeLa-t Zellen infiziert. 40 Stunden nach Infektion wurde sowohl der Anteil an B7.2 exprimierenden Zellen mittels FACS-Analyse, als auch die Expression von GM-CSF im Zellkultur-Überstand mittels ELISA-Technik ermit- telt. Die in der nachfolgenden Tabelle 2 angegebenen Werte stellen Mittelwerte aus Duplikaten zu je 4 verschiedenen Klonen desselben Plasmid- typs dar:
Tabelle 2
Wie aus Tabelle 2 zu entnehmen ist, werden mit beiden Vektorplasmiden sehr hohe Mengen an rAAV erhalten, wobei die Menge an rAAV, die bei Verwendung des Vektorplasmids mit der Deletion im C-Palindrom des 5'- lokalisierten ITR erhalten wird zusätzlich über der Menge liegt, die bei Verwendung des Vektorplasmids B7.2/GM-CSF erhalten wird.
Herstellung von Helferkonstrukten
Aus Wildtyp-AAV-DNA wurden mittels PCR die AAV-Basen 190 bis 1060 amplifiziert. Dabei wurde der 5'-Primer so gewählt, daß an Position 199 eine singuläre Xbal-Schnittstelle eingeführt wurde. Das PCR- Fragment wurde mit Xbal und BamHI nachgeschnitten und in den ebenso geschnittenen Vektor pUC19 kloniert. Position 199 im AAV-Genom wurde gewählt, um sicherzustellen, daß alle wichtigen P5-Promotorelemente im Helferkonstrukt vorhanden sind. Nach einer Kontrollsequenzierung wurde Wildtyp-AAV-DNA mit BamHI und SnaBI geschnitten und das In- sert-Fragment anschließend in die BamHI und Smal-Position des Zwischenproduktes einkloniert. Auf diese Weise wurde das Basis- Helferkonstrukt pUC "rep/cap" gewonnen (Fig. 6). Dieses Helferkonstrukt enthält die AAV-Sequenzen 201 bis 4497, während das Vektorkonstrukt die AAV-Sequenzen 1 bis 191 bzw. 1-60/83-191 (linker ITR) und 4498 bis 4671 (rechter ITR) trägt (vgl. Fig. 7). Auf diese Weise wurde sichergestellt, daß keine homologen AAV-Sequenzüberlappungen auf den Plasmi- den existieren. Anschließend wurde vom 3 '-Ende des AAV-Genoms in pUC "rep/cap" Δ37 Basen deletiert, die für eine optimale Expression der AAV-Rep und Cap-Gene nicht benötigt werden. Das resultierende Helferkonstrukt wird mit pUC "rep/cap" Δ37 bezeichnet und enthält die minima- lisierte AAV-Sequenz von Position 201 bis 4460 (Fig. 6).
Anschließend wurde die Rep-Bindungsstelle (RBS) im Vektorrückgrat pUC19 (Position 684 bis 708 einschließlich; Sequenz: 5'- CTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGAC-3) deletiert, um eine nichthomologe Rekombination an dieser Position zu vermeiden. Das Konstrukt trägt die Bezeichnung pUC "rep/cap" (RBS)Δ37 (vgl. Fig. 6). In einigen
Plasmiden wurden zudem die drei RBS im Rep-Gen (P5- und P19- Promotor) einzeln und in verschiedenen Kombinationen mutiert, ohne die Aminosäuresequenzen des Rep-Proteins zu verändern (Fig. 6).
In einem weiteren Helferkonstrukt wurde eine sog. "functional separati- on"-Sequenz (fs) von 638 Basenpaaren Länge zwischen das Rep- und Cap- Gen eingeführt. Hierzu wurde zuerst die AAV-Sequenz 1691 bis 2328, die den Rep C-Terminus bzw. den AAV P40-Promotor einschließlich Cap- Sequenzen und alle für P40 essentiellen regulatorischen Sequenzen ent- hält, verdoppelt und hinter das Stop-Kodon für die gespleißten Rep- Versionen (Position 2329) Moniert. Dadurch wurde der AAV P40- Promotor, welcher das cap-Gen kontrolliert, verdoppelt und hinter das rep- Gen inseriert. Anschließend wurde der P40-Promotor im rep-Gen zerstört, ohne die Rep-Aminosäuresequenz zu verändern. Dies wurde durch eine Mutation der P40 TATA-Box gewährleistet. Insgesamt wurden für die erforderlichen Klonierungsschritte folgende AAV-Nukleotide verändert, ohne dabei jedoch die Aminosäuresequenz von Rep und Cap zu verändern: 1693 (T → A), 1694 (T → G), 2330 (G → C), 2331 (G → T), 2332 (G → A), 1625 (C → T), 1628 (A → G), 1826 (A → C), 1827 (A → T) und 1828 (G → C). Das resultierende Helferkonstrukt wird mit pUC
"rep/fs/cap" Δ37 bezeichnet (Fig. 6).
Analog wurde eine zusätzliche Sequenz in pUC "rep/cap" (RBS) Δ37 eingefügt, wobei ein Helferkonstrukt mit der Bezeichnung pUC "rep/fs/cap" (RBS) Δ37 resultierte (Fig. 6).
Die weiteren Rep 78-defizienten Helferkonstrukte wurden hergestellt, indem im Helferkonstrukt pUC"rep/cap" (RBS)Δ37 (vgl. Fig. 6) die AAV Nukleotide 1907 bis 2227, die dem rep-Intron entsprechen, durch Dop- pelstrangmutagenese deletiert wurden, wodurch das Plasmid pU-
CAAVSpleiß als Zwischenprodukt erhalten wurde. Das Plasmid pU- CAANSpleiß wurde mit dem Restriktionsenzym Νdel linearisiert, mit einer Exonuklease, beispielsweise Mung Bean Νuclease (Boehringer Mannheim, Deutschland) behandelt und anschließend mit dem Restriktionsen- zym SphI versetzt. Das so erhaltene Fragment mit einer Länge von 4222 bp wurde mit einem Nektorfragment zum Rep78-defizienten Helferkonstrukt pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37 (10657 bp) durch Ligation verbunden (vgl. Fig. 12). Für die Gewinnung dieses Nektorfragments kann beispielsweise pUC"rep/cap"(RBS)Δ37 (vgl. Fig. 6) verwendet werden, das nach einer Behandlung mit den Restriktionsenzymen Nrul und SphI in einer Länge von 6435 bp erhalten wird.
Dasselbe Nektorfragment kann weiterhin zur Herstellung eines weiteren Rep78-defizienten Helferkonstruktes ρUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 verwendet werden (vgl. Fig. 13). Hierfür wurde das Zwischenprodukt pU- CAANSpleiß mit den Restriktionsenzymen Asel, BsrBI sowie SphI behandelt. Das 1808 bp lange BsrBI- Sphl-Fragment wurde mit dem 6435 bp langen Nektorfragment zu besagtem Helferkonstrukt pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37 mit einer Gesamtlänge von 8243 bp durch
Ligation verbunden. Durch diese Klonierungsstrategie wird in beiden Rep78-defizienten Helferkonstrukten das rep Gen teilweise dupliziert, so daß eine verstärkte Expression der Rep-Proteine Rep 68, Rep 52 und Rep 40 von beiden rep Genen ermöglicht wird. Schließlich kann aus diesem Konstrukt der AAN-DΝA-Abschnitt 2946-4049 durch Verdau mit Apa 1 und Religation deletiert werden, wodurch das Rep-Expressionsplasmid pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS) Δ37 entsteht, welches ausschließlich Rep 68, Rep 52 und Rep 40 kodiert. Die oben beschriebenen und in Fig. 6 schematisch dargestellten Helferplasmide besitzen alle in etwa vergleichbare Ver- packungskapazitäten.
Tabelle 3
tP = transduzierende Partikel seq = sequentielle Transfektion
Rep78-defiziente Helferkonstrukte zeigen bei sequentieller Transfektion von Helfer- und Vektorkonstrukt (Experimente 1 und 3, in der nachfolgenden Tabelle 4 dargestellt, sowie ein weiteres Experiment in Tabelle 5) in etwa gleich gute Verpackungseffizienzen verglichen mit Rep78-kodierenden Helferkon- strukten. Bei Experiment 2 wurden Ko-Transfektionen durchgeführt, wodurch andere Versuchsbedingungen gewählt wurden und Experiment 2 daher auch hinsichtlich der Verpackungseffizienzen nicht mit Experiment 1 und 3 verglichen werden kann. Tabelle 4
Werden die erfindungsgemäßen Rep-Helferkonstrukte p5RepΔ37 (kodiert alle 4 Rep Proteine, aber kein Cap) bzw. ρUC"ΔRep78ΔCap"(RBS)Δ37 (kodiert ausschließlich für die Rep Proteine Rep68, 52 und 40) zusammen mit dem Cap Konstrukt p5pl9p40CapΔ37 im Verhältnis 1:1 in geeignete Verpackungszellen kotransfiziert, so lassen sich bei nachfolgender sequentieller oder zeitgleicher Transfektion eines Vektorkonstruktes und Überinfektion mit Adenoviren wiederum vergleichbare rAAV Titer erzielen, wie wenn ein einziges Helferkonstrukt, welches für sowohl rep, als auch cap kodiert, in die Zellen transfiziert wird (pUC"rep/cap"(RBS)Δ37, pUC"Rep68,52,40Cap"(RBS)Δ37, pUC"ΔRep78Cap"(RBS)Δ37). Daten hierzu sind in Tabelle 5 dargestellt. Überraschenderweise konnten in derart hergestellten rAAV Lysaten bislang keinerlei rcAAV Verunreinigungen gefunden werden. Tabelle 5
tP transduzierende Partikel seq = sequentielle Transfektion
Im Rahmen der Transfektionsexperimente wurden 4 μg Vektorkonstrukt (pAAV-GFP) mit 12 μg Helferkonstrukt in lxlO6 HeLa-t Zellen Kotransfiziert. Lediglich im Falle der mit (seq) bezeichneten Experimente wurden zunächst 16 μg Helferkonstrukt, einen Tag darauf 16 μg Vektorkonstrukt sequentiell transfiziert. In den Verpackungsansätzen, in denen rep und cap als getrennte Helfergene transfiziert wurden (p5RepΔ37, pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS)Δ37 und p5pl9p40CapΔ37), wurden rep und cap im Verhältnis 1:1 (also 8 μg rep und 8 μg cap) kotransfiziert. Zwei Tage nach (der ersten) Transfektion wurden die Zellen mit Ad-5 (MOI2) infiziert. Drei Tage später wurden die Zellen im Medium durch Frier/Tau- Lyse aufgeschlossen, Zellbestandteile pelletiert und das rAAV-Lysat 10 min bei 60°C Hitze-inaktiviert. Mit verschiedenen Verdünnungen des Ly- sats wurden 3xl05 bestrahlte HeLa-t Zellen (100 Gy) infiziert. 40 Stunden nach Infektion der Zellen mit rAAV wurden die Zellen im FACS-Flow (siehe unten) hinsichtlich der GFP Expression analysiert und hieraus die transduzierenden Titer der rAAV Rohlysate ermittelt. Jedes Helferkonstrukt wurde in mindestens fünf unabhängigen Experimenten getestet.
4. Optimales rep/cap Verhältnis bei Tripeltransfektion bzw. bei sequentieller Transfektion
Da bei Verwendung getrennter rep- und cap-Expressionsplasmide nicht unbedingt ein rep:cap Verhältnis 1 :1 gewählt werden muss, wurde das optimale rep: cap Verhältnis für die folgenden Plasmidkombinationen ermittelt.
Es wurden die Kombinationen p5RepΔ37 mit p5pl9p40CapΔ37 sowie pUC"ΔRep78ΔCaρ"(RBS) Δ37 mit p5pl9ρ40CaρΔ37 jeweils mit dem
Vektorplasmid pAAV-(B7.2free/GM-CSF) getestet. Dies wurde zum einen in einer Tripeltransfektion (Transfektion aller drei Plasmide gleichzeitig), zum anderen in einer sequentiellen Transfektion untersucht, bei der zunächst die beiden AAV Helferplasmide und - um einen Tag versetzt - das Vektorplasmid transfiziert wurde.
Im Falle einer Tripeltransfektion aller 3 Plasmide wurde grundsätzlich das optimale Verhältnis zwischen Helfer- zu Vektorplasmid von 4:1 gewählt. Für die Helferplasmide wurde nun das optimale rep: cap Verhältnis be- stimmt. Für alle 4 Kombinationen wurde ein rep: cap Verhältnis von 12:1 bis 1:12 getestet. Als optimal haben sich schließlich die in Tabelle 6 zusammengestellten rep: cap Verhältnisse erwiesen (Durchschnitt aus ca. 10 Einzelexperimenten) . Tabelle 6
Im Anschluß wurden die verschiedenen Plasmidkombinationen mit jeweils optimalem rep: cap Verhältnis (siehe Tabelle 6) hinsichtlich ihrer Verpackungseffizienz miteinander verglichen. Als Referenzverpackung diente die sequentielle Transfektion des Helferplasmids pUC"rep/cap"(RBS) Δ37 mit demselben Vektorplasmid (=100%). Die erzielten Werde sind in Tabelle 7 als Mittel aus 10 Einzelexperimenten zusammengestellt.
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Tabelle 7
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Aus Tabelle 7 wird deutlich, dass sich mit den separaten Rep-Cap Hel- ferplasmiden höhere Verpackungseffizienzen erzielen lassen als mit dem Referenzplasmid pUC "rep/cap " (RB S) Δ37 (132 bis 162% entsprechend mit einem Faktor 1,3 bis 1,6). Lediglich die Kombination von pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS) Δ37 mit p5pl9ρ40CapΔ37 in einer sequentiellen Transfektion mit dem Vektorplasmid fällt bezüglich der Partikelpro- duktion signifikant ab. (70% Verpackungseffizienz)
Zudem ist von Bedeutung, dass in keinem der 4 Ansätze mit den getrennten Helferplasmiden wtAAV nachweisbar war, während das Refe- rernzplasmid noch rcAAV Mengen im Bereich 0,01% verglichen mit dem rAAV Titer generiert.
Somit konnten mittels der erfindungsgemäßen Helferplasmide sowohl höhere Verpackungseffizienzen erzielt werden, als auch die Bildung von rcAAV verhindert werden.
5. Zellkultur
Die HeLa-Ausgangszellen und alle davon abgeleiteten VerpackungsZellli- nien wurden als „Monolayer"-Zellkulturen in Dulbecco's Modified Ea- gle's Medium (DMEM), das 10 % fötales Kälberserum aufwies, gehalten. Zusätzlich wurden verschiedene Selektionsmittel verwendet, um aus den transfizierten Zellen stabile Zelllinien zu erhalten. Dabei wurde Hygromy- cin B in einer Konzentration von 500 μg/ml, Neomycin in einer Konzent- ration von 800 μg/ml und/oder Puromycin in einer Konzentration von 1 μg/ml verwendet. Die Zellen wurden bei 37°C in einer 5 %igen CO - Atmosphäre angezogen. Die Transfektionen wurden mit Hilfe herkömmlicher Calcium-Phosphat-Präzipitations-Techniken (Ca3(PO4) 2) und Endo- toxin-freier Plasmid-DNA durchgeführt, die unter Verwendung von Kits der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland), gewonnen wurde. Um stabile
Zelllinien nach der Ko-Transfektion des zu integrierenden Plasmids und dem Resistenzplasmid zu erhalten, wurde ein Mischungsverhältnis der beiden Plasmide von 20:1 gewählt.
6. Herstellung einer stabilen Rep-exprimierenden Zelllinie
Ein Rep-kodierendes Plasmid wurde unter Entfernung der Cap- kodierenden Sequenzen aus dem Genom von AAV2, das keine ITR- Sequenzen, aber alle weiteren AAV-regulatorischen Elemente aufwies, hergestellt (Fig. 1). Anschließend wurden HeLa-Zellen mit dem Rep- Expressionskonstrukt transfiziert, und Zeilklone, die das Rep-Protein nach
Adenovirus-Infektion exprimierten, wurden mittels Western-Blot, wie in Fig. 2 gezeigt, identifiziert. Es wurde ein einzelner Klon ausgewählt und hinsichtlich seiner Fähigkeit, ein eingeführtes rAAV-Genom in der Gegenwart von Helfervirus zu replizieren, näher charakterisiert. Nach Identi- fizierung einer Rep-Zelllinie und dem Nachweis der Funktionalität der
Rep-Proteine wurde diese Zelllinie verwendet, um in sie ein Cap- Helferkonstrukt einzuführen.
7. Identifizierung eines Helferkonstrukts. das für die Herstellung einer stabi- len Cap-Zelllinie geeignet war
Es wurden einige Plasmide konstruiert, in denen die Expression des Cap- Proteins durch die natürlichen AAV regulatorischen Elemente kontrolliert wurde. Zunächst wurde ein Plasmid konstruiert, welches das cap-Gen un- ter der Kontrolle des P5 Promotors aufwies. Dieses Plasmid führte lediglich nach der Helfervirus-Infektion mit Adenovirus zu einer nachweisbaren Expression von Cap-Protein, aber die nachweisbaren Proteinmengen waren vergleichsweise gering. Daher wurde ein zweites Plasmid konstruiert, in dem die DNA-Sequenzen zwischen dem P5 und dem P19 Promotor ent- fernt wurden. Dieses Plasmid exprimierte nicht nur die Cap-Proteine, sondern auch das P19-Rep-Protein. Mit Hilfe dieses Cap-Expressions- Plasmids konnte nach Helfervirus-Infektion nur eine sehr geringe Cap- Proteinmenge nachgewiesen werden. Anschließend wurde eine ganze Reihe von Cap-Plasmiden konstruiert, die schematisch in Fig. 3 dargestellt sind. Alle diese Plasmide führten zu einer signifikanten Cap- Proteinexpression, wobei die erzielten Proteinmengen vergleichbar waren mit der Proteinmenge von einem Plasmid, welches das gesamte AAV- Genom mit Ausnahme der ITR-Sequenzen enthielt (vgl. Fig. 3 "wt"). Für alle folgenden Versuche wurde das Plasmid P5P19P40Cap, wie in Fig. 1 gezeigt, verwendet, weil es in verschiedensten Experimenten stets gering- fügig höhere Mengen an Cap-Protein lieferte als die weiteren Cap-
Konstrukte (vgl. Fig. 3).
8. Herstellung einer stabilen Zelllinie, die Rep- und Cap-Proteine exprimiert
Die unter Beispiel 5 beschriebene, das Rep-Protein stabil exprimierende Zellinie wurde anschließend mit dem Plasmid P5P19P40Cap transfiziert. Anschließend wurde ein Zeilklon identifiziert, der nach Adenovirus-
Infektion hohe Mengen sowohl an Rep- als auch an Cap-Proteinen expri- mierte (vgl. Fig. 4). Anschließend wurde die Funktionalität der Rep- und Cap-Proteine in der ausgewählten Zellinie in einem Infektiösitäts-Versuch mit zwei Amplifikationsrunden untersucht. Die Versuchsergebnisse in Fig. 5 zeigen deutlich, daß sowohl die Rep- als auch die Cap-Proteine in der ausgewählten Zellinie funktionell sind und daß in diesen Zellen infektiöses rAAV gebildet wird. Weiterhin zeigen diese Daten, daß diese Zellinie verwendet werden kann, um einen infektiösen Titer für einen rAAV-Stock zu erhalten. Ein Southern-Blot Experiment mit genomischer DNA bewies, daß die Rep- und Cap-Expressionskassetten vollständig an zwei verschiedenen chromosomalen Orten integriert waren. Transiente Herstellung von rAAV mit Hilfe dieser Verpackungszelllinie
Anschließend wurde bestimmt, wie hoch der Anteil von rAAV war, der mit dieser erfindungsgemäßen Verpackungszelllinie erreicht werden konnte, wenn ein Vektorkonstrukt in einem transienten Transfektionsexpe- riment zur Verfügung gestellt wurde. Deshalb wurden Vektorkonstrukte, die entweder für GFP oder B7.2-GM-CSF (Fig. 1B) kodieren, in die stabile Zellinie transfiziert. 24 bis 48 Stunden später wurde Adenovirus in ei- ner Infektionsmultiplizität von 5 (MOI 5) hinzugefügt. Nach 72 Stunden wurde ein virales Lysat erhalten, gereinigt und verwendet, um HeLa- Zellen zu transduzieren. In neun unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, daß C97-Zellen tatsächlich in der Lage sind, rAAV zu produzieren, wenn ein Vektorplasmid und Adenovirus-Helferfunktion anwe- send sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.
Tabelle 7
Ein entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Zellinie ist, daß kein Wildtyp-AAV (rcAAV) zu erwarten ist. Es wurden zahlreiche Versuche unternommen, rcAAV-Kontaminationen zu detektieren, aber es konnten bisher keine rcAAV-Partikel in Virusstocks, die aus diesen Zelllinien hergestellt wurden, nachgewiesen werden. Dabei wurden 1-2 ml Virus mit etwa 5 x 107 transduzierenden Partikeln/ml getestet.
10. Herstellung von stabilen Produktionszelllinien
In einem nächsten Schritt sollten stabile Zelllinien für die Produktion von rAAV hergestellt werden, die für die rAAV Produktion keine Transfektion des Vektorkonstrukts mehr benötigen und dadurch eine Produktion von rAAV in großem Maßstab erlauben. Hierzu wurden in mehreren unabhän- gigen Transfektionsschritten Vektorkonstrukte in C97-Zellen transfiziert. Primär wurden Klone nach der Expression der Fremd-DNA, die in den rAAV-Genomen enthalten waren, gescreent. Sekundär wurde auch hinsichtlich der Virusausbeute durch die Rep- und Cap-Expression eine Auswahl zwischen den Klonen getroffen. Nach dem Screening wurden 72 Klone für das Vektorkonstrukt GFP, 31 Klone für das Vektorkonstrukt B7.2-GM-CSF und 34 Klone für das Vektorkonstrukt nLacZ identifiziert, die nur nach Adenovirus-Infektion in der Lage waren, rAAV in unterschiedlichen Größenordnungen zu bilden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 8
11. Herstellung weiterer Verpackungszelllinien
Mit den zuvor beschriebenen Helferplasmiden p5RepΔ37 (kodierend für alle 4 Rep Proteine) bzw. pUC"ΔRep78ΔCap"(RBS)Δ37 (Rep78-defizient) in Kombination mit jeweils p5pl9p40CapΔ37 (kodierend für die 3 Kapsidproteine) sowie einem Neomycinresistenzgenplasmid wurden wie im folgenden beschrieben weitere Verpackungszelllinien für AAV-2 Vektoren hergestellt.
HeLa-t Zellen wurden bei ca. 10% Konfluenz mit je einem rep, cap und Resistenzgenplasmid kotransfiziert (im Verhältnis 10:10:1) und solange weiterkultiviert, bis die Zellen eine Konfluenz von nahezu 100% erreichten. Mit der Antibiotika-Selektion (G418 wurde 48h nach der Transfektion begonnen. Nach Erreichen von 100% Zellkonfluenz wurden die Zellen trypsiniert und in 10 Zellpools zu je 10% Konfluenz ausgesät. Diese Zell- pools wurden für ca. 4 Wochen weiterkultiviert (mit jeweiliger Passagie- rung der Zellen nach Erreichen von 100% Konfluenz), ehe ein erstes Verpackungsexperiment gestartet wurde.
Von jedem Pool wurden Replikate hergestellt. Ein Replikat wurde weiter- kultiviert, das dazugehörige Replikat wurde bei 10% Konfluenz mit einem
AAV-GFP Vektorplasmid transfiziert und 24h später mit AdV infiziert. 72h später wurden die rAAV Vektoren wie in den Beispielen "Herstellung von rAAV" und "Virustitration", Nummer 12 und 13, beschrieben geerntet und titriert. Auf diese Weise wurde der effizienteste der 10 Pools hinsicht- lieh Verpackung von rAAV Vektoren identifiziert.
Je 1 Pool für beide neuen Verpackungszelllinien (mit und ohne Rep78- Gen) wurde anschließend weiterkloniert. Zunächst wurden ca. 250 Pools ä 100-1000 Zellen in Verpackungsexperimenten gescreent. Der wiederum beste Pool wurde weiterkloniert, wobei im nächsten Schritt ca. 1000 Pools ä 10 Zellen (pro Zelllinie) analysiert wurden. Der hiervon beste Pool wurde schließlich einer Einzelzellklonierung unterzogen. Ca. 100 Einzelzell- klone pro Verpackungszelllinie wurden analysiert.
Schließlich kristallisierten sich 3 Einzelzellklone der Rep78-kodierenden
Zelllinie (mit SH benannt) sowie 4 Einzelzellklone der Rep78-defizienten Verpackungszelllinie (DJ) heraus. Diese Klone wurden weitere 40 Passagen in Abwesenheit von G418 und somit ohne weiteren Selektionsdruck kultiviert.. Alle ca. 2 Wochen wurden Verpackungsexperimente wie zuvor beschrieben mit den 7 Klonen durchgeführt. Als Vektorplasmid wurde pAAV-GFP oder pAAV-(B7.2/GM-CSF) verwendet. Als Helfervirus wur- de innerhalb dieser Versuchsreihe nur AdV eingesetzt. Hierbei zeigte sich, dass alle 7 Klone ihre Verpackungseffizienz über die gesamte Kultivierungszeit beibehielten, weshalb von einer stabilen Integration der AAV Gene ausgegangen werden kann. Alle 7 Klone erzielten bei Verwendung von Adenoviren als Helfer etwa vergleichbare Verpackungseffizienzen im
Bereich von lxlO7 tP/ml.
12. Herstellung von rAAV
Um rAAV herzustellen, wurden Verpackungszellen mit einem Vektorplasmid transfiziert und 48h später mit Adenovirus (MOI 5) infiziert. Produktionszelllinien wurden lediglich mit Adenovirus infiziert. 72 Stunden nach der Adenovirus-Infektion wurden die Zellen und der Überstand geerntet, wobei die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 Upm für 5 min abzentrifugiert wurden und ca. 107 Zellen/ml in einem Teil des Überstandes resuspendiert wurden. Der restliche Teil des Überstandes wurde für 30 min bei 56°C behandelt und anschließend bis zur Verwendung eingefroren. Die Zellsuspension wurde einem dreimaligen „Einfrier-Auftau"- Zyklus unterworfen, wobei der Einfriervorgang bei -80°C und der Auftau- Vorgang bei 37°C erfolgte. Anschließend wurden Zelltrümmer durch
Zentrifugation in einer Mikrofuge für 5 min bei voller Leistung entfernt. Verbleibendes Adenovirus wurde durch eine Inkubation bei 56°C für 30 min inaktiviert. Der daraus resultierende Überstand wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Virusstock für weitere Reinigungen verwendet.
13. Virustitration
Es wurde stets ein Titer des Virusstocks erreicht, der funktionell für die
Transduktion ausreichend war. HeLa-Zellen wurden mit UV-Licht (35 J/m2) in einem Stratalinker™ (herkömmlicherweise zu beziehen bei der
Firma Stratagene Deutschland) in Phosphat-gepufferter Salzlösung behan- delt. Unmittelbar nach der Bestrahlung wurden die Zellen der rAAV Suspension ausgesetzt. Es wurden stets verschiedene Volumina einer gegebenen Präparation verwendet, um verschiedene Mengenanteile an transdu- zierten Zellen zu erhalten. Ausgehend von der daraus bekannten Zahl der Zielzellen wurde rechnerisch die Zahl der transduzierenden Einheiten ermittelt. Der Anteil der transduzierten Zellen verhielt sich bei hohen Trans- duktionsraten nicht mehr linear, er war jedoch annähernd linear, wenn Transduktionsraten von unter 10 % gewählt wurden. Die Titrationen wurden in 12-Lochplatten durchgeführt, wobei 2x105 HeLa-Zellen pro Loch infiziert wurden. Diese Infektionen wurden in 500 μl Puffer durchgeführt.
Weiterhin wurden einige Virusstocks, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet wurden, unter Verwendung eines speziellen Infektionsversuchs titriert, wobei zwei Amplifikationsrunden der Verpackungszellen durchge- führt wurden, um die infektiösen Titer der Präparationen zu ermitteln. Einzelheiten zu diesem Versuch sind beispielsweise nachzulesen bei Clark et al. (1996) Gene Therapy 3, 1124-1232. Hierzu wurden die Virusstocks seriell in serumfreiem Medium verdünnt, anschließend wurden Teilmengen, die bekannte Volumina der Ausgangsvirusstocks enthielten, verwendet, um die Verpackungszelllinie C97 im Rahmen dieser Erfindung zusammen mit einer konstanten Menge an Adenovirus (MOI5) zu transduzieren. Nach 72 Stunden wurden die Zellen und der Überstand geerntet, einem dreimaligen „Einfrier-Auftau"-Zyklus unterworfen, abzentrifugiert, um Zellteile zu entfernen, bei 56°C behandelt, um Adenovirus zu inaktivieren und an- schließend auf eine Zellkulturschale mit frischen C97-Zellen zusammen mit frischen Adenoviren (MOI5) gegeben. Nach weiteren drei Tagen wurden die Zellen geerntet und ihre DNA mit Hilfe der Hirt-Lyse unter Verwendung eines Standardprotokolls (Hirt (1967) J. Mol. Biol. 26, 365-369) gewonnen. Die DNA wurde nach ihrer Größe in einem Agarosegel aufge- trennt, geblottet und mit einer Sonde, die entweder einen Teil des Vektor- konstrukts zur Identifikation der Replikationsformen von rAAV enthielt o- der einen Teil des Wildtyp-AAV Genoms, um die Rep- und Cap- enthaltenden infektiösen Partikel zu identifizieren, inkubiert.
Es wurden weitere Titrationen der Vektorpräparationen zur Bestimmung der genomischen Titer durchgeführt. Die erhaltene Virussuspension wurde mit DNAsel behandelt und anschließend bei 68°C für 30 min unter Hinzufügen von 5 mM EDTA inkubiert, und in Capsid eingeschlossene DNA wurde durch eine anschließende Inkubation mit ProteinaseK (0,5 mg/ml) in 0,5 % SDS freigesetzt. Die DNA wurde anschließend über eine Phe- nol/Chloroform-Extraktion gereinigt, anschließend einer Ethanolpräzipita- tion unterworfen und auf eine Nylonmembran unter Verwendung eines Dot-Blot Apparates geblottet, anschließend mit Sonden hybridisiert, die spezifisch waren für rAAV oder Wildtyp-AAV. Das Verhältnis zwischen genomischen Partikeln und infektiösen Partikeln betrug 100 bis 1000 zu 1, abhängig jeweils von der Präparation, die untersucht wurde.
Das Helfervirus Adenovirus Typ 5, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wurde durch Piaquereinigung erhalten. Nach der Vermehrung in HeLa-Zellen und der Reinigung über doppelte CsCl- Gradientenzentrifugation, wurde Adenovirus nochmals auf HeLa-Zellen titriert, um die benötigte Anzahl von plaquebildenden Einheiten (engl: plaque forming units = PFU) pro ml (PFU/ml) zu erhalten. Vor der Verwendung wurde eine geringe Teilmenge der erhaltenen Virusstocks auf die Anwesenheit von Wildtyp-AAV getestet, die aber stets negativ war. 4. Protein- und DNA- Analyse
Die DNA mit niedrigem Molekulargewicht als auch die genomische DNA wurden unter Verwendung von Standardisolierungsverfahren gewonnen (Sambrook et al. (1989) supra; Hirt (1967) supra). Für Southern-Blot A- nalysen von genomischer DNA wurden 15 μg DNA mit dem gewünschten Restriktionsenzym versetzt, der Ansatz anschließend im Agarosegel aufgetrennt und die DNA auf eine Nylonmembran unter Verwendung eines Vakuumblotters (Firma Pharmacia, Erlangen, Deutschland) transferiert. Bei Verwendung von DNA, die mittels Hirt-Lyse gewonnen wurde, wurde pro Spur eine Menge, die 105 Zellen entsprach, geladen. Als Sonden für die AAV-Genome wurden ein 1,5 kb-HincII Cap-spezifisches Fragment oder ein 655 bp BamHI-BstEII Rep-spezifisches Fragment verwendet. Für die rAAV-Genome, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, diente als Sonde eine Probe, die dem CMV Promotor entsprach.
Die Sonden wurden mit Digoxigenin markiert, das herkömmlicherweise als Kit bei der Firma Boehringer Mannheim, Deutschland erhältlich ist, und nach den Angaben des Herstellers verwendet wurde. Für den Nachweis wurde ein alkalischer Phosphatase-konjugierter Anti-Digoxigenin Antikörper verwendet, woran sich eine Inkubation mit dem Substrat CDP
Star™ und eine Autoradiographie anschloß. Für Dot-Blot Experimente wurden die Proben auf eine Endkonzentration von 0,4 N NaOH eingestellt und unter Verwendung des bereits genannten Vakuumblotters auf eine Membran transferiert.
Für Proteinanalysen wurden die Proben in Laemli-Probenpuffer, der 100 mM DTT aufwies, resuspendiert und anschließend für 15 min aufgekocht, bevor sie in einer SDS-PAGE analysiert wurden. Anschließend wurden die Proteine entweder unter Verwendung eines „Liquid-Transfer-Systems" (Firma Sigma, Deutschland) oder eines „Semi-Dry-Systems" (Firma Höfer, Deutschland) geblottet. Der Nachweis erfolgte mit dem Rep- spezifischen Antikörper 303.9 sowie dem Cap-spezifischen Antikörper Bl (Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71, 1341-1353).
15. FACS-Analvsen
Die B7.2-Expression wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen FITC-konjugierten Antikörpers, der gegen B7.2 gerichtet war (Firma Pharmingen International, USA), untersucht. Um unspezifische Färbungen auszuschließen, wurde ein Isotyp-Kontroll- Antikörper sowie die Färbung von Mock-transduzierten Zellen mit einem B7.2 Antikörper durchgeführt. Die Zellen wurden mit dem Antikörper für 30 min auf Eis inkubiert, anschließend zweimal in Phosphat-gepufferter Salzlösung inkubiert, bevor sie analysiert wurden. Die Antikörperfärbung wurde in DlO-Puffer durch- geführt, die Zellen wurden nach den Waschschritten in DlO-Puffer resuspendiert und der FACS-Analyse unterworfen. Die Fluoreszenz wurde mit einem „Beckton Dickinson FACS Vantage flow cytometer" bei einer Extinktionswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 ± 15 nm durchgeführt. Der Anteil der positiven Zellen wurde definiert als der Teil, dessen Fluoreszenzintensität größer als 99 % der Kontrollzellen war.

Claims

Patentansprüche
1. Wirtszelle zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV) enthaltend mindestens eine Kopie eines Helferkonstruktes zur Expression mindestens eines AAV Rep-Proteins und mindestens eines AAV Cap-Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Rep-Protein und das Cap-Protein kodierenden Nukleinsäuren funktionell getrennt vorliegen und operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, insbesondere mit den natürlichen Promotoren von AAV verbunden sind.
2. Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAV) ausgewählt ist aus den Serotypen AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 und/oder aus einer Kapsid- mutante von AAN.
3. Wirtszelle nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich mindestens eine Kopie eines Vektorkonstruktes enthält (Produktionszelle).
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Kopie eines Νukleinsäurekonstruktes für mindestens ein Genprodukt eines Helfervirus und/oder eines zellulären Gens, das für die Produktion von rAAV notwendig ist, enthält.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich die für das Rep-Protein und das Cap-Protein kodierenden Nukleinsäuren auf zwei unterschiedlichen Helferkonstrukten befinden.
6. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Helferkonstrukte zur Expression des Rep-Proteins und des Cap- Proteins an zwei verschiedenen Stellen in das Genom der Wirtszelle integriert sind.
7. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Rep-Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P5 kontrolliert ist.
8. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Cap-Proteins durch den natürlichen AAV Promotor P40, insbesondere durch die natürlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem durch die natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 kontrolliert ist.
9. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Rep-Proteins und des Cap-Proteins in der Wirtszelle voneinander abhängig reguliert ist.
10. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Termination der Transkription der für das Rep-Protein und das Cap- Protein kodierenden Nukleinsäuren durch die natürlichen regulatorischen
Sequenzen, insbesondere durch das natürliche AAV Poly-A-Signal kontrolliert ist.
11. Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle eine Säugetierzelle, insbesondere eine menschliche
Zervixkarzinomzelle, vor allem eine HeLa Zelle ist.
12. Helferkonstrukt zur Expression wenigstens eines AAV Rep-Proteins in einer Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Rep-Protein ko- dierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Se- quenzen von AAV, insbesondere mit dem natürlichen AAV Promotor P5 verbunden ist.
13. Helferkonstrukt nach Anspruch 12 enthaltend Nukleinsäuresequenzen ko- dierend für mindestens ein Rep-Protein, dadurch gekennzeichnet, daß die
Rep-Proteine Rep 68, Rep 52 und/oder Rep 40, nicht aber Rep 78 sind.
14. Helferkonstrukt zur Expression wenigstens eines AAV Cap-Proteins in einer Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Cap-Protein ko- dierende Nukleinsäure operativ mit den natürlichen regulatorischen Sequenzen von AAV, vorzugsweise mit dem natürlichen AAV Promotor P40, insbesondere mit den natürlichen AAV Promotoren P19 und P40, vor allem mit den natürlichen AAV Promotoren P5, P19 und P40 verbunden ist.
15. Vektorkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäure/n, die von ITR-Sequenzen flankiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die 5 '-lokalisierte ITR-Sequenz eine Deletion im Bereich des C- Palindroms aufweist.
16. Vektorkonstrukt nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion der 5 '-lokalisierten ITR-Sequenz 150 Nukleotide, bevorzugt 80 Nukleotide, insbesondere 40 Nukleotide, vor allem 22 Nukleotide des C- Palindroms beträgt.
17. Vektorkonstrukt enthaltend ein oder mehrere zu AAV heterologe Nukleinsäuren, insbesondere eine Nukleinsäure kodierend für ein Protein ausgewählt aus einem Zytokin, insbesondere IL2, IL4, IL12 und/oder GM-CSF und/oder einem ko-stimulierenden Molekül, insbesondere B7, vor allem B7.1 und/oder B7.2, welche insbesondere von AAV ITR-Sequenzen flan- kiert werden und die Expression der heterologen Nukleinsäure/n von einem zu AAV heterologen Promotor und/oder Enhancer, insbesondere von CMV MIEP kontrolliert sind.
18. Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle zur Verpackung und/oder Produktion von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), das die Schritte umfaßt:
(a) Herstellung eines Rep-Helferkonstruktes gemäß Anspruch 11 oder 12 und eines Cap-Helferkonstruktes gemäß Anspruch 13, (b) Einbringen des Rep-Helferkonstruktes in eine Wirtszelle,
(c) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt enthaltenden Wirtszelle ,
(d) Einbringen des Cap-Helferkonstruktes in die selektionierte Wirtszelle aus Schritt (c) und
(e) Selektion einer das Rep-Helferkonstrukt und das Cap- Helferkonstrukt enthaltenden Wirtszelle.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Cap- Helferkonstrukt vor dem Rep-Helferkonstrukt in die Wirtszelle eingebracht wird.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Rep- und das Cap-Helferkonstrukt im wesentlichen gleichzeitig in die Wirtszelle eingebracht werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Cap-Helferkonstrukt, mindestens ein Rep- Helferkonstrukt, mindestens ein Vektorkonstrukt und/oder mindestens ein Helfergen in die Wirtszelle eingebracht wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstrukte und/oder Gene transfiziert, insbesondere stabil transfiziert werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Konstrukte und/oder Gene mit Viren, insbesondere mit rekombinanten Viren, vor allem rAAV, Adenoviren, Herpesviren, Vacciniaviren Baculoviren, Phagen und/oder Bakteriophagen in die Wirtszelle eingebracht werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorselektion auf Zellen mit Integrationsereignissen durchgeführt wird, insbesondere durch das gemeinsame Einbringen eines Reporterkon- struktes mit einem der Konstrukte und/oder Gene in eine Wirtszelle und anschließende Selektion bezüglich des Reporters.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der Konstrukte- und/oder Gene-enthaltenden Wirtszelle über den Nachweis der Proteinexpression, insbesondere mittels Westemblot erfolgt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der Konstrukte- und/oder Gene-enthaltenden Wirtszelle über den Nachweis spezifischer Nukleinsäuren, insbesondere mittels Southemblot, Northernblot und/oder quantitativer PCR erfolgt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Selektion der Konstrukte- und/oder Gene-enthaltenden Wirtszelle über den Nachweis der rAAV-Partikelbildung erfolgt, in dem in die Wirts- zelle die zur rAAV-Partikelbildung fehlenden Konstrukte eingebracht werden und/oder mit Helferviren infiziert werden.
28. Verwendung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder mindestens eines Rep-Helferkonstrukt nach Anspmch 12 oder 13 und mindestens eines Cap-Helferkonstruktes gemäß Anspmch 14 und/oder ei- nes Vektorkonstruktes nach einem der Ansprüche 15 bis 17 zur Herstellung von rAAV.
29. Verwendung von rAAV gemäß Anspmch 28 zum Transfer von Genen in Zellen, insbesondere von immunstimulatorischen Genen, vor allem GM- CSF, B7.1 und/oder B7.2.
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