CZ182798A3 - Komplementární adenovirové vektorové systémy a buněčné linie - Google Patents

Komplementární adenovirové vektorové systémy a buněčné linie Download PDF

Info

Publication number
CZ182798A3
CZ182798A3 CZ981827A CZ182798A CZ182798A3 CZ 182798 A3 CZ182798 A3 CZ 182798A3 CZ 981827 A CZ981827 A CZ 981827A CZ 182798 A CZ182798 A CZ 182798A CZ 182798 A3 CZ182798 A3 CZ 182798A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
adenoviral vector
adenoviral
vector
region
genome
Prior art date
Application number
CZ981827A
Other languages
English (en)
Inventor
Alena Lizonova
Joseph T. Bruder
Imre Kovesdi
Douglas E. Brough
Duncan L. Mcvey
Original Assignee
Genvec, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genvec, Inc. filed Critical Genvec, Inc.
Publication of CZ182798A3 publication Critical patent/CZ182798A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4712—Cystic fibrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Design And Manufacture Of Integrated Circuits (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález popisuje rekombinantní, vícenásobně replikačně deficientní adenovirové vektory, které mají intergenovou sekvenci při nejmenším v jedné z replikačně deficientních adenovirových oblastí a dále se zde popisuje terapeutické použití takových vektorů.
Dosavadní stav techniky
Během zimy a jara na přelomu let 1952 až 1953 Rowe a jeho kolegové z Národního ústavu zdraví (NIH) získali adenoidy, které byly chirurgicky odstraněny malým dětem z oblasti Washington D.C., a připravili z nich tkáňovou kulturu (Rowe et al., Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953)) . Po několika týdnech řada kultur začala vykazovat progresivní degeneraci epiteliálních buněk. Tento chraktérizovanou cytopatický účinek rozkladem se mohl rozšířit filtrovanými kultivačními roztoky, které se používají pro založení tkáňových kultur lidských buněčných linií. Cytopatické agents degenerující u(Ad) agents. běžným pro tato agents.
Proč. Soc. Exp, al., Am. Rev.
se pojmenovalo adenoidní Jméno adenovirus se stalo Po tomto počátečním objevu následovaly další objevy řady prototypů kmenů adenoviru, z nichž některé způsobují respirační onemocnění (Rowe et al., Biol. Med., 84, 570-573 (1953); Dingle et
Respir. Dis., 97, 1-65 (1968); shrnuto v publikaci Herwitz, Adenoviridae and Their Replication, v Virology (Fields et al., eds, Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed., 1990), pp. 1679-1721).
Z lidí se izolovalo přes 40 adenovirových subtypů a přes 50 dalších subtypů se izolovalo z jiných savců a ptáků (Ishibishi et al., Adenoviruses of animals v The i
• ·
Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenům Press, New York, NY, pp. 497-562 (1984); Strauss, Adenovirus infections in humans, v The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenům Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984)). Všechny tyto subtypy patří do čeledi Adenoviridae, která se roděluje do dvou rodů, jmenovitě Mastadenovirus a Aviadenovirus.
Všechny adenoviry mají podobnou morfologii a strukturu. U lidí však adenoviry mají různé imunologické vlastnosti a proto se rozdělují do sérotypů. Intenzivně se studovaly dva lidské sérotypy adenoviru, jmenovitě Ad2 a Ad5. Z těchto studií se získala většina obecných informací o adenovirech. Genomy Ad2 a Ad5 se kompletně sekvenovaly a dostupné jsou i sekvence vybraných oblastí genomů z jiných sérotypů. Mezi sérotypy je organizace adenovirového genomu konzervativní, což znamená, že specifické funkce jsou umístěny na podobných místech.
Obecně adenoviry nemají obal, tvoří pravidelné dvacetistěny o průměru 65 až 80 nanometrů, které obsahují vnější kapsid a vnitřní jádro. Kapsid je tvořen 20 trojúhelníky nebo fasetami a 12 vrcholy (Horné et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Fasety obsahují hexony a vrcholy obsahují pentony. Z každého vrcholu vyčnívá vlákno. Vedle hexonů, pentonů a vláken se zde nachází osm vedlejších strukturních polypeptidů, přičemž přesná poloha většiny z nich není jasná. Jeden minoritní polypeptidový komponent, jmenovitě polypeptid IX, se váže v polohách, kde může stabilizovat spojení hexon-hexon, což se uvádí jako skupina devíti centra každé fasety (Furcinitti et al., EMBO, 8, 3563-3570 (1989)). Věří se, že vedlejší polypeptidy VI a VIII stabilizují kontakty hexon-hexon mezi sousedními fasetami. Minorní polypeptid IIIA, o kterém se ví, že se nachází v oblastech vrcholů, váže kapsid a jádro, jak naznačuje Stewart et al v publikaci Cell, 67, 145-154 (1991)).
• ·
Virové jádro obsahuje lineární dvouřetězcovou molekulu DNA s obrácenými terminálními repeticemi (ITR), jejichž délka u různých izolátů kolísá od 103 párů baží do 163 párů baží (Garon et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972); Wolfson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 30543057 (1972); Arrand et al. , J. Mol. Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al. , Nucleic Acids Res., 4, 4371-4386 (1977); a Tooze, DNA Tumor Viruse, 2nd ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 943-1054 (1981)). Oblast ITR zahrnují počátky replikace DNA (Garon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972);
/Wolfson et al. , Wolfson et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol·. Biol., 128, 577594 (1973); Steenberg et al. , Nucleic Acids Res., 4, 43714386 (1977)).
Virová DNA je spojena se čtyřmi polypeptidy, jmenovitě V, VII, μ, a terminální polypeptid (TP). Terminální polypeptid o velikosti 55 kilodaltonu je kovalentně připojen k 5'koncům DNA přes dCMP (Rekosh et al., Cell, 11, 283-295 (1977); Robinson et al. , virology, 56, 54-69 (1973)). Další tři polypeptidy jsou nekovalentně vázány s DNA a stáčí se způsobem, aby pasovaly do malého objemu kapsidu. DNA se balí do strukturálně podobných celulárních nukleozómů, což je patrné z paternu štěpení nukleázou (Corden et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 73, 401-404 (1976); Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979); Mirza et al., Biochim. Biophys. Acta, 696, 76-86 (1982)).
Adenovirus infikuje buňku tak, že se vlákno zachytí na specifickém receptorů na buněčné membráně (Londberg-Holm et al., J. Virol., 4, 323-338 (1969); Morgan et al., J. Virol., 4, 777-796 (1969); Pastan et al., Adenovirus entry into cells: some new obsarvetions on an old problém, v Concepts in viral Pathogenesis, Notkins et al., eds., Springer-Verlag, • · · · et al., Virology, 75, 442-456 (1976); Sharp, Adenovirus transcription v The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenům Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984)). Každá oblast má nejméně jeden odlišný promotor a umožňuje vznik více druhů mRNA.
Produkty časných oblastí (E) za prvé slouží jako regulátory exprese jiných virových komponentů, za druhé jsou zahrnuty do zastavení replikace buněčné DNA a syntézy proteinu a za třetí jsou nutné při replikaci DNA. Komplikované série jevů, které regulují časnou transkripci mRNA začínají při expresi určitých bezprostředních časných oblastí, je^ž zahrnují E1A, LI a gen o velikosti 13,5 kilodaltonů (Sharp, Adenovirus transcription v The Adenoviruses, Ginsberg, ed. , Plenům Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984); Horwitz (1990) citace uveden shora)). Exprese opožděných časných oblastí E1B, E2A, E3 a E4 závisí na produktech genu ElA. Tři promotory, promotor E2 v 72 map jednotkách (mu), promotor proteinu IX a promotor IVa, jsou zesíleny záčetkem replikace, ale nejsou na ní závislé (Wilson et al. , Virology, 94, 175-184 (1979)). Jejich exprese charakterizuje intermediární fázi exprese virového genomu. Výsledek kaskády exprese časného genu je počátek replikace virové DNA.
Iniciace replikace virové DNA se jeví býti podstatnou pro vstup do pozdní fáze. Pozdní fáze virové infekce je charakterizována produkcí velkého množství virových strukturních polypeptidů a nestrukturních proteinů, které se účastní sestavení kapsidu. Hlavní pozdní promotor (MLP) se stává plně aktivní a produkuje transkripty, které začínají v 16,5 mu a končí blízko konce genomu. Post-transkripční zpracování tohoto dlouhého transkriptu dává vznik pěti rodinám pozdní mRNA, které se označují jako LI až L5 (Shaw et al., Cell, 22, 905-916 (1980)). Mechanizmy, které řídí
44
New York, NY, pp. 141-146 (1987)). Pentonová báze se pak váže na receptor adenovirového integrinu. Receptor vázající virus migruje z plazmatické membrány do klatrinem potažených jamek, které tvoří endocytické váčky nebo receptozómy, kde hodnota pH padá na 5,5 (Pastan et al. , Concepts in Viral Pathogenesis, Notkins and Oldstone, eds. Springer-Verlag, New Yourk. pp. 141-146 (1987)). Věří se, že při poklesu pH se změní konfigurace povrchu viru, což vede k ruptuře receptozómu a‘virus se uvolní do cytoplazmy buňky. Virová DNA není částečně potažená, což znamená, že v cytoplamě částečně neobsahuje asociované proteiny, zatímco je transportovaná do jádra.
Když virus dojde k jaderným pórům,virová DNA vstoupí do jádra, přičemž většina proteinů zůstane v cytoplazmě (Philipson et al., J. Virol., 2, 1064-1075 (1968)). Avšak virová DNA není zcela bez proteinů, protože nejméně část virové DNA je asociována s nejméně čtyřmi virovými polypeptidy, jmenovitě V, VII, TP a μ, a přeměňuje se na virový DNA-buněčný histonový komplex (Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979)).
Cyklus od infekce buněk k produkci virových partikulí trvá jeden až dva dny a vede k produkci přibližně až 10 000 infekčních partikulí na buňku (Green et al., Virology, 13, 169-176 (1961)). Proces infekce adenoviru je rozdělen do dvou fází časné (E) a pozdní (L) , které jsou odděleny replikací virové DNA, ačkoli k některým jevům dochází jak během časné tak i pozdní fáze. Další dělení se uskutečnilo za účelem popsání dočasné exprese virových genů.
Během časné fáze se syntetizuje virová mRNA, která zahrnuje minoritní část celkové RNA přítomné v buňce, z obouch řetězců adenovirové DNA, která je přítomna v buněčném jádru. Přepisuje se nejméně pět oblastí označených El, E2, E3, E4 a MLP-L1 (Lewis et al., Cell, 7, 141-151 (1976); Sharp
přechod z časné do pozdní fáze a vedou k tak dramatickému posunu v transkripčním využití nejsou jasné. Požadavky pro replikaci DNA mohou být cis-vlastnosti templátu DNA, protože pozdní transkripce se nevyskytuje u superinfikujících virů v době, kdy je aktivní pozdní transkripce primárně infikujících virů (Thomas et al., Cell, 22, 523-533 (1980)).
Jisté rekombinantní adenovirové vektory se používaly v genové terapii. Použití rekombinantního adenovirového vektoru pro přenos jednoho nebo více rekombinantních genů schopných cílového zavádění genu nebo genů do orgánu, tkáně nebo buněk za účelem léčby, obchází problém zavedení, který se vyskytuje ve většině formách somatické genové terapie. Rekombinantní adenovirové vektory pro expresy adenovirových proteinů nepožadují proliferaci hostitelských buněk (Horwitz et al., v Virology, Raven Press, New York, 2, 1679-1721 (1990); a
Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988)). Jestliže nemocný orgán, který vyžaduje léčbu jsou plíce, pak použití adenoviru jako vektoru genetické informace má výhodu, že adenovirus je normálně pro respirační epitelium trofický (Straus, v Adenoviruse, Plenům Press, New York, pp. 451-496 (1984)).
Další výhody adenovirů jako potencionálních vektorů pro lidskou genovou terapii jsou následující: (i) řídká rekombinace, (ii) adenovirové infekce nejsou spojovány s lidským maligním onemocnění, mimo běžných lidských infekcí; (iii) adenovirový genom (který je lineární, dvouřetězcová DNA) se může manipulovat tak, aby pojmul cizí geny, jejichž velikost se pohybuje v rozmezí 7,0 až 7,5 kb; (iv) DNA adenovirového vektoru se nezačleňuje do chromozómu buňky, tak její účinek není permanentní a a není pravděpodobné, že interferuje s normální buněčnou funkcí; (v) adenovirus může infikovat buňky, které se nedělí nebo terminálně diferenciované buňky, jako jsou buňky mozku a plic; a (vi) živý adenovirus, jehož podstatná charakteristika je schopnost
·· ·· ·· • · · · · · ·· · · ·· • · · ···· · • · · · · «> ·· ·· replikace, se používá pro vakcinaci lidí (Horwitz et al., v Virology, Raven Press, New York, 2, 1679-1721 (1990); Berkner et al. , J. Virol., 61, 1213-1220 (1987); Straus Adenovirus infections in humans, v Adenoviruses, Ginsberg, ed. Plenům Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984); Chanock et al. ,
JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al. , J. Virol., 57, 267 (1986); a Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)).
Jestliže se adenoviry používají jako expresivní vektory, pak se cizí geny začleňují do dvou hlavních oblastí adenovirového genomu, jmenovitě oblasti El a E3 tak vznikají deficitní adenoviry a od nich odvozené vektory. Jestliže dojde k inzerci do oblasti El vzniká defektní progen, který vyžaduje růst v komplementárních buňkách nebo přítomnost intaktního pomocného viru, který buď nahrazuje funkci poškozené nebo nepřítomné oblasti El (Berkner et al., BioTechniques, 6, 616 (1988); Davidson et al., J. virol., 61, 1226-1239 (1987); a Mansour et al., Mol. Cell Biol., 6, 26842694 (1986)). Tato oblast genomu se nejčastěji používá pro expresi cizorodých genů.
Geny začleněné do oblasti El jsou řízeny různými promotory a většina z nich produkuje velké množství produktu cizího genu v závislosti na expresivní kazetě. Tyto adenovirové vektory však nebudou růst v nekomplementárních buněčných liniích. Příklady takových buněčných linií zahrnují HEK-293 (Graham et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 637-650 (1975)), W162 (Weinberg et al. , Proč,
Nati. Acad. Sci. USA, 80, 5383-5386 (1983)) a gMDBP (Kleissig et al., Mol. Cell Biol., 4, 1354-1362 (1984); Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992)).
Ve srovnání oblast E3 není podstatná pro růst viru v tkáňové kultuře (to je produkce viru) a záměna této oblasti expresivní kazetou s cizím genem způsobuje, že virus produktivně roste v nekomplementární buněčné linii. Například
···· ·· ··· · • 4 ·« inzerce a exprese povrchového antigenu hepatitidy B do oblasti E3 s následnou inokulací a tvořením protilátek v morčatech se popisuje v publikaci Morin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 4626-4630 (1987)).
Problém spojený s použitím deficientních adenovirových vektorů je ten, že limitují množství použitelného místa v adenovirovém genomu pro inzerci a expresi cizího genu. Díky podobnostem nebo přesahu ve virových sekvencích obsažených v deficietních adenovirových vektorech a v komplementárních buněčných liniích, které v současné době existují, probíhá rekombinace a vznikají v nich replikační komponenty viru a tak se pomnožuje zásobním roztok vektoru. Tento jev činí zásobní roztok vektoru nepoužitelný pro účely genové terapie.
Vícenásobně replikačně deficitní vektory (vektory deficitní nejméně ve dvouch oblastech, které jsou nutné pro produkci viru) vznikly na základě úsilí obejít tento problém (přihláška PCT patentu WO 94/28152 (Imler et al.)). Takové vektory, které mají nejméně jednu z delecí v oblastech E2 nebo E4, však vykazují redukovanou expresi vlákna a redukovaný virový růst v komplementárních buněčných liniích. Předpokládá se, že oblast E4 má určitou úlohu při replikaci virové DNA, syntéze pozdní mRNA, při zastavení syntézy hostitelského proteinu a uspořádání viru. Při pokusu korigovat růst virových vektorů, který jsou nedostatečný v oblastech E4v komplementárních buněčných liniích, vznikly adenovirové vektory, které mají delece v E4 a které drží podstatné otevřené čtecí rámce oblasti E4, specificky ORF6 nebo ORF3 (přihláška patentu PCT WO 94/12694 (Gregory et al.,)).
Zatímco otevřený čtecí rámec 3 nebo 6 je schopný poskytnout funkce E4 nutné pro propagaci viru in vitro, produkt ORF 3 ovlivňuje redukovanou účinnost (Armentano et al. , Human Gene Therapy, 6, 1343-1353 (1995)). Popisuje se
4444 ·· ·· · · *
4 44
4« · · ·
4 ·
44 několik vlastností spojených s ORF, které mohou fungovat in vivo (např. Armentano et al., Human Gene Therapy, 6, 13431353 (1995)). Například produkt ORF 6/7 se podílí na aktivaci promotoru E2A prostřednictvím tvorby komplexu s faktorem buněčné transkripce E2f a jeho stimulace. Podobně 0RF3 i ORF6 se podílejí na regulaci intronové inkluze/exkluze při sestřihu hlavní pozdní trojdílné vedoucí sekvence. Ani ORF 6 však není schopen zajistit produkci viru divokého typu u mutantu s delecí adenovirové E4. Adenovirový El” E4” deleční mutant obsahující ORF 6 ve srovnání s adenovirem, který nemá deleci oblasti E4, konkrétně vykazoval desetinásobné snížení syntézy vlákna, zpožděnou replikaci viru a pomalejší tvoření plaků in vitro a sníženou a zpožděnou replikaci viru in vivo (Armentano et al., Human Gene Therapy, 6, 1343-1353 (1995)).
Účelem vynálezu je připravit vícenásobně replikačně deficientní adenovirové vektory, které se mohou přizpůsobit pro začlenění a expresi relativně velkého kusu cizorodé DNA, zatímco jsou schopny se uspokojivě replikovat in vitro, tj. produkovat virus. Dále je účelem vynálezu nalézt rekombinanty takových vícenásobně deficitních adenovirových vektorů a terapeutické metody, zvláště spojené s genovou terapií, vakcinací a podobně, zahrnující použití takových rekombinant. Tyto a jiné předměty a výhody vynálezu jsou zřejmé z následujícího podrobného popisu vynálezu.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou vícenásobně replikační deficitní adenovirové vektory a komplementární buněčné linie. Vícenásobně replikační deficitní adenovirové vektory mají intergenovou sekvenci v nejméně jedné z replikačně deficitních adenovirových oblastí. Tyto vícenásobně replikační deficitní adenovirové vektory mohou umožňovat začlenění a expresi větších fragmentů cizorodé DNA než jak je
·· ·· • 4 • 4 ·· • 44 4 ·
4 4 možné u jednoduše deficitních adenovirových vektorů, a přitom poskytují podobnou expresi vlákna a růst viru jako u jednoduše replikačně deficientních adenovirových vektorů. Vynález také popisuje rekombinantní vícenásobně replikačně deficientní adenovirové vektory a terapeutické metody například spojené s genovou terapií, vakcinací a podobně, zahrnující použití uvedených rekombinantů.
Vynález mimo jiné popisuje vícenásobně replikačně deficientní adenovirové vektory pro klonování genu a expresi. Vícenásobně replikačně deficientní adenovirové vektory podle vynálezu se odlišují od současně dostupných jednoduše replikačně deficitních adenovirových vektorů tím, že jsou deficitní nejméně ve dvou oblastech adenovirového genomu, zvláště ve dvou takových oblastech, nutných při produkci viru, což umožňuje takovým vektorům přijmout a exprimovat větší kusy cizorodé DNA. Termín cizí DNA nebo cizorodá DNA znamená libovolnou sekvenci DNA začleněnou do vektoru (to je do transferového vektoru) podle vynálezu, která je pro adenovirový genom cizí. Taková cizorodá DNA může tvořit geny, části genů nebo libovolné jiné skevence DNA, zahrnující, avšak bez omezení, sekvence, které kódují RNA, anti-sense RNA a/nebo polypeptidy. Vícenásobně replikačně deficitní adenovirové vektory podle vynálezu se také liší od nedávno objevených vícenásobně replikačně deficitní adenovirových vektorů v tom, že jsou schopny dosáhnout exprese vlákna a růstu viru v komplementární buněčné linii podobně jako u jednoduše replikačně deficitního vektoru díky přítomností intergenové sekvence nejméně v jedné deficitní adenovirové oblasti, která může způsobit zablokování transkripce a tak zabránit čtení bez zastávky.
Oblast adenovirového genomu obsahuje jeden nebo více genů. Takové geny kódují genové produkty, které zprostředkovávají, umožňují, způsobují nebo jsou různými
• 444
4 • 44 44 komponenty nebo aktivitami adenoviru, jako je zachycení, penetrace, nepotažení, replikace, jaderný protein, hexon, vlákno, s hexonem spojený protein a podobně. Jedním účinkem deficitní oblasti může být například neschopnost adenoviru se pomnožovat, což může zahrnovat libovolné nebo všechny shora jmenované komponenty nebo aktivity. Tyto shora jmenované komponenty nebo aktivity se zde uvádějí jako funkce genů.
Nedostečnost genu nebo funkce genu, to je deficitní gen, oblast genu nebo oblast, zde znamená deleci genového materiálu virového genu, která vede k poškození nebo zrušení funkce genu, jehož sekvence DNA je deletována celá nebo zčásti, a k uvolnění prostoru nebo schopnosti virového genomu pro inserci DNA, která je pro virový genom cizí. Taková nedostatečnost se může vyskytovat v genech, které jsou podstatné nebo nepodstatné při propagaci adenovirového vektoru v tkáňové kultuře nekomplementárního buněčného hostitele; přednostně chybí u alespoň jednoho, zejména u alespoň dvou deficientních genů virových vektorů podle vynálezu gen, který je podstatný při propagaci viru.
Jako zdroj DNA při generaci vícenásobně deficitních adenovirových vektorů může být použit libovolný subtyp, směs subtypů nebo chimérický adenovirus. Avšak protože genom Ad5 je zcela sekvenován, je vynález je popsán s ohledem na sérotyp Ad5.
Adenovirový vektor podle vynálezu je vhodně vícenásobně replikačně deficientní. To znamená, že je deficitní nejméně ve dvou oblastech nutných při produkci viru (to je replikace viru in vitro) . Takové oblasti zahrnují časnou oblast 1 (El), časnou oblast 2A (E2A), časnou oblast 2B (E2B), časnou oblast 4 (E4), pozdní oblast 1 (LI), pozdní oblast 2 (L2), pozdní oblast 3 (L3), pozdní oblast 4 (L4) a pozdní oblast 5 (L5) . Přestože se má za to, že oblast El zahrnuje časnou oblast ΙΑ (E1A) a časnou oblast 1B (E1B), nedostatečnost v buď jedné nebo obou oblastech E1A a/nebo E1B se považuje s ohledem na vynález za jednoduchou nedostatečnost. Takový vektor může být deficitní v jedné nebo více oblastech, které nejsou nutné při produkci viru, například vektory mohou být deficitní v časné oblasti 3 (E3).
Výhodně je adenovirový vektor podle vynálezu deficitní v oblasti E4 a jedné nebo více dalších oblastech, nutných při produkci viru (zvláště jiných časných oblastech nutných při produkci viru), s výhodou je z adenovirového vektoru deletována celá oblast E4, případně mimo polyadenylační sekvence mezi zbývající oblastí vlákna L5 a pravostrannou ITR. Výhodněji je další deficitní oblastí nutnou při produkci viru oblast El a/nebo E2A, a zejména se současným odstraněním oblasti E3. Preferované provedení adenovirového vektoru podle vynálezu tak zahrnuje adenovirové vektory El E2A”, El“ E2A“ E4“, El“ E4“ a E2A“ E4“, které mohou také být E3“. Nejvýhodnéjší je, když se z adenovirového vektoru odstraní všechny časné oblasti (ať už jsou nebo nejsou odstraněny pozdní oblasti, přednostně s ponecháním přinejmenším oblasti vlákna L5), případně mimo dříve zmíněné polyadenylační sekvence E4 mezi zbývající oblastí vlákna L5 a pravostranou ITR.
Adenovirový vektor podle vynálezu zahrnuje intergenovou sekvenci, což umožňuje růst viru v komplementující buněčné linii, který je podobný růstu dosaženého jednoduše replikačně deficitními adenovirovými vektory, zvláště jednoduše replikačně deficitním adenovirovým vektorem v oblasti El.
V preferovaném E4“ adernovirovém vektoru podle vynálezu, kde zůstala oblast vlákna L5, je výhodné, je-li intergenová sekvence umístěna mezi oblastí vlákna L5 a pravostranou ITR.
V takovém adenovirovém vektoru se více upřednostňuje, aby mezi oblastí vlákna L5 a pravostrannou ITR existovala samotná ·· ·· ·· ·· • · · · · · · * · • · · ·· · · ·· • · · · · · · ···· * • » · · · · · · • ·· ·* ·· ··
Tak se dostatečně oddělí zbývající oblast vlákna L5 od pravostranné ITR a pak virová produkce takového vektoru dosáhne produkce jednoduše replikačně deficitního adenovirového vektoru, zvláště jednoduše replikačně deficitního adenovirového vektoru oblasti El.
Jestliže intergenová sekvence není přítomna,, produkce proteinu vlákna a/nebo virový růst vícenásobně replikačně deficitního adenovirového vektoru je redukován ve srovnání s růstem jednoduše replikačně deficitním adenovirovým vektorem. Avšak inkluze intergenové sekvence v nejméně jedné deficitní adenovirové oblasti, upřednostňuje se oblast E4, působí proti defektu v růstu a expresi vlákna.
Funkci replikačně deficitní oblasti poskytuji komplementární buněčná linie. Výsledkem je, že intergenová sekvence nepotřebuje poskytovat deficitní funkci a může jí být libovolná sekvence, limitovaná pouze velikostí inzertu, kterému je vektor schopen se přizpůsobit. Samotná intergenová sekvence může napravit defekt růstu a zesílit expresi vlákna, což se vyskytuje u vícenásobně replikačně deficitních adenovirových vektorů. Intergenová sekvence může mít libovolnou vhodnou velikost, požaduje se nejméně okolo 15 párů baží (např. 15 párů baží až 12 000 párů baží), upřednostňuje se přibližně 100 párů baží až 10 000 párů baží, výhodné je přibližně 500 párů baží až 8 000 párů baží, dokonce více se upřednostňuje okolo 1 500 párů baží až 6 000 párů baží a nejvíce se upřednostňuje přibližná velikost 2 000 až 3 000 párů baží.
Intergenová sekvence obsahuje libovolnou sekvenci nebo sekvence, které mají požadovanou délku. Intergenové sekvence jsou kódující nebo nekódující a jsou nativní nebo nepřirozené s ohledem na adenovirový genom, ale nedokáží obnovit replikační funkci deficitní oblasti. Intergenová sekvence také může obsahovat expresivní kazetu s variabilním ·#·· «9 99
W' 9 ·
9 99 « 9 9 9 9 · 9 ·
99
9 9 9
9 99
999 9 ·
9 · promotorem. Výhodnější je, když intergenová sekvence obsahuje navíc polyadenylační sekvenci a/nebo cizorodý gen. Je výhodné v případě, že intergenová sekvence je začleněna do deficitní E4 oblasti, aby E4 polyadenylační sekvence a promotor E4 adenovirového genomu nebo libovolný jiný (buněčný nebo virový) promotor zůstal ve vektoru. Intergenová sekvence je umístěna mezi E4 polyadenylačním místem a promotorem E4 nebo jestliže promotor E4 není přítomen ve vektoru, intergenová sekvence je proximální pravostranné ITR.
Intergenová sekvence může obsahovat libovolnou polyadenylační sekvenci. Příklady vhodných polyadenylačních sekvencí zahrnují syntetické optimalizované sekvence, BGH (bovinní růstový hormon), polyoma virus, TK (thymidinovou kinázu), EBV (Epstein-Barrové virus) a papilomaviry, které zahrnují lidské papilomaviry a BPV (bovinní papilomavirus). Upřednostňuje se zvláště u deficitní oblasti E4, aby intergenová sekvence zahrnovala polyadenylační sekvenci SV40. Polyadenylační sekvence SV40 umožňuje silnější virovou produkci vícenásobně replikačně deficitních adenovirových vektorů.
Ačkoli cizorodý gen je typicky začleněn do El deficitní oblasti adenovirového genomu, cizorodý gen může také fungovat jako intergenová sekvence v E4 deficitní oblasti adenovirového genomu. Cizorodý gen je limitován pouze velikostí fragmentu, kterému se vektor může přizpůsobit a může to být libovolný vhodný gen. Příklady vhodných cizorodých genů zahrnují sekvence markrového genu, jako jsou pGUS, sekreční alkalická fosfatáza, luciferáza, βgalaktozidáza a lidský anti-trypsin; zajímavé terapeutické geny, jako je cystický fibrózní transmembránový regulační gen (CFTR); a potencionální imunní modifikátory, jako je B3-19K, E3-14.7, ICP47, ligandový gen fas a gen CTLA4.
···· • 4 4-4 · · · · · « · · ·· · · *· « 4 4 4 4 4 * ♦·· · J
4 4 4
44 • 4 44 4 4 replikační deficitní který je deficitní v
Upřednostňuje se vícenásobně adenovirový vektor podle vynálezu, oblasti E2A, dále obsahuje část oblasti E2A adenovirového genomu v deficitní oblasti E2A, jejíž velikost je menší než přibližně 230 párů baží. Obecně oblast E2A adenoviru kóduje DBP (protein vázající DNA), což je polypeptid nutný pro replikaci DNA. DBP se skládá z 473 až 529 aminokyselin v závislosti na virovém sérotypů. Věří se, že DBP je asymetrický protein, který existuje jako protáhlý elipsoid obsahující globulární Ct s rozšířenou Nt doménou. Studie indikují, že Ct doména je odpovědná za schopnost DBP vázat se na nukleové kyseliny, vázat se na zinek a podílet se na syntéze DNA na úrovni elongace řetězce DNA. Věří se však, že doména Nt funguje při expresi pozdního genu jak na úrovni transkripce tak i na úrovni post-transkripčních úprav, je odpovědná za účinou lokalizaci proteinu v jádru a také se podílí na zesílení své vlastní exprese. Delece v doméně Nt mezi aminokyselinami 2 až 38 indikovaly, že tato oblast je důležitá při fungování DBP. (Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)). Zatímco delece v oblasti E2A kódující oblast Ct proteinu DBP nemá účinek na produkci viru, delece v oblasti E2A kóduje aminokyseliny 2 až 38 domény Nt proteinu DBP, poškozuje produkci viru. Proto se upřednostňuje, aby vícenásobně replikačně deficitní adenovirový vektor obsahoval tuto část oblasti E2A adenovirového genomu.
Zvláště se požaduje, aby se uchovala část oblasti E2A, což je ta část oblasti E2A adenovirového genomu, která se definuje 5zkoncem oblasti E2A, specificky pozicemi Ad5(23816) až Ad5(24032) oblasti E2A adenovirového genomu sérotypů Ad5, která propůjčuje vektoru replikační kompetenci v komplementární buněčné linii. Tato část adenovirového genomu se musí zahrnout do adenovirového genomu, protože není doplněna v buněčných liniích E2A a v její nepřítomnosti nelze • · ··· · • · φ · « dosáhnout v komplementárních buněčných liniích požadované úrovně produkce viru a exprese vlákna.
Jedna libovolná z deletovaných oblastí může být nahrazena expresivní kazetou s variabilním promotorem za účelem produkce produktu cizího genu, který je cizorodý vzhledem k adenoviru. Inzerce cizorodého genu do oblasti E2A může například být provedena zavedením jediného restrikčního místa tak, že produkt cizorodého genu se může exprimovat z promotoru E2A. Také se zahrnují adenovirové vektory, které jsou deficitní v pozdní oblasti genomu, adenovirové vektory, které jsou deficitní v časných a pozdních oblastech genomu stejně jako vektory, ze kterých se odstranil v podstatě celý genom; v jejich případě se preferuje, že nejméně buď virová obrácená terminální repetice a některý z promotorů nebo virová obrácená terminální repetice a signál balení zůstávají nedotčeny. Odborník ocení, že čím větší oblast adenovirového genomu je odstraněna tím větší kus exógenní DNA může být do genomu začleněn. Jestliže adenovirový genom je 36 kb velký a virová obrácená terminální repetice a některý z promotorů zůstanou nedotčeny, pak kapacita adenoviru je přibližně 35 kb. V jiném případě se může vytvořit vícenásobně deficitní adenovirový vektor, který obsahuje pouze ITR a signál balení. Což umožňuje expresi cizorodé DNA o velikosti 37 až 38 kb. Samozřejmě inkluze intergenové sekvence v libovolné nebo ve všech adenovirových oblastech bude snižovat kapacitu adenovirového vektoru ve velikosti, která koresponduje s velikostí intergenové sekvence.
Konstrukce virového vektoru spoléhá na vysokou úroveň rekombinace mezi fragmenty adenovirové DNA v buňce. Dva nebo tři fragmenty adenovirové DNA, které obsahují oblasti podobnosti (nebo přesahu) fragmentůa ustanovují délku genomu se transfekují do buňky. Rekombinací shora zmiňovaných fragmentů v hostitelské buňce se konstruuje virový vektorový • · · · · · • ·· · · ♦· • · · · ··· · <
• · · · · I ·· ·· ·· genom. v plné délce. Další vhodné postupy konstrukce virů, které obsahují změny různých jednotlivých oblastí už byly popsány (Berkner et al., Nucleic Acids Res., 12, 925-941 (1984); Berkner et al., Nucleic Acids Res., 11, 6003-6020 (1983); Brough et al., Virol., 190, 624-634 (1992)) a mohou se použít ke konstrukci vícenásobně deficitních virů; mohou se použít další vhodné postupy zahrnující například in vitro rekombinaci a ligaci.
První krok při konstrukci vektoru je konstrukce delece nebo modifikace (jako je přidání intergenové sekvence nebo delece oblasti) určité oblasti adenovirového genomu v kazetě plasmidu za použití standardních molekulárních biologických metod. Po extenzivní analýze se tato pozměněnná DNA (obsahující deleci nebo modifikaci) přenese do daleko většího plazmidu, který obsahuje až jednu polovinu adenovirového genomu. Další krok je transfekce plazmidové DNA (která obsahuje deleci nebo modifikaci) a velkého kusu adenovirového genomu do recipientní buňky. Tyto dva kusy DNA dohromady zahrnují celý adenovirový genom a oblast podobnosti. V této oblasti podobnosti probíhá rekombinace za vzniku rekombinovaného virového genomu, který zahrnuje deleci nebo modifikaci. V případě vícenásobně replikačně deficitních vektorů recipientní buňka zabezpečí ne pouze funkce rekombinace, ale také všechny chybějící virové funkce, které nejsou obsaženy v transfekovaném virovém genomu, tak se doplní libovolná nedostatečnost rekombinovaného virového genomu. Vícenásobně replikačně deficitní vektor se může dále modifikovat změnou ITR a/nebo signálu balení, například tak, že vícenásobně replikačně deficitní vektor funguje nebo roste pouze v komplementární buněčné linii.
Vynález popisuje komplementární buněčné linie vhodné pro pomnožení nebo růst vícenásobně deficitních adenovirových vektorů. Preferované buněčné linie podle vynálezu jsou • · · · • · · ♦ 4 • · 4 «· ·· v jedné z ty, které genových doplňuj í deficitního za použití charakterizovány komplementací nejméně jedné z genových funkcí, které vykazují oblasti El, E2 a E4 adenovirového genomu. Jiné buněčné linie zahrnují ty, které doplňují adenovirové vektory deficitní nejméně funkcí, zahrnujících pozdní oblasti, kombinaci funkcí časných a pozdních genů a ty, jež doplňují všechny adenovirové funkce. Odborník ocení, je-li zvolená buněčná linie taková, že specificky doplňuje funkce, jež chybějí u daného rekombinantního vícenásobně adenovirového vektoru a jež se vytvoří standardních molekulárně biologických metod. Buněčné linie jsou dále charakterizovány obsahem komplementárních genů tak, že se nepřekrývají, což minimalizuje a prakticky eliminuje možnost rekombinace vektorového genomu s buněčnou DNA. Ze zásob vektorů jsou tak eliminovány replikačně kompetentní adenoviry a tyto vektory jsou proto vhodné pro úrčité terapeutické účely, zvláště pro účely genové terapie. To také eliminuje replikaci adenovirů v nekomplementárních buňkách.
Komplementární buněčná linie musí být schopna exprimovat produkty dvou nebo více deficientních adenovirových genových funkcí v množství vhodném pro tyto produkty za účelem vytvořit vysoký titr zásobního rekombinantního adenovirového vektoru. Pro replikaci adenovirové DNA je například nezbytné exprimovat produkt E2A DBP v stechiometrickém množství, tj. na relativně vysoké úrovni, ale produkt E2B Ad pol je pro replikaci adenovirové DNA nezbytný pouze v katalytickém množství, tj. v relativně malém množství. Aby se zajistil vysoký titr rekombinantního adenovirového vektoru, je nutné, aby nejenom množství produktu bylo vhodné, ale také musí být dočasná exprese produktu konzistentní s produkcí, ke které dochází při normální virové infekci buňky. Například se musejí komponenty nezbytné pro replikaci virové DNA exprimovat před komponenty, které
J sou • · · · ·· 44 ··
4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 ··· • ·· ·· · · · · 4 • · 4 · · · · • 4 44 »♦ ·· nezbytné při sestavení virionů. Za účelem předejít buněčné toxicitě, která často doprovází silnou expresi virových produktů a za účelem regulace dočasné exprese produktů se používají indukovatelné promotorové systémy. Při expresi celé oblasti E4, otevřeného čtecího rámce 6 oblasti E4 a oblasti E2A se může použít například ovčí metalothioninový indukovatelný promotorový systém. Jiné příklady vhodného indukovatelného promotorového systému zahrnují například bakteriální lac operon, T7 polymerázový systém, tetracyklinový operon a kombinace a chimérické konstrukce eukaryontních a prokaryontních transkripčních faktorů, represorů a jiných komponentů. V případě, že exprimovaný produkt je vysoce toxický, je nutné použít bipartitní indukovatelný systém, kde indukční činidlo je neseno virovým vektorem a indukovatelný produkt je na chromatinu komplementární buněčné linie. Mohou se také použít potlačitelné/indukovatelné expresní systémy, jako je tetracyklinový expresivní systém a lac expresivní systém.
DNA, která vstupuje do malého podílu transfektovaných buněk, se může stát stabilní dokonce i v malých frakcích. Izolace buněčné linie, která exprimuje jeden nebo více transfekovaných genů, se dosáhne tím, že se do stejné buňky zavede druhý gen (reportní gen), který například předá buňce rezistenci na antibiotika, léky nebo jinou látku. Tento výběr je založen na skutečnosti, že v přítomnosti antibiotik, léků nebo jiné látky buňka, která neobsahuje transferovaný gen, umírá, zatímco buňka, jenž transferovaný gen obsahuje, přežije. Buňka, která přežije, je pak klonálně izolována a vznikají z ní jednotlivé buněčné linie. Do těchto buněčných linií patří ty, které exprimují reportní gen a gen nebo geny, o které je zájem. Propagace buněk závisí na rodičovské buněčné linii a způsobu selekce. Transfekce buňky také závisí na typu buňky. Nejběžnějším způsobem transfekce jsou srážení • · · · • · ·
• ·· fosforečnanem vápenatým, transfer DNA zprostředkovaný lipozómy nebo DEAE dextranem.
Je možná řada modifikací a variací ilustrativních sekvencí DNA a plazmidů. Například degenerace genetického kódu umožňuje substituci nukleotidů v celé délce kódujících oblastí polypeptidu a signálu terminace translace, aniž se změní kódovaná polypeptidová kódující sekvence. Takové substituovatelné sekvence se mohou dedukovat ze známé aminokyselinové sekvence nebo sekvence DNA danného genu a může se konstruovat běžnou syntézou nebo způsobem místně specifické mutageneze. Způsoby syntézy DNA mohou proběhnout v podstatě v souladu se způsoby popsanými v publikacích Itakura et al., Science, 198, 1056 (1977) a Crea et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978). Způsoby místně specifické mutageneze se popisují v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989). Proto vynález není žádným způsobem omezen na sekvence DNA a plazmidy, které jsou uvedeny v této přihlášce. Uvedené vektory se používají při genové terapii cystické fjbrózy, protože obsahují a exprimují cystický fibrózní transmembránový regulační gen (CFTR), avšak popsané vektory lze snadno pozměnit za účelem léčby dalších nemocí, jako jsou například jiná chronická onemocnění plic, např. emfyzém, astma, respirační syndrom úzkosti u dospělých a chronická bronchitida, zhoubné bujení, koronární onemocnění srdce a další choroby, které je možné léčit nebo jim předcházet genovou terapií, vakcinací a podobně. Do vícenásobně deficitního adenovirového vektoru je možné začlenit libovolný gen nebo sekvenci DNA. Volba genu nebo sekvence DNA ovlivňuje terapeutický a/nebo profylaktický účinek, například v kontextu s genovou terapií, vakcinací a podobně.
Odborník přivítá existenci vhodných metod pro aplikaci zvířatům vícenásobně deficitního adenovirového vektoru podle vynálezu pro léčebné a profylaktické účely, například genová terapie, vakcinace a podobně (Rosenfeld et al., Science, 252, 431-434 (1991), Jaffe et al., Clin. Res., 39(2), 302A (1991), Rosenfeld et al. , Clin. Res., 39(2), 311A (1991), Berkner, BioTechniques, 6, 616-629 (1988)), ačkoli pro aplikaci jednoho vektoru se může použít více jak jeden způsob, každý způsob může vyfc&zovat jiný účinek. Odborníci také dobře znají běžně dostupné farmaceuticky přijatelné eXcipienty. Volba eXcipientu je částečně dárr^p. určitým způsobem aplikace kompozice. S ohledem na to existuje velká řada vhodných formulací faramceutické kompozice podle vynálezu. Následující formulace a způsoby podle vynálezu jsou pouze příklady, ale v žádném případě nejsou omezující. Preferují se však orální, injekční a aerosolové formulace.
Formulace vhodné pro orální aplikaci mohou obsahovat (a) kapalné roztoky, účinné množství látky rozpuštěné v ředidle, kterým je například voda, fyziologický roztok nebo pomerančový džus; (b) kapsule, tobolky nebo tablety, přičemž každá obsahuje předem určené množství aktivní látky v pevné formě nebo v granulých; (c) suspenze ve vhodných roztocích; a (d) vhodné emulze. Tabletové formy mohou zahrnovat jednu nebo více látek ze skupiny, která zahrnuje laktózu, manitol, kukuřičný škrob, bramborový škrob, mikrokystalickou celulózu, arabskou gumu, želatinu, koloidní oxid křemičitý, kroskarmelóza sodíku, talek, stearat hořčíku, kyselinu stearovou a jiné eXcipienty, jako jsou barviva, ředidla, pufry, zvlhčovači činidla, konzervační a aromatizační přísady a farmakologicky kompatibilní eXcipienty. Formy zdravotních boWibonů mohou obsahovat ochucenou aktivní látku, obvykle se používá sacharóza a arabská guma nebo tragakant. Pastilky zahrnují aktivní látku obsaženou v inertní bázi, jako je želatina a glycerin nebo sacharóza a arabská guma, v • · · · «· φφ » · · <
» Φ·>
• · · ·
Φ Φ '
ΦΦ Φ· například vody, suspenze podle emulzích, gelech a podobně, které obsahují mimo aktivní látky navíc e&cipienty známé v oboru.
Vektory podle vynálezu samotné nebo v kombinaci s jinými vhodnými komponenty se mohou připravovat do aerosolových formulací, které se aplikají inhalací. Tyto aerosolové formulace se plní s tlakovanou přijatelnou hnací látkou, jako je dichloro difluorometan, propan, dusík a podobně. Také se mohou připravovat jako léky v netlakovaných formách, jako jsou zmlžovače a rozprašovače.
Formulace vhodné pro parenterální aplikaci zahrnují vodné a nevodné izotonické sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostaty a rozpouštědla, která tvoří formulaci izotonickou s krví recipienta a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující činidla, solubilizátory, zahušťovací činidla, stabilizátory a konzervační činidla. Formulace se vyskytují v jednotkové dávce nebo ve vícenásobné dávce v uzavřených kontejnerech, jako jsou ampule a lahvičky, a mohou se skladovat lyofilizovaném stavu, což vyžaduje pro aplikaci injekcí pouze přidání sterilního kapalného ekcipientu, těsně před použitím. Injekční roztok nebo předpisu se připraví ze shora popsaného sterilního prášku, granulí a tablet.
Navíc vektory, které se používají podle vynálezu, se mohou aplikovat jako čípky smícháním s různými bázemi, jako jsou emulzifikační nebo ve vodě rozpustné báze.
Formulace vhodné pro vaginální aplikaci se připravují ve formě pesarů, tampónů, krémů, gelů, past, pěn nebo sprejů, které obsahují mimo aktivní látky vhodné nosiče.
Dávka aplikována zvířeti, zvláště pak lidem podle vynálezu se bude měnit v závislosti na genu nebo jiné sekvenci, použité kompozici, způsobu aplikace a místa a organizmu, který se léčí. Dávka by měla být dostatečná, aby • · ·· ► · ♦ * > · ·· způsobila požadovanou odezvu, například terapeutickou nebo profylaktickou odezvu, v požadovaném časovém úseku,.
Vícenásobně deficitní adenovirové vektory a komplementární buněčné linie podle vynálezu jsou využitelné také in vitro. Mohou se například používat při studiu funkce adenovirového genu a sestavení nebo expresi cizorodé DNA ve vhodné cílové buňce. Odborník může určit vhodnou cílovou buňku tak, že vybere buňku, která může být transfikována adenovirovým vektorem podle vynálezu a/nebo infikována adenovirovými částicemi, což vede k expresi začleněného adenovirového komplementu DNA. Přednostně se volí zaková cílová buňka, která má receptory pro zachycení a penetraci adenoviru do buňky. Takové buňky zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, buňky původně izolované z jakéhokoli savce. Jakmile byla vybrána vhodná cílová buňka, uvede se do styku s rekombinantním vícenásobně deficitním adenovirovým vektorem nebo adenovirovou částicí podle vynálezu, která obsahuje cizorodou DNA, přičemž dochází k transfekci, resp. infekci. Pak se měří známými konvenčními metodami exprese, toxicita a jiné parametry týkající se inserce a aktivity cizorodé DNA v cílové buňce. Přitom mohou výzkumníci poznávat a osvětlovat jevy související s adenovirovou infekcí, jakož i účinnost a účinek exprese různých sekvencí cizorodé DNA, zavedených vektorem podle vynálezu do různých buněčných typů, získaných z různých organismů a studovaných v tkáňových kulturách.
Navíc je možno výhodně manipulovat in vitro s buňkami, odebranými pacientovi, trpícímu onemocněním, jež se vhodně ošetřuje genovou terapií v souvislosti s vynálezem. Například se buňky kultivované in vitro z takového jedince uvedou do styku s adenovirovým vektorem podle vynálezu za vhodných podmínek pro transfekci, které odborník snadno určí, přičemž vektor zahrnuje vhodnou cizorodou DNA. Výsledkem je výhodně transfekce vektoru do kultivovaných buněk, přičemž se • · * · ·· ·· * · · * • « ·· transfikované buňky vybírají pro použití vhodného markéru a selektivních podmínek kultivace. Přitom se testováním vitality buněk standardními metodami, a tedy měřením toxicity, a zjiš'továním přítomnosti genových produktů cizorodého genu nebo genů daného vektoru, a tedy měřením exprese, buňky jedince testují na kompataibilitu, expresi a toxicitu daného vektoru obsahujícího cizorodý gen, což poskytuje informace ohledně vhodnosti a účinnosti léčby jedince tímto testovaným sytémem vektor/cizorodá DNA. Takové odebrané a transfikované buňky, kromě toho, že slouží k testování potencionální účinnosti/toxicity režimu dané genové terapie, mohou být vráceny zpět do těla jedince ve formě in vivo. Mohou být do těla jedince vráceny bez změny s výjimkou in vitro transfekce, nebo obaleny matricí nebo zasazeny do matrice, která je separuje od jiných tkání a buněk těla jedince. Jako taková matrice může sloužit jakýkoli vhodný biokompatibilní materiál, zahrnující kolagen, celulózu apod. Jakmile se pozoruje pozitivní odezva na in vitro test, je samozřejmě možno místo toho nebo navíc provést transfekci in šitu způsobem aplikace, popsaným dále v textu.
Následující příklady dále osvětlují vynález a samozřejmě ho neomezují. Enzymy uvedené v příkladech jsou dostupné, není-li uvedeno jinak, z Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithesburg, MD 20877, New England Biolabs lne. (NEB), Beverly, MA 01915 nebo Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB), 7941 Castleway Drive, Indianapolis, IN 46250 a používají se v podstatě podle návodu výrobce. Řada dalších zde používaných metod je odobrníkům známa. Metody molekulární biologie jsou podrobně popsány ve vhodných laboratorních příručkách, jako je Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989) a Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. (1987)). Alternativní metody jsou odborníkovi známy. Ačkoli «· · · » · · 9 9 * · ♦♦ příklady a obrázky se vztahují na AdGv.10, AdCT.ll, AdGv.llS, AdGv.12 a AdGV.13, které například obsahují reportní gen nebo terapeutický gen, jako je cystický fibrozní transmembránový regulační gen (CFTR) , a zahrnují například AdGV.CFTR. 10, Adsv.CFTR.ll, AdGv. CFTR. 11S, AdGV.CFTR.12 a AdGV. CFTR. 13, nejsou tyto vektory omezeny na expresi genu CFTR a mohou se použít pro expresi jiných genů a sekvencí DNA. Například pak vynález zahrnuje vektory, zahrnující libovolnou vhodnou sekvenci DNA, která může být cizorodým genem, jeho fragmentem nebo jinou sekvencí DNA. Taková vhodná sekvence DNA se může využít v genové terapii pro léčbu nemocí, pro něž je genová terapie vhodnou léčbou. Vhodná sekvence DNA se může také použít profylakticky, například když je schopna exprese v savci, přičemž vzniká například polypeptid schopný vyvolat imunitní odezvu, jako se používá při vakcinaci. Dalším alternativním použitím vhodné sekvence DNA schopné exprese v savci je poskytnutí jiného vhodného terapeutického a/nebo profylaktického prostředku, jako je antisense molekula, zvláště antisense molekula vybraná ze skupiny zahrnující mRNA a syntetické oligonukleotidy.
Přehled obrázků na výkrese
Na obrázku č. 1 jsou znázorněny schématické diagramy virových vektorů AdGVCFTR.10L a AdGVCFTR. 10R.
Na obrázku č. 2 je schématický diagram virového vektoru
AdGVCFTR . 11. •
Na obrázku č. 3 je schématický i diagram virového vektoru {
AdGVCFTR .13.
Na obrázku č. 4 je schématický diagram expresivního
vektoru E2A.
Na obrázku č. 5 je uveden imunoblot používaný pro
testování síly indukované DBP exprese v určitých klonálních buněnčných liniích 293/E2A.
»»»·
Na obrázku č. 6 je uveden imunoblot, který se používal pro analýzu akumulace DBP určitými klonálními buněčnými liniemi 293/E2A během prvních 24 hodin indukce.
Na obrázku č. 7 jsou znázorněny schématické diagramy virových vektorů AdGVCFTR.10L a AdGVCFTR. 12B.
Na obrázku č. 8 je fotografie gelu s DNA obarveného v etidium bromidu, která poskytuje data vztahující se k detekci pomocí PCR virového vektoru AdGVCFTR z pasážovaných transfekovaných lyzátů.
Obrázek č. 9 je schématický diagram virového vektoru AdGVLuc; E2GUS .
Obrázek č. 10 je schématický diagram expresivního vektoru E4-ORF6.
Obrázek č. 11 je fotografie gelu s DNA obarveného v etidium bromidu, která poskytuje data vztahující se k detekci pomocí PCR E4 deleční oblasti v pasážovaných lyzátech AdGV3gal. 11.
Na obrázku č. 12 je sloupcový graf zobrazující množství viru produkovaného (PFU/buňku na ose y) E4 delečním virem, který si po infekci různých buněčných linií udržuje funkci oblasti El.
Na obrázku č. 13 je schématický diagram virového vektoru AdGVPgal. 11.
Obrázky č. 14 A až C jsou schématické diagramy srovnávající oblast vlákno/E4 vektorů ve kterých: sekvence E4 jsou zcela deletovány a sekvence vlákna L5 fúzuje s pravostranou ITR (obrázek č. 14A) , E4 kódující sekvence jsou deletovány a sekvence vlákna L5 se fúzuje s promotorem E4 a s pravostranou ITR za vzniku vektoru AdGV.ll (obrázek č. 14B) a E4 kódující sekvence jsou deletovány a mezi oblast vlákna L5 a pravostraríou ITR se přidaly sekvence (zahrnující polyadenylační sekvenci SV40) za vzniku vektoru AdGVCFTR.llS (obrázek č. 14C) založeném na AdGV.llS. Symboly: ITR,
• 4 '4 *
4444
4 4 4 • 4·
4 44
4 4
4 4 • 4 44
4 4
4 « 44 4 4
4 obrácená terminální repetice; Mfe I (izoschizomér Mun I), Pac I, Eag I, palindromická rozeznávající místa těchto enzymů; GUS, kódující sekvence β-glukuronidázy; SV40 polyA, polyadenylační místo opičího viru 40; E4p, promotor E4.
Obrázek č. 15 reprezentuje imunoblot různých buněčných lyzátů 293/ORF6 buď neinfikovaných vektorem (slepá infekce) (dráha 1), infikovaných El deficitním vektorem Ad^gal.lO (dráha 2) nebo El a E4 deficitním vektorem AdcvPgal.il (dráha 3) . Imunoblot se připravil za použití králičího séra, které rozeznává všechny strukturální proteiny adenovirového kapsidu.
Obrázek č. 16 ukazuje imunoblot izolovaných kapsidů získaných z různých buněčných lyzátů 293/ORF6 infikovaných buď El a E3 deficitním vektorem AdGV3gal.l0 (dráha 1) nebo El a E4 deficitním vektorem Ad^gal.ll (dráha 2). Imunoblot se připravil za použití protilátek proti adenovirovému proteinu vlákna.
Obrázek č. 17 ukazuje imunoblot různých buněčných lyzátů 293/ORF 6 buď neinfikovaných vektorem (slepá infekce) (dráha 1) nebo infikovaných El a E3 deficitním vektorem AdGvPgal.lO (dráha 2) nebo El a E4 deficitním vektorem AdGVBgal.ll (dráha 3) nebo El, E3 a E4 deficitním vektorem AcLy llS-založený vektor AdGVCFTR. 11S, který obsahuje v oblasti delec& E4 intergenovou sekvenci (dráha 4) . Imunoblot se připravil za použití protilátek proti adenovirovému proteinu vlákna.
Obrázek č. 18 je graf množství aktivního vektoru (fokální tvořící se jednotky; ffu) na buňku versus hodiny po infekci pro buňky A232 infikované El a E3 deficitním AdGv.10založeným vektorem AdGVPgal.lO (plné čtverce), infikované El a E4 deficitním AdGV· 11-založeným vektorem AdGvPgal.ll (prázdné kosočtverce), nebo El, E3 a E4 deficitním AdGV.llS444·
44 • 4 4 4 • · 44 • 9 9 9
9 9 9 ·4 • 4 • 4 4 • · • 4 · 4 • 4
4« založeným vektorem AdGVCFTR. 11S, který obsahuje intergenovou sekvenci v oblasti delece E4 (prázdné kruhy).
Obrázek č. 19 je schématický diagram genu E2a přeloženého do proteinu E2A divokého typu a odpovídající oblastem překládaným adenovirových delečních vektorů <51801, <52802. a <52803 a účinel takové translace je růst. Zkratky a symboly: Nt, oblast genového produktu E2A implikovaného v lokalizaci jádra a exprese pozdního genu; Ct, oblast genového produktu Ε2Ά implikovaného v replikaci DNA, navázání ssDNA a navázáni mRNA; DBP, genový produkt E2A (to je protein vázající se na jednořetězcovou DNA); rovná čára, oblast kódující sekvence E2A, která se překládá v rámci v delečních vektorech; lomená čára, oblast kódující sekvence E2A, která se překládá z rámce v delečních vektorech v důsledku delece sekvencí E2A; +++, chování růstu divokého typu; +, redukovaný virový růst; -/+, silněji redukovaný virový růst, Čéhež je důkaz tvoření malých plaků.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad popisuje vznik jednoho provedení, které zahrnuje AdGV.10, jmenovitě AdGVCFTR.10, které je deficitní v oblastech El a E3.
AdGVCFTR.10 exprimuje gen CFTR z časného promotoru cytomegaloviru (CMV). Zkonstruovaly se dvě generace tohoto vektoru a označily se jako AdGVCFTR.10L a AdGVCFTR. 10R, v závislosti na směru, ve kterém je exprisivní kazeta CFTR umístěna v oblasti El ve vztahu k genomu vektoru, jak ukazuje obrázek č. 1, který znázorňuje schématický diagram AdGVCFTR.10L a AčbvCFTR. 10R.
Konstrukce expresivní kazety CFTR byla provedena následovně. PRK5 (Genentech lne., South San Francisco, CA) se «9 ·· · 99·· • · 9 · ·· • 9 · · · * ·
9·· ·· ·· ·* ··♦· ·· • · · • · ·· • · • 9 9· štěpil restrikčním enzymem KpnI (New Englnd Biolabs (NEB), Beverly, MA) , konce byly upraveny na tupé konce nuklázou z fazolí mungo (NEB) a do Κρη I restrikčního místa se ligoval Xho I linker (NEB). Výsledný vektor se pojmenoval pRK5-Xho I. pRK5-Xho I se pak štěpil restrikčními enzymemy Srna I (NEB) a Hind III (NEB) a tupé konce se upravily nukleázou z fazolí mungo. Plazmid obsahující gen CFTR pBQ4.7 (Dr. Lap-Chee Tsui, Hospital for Sick Children, Toronto, Canada) se štěpil restrikčními enzymy Ava I (NEB) a Sac I (NEB) a tupé konce se upravily nukleázou z fazolí mungo. Tyto dva fragmenty se izolovaly a ligovaly se dohromady za vzniku pRK5-CFTRl, což je xepresivní kazeta CFTR.
pRK5-CFTRl se štěpila restrikčními enzymy Spe I (NEB) a Xho I a tupé konce se upravily Klenow enzymem (NEB). pAd60.454 (Dr. L. E. Babiss, The Rockefeller University, New Yourk, NY), který obsahuje Ad5 sekvence z 1-454/3325-5788, se štěpil restrikčním enzymem Bgl II (NEB) a tupé konce se upravily Klenow. Tyto dva fragmenty se izolovaly od sekvencí vektoru na agaróze tající za nízké teploty (Maniatis et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989)) a ligovaly se dohromady za vzniku levého ramene plazmidů pGVCFTR.IOL a pGVCFTR.lOR.
Levé rameno plazmidů pGVCFTR.IOL nebo pGVCFTR.lOR se štěpilo restrikčním enzymem Nhe I (NEB). Pravé rameno viru vzniklo štěpením Ad5d2324 (Dr. Thomas E. Shenk, Princeton University, Princeton, NJ) pomocí restrikčního enzymu Cla I (NEB) . Dva fragmenty, malý o velikosti 918 bp a velký o přibližné velikosti 32 800 bp, se separovaly na sacharózovém gradientu centrifugací (Maniatis et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989)). Velký fragment se smíchal s fragmenty levého ramene plazmidů a transfekoval se do buněk 293 podle standardního protokolu fosforečnanem vápenatým (Graham et al., Virology, 52, 456 »·♦· φ ·
(1973)). Výsledné rekombinantní viry se čistily pomocí plaků na buňkách 293 a připravila se zásoba viru podle standardní virologické metody (např. Berkner et al., Nucleic Acids Res., 12, 925-941 (1984); Berkner et al. , Nucleic Acids Res., 11, 6003-6020 (1983)).
Příklad 2
Tento příklad popisuje vznik jednoho provedení, které zahrnuje AdGV. 11, jmenovitě AdGVCFTR.ll, které je deficitní v oblastech El, E3 a E4.
Pro AdGV.ll je charakteristická celková eliminace oblasti E4. Tato velká delece umožňuje inzerci exogenní DNA až o velikosti lOkb. Důležitější je, že jiná oblast genomu je náchylná pro zavedení expresivních kazet cizorodé DNA Za použití vektorů AdGVCFTR.ll. Tato delece umožňuje zavedení větších expresivních kazet jiných produktů, například rozpustných receptorů, to je TNF nebo IL-6 bez transmembránové domény tak, že nyní nejsou připojeny na membránu a antisense molekuly, například ty určené proti produktům regulující buněčný cyklus, jako je cdc2, cdk kinázy, cykliny, to je cyklin E nebo cyklín D a faktory transkripce, to je E2F nebo c-myc, aby eliminovaly zánět a imunní odezvy.
AdGVCFTR.ll se zkonstruoval způsobem jediné in vivo rekombinace mezi 1 až 27082, to znamená mezi levým ramenem AdGVCFTR.10 a plazmidem (pGVllA, pGVHB, pGVHC nebo pGVHD; detailně popsáno dále v textu) obsahující 21562 až 35935, to je pravé rameno Ad5 linearizované restrikčními enzymy BamH I a Sal I (NEB), do kterého se zavedly různé změny E3 a E4, jak se popisuje dále v textu.
Levé rameno AdGVCFTR.10 se izolovalo na konkávním 10 až 40% sacharózovém gradientu, kde 1/4 celkového roztoku je 40%. AdGVCFTR.10 se štěpil restrikčními enzymy Spe I (NEB) a Srf I >·»· ··
• · • · * « • · ·· ··· ♦ · • · · ·« ·« (Stratagen^ La Jolla, CA) za vzniku fragmentu o velikosti 1 až 27082 bp.
Pravé rameno se získalo štěpením modifikovaného vektoru pGEM (pGBS) restrikčními enzymy Bam HI a Sal I. PGBS vznikl následovně. pGeml (Promega, Madison, WI) se štěpil restrikčním enzymem EcoR I a tupé konce se upravily Klenow. Do vektoru se ligoval Sal I linker. Výsledná DNA se pak štěpila restrikčním enzymem Sal I a znovu se ligovala, přičemž restrikční místo EcoR I se nahradilo restrikčním místem Sal I a deletovala se sekvence mezi dvěma restrikčními místy Sal I za vzniku pGEMH/P/S, které se štěpilo restrikčním enzymem Hind III a konce se upravily Klenow. Do vektoru se ligoval BamH I linker za vzniku pGEMS/B. pGEMS/B se štěpila restrikčními enzymy Bam HI a Sal I a ligovala se s Bam HI a Sal I fragmentem o velikosti 14 kb (21562 až 35935 z Ad5) z pBR plazmidu, který se nazývá p50-100 (Dr. Paul Freimuth, Colombia University, NY) za vzniku pGBS.
Pozměnil se pGBSÁE3 za vzniku plazmidu s pravým ramenem, ve kterém je deletována celá oblast E4. Výsledný plazmid, ve kterém jsou deletovány celé oblasti E3 a E4 se nazývá pGVll(O). To se provedlo zavedením restrikčního místa Pac I do Afl III místa v pozici 32811 a Bsq I místa v pozici 35640. Délece fragmentu Pac I mezi těmito dvěma místy účinně eliminuje všechny sekvence E4 zahrnující E4 TATA element s E4 promotorem a polyA místem.
Tři různé verze plazmidu s pravým ramenem se zkonstruovaly za účelem zavedení produktů dvou Ad E3 genu do adenovirového vektoru. Tyto produkty mají antiimunitní a protizánětlivé vlastnosti. Velká delece E3 v pGBSÁE3ORF6, označená pGVll(O) (příklad 7) byla podstatně nahrazena třemi různými verzemi expresivní kazety obsahující promotor dlouhé terminální repetice viru Rousova sarkomu, který řídí expresi bicistronní mRNA, která obsahuje na 5zkonci Ad2 E3 anti-
• ·· ·· ·· ·· ·· ···· · ·· · • · ·· · · ·« imunní genový produkt o molekulové hmotnosti 19 a na 3konci Ad5 E3 protizánětlivý genový produkt o molekulové hmotnosti 14,7. Další virus se zkonstruoval delecí fragmentu cDNA o molekulové hmotnosti 19 pomocí restrikčního enzymu Bst BI (NEB). Tento virus, označený jako AdGVCFTR.11(D), obsahuje RSV-LTR promotor, který řídí expresi monocistronní mRNA obsahující pouze E3 protizánětlivý genový produkt o molekulové hmotnosti 14,7.
Fragment restrikčních enzymů Spe I (27082) a Ndel (31089) z pGBSÁE3 (příklad 4) se subklonoval do pUC 19 při prvním klónování fragmentu EcoR I (27331) a Nde I (31089) do identických míst v polylinkru PUC 19. Fragment Hind III (26328) a EcoR I (27331) vytvořený z pGB se pak klonoval do EcoR I místa tohoto klonu za vzniku pHNÁE3. Za použití vhodných primerů se vytvořil pomocí PCR fragment lemovaný restrikčními místy Xba I. Tento fragment obsahuje promotor RSV-LTR, Ad2 E3 genový produkt o molekulové hmotnosti 19 a Ad5 E3 genový produkt o molekulové hmotnosti 14,7. Amplifikovaný fragment se štěpil restrikčním enzymem Xbal a subklonoval se do pUC 19 za vzniku pXA. Po analýze Xba I fragmentu se fragment ligoval do pHNÁE3 za vzniku pHNRA.
Za použití vhodných primerů pomocí PCR vznikly dva fragmenty lemované restrikčními místy Bst BI, které kódují vnitřní ribozomální vstupní místa (IRES), o kterých se ví, že zesilují translaci mRNA, která je obsahuje (Jobling et al. , Nátuře, 325, 622-625 (1987); Jang et al. , Genes and Development, 4, 1560-1572 (1990)). Jeden fragment (verze B) obsahuje 34 bp IRES z nepřekládané vedoucí sekvence obalového proteinu mRNA alfaalfa mozajkového viru (AMV RNA 4 vedoucí sekvence) (Jobling et al., Nátuře, 325, 622-625 (1987)). Další fragment (verze C) obsahuje 570 bp IRES z 5'nepřekládané oblasti mRNA viru encefalomyokarditidy (EMCV) (Jang et al. , Genes and Development, 4, 1560-1572 (1990)).
····
Každý Bst BI fragment z verze B nebo C se klonoval na místo Bst BI fragmentu v pXA. Výsledné plazmidy, které se nazývají pXB a pXC, se přenesly po sekvenční analýze Xba I fragmentů do pHNÁE3 za vzniku pHNRB a pHNRC.
Fragment Spěl (27082) a Ndel (31089) z pGBSÁE3ORF6 nahradily Spěl a Ndel fragmenty z pHNRA, pHNRB, pHNRC a pHNRD za vzniku pGVHA, pGVHB, pGVHC a pGVUD.
DNA plazmidu pGVX se linearizovala restrikčními enzymy BamHI a Sáli a smísila se s fragmentem DNA levého ramene v různých koncentracích, kde bylo přibližně 20gg celkové DNA, užívá se sperma lososa nebo DNA telecího týmu (Life Technologies, Gaithersburg, MA) . Směs fragmentů se pak transfekovala do buněk 293 za použití standardní metody s fosforečnanem vápenatým (Graham et al., Virology, 52, 456 (1973)). Používá se buď buněčná linie 293/E4 nebo 293/ORF6.
Pět dnů po transfekci se izolovala monovrstva buněk zmrazením a rozmražením ve třech cyklech. Výsledný hybridní virus se titroval za použití buněk 293avypíchly se izolované plaky. Proces izolace plak se opakoval dvakrát. Zásoba izolovaných plaků se pak pomnožila na velkou zásobu viru podle standardních virologických metod, jak popisuje Burlseson et al. , v Virology: a Laboratory Manual, Academie Press lne. (1992).
Protože E4 obsahůdj. podstatné genové produkty, které jsou nezbytné pro růst viru, výsledný mutantní virus s delecí E4 nemůže růst v nepřítomnosti exogenně exprimované E4. Proto všechny manipulace virové konstrukce probíhají v nové buněnčné linii 293/E4 nebo 293/ORF6 (jak se popisuje v příkladu 6). Výsledným virem je AdGVCFTR.ll, který je uveden na obrázku č.2, srovnává se s AdGVCFTR.10L.
Příklad 3 ·· ·· « · · · • · ·· • « · · · • * · · ·· ·· ·· ·· • · · · • · ·· • •4 · « • · · *· ··
Tento příklad popisuje vznik AdGv.13, toje AdGVCFTR.13, který je deficitní v oblastech El, E2, E3 a E4.
AdGV.13 je charakterizován ne pouze celkovou eliminací El a E4 (jako u AdGV.ll), ale také celkovou eliminací E2A. Celá kódující oblast E2A se deletuje fúzí DNA z dvou E2A mutantních virů, jmenovitě H5in800a H5in804, které obsahují inzerce restrikčních míst Cla I na obouch koncích otevřeného čtecího rámce (Vos et al., Virology, 172, 634-642 (1989); Brough et al., 190, 624-634 (1992)). Restrikční místo Cla I H5in800 je v genu mezi kodony 2 a 3 a v H5in804 se nachází v terminačním kodonu genu E2A. Výsledný virus obsahuje otevřený čtecí rámec, který zahrnuje 23 aminokyselin, které nemají žádnou podobnost s otevřeným čtecím rámcem E2A. Důležitější je, že tato kazeta nabízí ještě další oblasti virového genomu, kam je možné zavést jediný gen. To se může provést zavedením genu do vhodného otevřeného čtecího rámce existujícího mini-ORF nebo zavedením další expresivní kazety, která obsahuje vedle genu své vlastní promotorové sekvence, polyadenylační signály a terminační sekvence.
Adenovirová DNA se připravila z H5in800 a H5in804. Po štěpení restrikčním enzymem Hind III (NEB) se Hind III A fragmenty z H5in800 a H5in804 klonovaly do pKS+ (Stratagene). Výsledné plazmidy se nazývaly pKS+H5in800Hin dlIIA a pKS+H5in804Hin dlIIA. Z pKS+H5in800Hin dlIIA se pak izoloval Cla I fragment a klonoval se na místo identického Cla I fragmentu z pKS+H5in804Hin dlIIA. Tento chimérický plazmid pHin dIIIA_E2A účinně odstraňuje všechny E2A čtecí rámce, jak se popisuje shora. V tomto okamžiku delece E2A se přesunula do restrikčních míst BamHI (NEB) a Spe I (NEB) za účelem nahradit sekvence divokého typu v pGV12(0) při konstrukci pGV13(0).
Virus AdGVCFTR.13 (obrázek č. 3) se zkonstruoval jak se popisuje shora v textu použitím DNA levého ramene AdGVCFTR.10
4444 • 4 44 • 4 4 · • 4 4 44 • 4 4 4 4 4 4 » 4 4 4 4 4
44 44
4 4
44 • 44 4 4 • 4 4
44 a DNA pravého ramene plazmidu pGV13(0). Pro konstrukci tohoto viru se jako recipientní buněčná linie používá buněčná linie 293/E4/E2A. Obrázek č. 3 znázorňuje schématický diagram virového vektoru AdGVCFTR.13. Diagram se porovnává s AdGVCFTR. 10L.
Příklad 4
Tento příklad popisuje konstrukci pGBSÁE3. Tento plazmid vznikl za účelem odstranit v pGBS většinu oblasti E3, což znamená promotor E3 a existující geny E3, aby vznikl prostor pro jiné konstrukce a bylo možné zavést expresivní kazety E3. Tento plazmid obsahuje deleci od pozice 28331 do 30469.
Fragment PCR za použití pGBS jako templátu a Ad5s(27324) a A5a(28330)X jako primerů. Výsledný fragment se štěpil restrikčními enzymy Eco RI (27331) a Xba I (28330) a čistil se na gelu. Tento fragment se pak zavedl do pGBS do restikčních míst Eco RI (27331) a Xba I (30470).
Příklad 5
Tento příklad popisuje konstrukci pGBSÁE3ÁE4.
Velká delece oblasti Ad5 E4 se zavedla dp pGBSÁE3 za účelem přenesení exogenních sekvencí do adenovirového genomu. Deletovaly se kódující E4 sekvence 32830 až 35566.
Restrikční místo Pac I vzniklo na místě restrikčního místa Mun I v pozici 32830 aplikací Klenow fragmentu na DNA pGBS štěpenou restrikčním enzymem Mun I a ligací linkru Pac I. Modifikovaná DNA se pak štěpila restrikčním enzymem Nde I a vzniklý fragment se o velikosti 1736 bp (Nde I 31089 až Pac I 32830) se čistil na gelu. Fragment PCR se připravil za použití A5 (35564)P (IDT, Coralville, IA) a primerů T7 (IDT, Coralville, IA) a pGBS jako templátu. Výsledný fragment se štěpil restrikčními enzymy Pac I a Sal I za vzniku Pac I ··· 99 ····
9 9 9 9
9 9 9 «9
35566 až Sal I 35935. Restrikční místo Sma I v oblasti polylinkru pUC 19 se ligací linkru Pac I změnilo na restrikční místo Pac I. Fragment Pac I 35566 až Sal I 35935 se přenesl do modifikovaného vektoru pUC 19 do restrikčních míst Pac I a Sal I do oblasti polylinkru. Modifikovaný fragment Ndel 31089 až Pac I 32830 se přenesl do plazmidu pUC 19, ve kterém se už nachází v restrikčních místech Nde I a Pac I zavedený fragment Pac I 35566 až Sal I 35935. Fragment Nde I 31089 až Sal I 35935 z plazmidu pUC 19 se čistil na gelu a klonoval se na místo restrikčních míst Nde I a Sal I v pGBSÁE3 za vzniku pGBSÁE3ÁE4.
Příklad 6
Příklad popisuje přípravu buněčné linie 293/E4.
Vektor pSMT/E4 se vytvořil následovně. Fragment Mun I (pozice 32825 Ad2) až Sph I (polylinkr) o velikosti 2753 bp se izoloval z pE4(89-99), což je plazmid pUC19, do kterého se subklonovala oblast 32264 až 35577 z Ad2 s tupými konci po aplikaci Klenow fragmentu a ošetřila se také fosfatázou (NEB). Fragment Mun I až Sph I o velikosti 2752 bp se ligoval do pMT010/A+ (McNeall et al. , Gene, 76, 81-89 (1989)), který se linearizoval restrikčním enzymem Bam HI a tupé konce se upravily Klenow fragmentem a oštřil se fosfatázou, za vzniku plazmidu s expresivní kazetou pSMT/E4.
Buněčm linie 293 (ATCC CRL 1573; American Type Culture Collection, Rockville, MD) se kultivovala v 10% fetálním bovinním séru v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (Life Technologies, Gaithersburg, MA) . Buňky 293 se transfíkovaly pSMT/E4, který je linearizovaný restrikčním enzymem Eco RI, za použití použití metody s fosforečnanem vápenatým (Sambrook et al. , Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Přibližně 24 až 48 hodin po transfekci se přiadalo shora popsané médium, které obsahuje • ·
100 μΜ metotrexát a ametopterin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) . Metotrexát v médiu se používá pro selekci exprese genu dihydrofolátové reduktázy(DHFR), který je selekční markér plazmidu pSMT/E4.
Dan_^á koncentrace metotrexátu (který je specifický pro typ buňky) inhibuje normální buněčný gen DHFR, což způsobuje smrt buňky. Exprese přidaného genu DHFR v transfikovaných buňkách, které obsahují pSMT/E4, způsobuje rezistenci na metotrexát. Z toho důvodu pouze transfěkované buňky, které obsahují nové geny, rostou za uvedených podmínek (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
V případě, že malé kolonie buněk se vytvořily z počáteční jedné buňky, která má selekční markér, byly klonálně izolovány a pomnoženy (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Tyto klony se pomnožily za vzniku buněčné linie, ve které se testovala exprese produktu, v tomto případě E4, a dále se testovala funkčnost komplementárních defektivních virů^' V tomto případě šlo o viry defektivní v oblastech El a E4.
Výsledek tohoto procesu je první buněčná linie 293/E4, která je schopna produkovat komplementární adenovirové vektory defektivní ve funkcích El a E4, jako je AdGVCFTR.ll.
Příklad 7
Tento příklad popisuje přípravu buněčné linie 293/E4/E2A. Tato buněčná linie umožňuje růst virových vektorů defektivních v oblastech El, E4 a E2A.
Expresivní kazeta E2A (obrázek č. 4), která je vhodná pro zavedení do buněk 293/E4, vzniká následovně. Prvním krokem je změna bází obklopující ATG E2A ve shodě s Kozákovým pravidlem (Kozák, J. Molec. Biol., 196, 947-950 (1987)) za účelem optimalizace exprese E2A. Za účelem změnit 5'oblast genu E2A se vytvořily dva primery. Oligonukleotid Ad5s(23884) o velikosti 18 bp a sekvenci 5ZGCCGCCTCATCCGCTTTT 3' (SEQ ID NO:3) se používá jako primer pro vnitřní oblast lemující restrikční místo Srna I genu E2A. Oligonukleotid DBP(ATG)R1 o velikosti 32 bp a sekvenci
5'CCGGAATTCCACCATGGCGAGTCGGGAGTCGGGAAGAGG 3' (SEQ ID NO:4) se používá pro zavedení translační sekvence okolo ATG do genu E2A, čímž ho modifikuje na perfektní rozšířenou sekvenci podle Kozáková pravidla a zavádí restrikční místo Eco RI právě na 5'konec, což umožňuje klonování. Výsledný produkt, který vznikl za použití shora uvedených primerů, se štěpil restrikčními enzymy Eco RI a Srna I (NEB) a klonoval se do identických restrikčních míst polylinkru pBluescript IIKS+ (Stratagene, La Jolla, CA). Výsledný plazmid se nazývá pKS/ESDP.
Fragment Srna I až Xba I se izoloval z pHRKauffman (Morin et al. , Mol. Cell. Biol., 9, 4372-4380 (1989)) a klonoval se do odpovídajících míst Srna I a Xba I pKS/ESDBP za účelem doplnění čtecího rámce E2A. Výsledný plazmid se nazývá pKSDBP. Za účelem eliminovat všechny homologní sekvence z vektoru, který je obsažen v exprsivní kazetě, fragment Κρη I až Dra I z pKSDBP se přenesl do korespondujících restrikčních míst Κρη I a Pme I do PNEB193 (NEB), ve kterém se v polylinkru porušilo restrikční místo Eco RI (Gen Vec, Rockville, MD) . Výsledný klon pE2A obsahuje všechny čtecí rámce E2A a neobsahuje navíc žádné sekvence homologní s vektorem z příkladu 3, který má deleci E2A.
Kazeta sestřihu na 5'konci se pak přenese do pE2A, což umožňuje správné zpracování mRNA v jádru a zesílení exprese E2A. Za tímto účelem pRK5 popsaný v příkladu 1 se štěpí restrikčním enzymem Sac II (NEB), tupé konce jsou upraveny nukleázou z fazolí Mung (NEB) a štěpí se restrikčním enzymem • ·
Eco RI (NEB). Výsledkem je fragment o velikosti okolo 240 bp, který obsahuje signály sestřihu. Tento fragement se klonuje do restrikčních míst Cla I (tupé konce upraveny klenow fragmentem) až Eco RI pE2A za vzniku p5'E2A. Fragment Sal I až Hind III s tupými konci (Klenow) z p5'E2A, který obsahuje sekvence E2A, se přenesl do Xba I restrikčního místa s tupým koncem (Klenow) pSMT/puro a pSMT/neo. Výsledný E2A se nazývá pKSE2A.
Fragment Xba I z pKSE2A, který obsahoval celý gen E2A^se přenesl do Xba I restrikčního místa pSMT/puro a pSMT/neo. Výesldné expresivní plazmidy, které obsahují E2A, pSMT/E2A/puro a pSMT/E2A/neo se transfi kovaly do buněk 2 93/E4 a 203/ORF-6. Buňky transfíkované pSMT/E2A/puro se vybraly na základě růstu ve standardním médiu s puromycinem a buňky transf(kované pSMT/E2A/neo se vybraly na základě růstu ve standardním médiu s geneticinem (G418; Life Technologies, Gaithesburg, MD) . Klonální expanze izolovaných kolonií se popisuje v příkladu 6. U výsledných buněčných linií se testovala schopnost doplnit virové vektory deficitní v oblastech El, E4 a E2A.
Uvedené buněčné linie jsou vhodné pro komplementární vektory, které jsou deficitní v oblastech El, E4 a E2A viru, jako jsou ty popsané v sérii virových vektorů AdGVCFTR.13.
Příklad 8
Tento příklad popisuje přípravu komplementárních buněčných linií, kde se jako rodičovská linie používá buněčné linie A549 (ATCC).
DNA viru Ad2 se připravila dříve popsaným způsobem. Genomová DNA se štěpí restrikčními enzymy Ssp I a Xho I a fragment o velikosti 5438 bp se čistil a klonoval do míst Eco RV/Xho I pKS+ (Stratagene) za vzniku pKS341-5778. Když se určil klon, fragment Xho I (tupé konce upraveny Klenow • · · ·
fragmentem) až Eco RI se přenesl Nru I (tupý konec) až Eco RI restrikčních míst v pRC/CMVneo za vzniku pElneo. Transformace buněk A549 tímto klonem vede ke vzniku komplementární buněčné linie (podobné 293), kam se mohou začlenit další expresivní kazety způsobem podobným způsobu, který se popisuje ve spojení s buňakami 293. Vznikají multikomplementární buněčné linií, které mají skvělý potenciál pro tvoření plaků.
Příklad 9
Tento příklad je protokol pro přípravu buněnčých linií 293/E2A, které se používají ke konstrukci adenovirového vektoru, jenž je deficitní v oblastech El a E2A.
Vektor s expresivní kazetou s E2A se získal v souladu s popisem v příkladu 7 a je zobrazen na obrázku č.4. Vektor s expresivní kazetou s E2A zahrnuje gen, který propůjčuje rezistenci na neomycin, což funguje jako markér transfektovaných buněk.
Jak se také popisuje v příkladu 7, buňky 293 se transf(kovaly pSMT/E2A/neo a transfJkované buňky se vybraly na základě růstu ve standardním médiu s G418. Klonální expanze selektovaných buněk byla provedena podle příkladu 6. U výsledných buněčných linii se testovala schopnost exprese proteinu, který váže DNA (DBP; produkt genu E2A) , a schopnost doplnit virové vektory defektní v oblastech El a E2A.
Při testování schopnosti neomycin pozitivních (neo+; to je rezistence na neomycin) klonálních izolátů buněčných linií 293/E2A exprimovat DBP, buňky rostou z důvodu udržení selekce v přítomnosti G418. Monovrstva z nezávislých klonálních izolátu se indukovala 100 μΜ ZnCl2 po dobu 24 hodin a exprese genu DBP se detekovala imunoblotem za použití standardních metod. Ze 62 testovaných linii u 42% buněčných linií neo+ byla exprese DBP pozitivní (DBP+) . Všechny buněčné linie DBP+ • · 4 · • · · 4 4 4 ···· • · · 4 44 44 4444 • •4 4 4 4 4 ·· ··· 44 44 44 44 44 vykazují indukovatelnou expresi DBP. Následující tabulka č, 1 ukazuje data z testu exprese DBP:
Tabulka č. 1
buněčná linie exprese DBP buněčná linie exprese DBP
3 - 202 -
6 - 203 -
9 - 207 -
10 + 208 -
12 + 210 -
13 + 211 -
16 - 212 +
17 + 213 -
19 + 215 -
21 + 216 +
32 + 219 -
35 + 301 +
36 302 -
39 + 305 -
41 - 307 -
42 - 309 -
43 - 311 -
52 - 313 -
54 + 314 -
55 - 315 -
57 + 316 -
58 + 317 -
60 - 321 +
61 + 323 -
62 - 324 -
104 + 325 +
107 - 326 -
108 + 327 +
····
111 - 328 +
112 + 329 +
201 + 330 4
U klonálních buněčných linií 293/E2A se následně testovala úroveň indukovatelné exprese DBP imiunoblotem za použití způsobu podle Brough et al., et al., Virology, 190, 624-634 (1992). Výsledky jsou uvedeny autoradiogramu označeném jako obrázky č. 5a 6. Dále se analyzovaly takové buněčné linie, které akumulovaly podobnou hladinu DBP, jako je v buňkách gmDBP2 založených na HeLa buňkách. Jak se uvádí na obrázku č. 5, v lyzátu indukovaných buněk úroveň indukovatelné exprese DBP kolísá v závislosti na klonálních izolátech. Například buněčné linie 104, 112 a 216 produkují po indukci podstatné množství DBP, jak se shora popisuje, zatímco buněčné linie 19 a 61 neprodukují větší množství než buňky gmDBP2.
U klonální buněčné linie 293/E2A se také analyzovala její schopnost akumulovat DBP během prvních 24 hodin indukce, opět za použití metody podle Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992) . Jak se uvádí na obrázku č. 6, testovaly se lyzáty buněk shromážděných 0, 2, 16 a 24 hodin po indukci. U některých buněčných linií se zaznamenala během doby inkubace progresivní akumulace DBP, která odpovídá růstu viru.
Při testování komplementace výslednými buněčnými liniemi 293/E2A se testoval růst viru s delecí E2A na těchto uvedených buňkách za použití běžných metod. Jak je známo v oboru růst viru je možné měřit semikvantitativně jednoduchým pozorováním tvoření plaků v monovrstvě hostitelských buněk. U stejných linií se testovala jejich relativní exprese genu E2A, to znamená, že relativní exprese DBP se měřila prostřednictvím imunoblotu podle Brought et al., Virology, 190, 624-634 (1992). Relativní úroveň exprese nebo růstu s • ·
ohledem na dříve uvedené parametry (nejnižší +/- až nejvyšší +++++) každé s testovaných buněčných linií je uvedená v tabulce č. 2.
Tabulka č. 2
buněčná linie relativní síla exprese DBP schopnost podpořit virus s delecí oblasti E2A při tvorbě plaků
54 ++++++ +++++
61 H—h +
104 +++++ -
112 ++++ ++++++
201 ++++ ++
208 - -
212 +++ +
216 ++++ +/-
325 + -
327 H—1—l· -
328 +++ -
330 +++++ -
Jak je zaneseno v tabulce č. 2, výsledek této studie ukazuje, že dvě buněčné linie 293/E2A (jmenovitě 54 a 112) podporují tvoření plaků u viru s delecí E2A a tak podporují růst.
Vybrané buněčné linie také vykazují schopnost doplňovat vektory, které jsou deficitní v oblastech El a E2A za použití kultivačních metod, které jsou v oboru rutinou. Takové dvojnásobně deficitní vektory se tvoří způsobem popsaným v příkladech 1 a 2. Obrázek č. 7 dokládá strukturu AdGVCFTR. 12B, který je adenovirový vektor deficitní v oblastech El a E2A. Přítomnost vektoru AdGVCFTR.12B ve třech různých lyzátech transfektovaných pasážovaných buněk se určila detekcí sekvencí DNA spojených s vektorem pomocí • ·· · ♦ · ·· ·· · 9 9 9 9
9 · * ·· • ······ • 9 · ♦ · · · ··· ·· ·· ♦· standardního PCR testu. U třech různých lyzátů se odděleně testovala přítomnost sekvencí CFTR (sloupce označené písmenem A na obrázku č. 8), nepřítomnost sekvencí E2A, to je důkaz delece (sloupce označené písmenenm B) a přítomnost sekvencí divokého typu E2A (sloupce označené písmenenm C) . Experiment se může analyzovat na základě fotografie s obráceným kontrastem fragmentů DNA separovaných na gelu, který je obarven v etidium bromidu, což je zobrazeno na obrázku č. 8.
Výsledku ukazují, že všechny tři lyzáty obsahují CFTR a deleci E2A, což je v souladu se strukturou vektoru AdcvCFTR.12B. U těchto lyzátů se nedetekovaly sekvence E2A divokého typu. Na obrázku č. 8 písmeno M označuje DNA markér pro určení velikosti produktu, znamínko + označuje vzorek, ve kterém se použil pozitivní templát pro dannou sadu primeru, znamínko označuje negativní primer užívaný pro každou dannou sadu primerů a jak je uvedeno shora, písmena A, B a C ozačují tři testované virové lyzáty.
Vytvořil se adenovirový vektor, který má delece v oblastech El a E2A, a buněčné linie, které mají schopnost doplnit dvojnásobně deficitní vektor.
Příklad 10
Tento příklad ilustruje použití E2A delečního plazmidu pro expresi cizorodé DNA.
Plazmid pGV13(0) s deleci E2A, jak se popisuje v příkladu 3, se použil ke konstrukci sérií vektorů GV12B. Modifikace pGV13(0) zahrnují substituci jediného restrikčního místa Sce I za Cla I a změnu oblasti obklopující ATG genu E2Aza účelem optimalizace sekvence podle Kozáková pravidla. Reportní gen (β-glukuronidáza), který je lemován restrikčními místy Sce I, se začlenil na místo genu E2A tak, že reportní gen se exprimuje jako odezva na všechny signály používané pro ·· ·· • · · · ♦ · ·· • ·· · 9 ·
9 9
99
444 4
• 4 44 • 4 4 • 44 ··· · ·
4 4
4« 44 expresi většiny časných genů, to je DBP. U výsledného plazmidu (pGBSE2GUS) se testovala funkčnost transfekcí a následným stanovením β-glukuronidázové aktivity; všechny testované transfekované buněčné linie vykazují vysokou úroveň exprese β-glukuronidázy, která se detekuje tvořením modré barvy, když β-glukuronidáza katalýzuje reakci se substrátem X-glu.
Jiný virový vektor (AdGVLuc;E2GUS), který je zobrazen na obrázku č. 9 se zkonstruoval, aby demonstroval využití deletované oblasti E2 pro umístění cizorodé DNA za účelem například genové terapie. Vektor AdGVLuc; E2GUS obsahuje v oblasti El markér CMV luciferázu a E2 β-glukuronidázu v oblasti E2A. Předcházející vektor (AdGVLuc.lO) se používal k transfekci buněk 293/E2A; při následném obarvení výsledných virových plaků v případě β-glukuronidázy za použití X-glu se neobjevilo modré zbarvení, to znamená, že se nedetekovala βglukuronidázová aktivita. Plaky, které se vytvořily z buněk 293/E2A transfvkovaných vektorem AdGVLuc;E2GUS, tvoří po přidání X-glu podstatné množství modré barvy.
V podstatě cizorodá DNA substituovaná v oblasti E2A adenovirového vektoru může fungovat.
Příklad 11
Tento příklad uvádí protokol pro přípravu buněčné linie 293/ORF6 a její použití ke konstrukci adenovirového vektoru, který je defektní v obou oblastech El a E4.
Expresivní kazeta E4-ORF6 uvedená na obrázku č. 10 se zkonstruovala pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) (PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academie Press, lne. (1990)) za použití primerů A5s(33190)P a A5a(34084)P, přičemž se amplifikuje ORF-6 gen Ad5 E4 a na koncích vznikají Pac I restrikční místa vhodná ····
Z······ · · · ··· ·· ·· ·· ·· ·· pro klonování. Amplifikovaný fragment se upravil Klenow fragmentem a vznikly tak tupé konce. Tento fragment se klonoval do pCR-Script SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). Výsledný plazmid pCR/ORF-6 se sekvenoval a pak se inzert ORF6 přenesl do expresivního vektoru pSMT/puro, který se vytvořil ligací fragmentu Eco RI až Hin dlll s tupými konci a který obsahuje promotor SMT, do místa Mlu I až Hin dlll v pRCpuro za vzniku pSMT/ORF-6.
Transfekce buněk 293 se provedla s pSMT/ORF6/puro a transfekované buňky se vybraly na základě růstu ve standardním médiu s pyromycinem. Klonální expanze se provedla způsobem, jenž se popisuje v příkladu 6. U výsledných buněčných linií se testovala schopnost exprimovat E4-ORF6 na základě indukce a schopnost doplnit virové vektory deficitní v oblastech El a E4.
U klonálních izolátů buněčných linií 293/ORF6 rezistentních na pyromycin (puro+; to znamená rezistentní na puromycin) se testovala schopnost exprimovat 0RF6. Buňky se kultivovaly v přítomnosti pyromycinu za účelem udržení selekce. Monovrstva vytvořená z nezávislých klonálních izolátů se indukovala 100 μΜ ZnCl2 po dobu 24 hodin. Exprese genu ORF6 se detekovala Northen přenosem, přičemž se určil transkript RNA. Relativní síla exprese (nejnížší (+) až nejvyšší +++++) každé testované buněčné linie je uvedena v tabulce č. 3:
Tabulka č. 3
buněčná linie exprese ORF6 buněčná linie exprese ORF6
A2 +++ B8 ++
A2-1 ( + ) B8-1 ( + )
A2-2 ( + ) B8-2 +++
A2-3 - B8-3 +
A2-4 ( + ) B8-4 +
• 9 · · ·· • · · · • * ·· • · · · • · · ·
9· 99 ·· · · * * ·· ·♦·· ·
9 · ··
A2-5 ( + ) B8-5 ( + )
A2-6 - B8-6 -
A2-7 ( + ) B8-7 +
A2-8 - B8-8 ++
A2-9 ( + ) B8-9B ++
A2-10 - 8-10 ( + )
A2-11 - B8-14 ( + )
A2-12 + B8-16 -
A2-13 - B8-18 -
A2-14 +++++ B8-19 -
A2-24 - B8-20 -
A2-32 ++H—h B8-21 -
A2-59 - B8-23 -
B8-22 - B8-27 -
B8-24 - B8-27 -
Výsledkem testu exprese genu 0RF6 je skutečnost, že u 53% buněčných linií rezistentních na puromycin se vyskytovaly transkripty 0RF6 a všechny takové pozitivní buněčné linie vykazují indukovatelnou expresi ORF6.
PCR se také používala při detekci inzerce gene při deleci oblasti E4 adenovirového vektoru, jejíž výsledky se uvádějí na obrázku č. 11. Pasážované lyzáty transfíkovaných buněk s AdGVpgal.ll se podrobily PCR, přičemž se amplifikovaly jisté genové sekvence spojené s oblastí E4 divokého typu, jmenovitě s fragmenty o velikosti 3087 bp a 367 bp. DNA z lyzátů z buněk 293/ORF6 (dráha 1) slepě infikovaných, buněk infikovaných AdGV3gal.l0 (dráha 2) a buněk infikovaných AdGV3gal.ll (dráha 3) se podrobily gelové elektroforéze a obarvení v ethidium bromidu. Fotografie na obrázku č. 11, která zobrazuje výsledný obarvený gel, indikuje, že vektoru AdGVPgal.l0 chybí část oblasti E4, která ·· ·· • · · · • t ··
zahrnuje sekvenci o velikosti 367 bp a u vektoru AdGvPgal. 11 chybí část oblasti E4, která zahrnuje sekvenci o velikosti 3087 bp.
Sledoval se růst vektoru, kde je deletovanána oblast E4, v buněčné linii 293/ORF6. Buňky se infikovaly při multiplicitě infekce (moi) 10 a růst viru se monitoroval komplementární plakovou analýzou po pěti dnech růstu. Výsledky jsou znázorněny na obrázku č. 12, což je sloupcový graf, kde se na osu y vynáší jednotky tvořící plaky (PFU) na buňku a na ose x je identifikována testovaná buněčná linie. Jako pozitivní kontrola růstu se použila buněčná linie W162, což je buněčná linie, která je schopna doplnit funkci E4. Jako negativní kontrola se použily buňky 293, které doplňují funkco El. Buněčné linie A2, B8, 216 a 406 jsou nezávislé izoláty buněčných linií 293/ORF6, které vykazují kolísavou kvantitativní komplementaci E4 deletovaného viru (<32 3 6 6) . Identifikovaly se buněčné linie, které doplňují funkci E4, přičemž umožňují růst viru s delecí E4, který je schopen nést funkčí cizorodé DNA. Tyto buněčné linie jsou vhodné ke komplementaci vektorů, které jsou dvounásobně deficitní ve virových oblastech El a E4, stejně jako ty shora popsané zahrnuté v sériích AdGVCFTR.ll nebo jak ukazuje obrázek č. 13, který schématizky zobrazuje vektor AdGvp-gal.11. Vektor AdGV3-gal.ll nese gen β-galaktozidázy začleněný v oblasti El a deletovanou oblast E4.
Příklad 12
Tento příklad popisuje použití adenovirových vektorů, které mají delece v oblastí El a E4.
Plazmid deletovaný v oblasti E4, který se nazývá pGBSÁE4se modifikoval, tak že obsahuje několik jediných restrikčních míst. Tyto místa se používají ke klonování
4«
444 4 • 4 44 • · · · · · « * 4 4 ·4 4 4 44
4 · 4 · 4 4 44 · · ·
4 44·· · · β
44 44 44 ·· ·· vhodné cizorodé DNA do této oblasti za použití adenovirového promotoru E4, který je vhodný pro expresi. Jak se popisuje shora, při klonování β-glufcuronidázy do této oblasti vzniká perfektně fungující vektor, který exprimuje cizorodou DNA. Jestliže se do stejného vektoru do obou oblastí El a E4 umístí vhodné odlišné cizorodé DNA, mohou se obě exprimovat a jejich exprese se řídí promotory El a E4 nebo je-li to nutné i jinými promotory.
Druhá modifikace oblasti E4 umožňuje expresi vhodné cizorodé DNA prostřednictvím různých heterologních řídících elementů. Konstrukce plazmidů se provedla tak, že velice snadno se může provést řada změn. Multiplazmid pGV.llS obsahuje následující rysy, které se mohou snadno měnit:
1. adenovirový segment, který se může použít při homologní rekombinaci, při ligaci pro DNA buď na konec El nebo na začlenění konec E4
7.
.
cizorodé vektoru;
segment promotoru; segment signálu sestřihu; segment cizorodé DNA; polyadenylační segment; adenovirová sekvence pro balení; adenovirová ITR; a všechny sekvence plazmidové DNA nezbytné k selekci a růstu plazmidů v bakteriích, stejně jako v savčí tkáňové kultuře.
Příklad 13
Příklad popisuje přípravu jednoho provedení vynálezu, které zahrnuje AdGv.llS, jmenovitě AdGVCFTR. 11S, který obsahuje intergenovou sekvenci, je ž je začleněna do oblasti deletované E4 přítomné v AdGV.ll. Podobně intergenová ···· ·· ·· • · · · • · ·· • · · · · • · · * ·· ·* ·· • · · · • · ·· ··· · · • · · ·· ·· ·* sekvence se může začlenit do oblasti delece E4, například AdGV.12S a AČUV.13S.
Rekombinantní virus AdGVCFTR.llS se zkonstruoval, izoloval a pomnožil za použití postupů popsaných v případě přípravy AdGVCFTR.ll, jak se uvádí v příkladu 2. AdGVCFTR.llS se zkonstruoval způsobem jednoduché in vivo rekombinace mezi pozicemi 1 až 27 082, to je levé rameno AdGVCFTR.10 a plazmid pGVUS, pravé rameno linearizované restrikčními enzymy Bam HI (NEB) a Sal I (NEB). Výsledný vektor AdGVCFTR.llS je v podstatě El a E4 deficitní a má začleněnou intergenovou sekvenci v deletované oblasti E4, stejně jako polyadenylační sekvenci SV40. Vektor také obsahuje polyadenylační sekvenci E4 a promotor E4, který pochází z oblasti E4 adenovirového genomu.
Oblast vlákno/E4 vektoru AdGVCFTR.llS je zobrazena na obrázku č. 14C. Za účelem srovnání různé jiné vektory podle vynálezu jsou zobrazeny na obrázcích č. 14A a 14B. Vektor na obrázku č. 14A má deleci celé oblasti E4 fúzující vlákno L5 s pravostranou ITR. Takový vektor ve srovnání s adenovirem divokého typu obsahuje deleci oblasti E4 o velikosti 2,5 kb. V následujících příkladech se popisují různé charakteristiky AdcvCFTR. 11S (obrázek č. 14C), které se srovnávají s vektory založenými na AdGV.ll (obrázek č. 14B) a s dalšími vektory.
Příklad 14
Příklad popisuje charakterizaci chování růstu a produkci proteinu vlákna vektoru deficitního v oblastech El a E4 ve srovnání s vektorem, který je deficitní v oblasti El a nese oblast E4 divokého typu.
V těchto experimentech se použil vektor AdGvPgal.lO, který je deficitní v oblastech El a E3, a vektor AdGvPgal.ll, který je deficitní v oblastech El a E4. Těmito vektory se infikovala kompetentní buněčná linie 293/ORF-6. Analýza
imunoblotem proběhla za použití lyzátu buněk 293/ORF6, jak se popisuje v příkladu 9. V tomto experimentu se použilo králičí sérum určené proti adenovirovému kapsidu. Uvedené protilátky rozeznávají všechny strukturální proteiny adenovirového kapsidu.
Jak je uvedeno na obrázku č. 15, vícenásobně replikačně deficitní El’ E4 adenovirové vektory ve srovnání s jednoduše replikačně deficitními adenovirovými vektory s deleci oblasti El vykazují redukovanou expresi vlákna a redukovaný růst viru. V buňkách infikovaných vektorem, který obsahuje delece El a E4 (to je vektor AdGvPgal.ll; dráha 3) ve srovnání s buňkami infikovanými vektorem E1’E4+ (to je vektor AdGvPgal.lO; dráha 2) existuje deficit v produkci několika pozdních proteinů, zvláště proteinu vlákna. Redukce proteinu vlákna ve vektoru E1'E4+ odpovídá přibližně 50-ti násobku.
Účinek tohoto deficitu ve smyslu produkce zralých virionů se zkoumala odhadem množství proteinu vlákna, který je přítomen v čištěném kapsidu. Partikule viru (kapsidy) se izolovaly pomocí tří sekvenčních gradientů césium chloridu za použití standardního protokolu pro produkci vektoru. Analýza imunoblotem za použití protilátek určených proti adenovirovému proteinu vlákna se provedla po porušení kapsidu povařením a elektroforéze na SDS/polyakrylamidovém gelu.
Výsledky těchto experimentů jsou znázorněny na obrázku č. 16. Jak je patrné z obrázku č. 16, podobné hladiny proteinu vlákna se produkují v buňkách infikovaných vektorem defictiním v oblasti El (to je AdGvPgal.lO, dráha 1) ve srovnání s buňkami infikovanými vektorem Ε1Έ4' (to je
AdcvPgal.il, dráha neprodukuje hladinu produkce jednoduše případě vektrou El')
2) . Vzhledem k tomu, že vektor Ε1Έ4' proteinu vlákna, která by dosahovala replikačně deficitního vektoru (v tomto , tyto výsledky naznačují, že redukovaná • · · • 99
9 9 9 produkce proteinu vlákna způsobuje snížení celkového počtu kapsidů, které se mohou vytvořit v infikovaných buňkách.
Příklad 15
Tento příklad popisuje produkci proteinu vlákna pozorovanou po infekci buňky vektorem, který je deficitní v oblasti E4 a který obsahuje intergenovou sekvenci v oblasti E4, což se srovnává s infekcí buňky vektorem defictním v oblasti E4, kterému chybí v adenovirovém genomu taková intergenová sekvence.
V těchto experimentech se použily vektory popsané v příkladu 14. Testoval se vektor AdGVCFTR. 11S, který je deficitní v oblastech El a E4 založený na vektoru AdGV.llS. Tento vektor dále obsahuje deleci oblasti E3 a intergenovou sekvenci začleněnou do deletované oblasti E4 v AdGV.ll, jak se popisuje v příkladu 13.
Výsledky těchto studií jsou zobrazeny na obrázku č. 17. Jak je možné vidět na obrázku č. 17, inkorporace intergenové sekvence do oblasti delece E4 umožňuje produkci proteinu vlákna L5, jejíž síla dosahuje produkce získané jednoduše replikačně deficitním adenovirovým vektorem. Zatímco došlo v buňkách infikovaných vektorem AdGvPgal.ll (dráha 3) ke zrušení produkce vlákna, množství vlákna pozorovaného v buňkách infikovaných vícenásobně replikačně deficitním El' E4' vektorem, který obsahuje intergenovou sekvenci, to znamená AdGVCFTR.llS (dráha 4), se blíží množství vlákna pozorovanému v buňkách infikovaných s jednoduše replikačně deficitním El' vektorem AdGVPgal.lO (dráha 2).
Tyto výsledky tak potvrzují, že inkorporace intergenové sekvence do vektoru Ε1Έ4’, zvláště do oblasti delece E4, umožňuje produkci vlákna, která je podobná produkci pozorované po infekci buňky vektorem, který má pouze deleci El.
• ·· ·
Příklad 16
Tento příklad popisuje chování růstu E4 deficitního vektoru, který obsahuje intergenovou sekvenci v oblasti E4, což se srovnává s E4 deficitním vektorem, kterému chybí v adenovirovém genomu intergenová sekvence.
V těchto experimentech se zkoumala schopnost opravit defekt růstu vícenásobně deficitních adenovirových vektorů přidáním intergenová sekvence do nejméně jedné z deletovaných oblastí. Produkce aktivních virových partikulí (fokální tvořící se jednotky; ffu) v buňce se určila jako funkce času uplynulého po infekci buněk A232 buď vektorem AdGV3gal.lO založeným na AdGV.10, který je deficitní v oblastech El a E3, vektorem AdGVLacZ.ll založeným na AdGV.ll, který je deficitní v oblastech El a E4 nebo vektorem AdGVCFTR.11S, který obsahuje intergenovou sekvenci v oblasti delece E4. Buňky A232 se použily na základě jejich schopnosti produkovat viry s delcí El a E4. Buňky A232 jsou buňku 293/ORF6, které rostou ve standardním médiu a jsou indukovány k produkci 0RF6 po infekci 100 μΜ ZnCl2. Fokální tvořící se jednotky se určily sériovým ředěním a infekcí komplementární buněčné monovrstvy zásobou viru. Počet infikovaných buněk se určil imunochemickou detekcí za použití protilátek proti DBP nebo produktu genu E2A. Produkce aktivních virových partikulí se určila přibližně 20, 40, 60 a 80 hodin po infekci.
Výsledky těchto experimentů jsou znázorněny na obrázku č. 18. Zdá se, že neexistují kinetická odlišnost mezi vektorem AdGV.10 (plné čtverce) deficitním v oblastech El a E3 a vektorem AdGV.llS, který je deficitní v oblastech El, E3 a E4 a obsahuje intergenovou skvenci v oblasti delece E4 (otevřená kolečka). Nej slabší produkci virionů vykazuje vektor AdGV.llS deficitní v oblastech El, E3 a E4, který nezahrnuje intergenovou sekvenci (prázdné kosočtverce),
·· ·· přičemž je možné pozorovat až 100 násobné rozdíly po 16 až 20 hodinách po infekci.
Následně se určil výtěžek produkce. Pro čištění vektroových kapsidů se používají tři césium chloridové gradienty. Při čištění kapsidů vektoeu musí virus projít rigorózním čistícím protokolem. Jako všechny čistící postupy i při této dochází ke ztrátě výtěžku. Proto kritická hodnota v těchto experimentech není nejvyšší hodnota na růstové křivcky zobrazené na obrázku č. 18, ale spíše síla produkce. Výtěžek produkce (udává se počet aktivních virových partikul! v jedné buňce) v buňkách infikovaných různými vektory je uveden v tabulce č. 4.
Tabulka č. 4
vektor výtěžek produkce
Adev.10 (to je AdGvPgal.lO) 650
AdGV.ll (to je AdcvPgal.ll) 22
AdGv.llS (to je AdGVCFTR. 11S) 720
Jak ukazují tyto data, začlenění intergenové sekvence do vícenásobně replikačně deficitního El' E4' vektoru zvyšuje produkci virových partikul! (a možná ji převyšuje) na úroveň virové produkce pozorované u jednoduše replikačně deficitního vektoru deletovaného v oblasti El. Tyto výsledky potvrzují, že intergenová sekvence je schopna působit proti drfektu růstu a snížit expresi vlákna pozorovanou u El' E4' vícenásobně replikačně deficitního adenovirového vektoru. Výsledky naznačují, že začlenění této intergenové sekvence do genomu adenoviru, který obsahuje delece El a E4, zvláště inkorporace do oblasti delece E4, umožňuje produkci vlákna a zvýšení růstu viru podobně jako je tomu u jednoduše replikačně deficitního vektoru, který je El deficitní.
• · ·
• · ·· ·· · · · • · · ·· ·*
Příklad 17
Tento příklad popisuje charakteristiky vektorů, které obsahují delece v oblasti E2, zvláště oblasti E2A, adenovirového genomu.
Jak se pozorovalo u E4 mutantů růstové chování jednoduše a vícenásobně replikačně deficitních adenovirů, které obsahují mutace v oblasti E2A, se nepoškodilo, listovala se schopnost různých E2A delečních mutantů, které obsahují sekvence El divokého typu, doplnit buněčné linie podle vynálezu. Zvláště se studovaly dříve popsané adenovirové vektory <31801, <31802, <31803 a <31807, které obsahují delece v oblasti E2A (rice te la., J. Virol., 56, 767-778 (1985); Vos et al., Virology, 172, 634-632 (1988)).
Otevřený čtecí rámec E2A obsahuje oblast od Ad5 nukleotidu 22 443 až do Ad5 nukleotidu 24 032. Produkt genu E2A je protein vázající jednořetězcovou DNA (to je DBP) . Virus <31803 obsahuje deleci E2A ORF od Ad5 nukleotidu 22 542 do Ad5 nukleotidu 23816 a obsahuje E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 816 do Ad5 nukleotidu 24 032. Následně produkt genu <31803 oblasti E2A (a jeho varianty) zahrnuje chimérický protein, který obsahuje část proteinu DBP, jenž vznikl translací normálního čtecího rámce (to znamená divokého typu) spojeného s dalšími proteinovými sekvencemi, který vznikl použitím alternativního čtecího rámce následujícího po deleci. Oblast proteinu DBP, která nenese chimérický protein, což způsobuje deleci(to je oblast Ct), se implikovala do replikace DNA, vázání ssDNA a vázání mRNA (Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)). Pro srovnání oblast poškozená z části vektorem (to je oblast Nt) se účastní při lokalizeci v jádře a expresi pozdních genů (Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992)).
Viry <31801 a <31802 zahrnují modifikace viru <31803. Virus <31802 dále obsahuje delece E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 816 ···· deleční virus Ad5 nukleotidu až Ad5 nukleotidu 23 969 tak, že výsledný obsahuje E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 969 do
032. Podobně virus d!801 dále obsahuje v rámci deleci E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 816 do Ad5 nukleotidu 24 011 tak, že výsledný deleční vektor obsahuje E2a ORF od Ad5 nukleotidu 24 011 do Ad5 nukleotidu 24 032. Pro srovnání dI807 obsahuje v rámci deleci E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 882 do Ad5 nukleotidu 23 954.
Při studiu chování růstu těchto různých delečních vektorů se zjistilo, že jisté segmenty oblasti E2A adenovirového genomu nemohou být komplementovány a musí být zahrnuty do (nebo dány zpátky do) adenovirového vektoru, aby umožnily růst viru. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na obrázku č. 19. Delece mutantu dI803 (který částečně obsahuje oblast Nt a chybí mu oblast Ct divokého typu) je plně funkční a nevykazuje růstový deficit v komplementaci E2A buněčných linií. Pro srovnání vektory dlQ07, dI802 (data nejsou uvedeny) a dI801 vykazují oslabený fenotyp, který nemůže být komplementován v expresivních E2A buněčných liniích. Vektor d!801 vykazuje fenotyp extrémně malých plaků [-/+]. Tyto výsledky potvrzují, že oblast, která zbyla v dI803, obsahující Ad5 nukleotid 23 816 až Ad5 nukleotid 24 032 je nutná pro zlepšení delece E2A a replikaci E2A delečních vektorů v současně dostupných komplementujících buněčných liniích.
. . . .· · · ··.
» · * · · · · ···· j • · ·· · · · ·
SEKVENČNÍ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 32 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:1
CACTTAATTA AACGCCTACA TGGGGGTAGA GT 32 (2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 34 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:2
CACTTAATTA AGGAAATATG ACTACGTCCG GCGT 34 (2) Údaje k SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 18 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:3 • 99*
9 9 · * · · ♦
99
GCCGCCTCAT CCGCTTTT (2) Údaje k SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristika sekvence:
(A) délka: 32 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Popis sekvence: SEQ ID NO:4
CCGGAATTCC ACCATGGCGA GTCGGGAAGA GG

Claims (28)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Adenovirový vektor, který je deficitní v jedné nebo více podstatných genových funkcích oblasti E4 adenovirového genomu, kde tento adenovirový vektor zahrnuje v oblasti E4 adenovirového genomu intergenovou sekvenci s alespoň asi 15 páry baží.
  2. 2. Adenovirový vektor podle nároku 1, kde uvedená intergenová sekvence zahrnuje polyadenylační sekvenci.
  3. 3. Adenovirový vektor podle nároku 1 nebo 2, kde byly deletovány všechny otevřené čtecí rámce oblasti E4 adenovirového genomu.
  4. 4. Adenovirový vektor podle nároku 1 nebo 2, kde uvedená oblast E4 uvedeného adenovirového vektoru je deletována a uvedená intergenová sekvence se nachází mezi pravostrannou ITR a zbytkem genomu.
  5. 5. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 4, kde uvedený adenovirový vektor je deficitní v jedné nebo více podstatných genových funkcích oblasti El adenovirového genomu.
  6. 6. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 5, kde uvedený adenovirový vektor je deficitní v jedné nebo více podstatných genových funkcích oblasti E2A adenovirového genomu.
    4444
    44 44 • 9 4 · • · 44
    4 99 9 9 4
    4 4 4
    44 44 ζ 4 · · ♦· • ♦♦···· • · · · · · · ··· 44 ·· ·*
  7. 7. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 6, kde uvedený adenovirový vektor je deficitní ve všech podstatných genových funkcích oblasti El adenovirového genomu.
  8. 8. Vektor podle libovolného z nároků 1 až 7, kde uvedený adenovirový vektor je deficitní ve všech podstatných genových funkcích oblastí El a E2A adenovirového genomu.
  9. 9. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 8, kde uvedený adenovirový vektor je deficitní v oblasti E3 adenovirového genomu.
  10. 10. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 9, kde v uvedeném vektoru jsou deletovány všechny otevřené čtecí rámce oblasti E2A adenovirového genomu jiné než otevřený čtecí rámec kódující DBP a kde uvedený adenovirový vektor zahrnuje méně než asi 230 párů baží otevřeného čtecího rámce DBP, přičemž uvedené sekvence otevřeného čtecího rámce DBP kódují část domény Nt proteinu DBP, dostačující pro růst viru v buněčné linii, která nedoplňuje nedostatečnost otevřeného čtecího rámce DBP.
  11. 11. Adenovirový vektor s deletovanými všemi otevřenými čtecími rámci oblasti E2A adenovirového genomu jinými než otevřený čtecí rámec kódující DBP, kde uvedený adenovirový vektor zahrnuje méně než asi 230 párů baží otevřeného čtecího rámce DBP, přičemž uvedené sekvence otevřeného čtecího rámce DBP kódují část domény Nt proteinu DBP, dostačující pro růst viru v buněčné linii, která nedoplňuje nedostatky otevřeného čtecího rámce DBP.
    • · » 9
    999 9 9 9
    99 99
    9 9 9 9
    9 9 99
    9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9
    999 99 · · ··
  12. 12. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 11, kde uvedený adenovirový vektor je připraven v buněčné linii, schopné doplnit in trans deficitní podstatné genové funkce uvedeného adenovirového vektoru.
  13. 13. Adenovirový vektor podle nároku 1, kde uvedený adenovirový vektor je AdGV.ll modifikovaný začleněním sekvence, zahrnující polyadenylační sekvenci, mezi pravostrannou ITR adenovirového genomu a zbytek genomu.
  14. 14. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 13, kde uvedený adenovirový vektor zahrnuje cizorodý gen.
    15. cizorodý Adenovirový vektor podle nároku gen kóduje terapeutické činidlo. 14, kde uvedený 16. Adenovirový vektor podle nároku 14, kde uvedený cizorodý gen. gen je cystický fibrózní transmembránový regulační 17. cizorodý Adenovirový vektor podle nároku gen kóduje antisense RNA. 14, kde uvedený 18. Adenovirový vektor podle nároku 14, kde uvedený cizorodý gen kóduje polypeptid schopný vyvolat imunitní
    odezvu.
  15. 19. Adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 18, kde uvedený adenovirový vektor je připraven v buňce za nepřítomnosti pomocného viru.
  16. 20. Použití adenovirového vektoru podle libovolného z nároků 1 až 19 při přípravě farmaceutické kompozice.
    ·· ·· • · · ’Χ ·’ · · ·· • · ♦ ♦ · · · * • · · · · · * ··· ·· ·· ·· ·· ·· • · · · • · ·· ··· · * • · * ·· ··
  17. 21. Replikačně kompetentní zásoba adenovirového vektoru podle libovolného z nároků 1 až 19, prostá adenoviru.
  18. 22. Zásoba podle nároku 21, vyznačuj ící se tím, že uvedený adenovirový vektor je připraven v buněčné linii schopné podpořit růst uvedeného adenovirového vektoru, přičemž genom uvedené buněčné linie je prost sekvencí překrývajících se s uvedeným adenovirovým vektorem, které jsou dostačující k zprostředkování rekombinace, za vzniku replikačně kompetentního adenovirového vektoru.
  19. 23. Zásoba podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že uvedený adenovirový vektor je připraven v buněčné linii schopné podpořit růst uvedeného adenovirového vektoru, přičemž uvedená zásoba je po jediné rekombinaci mezi genomem uvedeného adenovirového vektoru a genomem uvedené buňky prostá replikačně kompetentního adenoviru.
  20. 24. Způsob přípravy adenovirového vektoru podle libovolného z nároků 1 až 19, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje propagaci uvedeného adenovirového vektoru v buněčné linii v nepřítomnosti pomocného viru, přičemž uvedená buněčná linie je schopna uvedený adenovirový vektor doplnit in trans.
  21. 25. Způsob s deletovanou v komplementární zvýšení propagace adenovirového vektoru oblastí E4 adenovirového genomu buněčné linii, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje začlenění intergenové sekvence mezi pravostrannou ITR a zbytek genomu, přičemž uvedená intergenové sekvence obsahuje alespoň asi 15 párů baží.
    <
    ·· ·· • ♦ · « • · ·· ·· · · <
  22. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačuj ící se tím, že uvedená intergenová sekvence je polyadenylační sekvence mezi pravostrannou ITR a zbytkem adenovirového genomu.
  23. 27. Způsob genové vyznačující se t uvedené buňky s adenovirovým z nároků 1 až 19.
    modifikace buňky, í m, že zahrnuje kontakt vektorem podle libovolného
  24. 28. Kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 19.
  25. 29. Hostitelská buňka, zahrnující adenovirový vektor podle libovolného z nároků 1 až 19.
  26. 30. Způsob testování toxicity libovolného adenovirového vektoru podle nároků 1 až 19 na cílové buňky, vyznačující se tím, že zahrnuje (1) přípravu kultury z alikvotu uvedených cílových buněk, (2) kontakt uvedených cílových buněk s uvedeným vektorem a (3) měření vitality uvedených kultivovaných cílových buněk.
  27. 31. Způsob testování exprese cizorodého genu libovolného adenovirového vektoru podle nároku 14 až 18 při transfekci do cílových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje (1) přípravu kultury z alikvotu uvedených cílových buněk, (2) kontakt uvedených cílových buněk s uvedeným vektorem a (3) měření exprese uvedeného cizorodého genu v uvedených cílových buňkách.
    • · · · · • · · · ·* ♦·
  28. 32. Způsob testováni exprese cizího genu libovolného adenovirového vektoru podle nároků 14 až 18 při transfekci do cílových buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje (1) přípravu kultury z alikvotu uvedených cílových buněk, (2) kontakt uvedených cílových buněk s uvedeným vektorem a (3) měření exprese uvedeného cizího genu v uvedených cílových buňkách.
CZ981827A 1995-12-14 1996-12-12 Komplementární adenovirové vektorové systémy a buněčné linie CZ182798A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/572,126 US5851806A (en) 1994-06-10 1995-12-14 Complementary adenoviral systems and cell lines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ182798A3 true CZ182798A3 (cs) 1998-11-11

Family

ID=24286453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ981827A CZ182798A3 (cs) 1995-12-14 1996-12-12 Komplementární adenovirové vektorové systémy a buněčné linie

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5851806A (cs)
EP (1) EP0870049B1 (cs)
JP (2) JP3299761B2 (cs)
AT (1) ATE320503T1 (cs)
AU (1) AU711366B2 (cs)
BG (1) BG62739B1 (cs)
BR (1) BR9612677A (cs)
CA (1) CA2238295C (cs)
CZ (1) CZ182798A3 (cs)
DE (1) DE69635931T2 (cs)
EA (1) EA199800566A1 (cs)
EE (1) EE9800185A (cs)
GE (1) GEP20012559B (cs)
HU (1) HUP9902310A3 (cs)
IL (1) IL124797A0 (cs)
IS (1) IS4762A (cs)
NO (1) NO982687L (cs)
NZ (1) NZ325627A (cs)
PL (1) PL327984A1 (cs)
SK (1) SK78598A3 (cs)
WO (1) WO1997021826A2 (cs)

Families Citing this family (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1548118A2 (en) * 1994-06-10 2005-06-29 Genvec, Inc. Complementary adenoviral vector systems and cell lines
US20030148968A1 (en) * 1995-02-28 2003-08-07 Hammond H. Kirk Techniques and compositions for treating cardiovascular disease by in vivo gene delivery
EP0760682A4 (en) 1995-02-28 1998-09-09 Univ California ANGIOGENIC THERAPY BY GENE TRANSFER
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US6265212B1 (en) * 1995-06-15 2001-07-24 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
DK0833934T4 (da) * 1995-06-15 2012-11-19 Crucell Holland Bv Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US20030027250A1 (en) * 1995-12-15 2003-02-06 Mitchell Lloyd G. Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US20020193580A1 (en) * 1995-12-15 2002-12-19 Mitchell Lloyd G. Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US20060088938A1 (en) * 1995-12-15 2006-04-27 Mitchell Lloyd G Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing in plants
ATE420182T1 (de) * 1996-09-25 2009-01-15 Scripps Research Inst Verpackungszellinien in der verwendung zur erleichterung der entwicklung hocheffizienter adenoviraler vektoren
US7232899B2 (en) 1996-09-25 2007-06-19 The Scripps Research Institute Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
WO1998032859A1 (en) * 1997-01-29 1998-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Multiple site delivery of adenoviral vector for the induction of angiogenesis
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US6696423B1 (en) 1997-08-29 2004-02-24 Biogen, Inc. Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta
IL141403A0 (en) 1998-08-28 2002-03-10 Univ Duke Deleted adenoviruses and methods of making and administering the same
US6303362B1 (en) 1998-11-19 2001-10-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Adenoviral vector and methods for making and using the same
CA2371069A1 (en) * 1999-04-23 2001-02-01 Crucell Holland B.V. Means and methods for nucleic acid transfer
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
US6627190B2 (en) * 1999-07-12 2003-09-30 Saint Louis University Recombinant adenovirus vectors that are replication-competent in tert-expressing cells
US6613516B1 (en) * 1999-10-30 2003-09-02 Affymetrix, Inc. Preparation of nucleic acid samples
US6867022B1 (en) 2000-01-21 2005-03-15 Regents Of The University Of Michigan Replication deficient adenovirus vectors and methods of making and using them
US6821775B1 (en) * 2000-02-11 2004-11-23 Genvec, Inc. Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor
US7653769B2 (en) * 2006-12-14 2010-01-26 International Business Machines Corporation Management of devices connected to infiniband ports
US6591543B2 (en) * 2000-04-14 2003-07-15 Kenneth P. Sabine Top water lure with highly active propeller
US7445929B2 (en) * 2000-05-26 2008-11-04 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Recombinant adenovirus vector having a reduced side effect
US6579522B1 (en) * 2000-06-27 2003-06-17 Genvec, Inc. Replication deficient adenoviral TNF vector
EP1203819A3 (en) 2000-10-06 2002-08-07 Transgene S.A. Anti-inflammatory vectors
US6573092B1 (en) 2000-10-10 2003-06-03 Genvec, Inc. Method of preparing a eukaryotic viral vector
US20040126774A1 (en) * 2001-01-08 2004-07-01 Mitchell Lioyd G. Correction of factor VIII genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
EP1427816A4 (en) 2001-09-18 2004-12-01 Clontech Lab Inc METHOD FOR PRODUCING ADENOVIRAL VECTORS BASED ON A SITE SPECIFIC RECOMBINASE
US20030087438A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. E1-revertant-free adenoviral composition
US20030086903A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. Therapeutic regimen for treating cancer
US20030158112A1 (en) * 2002-02-15 2003-08-21 Johns Hopkins University School Of Medicine Selective induction of apoptosis to treat ocular disease
US7399753B2 (en) * 2002-02-25 2008-07-15 Virxsys Corporation Trans-splicing mediated photodynamic therapy
CA2485341A1 (en) * 2002-05-08 2004-06-17 Intronn, Inc. Use of spliceosome mediated rna trans-splicing to confer cell selective replication to adenoviruses
EP1579004B1 (en) * 2002-10-23 2010-06-16 VIRxSYS Corporation Screening methods for identification of efficient pre-trans-splicing molecules
JP2006516027A (ja) * 2002-12-02 2006-06-15 ジェンベク、インコーポレイティッド 眼関連障害の治療用材料および治療方法
US20040166091A1 (en) * 2003-02-24 2004-08-26 Genvec, Inc. Materials and methods for treating disorders of the ear
EP1606313A2 (en) * 2003-03-19 2005-12-21 Isogenis, Inc. Specific inhibition of allograft rejection
ES2391975T3 (es) * 2003-07-25 2012-12-03 Genvec, Inc. Vacunas a base de vector adenovírico
JP2007511507A (ja) * 2003-11-14 2007-05-10 ジェンベク、インコーポレイティッド 癌を処置するための治療レジメン
CN100482674C (zh) * 2003-11-24 2009-04-29 坎吉有限公司 皮肤瘢痕形成的减少
US7968334B2 (en) * 2004-01-23 2011-06-28 Virxsys Corporation Expression of apoAI and variants thereof using spliceosome mediated RNA trans-splicing
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
JP2007518423A (ja) * 2004-01-23 2007-07-12 イントロン、インコーポレイテッド スプライセオソーム仲介型ｒｎａトランススプライシングを使用するアポａ−１及びその変異体の発現
AU2005214090B2 (en) * 2004-02-23 2008-09-11 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
EP1740218A1 (en) * 2004-03-12 2007-01-10 Genvec, Inc. Materials for treating vascular leakage in the eye
EP2567967A3 (en) 2004-04-12 2013-08-21 GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Method of using adenoviral vectors to induce an immune response
CA2574802A1 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Isogenis, Inc. Specific inhibition of autoimmunity and diseases associated with autoantigens
US20060094110A1 (en) * 2004-07-30 2006-05-04 Mcgarrity Gerard J Use of spliceosome mediated RNA trans-splicing for immunotherapy
US20060134658A1 (en) * 2004-08-09 2006-06-22 Garcia-Blanco Mariano A Use of RNA trans-splicing for generation of interfering RNA molecules
CA2589602A1 (en) * 2004-09-01 2006-04-13 Genvec, Inc. Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation
DE102004047492B4 (de) * 2004-09-23 2006-07-20 Jost-Werke Gmbh & Co. Kg Verfahren zum Übertragen von elektrischer, pneumatischer oder hydraulischer Energie sowie ein Energieübertragungssystem
US7879321B2 (en) * 2004-10-08 2011-02-01 Virxsys Corporation Use of RNA trans-splicing for antibody gene transfer and antibody polypeptide production
US7871795B2 (en) 2004-10-08 2011-01-18 Virxsys Corporation Targeted trans-splicing of highly abundant transcripts for in vivo production of recombinant proteins
US20060188481A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-24 Saitama Medical School Methods for prophylactically or therapeutically treating an animal for an ocular-related disorder
CA2598806A1 (en) 2005-02-23 2006-08-31 Uab Research Foundation Alkyl-glycoside enhanced vaccination
CA2602944C (en) * 2005-04-11 2015-08-11 Crucell Holland B.V. Virus purification using ultrafiltration
US8450055B2 (en) * 2005-08-31 2013-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
WO2007027860A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
US9651543B2 (en) 2005-08-31 2017-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
BRPI0618441B8 (pt) * 2005-11-10 2021-07-27 Genvec Inc vetor adenoviral
US20100278870A1 (en) * 2007-01-09 2010-11-04 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
EP2132300B1 (en) * 2007-03-09 2011-01-12 Vectorlogics, Inc. Cells for adenovirus vector and protein production
US20100263066A1 (en) * 2007-04-30 2010-10-14 Medtronic, Inc Inert dna sequences for efficient viral packaging and methods of use
US20090202492A1 (en) * 2008-01-25 2009-08-13 University Of South Florida Adenovirus vaccine utilizing ikk as adjuvant
EP2342321B1 (en) * 2008-09-17 2018-04-11 Isogenis, Inc. Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof
CN102203242B (zh) * 2008-11-03 2013-06-12 克鲁塞尔荷兰公司 产生腺病毒载体的方法
AU2010305765B2 (en) 2009-10-15 2015-07-02 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
US8470585B2 (en) 2009-10-15 2013-06-25 Crucell Holland B.V. Process for adenovirus purification from high cell density cultures
US20120219583A1 (en) 2009-10-16 2012-08-30 Los Alamos National Security, Llc Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins
WO2011057254A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
AU2010314842A1 (en) 2009-11-09 2012-05-31 Genvec, Inc. Methods of propagating monkey adenoviral vectors
EA023816B1 (ru) 2010-02-15 2016-07-29 Круселл Холланд Б.В. СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26
ES2887335T3 (es) 2010-03-17 2021-12-22 Univ Cornell Vacuna contra las drogas de abuso basada en adenovirus alterado
AU2011232435B2 (en) 2010-03-23 2016-01-28 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
AP3390A (en) 2010-09-20 2015-08-31 Crucell Holland Bv Therapeutic vaccination against active tuberculosis
CA2809463C (en) 2010-09-27 2021-05-25 Crucell Holland B.V. Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria
WO2012083297A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Genvec, Inc. Adenoviral vectors with modified hexon regions
WO2012088041A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based dengue fever vaccine
AU2012225749B2 (en) 2011-03-04 2015-01-22 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
JP6757120B2 (ja) 2011-10-05 2020-09-16 ジェンヴェック エルエルシー アーフェンアデノウイルス（ゴリラ）又はアデノウイルスベクター、及び使用方法
CA2851251C (en) 2011-10-05 2023-09-12 Genvec, Inc. Simian (gorilla) adenovirus or adenoviral vectors and methods of use
US9580476B2 (en) 2011-10-05 2017-02-28 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (RSV) vaccine
JP6757119B2 (ja) 2011-10-05 2020-09-16 ジェンヴェック エルエルシー アーフェンアデノウイルス（ゴリラ）又はアデノウイルスベクター、及び使用方法
EP2780034A1 (en) 2011-11-14 2014-09-24 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
US20150157700A1 (en) 2012-02-02 2015-06-11 GanVec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccine
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
CN104379733B (zh) 2012-03-12 2016-01-20 克鲁塞尔荷兰公司 具改变末端的重组腺病毒群
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
NZ630649A (en) 2012-03-22 2016-12-23 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccine against rsv
EP2855669B1 (en) 2012-05-29 2018-10-10 GenVec, Inc. Modified serotype 28 adenoviral vectors
WO2013180967A1 (en) 2012-05-29 2013-12-05 Genvec, Inc. Herpes simplex virus vaccine
JP6469081B2 (ja) 2013-04-25 2019-02-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 安定化された可溶性融合前ｒｓｖｆポリペプチド
AU2014283334B2 (en) 2013-06-17 2018-10-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides
AU2014323230B2 (en) 2013-09-19 2017-05-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Improved adenovirus formulations
EP3189067B1 (en) 2014-09-04 2021-05-19 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
TWI710635B (zh) * 2014-10-09 2020-11-21 美商珍維克公司 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體
MD3215187T2 (ro) 2014-11-04 2019-02-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccinuri HPV16 terapeutice
WO2016103238A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant metapneumovirus f proteins and their use
EP3247388A1 (en) 2015-01-20 2017-11-29 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant human/bovine parainfluenza virus 3 (b/hpiv3) expressing a chimeric rsv/bpiv3 f protein and uses thereof
KR20170140180A (ko) 2015-02-24 2017-12-20 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 면역원, 항체 및 그 용도
WO2016146844A1 (en) 2015-03-18 2016-09-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Assays for recombinant expression systems
EP3283634B1 (en) 2015-04-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
WO2017005848A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
AU2016289492B2 (en) 2015-07-07 2022-08-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against RSV
SG10202001501QA (en) 2015-08-20 2020-04-29 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv18 vaccines
CN108135843B (zh) 2015-10-06 2021-11-02 扬森疫苗与预防公司 用于预防生物制品的塑料诱导降解的方法
WO2017139392A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
EP3426291A1 (en) 2016-03-09 2019-01-16 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
LT3439672T (lt) 2016-04-05 2021-01-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilizuotas tirpus rsv f baltymas prieš suliejimą, skirtas naudoti rsv infekcijos profilaktikai
SG11201807912SA (en) 2016-04-05 2018-10-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccine against rsv
EP3452087A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
KR102421049B1 (ko) 2016-05-30 2022-07-15 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 안정화된 융합-전 rsv f 단백질
AU2017283118B2 (en) 2016-06-20 2019-02-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
US10744196B2 (en) 2016-07-14 2020-08-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HPV vaccines
WO2018064523A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Genvec, Inc. Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into t cells
EP3518968B1 (en) 2016-10-03 2022-01-05 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Hiv-1 env fusion peptide immunogens and their use
US10960070B2 (en) 2016-10-25 2021-03-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion coronavirus spike proteins and their use
WO2018109220A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof
CA3053212C (en) 2017-02-09 2021-04-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
US11235056B2 (en) 2017-03-24 2022-02-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Glycan-masked engineered outer domains of HIV-1 gp120 and their use
EP3624844A1 (en) 2017-05-17 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
CA3073790A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for the safe induction of immunity against rsv
WO2019079337A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services RECOMBINANT HIV-1 ENVELOPE PROTEINS AND THEIR USE
CA3078685A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
AU2018357912B2 (en) 2017-10-31 2023-11-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
WO2019086461A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
MX2020004492A (es) 2017-10-31 2020-11-24 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus y usos de los mismos.
US11447526B2 (en) 2018-01-23 2022-09-20 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2019231652A1 (en) 2018-03-06 2020-10-01 Precigen, Inc. Hepatitis B vaccines and uses of the same
CA3117390A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
EP3959228A1 (en) 2019-04-25 2022-03-02 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant influenza antigens
AU2020275455A1 (en) 2019-05-15 2021-12-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
MX2021013947A (es) 2019-05-15 2021-12-14 Janssen Vaccines & Prevention Bv Tratamiento profilactico de la infeccion por virus sincitial respiratorio con una vacuna basada en adenovirus.
BR122024002387A2 (pt) * 2019-05-30 2024-03-12 Gritstone Bio, Inc. Vetores de adenovírus, composição farmacêutica, sequência de nucleotídeo isolada, célula isolada, vetor, kit, usos de um vetor, método para fabricar o vetor, métodos para produzir um vírus e vetor viral
AU2020342463A1 (en) 2019-09-05 2022-03-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2021064688A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
WO2021072129A2 (en) 2019-10-08 2021-04-15 Trustees Of Boston College Proteins containing multiple, different unnatural amino acids and methods of making and using such proteins
JOP20220116A1 (ar) 2019-11-18 2023-01-30 Janssen Biotech Inc اللقاحات المستندة إلى الطافر calr وjak2 واستخداماتها
WO2021163365A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sars-cov-2 vaccine
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
US11213482B1 (en) 2020-03-05 2022-01-04 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system
JP2023517011A (ja) 2020-03-05 2023-04-21 ネオティーエックス セラピューティクス リミテッド 免疫細胞を用いて癌を治療するための方法および組成物
US11773391B2 (en) 2020-04-01 2023-10-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19
JP2023521194A (ja) 2020-04-13 2023-05-23 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｐｓｍａ及びｓｔｅａｐ１ワクチン並びにそれらの使用
EP4142785A2 (en) 2020-04-29 2023-03-08 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant human metapneumovirus f proteins and their use
EP4175721A1 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022009051A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022035860A2 (en) 2020-08-10 2022-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Replication-competent adenovirus type 4-hiv env vaccines and their use
WO2022232648A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use
AU2022323509A1 (en) 2021-08-03 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection
WO2023091696A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Adenovirus delivery system for cancer treatment
WO2023192835A1 (en) 2022-03-27 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use
WO2023196898A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta globin mimetic peptides and their use
EP4338727A1 (en) 2022-09-14 2024-03-20 Roquette Freres Adenovirus formulations

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4405712A (en) * 1981-07-01 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services LTR-Vectors
US5585362A (en) * 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
AU692423B2 (en) * 1992-09-25 1998-06-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
EP0957172B1 (en) * 1992-11-18 2005-10-19 Arch Development Corporation Adenovirus-mediated gene transfer to cardiac and vascular smooth muscle
AU680459B2 (en) * 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
CA2166118C (en) * 1993-06-24 2007-04-17 Frank L. Graham Adenovirus vectors for gene therapy
FR2707664B1 (fr) * 1993-07-13 1995-09-29 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
EP0667912B1 (fr) * 1993-07-13 2008-07-02 Centelion Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique
LU88429A1 (fr) * 1993-11-23 1995-07-10 Wurth Paul Sa Dispositif de chargement d'un four à cuve
US5731172A (en) * 1994-03-09 1998-03-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. Recombinant adenovirus and process for producing the same
US5872005A (en) * 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
BG62739B1 (bg) 2000-06-30
HUP9902310A2 (hu) 1999-10-28
CA2238295A1 (en) 1997-06-19
IL124797A0 (en) 1999-01-26
DE69635931D1 (de) 2006-05-11
NZ325627A (en) 2000-01-28
EE9800185A (et) 1998-12-15
JPH11502421A (ja) 1999-03-02
US5851806A (en) 1998-12-22
EP0870049B1 (en) 2006-03-15
CA2238295C (en) 2007-04-03
BR9612677A (pt) 1999-07-20
GEP20012559B (en) 2001-10-25
BG102612A (en) 1999-04-30
HUP9902310A3 (en) 2001-11-28
EP0870049A2 (en) 1998-10-14
IS4762A (is) 1998-06-03
SK78598A3 (en) 1998-12-02
EA199800566A1 (ru) 1999-02-25
PL327984A1 (en) 1999-01-04
ATE320503T1 (de) 2006-04-15
DE69635931T2 (de) 2006-11-30
NO982687D0 (no) 1998-06-11
MX9804716A (es) 1998-10-31
JP3299761B2 (ja) 2002-07-08
WO1997021826A2 (en) 1997-06-19
AU711366B2 (en) 1999-10-14
JP2002199894A (ja) 2002-07-16
AU1417797A (en) 1997-07-03
NO982687L (no) 1998-07-13
WO1997021826A3 (en) 1997-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0870049B1 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
EP0784690B1 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
US5837511A (en) Non-group C adenoviral vectors
AU743923B2 (en) Method for the production of non-group C adenoviral vectors
WO1997012986A9 (en) Non-group c adenoviral vectors
AU730278B2 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
AU703768C (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
MXPA98004716A (en) Complementary systems of adenoviral vectors and cell lines

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic