PT1349926E - Linhas celulares de complementação - Google Patents

Description

ΕΡ 1 349 926 /PT DESCRIÇÃO "Linhas celulares de complementação"

Campo técnico: 0 invento refere-se em geral ao campo de biotecnologia e, mais especificamente, linhas celulares de complementação com base em adenovirus.

Antecedentes: Tipicamente, têm de se adaptar vectores e células de empacotamento uns aos outros de modo a que tenham todos os elementos necessários, mas não tenham elementos sobrepostos que possam originar virus competentes em replicação por recombinação. Assim, as sequências necessárias para transcrição adequada da construção de empacotamento podem ser sequências de regulação heterólogas derivadas de, por exemplo, outros serótipos de adenovirus (Ad) humanos, adenovirus não humanos, outros virus tais como, entre outros, SV40, virus de hepatite B (HBV), virus de sarcoma de Rous (RSV), citomegalovirus (CMV), etc., ou de eucariotas superiores tais como mamíferos. Em geral, estas sequências incluem um promotor, facilitador e sequências de poli-adenilação. PER.C6 (número de depósito ECACC 96022940) constitui um exemplo de uma linha celular isenta de sobreposição de sequências entre a construção de empacotamento e o vector adenovírico (Fallaux et al., 1998). Os vírus recombinantes baseados em adenovirus de subgrupo C, tais como Ad5 e Ad2, podem ser propagados eficazmente nestas células de empacotamento. Verificou-se que a geração e propagação de adenovirus de outros serótipos, tais como vírus de subgrupo B, é mais difícil em células PER.C6. Contudo, tal como descrito em pedido de patente europeia 00201738.2, podem preparar-se vírus recombinantes com base em vírus Ad35 de subgrupo B por co-transfecção de uma construção de expressão contendo sequências de região 1 precoces de Ad35 (Ad35-El). Além disso, verificou-se que os vírus com base em Ad35 aos quais se eliminou as sequências EIA replicam eficazmente em células PER.C6. Assim, as proteínas EIA de Ad5 complementam as funções Ad35-E1A, enquanto pelo menos parte das funções E1B de Ad35 são necessárias. Esta especificidade de serótipo em funções E1B foi recentemente também descrita para vírus recombinantes 2

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Ad7. Numa tentativa de gerar adenovírus recombinantes derivados de virus Ad7 de subgrupo B, Abrahamsen et al. (1997) não conseguiram gerar virus com EI eliminado em células 293 sem contaminação com Ad7 de tipo selvagem (wt). Verificou-se que os virus que foram repicados após purificação de placa em células 2930RF6 (Brough et al., 1996) contêm sequências Ad7 E1B incorporadas por recombinação não homóloga. Assim, verificou-se que a propagação eficaz de virus recombinantes Ad7 só é possível na presença de expressão de Ad7-E1B e de expressão de Ad5-E4-ORF6. Sabe-se que as proteínas E1B interactuam com proteínas celulares, bem como víricas (Bridge et al., 1993; White, 1995). Possivelmente, o complexo formado entre a proteína E1B 55K e E4-ORF6 que é necessário para aumentar a exportação de ARNm de proteínas víricas e para inibir a exportação da maior parte do ARNm celular, é crítico e de algum modo específico de serótipo.

Descrição do invento 0 presente invento proporciona novas linhas celulares de empacotamento capazes de complementar adenovírus recombinantes com base em serótipos diferentes dos vírus de subgrupo C, tais como serótipos de subgrupo B, tais como adenovírus do tipo 35.

Num aspecto, o invento proporciona linhas celulares de empacotamento capazes de complementar adenovírus recombinantes baseados num serótipo de subgrupo B, de preferência de serótipo 35. As expressões "com base em ou derivado de um adenovírus" significam que utiliza ácido nucleico correspondente a ácido nucleico existente no referido serótipo. 0 ácido nucleico utilizado pode ser derivado por clonagem por PCR ou outros métodos conhecidos na arte.

Num aspecto do invento, as novas células de empacotamento são derivadas de células humanas diplóides primárias tais como, entre outras, retinoblastos humanos primários, células de rim embrionário humana primárias ou amniócitos humanos primários. A transfecção de células primárias ou seus derivados só com o gene de adenovírus EIA pode induzir proliferação ilimitada (imortalização), mas não resulta em transformação completa. No entanto, a expressão de EIA na maioria dos casos resulta na indução de morte celular 3

ΕΡ 1 349 926 /PT programada (apoptose) e ocasionalmente obtém-se imortalização (Jochemsen et al., 1987). É necessária a co-expressão do gene E1B para evitar indução de apoptose e para ocorrer transformação morfológica completa (revisto em White, 1995). Assim, num aspecto do invento, transformam-se células humanas primárias ou seus derivados por expressão de proteínas EI de adenovírus de um subgrupo diferente de subgrupo C, de preferência subgrupo B, com maior preferência adenovírus tipo 35. A actividade combinada das proteínas EIA e E1B estabelece crescimento indefinido das células e permite complementação de adenovírus recombinante. A transformação morfológica completa de células primárias por genes de EI de adenovírus é o resultado das actividades combinadas das proteínas codificadas pelas regiões EIA e E1B. Os papéis das diferentes proteínas EI em infecção lítica e em transformação foram extensamente estudados (revisto em Zantema e van der Eb, 1995; White, 1995, 1996). As proteínas EIA de adenovírus são essenciais para transformação de células primárias. As proteínas EIA exercem este efeito através de interacção directa com várias proteínas celulares que estão envolvidas em regulação de transcrição. Tais incluem a família de proteínas pRB, p300/CBP e proteínas de ligação TATA. Além disso, EIA aumenta o nível de proteína p53 nas células. Na ausência de actividade E1B de adenovírus o aumento dos níveis de p53 leva à indução de apoptose. Ambas as proteínas codificadas pela região E1B contrariam a indução de apoptose embora por mecanismos diferentes. E1B-21K aparentemente contraria apoptose de uma forma semelhante a Bcl-2, através de interacção com as proteínas efectoras a jusante na via de apoptose (Han et al., 1996), enquanto que E1B-55K funciona através de interacção directa com p53. É importante salientar que o mecanismo molecular pelo qual as proteínas E1B-55K de Ad2 e Ad5 (subgrupo C) e Adl2 (subgrupo A) funcionam na capacidade para neutralizar p53 pode diferir. Enquanto que Ad5 E1B-55K liga fortemente p53 e o complexo localiza-se no citoplasma, Adl2 E1B-55K liga fracamente p53 e ambas as proteínas localizam-se no núcleo (Zantema et al., 1985; Grand et al., 1999). Contudo, ambas as proteínas inibem a transactivação de outros genes por p53 (Yew e Berk, 1992). 4

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Em células de roedores, a actividade de EIA conjuntamente com E1B-21K ou E1B-55K é suficiente para transformação completa embora a expressão de ambas as proteínas E1B conjuntamente seja duas vezes mais eficaz (Rao et ai., 1992). No entanto, em células humanas, a actividade da proteína E1B-55K parece ser mais importante dado que se verificou que E1B-55K é indispensável para o estabelecimento de células transformadas (Gallimore, 1986). 0 exemplo 6 no presente documento descreve a geração de pIG270. Nesta construção, os genes Ad35-El são expressos a partir do promotor hPGK e a transcrição termina pelo HBVpA. 0 promotor hPGK constitui um fragmento HincII-EcoRI da sequência de promotor descrita por Singer-Sam et ai. (1984). 0 HBVpA está localizado num fragmento BamHI-BglII do genoma do vírus da hepatite B (Simonsen e Levinson, 1983; consultar igualmente Genbank HBV-AF090841). Tal como previamente mencionado, o promotor e as sequências de poli-adenilação das construções de expressão de EI descritas no presente invento podem ser derivados de outras fontes sem afastamento do invento. Igualmente, podem ser utilizados outros fragmentos funcionais das sequências hPGK e HBVpA mencionadas supra. A funcionalidade de pIG270 foi demonstrada por transformação de células primárias de rim de rato bebé (BRK). Por comparação com uma construção de expressão Ad5-El equivalente verificou-se que os genes Ad35-El foram menos eficazes a transformar estas células. Foi feita a mesma observação para os genes de EI de Adl2 (Bernards et al., 1982) . Não é claro qual(is) das proteínas EI determina(m) a diferença em eficácia de transformação de sequências de EI observadas para adenovírus de diferentes subgrupos. No caso de Adi 2, estudos de transfecção com genes E1A/E1B quiméricos sugeriram que a eficácia de transformação de células BRK foi determinada pelas proteínas EIA (Bernards et al., 1982). Demonstra-se infra que a proteína E1B-55K contem funções específicas de serótipo necessárias para complementação de adenovírus com deleção El. Se estas funções estiverem relacionadas com a regulação da distribuição de ARNm ou outra função vírica tardia, é improvável que estas estejam envolvidas na eficácia de transformação. 5

ΕΡ 1 349 926 /PT A análise de domínios funcionais nas proteínas E1B-55K de Ad2 ou Ad5 utilizando mutantes de inserção revelou que as funções relacionadas com replicação vírica, síntese de proteína tardia e cancelamento de proteínas do hospedeiro não estão confinadas a domínios específicos, encontrando-se distribuídos ao longo da proteína (Yew et al., 1990).

Utilizando o mesmo conjunto de mutantes, verificou-se que os domínios importantes para interacção com p53 e E4-Orf6 são mais restritos. Além de uma região de ligação comum (aminoácidos 262 a 326), a ligação a p53 foi afectada por mutações no aminoácido 180 e a ligação a E4-Orf6 foi afectada por mutações no aminoácido 143 (Yew e Berk, 1992; Rubenwolf et al., 1997) .

Conjuntamente, estes resultados indicam que é difícil separar as funções E1B-55K relacionadas com transformação (ligação a p53) e síntese de proteína tardia (ligação a Orf6). O invento revela novas construções EI que combinam a elevada eficácia de transformação de um serótipo com a função de complementação específica de serótipo de outro serótipo. Estas novas construções são utilizadas para transformar células primárias de retinoblasto embrionário humano e amniócitos humanos.

Noutro aspecto do invento, as sequências de EI de transformação são derivadas de serótipos diferentes. Tal como revelado no pedido de patente europeia 00201738.2, as sequências Ad35 EI são capazes de transformar células de rim de rato bebé (BRK) , embora com uma menor eficácia do que a observada com sequências Ad5-El. Tal foi igualmente verificado para sequências de EI de Adl2 (Bernards et al., 1982) . Assim, neste aspecto do invento, transformam-se células primárias diplóides humanas ou seus derivados com construção de EI quimérica que consiste de parte das sequências de EI de um serótipo que permite transformação eficaz de células humanas primárias ou seus derivados e parte das sequências de EI de outro serótipo, cujas sequências de EI proporcionam a(s) função(ões) E1B específica(s) de serótipo que permite(m) propagação eficaz de vírus com deleção de EI desse serótipo. Numa concretização preferida deste aspecto do invento, a região EIA é derivada de um adenovírus do subgrupo C tal como, 6 ΕΡ 1 349 926 /PT entre outros, Ad5, e as sequências de codificação E1B são derivadas de um adenovirus alternativo, mais especificamente de um adenovirus de subgrupo B, ainda mais especificamente de adenovirus tipo 35. As sequências de codificação E1B-21K podem também ser quiméricas incluindo ambas as sequências de codificação de subgrupo C e subgrupo B. De preferência, a totalidade ou a maior parte de E1B-21K inclui sequências de codificação de subgrupo C. Numa concretização mais preferida, as sequências de codificação EIA e as sequências de codificação E1B-21K são derivadas de um adenovirus de subgrupo C tal como, entre outros, Ad5. Numa concretização, a célula inclui adicionalmente sequências de codificação ElB-55k que são, de preferência, desde que não se sobreponham com as sequências de codificação 21K derivadas de um adenovirus de subgrupo B, mais especificamente de adenovirus tipo 35. Numa concretização ainda mais preferida, todas as sequências de codificação de EI são derivadas de um adenovirus de subgrupo C, tal como, entre outros, Ad5, excepto pelo menos a parte das sequências de codificação E1B-55K que são necessárias para complementação especifica de serótipo de um subgrupo de adenovirus alternativo, mais especificamente adenovirus de subgrupo B, ainda mais especificamente adenovirus de tipo 35. 0 invento também proporciona uma linha celular de empacotamento em que as células primárias diplóides humanas ou seus derivados foram transformadas com uma construção de EI de adenovirus quimérica incluindo parte de uma primeira sequência de codificação de EI de adenovirus de um primeiro serótipo de adenovirus que permite transformação eficaz de células humanas primárias e seus derivados; e parte de uma segunda sequência de codificação de EI de adenovirus de um segundo serótipo de adenovirus, em que a referida segunda sequência de codificação de EI de adenovirus proporciona a(s) função(ões) E1B de adenovirus especifica(s) de serótipo que permite(m) propagação eficaz de vírus com deleção de EI adenovirus recombinantes do referido segundo serótipo de adenovirus. De preferência, o referido primeiro serótipo de adenovirus é um adenovirus de subgrupo C e o referido segundo serótipo de adenovirus é um adenovirus de subgrupo B, mais especificamente adenovirus de tipo 35. Numa concretização, a linha celular de empacotamento do invento inclui ElB-55k de adenovirus bovino. Tal linha celular que expressa ElB-55k bovino é particularmente adequada 7

ΕΡ 1 349 926 /PT para obter elevados rendimentos de um adenovírus recombinante bovino complementado.

As células primárias diplóides humanas ou seus derivados são transformadas por sequências de EI de adenovírus, quer ligadas operativamente numa molécula de ADN, quer localizadas em duas moléculas de ADN separadas. Neste último caso, uma molécula de ADN transporta pelo menos parte das sequências de El do serótipo que permite transformação eficaz e a segunda molécula de ADN transporta pelo menos parte das sequências necessárias para complementação específica de serótipo. Também se proporciona uma construção híbrida incluindo sequências de El do serótipo que permitem transformação eficaz e sequências de El de outro serótipo necessárias para complementação específica de serótipo. As sequências que proporcionam complementação específica de serótipo podem com certeza conter também actividades adicionais que contribuem para transformação. De preferência, as referidas sequências que permitem transformação eficaz incluem EIA. De preferência, as referidas sequências e as referidas sequências necessárias para complementação específica de serótipo de preferência incluem sequências E1B. Com maior preferência, as referidas sequências que permitem transformação eficaz incluem sequências EIA e E1B-21K e as referidas sequências necessárias para complementação específica de serótipo incluem sequências E1B-55K. Também se proporcionam células transformadas por tais construções híbridas. Tais células podem ser utilizadas favoravelmente para a propagação de adenovírus com deleção de El recombinantes do referido outro serótipo. Com certeza, é também possível proporcionar ambas as funções de sequências de El em construções independentes. Em todos os aspectos, as sequências estão ligadas operativamente a sequências de regulação que permitem transcrição e tradução das proteínas codificadas. De preferência, uma célula de empacotamento do invento inclui adicionalmente um ADN que codifica pelo menos E4-orf6 de um adenovírus de subgrupo B, de preferência adenovírus de serótipo 35. De preferência, o referido E4-orf6 é derivado do referido outro serótipo. De preferência, a referida célula inclui E1B-55K e E4-orf6 do mesmo serótipo do vector recombinante a ser propagado/complementado ou produzido de outro modo. 8

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Noutro aspecto do invento, descrevem-se novas células de empacotamento que são derivadas de PER.C6 (número de depósito ECACC 96022940; Fallaux et al., 1998) e contêm sequências Ad35-El integradas no seu genoma. Estas sequências Ad35-El encontram-se presentes numa cassete de expressão funcional, mas de preferência não contêm sequências sobrepostas com sequências presentes no vector virico recombinante. De preferência, a cassete de expressão funcional consiste de um promotor heterólogo e funcionalidade de sinal de poli-adenilação ligados a sequências Ad35-El. Mais especificamente, as sequências de codificação Ad35-El estão ligadas funcionalmente ao promotor de gene de fosfoglicerato humano (hPGK) e sinal de poli-adenilação de vírus da hepatite B (HBV-pA). De preferência, as sequências de codificação Ad35-El incluem as regiões de codificação das proteínas EIA e as sequências de promotor E1B ligadas a sequências de codificação E1B até ao codão de terminação da proteína E1B 55K, inclusive. Com maior preferência, as sequências Ad35-El incluem desde o nucleótido 468 ao nucleótido 3400 da sequência Ad35 de tipo selvagem. De modo a poder seleccionar células transfectadas, deve incorporar-se um marcador de selecção dominante, tal como, entre outros, o gene neor no vector de expressão ou o vector de expressão Ad35 é co-transfectado com um vector de expressão independente que medeia a expressão do marcador de selecção. Em ambos os casos, o marcador de selecção fica integrado no genoma celular. Podem ser utilizadas outras linhas celulares transformadas Ad5-El, tal como 293 (Graham et al., 1977) e 911 (Fallaux et al., 1996) ou linhas celulares humanas estabelecidas, tais como células A549, sem afastamento do presente invento.

Noutro aspecto do invento, descrevem-se células derivadas de PER.C6 que expressam sequências Ad35-E1B funcionais. Numa concretização, as sequências de codificação Ad35-E1B são dirigidas pelo promotor E1B e terminadas por um sinal de poli-adenilação heterólogo tal como, entre outros, o HBVpA. Numa concretização preferida, as sequências de codificação Ad35-E1B são dirigidas por um promotor heterólogo, tal como, entre outros, o promotor hPGK ou promotor de factor la de alongamento (EF-ΐα) e terminada por um sinal pA heterólogo, tal como, entre outros, o HBVpA. Estas sequências Ad35-E1B incluem de preferência as regiões de codificação das proteínas 9

ΕΡ 1 349 926 /PT Ε1Β 21K e E1B 55K localizadas entre os nucleótidos 1611 e 3400 da sequência Ad35 de tipo selvagem (wt). Com maior preferência, as sequências Ad35-E1B incluem os nucleótidos 1550 a 3400 da sequência Ad35 de tipo selvagem. Numa concretização ainda mais preferida, as sequências E1B incluem as sequências de codificação do gene E1B-55K localizadas entre os nucleótidos 1916 e 3400 da sequência Ad35 de tipo selvagem. Numa concretização ainda mais preferida, uma linha celular de empacotamento ou uma linha celular do invento não contem uma sequência de codificação funcional para E1B 21k. Tais linhas celulares, em geral, produzem significativamente mais adenovirus recombinantes do que as linhas celulares positivas E1B 21K. 0 invento proporciona ainda um método para complementação de um adenovirus recombinante incluindo proporcionar uma linha celular de empacotamento ou uma linha celular de acordo com o invento, com o referido adenovirus recombinante e cultivar a referida célula para permitir complementação. Numa concretização preferida, o referido método inclui adicionalmente recolher adenovirus recombinantes complementados. De preferência, o referido adenovirus recombinante é derivado de adenovirus de subgrupo B. Com maior preferência, o referido adenovirus recombinante é derivado de adenovirus serótipo 35.

Noutro aspecto, o invento proporciona um adenovirus recombinante obtido por um método do invento ou com uma célula de empacotamento do invento. Tal adenovirus pode ser obtido essencialmente isento de adenovirus de tipo selvagem contaminante ou adenovirus competente para replicação. Tais preparações de adenovirus recombinante são muito adequadas para administração de sequências terapêuticas a tecidos somáticos in vivo em, por exemplo, estabelecimento de terapia génica. São preferidos adenovirus recombinantes incluindo uma deleção de ácido nucleico que codifica pelo menos uma proteína de região El. De preferência, tal adenovirus inclui adicionalmente uma deleção de ácido nucleico que codifica pelo menos uma proteína de região E3. De preferência, tal adenovirus inclui adicionalmente uma deleção de ácido nucleico que codifica pelo menos uma proteína de região E4. De preferência, tal adenovirus inclui adicionalmente uma deleção 10 ΕΡ 1 349 926 /PT de ácido nucleico que codifica pelo menos uma proteína E4-Orf6. Por este motivo, o invento também proporciona a utilização de um adenovírus recombinante do invento para a preparação de um medicamento.

Com a expressão proteína E1B-55K, tal como utilizada no presente documento, pretende-se significar a proteína codificada pela região E1B de um serótipo de adenovírus tendo uma função semelhante no referido serótipo tal como proporcionada pela proteína E1B-55K de Ad5.

Com a expressão proteína E1B-21K, tal como utilizada no presente documento, pretende-se significar a proteína abrangida pela região E1B num serótipo de adenovírus tendo uma função semelhante no referido serótipo tal como proporcionada pela proteína E1B-19K de Ad5. Aplica-se a mesma terminologia para as sequências que codificam estas proteínas. Quando em referência às sequências Ad35-El de um determinado nucleótido ao nucleótido 3400 significa "até e incluindo o nucleótido 3400".

As linhas celulares objectos do presente invento são úteis para, entre outras coisas, produzir adenovírus recombinante concebido para terapia génica e vacinação. As linhas celulares, sendo derivadas de células de origem humana, são também úteis para a produção de proteínas recombinantes humanas tais como, entre outras, factores de crescimento humanos, anticorpos humanos. Além disso, as linhas celulares são úteis para a produção de vírus humanos diferentes de adenovírus tais como, entre outros, vírus de influenza, vírus de herpes simplex, rotavírus, vírus de sarampo.

Constitui um derivado preferido de células humanas diplóides primárias a linha celular PER.C6 (número de depósito ECACC 960022940).

Encontra-se no âmbito das capacidades do perito na arte proporcionar proteínas apresentando uma função semelhante em tipo à da proteína EI de adenovírus referida no presente documento. Por exemplo, pode proporcionar-se uma parte funcional e/ou pode proporcionar-se um derivado com uma função semelhante em tipo e não necessariamente em quantidade. 11

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Descrição sucinta das figuras

Figura 1: Gráfico de barras apresentando a percentagem de amostras de soro positivas para neutralização para cada adenovirus humano de tipo selvagem ensaiado (consultar exemplo 1 para descrição do ensaio de neutralização).

Figura 2: Gráfico apresentando a ausência de correlação entre a razão VP/CCID50 e a percentagem de neutralização.

Figura 3: Gráfico de barras apresentando a percentagem de amostras de soro que apresentam actividade de neutralização para uma selecção de serótipos de adenovirus. Os soros foram derivados de voluntários saudáveis de Bélgica e Reino Unido.

Figura 4: Gráfico de barras apresentando a percentagem de amostras de soro que apresentam actividade de neutralização para adenovirus de serótipos 5, 11, 26, 34, 35, 48 e 49. Os soros foram derivados de cinco localizações diferentes na Europa e nos Estados Unidos.

Figura 5: Figura 6 : Figura 7 : para construir Figura 8: Figura 9 : Figura 10 Figura 11: Figura 12 : Figura 13 : Figura 14:

Sequência de adenovirus tipo 35 humano.

Mapa de pAdApt35IPl.

Representação esquemática das etapas utilizadas pWE.Ad35.pIX-rITR.

Mapa de pWE.Ad35.pIX-rITR.

Mapa de pRSV.Ad35-El.

Mapa de pPGKneopA

Mapa de pRSV-PNeo.

Mapa de pRSVhbvNeo.

Mapa de pIG.ElA.EIB.

Mapa de pIG135. 12

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Figura 15: Mapa de pIG270.

Figura 16: Mapa de pBr.Ad35.leftITR-pIX.

Figura 17: Mapa de pBr.Ad35.leftITR-pIXÀElA.

Figura 18: Mapa de pBr.Ad35..Δ21K.

Figura 19: Mapa de pBr.Ad35..Δ55Κ1.

Figura 20: Mapa de pBrAd35ASM.

Figura 21: Representação esquemática de construções de deleção Ad35-E1A/E1B.

Figura 22: Mapa de pIG.35BL. Figura 23: Mapa de pRSVneo4. Figura 24: Mapa de pIG35Bneo. Figura 25: Mapa de pIG35.55K. Figura 26: Mapa de pIG535. Figura 2 7: Mapa de pIG635. Figura 2 8: Mapa de pIG735. Figura 29: Mapa de pCC2 71. Figura 30: Mapa de pCC535s. Figura 31: Mapa de PCR535E1B. Figura 32: Mapa de pCC2155s. Figura 33: Mapa de pCC536s. Figura 34: Mapa de pIG53 6.

Figura 35: Mapa de pBr.Ad35.PRn. 13

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Figura 36: Mapa de pBr.Ad35.PRnÀE3.

Figura 37: Mapa de pWE.Ad35.pIX-rITRÀE3.

Figura 38: Alinhamento de sequências de aminoácidos E1B-21K (A) e E1B-55K (B) em pCC536s com sequências wtAd5 e wtAd35.

Descrição detalhada do invento 0 invento é explicado adicionalmente por utilização dos seguintes exemplos ilustrativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Ensaio de elevado rendimento para a detecção de actividade de neutralização em soro humano

Para permitir o rastreio de uma elevada quantidade de soros humanos relativamente à presença de anticorpos neutralizantes contra todos os serótipos de adenovírus, desenvolveu-se um ensaio de 96 poços automatizado.

Soros humanos

Seleccionou-se um painel de 100 indivíduos. Os voluntários (50% homens, 50% mulheres) foram indivíduos saudáveis com idades entre 20 e 60 anos de idade sem restrição de raça. Todos os voluntários assinaram um consentimento informado. Excluíram-se pessoas envolvidas profissionalmente em investigação de adenovírus.

Colocou-se aproximadamente 60 ml de sangue em tubos secos. No intervalo de duas horas após recolha, o sangue foi centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos. Transferiu-se aproximadamente 30 ml de soro para tubos de polipropileno e armazenaram-se congelados a -20°C até utilização adicional.

Descongelou-se o soro e inactivou-se por calor a 56°C durante 10 minutos e seguidamente separou-se em alíquotas para evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento. Parte foi utilizada para efectuar cinco etapas de diluições duas 14

ΕΡ 1 349 926 /PT vezes em meio (DMEM, Gibco BRL) numa quantidade suficientemente grande para encher aproximadamente 70 placas de 96 poços. Pipetaram-se alíquotas de soros não diluídos e diluídos em placas de poços profundos (formato de 96 poços) e utilizando um pipetador robotizado programável medindo alíquotas de 100 μΐ para placas de 96 poços. Deste modo, as placas foram carregadas com oito soros diferentes em duplicado (100 μΐ/poço) de acordo com o seguinte esquema:

Sl/2 S1/4 S1/8 81/16 S1/32 S5/2 S5/4 S5/8 S5/16 S5/32 - - Sl/2 S1/4 S1/8 S1/16 S1/32 S5/2 S5/4 S5/8 S5/16 S5/32 - - S2/2 S2/4 S2/8 S2/16 S2/32 S6/2 S6/4 S6/8 S6/16 S6/32 - - S2/2 S2/4 S2/8 S2/16 S2/3 S6/2 S6/4 S6/8 S6/16 S6/32 - - S3/2 S3/4 S3/8 S3/16 S3/32 S7/2 S7/4 57/8 57/16 S7/32 - - S3/2 S3/4 S3/8 S3/16 S3/32 S7/2 S7/4 S7/8 S7/16 S7/32 - - S4/2 S4/4 S3/8 S3/16 S3/32 S8/2 S8/4 S8/8 S8/16 S8/32 - - S4/2 S4/4 S3/8 S3/16 S3/32 S8/2 S8/4 S8/8 S8/16 S8/32 - -

Em que Sl/2 a S8/2 nas colunas 1 e 6 representam soros diluídos Ix e Sx/4, Sx/8, Sx/16 e Sx/32 as diluições em série duas vezes. As últimas placas continham também quatro poços cheios com 100 μΐ de soro de vitelo fetal como um controlo negativo. As placas foram mantidas a -20°C até utilização adicional.

Preparação de soluções-mãe de adenovírus humano

Inocularam-se protótipos de todos os adenovírus humanos conhecidos em frascos T25 cultivados com células PER.C6 (Fallaux et al., 1998) e recolheram-se após efeito citopatogénico completo. Após congelamento/descongelamento, utilizou-se 1-2 ml dos lisados em bruto para inocular um frasco T80 com PER.C6 e recolheu-se o vírus após efeito citopatogénico completo. A evolução temporal entre inoculação e ocorrência de efeito citopatogénico, bem como a quantidade de vírus necessária para reinfectar uma cultura nova, diferiram entre serótipos. Prepararam-se soluções-mãe de adenovírus por congelamento/descongelamento e utilizaram-se para inocular 3-4 frascos de três camadas T175 cm2 com células PER.C6. Após ocorrência de efeito citopatogénico, recolheram-se as células por pequenas pancadas no frasco, sedimentaram-se e isolaram-se e purificaram-se vírus através de um gradiente de CsCl em duas etapas, da seguinte forma. Dissolveram-se sedimentos celulares em 50 ml de tampão NaP04 10 mM (pH 7,2) e congelaram-se a -20 °C. Após descongelar a 15

ΕΡ 1 349 926 /PT 37°C, adicionou-se 5,6 ml de desoxicolato de sódio (5% p/v) . Misturou-se a solução cuidadosamente e incubou-se durante 5-15 minutos a 37°C para lisar completamente as células. Após homogeneizar a solução, adicionou-se 1875 μΐ de MgCl2 1 M. Após a adição de 375 μΐ de ADNase (10 mg/ml), incubou-se a solução durante 30 minutos a 37°C. Removeram-se os resíduos celulares por centrifugação a 1880 x g durante 30 minutos à temperatura ambiente sem travagem. Subsequentemente purificou-se o sobrenadante das proteínas por extracção com FREON (3x). O sobrenadante límpido foi carregado num gradiente de bloco de cloreto de césio (gama: 1,2/1,4 g/ml) tamponado com Tris/HCl 1 M e centrifugou-se a 21000 rpm durante 2,5 horas a 10°C. A banda de vírus é isolada após uma segunda purificação utilizando um gradiente contínuo de cloreto de césio a 1,33 g/ml tamponado com Tris/HCl 1 Μ. O vírus foi então centrifugado durante 17 horas a 55000 rpm a 10°C. A banda de vírus é isolada e adiciona-se sacarose (50% p/v) até uma concentração final de 1%. Remove-se o excesso de cloreto de césio por diálise (três vezes, 1 hora, à temperatura ambiente) em lâminas de diálise (Slide-a-lizer, corte de 10000 kDa, Pierce, EUA) contra 1,5 litro de PBS suplementado com CaCl2 (0,9 mM), MgCl2 (0,5 mM) e uma concentração crescente de sacarose (1, 2, 5%). Após diálise, remove-se o vírus do slide-a-lizer após o que é dividido em alíquotas em porções de 25 e 100 μΐ, sendo depois o vírus armazenado a -85 °C.

Para determinar o número de partículas de vírus por mililitro, corre-se 50 μΐ da soluçao-mãe de vírus num cromatógrafo líquido de alta resolução (HPLC) tal como descrito por Shabram et al (1997) . Eluem-se os vírus com um gradiente de NaCl na gama de 0 a 600 mM. Tal como apresentado na tabela I, a concentração de NaCl à qual eluem os vírus diferiu significativamente entre serótipos. A maioria dos adenovírus humanos replicou bem em células PER.C6 com algumas excepções. Os adenovírus tipo 8 e 40 foram cultivados em células 911-E4 (He et al., 1998). As soluções-mãe purificadas continham entre 5xl010 e 5xl012 partículas de vírus/ml (VP/ml; consultar tabela I). 16

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Titulação de soluções-mãe de adenovírus humanos purificadas

Os adenovírus foram titulados em células PER.C6 para determinar a quantidade de vírus necessária para obter efeito citopatogénico completo em cinco dias, a duração do ensaio de neutralização. Para tal, proporcionou-se 100 μΐ de meio para cada poço de placas de 96 poços. Adicionou-se 25 μΐ de soluções-mãe de adenovírus pré-diluídas 104 , 105 , 106 ou 107 vezes à coluna 2 de uma placa de 96 poços e misturou-se pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Seguidamente removeu-se 25 μΐ da coluna 2 para a coluna 3 e misturou-se novamente. Tal foi repetido até à coluna 11 e seguidamente removeram-se 25 μΐ da coluna 11. Deste modo, obtiveram-se diluições em série em etapas de 5 iniciando com uma solução-mãe pré-diluida. Seguidamente adicionaram-se 3 x 104 células PER.C6 (número de depósito ECACC 96022940) num volume de 100 μΐ e as placas foram incubadas a 37°C, CO2 a 5% durante cinco ou seis dias. Monitorizou-se o efeito citopatogénico microscopicamente. O método de Reed e Muensch foi utilizado para calcular a dose de inibição de 50% da cultura celular (CCID50).

Paralelamente, prepararam-se placas idênticas que foram analisadas utilizando o ensaio MTT (Promega). Neste ensaio quantificam-se células vivas por coloração colorimétrica. Para isso adicionou-se 20 μΐ de MTT (7,5 mg/ml em PBS) aos poços e incubou-se a 37°C, CO2 a 5% durante duas horas. Removeu-se o sobrenadante e adicionou-se 100 μΐ de uma solução de isopropanol/triton-X100 20:1 aos poços. Colocaram-se as placas num agitador de 96 poços durante 3-5 minutos para solubilizar a coloração precipitada. Mediu-se a absorvância a 540 nm e a 690 nm (linha de base). Através deste ensaio pode distinguir-se poços com efeito citopatogénico em curso ou efeito citopatogénico completo.

Ensaio de neutralização

Descongelaram-se placas de 96 poços com amostras de soro humano diluídas a 37°C, CO2 a 5%. Prepararam-se soluções-mãe de adenovírus diluídas a 200 CCID50 por 50 μΐ e adicionaram-se alíquotas de 50 μΐ às colunas 1-11 das placas com soro. Incubaram-se as placas durante 1 hora a 37°C, CO2 a 5%. Seguidamente, adicionaram-se 50 μΐ de células PER.C6 a 17 ΕΡ 1 349 926 /PT 6 χ 105/ml a todos os poços e incubaram-se durante 1 dia a 37°C, CO2 a 5%. Removeu-se o sobrenadante utilizando pontas de pipeta novas para cada linha e adicionou-se 200 μΐ de meio fresco a todos os poços para evitar efeitos tóxicos do soro. As placas foram incubadas durante mais 4 dias a 37°C, CO2 a 5%. Além disso, prepararam-se em duplicado placas de controlo paralelas, com soros de controlo positivo diluídos gerados em coelhos e específicos para cada serótipo a ser ensaiado nas linhas A e B e com soro de controlo negativo (FCS) nas linhas C e D. Igualmente, em cada uma das linhas E-H, efectuou-se uma titulação tal como descrito supra com etapas de diluições de cinco vezes com início com 200 CCID50 de cada vírus a ser ensaiado. No dia 5, analisou-se uma das placas de controlo microscopicamente e com o ensaio MTT. O título experimental foi calculado a partir da placa de titulação de controlo observada microscopicamente. Caso se verifique que o efeito citopatogénico está completo, ou seja, a primeira diluição na experiência de titulação de controlo analisada por MTT apresenta claramente morte celular, processam-se todas as placas de ensaio. Caso contrário, deixa-se prosseguir o ensaio durante um ou mais dias até efeito citopatogénico completo aparente, após o qual todas as placas foram processadas. Na maioria dos casos, o ensaio terminou no dia 5. Para Adi, Ad5, Ad33, Ad39, Ad42 e Ad43 deixou-se o ensaio durante seis dias e para Ad2 durante oito dias.

Considera-se que uma amostra de soro é "não neutralizante" quando, à concentração de soro mais elevada, se verifica um máximo de protecção de 40% comparativamente a controlos sem soro.

Os resultados da análise de 44 protótipos de adenovírus contra soro de 100 voluntários saudáveis apresentam na figura 1. Tal como esperado, a percentagem de amostras de soro que continham anticorpos neutralizantes para Ad2 e Ad5 foi muito elevada. Tal também é verdade para a maioria dos adenovírus com numeração baixa. Surpreendentemente, nenhuma das amostras de soro continha anticorpos neutralizantes para Ad35. Além disso, o número de indivíduos com títulos de anticorpo neutralizante para os serótipos 26, 34 e 48 foi muito baixo. Assim, os adenovírus com deleção de EI recombinantes com base em Ad35 ou um dos outros serótipos 18

ΕΡ 1 349 926 /PT supramencionados apresentam uma vantagem importante comparativamente a vectores recombinantes com base em Ad5 relativamente a depuração dos vírus por anticorpos neutralizantes.

Igualmente, os vectores baseados em Ad5 que têm partes de proteínas de cápside envolvidas em resposta imunogénica do hospedeiro substituídas pelas partes correspondentes das proteínas de cápside de Ad35 ou um dos outros serótipos serão neutralizados em menor escala, ou eventualmente não serão neutralizados pela grande maioria dos soros humanos.

Tal como pode ser verificado na tabela I, a razão VP/CCID50 calculada a partir das partículas de vírus por ml e do CCID50 obtido para cada vírus nas experiências foi altamente variável e na gama de 0,4 a 5 log. Tal é provavelmente causado pelas diferentes eficácias de infecção de células PER.C6 e pelas diferenças na eficácia de replicação dos vírus. Além disso, podem também desempenhar um papel diferenças nas propriedades dos lotes. Uma razão VP/CCID50 elevada significa que se colocaram mais vírus nos poços para obter efeito citopatogénico em 5 dias. Consequentemente, o resultado do estudo de neutralização pode ser desviado dado que mais partículas de vírus inactivas poderiam proteger os anticorpos. Para verificar a ocorrência de tal fenómeno, representou-se graficamente a razão VP/CCID50 em função da percentagem de amostras de soro positivas no ensaio (figura 2). O gráfico mostra claramente que não existe qualquer correlação negativa entre a quantidade de vírus no ensaio e a neutralização no soro.

Exemplo 2 A prevalência de actividade neutralizante (NA) para Ad35 é baixa em soros humanos recolhidos em diferentes localizações geográficas

No exemplo 1, descreveu-se a análise de actividade neutralizante ("NA") em soros humanos de uma localização na Bélgica. Surpreendentemente, de um painel de 44 serótipos de adenovírus ensaiados, um serótipo, Ad35, não foi neutralizado em qualquer dos 100 soros analisados. Além disso, verificou-se que alguns serótipos, Ad26, Ad34 e Ad48, foram neutralizados 19 ΕΡ 1 349 926 /PT em 8%, ou menos, dos soros ensaiados. Esta análise foi estendida posteriormente a outros serótipos de adenovirus que não tinham sido previamente ensaiados e, utilizando uma selecção de serótipos do primeiro rastreio, foi também estendida a soros de diferentes localizações geográficas.

Para tal, propagaram-se, purificaram-se e ensaiaram-se adenovirus para neutralização no ensaio de inibição de efeito citopatogénico, tal como descrito no exemplo 1. Utilizando os soros do mesmo lote utilizado no exemplo 1, ensaiaram-se adenovirus de serótipos 7B, 11, 14, 18 e 44/1876 para neutralização. Verificou-se que estes vírus foram neutralizados em, respectivamente, 59, 13, 30, 98 e 54% dos soros. Assim, desta série, Adll é neutralizado com uma frequência relativamente baixa.

Dado que se sabe que a frequência de isolamento de serótipos de adenovirus de tecidos humanos, bem como a prevalência de NA para serótipos de adenovirus, pode diferir em diferentes localizações geográficas, ensaiamos adicionalmente uma selecção dos serótipos de adenovirus contra soros de diferentes locais. Os soros humanos foram obtidos de dois locais adicionais na Europa (Bristol, Reino Unido e Leiden, Holanda) e de dois locais nos Estados Unidos (Stanford, Califórnia e Great Neck, Nova Iorque). Ensaiaram-se os adenovirus que se verificou terem sido neutralizados em 20% ou menos dos soros no primeiro rastreio, bem como Ad2, Ad5, Ad27, Ad30, Ad38, Ad43, para neutralização em soros do Reino Unido. Os resultados destas experiências apresentam-se na figura 3. Mais uma vez os adenovirus de serótipos 2 e 5 foram neutralizados numa elevada percentagem de soros humanos. Além disso, alguns dos serótipos que foram neutralizados numa baixa percentagem de soros no primeiro rastreio foram neutralizados numa percentagem mais elevada de soros do Reino Unido, por exemplo, Ad26 (7% contra 30%), Ad28 (13% contra 50%), Ad34 (5% contra 27%) e Ad48 (8% contra 32%). Verificou-se que a actividade neutralizante contra Adll e Ad49, que foi verificada numa percentagem relativamente baixa de soros no primeiro rastreio, foi ainda em menor percentagem em soros neste segundo rastreio (13% contra 5% e 20% contra 11%, respectivamente). Verificou-se que o serótipo Ad35, que não tinha sido neutralizado em qualquer dos soros no primeiro 20 ΕΡ 1 349 926 /PT rastreio, verificou-se que foi neste caso neutralizado numa baixa percentagem (8%) dos soros do Reino Unido. A prevalência de NA em soros humanos do Reino Unido é mais baixa para os serótipos Adll e Ad35.

Para análise adicional, foram obtidos soros de dois locais dos EUA (Stanford, Califórnia e Great Neck, Nova Iorque) e da Holanda (Leiden). A figura 4 apresenta uma revisão geral dos dados obtidos com estes soros e os dados anteriores. Nem todos os vírus foram ensaiados em todos os soros, excepto Ad5, Adll e Ad35. A conclusão global deste rastreio abrangente de soros humanos é que a prevalência de actividade neutralizante para Ad35 é a mais baixa de todos os serótipos nos países ocidentais: em média 7% dos soros humanos apresentavam actividade neutralizante (5 locais diferentes). Outro adenovírus do grupo B, Adll, é também neutralizado num baixa percentagem de soros humanos (média de 11% em soros de 5 locais diferentes). O adenovírus de tipo 5 é neutralizado em 56% dos soros humanos obtidos de 5 locais diferentes. Embora não tenha sido ensaiado em todos os soros, o serótipo 49 do grupo D também é neutralizado com frequência relativamente baixa em amostras da Europa e num local dos Estados Unidos (média de 14%).

Nas experiências de neutralização descritas no presente documento, considera-se que um soro não é neutralizante quando, no poço com a concentração de soro mais elevada se verifica a máxima protecção de efeito citopatogénico a 40% comparativamente com os controlos sem soro. A protecção é calculada da seguinte forma: 1% de protecção = (DO poço correspondente-DO controlo de vírus) (DO controlo não infectado-DO controlo de vírus) 100$ para

Tal como descrito no exemplo 1, plaqueia-se o soro em cinco diluições diferentes na gama de 4 x a 64 x diluído. Assim, é possível distinguir títulos baixos (ou seja, neutralização apenas nas concentrações de soro mais elevadas) e títulos elevadas de NA (ou seja, neutralização também em poços com a concentração de soro mais baixa). Dos soros humanos utilizados no nosso rastreio que se verificou que apresentavam actividade neutralizante para Ad5, 70% 21 ΕΡ 1 349 926 /PT apresentaram títulos elevados, enquanto que, dos soros que apresentavam NA para Ad35, apenas 15% apresentavam títulos elevados. Dos soros que foram positivos para NA para Adll, somente 8% apresentavam títulos elevados. Para Ad49, tal foi 5%. Assim, não só a frequência de NA para Ad35, Adll e Ad49 é muito inferior comparativamente a Ad5, como dos soros que não apresentavam NA para estes vírus, a larga maioria apresentava títulos baixos. Assim, os vectores adenovíricos com base em Adll, Ad35 ou Ad49 apresentam uma clara vantagem relativamente a vectores baseados em Ad5 quando utilizados como veículos de terapia génica ou vectores de vacinação in vivo ou em qualquer aplicação em que a eficácia de infecção é prejudicada pela actividade neutralizante.

Nos seguintes exemplos descreve-se a construção de um sistema de vector para a geração de vectores baseados em Ad35 isentos de RCA e seguros.

Exemplo 3

Sequência do adenovírus humano tipo 35

Propagaram-se vírus Ad35 em células PER.C6 e isolou-se ADN da seguinte forma: Adicionou-se 10 μΐ de tampão de ADNase lOx (Tris-HCl 130 mM, pH 7,5; CaCl2 1,2 M; MgCl2 50 mM) a 100 μΐ de solução-mãe de vírus (Ad35: 3,26 x 1012 VP/ml). Após adição de 10 μΐ de ADNase I a 10 mg/ml (Roche Diagnostics), incubou-se a mistura durante 1 h a 37°C. Após adição de 2,5 μΐ de EDTA 0,5 M, 3,2 μΐ de SDS a 20% e 1,5 μΐ de ProteinaseK (Roche Diagnostics; 20 mg/ml), incubaram-se as amostras a 50°C durante 1 h. Seguidamente, isolou-se ADN vírico utilizando o kit de rotação GENECLEAN (BIO 101 Inc.) segundo as instruções do fabricante. Eluiu-se o ADN da coluna de rotação com 25 μΐ de água MilliQ estéril. A sequência total foi gerada por Qiagen Sequence Services (Qiagen GmbH, Alemanha). Quebrou-se o ADN vírico total com ultra-sons e tornaram-se as extremidades do ADN planas por T4 ADN polimerase. Os fragmentos partidos com extremidades planas foram fraccionados por tamanho em géis de agarose e obtiveram-se partes do gel correspondentes a fragmentos de ADN de 1,8 a 2,2 kb. Purificou-se o ADN a partir das partes de gel através do protocolo de extracção de gel QIAquick e subclonou-se para uma biblioteca por disparos de vectores de clonagem de plasmídeo pUC19. Utilizou-se uma 22

ΕΡ 1 349 926 /PT matriz de clones em placas de 96 poços abrangendo o ADN alvo 8 (+/-2) vezes para gerar a sequência total. A sequenciação foi efectuada num termociclador Perkin-Elmer 9700 utilizando química de Big Dye Terminator e AmpliTaq FS ADN polimerase seguido de purificação das reacções de sequenciação utilizando tecnologia QIAGEN DyeEx 96. Os produtos da reacção de sequenciação foram então sujeitos a separação automatizada e detecção de fragmentos em sequenciadores ABI 377 XL de 96 pistas. Os resultados de sequência iniciais foram utilizados para gerar uma sequência contígua e preencheram-se as falhas por leituras de marcha com iniciador no ADN alvo ou por sequenciação directa de produtos de PCR. Verificou-se que as extremidades do vírus estavam ausentes da biblioteca por disparos, mais provavelmente devido a dificuldades de clonagem resultantes dos aminoácidos de pTP que permanecem ligados às sequências ITR após digestão com proteinase K do ADN vírico. Experiências de sequenciação adicionais de ADN vírico resolveram a maior parte da sequência nessas regiões, contudo, foi difícil obter uma sequência clara dos nucleótidos mais terminais. Na extremidade 5', a parte de sequência obtida foi 5'-CCAATAATATACCT-3' (SEQ ID N°_) enquanto que na extremidade 3', a parte de sequência obtida foi 5'-AGGTATATTATTGATGATGGG-3' (SEQ ID N°_). A maior parte dos adenovírus humanos têm uma sequência terminal 5'-CATCATCAATAATATACC-3' (SEQ ID N°_) .Além disso, verificou-se que um clone representativo da extremidade 3' do ADN de Ad35 obtido após clonagem do fragmento EcoRI de Ad35 terminal de 7 kb para pBr322 também apresentava a sequência CATCATCAATAAT... típica. Assim, Ad35 pode apresentar uma sequência terminal típica e as diferenças obtidas na sequenciação directa do ADN vírico são devidas a artefactos relacionados com experiências de sequenciação mal sucedidas e com a presença de aminoácidos residuais de pTP. A sequência total de Ad35 com sequências terminais corrigidas é apresentada na figura 5. Com base em homologia de sequência com Ad5 (Genbank N° M72360) e Ad7 (sequência parcial Genbank N° X03000) e na localização de quadros de leitura aberta, a organização do vírus é idêntica à organização geral da maior parte dos adenovírus humanos, especialmente os vírus de subgrupo B. O comprimento total do genoma é de 34 794 pares de bases. 23

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Exemplo 4

Construção de um sistema de vector baseado em plasmídeo para gerar vírus com base em Ad35 recombinante

Um sistema de vector baseado em plasmídeo funcional para gerar vectores adenovíricos recombinantes inclui os seguintes componentes: 1. Um plasmídeo adaptador incluindo um ITR esquerdo e sequências de empacotamento derivadas de Ad35 e pelo menos um local de restrição para inserção de uma cassete de expressão heteróloga e isento de sequências de El. Além disso, o plasmídeo adaptador contém sequências Ad35 a 3' da região de codificação E1B incluindo o promotor pIX e sequências de codificação suficientes para mediar recombinação homóloga do plasmídeo adaptador com uma segunda molécula de ácido nucleico. 2. Uma segunda molécula de ácido nucleico, incluindo sequências homólogas ao plasmídeo adaptador e sequências de Ad35 necessárias para a replicação e empacotamento do vírus recombinante, ou seja, genes precoce, intermédio e tardio que não se encontram presentes na célula de empacotamento. 3. Uma célula de empacotamento que proporciona pelo menos proteínas El funcionais capazes de complementar a função El de Ad35. São conhecidos na arte outros métodos para gerar adenovírus recombinantes na complementação de células de empacotamento e podem ser aplicados a vírus Ad35 sem afastamento do invento. Por exemplo, descreve-se detalhadamente infra a construção de sistema baseado em plasmídeo, tal como descrito sucintamente supra. 1) Construção de plasmídeos adaptadores de Ad35 0 plasmídeo adaptador pAdApt (descrito na pedido de patente internacional W099/55132) foi primeiramente modificado para obter plasmídeos adaptadores que contêm poli-ligantes extensos e que apresentam locais de restrição únicos convenientes que flanqueiam o ITR esquerdo e a sequência de 24

ΕΡ 1 349 926 /PT adenovírus na extremidade 3', para permitir a libertação da inserção de adenovírus das sequências de vector de plasmídeo. A construção destes plasmídeos descreve-se detalhadamente infra:

Digeriu-se o plasmídeo adaptador pAdApt com Sall e tratou-se com fosfatase alcalina de camarão para reduzir religação. Ligou-se directamente um elemento de ligação, composto dos seguintes dois oligonucleótidos fosforilados e hibridados: ExSalPacF 5' -TCG ATG GCA AAC AGC TAT TAT GGG TAT TAT GGG TTC GAA TTA ATT AA-3' (SEQ ID N°J e ExSalPacR 5'-TCG ATT AAT TAA TTC GAA CCC ATA ATA CCC ATA ATA GCT GTT TGC CA-3' (SEQ ID N° _) à construção digerida, substituindo assim o

local de restrição Sall por Pi-PspI, SwaI e Pacl. Esta construção foi denominada elemento de ligação pADAPT+ExSalPac. Além disso, parte do ITR esquerdo de pAdApt foi amplificada por PCR utilizando os seguintes iniciadores: PCLIPMSF: 5'-CCC CAA TTG GTC GAC CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT TGG-3' (SEQ ID N°_) e pCLIPBSRGI: 5'-GCG AAA ATT GTC ACT TCC TGT G-3' (SEQ ID N°_) . 0 fragmento amplificado foi digerido com Muni e BsrGI e clonado para pAd5/Clip (descrito no pedido de patente internacional W099/55132), que foi parcialmente digerido com EcoRI e após purificação foi digerido com BsrGI, reinserindo assim o ITR esquerdo e sinal de empacotamento. Após análise por enzima de restrição, a construção foi digerida com Seal e SgrAI e isolou-se um fragmento de 800 pb do gel e ligou-se com elemento de ligação pADAPT+ExSalPac digerido com Scal/SgrAl. A construção resultante, denominada pIPspSalAdapt, foi digerida com Sall, desfosforilada e ligou-se a elemento de ligação em cadeia dupla ExSalPacF/ExSalPacR fosforilado previamente mencionado. Identificou-se um clone no qual o local Pacl se encontrava mais perto do ITR por análise de restrição e confirmaram-se as sequências por análise de sequenciação. Esta nova construção pAdApt, denominada pIPspAdapt, transporta assim dois elementos de ligação ExSalPac contendo sequências de reconhecimento para Pacl, PI-PspI e BstBI, que circundam a parte adenovírica da construção de adaptador adenovírico e que pode ser utilizada para linearizar o ADN de plasmídeo antes de co-transfecção com fragmentos auxiliadores de fago.

De modo a aumentar adicionalmente as permutações de clonagem de transgene, construíram-se várias variantes de 25

ΕΡ 1 349 926 /PT poli-ligante com base em pIPspAdapt. Para tal, digeriu-se primeiramente pIPspAdapt com EcoRI e desfosforilou-se. Ligou-se a esta construção um elemento de ligação composto dos seguintes dois oligonucleótidos fosforilados e hibridados: Ecolinker+: 5'-AAT TCG GCG CGC CGT CGA CGA TAT CGA TAG CGG CCG C-3' (SEQ ID N°_) e Ecolinker-: 5'-AAT TGC GGC CGC TAT CGA TAT CGT CGA CGG CGC GCC G-3' (SEQ ID N°J, criando assim locais de restrição para Asei, Sall, EcoRV, Ciai e NotI. Obtiveram-se ambas as orientações deste elemento de ligação e confirmaram-se as sequências por análise de restrição e análise de sequência. 0 plasmideo contendo o poli-ligante na ordem 5' HindIII, Kpnl, Agel, EcoRI, Asei, Sall, EcoRV, Ciai, NotI, Nhel, Hpal, BamHI e Xbal foi denominado pIPspAdaptl, enquanto que o plasmideo contendo o poli-ligante na ordem HindIII, Kpnl, Agel, NotI, Ciai, EcoRV, Sall, Asei, EcoRI, Nhel, Hpal, BamHI e Xbal foi denominado pIPspAdapt2.

Para facilitar a clonagem de outras construções em sentido ou em anti-sentido, concebeu-se um elemento de ligação composto pelos dois oligonucleótidos seguintes para reverter o poli-ligante de pIPspAdapt: HindXba+ 5'-AGC TCT AGA GGA TCC GTT AAC GCT AGC GAA TTC ACC GGT ACC AAG CTT A-3' (SEQ ID N°_); HindXba- 5 ' -CTA GTA AGC TTG GTA CCG GTG AAT TCG CTA GCG TTA ACG GAT CCT CTA G-3' (SEQ ID N°_) . Este elemento de ligação foi ligado a pIPspAdapt digerido com HindIII/Xbal e isolou-se a construção correcta. Efectuou-se confirmação por análise de enzima de restrição e sequenciação. Esta nova construção, pIPspAdaptA, foi digerida com EcoRI e o Ecolinker previamente mencionado foi ligado a esta construção. Foram obtidas ambas as orientações deste elemento de ligação, resultando em pIPspAdapt3, que contem o poli-ligante na ordem Xbal, BamHI, Hpal, Nhel, EcoRI, Asei, Sall, EcoRV, Ciai, NotI, Agel, Kpnl e HindIII. Todas as sequências foram confirmadas por análise de enzima de restrição e sequenciação.

Construiram-se então plasmideos adaptadores com base em Ad35 da seguinte forma:

Amplificaram-se por PCR as sequências de ITR esquerdo e a sequência de empacotamento correspondente a Ad35 de tipo selvagem nucleótidos 1 a 464 (figura 5) em ADN de Ad35 de tipo selvagem utilizando os seguintes iniciadores: 26

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Iniciador 35F1: 5' -CGG AAT TCT TAA TTA ATC GAC ATC ATC AAT AAT ATA CCT TAT AG-3 ' (SEQ ID N°_)

Iniciador 35R2: 5'-GGT GGT CCT AGG CTG ACA CCT ACG TAA AAA CAG-3' (SEQ ID N°_) A amplificação introduz um local PacI na extremidade 5' e um local Avrll na extremidade 3' da sequência.

Para a amplificação, utilizou-se enzima ADN polimerase Platinum Pfx (LTI) segundo as instruções do fabricante, mas com iniciadores adicionados a 0,6 μΜ e com DMSO para uma concentração final de 3%. O programa de amplificação foi o seguinte: 2 min a 94°C, (30 s, 94°C, 30 s a 56°C, 1 min a 68°C) durante 30 ciclos, seguido por 10 min a 68°C. O produto de PCR foi amplificado utilizando um kit de purificação de PCR (LTI) segundo as instruções do fabricante e digerido com PacI e Avrll. O fragmento digerido foi então purificado do gel utilizando o kit GENECLEAN (BIO 101, Inc.). Digeriu-se o plasmideo adaptador com base em Ad5 pIPspAdApt-3 com Avrll e seguidamente parcialmente com PacI e isolou-se o fragmento de 5762 pb numa tira de gel de agarose LMP e ligou-se com o supramencionado fragmento de PCR digerido com as mesmas enzimas e transformado para células DH10B electrocompetentes (LTI). O clone resultante foi denominado pIPspAdApt3-Ad3 51ITR.

Paralelamente, amplificou-se uma segunda parte de ADN de Ad35 utilizando os seguintes iniciadores: 335F3: 5'- TGG TGG AGA TCT GGT GAG TAT TGG GAA AAC-3' (SEQ ID N°_) 435R4: 5'- CGG AAT TCT TAA TTA AGG GAA ATG CAA ATC TGT GAG G-3' (SEQ ID N°_) A sequência deste fragmento corresponde aos nucleótidos 3401 a 4669 de Ad35 de tipo selvagem (figura 5) e contém 1,3 kb de sequências com inicio directamente a 3' da sequência 27 ΕΡ 1 349 926 /PT de codificação E1B 55k. A amplificação e purificação foram efectuadas tal como descritas supra no presente documento para o fragmento contendo o ITR esquerdo e sequência de empacotamento. O fragmento de PCR foi então digerido com PacI e subclonado para o vector pNEB193 (New England Biolabs) digerido com Smal e PacI. A integridade da sequência do clone resultante foi verificada por análise de sequência. Digeriu-se então pNEB/Ad35pF3R4 com BglII e PacI e isolou-se a inserção de Ad35 do gel utilizando o kit QIAExII (Qiagen) . Digeriu-se pIPspAdApt3-Ad351ITR com BglII e seguidamente parcialmente com PacI. 0 fragmento de 3624 pb (contendo sequência de vector, o ITR de Ad35 e sequências de empacotamento, bem como o promotor CMV, região de clonagem múltipla e sinal de poliA) foi também isolado utilizando o kit QIAExII (Qiagen). Ambos os fragmentos foram ligados e transformados para células DH10B competentes (LTI) . 0 clone resultante, pAdApt35IP3, tem a cassete de expressão de pIPspAdApt3 mas contem o ITR esquerdo de Ad35 e sequências de empacotamento e um segundo fragmento correspondente aos nucleótidos 3401 a 4669 de Ad35. Preparou-se uma segunda versão do plasmídeo adaptador de Ad35 contendo o local de clonagem múltipla na orientação oposta da seguinte forma:

Digeriu-se pIPspAdaptl com Ndel e BglII e isolou-se a banda de 0,7 kpb contendo parte do promotor CMV, o MCS e poliA de SV40 e inseriu-se nos locais correspondentes de pAdApt35IP3 gerando pAdApt35IPl (figura 6).

Geraram-se então plasmídeos adaptadores pAdApt35.LacZ e pAdApt35.Luc por inserção dos transgenes de pcDNA.LacZ (digerido com Kpnl e BamHI) e pAdApt.Luc (digerido com HindIII e BamHI) para os locais correspondentes de pAdApt35IPl. A geração de pcDNA.LacZ e pAdApt.Luc encontra-se descrita no pedido de patente internacional W099/55132.

2) Construção de cosmídeo pWE.Ad35.pIX-rITR A figura 7 apresenta as várias etapas efectuadas para construir o clone de cosmideo contendo as sequências de Ad35 desde pb 3401 a 34794 (final do ITR direito) que são descritas detalhadamente infra. 28

ΕΡ 1 349 926 /PT

Gerou-se um primeiro fragmento de PCR (pIX-Ndel) utilizando o seguinte conjunto de iniciadores: 535F5: 5'-CGG AAT TCG CGG CCG CGG TGA GTA TTG GGA AAA C -3' (SEQ ID N°_) 635R6: 5'-CGC CAG ATC GTC TAC AGA ACA G-3' (SEQ ID N°_)

Utilizou-se ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante, contudo com uma concentração final de 0,6 μΜ de ambos os iniciadores e utilizando 50 ng de ADN de Ad35 de tipo selvagem como molde. A amplificação foi efectuada do seguinte modo: 2 min a 94°C, 30 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 65°C e 1 min 45 s a 72°C, seguido por 8 min a 68°C. Para permitir clonagem no vector de clonagem TA PCR2.1, efectuou-se uma última incubação com 1 unidade de superTaq polimerase (HT Biotechnology LTD) durante 10 min a 72°C. O fragmento amplificado de 3370 pb contem sequências de Ad35 desde pb 3401 a 6772 com um local Notl adicionado na extremidade 5'. Purificaram-se os fragmentos utilizando o kit de purificação de PCR (LTI).

Gerou-se um segundo fragmento de PCR (Ndel-rITR) utilizando os seguintes iniciadores: 735F7: 5'-GAA TGC TGG CTT CAG TTG TAA TC -3' (SEQ ID N°_) 835R8: 5'- CGG AAT TCG CGG CCG CAT TTA AAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC-3' (SEQ ID N°_) A amplificação foi efectuada com pfx ADN polimerase (LTI) segundo as instruções do fabricante mas com 0,6 μΜ de ambos os iniciadores e DMSO a 3% utilizando 10 ng de ADN de Ad35 de tipo selvagem como molde. O programa foi o seguinte: 3 min a 94°C e 5 ciclos de 30 s a 94°C, 45 s a 40°C, 2 min 45 s a 68°C seguido por 25 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 60°C, 2 min 45 s a 68°C. Para permitir clonagem para o vector de clonagem TA PCR2.1, efectuou-se uma última incubação com 1 unidade de superTaq polimerase durante 10 min a 72°C. O fragmento 29

ΕΡ 1 349 926 /PT amplificado de 1,6 kb abrangendo desde o nucleótido 33178 até ao final do ITR direito de Ad35 foi purificado utilizando o kit de purificação de PCR (LTI).

Ligaram-se ambos os fragmentos de PCR purificados ao vector PCR2.1 do kit de clonagem TA (Invitrogen) e transformaram-se em células STBL-2 competentes (LTI). Sequenciaram-se os clones contendo a inserção esperada para confirmar amplificação correcta. Seguidamente, excisaram-se ambos os fragmentos do vector por digestão com Notl e Ndel e purificaram-se do gel utilizando o kit GENECLEAN (BIO 101, Inc. ) . Digeriu-se o vector de cosmideo pWE15 (Clontech) com Notl, desfosforilou-se e também foi purificado do gel. Ligaram-se estes três fragmentos e transformaram-se em células STBL2 competentes (LTI). Digeriu-se então um dos clones correctos que continham ambos os fragmentos de PCR com Ndel e purificou-se o fragmento linear do gel utilizando o kit GENECLEAN. Digeriu-se ADN de Ad35 de tipo selvagem com Ndel e purificou-se o fragmento de 26,6 kb do gel LMP utilizando enzima agarase (Roche) segundo as instruções do fabricante. Ligaram-se estes fragmentos conjuntamente e empacotaram-se utilizando extractos de empacotamento de fago λΐ (Stratagene) segundo o protocolo do fabricante. Após infecção para células STBL-2, cultivaram-se colónias em placas e analisaram-se para a presença da inserção completa. Seleccionou-se um clone com o fragmento grande inserido na orientação correcta e contendo os padrões de restrição correctos após digestões independentes com três enzimas (Ncol, PvuII e Seal). Este clone foi denominado pWE.Ad35.pIX-rITR. Contem as sequências de Ad35 desde pb 3401 até ao fim e é flanqueado por locais Notl (figura 8). 3) Geração de vírus recombinante com base em Ad35 em PER.C6 O vírus Ad35 de tipo selvagem pode ser cultivado em células de empacotamento PER.C6 até títulos muito elevados. Contudo, desconhece-se se a região Ad5-El que se encontra presente em PER.C6 é capaz de complementar vírus recombinantes Ad35 com deleção de El. Para ensaiar tal, co-transfectaram-se células PER.C6 com o plasmídeo adaptador descrito supra pAdApt35.LacZ e o fragmento de esqueleto grande pWE.Ad35.pIX-rlTR. Primeiramente, digeriu-se pAdApt35.LacZ com PacI e digeriu-se pWE.Ad35.pIX-rITR com Notl. Sem purificação 30

ΕΡ 1 349 926 /PT adicional, misturou-se 4 μg de cada construção com DMEM (LTI) e transfectou-se para células PER.C6, cultivadas a uma densidade de 5 x 106 células num frasco T25 no dia anterior, utilizando Lipofectamina (LTI) segundo as instruções do fabricante. Como controlo positivo, co-transfectou-se 6 μρ de ADN de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido com PacI com um fragmento de Nhel de 6,7 kb isolado de ADN de Ad35 de tipo selvagem contendo a extremidade esquerda do genoma virico incluindo a região El. No dia seguinte, refrescou-se o meio (DMEM com FBS a 10% e MgCl2 10 mM) e incubaram-se adicionalmente as células. No dia 2 após a transfecção, tripsinizaram-se as células e transferiram-se para frascos T80. O frasco de controlo positivo apresentou efeito citopatogénico aos cinco dias após transfecção, demonstrando que a construção pWE.Ad35.pIX-rITR é funcional, pelo menos na presença de proteínas Ad35-El. A transfecção com o plasmídeo adaptador de LacZ de Ad35 e pWE.Ad35.pIX-rITR não originou efeito citopatogénico. Recolheram-se estas células do meio ao dia 10, congelou-se/descongelou-se uma vez para libertar o vírus das células. Adicionou-se 4 ml do material recolhido a um frasco T80 com células PER.C6 (a 80% de confluência) e incubou-se durante mais cinco dias. Esta recolha/re-infecção foi repetida duas vezes mas não se verificou qualquer evidência de efeito citopatogénico associado a vírus.

Para tal experiência, parece que as proteínas Ad5-El não são capazes de complementar vírus recombinante Ad35 ou não o fazem suficientemente bem. Contudo, é possível que a

sobreposição de sequência do plasmídeo adaptador e do plasmídeo de esqueleto pWE.Ad35.pIX-rITR não seja suficientemente grande para recombinar eficazmente e originar um genoma virico recombinante. A transfecção com controlo positivo foi efectuada com um fragmento terminal esquerdo de 6,7 kb e, consequentemente, a sobreposição de sequência foi de cerca de 3,5 kb. O plasmídeo adaptador e o fragmento pWE.Ad35.pIX-rITR têm uma sobreposição de sequência de 1,3 kb. Para verificar se a sobreposição de sequência de 1,3 kb é demasiado pequena para recombinação homóloga eficaz, efectuou-se uma co-transfecção com pWE.Ad35.pIX-rITR digerido com PacI e gerou-se um fragmento de PCR de ADN de Ad35 de tipo selvagem com os supramencionados 35F1 e 35R4 utilizando os mesmos procedimentos descritos supra no presente documento. O 31 ΕΡ 1 349 926 /PT fragmento de PCR contem assim sequências da extremidade esquerda e sequências até pb 4669 e, consequentemente, tem as mesmas sequências de sobreposição com pWE.Ad35.pIX-rITR do que o plasmideo adaptador pAdApt35.LacZ, mas tem sequências Ad35 El. Após purificação em coluna de PCR, digeriu-se o ADN com Sall para remover possíveis sequências molde intactas. Utilizou-se como controlo negativo uma transfecção com o produto de PCR digerido sozinho. Quatro dias após transfecção, ocorreu efeito citopatogénico nas células transfectadas com o produto de PCR e o fragmento Ad35 pIX-rITR mas não no controlo negativo. Tal resultado demonstra que uma sequência de sobreposição de 1,3 kb é suficiente para gerar vírus na presença de proteínas Ad35 El. A partir destas experiências concluímos que é necessária a presença de pelo menos uma das proteínas Ad35.El para gerar vectores baseados em Ad35 recombinantes de ADN de plasmideo em linhas celulares de complementação de Ad5.

Exemplo 5 1) Construção de plasmídeos de expressão Ad35.El

Dado que as proteínas Ad5-El em PER.C6 são incapazes de complementar vírus Ad35 recombinante eficazmente, têm que se expressar proteínas Ad35-El em células que complementem Ad5 (por exemplo, PER.C6). Alternativamente, tem de ser preparada uma nova linha celular de empacotamento que expresse proteínas Ad35 El, partindo quer de células humanas primárias diplóides, quer de linhas celulares estabelecidas que não expressem proteínas El de adenovírus. Para testar a primeira possibilidade, clonou-se a região Ad35-El nos plasmídeos de expressão, tal como descrito supra.

Primeiro, amplificou-se a região Ad35-El desde pb 468 a pb 3400 de ADN de Ad35 de tipo selvagem utilizando o seguinte conjunto de iniciadores: 135F11: 5'-GGG GTA CCG AAT TCT CGC TAG GGT ATT TAT ACC-3' (SEQ ID N°_) 235F10: 5' -GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG-3 ' (SEQ ID N°_) 32

ΕΡ 1 349 926 /PT

Este PCR introduz um local Kpnl e EcoRI na extremidade 5' e um local SbfI e Xbal na extremidade 3'.

Efectuou-se a amplificação em 5 ng de ADN molde com ADN polimerase Pwo (Roche) utilizando as instruções do fabricante, contudo, com ambos os iniciadores a uma concentração final de 0,6 μΜ. O programa foi o seguinte: 2 min a 94°C, 5 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 56°C e 2 min a 72°C, seguido de 25 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 60°C e 2 min a 72°C, seguido por 10 min a 72°C. Purificou-se o produto de PCR com um kit de purificação de PCR (LTI) e digeriu-se com Kpnl e Xbal. O fragmento de PCR digerido foi então ligado ao vector de expressão pRSVhbvNeo (consultar infra) também digerido com Kpnl e Xbal. As ligações foram transformadas para células STBL-2 competentes (LTI) segundo as instruções do fabricante e analisaram-se as colónias para a inserção correcta de sequências Ad35El no poli-ligante e entre o promotor RSV e poliA de HBV. O clone resultante foi denominado pRSV.Ad35-El (figura 9). Verificaram-se as sequências de Ad35 em pRSV.Ad35-El por análise de sequência.

Gerou-se pRSVhbvNeo da seguinte forma: digeriu-se pRc-RSV (Invitrogen) com PvuII, desfosforilou-se com enzima TSAP (LTI) e isolou-se o fragmento de vector de 3 kb em agarose de baixo ponto de fusão (LMP). Digeriu-se plasmídeo pPGKneopA (figura 10; descrito no pedido de patente internacional W096/35798) com SspI completamente para linearizar o plasmídeo e facilitar a digestão parcial com PvuII. Após digestão parcial com PvuII, separaram-se os fragmentos resultantes num gel de agarose LMP e isolou-se o fragmento PvuII de 2245 pb contendo o promotor PGK, gene de resistência a neomicina e HBVpoliA. Ligaram-se ambos os fragmentos isolados para obter o vector de expressão pRSV-pNeo que agora apresenta a cassete de expressão SV40prom-neo-SV40polyA original substituída por uma cassete PGKprom-neo-HBVpolyA (figura 11). Este plasmídeo foi modificado adicionalmente para substituir o BGHpA por o HBVpA da seguinte forma: linearizou-se pRSVpNeo com Seal e digeriu-se adicionalmente com Xbal. Isolou-se do gel o fragmento de 1145 pb, contendo parte das sequências do gene Amp e do promotor RSV e a sequência do poli-ligante, 33

ΕΡ 1 349 926 /PT utilizando o kit GENECLEAN (Bio Inc. 101) . Seguidamente, linearizou-se pRSVpNeo com Seal e digeriu-se adicionalmente parcialmente com EcoRI e isolou-se do gel o fragmento de 3704 pb contendo a cassete PGKneo e as seguências do vector, tal como supra. Gerou-se então um terceiro fragmento, contendo a seguência poliA de HBV flangueada por Xbal e EcoRI nas extremidades 5' e 3', respectivamente, por amplificação por PCR em pRSVpNeo utilizando o seguinte conjunto de iniciadores: 3HBV-F: 5'- GGC TCT AGA GAT CCT TCG CGG GAC GTC -3' (SEQ ID N°_) e 4HBV-R: 5'- GGC GAA TTC ACT GCC TTC CAC CAA GC -3' (SEQ ID N°_). A amplificação foi efectuada com enzima Elongase (LTI) segundo as instruções do fabricante com as seguintes condições: 30 segundos a 94°C, seguidamente 5 ciclos de 45 segundos a 94°C, 1 minuto a 42°C e 1 minuto a 68°C, seguido de 30 ciclos de 45 segundos a 94°C, 1 minuto a 65°C e 1 minuto a 68°C, seguido de 10 minutos a 68°C. Purificou-se então o fragmento de PCR de 625 pb utilizando o kit de purificação de PCR Qiaquick, digeriu-se com EcoRI e Xbal e purificou-se do gel utilizando o kit GENECLEAN. Ligaram-se os três fragmentos isolados e transformaram-se para células DH5CC competentes (LTI) para obter a construção pRSVhbvNeo (figura 12). Nesta construção, as regiões de regulação de transcrição da cassete de expressão de RSV e o marcador de selecção de neomicina são modificados para reduzir a sobreposição com vectores adenoviricos que contêm frequentemente sequências de regulação de transcrição de CMV e SV40. 2) Geração de vírus recombinante de Ad35 em células PER.C6 co-transfectadas com uma construção de expressão Ad35-El.

Inocularam-se células PER.C6 a uma densidade de 5 x 106 células num frasco T25 e no dia seguinte transfectaram-se com uma mistura de ADN contendo:

1 μg de pAdApt35.LacZ digerido com PacI 5 μg de pRSV.Ad35El não digerido 2 μg de pWE.Ad35.pIX-rITR digerido com Notl A transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina segundo as instruções do fabricante. Cinco horas após adição da mistura de transfecção às células, removeu-se meio e 34

ΕΡ 1 349 926 /PT substituiu-se por meio fresco. Após dois dias, transferiram-se as células para frascos T80 e cultivaram-se adicionalmente. Uma semana após transfecção, adicionou-se 1 ml do meio às células A549 e, no dia seguinte, coraram-se as células para expressão de LacZ. Foram claramente visíveis células azuis após duas horas de coloração, indicando que se produziram vírus que expressam LacZ recombinante. Cultivaram-se adicionalmente as células, mas não se verificou qualquer aparecimento evidente de efeito citopatogénico. Contudo, após 12 dias, apareceram cachos de células numa monocamada e 18 dias após transfecção destacaram-se as células. Recolheram-se então as células e o meio, congelaram-se/descongelaram-se uma vez e utilizou-se 1 ml de lisado em bruto para infectar células PER.C6 numa placa de 6 poços. Dois dias após infecção, coraram-se as células para actividade LacZ. Após duas horas, 15% das células estavam coradas de azul. Para ensaiar a presença de vírus de tipo selvagem e/ou vírus competentes para replicação, infectaram-se células A549 com estes vírus e cultivaram-se adicionalmente. Não se verificaram quaisquer sinais de efeito citopatogénico indicando a ausência de vírus competentes para replicação. Estas experiências mostram que foram preparados vírus AdApt35.LacZ recombinantes em células PER.C6 co-transfectadas com uma construção de expressão Ad35-El.

Os vírus Ad35 recombinantes escapam de neutralização em soro humano contendo actividade neutralizante para vírus Ad5.

Utilizaram-se então os vírus AdApt35.LacZ para investigar infecção na presença de soro que contem actividade neutralizante para vírus Ad5. Utilizaram-se vírus LacZ baseados em Ad5 purificados como controlo positivo para NA. Para tal, inocularam-se células PER.C6 numa placa de 24 poços a uma densidade de 2 x 105 células/poço. No dia seguinte, diluiu-se uma amostra de soro humano com actividade neutralizante para Ad5 elevada no meio de cultura em cinco etapas de diluições de cinco vezes. Misturou-se então 0,5 ml de soro diluído com 4 x 106 partículas de vírus de vírus AdApt5.LacZ em 0,5 ml de meio e após 30 minutos de incubação a 37°C, adicionou-se 0,5 ml da mistura às células PER.C6 em duplicado. Para os vírus AdApt35.LacZ, misturou-se 0,5 ml das amostras de soro diluídas com 0,5 ml de lisado em bruto 35 ΕΡ 1 349 926 /PT contendo vírus AdApt35.LacZ e, após incubação, adicionou-se 0,5 ml desta mistura a células PER.C6 em duplicado. Utilizaram-se amostras de vírus incubadas em meio sem soro como controlos positivos para infecção. Após duas horas de infecção a 37°C, adicionou-se meio até atingir um volume final de 1 ml e incubaram-se adicionalmente as células. Dois dias após infecção, coraram-se as células para actividade LacZ. Apresentam-se os resultados na tabela II. A partir destes resultados, é evidente que enquanto os vírus AdApt5.LacZ são neutralizados eficazmente, os vírus AdApt35.LacZ permanecem infecciosos independentemente da presença de soro humano. Tal prova que os vírus com base em Ad35 recombinantes escapam a neutralização em soros humanos que contêm NA para vírus baseados em Ad5.

Exemplo 6

Geração de linhas celulares capazes de complementação de vírus

Ad35 com deleção de El

Geração de pIG135 e pIG270 A construção de pIG.ElA.ElB (figura 13) contem sequências da região El de Ad5 correspondentes a nucleótidos 459 a 3510 da sequência de Ad5 de tipo selvagem (número de acesso Genbank M72360) ligadas operativamente ao promotor de fosfoglicerato quinase humana ("PGK") e sequências poliA de vírus de hepatite B. A geração desta construção encontra-se descrita no pedido de patente internacional N° WO97/00326. As sequências de El de Ad5 foram substituídas pelas sequências correspondentes de Ad35 da seguinte forma. Digeriu-se pRSV.Ad35-El (descrito no exemplo 5) com EcoRI e Sse8387I e isolou-se do gel o fragmento de 3 kb correspondente às sequências Ad35 El. A construção pIG.ElA.ElB foi digerida com Sse8387I completamente e parcialmente com EcoRI. O fragmento de 4,2 kb correspondente às sequências de vector sem a região Ad5 El mas mantendo o promotor PGK foi separado de outros fragmentos no gel de agarose LMP e excisou-se a banda correcta do gel. Ambos os fragmentos obtidos foram ligados resultando em pIG.Ad35-El.

Este vector foi modificado adicionalmente para remover sequências LacZ presentes no esqueleto do vector pUC119. Para tal, digeriu-se o vector com BsaAI e BstXI e isolou-se o 36

ΕΡ 1 349 926 /PT fragmento grande do gel. Preparou-se um oligonucleótido em cadeia dupla por hibridação dos seguintes dois oligonucleótidos: 1BB1: 5'-GTG CCT AGG CCA CGG GG-3' (SEQ ID N°_) e 2BB2: 5'-GTG GCC TAG GCA C-3'. (SEQ ID N°_) A ligação do oligonucleótido e do fragmento de vector resultou na construção pIG135 (figura 14). A inserção correcta dos oligonucleótidos restabelece os locais BsaAI e BstXI e introduz um local Avrll único. Seguidamente, introduzimos um local único na extremidade 3' da cassete de expressão Ad35-El em pIG135. Para tal, digeriu-se a construção com SapI e tornaram-se planas as extremidades 3' salientes por tratamento com T4 ADN polimerase. 0 plasmídeo linear assim tratado foi digerido adicionalmente com BsrGI e isolou-se do gel o fragmento contendo o vector grande. Para restabelecer a extremidade 3' da sequência HBVpoliA e para introduzir um local único, gerou-se um fragmento de PCR utilizando os seguintes iniciadores: 3270F: 5'- CAC CTC TGC CTA ATC ATC TC -3' (SEQ ID N°_) e 4270R: 5'- GCT CTA GAA ATT CCA CTG CCT TCC ACC -3'. (SEQ ID N°_)

Efectuou-se PCR em ADN de pIG.Ad35.El utilizando polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante. Digeriu-se o produto de PCR obtido com BsrGI e desfosforilou-se utilizando enzima Tsap (LTI), esta última para evitar inserir dimerização no local BsrGI. Ligaram-se o fragmento de PCR e o fragmento de vector para obter a construção pIG270 (figura 15).

As sequências Ad35 El são capazes de transformar células primárias de rato

Sacrificaram-se ratos WAG/RIJ recém-nascidos com 1 semana de gestação e isolaram-se os rins. Após remoção cuidadosa da cápsula, desintegraram-se os rins para uma suspensão de células individuais através de vários ciclos de incubação em tripsina/EDTA (LTI) a 37°C e recolheram-se as células flutuantes em PBS frio contendo FBS a 1%. Quando a maior parte do rim tinha sido tripsinizado, ressuspenderam-se todas as 37

ΕΡ 1 349 926 /PT células em DMEM suplementado com FBS a 10% e filtrou-se através de um gaze estéril. As células de rim de rato bebé (BRK) obtidas de um rim foram plaqueadas em 5 placas (Greiner, 6 cm) . Quando se atingiu uma confluência de 70-80%, transf ectaram-se as células com 1 μg ou 5 μg de ADN/placa utilizando o kit de precipitação de CaP04 (LTI) segundo as instruções do fabricante. Utilizaram-se as seguintes construções em transfecções independentes: pIG.ElA.ElB (que expressa a região Ad5-El), pRSV.Ad35-El, pIG.Ad35-El e pIG270 (que expressam a região Ad35-El). Incubaram-se as células a 37°C, CO2 a 5% até aparecerem focos de células transformadas. A tabela III apresenta o número de focos que resultaram de várias experiências de transfecção utilizando ADN circular ou linear. Tal como esperado, a região Ad5-El transformou eficazmente células BRK. Também apareceram focos na camada celular transfectada com Ad35-El embora com menor eficácia. Os focos transformados com Ad35 apareceram num ponto temporal mais tardio: ~ 2 semanas após a transfecção comparativamente com 7-10 dias para Ad5-El. Estas experiências demonstram claramente que os genes de EI do virus Ad35 do grupo B são capazes de transformar células de roedores primárias. Tal prova a funcionalidade das construções de expressão Ad35-El e confirma as revelações anteriores sobre a capacidade de transformação dos virus Ad3 e Ad7 do grupo B (Dijkema, 1979) . Para ensaiar se as células nos focos foram realmente transformadas, repicaram-se e expandiram-se alguns focos. Dos 7 focos repicados, pelo menos 5 cresceram como linhas celulares estabelecidas.

Geração de novas células de empacotamento derivadas de amniócitos humanos primários

Centrifugou-se o fluido amniótico obtido após amniocentese e ressuspenderam-se células em meio AmnioMax (LTI) e cultivaram-se em frascos de cultura de tecidos a 37°C e CO2 a 10%. Quando as células atingiram crescimento estável (aproximadamente uma divisão celular/24 h) , substituiu-se o meio por uma mistura 1:1 de meio completo AmnioMax e meio de baixa glucose DMEM (LTI) suplementado com Glutamax I (concentração final 4 mM, LTI) e glucose (concentração final 4,5 g/L, LTI) e FBS a 10% (LTI) . Para transfecção, plaquearam-se * 5 x 105 células em placas de cultura de tecidos de 10 cm. No dia seguinte, transfectaram-se as células 38

ΕΡ 1 349 926 /PT com 20 μg de pIG270 circular por placa por utilização do kit de transfecção de CaPC>4 (LTI) seguindo as instruções do fabricante e incubaram-se as células durante a noite com o precipitado de ADN. No dia seguinte, lavaram-se as células 4 vezes com PBS para remover o precipitado e incubaram-se adicionalmente durante três semanas até ao aparecimento de focos de células transformadas. Substituiu-se o meio por meio fresco uma vez por semana. Utilizaram-se outros agentes de transfecção tais como, entre outros, LipofectAmine (LTI) ou PEI (polietilenimina, peso molecular elevado, isenta de água, Aldrich). De entre esses três agentes, a melhor eficácia de transfecção foi obtida com PEI em amniócitos humanos primários: 1% de células azuis em 48 h após transfecção de pAdApt35. LacZ.

Isolaram-se os focos do seguinte modo. Remove-se o meio e substitui-se por PBS após o que se isolam os focos por raspagem suave das células por utilização de uma pipeta Gilson de 50-200 μΐ com uma ponta com filtro descartável.

Colocaram-se as células contidas em * 10 μΐ de PBS numa placa de 96 poços contendo 15 μΐ tripsina/EDTA (LTI) e obteve-se uma suspensão de células individuais pipetando para cima e para baixo seguido de uma curta incubação à temperatura ambiente. Após adição de 200 μΐ da mistura 1:1 descrita supra de meio completo AmnioMax e DMEM com suplementos e FBS a 10%, incubaram-se adicionalmente as células. Os clones que continuaram a crescer foram expandidos e analisados relativamente à sua capacidade de complementar o crescimento de vectores adenovíricos com deleção de EI de diferentes subgrupos, especificamente os derivados de vírus do grupo B e mais especificamente de Ad35 ou Adll.

Geração de novas linhas celulares de empacotamento a partir de células HER

Isolam-se e cultivam-se células HER em meio DMEM suplementado com FBS a 10% (LTI) . No dia anterior à transfecção, plaqueiam-se «5 x 105 células em placas de 6 cm e cultivam-se durante a noite a 37°C e CO2 a 10%. A transfecção é efectuada por utilização do kit de precipitação com CaP04 (LTI) segundo as instruções do fabricante. Cada placa é transfectada com 8-10 μιηρ de ADN pIG270, quer sob a forma de um plasmídeo circular, quer como um fragmento purificado. Para 39

ΕΡ 1 349 926 /PT obter o fragmento purificado, digeriu-se pIG270 com Avrll e Xbal e isolou-se o fragmento de 4 kb correspondente à cassete de expressão Ad35 El a partir do gel por tratamento com agarase (Roche). No dia seguinte, remove-se cuidadosamente o precipitado através de guarto lavagens com PBS estéril. Adiciona-se então meio fresco e cultivam-se adicionalmente as células transfectadas até ao aparecimento de focos de células transformadas. Quando estiverem suficientemente grandes (> 100 células), repicam-se os focos e colocam-se em placas de 96 poços tal como descrito supra. Os clones de células HER transformadas gue continuam a crescer são expandidos e ensaiados relativamente à sua capacidade de complementar o crescimento de vectores adenoviricos com deleção de El de diferentes subgrupos, especificamente os derivados de vírus do grupo B e mais especificamente de Ad35 ou Adll.

Novas linhas celulares de empacotamento derivadas de PER.C6

Tal como descrito no exemplo 5, é possível gerar e crescer vírus Ad35 com deleção de El em células PER.C6 por co-transfecção de uma construção de expressão Ad35-El, por exemplo, pRSV.Ad35.El. Contudo, a produção em larga escala de adenovírus recombinantes por utilização deste método é demorada porgue para cada etapa de amplificação é necessária uma transfecção da construção Ad35-El. Adicionalmente, este método aumenta o risco de recombinação não homóloga entre o plasmídeo e o genoma do vírus com elevadas probabilidades de gerar vírus recombinantes gue incorporam seguências de El gue resultam em vírus competentes para replicação. Para evitar este efeito, a expressão de proteínas Ad35-El em PER.C6 tem gue ser mediada por cópias do plasmídeo de expressão integradas no genoma. Dado gue as células PER.C6 estão já transformadas e expressam proteínas Ad5-El, a adição de expressão Ad35-El adicional pode ser tóxica para as células. Contudo, não é impossível transfectar células transformadas de modo estável com proteínas El dado gue foram geradas células A549 gue expressam Ad5-El.

Numa tentativa de gerar adenovírus recombinantes derivados dos vírus Ad7 do subgrupo B, Abrahamsen et al. (199 7) não foram capazes de gerar vírus com deleção de El em células 293 sem contaminação de Ad7 de tipo selvagem. Mostrou-se que vírus gue foram repicados após purificação em placa em células 293- 40

ΕΡ 1 349 926 /PT ORF6 (Brough et al., 1996) tinham incorporado sequências Ad7 E1B por recombinação não homóloga. Assim, provou ser possível propagação eficaz de vírus Ad7 recombinantes apenas na presença de expressão Ad7-E1B e Ad5-E4-ORF6. Sabe-se que as proteínas E1B interagem com proteínas celulares e víricas (Bridge et al., 1993; White, 1995). Possivelmente, o complexo formado entre a proteína E1B 55K e E4-ORF6 que é necessário para aumentar a exportação de ARNm de proteínas víricas e para inibir a exportação da maioria dos ARNm celulares, é crítico e de certa forma específico de serótipo. As experiências supra sugerem que as proteínas EIA de Ad5 são capazes de complementar uma deleção Ad7-E1A e que a expressão Ad7-E1B em células empacotadoras de adenovírus não é por si só suficiente para gerar uma linha celular de complementação estável. De modo a ensaiar se uma ou ambas as proteínas Ad35-E1B é ou são o factor limitativo para propagação eficaz de vector Ad35 em células PER.C6, geramos um plasmídeo adaptador Ad35 que contém o promotor E1B e sequências E1B mas não contém o promotor e a região de codificação para EIA. Para tal, a extremidade esquerda do ADN de Ad35 de tipo selvagem foi amplificada por utilização dos iniciadores 35F1 e 35R4 (ambos descritos no exemplo 4) com ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante. O produto de PCR de 4,6 kb foi purificado por utilização do kit de purificação de PCR (LTI) e digerido com enzimas SnaBI e Apal. O fragmento resultante de 4,2 kb foi então purificado do gel por utilização do kit QlAExll (Qiagen). Seguidamente, digeriu-se pAdApt35lPl (exemplo 4) com SnaBI e Apal e o fragmento de 2,6 kb contendo o vector foi isolado do gel por utilização do kit GENECLEAN (BIO 101, Inc) . Ambos os fragmentos isolados foram ligados para originar pBr/Ad35.leftITR-pIX (figura 16). A amplificação correcta durante PCR foi verificada por um ensaio de funcionalidade como se segue: digeriu-se o ADN com BstBI para libertar a inserção Ad35 das sequências de vector e co-transfectaram-se 4 μρ deste ADN com 4 μρ de pWE/Ad35.pIX-rITR digerido com Notl (exemplo 4) para células PER.C6. Passaram-se as células transfectadas para frascos T80 no dia 2 e mais uma vez dois dias depois formou-se efeito citopatogénico que demonstra que a nova construção pBr/Ad35.leftITR-pIX contém sequências de EI funcionais. A construção pBr/Ad35.leftITR-pIX foi então adicionalmente modificada como se segue. O ADN foi digerido com SnaBI e HindIII e a sequência saliente HindIII a 41

ΕΡ 1 349 926 /PT 5' foi preenchida por utilização da enzima Klenow. A religação do ADN digerido e transformação para células competentes (LTI) originou a construção pBr/Ad351eftITR-pIXÀDElA (figura 17) . Esta última construção contém a extremidade esguerda de 4,6 kb de Ad35 com excepção das seguências EIA entre os pb 450 e 1341 (numeração de acordo com Ad35 de tipo selvagem, figura 5) e conseguentemente não apresenta o promotor EIA e a maioria das sequências de codificação EIA. Digeriu-se então pBr/Ad35.leftITR-ρΙΧΔϋΕΙΑ com BstBI e co-transfectaram-se 2 μg desta construção com 6 μg de pWE/Ad35.pIX-rITR digerido com Notl (exemplo 4) em células PER.C6. Uma semana após transfecção, formou-se efeito citopatogénico completo nos frascos transfectados.

Esta experiência demonstra que as proteínas Ad35-E1A são complementadas funcionalmente por expressão Ad5-E1A em células PER.C6 e que pelo menos uma das proteínas Ad35-E1B não pode ser complementada por expressão Ad5-El em PER.C6. Demonstra adicionalmente que é possível produzir uma linha celular de complementação para vírus Ad35 com deleção de EI através de expressão de proteínas Ad35-E1B em PER.C6. A expressão estável de sequências Ad35-E1B a partir de cópias integradas no genoma de células PER.C6 pode ser dirigida pelo promotor E1B e terminada por um sinal de poliadenilação heterólogo, tal como, entre outros, a de HBVpA. O sinal pA heterólogo é necessário para evitar sobreposição entre a inserção E1B e o vector recombinante dado que a terminação E1B natural se localiza na unidade de transcrição pIX que tem que se encontrar presente no vector adenovírico. Alternativamente, as sequências E1B podem ser dirigidas por um promotor heterólogo, tal como, entre outros, o promotor PGK humano ou por um promotor indutível, tal como, entre outros, o promotor 7xtetO (Gossen e Bujard, 1992). Igualmente, nestes casos, a terminação de transcrição é mediada por uma sequência pA heteróloga, por exemplo, a HBVpA. As sequências Ad35-E1B incluem pelo menos uma das regiões de codificação das proteínas E1B 21K e E1B 55K localizadas entre os nucleótidos 1611 e 3400 da sequência de Ad35 de tipo selvagem. A inserção pode também incluir (parte das) sequências Ad35-E1B entre os nucleótidos 1550 e 1611 da sequência de Ad35 de tipo selvagem. 42

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Exemplo 7 Vírus baseados em Ad35 com deleção dos genes EIA e E1B-21K propagam-se eficazmente em linhas celulares de complementação de Ad5 A geração de vírus baseados em Ad35 que se encontram eliminados para EIA e retêm a região E1B completa é descrita no exemplo 6 do presente pedido. Tais vírus podem ser gerados e propagados na linha celular PER.C6 de complementação de Ad5. A região E1B inclui sequências de codificação parcialmente sobrepostas para as duas proteínas principais 21K e 55K (Bos et al., 1981). Enquanto que, durante a infecção produtiva de adenovírus de tipo selvagem tanto 21K como 55K estão envolvidas na anulação dos efeitos indutores de apoptose de proteínas EIA, tem sido sugerido que a proteína E1B 55K tem funções adicionais durante a fase tardia da infecção vírica. Tais incluem a acumulação de ARNm víricos, o controlo de expressão génica vírica tardia e o cancelamento da maioria dos ARNm do hospedeiro ao nível do transporte de ARNm (Babiss et al., 1984, 1985; Pilder et al., 1986). Um complexo formado entre E1B-55K e a proteína 0RF6 codificada pela região precoce 4 do adenovírus (Leppard e Shenk, 1989; Bridge e Ketner, 1990) exerce pelo menos parte destas funções. A fim de analisar qual das proteínas E1B é necessária para propagação de vírus Ad35 recombinantes com deleção EIA em células de empacotamento PER.C6, eliminou-se adicionalmente a região E1B na construção pBr.Ad35.leftITR-pIXÁElA (consultar exemplo 6 e figura 17). Uma primeira construção, pBr.Ad35Á21K, retém a sequência E1B-55K completa e apresenta deleção para EIA e E1B-21K. Para tal, digeriu-se pBr.Ad35.leftITR-pIXÁElA com Ncol e BspEl e isolou-se o fragmento de vector de 5 KB do gel de agarose por utilização do kit GENECLEAN (BIO 101, Inc.) segundo as instruções do fabricante. Seguidamente gerou-se um fragmento de PCR com pBr.Ad35.leftITR-ρΙΧΔΕΙΑ como ADN molde por utilização dos seguintes iniciadores: 135D21: 5'- TTA GAT CCA TGG ATC CCG CAG ACT C-3' (SEQ ID N° _) e 235B3: 5'- CCT GAG CCC CAT TTC CAG-3' (SEQ ID N° _). 43

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Efectuou-se amplificação por utilização de ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as recomendações do fabricante com a adição de DMSO (concentração final de 3%) na mistura reaccional. 0 programa de PCR foi como se segue: 94°C durante 2', seguido de 30 ciclos de 94°C durante 30' ', 58°C durante 30'' e 72°C durante 45'' e uma etapa final a 68°C durante 8' para assegurar extremidades planas.

Esta PCR amplifica sequências Ad35-E1B desde os nucleótidos 1908 a 2528 (sequência Ad35, figura 5) e introduz um local Ncol no codão de iniciação da sequência de codificação E1B-55K (a negrito no iniciador 35D21). Purificou-se o fragmento de PCR de 620 pb por utilização do kit de purificação de PCR (Qiagen) e seguidamente digeriu-se com Ncol e BspEI, purificou-se de gel de agarose como supra e ligou-se ao fragmento de vector digerido com NcoI/BspEl descrito supra para originar pBr.Ad35À21K (figura 18).

Dado que as regiões de codificação das proteínas 21K e 55K se sobrepõem, é apenas possível eliminar parte das sequências de codificação 55K enquanto se retém 21K. Para tal, digeriu-se pBr.Ad35.leftITR-pIX.ΔΕ1Α com BglII e religou-se o fragmento de vector para obter pBr.Ad35À55Kl (figura 19). Esta deleção remove sequências de codificação E1B dos nucleótidos 2261 a 3330 (sequência Ad35 na figura 5). Nesta construção mantêm-se os 115 aminoácidos N-terminais e fundem-se a 21 aminoácidos adicionais fora do quadro de leitura aberta adequado antes de aparecer um codão de terminação. A região de codificação 21K encontra-se intacta na construção pBr.Ad35À55Kl.

Foi gerada uma terceira construção que apresenta uma deleção de EIA, 21K e a maioria das sequências 55K do seguinte modo. Digeriu-se pBr.Ad35.leftITR-pIX (figura 16) com SnaBI e Mfel (isoesquizómero de Muni) e a extremidade saliente a 5' resultante da digestão com Mfel foi preenchida por utilização da enzima Klenow. Isolou-se o fragmento de vector de 4,4 kb do gel por utilização do kit GENECLEAN (BIO 101, Inc.) segundo as instruções do fabricante e religou-se para originar a construção pBr.Ad35ÀSM (figura 20). Nesta construção, as sequências Ad35 entre os nucleótidos 453 e 2804 encontram-se eliminadas. Assim, retêm-se 596 nucleótidos da extremidade 3' de Elb-55K. Efectuou-se uma deleção adicional de sequências 44

ΕΡ 1 349 926 /PT 55Κ na construção pBr. Αο135ΔΕ1Α.ΔΕ1Β por digestão de pBr. Ad35.leftITR-pIX com SnaBI e BglII, tratamento com Klenow para preencher as extremidades coesivas BglII e religação. A figura 21 apresenta uma representação esquemática das construções supra mencionadas.

De modo a ensaiar se os vírus baseados em Ad35 podem ser gerados com estas construções, cada uma das construções foi co-transfectada com pWE.Ad35pIX-rITR digerido com Notl (consultar exemplo 4) para células PER.C6. Para tal, os fragmentos respectivos foram amplificados por PCR por utilização de iniciadores 35F1 e 35R4 (consultar exemplo 4). Esta amplificação por PCR foi efectuada dado que algumas das construções foram difíceis de isolar em quantidades suficientemente elevadas. Deste modo, assegurou-se uma

qualidade equivalente para os diferentes fragmentos de adaptador. Para a amplificação, utilizou-se ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante mas com DMSO (concentração final de 3%) adicionado à mistura de PCR. Utilizaram-se 50 ng de ADN de cada molde. As condições para a PCR foram as seguintes: 94°C durante 2', seguido de 5 ciclos de 94°C durante 30'', 48°C durante 45' ' e 72°C durante 4' seguido de 25 ciclos de 94°C durante 30''', 60°C durante 30'' e 72°C durante 4' e uma etapa final de 68°C durante 8'.

Geraram-se fragmentos de PCR a partir de pBr.Ad351eftlTR-pIX, pBr.Ad35.leftITR-ρΙΧΔΕΙΑ, pBr.Ad35A21K, pBr.Ad35A55Kl, pBr.Ad3 5ÀSM e pBr.Ad35AElAAElB. Purificaram-se todos os fragmentos por utilização do kit de purificação de PCR (Qiagen) segundo as instruções do fabricante e estimaram-se concentrações finais em géis de agarose corados com EtBr por utilização do sistema de vídeo Eagle Eye II Still e utilitário EagleSight (Stratagene) utilizando o marcador de peso molecular SmartLadder (Eurogentec) como referência. Inocularam-se células PER.C6 a uma densidade de 2,5 x 106 células num frasco de cultura T25 em DMEM contendo soro de vitelo fetal (FCS) a 10% e MgS04 10 mM e cultivaram-se numa estufa humidificada a 37°C, CO2 a 10%. No dia seguinte, co-transfectaram-se 3 mg de cada um dos fragmentos de PCR com 5 μg de pWE.Ad35pIX-rITR digerido com Notl por utilização de LipofectAmine (GIBCO, Life Technologies Inc.) segundo as instruções do fabricante. Dois dias após a transfecção, 45

ΕΡ 1 349 926 /PT passaram-se todas as células para um frasco T80 e cultivaram se adicionalmente. Monitorizaram-se então as culturas relativamente ao aparecimento de efeito citopatogénico. De acordo com o resultados de experiências anteriores descritas nos exemplos 4 e 6, pBr.Ad35.leftITR-pIX e pBr.Ad35.leftITR-ρΙΧΔΕΙΑ apresentaram efeito citopatogénico praticamente completo uma semana após transfecção. Dos fragmentos com diferentes deleções E1B, apenas pBr.Ad35Á21K apresentou efeito citopatogénico ao mesmo tempo que os dois fragmentos supra. As construções pBr.Ad35Á55Kl, pBr.Ad35ÀSM e pBr.Ad35AElAÀElB não apresentaram qualquer efeito citopatogénico, nem mesmo depois de recolha por congelamento-descongelamento e reinfecção do lisado em bruto para células PER.C6 frescas.

Destas experiências, pode concluir-se que Ad35-E1B-55K, e não E1B-21K, é necessária para a geração e propagação de vírus baseados em Ad35 em linhas celulares que complementam Ad5. Consequentemente, os vírus baseados em Ad35 apresentando uma deleção dos genes EIA e E1B 21K e apresentando o gene E1B-55K ou um fragmento funcional derivado, podem ser cultivados em linhas celulares que complementam Ad5. Alternativamente, os vírus baseados em Ad35 podem ser cultivados em células PER.C6 que expressam de modo estável a região E1B completa ou o gene E1B-55K ou um fragmento funcional derivado. 0 gene Ad35 E1B-55K ou partes funcionais derivadas, pode ser expresso a partir de um promotor heterólogo tal como, entre outros, o promotor PGK humano, o promotor precoce imediato de citomegalovírus humano (CMV) , promotor do vírus do sarcoma de Rous, etc., e terminado por uma sequência de poliadenilação (PA) heteróloga tal como, entre outras, a sequência de poliadenilação do vírus da hepatite B (HBVpA) e a sequência de poliadenilação do vírus símio 40 (SV40pA), etc. Constituem exemplos não limitativos, células PER.C6 que expressam a região Ad35-E1B dirigida pelo promotor E1B e HBVpA, células PER.C6 que expressam a região Ad35-E1B dirigida pelo promotor PGK humano e HBVpA e células PER.C6 que expressam um fragmento funcional de Ad35 E1B-55K dirigido pelo promotor PGK humano e HBVpA, tal como descrito infra. 46

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Geração de pIG35BL e pIG35BS

Descrevemos a geração de duas construções de expressão, pIG.35BS e pIG.35BL, transportando ambas os genes Ad35-E1B e um marcador de selecção de neomicina. As duas construções diferem no tamanho do fragmento contendo o promotor E1B. Em 3 5BL, o fragmento de promotor é mais longo e inclui a extremidade 3' da região EIA (sequência de codificação de 103 nucleótidos e pA). A região E1B é terminada pela HBVpoliA e o gene neor é dirigido por uma cassete de promotor hPGK/HBVpA. pIG.35BL foi produzido do seguinte modo. Digeriu-se a construção pRSV.Ad35El (descrita no exemplo 5, figura 9) com NruI e HindIII e as extremidades protuberantes foram preenchidas por tratamento com Klenow. Separou-se o fragmento de vector de 7 kb do fragmento mais pequeno no gel e isolou-se por utilização do kit GENECLEAN (BIO 101, Inc.). Após religação do ADN e transformação para células STBL2 competentes (Gibco, LTI), isolaram-se clones correctos. pIG.35BL (figura 22) contém 273 nucleótidos a montante do local de iniciação da região de codificação E1B-21K. pIG.35BS foi produzido do mesmo modo que pIG.35BL com a excepção de pRSV.Ad35El ter sido digerido com NruI e Hpal (ambas as enzimas geram extremidades planas), resultando num fragmento mais curto a montante da região de codificação de E1B-21K: 97 nucleótidos.

De modo a gerar células que expressam Ad35-E1B, inocularam-se células PER.C6 em placas de 10 cm a 1 x 106 células/placa. Dois dias mais tarde, transfectaram-se células com construções linearizadas Seal. Transfectaram-se quatro placas com 1 μρ de ADN e quatro com 2 μρ de ADN (total de 16 placas; Lipofectamina (Gibco, LTI), não se utilizou ADN transportador) segundo as instruções do fabricante. No dia seguinte, as células transfectadas receberam meio contendo G418 (0,75 mg/ml). Coraram-se transfecções de controlo utilizando construções de expressão LacZ (2 μρ) após 48 h e apresentaram uma eficácia de transfecção de * 25%. Quatro dias após adição do meio de selecção, as células não transf ectadas começaram a morrer e mais uma vez, três dias mais tarde, os clones estavam a tornar-se visíveis. Uma semana mais tarde 47

ΕΡ 1 349 926 /PT repicaram-se os primeiros clones. A transfecção com 1 μρ resultou em menos clones e que inicialmente eram mais pequenos (total de «20 clones/placa contra >50 clones/placa para a transfecção com 2 μg de ADN) . A transfecção de controlo positivo utilizando 2 μg de pcDNA3 (Invitrogen) resultou em «50 clones.

No total, repicaram-se 120 clones e 107 foram estabelecidos com sucesso (55 de pIG35BS e 52 de pIG35BL).

Geração de pIG35Bneo pIG35Bneo é um plasmideo de expressão Ad35-E1B a partir do qual se expressam os genes E1B utilizando um promotor heterólogo (hPGK) e que também contém uma cassete de expressão de resistência à neomicina. De modo a evitar instabilidade do plasmideo devido a eventos de recombinação em sequências homólogas, o promotor RSV dirige o gene neor. Com este objectivo, digeriu-se a construção pRSVhbv.Neo (descrita no exemplo 5, figura 12) com Seal e BamHI e as extremidades protuberantes foram preenchidas por utilização de enzima Klenow. Isolou-se o fragmento de 1070 pb contendo parte do gene de ampicilina e o promotor RSV a partir do gel por utilização do kit GENECLEAN (BIO 101, Inc.). Seguidamente, digeriu-se pRSVhbvNeo com Seal e EcoRI, estabeleceram-se extremidades planas com Klenow e isolou-se o fragmento de 3,2 kb contendo o gene neo, HBVpA, vector e parte do gene de ampicilina, tal como descrito supra. Ligaram-se então os dois fragmentos para produzir pRSVneo4 (figura 23). Digeriu-se então a construção pIG270 (figura 15, descrita no exemplo 6) com EcoRI e Ncol e tornaram-se planas as extremidades coesivas com enzima Klenow. Isolou-se o fragmento contendo o vector a partir do gel tal como descrito supra e religou-se para originar pIG270delElA. Digeriu-se esta construção com Avrll e Xbal e as extremidades protuberantes foram preenchidas por utilização de enzima Klenow. Isolou-se o fragmento de 2,9 kb contendo as sequências de promotor HPGK e de Ad35-E1B a partir do gel tal como descrito supra. Seguidamente, digeriu-se pRSVneo4 com BglII, tornaram-se as extremidades planas com enzima Klenow, desfosforilou-se e isolou-se do gel. Ligou-se então o fragmento Avrll/Xbal Ad35-E1B com extremidades planas com o fragmento de vector pRSVneo4 preparado supra e analisaram-se os clones resultantes. Escolheu-se um clone que 48 ΕΡ 1 349 926 /PT continha ambas as cassetes de expressão na mesma orientação e denominou-se pIG35Bneo (figura 24). A análise detalhada deste clone revelou que se encontrava presente um local BglII extra, provavelmente devido a uma reacção de Klenow incompleta (local BglII no nucleótido 2949 na figura 24).

Geração de pIG35.55K A construção pIG35.55K é semelhante a pIG35Bneo, contudo, não apresenta a região de codificação de Ad35.E1B-21K. Para tal, tanto as sequências EIA como E1B-21K são primeiramente eliminadas de pIG270 de seguinte modo:

Digeriu-se a construção pIG270 com EcoRI, tratou-se com enzima Klenow e purificou-se por utilização de um kit de purificação de PCR (Qiagen) segundo as instruções do fabricante. Digeriu-se então o ADN recuperado com Agel e isolou-se o fragmento de vector de * 5 kb a partir do gel como supra. Seguidamente, amplificam-se sequências Ad35 E1B-55K por PCR em molde de ADN de pIG270 por utilização dos seguintes iniciadores: 535D21: 5'- TTA GAT CCA TGG ATC CCG CAG ACT C-3' (SEQ ID N° _) e 635B3: 5'- CCT CAG CCC CAT TTC CAG-3' (SEQ ID N° _).

As condições utilizadas para a amplificação são como previamente descrito. Purifica-se o fragmento de PCR por utilização do kit de purificação de PCR (Qiagen) e digere-se com Ncol. Após tratamento com Klenow para preencher as extremidades protuberantes, o ADN é digerido adicionalmente com Agel e mais uma vez purificado em coluna. 0 fragmento de PCR assim tratado é então clonado no fragmento de vector digerido com EcoRI/Agel preparado supra para originar pIG270.ΔΕ1ΑΔ21Κ. As últimas etapas para obter pIG35.55K (figura 25) são equivalentes às últimas etapas descritas supra para a geração de pIG35Bneo, partindo de pIG270..ΔΕ1ΑΔ21Κ em vez de pIG270..ΔΕ1Α. pIG35.55K é então linearizado com Seal e utilizado para transfectar células PER.C6 como descrito supra. Repicam-se os clones que são resistentes a selecção G418 e analisam-se 49 ΕΡ 1 349 926 /PT relativamente à sua capacidade de complementar a propagação de vírus Ad35 com deleção de Ei.

Exemplo 8

Novas linhas celulares de empacotamento para a geração e propagação de vectores baseados em Ad35 com deleção de EI derivadas de células primárias humanas. A transformação morfológica completa de células primárias por genes de EI de adenovírus é o resultado das actividades combinadas das proteínas codificadas pelas regiões EIA e E1B. Os papéis das diferentes proteínas EI na infecção lítica e na transformação têm sido extensivamente estudados (revisto em Zantema e van der Eb, 1995; White, 1995, 1996). As proteínas EIA de adenovírus são essenciais para a transformação de células primárias. As proteínas EIA exercem este efeito através de interacção directa com várias proteínas celulares gue estão envolvidas na regulação de transcrição. Estas incluem a família de proteínas pRB, p300/CBP e proteína de ligação a TATA. Além disso, EIA aumenta o nível da proteína p53 nas células. Na ausência de actividade E1B de adenovírus, o aumento do níveis de p53 leva à indução de apoptose. Ambas as proteínas codificadas pela região E1B cancelam a indução de apoptose, apesar de utilizarem mecanismos diferentes. E1B-21K parece cancelar apoptose de um modo semelhante a Bcl-2 através de interacção com proteínas efectoras a jusante da via de apoptose (Han et al., 1996), enquanto que E1B-55K funciona através de interacção directa com p53. De modo importante, o mecanismo molecular pelo qual as proteínas E1B-55K de Ad2 e Ad5 (subgrupo C) e Adl2 (subgrupo A) funcionam na capacidade de neutralizar p53 pode ser diferente. Enquanto que Ad5 E1B-55K liga p53 fortemente e o complexo localiza-se no citoplasma, Adl2 E1B-55K liga p53 fracamente e ambas as proteínas se localizam no núcleo (Zantema et al., 1985; Grand et al., 1999). Contudo, ambas as proteínas inibem a transactivação de outros genes por p53 (Yew e Berk, 1992) .

Em células de roedores, a actividade de EIA, conjuntamente quer com E1B-21K quer com E1B-55K é suficiente para transformação completa apesar da expressão simultânea de ambas as proteínas E1B ter o dobro da eficácia (Rao et al., 1992;). Contudo, em células humanas, a actividade da proteína E1B-55K 50

ΕΡ 1 349 926 /PT parece ser mais importante tendo em conta a observação que E1B-55K é indispensável para o estabelecimento de células transformadas (Gallimore, 1986). O exemplo 6 incluído descreve a geração de pIG270. Nesta construção, os genes Ad35-El são expressos a partir do promotor hPGK e a transcrição é terminada pela HBVpA. O promotor hPGK constitui um fragmento HincII-EcoRI da sequência de promotor descrita por Singer-Sam et al. (1984). A HBVpA localiza-se no fragmento BamHI-BglII do genoma do vírus da hepatite B (Simonsen e Levinson, 1983; consultar igualmente Genbank HBV-AF090841). Tal como mencionado supra, as sequências de promotor e de poliadenilação das construções de expressão de EI descritas no presente invento podem ser derivadas a partir de outras fontes sem afastamento do invento. Podem igualmente ser utilizados outros fragmentos funcionais das sequências hPGK e HBVpA mencionadas supra. A funcionalidade de pIG270 foi demonstrada por transformação de células primárias de rim de rato bebé (BRK). A comparação com uma construção de expressão Ad5-El equivalente revelou que os genes Ad35-El eram menos eficazes na transformação dessas células. O mesmo foi revelado para os genes de EI de Adl2 (Bernards et al., 1982). Não é claro qual/quais a(s) proteína(s) EI que determina(m) a diferença na eficácia da transformação de sequências de EI observadas para adenovírus de diferentes subgrupos. No caso de Adl2, estudos de transfecção com genes E1A/E1B quiméricos sugeriram que a eficácia da transformação de células BRK era determinada pelas proteínas EIA (Bernards et al., 1982) . Demonstra-se infra que a proteína E1B-55K contém funções específicas do serótipo necessárias para complementação de adenovírus com deleção de El. Se estas funções estão relacionadas com a regulação da distribuição de ARNm ou com outra função vírica tardia, é pouco provável que estas se encontrem envolvidas na eficácia da transformação. A análise dos domínios funcionais nas proteínas E1B-55K de Ad2 ou Ad5 por utilização de mutantes de inserção revelou que as funções relacionadas com replicação vírica, síntese tardia de proteínas e cancelamento de proteínas do hospedeiro não se encontram limitadas a domínios específicos mas encontram-se 51

ΕΡ 1 349 926 /PT distribuídas ao longo da proteína (Yew et al., 1990). Por utilização do mesmo conjunto de mutantes, os domínios importantes para a interacção com p53 e E4-Orf6 revelaram ser mais restritos. Adicionalmente a uma região de ligação comum (aminoácidos 262 a 326), a ligação de p53 foi afectada por mutações no aminoácido 180 e a ligação de E4-Orf6 foi afectada por mutações no aminoácido 143 (Yew e Berk, 1992; Rubenwolf et al., 1997).

Conjuntamente, estes resultados indicam que é difícil separar as funções E1B-55K relacionadas com transformação (ligação de p53) e síntese tardia de proteínas (ligação de Orf6). O invento revela novas construções de EI que combinam a elevada eficácia de transformação de um serótipo com a função de complementação específica do serótipo de outro serótipo. Estas novas construções são utilizadas para transformar células de retinoblasto embrionárias humanas primárias e amniócitos humanos. A geração de pIG535, pIG635 e pIG735 A construção pIG535 contém a região Ad5 EIA e sequências de promotor E1B ligadas às sequências Ad35 E1B. Para tal, digeriu-se pIG270 (figura 15; consultar exemplo 6) com EcoRI e Ncol. O fragmento de vector de 5,3 kb foi então isolado do gel por utilização do kit GENECLEAN (BIO Inc. 101) segundo as instruções do fabricante. Seguidamente, digeriu-se a construção pIG.ElA.ElB (figura 13; consultar exemplo 6) com EcoRI e Xbal e isolou-se o fragmento de 890 pb resultante como supra. Gerou-se um terceiro fragmento por amplificação por PCR em pIG.ElA.ElB por utilização dos seguintes iniciadores: 15E1A-F: 5'- GAG ACG CCC GAC ATC ACC TG -3' (SEQ ID N° ) e 25E1B-R: 5'- CAA GCC TCC ATG GGG TCA GAT GTA AC -3' (SEQ ID N° ).

Utilizou-se o seguinte programa de PCR: 94°C durante 2' seguido de 30 ciclos a 94°C durante 30'', 60°C durante 30” e 72°C durante 1' e a uma etapa final a 72°C durante 10' para assegurar extremidades planas. 52

ΕΡ 1 349 926 /PT

Digeriu-se o fragmento de PCR resultante de 400 bp com Xbal e Ncol. Após isolamento do gel como supra, ligaram-se os três fragmentos e transformaram-se para bactérias STBL-2. Seleccionou-se uma colónia contendo todos os três fragmentos na ordem correcta e designou-se por pIG535 (figura 26). A construção pIG635 contém a Ad5 EIA e uma região quimérica Ad5-Ad35 E1B de modo a que a sequência 21K é essencialmente de Ad5 e ligada às sequências Ad35 E1B-55K desde que não se sobreponha às sequências 21K. Primeiramente, parte das sequências Ad5 EI são amplificadas por PCR por utilização de pIG.ElA.ElB como molde e os seguintes iniciadores: 45AK: 5'-GAG CGA AGA AAC CCA TCT GAG-3' (SEQ ID N° _) e 52155R: 5'-GGT CCA GGC CGG CTC TCG G-3' (SEQ ID N° _). A amplificação é obtida com ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante. Os fragmentos de 210 pb são então purificados das sequências de iniciadores por utilização do kit de purificação de PCR (Qiagen).

Amplifica-se um segundo fragmento de PCR a partir do ADN de pIG270 tal como descrito supra mas com os seguintes iniciadores: 62155F: 5'- CCG AGA GCC GGC CTG GAC -3' (SEQ ID N° _) e 735F10: 5'- GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG -3' (SEQ ID N° _).

Purifica-se o fragmento amplificado de 1,3 kb como supra e mistura-se numa razão molar 1:1 com o primeiro fragmento de PCR. Sujeita-se então a mistura primeiramente a uma reacção de PCR sem adição de iniciadores por utilização de ADN polimerase Pwo e o seguinte programa: 94°C durante 2' e seguidamente 5 ciclos de 94°C durante 30'', 60°C durante 30'', 72°C durante

90''. Subsequentemente, adicionaram-se iniciadores 5AK e 35F10 a uma concentração de 0,6 μΜ após o que uma última PCR amplifica um fragmento de 1,5 kb. Para tal, a temperatura foi estabelecida como se segue: 94°C durante 2', seguidamente 30 ciclos de 94°C durante 30'', 60°C durante 30'' e 72°C 53

ΕΡ 1 349 926 /PT durante 90'', seguido de uma etapa final a 72°C durante 10' para assegurar extremidades planas. O produto resultante é purificado por utilização do kit de purificação de PCR (Qiagen) tal como supra e digerido com Kpnl e Sbfl (isoesquisómero de Sse8387I). Isolou-se então o ADN digerido do gel por utilização do kit geneclean (BIO Inc., 101). Digere-se a construção pIG.ElA.ElB com Kpnl e Sbfl e isola-se o fragmento contendo o vector a partir do gel como supra. Liga-se então este fragmento ao produto de PCR final preparado supra e a mistura de ligação é transformada para células STBL-2 (Gibco, LTI) segundo as instruções do fabricante. Este procedimento fornece a construção pIG635 (figura 27).

Na construção pIG735, a fronteira entre sequências derivadas de Ad5 e sequências derivadas de Ad35 localiza-se mais a 3' do que na construção pIG635. Primeiramente, introduz-se um local BspEI na sequência Ad5 da construção pIG.ElA.ElB sem alterar a sequência de aminoácidos. Para tal, amplificam-se sequências Ad5 de pIG.ElA.ElB por utilização dos seguintes iniciadores de PCR:

5AK: consultar supra e Bsp-R: 5'-GCT CTA GAC CTG CAG GGT AGC AAC AAT TCC GGA TAT TTA CAA G-3' (SEQ ID N° _). Obtém-se amplificação por utilização de ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante. Utilizou-se o seguinte programa de PCR: 94°C durante 2' seguido por 30 ciclos de 94°C durante 30", 60°C durante 30'' e 72°C durante 30'' e uma etapa final a 72°C durante 10' para assegurar extremidades planas. Purifica-se o fragmento de 0,6 kb resultante como supra e digere-se com Kpnl e Sbfl e liga-se ao fragmento de vector pIG.ElA.ElB digerido com Kpnl/Sbfl. A selecção de colónias após transformação de bactérias STBL-2 (Life Techn. Inc.) origina a construção pIG.ElA55K. pIG.ElA55K é seguidamente digerido com Sbfl e parcialmente com BspEI. Isola-se então o fragmento de vector de 6,4 kb digerido com BspEI e parcialmente digerido com Sbfl do gel por utilização do kit geneclean (BIO 101, Inc.). Seguidamente, digere-se pIG270 com BspEI e Sbfl e o fragmento de 915 pb resultante é isolado do gel como supra. Este fragmento é então ligado ao fragmento de vector pIG.ElA55K digerido com BspEI e parcialmente com Sbf preparado supra e transformado para células competentes STBL-2. Este processo origina a construção 54 ΕΡ 1 349 926 /PT pIG735 (figura 28). Analisam-se clones por digestão com enzimas de restrição e sequencia-se para assegurar ligação correcta dos fragmentos. As construções pIG535, pIG635 e pIG735 podem ser utilizadas para gerar linhas celulares de complementação a partir de células humanas primárias tal como descrito no exemplo 6.

Exemplo 9

Linhas celulares de complementação baseadas em PER.C6 para vírus Ad35 com deleção de El

Inocularam-se células PER.C6 em placas de cultura de 10 cm a uma densidade de 3 x 106 células/placa em DMEM (Gibco BRL) complementado com FBS (Gibco BRL) até 10% e MgCl2 10 mM (solução-mãe a 4,9 M, Sigma). Dois dias depois, transfectaram-se 9 placas com 1 μρ de ADN de pIG35.55K linearizado com Seal (consultar exemplo 7) e transfectaram-se 9 placas com 1,5 μρ de ADN de pIG35.55K linearizado com Seal. Transfectaram-se placas de controlo independentes com 1 μρ ou 1,5 μρ de pAdApt35.LacZ linearizado com Seal para monitorizar a eficácia da transfecção e com 1 μρ ou 1,5 μρ de pcDNA.nlsLacZ linearizado com Seal. pcDNA.nlsLacZ é um plasmideo baseado em pcDNA3 (Invitrogen) com o gene nlsLacZ (Bonnerot et al. , 1987) dirigido pelo promotor CMV. pcDNA.nlsLacZ contém igualmente uma cassete de expressão neor. Como controlo negativo, transfectou-se uma placa adicional com pAdApt35.LacZ linearizado, uma construção isenta do gene de selecção neor. Efectuaram-se todas as transfecções com o kit de transfecção LipofectAmine (Invitrogen/Life Technologies) segundo as instruções do fabricante por utilização de 5 ml de reagente LipofectAmine por μρ de ADN. Incubaram-se as células durante 4 h com a mistura de transfecção após o que se substituiu o meio com meio de cultura PER.C6. No dia seguinte o meio foi substituído por meio de cultura contendo 0,5 mg/ml de G418 (Gibco BRL) excepto nas duas placas que foram transfectadas com 1 μρ ou 1,5 μρ de pAdApt35. LacZ. Estas últimas placas foram utilizadas para monitorizar a expressão de LacZ dois dias após a transfecção. Após coloração com X-gal dessas culturas, a eficácia da transfecção foi estimada a aproximadamente 40% com ligeiramente mais células azuis nas placas transfectadas com 1,5 μρ de ADN. O meio de selecção foi 55

ΕΡ 1 349 926 /PT renovado duas vezes por semana nas restantes placas transfectadas. No prazo de duas semanas após a primeira adição de meio de selecção, a maioria das células da placa de controlo negativo (transfectadas com 1,5 μρ de pAdApt35.LacZ) morreram. Nas placas transfectadas com pcDNA.nlsLacZ tornaram-se visíveis clones de células. Dado que as células transfectadas com pIG35.55K pareceram ser mais resistentes a G418, a concentração foi aumentadas para 0,75 mg/ml 3 semanas após a transfecção. Três e sete dias depois repicaram-se um total de 196 clones de células das placas transfectadas com pIG35.55K e inocularam-se em poços independentes de placas de 96 poços.

Trataram-se com tripsina as células remanescentes após repicagem de colónias de duas placas de 10 cm da transfecção com 1 μρ de ADN de pIG35.55K, juntaram-se e expandiram-se para originar o conjunto PER55K(1.0). efectuou-se o mesmo procedimento para duas placas da transfecção com 1,5 μρ. O conjunto de células PER55K(1.0) foi expandido e inoculado em 4 frascos T25 a uma densidade de 3,5 x 106 células/frasco para transfecção para ensaiar a geração de vírus. Adicionalmente, inocularam-se 3 frascos T25 com células PER.C6 parentais à mesma densidade. Digeriu-se pAdApt35.eGFP (um plasmídeo adaptador contendo a proteína fluorescente verde como gene marcador; consultar exemplo 4) com PacI para libertar as sequências adenovíricas do esqueleto de plasmídeo. Digeriu-se pWE.Ad35.ρΙΧ-rITR (consultar exemplo 4) com Notl para libertar as sequências adenovíricas do esqueleto de cosmídeo. Transfectaram-se 2 frascos com células PER.C6 e 2 frascos com células PER55K(1.0), cada um com 2 μρ de pAdApt35.eGFP digerido e 6 μρ de pWE.Ad35.ρΙΧ-rITR digerido. Transfectou-se um frasco de cada linha celular com 8 μρ de pAdApt35.LacZ para monitorizar a eficácia da transfecção. O frasco remanescente com células PER55K(1.0) serviu como controlo negativo e foi tratado como os outros mas não recebeu a mistura de transfecção. Todas as transfecções foram efectuadas com LipofectAmine (Invitrogen/Life Techn.) segundo as instruções do fabricante utilizando para cada transfecção um total de 8 μρ de ADN e 40 μΐ de reagente Lipof ectAmine. A mistura de transfecção foi removida após 4 h de incubação e adicionou-se meio de cultura fresco. As transfecções foram efectuadas no 56 ΕΡ 1 349 926 /PT dia após inoculação das células e novamente dois dias depois. As células nos frascos T25 foram transferidas para um frasco T80 com excepção dos controlos de transfecção LacZ. Estes foram coradas com solução X-gal após fixação suave. Após cinco horas de incubação com solução corante, a percentagem de células azuis foi estimada a aproximadamente 90% em ambos os frascos o que demonstra que a transfecção decorreu bem para ambas as linhas celulares. Quatro dias após a passagem para os frascos T80 as culturas PER55K(1.0) transfectadas apresentaram inicio de efeito citopatogénico indicativo de replicação virica com aproximadamente 100 eventos/frasco. As células PER55K(1.0) não transfectadas foram cultivadas até confluência sem qualquer evidência de efeito citopatogénico. Nas culturas PER.C6 transfectadas apenas foram visíveis três eventos de efeito citopatogénico na monocamada confluente de células. Novamente três dias depois, as culturas PER55K(1.0) transfectadas apresentaram efeito citopatogénico completo com todas as células arredondadas e destacadas em cachos. Contrariamente, nas culturas PER.C6 os poucos eventos de efeito citopatogénico não tinham progredido e as células encontravam-se ainda em monocamada. Esta observação confirma observações anteriores de que a geração de vírus baseados em Ad35 com deleção de EI em PER.C6 é muito ineficaz. Igualmente as culturas PER55K(1.0) não transfectadas apresentaram, tal como esperado, uma monocamada confluente sem qualquer efeito citopatogénico. Recolheram-se as células e o meio nos frascos PER55K(1.0) com efeito citopatogénico completo e sujeitaram-se a dois ciclos de congelamento/descongelamento após o que se removeram os resíduos celulares por centrifugação a 3000 rpm durante 10 minutos numa centrífuga de bancada. Um dos lisados em bruto resultantes foi utilizado para infectar uma cultura fresca de células PER55K(1.0) num frasco T175 (1,5 ml/frasco). Recolheram-se células e meio com efeito citopatogénico completo quatro dias depois. Esta observação demonstra que os vírus infecciosos se tinham formado nas transfecções iniciais. A expressão de proteína fluorescente verde foi confirmada por microscopia de fluorescência de células A549 infectadas com o lisado em bruto. O lisado em bruto foi então utilizado para analisar complementação deste vírus Ad35.AdApt.eGFP com deleção de EI nos clones individuais tal como descrito infra. 57

ΕΡ 1 349 926 /PT

Os clones descritos supra que foram repicados das células PER.C6 transfectadas com pIG35.55K foram expandidos e a sua funcionalidade foi ensaiada relativamente à capacidade de manter replicação de Ad35.AdApt.eGFP. Para tal, inocularam-se os clones a duas densidades em placas de 6 poços e um dia depois infectaram-se com 15 ml do lisado em bruto descrito supra. Monitorizou-se o efeito citopatogénico no dia seguinte. Dos 146 clones ensaiados deste modo, 19 apresentaram efeito citopatogénico completo ao dia 2 ou 3 e 68 apresentaram efeito citopatogénico completo ao dia 5 ou 6. Os restantes clones tinham apenas efeito citopatogénico parcial ou apresentavam alguns eventos de não progressão. Os últimos não eram distintos de células PER.C6 que foram tomadas como um controlo negativo.

Com base nestes resultados efectuou-se uma selecção de 24 clones que foram adicionalmente rastreados relativamente à capacidade de gerar vírus com deleção de EI recombinantes após transfecção do plasmídeo adaptador pAdApt35.GFP e do grande clone de cosmídeo pWE.Ad35.pIX-rITR. Para tal, plaquearam-se os clones em frascos T25 e transf ectaram-se com 2 μρ do adaptador e 6 μρ de plasmídeo de esqueleto por utilização de LipofectAmine tal como descrito supra. Dois dias após a transfecção, transferiram-se as células para frascos T80 para evitar confluência excessiva das culturas. Dos 24 clones, 5 apresentaram efeito citopatogénico completo três dias após passagem para T80 e outros 13 clones apresentaram progressão para efeito citopatogénico completo no dia seguinte. Os 6 clones remanescentes não apresentaram qualquer efeito citopatogénico ou apresentaram um efeito ainda no início. Comparativamente: a geração rotineira de vectores Ad5 com deleção de EI em células PER.C6 resulta de um modo geral em efeito citopatogénico completo quatro a seis dias após transferência para frascos T80. mas

Esta observação demonstra que os novos clones complementam eficazmente vectores de adenovírus com deleção de EI. Um dos clones descrito supra (clone n° 16) foi utilizado para gerar e produzir lotes múltiplos de vírus Ad35 com deleções de EI e E1/E3 contendo diferentes transgenes. Para tal, os vírus dos lisados em bruto resultantes das transfecções tal como descrito supra mas utilizando diferentes plasmídeos 58 ΕΡ 1 349 926 /PT adaptadores foram purificados em placa na nova linha celular. Ensaiaram-se placas individuais relativamente a actividade de transgene e seguidamente amplificaram-se para produção em média escala em 4-8 frascos de camada tripla (3 x 175 cm/frasco). Recolheram-se as células com efeito citopatogénico completo e libertou-se o vírus e purificou-se tal como efectuado rotineiramente para adenovírus e descrito no exemplo 1. A etapa de extracção com freon para remover resíduos celulares foi contudo substituída por uma etapa de centrifugação. Assim após incubação com ADNase I, centrifugaram-se os resíduos celulares em tubos cónicos de 50 ml (Greiner) a 8000 rpm numa centrífuga de bancada (Beckman Coulter Allegra 21R com rotor de ângulo fixo) durante 30 minutos a 4°C. Esta etapa é repetida num tubo de 50 ml fresco até que o sobrenadante seja límpido (normalmente uma vez). A quantidade de partículas víricas foi determinada por HPLC (Shabram et al., 1997). A tabela IV apresenta os rendimentos após processamento a jusante de produções em média escala de vírus Ad35 com deleções de EI e E1/E3 em frascos de camada tripla com células PER55K do clone n° 16. A quantidade de partículas víricas purificadas é comparável com os rendimentos de vectores baseados em Ad5 em células PER.C6.

Concluímos que geramos várias linhas celulares que complementam eficaz e completamente vectores baseados em Ad35 com deleção de El. Assim, a expressão de Ad35 E1B-55K numa linha celular de complementação de Ad5 facilita a replicação de vectores Ad35.

Exemplo 10

Novas linhas celulares de complementação originárias de células primárias O exemplo 8 descreveu a geração da construção pIG535, um plasmídeo de expressão híbrido Ad5ElA-Ad35 E1B. pCC536s e pIG536 são também construções híbridas Ad5-Ad35 El mas com a região EIA, promotor E1B e a maioria do gene E1B-19K derivados de Ad5 e a maioria do gene E1B-55K derivado de Ad35. As construções pCC536s e pIG536 diferem apenas na sequência de poliadenilação heteróloga que termina o produto de transcrição E1B: pIG536 tem a sequência HBVpA e pCC536s tem uma sequência pA sintética (SpA). A sequência SpA consiste do elemento de 59

ΕΡ 1 349 926 /PT sequência a montante (USE) do gene de complemento humano C2 (Moreira et al., 1995) e a sequência de pA sintética (SPA) descrita por Levitt et al., 1989. A sequência poliA sintética é construída por utilização dos seguinte oligonucleótidos: C2SPA-1: 5'- CCC TGC AGG GAC TTG ACT CAT GCT TGT TTC ACT TTC ACA TGG AAT TTC CCA GTT ATG AAA TTA ATA AAG -3' C2SPA-2: 5'- GTC TAG ACA CAC AAA AAA CCA ACA CAC TAT TGC AAT GAA AAT AAA TTT CCT TTA TTA ATT TCA TAA CTG -3'.

Misturaram-se os oligonucleótidos a uma concentração de 10 μΜ em tampão de hibridação 1 x (Tris HC1 10 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM) e por utilização de uma máquina de PCR aqueceu-se a solução a 94°C durante 5 minutos e seguidamente arrefeceu-se até 65°C a 0,5°C/segundo e após incubação a 65°C durante 5 minutos, arrefeceu-se adicionalmente a 20°C a 0,05°C/segundo. Subsequentemente, adicionou-se 10 μΐ de dNTP 2 mM, 0,5 μΐ de MgCl2 1M e 3 μΐ de fragmento de Klenow (New England Biolabs) a 87 μΐ da amostra hibridada e a mistura foi então incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Amplificou-se então 1 μΐ da amostra hibridada e tratada com Klenow por utilização dos seguintes iniciadores: C2for: 5'-CGG GAT CCC CTG CAG GGA CTT GAC-3 ' e SPArev: 5'-TTG CGA CTT AAG TCT AGA CAC ACA AAA AAC C-3' por utilização de ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante mas com adição de DMSO (Sigma) para uma concentração final de 3%. O programa de PCR foi estabelecido a 94°C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30'', 55°C durante 30'' e 72°C durante 20''). Nas descrições destes programas de PCR no presente documento, ' significa tempo em minutos e ' ' significa tempo em segundos. O ADN amplificado foi então purificado por utilização do kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen) e digerido com Xbal e Sbfl. O produto digerido foi então novamente purificado com o kit de purificação de PCR para remover as extremidades digeridas pequenas. A construção pIG270 foi também digerida com Xbal e Sbfl (isoesquizómero de Sse8387I) e o fragmento contendo o vector resultante de 5, 9 kb foi isolado a partir do gel por utilização do kit GeneClean II (BIO 101, Inc). O vector tratado e a inserção de PCR foram então ligados para originar 60

ΕΡ 1 349 926 /PT pCC271 (figura 29) . pCC271 contém assim o promotor PGK, a região Ad35 EI (nucleótidos 468 até 3400, inclusive, da seguência Ad35 no exemplo 3 e figura 5) e a pA sintética (SpA). A sequência de pA sintética foi então igualmente clonada na construção pIG535 do seguinte modo.

Digeriu-se pIG535 com EcoRI, PstI e Seal (todas enzimas de New England Biolabs digeridas em tampão 3 de NEB) e a inserção de 3 kb correspondente à região Ad5-Ad35 EI quimérica foi purificada por utilização do kit GeneClean II (BIO 101, Inc.). Digeriu-se a construção pCC271 com EcoRI e PstI e o fragmento de vector de 3 kb contendo a SpA e promotor PGK foi isolado como supra. Ligaram-se ambos os fragmentos isolados e transformaram-se para células competentes STBL-2 (Invitrogen/LifeTechnologies) para originar pCC535s (figura 30). pCC535s contém as mesmas sequências Ad5-Ad35 EI que pIG535 contudo apresenta uma sequência pA diferente.

Para a construção de pCC536s, produziu-se um subclone com as novas sequências E1B híbridas. Para tal, amplificaram-se sequências Ad5 E1A/E1B21K por utilização dos iniciadores 5AK: 5 ' -GAG CGA AGA AAC CCA TCT GAG-3 ' e 2155R: 5' -GGT CCA GGC CGG CTC TCG G-3' com pIG.ElA.ElB (consultar exemplo 6 e figura 13) como ADN molde utilizando ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante e adicionalmente uma concentração final de DMSO a 3%. O programa foi estabelecido a: 94°C durante 2' seguido de 30 ciclos de (94°C durante 30'', 58°C durante 30'' e 72°C durante 30'') e terminou com 68°C durante 8'. Este processo resultou num fragmento de 210 pb correspondente aos nucleótidos 2022-2233 da sequência Ad5. Foi efectuada uma segunda PCR sobre pCC271 com iniciadores: 2155F: 5'- CCG AGA GGC GGC CTG GAC C-3' e 35F10: 5'- GCT CTA GAC CTG CAG GTT AGT CAG TTT CTT CTC CAC TG-3'.

Utilizou-se o mesmo programa de PCR mas agora com um tempo de alongamento de 90''. O fragmento resultante de 1,3 kb corresponde aos nucleótidos 2112 a 3400 da sequência Ad35 com um local Sbf I na extremidade 3' . Note-se que os iniciadores 2155F e 2155R são perfeitamente complementares permitindo montagem dos dois fragmentos como se segue: 61

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Purificaram-se ambos os fragmentos de PCR a partir do gel utilizando o kit de extracção de gel da Qiagen. Misturaram-se então aliquotas das amostras purificadas em razões equimolares e utilizaram-se como molde para uma amplificação por PCR de montagem com iniciadores 5AK e 35F10 com ADN polimerase Pwo como supra utilizando os parâmetros de programa: 94°C durante 2' e 5 ciclos de (94°C durante 30", 60°C durante 30'' e 72°C durante 2') seguido por 25 ciclos de (94°C durante 30'', 58°C durante 30'' e 72°C durante 90''). Purificou-se o fragmento resultante de 1,5 kb a partir do gel por utilização do kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen), ligou-se para o vector de clonagem pCR-Script/Amp (Stratagene) e transformou-se para células competentes DH5a (Invitrogen/Life Technologies) resultando em pCR535ElB (figura 31). Esta construção foi verificada por análise de restrição e sequenciação para confirmar amplificação correcta das sequências alvo.

Digeriu-se então pCR535ElB com Notl e tornaram-se planas as extremidades protuberantes com fragmento de Klenow. O ADN foi então purificado por utilização do kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen) e o ADN eluido foi digerido com PstI. Purificou-se do gel o fragmento de 1,5 kb contendo as sequências quiméricas EI do vector pCR535ElB por utilização do kit GeneClean II (BIO 101, Inc.) . Ligou-se este fragmento ao vector pCC535s digerido com PvuII e PstI e transformou-se para células competentes STBL-2 (Invitrogen/Life Technologies) para originar pCC2155s (figura 32). Para completar a construção pCC536s clonaram-se então sequências Ad5-El para o subclone pCC2155s. Para tal, digeriu-se pIG.ElA.ElB com EcoRI e Kpnl e isolou-se do gel o fragmento de 1,6 kb correspondente a Ad5 EIA e Ad5 E1B 21K (nucleótidos 459 a 2048 da sequência Ad5) por utilização do kit GeneClean. Digeriu-se pCC2155s com EcoRI e Kpnl e o fragmento contendo o vector foi também purificado do gel. A ligação de ambos os fragmentos isolados e transformação em células DH10B electrocompetentes (Invitrogen/Life Technologies) resultou em pCC536s (figura 33). Apresentam-se mais detalhadamente na figura 38 as sequências E1B híbridas. A figura 38A apresenta um alinhamento de sequências de proteína de E1B-21K na construção pCC536s com sequências Ad35 e Ad5 de tipo selvagem (wt). Tal como se pode constatar, a maioria da proteína E1B-21K em pCC536s é derivada de Ad5 com excepção dos 6 aminoácidos C-terminais que são 62 ΕΡ 1 349 926 /PT idênticos a Ad35 E1B-21K. A figura 38B apresenta o mesmo alinhamento para as proteínas E1B-55K. Neste caso os aminoácidos N-terminais de pCC536s são idênticos a Ad5 até ao aminoácido 65. O remanescente é idêntico a Ad35 E1B-55K. Obviamente, podem conceber-se diferentes construções E1B-55K híbridas por utilização do método geral delineado supra sem afastamento do invento. A construção pIG536 foi produzida por substituição de um fragmento com a SpA em pCC536s pelo fragmento correspondente de pIG270 (exemplo 6, figura 15) contendo a HBVpA. Para tal, digeriu-se pIG270 com BamHI e Bgll e isolou-se do gel a inserção de 1,8 kb por utilização do kit GeneClean II (BIO 101, Inc.). Digeriu-se pCC536s com as mesmas enzimas e o fragmento contendo o vector de 4,8 kb foi purificado do gel como supra. A ligação de ambos os fragmentos isolados e transformação para células competentes STBL-2 (Invitrogen/Life Technologies) originou a construção pIG536 (figura 34).

As construções de EI geradas foram ensaiadas em células primárias de rim de rato bebé (BRK) tal como descrito no exemplo 6. Os resultados (tabela V) confirmam observações anteriores que os genes Ad5-El transformam mais eficazmente células primárias BRK do que genes Ad35 El. As construções de expressões Ad5-Ad35 El quiméricas, pCC535s e pCC536s, produziram mais colónias transformadas do que as construções Ad35 El completas, pIG270 e pCC271. Além disso, a utilização de uma sequência de poliadenilação sintética em pCC535s resultou num número ligeiramente superior de focos comparativamente com a variante com HBVpA, pIG535.

Isolaram-se células de retinoblastos embrionários humanos (HER) dos olhos de fetos abortados de 18 e 21 semanas de idade. Colocaram-se os olhos numa placa de 6 cm com PBS e clarificou-se o tecido externo. Efectuou-se uma incisão para atingir o lado interno e raspou-se a camada de células cinzentas do reverso interior dos olhos contendo os retinoblastos. Transferiu-se esta camada para um tubo de 14 ml em 2 ml de PBS e deixou-se o tecido sedimentar após o que se removeu o PBS. Adicionaram-se 2 ml de tripsina (0,25%, sem EDTA, GibcoBRL) e incubou-se durante 5 minutos a 37°C com agitação por rotação ocasional. Deixaram-se sedimentar porções 63 ΕΡ 1 349 926 /PT de tecido e transferiu-se para um novo tubo de 1 ml de tripsina com células. Adicionou-se a este tubo 4 ml de meio de cultura (DMEM com FCS a 10%) e armazenou-se o tubo em gelo. As porções de tecido em tripsina restantes foram colocadas numa placa de 6 cm e cortadas em porções mais pequenas. Estas foram, após adição de 2 ml de tripsina fresca, mais uma vez incubadas num tubo de 14 ml a 37°C com agitação por rotação ocasional. Seguidamente adicionou-se esta mistura às células primeiramente isoladas em meio de cultura e centrifugou-se a totalidade a 1000 rpm numa centrífuga de bancada. Removeu-se o sobrenadante e ressuspenderam-se as células em 10 ml de meio de cultura. Plaquearam-se as células HER isoladas em duas placas de 6 cm e incubaram-se a 37°C/C02 a 10%. Após confluência a 90% dividiram-se as culturas 1:3 e incubaram-se adicionalmente. Repetiu-se este procedimento até se obterem placas suficientes para ser utilizadas para transfecção e cultura adicional. As transfecções foram efectuadas para diferentes números de passagens por utilização do kit de cotransfecção de CaP04 (Invitrogen/Life Technologies) segundo as instruções do fabricante. Para cada placa (confluência 50-70%) utilizaram-se 20 μρ de ADN. Efectuaram-se as transfecções iniciais com pIG.ElA.ElB, uma construção de expressão Ad5-El e com pIG535, a construção de expressão Ad5-E1A/Ad35-E1B híbrida. 2-3 semanas após transfecção os focos transformados tornaram-se visíveis nas placas transfectadas pIG.ElA.ElB. Detectaram-se em média 15-20 focos/placa nas placas que foram transfectadas com pIG.ElA.ElB. Repicaram-se mais de 30 clones e transferiram-se para placas de 96 poços. Após confluência passaram-se as células para placas ou frascos de cultura maiores e finalmente foram congeladas de modo viável em ampolas em azoto líquido a partir de um frasco T175. Todos os clones repicados foram estabelecidos deste modo. Os focos transformados apareceram muito mais tarde nas placas que foram transfectadas com pIG535 ocorrendo a primeira cerca de cinco semanas após a transfecção. Detectaram-se em média 3-4 clones por placa. Repicou-se um total de 46 clones desde 7 semanas a 3 meses após transfecção dos quais 14 eram viáveis e puderam ser passadas várias vezes. Destes, cultivaram-se 2 clones (clone n° 45 e clone n° 75) num frasco T175 e foram congelados de modo estável em ampolas em azoto líquido. 64

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Transfectaram-se também células HER primárias com as construções pCC535s e pCC536s. A transfecção de pCC535s levou uma média de 2 clones/placa e repicaram-se um total de 50 clones. Destes clones repicados puderam estabelecer-se 2. A partir da transfecção com pCC536s pôde estabelecer-se pelo menos um clone.

As experiências descritas supra demonstram que as células HER primárias podem ser transformadas com sequências Ad5-Ad35 EI híbridas. A eficácia da transformação foi inferior do que a obtida com a região Ad5 EI completa. Ensaiamos então se as novas linhas celulares poderiam complementar vectores baseados em Ad35 com deleção de EI recombinantes. Para tal, cultivou-se o clone n° 45 que foi obtido da transfecção pIG535 em frascos T25 a uma densidade de 7 x 106 células/frasco e infectou-se com vírus Ad35.AdApt.eGFP (consultar exemplo 9) com uma multiplicidade de infecção (moi) de 5 e 25 partículas víricas por célula. Observou-se efeito citopatogénico completo nos dias 4 e 5 para a moi 25 e 5, respectivamente. Como comparação, culturas paralelas de células do clone n° 45 que foram infectadas com vírus Ad5.AdApt.eGFP apresentaram efeito citopatogénico completo aos dias 7 e 8 para moi 25 e 5, respectivamente. A eficácia de infecção inicial foi comparável para os vírus Ad5 e Ad35, «80% (moi=5) e «95% (moi=25) das células foram infectadas com vírus GFP um dia após infecção tal como medido por microscopia de fluorescência. Inocularam-se células do clone n° 75 numa placa de 6 poços a uma densidade de 2 x 106 células/poço e infectaram-se com Ad35.AdApt.eGFP ou Ad5.AdApt.eGFP a uma moi de 5 (VP/célula). Mais uma vez a eficácia de infecção inicial foi comparável para ambos os vírus. Observou-se efeito citopatogénico completo ao dia 4 no caso de infecção com Ad3 5 .AdApt. eGFP ao passo que células do clone n° 75 infectado com Ad5.AdApt.eGFP apresentou efeito citopatogénico completo ao dia 7. A diferença de eficácia de replicação em células de complementação de Ad35 entre os vectores recombinantes Ad35 e Ad5 é ainda mais clara quando o vírus é gerado por transfecção com plasmídeo. Esta observação é exemplificada pela seguinte experiência de transfecção. Inocularam-se células do clone n° 45 em frascos T25 a uma densidade de 3,5 x 106 células e transfectaram-se três dias depois por utilização do reagente LipofectAmine (Invitrogen/Life Technologies) segundo as 65

ΕΡ 1 349 926 /PT instruções do fabricante e descrito supra. Cotransfectaram-se 2 μg de plasmídeo adaptador pAdApt35.eGFP digerido com PacI com 6 μg de esqueleto de cosmideo pWE.Ad35.pIX-ITR ou pWE.Ad35.pIX-rITRÀE3 digerido com NotI. Co-transfectaram-se 2 μg de pAdApt.eGFP (plasmideo adaptador Ad5, descrito em WO 00/70071) digerido com PacI com 6 μg de pWE.Ad5.AfIII-rlTRsp (plasmídeo de esqueleto de Ad5, descrito em WO 00/70071) também digerido com PacI. Um T25 não foi transfectado e serviu como controlo negativo. Passado um dia monitorizaram-se as eficácias de transfecção por microscopia de fluorescência e estimaram-se a 10-15% em todas as transfecções eGFP. Três dias após a transfecção transferiram-se células para frascos T80 e incubaram-se adicionalmente a 37°C/ CO2 a 10%. Mais uma vez passados três dias começaram a tornar-se visíveis eventos de efeito citopatogénico nas culturas transfectadas com o pAdApt35.eGFP e o pWE.Ad35pIX-rlTR + E3 ou pWE.Ad35pIX-rITR - E3. As transfecções com o esqueleto com deleção E3 continham mais células fluorescentes verdes e mais eventos de efeito citopatogénico. As transfecções com plasmídeos Ad5 apresentaram apenas cerca de 20% de células fluorescentes verdes, das quais a maioria estava a morrer e não se observaram eventos de efeito citopatogénico. Dois dias mais tarde esta diferença tinha-se tornado maior dado que culturas transfectadas com o pAdApt35.eGFP e o pWE.Ad35pIX-ITRAE3 mostraram claramente 80% de efeito citopatogénico e culturas transfectadas com o pAdApt35.eGFP e o pWE.Ad35pIX-rITR apresentaram eventos de efeito citopatogénico em progressão. A cultura transfectada com Ad5 não apresentou qualquer progressão. A tabela VI sumariza estes resultados.

Concluímos que as novas linhas celulares de complementação descritas supra suportam eficazmente replicação de vírus baseados em Ad35 com deleção de EI e que a geração e replicação dos vírus baseados em Ad5 com deleção de EI é menos eficaz. Aparentemente, as proteínas Ad35-E1B55K não formam um complexo funcional com proteínas Ad5-E40rf6. Assim a especificidade de serótipo para complementação é agora também demonstrada para vectores Ad5 recombinantes em células de empacotamento Ad35. 66

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Exemplo 11

Geração de pWE.Ad.pIX-rITRÁE3 A região-3 precoce de adenovírus humanos contém várias regiões de codificação para proteínas que interferem com a resposta imune do hospedeiro a infecção com adenovírus. Quando se utilizam vectores adenovíricos como transportadores de vacinas tal interferência não é desejável. Consequentemente, construímos um cosmídeo de esqueleto Ad35 isento da região E3.

Para tal, digeriu-se a construção pBr.Ad35.PRn (figura 35; descrita no exemplo 13 na publicação ΕΡ 1 054 064 AI) com StuI e MluI e purificou-se o fragmento de vector de 17,3 kb a partir de gel de ponto de fusão baixo (LMP) por utilização de enzima agarase (Roche) segundo as instruções do fabricante. Seguidamente, gerou-se um fragmento de PCR em pBr.Ad35.PRn por utilização dos iniciadores: 35E3for: 5'-AAT GAC TAA TGC AGG TGC GC-3' e 35E3rev: 5'-CGA CGC GTT GTA GTC GTT GAG CTT CTA G-3'.

Para a amplificação utilizou-se ADN polimerase Pwo (Roche) segundo as instruções do fabricante e estabeleceu-se um programa: 94°C durante 2', 30 ciclos de (94°C durante 30”, 58°C durante 30''' e 72 °C durante 1') e uma incubação final a 68 °C durante 8'. Purificou-se o produto de PCR de 833 pb por utilização do kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen) e digeriu-se com MluI e StuI. Purificou-se do gel o ADN digerido por utilização do kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). Ambos os fragmentos isolados foram ligados e transformados para células competentes DH5a (Invitrogen/Life Technologies) para originar pBr.Ad35.PRnÀE3 (figura 36). Verificou-se o plasmídeo por análise de restrição e sequenciação da inserção amplificada por PCR. Clonou-se então a deleção E3 para o esqueleto de cosmídeo pWE.Ad35.pIX-rITR. Para tal, digeriu-se pWE.Ad35.ρΙΧ-rITR (consultar exemplo 4 e figura 8) com PacI e purificou-se o ADN por precipitação com isopropanol e lavagem com EtOH a 70%. Após ressuspensão em água milliQ, digeriu-se o ADN com SwaI e purificou-se o fragmento de 22,8 kb contendo o vector do gel LMP por utilização da enzima agarase como supra. Digeriu-se a construção pBr.Ad35.PRnÁE3 com PacI e SwaI do 67

ΕΡ 1 349 926 /PT mesmo modo e o fragmento de 16,6 kb foi igualmente isolado por utilização de enzima agarase. Ligaram-se ambos os fragmentos isolados por utilização de 0,5-0,6 μg de cada fragmento. Empacotaram-se então os fragmentos ligados por utilização de extractos de empacotamento de fago λ (Stratagene) segundo as instruções do fabricante e misturou-se com células STBL-2. Plaquearam-se as bactérias em placas LB+Amp e analisaram-se as colónias resultantes relativamente à presença da construção correcta. Este procedimento forneceu a construção pWE.Ad3 5.pIX-rITRAE3 (figura 37). A deleção E3 extende-se desde os nucleótidos 27648 a 30320 da sequência Ad35 (exemplo 3) e consequentemente abrange uma região de 2,6 kb. A cotransfecção de pWE.Ad35.pIX-rITRÀE3 digerido com Notl e pAdApt35.eGFP digerido pIPsp-1 para células PER55 - clone n° 16 (consultar exemplo 9) tal como descrito supra deu origem a que vírus baseados em Ad35 expressassem proteína fluorescente verde. Após isolamento do ADN vírico destes vírus, a amplificação por PCR da região E3 demonstrou que os vírus apresentavam 2,6 kb de sequências E3 eliminadas para tal como esperado.

Tabela I:

Serótipo Eluição [NaCl] mM VP/ml CCID50 logio razão VP/CCID50 1 597 8,66xl010 5,OOxlO7 cg 00 2 574 1, 04xl012 3, 66x1o11 0,4 3 131 1,19x1o11 1,28xl07 4,0 4 260 4, 84x1o11 2,50x10® 3,3 5 533 5, 40X1011 1, 12xl010 1,7 6 477 1, 05xl012 2, 14xl010 1,7 7 328 1,68xl012 2,73xl09 2,4 9 379 4, 99X1011 3,75xl07 4,1 10 387 8,32xl012 1,12xl09 co 00 12 305 3,64x1o11 1,46xl07 4,4 13 231 4, 37xl012 7,31x10® 00 00 15 443 5, 33xl012 1,25x 109 3,6 16 312 1, 75xl012 5,59x10® 3,5 17 478 1,39xl012 1,45xl09 O 00 19 430 8, 44x1o11 8,55xl07 4,0 20 156 1, 41X1011 1,68xl07 3,9 68

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Serótipo Eluição [NaCl] mM VP/ml CCID50 logio razão VP/CCID50 21 437 3, 21x1o11 1,12x 108 3,5 22 365 1, 43xl012 5,59xl07 3,4 23 132 2, 33x1o11 1,57xl07 4,2 24 405 5, 12xl012 4,27xl08 4,1 25 405 7, 24x1o11 5,59xl07 4,1 26 356 1, 13xl012 1,12xl08 4,0 27 342 2, OOxlO12 1,28x10® 4,2 28 347 2, 77xl012 5,OOxlO7 4, 7 29 386 2, 78X1011 2,OOxlO7 4,1 30 409 1, 33xl012 5,59x10® 3,4 31 303 8, 48xl010 2,19xl07 3,6 33 302 1, 02xl012 1,12xl07 5, 0 34 425 1, 08xl012 1, 63x1o11 O 00 35 446 3, 26xl012 1, 25x1o11 1,4 36 325 9, 26xl012 3,62xl09 3,4 37 257 5, 86xl012 2,8xl09 3, 3 38 337 3, 61xl012 5,59xl07 4,8 39 241 3,34x1o11 1,17xl07 4,5 42 370 1, 95xl012 1,12x10® 4,2 43 284 2, 42xl012 1,81x10® 4,1 44 295 8, 45X1011 2,OOxlO7 4, 6 45 283 5,20χ10η 2,99xl07 4,2 46 282 9, 73xl012 2,50x10® 4, 6 47 271 5, 69x1o11 3,42xl07 4,2 48 264 1,68xl012 9,56x10® 3, 3 49 332 2,20xl012 8,55xl07 4,4 50 459 7, 38xl012 2,80xl09 3,4 51 450 8, 41x1o11 1,88x10® 3,7

Legenda da tabela I:

Todos os adenovírus humanos utilizados nas experiências de neutralização foram produzidos em células PER.C6 (Fallaux et ai., 1998) e purificados em CsCl tal como descrito no exemplo 1. Apresenta-se a concentração de NaCl à qual os diferentes serótipos eluíram da coluna de HPLC. Calculou-se o número de partículas víricas/ml (VP/ml) a partir de um padrão de Ad5. 0 título das experiências (CCID50) foi determinado em 69

ΕΡ 1 349 926 /PT células PER.C6 tal como descrito no exemplo 1 através de titulações efectuadas em paralelo com a experiência de neutralização. Apresenta-se o CCID50 para os 44 vírus utilizados no presente estudo e reflecte a diluição de vírus necessária para obter efeito citopatogénico em 50% dos poços após 5 dias. Representa-se a razão VP/CCID50 em logio e é uma medida da infectividade dos diferentes lotes sobre células PER.C6.

Tabela II. Vírus AdApt35.LacZ escapam neutralização por soro humano.

Diluição de soro humano Vírus sem soro 10X 50X 250X 1250X 6250X AdApt5.LacZ moi: 5 VP/célula 100% 0% 0% 1% 40% 80% AdApt35.LacZ 250 μΐ de lisado em bruto 100% 100% 100% 100% 100% 100%

Tabela III: Número de focos obtidos com as diferentes construções de expressão de EI em experiências de transformação BRK Número médio de focos por placa:

Construção 1 μρ 5 μg Experiência 1 pIG.ElA.ElB nd 60 pIG.ElA.ElB nd 35 pRSVAd35El 0 3 pIG.Ad35.EI 3 7 Experiência 2 pIG.ElA.ElB 37 nd pIG.Ad35.EI nd 2 Experiência 3 pIG.ElA.ElB nd 140 pIG.Ad35.EI nd 20 pIG2 70 nd 30 70

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Tabela IV: Rendimentos de vírus Ad35 com deleções de EI e E1/E3 em células do clone n° 16 produzidas em frascos de camada tripla. Vírus Escala(T175III frascos) Total de Partículas de Vírus após DSP VP/célula Ad35.AdApt.eGFP 4 7, 5xlOn 2500 Ad35.Δ1Ε3.AdApt.empty 8 2xl012 3300 Ad35.ΔΕ3.AdApt.LacZ 8 3,8xlOn 600 Ad35.ΔΕ3.AdApt.MV-F 4 8,8xlOn 2900 Ad35.ΔΕ3.AdApt.MV-H 8 2, 6xl012 4250

Tabela V: Eficácias de transformaçao em células BRK com diferentes construções de expressão Ad-El

Construção ADN transfectado (w) N° de focos por placa Experiência 1 pIG.ElA.ElB 5 44 pIG270 5 0 pCC271 5 0 pIG535 5 1 pCC535s 5 2,5 Experiência 2 pIG.ElA.ElB 4 15 pCC2 71 4 0 pCC535s 4 3 pCC536s 4 3

Tabela VI: Geraçao de celular de complementação vírus Ad35 recombinantes na do clone n° 45 estabelecida de Expressão de GFP x linha novo. Construções transfectadas Dia 1 Dia 3 Dia 6 Dia 8 pAdApt35.eGFP + 15% 20% 30% 50% pWE.Ad35.pIX-rITR pAdApt35.eGFP + 10% 25% 40-50% 100% pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 pAdApt 5.eGFP + 15% 25% 20% 20% pWE.Ad5.AflII-rITR Não transfectada 0% 0% 0% 0% 71

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Eventos de efeito citopatogénico x

Construções transfectadas Dia 1 Dia 3 Dia 6 Dia 8 pAdApt35.eGFP + 0 0 1 vários pWE.Ad35.pIX-rITR pAdApt35.eGFP + 0 0 vários 80% pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 pAdAptõ.eGFP + 0 0 0 0 pWE.Ad5.Af11I-rITR Não transfectada 0 0 0 0

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Lisboa,

Claims (29)

1. ΕΡ 1 349 926 /PT 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Linha celular de empacotamento capaz de complementar um adenovirus recombinante com base num serótipo do subgrupo B, em que a referida linha celular é derivada de uma célula humana que foi transformada por sequências de codificação de EI de um adenovirus em que a sequência que codifica a proteína E1B-55K é do subgrupo B.
2. 2. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 1, em que a referida célula humana é uma célula primária, diplóide ou uma sua derivada.
3. 3. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido adenovirus de subgrupo B é do serótipo 35.
4. 4. Linha celular de empacotamento de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que as referidas sequências de codificação de EI estão ligadas operativamente a sequências de regulação que permitem a transcrição e a tradução de proteínas codificadas.
5. 5. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, em que as referidas sequências de codificação de EI de adenovirus estão ligadas operativamente a uma molécula de ADN ou localizadas em duas moléculas de ADN independentes.
6. 6. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, em que as células humanas primárias foram seleccionadas do grupo que consiste em retinoblastos primários, células primárias de rim embrionário e amniócitos primários.
7. 7. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o referido adenovirus do subgrupo B é adenovirus de serótipo 35 e em que todas as sequências de codificação de EI são de serótipo 35.
8. 8. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 7, em que as referidas sequências de codificação ΕΡ 1 349 926 /PT 2/4 de EI incluem as regiões de codificação das proteínas EIA e a sequência de promotor de E1B ligada às sequências de codificação de E1B até ao codão de terminação, inclusive, da proteína E1B-55K.
9. 9. Linha celular de empacotamento de qualquer uma das reivindicações 1-6, em que o referido adenovírus do subgrupo B é adenovírus de serótipo 35 e em que as sequências de codificação de EI incluem os nucleótidos 468 a 3400 de uma sequência Ad35 de tipo selvagem.
10. 10. Linha celular de empacotamento capaz de complementar adenovírus recombinante com base num serótipo do subgrupo B, em que a referida linha celular é derivada de uma célula que foi transformada por uma construção EI de adenovírus quimérica incluindo sequências de codificação de EIA e pelo menos parte de sequências de codificação de E1B-21K de um adenovírus que não do subgrupo B e incluindo adicionalmente sequências de codificação de E1B-55K de um adenovírus de subgrupo B.
11. 11. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 10, em que as sequências de codificação de E1B-55K que não se sobrepõem com as sequências de codificação de E1B-21K são de um adenovírus de subgrupo B.
12. 12. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o adenovírus de subgrupo B é adenovírus de serótipo 35.
13. 13. Linha celular de empacotamento de qualquer uma das reivindicações 8-10, em que as referidas sequências de codificação de EI de adenovírus estão ligadas operativamente a sequências de regulação que permitem a transcrição e a tradução de proteínas codificadas.
14. 14. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, em que a referida célula é uma célula humana primária diplóide ou uma sua derivada.
15. 15. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 14, em que as células humanas primárias foram seleccionadas do grupo que consiste em retinoblastos ΕΡ 1 349 926 /PT 3/4 primários, células primárias de rim embrionário e amniócitos primários.
16. 16. Linha celular de empacotamento capaz de complementar adenovirus recombinante com base num serótipo do subgrupo B, em que a referida linha celular é derivada de uma célula que foi transformada por sequências de codificação de EI de um adenovirus que não do subgrupo B e em que a referida célula inclui adicionalmente uma sequência de codificação de E1B-55K de um adenovirus de subgrupo B integrado no genoma da referida célula.
17. 17. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 16, em que o referido adenovirus de subgrupo B é adenovirus de serótipo 35.
18. 18. Linha celular de empacotamento das reivindicações 16 ou 17, em que as referidas sequências de codificação EI estão ligadas operativamente a sequências de regulação que permitem a transcrição e a tradução de proteínas codificadas.
19. 19. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-18, em que a referida sequência de codificação de E1B-55K é dirigida por um promotor de E1B e terminada por um sinal de poli-adenilação heterólogo.
20. 20. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-18, em que a referida sequência de codificação de E1B-55K é dirigida por um promotor heterólogo.
21. 21. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-20, em que as referidas sequências de codificação de EI de adenovirus estão ligadas operativamente a uma molécula de ADN ou localizadas em duas moléculas de ADN independentes.
22. 22. Linha celular de empacotamento de qualquer uma das reivindicações 16-21, em que a referida célula é uma célula humana primária diplóide ou uma sua derivada.
23. 23. Linha celular de empacotamento da reivindicação 22, em que as células humanas primárias foram seleccionadas do grupo ΕΡ 1 349 926 /PT 4/4 que consiste em retinoblastos primários, células primárias de rim embrionário e amniócitos primários.
24. 24. Linha celular de empacotamento de acordo com a reivindicação 22, em que a referida célula que é transformada por sequências de codificação EI de adenovírus de subgrupo C é uma célula PER.C6 (número de depósito ECACC 96022940), uma célula 293, uma célula 911 ou uma célula A549 ou uma derivada de qualquer uma dessas células.
25. 25. Linha celular de empacotamento de qualquer uma das reivindicações 1-24, em que as referidas sequências de EI do adenovírus de subgrupo B não contêm sequências sobrepostas com sequências presentes num vector vírico recombinante associado.
26. 26. Linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-25, em que o referido adenovírus que não do subgrupo B é adenovírus de serótipo 5.
27. 27. Método para complementar um adenovírus recombinante baseado num serótipo de subgrupo B, incluindo o referido método proporcionar uma linha celular de empacotamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26 com um ácido nucleico que codifica o referido adenovírus recombinante e cultivar a referida linha celular de modo a permitir complementação.
28. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, incluindo adicionalmente a recolha dos adenovírus recombinantes complementados.
29. 29. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, em que o referido adenovírus recombinante se baseia no serótipo 35. Lisboa,