JP4402881B2 - 相補細胞株 - Google Patents
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Description
(発明の属する技術分野)
本発明は一般的にはバイオテクノロジーの分野に関し、特にはアデノウイルス基相補細胞株に関する。
【0002】
(従来の技術)
典型的には、ベクターおよびパッケージング細胞は、必要な素子を全て保持し、かつ組換えにより複製能力ウイルスに至るオーバーラップ素子を保持しないために、互いに適応性が必要である。したがって、パッケージング構成物の適正な転写に必要な配列は、例えば他のヒトアデノウイルス(Ad)血清型、非ヒトアデノウイルス、非制限的にSV40、B型肝炎ウイルス(HBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、サイトメガロウイルス(CMV)等の他のウイルスから誘導される、または哺乳動物等のより高度な真核生物から誘導される異種調節配列である。一般に、これらの配列はプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化配列を含む。
【0003】
PER.C6(ECACC寄託番号96022940)は、パッケージング構造体とアデノウイルスベクター間の配列オーバーラップが欠けている細胞株の一例である(Fallaux 等、1998年)。Ad5およびAd2等のサブグループCアデノウイルスに基づく組換えウイルスはこれらのパッケージング細胞上で効率的に増殖できる。サブグループBのような他の血清型からのアデノウイルスの産生および増殖はPER.C6細胞についてより困難であることがわかった。しかし、欧州特許出願第00201738.2に記載されているように、サブグループBウイルスAd35に基づく組換えウイルスはAd35初期領域−1配列(Ad35−E1)を含有する発現構造体の同時トランスフェクションにより作ることができる。さらに、E1A配列について除去されたAd基ウイルスはPER.C6細胞上で効率的に複製することが示された。したがって、Ad5相補Ad35−E1A機能のE1A蛋白質、Ad35のE1B機能の少なくとも1部は必要である。E1B機能におけるこの血清型特異性は最近Ad7組換えウイルスについても記載されている。サブグループBウイルスAd7由来の組換えアデノウイルスを産生するための試みにおいて、Abrahamsen等(1997年)は野生型(wt)Ad7の混入なく293細胞においてE1除去ウイルスを産生することができなかった。293−ORF6細胞におけるプラーク精製(Brough等、1996年)の後、採取されるウイルスは非異種組換えによりAd7E1Bを取り込むことが示された。したがって、Ad7組換えウイルスの効率的な増殖はAd7−E1B発現およびAd5−E4−ORF6発現の存在下においてのみ可能であることがわかった。E1B蛋白質は細胞およびウイルス蛋白質と相互作用することが知られている(Bridge 等、1993; White,1995年)。ウイルス蛋白質のmRNA輸出を増加するためにおよび殆どの細胞mRNAの輸出を阻害するために必要である、E1B55K蛋白質およびE4−ORF6間に形成される複合体は重要でありかつ場合によって血清型特異性である可能性がある。
【0004】
(発明の説明)
本発明は、アデノウイルス型35のような、サブグループBからの血清型等の、サブグループCウイルス以外の血清型に基づく組換えアデノウイルスに相補できる新規なパッケージング細胞株を提供する。
本発明は、一観点において、サブグループBの血清型、好ましくは血清型35に基づく組換えアデノウイルスに相補できるパッケージング細胞株を提供する。
「アデノウイルスに基づくまたはアデノウイルスに由来する」の用語は、その血清型において見いだされる核酸に対応する核酸を利用することを意味する。利用された核酸はPCRクローニングまたは業界に知られた他の方法で誘導される。
【0005】
本発明の一観点において、新規なパッケージング細胞は、非制限的に、一次ヒト網膜芽細胞、一次ヒト胎児性腎臓細胞または一次ヒト羊膜細胞等の一次二倍体ヒト細胞から誘導される。一次細胞またはアデノウイルスE1A遺伝子のみを用いたその誘導体のトランスフェクションは、無制限な増殖(不死化)を誘導できるが、完全な形質転換には至らない。しかし、殆どの場合、E1Aの発現はプログラム化細胞死(アポトーシス)を誘導し、場合によって、不死化が得られる(Jochemsen等、1987年)。E1B遺伝子の同時発現はアポトーシスの誘導を防止するために、および完全な形態学的形質転換を生じるために必要である(White,1995年)。したがって、本発明の一観点では、一次ヒト細胞またはその誘導体は、サブグループC以外のサブグループ、好ましくはサブグループB、より好ましくはアデノウイルス35型の、アデノウイルスE1蛋白質の発現により形質転換される。E1AおよびE1B蛋白質の結合活性は細胞の無制限な成長を樹立し、組換えアデノウイルスの相補を可能にする。
【0006】
アデノウイルスE1遺伝子による一次細胞の完全な形態学的形質転換はE1AおよびE1B領域によりコード化された蛋白質の結合活性の結果である。溶菌感染および形質転換における種々のE1蛋白質の役割は広範に研究された(Zantema およびvan der Eb, 1995年; White, 1995年, 1996年)。アデノウイルスE1A蛋白質は一次細胞の形質転換に対して重要である。E1A蛋白質は転写の調節に伴われる多くの細胞蛋白質との直接的な相互作用を介してこの効果を及ぼす。これらは蛋白質のpRBファミリー、p300/CBPおよびTATA結合蛋白質を含む。さらに、E1Aは細胞におけるp53蛋白質のレベルを高める。アデノウイルスE1B活性の不存在下で、p53レベルの上昇はアポトーシスを誘導する。E1B領域によりコード化された両蛋白質は、異なるメカニズムではあるが、アポトーシスの誘導を阻害する。E1B−21Kは、アポトーシス経路の下流のエフェクター蛋白質との相互作用によりBcl−2に類似の方法でアポトーシスを阻害すると思われる(Han等, 1006年)が、E1B−55Kはp53との直接的な相互作用を介して機能する。p53を不活性化する能力における分子メカニズムが異なり、このメカニズムにより、Ad2および5(サブグループC)およびAd12(サブグループA)のE1B−55K蛋白質が機能する。Ad5 E1B−55Kはp53に強く結合し、この複合体は細胞質に局在化するが、Ad12 E1B−55Kはp53に弱く結合し、両蛋白質は核に局在化する(Zantema等,1985年; Grand等, 1999年)。しかし、両蛋白質はp53により、他の遺伝子のトランス活性化を阻害する(Yew およびBerk,1992年)。
【0007】
げっ歯類細胞において、E1B−21Kまたは55Kのいずれかと共にE1Aの活性は完全は形質転換に対して十分であり、両E1B蛋白質一緒での発現は2倍の効率である(Rao等、1992年)。しかし、ヒト細胞では、E1B−55K蛋白質の活性はより重要であると考えられ、E1B−55Kが形質転換細胞の樹立に対して必須であることが観察された(Gallimore,1986年)。
本発明の実施例6はpIG270の産生を説明する。この構成では、Ad35−E1遺伝子はhPGKプロモーターから発現され、転写はHBVpAにより終了する。hPGKプロモーターはSinger-Sam等(1984年)により記載されたプロモーター配列のHincII−EcoRIフラグメントを構成する。HBVpAはB型肝炎ウイルスゲノムのBamHI−BglIIフラグメントに位置する(Simonsen およびLevinson, 1983年; Genbank HBV-AF090841)。前記のとおり、本発明に記載したE1発現構造体のポリアデニル化配列およびプロモーターは本発明の範囲から外れることなく、他の給源から誘導できる。さらに、上記hPGKおよびHBVpA配列の他の機能フラグメントも使用できる。
【0008】
pIG270の機能性は一次ベイビーラット腎臓細胞(BRK)の形質転換により示された。等価なAd5−E1発現構築物との比較により、Ad35−E1遺伝子がこれらの細胞を形質転換するには効率的ではないことがわかった。同様のことが、Ad12のE1遺伝子についてもわかった(Bernards等, 1982年)。
異なるサブグループからのアデノウイルスに対して観察されたE1配列の形質転換効率における相違をE1蛋白質が決定することは不明確である。Ad12の場合、キメラE1A/E1B遺伝子についての感染の研究は、BRK細胞の形質転換効率がE1A蛋白質により決定されることを示唆した(Bernards等, 1982年)。E1B−55K蛋白質がE1除去アデノウイルスの相補性に対して必要な血清型特異性機能を有することを下記に示す。これらの機能がmRNA分布および別の後期ウイルス機能の調節に関係する場合、これらが形質転換効率に含まれることは考えにくい。
【0009】
挿入変異体を使用したAd2またはAd5 E1B−55K蛋白質における機能ドメインの解析により、ウイルス複製、後期蛋白質合成およびホスト蛋白質シャット−オフに関する機能が特異ドメインに限定されず、蛋白質に沿って分布することがわかった(Yew等, 1990年)。同じセットの変異体を使用して、p53およびE4−Orf6との相互作用に対して重要なドメインがより制限されることがわかった。普通の結合領域(アミノ酸262から326)に加えて、p53結合はaa180における変異により影響され、E4−Orf6結合はaa143における変異により影響された(Yew およびBerk, 1992年; Rubenwolf等, 1997)。
これらの結果は全体として、形質転換(p53結合)および後期蛋白質合成(Orf6結合)に関係するE1B−55K機能を分離することが困難であることを示す。
【0010】
本発明は新規なE1構造体を開示し、この構造体は一方の血清型の高効率形質転換を他方の血清型の血清型特異性相補機能とを結び付ける。これらの新規な構造体を使用して一次ヒト胎児性網膜芽細胞およびヒト羊膜細胞を形質転換する。
本発明の別の観点において、形質転換E1配列を異なる血清型から誘導する。欧州特許出願第00201738.2に記載したように、Ad35 E1配列はベイビーラット腎臓(BRK)細胞を、Ad5 E1配列に関して見られるよりも低効率ではあるが、形質転換可能である。このことは、Ad12からのE1配列に対しても観察された(Bernards等, 1982年)。したがって、本発明のこの観点では、一次二倍体ヒト細胞またはその誘導体はキメラE1構造体で形質転換され、この構造体は一次ヒト細胞またはその誘導体の効率的な形質転換を可能にする血清型のE1配列の部分と、別の血清型のE1除去ウイルスの効率的な増殖を可能にする血清型特異的E1B機能を提供する別の血清型のE1配列の部分からなる。本発明のこの観点の好ましい態様では、E1A領域は、非制限的にAd5等の、サブグループCアデノウイルスから誘導され、E1Bコード配列は代替的なアデノウイルス、特にサブグループBのアデノウイルス、特にアデノウイルス35型から誘導される。また、E1B−21Kコード配列はサブグループCおよびサブグループBコード配列両方で構成されるキメラである。好ましくは、E1B−21Kの全てまたは殆どがサブグループCコード配列で構成される。より好ましい態様では、E1Aコード配列およびE1B−21Kコード配列は非制限的にAd5等のサブグループCアデノウイルスから誘導される。ある態様では、細胞はさらにE1B−55Kコード配列で構成され、好ましくは、これは、サブグループBのアデノウイルス、特にアデノウイルス型35から誘導された21Kコード配列と重複しない。さらに好ましい態様では、全E1コード配列は、代替的なアデノウイルスサブグループ、特にアデノウイルスサブグループB、特にアデノウイルス型35の血清特異的相補に必要なE1B−55Kコード配列の少なくとも1一部を除いて、非制限的にAd5等の、サブグループCアデノウイルスから誘導される。本発明はパッケージング細胞株をも提供する。ここで、一次ニ倍体ヒト細胞またはその誘導体はキメラアデノウイルスE1構造体を用いて形質転換され、この構造体は一次ヒト細胞およびその誘導体の効率的な形質転換可能な第1アデノウイルス血清型の第1アデノウイルスE1コード配列の一部;および第2アデノウイルス血清型の第2アデノウイルスE1コード配列の一部であって、この第2アデノウイルスE1配列は第2アデノウイルス血清型の組換えアデノウイルスE1除去ウイルスの効率的な増殖を可能にする血清型特異的アデノウイルスE1B機能を提供する第2アデノウイルスE1配列の一部で構成される。好ましくは、この第1アデノウイルス血清型はサブグループCアデノウイルスであり、第2アデノウイルス血清型はサブグループBアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス型35である。ある態様では、本発明のパッキング細胞株はウシアデノウイルスE1B−55Kで構成される。このようなウシE1B−55K発現細胞株は高収量で相補ウシ組換えアデノウイルスを得るために特に適している。
【0011】
一次二倍体ヒト細胞またはその誘導体は、一つのDNA分子に操作可能に結合したか、または2つの別々のDNA分子に位置するアデノウイルスE1配列により形質転換される。後者の場合、一方のDNA分子は効率的な形質転換を可能にする血清型のE1配列の少なくとも一部を運び、別のDNA分子は血清型特異的相補性に必要な配列の少なくとも一部を運ぶ。さらに、効率的な形質転換を可能にする血清型のE1配列および血清型特異的相補に必要な別の血清型のE1配列で構成されるハイブリド構造体が提供される。血清型特異的相補性を提供する配列は形質転換に寄与する活性をさらに有していてもよい。好ましくは、効率的形質転換を可能にする配列はE1Aで構成される。好ましくは、この配列および血清型特異的相補性に必要な配列はE1B配列で構成される。より好ましくは、効率的形質転換を可能にする前記配列はE1AおよびE1B−21K配列で構成され、血清特異的相補性に必要な配列はE1B−55K配列で構成される。このようなハイブリド構造体により形質転換された細胞をも提供する。このような細胞は前記別の血清型の組換えE1除去アデノウイルスの増殖に好ましく使用される。勿論、別の構造体上にあるE1配列の両方の機能を提供することも可能である。全観点から、配列はコード化蛋白質の転写および翻訳可能な調節配列に操作可能的に結合する。好ましくは、本発明のパッケージング細胞はサブグループBのアデノウイルスの少なくともE4−orf6、特にアデノウイルス血清型35をコード化するDNAで構成される。好ましくは、細胞は増殖/相補あるいは産生されるべき組換えベクターと同じ血清型のE1B−55KおよびE4−orf6で構成される。
【0012】
本発明の別の観点では、PER.C6(ECACC寄託番号96022940;Fallaux等、1998年)から誘導され、かつゲノムに組み込まれるAd35−E1配列を含む新規なパッケージング細胞を開示する。これらのAd35−E1配列は機能発現カセットに存在するが、好ましくは、組換えウイルスベクターに存在する配列を重複する配列を含まない。好ましくは、機能発現カセットはAd35−E1配列に機能的に結合した異種プロモータおよびポリアデニル化信号からなる。特に、Ad35−E1コード配列はヒトホスホグリセラート遺伝子プロモータ(hPGK)およびB型肝炎ウイルスポリアデニル化信号(HBV−pA)に機能的に結合する。好ましくは、Ad35−E1コード配列はE1B55K蛋白質の停止コドンまでおよびこれを含むE1Bコード配列に結合したE1A蛋白質およびE1Bプロモータ配列のコード領域を有する。さらに好ましくは、Ad35−E1配列はAd35wt配列のヌクレオチド468からヌクレオチド3400までを有する。トランスフェクション細胞に対する選択を可能にするために、非限定的に、ネオ遺伝子等の優性選択マーカーは発現ベクターに取り込まれる必要があり、あるいはAd35発現ベクターは選択マーカーの発現を媒介する分離発現ベクターと共トランスフェクションされる。両方のケースにおいて、選択マーカーは細胞ゲモムに組み込まれる。293(Graham等、1977年)および911(Fallaux等、1996年)等の他のAd35−E1形質転換細胞株またはAd549細胞等の樹立ニト細胞株は本発明の範囲から逸脱することなく、使用可能である。
【0013】
本発明の別の観点では、PER.C6誘導細胞は機能Ad35−E1Bhairetuを発現する。ある態様では、Ad35−E1Bコード配列はE1Bプロモータにより駆動され、非制限的に、HBVpA等の異種ポリアデニル化信号により終了される。好ましい態様では、Ad35−E1Bコード配列は非制限的に、hPGKプロモータまたは延長因子−1α(EF−1α)プロモータ等の異種プロモータにより駆動され、非制限的に、HBVpA等の異種pA信号により終了される。これらのAd35−E1B配列は野生型(wt)Ad35配列のヌクレオチド1611と3400の間に位置するE1B21KおよびE1B55K蛋白質のコード領域を有する。より好ましくは、Ad35−E1B配列はwtAd35配列のヌクレオチド1550から3400までを有する。さらに好ましい態様では、E1B配列はwtAd35配列のヌクレオチド1916および3400間に位置するE1B−55K遺伝子のコード配列を有する。さらに好ましい態様では、本発明のパッケージング細胞株または細胞株はE1B21Kに対する機能コード配列が欠けている。このような細胞株は一般にはE1B21K正細胞株より非常に多い組換えアデノウイルスを産生する。
【0014】
さらに、本発明は、組換えアデノウイルスを相補するための方法であって、前記組換えアデノウイルスを有する、本発明のパッケージング細胞株または細胞株を提供することおよび相補可能な前記細胞を培養することを有する方法を提供する。好ましい態様では、前記方法は、さらに、相補組換えアデノウイルスをハーベストすることを有する。好ましくは、前記組換えアデノウイルスはアデノウイルスサブグループBから誘導される。より好ましくは、前記組換えアデノウイルスはアデノウイルス35血清型から誘導される。
【0015】
別の観点において、本発明は、本発明の方法により得られた、あるいは本発明のパッケージング細胞を用いた、組換えアデノウイルスを提供する。本質的に汚染のない野生型アデノウイルスまたは複製コンピテント細胞細胞を得ることができる。このような組換えアデノウイルス調製は例えば遺伝子治療場面に対するインビボにおける体細胞組織への治療配列の投与に非常に適している。少なくとも一つのE1領域蛋白質をコード化する核酸の欠如を有する組換えアデノウイルスが好ましい。好ましくは、このようなアデノウイルスはさらに少なくとも一つのE3領域蛋白質をコード化する核酸の欠如を有する。好ましくは、このようなアデノウイルスは少なくとも一つのE4領域蛋白質をコード化する核酸の欠如をさらに有する。好ましくは、このようなアデノウイルスは少なくともE4−Orf6蛋白質をコード化する核酸の欠如をさらに有する。この理由のために、本発明は薬剤の調製用に、本発明の組換えアデノウイルスの使用を提供する。
【0016】
E1B−55K蛋白質とは、Ad5のE1B−55K蛋白質により提供された、アデノウイルス血清型の同様の機能を有するアデノウイルス血清型のE1B領域によりコード化された蛋白質を意味する。
E1B−55K蛋白質とは、Ad5のE1B−19K蛋白質により提供された、アデノウイルス血清型の同様の機能を有するアデノウイルス血清型のE1B領域によりコード化された蛋白質を意味する。同じ技術用語をこれらの蛋白質をコード化する配列に対して適用する。Ad35−E1配列をいう場合、特定のヌクレオチドからヌクレオチド3400までとは、ヌクレオチド3400までとヌクレオチド3400を含むことを意味する。
【0017】
本発明の細胞株対象物は、他のもののなかで、遺伝子治療およびワクチン接種用に設計された組換えアデノウイルスの産生に有益である。また、ヒト起源の細胞から誘導された細胞株は非制限的に、ヒト成長因子、ヒト抗体等のヒト組換え治療蛋白質の産生にも有益である。さらに、細胞株は、非制限的にインフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス等のアデノウイルス以外のヒトウイルスの産生に有益である。
一次、二倍体ヒト細胞の好ましい誘導体は、PER.C6細胞株(ECACC寄託番号960022940)である。
【0018】
本発明で言及したアデノウイルスE1蛋白質と本質的に類似機能を有する蛋白質を提供することは当業者には可能である。例えば、機能部分は提供され、および/または誘導体は量はともかく、本質的に類似機能を備えることができる。
このような部分および誘導体は、類似の形質転換/相補性および/または血清型特異性機能が量はともかく本質的に提供される限り、本発明の範囲内であると考えられる。
【0019】
(実施例)
実施例1
ヒト血清における活性の不活化を検出ための高処理能力アッセイ
全アデノウイルス血清型に対する中和抗体の存在下で多量のヒト血清をスクリーニング可能とするために、自動化96ウェルアッセイを展開した。
ヒト血清
100個体のパネルを選択した。ボランティア(50%が男性、50%が女性)は人種制限のない、20才から60才の健康体であった。全ボランティアはインフォームドコンセントの書類にサインした。アデノウイルス研究に職業的に関与している人々は排除した。
【0020】
約60mlの血液を乾燥試験管に入れた。採取後2時間以内に、血液を2500rpm/10minで遠心分離した。
約30mlの血清をポリプロピレン管に移し、−20℃で次の使用まで凍結貯蔵した。
血清を解凍して56℃下10分間で熱不活化し、分取して凍結/解凍の繰り返しサイクルを防止した。一部を使用して、約70の96ウェルプレートを満たすのに充分な量の培地(DMEN,ギブコ BRL)中で5段階の2倍希釈を行った。未希釈および希釈血清アリコートを深いウェルプレート(96ウェル形式)にピペットで取り、プログラムプレートメイトを使用して96ウェルプレートに100μlのアリコートで分配した。このように前記プレートにデュプロ(100μl/ウェル)で8つの異なる血清を下図(数1)にしたがって入れた。
【0021】
【数1】
カラム1と6のS1/2〜S8/2は1x希釈血清を表し、Sx/4、Sn/8、Sx/16、およびSx/32は連続2倍希釈を表す。また、最後のプレートは負コントロールとして100μlの胎性ウシ血清を入れた4つのウェルを有する。プレートを−20℃で次の使用まで保存した。
【0022】
ヒトアデノウイルスストックの調製
全既知ヒトアデノウイルスのプロトコルをPER.C6細胞(Fallaux等、1998年)を蒔いたT25フラスコで培養し、充分なCPEについてハーベストした。凍結/解凍後、1−2mlの粗ライゼートを使用してPER.C6のT80フラスコに接種し、ウイルスを充分なCPEでハーベストした。接種およびCPE発生間の時間枠ならびにウイルス量には血清型間で異なる新規な培養物を再感染する必要があった。アデノウイルスストックを凍結/解凍により調製し、PER.C6細胞を有する3−4のT175cm2の3層フラスコに接種した。CPE発生の際、フラスコをタッピングすることにより細胞をハーベストした。ペレットとウイルスを単離し、下記の2段階CsCl勾配により精製した。細胞ペレットを50mlの10mMNaPO4緩衝液(pH7.2)に溶解し、−20℃で凍結した。37℃解凍後、5.6mlのデオキシコール酸ナトリウム(5%w/v)を添加した。溶液をゆるやかに混合し、5−15分間37℃で培養し、細胞を完全に溶解した。溶液を均質化した後、1875μlの1MMgCl2を添加した。375μlのデオキシリボヌクレアーゼ(10mg/ml)の添加後、溶液を30分間37℃で培養した。細胞残渣を破壊することなく、室温で30分間1880xgで遠心分離した。次に、上清を蛋白質からFREON(3x)を用いて抽出により精製した。透明な上清を1Mトリス/HCl緩衝塩化セシウムブロック勾配(範囲:1.2/1.4g/ml)に入れ、10℃下2.5時間2100rpmで遠心分離した。ウイルスバンドを単離し、その後、第2精製を1Mトリス/HCl緩衝を使用して継続し、塩化セシウムの1.33g/mlの勾配を実施した。その後、ウイルスを10℃で55000rpmで17時間遠心分離した。ウイルスバンド単離し、スクロース(50%w/v)を添加して最終濃度1%にした。過剰の塩化セシウムを、CaCl2(0.9mM)、MgCl2(0.5mM)おおよび増加濃度のスクロース(1、2、5%)で補充された1.5リットルPBSに対する透析スライド(Slide-a-lizer、カットオフ10000kDa,Pierce、USA)中における透析(3回1時間室温下にて)により除去した。透析後、スライド−ア−ライザーからウイルスを除去し、この後、25および100μlの部分に分取し、ウイルスを−85℃で貯蔵した。
【0023】
1ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を決定するために、50μlのウイルスバッチをShabram等(1997年)に説明された高圧液体クロマトグラフ(HPLC)で展開する。ウイルスを、0〜600mMの範囲のNaCl勾配を使用して溶出した。表1に示すように、ウイルスが溶出されるNaCl濃度は血清型によって有意に異なる。
殆どのヒトアデノウイルスは僅かな例外はあるが、PER.C6で良好に複製された。アデノウイルス8型および40型を911−E4細胞(He等、1998年)で成長させた。精製ストックは5×1010および5×1012ウイルス粒子/mlの間で含む(VP/ml;参照表1)。
【0024】
精製ヒトアデノウイルスストックの滴定
中和化アッセイの長さである、5日間で完全なCPEを得るために必要なウイルス量を決定するためにPER.C6でアデノウイルスを滴定した。100μl培地を96ウェルプレートの各ウェルに分注した。予め104、105、106または107倍に希釈した25μlのアデノウイルスストック96ウェルプレートのカラム2に添加し、ピペットで上下10回混合した。その後、25μlをカラム2からカラム3に運び再び混合した。この操作をカラム11まで繰り返した。この後、25μlをカラム11から廃棄した。このように、5の段階における連続希釈を予め希釈したストックから開始して得た。この後、3×104PER.C6細胞(ECACC寄託番号96022940)を100μl体積で添加し、プレートを37℃下、5日または6日間5%CO2で培養した。CPEを顕微鏡でモニターした。Reed−Muench法を使用して、細胞培地阻害量50%(CCID50)を計算した。
【0025】
並行して、同一のプレートを用意してMTTアッセイ(プロメガ)を使用して分析した。このアッセイでは、生細胞は比色染色により定量化した。20μlMTT(PBS中7.5mgr/ml)をウェルに添加し、37℃下2時間5%CO2で培養した。上清を除去し100μリットルの20:1イソプロパノール/トリトン−X100溶液をウェルに添加した。プレートを96ウェルシェイカーに3−5分間載せ、沈殿した染色を可溶化した。吸光度を540nmおよび690nm(バックグラウンド)で測定した。このアッセイにより、進行中CPEまたは完全CPEを有するウェルを識別できる。
【0026】
中和化アッセイ
希釈ヒト血清サンプルを有する96ウェルプレートを37℃下、55CO2で解凍した。200CCID50/50μlに希釈したアデノウイルスストックを調製し、50μlアリコートを、血清を有するプレートのカラム1〜11に添加した。プレートを1時間37℃下5%CO2で培養した。その後、6×105/mlにて50μlPER.C6細胞を全ウェルに分注し、1日37℃下5%CO2で培養した。血清の毒性効果を避けるために、上清を新しいピペットチップを使用して各列について除去し、200μlの新しい培地を全ウェルに添加した。プレートを更に4日間37℃下5%CO2で培養した。さらに、並行したコントロールプレートをラビットで発生し、例AおよびBにおける試験されるべき各血清型に対して特異的である希釈した正コントロール血清および列CおよびDの負コントロール血清(FCS)を有するデュプロにて用意した。また、列E−Hのそれぞれにおいて、試験されるべき各ウイルスの200CCID50で開始する5回希釈の段階を有する上記方法で滴定を行った。5日に、コントロールプレートの一つを顕微鏡的にMTTアッセイを用いて分析した。実験力価を顕微鏡的に観察したコントロール滴定プレートから計算した。CPEが完全であることがわかった場合、すなわち、MTTにより分析されたコントロール滴定実験における第1希釈が明確な細胞子を示す場合、全アッセイプレートを処理した。そうでない場合は、充分なCPEが見られるまで、アッセイを1日またはそれ以上進めることができ、その後全プレートを処理した。殆どの場合、アッセイを5日で終了した。Ad1、5、33、39、42および43について、アッセイを6日間放置し、Ad2については8日放置した。
【0027】
最高血清濃度で血清がないコントロールに比べて40%の最大保護が見られた場合、血清サンプルを「非中和化」と見なす。
100人の健康なボランティアから得た血清に対する44のプロトタイプアデノウイルスの分析結果を図1に示す。予想通り、Ad2およびAd5に対する中和化抗体を含む血清サンプルのパーセントは非常に高かった。このことは、番号のより小さいアデノウイルスの殆どに対しても真実であった。驚くべきことに、血清サンプルはAd35に対する中和化抗体を含まなかった。さらに、血清型26、34および48に対する中和化抗体力価を有する個々の数は非常に低かった。
したがって、Ad35に基づく組換えE1欠損アデノウイルスすなわち上記他の血清型の一つは抗体中和化によるウイルスの一掃についてAd5に基づく組換えベクタに比較して重要な利点を有する。
また、対応するAd35のキャプシド蛋白質(の一部)または他の血清型により置換されるホストの免疫応答に含まれるキャプシド蛋白質(の一部)を有するAd5基ベクタはヒト血清の大部分により中和化されないか、非常に少ない。
【0028】
表1に示されるように、1mlあたりのウイルス粒子および実験における各ウイルスに対して得たCCID50から計算したVP/CCID50比は高度に可変であり、0.4〜5logの範囲であった。これはおそらく、PER.C6細胞の異なる感染効率およびウイルスの複製効率に於ける相違により引き起こされる。さらに、バッチ品質に於ける相違が役割を演じているかもしれない。高VP/CCID50比は、5日でCPEを得るためにウェルにより多くのウイルスを入れることを意味する。結果として、より多くの(不活性な)ウイルス粒子が抗体を遮蔽可能なので、中和研究の結果について先入観を持たれる可能性がある。この現象が生じたかどうかを確認するために、VP/CCID50比をアッセイ(図2)で正であることがわかった血清サンプルのパーセントに対してプロットした。グラフはアッセイにおけるウイルス量と血清における中和化の間に逆相関がないことを明確に示す。
【0029】
実施例2
Ad35に対する中和化活性(NA)の普及は異なる地理的位置からのヒト血清において低い
実施例1において、ベルギーのある場所からのヒト血清における中和化活性(NA)の分析を説明した。試験した44のアデノウイルス血清型のパネルのうち一血清型つまりAd35はアッセイした100の血清のいずれにおいても中和されなかった。さらに、いくつかの型つまりAd26、Ad34,およびAd48は試験した血清のうち8%以下において中和されることがわかった。さらに、この分析は先に試験していないアデノウイルスの他の血清型に拡張し、第1スクリーンからの血清型の選択を使用して、異なる地理的位置からの血清にも拡張した。
【0030】
これまで、アデノウイルスを増殖し、精製し、実施例1に記載したCPE阻害アッセイにおける中和化に対して試験した。実施例1におけると同じバッチからの血清を使用して、アデノウイルス血清型7B、11、14、18、および44/1876を中和化に対して試験した。これらのウイルスが血清のそれぞれ59、13、30、98および54%で中和されることがわかった。しがたって、この血清のうちAd11は比較的低い頻度で中和される。
【0031】
ヒト組織からのアデノウイルス血清型の単離の頻度およびアデノウイルス血清型へのNAの普及が異なる地理的位置について異なることが知られているので、我々は異なる場所からの血清に対するアデノウイルス血清型の選択をさらに試験した。ヒト血清を、付加的に欧州(イギリスのブリストルおよびオランダのライデン)の二カ所から、および合衆国(カリフォルニアのスタンフォードおよびニューヨークのグレートネック)の二カ所から得た。第1スクリーンにおいて20%以下の血清にて中和されることがわかったアデノウイルスおよびAd2,Ad5,Ad27,Ad30,Ad38,Ad43をイギリスからの血清における中和化に対して試験した。これらの実験の結果を図3に示す。アデノウイルス血清型2および5を高パーセントのヒト血清において再び中和化した。さらに、第1スクリーンにおける低パーセントの血清において中和された血清型の幾つかはイギリスからのより高パーセントの血清、例えばAd26(7%対30%)、Ad28(13%対50%)、Ad34(5%対27%)、およびAd48(8%対32%)において中和される。第1スクリーンにおける比較的低パーセントの血清において見いだされたAd11およびAd49に対する中和化活性はこの第2スクリーン(それぞれ13%対5%および20%対11%)におけるさらにより低パーセントの血清において見いだされた。第1スクリーンにおける血清において中和されなかった血清型Ad35はイギリスからの低パーセント(8%)の血清において中和されることが今回わかった。イギリスからのヒト血清におけるNAの普及は血清型Ad11およびAd35に対して最低である。
【0032】
更なる分析のために、合衆国(カリフォルニアのスタンフォードおよびニューヨークのグレートネック)の二カ所からおよびオランダ(ライデン)から血清を得た。図4はこれらの血清について得たデータおよび先のデータの外観を示す。Ad5,Ad11、およびAd35を除く全血清について全ウイルスを試験したわけではない。ヒト血清のこの包括的なスクリーンからの全結論は、Ad35に対する中和活性の普及が西の国々にわたる全血清型のうちで最低である、ということである:すなわち、平均7%のヒト血清が中和活性を有する(5つの異なる場所)。別のBグループアデノウイルスであるAd11も低パーセントのヒト血清において中和される(5つの異なる場所からの血清において平均11%)。アデノウイルス型5は5つの異なる場所から得たヒト血清の56%において中和される。全血清を試験したわけではないが、Dグループ血清型49も比較的低い頻度で中和される(平均14%)。
【0033】
本願発明に記載の中和化実験において、血清を含まないコントロールに対して、最高血清濃度のウェル中でCPEの最大保護が40%である場合に血清は非中和化であると判定される。この保護は以下のようにして計算される:
【数2】
【0034】
実施例1に記載したように、血清は4×希釈から64×希釈までの範囲を有する5つの異なる希釈に付される。したがって、NAの低力価(すなわち、最高血清濃度中においてのみ中和される)および高力価(すなわち、最低血清濃度のウェル中でも中和される)間で区別する可能性がある。Ad5に対する中和活性を有することを見いだしたわれわれのスクリーンで使用したヒト血清のうち、70%が高力価を有するに至ったが、Ad35に対するNA含有血清では、たったの15%しか高力価をもたなかった。Ad11へのNAに対して正であった血清のうち、たったの8%しか高力価を示さなかった。Ad49については5%であった。したがって、Ad35、Ad11および49へのNAに対する頻度はAd5に比べてずっと低いのみならず、これらのウイルスに対するNA含有血清のうち大多数が低力価である。したがって、Ad11、Ad35、またはAd49に基づくアデノウイルスベクタは、感染効率が中和活性により妨害される用途でまたはインビボで遺伝子治療ビヒクルまたはワクチン接種ベクタとして使用した場合Ad基ベクタを超えて明らかな利点を有する。
以下の実施例において、安全なRCAフリーのAd35基ベクタの生成に対するベクタ系の構築を説明する。
【0035】
実施例3
ヒトアデノウイルス型35の配列
Ad35ウイルスをPER.C6細胞で増殖し、DNAを以下にようにして単離した:つまり、100μlのウイルスストック(Ad35:3.26×1012VP/ml)に、10μlの10×DNアーゼ緩衝液(130mMのトリスHCl,pH7.5;1.2MのCaCl2;50mMのMgCl2)を添加した。10μlの10mg/mlDNアーゼI(ロシュ ダイアグノスティクス)の添加の後、混合物を1時間37℃で培養した。2.5μlの0.5MのEDTA、3.2μlの20%SDSおよび1.5μlのプロテイナーゼK(ロシュ ダイアグノスティクス;20mgr/ml)の添加に続いて、サンプルを50℃で1時間培養した。次に、ウイルス性DNAをジーンクリーンスピンキット(Biol01Inc.)を使用して製造者に指示にしたがって培養した。DNAをスピンカラムから25μlの無菌MilliQ水で溶出した。全配列を。Qiagen Sequence Services(Qiagen GmbH,ドイツ)により生成した。全ウイルス性DNAを超音波処理により剪断した。剪断した平滑フラグメントをアガロースゲルでサイズフラクションし、1.8〜2.2kbのDNAフラグメントに対応するゲルスライスを得た。DNAをQIAクイックゲル抽出プロトコルによりゲルスライスから精製し、pUC19プラスミドクローニングベクタのショットガンライブラリにサブクローニングした。標的DNA8(+/−2)倍をカバーする96ウェルプレートにあるクローンのアレイを使用して全配列を使用した。配列決定をPerkin−Elmer9700サーモサイクラーでBig Dye Terminator ケミストリーおよびAmpliTagFSDNAポリメラーゼを使用して実施し、続いてQIAGEN DyeEx96を使用して配列決定反応の精製を行った。その後、配列決定反応生成物をABI377XL96レーンシークエンサーでフラグメントの自動化分離および検出に付した。初期配列結果を使用して連続配列を生成し、隙間を標的DNAについてプライマーウォーキングによりまたはPCR生成物の直接配列決定により満たした。ウイルス末端はショットガンライブラリーにないことがわかった。おそらく、ウイルス性DNAのプロテイナーゼK消化後、ITR配列に残りのpTPのアミノ酸が結合したことにより、クローニングが困難なためである。付加的な配列はこれらの領域における配列の殆どを解決したウイルス性DNA上にあるが、殆どの末端ヌクレオチドの明確な配列を得ることは困難であった。5’末端で得られた配列部分は5’−CCAATAATATACCT−3’(SEQ.I.D.NO. )であり、3’末端で得られた配列部分は5’−AGGTATATTATTGATGATGGG−3’(SEQ.I.D.NO. )であった。殆どのヒトアデノウイルスは末端配列5’−CATCATCAATAATATACC−3’(SEQ.I.D.NO. )を有する。さらに、pBr322への末端7kbAd35EcoRIフラグメントをクローニングした後得たAd35DNAの3’端部を表すクローンが典型的なCATCATCAATAAT...配列を有することがわかった。したがって、Ad35は典型的な端部配列を持ち、ウイルス性DNAで直接配列決定する際に得られた相違がランオフ配列ランに関連するアーチフェクトおよびpTPの残渣アミノ酸が存在するためである。
【0036】
修正末端配列を有するAd35の全配列を図5に示す。オープンリーディングフレームの位置におけるAd5(Genbank#M72360)およびAd7(部分配列Genbank#X03000)についての配列ホモロジーに基づいて、ウイルス組織は殆どのヒトアデノウイルスの一般的な組織と、特にサブグループBウイルスと同一である。ゲノムの全長さは34,794塩基対である。
【0037】
実施例4
組換えAd35基ウイルスを生成するためのプラスミド基ベクタ系の構成
組換えアデノウイルスベクタを生成するための機能性プラスミド基ベクタ系は以下の成分から構成される。
1.
レフトITRおよびAd35から誘導されたパッケージング配列および異種発現カセットの挿入のための少なくとも1つの制限部位および欠損E1配列を含むアダプタープラスミド。さらに、このアダプタープラスミドはpIXプロモータを含むE1Bコード化領域からのAd35配列’および第2核酸分子を有するアダプタープラスミドの相同な組換えを媒介するのに充分なコード配列を含む。
2.
アダプタープラスミドに相同な配列、および組換えウイルスの複製およびパッケージングに必要なAd35配列、すなわちパッケージング細胞に存在しない初期、中期、後期遺伝子を含む第2核酸分子。
3.
Ad35のE1機能を相補可能な少なくとも機能性E1蛋白質を提供するパッケージング細胞。
パッケージング細胞を相補する際に組換えアデノウイルスを生成するための他の方法は当業界で知られており、発明から離れることなくAd35ウイルスに適用可能である。例として、上記のようなプラスミド基系の構成を以下に示す。
【0038】
1)Ad35アダプタープラスミドの構成
アダプタープラスミドpAdApt(国際特許出願WO99/55132に開示)を第1修飾して拡張したポリリンカを含み、かつプラスミドベクタ配列からのアデノウイルス挿入断片の均衡を可能にする3’端部におけるアデノウイルス配列およびレフトITRに隣接する便利なユニークな制限部位を含むアダプタープラスミドを得た。これらのプラスミドの構成は以下に詳細に説明する。
アダプタープラスミドpAdAptをSalIで消化して、再連結を減少するためにシュリンプアルカリフォスファターゼで処理した。以下の2つのリン酸化およびアニール化オリゴから構成されるリンカーを消化した構成物に直接結合し、これによりSalI制限部位をPi−PspI、SwaIおよびPacIにより置き換える。前記2つのオリゴ:ExSalPacF5’−TCGATGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGTTCGAATTAATTAA−3’(SEQ.I.D )およびExSalPacR5’−TCGATTAATTAATTCGAACCCATAATACCCATAATAGCTGTTTGCCA−3’ (SEQ.I.D )。この構築物をpADAPT+ExSalPacリンカーと表示する。さらに、pAdAptのレフトITRの一部を以下のプライマーを使用してPCRにより増幅する:PCLIPMSF:5’−CCCCAATTGGTCGACCATCATCAATAATATACCTTATTTTGG−3’ (SEQ.I.D )およびpCLIPBSRGI:5’−GCGAAAATTGTCACTTCCTGTG−3’ (SEQ.I.D )。増幅したフラグメントをMunIおよびBsrGIで消化し、pAd5/Clip(国際特許出願WO99/55132)にクローン化し、これをEcoRIで部分的に消化し、精製後、BsrGIで消化し、これにより、レフトITRおよびパッケージング信号を再挿入した。制限酵素分析の後、構築物をScaIおよびSgrAIで消化し、800bpフラグメントをゲルから単離し、ScaI/SgrAI消化pADAPT+ExSalPacリンカーに結合した。得られた構築物、すなわち消化されたpIPspSalAdaptをSalIで消化し、リン酸化し、前記リン酸化ExSalPacF/ExSalPacR二重鎖リンカーに結合した。PacI部位がITRに最も近いクローンを制限分析により同定し、配列を配列分析により確認した。pIPspAdaptと呼ばれる新規なpAdApt構築物は、PacI、PI−PspIおよびBstBIに対する認識配列を有する2つのExSalPacリンカーを持っている。これらはアデノウイルスアダプター構築物のアデノウイルス部分を取り囲み、アデノウイルスヘルパーフラグメントを用いた同時トランスフェクションの前にプラスミドDNAを直線化するために使用できる。
【0039】
導入遺伝子クローニング順列をさらに増加するために、多くのポリリンカー変異株をpIPspAdaptに基づいて構築した。この目的のために、pIPspAdaptをEcoRIで先ず消化し、脱リン酸化した。以下の2つのリン酸化およびアニール化オリゴから構成されるリンカーをこの構成物に結合し、これによりAscI,SalI,EcoRV,ClaIおよびNotIに対する制限部位を作る:前記2つのオリゴ:エコリンカー+:5’−AATTCGGCGCGCGTCGACGATATCGATAGCGGCCGC−3’(SEQ.I.D )およびエコリンカー:5’−AATTGCGGCCGCTATCGATATCGTCGACGGCGCGCCG−3’ (SEQ.I.D )。このリンカーの両配向を得て、配列を制限分析および配列分析により確認した。順序5’HindIII,KpnI,AgeI,EcoRI,AscI,SalI,EcoRV,ClaI,NotI,NheI,HpaI,BamHIおよびXbaIにおけるポリリンカーを含むプラスミドをpIPspAdapt1と呼び、順序HindIII,KpnI,AgeI,NotI,ClaI,EcoRV,SalI,AscI,EcoRI,NheI,HpaI,BamHIおよびXbaIにおけるポリリンカーを含むプラスミドをpIPspAdapt2と呼ぶ。
【0040】
他のセンスまたはアンチセンス構築物のクローニングを容易にするために、以下の2つのオリゴヌクレオチドから構成されるリンカーを消化し、pIPspAdaptのポリリンカーを逆転した:HindXba+5’−AGCTCTAGAGGATCCGTTAACGCTAGCGAATTCACCGGTACCAAGCTTA−3’(SEQ.I.D.NO. );HindXba−5’−CTAGTAAGCTTGGTACCGGTGAATTCGCTAGCGTTAACGGATCCTCTAG−3’(SEQ.I.D.NO. )。このリンカーをHindIII/XbaI消化pIPspAdaptに結合し、訂正した構築物を単離した。制限酵素分析および配列決定により確認した。この新規な構築物であるpIPspAdaptAをEcoRIで消化し、前記エコリンカーをこの構築物に結合した。このリンカーの両配向を得て、pIPspAdaptA3と呼ぶ。これは順序XbaI,BamHI,HpaI,NheI,EcoRI,AscI,SalI,EcoRV,ClaI,NotI,AgeI,KpnI,およびHindIIIにおけるポリリンカーを含む。全配列を制限酵素分析および配列決定により確認した。
【0041】
Ad35に基づくアダプタープラスミドを以下ようにして構築した:
レフトITRおよびAd35wt配列ヌクレオチド1〜464(図5)に対応するパッケージング配列をPCRによりwtAd35DNAで以下のプライマーを使用して増幅した:lプライマー35F1:
25’−CGGAATTCTTAATTAATCGACATCATCAATAATATACCTTATAG−3’ (SEQ.I.D.NO. )
プライマー35R2:
5’−GGTGGTCCTAGGCTGACACCTACGTAAAAACAG−3’(SEQ.I.D.NO. )
増幅によりPacI部位を前記配列の5’端部およびAvrII部位を3’端部に導入する。
増幅のために、白金Pfx DNAポリメラーゼ酵素(LTI)を製造者の指示書にしたがって使用した。ただし、プライマーを0.6μMにておよびDMSOを3%の最終濃度に添加した。増幅プログラムは以下のとおりである。94℃で2分(94℃で30秒、56℃で30秒、68℃で1分)を30サイクル行い、次に68℃で10分行った。
【0042】
PCR製品をPCR精製キット(LTI)を使用して製造者の指示書にしたがって精製し,PacIおよびAvrIIを使用して消化した。その後、この消化したフラグメントをゲルからジーンクリーンキット(Bio101社)を使用して精製した。Ad5基アダプタープラスミドpIPspAdApt−3をAvrIIで消化し、その後部分的にPacIで消化し、5762bpフラグメントをLMPアガロースゲルスライスにて単離し、同じ酵素で消化した上記PCRフラグメントを使用して結合した。得られたクローンをpIPspAdApt3−Ad35lITRと表示する。
並行して、Ad35DNAの別のスライスを以下のプライマーを使用して増幅した:
335F3:5’−TGGTGGAGATCTGGTGAGTATTGGGAAAAC−3’ (SEQ.I.D.NO. )
435R4:5’−CGGAATTCTTAATTAAGGGAAATGCAAATCTGTGAGG−3’(SEQ.I.D.NO. )
【0043】
このフラグメントの配列は、wtAd35(図5)のヌクレオチド3401〜4669に対応し、E1B55kコード配列から直接3’から開始する1.3kbの配列を含む。増幅と精製を、レフトITR及びパッケージング配列を含むフラグメントについて上記のようにして実施した。その後、PCRフラグメントをPacIで消化し、SmaIおよびPacIで消化したpNEB193ベクター(New England Biolabs)にサブクローン化した。得られたクローンの配列の完全性を配列分析により確認した。その後、pNEB/Ad35pF3R4をBglIIおよびPacIで消化し、Ad35をゲルからQIAExIIキット(Qiagen)を使用して単離した。pIPspAdApt3−Ad35lITRをBglIIで消化し、その後PacIで部分的に消化した。3624bpフラグメント(ベクター配列、Ad35ITRおよびパッケージング配列およびCMVプロモータ、多重クローニング領域およびポリA信号含有)をもQIAExIIキット(Qiagen)を使用して単離した。両フラグメントを結合し、能力DH10B細胞(LT1)に形質転換した。得られたクローンであるpAdApt35IP3はpIPspAdApt3から発現カセットを有するが、Ad35レフトITRおよびパッケージング配列およびAd35からのヌクレオチド3401から4669に対応する第2フラグメントを含む。反対の配向における多重クローニング部位を有するAd35アダプタープラスミドの第2バージョンを以下のようにして作った。
【0044】
pIPspAdapt1をNdeIおよびBglIIで消化し、0.7kbpバンドはCMVプロモータの一部を含有した。MCSおよびSV40ポリAを単離し、pAdApt35IP1を生じるpAdApt35IP3の対応部位に挿入した(図6)。
その後、pAdApt35.LacZおよびpAdApt35.LucアダプタープラスミドをpcDNA.LacZ(KpnIおよびBamHIで消化)およびpAdApt.Luc(HindIIIおよびBamHIで消化)からの導入遺伝子をpAdApt35IP1における対応部位に挿入することによって生成した。pcDNA.LacZおよびpAdApt.Lucの生成を国際特許出願WO99/55132に記載する。
【0045】
2)コスミドpWE.Ad35.pIX−rITRの構築
図7は、以下に詳細に記載する、bp3401〜34794(ライトITR端部)からのAd35配列を含有するコスミドクローンを構築するために採用した種々の段階を示す。
第1PCRフラグメント(pIX−NdeI)を以下のプライマーセットを使用して生成した:
535F5:5’−CGGAATTCGCGGCCGCGGTGAGTATTGGGAAAAC−3’ (SEQ.I.D.NO. )
635R6:5’−CGCCAGATCGTCTACAGAACAG−3’ (SEQ.I.D.NO. )
DNAポリメラーゼPwo(ロシュ)を製造者の指示にしたがって使用した。ただし、両プライマーの最終濃度は0.6μMであり、テンプレートとして50ngrwtAd35DNAを使用した。増幅を以下のようにして行った:94℃で2分;94℃で30秒、65℃で30秒、および72℃で1分45秒を30サイクル、そして68℃で8分である。TAクローニングベクターPCR2.1におけるクローニングを可能にするために、72℃で10分間1単位スーパーTagポリメラーゼ(HTバイオテクノロジーLTD)について最後のインキュベーションを行った。
3370bp増幅フラグメントは、5’末端に付加されたNotI部位を有するbp3401〜6772のAd35配列を含む。フラグメントをPCR生成キット(LT1)を使用して生成した。
【0046】
第2PCRフラグメント(NdeI−rITR)を以下のプライマーを使用して生成した:
735F7:5’−GAATGCTGGCTTCAGTTGTAATC−3’ (SEQ.I.D.NO. )
835R8:5’−CGGATTCGCGGCCGCATTTAAATCATCATCAATAATATACC−3’ (SEQ.I.D.NO. )
増幅をpfxDNAポリメラーゼ(LTI)を用いて製造者の指示にしたがって行った。ただし、0.6μMの両プライマーおよび3%DMSOを使用し、テンプレートとして10ngr.のwtAd35DNAを使用した。使用したプログラムは以下の通りである:
94℃で3分、および94℃で30秒、40℃で45秒、68℃で2分45秒を5サイクル、さらに94℃で30秒、60℃で30秒、68℃で2分45秒を25サイクルである。TAクローニングベクターPCR2.1におけるクローニングを可能にするために、1単位のスーパーTaqポリメラーゼについて最後のインキュベーションを10分間72℃で行った。ヌクレオチド33178〜Ad35のライトITRの末端までの範囲の1.6kbの増幅フラグメントをPCR精製キット(LTI)を使用して精製した。
【0047】
両方の精製PCRフラグメントをTAクローニングキット(インビトロゲン社)のPCR2.1ベクターに結合し、STBL−2コンピテント細胞(LTI)に形質転換した。期待した挿入物を含有するクローンを配列決定して正しい増幅を確認した。次に、両方のフラグメントをベクターからNotIおよびNdeIを用いて消化することにより切除し、ゲルからジーンクリーンキット(BIO101社)を使用して精製した。コスミドベクターpWE15(Clontech社)をNotIで消化し、脱リン酸化し、さらにゲルから精製した。これらの3つのフラグメントを結合してSTBL2コンピテント細胞(LTI)に形質転換した。その後、両方のPCRフラグメントを含む正しいクローンをNdeIで消化し、一次フラグメントをゲルからジーンクリーンキットを使用して精製した。Ad35wtDNAをNdeIで消化し、26.6kbフラグメントをLMPゲルからアガロース酵素(ロシュ社)を製造者の指示にしたがって使用して精製した。これらのフラグメントを一緒に結合して、λ1相パッケージング抽出物(ストラタジーン社)を使用して製造者のプロトコルにしたがってパッケージングした。STBL−2細胞への感染の後、コロニーはプレート上で成長し、完全な挿入の存在について分析した。正しい配向に挿入され、かつ3つの酵素(NcoI,PvuII,およびScaI)で独立して消化した後正しい制限パターンを有する大きいフラグメントを有する一つのクローンを選択した。このクローンをpWE.Ad35.pIX−rITRとして表示する。これはbp3401〜末端までのAd35配列を含有し、NotI部位に隣接する(図8)。
【0048】
3)PER.C6におけるAd35基組換えウイルスの生成
野生型Ad35ウイルスはPER.C6パッケージング細胞上で非常に高い力価まで成長可能である。しかし、PER.C6に存在するAd5−E1領域が能力E1−欠損Ad35組換えウイルスであるかどうかは不明である。これを試験するために、PER.C6を上記アダプタープラスミドpAdApt35.LacZおよび大きいバックボーンフラグメントpWE.Ad35.pIX−rITRを用いて同時トランスフェクションした。先ず、pAdApt35.LacZをPacIで消化し、pWE.Ad35.pIX−rITRをNotIで消化した。さらに生成することなく、4μgrの各構築物をDMEM(LTI)で混合し、PER.C6細胞にトランスフェクションした。これは、製造者の指示書にしたがってリポフェクトアミン(LTI)を使用して先にT25フラスコに5×106細胞の密度で蒔いた。正のコントロールとして、6μgrのPacI消化pWE.Ad35.pIX−rITR DNAをE1領域を含むウイルス性ゲノムのレフト末端を含有するAd35wtDNAから単離した6.7kbNheIフラグメントで同時トランスフェクションした。次の日の、培地(10%のFBSおよび10mMのMgCl2を含有するDMEM)を新しくし、細胞をさらにインキュベートした。トランスフェクション後2日で、細胞をトリプシン処理しT80フラスコに移した。正のコントロールフラスコはトランスフェクション後5日でCPEを示し、pWE.Ad35.pIX−rITR構築物は少なくともAd35−E1蛋白質の存在下で機能的であることを示した。Ad35LacZアダプタープラスミドおよびpWE.Ad35.pIX−rITRについてのトランスフェクションはCPEを生じなかった。これらの細胞を10日で培地にハーベストし、凍結/解凍を1回行い、細胞からウイルスを放出した。4mlのハーベスト材料をPER.C6細胞(80%の密集度)の入ったT80フラスコに添加し、さらに5日間インキュベートした。このハーベスト/再感染を2回繰り返したがウイルス関連CPEの証拠はなかった。
【0049】
この実験から、Ad35−E1蛋白質は、Ad35組換えウイルスを相補できないかあるいは充分ではないと思われる。しかし、アダプタープラスミドおよびpWE.Ad35.pIX−rITRバックボーンプラスミドの配列オーバーラップが効率的に再結合して組換えウイルスゲノムを生じるのに充分には大きくない可能性がある。正のコントロールトランスフェクションを6.7kbレフト末端フラグメントで行い、配列オーバーラップは約3.5kbであった。アダプタープラスミドおよびpWE.Ad35.pIX−rITRフラグメントは1.3kbの配列オーバーラップを有する。1.3kbの配列オーバーラップが効率的な相同の組換えに対して小さすぎるかどうかを確認するために、同時トランスフェクションを、前記と同じ手順を使用して、PacI消化pWE.Ad35.pIX−rITRおよび35F1および35R4を使用して生成したAd35wtDNAのPCRフラグメントについて行った。したがって、PCRフラグメントはbp4669までのレフト末端配列を含み、したがって、アダプタープラスミドpAdApt35.LacZと同じpWE.Ad35.pIX−rITRを有するオーバーラップ配列を有する。しかし、Ad35E1配列を有する。PCRカラム生成の後、DNAをSalIで消化し、潜在的な無傷なテンプレート配列を除去する。消化したPCR生成物単独でのトランスフェクションは負のコントロールとして役立つ。トランスフェクション後4日でCPEがPCR生成物およびAd35pIX−rITRフラグメントでトランスフェクションした細胞に生じた。これは負のコントロールにはない。この結果により、1.3kbオーバーラップ配列はAd35E1蛋白質の存在下でウイルスを生成するために充分であることがわかる。これらの実験から、われわれは、Ad35.E1蛋白質の少なくとも1つの存在がAd5相補細胞株においてプラスミドDNAから組換えAd35基ベクターを生成するために必要であると結論した。
9
【0050】
実施例5
1)Ad35.E1発現プラスミドの構築
PER.C6のAd5−E1蛋白質はAd35組換えウイルスを効率的に相補することが不可能であるので、Ad35E1蛋白質をAd5相補細胞(例えばPER.C6)で発現させる必要がある。あるいは、Ad35E1蛋白質を発現する新規なパッケージング細胞株を、アデノウイルスE1蛋白質を発現しない樹立した細胞株または二倍体一次ヒト細胞から開始して作る必要がある。第1の可能性に対処するために、Ad35E1領域を下記の発現プラスミドにおいてクローン化した。
第1に、bp468からbp3400までのAd35E1領域を以下のプライマーセットを使用してwtAd35DNAから増幅した:
135F11:5’−GGGGTACCGAATTCTCGCTAGGGTATTTATACC−3’(SEQ.I.D.NO. )
235F10:5’−GCTCTAGACCTGCAGGTTAGTCAGTTTCTTCTCCACTG−3’ (SEQ.I.D.NO. )
【0051】
このPCRにより、5’末端にKpnIおよびEcoRI部位をおよび3’末端にXbaI部位を誘導する。
5ngr.テンプレートDNAにおける増幅を製造者の指示にしたがってPwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)で行った。しかし、両方のプライマーの最終濃度は0.6μMであった。プログラムは以下のようであった:94℃で2分;94℃で30秒、56℃で30秒および72℃で2分を5サイクル;さらに、94℃で30秒、60℃で30秒および72℃で2分を25サイクル;さらに72℃で10分である。PCR生成物をPCR精製キット(LTI)で精製し、KpnIおよびXbaIで消化した。その後、消化したPCRフラグメントを発現ベクターpRSVhbvNeo(下記参照)に結合し、KpnIおよびXbaIで消化した。結合物を製造者の指示にしたがって能力STBL−2細胞(LTI)に形質転換し、コロニーをRSVプロモータおよびHBVポリA間のポリリンカーへのAd35E1配列の正しい挿入に対して分析した。
【0052】
得られたクローンをpRSV.Ad35−E1として表した(図9)。pRSV.Ad35−E1におけるAd35配列を配列分析により確認した。
pRSVhbvNeoを以下のようにして生成した:pRc−RSV(インビトロゲン)をPvuIIで消化し、TSAP酵素で脱リン酸化し、3kbベクターフラグメントを低融点アガロースにおいて単離した(LMP)。プラスミドpPGKneopA(図10、国際特許出願 WO96/35798)をSspIで完全に消化し、プラスミドを直線化し、PvuIIを用いた部分的消化を容易にした。PvuIIを用いた部分的な消化の後、得られたフラグメントをLMPアガロースゲル上で分離し、PGKプロモータ、ネオマイシン耐性遺伝子およびHBVポリA含有2245bpPvuIIフラグメントを単離した。単離した両方のフラグメントを結合して、PGKprom−ネオ−HBVポリAカセットにより置換されたオリジナルSV40prom−ネオ−SV40ポリA発現カセットを持つに至った発現ベクターpRSV−pNeoを得た(図11)このプラスミドを、BGHpAをHBVpAで置換するために、さらに以下のように修飾した:pRSVpNeoをScaIで直線化し、さらにXbaIで消化した。Amp遺伝子の一部およびRSVプロモーター配列およびポリリンカー配列を含有する1145bpフラグメントをゲルからジーンクリーンキット(BioInc.101)を使用して単離した。次に、pRSVpNeoをScaIで直線化し、さらにEcoRIで部分的に消化し、PGHneoカセットおよびベクター配列を含む3704bpフラグメントをゲルから上記のように単離した。その後、それぞれ5’および3’末端にてXbaIおよびEcoRIに隣接したHBVポリA配列含有第3フラグメントを以下のプライマーセットを使用してpRSVpNeo上でPCR増幅により生成した。
3HBV−F:5’−GGCTCTAGAGATCCTTCGCGGGACGTC−3’(SEQ.I.D.NO. )および
4HBV−R:5’−GGCGAATTCACTGCCTTCCACCAAGC−3’(SEQ.I.D.NO. )
【0053】
増幅をエロンガーゼ酵素(LTI)を使用して製造者の指示にしたがって以下の条件で行った:94℃で30秒;その後、94℃で45秒;42℃で1分、68℃で1分を5サイクル;さらに94℃で45秒、65℃で1分および68℃で1分を30サイクル;さらに68℃で10分である。その後、625bpPCRフラグメントを、QiaquickPCR精製キットを使用して精製し、EcoRIおよびXbaIで消化し、ゲルからジーンクリーンキットを使用して精製した。3つの単離したフラグメントを結合してDH5αコンピテント細胞に形質転換し(LTI),構築物pRSVhbvNeoを得た(図12)。この構築物において、RSV発現カセットおよびネオマイシン選択マーカーの転写調節領域を修飾してCMVおよびSV40転写調節配列をしばしば含むアデノウイルスベクターとのオーバーラップを減少させる。
【0054】
2)Ad35−E1発現構築物を使用した同時トランスフェクションされたPER.C6細胞上のAd35組換えウイルスの生成
PER.C6細胞をT25フラスコに5×106細胞の密度で蒔き、次の日、PacIで消化した1μgpAdApt35.LacZ
未消化の5μgpRSV.Ad35E1
NotIで消化した2μgpWE.Ad35.pIX−rITR
を含有するDNA混合物を使用してトランスフェクションした。
トランスフェクションを、製造者の指示にしたがってリポフェクトアミンを使用して行った。トランスフェクション混合物を細胞に添加した後5時間で、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。2日後、細胞をT80フラスコに入れ、さらに培養した。トランスフェクション後1週間で、1mlの培地をA549細胞に添加し、次の日、細胞をLacZ発現に対して染色した。染色後2時間で青い細胞がはっきり見え、組換えLacZ発現ウイルスが生成されたことを示した。さらに、細胞を培養したが、CPEは明確には見られなかった。しかし、12日後、細胞の塊が単層にて現れ、トランスフェクション後18日で細胞が外れた。その後、細胞および培地をハーベストし、凍結/解凍を1回行い、1mlの粗ライゼートを使用して6ウェルプレートでPER.C6を感染した。感染後2日で、細胞をLacZ活性に対して染色した。2時間後、細胞の15%が青く染色した。wtの存在および/または能力ウイルスの複製を試験するために、A549細胞をこれらのウイルスを使用して感染し、さらに培養した。CPEの徴候は見られず、能力ウイルス複製の不存在を示した。これらの実験から、組換えAdApt35.LacZウイルスを、Ad35−E1発現構築物で同時トランスフェクションしたPER.C6細胞で作った。Ad35組換えウイルスはAd5ウイルスに対する活性を中和化することを含むヒト血清における中和化を免れる。
【0055】
その後、AdApt35.LacZウイルスを使用してAd5ウイルスに対する活性の中和化を含む血清の存在下における感染を調べた。精製したAd5基LacZウイルスはNAに対する正のコントロールとして役立った。これまで、PER.C6を24ウェルプレートに2×105セル/ウェルの密度で蒔いた。次の日、Ad5に対する高中和活性を有するヒト血清サンプルを5段階の5倍希釈における粗培地において希釈した。その後、0.5mlの希釈血清を0.5ml培地中の4×106ウイルス粒子AdApt5.LacZウイルスで混合し、37℃で30分インキュベーションした後その混合物の0.5mlをPER.C6に二重試験下にて添加した。AdApt35.LacZウイルスについて、0.5mlの希釈血清サンプルをAdApt35.LacZウイルスを含有する0.5mlの粗ライゼートで混合し、インキュベーション後、この混合物の0.5mlをデュプロにおけるPER.C6細胞に添加した。血清無しで培地中でインキュベートしたウイルスサンプルを感染に対する正のコントロールとして使用した。37℃における感染の2時間後、培地を添加し最終体積を1mlにし、さらに細胞をインキュベートした。感染後2日で、細胞をLacZ活性に対して染色した。その結果を表IIに示す。これらの結果から、AdApt5.LacZウイルスが効率的に中和され、AdApt35.LacZウイルスがヒト血清の存在に関係なく感染性のままであることが明らかである。これにより、組換えAd35基ウイルスはAd5基ウイルスに対するNAを含有するヒト血清中での中和を免れることがわかる。
【0056】
実施例6
E1欠損Ad35ウイルスを相補可能な細胞株の精製
pIG135およびpIG270の精製
構築物pIG.E1A.E1B(図13)は,Ad5配列のヌクレオチド459から3510(ジーンバンク寄託バンゴM72360)に相当するAd5のE1領域配列を含み、ヒトホスフォグリセレートキナーゼプロモータ(「PGK」)およびヘパティティスBウイルスポリA配列に操作により結合させることが可能である。この構築物の生成は国際特許出願WO97/00326に記載されている。Ad5のE1配列を以下のAD35の対応する配列により置換した。pRSV.Ad35−E1(実施例5に記載)をEcoRIおよびSse8387Iで消化し、Ad35E1配列に対応する3kbフラグメントをゲルから単離した。構築物pIG.E1A.E1BをSse8387Iで完全に消化し、EcoRIで部分的に消化した。ベクター配列に相当する、Ad5E1領域は無いがPGKプロモータは残っている4.2kbフラグメントを他のフラグメントからLMPアガロースゲルで分離し、正しいバンドをゲルから切り取った。得られた両方のフラグメントを結合し、pIG.Ad35−E1を得た。
【0057】
このベクターをさらに修飾してpUC119ベクターバックボーンに存在するLacZ配列を除去した。ベクターをBsaAIおよびBstXIで消化し、大きいフラグメントをゲルから単離した。二重鎖オリゴを以下の2つのオリゴをアニーリングすることにより調製した:
1BB1:5’−GTGCCTAGGCCACGGGG−3’(SEQ.I.D.NO. )および
2BB2:5’−GTGGCCTAGGCAC−3’ (SEQ.I.D.NO. )
【0058】
オリゴとベクターフラグメントの結合により構築物pIG135ができる(図14)。オリゴの適正な挿入によりBsaAIおよびBstXI部位が回復しユニークAvrII部位が導入される。次に、我々はpIG135のAd35−E1発現カセットの3’末端におけるユニーク部位を導入した。構築物をSapIで消化し、3’突出末端をT4DNAポリメラーゼを用いた処理により平滑にした。したがって、このように処理した直線プラスミドさらにBsrGIで消化し、大きいベクター含有フラグメントをゲルから単離した。HBVポリA配列の3’末端を回復するために、およびユニーク部位を導入するために、PCRフラグメントを以下のプライマーを使用して生成した:
3270F;5’−CACCTCTGCCTAATCATCTC−3’(SEQ.I.D.NO. )および
4270R:5’−GCTCTAGAAATTCCACTGCCTTCCACC−3’(SEQ.I.D.NO. )
PCRをpIG.Ad35E1DNAに対してPwoポリメラーゼ(ロシュ)を使用して製造者の指示にしたがって実施した。得られたPCR生成物をBsrGIで消化し、Tsap酵素(LTI)を使用して脱リン酸化した。後者はSsrGI部位における挿入断片二量化を回避するためである。PCRフラグメントおよびベクターフラグメントを結合して構築物pIG270を得た(図15)。
【0059】
Ad35E1配列はラット一次細胞を形質転換可能である。
新生WAG/RIJラットを1週間の妊娠期間にて犠牲にし、腎臓を単離した。注意深く皮膜を除去した後、腎臓を37℃でトリプシン/EDTA(LTI)中多重ラウインドのインキュベーションにより壊して単細胞懸濁液にした。浮いた細胞を冷たい1%FBS含有冷PBSに集めた。腎臓の殆どをトリプシン処理したとき、全細胞を10%FBSで補充したDMEM中に再懸濁し、滅菌チーズクロスを介して濾過した。一つの腎臓から得たあかちゃんラットの腎臓(BRK)細胞を5つの皿(Greiner、6cm)にプレートした。70〜80%の密集度に達したとき、細胞を1または5μgrのDNA/皿を用いてCaPO4沈殿キット(LTI)を使用して製造者の指示にしたがってトランスフェクションした。以下の構築物を別のトランスフェクションにおいて使用した:つまり、pIG.E1A.E1B(Ad5−E1領域発現)、pRSV.Ad35−E1,pIG.Ad35−E1およびpIG270(Ad35−E1領域発現)。形質転換された細胞の細胞増殖巣が現れるまで細胞を37℃でインキュベートした。表IIIは円状のまたは線状のDNAを使用する幾つかのトランスフェクション実験から得られた細胞増殖巣の数を示す。予想通り、Ad5−E1領域は効率的にBRK細胞を形質転換した。また、細胞増殖巣は低率ではあるが、Ad35−E1トランスフェクション細胞層においても現れた。Ad35形質転換細胞増殖巣は後の時点で現れた:つまり、Ad5E1に対する7〜10日に比べてトランスフェクション後、〜2週間である。これらの実験は、BグループウイルスAd35のE1遺伝子が一次げっ歯細胞を形質転換できることを明確に示す。このことはAd35−E1発現構築物の機能性を証明し、BグループウイルスAd3およびAd7の形質転換能の以前の発見を確認する(Dijkema,1979年)。細胞増殖巣における細胞が実際に形質転換されたかどうかを試験するために、細胞増殖巣を少し選んで、膨張(expand)させた。選択した7つの細胞増殖巣から少なくとも5つが樹立された細胞株として成長せることがわかった。
【0060】
一次ヒト羊膜細胞由来新規なパッケージング細胞の生成
羊膜穿刺後に得た羊水を遠心し、細胞をAmnioMax培地(LTI)中に再懸濁し、組織培養フラスコ中で、37℃、10%CO2で培養した。細胞が良好に成長しているとき(約1回の細胞分裂/24時間)、培地を、AmmioMax完全培地とGlutamaxI(最終濃度4mM、LTI)およびグルコース(最終濃度4.5gr/L、LTI)で補充したDMEM低グルコース培地(LTI)の1:1混合物および10%FBS(LTI)で置き換えた。トランスフェクションのために、〜5×105細胞を10cmの組織培養皿にプレートした。後日、細胞を20μgrのpIG270/皿でCaPO4形質転換キット(LTI)を使用して製造者の指示にしたがってトランスフェクションし、細胞を、DNA沈殿物と共に一晩インキュベートした。次の日、細胞を4回、PBSで洗浄し、沈殿物を除去し、さらに3週間以上形質転換した細胞巣が現れるまでインキュベートした。1週間に一度、培地を新しい培地で置き換えた。非制限的に、リポフェクトアミン(LTI)またはPEI(ポリエチレンイミン、高分子量、無水、Aldrich)等の他のトランスフェクション剤を使用した。これらの3種の薬品のうち、PEIが最良のトランスフェクション効率に一次ヒト羊膜細胞について達した:つまり、〜1%青細胞48時間。pAdAdt35.LacZの次の形質転換。
【0061】
細胞増殖巣を以下のように単離した。培地を除去し、PBSによって置き換え、その後、細胞増殖巣を、使い捨てフィルタチップのついた50−200μlギルソンピペットを使用して細胞をやさしく擦って単離した。〜10μmlPBSに含まれる細胞を15μlトリプシン/EDTA(LTI)を含む96ウェルプレートに入れ、単細胞懸濁液をピペットで上下して得、室温で短くインキュベーションした。上記AmmioMax完全培地と補充DMEMの1:1混合物および10%FBSを200μl添加した後、細胞をさらにインキュベートした。成長し続けるクローンを膨張させ、特に、Ad35またはAd11から特異的なBグループウイルス由来の、異なるサブグループのE1欠損アデノウイルスベクターの成長を補足する能力を分析した。
【0062】
HER細胞からの新規なパッケージング細胞株の生成
HER細胞を単離し、10%FBS(LTI)で補充したDMEM培地で培養した。トランスフェクション前日、〜5×105細胞を6cm皿にプレートし、37℃、10CO2下で一晩培養した。トランスフェクションをCaPO4沈殿キット(LTI)を使用して製造者の指示にしたがって実施した。各皿を8〜10μmgrのpIG270DNAで、円状プラスミドとしてまたは精製フラグメントとしてトランスフェクションした。精製フラグメントを得るために、pIG270をAvrIIおよびXbaIで消化し、Ad35E1発現カセットに相当する4kbフラグメントをゲルからアガラーゼ処理(ロシュ)により単離した。次の日、4つの皿から滅菌PBSを使用して沈殿物を注意深く洗い去る。新鮮な培地を添加し、トランスフェクションした細胞を、栄質転換細胞の細胞増殖巣が現れるまでさらに培養した。充分に大きい(>100細胞)細胞巣を選択し、上記のように96ウェルに入れた。成長を続ける形質転換HER細胞のクローンを膨張させ、特に、Ad35またはAd11から特異的なBグループウイルス由来の、異なるサブグループのE1欠損アデノウイルスベクターの成長を補足する能力を試験した。
【0063】
PER.C6由来の新規なパッケージング細胞株
実施例5に記載したように、例えばpRSV.Ad35.E1等のAd35−E1発現構築物の同時トランスフェクションによるPER.C6細胞におけるAd35E1欠損ウイルスを生成、成長させることが可能である。しかし、この方法を使用する組換えアデノウイルスの大規模生成は面倒である。その理由は、各増幅段階について、Ad35E1構築物のトランスフェクションを必要とするからである。さらに、この方法はプラスミドとウイルスゲノム間の非同種組換えの危険を増加させ、複製能力ウイルスになるE1配列を結合した組換えウイルスの生成の機会が多い。これを避けるために、PER.C6のAd35−E1蛋白質の発現は、ゲノムの発現プラスミドの完全なコピーにより媒介される必要がある。PER.C6細胞を既に形質転換しAd35−E1蛋白質を発現するので、余計なAd35−E1発現の添加は細胞に対して毒性を有するかもしれない。しかし、E1蛋白質で形質転換細胞を安定的にトランスフェクションすることは不可能ではない。その理由は、Ad5−E1発現A549細胞が生成されたからである。
【0064】
サブグループBウイルスAd7由来の組換えアデノウイルスを生成する試みにおいて、Abrahamsen氏等(1997年)は、wtAd7の汚染無く、293細胞にE1欠損ウイルスを生成できなかった。293−ORF6細胞(Brough氏等、1996年)についてプラーク精製後選択したウイルスを、非同種組換えによりAd7E1B配列を結合したことを示した。したがって、Ad7組換えウイルスの効率的な増殖はAd7−E1B発現およびad5−E4−ORF6発現の存在下でのみ可能であることがわかった。E1B蛋白質は細胞およびウイルス蛋白質と相互作用することが知られている(Bridge等、1993年;White 1995年)。ウイルス蛋白質のmRNA搬出を増加することおよび殆どの細胞mRNAの搬出を阻害することが必要である、E1B55K蛋白質およびE4−ORF6間に形成された複合体は、重要であり、ある場合には血清型特異的である。上記の実験は、Ad5のE1A蛋白質がAd7−E1A欠損を相補できることおよびアデノウイルスパッケージング細胞のそれ自体におけるAd7−E1B発現が安定な相補細胞株を生成するのに不十分であることを示す。Ad35−E1B蛋白質の一方または両方がPER.C6における効率的なAd35ベクター増殖の制限因子であるかどうかを試験するために、我々はE1BプロモータおよびE1B配列を含まず、そのプロモータおよびE1Aに対するコード化領域を欠くAd35アダプタープラスミドを生成した。wtAd35DNAのレフト末端をプライマー35F1および35R4(両方とも実施例4に記載)を使用してPwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)を用いて製造者の指示にしたがって増幅した。4.6kbPCR生成物をPCR精製キット(LTI)を使用して精製し、SnaBIおよびApaI酵素を用いて消化した。その後、得られた4.4kbフラグメントをゲルからQIAExIIキット(Qiagen)を使用して精製した。次に、pAdApt35IP1(実施例4)をSnaBIおよびApaIで消化し、2.6kbベクター含有フラグメントをゲルからジーンクリーンキット(BIO101,Inc.)を使用して単離した。単離した両方のフラグメントを結合してpBr/Ad35.レフトITR−pIXを得た(図16)。PCR中の適正な増幅は以下の機能性試験により証明された:DNAをBstBIで消化し、Ad35挿入物をベクター配列から放し、このDNA4μgを4μgのNotI消化pWE/Ad35.pIX−rITR(実施例4)でPER.C6細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクション細胞をT80フラスコに2日で継代し、2日後、再びCPEは形成し、新規なpBr/Ad35.レフトITR−pIX構築物が機能性E1配列を含むことを示す。この後、pBr/Ad35.レフトITR−pIX構築物をさらに以下のようにして修飾した。DNAをSnaBIおよびHindIIIで消化し、5’HindIII突出を、クレノウ酵素を使用して満たした。消化DNAの再結合およびコンピテント細胞(LTI)への形質転換により構築物pBr/Ad35.レフトITR−pIXΔDElAを得た(図17)。後者の構築物はbp450および1341(図5、wtAd35の番号付け)間のE1A配列を除き、レフト末端4.6kbのAd35を含み、E1AプロモータおよびE1Aコード配列の殆どを欠く。その後、pBr/Ad35.レフトITR−pIXΔDElAをBstBIで消化し、この構築物の2μgを6μmgrのNotI消化pWE/Ad35.pIX−rITR(実施例4)でPER.C6に同時トランスフェクションした。トランスフェクション後1週間で完全なCPEがトランスフェクションフラスコに形成した。
【0065】
この実験から、Ad35−E1A蛋白質がPER.C6細胞におけるAd5−E1A発現により機能的に相補されることおよびAd35−E1B蛋白質の少なくとも1つがPER.C6細胞におけるAd5−E1発現により相補されえないことがわかる。さらに、PER.C6におけるAd35−E1B蛋白質を発現することによりAd35−E1欠損ウイルスに対する相補細胞株を作ることが可能であることがわかる。PER.C6細胞のゲノムにおける完全なコピーからのAd35−E1B配列の安定な発現はE1Bプロモータにより駆動され、非制限的にHBVpA等の異種ポリアデニル化信号により終了されうる。異種pA信号はE1B挿入物と組換えベクター間のオーバーラップを避けることが必要である。その理由は、天然E1B終止はアデノウイルスベクターに存在する必要があるpIX転写単位に存在するからである。あるいは、E1B配列は非制限的にヒトPGKプロモーター等の異種プロモーターにより、あるいは非制限的に7xtetOプロモーター(Gossen およびBujard、1992年)等の誘導性プロモーターにより駆動されうる。さらに、これらの場合には、転写終止は異種pA配列、例えばHBVpAにより媒介される。Ad35−E1B配列は、wtA35配列のヌクレオチド1611および3400間に位置するE1B21KおよびE1B55K蛋白質のコード領域の一つを少なくとも含む。さらに、挿入物はwtAd35配列のヌクレオチド1550および1611間のAd35−E1B配列(の一部)をも含みうる。
【0066】
実施例7
E1AおよびE1B−21K遺伝子について欠損するAd基ウイルスがAd5相補細胞株で増殖する
E1Aについて欠損し、完全なE1B領域を保持するAd35基ウイルスの生成については本発明の実施例6に記載している。このようなウイルスは、Ad5相補細胞株PER.C6で生成かつ増殖可能である。E1B領域は2つの主な蛋白質21Kおよび55K(Bos等、1981年)に対する部分的にオーバーラップするコード配列を含む。生産的なwtアデノウイルス感染の間、21Kおよび55Kの両方はE1A蛋白質のアポトーシス誘導効果に反作用する際に伴われるが、E1B55K蛋白質はウイルス感染の後期段階の間付加的な機能を有すると考えられた。これらは、ウイルス性mRNAの蓄積、後期ウイルス性遺伝子発現のコントロール、およびmRNA移送のレベルにおける殆どのホストmRNAのショットガンを含む(Basiss等、1984年、Pilder等、1986年)。E1B−55Kおよびアデノウイルス初期領域によりコード化されたORF6蛋白質間に形成された複合体はこれらの機能の少なくとも一部を発揮する。
【0067】
E1B蛋白質のいずれがPER.C6パッケージング細胞でAd35−E1A欠損組換えウイルスの増殖に必要であるかを分析するために、構築物pBr.Ad35.レフトITR−pIXΔE1A(参照:実施例6および図17)におけるE1B領域をさらに欠いた。第1構築物であるpBr.Ad35Δ21Kは完全なE1B−55K配列を保持し、E1AおよびE1B−21Kについて欠いている。pBr.Ad35.レフトITR−pIXΔE1AをNeoIおよびBspE1で消化し、5KBベクターフラグメントをアガロースゲルからジーンクリーンキット(BIO101Inc.)を使用して製造者の指示にしたがって単離した。その後、PCRフラグメントをpBr.Ad35.レフトITR−pIXΔE1AをテンプレートDNAとして以下のプライマーを使用して生成した:
135D21:5’−TTAGATCCATGGATCCCGCAGACTC−3’(SEQ.I.D.NO. )および
235B3:5’−CCTCAGCCCCATTTCCAG−3’(SEQ.I.D.NO. )
3PwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)を使用して製造者の推薦にしたがって反応混合物にDMSO(最終濃度3%)を添加して増幅した。PCRプログラムは以下の通りである。94℃で2分、その後、94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で45秒を30サイクル、最終段階は68℃で8分であり、平滑末端を確実にした。
【0068】
このPCRはヌクレオチド1908〜2528(配列Ad35,図5)のAd35−E1B配列を増幅し、E1B−55Kコード配列(プライマー35D21におけるボールド)の開始コドンにNcoI部位を導入する。620bpPCRフラグメントをPCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、その後、NcoIおよびBspE1を用いて消化し、上記アガロースゲルから精製し、上記NcoI/BspE1消化ベクターフラグメントに結合し、pBr.Ad35Δ21K(図18)を得た。
【0069】
21Kおよび55K蛋白質のコード領域がオーバーラップしているので、21Kを残して55Kコード配列の一部を単に欠損できるのみである。pBr.Ad35.レフトITR−pIXΔE1AをBglIIで消化し、ベクターフラグメントを再結合してpBr.Ad35Δ55k1(図19)を得た。この欠損によりE1Bコード配列をヌクレオチド2261〜3330(図5のAd35配列)まで除去した。この構築物において、N末端115アミノ酸は保持され、停止コドンに至るまえに適正なリーディングフレームからの21の付加的なアミノ酸に融合した。21Kコード領域は構築物pBr.Ad35Δ55K1において無傷である。
【0070】
E1A、21K、および55K配列の殆どが欠損する第3構築物を以下のようにして生成した。pBr.Ad35.レフトITR−pIX(図16)をSnaBIおよびMfeI(MunIのアイソシゾマー)で消化し、MfeI消化から得た5’突出を、クレノウ酵素を使用して満たした。4.4kbベクターフラグメントをゲルから単離し、ジーンクリーンキット(BIO101,Inc.)を使用して製造者の指示にしたがって単離し、再結合し構築物pBr.Ad35ΔSM(図20)を得た。この構築物では、ヌクレオチド453および2804間のAd35配列が削除され、E1B55Kの3’末端の596ヌクレオチドが保持された。55K配列のさらなる欠損を構築物pBr.Ad35ΔE1A.ΔE1Bにおいて、SnaBIおよびBglIIでpBr.Ad35.レフトITR−pIXを消化し、クレノウ処理してBglII結合性末端で満たし、再結合をすることにより行った。図21は上記構築物を図で示す。
【0071】
Ad35基ウイルスがこれらの構築物を伴って生成可能であるかどうかを試験するために、構築物の各々をNotI消化pWE.Ad35pIX−rITR(実施例4参照)を使用してPER.C6で同時トランスフェクションした。それぞれのフラグメントをプライマー35F1および35R4を使用してPCR増幅した(実施例4参照)。構築物のうち幾つかを充分多量に単離することが困難であったので、このPCR増幅を実施した。この方法で等しい品質の異なるアダプターフラグメントを確認した。増幅のために、PwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)を製造者の指示にしたがって使用した。ただし、DMSO(最終濃度3%)をPCR混合物に添加した。各テンプレートに、〜50ngDNAを使用した。PCRに対する条件は以下の通りである:つまり94℃2分、その後94℃30秒、48℃45秒、72℃4分を5サイクル、さらに、94℃30秒、60℃30秒、72℃4分を25サイクル、最後に68℃8分である。
4PCRフラグメントをpBr.Ad35レフトITR−pIX,pBr.Ad35.レフトITR−pIXΔE1A,pBr.Ad35Δ21K,pBr.Ad35Δ55K1、pBr.Ad35ΔSMおよびpBr.Ad35ΔE1AΔE1Bから生成した。全フラグメントについてPCR精製キット(Qiagen)を使用し製造者の指示にしたがい、最終濃度はEtBr染色アガロースゲルで、Eagle Eye II Still VideoシステムおよびEagleSightソフトウェア(ストラタジーン)を使用して、参考にSmartLadder分子量マーカー(Eurogentec)を用いて見積った。PER.C6細胞を2.5×106細胞の密度で、T25培養フラスコ中に、10%胎児牛血清(FCS)および10mMのMgSO4含有DMEMにおいてシードまき、加湿ストーブにおいて37℃で培養した。次の日、3mgのPCRフラグメントの各々を5μgrのNotI消化pWE.Ad35pIX−rITRを用いてリポフェクトアミン(ギブコ,Life Technologies Inc.)を使用し、製造者の指示にしたがって同時トランスフェクションした。トランスフェクション後2日で、全細胞をT80フラスコに移し、さらに培養した。その後、培養物をCPEの出現についてモニターした。実施例4および6に記載した先の実験の結果に合致して、pBr.Ad35.レフトITR−pIXおよびpBr.Ad35.レフトITR−pIXΔE1Aは、トランスフェクション後1週間の内に殆ど完全なCPEを示した。異なるE1B欠損を有するフラグメントのうちpBr.Ad35Δ21Kのみが上記2つのフラグメントとして同時にCPEを示した。構築物pBr.Ad35Δ55K1、pBr.Ad35ΔSM,およびpBr.Ad35ΔE1AE1Bは全くCPEを得られず、さらに、凍結・解凍によるハーベストおよび粗ライゼートの新しいPER.C6細胞への再感染の後も得られなかった。
【0072】
これらの実験から、Ad35−E1B−55K(E1B−21Kではなく)が、Ad5相補細胞株におけるAd35基ウイルスの生成および増殖に必要であることが結論付けられる。したがって、E1AおよびE1B21K遺伝子の欠損を有し、かつE1B−55K遺伝子またはその機能性フラグメントを有するAd35基ウイルスは、Ad5相補細胞株において成長できる。あるいは、Ad35基ウイルスは、完全なE1B領域またはE1B−55K遺伝子またはその機能性フラグメントを安定的に発現するPER.C6細胞で成長できる。Ad35E1B−55K遺伝子またはその機能性部分は、非制限的にヒトPGKプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター(CMV)、ラウス肉腫ウイルスプロモーター等異種プロモーターから発現され、非制限的にB型肝炎ウイルスポリアデニル化配列(HBVpA)、シミアンウイルス40ポリアデニル化配列(SV40pA)等の異種ポリアデニル化配列により終止する。非制限的な例として、E1BプロモーターおよびHBVpAにより駆動されるAd35E1B領域を発現するPER.C6細胞、ヒトPGKプロモーターおよびHBVpAにより駆動されるAd35−E1B領域を発現するPER.C6細胞、およびヒトPGKプロモーターおよびHBVpAにより駆動されるAd35E1B−55Kの機能性フラグメントを発現するPER.C6細胞を以下に記載する。
【0073】
pIG35BLおよびpIG35BSの生成
我々は2つの発現構築物であるpIG.35BSおよびpIG35BLについて説明する。両方とも、Ad35−E1B遺伝子およびネオマイシン選択マーカーを運ぶ。この2つの構築物はE1Bプロモーターを含有するフラグメントの長さが異なる。35BLでは、プロモーターフラグメントはより長く、E1A領域(103ヌクレオチドコード配列およびpA)の3’末端を含む。E1B領域はHBVポリAにより終止する。ネオマイシン耐性遺伝子はhPGKプロモーター/HBVpAカセットにより駆動される。
pIG.35BLを以下のようにして作製した。構築物pRSV.Ad35E1(実施例5に記載、図9)をNruIおよびHindIIIで消化し、突出末端をクレノウ処理で満たした。7kbのベクターフラグメントをゲル上のより小さいフラグメントから分離し、ジーンクリーンキット(BIO101、Inc.)を使用して単離した。DNAの再結合および能力STBL2細胞(ギブコ,LTI)への形質転換の後、適正なクローンを単離した。pIG.35BL(図22)はE1B−21Kコード領域の開始部位の上流の273ヌクレオチドを含む。pIG.35BSをpIG35BLと同じ方法で作った。ただし、pRSV.Ad35E1をNruIおよびHpaI(両方の酵素は平滑末端を有する)で消化し、E1B−21Kのコード領域の上流のより短いフラグメントを得た:つまり97ヌクレオチド。
Ad35−E1B発現細胞を生成するために、PER.C6細胞を1×106細胞/皿にて10cmの皿に蒔いた。2日後、細胞をScaI線状構築物でトランスフェクションした。
4皿について2μgDNAを使用して1と4に関して製造者の指示にしたがってトランスフェクションした(合計16皿、リポフェクトアミン(ギブコ、LTI)、非担体DNA使用)。次の日、トランスフェクション細胞にG418含有培地(0.75mg/ml)を入れた。LacZ発現構築物(2μg)を使用するコントロールトランスフェクション物を48時間後に染色し、〜25%のトランスフェクション効率を示した。選択培地の添加後4日で未トランスフェクション細胞は死に始め、さらに三日後クローンは行き始めた。1週間後、第1クローンを選択した。1μgでのトランスフェクション物は最初より少ないか小さいクローンとなった(合計、〜20クローン/皿、これに対して2μgDNAでのトランスフェクションについては>50クローン/皿)。2μgのpcDNA3(インビトロゲン)を使用する正のコントロールトランスフェクションは〜50クローンになった。
合計で120クローンを選択し、107について樹立に成功した(pIG35BSから55、pIG35BLから52)。
【0074】
pIG35Bneoの生成
pIG35Bneoは、E1B遺伝子が異種プロモーター(hPGK)から発現され、かつネオマイシン耐性発現カセットをも含むAd35−E1B発現プラスミドである。同種配列における組換え事実のためにプラスミドが不安定になることを回避するため、RSVプロモーターはネオマイシン耐性遺伝子を駆動する。これを達成するために、構築物pRSVhbv.Neo(実施例5に記載、図12)をScaIおよびBamHIで消化し、突出末端をクレノウ酵素を使用して満たす。アンピシリン遺伝子の一部およびRSVプロモーターを含有する1070bpフラグメントをゲルからジーンクリーンキット(bio101,Inc.)を使用して単離した。次に、pRSVpRSVhbvNeoをScaIおよびEcoRIで消化し、クレノウで平滑化し、ネオ遺伝子、HBVpA、ベクターおよびアンピシリン遺伝子の一部を含有する3.2kbフラグメントを上記のようにして単離した。その後、2つのフラグメントを結合してpRSVneo4を得た(図23)。さらに、構築物pIG270(図15、実施例6に記載)をEcoRIおよびNcoIで消化し、粘着末端をクレノウ酵素で平滑化した。フラグメント含有ベクターをゲルから上記のようにして単離し、再結合し、pIG270delE1Aを得た。この構築物をAvrIIおよびXbaIで消化し、突出末端クレノウ酵素を使用して満たした。hPGKプロモーターおよびAd35.E1B配列含有2.9kbフラグメントをゲルから上記のようにして単離した。次に、pRSVneo4をBglIIで消化し、クレノウ酵素で平滑化し、脱リン酸化し、ゲルから単離した。その後、平滑化AvrII/XbaIAd35.E1Bフラグメントを上記で調製したpRSVneo4ベクターフラグメントに結合し、得られたクローンを分析した。同じ配向の両方の発現カセットを含む1つのクローンを選択し、pIG35Bneoとする(図24)。このクローンの詳細な分析により、不完全なクレノウ反応のため余分なBglII部位がおそらく存在することがわかった(図24のヌクレオチド2949におけるBglII部位)。
【0075】
pIG35.55Kの生成
構築物pIG35.55KはpIG35Bneoに類似している。しかし、Ad35.E1B−21Kのコード領域が欠けている。E1AおよびE1B−21K配列の両方は以下のようにpIG270から先ず単離される:
構築物pIG270をEcoRIで消化し、クレノウ酵素で処理し、PCR精製キット(Qiagen)を使用して製造者の指示にしたがって精製した。その後、回収したDNAをAgeIで消化し、〜5kbベクターフラグメントを上記にようにゲルから単離した。次に、Ad35E1B−55K配列をPCRによりpIG270テンプレートDNAで下記プライマーを使用して増幅する:
535D21:5’−TTAGATCCATGGATCCCGCAGACTC−3’(SEQ.I.D.NO. )および
635B3:5’−CCTCAGCCCCATTTCCAG−3’(SEQ.I.D.NO. )
増幅に使用した条件は前記の通りである。PCRフラグメントはPCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、NcoIで消化した。突出末端を満たすためのクレノウ処理の後、さらにDNAをAgeIで消化し、再びカラム精製する。このように処理したPCRフラグメントを上記調製EcoRI/AgeI消化ベクターフラグメントにクローン化し、pIG270.ΔE1AΔ21Kを得た。pIG35.55K(図25)を得る最後の段階は、pIG270.ΔE1Aの代りにpIG270.ΔE1AΔ21Kで開始するpIG35Bneoの生成に対する上記最後の段階に等しい。
【0076】
その後、pIG35.55KをScaIで線状化し、上記にようにPER.C6細胞をトランスフェクションするために使用した。G418選択に対して耐性であるクローンを選択してE1欠損Ad35ウイルスの増殖を相補する能力について分析する。
【0077】
実施例8
E1欠損Ad35基ベクターの生成および増殖に対する新規なパッケージング細胞株を一次ヒト細胞から誘導した。
アデノウイルスE1遺伝子による一次細胞の完全な形態学的形質転換はE1AおよびE1B領域によりコード化された蛋白質の活性が結合した結果である。溶菌感染および形質転換における種々のE1蛋白質の役割は広範囲に研究された(Zentema およびvan der Eb,1995; White 1995、1996)。アデノウイルスE1A蛋白質は一次細胞の形質転換に対して本質的である。E1A蛋白質はこの効果を転写調節に含まれる多くの細胞蛋白質との直接的な相互作用を介して及ぼす。これらは蛋白質のpRBファミリー、p300/CBPおよびTATA結合蛋白質を含む。さらに、このE1Aは細胞中のp53蛋白質レベルを上げる。アデノウイルスE1B活性が不存在の下では、p53レベルの上昇によりアポトーシスが誘発される。E1B領域によりコード化された両方の蛋白質は、メカニズムは異なるが、アポトーシスの誘発に対抗する。アポトーシス経路における下流のエフェクター蛋白質との相互作用を介してBcl−2に類似した方法で(Han等、1996年)、E1B−21Kはアポトーシスを妨げるが、E1B55Kはp53との直接相互作用を介して機能すると思われる。重要なことは、Ad2および5(サブグループC)およびAd12(サブグループA)のE1B−55K蛋白質がp53を中和する能力において機能する分子メカニズムが異なり得ることである。Ad5E1B−55Kはp53に強く結合するが、その複合体は細胞質に局在し、Ad12E1B−55Kはp53に弱く結合し、両蛋白質は核に局在する(Zantema等、1985年、Grand等、1999年)。しかし、両蛋白質はp53により他の遺伝子の転写促進を阻害する(Yew およびBerk、1992年)。
【0078】
げっ歯類細胞において、E1Aおよび、E1B−21Kまたは55Kの活性は完全な形質転換に対して充分であり、両方のE1B蛋白質の発現は2倍の効率である(Rao等、1992年)。しかし、E1B−55Kが形質転換細胞の樹立に対して必須であるという観察から、ヒト細胞において、E1B−55K蛋白質の活性はより重要であると思われる(Gallimore,1986)。実施例6はpIG270の生成を説明する。この構築物において、Ad35−E1遺伝子はhPGKプロモーターから発現され、転写はHBVpAにより終止する。hPGKプロモーターはSinger Sam等(1984年)により記載されたプロモーター配列のHincII−EcoRIフラグメントを構成する。HBVpAをB型肝炎ウイルスゲノムのBamHI−BglIIフラグメントに位置する(Simonsenおよび Levinson 1983年; Genbank HBV-AF090841参照)。上記のように、本発明に記載したE1発現構築物のポリアデニル化配列およびプロモーターは本発明とかけ離れることなく、他の給源から誘導可能である。さらに、上記のhPGKおよびHBVpA配列の他の機能性フラグメントを使用することができる。
【0079】
pIG270の機能性は一次ベイビーラット腎臓細胞(BRK)の形質転換により示された。等価なAd5−E1発現構築物との比較により、Ad35−E1遺伝子がこれらの細胞を形質転換する際により低効率であることがわかった。同様のことがAd12のE1遺伝子に対してもわかった(Bernard等、1982年)。
E1蛋白質が異なるサブグループからのアデノウイルスに対して観察されたE1配列の形質転換効率における差を決定することは明確ではない。Ad12の場合は、キメラE1A/E1B遺伝子についてのトランスフェクション研究によりBRK細胞の形質転換効率がE1A蛋白質により決定された(Bernard等、1982年)。E1B−55K蛋白質がE1欠損アデノウイルスの相補に対して必要な血清型特異性機能を有することを以下に示す。これらの機能がmRNA分布または別の後期ウイルス性機能の調節に関係する場合、これらは形質転換効率には含まれそうもない。
【0080】
挿入変異体を使用するAd2またはAd5E1B−55K蛋白質における機能性ドメインの分析により、ウイルス性複製、後期蛋白質合成およびホスト蛋白質シャットオフに関する機能が特異的なドメインに閉じ込められず、蛋白質に沿って分布することがわかった(Yew等、1990年)。変異体の同じセットを使用して、p53およびE4−Orf6との相互作用に重要なドメインがより制限されることがわかった。普通の結合領域(アミノ酸262〜326)に加え、p53結合はaa180における変異により影響され、e4−Orf6結合はaa143における変異により影響された(Yewおよび Berk、1992年、Rubenwolf等、1997年)。
【0081】
これらの結果は、形質転換に関係するE1B−55K機能(p53結合)と後期蛋白質合成(Orf6結合)を分離することが困難であることを示す。
本発明は、ある血清型の高効率な形質転換と別の血清型の血清型特異的相補機能を結合する新規なE1構築物を開示する。これらの新規な構築物を使用して一次ヒト胎児性網膜芽細胞およびヒト羊膜細胞を形質転換する。
【0082】
pIG535,pIG635,およびpIG735の生成
構築物pIG535はAd35E1B配列に結合したE1Bプロモーター配列およびAd5E1A領域を含む。pIG270(図15、実施例6参照)をEcoRIおよびNcoIで消化した。その後、5.3kbベクターフラグメントをゲルからジーンクリーンキット(bio101,Inc.)を使用して製造者の指示にしたがって単離した。次に、構築物pIG.E1A.E1B(図13、実施例6参照)をEcoRIおよびXbaIで消化し、得られた890bpフラグメントを上記のように単離した。第3フラグメントをpIG.E1A.E1BにおけるPCR増幅により以下のプライマーを使用して生成した:
15E1A−F:5’−GAGACGCCCGACATCACCTG−3’(SEQ.I.D.NO. )および
25E1B−R:5’−CAAGCCTCCATGGGGTCAGATGTAAC−3’(SEQ.I.D.NO. )。
3以下のPCRプログラムを使用した:94℃2分、さらに、94℃30秒、60℃30秒および72℃1分を30サイクル、そして最後の段階として72℃で10分を行い、平滑末端を確実にした。
得られた400bpPCRフラグメントをXbaIおよびNcoIで消化した。上記のゲル単離の後、3つのフラグメントを結合し、STBL−2バクテリアに形質転換した。全3フラグメントを正しい順序で含有する1つのコロニーを選択し、pIG535(図26)と表す。
【0083】
構築物pIG635は、21K配列が本質的にAd5からのものであり、21K配列とオーバーラップしない限りAd35E1B−55K配列に結合するような、Ad5E1AおよびキメラAd5−Ad35E1B領域を含む。第1に、AAd5E1配列の一部はPCRによりpIG.E1A.E1Bをテンプレートとして使用し、かつ以下のプライマーを使用して増幅される:
45AK:5’−GAGCGAAGAAACCCATCTGAG−3’ (SEQ.I.D.NO. )および
52155R:5’−GGTCCAGGCCGGCTCTCGG−3’ (SEQ.I.D.NO. )。
増幅はPwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)を製造者の指示にしたがって用いて達成される。その後、210bpフラグメントをプライマー配列からPCR精製キット(Qiagen)を使用して精製する。
【0084】
第2PCRフラグメントを上記pIG270DNAから以下のプライマーを使用して増幅する:
62155F:5’−CCGAGAGCCGGCCTGGAC−3’ (SEQ.I.D.NO. )および
735F10:5’−GCTCTAGACCTGCAGGTTAGTCAGTTTCTTCTCCACTG−3’ (SEQ.I.D.NO. )。
1.3kb増幅フラグメントを上記のように精製し、1:1モル比で第1PCRフラグメントと混合する。その後、混合物をPwoDNAポリメラーゼおよび以下のプログラムを使用してプライマーを添加することなく、PCR反応を先ず行う:94℃で2分、その後94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で90秒を5サイクル。次に、プライマー5AKおよび35F10を0.6μM濃度で添加し、その後、最後のPCRにより1.5kbフラグメントに増幅する。温度を以下のように設定した:94℃で2分、その後、94℃で30秒、60℃で30秒および72℃で90秒を30サイクル、続いて最終段階を72℃で10分行い、平滑末端を確実にした。得られた生成物をPCR精製キット(Qiagen)を使用して上記のように精製し、KpnIおよびSbfI(Sse8387Iのアイソシゾマー)で消化する。その後消化DNAをジーンクリーンキット(BIOInc.101)を使用してゲルから単離する。構築物pIG.E1A.E1BをKpnIおよびSbfIで消化し、ベクター含有フラグメントを上記のようにゲルから単離する。このフラグメントを上記調製最終PCR生成物に結合し、この結合混合物をSTBL−2細胞(ギブコ、LTI)に製造者の指示にしたがって形質転換する。これにより構築物pIG635(図27)を得る。
【0085】
構築物pIG735において、Ad5誘導配列およびAd35誘導配列間の境界は構築物pIG635におけるよりより3’に位置する。先ず、BspEI部位が構築物pIG.E1A.E1BのAd5配列にアミノ酸配列を変化させることなく導入される。pIG.E1A.E1BからのAd5配列を以下のPCRプライマーを使用して増幅する:
5AK:上記を参照
Bsp−R:5’−GCTCTAGACCTGCAGGGTAGCAACAATTCCGGATATTTACAAG−3’(SEQ.I.D.NO. )。
増幅をPwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)を使用し製造者の指示にしがたって達成した。以下のPCRプログラムを使用する:94℃2分、その後94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒を30サイクル、その後、最終段階を72℃10分で行い、平滑末端を確実にした。得られた0.6kbフラグメントを上記のように精製し、KpnIおよびSbfIで消化し、上記KpnI/SbfI消化pIG.E1A.E1Bベクターフラグメントに結合する。STBL−2バクテリアの形質転換(Life Techn. Inc.)後のコロニーの選択により構築物pIG.E1Δ55Kを得る。その後、pIG.E1Δ55KをSbfIで、かつ部分的にBspEIで消化する。その後、6.4kbSbfI−部分的BspEI消化ベクターフラグメントをジーンクリーンキット(bio101Inc.)を使用してゲルから単離する。次に、pIG270をBspE1およびSbfIで消化し、得られた915bpフラグメントをゲルから上記にように単離する。その後、このフラグメントを上記調製SbfI/部分的BspEI消化pIG.E1Δ55Kベクターフラグメントに結合し、STBL−2コンピテント細胞に形質転換する。これにより、構築物pIG735(図28)を得る。クローンを制限酵素消化により分析し、フラグメントの正しい結合を確実にするために配列決定した。構築物pIG535,pIG635およびpIG735を使用して相補細胞株を一次ヒト細胞から実施例6に記載されるように生成できる。
【0086】
実施例9
E1欠損Ad35ウイルスに対するPER.C6基相補細胞株
PER.C6細胞を10cm培養皿に3×106細胞/皿の密度でFBS(ギブコBRL)を10%までかつ10mMのMgCl2で補充したDMEM(ギブコ、BRL)中に蒔いた(4.9ストック溶液、シグマ)。2日後、9皿を1μgのScaI線状化pIG35.55KDNA(実施例7参照)を用いてトランスフェクトし、9皿を1.5μgのScaI線状化pIG35.55KDNAを用いてトランスフェクトした。別々のコントロール皿を、トランスフェクション効率をモニターするために1または1.5μgのScaI線状化pAdApt35.LacZを用いて、かつ、1または1.5μgのScaI線状化pcDNA.nlsLacZでトランスフェクトした。pcDNA.nlsLacZはCMVプロモーターにより誘導されたnlsLacZ遺伝子(Bonnerot等、1987年)を有するpcDNA3−基プラスミド(インビトロゲン)である。pcDNA.nlsLacZもネオマイシン耐性発現カセットを含む。負のコントロールとして、1つの余分な皿を線状化pAdApt35.LacZでトランスフェクトした。構築物はネオマイシン耐性選択遺伝子を欠いている。全トランスフェクションをリポフェクトアミントランスフェクションキット(インビトロゲン/Life Technologies)で製造者の指示にしたがって、5mlのリポフェクトアミンシラク/μgDNAを使用しておこなった。細胞を4時間トランスフェクション混合物でインキュベートし、その後培地をPER.C6培養培地で置き換えた。次の日、培地を、0.5mg/mlG418(ギブコBRL)含有培養培地で置換した。ただし、1または1.5μgのpAdApt35.LacZでトランスフェクトした2つの皿は除く。これらの皿はトランスフェクション後2日のLacZ発現をモニターするために使用した。これらの培養物のXgal染色後、トランスフェクション効率を1.5μgDNAでトランスフェクトした皿に僅かに青い細胞を伴い、約40%と見積もった。残りのトランスフェクトした皿において選択培地を週に2回リフレッシュした。選択培地を最初に添加した後2週間以内に負のコントロール皿(1.5μgのpAdApt35.LacZでトランスフェクトされた)の殆どの細胞が死んだ。pcDNA.nlsLacZでトランスフェクトした皿において、細胞クローンは目視可能になった。pIG35.55Kでトランスフェクトした細胞がG418により耐性であると考えられるので、トランスフェクション後3週、濃度を0.75mg/mlに上げた。3日後および7日後、合計196細胞クローンをpIG35.55Kでトランスフェクトした皿から選択し、96ウェルプレートの別々のウェルに蒔いた。
【0087】
1μgのpIG35.55KDNAでのトランスフェクションの2つの10cmの皿のコロニー選択後に残っている細胞をトリプシン処理し、プールし、膨張させ、プールPER55K(1.0)を得た。同様の操作を、1.5μgトランスフェクションの2つの皿に対して行った。PER55K(1.0)細胞プールを膨張させ、4つのT25フラスコに3.5×106細胞/フラスコの密度でトランスフェクションのために蒔き、ウイルス生成を試験した。さらに、親のPER.C6細胞を有する3つのT25フラスコを同じ密度で蒔いた。pAdApt35.eGFP(マーカー遺伝子として緑色の蛍光蛋白質を含有するアダプタープラスミド、実施例4参照)をPacIで消化し、プラスミドバックボーンからのアデノウイルス配列を遊離した。pWE.Ad35.pIX−rITR(実施例4参照)をNotIで消化し、コスミドバックボーンからのアデノウイルス配列を遊離した。PER.C6細胞を有する2つのフラスコおよびPER55K(1.0)細胞を有する2つのフラスコを2μgの消化pAdApt35.eGFPおよび6μg消化pWE.Ad35.pIX−rITRでそれぞれトランスフェクトした。各細胞株の1つのフラスコを8μgのpAdApt35.LacZでトランスフェクトし、トランスフェクション効率をモニターした。PER55K(1.0)細胞を有する残りのフラスコが負のコントロールとして役立ち、他のものとして処理されたが、トランスフェクション混合物を入れなかった。全トランスフェクションをリポフェクトアミン(インビトロゲン/Life Techn.)を用いて製造者に指示にしたがって8μgのDNAおよび40μlのリポフェクトアミン試薬の合計を各トランスフェクションに対して使用して行った。トランスフェクション混合物を4時間インキュベーションした後除去し、新鮮な培養培地を添加した。細胞を蒔いた後日トランスフェクションを行い、2日後、再びT25フラスコ中の細胞をT80フラスコに移した。ただし、LacZコントロールトランスフェクションは除く。これらを穏やかな固定化の後、Xgal溶液で染色した。染色溶液を用いた5時間のインキュベーション後、青い細胞の割合を両方の細胞株に対して充分にトランスフェクションされたことを示す両方のフラスコにおいて約90%にて見積もった。T80フラスコへの継代後4日、トランスフェクトPER55K(1.0)培養物は約100の現象/フラスコのCPE(ウイルス複製を示す、細胞変性効果)の開始を示した。未トランスフェクトPER55K(1.0)細胞はCPEの証拠なく密集して成長した。トランスフェクトしたPER.C6培養物において、3つのDPEの現象が密集した単層の細胞において目視可能であった。さらに3日後、トランスフェクトPER55K(1.0)培養物は全細胞は丸く塊中で離れた状態で充分なCPEを示した。対照的に、PER.C6培養物において、CPEの幾つかの現象は進行しておらず、細胞は未だ単層であった。これにより、PER.C6におけるE1欠損Ad35基ウイルスの生成は非常に非能率的であるという初期の観察が確認される。また、未トランスフェクトPER55K(1.0)培養物は、予期したように、CPEのない密集した単層を示した。充分なCPEを有するPER55K(1.0)フラスコにおける細胞および培地をハーベストし、2サイクルの凍結/解凍を行い、その後、細胞の破片を3000rpmで10分間テーブル遠心分離機により遠心分離により除去した。得られた粗ライゼートの一つを使用してT175フラスコ(1.5ml/フラスコ)におけるPER55K(1.0)細胞の新しい培養物を感染した。細胞および培地を4日後の充分なCPEでハーベストした。これにより、感染性ウイルスが初期トランスフェクションにおいて形成されることがわかった。GFP発現を、粗ライゼートで感染したA549細胞の蛍光顕微鏡検査により確認した。その後、粗ライゼートを使用して下記のように、個々のクローンにおけるこのE1欠損Ad35.AdApt.eGFPウイルスの相補性を分析した。
【0088】
pIG35.55KトランスフェクトPER.C6細胞から選択された上記クローンを膨張させ、Ad35.AdApt.eGFPの複製に耐える能力について機能的に試験をした。このクローンを6ウェルプレートに2つの密度で蒔き、1日後、15mlの上記粗ライゼートで感染した。CPEを後日モニターした。この方法で試験した146のクローンのうち19が2または3日で充分なCPEをもたらし、68が5または6日で充分はCPEをもたらした。残りのクローンは単に部分的なCPEであり、あるいは少しの非進行現象を示した。後者は負のコントロールとして伴われたPER.C6細胞と区別不能であった。
【0089】
これらの結果に基づき、24クローンの選択を、pAdApt35.GFPアダプタープラスミドおよび大きいpWE.Ad35.pIX−rITRコスミドクローンのトランスフェクション後、組換えE1欠損ウイルスを生成する能力についてさらにスクリーンにかけておこなった。クローンをT25フラスコにプレートし、上記リポフェクトアミンを使用して2μgのアダプターおよび6μgのバックボーンプラスミドを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後2日で、細胞をT80フラスコに移し、培養物が過密になるのを防止した。24クローンのうち5つがT80への継代後3日で充分なCPEを示し、別の13クローンがその後充分なCPEに進行した。残りの6クローンはCPEをしめさないかあるいはほんの開始あった。比較すると、PER.C6細胞におけるE1欠損Ad5ベクターの通常の生成は、一般にT80フラスコに移動した後4日か6日で充分なCPEに至る。
【0090】
これにより、新しいクローンはE1欠損アデノウイルスベクターを効率的に相補することがわかる。上記クローンのうち一つを使用して、種々の導入遺伝子を含むE1およびE1/E3欠損Ad35ウイルスの多重バッチを生成、製造した。上記トランスフェクションから得られ、種々のアダプタープラスミドを使用する粗ライゼートにおけるウイルスは新しい細胞株において精製されるプラークである。プラークを導入遺伝子活性について試験し、その後、4−8三重層フラスコにおいて中程度の規模生産に対して増幅した(3×175cm/フラスコ)。細胞を充分はCPEでハーベストし、ウイルスを遊離し、実施例1において記載しアデノウイルスに対する通常の操作で精製した。しかし、細胞の塊を除去するためにフレオンを用いた抽出段階は遠心分離段階で置き換えた。このようにして、DNアーゼIを用いたインキュベーション後、細胞塊をコニカル50ml管(Greiner)で8000rpmで卓上遠心分離機(固定アングルローラーを具えたBeckman Coulter allegra 21R)において30分4℃で遠心分離した。この段階を、上清が透明になるまで、新しい50ml管で繰り返した(通常は1回)。ウイルス粒子の量はHPLCにより決定された(Shabram等、1997年)。表IVは、PER55Kクローン#16細胞を入れた三重層フラスコにおけるE1およびE1/E3欠損Ad35ウイルスの中規模生産の下流処理後の収量を示す。精製ウイルス粒子量はPER.C6細胞におけるAd5基ベクターの収量で比較できる。
【0091】
我々は、充分なE1欠損Ad35基ベクターを効率的に相補する多重細胞株を生成したと結論付けた。Ad5相補細胞株におけるAd35E1B−55K発現はAd35ベクターの複製を容易にする。
【0092】
実施例10
一次細胞からの新規な相補細胞株
実施例8は構築物pIG535,ハイブリドAdE1A−Ad35E1B発現プラスミドの生成を開示する。また、pCC536sおよびpIG536はハイブリドAd5−Ad35E1構築物であるがE1A領域、E1BプロモーターおよびAd5からのE1B−19K遺伝子の殆どおよびAd35からのE1B−55K遺伝子の殆どを有する。構築物pCC536sおよびpIG536はE1B転写を終了する異種ポリアデニル化配列においてのみ異なる:pIG536はHBVpA配列を有し、pCC536sは合成pA配列を有する(SpA)。SpA配列はヒトC2相補遺伝子(Moreira等、1995年)の上流配列素子(USE)およびLevitt等(1989年)により記載された合成pA配列(SPA)からなる。
合成ポリA配列は以下のオリゴを使用して構成される:
C2SPA−1:5’−CCCTGCAGGGACTTGACTCATGCTTGTTTCACTTTCACATGGAATTTCCCAGTTATGAAATTAATAAAG−3’
C2SPA−2:5’−GTCTAGACACACAAAAAACCAACACACTATTGCAATGAAAATAAATTTCCTTTATTAATTTCATAACTG−3’
【0093】
オリゴヌクレオチドを1×アニーリング緩衝液(10mMトリスHClpH7.5,100mM NaCl,1mM EDTA)に10μMの濃度でPCRマシーンを使用して混合し、この溶液を94℃5分加熱し、その後65℃に0.5℃/秒で冷却し、65℃で5分間インキュベーション後、さらに20℃に0.05℃/秒で冷却した。次に、10μl、2mMのdNTP,0.5μl、1MのMgCl2および3μlのクレノウフラグメント(New England Biolabs)を87μlのアニールサンプルに添加し、混合物を室温で30分間インキュベートした。その後1μlのアニール化およびクレノウ処理サンプルを以下のプライマーを使用して増幅した:
C2前:5’−CGGGATCCCCTGCAGGGACTTGAC−3’
SPA逆:5’−TTGCGACTTAAGTCTAGACACACAAAAAACC−3’,製造者の指示にしたがってPwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)使用し、ただし最終濃度3%にDMSO(シグマ)を添加。PCRプログラムを94℃2分、次に(94℃30秒、55℃30秒、および72℃20秒)の30サイクルに設定した。その後、増幅DNAをQIAquickPCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、XbaIおよびSbfIで消化した。その後、この消化生成物を再びPCR精製キットで精製し、小さい消化末端を除去した。構築物pIG270をもXbaIおよびSbf(Sse8387Iのアイソシゾマー)で消化し、得られたフラグメント含有5.9kbベクターをゲルからジーンクリーンIIキット(Bio101,Inc.)を使用して単離した。その後、処理したベクターおよびPCR挿入断片を結合してpCC271(図29)を得た。こうしてpCC271はPGKプロモーター、Ad35E1領域(実施例3および図5のAd35配列からのヌクレオチド468〜3400(これも含む))および合成pA(SpA)を含む。その後、合成pA配列をも構築物pIG535に以下のようにクローン化した。
【0094】
pIG535をEcoRI、PstIおよびScaI(全酵素はNEB緩衝液3で消化したNew England Biolabsから)で消化し、キメラAd5−Ad35E1領域に対応する3kb挿入断片をジーンクリーンIIキット(Bio101,Inc.)を使用して精製した。構築物pCC271をEcoRIおよびPstIで消化した。SpAおよびPGKプロモーター含有3kbベクターフラグメントを上記のようにして単離した。単離した両フラグメントを結合して、STBL−2コンピテント細胞(Invitrogen/Life Technnoligies)に形質転換し、pCC535s(図30)を得た。pCC535sはpIG535と同じAd5−Ad35E1配列を含むが異なるpA配列である。
【0095】
pCC536sの構築物に対して、サブクローンを新規なハイブリドE1B配列を使用して作製した。Ad5E1A/E1B21K配列を以下のプライマーを使用して増幅した:
5AK:5’―GAGCGAAGAAACCCATCTGAG―3’および
2155R:5’−GGTCCAGGCCGGCTCTCGG−3’
これはDNAをテンプレートとしてPwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)を製造者の指示にしたがって使用するがさらに最終濃度を3%にDMSOを添加した、pIG.E1A.E1B(参照:実施例6および図13)を有する。プログラムは、以下のように設定した:94℃2分、その後(94℃30秒、58度30秒、72℃30秒)の30サイクル、最後に68℃8分。これにより、Ad5配列のヌクレオチド2022−2233に対応する210bpフラグメントを得た。第2PCRをプライマーを使用してpCC271において行った:
2155F:5’−CCGAGAGCCGGCCTGGACC―3’および
35F10:5’−GCTCTAGACCTGCAGGTTAGTCAGTTTCTTCTCCACTG−3’。
同じPCRプログラムを使用したが90秒に延長した。得られた1.3kbフラグメントが3’末端にSbfI部位を有するAd35配列のヌクレオチド2112〜3400に対応する。留意することは、プライマー2155Fおよび2155Rが以下のように2つのフラグメントの組み立て可能に充分相補性であることである:
両方のPCRフラグメントをゲルからQiagenゲル抽出キットを使用して精製した。精製サンプルのアリコートを等モル比で混合し、上記のように下記のプログラム設定を使用してPwoDNAポリメラーゼを使用しプライマー5AKおよび35F10を使用する組み立てPCR増幅に対するテンプレートとして使用した:
94℃2分、および(94℃30秒、60℃30秒、72℃2分)を5サイクル、さらに、(94℃30秒、58℃30秒、72℃90秒)を25サイクル。得られた1.5kbフラグメントをゲルからQiaquickゲル抽出キット(Qiagen)を使用して精製し、pCR−Script/Ampベクター(ストラタジーン)に結合し、DH5aコンピテント細胞(Invitorgen/Life Technologies)に形質転換し、pCR535E1B(図31)を得た。この構築物を制限分析により確認し、配列決定し、目標配列の正しい増幅を確認した。
【0096】
その後、pCR535E1BをNotIで消化し、突出端をクレノウフラグメントで平滑にした。その後、DNAをQiaquickPCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、溶出DNAをPstIで消化した。pCR535E1BベクターからのキメラE1配列含有1.5kbフラグメントをゲルからジーンクリーンIIキット(Bio101,Inc.)を使用して精製した。このフラグメントをPvuIIおよびPstIで消化したベクターpCC535sに結合し、STBL−2コンピテント細胞(Invitorgen/Life Technologies)に形質転換し、pCC2155s(図32)を得た。その後、pCC536s構築物を完成するために、Ad5−E1配列をpCC2155sサブクローンにクローン化した。pIG.E1A.E1BをEcoRIおよびKpnIで消化し、Ad5E1AおよびAdE1B21K(Ad5配列のヌクレオチド459〜2048)に対応する1.6kbフラグメントをゲルからジーンクリーンキットを使用して単離した。pCC2155sをEcoRIおよびKpnIで消化し、フラグメント含有ベクターをもゲル精製した。両方のフラグメントを結合してDH10B電気コンピテント細胞(Invitorgen/Life Technologies)への形質転換によりpCC536s(図33)を得た。ハイブリドE1B配列を図38により詳細に示す。図38Aは野生型(wt)Ad35およびAd5配列を有するpCC536s構築物におけるE1B−21Kの蛋白質配列のアラインメントを示す。pCC536sにおけるE1B−21K蛋白質の殆どがAd5から誘導される。ただし、Ad35E1B−21Kに等しいC末端の6つのアミノ酸を除く。図38BはE1B−55K蛋白質に対して同じアラインメントを示す。この場合、pCC536sのN末端アミノ酸はAd5にaa65まで等しい。残りはAd35E1B−55Kに等しい。明らかに、種々のハイブリドE1B−55K構築物を、本発明から逸脱することなく上記一般的方法にしたがって設計可能である。
【0097】
構築物pIG536を、フラグメントをHBVpA含有pIG270(実施例6、図15)からの対応フラグメントを有するpCc536sにおけるSpAで置換することにより作製した。pIG270をBamHIおよびBglIで消化し、1.8kb挿入断片をゲルからジーンクリーンIIキット(Bio101,Inc.)を使用して単離した。pCC536sを同じ酵素で消化し、フラグメント含有4.8kbベクターをゲルから上記のようにして精製した。単離した両フラグメントを結合し、STBL−2コンピテント細胞(Invitorgen/Life Technologies)に形質転換し、構築物pIG536(図34)を得た。
【0098】
生成したE1構築物を実施例6で記載した一次ベイビーラット腎臓(BRK)細胞において試験した。この結果(表V)により、Ad5−E1遺伝子は一次BRK細胞をAd35E1遺伝子よりさらに効率的に形質転換するという初期の観察を確認した。キメラAd5−Ad35E1発現構築物、pCC535sおよびpCC536sは完全なAd35E1構築物、pIG270およびpCC271よりさらに多くの形質転換コロニーを製造した。さらに、pCC535sにおける合成ポリアデニル化配列の使用により、HBVpA変種pIG535に比較して僅かに多い細胞増殖巣を得た。
【0099】
ヒト胎児網膜芽細胞(HER)を18週および21週の中絶された胎児の眼から単離した。この眼をPBSの入った6cmの皿に入れ、外側組織を除いた。内側に至る切り込みを入れて網膜芽細胞を含有する眼の内側後ろにある灰色の細胞層をこすり取った。この層を2mlのPBSの入った14ml管に入れ、組織を沈殿させ、その後、PBSを除去した。2mlのトリプシン(0.25%、EDTA無し,ギブコBRL)を添加し、5分間37℃でインキュベートし、時折旋回した。組織片を沈殿させ、細胞の入った1mlのトリプシンを新しい管に移した。この管に4mlの培養培地(10%FCSの入ったDMEM)を入れ、管を氷上に貯蔵した。トリプシン中の残りの組織片を6cmの皿に入れ、さらに小さい片に切断した。2mlの新しいトリプシンを添加した後、これらを再び14ml管で37℃にて時折旋回してインキュベートした。その後、この混合物を培養培地中の第1に単離した細胞に添加し、合計を1000rpmで卓上遠心分離機において遠心分離した。上清を除去し、細胞を10mlの培養培地に再懸濁した。単離HER細胞を2つの6cm皿に入れ、37℃で10%のCO2下でインキュベートした。90%の密集度の培養物を1:3に分割し、さらにインキュベートした。この手順を、トランスフェクションに使用するのに充分な皿を確保するまで繰り返し、さらに培養した。トランスフェクションを、製造者の指示にしたがって、CaPO4同時トランスフェクションキット(Invitorgen/Life Technologies)を使用して、種々の継代数にて実施した。各皿(50〜70%の密集度)に対して、20μgのDNAを使用した。初期トランスフェクションをpIG.E1A.E1BつまりAd5−E1発現構築物、およびpIG535つまりハイブリドAd5−E1A/Ad35−E1B発現構築物を使用しておこなった。トランスフェクション後2〜3週間で形質転換細胞増殖塊がpIG.E1A.E1Bトランスフェクション皿において見られるようになった。pIG.E1A.E1Bでトランスフェクトした皿において平均15〜20の細胞増殖塊/皿が見られた。30を超えるクローンを選択して96ウェルプレートに移した。密集細胞をより大きい培養プレートまたはフラスコに継代し、最終的に、T175フラスコから液体窒素中でアンプルに入れて生存可能な冷凍を施した。全選択クローンをこの方法で樹立した。pIG535でトランスフェクトした皿ではずっと後になって、最初のものはトランスフェクション後約5週間で、形質転換細胞増殖塊が見られた。平均3〜4クローンを1皿当たりに見つけた。合計46クローンを、トランスフェクション後7週間から3カ月で選択し、そのうち14が生存可能で複数回継代可能であった。これらのうち、2つのクローン(クローン#45および#75)をT175フラスコまで成長し、液体窒素中アンプルにて生存可能に冷凍した。
【0100】
一次HER細胞をも構築物pCC535sおよびpCC536sでトランスフェクトした。pCC535sのトランスフェクションにより平均2クローン/皿になり、合計50クローンを選択した。これらの選択したクローンのうち、2つを樹立した。pCC536sを用いたトランスフェクションから、少なくとも1つのクローンを樹立できた。
【0101】
上記実験により、一次HER細胞はハイブリドAd5−Ad35E1配列で形質転換可能であることがわかる。形質転換効率は完全Ad5E1領域で得たものより低かった。その後、我々は新しい細胞株が組換えAd35基E1欠損ベクターを相補できるかどうかを試験した。pIG535トランスフェクションから得たクローン#45をT25フラスコに7×106細胞/フラスコの密度で蒔き、Ad35.AdApt.eGFPウイルス(実施例9参照)を用いて5および25ウイルス粒子/細胞の多重感染にて感染させた。多重感染度25および5に対してそれぞれ4および5日で充分なCPEが見られた。Ad5.AdApt.eGFPウイルスで感染したクローン#45細胞の比較並行培養として、多重感染度25および5に対してそれぞれ7および8日で充分なCPEを得た。初期感染効率はAd5およびAd35ウイルスに対して比較し、〜80%(多重感染度=5)および〜95%(多重感染度=25)の細胞は、感染後1日でGFPウイルスで感染された。蛍光顕微鏡で測定された。クローン#75からの細胞を6ウェルプレートに2×106細胞/ウェルの密度で蒔き、多重感染度5(VP/細胞)にてAd35.AdApt.eGFPまたはAd5.AdApt.eGFPで感染した。再び、初期感染効率を両ウイルスに対して比較した。Ad35.AdApt.eGFP感染の場合4日で充分なCPEを観察したが、Ad5.AdApt.eGFP感染クローン#75細胞は7日で充分はCPEを得た。Ad35およびAd5組換えベクター間のAd35相補細胞における複製効率の違いは、ウイルスがプラスミドトランスフェクションにより生成された場合により明瞭である。
【0102】
クローン#45細胞をT25フラスコに3.5×106細胞の密度で蒔き、上記にように、リポフェクトアミン試薬(Invitorgen/Life Technologies)を使用して製造者の指示にしたがって3日後にトランスフェクトした。PacIで消化した2μgのpAdApt35.eGFPアダプタープラスミドを、NotIで消化した6μgのpWE.Ad35.pIX−rITRまたはpWE.Ad35.pIX−rITRΔE3バックボーンコスミドを使用して同時トランスフェクトした。PacIを使用して消化した2μgのpAdApt.eGFP(Ad5アダプタープラスミド、国際特許出願WO00/70071に記載)をPacIで消化した6μgのpWE.Ad5.AflII−rITRsp(Ad5バックボーンプラスミド、国際特許出願WO00/70071に記載)で同時トランスフェクトした。一つのT25はトランスフェクトせず、負のコントロールをしてつかった。トランスフェクション後1日、蛍光顕微鏡でモニターし、全eGFPトランスフェクションにおいて10〜15%で見積もった。トランスフェクション後3日で細胞をT80フラスコに移し、さらに37℃/10%CO2でインキュベートした。再び3日後、CPE現象を、pAdApt.eGFPおよびpWE.Ad35pIX−rITR+または−E3でトランスフェクトした培養物において見えるようになった。E3欠損バックボーンを用いたトランスフェクションはより多くの緑色蛍光細胞およびCPE現象を有した。Ad5プラスミドを用いたトランスフェクションは約20%の緑色蛍光細胞を示したにすぎず、そのうち殆どは死に、CPE現象は生じなかった。pAdApt35.eGFPおよびpWE.Ad35.pIX−rITRΔE3でトランスフェクトした培養物は80%のCPEを明らかに示し、かつpAdApt35.eGFPおよびpWE.Ad35.pIX−rITR構築物は進行CPE現象を示したので、2日後、この違いはより大きくなった。Ad5トランスフェクト培養物はなんの進行もしめさなかった。表VIはこれらの結果を纏める。我々は上記の新規相補細胞株がE1欠損Ad35基ウイルスの複製を効率的に持続し、かつE1欠損Ad5基ウイルスの生成および複製は効率がより劣ることを結論付ける。あきらかに、Ad35E155K蛋白質はAd5−E4Orf6蛋白質との機能的複合体を形成しない。したがって、相補性に対する血清型特異性をもAd35パッケージング細胞における組換えAd5ベクターに対して示される。
【0103】
実施例11
pWE.Ad.pIX−rITRΔE3の生成
ヒトアデノウイルスの初期領域−3は、アデノウイルス感染に対するホスト免疫応答と干渉する蛋白質に対する複数コード化領域を含む。アデノウイルスベクターをワクチンキャリヤとして使用する場合このような干渉は望ましくない。したがって、我々はE3領域を欠くAd35バックボーンコスミドを構築した。
【0104】
構築物pBr.Ad35.PRn(図35、公開EP1054064A1)をStuIおよびMluIで消化し、17.3kbベクターフラグメントを低融点(LMP)ゲルからアガラーゼ酵素(ロシュ)を使用して製造者の指示にしたがって精製した。次に、PCRフラグメントを以下のプライマーを使用してpBr.Ad35.Prnにおいて生成した:
35E3前:5’―AATGACTAATGCAGGTGCGC−3’および
35E逆:5’−CGACGCGTTGTAGTCGTTGAGCTTCTAG−3’。
増幅に対して、PwoDNAポリメラーゼ(ロシュ)を製造者の指示にしたがって使用し、以下のプログラムを使用した:94℃で2分、(94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で1分)の30サイクル、そして68℃8分で最後のインキュベーション。833bpPCR生成物をQIAquickPCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、MluIおよびStuIで消化した。消化DNAをゲルからQIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を使用して精製した。両方の単離フラグメントを結合し、DH5aコンピテント細胞(Invitorgen/Life Technologies)に形質転換し、pBr.Ad35.PRnΔE3(図36)を得た。プラスミドを制限分析およびPCR増幅挿入断片の配列決定により確認した。その後、E3欠損をpWE.Ad35pIX−rITRコスミドバックボーンにクローン化した。pWE.Ad35pIX−rITR(実施例4および図8を参照)をPacIで消化し、DNAをイソプロパノールを用いた沈殿により精製し、70%EtOHで洗浄した。milliQ水中での再懸濁後、DNAをSwaIで消化し、22.8kbベクター含有フラグメントをLMPゲルから上記アガラーゼ酵素を使用して精製した。
【0105】
構築物pBr.Ad35.PRnΔE3をPacIおよびSwaIで同じ方法で消化し、16.6kbフラグメントをアガラーゼ酵素を使用して単離した。両方の単離したフラグメントを0.5〜0.6μgの各フラグメントを使用して結合した。その後、結合フラグメントをλ相パッケージング抽出物(ストラタジーン)を使用して製造者の指示にしたがってパッケージングし、STBL−2細胞と混合した。バクテリアをLB+Ampプレートにプレートし、得られたコロニーを正しい構築物の存在について分析した。これにより、構築物pWE.Ad35.pIX−rITRΔE3(図37)を得た。E3欠損はAd35配列(実施例3)のヌクレオチド2764から30320に拡張し、2.6kb領域に及ぶ。上記のようにPER55−クローン#16細胞(実施例9参照)におけるNotI消化pWE.Ad35.pIX−rITRΔE3およびpIPep−1消化pAdApt35.eGFPの構築物によりGFP発現Ad35基ウイルスをもたらす。これらのウイルスからのウイルス性DNAの単離に際し、ウイルスはE3領域のPCR増幅により、ウイルスが予想どおり2.6kbのE3配列について欠いていることがわかった。
【0106】
【表1】
【0107】
表1の説明
中和実験に使用した全ヒトアデノウイルスを、実施例1に記載したように、PER.C6細胞(Fallaux 等、1998年)で生成し、CsClで精製した。HPLCカラムから種々の血清型が溶出するNaCl濃度を示す。ウイルス粒子/ml(VP/ml)をAd5標準から計算した。実験(CCID50)における力価を、中和実験と並行して実施した滴定により、実施例1で記載したように、PER.C6細胞で定量した。CCID50はこの研究で使用された44のウイルスについて示し、かつ5日後にウェルの50%でCPEを得るために必要なウイルスの希釈を示す。VP/CCID50の比をlog10で示し、PER.C6細胞における種々のバッチの感染力の測定値である。
【0108】
【表2】
【0109】
【表3】
【0110】
【表4】
【0111】
【表5】
【0112】
【表6】
【0113】
リファレンス:
【図面の簡単な説明】
【図1】 試験した各ヒト野生型アデノウイルスに対する中和に対して正の血清サンプルのパーセントを示す棒グラフ(参照:中和アッセイの説明に対する実施例)。
【図2】 VP/CCID50比および中和のパーセントの間に相関が無いことを示すグラフ。
【図3】 アデノウイルス血清型の選択に対する中和活性を示す血清サンプルのパーセントを示す棒グラフ。血清はベルギーおよびイギリスの健康なボランティアから得た。
【図4】 アデノウイルス血清型5、11、26、34、35、48および49に対する中和活性を示す血清サンプルのパーセントを示す棒グラフ。血清はヨーロッパおよび合衆国の5箇所から得た。
【図5】 ヒトアデノウイルス35型の配列(Ad35の全配列)。
【図6】 pAdApt35IP1のマップ。
【図7】 構築物pWE.Ad35.pIX−rITRに対して実施された工程の略図。
【図8】 pWE.Ad35.pIX−rITRのマップ。
【図9】 pRSV.Ad35−E1のマップ。
【図10】 PGKneopAのマップ。
【図11】 pRSVpNeoのマップ。
【図12】 pRSVhbvNeoのマップ。
【図13】 pIG.E1A.E1Bのマップ。
【図14】 pIG135のマップ。
【図15】 pIG270のマップ。
【図16】 pBr.Ad35.leftITR−pIXのマップ。
【図17】 pBr.Ad35.leftITR−pIXΔE1Aのマップ。
【図18】 pBr.Ad35.Δ21Kのマップ。
【図19】 pBr.Ad35.Δ55K1のマップ。
【図20】 pBrAd35ΔSMのマップ。
【図21】 Ad35−E1A/E1B欠損構築物の略図。
【図22】 pIG.35BLのマップ。
【図23】 pRSVneo4のマップ。
【図24】 pIG35Bneoのマップ。
【図25】 pIG35.55Kのマップ。
【図26】 pIG535のマップ。
【図27】 pIG635のマップ。
【図28】 pIG735のマップ。
【図29】 pCC271のマップ。
【図30】 pCC535sのマップ。
【図31】 pCR535E1Bのマップ。
【図32】 pCC2155sのマップ。
【図33】 pCC536sのマップ。
【図34】 pIG536のマップ。
【図35】 pBr.Ad35.PRnのマップ。
【図36】 pBr.Ad35.PRnΔE3のマップ。
【図37】 pWE.Ad35.pIX−rITRΔE3。
【図38A】 wtAd5およびwtAd35配列を有するpCC536sにおけるE1B−21K(A)アミノ酸配列のアラインメント。
【図38B】 wtAd5およびwtAd35配列を有するpCC536sにおけるE1B−55K(B)アミノ酸配列のアラインメント。
Claims (29)
- サブグループBからの血清型に基づく組換えアデノウイルスを補足し得るパッケージング細胞系であって、アデノウイルスのE1コード配列によって形質転換されているヒト細胞から導かれ、E1B-55Kタンパク質をコードする配列がサブグループBからのものであり、サブグループCのアデノウイルスに由来するE1Aタンパク質のコード領域を備える、細胞系。
- 前記ヒト細胞が、一次のもの、二倍体の細胞、又はその誘導体である、請求項1記載のパッケージング細胞系。
- 前記サブグループBのアデノウイルスが血清型35である、請求項1又は2記載のパッケージング細胞系。
- 前記E1コード配列が、動作可能に、コード化タンパク質の転写及び翻訳を可能にする調節配列に連結される、請求項1〜3の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記アデノウイルスE1コード配列が、動作可能に1つのDNA分子上に連結されるか、又は2つの別々のDNA分子上に配置されるかそのどちらもである、請求項1〜4の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 一次のヒト細胞が、一次の網膜芽細胞、一次の胚腎臓細胞及び一次の羊膜細胞からなる群より選ばれている、請求項1〜5の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35である、請求項1〜6の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記E1コード配列が、E1Aタンパク質のコード領域、及びE1B-55Kタンパク質の停止コドンに至るまで及びこれを含むE1Bコード配列に連結するE1Bプロモータ配列を備える、請求項7記載のパッケージング細胞系。
- 前記サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35であり、及びE1コード配列がAd35野生型配列のヌクレオチド468から3400までを備える、請求項1〜6の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- サブグループBからの血清型に基づく組換えアデノウイルスを補足し得るパッケージング細胞系であって、非サブグループBアデノウイルスからのE1Aコード配列及び少なくとも1部分のE1B-21Kコード配列を備え、及び更にサブグループBのアデノウイルスからのE1B-55Kコード配列を備えるキメラのアデノウイルスE1構築物によって形質転換されている細胞から導かれ、及びサブグループCのアデノウイルスに由来するE1Aタンパク質のコード領域を備える、細胞系。
- E1B-55Kコード配列がE1B-21Kコード配列と重複せず、サブグループBのアデノウイルスからのものである、請求項10記載のパッケージング細胞系。
- サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35である、請求項8又は9記載のパッケージング細胞系。
- 前記アデノウイルスE1コード配列が、動作可能に、コード化タンパク質の転写及び翻訳を可能にする調節配列に連結される、請求項8〜10の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記細胞が、一次のもの、二倍体のヒト細胞、又はその誘導体である、請求項10〜13の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 一次のヒト細胞が、一次の網膜芽細胞、一次の胚腎臓細胞及び一次の羊膜細胞からなる群より選ばれている、請求項14記載のパッケージング細胞系。
- サブグループBからの血清型に基づく組換えアデノウイルスを捕捉し得るパッケージング細胞系であって、非サブグループBアデノウイルスのE1コード配列によって形質転換されている細胞から導かれ、及び更にサブグループBのアデノウイルスのE1B-55Kコード配列で前記細胞のゲノム中に統合されるものを備え、サブグループCのアデノウイルスに由来するE1Aタンパク質のコード領域を備える、細胞系。
- 前記サブグループBのアデノウイルスがアデノウイルス血清型35である、請求項16記載のパッケージング細胞系。
- 前記E1コード配列が、動作可能に、コード化タンパク質の転写及び翻訳を可能にする調節配列に連結される、請求項16又は17記載のパッケージング細胞系。
- 前記E1B-55Kコード配列が、E1Bプロモータにより駆動され、及び異種ポリアデニル化信号により終止される、請求項16〜18の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記E1B-55Kコード配列が異種プロモータにより駆動される、請求項16〜18の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記アデノウイルスE1コード配列が、動作可能に1つのDNA分子上に連結されるか、又は2つの別々のDNA分子上に配置されるかそのどちらもである、請求項16〜20の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記細胞が、一次のもの、二倍体のヒト細胞、又はその誘導体である、請求項16〜21の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 一次のヒト細胞が、一次の網膜芽細胞、一次の胚腎臓細胞及び一次の羊膜細胞からなる群より選ばれている、請求項22記載のパッケージング細胞系。
- 前記細胞がサブグループCのアデノウイルスE1コード配列によって形質転換され、PER.C6細胞(ECACC受託番号96022940)、293細胞、911細胞、又はA549細胞、又は何れかのこれらの細胞の誘導体である、請求項22記載のパッケージング細胞系。
- サブグループBのアデノウイルスの前記E1配列が、関連組換えウイルスベクタに存在する配列と重複する配列を含まない、請求項1〜24の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- 前記非サブグループBアデノウイルスがアデノウイルス血清型5である、請求項10〜25の何れか1項記載のパッケージング細胞系。
- サブグループBの血清型に基づく組換えアデノウイルスを補足するための方法であって、請求項1〜26の何れか1項記載のパッケージング細胞系を、前記組換えアデノウイルスをコード化する核酸と共に提供する工程、及び前記細胞系を培養し補足を可能にさせる工程を含む、方法。
- さらに、補足した組換えアデノウイルスを収集する工程を含む、請求項27記載の方法。
- 前記組換えアデノウイルスが血清型35に基づく、請求項27又は28記載の方法。
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US6783980B2 (en) * | 1995-06-15 | 2004-08-31 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
US20040043489A1 (en) * | 1998-07-08 | 2004-03-04 | Menzo Havenga | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use |
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EP1157999A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-11-28 | Introgene B.V. | Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof |
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US7608425B2 (en) | 2004-07-23 | 2009-10-27 | Immunomedics, Inc. | Methods for protein expression in mammalian cells in serum-free medium |
US7531327B2 (en) | 2004-07-23 | 2009-05-12 | Immunomedics, Inc. | Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture |
US7537930B2 (en) | 2004-07-23 | 2009-05-26 | Immunomedics, Inc. | Mammalian cell lines for increasing longevity and protein yield from a cell culture |
CA2583843C (en) | 2004-10-13 | 2010-09-21 | Crucell Holland B.V. | Improved adenoviral vectors and uses thereof |
AU2005305869B2 (en) | 2004-11-16 | 2010-12-09 | Aeras Global Tb Vaccine Foundation | Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors |
CA2593036A1 (en) | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Medimmune Vaccines, Inc. | Methods of producing influenza vaccine compositions |
ES2317517T5 (es) * | 2005-04-11 | 2016-01-21 | Crucell Holland B.V. | Purificación de virus usando ultrafiltración |
AU2012216357B2 (en) * | 2005-04-11 | 2014-01-30 | Purdue Research Foundation | Vaccine against pandemic strains of influenza viruses |
CA2609276A1 (en) * | 2005-05-23 | 2006-11-30 | De-Chu C. Tang | Rapid production of adenovirus-free recombinant adenovirus vectors |
AU2006202209B2 (en) * | 2005-05-27 | 2011-04-14 | Lifescan, Inc. | Amniotic fluid derived cells |
PL1951296T5 (pl) | 2005-11-01 | 2015-06-30 | Seqirus Uk Ltd | Szczepionki wirusowe otrzymane z komórek o niskim poziomie pozostałości DNA komórkowego poprzez traktowanie beta-propiolaktonem |
DE102005054628A1 (de) | 2005-11-16 | 2007-05-24 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Verfahren zur Herstellung von permanenten humanen Zelllinien |
US20100143302A1 (en) * | 2006-03-16 | 2010-06-10 | Crucell Holland B.V. | Recombinant Adenoviruses Based on Serotype 26 and 48, and Use Thereof |
EP1998804B1 (en) * | 2006-03-27 | 2014-04-16 | Crucell Holland B.V. | Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant |
EP2010557B1 (en) | 2006-03-31 | 2014-02-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | High titer recombinant influenza viruses for vaccines |
WO2007143606A2 (en) | 2006-06-02 | 2007-12-13 | International Aids Vaccine Initiative | Hiv-1 clade a consensus sequences, antigens, and transgenes |
EP2415783B1 (en) | 2006-10-16 | 2016-12-14 | Genelux Corporation | Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method |
AU2008209759B2 (en) | 2007-01-30 | 2013-03-21 | Transgene S.A. | Papillomavirus E2 polypeptide used for vaccination |
DE602008004476D1 (de) * | 2007-03-09 | 2011-02-24 | Vectorlogics Inc | Zellen für adenovirusvektor- und proteinherstellung |
US9474798B2 (en) | 2007-06-18 | 2016-10-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Influenza M2 protein mutant viruses as live influenza attenuated vaccines |
US8871515B2 (en) * | 2008-09-17 | 2014-10-28 | Isogenis, Inc. | Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof |
MX2011004292A (es) * | 2008-11-03 | 2011-05-31 | Crucell Holland Bv | Metodo para la produccion de vectores adenovirales. |
AU2010206195B2 (en) | 2009-01-20 | 2016-03-10 | Transgene Sa | Soluble ICAM-1 as biomarker for prediction of therapeutic response |
RU2542435C2 (ru) | 2009-03-24 | 2015-02-20 | Трансжене Са | Биомаркер для мониторинга пациентов |
SI2419728T1 (sl) | 2009-04-17 | 2014-03-31 | Transgene Sa | Bio-označevalec za monitoring pacientov |
SG176619A1 (en) | 2009-07-10 | 2012-01-30 | Transgene Sa | Biomarker for selecting patients and related methods |
CA2770075C (en) | 2009-08-07 | 2021-08-24 | Perrine Martin | Composition for treating hbv infection |
AU2010305768B2 (en) | 2009-10-15 | 2015-05-14 | Crucell Holland B.V. | Process for adenovirus purification from high cell density cultures |
PL2488636T3 (pl) | 2009-10-15 | 2014-07-31 | Crucell Holland Bv | Sposób oczyszczania cząsteczek adenowirusów z hodowli o wysokim zagęszczeniu komórkowym |
ES2813347T3 (es) | 2009-10-26 | 2021-03-23 | Wisconsin Alumni Res Found | Virus recombinantes de la influenza de alto título con replicación mejorada en células Vero |
US20120309056A1 (en) | 2010-02-04 | 2012-12-06 | Leon Arnaud | Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells |
ES2578514T3 (es) | 2010-02-15 | 2016-07-27 | Crucell Holland B.V. | Método para la producción de vectores adenovíricos |
US10130697B2 (en) | 2010-03-23 | 2018-11-20 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses |
US20130203151A1 (en) | 2010-04-26 | 2013-08-08 | Scott Balsitis | Production of alphavirus replicon particles in packaging cells |
DK2606128T3 (en) * | 2010-08-16 | 2014-12-01 | Cevec Pharmaceuticals Gmbh | Permanent human amniocyte cell line for influenza virus production |
US8771709B2 (en) | 2010-09-20 | 2014-07-08 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic vaccination against active Tuberculosis |
EP2627351B1 (en) | 2010-10-11 | 2018-12-26 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Antigen delivery platforms |
EP2667892B1 (en) | 2011-01-26 | 2019-03-27 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Rsv immunization regimen |
US9058175B2 (en) * | 2011-06-07 | 2015-06-16 | The Mathworks, Inc. | Parameter promotion in a block diagram modeling environment |
BR112014008694A2 (pt) | 2011-10-11 | 2017-06-20 | Novartis Ag | moléculas de ácido nucleico policistrônico recombinante |
WO2013054199A2 (en) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Novartis Ag | Cmv antigens and uses thereof |
EP2785372B1 (en) | 2011-11-28 | 2019-06-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Influenza virus vaccines and uses thereof |
US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
NZ628385A (en) | 2012-03-12 | 2016-09-30 | Crucell Holland Bv | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
NZ630649A (en) | 2012-03-22 | 2016-12-23 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vaccine against rsv |
US9125870B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-08 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
US9442702B1 (en) | 2012-04-30 | 2016-09-13 | The Mathworks, Inc. | Overriding an interface in a graphical block diagram modeling environment |
WO2013174910A1 (en) | 2012-05-24 | 2013-11-28 | Crucell Holland B.V. | Adenoviral vectors for transduction of vascular tissue |
WO2014066443A1 (en) | 2012-10-23 | 2014-05-01 | Emory University | Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto |
WO2014078688A2 (en) | 2012-11-16 | 2014-05-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Recombinant adenoviruses and use thereof |
EP2988780B1 (en) | 2013-04-25 | 2018-12-26 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides |
CN105408348B (zh) | 2013-06-17 | 2021-07-06 | 扬森疫苗与预防公司 | 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽 |
JP2016524915A (ja) | 2013-07-15 | 2016-08-22 | ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション | Mdck、ベロ細胞又は卵内で増強された複製を有する高力価の組換えインフルエンザウイルス |
HUE041791T2 (hu) | 2013-09-19 | 2019-05-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Javított adenovírus-készítmények |
US10801070B2 (en) | 2013-11-25 | 2020-10-13 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer |
WO2015085147A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | The Broad Institute Inc. | Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data |
BR112016014410A2 (pt) | 2013-12-20 | 2018-02-20 | The Broad Institute Inc. | terapia de combinação com vacina de neoantígeno |
US10053671B2 (en) | 2014-06-20 | 2018-08-21 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
MA40920A (fr) | 2014-11-07 | 2017-09-12 | Takeda Vaccines Inc | Vaccins de la main, du pied et de la bouche, et procédés de fabrication et d'utilisation de ceux-ci |
AU2015252119A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-26 | Takeda Vaccines, Inc. | Hand, foot, and mouth vaccines and methods of manufacture and use thereof |
EP3234193B1 (en) | 2014-12-19 | 2020-07-15 | Massachusetts Institute of Technology | Molecular biomarkers for cancer immunotherapy |
US10993997B2 (en) | 2014-12-19 | 2021-05-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods for profiling the t cell repertoire |
US20180271891A1 (en) | 2015-03-11 | 2018-09-27 | The Broad Institute Inc. | Selective treatment of prmt5 dependent cancer |
EP3283634B1 (en) | 2015-04-14 | 2019-05-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter |
MY190974A (en) | 2015-05-20 | 2022-05-25 | Massachusetts Gen Hospital | Shared neoantigens |
US10633422B2 (en) | 2015-06-01 | 2020-04-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication by inhibiting microRNA lec7C binding to influenza viral cRNA and mRNA |
TWI750122B (zh) | 2015-06-09 | 2021-12-21 | 美商博德研究所有限公司 | 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法 |
US9890363B2 (en) | 2015-07-06 | 2018-02-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
KR20180026734A (ko) | 2015-07-07 | 2018-03-13 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 가용성 융합-전 rsv f 폴리펩티드 |
PL3319633T3 (pl) | 2015-07-07 | 2021-04-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Szczepionka przeciwko rsv |
WO2017060329A1 (en) | 2015-10-06 | 2017-04-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods for preventing plastic-induced degradation of biologicals |
CN109477074B (zh) | 2016-02-19 | 2023-01-24 | 威斯康星旧生研究基金会 | 用于疫苗开发的改进的乙型流感病毒复制 |
MX2018012095A (es) | 2016-04-05 | 2019-01-10 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vacuna contra vrs. |
WO2017174568A1 (en) | 2016-04-05 | 2017-10-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f proteins |
AU2017254477A1 (en) | 2016-04-18 | 2018-11-01 | Jennifer G. ABELIN | Improved HLA epitope prediction |
DK3464331T3 (da) | 2016-05-30 | 2021-01-18 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Stabiliserede præfusions-rsv f-proteiner |
BR112018075969A2 (pt) | 2016-06-20 | 2019-04-02 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | promotor bidirecional potente e equilibrado |
JP7229151B2 (ja) | 2016-07-14 | 2023-02-27 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | Hpvワクチン |
EP3574116A1 (en) | 2017-01-24 | 2019-12-04 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide |
CN116693695A (zh) | 2017-02-12 | 2023-09-05 | 百欧恩泰美国公司 | 基于hla的方法和组合物及其用途 |
JP2020519663A (ja) | 2017-05-17 | 2020-07-02 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーJanssen Vaccines & Prevention B.V. | Rsv感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物 |
EP3681533A1 (en) | 2017-09-15 | 2020-07-22 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Method for the safe induction of immunity against rsv |
CN111615397A (zh) | 2017-11-03 | 2020-09-01 | 武田疫苗股份有限公司 | 寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法 |
WO2019118480A1 (en) | 2017-12-11 | 2019-06-20 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Recombinant adenoviruses and uses thereof |
US11793867B2 (en) | 2017-12-18 | 2023-10-24 | Biontech Us Inc. | Neoantigens and uses thereof |
CN108342362A (zh) * | 2018-01-31 | 2018-07-31 | 武汉枢密脑科学技术有限公司 | 一种用于扩增重组犬腺病毒cav2的稳定细胞系mdck及其构建方法 |
WO2020072700A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Hla single allele lines |
WO2020131586A2 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identifying neoantigens |
SG11202106678PA (en) | 2018-12-21 | 2021-07-29 | Biontech Us Inc | Method and systems for prediction of hla class ii-specific epitopes and characterization of cd4+ t cells |
EP3914295A2 (en) | 2019-01-23 | 2021-12-01 | Yoshihiro Kawaoka | Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses |
EP3921413A1 (en) | 2019-02-08 | 2021-12-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) | Humanized cell line |
US11390649B2 (en) | 2019-05-01 | 2022-07-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) | Influenza virus replication for vaccine development |
KR20220007077A (ko) | 2019-05-08 | 2022-01-18 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 불활성화 바이러스 조성물 및 지카 백신 제형 |
CN113950333A (zh) | 2019-05-15 | 2022-01-18 | 扬森疫苗与预防公司 | 使用基于腺病毒的疫苗预防性治疗呼吸道合胞病毒感染 |
US20220273787A1 (en) | 2019-05-15 | 2022-09-01 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
WO2021041624A2 (en) | 2019-08-27 | 2021-03-04 | Yoshihiro Kawaoka | Recombinant influenza viruses with stabilized ha for replication in eggs |
KR20230142704A (ko) | 2020-12-14 | 2023-10-11 | 바이오엔테크 유에스 인크. | 암 면역요법을 위한 조직 특이적 항원 |
WO2023154043A1 (en) | 2022-02-09 | 2023-08-17 | Takeda Vaccines, Inc. | Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same |
US20230399625A1 (en) * | 2022-06-09 | 2023-12-14 | CHO Plus, Inc. | Cell hybrids as host cells for high efficiency production of gene therapy vectors and viral vaccines |
WO2024015892A1 (en) | 2022-07-13 | 2024-01-18 | The Broad Institute, Inc. | Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery |
EP4338727A1 (en) | 2022-09-14 | 2024-03-20 | Roquette Freres | Adenovirus formulations |
Family Cites Families (122)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4593002A (en) * | 1982-01-11 | 1986-06-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Viruses with recombinant surface proteins |
US4487829A (en) * | 1982-03-23 | 1984-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Production and use of monoclonal antibodies against adenoviruses |
US4589881A (en) * | 1982-08-04 | 1986-05-20 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
US4517686A (en) * | 1982-08-04 | 1985-05-21 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
US4792525A (en) * | 1982-08-04 | 1988-12-20 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
US4578079A (en) * | 1982-08-04 | 1986-03-25 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
FR2602790B1 (fr) | 1986-08-13 | 1990-06-01 | Transgene Sa | Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante |
US5166320A (en) * | 1987-04-22 | 1992-11-24 | University Of Connecticut | Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells |
US4956281A (en) * | 1987-06-03 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lymphocyte function associated antigen-3 |
US5024939A (en) * | 1987-07-09 | 1991-06-18 | Genentech, Inc. | Transient expression system for producing recombinant protein |
US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
CA2000048A1 (en) * | 1988-10-03 | 1990-04-03 | Edward F. Plow | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand bindin g |
US5096815A (en) * | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
US5198346A (en) * | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
US5223394A (en) * | 1989-04-10 | 1993-06-29 | Biogen, Inc. | Recombinant dna molecule comprising lymphocyte function-associated antigen 3 phosphatidylinositol linkage signal sequence |
ATE144793T1 (de) | 1989-06-29 | 1996-11-15 | Medarex Inc | Bispezifische reagenzien für die aids-therapie |
US5240846A (en) * | 1989-08-22 | 1993-08-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Gene therapy vector for cystic fibrosis |
US5332567A (en) * | 1989-08-24 | 1994-07-26 | Immunomedics | Detection and treatment of infections with immunoconjugates |
US5436146A (en) * | 1989-09-07 | 1995-07-25 | The Trustees Of Princeton University | Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors |
DE69032979T2 (de) | 1989-10-20 | 1999-11-04 | Medarex Inc | Bispezifische heteroantikörper mit zweifachen effektorfunktionen |
ES2132072T3 (es) | 1989-10-20 | 1999-08-16 | Dartmouth College | Anticuerpo monoclonal especifico para receptor iga. |
WO1991018088A1 (en) * | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
US5349053A (en) * | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
US5246921A (en) * | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
GB2246779B (en) | 1990-08-03 | 1994-08-17 | Delta Biotechnology Ltd | Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells |
GB9101550D0 (en) | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
JP3534749B2 (ja) | 1991-08-20 | 2004-06-07 | アメリカ合衆国 | アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送 |
FR2681786A1 (fr) | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
IL103059A0 (en) | 1991-09-30 | 1993-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
US5521291A (en) * | 1991-09-30 | 1996-05-28 | Boehringer Ingelheim International, Gmbh | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
EP0669987B1 (en) | 1992-09-25 | 2008-08-13 | Aventis Pharma S.A. | Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain |
GB9223084D0 (en) | 1992-11-04 | 1992-12-16 | Imp Cancer Res Tech | Compounds to target cells |
WO1994011506A1 (en) | 1992-11-18 | 1994-05-26 | Arch Development Corporation | Adenovirus-mediated gene transfer to cardiac and vascular smooth muscle |
GB9300686D0 (en) | 1993-01-15 | 1993-03-03 | Imp Cancer Res Tech | Compounds for targeting |
WO1994017832A1 (en) | 1993-02-09 | 1994-08-18 | The Scripps Research Institute | Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton |
DE4311651A1 (de) | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Ingelheim Int | Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen |
PT698109E (pt) | 1993-05-10 | 2002-12-31 | Univ Michigan | Transferencia de genes para dentro de celulas epiteliais pancreaticas |
US5834256A (en) * | 1993-06-11 | 1998-11-10 | Cell Genesys, Inc. | Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells |
US5543328A (en) * | 1993-08-13 | 1996-08-06 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having modified fiber proteins |
CA2170882A1 (en) | 1993-09-03 | 1995-03-09 | Michael Strauss | Vector for gene therapy of the liver |
US5552311A (en) * | 1993-09-14 | 1996-09-03 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy |
US5534423A (en) * | 1993-10-08 | 1996-07-09 | Regents Of The University Of Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
FR2712812B1 (fr) | 1993-11-23 | 1996-02-09 | Centre Nat Rech Scient | Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo. |
IT1271461B (it) | 1993-12-01 | 1997-05-28 | Menarini Ricerche Sud Spa | Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso. |
US5443953A (en) * | 1993-12-08 | 1995-08-22 | Immunomedics, Inc. | Preparation and use of immunoconjugates |
US5928944A (en) | 1994-02-04 | 1999-07-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of adenoviral-medicated cell transfection |
US6312699B1 (en) | 1994-03-28 | 2001-11-06 | Uab Research Foundation | Ligands added to adenovirus fiber |
US7252989B1 (en) | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
ATE200105T1 (de) | 1994-05-13 | 2001-04-15 | Chiron Corp | Verfahren und zusammensetzungen als vehikel zur zielgerichtete einbringen von genen |
US5571531A (en) | 1994-05-18 | 1996-11-05 | Mcmaster University | Microparticle delivery system with a functionalized silicone bonded to the matrix |
US5570975A (en) | 1994-06-27 | 1996-11-05 | Reinert, Sr.; Gary L. | Metal foundation push-it and installation apparatus and method |
FR2721943B1 (fr) | 1994-06-29 | 1996-08-02 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutase |
US5559099A (en) * | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
WO1996007739A2 (en) | 1994-09-09 | 1996-03-14 | Neurocrine Biosciences, Incorporated | Interleukin-1 type 3 receptors |
FR2724846B1 (fr) | 1994-09-27 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras |
FR2725726B1 (fr) | 1994-10-17 | 1997-01-03 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
ATE293701T1 (de) | 1994-10-28 | 2005-05-15 | Univ Pennsylvania | Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung |
WO1996014837A1 (en) | 1994-11-09 | 1996-05-23 | Genetic Therapy, Inc. | Gene therapy for hypercholesterolemia |
ATE195555T1 (de) | 1994-11-29 | 2000-09-15 | Takara Shuzo Co | Verfahren zur herstellung transformierter zellen |
FR2727867B1 (fr) | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
US5880102A (en) * | 1995-01-17 | 1999-03-09 | Duke University | Adenoviral vector system |
AUPN107195A0 (en) | 1995-02-10 | 1995-03-09 | Withers, Graham Rex | Metal matrix forming method and apparatus |
US5770442A (en) | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
US6127525A (en) * | 1995-02-21 | 2000-10-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
AU5703796A (en) | 1995-05-10 | 1996-11-29 | Introgene B.V. | Improved retroviral vectors, especially suitable for gene th erapy |
US6265212B1 (en) * | 1995-06-15 | 2001-07-24 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
KR100449181B1 (ko) * | 1995-06-15 | 2005-01-24 | 크루셀 홀란드 비.브이. | 유전자요법에사용할수있는사람의재조합아데노바이러스패키징시스템 |
US5622699A (en) * | 1995-09-11 | 1997-04-22 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo |
US5837511A (en) | 1995-10-02 | 1998-11-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Non-group C adenoviral vectors |
US5871727A (en) * | 1995-12-08 | 1999-02-16 | Uab Research Foundation | Targeted adenovirus vectors |
EP0927044A4 (en) | 1996-04-16 | 1999-09-08 | Immusol Inc | DEFINED TARGET VIRAL VECTORS |
AU4344197A (en) | 1996-09-13 | 1998-04-02 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Car, a novel coxsackievirus and adenovirus receptor |
JP4350800B2 (ja) | 1996-09-25 | 2009-10-21 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 高キャパシティーアデノウイルスベクターの開発の促進に使用するためのパッケージング細胞系 |
US5994132A (en) * | 1996-10-23 | 1999-11-30 | University Of Michigan | Adenovirus vectors |
US5877011A (en) | 1996-11-20 | 1999-03-02 | Genzyme Corporation | Chimeric adenoviral vectors |
US5922315A (en) * | 1997-01-24 | 1999-07-13 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having altered hexon proteins |
AU6691098A (en) * | 1997-03-07 | 1998-09-22 | Wistar Institute Of Anatomy & Biology, The | Method and compositions for healing tissue defects and inducing hypervascularityin mammalian tissue |
US6100086A (en) * | 1997-04-14 | 2000-08-08 | Genzyme Corporation | Transgene expression systems |
IL132537A0 (en) | 1997-04-25 | 2001-03-19 | Collateral Therapeutics | Truncated vegf-related proteins |
JP2002513290A (ja) | 1997-05-08 | 2002-05-08 | ジェネティック・セラピー・インコーポレテッド | 修飾されたファイバー蛋白質を有するアデノウイルスによる遺伝子移入 |
US5849561A (en) * | 1997-05-22 | 1998-12-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for the production of non-group C adenoviral vectors |
DE19754103A1 (de) * | 1997-12-08 | 1999-06-10 | Hepavec Ag Fuer Gentherapie | Verpackungszellinie zur Produktion von E1 deletierten Adenoviren |
NZ505325A (en) * | 1997-12-23 | 2003-07-25 | Crucell Holland B | Adeno-associated virus and adenovirus chimeric recombinant viruses useful for the integration of foreign genetic information into the chromosomal dna of target cells |
US6287857B1 (en) * | 1998-02-09 | 2001-09-11 | Genzyme Corporation | Nucleic acid delivery vehicles |
DE19807265C2 (de) * | 1998-02-20 | 2000-01-05 | Centeon Pharma Gmbh | Adenoviraler Transfervektor für den Gentransport einer DNA-Sequenz |
AU3358999A (en) | 1998-03-20 | 1999-10-11 | Genzyme Corporation | Chimeric adenoviral vectors for targeted gene delivery |
US6670188B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
IT1299201B1 (it) | 1998-05-08 | 2000-02-29 | San Raffaele Centro Fond | Fibroblasti modificati geneticamente e loro uso |
EP0959136A1 (en) | 1998-05-20 | 1999-11-24 | Introgene B.V. | Targeted delivery through a cationic amino acid transporter |
US6413776B1 (en) | 1998-06-12 | 2002-07-02 | Galapagos Geonomics N.V. | High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications |
US20030017138A1 (en) | 1998-07-08 | 2003-01-23 | Menzo Havenga | Chimeric adenoviruses |
WO2000024730A1 (en) | 1998-10-28 | 2000-05-04 | The University Of British Columbia | Organic vanadium(iii) complexes and their use |
EP1020529B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-06-01 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
US6929946B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
IL133032A (en) | 1998-11-20 | 2007-06-03 | Introgene Bv | Adenoviral gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells and /or endothelial cells |
EP1016726A1 (en) | 1998-12-30 | 2000-07-05 | Introgene B.V. | Gene therapy to promote angiogenesis |
US6869936B1 (en) | 1999-03-04 | 2005-03-22 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for fibroblast-like or macrophage-like cell transduction |
ATE403006T1 (de) | 1999-03-04 | 2008-08-15 | Crucell Holland Bv | Verwendung eines adenovirusvektors zur transduktion von synovialen zellen |
DE19918023A1 (de) * | 1999-03-16 | 2000-09-21 | Guenter Cichon | Verfahren zur Herstellung von leberzellabgleiteten Verpackungszelllinien und ihre Verwendung |
US7604960B2 (en) | 1999-04-15 | 2009-10-20 | Crucell Holland B.V. | Transient protein expression methods |
KR100741247B1 (ko) | 1999-05-17 | 2007-07-19 | 크루셀 홀란드 비.브이. | 아데노바이러스 타입 35의 적어도 하나의 구성성분을포함하는 아데노바이러스 유래 유전자 전달체 |
US6492169B1 (en) * | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
US6913922B1 (en) | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
EP1067188A1 (en) | 1999-07-08 | 2001-01-10 | Introgene B.V. | Infection with chimaeric adenoviruses of cells negative for the adenovirus serotype 5 Coxsacki adenovirus receptor (CAR) |
WO2001030158A1 (fr) | 1999-10-28 | 2001-05-03 | Research Association For Improvement Of Wood Quality | Emulsion d'huile de creosote et procede de production associe |
DE60116513T2 (de) | 2000-08-10 | 2006-09-21 | Crucell Holland B.V. | Adenovirenvektoren zur transduktion der chondrozyten |
CA2421864A1 (en) | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Crucell Holland B.V. | Transduction of dendritic cells using adenoviral vectors |
EP1191104A1 (en) | 2000-09-26 | 2002-03-27 | Introgene B.V. | Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine |
DE60138403D1 (de) | 2000-09-26 | 2009-05-28 | Crucell Holland Bv | Adenovirale vektoren für die übertragung von genen in zellen der skelettmuskulatur oder myoblasten |
US6905678B2 (en) | 2001-07-07 | 2005-06-14 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors with cell type specificity for mesenchymal stem cells |
DK1497438T3 (da) | 2002-04-25 | 2010-01-04 | Crucell Holland Bv | Midler og fremgangsmåder til fremstilling af adenovirusvektorer |
PL208588B1 (pl) | 2002-04-25 | 2011-05-31 | Crucell Holland Bv | Rekombinowane adenowirusy, wyizolowane kwasy nukleinowe, komórki pakujące oraz sposoby zwiększania stabilności i/lub pojemności upakowania rekombinowanego adenowirusa |
US20080153083A1 (en) | 2003-10-23 | 2008-06-26 | Crucell Holland B.V. | Settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
EP1553983A2 (en) | 2002-10-23 | 2005-07-20 | Crucell Holland B.V. | New settings for recombinant adenoviral-based vaccines |
US7026164B2 (en) * | 2003-07-03 | 2006-04-11 | Cell Genesys, Inc. | Adenovirus packaging cell lines |
WO2005033320A1 (en) | 2003-10-02 | 2005-04-14 | Crucell Holland B.V. | Packaging cells for recombinant adenovirus |
CA2583843C (en) | 2004-10-13 | 2010-09-21 | Crucell Holland B.V. | Improved adenoviral vectors and uses thereof |
AU2005305869B2 (en) | 2004-11-16 | 2010-12-09 | Aeras Global Tb Vaccine Foundation | Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors |
-
2000
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Class et al. | Patent application title: COMPLEMENTING CELL LINES Inventors: Ronald Vogels (Linschoten, NL) Menzo Jans Emco Havenga (Alphen A/d Rijn, NL) Majid Mehtall (Plobsheim, FR) |
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