JP4654033B2 - 効率的なプレ−トランス−スプライシング分子の同定のためのスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、最適なプレ-トランス-スプライシング分子(PTM)の迅速大容量機能的スクリーニングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は標的前駆体メッセンジャーRNA分子(標的プレmRNA)と相互作用し、新規なキメラRNA分子(キメラRNA)の生成をもたらすトランス-スプライシング反応を媒介するようデザインされている候補PTMをコードし得るPTM発現ライブラリーを含む。本発明の候補PTMは第1のリポーター分子の一部をコードし、かつ、最適なPTM(効率的かつ特異的)を発現する細胞を選択するために使用できる他の1以上のリポーター分子をコードし得る。本発明の組成物はまた、第1のリポーター分子の残部をコードする標的プレmRNAを発現する細胞も含む。
染色体中のDNA配列は、コード領域(エキソン)を含み、かつ一般的には介在する非コード領域(イントロン)もまた含むプレmRNAへと、転写される。イントロンはスプライシングと呼ばれる精密なプロセスでプレmRNAから除去される(Chowら, 1977, Cell 12:1-8;およびBerget, S.M.ら, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:3171-3175)。スプライシングはいくつかの核内低分子リボ核タンパク質粒子(snRNP)と、集合体となってスプライセオソームとして知られている酵素複合体を形成する多くのタンパク質因子との協調した相互作用によって行われる(Mooreら, 1993, in The RNA World, R.F. GestlandおよびJ.F. Atkins編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Kramer, 1996, Annu. Rev. Biochem., 65:367-404; StaleyおよびGuthrie, 1998, Cell 92:315-326)。
ろ、内因性のプレmRNA標的が修復され、β-ガラクトシダーゼ機能が回復した。最後に、マウスにおいてリポーター遺伝子をコードするPTMを用いて、ヘミリポーター遺伝子の発現をイメージングすることに成功している(Bhaumikら Mol. Imaging and Biology 2002; Bhaumikら Mol. Therapy 2003)。これらの結果は、スプライセオソームにより媒介されるRNAトランス-スプライシング技術の種々の用途に対する有用性を実証している。
本発明は、最適なプレ-トランス-スプライシング分子(PTM)の迅速大容量機能的スクリーニングのための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、標的プレmRNA分子と相互作用し、スプライセオソームに基づくトランス-スプライシング反応を媒介して新規なキメラRNA分子の生成をもたらすようデザインされた候補PTMのライブラリーを含む。本発明の候補PTMは第1のリポーター分子の一部をコードし、1以上のさらなるリポーター分子を含んでもよく、それらは各々、最適なPTMを発現する細胞を選択するために使用できる。本発明の組成物はまた、第1のリポーター分子の一部を含む標的プレmRNAを発現するように操作された標的細胞も含む。トランス-スプライシング反応の存在下で、標的プレmRNAは、スプライシング基質として機能し、それにより、発現される少なくとも1つのリポーター分子をコードし得る修復されたキメラRNAの形成をもたらすようデザインされる。
図1A。3'エキソン置換型スプライセオソーム媒介RNAトランス-スプライシングのモデル。効率的なトランス-スプライシングが、ヘミリポーターを修復する。
本発明は、最適なプレ-トランス-スプライシング分子の迅速大容量機能的スクリーニングのための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、標的プレmRNAと相互作用し、新規なキメラRNA分子の生成をもたらすトランス-スプライシング反応を媒介するようデザインされている候補PTMをコードし得るPTM発現ライブラリーを含む。以下に詳細に記載するように、本発明の組成物およびスクリーニング法を用いて、最適なPTMを、効率的かつ特異的なトランス-スプライシング反応を媒介するそれらの能力に基づいて迅速に評価、比較および同定することができる。
本発明は、最適PTMの迅速大容量機能的スクリーニングのための組成物を提供する。本発明の組成物は、候補PTMをコードし得るPTM発現ライブラリーを含む。一般に、PTMは、以下の構造エレメント:(i)PTMの結合をプレmRNAへターゲッティングする1以上の標的結合ドメイン、(ii)3'スプライス領域および/または5'スプライス供与部位、(iii)RNAスプライス部位を標的結合ドメインから隔てるための1以上のスペーサー領域、ならびに(iv)「セーフティー配列」のうちの、1以上を含む。この3'スプライス領域は分岐点、ピリミジン領域および/または3'スプライス受容部位を含み得る。PTMはまた、ミニイントロン、ISAR(イントロンスプライシングアクチベーターおよびリプレッサー)コンセンサス結合部位、リボザイム配列、および、標的イントロンの3' スプライスシグナルに近接するイントロン配列へとターゲッティングされている結合ドメインを含んでもよい。このようなPTMの全体的設計、構築および遺伝子操作、ならびに細胞内でのそれらの首尾よくトランス-スプライシング反応を媒介する能力の証明は、米国特許第6,083,702号、同第6,013,487号および同第6,280,978号、ならびに特許出願番号09/941,492(これらは各々、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる)に詳細に記載されている。
本発明は、PTMを、標的プレmRNAとのトランス-スプライシング反応を媒介し得るその能力に基づいて迅速に同定、評価および比較するために使用できるスクリーニング方法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、本発明のスクリーニング方法を用いて、標的プレmRNAとのトランス-スプライシング反応を同様に媒介し得る他のPTM分子と比較した場合に、より効率的かつ/またはより特異的なトランス-スプライシング反応を媒介するその能力に基づいて最適なPTMを同定することができる。本発明のこのスクリーニング方法は、(i)PTMライブラリーと標的プレmRNAを発現する標的細胞とを、リポーター分子をコードし得るキメラRNA分子の形成をもたらすPTMの存在下でトランス-スプライシング反応が起こる条件下で接触させること;(ii)リポーター分子を発現する細胞を選択すること(ここで、そのリポーター分子の発現は選択された細胞においてトランス-スプライシング反応を媒介し得るPTMが存在することを示す);および(iii)選択された細胞で発現されたPTMを同定すること、を含む。
本発明の方法および組成物を用いて同定された最適なPTMは、遺伝子修復、遺伝子調節およびターゲッティングされた細胞死をはじめとする種々の異なる用途を持つ。例えば、トランス-スプライシングを用いて毒性を有するタンパク質を細胞に導入することができる。さらに、PTMを、ウイルスmRNAと結合してウイルスmRNAの機能を破壊するか、あるいはウイルスmRNAを発現する細胞を破壊するように操作することができる。本発明のさらに別の実施形態では、有害なmRNA転写物中に終止コドンを配置し、それによりその転写物の発現を低下させるようにPTMを操作することができる。
本明細書に記載のライブラリースクリーニング法は、機能が改善されたCFTRに基づくPTMを選択するために使用できる。結合ドメインの他、PTMライブラリー内の他の構造エレメントをランダムなヌクレオチド配列で置換して、異なるトランス-スプライシング能力を有する膨大な候補PTMを作製することができる。このようなエレメントの1つであるセーフティー配列は、PTM分子内で二次構造を形成することができ、それにより、PTMのスプライシングエレメントは、結合ドメインが標的プレmRNAと相互作用するまでスプライシングから遮断される。機能が改善されたCFTRに基づくPTMは、既存のPTMであるCF PTM24に基づいたランダム化された「セーフティーな」PTM結合ドメインのライブラリーをスクリーニングし、蛍光リポーターの発現の修復において最も効率的かつ特異的なものを選択することによりトランス-スプライシングの特異性を向上させること、および(ii)クローン化された非選択のトランス-スプライスされたmRNA産物を配列決定することによりリードセーフティーPTMの特異性を定量化することにより、同定することができる。この方法では、結果として、既存のCFにターゲッティングされるPTM 24よりも著しく性能の向上したPTMが同定され、臨床治療薬の開発の成功の確率が向上する。
本明細書に記載の新規なライブラリースクリーニングアッセイは、効率および特異性の点で最適なPTMを迅速に選択するようにデザインされる。このアッセイは、1時間当たり数千万の細胞を評価し、所望の特性を有する数個の細胞を回収するFACS選別の能力に基づく。このアッセイでは、各形質導入細胞は、2つの蛍光マーカーの読み出しに基づいて個々のPTMの効率および特異性を評価するのに用いる別個の実験となる。これにより、コスト効率のよい方式での数百万のPTMの迅速なスクリーニング、および臨床開発経路に入るのに最適なPTMを同定するためにさらに特性解析され得るリードPTMの選択が、可能となる。
セーフティーPTMターゲッティングCFTRイントロン9のライブラリーは、10〜300bpの範囲の長さのセーフティーステムを生成するようにCF PTM24の結合ドメインに隣接するランダム化配列を組み込むことにより構築される。経験的にデザインされたセーフティーPTMを用いたこれまでの試験に基づけば、この大きさの範囲のステムループが最適であると考えられている。これらのランダム配列は、CMVプロモーターの後に、CF PTM24の結合ドメイン、ランダム化セーフティー配列、スペーサー領域、強力な3'スプライス部位(酵母コンセンサス分岐点、強力なポリピリミジン領域およびスプライス受容部位を含む)、および増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)の'コード配列を含むCF PTM24発現カセットにクローニングされる(図7)。eGFPの下流には、細胞質に達して翻訳され得るPTMについて赤色蛍光タンパク質の発現を指示する内部リボソーム侵入部位(IRES)が続く。特異的トランス-スプライシングは緑色および赤色蛍光の双方のレベルを生じる。非特異的トランス-スプライシン、PTMシス-スプライシングまたは直接的PTM翻訳は赤色蛍光だけに寄与する。最適なPTMは以下に記載されるように高度な緑色/適度な(proportionate)赤色シグナルに基づいて選択される。得られるライブラリーは独立したセーフティーPTMを105〜106の範囲の複雑性を有すると考えられる。
CFイントロン9の一部に結合された5'ヘミeGFP遺伝子を含む標的細胞系を構築する(図8)。この標的細胞系は、これまでに構築されているPTMの機能を評価するのにこれまでに用いられてきたミニ-イントロン9標的配列を含む。増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)のコード配列の5'側半分とCFTRミニ-イントロンを含む標的発現ベクターを293細胞に安定的に組み込む。集団中の各細胞で一貫したレベルのCFTR標的を産生するクローン細胞系を確立する。このことは、トランス-スプライシング効率が標的プレmRNAとPTMの双方の濃度によって異なり得ることから重要である。このアッセイはこれらの変数を最小にするよう構成される。
PTMライブラリーを送達するにはレトロウイルスを使用することができる。この方法は、PTMライブラリーの1つのメンバーを1つの標的細胞に送達するその能力のため、有用である。これらのレトロウイルスは、レトロウイルスの組み込みのランダムな性質による転写における可能性のある影響を最小にするためにニワトリβ-グロビン由来のインスレーター配列を含むようにデザインされる。トランス-スプライシングの特異性と効率の比較のためにリポーター遺伝子の発現を信頼性を持って用いるためには、各細胞で標的とPTM双方に関して一貫した発現レベルを維持することが重要である。異なる細胞間で標的PTMの濃度が異なる場合、読み出しも実質的に影響を受け得る。
PTMセーフティーライブラリーを上記のように作出した標的細胞系へトランスフェクトする。その標的に対するPTMの特異的トランス-スプライシングにより、eGFPの完全なコード配列が生じる。RFP発現は、(i)特異的トランス-スプライシングに加えて、(ii)正確なプレmRNAへのトランス-スプライシング(いずれのリーディングフレームでもよい)および(iii)PTMの直接的翻訳を含む非特異的事象が全て組合せられることによって生じる。リード候補セーフティーPTMは、PTMの特異的トランス-スプライシングを最大にし(高度に緑色)、非特異的発現を最小にする(適度な(proportionate)赤/緑色比)ように選択される。FACS選別を行い、最大レベルのeGFPと適度なレベルのRFPを発現する(また1つのGFPが1つのRFPを産生するはずである)PTMを形質導入された細胞を同定および選択する。これらの細胞を、FACS機器により、適当な増殖培地を含む混合集団としてまたは個々に(96ウェルプレート中など)回収する。このリードセーフティーPTM候補を互いに、そしてCF PTM24(これもスクリーニングに含める)と比較して、さらに特性決定を行うべき1つまたは数個のリードセーフティーCF PTMを同定する。回収された混合集団またはテトラサイクリンの存在下で増殖させたクローン選抜細胞に対して、特異性に関するスクリーニングの第2のラウンドを行う。この条件下では、tetリプレッサーはGFP-CFTR標的の産生を顕著に低下させる。これにより、CFTR標的の不在下でRFP発現の定量化が可能となる。第1ラウンドのスクリーニングでは、正確なトランス-スプライシングによって生じたRFPシグナルが低下しているか、または消失している場合には、最も効率的かつ特異的なPTMと、同じく効率的ではあるが不適当なPTM発現によって生じた若干非特異性の高いRFPシグナルを生じるPTMとを識別するのは困難であると思われる。
リードセーフティーPTMの特異性を次のように定量化し、第II相での機能的試験の最終的なリードPTMを選択する。Tetを用いずに(CFTR標的は存在する)増殖させた細胞から、FACSで選択した10の細胞系に由来する全RNAを単離する。このRNAを、市販のキット(Ambion)を用いる5' RACE法で使用する。得られたcDNAをクローニングする。各リードPTMから5' RACEによって生じた非選択トランス-スプライス産物に由来する96の独立したクローンを配列決定し、特異的および非特異的にトランス-スプライスされた事象の数を定量する。PTM 24の特異性もこの方法によって定量する。次に、リポーター分子を、修復すべきCFTRの部分をコードするエキソンで置換する第II相において、CFTR機能を回復させる能力に関して最も特異的なPTMを評価する。CF患者由来の細胞について、これらのPTMを、Liu, X, Q. Jiang, S.G. Mansfield, M. Puttaraju, Y. Zhang, W. Zhou, M. A. Garcia-Blanco, L.G. Mitchell and J.F. Engelhardt. Functional Restoration of CFTR Chloride Conductance in Human CF Epithelia by Spliceosome-mediated RNA Trans-splicing. Nature Biotechnology 20(1): 47-52, 2002に記載されている、これらの細胞における突然変異を修正し、機能を回復させるその能力に関して試験する。
7.1.ベクターの説明
ベクター骨格は部位特異的な組み込みのためのpcDNA5-FRT/TO、またはランダム組み込みのためのpcDNA5-TO(Invitrogen)からなる。各ベクターは、各々異なるプロモーター/エンハンサーを用いて反対方向でPTMおよび標的プレmRNAを転写するように再操作される。標的の転写レベルはベクター中に存在するTet-on/Tet-off誘導性プロモーターにより制御されるが、PTMの転写の方は種々の継続的に活性なプロモーターにより制御される。後者は標的とPTMプロモーターの間の干渉が小さくなるように慎重に選択する。
標的プレmRNAをコードする配列をCMV誘導性プロモーターの上流にクローニングする。結合ドメイン以外の全てのエレメントを含むPTMカセットを様々なプロモーターの制御下の異なる位置にクローニングする。次に、この構築物をPTM結合ドメインのクローニング部位で線状化し、種々の配列の挿入によりベクターのライブラリーを構築する。次に、これらのプラスミドを293 Flp-In T-Rex 細胞系(Invitrogen)にトランスフェクトして、その細胞系の内因性FRT部位(図9参照)に、またはランダムな部位にPTMおよび標的の単一の統合化されたコピーが組み込まれたものを得る。
以下に記載されるように、本発明のライブラリースクリーニング方法を用い、機能の向上したヒト乳頭腫ウイルス(HPV)に基づくPTMを選択することができる。大容量スクリーニングでは、数百万の異なる配列の組合せを迅速に評価し、最適なPTMを同定するための反復したサイクルで行う選択と組み合わせて、蛍光活性化細胞選別(FACS)の力を利用する。このアプローチはヘミリポーターに基づくものである。しかしながら、この設計にはまた、1回のスクリーニングでトランス-スプライシング特異性を同時に評価することが可能な第2のリポーターも含む。この大容量スクリーニングの2つの主要な構成要素は、(i)意図するプレmRNA標的を発現する細胞系(アッセイ細胞)と(ii)PTMライブラリーである。
ヒト乳頭腫ウイルス16 E6/E7型(HPV-16)遺伝子の上流の非コード配列と連結された緑色蛍光タンパク質(GFP)(Clontech, Palo Alto, Ca.製の「zsGreen」)のコード配列の5'側半分を発現する安定な標的細胞系を確立した。この標的プレmRNAは、開始ATGコドンの後にHPV 16 E6/E7遺伝子のヌクレオチド226〜880を含む、zsGreenコード配列のヌクレオチド1〜210を含む(図10A)。標的プラスミド(pc5'GE67)でトランスフェクトされた細胞由来の全RNAを逆転写(RT)PCRにより分析したところ、GFP機能が検出されなかったこと以外は、予測したシス-スプライスされた産物が得られた。GFP-HPV 16 E6/E7プレmRNA標的のスプライシングパターンを確認する上で、293T細胞において、標的プラスミドをトランスフェクトした後にハイグロマイシン選択を行うことにより、安定した細胞系を確立した。数個の別個のクローンを単離し、RT-PCRにより特性決定した。これらの結果に基づき、最も高度な標的プレmRNA発現を示した1つのクローン(293TE67-12)を大容量スクリーニングのために選択した。トランス-スプライシングはより高濃度の標的の存在下で促進される。
HBV-16 E6/E7標的プレmRNAに向けられたPTMの大容量スクリーニングに用いられるPTMカセットの模式図は図10Bに示されている。このPTMカセットはランダム化結合ドメイン(BD)のクローニングのためのユニークなPmeI制限部位を含むトランス-スプライシングドメイン(TSD)からなる。PmeI部位に隣接して、さらなる試験のためにリードBDを抽出するのに使用できるユニークNheIとSacII部位が存在する。この後ろに、24ヌクレオチドのスペーサー領域、強力な3'スプライス部位(コンセンサス酵母分岐点(BP)、延長されたポリピリミジン領域(19ヌクレオチド長)、スプライス受容部位(CAGジヌクレオチド)を含む)、HBV-16 E6/E7標的プレmRNAには存在しないzsGreen蛍光タンパク質の残りの3'コード配列(487ヌクレオチド)、その後に脳心筋炎ウイルス(ECMV)内部リボソーム侵入部位(IRES)およびDsRedExpress蛍光タンパク質の完全なコード配列(Clontech)が続く。後者はトランス-スプライシング特異性の評価に用いられる。意図したプレmRNA標的とPTMの間の特異的トランス-スプライシングにより、緑色蛍光および適度な(proportionate)量の赤色蛍光の両方が生じる。非標的mRNAに対する非特異的トランス-スプライシングまたはPTMの直接的翻訳は赤色蛍光しか生じない。
HPV-16 E6/E7遺伝子配列(ヌクレオチド79〜1071、全部で992bp)を超音波処理により小片に断片化し、3%アガロースゲルで分画した。50〜250ヌクレオチドのサイズ範囲の断片をゲル精製し、溶出させた。断片の末端をクレノウ酵素を用いて修復し、上記のPTMカセット中へクローニングした(図10B)。これらのライブラリーコロニーをPCR分析したところ、組換え効率>95%が示され、50〜250ヌクレオチドの様々な大きさのBDを有する最大106個の独立したクローンのライブラリーが作製された。この一次ライブラリーを細菌内で増幅させ、PTMのスクリーニングに用いた。このPTMライブラリーを細菌プロトプラストを用いてアッセイ細胞に送達した。細胞間で比較的一定した標的発現を維持することが重要である。細胞間で標的濃度を変えること、または細胞に1を超えるPTMライブラリーを送達することにより、異なる細胞間のトランス-スプライシングのレベルを効率的に評価できるかどうかは影響を受け得る。
HBV-16 E6/E7標的プレmRNAに向けられるPTMの、FACSに基づく選択戦略は図10Cに示されている。まず、PTMライブラリーを、プレmRNA標的を発現するアッセイ細胞にトランスフェクトした。24時間後、FACSを用い、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現に関して細胞を分析した。プレmRNA標的とPTMの間の特異的トランス-スプライシングの結果、GFPおよび適度なレベルの赤色蛍光タンパク質(RFP)が発現する。緑色蛍光の強度を特異的トランス-スプライシング効率の指標として用いる。誤った標的プレmRNAへのPTMの非特異的トランス-スプライシング、またはPTMの直接的発現は、RFPの発現は引き起こすが、GFPの発現は引き起こさない。本スクリーニングにおけるリードPTMの選択には、発現パターンの違い(すなわち、高度のGFPおよび適度なRFPに対して、高度のRFP発現)を利用した。図10Cに示すように、高度にGFPと適度にRFPを発現する細胞を回収し、高度にRFPを発現する細胞を排除した。全長GFP-IRES-全長RFPを発現する陽性対照プラスミドを、高度の緑色と適度な赤色の細胞を選択するための領域(ゲート)を決定するための参照として用いた。陽性対照は100%のトランス-スプライシング効率を有し、非特異的活性をもたない理想的なPTMに相当する。対照PTM FACSプロフィールを参照として用い、リードPTMを回収した。これらのPTMを、HIRT DNA抽出とその後のDpn I処理によりレスキューして、インプットライブラリーPTMを排除した。ラウンドIから得られた富化PTMライブラリーを細菌内で増幅させ、プロトプラストを調製し、スクリーニングにおける次のラウンドにおいて標的細胞のトランスフェクションに用いた。このトランスフェクションサイクルの後、緑色/赤色の比率が十分向上するまでFACS選択を繰り返した。この選択プロセスを繰り返す主な目的はノイズと偽陽性を最小化し、かつ/または排除するためであった。例えば、高度なGFP発現が、細胞当たり1を超えるPTMライブラリーメンバーが存在するためか、または標的発現が変動するために生じるのであれば、反復したサイクルで選択を行うことにより、次のラウンドで偽陽性は排除されるはずである。最後に、所望の緑色/赤色比率が達成されたところで、個々のクローンを単離し、トランス-スプライシングの特異性と効率を評価した。
HPV PTM-BDライブラリーは、ヘミGFP-HPV-16 E6/E7プレmRNA標的を発現するアッセイ細胞を用いて試験した。図11A−Bは、2ラウンドの選択から得られた結果を示し、これらの選択は、最初のライブラリー(R0)に比べ、2回の富化ラウンド後(R2)に機能レベルに約5〜7倍の向上をもたらした。GFP+細胞の割合%を陽性細胞集団だけを考慮して算出した(図11B)。エンドポイントとして平均蛍光値を用いた場合にも同様の結果が得られた。予測されたとおり、R0において99%を超えるPTMライブラリーが著しいRFP発現を生じ、かつ、GFP発現はほとんど生じないか、または全く生じなかったが、このことはライブラリー中の大部分のBDが、(a)無効なトランス-スプライサーであるか、(b)誤った配向であるか、(c)非標的プレmRNAへと非特異的にトランス-スプライスされたか、または(d)PTM BDまたはベクター骨格およびPTM受容部位内でシス-スプライシングによって直接的に発現されたかのいずれかであったことを示す。機能的レベルでの富化に加えて、本発明者らは、R2に比べてR0からの緑色/赤色比率の顕著な逆転も観察した。すなわち、富化ライブラリーの4.9に対して最初のライブラリーでは0.1の緑色/赤色比率が得られた(図11Aの挿入図)。R0では、いくつかのGFP発現細胞が見られるとしても、ほとんどの細胞で極めて高いRFP発現が検出された。しかし、2ラウンドの選択後、R2では全く異なるパターンが観察され、すなわち、適度なレベルでGFP/RFPを発現し、かつより高度にGFPを発現する細胞がより多く観察された(図11B)。この観察は、特異的トランス-スプライシング(GFPコード配列の回復)の効率を測定するための逆転写(RT)リアルタイム定量的PCR(RT-qPCR)分析により、分子レベルで確認した。全細胞集団(GFP+と陰性細胞の双方を含む)からRNAを単離し、全長GFP mRNAの量をRT-qPCRにより定量した。特異的トランス-スプライシングを測定するためには、標的とPTM特異的プライマーを用いた。全シス-、トランス-および非スプライス標的RNAは、5'zsGreenエキソンに特異的なプライマーを用いて測定した(図10A−B)。このqPCR結果に基づけば、最初のライブラリー(R
0)に比べ富化ライブラリー(R2)ではトランス-スプライシング効率において約6〜7倍の向上が検出された(図11B)。これらのqPCR結果はFACS(機能的)結果と密接に一致する。
反復選択の結果は、集団レベルでのトランス-スプライシング効率における有意な向上を示した。またスプライシング効率は、個々のPTMに関しても試験した。富化ライブラリー(R2)からの20個のランダムなPTMおよび最初のライブラリー(R0)からの20個のランダムなPTMを、並行トランスフェクションによるさらなる試験のために選択した。GFP-HBV-16 E6/E7標的プレmRNAを発現する安定な細胞を、これらのライブラリーから単離した選択されたPTMによってトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、FACSにより細胞をGFPの発現に関して分析した。予測されたように、最初のライブラリーでは10%に過ぎないのに対し、富化ライブラリーでは90%を超えるPTMがバックグラウンドを超えるトランス-スプライシング活性を示した(図12A)。これらの結果を分子レベルでさらに確認した。個々のPTMでトランスフェクトされた細胞からの全RNAを単離し、上記のようにRT-qPCRによりトランス-スプライシング効率を測定した。このqPCRの結果を、PTM発現を定量化することによりトランスフェクション効率に関して標準化した。トランスフェクション効率に関して補正したところ、qPCRの結果から、トランス-スプライシングのレベルがFACSの結果(GFPの産生=機能)と同等であることが証明された。機能レベルでより高いトランス-スプライシング効率を示したPTMはまた、分子レベルでもトランス-スプライシングにおいて効率が高かった。これは最初のライブラリーからのPTMについても富化ライブラリーからのPTMについてもその通りであった。
本発明は、高いトランス-スプライシング特異性および効率を有する最適なPTMを単離するためのツールとしての大容量スクリーニングを提供する。5'RACE技術を用いてトランス-スプライスされた分子のライブラリーを構築し、次いで配列解析を用うことにより、トランス-スプライシングの特異性を定量した。特異的にトランス-スプライスされたmRNAの数に対する非特異的にトランス-スプライスされたmRNAの数を定量した。トランス-スプライシングの特異性を評価するためには、適度なGFP/RFPを産生する富化画分(R2)から、また、濃赤色領域(大部分は高度にRFPを発現する細胞を含む)から回収した細胞より全RNAを抽出し、5'RACE ライブラリーの構築に用いた。特異的トランス-スプライシングについて96個の独立したクローンをスクリーニングした予備的なPCR結果は、高度にRFPを発現する細胞を用いて構築したライブラリーに比べ、富化ライブラリーでは少なくとも10倍のトランス-スプライシング特異性の増強を示した。これらの結果は、IRESにより駆動される第2のリポーターが、高い特異性および効率を示すPTMを選択する上で有用であり得ることを示唆している。さらに、5'RACEの結果は、ライブラリーの反復ラウンドで行う選択が最終的なライブラリー中のスプライスされていないPTMの数を減少させるか、または排除することも示している。最後に、ここに示した結果は、高度な複雑性を示すPTMライブラリーの大容量スクリーニングが、潜在的リードPTMを同定する上で有効であることを明らかに示している。
Claims (12)
- トランス-スプライシング反応を媒介し得るプレ-トランス-スプライシング分子(PTM)をランダム化PTMから同定する方法であって、
(I) ランダム化PTMの発現ライブラリーと標的プレmRNAを発現する細胞とを、トランス-スプライシング反応を媒介し得る1以上のPTMの存在下でトランス-スプライシング反応が起こる条件下で、接触させる工程であって、ここで、前記ランダム化PTMが(i)標的結合ドメイン;(ii)3'スプライス領域および/または5'スプライス領域;(iii)第1のリポーター分子の一部をコードする少なくとも1つの核酸配列であって、トランス-スプライシング反応の結果、完全な第1のリポーター分子をコードするキメラRNA分子が形成される、上記核酸配列;(iv)第2の異なるリポーター分子をコードする核酸配列;ならびに(v)内部リボソーム侵入部位(IRES)であって、第2のリポーター分子をコードする核酸配列の発現がIRESによって指示される、上記IRESを含み、前記ランダム化PTMは、標的結合ドメイン、3'スプライス領域および5'スプライス領域、および存在する場合にはスペーサー領域、および存在する場合にはセーフティー配列、からなる群より選択される少なくとも1つのエレメント中にランダム化された核酸配列を含む、前記工程、
(II) 第1および第2のリポーター分子を発現する細胞を選択する工程であって、ここで、第1のリポーター分子の発現が、選択された細胞においてトランス-スプライシング反応を媒介し得るPTMが存在することを示す前記工程、および
(III) 選択された細胞において発現されたPTMを同定する工程、
を含む前記方法。 - 前記ランダム化PTMが、スプライス領域を標的結合ドメインから隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ランダム化PTMがセーフティー配列をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記リポーター分子が、(i)生物発光分子;(ii)蛍光分子;(iii)受容体分子;(iv)酵素分子;および(v)タンパク質/ペプチドタグからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ランダム化PTMが、標的プレmRNAに相補的な核酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 蛍光細胞選別によってPTMを発現する細胞を選択する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- トランス-スプライシング反応を媒介し得るPTMを同定するためのランダム化PTMをコードするプレ-トランス-スプライシング分子(PTM)発現ライブラリーであって、前記ランダム化PTMが(i)標的結合ドメイン;(ii)3'スプライス領域および/または5'スプライス領域;(iii) 第1のリポーター分子の一部をコードする少なくとも1つの核酸配列であって、トランス-スプライシング反応の結果、完全な第1のリポーター分子をコードするキメラRNA分子が形成される、上記核酸配列;(iv)第2の異なるリポーター分子をコードする核酸配列;ならびに(v)内部リボソーム侵入部位(IRES)であって、第2のリポーター分子をコードする核酸配列の発現がIRESによって指示される、上記IRESを含み、前記ランダム化PTMは、標的結合ドメイン、3'スプライス領域および5'スプライス領域、および存在する場合にはスペーサー領域、および存在する場合にはセーフティー配列、からなる群より選択される少なくとも1つのエレメント中にランダム化された核酸配列を含む、前記PTM発現ライブラリー。
- 前記ランダム化PTMが、スプライス領域を標的結合ドメインから隔てるスペーサー領域をさらに含む、請求項7に記載の発現ライブラリー。
- 前記ランダム化PTMがセーフティー配列をさらに含む、請求項7または8に記載の発現ライブラリー。
- リポーター分子が、(i)生物発光分子;(ii)蛍光分子;(iii)受容体分子;(iv)酵素分子;および(v)タンパク質/ペプチドタグからなる群から選択される、請求項7〜9のいずれか1項に記載の発現ライブラリー。
- 前記ランダム化PTMが、標的プレmRNAに相補的な核酸配列を含む、請求項7〜10のいずれか1項に記載の発現ライブラリー。
- その細胞が請求項7〜11のいずれか1項に記載のプレ-トランス-スプライシング分子(PTM)発現ライブラリーのメンバーを含む、哺乳類細胞の培養物。
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