CN118119703A - 腺相关病毒的制造方法、细胞及表达载体 - Google Patents

腺相关病毒的制造方法、细胞及表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够提高腺相关病毒的产生量的腺相关病毒的制造方法，以及提供一种用于上述的腺相关病毒的制造方法中的细胞及表达载体。根据本发明，提供一种腺相关病毒的制造方法，其包括由外源启动子表达E4ORF6基因的步骤，其中，与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。

Description

腺相关病毒的制造方法、细胞及表达载体
技术领域
本发明涉及一种腺相关病毒的制造方法。此外，本发明涉及一种用于上述的腺相关病毒的制造方法中的细胞及表达载体。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus(也称为AAV))是属于细小病毒科的直链单链DNA病毒。野生型AAV基因组包含复制的调节基因(Rep基因)和衣壳的结构基因(Cap基因)，且为了病毒的复制和包装反向末端重复序列(ITR)相邻。AAV载体能够在增殖或非增殖的任一细胞中进行基因导入，尤其能够在非分裂细胞中进行长期的表达。并且，AAV被认为是非病原性，且免疫原性低。根据上述情况，AAV载体作为基因治疗用载体在临床应用上取得进展。
AAV为在腺病毒和疱疹病毒等辅助病毒的存在下增殖的非包膜病毒。在制备用于基因治疗或核酸导入的AAV时，经典的做法为使腺病毒与宿主细胞共感染而进行了AAV复制。并且，明确了负责腺病毒的辅助作用的基因，还使用携带有该基因的质粒。例如，通过使包含Rep基因及Cap基因的质粒、腺病毒辅助质粒及包含导入基因的质粒同时转染HEK293细胞而能够包装成重组型AAV(rAAV)。
在专利文献1中，记载有一种核酸分子，所述核酸分子包括：(a)编码AAV的REP蛋白质的碱基序列；(b)编码AAV的衣壳的结构蛋白质的碱基序列；(c)包含第一AAV的反向末端重复(ITR)的碱基序列；(d)包含第二AAV的反向末端重复(ITR)的碱基序列；(e)位于第一ITR与第二ITR之间的、用于插入编码外源的蛋白质的碱基序列的碱基序列或/和编码外源的蛋白质的碱基序列；(f)包含腺病毒的E2A区域的碱基序列；(g)包含腺病毒的E4区域的碱基序列；及(h)包含腺病毒的VA-RNA区域的碱基序列。
在专利文献2中，记载有包含至少4个不同的重组靶位点(RTS)、包含E1A、E1B或它们的组合的腺病毒(Ad)基因、及与Ad基因可操作地连接的启动子，且将RTS、Ad基因及启动子整合到染色体中的哺乳动物细胞、为了生成重组腺相关病毒(rAAV)生产(Producer)宿主细胞使用上述细胞的方法、以及使用AAV生产宿主细胞生产、包装及纯化rAAV的方法。
在专利文献3中，记载有一种双质粒系统，其包含辅助质粒及载体质粒，其中，辅助质粒包含编码至少1种功能性Rep蛋白质的至少1种Rep基因，且不包含编码Cap蛋白质的功能组的Cap基因。
在专利文献4中，记载有一种在哺乳动物宿主细胞中产生重组AAV病毒体的体外方法，其包括在转染培养基中孵化细胞的步骤，所述转染培养基包含：(i)含有包含腺病毒E2、E4ORF6、及VA-RNA基因的辅助质粒的附属(accessory)构建体；(ii)含有包含与1以上的调节序列可操作地连接的AAVRep及AAVCap的反式质粒(trans plasmid)的AAV辅助构建体；及(iii)含有包含相邻于以与1以上的调节序列可操作地连接为目的异源基因的AAV反向末端重复序列的质粒(pCis)的AAV载体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2020-188763号公报
专利文献2：日本特表2020-507331号公报
专利文献3：国际公开WO2020/208379号公报
专利文献4：美国专利公开US2016/0222356号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
在上述的现有技术中，在辅助质粒中编码E4基因区域，但是没有研究E4基因的表达量的最优化。本发明的课题在于提供一种能够提高腺相关病毒的产生量的腺相关病毒的制造方法。本发明的课题在于还提供一种用于上述的腺相关病毒的制造方法中的细胞及表达载体。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究的结果，发现了通过降低腺相关病毒产生所需的基因即E4ORF6的表达量，或通过降低E4ORF6基因导入细胞的量，能够提高腺相关病毒的产生量。本发明是基于上述见解而完成的。
根据本发明，提供以下发明。
＜1＞一种腺相关病毒的制造方法，其包括由外源启动子表达E4ORF6基因的步骤，其中，
与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA(聚A)信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。
＜2＞根据＜1＞所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4ORF6的表达的降低为E4ORF6的mRNA表达的降低和/或E4ORF6的蛋白质表达的降低。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、E4ORF6基因及PolyA序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达的量降低至1/2以下。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
通过以下的(a)至(e)中任一个以上的条件E4ORF6的表达降低。
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不使用Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不使用增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不使用PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
与Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量相比，E4ORF6基因导入细胞的量为1/2以下。
＜6＞一种腺相关病毒的制造方法，其包括将至少包含E4ORF6基因的E4区域导入细胞中的步骤，其中，
与Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量相比，E4ORF6基因导入细胞的量为1/2以下。
＜7＞根据＜6＞所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4区域导入细胞的量为Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量的1/10以下。
＜8＞根据＜6＞或＜7＞所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4区域和E2A基因及VA-RNA基因通过不同的质粒载体导入细胞中。
＜9＞根据＜6＞至＜8＞中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4区域仅由E4ORF6基因组成。
＜9A＞根据＜6＞至＜9＞中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，E4区域存在于能够调节表达的启动子的下游。
＜9B＞根据＜6＞至＜9＞及＜9A＞中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4区域仅由E4ORF基因组成，且不包含PolyA信号序列。
＜10＞一种细胞，其至少具有由外源启动子表达的E4ORF6基因，其中，
与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。
＜11＞根据＜10＞所述的细胞，其中，
由外源启动子表达的E4ORF6基因通过满足以下的(a)至(e)中任一个以上的条件的表达载体导入细胞中。
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不具有Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不具有增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不具有PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
＜12＞一种细胞，其至少具有由外源启动子表达的E4ORF6基因，其中，
E4ORF6基因导入细胞的量比Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量少。
＜13＞根据＜10＞至＜12＞中任一项所述的细胞，其还具有E2A基因及VA-RNA基因。
＜14＞根据＜10＞至＜13＞中任一项所述的细胞，其还具有Rep基因。
＜15＞根据＜10＞至＜14＞中任一项所述的细胞，其还具有Cap基因和/或所期望的治疗或预防用基因。
＜16＞一种表达载体，其包含与外源启动子连接的E4ORF6，其中，
满足以下的(a)至(e)中任一个以上的条件。
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不具有Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不具有增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不具有PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
发明效果
根据本发明的腺相关病毒的制造方法、细胞及表达载体，能够提高腺相关病毒的产生量。
附图说明
图1表示E4ORF6表达量的测定结果。
图2表示AAV基因组滴度的测定结果。
图3表示细胞毒性的测定结果。
图4表示E4ORF6表达量的测定结果。
图5表示AAV基因组滴度的测定结果。
图6表示质粒的结构。
图7表示E4ORF6表达量的测定结果。
图8表示AAV基因组滴度的测定结果。
图9表示增殖的细胞数量的测定结果。
图10表示AAV基因组滴度的测定结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式的一例进行说明。但是，本发明并不因以下的实施方式而受到任何限定，在本发明的目的的范围内，能够适当进行变更来实施。在本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
＜术语的说明＞
启动子表示能够使RNA聚合酶键合，且参与下游的编码序列或非编码序列的转录起始的DNA控制区域/序列。
载体是指为了将外源基因人工传递到另一个细胞中而利用的DNA或RNA分子。将用于表达基因的载体称为表达载体。若包含想要导入的外源基因的载体导入细胞内，则在细胞内进行外源基因的复制和/或表达。作为载体，可以举出附加型(例如质粒)载体及非附加型载体。载体能够通过转染、转导、细胞融合及脂质转染等方法导入宿主细胞中。
携带表示其他的核酸序列整合到染色体或核酸序列中。
基因表示编码多肽的核苷酸，例如，可以举出cDNA或基因组DNA等核酸分子。
在本发明中，Kozak序列表示E4ORF6的起始密码子(ATG)之前的序列，为GCCACC。
在本发明中，IRES序列是指internal ribosome entry site(内部核糖体进入位点)。只要是没有mRNA的5’侧的cap(帽子)结构，且具有被核糖体识别而开始翻译的功能的序列，则没有特别限定。优选为与seq16中公开的序列具有90％以上的同源性的序列。更优选为与seq16中公开的序列具有95％以上的同源性的序列，最优选为与seq16相同的序列。
<腺相关病毒的制造方法>
本发明的腺相关病毒的制造方法的第一方式为以下的腺相关病毒的制造方法：其包括由外源启动子表达E4ORF6基因的步骤，其中，与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。
本发明的腺相关病毒的制造方法的第二方式为以下的腺相关病毒的制造方法：其包括将至少包含E4ORF6基因的E4区域导入细胞中的步骤，其中，与Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量相比，E4ORF6基因导入细胞的量为1/2以下。
如上述，在本发明中，通过降低腺相关病毒产生所需的基因即E4ORF6的表达量，能够大量产生腺相关病毒。并且，在本发明中，能够降低由E4ORF6引起的细胞损伤，且提高基因导入后的细胞存活率。此外，在本发明的第二方式中，由于质粒的导入比率降低，因此能够降低成本。
在本发明中，由外源启动子表达E4ORF6基因。
外源启动子表示不包含野生型的启动子，在E4基因的情况下，表示不包含于野生型腺的E4区域中的启动子。作为用于表达E4ORF6基因的外源启动子，可以使用来源于巨细胞病毒的启动子(CMV启动子)，或也可以使用比CMV启动子的转录活性弱的启动子。关于比CMV启动子的转录活性弱的启动子将进行后述。
只要是本领域技术人员，则能够理解使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况表示强表达E4ORF6。在一方式中，表示E4ORF6用seq4表达的情况。即，本发明中的“与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低”表示优选与使用后述的实施例的seq4(具有序列号4的碱基序列的质粒)表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。并且，在本发明中，与通过5’Cap结构表达E4ORF6基因的方法相比，优选不通过5’Cap结构表达E4ORF6基因的方法(例如，使用IRES序列表达E4ORF6基因的方法)。
在本发明的腺相关病毒的制造方法的第一方式中，与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达只要降低即可，但是优选降低至1/2以下，更优选降低至1/4以下，更优选降低至1/10以下，更优选降低至1/50以下，更优选降低至1/250以下，更优选降低至1/1250以下。
E4ORF6的表达的降低为E4ORF6的mRNA表达的降低和/或E4ORF6的蛋白质表达的降低。
作为E4ORF6基因的mRNA表达量，与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，优选为1/2以下，更优选为1/4以下，更优选为1/10以下，更优选为1/50，更优选为1/250以下，更优选为1/1250以下。
作为通过E4ORF6基因表达的蛋白质的表达量，与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，优选为1/2以下，更优选为1/4以下，更优选为1/10以下，更优选为1/50，更优选为1/250以下，更优选为1/1250以下。
降低E4ORF6的表达的方法优选以下的(a)至(e)中任一个以上的条件。根据本发明，提供一种表达载体，其包含与外源启动子连接的E4ORF6，其中，满足以下的(a)至(e)中任一个以上的条件。
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不使用Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不使用增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不使用PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
作为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子，可以举出EF1α启动子、CAG启动子、SV40启动子、PGK启动子、RSV启动子等。
作为Kozak序列的修饰方法，可以举出将突变导入序列的方法、基于序列的去除降低活性的方法。
作为增强子序列的修饰方法，可以举出将突变导入序列的方法、基于序列的去除降低活性的方法。
作为PolyA信号序列的修饰方法，可以举出将突变导入序列的方法、基于序列的去除降低活性的方法。
在本发明的腺相关病毒的制造方法中，E4区域导入细胞的量为Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量的、优选为1/2以下，更优选为1/4以下，更优选为1/10以下，更优选为1/50以下，更优选为1/250以下，更优选为1/1250以下。
在本发明中，E4区域和E2A基因及VA-RNA基因可以通过相同的质粒载体导入细胞中，也可以通过不同的质粒载体导入细胞中。
在本发明中，E4区域可以为包含E4ORF6基因及E4ORF6基因以外的基因的区域、或仅由E4ORF6基因组成的区域。优选E4区域为仅由E4ORF6基因组成的区域。优选E4区域仅由E4ORF基因组成，且不包含PolyA信号序列。并且，优选E4区域存在于能够调节表达的启动子的下游。
在本发明的腺相关病毒的制造方法中，将病毒辅助基因导入细胞中。
病毒辅助基因优选受到启动子的控制，也可以受到能够调节表达的启动子的控制。
作为能够调节表达的启动子，能够使用能够通过刺激的有无来调节表达的开启与关闭的启动子。作为刺激，能够举出化学性刺激(内源性激素/应激反应、乳糖、四环素或其衍生物(例如，多西环素)、枯茗酸、蛋白质(雷帕霉素、FKCsA、脱落酸(ABA)等)、他莫昔芬/Cre-loxP(使用以能够通过他莫昔芬来诱导激活的方式修饰的Cre启动子的系统)、核糖开关)、物理性刺激(蓝色光、热)等，但是没有特别限定。
能够调节表达的启动子可以为通过药物能够调节表达的启动子。作为药物，优选为四环素或其衍生物(例如，多西环素)。
作为能够调节表达的启动子，能够举出四环素反应型启动子、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子及金属硫蛋白启动子等。具体的四环素反应型启动子中，可以举出Tet开启/关闭系统(TET Systems GmbH&Co.KG制造)。
能够调节表达的启动子可以为通过四环素能够调节表达的启动子即Tet开启/关闭系统，也可以为Tet开启系统。
在Tet开启系统中，启动子另外包含至少一个Tet操纵子。通过使用Tet操纵子(四环素控制转录激活)，能够在抗生素即四环素或其衍生物之一的(例如，多西环素)存在下可逆地切换转录的开启或关闭。存在于细胞内的Tet阻遏蛋白质通过键合于导入启动子的Tetoperator(四环素操纵子)序列来阻断表达。因此，在Tet阻遏与Tet operator序列键合的情况下，没有观察到基因表达。若添加四环素或多西环素，则Tet阻遏被隔离以允许启动子活性，开启基因表达。Tet操纵子系统是广泛可用的，例如能够从Invitrogen获取的pcDNA(商标)4/TO哺乳动物表达载体中所使用的Tet操纵子等。
在Tet开启系统中，Tet operator序列可以位于要调节表达的启动子的上游，也可以位于下游。在减少关闭表达时的表达泄露的点上，Tet operator序列优选位于能够调节表达的启动子的下游。
作为启动子的具体例没有特别限定，但是能够举出来源于巨细胞病毒的启动子(CMV启动子)(根据所需包含增强子)、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子、逆转录病毒的劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子及磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子等。
病毒辅助基因是指用于能够进行腺相关病毒的复制及包装的非腺相关病毒基因。作为病毒辅助基因，可以使用来源于腺相关病毒以外的其他种类的病毒的基因。作为病毒辅助基因的具体例，能够举出来源于腺病毒或疱疹病毒的病毒辅助基因，优选为病毒辅助基因来源于腺病毒。
腺病毒是指腺病毒科家族的具有包含双链DNA的二十面体核衣壳的非包膜型病毒。从人类中分离出超过50种的腺病毒亚型，从其他的哺乳动物及鸟类中分离出许多其他亚型。这些亚型属于腺病毒科家族，分类为两种属(即哺乳动物腺病毒属及禽腺病毒属)。这些腺病毒在形态学及结构上相似。然而，在人类中，腺病毒显示不同的免疫学特性，即分类为血清型。重点研究腺病毒中2种人类血清型(即Ad2及Ad5)。
来源于腺病毒的病毒辅助基因为参与腺相关病毒的复制及包装的基因。
作为来源于腺病毒的病毒辅助基因，能够举出E1A、E1B、E2A、E4、及VA-RNA等。在具有E1区域的全部或其一部分的宿主细胞中，AAV的基因组会被复制并包装到衣壳中，用于形成病毒病毒体所需的腺病毒基因组的区域为E2A区域、E4区域、及VA-RNA区域。关于基于E4区域的功能，在AAV的复制中需要由E4区域的开放阅读框6(E4ORF6)编码的E4 34kDa蛋白质。优选为病毒辅助基因为E2基因、E4基因(E4ORF6)、及VA-RNA基因。VA-RNA基因优选为VA-RNAI基因。
来源于腺病毒的病毒辅助基因(E1A、E1B、E2A、E4及VA-RNA等)可以为野生型基因，但是只要是发挥本来所具有的功能的基因，则可以使用对野生型基因进行了碱基的取代、缺失、插入或附加等修饰的基因。
在对野生型病毒辅助基因进行碱基的取代、缺失、插入或附加等修饰的情况下，修饰的碱基的个数优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～3个。经修饰的病毒辅助基因的碱基序列与野生型病毒辅助基因的碱基序列优选显示85％以上的序列同源性，更优选显示90％以上的序列同源性，进一步优选显示95％以上的序列同源性，更进一步优选显示98％以上的序列同源性。
在将病毒辅助基因导入细胞中的情况下，能够将包含病毒辅助基因的载体导入细胞中。
作为包含病毒辅助基因的载体，例如，能够使用质粒、来源于病毒的序列、人工合成的核酸等，优选为质粒。
在本发明的腺相关病毒的制造方法中，将腺相关病毒基因导入细胞中。
腺相关病毒(AAV)是指细小病毒科及依赖性细小病毒属的家族的包含单链DNA的小型的能够复制的不完整的非包膜型病毒。可知在AAV中存在超过100种的血清型，并根据血清型的不同，宿主范围或病毒所具有的特征不同。可知血清型2(AAV2)是长期被广泛研究的血清型之一，宿主范围非常广泛。血清型1(AAV1)、血清型5(AAV5)、血清型6(AAV6)是具有更高的组织指向性的血清型。可以说AAV1对肌肉、肝脏、呼吸道、中枢神经系统等的基因导入效率高，AAV5对中枢神经系统、肝脏、视网膜等的基因导入效率高，AAV6对心脏、肌肉、肝脏等的基因导入效率高。本发明优选使用血清型2或血清型5。尤其优选血清型5。
腺相关病毒基因是指由来源于一种或多种腺相关病毒的血清型的一种或多种核酸序列构成的基因。腺相关病毒基因优选为参与AAV的复制及包装的基因及编码AAV构成蛋白质的基因。
作为腺相关病毒基因，优选使用Rep基因及Cap基因。Rep基因及Cap基因编码参与病毒体的复制及包装的蛋白质。在野生型中，Rep基因由P5启动子及p19启动子表达。Cap区域表达VP1、VP2、及VP3。作为Cap基因天然保持的启动子，能够举出p40启动子。
腺相关病毒基因(Rep基因及Cap基因等)可以为野生型基因，但是只要是发挥本来所具有的功能的基因，则可以使用对野生型基因进行了碱基的取代、缺失、插入或附加等修饰的基因。
在对野生型腺相关病毒基因(Rep基因及Cap基因等)进行碱基的取代、缺失、插入或附加等修饰的情况下，修饰的碱基的个数优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～3个。经修饰的腺相关病毒基因的碱基序列与野生型腺相关病毒基因的碱基序列优选显示85％以上的序列同源性，更优选显示90％以上的序列同源性，进一步优选显示95％以上的序列同源性，更进一步优选显示98％以上的序列同源性。
在将Rep基因及Cap基因导入细胞中的情况下，能够将包含Rep基因及Cap基因的载体导入细胞中。在载体中的Rep基因及Cap基因的配置没有特别限定，Rep基因可以位于Cap基因的上游，也可以位于Cap基因的下游，但是优选Rep基因位于Cap基因的上游。
Rep基因是指编码本领域技术人员已知的病毒基因组的复制中集中所需的病毒的复制蛋白质、或者例如人类疱疹病毒6(HHV-6)Rep基因等(已知介导AAV-2DNA复制)其功能性同源物的AAV基因组的区域。因此，Rep基因的编码区域至少包含编码AAV的REP78及REP68(“长形式的REP蛋白质”)以及REP52及REP40(“短形式的REP蛋白质”)的基因或其功能性同源物。本发明中所使用的Rep基因的编码区域可以来源于任何AAV血清型，但是优选来源于AAV2。作为来源于AAV2的蛋白质，可以举出REP78及REP68以及REP52及REP40、ITR。
Cap基因是指AAV基因组中的编码本领域技术人员已知的病毒衣壳蛋白质的区域。这些衣壳蛋白质的例子为AAV衣壳蛋白质VP1、VP2及VP3。在本发明中使用的Cap基因可以来源于任何AAV血清型，但是优选来源于AAV2或AAV5。尤其优选为AAV5。
作为包含Rep基因及Cap基因的载体，例如，能够使用质粒、来源于病毒的核酸序列、人工合成的核酸等，优选为质粒。
在本发明的腺相关病毒的制造方法中，可以将治疗或预防用基因导入细胞中。
作为治疗或预防用基因，能够使用靶细胞的基因组中不完整或缺失的基因、或者编码具有所期望的生物学或治疗效果(例如抗病毒功能)的非天然蛋白质的基因等，但是没有特别限定。作为治疗或预防用基因的具体例，可以举出为了炎症性疾病、自身免疫、慢性及传染性疾病(包含AIDS、癌症、神经系统疾病、心血管疾病、高胆固醇血症等疾病)、贫血及血友病等各种血液疾病、基因缺损(例如囊性纤维化、戈谢病、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏、肺气肿等)的治疗或预防而使用的基因。
作为治疗或预防用基因，也可以为针对癌症及病毒疾病的反义疗法中有用的一些反义寡核苷酸(例如，与mRNA的翻译起始位点(AUG密码子)周围的序列互补的短链寡核苷酸)。
治疗或预防用基因可以与用于表达治疗或预防用基因的启动子连接。用于表达治疗或预防用基因的启动子没有特别限定，但是能够举出来源于巨细胞病毒的启动子(根据所需包含增强子)、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子、逆转录病毒的劳斯肉瘤病毒LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子及磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子等。治疗或预防用基因及用于表达基因的启动子优选夹在ITR序列之间。
作为在本发明中载体的组合的优选的方式，能够举出以下的方式。
(1)使用包含Rep基因及Cap基因的载体、包含E2A基因及VA-RNA基因的载体、包含E4基因的载体、以及包含所期望的治疗或预防用基因的载体，以减少具有E4基因的载体的导入比率的方式；
(2)使用包含Rep基因及Cap基因的载体、包含E2A基因及VA-RNA基因的载体、包含E4ORF6基因的载体、以及包含所期望的治疗或预防用基因的载体，以减少具有E4ORF6基因的载体的导入比率的方式；
(3)使用包含Rep基因及Cap基因的载体、包含E2A基因及VA-RNA基因的载体、包含E4ORF6基因且降低了E4ORF6基因的表达量的载体、以及包含所期望的治疗或预防用基因的载体的方式；
(4)使用包含Rep基因及Cap基因的载体、包含E2A基因、E4ORF6基因及VA-RNA基因且降低了E4ORF6基因的表达量的载体、以及包含所期望的治疗或预防用基因的载体的方式；
(5)使用包含Rep基因、Cap基因、E2A基因及VA-RNA基因的载体、包含E4基因的载体、以及包含所期望的治疗或预防用基因的载体，以减少具有E4基因的载体的导入比率的方式；
(6)使用包含Rep基因、Cap基因、E2A基因及VA-RNA基因的载体、包含E4ORF6基因且降低了E4ORF6基因的表达量的载体、以及包含所期望的治疗或预防用基因的载体的方式；
(7)使用包含Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因及所期望的治疗或预防用基因的载体、以及包含E4基因的载体，以减少具有E4基因的载体的导入比率的方式；
(8)使用包含Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因及所期望的治疗或预防用基因的载体、以及包含E4ORF6基因且降低了E4ORF6基因的表达量的载体的方式；
(9)使用包含Rep基因、Cap基因、E2A基因、E4ORF6基因及VA-RNA基因且降低了E4ORF6基因的表达量的载体、以及包含所期望的治疗或预防用基因的载体的方式；
(10)使用包含Rep基因、Cap基因、E2A基因、E4ORF6基因、VA-RNA基因及所期望的治疗或预防用基因且降低了E4ORF6基因的表达量的载体的方式。
在基于本发明的腺相关病毒的制造方法中，能够制造病毒辅助基因、腺相关病毒基因，在必要的情况下，通过培养包含所期望的治疗或预防用基因的细胞，能够制造腺相关病毒。
作为腺相关病毒的制造方法，可以为TT(Triple Transfection(三重转染))法、包装细胞法、或Producer cell(生产细胞)法中的任一种。在代替E4基因使用E4ORF6的情况下，尤其优选TT法。
TT法是指通过使包含Rep基因及Cap基因的质粒、腺病毒辅助质粒及包含导入基因(例如，所期望的治疗或预防用基因)的质粒同时转染HEK293细胞而包装成重组型AAV(rAAV)的方法。
包装细胞法是指针对将TT法中的一部分基因预先整合到染色体中的细胞，通过转染导入剩余基因，从而产生AAV的方法。
Producer cell法是指使用将TT法中的全部基因整合到染色体中的细胞，且无需转染操作而产生AAV的方法。
作为在本发明中尤其优选的方式，能够举出以下的方式。
一种AAV基因的制造方法，其包括将携带有Rep基因及Cap基因的质粒、携带有E2A基因、VA-RNA基因及E4ORF6的质粒、及携带有GOI基因的质粒进行基因导入的工序，携带有上述E4ORF6的质粒不具有用于表达E4ORF6的enhancer(增强子)及PolyA信号序列。
一种AAV基因的制造方法，其包括将携带有Rep基因及Cap基因的质粒、携带有E2A基因、VA-RNA基因及E4ORF6的质粒、及携带有GOI基因的质粒进行基因导入的工序，表达携带有上述E4ORF6的质粒的E4ORF6的启动子为CAG启动子。
基于本发明的腺相关病毒的制造方法中的细胞的培养能够在用于细胞培养的通常的条件下进行。关于使用的培养基及培养条件，只要是本领域技术人员，则能够适当地进行选择。作为培养基，能够使用Expi29 Expression Medium(表达培养基)(Thermo FisherScientific，A1435101)、含有10％(vol/vol)胎牛血清(FBS)的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)、无血清UltraCULTURE(商标)培养基(Lonza)等，但是没有特别限定。
培养温度通常为25℃～45℃，优选为30℃～42℃，更优选为35℃～40℃，作为一例，为37℃。
CO2浓度通常为3～10％CO2，优选为5～10％CO2，作为一例，为8％CO2。
细胞能够在任意体积的培养基中进行培养，例如，能够在1mL至2000L的培养基中培养细胞，优选为1L～2000L，更优选为50L～2000L，尤其优选为500L～2000L。
培养可以在振动搅拌的同时进行。进行振动搅拌时的搅拌速度通常为50rpm～200rpm，优选为80～150rpm。
搅拌培养可以为基于反应器内的螺旋桨等的旋转搅拌培养。进行旋转搅拌时的搅拌速度通常为50rpm～200rpm，优选为80～150rpm。并且，可以通过波动式振动搅拌或搅拌叶片的上下移动来进行搅拌，但是没有特别限定。
各工序中的培养时间没有特别限定，但是通常为6小时～14天，优选为12小时～7天，更优选为24小时～144小时，进一步优选为24小时～96小时。
所制造的腺相关病毒的滴度能够通过本领域技术人员已知的常规的方法来进行测定。例如，回收培养后的细胞培养液，并通过冻融对细胞进行了破碎之后，通过离心分离回收上清。通过在所回收的上清中添加MgCl2及Benzonase(核酸酶)而进行反应，从而能够消化gDNA(基因组DNA)和残留质粒。使用包含通过上述而获得的腺相关病毒的样品作为ddPCR(Droplet Digital PCR(微滴式数字PCR))样品，并能够通过进行ddPCR来测定AAV的滴度。
<细胞>
本发明的细胞的第一方式为以下的细胞：其至少具有由外源启动子表达的E4ORF6基因，其中，与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。
在本发明的细胞中，优选由外源启动子表达的E4ORF6基因通过满足以下的(a)至(e)中任一个以上的条件的表达载体导入细胞中。
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不具有Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不具有增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不具有PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
本发明的细胞的第二方式为以下的细胞：其至少具有由外源启动子表达的E4ORF6基因，其中，E4ORF6基因导入细胞的量比Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量少。
本发明的细胞还可以具有E2A基因及VA-RNA基因。
本发明的细胞还可以具有Rep基因。
本发明的细胞还可以具有Cap基因和/或所期望的治疗或预防用基因。
关于本发明的细胞中的各构成要素的详细内容，如本说明书中的上述内容所述。
细胞优选为真核细胞，例如为哺乳动物细胞或昆虫细胞。细胞更优选为哺乳动物细胞。作为哺乳动物细胞，例如能够举出人体细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猴细胞、仓鼠细胞等，但是没有特别限定。能够优选使用人体细胞。作为细胞的例子，可以举出小鼠骨髓瘤(NSO)细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、HT1080、H9、HepG2、MCF7、MDBK Jurkat、NIH3T3、PC12、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、YB2/0、Y0、C127、L细胞、COS(例如COS1及COS7)、QC1-3、HEK293(来源于人类胎儿的肾细胞)、VERO、PER.C6、HeLa、EB1、EB2、EB3、溶瘤(oncolytic)或杂交瘤细胞系。优选为细胞为HEK293细胞、CHO细胞，更优选为HEK293细胞。
本发明的细胞至少具有由外源启动子表达的E4ORF6基因。优选在染色体中具有包含上述的E4ORF6基因的载体。在染色体中具有表示将载体的全长或一部分整合到染色体中。通过载体整合到染色体中，腺相关病毒产生所需的基因恒定地维持在细胞内，能够在任意的时间点产生腺相关病毒。
包含E4ORF6基因的载体只要以能够表达的方式导入即可，但是更优选使其永久性表达。所谓永久性表达是指在细胞进行了分裂的情况下，成为包含E4ORF6基因的载体也会被复制，且分裂后的细胞也具有载体。关于永久性表达，能够通过载体整合到细胞的染色体中或者使用具有在细胞质内复制的能力的载体来进行。
包含E4ORF6基因的载体能够通过转染、转导、细胞融合及脂质转染等方法导入宿主细胞中。
所谓转染是指通过化学手段(例如，磷酸钙介导的沉淀)、机械手段(例如，电穿孔)或物理手段(例如，基于生物弹道(bioballistic)的递送)穿过真核细胞的膜并将核酸导入细胞中。
所谓转导是指经通过源于病毒的载体，穿过真核细胞的膜并将核酸导入细胞中。
所谓脂质转染是指通过电相互作用形成载体和正电荷脂质等的复合体，通过内吞作用或膜融合将核酸导入细胞中。
通过以下实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例
[材料及方法]
<细胞培养>
使悬浮的HEK293细胞(Thermo Fisher Scientific，R79007)悬浮在12mL的Expi29Expression Medium(Thermo Fisher Scientific，A1435101)中，使其成为1×107cells(细胞)/mL，并在125mL振荡烧瓶中培养了24小时。培养液以120rpm恒定地搅拌的同时，在37℃、8％CO2条件下进行了孵化。
<质粒>
使用了AAVpro(注册商标)Helper Free System(无辅助病毒系统)(AAV5)(TakaraBio Inc.，6650)(seq1、seq2)。以序列表的序列号1～7来表示所使用的质粒(seq1～seq7)的整体序列。以序列表的序列号14～16来表示seq14～seq16的序列。
seq1(GOI)：携带GOI的质粒
seq2(RC)：携带有Rep基因及Cap基因的质粒
seq3(ΔE4)：基于pHelper(Takarabio)去除E4基因编码区域，并通过自身环化(self ligation)重新环化的质粒
seq4(CMV-E4ORF6)：合成CMV-E4ORF6基因序列，并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)
seq5(E4)：合成E4区域序列，并插入到pUC57载体的EcoRV位点的质粒(GENEWIZ)
seq6(CAG-E4ORF6)：向CAG启动子下游插入了E4ORF6基因序列的质粒
seq7(CMV-E4ORF6ΔEnhancerΔPolyA)：从seq4去除了Enhancer序列及PolyA信号序列的质粒
seq14(TET-RFP-IRES-E4ORF6)：将E4ORF6基因通过IRES连接到位于整合有Tetoperator序列的能够调节表达的启动子的下方的RFP(红色荧光蛋白质)基因的更下游的质粒
seq15(TET-RFP-IRES-E4ORF6ΔPolyA)：从seq8去除了polyA的质粒
seq16：IRES序列
＜Real-time(实时)PCR＞
将基因导入后在72小时、37℃、8％CO2条件下进行了培养的HEK细胞，通过300xg的离心进行了回收。使用RNeasy Plus Mini Kit(总RNA小提试剂盒)(Qiagen(凯杰))纯化mRNA，并通过使用了High Capacity RNA to cDNA Kit(高容量RNA至cDNA试剂盒)的逆转录制备了cDNA。所制备的cDNA通过将使用TaqMan Gene Expression Master Mix(TaqManTM基因表达预混液)(Applied Biosystems)，并利用针对E4ORF6的引物(seq8、seq9)及探针(seq10)检测E4ORF6，并且针对GAPDH(Thermo Fisher Scientific，Hs02786624＿g1)使用TaqMan Gene Expression Assay(TaqManTM基因表达检测)进行标准化，从而进行了定量评价。以序列表的序列号8～10来表示seq8～seq10。
<测定AAV滴度>
回收基因导入后在72小时、37℃、8％CO2条件下进行了培养的HEK细胞培养液，并在-80℃下通过冻融对细胞进行了破碎。之后，通过13,800×g的离心分离回收上清，并添加终浓度2mmol/L的MgCl2、25U/mL的Benzonase，在37℃下进行2小时的反应，从而消化了gDNA(基因组DNA)和残留质粒。反应后的样品依次在95℃下孵化15分钟、在70℃下孵化3分钟、在40℃下孵化3分钟、在20℃下孵化3分钟，使Benzonase失活，并将其制成ddPCR(DropletDigital PCR)样品。ddPCR样品用在TE buffer(TE缓冲液)(pH8.0)中混合0.05％Pluronic(嵌段式聚醚)F-68及10μg/mL牛胸腺DNA而成的溶液稀释成50倍。在冰上试管中混合ddPCRtm Supermix for Probes(ddPCR探针预混液)(no dUTP)(BIORAD公司)10μL、已稀释的ddPCR样品2μL、引物(seq11、seq12、最终浓度900nmol/L)及探针(seq13、最终浓度250nmol/L)、无核酸酶水(Thermo Fisher Scientific，10977015)，并调整为总液量22μL，从而进行了ddPCR。以序列表的序列号11～13来表示seq11、seq12及seq13的序列。
在ddPCR中，通过微滴形成装置(QX200 Droplet Generator、BIORAD)从调制液形成液滴，接着，依次进行了在95℃下孵化10分钟、在94℃下孵化30秒钟及在55℃下重复40次、在98℃孵化10分钟。通过微滴分析仪(QX200Droplet Reader、BIO RAD)进行测定，并计算出AAV基因组滴度(vg/mL)。
＜细胞毒性评价＞
关于基因导入细胞的毒性，从基因导入经过72小时后进行trypan blue(台盼蓝)染色，并根据染色陽性细胞的计数计算出细胞损伤率(％)。
[结果]
对改变了携带有E4ORF6的质粒的导入量时的AAV产生量的变化进行了评价。将通过以下的组合将基因导入HEK293细胞中，并对72小时后的E4ORF6表达量进行了定量评价的结果示于图1，将通过ddPCR测定了AAV的滴度的结果示于图2，将由台盼蓝染色引起的细胞的损伤率示于图3。
E4ORF6基因导入比1
seq1:seq2:seq3:seq4＝1:1:1:1
E4ORF6基因导入比0.02
seq1:seq2:seq3:seq4＝1:1:1:0.02
E4ORF6基因导入比0.004
seq1:seq2:seq3:seq4＝1:1:1:0.004
E4基因
seq1:seq2:seq3:seq5＝1:1:1:1
E4非导入
seq1:seq2:seq3:seq5＝1:1:1:0
E4ORF6表达量
将E4ORF6基因导入比1:1的情况设为基准(1)。
E4ORF6基因导入比0.02:0.0124
E4ORF6基因导入比0.004:0.000353
E4基因：0.0722
病毒量(vg/mL)
将E4ORF6基因导入比1:1的情况设为基准(1)。
E4ORF6基因导入比0.02:1.90
E4ORF6基因导入比0.004:1.88
E4基因：0.924
E4非导入：0.179
细胞毒性(％)
E4ORF6基因导入比1:49.0
E4ORF6基因导入比0.02:29.9
E4ORF6基因导入比0.004:24.9
E4基因：44.6
E4非导入：20.6
从图1的结果发现，通过降低进行了编码E4ORF6基因的质粒的导入比率，E4ORF6的表达量降低。
从图2的结果发现，通过降低质粒的导入比率，AAV产生量得到提高。
从图3的结果发现，通过降低质粒的导入比率，细胞毒性降低。
对改变了E4ORF6的表达启动子时的AAV产生量的变化进行了评价。将通过以下的组合将基因导入HEK293细胞中，并在72小时后对E4ORF6表达量进行了定量评价的结果示于图4，将通过ddPCR测定了AAV的滴度的结果示于图5。
CMV-E4ORF6
seq1:seq2:seq3:seq4＝1:1:1:1
CAG-E4ORF6：
seq1:seq2:seq3:seq6＝1:1:1:1
E4ORF6表达量
将CMV-E4ORF6的情况设为基准(1)。
CAG-E4ORF6：0.203
病毒量(vg/mL)
将CMV-E4ORF6的情况设为基准(1)。
CAG-E4ORF6：1.70
从图4的结果发现，通过将进行了编码E4ORF6基因的质粒的启动子从CMV变更为CAG，E4ORF6的表达量降低。
从图5的结果发现，通过变更启动子AAV产生量得到提高。
对改变了E4ORF6的表达调节序列时的AAV产生量的变化进行了评价。将变更了表达调节序列的E4ORF6质粒图示于图6。将通过以下的组合将基因导入HEK293细胞中，并在72小时后对E4ORF6表达量进行了定量评价的结果示于图7，将通过ddPCR测定了AAV的滴度的结果示于图8。
CMV-E4ORF6
seq1:seq2:seq3:seq4＝1:1:1:1
CMV-E4ORF6ΔEnhancerΔPolyA：
seq1:seq2:seq3:seq7＝1:1:1:1
E4ORF6表达量
将CMV-E4ORF6的情况设为基准(1)。
CMV-E4ORF6ΔEnhancerΔPolyA：0.121
病毒量(vg/mL)
将CMV-E4ORF6的情况设为基准(1)。
CMV-E4ORF6ΔEnhancerΔPolyA：2.57
从图7的结果发现，通过去除进行了编码E4ORF6基因的质粒的enhancer及polyA信号序列，E4ORF6的表达量降低。从图8的结果发现，通过变更序列AAV产生量得到提高。
使用设计为将E4ORF6基因通过IRES连接到位于整合有Tet operator序列的能够调节表达的启动子的下方的RFP(红色荧光蛋白质)基因的更下游(seq14：TET-RFP-IRES-E4ORF6)及质粒设计为去除了E4ORF6基因下游的polyA信号序列(seq15：TET-RFP-IRES-E4ORF6ΔPolyA)的质粒，并分别导入HEK细胞中测定了在不存在四环素的情况下的由增殖引起的细胞数量的增加。将在相同的的条件下，对E4区域(seq5)导入细胞中的细胞数量的增加进行测定，并将进行了比较的结果示于图9。
从图9的结果发现，导入seq14、seq15的细胞的细胞数量的增加大于导入E4区域的细胞的细胞数量。
将TET-RFP-IRES-E4ORF6及TET-RFP-IRES-E4ORF6ΔPolyA导入HEK细胞中，通过G418药物处理来制备了整合有质粒的稳定表达细胞。将对稳定表达的细胞导入Rep、Cap、E2、VA-RNA基因，并测定了AAV产生滴度的结果示于图10。
从图10的结果确认到，使用所制备的TET-RFP-IRES-E4ORF6及、TET-RFP-IRES-E4ORF6ΔPolyA的稳定表达细胞能够产生AAV。并且，发现通过去除PolyA信号序列滴度会提高。

Claims (16)

1.一种腺相关病毒的制造方法，其包括由外源启动子表达E4ORF6基因的步骤，其中，
与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。
2.根据权利要求1所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4ORF6的表达的降低为E4ORF6的mRNA表达的降低和/或E4ORF6的蛋白质表达的降低。
3.根据权利要求1或2所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、E4ORF6基因及PolyA序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达的量降低至1/2以下。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
通过以下的(a)至(e)中任一个以上的条件E4ORF6的表达降低，
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不使用Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不使用增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不使用PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
与Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量相比，E4ORF6基因导入细胞的量为1/2以下。
6.一种腺相关病毒的制造方法，其包括将至少包含E4ORF6基因的E4区域导入细胞中的步骤，其中，
与Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量相比，E4ORF6基因导入细胞的量为1/2以下。
7.根据权利要求6所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4区域导入细胞的量为Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量的1/10以下。
8.根据权利要求6或7所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4区域和E2A基因及VA-RNA基因通过不同的质粒载体导入细胞中。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的腺相关病毒的制造方法，其中，
E4区域仅由E4ORF6基因组成。
10.一种细胞，其至少具有由外源启动子表达的E4ORF6基因，其中，
与使用包含增强子、来源于巨细胞病毒的启动子、Kozak序列、E4ORF6基因及PolyA信号序列的表达单元表达E4ORF6的情况相比，E4ORF6的表达降低。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中，
由外源启动子表达的E4ORF6基因通过满足以下的(a)至(e)中任一个以上的条件的表达载体导入细胞中，
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不具有Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不具有增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不具有PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
12.一种细胞，其至少具有由外源启动子表达的E4ORF6基因，其中，
E4ORF6基因导入细胞的量比Rep基因、Cap基因、E2A基因、VA-RNA基因、所期望的治疗或预防用基因中的任一种以上的基因导入细胞的量少。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的细胞，其还具有E2A基因及VA-RNA基因。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的细胞，其还具有Rep基因。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的细胞，其还具有Cap基因和/或所期望的治疗或预防用基因。
16.一种表达载体，其包含与外源启动子连接的E4ORF6，其满足以下的(a)至(e)中任一个以上的条件，
(a)外源启动子为比来源于巨细胞病毒的启动子的转录活性弱的启动子；
(b)E4ORF6基因的Kozak序列为经修饰的Kozak序列或不具有Kozak序列；
(c)增强子序列为经修饰的增强子序列或不具有增强子序列；
(d)PolyA信号序列为经修饰的PolyA信号序列或不具有PolyA信号序列；
(e)使用IRES序列表达E4ORF6基因。
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