BG62739B1 - Комплементарни аденовирусни векторни системи и клетъчни линии - Google Patents

Комплементарни аденовирусни векторни системи и клетъчни линии Download PDF

Info

Publication number
BG62739B1
BG62739B1 BG102612A BG10261298A BG62739B1 BG 62739 B1 BG62739 B1 BG 62739B1 BG 102612 A BG102612 A BG 102612A BG 10261298 A BG10261298 A BG 10261298A BG 62739 B1 BG62739 B1 BG 62739B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
adenoviral
vector
region
genome
adenoviral vector
Prior art date
Application number
BG102612A
Other languages
English (en)
Other versions
BG102612A (bg
Inventor
Imre Kovesdi
Douglas Brough
Duncan McVEY
Joseph Bruder
Alena Lizonova
Original Assignee
Genvec Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genvec Inc. filed Critical Genvec Inc.
Publication of BG102612A publication Critical patent/BG102612A/bg
Publication of BG62739B1 publication Critical patent/BG62739B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4712—Cystic fibrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Design And Manufacture Of Integrated Circuits (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Semiconductor Memories (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до множествени репликационно дефицитни аденовирусни вектори, имащи спейсер най-малко в един репликационно дефицитен аденовирусен район, до съответните комплементиращи клетъчнилинии, както и до средства за конструиране на такива вектори. Изобретението се отнася още до съответните методи за употребата им, например в генната терапия.

Description

Настоящото изобретение се отнася до рекомбинантни, аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност, притежаващи спейсер в поне един от репликационно дефицитните аденовирусни региони и до терапевтичното използуване на такива вектори.
Предшествувашо Ниво на Техниката
През зимата и пролетта на 1952 -1953 г., Rowe и неговите колеги от Националните Институти по Здравеопазване (NIH), получиха и поставиха в тъканни култури аденоиди, които са били отстранени по хирургичен начин от малки деца от Вашингтон, област D.C. (Rowe et al., Proc. Soc. Exp. Biol, Med.. 84, 570-573 (1953)). След период от няколко седмици, много от културите започнаха да показват прогресираща дегенерация, характеризираща се с разрушаване на епителните клетки. Този цитопатичен ефект можа да бъде серийно прехвърлен от филтруваните клетъчни течности в установени клетъчни култури на човешки клетъчни линии. Цитопатичният агент беше наречен „аденоид дегенериращ“ u (Ad) агент. Наименованието „аденовирус“ постепенно стана общоприето за тези агенти. Тези начални открития бяха оследвани от откриването на много прототипни щамове от аденовируси, някои от които причиняват дихателни заболявания (Rowe et al., цитиран по - горе: Dingle et al., Am, Rev. Respir, Dis.. 9Z, 1-65 (1968); реферирано в Horwitz, „Аденовируси и тяхната реликация“ в Virology (Fields et al., eds., Raven Press Ltd., New York, NY, 2d ed., 1990), 1679 -1721).
Повече от 40 аденовирусни подтипа са били изолирани от човешки организми и повече от 50 допълнителни подтипа са били изолирани от други бозайници и птици (описани от Ishibashi et al., „Adenoviruses of animals“, in the Adenoviruses. Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY, pp. 497 - 562 (1984); Strauss, „Adenovirus infections in humans“, in The Adenoviruses. Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY, 451 - 596 (1984)). Всички тези подтипове принадлежат към семейство Adenoviridae, което понастоящем е разделено на два рода, наречени Mastadenovirus и Aviadenovirus.
Всички аденовируси са морфологично и структурно подобни. При хората обаче, аденовирусите имат дивергиращи имунологични качества и следователно, се разделят в серотипове. Два човешки серотипа от адуновируси, наречени Ad2 и Ad5 са били интензивно изучавани. Тези проучвания са осигурили основната част от информацията за аденовирусите по принцип. Геномите на Ad2 и Ad5 са били напълно секвенирани и също са известни последователностите на избрани региони от геномите от други серотипове. Цялостната организация на аденовирусния геном е запазена между серотиповете, така че специфични функции са с подобна позиция.
По принцип, аденовирусите са неопаковени, правилни икосахедрони от около 65 до 80 нанометра в диаметър,състоящи се от външна капсула и вътрешна кора. Капсулата е изградена от 20 триъгълни повърхности или фасети и 12 вертикса (Horne et al., J, Mol, Biol.. 1, 84-86 (1959)).
фасетите изградени от хексони, а вертиксите са изградени от пентони. От всеки вертикс излиза фибер. В допълнение към хексоните, пентонте и фиберите, има 8 малки структурни полипетиди, точните позиции на повечето от тях са неясни. Един малък полипетиден компонент, наречен полипептид IX, се свързва на позиция, където той може да стабилизира хекон хексон връзката, с което той се отнася към „групата на деветте“ в центъра на всеки фасет (Furcinitti et al., EMBO. 8, 3563 - 3570 (1989)). За малките полипептиди VI и VIII се приема че стабилизират хексон - хексон връзките между близкоразположените фасети. Малкият полипептид IIIA, за който се знае че е локализиран в регионите на вертиксите, съгласно предположението на Stewart et al., (Cell, 67, 145 - 154 (1991)) свързва капсулата и сърцевината.
Вирусната сърцевина съдържа линейна, двойноверижна ДНК молекула с обратни терминални повтори (ITRs), за които е отбелязано?че варират в дължина от 103 базови двойки до 163 базови двойки при различните изолати (Garon et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 69, 2391 - 2394 (972); Wolfson et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 69, 3054 - 3057 (1972); Arrand et al., J, Mol, Biol.. 128. 577 - 594 (1973); Tooze, DNA Tumor Viruses. 2 ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Sping Harbor Laboratory, 943 -1054 (1981)). ITRs са отговорни за началото на ДНК репликацията (Garon et al., цитиран по - горе. Wolfson et al.- цитиран по - горе, Arrand et al. - цитиран по - горе. Steenberg et al. - цитиран по горе).
Вирусната ДНК е асоциирана с четири полипептида, наречени V, VII, μ и терминални полипептид (ТР). 55 килодалтоновият ТР полипептид е ковалентно свързан с 5’ края на ДНК през dCMP (Rekosh et al., Cell. Ц, 283 - 295 (1977); Robinson et al., Virology, 56, 54 - 69 (1973)). Останалите три полипептида са нековалентно свързани към ДНК и я нагъват по такъв начин, че да може да се разположи в малкия обем на капсулата. Очевидно е, че ДНК молекулата е пакетирана в структура, подобна на клетъчните нуклеозоми, както се вижда от профила след нуклеазно смилане (Corden et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 73,401 - 404 (1976); Tale et al., Nucleic Acids Res.. 6, 2769 2785 (1979); Mirza et al., Biochim, Biophys, Acta. 696. 76 86 (1982)).
Аденовирусът инфектира клетката ? като се прикрепя с фибера към специфичен рецептор върху клетъчната мембрана (Longberg - Holm et al., J, Virol.. 4. 777 - 796 (1969); Morgan et al., J, Virol.. 4, 777 - 796 (1969), Pastan et al., „Adenovirus entry into cells: some new observations on an old problem“ в Concepts in Viral Pathogenesis. Notkins et al., eds., Springer Verlag, New York, NY, 141 - 146 (1987)). След това пентоновата база се свързва с аденовирусния интегринов рецептор. Свързаният с рецептор вирус след това мигрира от плазмената мембрана към опакованите с клатрин вдлъбнатини, които образуват ендоцитни везикули или рецептозоми, където pH намалява до
5.5 (Pastan et al., Concepts in Viral Pathogenesis. Notkins et al., eds., Springer Verlag, New York, NY, 141 - 146 (1987)). Приема се, че намаляването на pH е свързано с промяна на повърхностната конфигурация на вируса, в резултат на което рецептозомите се разрушават и вируса се освобождава в цитоплазмата на клетката. Вирусната ДНК е частично неопакована, т.е. частично освободена от асоцираните белтъци в цитоплазмата, докато се транспортира до ядрото.
Когато вирусът достигне порите на ядрото, отделя повечето остатъчни белтъци в цитоплазмата (Philipson et al., ± Virol.. 2, 1064 - 1075 (1968)). Въреки това, вирусната ДНК не е напълно освободена от белтъците, като поне част от вирусната ДНК е асоциирана с поне четири вирусни полипептида, наречени V, VII, ТР и μ, след което се превръща във вирусна ДНК - клетъчен хистонен комплекс (Tate et al., Nucleic Acids Res.. 6, 2769 - 2785 (1979)).
Цикълът от клетъчна инфекция до продукция на вирусни частици продължава около един - два дни, в резултат на което се получават до около 10 000 инфектирани частици на клетка (Green et al., Virology. IS, 169 -176 (1961)). Процесът на инфекция с аденовируса се разделя на две фази: ранна фаза (Е) и късна фаза (L), които са разделени от роцеса на вирусна ДНК репликация, въпреки че някои процеси, които протичат през ранната фаза, протичат и през късната фаза и обратно. По нататъшно отдиференциране на двете фази, е било направено с цел пълно описание на експресията на вирусните гени.
През ранната фаза, вирусната тРНК, която представлява малка част от общата РНК, налична в клетката, се синтезира от двете вериги на аденовирусната ДНК, присъствуваща в клетъчното ядро. Поне пет региона, означени като Е1, Е2, ЕЗ, Е4 и MLP-L1ace транскрибират (Lewis et al., Cell, 7, 141 - 151 (1976); Sharp et al., „Adenovius transcription“ in The Adenoviruses. Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, NY, 173 - 204 (1984)). Всеки регион има поне един отдалечен промотор и е отговорен за генерирането на множествени тРНК видове.
Продуктите от ранните (Е) региони: (1) имат регулаторна роля за експресията на други вирусни компоненти, (2) са включени в общото прекратяване на клетъчната ДНК репликация и белтъчна синтеза, и (3) са необходими за вирусната ДНК репликация. Серия от процеси, регулиращи началната транскрибция на тРНК, започват с експресията на определени ранни региони, включващи Е1А, L1 и 13.5 килодалтоновия ген (описан от Sharp (1984), цитиран по горе. Horwitz (1990), цитиран по - горе). Експресията на закъснелите ранни региони Е1В, Е2А, Е2В, ЕЗ и Е4 зависи от Е1А гениите продукти. Три промотора - Е2 промотора при 72 единица на картата (mu), промотора на белтък IX, и IVa промотора се подсилват от началото на ДНК репликацията, но не зависят от нея (Wilson et al., Virology. 94, 175 - 184 (1979)). Тяхната експресия характеризира междинната фаза на вирусната генна експресия. Резултатът от каскадата от ранна генна експресия е началото на вирусната ДНК репликация.
Инициацията на вирусната ДНК репликация очевидно е важна за навлизането в късната фаза. Късната фаза на вирусната инфекция се характеризира с продукция на големи количества вирусни структурни полипептиди и неструктурни белтъци, включени в капсулния комплекс. Главният късен промотор (MLP) става напълно активен и продуцира транскрибти, които възникват на 16.5 mu и спират близо до края на генома. Пост - транскрибционната обработка на този дълъг транскрибт дава началото на пет семейства от късна тРНК; означени съответно L1 - L5 (Shaw et al., Cell, 22, 905 - 916 (1980)). Механизмите, които контролират превключването от ранна към късна фази, в резултат на което се получава такова драматично превключване в транскрибционната утилизация, не са ясни. Изискване за ДНК репликацията може да бъде cis-свойство на
ДНК шаблона, т.к. късната транскрибция не възниква от суперинфектиращ вирус по време, когато късната транскрибция на първоначално инфектиращия вирус е активна (Thomas et a!., Cell. 22, 523 - 533 (1980)).
Определени рекомбинантни аденовирусни вектори са били използувани за генна терапия. Използуването на рекомбинантни аденовирусни вектори за прехвърляне на един или повече рекомбинантни гени подпомага насочения пренос на ген или гени до орган, тъкан или клетка, нуждаещи се от третиране, и по този начин се превъзмогват проблемите, свързани с пренос, възникващи при повечето форми на соматична генна терапия. Нещо повече, рекомбинантните аденовирусни вектори не изискват пролиферация на клетката гостоприемник за експресия на аденовирусните белтъци (Horwitz et al., in Virology. Raven Press, New York, 2, 1679 - 1721 (1990); Berkner, Biotechniques, 6, 616, (1988)). Освен това, ако болният орган, нуждаещ се от лечение . е бял дроб, използуването на аденовирус като вектор на генетична информация има допълнителното предимство, че аденовирусите са нормално трофични за дихателния епител (Straus, in Adenoviruses. Plenum Press, New York, 451 - 496 (1984)).
Други предимства на аденовирусите като потенциални вектори за човешка генна терапия са.както следва: (i) рядко се наблюдава рекомбинация, (Н) до сега не са известни асоциации на човешки ракови образования с аденовирусни инфекции, въпреки честите инфекции на хора с аденовируси ; (iii) аденовирусният геном, (който е линеен, двойно верижен), може регулярно да бъде маниулиран да приеме чуждеродни гени с размер 7.0 - 7.5 кВ, (iv) аденовирусният вектор не инсертира негова собствена ДНК в хромозомите на клетката, така че неговото влияние е такова, че е малко вероятно да попречи на нормалните клетъчни функции; (v) аденовируса може да инфектира неделящи се или терминално диференцирани клетки, като клетките в мозъка и белите дробове; и (vi) живи аденовируси, притежаващи като жизненоважна характеристика способността за репликация. са били успешно и безопасно използувани като ваксини при хората (Horwitz et al., цитиран по горе: Berkner et al., J. Virol., 61. 1213 - 1220 (1987); Straus, цитиран no rope: Chanock et al, JAMA, 195.151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol, 57. 267 (1985); Ballay et al., EMBO, 4. 3861 (1985)).
Чуждеродни гени са били вкарвани в два главни региона на аденовирусния геном с цел иползуването им като експресионни вектори, наречени Е1 и ЕЗ региони, и по този начин осигуряващи аденовируси с единична репликационна недостатъчност и векторите произтичащи от тях. В резултат на инсерция в Е1 региона може да се получи дефектно потомство, което изисква или растеж в комплементарни клетки. или присъствието на цялостни помощни вируси, като всеки от тези два случая служи за заместване на функцията на повредеия или липстващия Е1 регион (Berkner et al., цитиран по - горе: Davidson et al., J. Virol.. 61.1226 - 1239 (1987); Mansour et al., Mol. Cell Biol., 6. 2684 - 2694 (1986)). Този регион от генома е бил използуван най-често за експресията на чуждородни гени.
Гените,вкарани в Е1 регона.са поставени под контрола на различни промотори и повечето от тях продуцират чуждероден генен продукт в големи количества, в зависимост от експресионната касета. Тези аденовирусни вектори, обаче няма да растат в некомплементарни клетъчни линии.
Понастоящем има съществуващи само няколко клетъчни линии, които са комплементарни по отношение на жизнено важни функции, липстващи при аденовирусите с единична недостатъчност. Примери на такива клетъчни линии включват НЕК-293 (Graham et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39. 637 - 650 (1975)), W162 (Weinberg et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 80. 5383 - 5386 (1983)), gMDBP (Klesig et al., Mol. Cell, Biol., 4,1354 -1362 (1984); Borugh et al., Virology, 190. 624 - 634 (1992)).
За сравнение, ЕЗ региона не е жизнено важен за вирусния растеж в тъканни култури (т.е. за вирусната продукция), и замяната на този регион с чуждеродна генна експресионна касета води до получаването на вирус, който може да расте репродуктивно в некомплементарни клетъчни линии. Например, има съобщения за инсерцията и експресията на повърхностния антиген на хепатит В в ЕЗ региона с последващо инокулиране и образуване на антитела в хамстер (Morin et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 84. 4626 - 4630 (1987)).
Един проблем, свързан c използуването на аденовирусни вектори с единична недостатъчност е, че те ограничават обема на полезното пространство в аденовирусния геном за инсерцията и експресията на чуждеродни гени. Нещо повече, в резултат на подобност или припокриване, вирусната последователност съдържаща се в аденовирусните вектори с единична недостатъчност и комплементарните клетъчни линии които понастоящем съществуват, могат да възникнат рекомбинационни процеси и да се създаде репликационно компетентен вирус в рамките на векторната структура, който да се възпроизведе. Този процес може да доведе до образуването на векторна наличност, която не може да бъде изолзувана за целите на генната терапия.
Векторите с множествена репликационна недостатъчност (т.е. вектори .дефицитни поне по два региона, неоходими за вирусната продукция) бяха създадени в резултат на усилията на изследователите за преодоляване на този проблем (РСТ патентна заявка WO94/28152 (Imler et al.)). Такива вектори, притежаващи поне една делеция в Е2 или Е4 регионите, обаче показват намалена фиберна експресия и намален вирусен растеж в комплементарните клетъчни линии. Подозира се, че Е4 региона играе роля във вирусната ДНК репликация, късната тРНК синтеза, прекъсването на белтъчната синтеза на гостоприемника и вируснатата асоциация. Напоследък, при опит да се коригира намалениятвирусен растеж на вектори^ дефицитни в Е4 регионите в комплементарни клетъчни линии, бяха създадени аденовирусни вектори, притежаващи Е4 делеции, които запазват важни отворени прочитаеми рамки на Е4 региона, по - специално ORF6 или ORF3 (РСТ патентна заявка WO 94/12649 (Gregory et al.)).
Въпреки че и двете отворени четящи рамки 3 или 6 притежават капацитет да осигурят Е4 функците, необходими за вирустното прорастване /7? vitro, ORF3 продукта прави това с намалена ефикасност (Armentano et al., Human Gene Therapy, 6, 1343 - 1353 (1995)). Нещо повече, описани са някои свойства? асоциирани с факта 7че ORF могат да функционират in vivo (Armentano et al., цитиран по - горе). Например продукт от ORF 6/7 е включен в активирането на Е2А промотора чрез комплексна формация с, и стимулиране на, клетъчния транскрибционен фактор E2f. Подобно на това, ORF3 и ORF6 участвуват в регулацията на включване/изключване на интрони в сплайсинга на главния късен троен водач. Обаче дори ORF 6 не може да осигури на аденовирусния мутант с Е4 делеция, вирусна продукция като на дивия тип. По - специално, аденовирусният мутант с Ε1Έ4' делеция, съдържащ ORF6, поазва 10 кратно намаляване на фиберната синтеза, закъсняла вирусна репликация и ниско плаково образуване in vitro, и намалена и закъсняла вирусна репликация in vivo, в сравнение с аденовирус не притежаващ Е4 делеция (виж Armentano et al., цитиран по -горе).
Съответно, цел на настоящото изобретение е да осигури аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност, които могат да понесат инсерцията и експресията на относително големи части от чуждеродна ДНК, като в същото време има възможност за задоволителна репликация in vitro, т.е вирусна продукция. Освен това цел на настоящото изобретение е да се осигурят рекомбинанти на такива аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност и терапевтични методи, по - специално отнасящи се към генната терапия, ваксинация и подобни третирания, включващи използуването на такива рекомбинанти. Тези и други цели и преимущества на настоящото изобретение, както и допълнително открити особености, са част от последващото детйлно описание.
Кратка Анотация на Изобретението
Настоящото изобретение осигурява аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност и комплементарни клетъчни линии. Аденовирусните вектори с множествена репликационна недостатъчност притежават спейсер в поне един от аденовирусните региони с репликационна недостатъчност. Тези аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност притежават способност да осъществят инсерцията и експресията на големи фрагменти от чуждеродна ДНК, в сравнение с аденовирусни вектори с единична репликационна недостатъчност, освен това се осигурява подобна фибер експресия и вирусен растеж, какъвто е бил установен при аденовирусни вектори с единична репликационна недостатъчност. Настоящото изобретение осигурява рекомбинантни аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност и терапевтични методи, наример такива отнасящи се до генна терапия, ваксинация и подобни третирания, включващи използуването на такива рекомбинанти.
Кратко Описание на Фигурите фигура 1 показва комплект схематични диаграми на вирусните вектори AdGVCFTR.10L и AdGVCFTR.10R.
фигура 2 показва схематична диаграма на вирусен вектор AdGVCFTR.11.
фигура 3 показва схематична диаграма на вирусен вектор AdGVCFTR.13.
фигура 4 показва схематична диаграма на експресионния вектор Е2А.
фигура 5 представлява имуноблот, използуван за скрининг на нивото на индуцирана DBP експресия в определена клонова 293/Е2 клетъчна линия.
фигура 6 представлява имуноблот, използуван за анализ на акумулацията на DBP в определена клонова 293/Е2 клетъчна линия след първите 24 часа на индукцията.
фигура 7 показва комплект схематични диаграми на вирусните вектори AdGVCFTR.10L и AdGVCFTR.12B.
фигура 8 е снимка на ДНК гел, оцветен с етидиев бромид, осигуряваща данни свързани с PCR детекцията на вирусен вектор AdGVCFTR.12B от пасажиранй трансфекционни лизати.
фигура 9 показва схематична диаграма на вирусен вектор AdGVLuc;E2GUS.
фигура 10 показва схематична диаграма на експресионен вектор E4-ORF6.
фигура 11 е снимка на ДНК гел, оцветен с етидиев бромид, осигуряваща данни свързани с PCR детекцията на Е4 регион с делеция в пасажирани трансфекционни лизати на AdGVPgal.11.
фигура 12 е графика, показваща количеството продуцирани вируси (PFU/клетки на у-оста) на вирус с Е4 делеция, който запазва Е1 функцията си след инфектиране на различни клетъчни линии.
фигура 13 показва схематична диаграма на вирусен вектор AdGVPgal.11.
фигури 14 А-В са схематични диаграми. сравняващи фибер/Е4 региона на вектори, при които: Е4 последователностите са напълно отстранени и L5 фибер последователността е фузирана с дясно страничен ITR (фигура 14А), Е4 кодиращи последователности са отстранени и L5 фибер последователността е фузирана с Е4 промотор и дясно страничен ITR за да се получи вектор AdGV.11 (фигура 14Б), Е4 кодиращи последователности са отстранени и последователности (включващи SV40 полиаденилатна последователност) са добавени между L5 фиберния регион и дясно - страничен ITRy3a да се получи на основата на вектор AdGv.11S - вектора AdGVCFTR.11S (фигура 14В). Символи: 1TR обратни терминални повтори; Mfe I (изошизомер на Mun I), Рас I, Eag I, сайт за палиндромично разпознаване на тези ензими; GUS - последователност кодираща β-глюкоруназа; SV40 polyA полиаденилационен сайт на вирус 40 от човекоподобна маймуна; Е4р - Е4 промотор.
фигура 15 представлва имуноблот на различни 293/ORF6 клетъчни лизати, инфектирани с: или никакъв вектор (т.е. фалшива инфекция) (1) или Е1 дефицитният вектор AdGVpgal.1O (2) или Е1 и Е4 дефицитният вектор AdGVpgal.11 (3). Имуноблота беше проведен,изполувайки заешки серум, който разпознава всички структурни белтъци на аденовирусната капсула.
фигура 16 представлва имуноблот на пречистени капсули, получени от различни 293/ORF6 клетъчни лизати, инфектирани с Е1 дефицитният вектор AdGVpgal.10 (1) или Е1 и Е4 дефицитният вектор AdGVpgal.11 (2). Имуноблота беше проведен.,изполувайки антитяло7насочено срещу аденовирусния фиберен бетък.
фигура 17 представлва имуноблот на различни 293/ORF6 клетъчни лизати, инфектирани с: или никакъв вектор (т.е. фалшива инфекция) (1) или Е1 и ЕЗ дефицитният вектор AdGVpgal.1O (2) или Е1 и Е4 дефицитният вектор AdGVpgal.11 (3), или Е1, ЕЗ и Е4 дефицитен вектор на базата на AdGV.11S вектор AdGVCFTR.11S, включващ спейсер в региона на Е4 делецията (4). Имуноблота беше проведен . изполувайки антитяло;насочено срещу аденовирусния фиберен бетък.
фигура 18 е графика на количеството активни вектори (фосус образуващи единици, ffu) на клетка, в различни часове след инфекцията на А232 клетки инфектирани с: вектор получен на основата на Е1 и ЕЗ дефицитен AdGV.1O - вектор AdGVpgal.1O (запълнени квадрати); вектор получен на основата на Е1 и ЕЗ дефицитен AdGV.11 - вектор AdGVpgal.11 (ромбоиди) или 1, ЕЗ и Е4 дефицитен вектор на базата на AdGV.11S - вектор AdGVCFTR.11S, включващ спейсер в региона на Е4 делецията (кръгче).
фигура 19 е схематична диаграма на Е2А гена, както е транслиран в див тип Е2А белтък, и съответните региони, транслирани в аденовирусни вектори с делеции d®01, с/В02 и с^ЗОЗ, и влиянието на такава транслация върху растежа. Съкращения и символи; Nt - регон от Е2А генния продукт, включен в ядрената локализация и късна генна експресия; Ct регион от Е2А генния продукт, отговорна за ДНК репликацията, ssflHK свързване и тДНК свързване; DPB - Е2А генен продукт (едноверижно свързващ се с ДНК белтък); права линия - регион от Е2А кодиращата последователност, която е транслирана в рамка във векторите с делеция; вълнообразна линия - регион от Е2А кодиращата последователност, която е транслирана извън рамка във векторите с делеция в резултат на делеция на Е2А поедователности; + + + - див тип растеж; + - намален вирусен растеж; -/+ - много силно намаленият вирусен растеж е очевиден от малките плаки.
Детайлно Описание на Изобретението
Настоящото изобретение осигурява, освен други неща, аденовирусни вектори с множествена репликационна недостътъчност за генно клониране и експресия. Аденовирусните вектори с множествена репликационна недостътъчност от настоящото изобретиние се различават от поенастоящем наличните аденовирусни вектори с единична репликационна недостътъчност по това, че са дефицитни по поне два региона от аденовирусния геном, особено такива два региона, които са необходими за вирусната репродукция, които по този начин позволяват такива вектори да приемат и експресират по - големи части от чуждеродна ДНК. Понятието „чуждеродна ДНК“ или „пасенджер ген“ се използуват,като се отнасят до която и да е последователност ДНК;вкарана във вектор (т.е. преносен вектор) от настоящото изобретение, която е чужда за аденовирусния геном. Такава чуждеродна ДНК може да се състои от гени, части от гени, или каквато и да е друга ДНК последователност, включваща, без ограничение последователности, които кодират РНК, безсмислена РНК и/или полипептиди. Аденовирусни вектори с множествена репликационна недостътъчност от настоящото изобретение се различават освен това от откритите напоследък аденовирусни вектори с множествена репликационна недостътъчност по това, че притежават способност да постигнат фиберна експресия и вирусен растеж в комплементарни клетъчни линии, подобно на аденовирусни вектори с единична репликационна недостътъчност, в резултат на наличието на спейсер в поне един от дефицитните аденовирусни региони, което може да предизвика транскрипционно блокиране и по този начин да възпрепятствува транскрипционното прочитане.
Регион от аденовирусния геном включва един или повече гени. Такива гени кодират генни продукти.които медиират, подпомагат, причиняват или са различни компоненти или активности на аденовируса, като прикрепване, проникване, репликация на белтък от сърцевината, хексон, фибер, асоцииран белтък с хексона и други подобни. Един ефект на дефицитния регион може да бъде невъзможност на аденовируса да се размножава например, който може да включва някой или всички гореспоменати компоненти или активности. Прежде споменатите компоненти или активности се споменават в настоящото изобретение като генни функции.
Недостатъчност на ген или генна функция, т.е. дефицитен ген, генен регион, или регион, както се използува тук, се дефинира като делеция на генетичен материал на вирусен геном, който служи да намали или унищожи функцията на гена, чиято ДНК последователност е отстранена изцяло или частично, и да осигури пространство или капацитет на вирусния геном за инсерция на ДНК, която е чужда за вирусния геном. Такава недостатъчност може да е в гени, които са жизнено важни или неважни за прорастването на аденовирусния вектор в тъканните култури в некомплементарен клетъчен гостоприемник, по - специално поне един, по - специално поне два от дефицитните гени на откритите вирусни вектори са дефицитни за ген, който е важен за вирусното прорастване.
Всеки подтип, смес от подтипове, или химерични аденовируси могат да бъдат използувани като източник на ДНК за генериране на аденовирусни вектори с множествена репликационна недостътъчност. Имайки предвид, че геноматна Ad5 е напълно секвениран, настоящото изобретение описва Ad5 серотипове.
Аденовируснияг вектор от настоящото изобретение е с множествена репликационна недостатъчност, т.е. той е дефицитен в поне два региона , необходими за вирусната продукция (т.е. вирусна репликация in vitro). Тези региони включват ранен регион 1 (Е1), ранен регион 2А (Е2А), ранен регион 2В (Е2В), ранен регион 4 (Е4), късен регион 1 (L1), късен регион 2 (L2), късен регион 3 (L3), късен регион 4 (L4) и късен регион 5 (L5). Въпреки че Е1 региона чоже да се счита като състоящ се от ранен регион 1А (Е1А) и ранен регион 1В (Е1В), дефицитност в който и да е от тях или и в двата от Е1А и/или Е1В региони се счита като единична недостатъчност в контекста на настоящото изобретение. В допълнение, такъв вектор може да бъде дефицитен в един или повече региони, които не са необходими за вирусната продукция, т.е. векторите могат да бъдат допълнително дефицитни в ранния регион 3 (ЕЗ).
Откритиятпонастоящем аденовирусен вектор е желателно да бъде дефицитен в Е4 региона и един или повече допълнителни региони , необходими за вирусната продукция (особено други ранни региони, необходими за вирусната продукция), по - специално в пълния Е4 регион,отстранен от аденовирусния вектор, освен полиаденилатната последователност между останалия L5 фиберен регион и дясно страничната ITR. По - специално, дефицитният допълнителен регион. необходим за вирусната продукция е Е1 и/или Е2А регион, с по - специално отстранен ЕЗ регион. Така специална част от понастоящем открития аденовирусен вектор включва ЕТ Е2А', ЕТ Е2А' Е4‘, ЕТ Е4', и Ε2ΑΈ4' аденовирусни вектори, които също могат да бъдат Е3‘. По - специално всички ранни региони са отстранени от аденовирусния вектор (със или без отстраняването на късния регион, по - специално, когато поне един задържа L5 фиберния регион), като изключение е възможно за преждеспоменатата Е4 полиаденилатна посладователност между останалия L5 фиберен регион и дясно-страничният ITR.
Понастоящем откритият аденовирусен вектор включва спейсер, осигуряващ вирусен растеж в комплементарна клетъчна линия, подобна на тази.постигната чрез аденовирусни вектори с единична репликационна недостътъчност, особено аденовирусен вектор с единична Е1 репликационна недостътъчност. В споменатия Е4- аденовирусен вектор от настоящото изобретение, където L5 фиберният регион е подтиснат, спейсерът е локализиран между L5 фиберният регион и дясно-страничната ITR. По - специално, при такъв аденовирусен вектор, Е4 полиаденилиращата последователност самостоятелно, и по - специално в комбинация с друга последователност съществува между L5 нишковидния регион и дясно - страничната ITR, така че да разделя в достатъчна степен подтиснатия L5 фиберен регион от дясно - страничната ITR, и по такъв начин, вирусната продукция на такъв вектор се доближава до тази на аденовирусен вектор с единична недостатъчност, по специално аденовирусен вектор с единична Е1 недостатъчност.
При липсата на спейсер, продукцията на фиберния белтък и/или вирусния растеж на аденовирусен вектор с множествена репликационна недостатъчност е намалена в сравнение с аденовирусен вектор с единична репликационна недостатъчност. Включването на спейсер в поне един от дефицитните аденовирусни региони, по - специално Е4 региона, осуетява действието на този дефект върху растежа и експресията на фибера.
Функционирането на дефицитния за репликацията регион се осигурява чрез комплементарни клетъчни линии. В резултат на това, не е необходимо спейсерът да осигурява дефицитна функция, а може да е, която и да е последователност, ограничена само по отношение на размера на вкарания участък, така че векторът да може да се приспособи. Спейсерът сам по себе си може да функционира; като възстанови растежния дефект и намали фиберната експресия, установена при аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност. Спейсерът може да бъде с всякакъв подходящ размер, по - специално поне около 15 базови двойки (т.е. между около 15 базови двойки и около 12 000 базови двойки), по специално от около 100 базови двойки до около 10 000 базови двойки, по - специално от около 500 базови двойки до около 8000 базови двойки, още по-специално от 1500 базови двойки до около 6 000 базови двойки и за предпочитане от около 2 000 базови двойки до около 3 000 базови двойки.
Спейсерът може да съдържа всяка последователност или последователности, които са с подходяща дължина. Последователността на спейсера може да бъде кодираща или не - кодираща, нативна или не - нативна по отношение на аденовирусния геном, но не трябва да притежава способност да възстановява репликационната функция на дефицитния регион. Спейсерът може освен това да съдържа промоторно изменчива експресионна касета. По - специално, спейсерът включва допълннителна полиаденилатна последователност и/или пасенджер ген. За предпочитане е в случая с вкаран спейсер в дефицитен по Е4 регион, както Е4 полиаденилатната последователност така и Е4 промотора на аденовирусния геном или който и да е друг (клетъчен или вирусен) промотор да останат във вектора. Спеисерът е разположен между Е4 полиаденилатната част и Е4 промотора или ако Е4 промотора не присъства във вектора, спейсерът е разположен близо да дясно - страничната ITR.
Спейсерът може да включва, която и да е подходяща полиаденилатна последователност. Примери на подходящи полиаденилатни последователности включват синтетични оптимизирани последователности, BGH (Говежди Растежен Хормон), полиомен вирус, ТК (тимидин киназа), EBV (Epstein Barr вирус) и папиломни вируси, включително човешки папиломни вируси и BPV (Говежди Папиломен Вирус). По специално, особено при Е4 дефицитният регион, спейсерът включва SV40 полиаденилатна последователност. SV40 полиаденилатната последователност позволява високи нива на вирусна продукция на аденовирусни вектори с множествена репликационна недостатъчност.
Въпреки че пасенджер генаггсе инсертира типично в Е1 дефицитен регион на аденовирусния геном, пасенджер генаг може също да функционира като спейсер в Е4 дефицитен регион на аденовирусния геном. Пасенджер генаге ограничен само по отношение размера на фрагмента, който вектора може да приеме и може да бъде всеки подходящ ген. Примери за подходящи пасенджер гени включват маркерни генни последователности като pGUS, секреторна алкална фосфатаза, луцифераза, β-галактозидаза, и човешки анти - трипсин; терапевтични гени, които представляват интерес, като цисто фиброзен трансмембранен регулаторен ген (CFTR); и потенциални имуно - модификатори като ВЗ-19К, ЕЗ-14.7, ICP47, лиганден ген, и CTLA4 ген.
По - специално, аденовирусният вектор с множествена репликационна недостатъчност от настоящото изобретение е дефицитен по Е2А региона, като освен това включва част от Е2А региона на аденовирусния геном в Е2А дефицитен регион, който е по - малък по дължина от 230 базови двойки. По принцип, Е2А региона на аденовируса кодира DBP (ДНК свързващ белтък), полипептид.,необходим за ДНК репликацията. ДНК свързващият белтък (DBP) се състои от 473 до 529 аминокиселини, в зависимост от серотипа на вируса. Приема се, че ДНК свързващ белтък (DBP) е асиметричен белтък, който съществува като .удължен елипсоид, състоящ се от глобуларен Ct домен с удължен Nt домен. Проучвания показват, че Ct домена отговаря за способността за свързване на ДНК свързващия белтък с нуклеиновите киселини, свързвайки се с цинк, и функционира при ДНК синтезата на ниво удължаване веригата на ДНК. Освен това се приема, че Nt домена, функциониращ в късната генна експресна както на транскрибционно.. така и на посттранскрибционно ниво, е отговорен за ефикасната ядрена локализация на белтъка и може също да играе роля за усилване на неговата собствена експресна. Делеции на Nt домена между аминокиселини 2 до 38, показват, че този регион е важен за функционирането на ДНК свързващ белтък (DBP). (Brough et al.. Virology, 196. 269-281 (1993)). Докато делеции на Е2А региона, кодиращи Ct региона на ДНК свързващ белтък (DPB) нямат влияние върху вирусната продукция, делеции в Е2А региона, които кодират аминокиселини 2 - 38 от Nt домена на ДНК свързващ белтък (DBP) водят до намаляване на вирусната продукция. Следователно, предпочита се всеки аденовирусен вектор с множествена репликационна недостатъчност да съдържа част от Е2А региона от аденовирусния геном.
По - специално, например, желаната част от Е2А региона която трябва да остане, по - специално тази част от Е2А региона на аденовирусния геном, която е определена от 5’ края на Е2А региона, специфично определяща позицията от Ad5(23816) до Ad5(24032) на Е2А региона на аденовирусния геном на серотип Ad5, е необходима за да запази компетентна векторната репликация в комплементарната клетъчна линия. Тази част от аденовирсния геном трябва да бъде включена в аденовирусния вектор, т.к. тя не е комплементарна в настоящите Е2А клетъчни линии, и при липсата й, необходимите нива на вирусна продукция и фиберна експресия не може да бъде постигната в комплементарните клетъчни линии.
Всеки един от отделените региони може да бъде заменен с промоторно изменчива експресионна касета, за да продуцира чуждероден генен продукт, който е чужд по отношение на аденовируса. Вкарването на чуждероден ген в Е2А региона например, може да бъде подпомогнато от вкарването на уникален рестрикционен сайт, така че чуждият генен продукт да се експресира от Е2А промотора.
Настоящото изобретение не се ограничава до аденовирусни вектори, които са дефицитни по отношение генни функции, само в ранния регион на генома. Също, включени са аденовирусни вектори, които са дефицитни в късния регион на генома, аденовирусни вектори, които са дефицитни в ранния и късния региони на генома, както и вектори, при които в крайна сметка е бил отстранен целият геном, в който случай се предпочита поне или вирусните обратни терминални повтори и някои от промоторите, или вирусните обратни терминални повтори и пакетиращия сигнал да са оставени незасегнати. Всеки, с достатъчни познания в съществуващото ниво на техниката, би оценил, че колкото е по-голям отстраненият от аденовирусният геном регион, толкова по - голяма е частта чуждаероднна ДНК, която може да бъде вкарана в генома. Например, приемайки, че аденовирусниятгеном е 36 кВ, чрез оставяне на вирусните обратни терминални повтори и някои от промоторите незясегнати, капацитета на аденовируса е приблизително 35 кВ. Алтернативно, би могло да се създаде аденовирусен вектор с множествена репликационна недостатъчност, който да съдържа само обратните терминални повтори (ITR) и пакетиращия сигнал. Това може ефективно да позволи експресната на 37 - 38 кВ от чуждеродна ДНК от този вектор. Разбира се . включването на спейсерна последователност в някоя или всички дефицитни аденовирусни региони би намалило капацитета на аденовирусния вектор до размер, съответсвуващ на размера на спейсерната последователност.
По принцип, вирусната векторна конструкция разчита на високо ниво рекомбинация между фрагменти от аденовирусната ДНК в клетката. В клетката са трансфектирани два или три фрагмента от аденовирусната ДНК, съдържащи региони на подобност (или припокриване) между фрагментите и изграждащи цялата дължина на генома. Рекомбинационната „машина“ на клетката гостоприемник изгражда пълноверижен вирусен векторен геном чрез рекомбинация на гореспоменатите фрагменти. Други подходящи процедури за конструиране на вируси, съдържащи алтернативни участъци в различни единични региони са описани и преди (Berkner et al., Nucleic Acids Res., 12. 925 - 941 (1984); Berkner at al., Nucleic Acid Res.. 11. 6003 - 6020 (1984); Brough et al., Virol- 190, 624 - 634 (1992)) и могат да бъдат използувани за конструкцията на вируси с множествена недостатъчност; освен това други подходящи процедури включват например рекомбинация и лигация in vitro.
Първа стъпка в конструирането на вирусния вектор е да се конструира делеция или модификация (такава като добавянето на спейсер в регион с делеция) на определен регион от аденовирусния геном в плазмидна касета. използувайки стандартни молекулярно - биологични техники. След интензивен анализ, тази променена ДНК (съдържаща делеция или модификация) се прехвърля в много по - голям плазмид, който съдържа до половината от аденовирусния геном. Следваща стъпка е да се осъществи трансфекция на плазмидната ДНК (съдържаща делеция или модификация) и голяма част от аденовирусния геном в клетката - реципиент. Заедно тези две части ДНК се включват в аденовирусния геном заедно с подобен регион. В този подобен регион, протича процес на рекомбинация, при което се генерира рекомбинантен вирусен геном, който включва делеция или модификация. В случая с вектори, които са с множествена репликационна недостатъчност, реципиентната клетка осигурява не само рекомбинационни функции, но също и всички липстаащи вирусни функции, които не се съдържат в трансфектния вирусен геном, и по този начин се допълват всички дефицити от рекомбинантния вирусен геном. Векторът с множествена репликационна недостатъчност може по - нататък да бъде модифициран чрез промяна на ITR и/или пакетиращия сигнал например, така че вектора с множествена репликационна недостатъчност да функционира или расте в комплементарната клетъчна линия.
В допълнение, настоящото изобретение осигурява комплементарни клетъчни линии за прорастване или растеж на настоящите изобретени аденовирусни вектори с множествена недостатъчност. Предпочитаните клетъчни линии съгласно настоящото изобретение се характиризират с комплементарност по отношение поне на една генна функция от гениите функции , включващи Е1, Е2 и Е4 региони от аденовирусния геном. Други клетъчни линии са такива, които са комплементарни на аденовирусните вектори, дефицитни по отношение на поне една генна функция от гениите функции включващи късните региони, или такива, които допълват комбинация от ранни и късни генни функции и такива, които допълват всички аденовирусни функции. Всеки запознат със съществуващото ниво на техниката, би оценил, че избраната клетъчна линия специфично трябва да допълва тези функции, които липстват в рекомбинантния вектор с множествена репликационна недостатъчност и се получават, използувайки стандартни молекулярно - биологични техники. Клетъчните линии се охарактеризират по това дали съдържат допълващите гени по неприпокриващ начин, което намалява и практически елиминира възможността векторния геном да рекомбинира с клетъчната ДНК. Съответно, репликационно компетентните аденовируси са елиминирани от векторната наличност, което ги прави следователно подходящи за определени терапевтични цели, особено за целите на генната терапия. Това също елиминира репликацията на аденовируси в некомплементарни клетки.
Комплементарната клетъчна линия трябва да бъде такава, че да притежава способност да експресира продукти на две и повече дефицитни аденовирусни генни функции на подходящо ниво за тези продукти с цел да се генерира наличност от рекомбинантни аденовирусни вектори с висок титър. Например, необходимо е да се експресира Е2А продукт, DBP, на стехиометрично ниво, т.е. относително високо ниво за аденовирусна ДНК репликация, докато Е2В продукт, Ad pol, е необходим само на каталитично ниво, т.е. относително ниско ниво, за аденовирусна ДНК репликация. Не само нивото на продукта трябва да бъде подходящо, временната експресия на продукта трябва да съответствува на тази, наблюдавана при нормална вирусна инфекция на клетки, за да се осигури наличност на рекомбинантния аденовирусен вектор с висок титър. Например, компонентите,необходими за вирусната ДНК репликация, трябва да бъдат експресирани преди тези необходими за получаването на вирусния комплекс. С цел да се избегне токсичност за клетката, която често придружава високи нива на експресия на вирусни продукти, и за да се регулира постоянна експресия на продуктите, се използуват индуцируеми промоторни системи. Например, овча металтионин индуцируема промоторна система може да бъде използувана за експресия на пълния Е4 регион, отворената прочитаща рамка 6 от Е4 регион и Е2А регион. Други примери на подходящи индуцируеми промоторни системи включват, без да се ограничават само до това, бактериален lac оперон, Т7 полимеразна система и комбинация на химерични конструкции от еукариотни и прокариотни транскрибционни фактори, репресори и други компоненти. Когато вирусният продукт, който се експресира е високо токсичен, желателно е използуването на двуразделни индуцируеми системи, при които индуциращата част се носи от вирусен вектор и индуцирания? продукт се носи в хроматина на комплементарните клетъчни линии. Репресиращи / индуциращи експресионни системи, като тетрациклин експресионната система и lac експресионната система също могат да бъдат използувани.
ДНК, която навлиза в малки пропорции в трансфектните клетки.може да стане стабилно поддържана в дори по - малки фракции. Изолирането на клетъчна линия, която експресира един или повече трансфектни гени.се постига чрез вкарването в същата клетка на втори ген (маркерен ген), например осигурява резистентност към антибиотици, лекарства или други съединения. Тази селекция се основава на факта, че в присъствието на антибиотик, лекарство или друго съединение, клетката без прехвърлените гени умира, докато клетката, съдържаща прехвърлените гени , преживява. Преживелите клетки са в последствие изолирани и съхранени като индивидуални клетъчни линии. Към такива клетъчни линии спадат такива, които експресират както маркерния гендака и интересуващия ни ген. Прорастването на клетките зависи от родителската клетъчна линия и метода на селекция. Трансфекцията на клетките също зависи от клетъчния тип. Най общоприетите техники . използувани за трансфекция , са преципитация с калциев фосфат, липозоми, или DEAE декстран медиирано ДНК прехвърляне.
Възможни са много модификации и вариации на представените понастоящем ДНК последователности и плазмиди. Например, дегенерацията на генетичния код позволява заместването на нуклеотиди в полипептид кодиращите региони, както и в транслационния стоп сигнал, без да се променя закодираната полипептид - кодираща последователност. Такива заместващи последователности могат да произлизат от известни аминокиселинни или ДНК последователности на даден ген и могат да бъдат конструирани чрез конвенционални синтетични или сайтово - специфични мутагенни процедури. Могат да бъдат прилагани в значителна степен синтетични ДНК методи, съгласно процедурите на Itakura et al., Science, 198. 1056 (1977) и Crea et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 75. 5765 (1978). Процедурите на сайтово специфичен мутагенез са описани от Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2 ed. 1989). Следователно настоящото изобретение по никакав начин не се ограничава до ДНК последователностите и плазмиди, специфично представени тук. Примерните вектори са за генна терапия на цистофиброза и следователно съдържат и експресират цистофиброзния трансмембранен регулаторен ген (CFTR), но описаните векторите са лесно конвертируеми за третиране на други заболявания, включително, но без да се ограничават само до, други хронични заболявания на белите дробове, като емфизем, астма, дихателен синдром при изтощение и хронични бронхити, както и рак, коронарно сърдечно заболяване, и други подобни, подходящо третирани или предотвратени чрез генна терапия, ваксинация, и други подобни методи. Съответно, всеки ген или ДНК последователност може да бъде вкарана в аденовирусен вектор с множествена недостатъчност. Изборът на ген или ДНК последователност е факт .благодарение на който може да се постигне терапевтичен и/или профилактичен ефект, например в контекста на генна терапия, ваксинация и подобни методи.
Всеки запознат със съществуващото ниво на техниката, би оценил, че подходящи методи за прилагането на аденовирусни вектори с множествена недостатъчност от настоящото изобретение при животни за терапевтични или профилактични цели, т.е. генна терапия, ваксинация и подобни третирания (вж. за пример, Rosenfeld et al., Science, 252. 431 434 (1991), Jaffe et al., Clin, Res., 39 (2), 302A (1991), Rosenfeld et al., Clin, Res., 39(2), 311A (1991), Berkner et al., Biotechniques, 6. 616 - 629 (1988)), са налични и въпреки, че може да бъде използуван повече от един метод за администриране на вектора, даден метод може да осигури по - незабавна и по ефективна реакция отколкото друг, фармацефтично приемливи третиращи форми са също добре известни и са налични в съществуващото ниво на техниката. Изборът на формата на третиране се определя частично от определения метод, който се използува за администриране на препарата. Съответно, съществува голямо разнообразие от подходящи смеси и фармацефтични препарати съгласно настоящото изобретение. По - долу описаните препарати и методи са примерни и по никакав начин не ограничават обхвата на изобретението. В този смисъл са предложени препарати за орална употреба, инжекционни форми и аерозоли.
Препарати,подходящи за орално администриране.могат да се състоят от; (а) течни разтвори, такива «че ефективно количество от съединението е разтворено в разредител, като вода, физиологичен разтвор или портокалов сок; (б) капсули, сашети или таблетки, всяка една съдържаща предварително определено количество от активния инградиент, като твърдо вещество или гранулат; (в) суспензии в подходяща течности (г) подходящи емулсии. Таблетните форми включват един или повече допълнителни компанети като лактоза, манитол, пшеничено нишесте, картофено ниесте, микрокристална целулоза, акация, желатин, колоиден силиконов диоксид, натриева кроскармелоза, талк, магнезиев стеарат, стеаринова киселина, и други добавки, оцветители, разтворители, буферни агенти, овлажняващи агенти, консерванти, есенции и други фармакологично съвместими вещества. Могат да бъдат използувани: таблетки със захарна обвивка, като активният инградиент може да бъде включен в различни субстанции, обикновено захароза, акация или трагаканта; бонбони за смучене, където активният инградиент е включен в инертна база като желатин и глицерин, или захароза и акация; емулсии; гелове и други подобни, които съдържат освен активния инградиент, добавки, известни в съществуващото ниво на техниката.
Векторите от настоящото изобретение, самостоятелно или в комбинация с други подходящи компоненти могат да бъдат приготвени под формата на аерозолни препарати, които да се прилагат чрез инхалиране. Тези аерозолни препарати могат да бъдат поставени в подходящ носител, издържащ на високо налягане, като дихлородифлуорометан, пропан, азот и други подобни. Те също могат да бъдат приготвени като фармацефтични препарати без налягане като пулверизатори и емулсиозатори.
Препаратите , подходящи за парантерална употреба включват водни или неводни, изотонични стерилни инжекционни разтвори, които могат да съдържат антиоксиданти, буфери, бактеростатици и вещества, които поддържат препарата изотоничен при постъпването му в кръвта на реципиента, и водни или неводни стерилни суспензии, които могат да включват суспендиращи агенти, разтворими вещества, уплътняващи агенти, стабилизатори и консерванти. Препаратите могат да бъдат произведени в запечатани съдове за еднократна или многократна употреба, като ампули, и фиолки, и могат да бъдат съхранявани в лиофилно състояние, при което е необходимо само добавянето на стерилна течност, например вода за инжекции, непосредствено преди употреба. Инжекционни препарати и суспензии могат да бъдат приготвени от стерилен прахообразен продукт, гранули и таблетки, описани по - горе, които да се разтварят непосредствено преди употреба.
В допълнение, векторите от настощото изобретение могат да бъдат приготвени като свещички чрез смесване с ра^ични бази като емулгаторни бази или водоразтворими бази.
Препарати, подходящи за вагинално прилагане, могат да бъдат приготвени под формата на маточни халки, тампони, кремове, гелове, пасти, пяна или спрейове, съдържащи като добавка към активният инградиент, различни носители, които са известни в съществуващото ниво на техниката като подходящи за такива препарати.
'У η
Дозата, прилагана на животни, и по-специално на хора, в кагекста на настоящото изобретение, може да варира в зависимост от гена или друга интересуваща ни последователност , използувания тип препарат, метод на администриране и лекуваната определената част и организъм. Дозата трябва да е достатъчна, за да предизвика желания / отговор, т.е. терапевтичен или профилактичен отговор в рамките на желаното време за третиране.
Аденовирусните вектори с множествена недостатъчност и комплементарните клетъчни линии от настоящото избретение могат да бъдат използувани също in vitro. Например, те могат да бъдат използувани за изучаване аденовирусните генни функции и асоциации или експресията на чуждородна ДНК в подходяща клетка - мишена. Всеки може да определи подходяща клетка мишена чрез селекция на някоя, която може да бъде трансфектирана от изобретения аденовирусен вектор и/или инфектирана с аденовирусни частици, в резултат на което се получава експресия на инсерция на аденовирусна ДНК. По специално, под подходяща клетка - мишена се разбира такава, която притежава рецептори за прикрепване и проникване на аденовируса в клетката. Такива клетки включват, без да се ограничават само до тях, клетки, които са изолирани, от който и да е бозайник. Веднаж избрана, подходящата клетка - мишена, се поставя в контакт със съдържащия чуждеродна ДНК рекомбинантен аденовирусен вектор с множествена недостатъчност или аденовирусни частици, съгласно настоящото изобретение, с последваща трансфекция или инфекция. Експресията, токсичносттта и други параметри, свързани с инсерцията на активност от чуждеродна ДНК в клетката - мишена, се определят, използувайки конвенционални методи, известни в съществуващото ниво на техниката. По този начин, изследователите могат да изучават и да хвърлят светлина върху различни феномени? свързани с аденовирусните инфекции, както и ефикасността и влиянието на експресията на различни последователности от чуждеродна ДНК, вкарана чрез изобретения вектор в различни типове клетки, изолирани от различни организми и проучвани в тъканни култури.
Нещо повече, клетки,получени и отделени от пациент със заболяване, което е подходящо третирано чрез генна терапия, в контекста на настоящото изобретение, могат да бъдат успешно манипулирани in vitro. Например, клетки,култивирани in viro в такъв организъм,се поставят в контакт с аденовирусен вектор, съгласно настоящото избретение при подходящи условия, така че да бъде повлияна трансфекцията, като лесно може да бъде определен векторът, включващ подходяща чуждеродна ДНК от всеки изследовател с достатъчно опит в съществуващото ниво на техниката. Такъв контакт води до трансфекция на вектор в клетката, като трансфектираните клетки са селекционрани с цел използуването на подходящ маркер и подходящо избрани условия на култивиране. Използувайки стандартни методи за изследване виталността на клетките, измерване на токсичността, и определяне наличието на генни продукти от чуждеродни гени или гени от интересуващия ни вектор и по този начин, оценявайки експресията, клетките на индивида се тестуват за съвместимост със, експресия в, и токсичност на чуждероден ген^съдържащ вектор, като се осигурява информация за това дали е подходящо и ефикасно третирането на индивида с вектор/чуждеродна ДНК система. Такива отделени и трансфектирани клетки, в допълнение на използуването им за тестуване на потенциална ефикасност/токсичност на режима на дадена генна терапия, могат също да бъдат върнати в in vivo позиция в тялото на организма. Такива клетки, могат да бъдат върнати в индивида в непроменен вид, освен проведената in vitro трансфекция, или поставени в матрикс, който да ги запази отделени от други тъкани и клетки в тялото на индивида. Такъв носител/матрикс може да представлява всякакъв подходящ биосъвместим материал, включващ колаген, целулоза и други подобни вещества. Ербира се ? алтернативно или като допълнение, след като веднаж е наблюдаван положителен отговор в in vitro теста, трансфекцията може да бъде приложена in situ чрез различни методи на администриране, подробно описани тук по - горе.
Следващите примери описват настоящото изобретение, но те разбира се в нкакъв случай не ограничават областта на изобретението. Ензимите.споменати в примерите .са осигурени, освен ако не е изрично упоменато от Научноизследователските лаборатории в Betesda (BRL), Gaithersburg, MD 20877, New Englans Biolabs Inc. (NEB), Beverly, Ma 01915 или Boehringen Mannheim Biochemicals (BMB), 7941 Castleway Drive, Indianapolis, In 4650, и са използувани в съответствие с указанията на производителя. Много ог техниките;използувани в настоящото изобретение?са известни в съществуващото ниво на техниката. Молекулярно - бологичните техники са детайлно описани в подходящи лабораторни ръководства като, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborator Manual, Cold Spring Harbor, NY (2 ed. 1989) и Current Protocols in Molecular Biology (Ansubel et al., eds. (1987)). Всеки изсл^звател, познаващ съществуващото ниво на техниката.би забелязал, че много от техниките,описани тук по-долу, могат да бъдат заменени с алтернативни такива. Въреки че примерите и фигурите се отнасят до AdGv.1O, AdGV,11, AdGV.11S, AdGV.12 и AdGv.13, които съдържат например терапевтичен ген като цистофиброзен трансмембранен регулаторен ген (CFTR), те включват наример AdGVCFTR.1O, AdGVCFTR.11, AdGVCFTR.11S, AdGVCFTR.12 и AdGVCFTR.13, тези вектори не са огранчени до експрсия само на CFTR гена и могат да бъдат използувани за експресия на други гени и ДНК последователности. Следователно, настоящото изобретение обхваща такива вектори, включващи всякаква подходяща ДНК последователност, която може да бъде чуждероден ген, негов фрагмент или всяка друга ДНК последователност. Такава подходяща ДНК последователност може да бъде използувана в генната тераия за третиране на болести, които подходящо се лекуват чрез генна терапия. Алтернативно, подходяща ДНК последователност може също да има профилактично приложение, тогава, когато ДНК поседователността може да бъде експресирана в бозайници в резултат, на което да се получи например полипептид, предизвикващ имунен отговор към полипептид, както е при ваксинациите. Друго алтернативно приложение на подходяща ДНК последователност, която може да бъде експресирана в бозайници, е да се осигури някакав друг подходящ терапевтичен и/или профилактичен агент, като безсмислена молекула, по - специално безсмислена молекула, избрана от група, състояща се от тРНК и синтетичен олигонуклеотид.
Пример 1
Този пример описва получаването на едно производно, включващо AdGV.1O, наречено AdGVCFTR.1O, което е непълно в Е1 и ЕЗ районите си.
AdGVCFTR.1O експресира гена CFTR за ранния промотор на цитомегаловирус (CMV). Бяха конструирани две производни на този вектор, означени като AdGVCFTR.10L и AdGVCFTR.10R, в зависимост от посоката, в която се поставя CFTR експресионната касета в Е1 района, по отношение на векторния геном, както е показано на фигура 1, която представлява набор от схематични диаграми на AdGVCFTR.10L и AdGVCFTR.10R.
CFTR експресионната касета беше конструирана както следва. pRK5 (Genentech Inc., South San Francisco, СА) беше смлян c Kpn I (New England Biolabs (NEB), Beverly, МА), запълнен до тъпи крайща с помощта на нуклеаза от златен фасул (Phaseolus aureus. Roxb.) (NEB) и в Kpn I мястото за срязване лигиран с Xho I линкер (NEB). Полученият вектор беше наречен pRK5-Xho I. pRK5-Xho I беше смлян с Sma I (NEB) и Hin dill (NEB) и запълнен до тъпи краища с помощта на нуклеаза от златен фасул. Един плазмид, съдържащ гена CFTR, pBQ4.7 (Dr. LapChee Tsui, Hospital for Sick Children, Toronto, Canada),беше смлян c Ava I (NEB) и Sac I (NEB) и запълнен до тъпи краища с помощта на нуклеаза от златен фасул. Тези два фрагмента бяха изолирани и лигирани заедно, за да се получи pRK5-CFTR1, експресионната касета CFTR.
pRK5-CFTR1 беше смлян с Spa I (NEB) и Xho I и запълнен до тъпи крайща с помощта на Кленов (NEB). pAD60.454 (Dr. L.E. Babiss, The Rockefeller University, New York, NY), който съдържа Ad5 последователности от 1-454/3325-5788, беше смлян с Bgl II (NEB) и запълнен до тъпи краища с помощта на Кленов. Тези два фрагмента бяха пречистени от векторните последователности чрез техниката с нискотопяща се агароза (Maniatis et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (2nd ed. 1989)) и лигирани заедно, за да образуват ляво-раменните плазмиди pGVCFTR.IOL и pGVCFTR.IOR.
Ляво-раменен плазмид от pGVCFTR.IOL или pGVCFTR.IOR беше смлян с Nhe I (NEB). Дясното рамо на вируса беше получено чрез смилане на Ad5d7324 (Dr. Thomas Е. Shenk, Princeton University, Princeton, NJ) c Cla I (NEB). Двата фрагмента, малък 918 bp фрагмент и голям, приблизително 32,800 Ьр фрагмент, бяха разделени чрез центрофугиране в захарозен градиент (Maniatis et al., supra). Големият фрагмент беше смесен с фрагменти на ляво-раменния плазмид и беше трансфектиран в 293 клетки, следвайки стандартен протокол с калциев фосфат (Graham et al., Virology. 52, 456 (1973)). Получените рекомбинантни вируси бяха пречистени в 293 клетки с помощта на плаки и беше получен вирусен резерв с помощта на стандартни вирусологични техники (напр. Berkner et al., (1983) и (1984), supra).
Пример 2
Този пример описва получаването на едно производно на AdGV.11, т.е. AdGVCFTR.11, което е непълно в Е1, ЕЗ и Е4 районите си.
AdGV.11 се характеризира с пълно елиминиране на Е4 района. Тази голяма делеция позволява инсертиране до около 10 kb от екзогенна ДНК. Което е по-важно, друг район от генома е достъпен за интродуциране на експресионни касети от чуждеродна ДНК с помощта на AdGVCFTR.11 вектори. Тази делеция позволява инкорпорирането на по-големи експресионни касети за други продукти. Например, разтворими рецептори, т.е. TNF или IL-6 без трансмембранен домен, така че да не са прикрепени към мембрана; безмислени молекули, например тези, насочени срещу продуктите, регулиращи клетъчния цикъл, такива като cdc2, cdk кинази, циклини, т.е. циклин Е или циклин D и транскрипционни фактори, т.е. E2F или с-тус, за елиминиране на възпалание и имунни отговори.
AdGVCFTR.11 беше конструиран с помощта на единствена рекомбинация in vivo между 1-27082, т.е. лявото рамо на AdGVCFTR,10 и плазмид (pGV11A, pGV11B, pGV11C и pGV11D, описани в детайли по-долу), съдържащ 21562-35935, т. е. дясното рамо на Ad5, линеаризиран с Bam HI (NEB) и Sal I (NEB) и в който са направени различни промени в ЕЗ и Е4, както са описани по-долу.
Лявото рамо от AdGVCFTR.1O беше изолирано с помощта на 10-40% вдлъбнат захарозен градиент, където 1/4 от тоталния разтвор беше 40%, след като интактен AdGVCFTR.1O беше смлян с Spe I (NEB) и Sri I (Stratagene, La Jolla, Са), за да се получи 1-27082 bp фрагмент.
Дясното рамо беше получено чрез Bam Hl-Sal I смилане на модифицирания вектор pGEM (pGBS). pGBS беше получен както следва. pGeml (Promega, Madison, WI) беше смлян с Eco RI, запълнен до тъпи крайща с Кленов и във така получения вектор беше лигиран Sal I линкер. Получената ДНК беше смляна с Sal I и религирана, като по този начин Eco RI мястото за срязване се замества с Sal I и се отстранява последователността между двете Sal I места за срязване, като в крайна сметка се получи pGEMH/P/S, който беше смлян с Hin dill и запълнен до тъпи крайща с Кленов и във вектора беше лигиран Bam HI линкер, за да се получи pGEMS/B. pGEMS/B беше смлян с Ват HI и Sal I и лигиран с 14 kb Ват Hl-Sal I фрагмент (21562-35935 от Ad5) от плазмид pBR, наречен р50-100 (Dr. Paul Freimuth, Columbia University, NY), за да се получи pGBS.
pGBSAE3 е променен, за да произвежда дясно-раменен плазмид, в който целият Е4 район е отстранен. Полученият плазмид, в който целите ЕЗ и Е4 райони са отстранени, се нарича pGV11(0). Това е осъществено чрез интродуциране на Рас място за срязване в Afl III мястото, позиция 32811 и на Bsq I в 35640. Делецията на Рас фрагмента между тези две места за срязване ефективно елиминира всички Е4 последователности, включително Е4 ТАТА елемента от Е4 промотора и полиА мястото в Е4.
Бяха конструирани три различни версии на дясно-раменен плазмид с цел в аденовирусния вектор да се интродуцират два Ad ЕЗ генни продукти, притежаващи антиимунни и противовъзпалителни качества. Голямата ЕЗ делеция в pGBSAE3ORF6, означена като pGV11(0) (Пример 7), беше заменена в основата си с три различни версии на експресионна касета, съдържаща промотор на вируса на саркома на Раус дълги крайни повтори (RSV-LTR), направляващ експресията на бицистронна иРНК, притежаваща в 5’ края си Ad2 ЕЗ 19 kDa антиимунен генен продукт и в 3’ края си Ad5 ЕЗ 14.7 kDa противовъзпалителен генен продукт. Един допълнителен вирус беше конструиран чрез изрязване на 19 kDa сДНК-ов фрагмент чрез Bst Bl (NEB) фрагментна делеция. Този вирус, означен като
AdGVCFTE.11(D), съдържа RSV-LTR промотор, направляващ експресията на моноцистронна иРНК, притежаваща само ЕЗ 14.7 kDa противовъзпалителен генен продукт.
Spe I (27082) - Nde I (31089) фрагментът от pGVSAE3 (Пример 4) беше субклониран в pUC 19 чрез първоначално клониране на Eco RI (27331) - Nde I (31089) фрагмент в идентичните места за срязване в полилинкер PUC 19. Фрагментът Hin dill (26328) - Eco RI (27331), получен от pGBS беше след това клониран в Eco RI мястото за срязване на този клон, за да се получи ρΗΝΔΕ3. С помощта на подходящи праймери беше получен PCR фрагмент с фланкиращи Xba I места за срязване, който съдържа RSV-LTR промотор, Ad2 ЕЗ 19 kDa генен продукт и Ad5 ЕЗ 14.7 kDa генен продукт. Амплифицираният фрагмент беше смлян с Xba I и субклониран в pUC 19, за да се получи рХА. След анализ на Xba I фрагмента, той беше лигиран в ρΗΝΔΕ3, за да се получи pHNRA.
С помощта на подходящи праймери бяха получени два PCR фрагмента с фланкиращи Bst Bl места за срязване, които кодират вътрешните рибозомални места за навлизане (IRES), известни с това че ускоряват транслацията на иРНКи, които ги съдържат (Jobling et al., Nature 325. 622-625 (1987); Jang et al., Genes and Development. 4, 1560-1572 (1990)). Единият фрагмент (версия Б) съдържа 34 bp IRES от нетранслируемата лидерна последователност от иРНК за белтъка от обвивката на мозаечен вирус по люцерната (AMV RNA 4 leader) (Jobling et al., supra). Другият фрагмент (версия В) съдържа 570 bp IRES от 5’ нетранслируемия район от иРНК за енцефаломиокардитен вирус (EMCV) (Jang et al., supra). Всеки един Bst Bl фрагмент от версия Б или В беше клониран на мястото на Bst Bl фрагмента в рХА. Получените плазмиди, наречени рХВ и рХС съответно, бяха прехвърлени в ρΗΝΔΕ3, за да се получат pHNRB и pHNRC респективно, след анализ на последователността на Xba I фрагментите.
Един Spe I (27082) - Nde I (31089) фрагмент от pGBSAE3ORF6 беше заместен с Spe I - Nde I фрагменти от pHNRA, pHNRB, pHNRC и pHNRD, за да се получат pGV11A, pGV11B, pGV11C и pGV11D респективно.
Плазмидна ДНК от pGVx беше лианиризирана с Bam HI и Sal I и смесена с пречистен ДНК фрагмент от лявото рамо в различни концентрации, така че да даде около 20 цд тотална ДНК, използвайки ДНК от сперма на пъстърва или ДНК от телешки тимус (Life Technologies, Gaithersburg, МА), така че да се доведе количеството на ДНК до необходимите 20 цд. Смесените фрагменти след това бяха трансфектирани в 293 клетки с помощта на стандартна техника с калциев фосфат (Graham et al., supra). Може да се използва както 293/Е4 клетъчна линия, така и 293/ORF6 клетъчна линия.
Пет дни след трансфекцията клетъчният монослой беше събран чрез трикратно замразяване-разтопяване. Полученият хибриден вирус беше титруван върху 293 клетки и изолираните плаки бяха събрани. Процесът на изолиране на плаките беше повторен още два пъти, за да се осигури наличие на единичен рекомбинантен вирус в началния плаков резерв. След това резервът от изолирани плаки беше амплифициран до голям вирусен резерв с помощта на стандартни вирусологични техники, както е описано в Burlseson et al.. Virology: a Laboratory manual. Academic Press. Inc. (1992).
Тъй като Е4 съдържа важни генни продукти, необходими за вирусния растеж, полученият мутантен вирус с Е4 делеция не може да расте в отсъствие на екзогенно експресиран Е4. Следователно, всички манипулации за конструиране на вируси се извършват в нова 293/Е4 клетъчна линия или 293/ORF6 клетъчна линия (както е описано в Пример 6). Полученият вирус е AdGVCFTR.11, който е представен схематично на фигура 2, с AdGVCFTR.10L за сравнение.
Пример 3
Този пример описва получаването на едно производно на AdGV.13, т.е. AdGVCFTR.13, което е непълно в Е1, Е2А, ЕЗ и Е4 районите си.
AdGV.13 се характеризира не само с пълно елиминиране на Е1 и Е4 (както в AdGV.11), но и с пълно елиминиране на Е2А. Целият кодиращ район на Е2А е делетиран чрез сливане на ДНК от два Е2А мутантни вируса, а именно ΗδΐηδΟΟ и H5in804, съдържащи инсерции от Cla I рестрикционни места за срязване в двата края на отворената рамка за четене (Vos et a., Virology, 172. 634-642 (1982); Brough et al., Virology. 190. 624-634 (1992)). Cla l мястото за срязване в ΗδΐηδΟΟ е между кодони 2 и 3 на гена, a Cla I мястото за срязване в Η5ϊηδ04 е в стоп кодона на гена Е2А. Полученият вирус съдържа една отворена рамка за четене, състояща се от 23 аминокиселини, която не е подобна на рамката за четене на Е2А. Което е по-важно, тази касета предлага друг район от вирусния геном, в който може да бъде интродуциран единствен ген. Това може да стане чрез инсерция на гена, който ни интересува в подходяща рамка за четене на вече съществуваща мини-ОРЧ или чрез вкарване на друга експресионна касета, съдържаща свои собствени промоторни последователности, сигнали за полиаденилиране и стоппоследователности в допълнение към интересуващия ни ген.
Аденовирусна ДНК беше изолирана от H5in800 и H5in804. След смилане с рестрикционен ензим Hin dill (NEB), Hin dill A фрагментите както от H5in800, така и от H5in804 бяха клонирани в pKS+ (Stratagene). Получените плазмиди са наречени pKS+H5in800Hin dlllA и pKS+H5804Hin dlllA, съответно. Cla I (NEB) фрагментът от pKS+H58Q0Hind III А беше след това изолиран и клониран на мястото на идентичен Cla I фрагмент от pKS+H5804Hind IIIA. Този химеричен плазмид, pHin dlllA_E2A ефективно отстранява всички Е2А отворени рамки за четене, както е описано по-горе. На този етап Е2А делецията се премества в Bam HI (NEB) и Spe I (NEB) места за срязване, за да замести последователностите от дивия тип в pGV12(0), с цел конструиране на pGV13(0).
Вирусът AdGVCFTR.13 (виж фигура 3) е конструиран, както е описано по-рано с използване на ДНК от лявото рамо на AdGVCFTR.1O и ДНК от дясното рамо на pGV13(0). Обаче, рецепиентната клетъчна линия за тази вирусна конструкция е тройно комплементарна клетъчна линия 293/Е4/Е2А. фигура 3 е схематична диаграма на вирусния вектор AdGVCFTR.13. Диаграмата е представена заедно с тази за AdGVCFTR.10L за сравнение.
Пример 4
Този пример описва получаването на pGBSAE3. Този плазмид беше получен с цел да се отстрани по-голямата част от ЕЗ района в pGBS, включително и ЕЗ промотора и същинските ЕЗ гени, за да се освободи пространство за други конструкти и да се ускори интродуцирането на ЕЗ експресионни касети. Този плазмид съдържа делеция от 28311 до 30469.
С помощта на праймерите Ad5s(27324) и А5а(28330)Х и pGVS като матрица беше получен PCR фрагмент. Този фрагмент беше смлян с Eco RI (27331) и Xba I (28330) и пречистен в гел. След това беше интродуциран в pGVS в Eco RI (27331) и Xba I (30470) местата за срязване.
Пример 5
Този пример описва получаването на на pGBSAE3AE4.
В pGBSAE3 беше интродуцирана една голяма делеция, за да се ускори преместването на допълнителни екзогенни последователности в аденовирусния геном. Беше отстранена 32830 - 35566 Е4 кодиращата последователност.
На мястото на Mun I мястото за срязване беше генерирано Рас I място за срязване, на позиция 32830, чрез обработване на смляна с Mun I ДНК от pGBS с Кленов за запълване на фрагмента до тъпи крайща и чрез лигиране към него на Рас I линкер. Модифицираната ДНК беше след това смляна с Nde I и полученият 1736 Ьр фрагмент (Nde I 31089 Рас I 32830) беше пречистен в гел. Беше приготвен PCR фрагмент с помощта на А5 (35564)Р (IDT, Coralville, ΙΑ) и Т7 (IDT, Coralville, ΙΑ) праймери и pGBS като матрица. Така полученият фрамент беше смлян с Рас I и Sal I, за да се получи Рас I 35566 Sal I 35935. Sma I място за срязване, локализирано в областта на полилинкера от pUC 19 беше превърнато в Рас I място за срязване чрез лигирането му в Рас I линкер. Рас I 35566 - Sal I 35935 фрагмент беше преместен в модифицирания вектор pUC 19 в местата за срязване Рас I и Sai I, съответно.
Модифицираният Nde I 31089 - Pac I 32830 фрагмент беше вкаран в плазмида pUC 19, в който вече беше инсертиран фрагмент Pac I 35566 - Sal I 35935, в местата за срязване Nde I и Pac I, съответно, фрагментът Nde I 31089 - Sal I 35935 от плазмид pUC 19 беше пречистен чрез гел и клониран на мястото на съответните Nde I и Sal I места за срязване в pGBSAE3, за да се получи pGBSAE3AE4.
Пример 6
Този пример описва получаването на клетъчна линия 293/Е4.
Векторът pSMT/E4 беше получен както следва. Един 2952 bp Mun I (място за срязване 32825 от Ad2) - Sph I (полилинкер) фрагмент беше изолиран от рЕ4 (89-99), представляващ pUC 19 плазмид, в който е субклониран район 32264 - 35577 от Ad2, запълнен до тъпи крайща с Кленов и третиран с фосфатаза (NEB). След това 2752 bp Mun I - Sph I фрагмент беше лигиран в рМТ010/А+ (McNeall et al., Gene, 76. 81-89 (1989)), който беше линеаризиран с Bam HI, запълнен до тъпи крайща с Кленов и третиран с фосфатаза, за да се получи плазмид, съдържащ експресионна касета.
Клетъчната линия 293 (АТСС CRL 1573; American Type Culture Collection, Rockville, MD) беше култивирана в среда на Eagle, модифицирана от Dulbecco, съдържаща 10% серум от говежди зародиш (Life Technologies, Gaithersburg, МА). След това 293 клетки бяха трансфектирани с pSMT/E4, линеаризиран с Eco RI по метода с калциев фосфат (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Около 24-48 ч. след трансфекцията беше добавяна среда (описана по-горе), съдържаща 100 μΜ метотрексат и аметоптерин (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). Наличието на метотрексат в средата е селективен фактор за експресията на гена за дихидрофолат редуктаза (DHFR), който е селективният маркер в плазмида pSMT/E4.
Нормалният клетъчен ген за DHFR се инхибира от определена концентрация на метотрексат (специфична за различните типове клетки), причиняваща клетъчна смърт. Експресията на допълнителен ген за DHFR в трансфектираните клетки, съдържащи pSMT/E4, осигурява устойчивост на метотрексат. Следователно, трансфектираните клетки, съдържащи новите гени, са единствените растящи в тези условия (за обзорна справка, виж Sambrook et al., supra)
Когато се получиха малки колонии от клетки, образувани от първоначална единична клетка, притежаваща селективния маркер, те бяха колонно изолирани и размножени (за обзорна справка, виж Sambrook et al., supra). Клоновете бяха намножени, за да образуват клетъчни линии и бяха скринирани за експресия на продукта - в този случай, Е4 - и скринирани за функционалност при комплементиране на дефектни вируси - в този случай, ЕЗ и Е4 дефектните вируси.
Резултатът от този процес е преди всичко продуциране на 293/Е4 клетъчни линии, способни да комплементират аденовирусни вектори, дефектни по ЕЗ и Е4 функциите си, такива като AdGVCFTR.11
Пример 7
Този пример описва получаването на 293/Е4/Е2А клетъчна линия. Клетъчната линия 293/Е4/Е2А позволява на Е1, Е4 и Е2А дефектните вируси да растат.
Е2А експресионната касета (виж фигура 4) за интродуциране в 293/Е4 клетки се получава както следва. Първата стъпка е да се променят базите, заобикалящи ATG от Е2А, за да се направи перфектна консенсусна последователност на Kozak (Kozak, J. Molec. Biol.. 196, 947-950 (1987)), за да се оптимизира експресията на Е2А. Бяха конструирани два праймера за промяна на 5’ района на гена Е2А. Ad5s (23884), 18 bp олигонуклеотид (5OCCGCCTCATCCGCTTTT3’) (Описание на последователност N 3), е конструиран така, че да започва от вътрешния район, фланкиращ Sma I мястото за срязване в Е2А гена. DBP (ATG) R1, един олигонуклеотид, състоящ се от 32 Ьр (5’CCGGAATTCCAACCATGGCGAGTCGGGAAGAGG 3’) (Описание на последователност N 4) е конструиран така, че да интродуцира транслационната консенсусна последователност около ATG от Е2А гена, модифицирайки я в перфектно удължена консенсусна последователност тип Козак и да интродуцира Есо RI място за срязване непосредствено до 5’ края, за да се ускори клонирането. Полученият PCR продукт с помощта на горните праймери беше смлян с Есо RI и Sma I (NEB) и клониран в идентични места за срязване в полилинкер от pBluescript IIKS+ (Stratagene, La Jolla, СА). Полученият плазмид бе наречен PKS/ESDBP.
Sma l-Xba I фрагмент бе изолиран от pHRKauffman (Morin et al., Mol, Cell. Biol., 9. 4372-4380 (1989)) и клониран в съответните
Sma I и Xba I места за срязване от pKS/ESDBP, за да попълни Е2А рамката за четене. Полученият плазмид е наречен pKSDBP. С цел да се елиминират всички хомоложни последователности от вектора, съдържащи се в експресионната касета, фрагмент от Κρη I до Dra I от pKSDBR беше преместен в съответните Κρη I и Pme I места за срязване в PNEB193 (NEB), в който Eco RI местата за срязване в полилинкера са разрушени (GenVec, Rockville, MD). Полученият клон рЕ2А, съдържаше цялата рамка за четене от Е2А без други допълнителни последователности, хомоложни на Е2А делетирания вектор от Пример 3.
След това една 5’ свързваща касета беше преместена в рЕ2А, за да осигури правилен ядрен процесинг на иРНК и да ускори по-нататъшната експресия на Е2А. За да се извърши това pRK5, описан в Пример 1, беше смлян с Sac II (NEB), запълнен до тъпи крайща с нуклеаза от златен фасул (NEB) и смлян с Eco RI (NEB). Полученият желан фрагмент от около 240 Ьр, съдържащ сигналите за сплайсинг, беше клониран в Cla I (запълнен до тъпи крайща с Кленов) до Eco RI местата за срязване, за да се получи р5’Е2А. фрагментът с тъпи крайща (Кленов) от Sal I до Hind III от р5’Е2А, съдържащ Е2А последователностите, беше преместен в Xba I мястото за срязване с тъпи крайща от pSMT/puro и pSMT/neo. Полученият Е2А беше наречен pKSE2A.
Фрагментът Xba I от pKSE2A, който съдържа целия Е2А ген, беше преместен в Xba I място за срязване от pSMT/puro и pSMT/neo. Получените Е2А експресионни плазмиди pSMT/E2A/puro и pSMT/E2A/neo бяха трансфектирани в 293/Е4 и 203/ORF-6 клетки, съответно. Клетките, трансфектирани с pSMT/E2A/puro бяха селекционирани за растеж в стандартна среда плюс Генетицин (G418; Life Technologies, Gaithersburg, MD). Нарастването на клоновете от изолирани колонии е както е описано в Пример 6. Получените клетъчни линии бяха скринирани за способността им да комплементират Е1, Е4 и Е2А дефектни вирусни вектори.
Тези клетъчни линии са подходящи за комплементиране на вектори, дефицитни по Е1, Е4 и Е2А районите от вируса, като тези, описани в AdGVCFTR.13 сериите от вирусни вектори.
Пример 8
Този пример описва получаването на комплементиращи клетъчни линии, с помощта на клетъчна линия А549 (АТСС) като родителска линия.
Ad2 вирусна ДНК беше приготвена чрез техника, описана по-рано. Геномната ДНК беше смляна с Ssp I и Xho I и фрагментът от 5438 Ьр беше пречистен и клониран в Eco RV/Xho I места за срязване от pKS+ (Stratagene), за да се получи pKS341-5778. След диагностично определяне на клона, фрагментът от Xho I (запълнен до тъп край с Кленов) до Eco RI беше преместен в Nru I (тъп край) до Eco RI местата за срязване в pRC/CMVneo, за да се получи рЕ1пео. Трансформацията на А549 клетките с този клон доведе до получаване на комплементираща клетъчна линия (подобна на 293), в която могат да се интродуцират допълнителни експресионни касети, по начин, подобен на този, описан за клетките 293, за да се получат мултикомплементиращи клетъчни линии с отличен потенциал за образуване на плаки.
Пример 9
Този пример представя протокол за получаване на 293/Е2А клетъчни линии и последващото им използване за конструиране на аденовирусен вектор, дефектен по Е1 и Е2А районите.
Беше получен вектор на Е2А експресионна касета, както е описано в Пример 7 и посочено на фигура 4. Векторът на Е2А експресионната касета включваше генът * който носи устойчивост към неомицин като маркер за трансфектираните клетки.
Освен това, както е описано в Пример 7, 293 клетките бяха трансфектирани с pSMT/E2A/neo и трансфектираните клетки бяха селекционирани за растеж в стандартни среди плюс G418. Нарастването на клона от подбрани клетки беше ефектирано, както е описано в Пример 6. Получените клетъчни линии бяха скринирани за способността им да експресират ДНК-свързващ белтък (DBP, продукт на Е2А гена) при индукция и за способността им да комплементират Е1 и Е2А дефектни вирусни вектори.
За изследване на способността на неомицин положителните (пео+; т.е. устойчиви на неомицин) клонови изолати от 293/Е2А клетъчни линии да експресират DBP, клетките бяха култивирани в присъствие на G418 за поддържане на селекцията. Получени монослоеве от независими клонални изолати бяха индуцирани със 100μΜ ZnCI2 за 24 часа и експресията на DBP гена беше детектирана чрез имуноблотинг, с помощта на стандартен метод. От 62 изпитани линии, 42% от пео+ клетъчни линии бяха положителни за експресия на DBP (DBP+) и всички те показаха индуцируема DBP експресия.
Следната таблица представя данни от скрининга на DBP експресията:
Таблица 1
Клетъчна DBP Клетъчна DBP
линия експресия линия експресия
3 - 202
6 - 203
9 - 207
10 + 208
12 + 210
13 + 211
16 - 212 +
17 + 213
19 + 215
21 + 216 +
32 + 219
35 + 301 +
36 - 302
39 + 305
41 - 307
42 - 309
43 - 311
52 - 313
54 + 314
55 - 315
57 + 316
58 + 317
60 - 321 +
61 + 323
62 - 324
104 + 325 +
107 - 326 -
108 + 327 +
111 - 328 +
112 + 329 +
201 + 330 +
Клоналните клетъчни линии 293/Е2А след това бяха скринирани за нивото на индуцирана DBP експресия чрез имуноблотинг, с помощта на метода на Brough et al., supra, резултатите от който са представени в авторадиограмите, означени като фигури 5 и 6. Тези от клетъчните линии, които акумулират нива от DBP, подобни на нивата в клетките gmDBP2, конструирани на базата на HeLa, бяха анализирани по-нататък. Както се вижда от фигура 5, въз основа на лизатите от индуцирани клетки, нивото на индуцираната DBP експресия варираше в широки граници в клоналните изолати. Например, клетъчни линии 104, 112 и 216 продуцираха значително количество DBP при индукция, описана по-горе, докато клетъчни линии 19 и 61 продуцираха не повече от тази на gmDBP2 клетките.
Клоналните клетъчни линии 293/Е2А бяха също така анализирани за способността им да натрупват DBP през първите 24 часа на индукцията, отново с помощта на метода на Brough et al., supra.. Както е показано на фигура 6, въз основа на лизати от клетки, събрани след 0, 2, 16 и 24 часа от индукцията, бяха отбелязани няколко линии, които прогресивно акумулират DBP през инкубационния период, в паралел с вирусния растеж.
За изследване на комплементация чрез получените 293/Е2А клетъчни линии, вирус с Е2А делеция беше тестван за растеж на тези клетъчни линии с помощта на конвенционални техники. Както е добре известно в съответното ниво на техника, вирусният растеж може да бъде измерен полуколичествено чрез просто наблюдение на образуването на плаки в монослой ог гостоприемникови клетки, както беше извършено тук. Същите линии бяха изследвани за относителната им експресия на Е2А гена, т.е. беше измерена относителната експресия на
DBP чрез имуноблот в съответствие с Brough et al., Virology, 190. 624-634 (1992). Относителното ниво на експресия или растеж по отношение на по-горе споменатите параметри (най-ниско +/към най-високо + + + + +) на всяка от изследваните клетъчни линии е представено по-долу в Таблица 2:
Таблица 2
Способност за
Относително ниво подръжка на вирус с
Клетъчна линия на DBP експресия Е2А делеция при
образуване на плака
54 ++++++ + + + + +
61 + + +
104 + + + + + -
112 + + + + ++++++
201 + + + + + +
208 - -
212 + + + +
216 + + + + +/-
325 + -
327 + + + -
328 + + + -
330 4-4- + + +
Както е отразено в Таблица 2, резултатът от това изследване показа, че две 293/Е2А клетъчни линии (а именно 54 и 112) подържат образуването на плаки от вирус с Е2А делеция и, следователно - растеж.
Беше също така показано, че подбраните клетъчни линии комплементират вектори, които са дефицитни по Е1 и Е2 районите от вируса, с помощта на методи на клетъчните култури, рутинни за това ниво на техниката. Такъв двойно дефицитен вектор беше получен с помощта на методи, включени в Примери 1 и 2. фигура 7 представя структурата на AdGVCFTR.12B, аденовирусен вектор, дефицитен по Е1 и Е2 районите. Наличието на AdGVCFTR.12B вектор в три различни лизати от трансфектирани клетки след пасажиране на клетките, беше отбелязано чрез детекция на последователности от ДНК, асоциирани с вектора чрез стандартно PCR изследване. Трите различни лизата бяха изследвани по отделно за наличие на CFTR последователности (колони, означени „А“ на фигура 8), отсъствие на Е2А последователности, т.е. доказателство за делеция (колони, означени „Б“), и наличие на Е2А последователност див тип (колони, означени „В“). Експериментът може да бъде анализиран на снимка с обратен контраст по светенето на оцветени с етидиев бромид ДНК фрагменти, разделени на гел, посочени на фигура 8, който се подтвърди с помощта на стандартни методи.
Резултатите показаха, че всичките три лизата съдържат CFTR и Е2А делеционните последователности, който факт е в съответствие със структурата на вектора AdGVCFTR.12B. В тези лизати не беше установена Е2А последователност от див тип. На фигура 8 „М“ означава маркерна ДНК за потвърждение на големината на размера на продуктите, „+“ посочва проба, в която е използвана положителна матрица за даден набор от праймери, означава отрицателен праймер, използван за всеки даден набор от праймери, и както беше посочено по-горе, А, Б и В - трите изследвани вирусни лизата.
Съответно, аденовирусен вектор, притежаващ делеции в Е1 и Е2 районите, беше получен и клетъчни линии, способни да комплементират двойно дефицитния вектор бяха идентифицирани.
Пример 10
Този пример илюстрира употребата на плазмид с Е2А делеция за експресията на чуждеродна ДНК.
Плазмидът pGV13(0) с Е2А делеция, както е описан в Пример 3, беше използван за конструиране на серията от вектори GV12B. Модификациите на pGV13(0) включваха заместване на уникално See I рестрикционно място за свързване с Cla I място за свързване и промяна на района, обграждащ ATG от Е2А гена с оптимизирана консенсусна последователност на Козак. Един маркерен ген (βглюкуронидаза), притежаващ фланкиращи See I места за срязване, беше инсертиран на мястото на Е2А гена, така че маркерният ген да се експресира в отговор на всички сигнали, използвани за експресия на най-изобилствуващия ранен ген, т.е., DBP. Полученият плазмид (pGBSE2GUS) беше изследван за функционалност чрез трансфекция и последваща оценка на βглюкуронидазна активност; всички трансфектирани клетъчни линии, които бяха изследвани, показаха високи нива на експресия на β-глюкуронидаза, което беше установено по образуването на син цвят, когато β-глюкуронидазата катализира реакция със субстрат X-glu.
Друг вирусен вектор (AdGVLuc; E2GUS), който е представен на фигура 9, беше конструиран, за да илюстрира възможността за употреба на делетирания Е2 район за замяна с чуждеродна ДНК, например за целите на генна терапия. Векторът AdGVLuc; E2GUS съдържа маркер CMV луцифераза в Е1 района и β-глюкуронидаза в Е2 района. Предшествуващият вектор (AdGVLUC.1O) беше изполван за трансфектиране на 293/Е2А клетки; последващо оцветяване на получените вирусни плаки за β-глюкуронидаза с помощта на X-glu не демонстрира никакво синьо оцветяване, т.е. никаква β-глюкуронидазна активност не беше открита. Плаките, които се образуваха от 293/Е2А клетките, трансфектирани с AdGVLuc;E2GUS векторът, образуваха допълнително количество син цвят при добавяне на X-glu.
Следователно, чуждеродната ДНК, заместена в Е2А района в аденовирусен вектор, може да функционира.
Пример 11
Този пример предлага допълнителен протокол за получаване на 293/ORF6 клетъчни линии и употребата им за конструиране на аденовирусен вектор, дефицитен едновременно по Е1 и Е2 районите.
E4-ORF6 експресионната касета, посочена на фигура 10. беше конструирана с помощта на праймери A5s(33190)P и А5а(34084)Р в полимеризационна верижна реакция (PCR) (PCR Protocols, A guide to methods and Applications. Innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990)) за амплифициране на ORF-6 гена от Е4 и генериране на Рас I места за срязване в крайщата на клонинга. Амплифицираният фрагмент беше запълнен до тъпи крайща с Кленов и клониран в pCR-Script SK (+) (Stratagene, La Jolla, СА). Полученият плазмид pCR/ORF-6 беше секвениран и след това инсертът ORF-6 беше прехвърлен в експресионния вектор pSMT/puro, който на свой ред беше получен чрез лигиране на запълнен до тъпи крайща Eco RI - Hind III фрагмент, съдържащ промотор SMT в Mlu I - Hind III място за срязване, тип „тъп край“ в pRCpuro, за да се получи pSMT/ORF-6.
Трансфекцията на 293 клетките беше ефектирана с pSMT/ORF6/puro и трансфектираните клетки бяха селекционирани за растеж в стандартни хранителни среди плюс пуромицин. Намножаването на клона беше ефектирано, както е описано в Пример 6. Получените клетъчни линии бяха скринирани за способността им да експресират E4-ORF6 при индукция и да комплементират Е1 и Е4 дефектни вирусни вектори.
Устойчивите на пуромицин (puro+; т.е. устойчиви на пуромицин) клонални изолати от 293/ORF6 клетъчните линии бяха скринирани за способност да експресират ORF6. Клетките бяха култивирани в присъствие на пуромицин за поддържане на селекцията. Представителни монослоеве от независими клонални изолати бяха индуцирани със 100 μΜ ZnCI2 за 24 часа. Експресията на ORF6 гена беше открита чрез Northern блотинг, по този начин идентифицирайки РНК транскрипт. Относителното ниво на експресия (най-ниско (+) към найвисоко + + + + +) на всяка една изследвана клетъчна линия е представено по-долу в Таблица 3.
Таблица 3
Клетъчна Експресия на Клетъчна Експресия на
линия ORF6 линия ORF6
А2 + + + В8 + +
А2-1 (+) В8-1 (+)
А2-2 (+) В8-2 + + +
А2-3 - В8-3 +
А2-4 (+) В8-4 +
А2-5 (+) В8-5 (+)
А2-6 - В8-6 -
А2-7 (+) В8-7 +
А2-8 - В8-8 + +
А2-9 (+) В8-9 + +
А2-10 - В8-10 (+)
А2-11 - В8-14 (+)
А2-12 + В8-16 -
А2-13 - В8-18 -
А2-14 + + + + + В8-19 -
А2-24 - В8-20 -
А2-32 + + + + В8-21 -
А2-59 - В8-23 -
В8-22 - В8-27 -
В8-24 В8-27 -
Резултатът от теста за експресия на ORF6 гена показа, че 53 % от устойчивите на пуромицин клетъчни линии са положителни за ORF6 транскриптите и всички тези положителни ORF6 клетъчни линии са индуцируеми за ORF6 експресията.
Беше използвана и PCR за установяване на инсерция на ген в Е4 делетиран район в аденовирусен вектор, резултатите от която са показани на фигура 11. Пасажираните лизати от трансфектирани клетки, бяха подложени на PCR, която амплифицира определена генна последователност, асоциирана с див тип Е4, а именно фрагменти с 3087 Ьр и 367 Ьр. ДНК от лизатите на лъжливо инфектирани с 293/ORF6 клетки (линия 1), AdGvpgal1.10 инфектирани клетки (линия 2) и AdGVpgal1.11 инфектирани клетки (линия 3) бяха подложени на гелелектрофореза и оцветяване с етидиев бромид. Снимката, представена на фигура 11, която е на получения оцветен гел, показва че във вектора AdGV3gal1.10 липсва част от Е4 района, която включва последователност от 367 Ьр и че във вектор AdGVpgal1.11 липсва част от Е4 района, която включва последователност от 3087 Ьр.
Растежът на Е4 делетирания вектор беше проследяван в 293/ORF6 клетъчни линии. Клетките бяха инфектирани с множественост на инфекцията (moi) - 10 и вирусният растеж беше проследяван чрез комплементарен плаков анализ след 5 дни. Резултатите са представени на фигура 12, която представлява хистограма на единиците, образуващи плаки (PFU) за клетка на ординатата и идентифицира изследваната клетъчна линия на абсцисата. За положителна контрола на растежа беше използвана клетъчна линия W162, която е клетъчна линия, комплементираща Е4 функцията. За отрицателна контрола беше използвана 293 клетъчна линия, която комплементира само Е1 функцията. Клетъчни линии А2,
В8, 216 и 406 са независими изолати от 293/ORF6 клетъчните линии, които показват различна степен на комплементация на Е4 делетирания вирус (dl366) По-специално, 293/ORF6 клетъчните линии комплементират Е4 функцията.
По аналогичен начин бяха идентифицирани клетъчните линии, които комплементиран Е4 функция и по този начин позволяват растеж на вируси с Е4 делеция, които от своя страна могат да поемат функционална чуждеродна ДНК. Тези клетъчни линии са подходящи за комплементиране на вектори, двойно дефицитни по Е1 и Е4 районите от даден вирус, като тези, описани в сериите AdcvCFTR, 11 по-горе или показани на фигура 13, която е схематично представяне на вектор AdcvA gal.ll. Векторът AdovAgal.il има Д-галактозидазен ген, инсертиран в Е1 района и делегиран Е4 район.
Пример 12
Този пример илюстрира използването на аденовирусни вектори, притежаващи Е1 и Е4 делеции.
Е4 делетираният плазмид pGBSAE4 беше модифициран така, че да съдържа няколко уникални места за срязване. Тези места за срязване се използват за клониране на всяка подходяща чуждородна ДНК в този район, с помощта на аденовирусен Е4 промотор за експресия. Както е посочено погоре, клонирането на β-глюкуронидаза в този район доведе до перфектно функциониращ и експресиращ чуждеродна ДНК вирусен вектор. По аналогичен начин, подходяща чуждеродна ДНК, поставена в Е1 района и друга подходяща чуждеродна ДНК в Е4 района, и двете на един и същ вирусен вектор, може да експресира съответните чуждеродни ДНКи с помощта на контрол на Е1 и Е4 промоторите или на други промотори, според желанието на експериментатора.
Втора модификация на Е4 района позволява експресията на подходяща чуждеродна ДНК от разнообразни хетероложни контролни елементи. Беше построен плазмиден конструкт по такъв начин, че могат да се получават удобно множествени промени. Мултиплазмидът pGV.11S притежава следните характерни черти, които могат да се променят подходящо:
1. аденовирусен сегмент, използван за хомоложна рекомбинация, за лигация при поставяне на чуждеродна ДНК или в Е1 или в Е4 края на вектора;
2. промоторен сегмент;
3. сегмент, съдържащ сигнал за сплайсинг;
4. сегмент, съдържащ чуждеродна ДНК;
5. сегмент за полиаденилация;
6. последователност за пакетиране на аденовируси;
7. аденовирусен ITR; и
8. всички плазмидни ДНК последователности, необходими за селекциониране и растеж на плазмида в бактерии, както и в тъканни култури на бозайници.
Пример 13
Този пример описва получаването на едно производно, включващо AdGv.11S, а именно AdGVCFTR.11S, което се състои от спейсерна последователност, инсертирана в района на Е4 делецията, находяща се в AdGV.11S. По подобен начин спейсерът може да бъде инкорпориран б район на Е4 делецията от, например AdGV.12S и AdGV.13S, за да се получи AdGVCFTR.12S и AdGVCFTR.13S, съответно.
Рекомбинантният вирус AdGVCFTR.11S беше конструиран, изолиран и култивиран с помощта на процедурите, описани при получаване на AdGVCFTR,11, както е отбелязано в Пример 2. AdGVCFTR.11S беше конструиран чрез единична рекомбинация in vivo между 1-27082, т.е., лявото рамо на AdGVCFTR.1O и плазмидът pGV11S, дясното рамо, линеаризирано с Bam HI (NEB) и Sal I (NEB). Съответно, полученият вектор AdGVCFTR.11S е дефицитен по Е1 и Е4 и инкорпорира спейсер в Е4 делетирания район, както и SV40 последователност за полиаденилиране. Разбира се, векторът съдържа също така Е4 последователност за полиаденилиране и Е4 промотор от Е4 района на аденовирусния геном.
Районът фибер/Е4 от вектора AdGVCFTR.11S е представен на фигура 14В. За сравнение, различни други вектори според изобретението са представени на фигури 14А и 14Б. Векторът на фигура 14А представлява пълна Е4 делеция, свързваща L5 фибер към дясно отстоящия ITR. Такъв вектор представлява една делеция от около 2.5 kb от Е4 района, в сравнение с дивия тип аденовирус. Различните характеристики на AdGVCFTR.11S (фигура 14В) сравнени с векторите, построени на базата на AdGV.11 (фигура 14Б) и други вектори са описани в последващите примери.
Пример 14
Този пример характеризира поведението на растеж и продуцирането на фибер белтък от Е1 и Е4 дефицитен вектор сравнени с тези на вектор, дефицитен по Е1 и със запазен, както в дивия тип, Е4 район.
За тези експерименти бяха използвани Е1 и ЕЗ дефицитния вектор AdGV/fc)al.1O и Е1 и Е4 дефицитния вектор AdGV/3gal.11. Векторите бяха инфектирани в комплементиращата клетъчна линия 293/ORF-6. Беше проведен имуноблотинг на 293/ORF6 клетъчни лизати, както е описано в Пример 9. В този експеримент, заешки серум насочен срещу целия аденовирусен капсид беше използван. Това антитяло разпознаваше всички структурни белтъци от аденовирусния капсид.
Както е показано на фигура 15, множествените дефицитни по репликация ЕГЕ4' аденовирусни вектори показват редуцирана фибер експресия и редуциран вирусен растеж, при сравнение с единичните дефицитни по репликация Е1 делетирани аденовирусни вектори. С други думи казано има дефицит в продуцирането на няколко късни белтъци, в частност на фибер белтъка в клеткитер инфектирани с вектор; ^състоящ се от Е1 и Е4 делециите (т.е., вектор AdGV$gal.11; линия 3), в сравнение с клеткитер инфектирани с ЕГЕ4+ вектор (т.е. вектор AdGV/fcjal.1O; линия 2). Намалението във фибер белтъците в ЕГ Е4+ векторът съответствува на около 50 пъти.
Ефектът на този дефицит върху продуцирането на зрели вириони беше изследван чрез оценяване на нивото на наличния фибер белтък в пречистени капсиди. Вирусните частици (капсиди) бяха изолирани чрез три последователни градиента с цезиев хлорид с помощта на стандартен протокол за продуциране на вектори. Имуноблотинг анализи с антитела, насочени срещу аденовирусния фибер белтък бяха проведени след разрушаване на капсидите чрез сваряване и провеждане на SDS/полиакриламидна гел електрофореза.
Резултатите от тези експерименти са представени на Фигура
16. Както се вижда от Фигура 16. подобни нива на фибер белтък се продуцират в клетки, инфектирани с Е1 дефицитен вектор (т.е., Adcv^gal.lO линия 1) в сравнение с клетките, инфектирани с ЕГЕ4+ вектор (т.е. AdGv/5gal. 10, линия 2).
Пример 15
Този пример описва продуцирането на фибер белтък, наблюдавано при инфекция на клетка с Е4 дефицитен вектор, състоящ се от спейсер в Е4 района, в сравнение с инфекция на клетка с Е4 дефицитен вектор, който не притежава такъв спейсер в аденовирусния геном.
За тези експерименти използваните вектори и последващото им характеризиране бяха описани както е посочено в Пример 14. В допълнение, Е1и Е4 дефицитният AdcvCFTR.l IS, построен на основата на Adcv-11S - беше изследван. Този вектор съдържа допълнително ЕЗ делеция в спейсер, инсертиран в района на Е4 деленията, намираща се в Adcv-l 1, както е описано в Пример 13.
Резултатите от тези изследвания са илюстрирани на Фигура 17. Както се вижда от Фигура 17, инкорпорирането на спейсер в района на Е4 делецията позволява нивата на продуциране на L5 фибер белтъка да достигнат тези, получени при единичния репликационно дефицитен аденовирусен вектор. По-специално, когато продуцирането на фибер се прекрати в клетки, инфектирани с Е1 и Е4 дефицитен вектор AdGV/3gal.11 (линия 3), нивата на наблюдавания фибер за клетка, инфектирана с множествен репликационно дефицитен ЕТЕ4+ вектор, състоящ се от спейсер, т.е. AdGVCFTR.11S, (линия 4), приближават нивата на фибер продукция, наблюдавани за клетка, инфектирана с единичен репликационно дефицитен ЕГ вектор AdGV/3gal.1O (линия2).
Тези резултати потвърждават, че инкорпорирането на спейсер в ЕТЕ4+ вектора, по-специално в района на Е4 делецията, осигурява правилна продукция на фибер, подобна на тази, наблюдавана при инфекция на клетка с вектор, притежаващ само Е1 делеция.
Пример 16
Този пример описва характера на растеж на Е4 дефицитен вектор, състоящ се от спейсер в Е4 района, в сравнение с инфекция на клетка с Е4 дефицитен вектор, който не притежава такъв спейсер в аденовирусния геном.
В тези експерименти беше изследвана способността да се компенсира дефекта липса на растеж на множествено дефицитни аденовирусни вектори чрез добавяне на спейсер към най-малко един от делетираните райони. С други думи, беше изследвано продуцирането на активни вирусни частици (огнище образуващи единици; ffu) за клетка като функция от времето след инфекцията на А232 клетки с Е1 или ЕЗ дефицитен вектор AdGV$gal.1O, построен на базата на AdGV-10, Е1 и Е4 дефицитен вектор AdGVLacZ.11, построен на базата на AdGV.11, или на Е1,
ЕЗ и Е4 дефицитен вектор AdGvCFTR.11S, построен на базата на AdGV.11S, притежаващ спейсерна последователност в района на Е4 делецията. Бяха използвани А232 клетките въз основа способността на клетките от тази клетъчна линия да продуцират Е1 и Е4 делетирани вируси. А232 клетките са 193/ORF6 клетки, които растат в стандартни хранителна среда и се индуцират за проидводство на ORF6 след инфекция с 100 μΜ ZnCI2. Огнище образуващите единици бяха определени чрез инфектиране на комплементиращи монослоеве от клетки със серии от разреден вирусен сток. Броят на инфектираните клетки беше определян чрез имунохимична детекция с помощта на антяло към генния продукт на DBP или Е2А гена. Продуцирането на активни вирусни частици беше изследвано на 20, 40, 60 и 80 час след инфекцията.
Резултатите от тези експерименти са представени на фигура 18. Изглежда няма кинетична разлика между Е1 и ЕЗ AdGV.1O дефицитния вектор (запълнени квадратчета) от една страна, и Е1, ЕЗ и Е4 дефицитния AdGV.11S вектор, притежаващ спейсер в района на Е4 делецията (празен кръг). Най-ниското ниво на продуциране на вириони е открито при Е1, ЕЗ и Е4 дефицитния AdGV.11 вектор, който не съдържа спейсер (празен ромб), както може да се види по разликата от 100 пъти на 16 до 20 час след инфекцията.
В допълнение, добивът на продукцията беше определен. Това включваше употреба на три градиента цезиев хлорид за пречистване на векторните капсиди. Вирусът трябваше да бъде подложен на сериозен протокол за пречистване на векторните капсиди. Както при всяка процедура по пречистване, това доведе до загуба в тоталния добив. Следователно, критичната точка в настоящите експерименти не е точката на „плато“ в растежната крива на фигура 18., а по-скоро нивото на продукция. Добивът по продукция (в активни вирусни частици за клетка) за клетки, инфектирани с различни вектори, е представен в Таблица 4.
Таблица 4
Вектор
AdGV.1O (т.е., AdGV/fcjal.1O)
AdGV.11 (т.е., AdGV$gal.11)
AdGV.11S (т.е., AdGVCFTR.11S)
Добив по продукция
650
720
Както се вижда от тези данни, при инкорпориране на спейсер в множествен репликационно дефицитен ЕГЕ4+ вектор, продукцията на вирусни частици се увеличава до (и може би надвишава) нивата на вирусна продукция, налюдавани при единичен репликационно дефицитен Е1 делетиран вектор.
Съответно, тези резултати потвърждават, че спейсерната последователност е способна да противодейства на невъзможността за растеж и на намалената експресия на фибер, наблюдавана при Ε1Έ4+ множествен репликационно дефицитен аденовирусен вектор. Нещо повече, цялостно погледнато, резултатите показват, че инкорпорирането на този спейсер в генома на аденовирус, притежаващ Е1 и Е4 делеции, по-специално инкорпорирането в района на Е4 делецията, води до правилна фибер продукция и увеличен вирусен растеж, подобни на тези при единичния репликационно дефицитен Е1 вектор.
Пример 17
Този пример илюстрира характеризирането на вектори, притежаващи делеции в Е2 района, по-специално Е2А района от аденовирусния геном.
Както беше наблюдавано при Е4 мутантите, поведението на растеж на единично и множествено репликационно дефицитни аденовируси, съдържащи мутации в Е2А района, е разстроено. Съответно, беше изследвана способността на различни Е2А делеционни мутанти, съдържащи див тип Е1 последователности, да бъдат комплиментирани от клетъчните линии според изобретението. В частност, преди това описаните аденовирусни вектори <У43О1, d802, о7803 и d/807, притежаващи делеции в Е2А (Rice et al., J. Virol.. 56, 767-778 (1985); Vos et al., Virology. 172, 634-632 (1988)) бяха изследвани.
E2A отворената рамка за четене се състои от Ad5 нуклеотид 22,443 до Ad5 нуклеотид 24,032. Е2А генният продукт е свързващ белтък на едноверижна ДНК (т.е., DBP ). Вирусът сУЛВОЗ съдържа делеция в Е2А ORF от Ad5 нуклеотид 22,542 до Ad5 нуклеотид 23,816 и Е2А ORF от Ad5 нуклеотид 23,816 до Ad5 нуклеотид 24,032. Следователно, генният продукт на с/ВОЗ Е2А района (и неговите варианти) съдържат химеричен белтък, състоящ се от част от DBP белтъка, резултат от транслация на нормална (т.е. див тип) отворена рамка, свързан със следваща белтъчна последователност, която е резултат от употребата на алтернативна рамка за четене, следваща делецията. Районът от DBP белтъка, който липсва в химеричния белтък поради делеция (т.е. patfoHa“Ct„) участвуваше в ДНК репликацията, ssflHK свързването и свързването на иРНК (Brough et al., Virology, 196. 269-281 (1993)). За сравнение, районът, частично запазен във вектора (т.е. района „Nt“).участваше в ядрената локализация и късната генна експресия (Brough et al., supra).
Вирусите dIBQI и 02 представляват модификации на вирус d!803. По-специално, d!8Q2 притежава делеция в Е2А ORF от Ad5 нуклеотид 23,816 до Ad5 нуклеотид 23,969, такава че полученият делетиран вирус съдържа Е2А ORF от Ad5 нуклеотид 23,969 до Ad5 нуклеотид 24,032. По подобен начин <74301 притежава вътрерамкова делеция на Е2А ORF от Ad5 нуклеотид 23,816 до Ad5 нуклеотид 24,011, такава че полученият делеционен вектор Е2А ORF е от Ad5 нуклеотид 24,011 до Ad5 нуклеотид 24,032. За сравнение, d/8Q7 съдържа вътрерамкова делеция на Е2А ORF от Ad5 нуклеотид 23,882 до Ad5 нуклеотид 23,954.
Изучавайки поведението на растеж на тези различни делеционни вектори, беше установено7че определени сегменти от Е2А района на аденовирусния геном не могат да бъдат комплементирани и трябва да бъдат възстановени чрез (или добавени обратно в; аденовирусен вектор, за да се осъществява вирусният растеж. Резултатите от тези експерименти се обобщени на фигура 19. По-специално, делеционният мутант dlB03 (който запазва частично Nt района и няма див тип Ct район) е напълно функционален и не показва растежен дефицит при комплементиране на Е2А клетъчни линии. За сравнение, векторите d!8Q7, d/8Q2 (не са представени данни) и dB01 демонстрират отслабен фенотип, който не може да се комплементира в Е2А експресиращи клетъчни линии. Поспециално с/ЛВ01 вектор показва фенотип на изключително малки плаки [-/+]. Следователно тези резултати потвърждават факта, че районът, оставащ в с/4303, съдържащ се между Ad5 нуклеотид 23816 и Ad5 нуклеотид 24032, е необходим за възстановяване на делецията Е2А и репликацията на Е2А делеционните вектори в наличните понастоящем клетъчни линии.
Всички литературни цитати , включително и публикациите и патентите, посочени тук, са включени като литературна справка в еднаква степен, така както би било.ако всеки цитат е индивидуално и специфично посочен за включване като литературен източник, и са цитирани тук в тяхната цялост.
Доколкото това изобретение е предназначено за предпочитаеми формирования, то би било очевидно за всички, притежаващи обикновени умения в съответното нива на техника. и предпочитаемите формирования могат да са различни. Цели се намерение изобретението да се практикува и по начин, различен от тези, специфично описани тук. Следователно, това изобретение включва всички модификации, съдържащи се в духа и целите на следните претенции.
Списък на последователностите (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:
(i) ЗАЯВИТЕЛ: Kovesdi, Imre
Brough, Douglas Е. McVey, Duncan L. Bruder, Joseph T. Lizonova, Alena (ii) НАИМЕНОВАНИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: Комплементарни аденовирусни векторни системи и клетъчни линии (iii) БРОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ: 4 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:
(A) АДРЕСАНТ: Leydig, Voit & Mayer, Ltd.
(Б) УЛИЦА: Two prudential Plaza, Suite 4900 (B) ГРАД: Chicago (Г) ЩАТ: Illinois (Д) ДЪРЖАВА: USA (E) ZIP: 60601 (v) ФОРМА, ЧИТАЕМА ОТ КОМПЮТЪР:
(A) ТИП HA СРЕДАТА: флопи диск (Б) КОМПЮТЪР: ПК, съвместим с IBM (B) ОПЕРАЦИОННА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (Г) СОФТУЕЪР: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) ДАННИ ЗА НАСТОЯЩАТА ЗАЯВКА:
(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: WO (Б) ДАТА НА ПОПЪЛВАНЕ: 12-ДЕК.-1996 (B) КЛАСИФИКАЦИЯ:
(vii) ПРЕДВАРИТЕЛНИ ДАННИ ЗА ЗАЯВКАТА:
(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: US 08-572126 (Б) ДАТА НА ПОПЪЛВАНЕ: 14-ДЕК.-1995 (B) КЛАСИФИКАЦИЯ:
(viii) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПЪЛНОМОЩНИКА / АГЕНТА:
(A) ИМЕ: Kilyk Jr., John (Б) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 30763 (B) РЕФЕРЕНТЕН / РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 75388 (ix) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ (А) ТЕЛЕФОН: (312) 616-5600 (Б) ТЕЛЕФАКС: (312) 616-5700 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 1:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 32 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) БРОЙ ВЕРИГИ: една (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (синтетична) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 1:
CACTTAATTA AACGCCTACA TGGGGGTAGA GT ' 32 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 2:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 34 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) БРОЙ ВЕРИГИ: една (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (синтетична) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 2:
CACTTAATTA AGGAAATATG ACTACGTCCG GCGT 34 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 3:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 18 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) БРОЙ ВЕРИГИ: една (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (синтетична) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 3:
GCCGCCTCAT CCGCTTTT 18 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 4:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 32 базови двойки (Б) ТИП: нуклеинова киселина (B) БРОЙ ВЕРИГИ: една (Г) ТОПОЛОГИЯ: линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (синтетична) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 4:
CCGGAATTCC ACCATGGCGA GTCGGGAAGA GG

Claims (32)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Аденовирусен вектор, който е дефицитен по една или повече жизнено важни генни функции от Е4 региона от аденовирусния геном, характеризиращ се с това, че аденовирусният вектор включва спейсерна последователност от поне около 15 базови двойки в Е4 региона на аденовирусния геном.
  2. 2. Аденовирусен вектор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че спейсера включва полиаденилатна последователност.
  3. 3. Аденовирусен вактор съгласно претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че са отстранени всички отворени четящи рамки на Е4 региона на аденовирусния геном.
  4. 4. Аденовирусен вектор съгласно претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че Е4 региона на аденовирусния вектор е отстранен и спейсерната последователност е локализирана между дясностраничните обратни терминални повтори ITR и останалата част от генома.
  5. 5. Аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 - 4, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е дефицитен по една или повече жизнено важни генни функции от Е1 региона на аденовирусния геном.
  6. 6. Аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 - 5, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е дефицитен по една или повече жизнено важни генни функции от Е2А региона на аденовирусния геном.
  7. 7. Аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 - 6, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е дефицитен по всички жизнено важни генни функции от Е1 региона на аденовирусния геном.
  8. 8. Вектор съгласно която и да е от претенции 1 - 7, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е дефицитен по всички жизнено важни генни функции от Е1 и Е2А регионите на аденовирусния геном.
  9. 9. Аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 - 8, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е дефицитен в ЕЗ региона на аденовирусния геном.
  10. 10. Аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 - 9, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е дефицитен по всички ORF от Е2А региони на аденовирусния геном, различни от ORF кодиращия ДНК свързващ белтък DBP, и където споменатият аденовирусен вектор включва по - малко от около 230 базови двойки от DBP ORF, и където споменатите последователности от DBP ORF кодират част от Nt домена на DBP, което е достатъчно за вирусния растеж в клетъчна линия, която не е комплементарна за дефицитните в DBP ORP.
  11. 11. Аденовирусен вектор, от който са отстранени всички ORF от Е2А региони на аденовирусния геном, различни от ORF кодиращия ДНК свързващ белтък DBP, и където споменатият аденовирусен вектор включва по - малко от около 230 базови двойки от DBP ORF, и където споменатите последователности от DBP ORF кодират част от Nt домена на DBP, което е достатъчно за вирусния растеж в клетъчна линия, която не е комплементарна за дефицитните по DBP ORP.
  12. 12. Аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1-11, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е бил подготвен в клетъчна линия ..имаща капацитет за допълване in trans на дефицитните жизнено важни генни функции на споменатият аденовирусен вектор.
  13. 13. Аденовирусен вектор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият аденовирусен вектор е AdGV.11 модифициран чрез инкорпорирането на последователност, включваща полиаденилатна последователност между дясно-страничните обратни терминални повтори ITR от аденовирусния геном и остатъка от генома.
  14. 14. Аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1-13, характеризиращ се с това, че аденовирусеният вектор включва чуждероден ген.
  15. 15. Аденовирусен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че чуждеродният ген кодира терапевтичен агент.
  16. 16. Аденовирусен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че чуждеродниятт ген е цистофиброзен трансмембранен регулаторен ген.
  17. 17. Аденовирусен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че чуждеродният ген кодира безсмислена РНК.
  18. 18. Аденовирусен вектор съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че чуждеродният ген кодира полипептид, който предизвиква имунен отговор.
  19. 19. Аденовирусен вектор, съгласно която и да е от претенции 1-18, характеризиращ се с това, че аденовирусният вектор е приготвен в клетка в отсъствието на помощен вирус.
  20. 20. Използуване на аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1-19 при приготвянето на фармацефтични препарати.
  21. 21. Репликационно компетентна наличност на свободен аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 -19.
  22. 22. Вектор съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че аденовирусният вектор е приготвен в клетъчна линия, притежаваща способност да подпомогне растежа на споменатия аденовирусен вектор, като в генома на споменатата клетъчна линия няма припокриващи се със споменатия аденовирусен вектор последователности, което е достатъчно да се медиират рекомбинационни процеси, в резултат на което се получава репликационно компетентен аденовирусен вектор.
  23. 23. Вектор съгласно претенции 21 или 22, характеризиращ се с това, че аденовирусният вектор приготвен в клетъчна линия, притежаваща способност да подпомогне растежа на споменатия аденовирусен вектор, като споменатата наличност е свободна от репликационно компетентен аденовирус след единична рекомбинация между генома на споменатия аденовирусен вектор и споменатата клетка.
  24. 24. Метод за приготвяне на аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 - 19, характеризиращ се с прорастването на споменатия аденовирусен вектор в клетъчна линия в отсъствието на помощен вирус, където споменатата клетъчна линия притежава способност да допълва in trans споменатия аденовирусен вектор.
  25. 25. Метод за увеличаване прорастването в комплементарна клетъчна линия на аденовирусен вектор с отстранен Е4 регион на аденовирусния геном в комплементарна клетъчна линия, характеризиращ се с инкорпорирането на спейсерна последователност между дясно - страничните обратни терминални повтори ITR и остатъка от генома, където споменатият спейсер е от около поне 15 базови двойки.
  26. 26. Метод съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че спейсерната последавателност е полиаденилатна последавателност между дясностраничните обратни терминални повтори ITR и остатъка от аденовирусния геном.
  27. 27. Метод на генетично модифициране на клетки, който метод се характеризира с поставяне в контакт на споменатите клетки с аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1 -19.
  28. 28. Препарат, съдържащ аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1-19.
  29. 29. Клетка - гостоприемник, съдържаща аденовирусен вектор съгласно която и да е от претенции 1-19.
  30. 30. Метод за тестуване токсичността на който и да е аденовирусен вектор съгласно претенции 1 - 19 в клетки мишени, който метод включва:(1) поставяне в култура аликвота от споменатите клетки - мишени, (2) контакт на споменатите клетки - мишени със споменатия вектор, и (3) измерване виталността на споменатите култивирани клетки - мишени.
  31. 31. Метод за тестуване експресията на чуждероден ген от който и да е аденовирусен вектор съгласно претенции 14-18 при трансфекция в клетки - мишени, който метод включва :(1) поставяне в култура аликвота от споменатите клетки - мишени, (2) контакт на споменатите клетки мишени със споменатия вектор, и (3) измерване експресията на споменатия чуждероден ген в споменатите клетки - мишени.
  32. 32. Метод за тестуване експресията на пасенджер ген от който и да е аденовирусен вектор съгласно претенции 14-18 при трансфекция в клетки - мишени, който метод включва :(1) поставяне в култура аликвота от споменатите клетки - мишени, (2) контакт на споменатите клетки мишени със споменатия вектор, и (3) измерване експресията на споменатия пасенджер ген в споменатите клетки - мишени.
BG102612A 1995-12-14 1998-07-08 Комплементарни аденовирусни векторни системи и клетъчни линии BG62739B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/572,126 US5851806A (en) 1994-06-10 1995-12-14 Complementary adenoviral systems and cell lines
PCT/US1996/019839 WO1997021826A2 (en) 1995-12-14 1996-12-12 Complementary adenoviral vector systems and cell lines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG102612A BG102612A (bg) 1999-04-30
BG62739B1 true BG62739B1 (bg) 2000-06-30

Family

ID=24286453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG102612A BG62739B1 (bg) 1995-12-14 1998-07-08 Комплементарни аденовирусни векторни системи и клетъчни линии

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5851806A (bg)
EP (1) EP0870049B1 (bg)
JP (2) JP3299761B2 (bg)
AT (1) ATE320503T1 (bg)
AU (1) AU711366B2 (bg)
BG (1) BG62739B1 (bg)
BR (1) BR9612677A (bg)
CA (1) CA2238295C (bg)
CZ (1) CZ182798A3 (bg)
DE (1) DE69635931T2 (bg)
EA (1) EA199800566A1 (bg)
EE (1) EE9800185A (bg)
GE (1) GEP20012559B (bg)
HU (1) HUP9902310A3 (bg)
IL (1) IL124797A0 (bg)
IS (1) IS4762A (bg)
NO (1) NO982687L (bg)
NZ (1) NZ325627A (bg)
PL (1) PL327984A1 (bg)
SK (1) SK78598A3 (bg)
WO (1) WO1997021826A2 (bg)

Families Citing this family (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2192442C (en) * 1994-06-10 2007-09-25 Imre Kovesdi Complementary adenoviral vector systems and cell lines
US20030148968A1 (en) * 1995-02-28 2003-08-07 Hammond H. Kirk Techniques and compositions for treating cardiovascular disease by in vivo gene delivery
EP0760682A4 (en) 1995-02-28 1998-09-09 Univ California ANGIOGENIC THERAPY BY GENE TRANSFER
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6265212B1 (en) * 1995-06-15 2001-07-24 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
IL122614A0 (en) * 1995-06-15 1998-08-16 Introgene Bv Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US20030027250A1 (en) * 1995-12-15 2003-02-06 Mitchell Lloyd G. Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US20060088938A1 (en) * 1995-12-15 2006-04-27 Mitchell Lloyd G Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing in plants
US20020193580A1 (en) * 1995-12-15 2002-12-19 Mitchell Lloyd G. Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US7232899B2 (en) 1996-09-25 2007-06-19 The Scripps Research Institute Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
DE69739211D1 (de) * 1996-09-25 2009-02-26 Novartis Ag Verpackungszellinien in der Verwendung zur Erleichterung der Entwicklung hocheffizienter adenoviraler Vektoren
IL131021A0 (en) * 1997-01-29 2001-01-28 Cornell Res Foundation Inc Multiple site delivery of adenoviral vector for the induction of angiogenesis
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6696423B1 (en) 1997-08-29 2004-02-24 Biogen, Inc. Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta
WO2000012740A2 (en) 1998-08-28 2000-03-09 Duke University ADENOVIRUSES DELETED IN THE IVa2, 100K AND/OR PRETERMINAL PROTEIN SEQUENCES
US6303362B1 (en) * 1998-11-19 2001-10-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Adenoviral vector and methods for making and using the same
EP1198559A1 (en) * 1999-04-23 2002-04-24 Introgene B.V. Means and methods for nucleic acid transfer
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
US6627190B2 (en) * 1999-07-12 2003-09-30 Saint Louis University Recombinant adenovirus vectors that are replication-competent in tert-expressing cells
US6613516B1 (en) * 1999-10-30 2003-09-02 Affymetrix, Inc. Preparation of nucleic acid samples
US6867022B1 (en) 2000-01-21 2005-03-15 Regents Of The University Of Michigan Replication deficient adenovirus vectors and methods of making and using them
US7653769B2 (en) * 2006-12-14 2010-01-26 International Business Machines Corporation Management of devices connected to infiniband ports
US6821775B1 (en) * 2000-02-11 2004-11-23 Genvec, Inc. Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor
US6591543B2 (en) * 2000-04-14 2003-07-15 Kenneth P. Sabine Top water lure with highly active propeller
US7445929B2 (en) * 2000-05-26 2008-11-04 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Recombinant adenovirus vector having a reduced side effect
US6579522B1 (en) * 2000-06-27 2003-06-17 Genvec, Inc. Replication deficient adenoviral TNF vector
EP1203819A3 (en) * 2000-10-06 2002-08-07 Transgene S.A. Anti-inflammatory vectors
US6573092B1 (en) 2000-10-10 2003-06-03 Genvec, Inc. Method of preparing a eukaryotic viral vector
US20040126774A1 (en) * 2001-01-08 2004-07-01 Mitchell Lioyd G. Correction of factor VIII genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
US6838285B2 (en) 2001-09-18 2005-01-04 Becton Dickinson Site specific recombinase based method for producing adenoviral vectors
US20030087438A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. E1-revertant-free adenoviral composition
US20030086903A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. Therapeutic regimen for treating cancer
US20030158112A1 (en) * 2002-02-15 2003-08-21 Johns Hopkins University School Of Medicine Selective induction of apoptosis to treat ocular disease
US7399753B2 (en) * 2002-02-25 2008-07-15 Virxsys Corporation Trans-splicing mediated photodynamic therapy
US7094399B2 (en) * 2002-05-08 2006-08-22 Intronn, Inc. Use of spliceosome mediated RNA trans-splicing to confer cell selective replication to adenoviruses
JP4654033B2 (ja) * 2002-10-23 2011-03-16 バークシス コーポレーション 効率的なプレ−トランス−スプライシング分子の同定のためのスクリーニング方法
EP1567198A4 (en) * 2002-12-02 2006-05-31 Genvec Inc MATERIALS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF EYE DISEASES
US20040166091A1 (en) * 2003-02-24 2004-08-26 Genvec, Inc. Materials and methods for treating disorders of the ear
JP2006520604A (ja) * 2003-03-19 2006-09-14 アイソジェニス・インコーポレイテッド ＣＤ８α鎖に基づき免疫原性が減少した遺伝子治療ベクター
EP1649028B1 (en) * 2003-07-25 2012-08-22 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based vaccines
EP1687032B1 (en) 2003-11-14 2010-02-24 Genvec, Inc. Pharmaceutical composition for treating unresectable, locally advanced pancreatic cancer (lapc).
CN101507822B (zh) * 2003-11-24 2012-06-06 坎吉有限公司 皮肤瘢痕形成的减少
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
EP1716165A4 (en) * 2004-01-23 2008-06-18 Virxsys Corp EXPRESSION OF APOLIPROTEIN A1 (APOA-1) AND VARIANTS USING SPLICE COMPLEX-INDUCED RNA TRANSPLANT
US7968334B2 (en) * 2004-01-23 2011-06-28 Virxsys Corporation Expression of apoAI and variants thereof using spliceosome mediated RNA trans-splicing
ES2329607T3 (es) * 2004-02-23 2009-11-27 Crucell Holland B.V. Metodos de purificacion de virus.
WO2005089811A1 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 Genvec, Inc. Materials for treating vascular leakage in the eye
CA2563396A1 (en) 2004-04-12 2005-11-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary, Department Of Health And Human Services Method of using adenoviral vectors to induce an immune response
CN101068574B (zh) * 2004-07-20 2012-07-18 伊索格尼斯股份有限公司 与自身抗原有关的自身免疫和疾病的特异性抑制
US20060094110A1 (en) * 2004-07-30 2006-05-04 Mcgarrity Gerard J Use of spliceosome mediated RNA trans-splicing for immunotherapy
US20060134658A1 (en) * 2004-08-09 2006-06-22 Garcia-Blanco Mariano A Use of RNA trans-splicing for generation of interfering RNA molecules
WO2006039045A2 (en) * 2004-09-01 2006-04-13 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation
DE102004047492B4 (de) * 2004-09-23 2006-07-20 Jost-Werke Gmbh & Co. Kg Verfahren zum Übertragen von elektrischer, pneumatischer oder hydraulischer Energie sowie ein Energieübertragungssystem
US7871795B2 (en) 2004-10-08 2011-01-18 Virxsys Corporation Targeted trans-splicing of highly abundant transcripts for in vivo production of recombinant proteins
AU2005326784B2 (en) * 2004-10-08 2012-03-15 Virxsys Corporation Use of RNA trans-splicing for antibody gene transfer and antibody polypeptide production
US20060188481A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-24 Saitama Medical School Methods for prophylactically or therapeutically treating an animal for an ocular-related disorder
MX2007010306A (es) 2005-02-23 2007-09-26 Uab Research Foundation Vacunacion mejorada con alquil-glicosido.
ATE412737T1 (de) * 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
US8765146B2 (en) * 2005-08-31 2014-07-01 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
US9651543B2 (en) 2005-08-31 2017-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
US8450055B2 (en) * 2005-08-31 2013-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
BRPI0618441B8 (pt) * 2005-11-10 2021-07-27 Genvec Inc vetor adenoviral
US20080248060A1 (en) * 2007-01-09 2008-10-09 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
DE602008004476D1 (de) * 2007-03-09 2011-02-24 Vectorlogics Inc Zellen für adenovirusvektor- und proteinherstellung
WO2008134720A2 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Medtronic, Inc. Inert dna sequences for efficient viral packaging and methods of use
US20090202492A1 (en) * 2008-01-25 2009-08-13 University Of South Florida Adenovirus vaccine utilizing ikk as adjuvant
WO2010033722A2 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Isogenis, Inc. Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof
PL2350268T3 (pl) * 2008-11-03 2015-05-29 Crucell Holland Bv Sposób wytwarzania wektorów adenowirusowych
ES2445713T3 (es) 2009-10-15 2014-03-04 Crucell Holland B.V. Proceso para la purificación de adenovirus a partir de cultivos de alta densidad celular
WO2011045378A1 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
WO2011047316A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins
WO2011057254A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
WO2011057248A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Genvec, Inc. Simian adenovirus and methods of use
NZ601424A (en) 2010-02-15 2014-07-25 Crucell Holland Bv Method for the production of ad26 adenoviral vectors
CN102892429B (zh) 2010-03-17 2016-08-31 康奈尔大学 基于被破坏的腺病毒的抗滥用药物疫苗
TW201823463A (zh) 2010-03-23 2018-07-01 美商英翠克頌公司 條件性表現治療性蛋白質之載體、包含該載體之宿主細胞及彼等之用途
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
CA2808556A1 (en) 2010-09-20 2012-03-29 Crucell Holland B.V. Therapeutic vaccination against active tuberculosis
MX354752B (es) 2010-09-27 2018-03-20 Janssen Vaccines & Prevention Bv Regimen de vacunacion de sensibilizacion y refuerzo heterologo contra malaria.
WO2012083297A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Genvec, Inc. Adenoviral vectors with modified hexon regions
US8920813B2 (en) 2010-12-20 2014-12-30 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based dengue fever vaccine
EP3450568A3 (en) 2011-03-04 2019-04-24 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
WO2013052859A2 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
IN2014DN03061A (bg) 2011-10-05 2015-05-15 Genvec Inc
US9233153B2 (en) 2011-10-05 2016-01-12 Genvec, Inc. Affenadenovirus (gorilla) or adenoviral vectors and methods of use
WO2013052832A2 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genvec, Inc. Adenoviral vectors and methods of use
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
WO2013116591A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccine
SG11201405228VA (en) 2012-03-12 2014-11-27 Crucell Holland Bv Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
EP2827895B1 (en) 2012-03-22 2017-08-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
US9125870B2 (en) 2012-03-22 2015-09-08 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
WO2013181128A1 (en) 2012-05-29 2013-12-05 Genvec, Inc. Modified serotype 28 adenoviral vectors
EP2855511B1 (en) 2012-05-29 2019-07-24 GenVec, Inc. Herpes simplex virus vaccine
DK2970398T3 (da) 2013-03-13 2024-08-05 Us Health Præfusions-rsv-f-proteiner og anvendelse deraf
AP2015008815A0 (en) 2013-04-25 2015-10-31 Crucell Holland Bv Stabilized soluble prefusion rsv f polypeptides
MY171210A (en) 2013-06-17 2019-10-02 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
ES2711115T3 (es) 2013-09-19 2019-04-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Formulaciones de adenovirus mejoradas
US10400015B2 (en) 2014-09-04 2019-09-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use
TWI710635B (zh) * 2014-10-09 2020-11-21 美商珍維克公司 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體
MY181175A (en) 2014-11-04 2020-12-21 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv16 vaccines
WO2016103238A1 (en) 2014-12-24 2016-06-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant metapneumovirus f proteins and their use
WO2016118642A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Recombinant human/bovine parainfluenza virus 3 (b/hpiv3) expressing a chimeric rsv/bpiv3 f protein and uses thereof
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
JP6887955B2 (ja) 2015-03-18 2021-06-16 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 組換え体発現系のアッセイ
SI3283634T1 (sl) 2015-04-14 2019-08-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Rekombinantni adenovirus, ki izraža dva transgena z dvosmernim promotorjem
JP7189014B2 (ja) 2015-07-07 2022-12-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｒｓｖに対するワクチン
EP3319634B1 (en) 2015-07-07 2019-08-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
EA037295B1 (ru) 2015-08-20 2021-03-05 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Терапевтические вакцины против hpv18
JP6487604B2 (ja) 2015-10-06 2019-03-20 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 生物学的製剤のプラスチック誘起分解を防止する方法
WO2017139392A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
US10808011B2 (en) 2016-03-09 2020-10-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use
JP7233928B2 (ja) 2016-04-05 2023-03-07 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｒｓｖに対するワクチン
DK3439672T3 (da) 2016-04-05 2021-02-15 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabiliserede opløselige præfusions-rsv-f-proteiner
CN109922829A (zh) 2016-05-02 2019-06-21 扬森疫苗与预防公司 治疗性hpv疫苗组合
ES2836598T3 (es) 2016-05-30 2021-06-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteínas F de RSV prefusión estabilizadas
CN109312362B (zh) 2016-06-20 2022-06-28 扬森疫苗与预防公司 有效和平衡的双向启动子
JP7229151B2 (ja) 2016-07-14 2023-02-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｈｐｖワクチン
WO2018064523A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Genvec, Inc. Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into t cells
WO2018067582A2 (en) 2016-10-03 2018-04-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv-1 env fusion peptide immunogens and their use
US10960070B2 (en) 2016-10-25 2021-03-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion coronavirus spike proteins and their use
WO2018109220A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof
AU2018217935B2 (en) 2017-02-09 2020-04-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
WO2018176031A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Glycan-masked engineered outer domains of hiv-1 gp120 and their use
JP2020519663A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． Ｒｓｖ感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物
SG11202001458SA (en) 2017-09-15 2020-03-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Method for the safe induction of immunity against rsv
WO2019079337A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services RECOMBINANT HIV-1 ENVELOPE PROTEINS AND THEIR USE
AU2018357912B2 (en) 2017-10-31 2023-11-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus and uses thereof
JP7438943B2 (ja) 2017-10-31 2024-02-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー アデノウイルス及びその用途
WO2019086461A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
MX2020004487A (es) 2017-10-31 2020-08-13 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus y usos de estos.
JP7317047B2 (ja) 2018-01-23 2023-07-28 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
CN112135622A (zh) 2018-03-06 2020-12-25 普莱西根股份有限公司 乙型肝炎疫苗及其用途
EP3870703A1 (en) 2018-10-22 2021-09-01 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion
BR112021013507A2 (pt) 2019-01-10 2021-11-16 Janssen Biotech Inc Neoantígenos da próstata e seus usos
CA3137448A1 (en) 2019-04-25 2020-10-29 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant influenza antigens
CN113950333A (zh) 2019-05-15 2022-01-18 扬森疫苗与预防公司 使用基于腺病毒的疫苗预防性治疗呼吸道合胞病毒感染
AU2020275455A1 (en) 2019-05-15 2021-12-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
JP7457733B2 (ja) * 2019-05-30 2024-03-28 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 改変アデノウイルス
KR20220057578A (ko) 2019-09-05 2022-05-09 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
US20220372515A1 (en) 2019-10-03 2022-11-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
AU2020361533A1 (en) 2019-10-08 2022-04-28 Trustees Of Boston College Proteins containing multiple, different unnatural amino acids and methods of making and using such proteins
BR112022009598A2 (pt) 2019-11-18 2022-08-16 Janssen Biotech Inc Vacinas baseadas em calr e jak2 mutantes e uso dos mesmos
CA3170322A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sars-cov-2 vaccine
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
US20230085724A1 (en) 2020-03-05 2023-03-23 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for treating cancer with immune cells
US11213482B1 (en) 2020-03-05 2022-01-04 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system
US11773391B2 (en) 2020-04-01 2023-10-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19
WO2021209897A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
WO2021222639A2 (en) 2020-04-29 2021-11-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant human metapneumovirus f proteins and their use
US20230029453A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
WO2022009049A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
US20230035403A1 (en) 2020-07-06 2023-02-02 Janssen Biotech, Inc. Method For Determining Responsiveness To Prostate Cancer Treatment
WO2022035860A2 (en) 2020-08-10 2022-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Replication-competent adenovirus type 4-hiv env vaccines and their use
US20240228549A1 (en) 2021-04-29 2024-07-11 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use
US20240277829A1 (en) 2021-08-03 2024-08-22 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection
WO2023091696A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Adenovirus delivery system for cancer treatment
WO2023192835A1 (en) 2022-03-27 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use
WO2023196898A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta globin mimetic peptides and their use
EP4338727A1 (en) 2022-09-14 2024-03-20 Roquette Freres Adenovirus formulations

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4405712A (en) * 1981-07-01 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services LTR-Vectors
US5585362A (en) * 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
AU692423B2 (en) * 1992-09-25 1998-06-11 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
ATE307212T1 (de) * 1992-11-18 2005-11-15 Arch Dev Corp Adenovirus-gelenkter gen-transfer zum herz-und glatten vaskulären muskel
EP0905253A3 (en) * 1992-12-03 2000-11-02 Genzyme Corporation Adenoviral vector deleted of all E4-ORF except ORF6
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
JP3532566B2 (ja) * 1993-06-24 2004-05-31 エル． グラハム，フランク 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター
FR2707664B1 (fr) * 1993-07-13 1995-09-29 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
JP4190028B2 (ja) * 1993-07-13 2008-12-03 アベンテイス・フアルマ・ソシエテ・アノニム 欠陥組換えアデノウイルスベクター及び遺伝子治療での使用
LU88429A1 (fr) * 1993-11-23 1995-07-10 Wurth Paul Sa Dispositif de chargement d'un four à cuve
CA2117668C (en) * 1994-03-09 2005-08-09 Izumu Saito Recombinant adenovirus and process for producing the same
US5872005A (en) * 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
CZ182798A3 (cs) 1998-11-11
WO1997021826A3 (en) 1997-09-12
JPH11502421A (ja) 1999-03-02
MX9804716A (es) 1998-10-31
EE9800185A (et) 1998-12-15
CA2238295A1 (en) 1997-06-19
AU1417797A (en) 1997-07-03
DE69635931D1 (de) 2006-05-11
EP0870049B1 (en) 2006-03-15
JP3299761B2 (ja) 2002-07-08
SK78598A3 (en) 1998-12-02
HUP9902310A3 (en) 2001-11-28
JP2002199894A (ja) 2002-07-16
EP0870049A2 (en) 1998-10-14
IL124797A0 (en) 1999-01-26
AU711366B2 (en) 1999-10-14
NO982687L (no) 1998-07-13
BR9612677A (pt) 1999-07-20
EA199800566A1 (ru) 1999-02-25
NZ325627A (en) 2000-01-28
BG102612A (bg) 1999-04-30
PL327984A1 (en) 1999-01-04
HUP9902310A2 (hu) 1999-10-28
IS4762A (is) 1998-06-03
ATE320503T1 (de) 2006-04-15
US5851806A (en) 1998-12-22
WO1997021826A2 (en) 1997-06-19
GEP20012559B (en) 2001-10-25
NO982687D0 (no) 1998-06-11
CA2238295C (en) 2007-04-03
DE69635931T2 (de) 2006-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0870049B1 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
EP0784690B1 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
US5837511A (en) Non-group C adenoviral vectors
AU743923B2 (en) Method for the production of non-group C adenoviral vectors
WO1997012986A9 (en) Non-group c adenoviral vectors
AU780822B2 (en) Bovine cells expressing adenovirus essential functions for propagation of recombinant adenoviral vectors
AU730278B2 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
AU2003283504A1 (en) Recombinant adenoviral vectors and applications thereof
AU703768C (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
MXPA98004716A (en) Complementary systems of adenoviral vectors and cell lines