WO2024043202A1 - 細胞へ核酸を導入する方法およびその応用 - Google Patents

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cells
nucleic acid
complex
cationic polymer
cell
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雅史 西野
亮太 佐藤
太一 村口
開 森谷
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富士フイルム株式会社
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method of introducing a nucleic acid into a cell, which comprises transfecting the cell with a complex of a cationic polymer and a nucleic acid.
  • the present invention further relates to a method for producing cells into which nucleic acids have been introduced, and a method for producing useful substances.
  • the invention further relates to a composition comprising a cationic polymer and a nucleic acid, and a cell culture comprising the composition and cells.
  • AAV vectors In order to produce gene therapy drugs such as adeno-associated virus (AAV) vectors, cells are being transiently transfected with genes.
  • methods for producing AAV vectors include a method in which an AAV production plasmid, which is a nucleic acid, is transiently introduced into the HEK (Human Embryonic Kidney cells) 293 cell line to produce an AAV vector.
  • nucleic acids into cells is essential not only for medical applications such as antibody preparations and gene therapy, but also for basic research in molecular cell biology.
  • transfection methods using viral vectors and non-viral transfection methods are known as methods for introducing genes into cells.
  • Non-viral transfection methods do not have the problems that transfection methods using viral vectors have, and are advantageous in the production of pharmaceuticals from nucleic acids.
  • Non-viral transfection methods allow products to be manufactured with high reproducibility and at acceptable cost.
  • non-viral transfection methods are known, and the main methods include methods using cationic lipids and/or cationic polymers.
  • cationic lipids and/or cationic polymers are commercially available and in use.
  • PEI Polyethyleneimine
  • a cationic polymer is a low-cost, non-viral, and non-liposomal transfection reagent, and is known as one of the cost-effective media.
  • PEI can form complexes with nucleic acids and efficiently transfect genes with low toxicity to cells. This PEI/nucleic acid complex is taken up into cells by endocytosis.
  • PEI has a high pH buffering capacity, protects imported DNA from degradation in lysosomes, and allows efficient release from lysosomes to the cytoplasm. PEI is thus useful as a transfection reagent and has been used to transfect DNA into mammalian cells.
  • Patent Document 1 describes a method in which free PEI is additionally added during the formation of a complex between PEI and nucleic acid.
  • Patent Document 2 describes transfecting a nucleic acid using PEI grafted with polyethylene glycol.
  • Patent Document 3 describes transfecting a nucleic acid using PEI modified with polyethylene glycol.
  • Patent Document 4 describes that the pH during the formation of a complex between PEI and a nucleic acid is defined under acidic conditions of 3.5 to 4.5.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 also describe the use of PEI for transfection.
  • An object of the present invention is to provide a method for introducing nucleic acids into cells, which can efficiently introduce high concentrations of nucleic acids as a complex of nucleic acids and cationic polymers.
  • a further object of the present invention is to provide a method for producing cells into which nucleic acids have been introduced, and a method for producing useful substances, using the method for introducing nucleic acids into cells as described above.
  • a further object of the present invention is to provide a composition comprising a cationic polymer and a nucleic acid, and a cell culture comprising the composition and cells, which are related to the above method.
  • the inventors of the present invention have found that, in forming a complex by mixing a cationic polymer and a nucleic acid to obtain a solution of a complex of a cationic polymer and a nucleic acid, the electrical conductivity of the complex solution is improved. It has been found that the above-mentioned problem can be solved by setting the degree to 1.0 to 7.0 mS/cm. The present invention was completed based on the above findings.
  • step (a) A complex formation step of mixing a cationic polymer and a nucleic acid to obtain a solution of a complex of the cationic polymer and the nucleic acid, wherein the concentration of the nucleic acid in the complex formation step is 100 to 1000 ⁇ g. /mL and the electrical conductivity of the complex solution after mixing is 1.0 to 7.0 mS/cm; and (b) the complex solution obtained in step (a) is suspended in cell suspension. Transfection step of adding to the suspension; Methods of introducing nucleic acids into cells, including.
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the electrical conductivity is 1.0 to 7.0 mS/cm within 0 to 10 minutes after the start of mixing the cationic polymer and the nucleic acid. . ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the concentration of the nucleic acid is 110 ⁇ g/mL to 300 ⁇ g/mL. ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the mass ratio of the cationic polymer to the nucleic acid is 8:1 to 1:1.
  • ⁇ 5> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the cell density of the cell suspension when contacted with the complex solution is 1 x 10 5 cells/mL to 5 x 10 8 cells/mL.
  • the method described in. ⁇ 6> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the cell density of the cell suspension when contacted with the complex solution is 5 x 10 6 cells/mL to 3 x 10 7 cells/mL.
  • the method described in. ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the total amount of nucleic acid used to form the complex is 0.1 to 1 ⁇ g per million cells.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the electrical conductivity of the composite solution is 3.0 to 5.0 mS/cm.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the average particle diameter of the composite is 200 nm to 1200 nm.
  • ⁇ 10> In the above complex forming step (a), before step (b), after mixing the cationic polymer and the nucleic acid, the complex solution is allowed to stand for 10 seconds to 4 hours, ⁇ 1> ⁇ The method described in any one of ⁇ 9>.
  • ⁇ 11> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 10>, wherein the volume ratio of the complex solution to the cell suspension is 1:2 to 1:500.
  • ⁇ 12> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>, wherein the cationic polymer is a polyamine.
  • ⁇ 13> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 12>, wherein the cationic polymer is polyethyleneimine.
  • ⁇ 14> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>, wherein the nucleic acid is a plasmid.
  • ⁇ 15> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14>, wherein the cell is an animal cell.
  • ⁇ 16> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 14>, wherein the cells are HEK cells.
  • ⁇ 17> A method for producing cells into which a nucleic acid has been introduced, including the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 16>.
  • ⁇ 18> A step of introducing a nucleic acid into a cell by the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 16>, and a step of culturing the cell to produce a useful substance, Methods for producing useful substances, including: ⁇ 19> The method according to ⁇ 18>, wherein the useful substance is a viral vector.
  • ⁇ 20> The method according to ⁇ 19>, wherein the viral vector is a drug substance.
  • composition containing a cationic polymer and a nucleic acid which has a nucleic acid concentration of 100 to 1000 ⁇ g/mL and an electrical conductivity of 1.0 to 7.0 mS/cm.
  • composition according to ⁇ 21> which is a composition for gene introduction.
  • a cell culture comprising the composition according to ⁇ 21> or ⁇ 22> and cells having a cell density of 1 ⁇ 10 5 cells/mL to 5 ⁇ 10 8 cells/mL.
  • a highly concentrated nucleic acid can be efficiently introduced into cells as a complex of a nucleic acid and a cationic polymer. According to the present invention, it is possible to form a complex between a nucleic acid and a cationic polymer at a high concentration, and it is possible to avoid a substantial reduction in culture scale due to increasing the density of cells into which the complex is introduced. is possible.
  • a numerical range indicated using " ⁇ " means a range that includes the numerical values listed before and after " ⁇ " as the minimum and maximum values, respectively.
  • the present invention (a) A complex forming step of mixing a cationic polymer and a nucleic acid to obtain a solution of a complex of the cationic polymer and the nucleic acid, wherein the concentration of the nucleic acid is 100 to 1000 ⁇ g/mL in the complex forming step. and (b) adding the complex solution obtained in step (a) to a cell suspension. Transfection step of adding;
  • the present invention relates to a method for introducing a nucleic acid into a cell, including the method.
  • the first feature of the present invention is that the concentration of nucleic acid in the complex formation step is high, that is, 100 to 1000 ⁇ g/mL.
  • the second feature of the present invention is that the electrical conductivity of the composite solution after mixing is specified to be 1.0 to 7.0 mS/cm.
  • the present invention does not require stabilizers (such as polyethylene glycol) or enhancers (later addition of cationic polymers such as PEI). Furthermore, although the present invention is not limited to this, in the present invention, there is no need to set the pH at acidic conditions of 3.5 to 4.5 when forming a complex between PEI and nucleic acid.
  • stabilizers such as polyethylene glycol
  • enhancers later addition of cationic polymers such as PEI
  • the electrical conductivity of the complex solution should be within the range of 1.0 to 7.0 mS/cm.
  • the increase in particle size of the complex can be controlled by this method, and thereby the complex of nucleic acid and cationic polymer can be efficiently introduced into cells.
  • a cationic polymer and a nucleic acid are mixed to obtain a solution of a cationic polymer and nucleic acid complex.
  • cationic polymers include, but are not limited to, chitosan, poly-L-lysine (pLL), polyamine (PA), polyalkyleneimine (PAI), polyethyleneimine (PEI), poly[a-(-aminobutyl) )-L-glycolic acid], polyamidoamine, poly(2-dimethylamino)ethyl methacrylate, polyhistidine, polyarginine, poly(4-vinylpyridine), poly(vinylamine) and poly(4-vinyl-N-alkylpyridinium) halides) or a combination thereof can be used.
  • polyamine is preferred, and polyethyleneimine (hereinafter also referred to as PEI) is particularly preferred.
  • PEI polyethyleneimine
  • the PEI may be a linear PEI or a branched PEI, but preferably a linear PEI.
  • the molecular weight of PEI is preferably 10,000 to 800,000 Da, more preferably 10,000 to 50,000 Da, still more preferably 10,000 to 27,000 Da, and particularly preferably It is approximately 25,000 Da.
  • linear PEI with a molecular weight of about 25,000 Da can be used.
  • PEI is commercially available and can be easily obtained.
  • PEIpro (101000033) manufactured by Polyplus can be preferably used.
  • a nucleic acid is a basic unit consisting of a nucleotide consisting of a purine or pyrimidine base, a sugar, and a phosphoric acid, and the phosphoric acid is polymerized by forming a diester bond between the 3' and 5' carbons of the sugar between each nucleotide. refers to a chain polynucleotide. Based on the difference in sugar, it can be broadly classified into deoxyribonucleic acid (DNA), in which the sugar moiety is deoxyribose, and ribonucleic acid (RNA), in which the sugar moiety is ribose.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • the nucleic acid may be any of genes, DNA (linear DNA or circular DNA), RNA, oligonucleotides, and polynucleotides. Nucleic acid is used herein interchangeably with gene, DNA, RNA, oligonucleotide, and polynucleotide.
  • An example of a nucleic acid in the present invention is a plasmid.
  • the concentration of nucleic acid in the complex formation step is 100 ⁇ g/mL to 1000 ⁇ g/mL, preferably 110 ⁇ g/mL to 1000 ⁇ g/mL, more preferably 110 ⁇ g/mL to 500 ⁇ g/mL, and even more preferably 110 ⁇ g/mL. ⁇ 300 ⁇ g/mL, particularly preferably 110 ⁇ g/mL to 200 ⁇ g/mL, and most preferably 110 ⁇ g/mL to 150 ⁇ g/mL.
  • Nucleic acid concentration can be measured using a Nanodrop (trademark) 2000c (ND-2000c, Thermofisher Scientific) microscopic spectrophotometer.
  • the mass ratio of the cationic polymer to the nucleic acid is preferably 8:1 to 1:1, more preferably 5:1 to 1:1, and even more preferably 3:1 to 1. :1.
  • the electrical conductivity of the composite solution is 1.0 to 7.0 mS/cm.
  • the time when the electrical conductivity of the complex solution is 1.0 to 7.0 mS/cm may be any time from 0 to 10 minutes after the start of mixing the cationic polymer and the nucleic acid.
  • the electrical conductivity of the composite solution is preferably 2.0 mS/cm to 6.0 mS/cm, more preferably 3.0 mS/cm to 5.0 mS/cm.
  • the electrical conductivity of the composite solution can be measured using an electrical conductivity meter by inserting the electrode of the electrical conductivity meter into each sample whose temperature is controlled at 25° C. and measuring the electrical conductivity.
  • the average particle size of the complex formed in the complex forming step is preferably 200 nm to 1200 nm, more preferably 300 nm to 1200 nm, even more preferably 400 nm to 1100 nm, particularly preferably 500 nm to 1000 nm. .
  • the average particle diameter of the composite can be measured by a dynamic light scattering method using the scattering intensity as a reference.
  • the analysis method is the cumulant method, and the viscosity and refractive index can be measured by using values actually measured with a viscometer and a refractometer.
  • the complex solution may be allowed to stand for 10 seconds to 4 hours, more preferably for 1 minute. It may be allowed to stand for 60 minutes, more preferably 10 minutes to 30 minutes. Further, the temperature during standing is preferably 15°C to 35°C, more preferably 20°C to 30°C, particularly preferably 22°C to 28°C.
  • a transfection step is performed in which the complex solution obtained in step (a) is added to a cell suspension.
  • Transfection means introducing a nucleic acid into a cell.
  • the cell density of the cell suspension when in contact with the complex solution is not particularly limited, but is preferably 1 x 10 5 cells/mL to 5 x 10 8 cells/mL, more preferably 1 x 10 5 cells/mL. /mL to 1 ⁇ 10 8 cells/mL, more preferably 5 ⁇ 10 5 cells/mL to 5 ⁇ 10 7 cells/mL, particularly preferably 1 ⁇ 10 6 cells/mL to 3 ⁇ 10 7 cells. /mL, most preferably between 5 x 10 6 cells/mL and 3 x 10 7 cells/mL. Cell density can be determined using the Vi-cellTM XR (Beckman Coulter).
  • the total amount of nucleic acid used to form the complex is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 1 ⁇ g per million cells, more preferably 0.2 to 0.0 ⁇ g per million cells. 9 ⁇ g, more preferably 0.3 to 0.8 ⁇ g per million cells, particularly preferably 0.4 to 0.7 ⁇ g per million cells.
  • the volume ratio of the complex solution to the cell suspension is not particularly limited, but is preferably 1:2 to 1:500, more preferably 1:5 to 1:300, particularly preferably 1: The ratio is 10 to 1:200, most preferably 1:20 to 1:200.
  • the lower limit of the volume ratio of the complex solution to the cell suspension may be 1:5, 1:10, or 1:20.
  • the upper limit of the volume ratio of the complex solution and cell suspension may be 1:300 or 1:200.
  • the cells used in the present invention may be isolated cells, cells contained in isolated biological tissue, or cultured cells.
  • the cells may be adherent cells or floating cells.
  • the cells are preferably animal cells.
  • Animal cells are not particularly limited, but are preferably mammalian cells or insect cells, and more preferably mammalian cells.
  • mammalian cells include, but are not limited to, human cells, mouse cells, rat cells, monkey cells, and hamster cells.
  • Preferably human cells can be used.
  • Examples of cells include mouse myeloma (NSO) cell line, Chinese hamster ovary (CHO) cell line, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK (baby hamster kidney cells), VERO, SP2. /0, YB2/0, Y0, C127, L cells, COS (e.g.
  • COS1 and COS7 COS1 and COS7), QC1-3, HEK (Human Embryonic Kidney cells) cells (e.g. HEK293, etc.), VERO, PER. C6, HeLa, EB1, EB2, EB3, oncolytic or hybridoma cell lines.
  • HEK Human Embryonic Kidney cells
  • VERO VERO
  • PER. C6 HeLa
  • EB1 EB293 cells preferably HEK293 cells.
  • a method for producing cells into which nucleic acids have been introduced including the method for introducing nucleic acids into cells according to the present invention.
  • the present invention further provides a method for producing a useful substance, which includes the steps of introducing a nucleic acid into a cell by the method of the present invention, and culturing the cell to produce a useful substance.
  • Useful substances include, but are not particularly limited to, viral vectors, proteins, and the like.
  • the useful substance is preferably a viral vector.
  • the protein or viral vector produced may be used, for example, as a drug substance.
  • Virus refers to a virus that introduces nucleic acid into cells to produce it.
  • viruses include adeno-associated viruses, lentiviruses, baculoviruses, retroviruses, and the like, and among the above, adeno-associated viruses are preferred.
  • Adeno-associated virus refers to a small, replication-incompetent, non-enveloped virus containing a single-stranded DNA of approximately 4700 bases in the Parvoviridae and Dependoparvovirus families.
  • Serotype 2 is one of the serotypes that has been widely studied for a long time, and is known to have a very wide host range.
  • Serotype 1 AAV1
  • serotype 5 AAV5
  • AAV6 serotype 6
  • AAV1 has a high efficiency of gene introduction into muscles, liver, airways, central nervous system, etc.
  • AAV5 has high efficiency of gene introduction into central nervous system, liver, retina, etc.
  • AAV6 has high efficiency of gene introduction into heart, muscles, liver, etc.
  • serotype 2 or serotype 5 Particularly preferred is serotype 5.
  • An adeno-associated virus gene refers to a gene composed of one or more nucleic acid sequences derived from one or more adeno-associated virus serotypes.
  • Adeno-associated virus genes are preferably genes involved in AAV replication and packaging, and genes encoding AAV component proteins.
  • AAV is a non-enveloped virus that multiplies in the presence of helper viruses such as adenovirus and herpesvirus.
  • helper viruses such as adenovirus and herpesvirus.
  • AAV replication was classically performed by co-infecting host cells with adenovirus.
  • the gene responsible for the helper action of adenovirus has been identified, and plasmids carrying this gene are also in use.
  • a plasmid containing the Rep and Cap genes, an adenovirus helper plasmid, and a plasmid containing a therapeutic or prophylactic gene can be packaged into recombinant AAV (rAAV) by simultaneously transfecting cells.
  • the Rep and Cap genes encode proteins involved in virion replication and packaging.
  • the Rep gene is expressed from the P5 and p19 promoters.
  • the Cap region expresses VP1, VP2, and VP3.
  • the p40 promoter can be mentioned as a promoter naturally held by the Cap gene.
  • Adeno-associated virus genes may be wild-type genes, but as long as they exhibit their original functions, base substitutions, deletions, insertions, additions, etc. to the wild-type genes may be used. You may also use a gene that has been modified.
  • the Rep gene is a viral replication protein known to those skilled in the art that is collectively required for the replication of the viral genome, or a protein that mediates AAV-2 DNA replication, such as, for example, the human herpesvirus 6 (HHV-6) Rep gene. refers to the region of the AAV genome that encodes a functional homologue thereof (known to be 1).
  • Cap gene refers to the region in the AAV genome encoding the viral capsid protein known to those skilled in the art.
  • a plasmid for example, a plasmid, a virus-derived nucleic acid sequence, an artificially designed nucleic acid, etc. can be used, and a plasmid is preferable.
  • therapeutic or preventive genes may be introduced into cells.
  • Therapeutic or prophylactic genes include genes that are incomplete or missing in the genome of the target cell or encode non-natural proteins that have the desired biological or therapeutic effect (e.g. antiviral function).
  • therapeutic or prophylactic genes include inflammatory diseases, autoimmunity, chronic and infectious diseases (including disorders such as AIDS, cancer, neurological diseases, cardiovascular diseases, hypercholesteremia, etc.), anemia and hematology.
  • genes used for the treatment or prevention of various blood diseases such as philophilia, and gene defects (eg, cystic fibrosis, Gaucher disease, adenosine deaminase (ADA) deficiency, emphysema, etc.).
  • some antisense oligonucleotides useful in antisense therapy against cancer and against viral diseases such as short oligonucleotides complementary to sequences around the translation start site (AUG codon) of mRNA. nucleotides).
  • the therapeutic or preventive gene may be linked to a promoter for expressing the therapeutic or preventive gene.
  • Promoters for expressing therapeutic or preventive genes are not particularly limited, but include cytomegalovirus-derived promoters (including enhancers if desired), SV40 early promoters, human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoters, and human ubiquitin C. Promoters include retroviral Rous sarcoma virus LTR promoters, dihydrofolate reductase promoters, ⁇ -actin promoters, and phosphoglycerate kinase (PGK) promoters.
  • the therapeutic or preventive gene and the promoter for expressing the gene are preferably sandwiched between ITR sequences.
  • a viral helper gene derived from an adenovirus may be introduced into cells.
  • Viral helper genes are non-adeno-associated viral genes to enable replication and packaging of adeno-associated viruses.
  • viruses helper gene genes derived from viruses other than adeno-associated virus are used.
  • Specific examples of viral helper genes include those derived from adenovirus or herpesvirus, and preferably, the viral helper gene is derived from adenovirus.
  • Viral helper genes derived from adenovirus include E1A, E1B, E2A, E4, and VA-RNA.
  • the regions of the adenovirus genome necessary for the AAV genome to be replicated and packaged into a capsid to form a viral virion in a host cell that has all or part of the E1 region are the E2A region, the E4 region, and VA1 RNA region.
  • the E4 34 kDa protein encoded by the E4 region open reading frame 6 (E4ORF6) is required for AAV replication.
  • the viral helper genes are the E2 gene, the E4 gene, and the VA-RNA gene.
  • the VA-RNA gene is preferably the VA-RNAI gene.
  • Viral helper genes derived from adenovirus may be wild-type genes; Genes that have been modified such as substitution, deletion, insertion, or addition may also be used.
  • a vector containing the viral helper gene can be introduced into the cells.
  • a vector containing a viral helper gene for example, a plasmid, a virus-derived sequence, an artificially designed nucleic acid, etc. can be used, and a plasmid is preferable.
  • the viral helper gene is under the control of a promoter.
  • promoters include, but are not limited to, cytomegalovirus-derived promoters (CMV promoters) (including enhancers if desired), SV40 early promoters, human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoters, human ubiquitin C promoters, Examples include the retrovirus Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter, dihydrofolate reductase promoter, ⁇ -actin promoter, and phosphoglycerate kinase (PGK) promoter.
  • the promoter may be under the control of a promoter that can regulate expression.
  • the promoter whose expression can be regulated may be a Tet on/off system, which is a promoter whose expression can be regulated by tetracycline, or a Tet on system.
  • proteins can also be produced as useful substances.
  • the protein is preferably a recombinant protein.
  • proteins include recombinant polypeptide chains, recombinant secretory polypeptide chains, antigen-binding proteins, antibodies (e.g., human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, mouse antibodies, bispecific antibodies, etc.), Fc fusion proteins, fragmented Examples include immune immunoglobulin, single chain antibody (scFv), and the like.
  • the protein is preferably an antibody, more preferably a human, humanized, chimeric, or murine antibody.
  • Fragmented immune immunoglobulins include Fab, F(ab')2, Fv, and the like.
  • the class of the antibody is also not particularly limited, and may be any class such as IgG such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, IgA, IgD, IgE, and IgM, but IgG and IgM are preferred when used as a medicine.
  • Antibodies include, but are not particularly limited to, anti-IL-6 receptor antibodies, anti-IL-6 antibodies, anti-glypican-3 antibodies, anti-CD3 antibodies, anti-CD20 antibodies, anti-GPIIb/IIIa antibodies, anti-TNF antibodies, and anti-CD25 antibodies.
  • Antibodies include anti-EGFR antibodies, anti-Her2/neu antibodies, anti-RSV antibodies, anti-CD33 antibodies, anti-CD52 antibodies, anti-IgE antibodies, anti-CD11a antibodies, anti-VEGF antibodies, and anti-VLA4 antibodies.
  • useful substances can be produced by culturing cells into which nucleic acids have been introduced. Culturing the cells can be carried out under normal conditions for culturing cells.
  • the cell culture temperature is not particularly limited, and the culture is carried out at a temperature at which the cells can survive.
  • the culture temperature is generally 25°C to 45°C, preferably 30°C to 42°C, more preferably 35°C to 40°C, and one example is 37°C.
  • the CO 2 concentration is generally 3-10% CO 2 , preferably 5-10% CO 2 , one example being 8% CO 2 .
  • the period for producing useful substances such as viruses is preferably 24 hours or more and 30 days or less, more preferably 24 hours or more and 20 days or less, even more preferably 24 hours or more and 10 days or less, even more preferably 24 hours or more and less than 10 days.
  • the time period is at least 1 hour and at most 7 days, particularly preferably at least 24 hours and at most 72 hours.
  • the culture can be performed by batch culture, fed-batch culture, perfusion culture, or shaking culture.
  • at least a part of the virus production process is perfusion culture.
  • the culture container is not particularly limited, and may be, for example, a flask or a bioreactor.
  • the culture scale is not particularly limited, and cells can be cultured in any volume of medium, for example, cells can be cultured in a medium of 1 mL to 2500 L, preferably 1 L to 2300 L, and more preferably 50 L to 2200 L. , 300L to 2100L are particularly preferred.
  • Cultivation may be performed while shaking and stirring.
  • the stirring speed for shaking and stirring is generally 50 rpm to 200 rpm, preferably 80 to 150 rpm.
  • the agitation culture may be a rotation agitation culture using a propeller or the like in a reactor.
  • the stirring speed in the case of rotary stirring is generally 50 rpm to 200 rpm, preferably 80 to 150 rpm.
  • stirring may be performed by wave-type shaking stirring or vertical movement of stirring blades, but there is no particular limitation.
  • Examples of media include, but are not limited to, BalanCD® medium, Expi293 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, A1435101), containing 10% (vol/vol) fetal bovine serum (FBS). Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), GibcoTM Viral Production Medium (Thermo Fisher Scientific, A4817901), Serum-Free UltraCULTURETM Medium (Lonza), HuMEC Basal Serum-Free Medium, KNOCKOUTTM CT S (trademark) XenoFREE ESC /iPSC medium, STEMPRO (trademark)-34 SFM medium, STEMPRO (trademark) NSC medium, ESSENTIAL (trademark)-8 medium, medium 254 , medium, 106, medium, 131, medium, 154, medium, 171, medium 171, Medium 200, Medium 231, HeptoZYME-SFM, Human Endothelium-SFM, GIBCO® FREESTYLETM 293 Expression Medium, Medium 154CF/PRF, Medium 154
  • the high density culture medium is CD FORTICHOTM medium, CD CHO AGT medium, CHO-S-SFM medium, GIBCO® FREESTYLETM CHO expression medium, CD OPTICHO (trademark) medium, CD CHO medium, CD DG44 medium, GIBCO (registered trademark) FREESTYLE (trademark) 293 expression medium, EXPI293 (trademark) expression medium, LV-MAX (trademark) production medium, FREESTYLE (trademark) F17 expression It may be a culture medium, DYNAMISTM medium, or a similar medium, or variations thereof.
  • the medium may be supplemented with 1x GlutaMAX (TM) (manufactured by ThermoFisher Scientific), if desired.
  • GlutaMAX manufactured by ThermoFisher Scientific
  • BalanCD® medium Expi29 Expression Medium (Thermo Fisher Scientific, A1435101)
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • G ibco(trademark) Viral Production Medium Thermo Fisher Scientific, A4817901
  • FREESTYLETM F17 expression medium are particularly preferred.
  • the titer of the produced virus can be measured by a conventional method known to those skilled in the art.
  • the cell culture solution after culturing is collected, the cells are disrupted by freezing and thawing, and then the supernatant is collected by centrifugation.
  • MgCl 2 and Benzonase By adding MgCl 2 and Benzonase to the collected supernatant and performing a reaction, gDNA (genomic DNA) and remaining plasmids can be digested. It is possible to measure the titer of the target virus by using the sample containing the target virus obtained above as a ddPCR (Droplet Digital PCR) sample and performing ddPCR.
  • ddPCR Droplet Digital PCR
  • a composition comprising a cationic polymer and a nucleic acid, which has a nucleic acid concentration of 100 to 1000 ⁇ g/mL and an electrical conductivity of 1.0 to 7.0 mS/cm. provided.
  • Preferred ranges for the cationic polymer, nucleic acid, nucleic acid concentration, and electrical conductivity are as described herein above.
  • the above composition is useful as a composition for gene introduction.
  • the present invention further provides a cell culture comprising the above composition and cells having a cell density of 1 ⁇ 10 5 cells/mL to 5 ⁇ 10 8 cells/mL. Cell densities and preferred ranges for cells are as described herein above.
  • HEK-293 cells (Expi293, A14527, manufactured by ThermoFisher Scientific) were cultured in Balan CD medium (Fujifilm Irvine Sc) supplemented with 1x GlutaMAX (TM) (manufactured by ThermoFisher Scientific). ientific Inc.). Cells were cultured in shake flasks (Corning) or bioreactors. In shake flasks, cells were cultured in a 37°C incubator with 120 rpm agitation and a humidified atmosphere of 8% CO2 . As a pre-culture, cells were seeded at 0.5 ⁇ 10 6 cells/mL, and when the cell density reached approximately 2 ⁇ 10 6 cells/mL, gene introduction was performed by adding a nucleic acid complex.
  • rAAV adeno-associated virus vector
  • Adenovirus helper plasmid containing E2, E4 and VARNA genes. All plasmids used were AAVpro Packaging Plasmid (AAV5,6650, manufactured by Takara Bio).
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • plasmid DNA used for transfection was 0.5 ⁇ g per million cells.
  • a PEI/DNA complex was prepared with PEI and plasmid DNA at 1:1, 2:1, or 3:1, incubated at room temperature for 15 minutes, and the plasmid DNA/PEI complex was added to the cell culture medium.
  • a 2:1 mixing ratio of PEI and plasmid DNA was preferable from the viewpoint of gene transfer efficiency, and therefore, the following examples will be described for the case where the mixing ratio is 2:1.
  • the process of mixing plasmid DNA and PEI to form a complex will be described below in comparison with standard conditions.
  • Plasmid and PEI (solvent: BalanCD medium, electrical conductivity 10.1 mS/cm) were mixed, the final concentration of plasmid was adjusted to 13 ⁇ g/mL, the final concentration of PEI was adjusted to 26 ⁇ g/mL, and 2 ⁇ 10 HEK cells were transfected at 6 cells/mL.
  • Plasmid and PEI (Use an electrical conductivity adjustment solvent prepared by mixing Balan CD medium and 10mM HEPES at a ratio of 3:7, 4:6, 5:5, 6:4 as a solvent, and mix the plasmid and PEI with the solvent before mixing. (with electrical conductivities of 3.7, 4.8, 5.6, and 6.8 mS/cm, respectively) were mixed, and the final concentration of plasmid was 130 ⁇ g/mL, and the final concentration of PEI was 260 ⁇ g/mL. The mixture was prepared and transfected into HEK cells at 2 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • the electrical conductivity adjusting solvent was prepared by mixing Balan CD medium: 10 mmol/L HEPES (ThermoFisher Scientific) at a ratio of 4:6.
  • Samples containing cells and cell culture medium were collected 24 hours after transfection to measure cell number and gene transfer efficiency, and 72 hours after transfection to evaluate AAV production.
  • Electrode conductivity Using an electrical conductivity meter, the electrodes of the electrical conductivity meter were inserted into each sample whose temperature was controlled to 25° C., and the electrical conductivity was measured.
  • the average particle diameter (based on scattering intensity) of the composite was measured at 25°C using a dynamic light scattering method.
  • the analysis method was the cumulant method, and the values actually measured using a viscometer and a refractometer were used for the viscosity and refractive index.
  • Cell density was determined using Vi-cellTM XR (Beckman Coulter).
  • the gene transfer efficiency was evaluated by flow cytometry (Attune Flowcytemeter, manufactured by ThermoFisher) by evaluating the percentage of EGFP-expressing cells 24 hours after the gene transfer operation. In comparing the gene transfer efficiency with the conventional method, evaluation was made using a relative value to the percentage of EGFP-expressing cells in the conventional method. The molar ratio of the three plasmid DNAs was 1:1:1 in both the reference example and the present invention.
  • the HEK cell culture medium was cultured at 37° C. and 8% CO 2 for 72 hours after the gene introduction and was collected. Thereafter, 0.1% final concentration of Triton The plasmid was digested. After the reaction, the sample was incubated at 95°C for 15 minutes, at 70°C for 3 minutes, at 40°C for 3 minutes, and at 20°C for 3 minutes to inactivate Benzonase, and this was used as a ddPCR (Droplet Digital PCR) sample. did. The ddPCR sample was diluted 50 times with TE buffer (pH 8.0, containing 0.05% Pluronic F-68 and 10 ⁇ g/mL calf thymus DNA).
  • TE buffer pH 8.0, containing 0.05% Pluronic F-68 and 10 ⁇ g/mL calf thymus DNA.
  • droplets were formed from the prepared solution using a droplet forming device, followed by incubation at 95°C for 10 minutes, 40 cycles of 94°C for 30 seconds and 55°C, and 98°C for 10 minutes. Measurement was performed using a droplet reader, and AAV genome titer (vg/mL) was calculated.
  • Table 1 shows the electrical conductivity of the complex solution, the average particle diameter of the complex, and the gene transfer efficiency (relative value) when transfecting cells at 2 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • the electrical conductivity of the complex solution, the average particle diameter of the complex, the gene transfer efficiency (relative value), and the AAV5 genome titer (relative value) are shown when transfecting cells at 2 ⁇ 10 7 cells/mL. Shown in 2.

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Abstract

本発明の課題は、細胞へ核酸を導入する方法であって、高密度の細胞に対して高濃度の核酸を、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体として、効率よく導入できる方法；核酸を導入した細胞の製造方法、並びに有用物質の製造方法；並びにカチオン性ポリマーと核酸とを含む組成物、並びに上記組成物と細胞とを含む細胞培養物、を提供することである。本発明によれば、（ａ）カチオン性ポリマーと核酸とを混合してカチオン性ポリマー及び核酸の複合体の溶液を得る複合体形成工程であって、上記複合体形成工程において上記核酸の濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬであり、混合後の複合体溶液の電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである複合体形成工程；及び（ｂ）工程（ａ）で得られた複合体溶液を細胞懸濁液に添加するトランスフェクション工程；を含む、細胞へ核酸を導入する方法が提供される。

Description

細胞へ核酸を導入する方法およびその応用
　本発明は、カチオン性ポリマー及び核酸の複合体を細胞にトランスフェクションすることを含む、細胞へ核酸を導入する方法に関する。本発明はさらに、核酸を導入した細胞の製造方法、並びに有用物質の製造方法に関する。本発明はさらに、カチオン性ポリマーと核酸とを含む組成物、並びに上記組成物と細胞とを含む細胞培養物に関する。
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの遺伝子治療薬を製造するために、細胞に遺伝子を一過性トランスフェクションすることが行われている。ＡＡＶベクターの製造方法としては、例えば、ＨＥＫ（Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌｓ）２９３細胞株に、核酸であるＡＡＶ製造用プラスミドを一過的に導入し、ＡＡＶベクターを製造させる方法が挙げられる。
　核酸の細胞内への導入は、抗体製剤や遺伝子治療のような医療応用はもちろん、分子細胞生物学の基礎研究に必須である。例えば、遺伝子の細胞内への導入方法として、ウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法、および非ウイルス性のトランスフェクション方法が知られている。
　ウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法は高レベルの遺伝子導入をもたらす。ウイルスベクターは効率的な遺伝子導入担体であるが、それらの使用は、免疫反応の誘発およびウイルス関連の病原性のために制限がある。
　非ウイルス性のトランスフェクション方法は、ウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法が有する問題がなく、核酸からの医薬品の製造においては有利である。非ウイルス性のトランスフェクション方法によれば、製品を高い再現性で許容できる価格で製造することができる。
　非ウイルス性のトランスフェクション方法は多くの方法が知られており、その主要な方法としてカチオン性脂質および／またはカチオン性ポリマーを使用する方法を例示できる。現在、カチオン性脂質やカチオン性ポリマーを主成分とした一連の非ウイルス性トランスフェクション試薬が市販され、そして使用されている。
　カチオン性ポリマーの代表例であるポリエチレンイミン（以下、ＰＥＩ）は、低価格、非ウイルス性、そして非リポソーム型のトランスフェクション試薬であり、費用対効果の高い媒体の１つとして知られている。ＰＥＩは、核酸と複合体を形成し、細胞に対する低い毒性を伴なって効率的に遺伝子をトランスフェクションすることができる。このＰＥＩ／核酸複合体はエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。ＰＥＩはｐＨ緩衝能が高く、取り込まれたＤＮＡをリソソームでの分解から保護し、そしてリソソームから細胞質へ効率的に放出させる。このようにＰＥＩはトランスフェクション試薬として有用であり、ＤＮＡの哺乳動物細胞へのトランスフェクションに使用されている。
　例えば、特許文献１には、ＰＥＩと核酸との複合体の形成時に遊離のＰＥＩを追加で添加する方法が記載されている。特許文献２には、ポリエチレングリコールをグラフトさせたＰＥＩを用いて核酸をトランスフェクションすることが記載されている。特許文献３には、ポリエチレングリコールで修飾されたＰＥＩを用いて核酸をトランスフェクションすることが記載されている。特許文献４には、ＰＥＩと核酸との複合体の形成時のｐＨを　３．５から４．５の酸性条件下に規定することが記載されている。非特許文献１および２においても、ＰＥＩをトランスフェクションに使用することが記載されている。
特表２０２０－５２４４９８号公報 特開２０２１－１０６５８０号公報 特表２００２－５０６４４１号公報 特開２０１１－２４４９３号公報
Ogris, M. et al., The size of DNA/transferring-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells. Gene Ther. 5, (1998) 1425-1433. Gonzalez-Dominguez et al(2019) Impact of physicochemical properties of DNA/PEI complexes on transient transfection of mammalian cells, New Biotechnology, Volume 49, 25 March 2019, pages 88-97
　従来の遺伝子導入工程では、核酸とＰＥＩとの複合体を形成させるステップにおいては、複合体の粒子径を制御する観点から、複合体濃度を適切な範囲にする必要がある。
　一方、目的物質を大量に製造するために鋭意検討した結果、細胞に対して、高濃度の核酸を導入することが必要になることが分かった。しかし、そのためには、複合体を形成するステップにおける複合体濃度を適切な範囲内に保つという観点から、溶媒量も増加させる必要がある。複合体濃度を適切な範囲内に保てない場合には、遺伝子導入効率が著しく低下し、目的タンパク質を大量に製造することが達成できなくなるからである。
　本発明は、細胞へ核酸を導入する方法であって、高濃度の核酸を、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体として、効率よく導入できる方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記した細胞へ核酸を導入する方法を利用した、核酸を導入した細胞の製造方法、並びに有用物質の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記の方法に関連した、カチオン性ポリマーと核酸とを含む組成物、並びに上記組成物と細胞とを含む細胞培養物を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、カチオン性ポリマーと核酸とを混合してカチオン性ポリマー及び核酸の複合体の溶液を得る複合体形成において、複合体溶液の電気伝導度を１．０～７．０ｍＳ／ｃｍとすることによって、上記の課題を解決できることを見出した。本発明は、上記知見に基づいて完成したものである。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　（ａ）カチオン性ポリマーと核酸とを混合してカチオン性ポリマー及び核酸の複合体の溶液を得る複合体形成工程であって、上記複合体形成工程において上記核酸の濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬであり、混合後の複合体溶液の電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである複合体形成工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた複合体溶液を細胞懸濁液に添加するトランスフェクション工程；
を含む、細胞へ核酸を導入する方法。
＜２＞　電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである時期が、カチオン性ポリマーと核酸との混合の開始後０分～１０分の何れかである、＜１＞に記載の方法。
＜３＞　上記核酸の濃度が１１０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬである、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞　カチオン性ポリマーと核酸との質量比が８：１～１：１である、＜１＞～＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞　上記複合体溶液と接触したときの細胞懸濁液の細胞密度が、１×１０５細胞／ｍＬ～５×１０８細胞／ｍＬである、＜１＞～＜４＞のいずれか一に記載の方法。
＜６＞　上記複合体溶液と接触したときの細胞懸濁液の細胞密度が、５×１０６細胞／ｍＬ～３×１０７細胞／ｍＬである、＜１＞～＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞　上記複合体の形成に用いられる核酸の総量が、細胞１００万個あたり、０．１～１μｇである、＜１＞～＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞　上記複合体溶液の電気伝導度が３．０～５．０ｍＳ／ｃｍである、＜１＞～＜７＞のいずれか一に記載の方法。
＜９＞　上記複合体の平均粒子径が２００ｎｍ～１２００ｎｍである、＜１＞～＜８＞のいずれか一に記載の方法。
＜１０＞　上記複合体形成工程（ａ）において、工程（ｂ）の前に、カチオン性ポリマーと核酸を混合後、複合体の溶液を１０秒～４時間静置することを含む、＜１＞～＜９＞のいずれか一に記載の方法。
＜１１＞　複合体溶液と細胞懸濁液の体積比が１：２～１：５００である、＜１＞～＜１０＞のいずれか一に記載の方法。
＜１２＞　カチオン性ポリマーが、ポリアミンである、＜１＞～＜１１＞のいずれか一に記載の方法。
＜１３＞　カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンである、＜１＞～＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
＜１４＞　上記核酸がプラスミドである、＜１＞～＜１３＞のいずれか一に記載の方法。
＜１５＞　上記細胞が、動物細胞である、＜１＞～＜１４＞のいずれか一に記載の方法。
＜１６＞　上記細胞が、ＨＥＫ細胞である、＜１＞～＜１４＞のいずれか一に記載の方法。
＜１７＞　＜１＞～＜１６＞の何れか一に記載の方法を含む、核酸を導入した細胞の製造方法。
＜１８＞　＜１＞～＜１６＞の何れか一に記載の方法により核酸を細胞に導入する工程、及び
上記細胞を培養して有用物質を製造する工程、
を含む、有用物質の製造方法。
＜１９＞　有用物質がウイルスベクターである、＜１８＞に記載の方法。
＜２０＞　ウイルスベクターが、医薬品原薬である、＜１９＞に記載の方法。
＜２１＞　カチオン性ポリマーと核酸とを含む組成物であって、核酸濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬであり、電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである組成物。
＜２２＞　遺伝子導入のための組成物である、＜２１＞に記載の組成物。
＜２３＞　＜２１＞又は＜２２＞に記載の組成物と、細胞密度が１×１０５細胞／ｍＬ～５×１０８細胞／ｍＬである細胞とを含む、細胞培養物。
　本発明によれば、細胞に対して高濃度の核酸を、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体として、効率よく細胞に導入することができる。本発明によれば、高濃度での核酸とカチオン性ポリマーとの複合体の形成が可能となり、複合体を導入する細胞を高密度にすることに伴う実質的な培養スケールの減少を回避することが可能である。
　以下、本開示の実施形態の一例について説明する。但し、本開示は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本開示の目的の範囲内において、適宜、変更を加えて実施することができる。本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
　本発明は、
（ａ）カチオン性ポリマーと核酸とを混合してカチオン性ポリマー及び核酸の複合体の溶液を得る複合体形成工程であって、上記複合体形成工程において上記核酸の濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬであり、混合後の複合体溶液の電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである複合体形成工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた複合体溶液を細胞懸濁液に添加するトランスフェクション工程；
を含む、細胞へ核酸を導入する方法に関する。
　本発明の第一の特徴は、複合体形成工程において核酸の濃度が、高濃度であること、即ち１００～１０００μｇ／ｍＬであることである。本発明の第二の特徴は、混合後の複合体溶液の電気伝導度が　１．０～７．０ｍＳ／ｃｍであることを規定していることである。
　本発明を限定するわけではないが、本発明においては、安定剤（ポリエチレングリコールなど）や増強剤（ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーを後で添加すること）は不要である。また、本発明を限定するわけではないが、本発明においては、ＰＥＩと核酸との複合体の形成時のｐＨを３．５から４．５の酸性条件とする必要もない。
　本発明においては、複合体形成工程において核酸の濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬという高濃度であっても、複合体溶液の電気伝導度を１．０～７．０ｍＳ／ｃｍの範囲内にすることによって複合体の粒子径の増大を制御することができ、これにより、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を効率よく細胞に導入することができる。
　本発明においては、カチオン性ポリマーと核酸とを混合して、カチオン性ポリマー及び核酸の複合体の溶液を得る。
　カチオン性ポリマーとしては、特に限定されないが、例えば、キトサン、ポリ－Ｌ－リジン（ｐＬＬ）、ポリアミン（ＰＡ）、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［ａ－（－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］、ポリアミドアミン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチル メタクリレート、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、ポリ（４－ビニルピリジン）、ポリ（ビニルアミン）およびポリ（４－ビニル－Ｎ－アルキルピリジニウムハライド）からなる群から選択される一種またはその組み合わせを使用することができる。
　カチオン性ポリマーとしては、ポリアミンが好ましく、ポリエチレンイミン（以下ＰＥＩとも表記する）が特に好ましい。カチオン性ポリマーとしては、非脂質性カチオン性ポリマーを使用することが好ましい。
　ＰＥＩは直鎖ＰＥＩでもよく、分枝ＰＥＩでもよいが、好ましくは直鎖ＰＥＩである。
　ＰＥＩの分子量は、そのトランスフェクション効率を考慮すると、好ましくは１０，０００～８００，０００Ｄａであり、より好ましくは１０，０００～５０，０００Ｄａ、さらに好ましくは１０，０００～２７，０００Ｄａ、特に好ましくは約２５，０００Ｄａである。一例としては分子量約２５，０００Ｄａの直鎖ＰＥＩを使用することができる。ＰＥＩは市販されており、容易に入手することができる。例えば、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社製のＰＥＩｐｒｏ（１０１００００３３）を好ましく使用できる。
　核酸とは、プリンまたはピリミジン塩基、糖、およびリン酸からなるヌクレオチドを基本単位とし、このリン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合を形成することにより重合した鎖状のポリヌクレオチドをいう。糖の違いにより、糖部分がデオキシリボースであるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と、糖部分がリボースであるリボ核酸（ＲＮＡ）とに大別される。核酸としては、遺伝子、ＤＮＡ（直鎖状ＤＮＡ又は環状ＤＮＡ）、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの何れでもよい。
　核酸は、本明細書において、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。
　本発明における核酸の一例としては、プラスミドである。
　複合体形成工程における核酸の濃度は１００μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは１１０μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは１１０μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは１１０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬであり、特に好ましくは１１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬであり、最も好ましくは１１０μｇ／ｍＬ～１５０μｇ／ｍＬである。
　核酸濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）２０００ｃ（ＮＤ－２０００ｃ，　Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｆｉｔｉｃ）　の微量分光光度計にて測定することができる。
　複合体形成工程において、カチオン性ポリマーと核酸との質量比は、好ましくは８：１～１：１であり、より好ましくは５：１～１：１であり、さらに好ましくは３：１～１：１である。
　本発明において、複合体溶液の電気伝導度は１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである。複合体溶液の電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである時期は、カチオン性ポリマーと核酸との混合の開始後０分～１０分の何れかであればよい。
　複合体溶液の電気伝導度は、好ましくは２．０ｍＳ／ｃｍ～６．０ｍＳ／ｃｍであり、より好ましくは３．０ｍＳ／ｃｍ～５．０ｍＳ／ｃｍである。
　複合体溶液の電気伝導度は、電気伝導度メーターを用い、２５℃に温調した各サンプルに電気伝導度メーターの電極を差し込み、電気伝導度を測定することにより測定することができる。
　複合体形成工程において形成される複合体の平均粒子径は、好ましくは２００ｎｍ～１２００ｎｍであり、より好ましくは３００ｎｍ～１２００ｎｍであり、さらに好ましくは４００ｎｍ～１１００ｎｍであり、特に好ましくは５００ｎｍ～１０００ｎｍである。
　複合体の平均粒子径は、散乱強度基準として、動的光散乱法で測定することができる。解析法はキュムラント法で、粘度と屈折率は粘度計と屈折率計で実測した値を使用することにより測定することができる。
　複合体形成工程（ａ）において、好ましくは、工程（ｂ）の前に、カチオン性ポリマーと核酸を混合後、複合体溶液を１０秒～４時間静置してもよく、より好ましくは１分～６０分静置してもよく、さらに好ましくは１０分～３０分静置してもよい。また、静置時の温度は摂氏１５℃～３５℃が好ましく、摂氏２０℃～３０℃がより好ましく、摂氏２２℃～２８℃が特に好ましい。
　本発明においては、工程（ａ）で得られた複合体溶液を細胞懸濁液に添加するトランスフェクション工程を行う。トランスフェクションとは、細胞に核酸を導入することを意味する。
　複合体溶液と接触したときの細胞懸濁液の細胞密度は、特に限定されないが、好ましくは１×１０５細胞／ｍＬ～５×１０８細胞／ｍＬであり、より好ましくは１×１０５細胞／ｍＬ～１×１０８細胞／ｍＬであり、さらに好ましくは５×１０５細胞／ｍＬ～５×１０７細胞／ｍＬであり、特に好ましくは１×１０６細胞／ｍＬ～３×１０７細胞／ｍＬであり、最も好ましくは５×１０６細胞／ｍＬ～３×１０７細胞／ｍＬである。
　細胞密度は、Ｖｉ－ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を使用して決定することができる。
　複合体の形成に用いられる核酸の総量は、特に限定されないが、好ましくは、細胞１００万個あたり、０．１～１μｇであり、より好ましくは、細胞１００万個あたり、０．２～０．９μｇであり、さらに好ましくは、細胞１００万個あたり、０．３～０．８μｇであり、特に好ましくは、細胞１００万個あたり、０．４～０．７μｇである。
　複合体溶液と細胞懸濁液の体積比は、特に限定されないが、好ましくは１：２～１：５００であり、より好ましくは、１：５～１：３００であり、特に好ましくは、１：１０～１：２００であり、最も好ましくは、１：２０～１：２００である。複合体溶液と細胞懸濁液の体積比の下限は、１：５、１：１０、または１：２０でもよい。複合体溶液と細胞懸濁液の体積比の上限は、１：３００、または１：２００でもよい。
　本発明で用いる細胞としては、単離された細胞、単離された生体由来組織に含まれる細胞、および培養細胞のいずれでもよい。細胞が、単離された細胞または培養細胞である場合、細胞は、接着性細胞又は浮遊性細胞の何れでもよい。
　細胞としては、動物細胞が好ましい。動物細胞としては特に限定されないが、好ましくは哺乳動物細胞または昆虫細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞などを挙げることができるが、特に限定されない。好ましくはヒト細胞を使用することができる。細胞の例としては、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（乳児ハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１－３、ＨＥＫ（Human Embryonic Kidney cells：ヒト胎児由来腎臓細胞）細胞（例えばＨＥＫ２９３など）、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。好ましくは、細胞はＨＥＫ細胞またはＣＨＯ細胞であり、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞である。
　本発明によれば、本発明による細胞へ核酸を導入する方法を含む、核酸を導入した細胞の製造方法が提供される。
　本発明によればさらに、本発明の方法により核酸を細胞に導入する工程、及び上記細胞を培養して有用物質を製造する工程、を含む、有用物質の製造方法が提供される。
　有用物質としては、特に限定されないが、ウイルスベクターまたはタンパク質などを挙げることができる。有用物質としては、好ましくはウイルスベクターである。製造されるタンパク質またはウイルスベクターは、例えば、医薬品原薬として使用するものでもよい。
　ウイルスとは、核酸を細胞に導入して製造させるウイルスを意味する。ウイルスとしては、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスなどが挙げられ、上記の中でもアデノ随伴ウイルスが好ましい。
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科及びディペンドパルボウイルス属のファミリーの約４７００塩基からなる一本鎖ＤＮＡを含む、小型の、複製能の不完全な、非エンベロープ型ウイルスを指す。ＡＡＶには１００を超える血清型が存在しており、血清型の違いによって宿主域やウイルスの持つ特徴が異なることが知られている。血清型２（ＡＡＶ２）は古くから広く研究されてきた血清型の一つであり、宿主域が非常に広いことが知られている。血清型１（ＡＡＶ１）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）は、より高い組織指向性を持った血清型である。ＡＡＶ１は筋肉、肝臓、気道、中枢神経系等、ＡＡＶ５は中枢神経系、肝臓、網膜等、ＡＡＶ６は心臓、筋肉、肝臓等への遺伝子導入効率が高いと言われている。本発明においては血清型２または血清型５で用いることが好ましい。特に好ましくは血清型５である。
　アデノ随伴ウイルス遺伝子とは、一つ又は複数のアデノ随伴ウイルスの血清型に由来する一つ又は複数の核酸配列から構成される遺伝子を指す。アデノ随伴ウイルス遺伝子は、好ましくは、ＡＡＶの複製及びパッケージングに関与する遺伝子、及びＡＡＶ構成タンパク質をコードする遺伝子である。
　ＡＡＶは、アデノウイルスやヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下で増殖する非エンベロープウイルスである。遺伝子治療もしくは核酸導入に用いるＡＡＶを作製する際には、古典的にはアデノウイルスを宿主細胞に共感染させて、ＡＡＶ複製が行なわれていた。また、アデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子が明らかにされ、この遺伝子を搭載したプラスミドも使用されている。例えば、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むプラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、および治療又は予防用遺伝子を含むプラスミドを同時に細胞にトランスフェクションすることで組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）へとパッケージングすることができる。
　Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子は、ビリオンの複製とパッケージングに関与するタンパク質をコードしている。Ｒｅｐ遺伝子は野生型では、Ｐ５プロモーターおよびｐ１９プロモーターから発現される。Ｃａｐ領域は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を発現させる。Ｃａｐ遺伝子が天然に保持するプロモーターとしてはｐ４０プロモーターを挙げることができる。
　アデノ随伴ウイルス遺伝子（Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子など）は、野生型の遺伝子でもよいが、本来有する機能を発揮するものである限り、野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変がなされた遺伝子を使用してもよい。
　Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を細胞に導入する場合、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むベクターを細胞に導入することができる。Ｒｅｐ遺伝子は、当業者に公知の、ウイルスゲノムの複製に集合的に必要とされるウイルスの複製タンパク質、又は、例えばヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）Ｒｅｐ遺伝子など（ＡＡＶ－２  ＤＮＡ複製を媒介することが公知）の、その機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。Ｃａｐ遺伝子は、当業者に公知のウイルスのカプシドタンパク質をコードするＡＡＶゲノム中の領域を意味する。
　Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含むベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルス由来の核酸配列、人工的に設計した核酸などを使用することができ、好ましくは、プラスミドである。
　本発明においては、治療又は予防用遺伝子を細胞に導入してもよい。
　治療又は予防用遺伝子としては、標的細胞のゲノムにおいては不完全であるか又は失われている遺伝子、または、所望の生物学的又は治療的効果（例えば抗ウイルス機能）を有する非天然タンパク質をコードする遺伝子などを使用することができるが、特に限定されない。治療又は予防用遺伝子の具体例としては、炎症性疾患、自己免疫、慢性及び伝染性疾患（ＡＩＤＳ、癌、神経系疾患、心血管疾患、過剰コレスタ血症などの障害を含む）、貧血及び血友病などの各種の血液疾患、遺伝子欠損（例えば嚢胞性線維形成、ゴーシェ疾患、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、気腫など）の治療又は予防のために使用される遺伝子が挙げられる。
　治療又は予防用遺伝子としては、がんに対する、及びウイルス疾患に対するアンチセンス療法において有用であるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）周辺の配列に対する相補的短鎖オリゴヌクレオチド）でもよい。
　治療又は予防用遺伝子は、治療又は予防用遺伝子を発現させるためのプロモーターに連結されていてもよい。治療又は予防用遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター（所望によりエンハンサーを含む）、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどを挙げることができる。治療又は予防用遺伝子および遺伝子を発現させるためのプロモーターはＩＴＲ配列に挟まれていることが好ましい。
　本発明においては、好ましくは、アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子を細胞に導入してもよい。ウイルスヘルパー遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製及びパッケージングを可能にするための非アデノ随伴ウイルス遺伝子である。ウイルスヘルパー遺伝子としては、アデノ随伴ウイルス以外の他種ウイルスに由来する遺伝子が使用される。ウイルスヘルパー遺伝子の具体例としては、アデノウイルス又はヘルペスウイルスに由来するウイルスヘルパー遺伝子を挙げることができ、好ましくは、ウイルスヘルパー遺伝子は、アデノウイルス由来である。
　アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ－ＲＮＡなどを挙げることができる。Ｅ１領域の全部又はその一部を有する宿主細胞において、ＡＡＶのゲノムが複製されてカプシドにパッケージングされて、ウイルスビリオンを形成するために必要なアデノウイルスゲノムの領域は、Ｅ２Ａ領域、Ｅ４領域、及びＶＡ１　ＲＮＡ領域である。Ｅ４領域による機能について、Ｅ４領域のオープンリーディングフレーム６（Ｅ４ＯＲＦ６）によりコードされるＥ４　３４ｋＤａ蛋白質がＡＡＶの複製に必要とされる。好ましくは、ウイルスヘルパー遺伝子は、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびＶＡ－ＲＮＡ遺伝子である。ＶＡ－ＲＮＡ遺伝子は、好ましくは、ＶＡ－ＲＮＡＩ遺伝子である。
　アデノウイルス由来のウイルスヘルパー遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ－ＲＮＡなど）は、野生型の遺伝子でもよいが、本来有する機能を発揮するものである限り，野生型の遺伝子に、塩基の置換、欠失、挿入または付加等の改変がなされた遺伝子を使用してもよい。
　ウイルスヘルパー遺伝子を細胞に導入する場合、ウイルスヘルパー遺伝子を含むベクターを細胞に導入することができる。
　ウイルスヘルパー遺伝子を含むベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルス由来の配列、人工的に設計した核酸などを使用することができ、好ましくは、プラスミドである。
　ウイルスヘルパー遺伝子は、プロモーターの制御下にあることが好ましい。
　プロモーターの具体例としては、特に限定されないが、サイトメガロウイルス由来プロモーター（ＣＭＶプロモーター）（所望によりエンハンサーを含む）、ＳＶ４０初期プロモーター、ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどを挙げることができる。プロモーターとしては、発現調節可能なプロモーターの制御下にあってもよい。発現調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンにより発現調節可能なプロモーターであるＴｅｔオン／オフシステムでもよく、Ｔｅｔオンシステムでもよい。
　本発明においては、有用物質としてタンパク質を製造することもできる。タンパク質は、好ましくは組み換えタンパク質である。タンパク質としては、例えば、組み換えポリペプチド鎖、組み換え分泌ポリペプチド鎖、抗原結合タンパク質、抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、バイスペシフィック抗体など）、Ｆｃ融合タンパク質、断片化免疫イムノグロブリン、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。
　タンパク質は、好ましくは抗体であり、より好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はマウス抗体である。断片化免疫イムノグロブリンとしては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどが挙げられる。抗体のクラスも特に限定されるものではなく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどいずれのクラスでもよいが、医薬として用いる場合はＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。
　抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗ＩＬ－６レセプター抗体、抗ＩＬ－６抗体、抗グリピカン－３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。
　本発明においては、核酸が導入された細胞を培養して有用物質を製造することができる。
　細胞の培養は、細胞の培養のための通常の条件において行うことができる。
　細胞の培養温度は、特に限定されず、細胞が生存可能な温度で実施する。培養温度は、一般的には２５℃～４５℃であり、好ましくは３０℃～４２℃であり、より好ましくは３５℃～４０℃であり、一例としては３７℃である。
　ＣＯ２濃度は、一般的には３～１０％ＣＯ２であり、好ましくは５～１０％ＣＯ２であり、一例としては８％ＣＯ２である。
　ウイルスなどの有用物質を製造する期間は、好ましくは２４時間以上３０日以下であり、より好ましくは２４時間以上２０日以下であり、さらに好ましくは２４時間以上１０日以下であり、さらに好ましくは２４時間以上７日以下であり、特に好ましくは２４時間以上７２時間以下である。
　培養は、バッチ培養、流加培養、灌流培養、または振とう培養を行うことができる。ウイルス製造工程の少なくとも一部は、灌流培養であることが好ましい。
　培養容器は、特に限定されず、例えば、フラスコまたはバイオリアクターのいずれでもよい。
　培養スケールは特に限定されず、任意の体積の培地において培養することができ、例えば、１ｍＬから２５００Ｌの培地において細胞を培養することができ、好ましくは１Ｌ～２３００Ｌであり、５０Ｌ～２２００Ｌがより好ましく、３００Ｌ～２１００Ｌが特に好ましい。
　培養は振盪攪拌しながら行ってもよい。振盪攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。
　攪拌培養は、リアクター内のプロペラ等による回転攪拌培養であっても良い。回転攪拌する場合の攪拌速度は、一般的には５０ｒｐｍ～２００ｒｐｍであり、好ましくは８０～１５０ｒｐｍである。また、波型振盪撹拌や、撹拌翼の上下動によって撹拌してもよいが、特に限定されない。
　培地の例としては、これらに限定されるものではないが、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）培地、Ｅｘｐｉ２９３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、 Gibco(商標) Viral Production Medium （Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， A4817901）、無血清ＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ（商標）培地（Ｌｏｎｚａ）、ＨｕＭＥＣ基礎無血清培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）ＣＴＳ（商標）ＸｅｎｏＦＲＥＥ ＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）－３４ ＳＦＭ培地、 ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）ＮＳＣ培地、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ（商標）－８培地、培地２５４ 、培地，１０６、培地，１３１、培地，１５４、培地，１７１、培地１７１、培地２００ 、培地２３１、ＨｅｐｔｏＺＹＭＥ－ＳＦＭ、ヒト内皮－ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、培地１５４ＣＦ／ＰＲＦ、培地１５４Ｃ 、培地１５４ ＣＦ、培地１０６、培地２００ＰＲＦ、培地１３１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ （商標）－６培地、ＳＴＥＭＰＲＯ（商標）－３４培地、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）アスト ロサイト培地、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標） Ｃ－１００基礎培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ（商標）－ＩＩ完全培地、ＣＤ ＦＯＲＴＩＣＨ Ｏ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培 地、ＣＤ ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＳＦ－９００（商標）培地、ＥＸＰＩ２９ ３（商標）発現培地、ＬＨＣ基礎培地、ＬＨＣ－８培地、２９３ ＳＦＭ培地、ＣＤ ２ ９３培地、ＡＥＭ成長培地、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞培地、ＡＩＭ Ｖ（登録商標）培地、ＥＸＰＩＬＩＦＥ（登録商標）培地、ケラチノサイトＳＦＭ培地、ＬＨＣ培地、 ＬＨＣ－８培地、ＬＨＣ－９培地、および任意の派生物またはその変形が挙げられる。ある特定の非限定的な実施形態において、高密度培養培地は、ＣＤ ＦＯＲＴＩＣＨＯ（商標）培地、ＣＤ ＣＨＯ ＡＧＴ培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）ＣＨＯ発現培地、ＣＤ ＯＰＴＩＣＨＯ（商標）培地、Ｃ Ｄ ＣＨＯ培地、ＣＤ ＤＧ４４培地、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３発現培地、ＥＸＰＩ２９３（商標）発現培地、ＬＶ－ＭＡＸ（商標）産生培地 、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）Ｆ１７発現培地、ＤＹＮＡＭＩＳ（商標）培地、もしくは同様の培地、またはそれらの変形形態であってもよい。培地には、所望により、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）などを補充してもよい。これらのうち、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）培地、Ｅｘｐｉ２９　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１４３５１０１）、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、 Gibco(商標) Viral Production Medium （Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， A4817901）、ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）Ｆ１７発現培地　が特に好ましい。
　本発明において製造される有用物質がウイルスである場合、製造されたウイルスの力価は、当業者に公知の通常の方法により測定することができる。例えば、培養後の細胞培養液を回収し、凍結融解にて細胞を破砕した後、遠心分離によって上清を回収する。回収した上清にＭｇＣｌ２及びＢｅｎｚｏｎａｓｅを添加して反応を行うことにより、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化することができる。上記により得られた目的ウイルスを含むサンプルを、ｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ）サンプルとして使用し、ｄｄＰＣＲを行うことにより目的ウイルスの力価を測定することが可能である。
　本発明によればさらに、カチオン性ポリマーと核酸とを含む組成物であって、核酸濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬであり、電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである組成物が提供される。カチオン性ポリマー、核酸、核酸濃度、および電気伝導度についての好ましい範囲は、本明細書において上記した通りである。上記組成物は、遺伝子導入のための組成物として有用である。
　本発明によればさらに、上記組成物と、細胞密度が１×１０５細胞／ｍＬ～５×１０８細胞／ｍＬである細胞とを含む、細胞培養物が提供される。細胞密度、および細胞についての好ましい範囲は、本明細書において上記した通りである。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜細胞培養液＞
　ＨＥＫ－２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３，Ａ１４５２７，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を補充したＢａｌａｎＣＤ培地（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ　Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ製）で培養した。
　細胞は、振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）又はバイオリアクターで培養した。振盪フラスコでは、３７℃のインキュベーターで１２０ｒｐｍの攪拌と８％ＣＯ２の加湿雰囲気で細胞を培養した。プレ培養として、０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞を播種し、細胞密度がおよそ２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達したとき、核酸複合体の添加による遺伝子導入を行った。　
＜核酸＞
　アデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）を作製するために３つのプラスミドＤＮＡを使用した：１）ＩＴＲが隣接した導入目的遺伝子を含むプラスミド、２）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むパッケージングプラスミド、３）アデノウイルスを含むアデノウイルスヘルパープラスミドＥ２、Ｅ４及びＶＡＲＮＡ遺伝子。全てのプラスミドは、ＡＡＶｐｒｏ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｐｌａｓｍｉｄ（ＡＡＶ５，６６５０，タカラバイオ製）を使用した。１）については、目的遺伝子としてＣＭＶプロモーター下流にＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）を挿入して使用した。
＜カチオン性ポリマー＞
　直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）「ＰＥＩ　ｐｒｏ」分子量２５ＫＤａ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ製）を遺伝子導入試薬として使用した。
＜トランスフェクション＞
　トランスフェクションに使用したプラスミドＤＮＡの総量は、細胞１００万個あたり０．５μｇであった。
　ＰＥＩとプラスミドＤＮＡを１：１、もしくは２：１、もしくは３：１でＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を調製し、室温で１５分間インキュベートし、プラスミドＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を細胞培養液に加えた。予備試験の結果、PEIとプラスミドDNAの混合比は２：１の場合が遺伝子導入効率の観点から好ましかったため、以下の実施例は混合比２：１の場合について記載する。
　このとき、プラスミドＤＮＡとＰＥＩを混合し、複合体を形成させる過程を標準条件と比較して以下に記載する。
標準条件（参考例）：
プラスミドとＰＥＩ（溶媒：　ＢａｌａｎＣＤ培地、電気伝導度１０．1　ｍＳ／ｃｍ）を混合し、プラスミドの終濃度を１３μｇ／ｍＬ、ＰＥＩの終濃度を２６μｇ／ｍＬとなるように調製し、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨＥＫ細胞へトランスフェクションした。
高濃度条件（本発明）：
プラスミドとＰＥＩ（溶媒としてＢａｌａｎＣＤ培地と１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを３：７，４：６，５：５，６：４の比率で混合した電気伝導度調整溶媒を使用し、プラスミドとＰＥＩを混合前の溶媒の電気伝導度をそれぞれ３．７, ４．８，５．６，６．８ｍＳ／ｃｍとした ）を混合し、プラスミドの終濃度を１３０μｇ／ｍＬ、ＰＥＩの終濃度を２６０μｇ／ｍＬとなるように調整し、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＨＥＫ細胞へトランスフェクションした。
＊電気伝導度調整溶媒は、ＢａｌａｎＣＤ培地：１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を４：６の比で混合して作成した。
　細胞及び細胞培養液培地を含むサンプルは、細胞数、遺伝子導入効率測定のためにトランスフェクションの２４時間後に採取され、ＡＡＶ製造量評価のため、トランスフェクション７２時間後に回収された。
［電気伝導度］
　電気伝導度メーターを用い、２５℃に温調した各サンプルに電気伝導度メーターの電極を差し込み、電気伝導度を測定した。
［複合体の平均粒子径の測定］
　複合体の平均粒子径　（散乱強度基準）は、動的光散乱法を用いて２５℃で測定した。解析法はキュムラント法で、粘度と屈折率は粘度計と屈折率計で実測した値を使用した。
［細胞密度］
　細胞密度は、Ｖｉ－ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ製）を使用して決定した。　　
［遺伝子導入効率］
　遺伝子導入効率は、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ　Ｆｌｏｗｃｙｔｅｍｅｔｅｒ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）で、遺伝子導入操作２４時間後におけるＥＧＦＰ発現細胞の割合を評価した。
　従来法との遺伝子導入効率を比較するうえでは、従来法のＥＧＦＰ発現細胞割合に対する相対値で評価した。なお、３つのプラスミドＤＮＡの比率は参考例、本発明ともに３種プラスミドのモル比を１：１：１とした。
[ＡＡＶ力価測定]
　遺伝子導入後７２時間、３７℃、８％ＣＯ２条件下で培養を行ったＨＥＫ細胞培養液を回収した。その後、終濃度０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）、終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、２５Ｕ／ｍＬ　Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ製）を添加し、３７℃で２時間反応を行い、ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）や残存プラスミドを消化した。反応後のサンプルは、９５℃で１５分、７０℃で３分、４０℃で３分、２０℃で３分の順にインキュベーションし、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを失活させ、これをｄｄＰＣＲ（Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ）サンプルとした。ｄｄＰＣＲサンプルはＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０，０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８　および１０μｇ／ｍＬウシ胸腺ＤＮＡ含有）で５０倍に希釈した。氷上でチューブにｄｄＰＣＲｔｍ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（ｎｏ　ｄＵＴＰ）（ＢＩＯＲＡＤ社）１０μＬ、希釈済みのｄｄＰＣＲサンプル２μＬ、プライマー（ｓｅｑ１、ｓｅｑ２、最終濃度９００ｎｍｏｌ／Ｌ）およびプローブ（ｓｅｑ３、最終濃度２５０ｎｍｏｌ／Ｌ、蛍光プローブとしてＦＡＭ（フルオレセインアミダイト）を付加）、ヌクレアーゼフリーｗａｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１０９７７０１５）を混合して、総液量２２μＬに調整し、ｄｄＰＣＲを行った。
　ｄｄＰＣＲにおいては、ドロップレット形成機器にて調製液からドロップレットを形成し、続いて９５℃で１０分、９４℃で３０秒および５５℃を４０サイクル、９８℃で１０分の順でインキュベーションした。ドロップレットリーダーにより測定を行い、ＡＡＶゲノム力価（ｖｇ／ｍＬ）を算出した。
ｓｅｑ１　 GGAACCCCTAGTGATGGAGTT（配列番号１）
ｓｅｑ２　 CGGCCTCAGTGAGCGA（配列番号２）
ｓｅｑ３　 CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG（配列番号３）
　２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞にトランスフェクションした場合について、複合体溶液の電気伝導度、複合体の平均粒子径、および遺伝子導入効率（相対値）を表１に示す。
　２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞にトランスフェクションした場合について、複合体溶液の電気伝導度、複合体の平均粒子径、遺伝子導入効率（相対値）、およびAAV5ゲノム力価（相対値）を表２に示す。
　表１及び表２に示す通り、電気伝導度を規定した溶媒中で複合体形成を制御することにより、高濃度の複合体形成条件においても、導入効率を維持することができた。
　表２に示す通り、電気伝導度を規定した溶媒中で複合体形成を制御してトランスフェクションすることにより、従来法と同等以上のＡＡＶ力価を達成することができた。

Claims (23)

  1. （ａ）カチオン性ポリマーと核酸とを混合してカチオン性ポリマー及び核酸の複合体の溶液を得る複合体形成工程であって、前記複合体形成工程において前記核酸の濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬであり、混合後の複合体溶液の電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである複合体形成工程；及び
    （ｂ）工程（ａ）で得られた複合体溶液を細胞懸濁液に添加するトランスフェクション工程；
    を含む、細胞へ核酸を導入する方法。
  2. 電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである時期が、カチオン性ポリマーと核酸との混合の開始後０分～１０分の何れかである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記核酸の濃度が１１０μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. カチオン性ポリマーと核酸との質量比が８：１～１：１である、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記複合体溶液と接触したときの細胞懸濁液の細胞密度が、１×１０５細胞／ｍＬ～５×１０８細胞／ｍＬである、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記複合体溶液と接触したときの細胞懸濁液の細胞密度が、５×１０６細胞／ｍＬ～３×１０７細胞／ｍＬである、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 前記複合体の形成に用いられる核酸の総量が、細胞１００万個あたり、０．１～１μｇである、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 前記複合体溶液の電気伝導度が３．０～５．０ｍＳ／ｃｍである、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 前記複合体の平均粒子径が２００ｎｍ～１２００ｎｍである、請求項１又は２に記載の方法。
  10. 前記複合体形成工程（ａ）において、工程（ｂ）の前に、カチオン性ポリマーと核酸を混合後、複合体の溶液を１０秒～４時間静置することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  11. 複合体溶液と細胞懸濁液の体積比が１：２～１：５００である、請求項１又は２に記載の方法。
  12. カチオン性ポリマーが、ポリアミンである、請求項１又は２に記載の方法。
  13. カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンである、請求項１又は２に記載の方法。
  14. 前記核酸がプラスミドである、請求項１又は２に記載の方法。
  15. 前記細胞が、動物細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  16. 前記細胞が、ＨＥＫ細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  17. 請求項１又は２に記載の方法を含む、核酸を導入した細胞の製造方法。
  18. 請求項１又は２に記載の方法により核酸を細胞に導入する工程、及び
    前記細胞を培養して有用物質を製造する工程、
    を含む、有用物質の製造方法。
  19. 有用物質がウイルスベクターである、請求項１８に記載の方法。
  20. ウイルスベクターが、医薬品原薬である、請求項１９に記載の方法。
  21. カチオン性ポリマーと核酸とを含む組成物であって、核酸濃度が１００～１０００μｇ／ｍＬであり、電気伝導度が１．０～７．０ｍＳ／ｃｍである組成物。
  22. 遺伝子導入のための組成物である、請求項２１に記載の組成物。
  23. 請求項２１又は２２に記載の組成物と、細胞密度が１×１０５細胞／ｍＬ～５×１０８細胞／ｍＬである細胞とを含む、細胞培養物。
     
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