CN116829725A - 用于产生腺相关病毒的试剂盒及其利用 - Google Patents
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Abstract
本发明的课题在于提供一种用于制作可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞的试剂盒及整合载体,并且提供一种可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞、其制造方法及腺相关病毒的制造方法。根据本发明,提供一种试剂盒,其包含:第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下;及第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制作腺相关病毒产生细胞的试剂盒及整合载体。而且本发明涉及一种腺相关病毒产生细胞、其制造方法及腺相关病毒的制造方法。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus:也称为AAV)是属于细小病毒科的直链单链DNA病毒。野生型AAV基因组包含复制的调控基因(rep基因)和衣壳的结构基因(cap基因),且为了病毒的复制和包装邻接反向末端重复序列(ITR)。AAV载体能够在增殖或非增殖的任一细胞中进行基因导入,尤其能够在非分裂细胞中进行长期的表达。并且,AAV被认为是非病原性的,且免疫原性较低。根据上述情况,AAV载体作为基因治疗用载体而进行临床应用。
AAV是在腺病毒和疱疹病毒等辅助病毒的存在下增殖的非包膜病毒。在制作用于基因治疗或核酸导入的AAV时,经典地使腺病毒与宿主细胞共感染而进行了AAV复制。并且,明确了负责腺病毒的辅助作用的基因,还使用搭载了该基因的质粒。例如,通过将包含rep基因及cap基因的质粒、腺病毒辅助质粒及包含导入基因的质粒同时转染到HEK293细胞中,从而能够包装成重组型AAV(rAAV)。
在专利文献1中,记载有为了产生AAV而使用哺乳动物细胞,所述哺乳动物细胞包含编码在第1可抑制解除的启动子的控制下的病毒辅助基因的核酸分子、编码在第2可抑制解除的启动子的控制下的AAV基因的核酸分子及编码第1及第2可抑制解除的启动子的阻遏要件的核酸分子。
在专利文献2中,记载有核酸分子,所述核酸分子包含(a)编码AAV的REP蛋白质的碱基序列、(b)编码AAV的衣壳的结构蛋白质的碱基序列、(c)包含第一AAV的反向末端重复(ITR)的碱基序列、(d)包含第二AAV的反向末端重复(ITR)的碱基序列、(e)位于第一ITR与第二ITR之间的、用于插入编码外来的蛋白质的碱基序列的碱基序列或/及编码外来的蛋白质的碱基序列,(f)包含腺病毒的E2A区域的碱基序列、(g)包含腺病毒的E4区域的碱基序列及(h)包含腺病毒的VA1 RNA区域的碱基序列。
在专利文献3中,记载有一种腺相关病毒(AAV)产生细胞,所述AAV产生细胞包含编码AAV rep/cap基因、辅助病毒基因及AAV载体粒子的DNA基因组的核酸序列,上述核酸序列全部一起整合到AAV产生细胞的基因组内的单一的基因座。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开2020-132059号公报
专利文献2:日本特开2020-188763号公报
专利文献3:日本特表2020-517238号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
在专利文献1中记载的AAV产生细胞中,认为通过对基因的人工序列附加来避免建立AAV产生细胞株时引起的细胞毒性。但是,在专利文献1中记载的AAV产生细胞中,由于在病毒辅助基因及AAV基因分别附加有人工控制序列,因此有可能产生控制序列之间的串扰(由于控制序列之间的相互干涉而难以控制每个对象基因的表达量),有可能无法充分地控制AAV产生。在专利文献2及3中记载的AAV产生细胞中,关于通过可表达调控的启动子来控制病毒辅助基因的表达没有具体的记载。
本发明的课题在于提供一种用于制作可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞的试剂盒及整合载体。本发明的另一课题在于提供一种可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞、其制造方法、及腺相关病毒的制造方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究的结果发现,通过使用包含在可表达调控的启动子的控制下的至少一个病毒辅助基因的第一载体和包含不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的至少一个腺相关病毒基因的第二载体,能够制造可控制制造腺相关病毒的AAV产生细胞。本发明是根据上述见解而完成的。
根据本发明,提供以下发明。
<1>一种试剂盒,其包含:
第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下;及
第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,并且上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
<2>根据<1>所述的试剂盒,其中,
第一载体中的可表达调控的启动子为通过药剂可表达调控的启动子。
<3>根据<1>或<2>所述的试剂盒,其中,
第一载体中包含的病毒辅助基因来源于腺病毒。
<4>根据<1>或<2>所述的试剂盒,其中,
第一载体中的包含的病毒辅助基因中,E4基因及VA-RNA基因在可表达调控的启动子的控制下。
<5>根据<1>至<4>中任一项所述的试剂盒,其中,
第一载体中包含的所有病毒辅助基因在可表达调控的启动子的控制下。
<6>根据<1>至<5>中任一项所述的试剂盒,其中,
第一载体中包含的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA-RNA基因。
<7>根据<6>所述的试剂盒,其中,
E4基因为E4ORF6基因。
<8>根据<6>或<7>所述的试剂盒,其中,
VA-RNA基因为VA-RNAI基因。
<9>根据<1>至<8>中任一项所述的试剂盒,其中,
在第二载体中,所有腺相关病毒基因不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
<10>根据<1>至<9>中任一项所述的试剂盒,其中,
在第二载体中,不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因中的任一个在腺相关病毒基因天然保持的启动子的控制下。
<11>根据<1>至<10>中任一项所述的试剂盒,其中,
第二载体中包含的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因。
<12>根据<1>至<11>中任一项所述的试剂盒,其中,
第二载体中包含的腺相关病毒基因中,不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因为rep基因。
<13>一种细胞,其具有<1>至<12>中任一项所述的试剂盒中包含的第一载体及第二载体。
<14>根据<13>所述的细胞,其中,
细胞为人体细胞。
<15>根据<13>或<14>所述的细胞,其中,
在染色体中具有上述第一载体和上述第二载体。
<16>一种整合载体,其以连结的状态具有:
第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下;及
第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,并且上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
<17>根据<16>所述的整合载体,其还具有:
第三载体,包含所期望的治疗或预防基因。
<18>一种细胞,其具有<16>或<17>所述的整合载体。
<19>根据<18>所述的细胞,其中,
细胞为人体细胞。
<20>根据<18>或<19>所述的细胞,其中,
在染色体中具有上述整合载体。
<21>一种用于产生腺相关病毒的细胞的制造方法,所述方法包括如下:
将第一载体和第二载体导入细胞中,所述第一载体包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下,所述第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因,并且上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
<22>一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
培养包含第一载体、第二载体,必要时包含第三载体的细胞的工序,所述第一载体包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下,所述第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因,并且上述腺相关病毒基因的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下,所述第三载体包含所期望的治疗或预防基因;及
通过使上述可表达调控的启动子进行动作来表达在可表达调控的启动子的控制下的病毒辅助基因的工序。
<23>一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分和腺相关病毒基因的一部分导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在上述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因、在上述第一工序中所获得的细胞不包含的腺相关病毒基因、及必要时将所期望的治疗或预防基因导入在上述第二工序中所获得的细胞中;以及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
<24>根据<23>所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因,在第三工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为cap基因。
<25>一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分、腺相关病毒基因,必要时将所期望的治疗或预防基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在上述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因导入在上述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
<26>根据<25>所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因。
<27>一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将腺相关病毒基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将病毒辅助基因,必要时将所期望的治疗或预防基因导入在上述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
<28>根据<27>所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA-RNA基因。
<29>一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分,必要时将所期望的治疗或预防基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在上述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因、腺相关病毒基因导入在所述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
<30>根据<29>所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因,在第三工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因。
发明效果
根据本发明,提供一种可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞。根据本发明,能够以控制的方式制造腺相关病毒。
附图说明
图1表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了细胞毒性性的结果。
图2表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了蛋白质表达的结果。
图3表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了细胞毒性性的结果。
图4表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
图5表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
图6表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
图7表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
图8表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
图9表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
图10表示以规定的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了在基因组内插入了质粒的AAV产生细胞株的AAV滴度的结果。
图11表示seq43的质粒图。
具体实施方式
以下,对本发明的实施方式的一例进行说明。但是,本发明并不因以下实施方式而受到任何限定,在本发明的目的的范围内,能够适当进行变更来实施。在本说明书中,使用“~”表示的数值范围表示将记载于“~”前后的数值分别作为最小值及最大值而包含在内的范围。
本发明中,在对野生型基因进行碱基的取代、缺失、插入或附加等改变的情况下,改变的碱基的个数优选为1~20个,更优选为1~10个,进一步优选为1~3个。经改变的基因的碱基序列与野生型基因的碱基序列优选表示85%以上的序列同源性,更优选表示90%以上的序列同源性,进一步优选表示95%以上的序列同源性,更进一步优选表示98%以上的序列同源性。
<试剂盒>
本发明的试剂盒包含:
第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下;及
第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,并且上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
例如,本发明的试剂盒包含:第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且第一载体中包含的病毒辅助基因中,只有E4基因及VA-RNA基因在可表达调控的启动子的控制下;及
第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,并且第二载体中包含的腺相关病毒基因中,不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因为rep基因。
本发明的试剂盒用于AAV的制造,只要包含包括第一载体和第二载体的载体序列的组合即可,也可以是溶解于缓冲液组合物或纯净水等的状态或分散的状态。可以与导入载体的试剂等实施本发明时有用的组合物进行组合,也可以包括适当的容器、例如小瓶、软管、试管或其他容器。
在专利文献1中记载的方法中,在辅助基因及腺相关病毒基因的多个位置人工附加用于控制表达的序列,但通过使用多个人工序列而存在串扰的问题。本发明中,通过限制可表达调控的启动子的使用,消除上述的串扰问题。
本发明中,明确了已知具有细胞毒性的AAV基因的表达依赖于辅助基因,由此判断出通过仅控制辅助基因的表达能够避免细胞毒性。即,本发明中,通过最小限的人工序列的附加,能够避免建立AAV产生细胞株时引起的细胞毒性。另外,对基因导入后的细胞例如通过trypan blue(台盼蓝)染色来测定细胞的生存率,由此能够评价细胞毒性。并且,为了消除因增加人工序列而产生的串扰等忧患,本发明中,尽量使用天然的序列,由此,构建了模仿自然界的AAV产生机构的产生系统。
而且,以往的AAV制造方法需要在每次制造时导入AAV产生基因,从成本和工序的观点出发,缺乏扩大规模的适应性。通过使用本发明的AAV产生细胞,能够抑制基因导入的成本和工序,能够制作治疗时所需的大量的AAV。
本说明书中,启动子是指能够使RNA聚合酶键合,且参与编码序列或非编码序列的转印开始的DNA控制区域/序列。
本说明书中,载体是指为了将外来遗传物质人工搬运到另一细胞而利用的DNA或RNA分子。若在细胞内导入包含想要导入的外来遗传物质的载体,则在细胞内进行外来遗传物质的复制和/或表达。作为载体,可举出附加型(例如质粒)载体及非附加型载体。载体能够通过转染、转导、细胞融合及脂质转染等方法导入宿主细胞中。
本说明书中,某一基因天然保持的启动子是指已知在天然状态下而并非人工状态下表达该基因的启动子。
(第一载体)
第一载体包含1个以上的病毒辅助基因,上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下。
作为可表达调控的启动子,可以使用能够通过刺激的有无来调控表达的开启与关闭的启动子。作为刺激,能够举出化学性刺激(内源性激素/应激响应、乳糖、四环素或其衍生物(例如,多西环素)、枯铭酸、蛋白质(雷帕霉素、FKCsA、脱落酸(ABA)等)、他莫昔芬/Cre-loxP(使用以能够通过他莫昔芬来诱导激活的方式进行了改变的Cre启动子的系统)、核糖开关)、物理性刺激(蓝色光、热)等,但并无特别限定。
优选第一载体中的可表达调控的启动子为通过药剂可表达调控的启动子。作为药剂,优选为四环素或其衍生物(例如,多西环素)。
作为可表达调控的启动子,能够举出四环素响应性启动子、RU486诱导性启动子、蜕皮素诱导性启动子、雷帕霉素诱导性启动子及金属硫蛋白启动子等。具体的四环素响应性启动子中,可举出Tet开启/关闭系统(TET Systems GmbH&Co.KG制)。
第一载体中的可表达调控的启动子尤其优选为通过四环素可表达调控的启动子即Tet开启/关闭系统,最优选为Tet开启系统。启动子并无特别限定,但能够举出来源于巨细胞病毒的启动子(根据所需包含增强子)、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子、逆转录病毒的劳斯肉瘤病毒LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子及磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子、H1启动子(RNA Polymerase(聚合酶)III启动子)、U6启动子(RNA PolymeraseIII启动子)等。
作为用于VA-RNA基因表达调控用的Tet开启系统的启动子,可以是H1启动子(RNAPolymeraseIII启动子)。
在Tet开启系统中,启动子附加地包含至少一个Tet操纵子。通过使用Tet操纵子(四环素控制转印激活),能够在作为抗生素的四环素或其衍生物中的一个(例如,多西环素)的存在下可逆地切换转印的开启或关闭。在细胞内存在的Tet阻遏蛋白质通过键合于导入启动子的Tet operator(tet操纵子)序列来阻断表达。因此,在Tet阻遏与Tet operator序列键合的情况下,看不到基因表达。若添加四环素或多西环素,则Tet阻遏被隔离而能够进行启动子活性,开启基因表达。Tet操纵子系统可广泛地获取,例如能够从Invitrogen(英杰公司)获取的pcDNA(商标)4/TO哺乳动物表达载体中使用的Tet操纵子等。
在Tet开启系统中,Tet operator序列可以在想要调控表达的启动子的上游也可以在下游。在关闭表达时减少表达泄露的点上,Tet operator序列优选在可表达调控的启动子的下游。
病毒辅助基因是指用于能够进行腺相关病毒的复制及包装的非腺相关病毒基因。作为病毒辅助基因,使用来源于腺相关病毒以外的其他种类的病毒的基因。作为病毒辅助基因的具体例,能够举出来源于腺病毒或疱疹病毒的病毒辅助基因,病毒辅助基因优选来源于腺病毒。
腺病毒是指腺病毒科家族的具有包含双链DNA的二十面体核衣壳的非包膜型病毒。从人类分离超过50种的腺病毒的亚型,从其他哺乳动物及鸟类分离许多其他亚型。这些亚型属于腺病毒科的家族,分类为2个属(即哺乳动物腺病毒属及禽腺病毒属)。这些腺病毒在形态学上及结构上相似。然而,在人类中,腺病毒表示不同的免疫学特性,即分类为血清型。重点研究腺病毒的2个人血清型(即Ad2及Ad5)。
来源于腺病毒的病毒辅助基因是参与腺相关病毒的复制及包装的基因。作为来源于腺病毒的病毒辅助基因,能够举出E1A基因、E1B基因、E2A基因、E4基因及VA-RNA基因等。
优选在第一载体中包含的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA-RNA基因。
更优选在第一载体中包含的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因。
E4基因优选为E4ORF6基因。
VA-RNA基因优选为VA-RNAI基因。
来源于腺病毒的病毒辅助基因(E1A基因、E1B基因、E2A基因、E4基因及VA-RNA基因等)可以是野生型基因,但只要发挥本来具有的功能,则可以使用对野生型基因进行了碱基的取代、缺失、插入或附加等改变的基因。
在对野生型病毒辅助基因进行碱基的取代、缺失、插入或附加等改变的情况下,改变的碱基的个数优选为1~20个,更优选为1~10个,进一步优选为1~3个。经改变的病毒辅助基因的碱基序列与野生型病毒辅助基因的碱基序列优选表示85%以上的序列同源性,更优选表示90%以上的序列同源性,进一步优选表示95%以上的序列同源性,更进一步优选表示98%以上的序列同源性。
在第一载体包含E4基因及VA-RNA基因的情况下,其配置并无特别限定,E4基因可以位于VA-RNA基因的上游,也可以位于VA-RNA基因的下游,但优选E4基因位于VA-RNA基因的上游。
第一载体中包含的病毒辅助基因在可表达调控的启动子的控制下。
第一载体中包含的病毒辅助基因中,优选E2基因不在可表达调控的启动子的控制下。
第一载体中包含的病毒辅助基因中,可以是只有E4基因在可表达调控的启动子的控制下。第一载体中包含的病毒辅助基因中,也可以是只有VA-RNA基因在可表达调控的启动子的控制下。优选在第一载体中包含的病毒辅助基因中,E4基因及VA-RNA基因在可表达调控的启动子的控制下。
作为第一载体,只要包含核酸则并无限定,但能够使用例如质粒载体、人工染色体载体、病毒载体、具有人工设计的核酸的载体等,优选为质粒载体。
(第二载体)
第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因,上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
腺相关病毒(AAV)是指细小病毒科及依赖性细小病毒属的家族的包含单链DNA的小型的能够复制的不完全的非包膜型病毒。在AAV中存在超过100种的血清型,可知根据血清型的不同,宿主范围或病毒所具有的特征不同。血清型2(AAV2)是自古以来被广泛研究的血清型中的一个,已知宿主范围非常广泛。血清型1(AAV1)、血清型5(AAV5)、血清型6(AAV6)是具有更高的组织指向性的血清型。可以说AAV1对肌肉、肝脏、呼吸道、中枢神经系统等的基因导入效率高,AAV5对中枢神经系统、肝脏、视网膜等的基因导入效率高,AAV6对心脏、肌肉、肝脏等的基因导入效率高。本发明优选使用血清型2或血清型5。尤其优选血清型5。
腺相关病毒基因是指由来源于一个或多个腺相关病毒的血清型的一个或多个核酸序列构成的基因。腺相关病毒基因优选为参与AAV的复制及包装的基因及编码AAV构成蛋白质的基因。
优选在第二载体中,所有腺相关病毒基因中的任一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
优选在第二载体中,不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因中的任一个在启动子的控制下,更优选在腺相关病毒基因天然保持的启动子的控制下。
优选在第二载体中,所有腺相关病毒基因不在表达调控启动子的控制下,更优选在所有腺相关病毒基因天然保持的启动子的控制下。
作为rep基因天然保持的启动子,能够举出p5及p19启动子。作为cap基因天然保持的启动子,能够举出p40启动子。
优选第二载体中包含的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因。
腺相关病毒基因(rep基因及cap基因等)可以是野生型基因,但只要发挥本来所具有的功能,则可以使用对野生型基因进行了碱基的取代、缺失、插入或附加等改变的基因。
在对野生型腺相关病毒基因(rep基因及cap基因等)进行碱基的取代、缺失、插入或附加等改变的情况下,改变的碱基的个数优选为1~20个,更优选为1~10个,进一步优选为1~3个。经改变的腺相关病毒基因的碱基序列与野生型腺相关病毒基因的碱基序列优选表示85%以上的序列同源性,更优选表示90%以上的序列同源性,进一步优选表示95%以上的序列同源性,更进一步优选表示98%以上的序列同源性。
在第二载体包含rep基因及cap基因的情况下,其配置并无特别限定,rep基因可以位于cap基因的上游,也可以位于cap基因的下游,但优选rep基因位于cap基因的上游。
rep基因是指本领域技术人员公知的编码病毒基因组的复制中集中所需的病毒的复制蛋白质、或者例如人类疱疹病毒6(HHV-6)rep基因等(公知介导AAV-2DNA复制)其功能性同系物的AAV基因组的区域。因此,rep基因的编码区域至少包含编码AAV的REP78及REP68(“长形态的REP蛋白质”)以及REP52及REP40(“短形态的REP蛋白质”)的基因或其功能性同系物。本发明中使用的rep基因的编码区域可以来源于任何AAV血清型,但优选来源于AAV2。作为来源于AAV2的编码区域,可举出REP78及REP68以及REP52及REP40、ITR。
cap基因是指本领域技术人员公知的编码病毒的衣壳蛋白质的AAV基因组中的区域。这些衣壳蛋白质的例子为AAV衣壳蛋白质VP1、VP2及VP3。本发明中使用的cap基因可以来源于任何AAV血清型,但优选来源于AAV2或AAV5。尤其优选为AAV5。
优选在第二载体中包含的腺相关病毒基因中,不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因为rep基因。
作为第二载体,只要包含核酸则并无限定,但能够使用例如质粒载体、人工染色体载体、病毒载体、具有人工设计的核酸的载体等,优选为质粒载体。
<整合载体>
本发明进一步涉及一种整合载体,所述整合载体以连结的状态具有:第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下;及第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。连结的状态是指直接或利用另一序列间接连接的状态。在第一载体或第二载体为环状时,通过切断载体序列的一部分而成为直链状,能够将连结的载体设为整合载体。
作为本发明的整合载体,可以是如实施例中所使用的图11中表示结构的Seq43那样合成了全碱基序列的载体。在图11所示的载体中,E4基因及其上游的启动子以及VA-RNA基因及其上游的启动子对应于第一载体,rep基因以及cap基因及其上游的启动子对应于第二载体,在图11所示的整合载体中,第一载体和第二载体以连结的状态存在。
作为整合载体,只要包含核酸则并无限定,但能够使用例如质粒载体、人工染色体载体、病毒载体等,优选为质粒载体。
整合载体中的第一载体及第二载体的结构在本说明书中如上述<试剂盒>中所说明那样。
本发明的整合载体可以进一步具有包含所期望的治疗或预防基因的第三载体。在第三载体为环状时,通过切断载体序列的一部分而成为直链状,能够将连结的载体设为整合载体。
第三载体是包含所期望的治疗或预防基因的载体。
作为治疗或预防基因,能够使用靶细胞的基因组中不完全或缺失的基因、或者编码具有所期望的生物学或治疗效果(例如抗病毒功能)的非天然蛋白质的基因等,但并无特别限定。作为治疗或预防基因的具体例,可举出为了炎症性疾病、自身免疫、慢性及传染性疾病(包含AIDS、癌、神经系统疾病、心血管疾病、高胆固醇血症等障碍)、贫血及血友病等各种血液疾病、基因缺损(例如囊胞性纤维形成、戈谢病、腺苷脱氨酶(ADA)缺损、气肿等)的治疗或预防而使用的基因。
作为治疗或预防基因,也可以是对癌及病毒疾病的反义疗法中有用的一些反义寡核苷酸(例如对mRNA的翻译开始部位(AUG密码子)周边的序列的互补短链寡核苷酸)。
第三载体可以包含用于表达治疗或预防基因的启动子。用于表达治疗或预防基因的启动子并无特别限定,但能够举出来源于巨细胞病毒的启动子(根据所需包含增强子)、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子、逆转录病毒的劳斯肉瘤病毒LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子及磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子等。治疗或预防基因及用于表达基因的启动子优选被ITR序列夹着。
作为第三载体,只要包含核酸则并无限定,但能够使用例如质粒、人工染色体、病毒等,优选为质粒。
<细胞>
本发明涉及一种具有上述的第一载体及第二载体的细胞。本发明进一步涉及一种具有上述的整合载体的细胞。本发明进一步涉及一种具有第一载体、第二载体及第三载体的细胞。
细胞优选为真核细胞,更优选为哺乳动物细胞。作为哺乳动物细胞,例如能够举出人体细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猴细胞、仓鼠细胞等,但并无特别限定。能够优选使用人体细胞。作为细胞的例子,可举出小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、NIH3T3、PC12、BHK(乳儿仓鼠肾脏细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS(例如COS1及COS7)、QC1-3、HEK293(来源于人类胎儿的肾脏细胞)、VERO、PER.C6、HeLa、EB1、EB2、EB3、肿瘤溶解性或杂交瘤细胞系。优选细胞为HEK293细胞、CHO细胞,更优选为HEK293细胞。
本发明的细胞优选具有第一载体及第二载体,或者整合载体。并且,优选在染色体中具有第一载体、第二载体及第三载体。所谓在染色体中具有,是指载体的全长或一部分整合到染色体中。能够通过进行基因组序列分析,并且载体中的序列与宿主基因组键合来确认整合到染色体中。通过载体整合到染色体中,腺相关病毒的产生所需的基因恒定地维持在细胞内,能够在任意的时间点产生腺相关病毒。
关于本发明的细胞,将第一载体和第二载体、整合载体、或者第一载体和第二载体和第三载体引入细胞内之后,能够将所述所导入的载体中的腺相关病毒的产生所需的基因在细胞内保持1周以上。因此,将导入了所述载体的细胞培养1周以上之后,能够产生腺相关载体。优选培养2周以上之后,能够产生腺相关载体,更优选培养1个月以上之后,能够产生腺相关载体。
<用于产生腺相关病毒的细胞的制造方法>
根据本发明,提供一种用于产生腺相关病毒的细胞的制造方法,所述方法包括如下:将第一载体和第二载体导入细胞中,所述第一载体包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下,所述第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因,并且上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。提供一种进一步包含第三载体的用于产生腺相关病毒的细胞的制造方法。第一载体、第二载体及第三载体的结构在本说明书中如上述<试剂盒>中所说明那样。只要第一载体、第二载体及第三载体以进行表达的方式被导入即可,但更优选成为永久性表达。永久性表达是指,在细胞分裂的情况下,第一载体、第二载体及第三载体也被复制,分裂后的细胞也具有第一载体、第二载体及第三载体。关于永久性表达,能够通过载体整合到细胞的染色体中或者使用具有在细胞质内复制的能力的载体来进行。
第一载体及第二载体能够通过转染、转导、脂质转染等方法导入细胞中。
所谓转染,是指通过化学手段(例如,磷酸钙介导沉淀)、机械手段(例如,电穿孔)或物理手段(例如,基于生物弹道(bioballistic)的递送)横穿真核细胞的膜并将核酸导入细胞中。
所谓转导,是指经由来源于病毒的载体,横穿真核细胞的膜并将核酸导入细胞中。
所谓脂质转染,是指通过电相互作用形成载体和正电荷脂质等的复合体,通过内吞作用或膜融合将核酸导入细胞中。
<腺相关病毒的制造方法>
作为基于本发明的腺相关病毒的制造方法的一例,可举出包括如下工序的方法:
培养包含第一载体、第二载体,必要时包含第三载体的细胞的工序,所述第一载体包含1个以上的病毒辅助基因,并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下,所述第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因,并且上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下,所述第三载体,包含所期望的治疗或预防基因;及
通过使上述可表达调控的启动子进行动作来表达在可表达调控的启动子的控制下的病毒辅助基因的工序。
关于第一载体、第二载体及第三载体的结构,在本说明书中如上所述。关于细胞,也在本说明书中如上所述。
为了使可表达调控的启动子进行动作,例如在使用能够通过刺激来调控表达的开启及关闭的启动子的情况下,通过赋予刺激或者去除刺激而能够将表达调控为开启及关闭。
作为基于本发明的腺相关病毒的制造方法的另一例,可举出包括如下工序的方法:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分和腺相关病毒基因的一部分导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在上述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因、在上述第一工序中所获得的细胞不包含的腺相关病毒基因、及必要时将所期望的治疗或预防基因导入在上述第二工序中所获得的细胞中;以及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
关于病毒辅助基因、腺相关病毒基因及治疗或预防基因的详细内容,在本说明书中如上所述。并且,关于将基因导入细胞中的方法,也在本说明书中如上所述。
优选在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因,在第三工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为cap基因,更优选在第三工序中进一步导入治疗或预防基因。
作为基于本发明的腺相关病毒的制造方法的又一例,可举出包括如下工序的方法:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分、腺相关病毒基因,必要时将所期望的治疗或预防基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在上述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因导入在上述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
关于病毒辅助基因、腺相关病毒基因及治疗或预防基因的详细内容,在本说明书中如上所述。并且,关于将核基因导入细胞中的方法,也在本说明书中如上所述。
在第二工序中细胞的倍增时间只要是200小时以内即可,优选为100小时以内,更优选为50小时以内,尤其优选为30小时以内。
在第二工序中细胞生存率只要是65%以上即可,优选为80%以上,更优选为95%以上。
优选在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因。
作为基于本发明的腺相关病毒的制造方法的又一例,可举出包括如下工序的方法:
第一工序,将腺相关病毒基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将病毒辅助基因,必要时将所期望的治疗或预防基因导入在上述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
关于病毒辅助基因、腺相关病毒基因及治疗或预防基因的详细内容,在本说明书中如上所述。并且,关于将核基因导入细胞中的方法,也在本说明书中如上所述。
优选在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA-RNA基因。
作为基于本发明的腺相关病毒的制造方法的又一例,可举出包括如下工序的方法:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分,必要时将所期望的治疗或预防基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在上述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因、腺相关病毒基因导入在所述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
关于病毒辅助基因、腺相关病毒基因及治疗或预防基因的详细内容,在本说明书中如上所述。并且,关于将核基因导入细胞中的方法,也在本说明书中如上所述。
优选在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因,在第三工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因。
基于本发明的腺相关病毒的制造方法中的细胞的培养能够在用于细胞培养的通常条件下进行。关于使用的培养基及培养条件,只要是本领域技术人员,则能够适当地进行选择。作为培养基,能够使用Expi29 Expression Medium(表达培养基)(Thermo FisherScientific,A1435101)、含有10%(vol/vol)胎牛血清(FBS)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、无血清UltraCULTURE(商标)培养基(Lonza)等,但并无特别限定。
培养温度一般为25℃~45℃,优选为30℃~42℃,更优选为35℃~40℃,作为一例,为37℃。
CO2浓度一般为3~10%CO2,优选为5~10%CO2,作为一例,为8%CO2。
细胞能够在任意体积的培养基中进行培养,例如能够在1mL至2000L的培养基中培养细胞,优选为1L~2000L,更优选为50L~2000L,尤其优选为500L~2000L。
可以一边进行振荡搅拌一边进行培养。振荡搅拌时的搅拌速度一般为50rpm~200rpm,优选为80~150rpm。
搅拌培养可以是利用反应器内的螺旋桨等的旋转搅拌培养。旋转搅拌时的搅拌速度一般为50rpm~200rpm,优选为80~150rpm。并且,可以通过波型振荡搅拌或搅拌叶片的上下移动来进行搅拌,并无特别限定。
各工序中的培养时间并无特别限定,但一般为6小时~14天,优选为12小时~7天,更优选为24小时~144小时,进一步优选为24小时~96小时。
所制造的腺相关病毒的滴度能够通过本领域技术人员公知的通常方法来测定。例如,回收培养后的细胞培养液,并利用冻结熔解破碎细胞之后,通过离心分离回收上清液。通过在回收的上清液中添加MgCl2及Benzonase(核酸酶)而进行反应,从而能够消化gDNA(基因组DNA)和残留质粒。将包含通过上述获得的腺相关病毒的样品用作ddPCR(DropletDigital PCR:微滴式数字PCR)样品,能够通过进行ddPCR来测定AAV的滴度。
通过以下实施例对本发明进行更具体的说明,但本发明并不受实施例的限定。
实施例
[材料及方法]
<细胞培养>
将浮动化HEK293细胞(Thermo Fisher Scientific,R79007)在12mL的Expi29Expression Medium(Thermo Fisher Scientific,A1435101)中以成为1×107cells/mL的方式进行悬浮,并在125mL振荡烧瓶中培养了24小时。培养液以120rpm恒定地进行搅拌的同时,在37℃、8%CO2条件下进行了孵化。
<质粒>
使用了AAVpro(注册商标)Helper Free System(无辅助病毒系统)(AAV5)(TakaraBio Inc.,6650)(Seq1、Seq2、Seq16)。
以序列表的序列号1~16、20~23表示所使用的质粒(Seq1~Seq16、Seq20~Seq23)的整体序列。
在AAVpro Helper Free System(AAV5)中,作为载体序列,包含pAAV-CMV Vector(载体)(seq16)、pRC5 Vector(seq2)及pHelper Vector(seq1)。
pRC5 Vector:包含AAV5的rep基因及AAV5的cap基因的质粒
pHelper Vector:包含来源于腺病毒的E2A基因、E4基因、VA-RNA基因的质粒
seq1(E2、E4、VA-RNA):放入AAVpro Helper Free System(AAV5)试剂盒中的pHelper Vector、包含来源于腺病毒的E2A基因、E4基因、VA-RNA基因的质粒
seq2(REP、CAP):放入AAVpro Helper Free System(AAV5)试剂盒中的pRCVector、包含AAV5的rep基因及AAV5的cap基因的质粒
seq3(ΔREP):以seq2为基础通过反向PCR去除rep基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq4(ΔCAP):以seq2为基础通过反向PCR去除cap基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq5(ΔE2):以seq1为基础通过反向PCR去除E2基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq6(ΔE4):以seq1为基础通过反向PCR去除E4基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq7(ΔVA-RNA):以seq1为基础通过反向PCR去除VA-RNA基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq8(REP):为与seq4相同的序列。
seq9(CAP):为与seq3相同的序列。
seq10(E2):合成E2基因序列,并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)。
seq11(E4):合成E4基因序列,并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)。
seq12(VA-RNA):合成VA-RNA基因序列,并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)。
seq13(E4ORF6):通过PCR扩增E4ORF6基因的区域,并插入到pEBMulti-Neo载体(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)的ApaI/XbaI位点的质粒。
seq14(VA-I):以seq1为基础通过反向PCR去除VA-RNAIII基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq15(VA-II):以seq1为基础通过反向PCR去除VA-RNAI基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq16:放入AAVpro Helper Free System(AAV5)试剂盒中的pAAV-CMV Vector、包含用于在CMV启动子及其下游插入目标基因的MCS以及2个ITR的载体质粒。
seq20(empty):以seq1为基础通过反向PCR去除E2基因、E4基因、VA-RNA基因编码区域,并通过自身环化进行了再环状化的质粒。
seq21(Switch1―VAI):合成连接了H1启动子(RNA polymerase III启动子)与VA-RNAI(VAI)基因的序列,并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)。Switch1―VAI成为在RNA polymerase III启动子下游整合了Tet操纵子序列的结构。
seq22(Switch2―VAI):合成连接了U6启动子(RNA polymerase III启动子)与VA-RNAI(VAI)基因的序列,并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)。Switch1―VAI成为在RNA polymerase III启动子上游整合了Tet操纵子序列的结构。
seq23(tTS):将合成的四环素调控性的转印沉默子(tTS)基因插入到pLVSIN-CMVHyg载体的ClaI-XbaI位点的质粒(GENEWIZ)。
Seq38(Switch―E4ORF6―Switch1―VAI―tTS):对编码了合成的E4ORF6基因序列的质粒(GENEWIZ),插入了利用PCR扩增的Switch1―VAI、tTS。
Seq39(nRCp5):用Bsp14071/BglII对pRC5 Vector(seq2)进行限制酶处理,制作了rep-cap片段。在AAVS1 Safe Harbor cDNA/miRNA Donor Vector(pAAVS1D-PGK.MSC-Ef1α.copGFPpuro)(SBI公司、GE603A-1)的Bsp14071/BglII位点之间交换rep-cap片段,并通过结扎进行再环状化,rep-cap敲入用质粒。
Seq40(p5RCp5):将合成的p5启动子序列插入到Seq39的质粒。在rep-cap基因的前后具有p5启动子序列。
Seq41(E2-GOI):合成夹在E2基因及AAV ITR序列的GFP基因、puromycin(嘌呤霉素)抗性基因以及具有piggyBac转座子序列的基因序列并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)。
Seq42:合成piggyBac转座酶基因序列,并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)。
Seq43(all-in-one):整合了通过合成制作的REP基因、CAP基因、E2基因、Switch―E4ORF6、Switch1―VAI、tTS的质粒。在图11中示出seq43的质粒图。
<基于PCR反应的质粒制作>
对铸模10pg DNA混合终浓度0.2μmol/L的Primer(底漆)1及Primer2、PrimeSTARMax Premix(1×),用无核酸酶水(Thermo Fisher Scientific,10977015)制备为总量50μL。以下示出前述质粒制作中所使用的primer1及primer2。以序列表的序列号24~37表示seq24~seq37的碱基序列。
用反向PCR制作seq3和seq4时,作为铸模使用了seq2的质粒,用反向PCR制作seq5~7、seq14、seq15、seq20时,作为铸模使用了seq1。以下示出(所制作的质粒):(在反向PCR中使用的底漆组)。
seq3:seq24及seq25
seq4:seq26及seq27
seq5:seq28及seq29
seq6:seq30及seq31
seq7:seq32及seq33
seq14:seq34及seq35
seq15:seq36及seq37
seq20:seq29及seq32
使所制备的样品在98℃下反应了10秒,在55℃下反应了15秒,在72℃下以5秒/kbp反映了30个循环。在用限制酶NotI(TOYOBO CO.,LTD.,NOT-111X)切断反应物之后,通过E.Coli(Takara Bio Inc.,9128)扩增了通过T4DNA Ligase(连接酶)(Takara Bio Inc.,2011A)环状化的质粒。
<基因导入方法及细胞毒性评价>
在1.8mL的Expi29 Expression Medium中等量混合Polyethylenimine(聚乙烯亚胺)(PEI)(PolyPlus-transfection SAS,115-0015)36μL和后述组合的质粒,悬浮出总量18μg,并静放了15分钟。之后,在前一天以细胞浓度1x107cells/mL进行了播种的培养细胞(培养液量为12mL)中添加上述试剂,在37℃、8%CO2条件下进行了孵化。
关于导入细胞的毒性,在基因导入后day4(第4天)、day7(第7天)、day11(第11天),根据基于trypan blue染色的细胞的生存率实施了评价。以细胞毒性率(%)=100-(细胞的生存率)进行了计算。
<Western blot(蛋白印迹)>
通过离心分离回收细胞,用RIPA Buffer(缓冲液)进行了溶解。在细胞溶液中添加Sample Buffer(样品缓冲液)(NACALAI,09499-14),在100℃下加热5分钟而制备了样品。使用十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶电泳装置(ATTO Corporation.,2321670)将样品中的蛋白质进行尺寸分离之后,使用半干印迹装置(ATTO Corporation.,2322490)对膜进行了转印。转印后的膜使用Blocking One(NACALAI TESQUE,INC.,03953-95)封闭30分钟之后,利用用封闭溶液稀释成70倍的抗REP抗体(OriGene Technologies)、与衣壳的结构蛋白质反应的抗VP抗体(PROGEN Biotechnik GmbH)、抗β-Actin(肌动蛋白)抗体(Abcam)在常温下反映了3小时。接着,作为第二抗体将用封闭溶液稀释成10,000倍的anti-mouse(抗小鼠)IgG-HRP(Cytiva)在常温下反应2小时之后,通过SuperSignal West Femto Maximum SensitivitySubstrate(SuperSignal West Femto最高灵敏度底物)(Thermo Fisher Scientific,34095)检测出REP蛋白质及衣壳的结构蛋白质(VP1、VP2、VP3)。在摄影中使用了WSE-6100LuminoGraphI(ATTO Corporation.,2006100)。在获取图像的分析中使用ImageJ实施了定量评价。
<测定AAV滴度>
回收在基因导入后在72小时、37℃、8%CO2条件下进行了培养的HEK细胞培养液,通过-80℃下的冻结熔解破碎了细胞。之后,通过13,800×g的离心分离回收上清液,并添加终浓度2mmol/L的MgCl2、25U/mL的Benzonase,在37℃下进行2小时的反应,从而消化了gDNA(基因组DNA)或残留质粒。反应后的样品以在95℃下15分钟、70℃下3分钟、40℃下3分钟、20℃下3分钟的顺序进行孵化,使Benzonase失活,将其制成ddPCR(Droplet Digital PCR)样品。ddPCR样品用TE buffer(pH8.0,含有0.05%Pluronic F-68及10μg/mL牛胸腺DNA)稀释成50倍。在冰上软管中混合ddPCRtm Supermix for Probes(no dUTP)(BIORAD公司)10μL、已稀释的ddPCR样品2μL、底漆(seq17、seq18、最终浓度900nmol/L)及探针(seq19、最终浓度250nmol/L)、无核酸酶水(Thermo Fisher Scientific,10977015),调整为总液量22μL,进行了ddPCR。以序列表的序列号17~19表示seq17、seq18及seq19的序列。
在ddPCR中,利用微滴形成设备从制备液形成微滴,接着以95℃下10分钟、94℃下30秒及将55℃进行40个循环、98℃下10分钟的顺序进行了孵化。通过微滴阅读仪进行测定,计算出AAV基因组滴度(vg/mL)。
<建立细胞株>
在1.8mL的Expi29 Expression Medium中等量混合Polyethylenimine(PEI)(PolyPlus-transfection SAS,115-0015)36μL和后述组合的质粒,悬浮出总量18μg,并静放了15分钟。之后,在前一天以细胞浓度1x107cells/mL进行了播种的培养细胞(培养液量为12mL)中添加上述试剂,在37℃、8%CO2条件下进行了孵化。将导入了基因的细胞维持培养3周,使用流式细胞仪在单细胞中分离了RFP或GFP荧光正电细胞。分离的细胞悬浮于含有10%胎牛血清的DMEM中,在6孔板上37℃、8%CO2条件下培养1个月,建立了细胞株。
[结果]
在图1中示出以以下组合将基因导入HEK293细胞中并评价了细胞毒性性的结果。
Type(类型):seq1、seq2
Mock:seq20
仅PEI:无基因
ΔREP:seq1、seq3
ΔCAP:seq1、seq4
ΔE2:seq2、seq5
ΔE4:seq2、seq6
ΔVA-RNA:seq2、seq7
细胞毒性率(以下,从左表示Day4、Day7、Day11的细胞毒性率)
Type:38.0%、66.6%、69.6%
Mock:11.0%、8.3%、6.9%
仅PEI:12.4%、7.1%、6.3%
ΔREP:39.1%、69.2%、60.4%
ΔCAP:37.0%、61.2%、54.3%
ΔE2:24.7%、30.6%、13.3%
ΔE4:14.0%、14.8%、7.4%
ΔVA-RNA:13.1%、10.2%、5.2%
根据图1的结果,在Day11中,通过除去E2基因、E4基因、VA-RNA基因减少了细胞毒性。
而且,从图1的结果确认到,没有E4基因,VA-RNA基因,由此能够避免细胞的毒性。
在图2中示出以以下组合将基因导入HEK293细胞中并评价了蛋白质表达的结果。
Type(类型):seq1、seq2
ΔHelper:seq2
ΔE2:seq2、seq5
ΔE4:seq2、seq6
ΔVA-RNA:seq2、seq7
从对图2及图2的带进行了定量的表1的结果确认到,通过除去辅助基因来抑制REP蛋白质及衣壳结构蛋白质的表达。确认到在辅助基因中,也可依赖于E4基因、VA-RNA基因来控制REP(有细胞毒性)的表达。
[表1]
相对于类型的表达量比(各种蛋白质/Loading control(加载控制))
REP78 | REP52 | VP1 | VP2 | VP3 | |
类型 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
ΔHelper | 0.17 | 0.19 | 0.08 | 0.05 | 0.11 |
ΔE2 | 0.49 | 0.74 | 0.10 | 0.14 | 0.89 |
ΔE4 | 0.18 | 0.19 | 0.10 | 0.10 | 0.31 |
ΔVA-RNA | 0.22 | 0.22 | 0.11 | 0.08 | 0.12 |
在图3中示出以以下组合将基因导入HEK293细胞中并评价了细胞毒性性的结果。
Type(类型):seq1、seq2
Mock:seq20
REP:seq8
CAP:seq9
E2:seq10
E4:seq11
VA-RNA:seq12
REP+CAP:seq2
细胞毒性率(以下,从左表示Day4、Day7的细胞毒性率)
Type:36.0%、62.1%
Mock:5.2%、6.7%
REP:9.7%、7.9%
CAP:10.4%、6.1%
E2:11.6%、12.9%
E4:36.9%、60.1%
VA-RNA:9.9%、52.7%
REP+CAP:15.6%、8.8%
从图3的结果确认到,E4基因,VA-RNA基因即使单独导入也具有细胞损坏性,需要控制其表达。
在图4中示出以以下组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
Type:seq1、seq2、seq16
-E4:seq2、seq6、seq16
+E4:seq2、seq6、seq11、seq16
+E4ORF6:seq2、seq6、seq13、seq16
病毒量(vg/mL)
Type:5.5×108
ΔE4:2.1×108
+E4:5.5×108
+E4ORF6:4.7×108
从图4的结果确认到,只有E4ORF6基因也产生与导入了E4基因时相同程度的病毒,且能够代替E4基因的功能。
在图5中示出以以下组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。
Type:seq1、seq2、seq16
-VA-RNA:seq2、seq7、seq16
+VA-RNAI:seq2、seq14、seq16
+VA-RNAII:seq2、seq15、seq16
病毒量(vg/mL)
Type:1.4×109
ΔVA-RNA:4.3×109
+VA-RNAI:1.3×109
+VA-RNAII:4.3×109
从图5的结果确认到,只有VA-RNAI(VAI)基因也表达与导入了VA-RNA基因时相同的程度,且能够代替VA-RNA基因的功能。
在图6中示出以以下组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。并且,在“Switch1―VAI+DOX”及“Switch2―VAI+DOX”样品中导入基因之后,添加了终浓度0.5μg/mL的doxycycline(多西环素)(DOX)。添加DOX之后,对培养了72小时的HEK293细胞的AAV基因组滴度进行了评价。
Type:seq1、seq2、seq16
ΔVA-RNA:seq2、seq7、seq16
Switch1―VAI:seq2、seq7、seq16、seq21、seq23
Switch2―VAI:seq2、seq7、seq16、seq22、seq23
病毒量(vg/mL)
Type:6.7×108
-VA-RNA:5.6×107
Switch1―VAI+DOX:8.2×107
Switch1―VAI-DOX:3.2×108
Switch2―VAI+DOX:3.5×108
Switch2―VAI-DOX:9.9×108
从图6的结果确认到,通过DOX添加,AAV产生量得到提高。确认到通过使用Switch1,与Switch2相比,在不添加DOX时能够抑制AAV产生。并且,确认到与Switch1相比,通过使用Switch2,可增加AAV的产生。得知通过使用利用了Switch2的VA-1,与不加入Switch的Type相比,通过添加DOX来增加表达。从在不添加DOX时能够抑制AAV产生的观点出发,更优选Switch1。
在图7中示出以seq2、seq10、seq16、seq38的组合将基因导入HEK293细胞中并评价了AAV滴度的结果。并且,在“+DOX”样品中导入基因之后,添加了终浓度0.5μg/mL的doxycycline(DOX)。添加DOX之后,对培养了72小时的HEK293细胞的AAV基因组滴度进行了评价。
病毒量(vg/mL)
-DOX:7.4×107
+DOX:3.2×108
在HEK293细胞中导入seq39或seq40和Cas9 SmartNuclease AAVS1-gRNATargeting Vector(SBI公司、CAS601A-1),从而建立了稳定表达株。在图8中示出对建立细胞以以下组合导入质粒并评价了AAV滴度的结果。
nRCp5:rep-cap基因插入细胞、seq1、seq20、seq16
p5RCp5:p5前后附加rep-cap基因插入细胞、seq1、seq20、seq16
对上述中建立的rep-cap株进行了1个月的培养。之后,通过使用了以仅在载体序列存在时扩增的方式设计的底漆及探针的微滴数字PCR法,确认在将从细胞中提取的染色体设为模板的情况下进行PCR扩增,由此确认到导入的序列被整合到细胞的染色体中。
病毒量(vg/cell)
nRCp5:9.9×101
p5RCp5:1.6×102
从图8的结果确认到,能够建立插入了不进行表达控制的rep-cap基因的细胞株,而且,通过从后导入E2基因、E4基因、VA-RNA基因、GOI基因,能够产生AAV。
对p5RCp5实施NGS分析,通过读取细胞的序列,确认到rep基因及cap基因被整合到染色体中。
在HEK293细胞中导入seq41和seq42,从而建立了2株稳定表达株(E2-GOI#1、#2)。在图9中示出对建立细胞以seq2和seq5的组合导入质粒并评价了AAV滴度的结果。
对上述中建立的2株E2-GOI株进行了1个月的培养。之后,通过使用了以仅在载体序列存在时扩增的方式设计的底漆及探针的微滴数字PCR法,确认在将从细胞中提取的染色体设为模板的情况下进行PCR扩增,由此确认到导入的序列被整合到细胞的染色体中。
病毒量(vg/cell)
E2-GOI#1:2.1×103
E2-GOI#2:1.9×103
从图9的结果确认到,能够建立插入了E2基因-GOI基因的细胞株,而且,通过从后导入REP基因、CAP基因、E4基因、VA-RNA基因,能够产生AAV。
单独导入seq43,或者共同导入seq43和seq42而分别建立了细胞株。对于建立后经过了1.5个月的株,在“+DOX”样品中添加了终浓度0.5μg/mL的doxycycline(DOX)。添加DOX之后,对培养了72小时的细胞的AAV基因组滴度进行了评价。在图10中示出结果。
病毒量(vg/mL)
seq43株
#1-DOX:1.8×106
#1+DOX:5.0×106
seq43+seq42株
#1-DOX:8.7×105
#1+DOX:7.1×106
#2-DOX:3.5×106
#2+DOX:1.8×107
#3-DOX:2.1×105
#3+DOX:5.9×106。
Claims (30)
1.一种试剂盒,其包含:
第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下;及
第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其中,
第一载体中的可表达调控的启动子为通过药剂可表达调控的启动子。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其中,
第一载体中包含的病毒辅助基因来源于腺病毒。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒,其中,
第一载体中包含的病毒辅助基因中,E4基因及VA-RNA基因在可表达调控的启动子的控制下。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒,其中,
第一载体中包含的所有病毒辅助基因在可表达调控的启动子的控制下。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒,其中,
第一载体中包含的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA-RNA基因。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其中,
E4基因为E4ORF6基因。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒,其中,
VA-RNA基因为VA-RNAI基因。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的试剂盒,其中,
在第二载体中,所有腺相关病毒基因不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的试剂盒,其中,
在第二载体中,不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因中的任一个在腺相关病毒基因天然保持的启动子的控制下。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的试剂盒,其中,
第二载体中包含的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的试剂盒,其中,
第二载体中包含的腺相关病毒基因中,不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因为rep基因。
13.一种细胞,其具有权利要求1至12中任一项所述的试剂盒中包含的第一载体及第二载体。
14.根据权利要求13所述的细胞,其中,
细胞为人体细胞。
15.根据权利要求13或14所述的细胞,其中,
在染色体中具有所述第一载体和所述第二载体。
16.一种整合载体,其以连结的状态具有:
第一载体,包含1个以上的病毒辅助基因,并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下;及
第二载体,包含1个以上的腺相关病毒基因,并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
17.根据权利要求16所述的整合载体,其还具有:
第三载体,包含所期望的治疗或预防基因。
18.一种细胞,其具有权利要求16或17所述的整合载体。
19.根据权利要求18所述的细胞,其中,
细胞为人体细胞。
20.根据权利要求18或19所述的细胞,其中,
在染色体中具有所述整合载体。
21.一种用于产生腺相关病毒的细胞的制造方法,所述方法包括如下:
将第一载体和第二载体导入细胞中,所述第一载体包含1个以上的病毒辅助基因,并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下,所述第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因,并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
22.一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
培养包含第一载体、第二载体,必要时包含第三载体的细胞的工序,所述第一载体包含1个以上的病毒辅助基因,并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下,所述第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因,并且所述腺相关病毒基因的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下,所述第三载体包含所期望的治疗或预防基因;及
通过使所述可表达调控的启动子进行动作来表达在可表达调控的启动子的控制下的病毒辅助基因的工序。
23.一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分和腺相关病毒基因的一部分导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在所述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因、在所述第一工序中所获得的细胞不包含的腺相关病毒基因、及必要时将所期望的治疗或预防基因导入在所述第二工序中所获得的细胞中;以及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
24.根据权利要求23所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因,在第三工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为cap基因。
25.一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分、腺相关病毒基因,必要时将所期望的治疗或预防基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在所述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因导入在所述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
26.根据权利要求25所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因。
27.一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将腺相关病毒基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将病毒辅助基因,必要时将所期望的治疗或预防基因导入在所述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
28.根据权利要求27所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA-RNA基因。
29.一种腺相关病毒的制造方法,其包括:
第一工序,将病毒辅助基因的一部分,必要时将所期望的治疗或预防基因导入细胞中;
第二工序,培养在第一工序中所获得的细胞并使其增殖;
第三工序,将在所述第一工序中所获得的细胞不包含的病毒辅助基因、腺相关病毒基因导入在所述第二工序中所获得的细胞中;及
第四工序,培养在第三工序中所获得的细胞。
30.根据权利要求29所述的腺相关病毒的制造方法,其中,
在第一工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E2基因,在第三工序中导入细胞中的病毒辅助基因为E4基因及VA-RNA基因,在第三工序中导入细胞中的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因。
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