SK78598A3 - Complementary adenoviral vector systems and cell lines - Google Patents

Complementary adenoviral vector systems and cell lines Download PDF

Info

Publication number
SK78598A3
SK78598A3 SK785-98A SK78598A SK78598A3 SK 78598 A3 SK78598 A3 SK 78598A3 SK 78598 A SK78598 A SK 78598A SK 78598 A3 SK78598 A3 SK 78598A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
adenoviral vector
adenoviral
vector
region
genome
Prior art date
Application number
SK785-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Imre Kovesdi
Douglas E Brough
Duncan L Mcvey
Joseph T Bruder
Alena Lizonova
Original Assignee
Genvec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genvec Inc filed Critical Genvec Inc
Publication of SK78598A3 publication Critical patent/SK78598A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4712—Cystic fibrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Design And Manufacture Of Integrated Circuits (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Semiconductor Memories (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)

Description

Komplementárne adenovírusové vektorové systémy a bunkové línie
Oblasť techniky
Vynález opisuje rekombinantné, viacnásobne replikačne deficientné adenovírusové vektory, ktoré majú intergénovú sekvenciu prinajmenšom v jednej z replikačne deficientných adenovírusových oblastí a ďalej sa tu opisuje terapeutické použitie takých vektorov.
Doterajší stav techniky
Počas zimy a jara na prelome rokov 1952 až 1953 Rowe a jeho kolegovia z Národného ústavu zdravia (NIH) získali adenoidy, ktoré boli chirurgicky odstránené malým deťom z oblasti Washington D.C., a pripravili z nich tkanivovú kultúru (Rowe et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953)). Po niekoľkých týždňoch rad kultúr začal vykazovať progresívnu degeneráciu charakterizovanú rozkladom epiteliálnych buniek. Tento cytopatický účinok sa mohol rozširiť filtrovanými kultivačnými roztokmi, ktoré sa používajú na založenie tkanivových kultúr ľudských bunkových línií.· Cytopatické agens sa pomenovalo “adenoidné degenerujúce” u(Ad) agens. Meno “adenovírus” sa stalo bežným pre tieto agens. Po tomto počiatočnom objave nasledovali ďalšie objavy radu prototypov kmeňov adenovírusu, z ktorých niektoré spôsobujú respiračné ochorenia (Rowe et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 84, 570-573 (1953); Dingle et al., Am. Rev. Respir. Dis., 97, 1-65 (1968); zhrnuté v publikácii Herwitz, “Adenoviridae and Their Replication,” vo Virology (Fields et al., eds, Raven Press Ltd., New York, NY, 2nd ed., 1990), pp. 1679-1721).
Z ľudí sa izolovalo vyše 40 adenovírusových subtypov a vyše 50 ďalších subtypov sa izolovalo z iných cicavcov a vtákov (Ishibishi et al., “Adenoviruses of animals” v The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plénum Press, New York, NY, pp. 497-562 (1984); Strauss, “Adenovirus infections in humans,” v The Adenoviruses, Ginsberg, ed.. Plénum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984)). Všetky tieto subtypy patria do čeľade Adenoviridae, ktorá sa rozdeľuje do dvoch rodov, menovite Mastadenovims a Aviadenovirus.
Všetky adenovírusy majú podobnú morfológiu a štruktúru. U ľudí však adenovírusy majú rôzne imunologické vlastnosti a preto sa rozdeľujú do sérotypov. Intenzívne sa študovali dva ľudské sérotypy adenovirusu, menovite Ad2 a Ad5. Z týchto štúdií sa získala väčšina všeobecných informácií o adenovírusoch. Genómy Ad2 a Ad5 sa kompletne sekvenovali a dostupné sú aj sekvencie vybraných oblastí genómov z iných sérotypov. Medzi sérotypmi je organizácia adenovirusového genómu konzervatívna, čo znamená, že špecifické funkcie sú umiestnené na podobných miestach.
Všeobecne adenovírusy nemajú obal, tvoria pravidelné dvadsaťsteny s priemerom 65 až 80 nanometrov, ktoré obsahujú vonkajší kapsid a vnútorné jadro. Kapsid je tvorený 20 trojuholníkmi alebo fazetami a 12 vrcholmi (Horne et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Fazety obsahujú hexóny a vrcholy obsahujú pentóny. Z každého vrcholu vyčnieva vlákno. Vedľa hexónov, pentónov a vlákien sa tu nachádza osem vedľajších štruktúrnych polypeptidov, pričom presná poloha väčšiny z nich nie je jasná. Jeden minoritný polypeptidový komponent, menovite polypeptid IX, sa viaže v polohách, kde môže stabilizovať spojenie hexón-hexón, čo sa uvádza ako “skupina deviatich” centra každej fazety (Furcinitti et al., EMBO, 8, 3563-3570 (1989)). Verí sa, že vedľajšie polypeptidy VI a VIII stabilizujú kontakty hexón-hexón medzi susednými fazetami. Minoritný polypeptid IIIA, o ktorom sa vie, že sa nachádza v oblastiach vrcholov, viaže kapsid a jadro, ako naznačuje Stewart et al. v publikáciii Celí, 67, 145-154 (1991)).
Vírusové jadro obsahuje lineárnu dvojreťazcovú molekulu DNA s obrátenými terminálnymi repeticiami (ITR), ktorých dĺžka u rôznych izolátov kolíše od 103 párov báz do 163 párov báz (Garon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2391-2394 (1972); Wolfson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol. Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 4371-4386 (1977); a Tooze, DNA Tumor Víruse, 2d ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory. pp. 943-1054 (1981)). Oblasť ITR zahrnujú počiatky replikácie DNA (Garon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 23912394 (1972); Wolfson et al., Wolfson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3054-3057 (1972); Arrand et al., J. Mol. Biol., 128, 577-594 (1973); Steenberg et al., Nucleic Acids Res., 4, 43714386 (1977)).
Vírusová DNA je spojená so štyrmi polypeptidmi, menovite V, Vil, μ, a terminálny polypeptid (TP). Terminálny polypeptid s veľkosťou 55 kilodaltona je kovalentne pripojený k 5'koncom DNA cez dCM.P (Rekosh et al.. Celí, I 1, 283-295 (1977); Robinson et al., virology.
56, 54-69 (1973)). Ďalšie tri polypeptidy sú nekovalentne viazané s DNA a stáčajú sa spôsobom, aby pasovali do malého objemu kapsidu. DNA sa balí do štrukturálne podobných celulárnych nukleozómov, čo je zrejmé z paternu štiepenia nukleázou (Corden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 401-404 (1976); Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979); Mirza et al., Biochim. Biophys. Acta, 696, 76-86 (1982)).
Adenovírus infikuje bunku tak, že sa vlákno zachytí na špecifickom receptore na bunkovej membráne (Londberg-Holm et al., J. Virol., 4, 323-338 (1969); Morgan et al., J. Virol., 4, 777-796 (1969); Pastan et al., “Adenovirus entry into cells: some new observations on an old problém,” v Concepts in viral Pathogenesis, Notkins et al., eds., Springer-Verlag, New York, NY, pp. 141-146 (1987)). Pentónová báza sa potom viaže na receptor adenovírusového integrínu. Receptor viažúci vírus migruje z plazmatickej membrány do klatrinom potiahnutých jamiek, ktoré tvoria endocytické vrecká alebo receptozómy, kde hodnota pH klesá na 5,5 (Pastan et al., Concepts in Viral Pathogenesis, Notkins and Oldstone, eds. Springer-Verlag, New Yourk. pp. 141-146 (1987)). Verí sa, že pri poklese pH sa zmení konfigurácia povrchu vírusu, čo vedie k ruptúre receptozómu a vírus sa uvoľní do cytoplazmy bunky. Vírusová DNA nie je čiastočne potiahnutá, čo znamená, že v cytoplazme čiastočne neobsahuje asociované proteíny, zatiaľ čo je transportovaná do jadra.
Keď vírus dôjde k jadrovým pórom vírusová DNA vstúpi do jadra, pričom väčšina proteínov zostane v cytoplazme (Philipson et al., J. Virol., 2, 1064-1075 (1968)). Avšak vírusová DNA nie je celkom bez proteínov, pretože najmenej časť vírusovej DNA je asociovaná s najmenej štyrmi vírusovými polypeptidmi, menovite V, Vil, TP a μ, a premieňa sa na vírusový DNAbunkový histónový komplex (Tate et al., Nucleic Acids Res., 6, 2769-2785 (1979)).
Cyklus od infekcie buniek k produkciii vírusových partikúl trvá jeden až dva dni a vedie k produkcii približne až 10 000 infekčných partikúl na bunku (Green et al., Virology, 13, 169-176 (1961)). Proces infekcie adenovírusu je rozdelený do dvoch fáz skorej (E) a neskorej (L), ktoré sú oddelené replikáciou vírusovej DNA, hoci k niektorým javom dochádza ako počas skorej tak aj neskorej fázy. Ďalšie delenie sa uskutočnilo za účelom opísania dočasnej expresie vírusových génov.
Počas skorej fázy sa syntetizuje vírusová mRNA, ktorá zahrnuje minoritnú časť celkovej RNA prítomnej v bunke, z oboch reťazcov adenovirusovej DNA, ktorá je prítomná v bunkovom jadre. Prepisuje sa najmenej päť oblasti označených El, E2, E3, E4 a MLP-LI (Lewis et al., Celí, 7, 141-151 (1976); Sharp et al., Virology, 75, 442-456 (1976); Sharp, “Adenovirus transcription” v The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plénum Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984)). Každá oblasť má najmenej jeden odlišný promótor a umožňuje vznik viacerých druhov mRNA.
Produkty skorých oblastí (E) po prvé slúžia ako regulátory expresie iných vírusových komponentov, po druhé sú zahrnuté do zastavenia replikácie bunkovej DNA a syntézy proteínu a po tretie sú nutné pri replikách DNA. Komplikované série javov, ktoré regulujú skorú transkripciu mRNA začínajú pri expresii určitých bezprostredných skorých oblastí, ktoré zahrnujú El A, L1 a gén s veľkosťou 13,5 kilodaltonov (Sharp, “Adenovirus transcription” v The Adenoviruses, Ginsberg, ed.. Plénum Press, New York, NY, pp. 173-204 (1984); Horwitz (1990) citácia uvedená vyššie)). Expresia oneskorených skorých oblastí E1B, E2A, E3 a E4 závisí od produktov génu E1A. Tri promótory, promótor E2 v 72 map jednotkách (mu), promótor proteínu IX a promótor IVa, sú zosilnené počiatkom replikácie, ale nie sú od nej závislé (Wilson et al., Virology, 94, 175-184 (1979)). Ich expresia charakterizuje intermediárnu fázu expresie vírusového genómu. Výsledok kaskády expresie skorého génu je počiatok replikácie vírusovej DNA.
Iniciácia replikácie vírusovej DNA sa javí byť podstatnou pre vstup do neskorej fázy. Neskorá fáza vírusovej infekcie je charakterizovaná produkciou veľkého množstva vírusových štruktúrnych polypeptidov a neštruktúrnych proteinov, ktoré sa zúčastňujú zostavenia kapsidu. Hlavný neskorý promótor (MLP) sa stáva plne aktívnym a produkuje transkripty, ktoré začínajú v 16,5 mu a končia blízko konca genómu. Post-transkripčné spracovanie tohto dlhého transkriptu dáva vznik piatim rodinám neskorej mRNA, ktoré sa označujú ako L1 až L5 (Shaw et al.. Celí, 22, 905-916 (1980)). Mechanizmy, ktoré riadia prechod zo skorej do neskorej fázy a vedú k tak dramatickému posunu v transkripčnom využití nie sú jasné. Požiadavky pre replikáciu DNA môžu byť c/s-vlastnosti templátu DNA, pretože neskorá transkripcia sa nevyskytuje u superinfikujúcich vírusov v dobe, kedy je aktívna neskorá transkripcia primárne infikujúcich vírusov (Thomas et al., Celí, 22, 523-533 (1980)).
Isté rekombinantné adenovírusové vektory sa používali v génovej terapii. Použitie rekombinantného adenovírusového vektora na prenos jedného alebo viacerých rekombinantných génov schopných cieľového zavádzania génu alebo génov do orgánu, tkaniva alebo buniek za účelom liečby, obchádza problém zavedenia, ktorý sa vyskytuje vo väčšine foriem somatickej gé novej terapie. Rekombinantné adenovírusové vektory pre expresiu adenovírusových proteinov nepožadujú proliferáciu hostiteľských buniek (Horwitz et al., vo Virology, Raven Press, New York, 2, 1679-1721 (1990); a Berkner, BioTechniques, 6, 616 (1988)). Ak chorým orgánom, ktorý vyžaduje liečbu, sú pľúca, potom použitie adenovírusu ako vektora genetickej informácie má výhodu, že adenovírus je normálne pre respiračný epitel trofický (Straus, v Adenoviruses, Plénum Press, New York, pp. 451-496 (1984)),
Ďalšie výhody adenovírusov ako potencionálnych vektorov pre ľudskú génovú terapiu sú nasledujúce: (i) zriedkavá rekombinácia, (ii) adenovírusové infekcie nie sú spojované s ľudským maligným ochorením, navzdory bežným ľudským infekciám s adenovírusmi; (iii) adenovirusový genóm (ktorý je lineárna, dvojreťazcová DNA) sa môže manipulovať tak, aby pojal cudzie gény, ktorých veľkosť sa pohybuje v rozmedzí 7,0 až 7,5 kb; (iv) DNA adenovirusového vektora sa nezačleňuje do chromozómu bunky, tak jej účinok nie je permanentný a a nie je pravdepodobné, že interferuje s normálnou bunkovou funkciou; (v) adenovírus môže infikovať bunky, ktoré sa nedelia alebo terminálne diferencované bunky, ako sú bunky mozgu a pľúc; a (vi) živý adenovírus, ktorého podstatná charakteristika je schopnosť replikácie, sa používa na vakcináciu ľudí (Horwitz et al., v Virology, Raven Press, New York, 2, 1679-1721 (1990); Berkner et al., J. Virol., 61, 1213-1220 (1987); Straus “Adenovirus infections in humans,” v Adenoviruses, Ginsberg, ed. Plénum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984); Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267 (1986); a Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)).
Ak sa adenovírusy používajú ako expresívne vektory, potom sa cudzie gény začleňujú do dvoch hlavných oblastí adenovirusového genómu, menovite oblasti El a E3 a tak vznikajú deficitné adenovírusy a od nich odvodené vektory. Ak dôjde k inzercii do oblasti El vzniká defektný progén, ktorý vyžaduje rast v komplementárnych bunkách alebo prítomnosť intaktného pomocného vírusu, ktorý buď nahradzuje funkciu poškodenej alebo neprítomnej oblasti El (Berkner et al., BioTechniques, 6, 616 (1988); Davidson et al., J. virol., 61, 1226-1239 (1987); a Mansour et al.. Mol. Celí Biol., 6, 2684-2694 (1986)). Táto oblasť genómu sa najčastejšie používa na expresiu cudzorodých génov.
Gény začlenené do oblasti El sú riadené rôznymi promótormi a väčšina z nich produkuje veľké množstvo produktu cudzieho génu v závislosti od expresívnej kazety. Tieto adenovírusové vektory však nebudú rásť v nekomplementárnych bunkových líniách. Príklady takých bunkových línii zahrnujú HEK-293 (Graham et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 637-650 (1975)), W162 (Weinberg et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5383-5386 (1983)) a gMDBP (Kleissig et al., Mol. Celí Biol., 4, 1354-1362 (1984); Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992)).
V porovnaní oblasť E3 nie je podstatná pre rast vírusu v tkanivovej kultúre (to je produkciu vírusu) a zámena tejto oblasti expresívnou kazetou s cudzím génom spôsobuje, že vírus produktívne rastie v nekomplementárnej bunkovej línii. Napríklad inzercia a expresia povrchového antigénu hepatitídy B do oblasti E3 s následnou inokuláciou a tvorením protilátok v morčatách sa opisuje v publikácii Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4626-4630 (1987)).
Problém spojený s použitím deficientných adenovírusových vektorov je ten, že limitujú množstvo použiteľného miesta v adenovirusovom genóme pre inzerciu a expresiu cudzieho génu. Vďaka podobnostiam alebo presahu vo vírusových sekvenciách obsiahnutých v deficitných adenovírusových vektoroch a v komplementárnych bunkových líniách, ktoré v súčasnej dobe existujú, prebieha rekombinácia a vznikajú v nich replikačné komponenty vírusu a tak sa pomnožuje zásobný roztok vektora. Tento jav spôsobuje, že zásobný roztok vektora je nepoužiteľný na účely génovej terapié.
Viacnásobne replikačne deficitné vektory (vektory deficitné najmenej vo dvoch oblastiach, ktoré sú nutné pre produkciu vírusu) vznikli na základe úsilia obísť tento problém (prihláška PCT patentu WO 94/28152 (Imler et al.)). Také vektory, ktoré majú najmenej jednu z delécií v oblastiach E2 alebo E4, však vykazujú redukovanú expresiu vlákna a redukovaný vírusový rast v komplementárnych bunkových líniách. Predpokladá sa, že oblasť E4 má určitú úlohu pri replikácii vírusovej DNA, syntéze neskorej mRNA, pri zastavení syntézy hostiteľského proteínu a usporiadaní .vírusu. Pri pokuse korigovať rast vírusových vektorov, ktorý sú nedostatočné v oblastiach E4 v komplementárnych bunkových líniách, vznikli adenovírusové vektory, ktoré majú delécie v E4 a ktoré držia podstatné otvorené Čítacie rámce oblasti E4, špecificky ORF6 alebo ORF3 (prihláška patentu PCT WO 94/12694 (Gregory et al.,)).
Zatiaľ čo otvorený čítací rámec 3 alebo 6 je schopný poskytnúť funkcie E4 nutné pre propagáciu vírusu in vitro, produkt ORF 3 ovplyvňuje redukovanú účinnosť (Armentano et al., Human Gene Therapy, 6, 1343-1353 (1995)). Opisuje sa niekoľko vlastností spojených s ORF, ktoré môžu fungovať in vivo (napr. Armentano et al., Human Gene Therapy, 6, 1343-1353 (1995)). Napríklad produkt ORF 6/7 sa podieľa na aktivácii promótora E2A prostredníctvom tvorby komplexu s faktorom bunkovej transkripcie' E2f a jeho stimulácie. Podobne 0RF3 aj OR.F6 sa podieľajú na regulácii intrónovej inklúzie/exklúzie pri zostrihu hlavnej neskorej trojdielnej vedúcej sekvencie. Ani ORF 6 však nie je schopný zaistiť produkciu vírusu divokého typu u mutanta s deléciou adenovírusovej E4. Adenovirusový E ľ E4‘ delečný mutant obsahujúci ORF 6 v porovnaní s adenovírusom, ktorý nemá deléciu oblasti E4, konkrétne vykazoval desaťnásobné zníženie syntézy vlákna, oneskorenú replikáciu vírusu a pomalšie tvorenie plakov in vitro a zníženú a oneskorenú replikáciu vírusu in vivo (Armentano et al., Human Gene Therapy, 6, 1343-1353 (1995)).
Účelom vynálezu je pripraviť viacnásobne replikačne deficitné adenovirusové vektory, ktoré sa môžu prispôsobiť na začlenenie a expresiu relatívne veľkého kusa cudzorodej DNA, zatiaľ čo sú schopné sa uspokojivo replikovať in vitro, t.j. produkovať vírus. Ďalej je účelom vynálezu nájsť rekombinanty takých viacnásobne deficitných adenovírusových vektorov a terapeutické metódy, obzvlášť spojené s génovou terapiou, vakcináciou a podobne, zahrnujúce použitie takých rekombinantov. Tieto a iné predmety a výhody vynálezu sú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu vynálezu.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu sú viacnásobne replikačné deficitné adenovirusové vektory a komplementárne bunkové línie. Viacnásobne replikačné deficitné adenovirusové vektory majú intergénovú sekvenciu v najmenej jednej z replikačne deficitných adenovírusových oblasti. Tieto viacnásobne replikačné deficitné adenovirusové vektory môžu umožňovať začlenenie a expresiu väčších fragmentov cudzorodej DNA než ako je možné u jednoducho deficitných adenovírusových vektorov, a pritom poskytujú podobnú expresiu vlákna a rast vírusu ako u jednoducho replikačne deficitných adenovírusových vektorov. Vynález tiež opisuje rekombinantné viacnásobne replikačne deficientné adenovirusové vektory a terapeutické metódy napríklad spojené s génovou terapiou, vakcináciou a podobne, zahrnujúce použitie uvedených rekombinantov.
Vynález okrem iného opisuje viacnásobne replikačne deficientné adenovirusové vektory na klonovanie génu a expresiu. Viacnásobne replikačne deficientné adenovirusové vektory podľa vynálezu sa odlišujú od súčasne dostupných jednoducho replikačne deficitných adenovírusových vektorov tým, že sú deficitné najmenej vo dvoch oblastiach adenovirusového genómu, obzvlášť vo dvoch takých oblastiach, nutných pri produkcii vírusu, čo umožňuje takým vektorom prijať a exprimovať väčšie kusy cudzorodej DNA. Termín “cudzia DNA” alebo “cudzorodá DNA” znamená ľubovoľnú sekvenciu DNA začlenenú do vektora (to je do transferového vektora) podľa vynálezu, ktorá je pre adenovírusový genóm cudzia. Taká cudzorodá DNA môže tvoriť gény, časti génov alebo ľubovoľné iné sekvencie DNA, zahrnujúce, avšak bez obmedzenia, sekvencie, ktoré kódujú RNA, anti-sense RNA a/alebo polypeptidy. Viacnásobne replikačne deficitné adenovírusové vektory podľa vynálezu sa tiež líšia od nedávno objavených viacnásobne replikačne deficitných adenovírusových vektorov v tom, že sú schopné dosiahnuť expresiu vlákna a rast vírusu v komplementárnej bunkovej línii podobne ako u jednoducho replikačne deficitného vektora vďaka prítomností intergénovej sekvencie najmenej v jednej deficitnej adenovírusovej oblasti, ktorá môže spôsobiť zablokovanie transkripcie a tak zabrániť čítaniu bez zastávky.
Oblasť adenovírusového genómu obsahuje jeden alebo viac génov. Také gény kódujú génové produkty, ktoré sprostredkovávajú, umožňujú, spôsobujú alebo sú rôznymi komponentami alebo aktivitami adenovírusu, ako je zachytenie, penetrácia, nepotiahnutie, replikácia, jadrový proteín, hexón, vlákno, s hexónom spojený proteín a podobne. Jedným účinkom deficitnej oblasti môže byť napríklad neschopnosť adenovírusu sa pomnožovať, čo môže zahrnovať ľubovoľné alebo všetky vyššie menované komponenty alebo aktivity. Tieto vyššie menované komponenty alebo aktivity sa tu uvádzajú ako funkcie génov.
Nedostatočnosť génu alebo funkcie génu, to je deficitný gén, oblasť génu alebo oblasť, tu znamená deléciu génového materiálu vírusového génu, ktorá vedie k poškodeniu alebo zrušeniu funkcie génu, ktorého sekvencia DNA je deletovaná celá alebo sčasti, a k uvoľneniu priestoru alebo schopnosti vírusového genómu pre inzerciu DNA, ktorá je pre vírusový genóm cudzia. Taká nedostatočnosť sa môže vyskytovať v génoch, ktoré sú podstatné alebo nepodstatné pri propagácii adenovírusového vektora v tkanivovej kultúre nekomplementárneho bunkového hostiteľa; prednostne chýba u aspoň jedného, najmä u aspoň dvoch deficientných génov vírusových vektorov podľa vynálezu gén, ktorý je podstatný pri propagácii vírusu.
Ako zdroj DNA pri generovaní viacnásobne deficitných adenovírusových vektorov môže byť použitý ľubovoľný subtyp, zmes subtypov alebo chimérický adenovírus. Avšak pretože genóm Ad5 je celkom sekvenovaný, je vynález opísaný vzhľadom na sérotyp Ad5.
Adenovírusový vektor podľa vynálezu je vhodne viacnásobne replikačne deficientný. To znamená, že je deficitný najmenej vo dvoch oblastiach nutných pri produkcii vírusu (to je replikách vírusu in vitro). Také oblasti zahrnujú skorú oblasť 1 (El), skorú oblasť 2A (E2A), skorú oblasť 2B (E2B), skorú oblasť 4 (E4), neskorú oblasť 1 (Ll), neskorú oblasť 2 (L2), neskorú oblasť 3 (L3), neskorú oblasť 4 (L4) a neskorú oblasť 5 (L5). Hoci sa má za to, že oblasť El zahrnuje skorú oblasť ΙΑ (E1A) a skorú oblasť 1B (E1B), nedostatočnosť v buď jednej alebo oboch oblastiach E1A a/alebo E1B sa považuje vzhľadom na vynález za jednoduchú nedostatočnosť. Taký vektor môže byť deficitný v jednej alebo viacerých oblastiach, ktoré nie sú nutné pri produkcii vírusu, napríklad vektory môžu byť deficitné v skorej oblasti 3 (E3).
Výhodne je adenovírusový vektor podľa vynálezu deficitný v oblasti E4 a jednej alebo viacerých ďalších oblastiach, nutných pri produkcii vírusu (obzvlášť iných skorých oblastiach nutných pri produkcii vírusu), výhodne je z adenovírusového vektora deletovaná celá oblasť E4, prípadne mimo polyadenylačnej sekvencie medzi zostávajúcou oblasťou vlákna L5 a pravostrannou ITR. Výhodnejšie je ďalšou deficitnou oblasťou nutnou pri produkcii vírusu oblasť El a/alebo E2A, a najmä so súčasným odstránením oblasti E3. Preferované uskutočnenie adenovírusového vektora podľa vynálezu tak zahrnuje adenovírusové vektory Eľ E2A’, Eľ É2A' E4\ Eľ E4' a E2A‘ E4‘, ktoré môžu tiež byť E3‘. Najvýhodnejšie je, keď sa z adenovírusového vektora odstránia všetky skoré oblasti (či už sú alebo nie sú odstránené neskoré oblasti, prednostne s ponechaním prinajmenšom oblasti vlákna L5), pripadne okrem skôr spomenutej polyadenylačnej sekvencie E4 medzi zostávajúcou oblasťou vlákna L5 a pravostranou ITR.
Adenovírusový vektor podľa vynálezu zahrnuje intergénovú sekvenciu, čo umožňuje rast vírusu v komplementujúcej bunkovej línii, ktorý je podobný rastu dosiahnutému jednoducho replikačne deficitnými adenovírusovými vektormi, obzvlášť jednoducho replikačne deficitným adenovírusovým vektorom v oblasti El. V preferovanom E4‘ adenovírusovom vektore podľa vynálezu, kde zostala oblasť vlákna L5, je výhodné, keď je intergénová sekvencia umiestnená medzi oblasťou vlákna L5 a pravostranou ITR. V takom adenovírusovom vektore sa viac uprednostňuje, aby medzi oblasťou vlákna L5 a pravostrannou ITR existovala samotná polyadenylačná sekvencia E4 alebo v kombinácii s inou sekvenciou. Tak sa dostatočne oddelí zostávajúca oblasť vlákna L5 od pravostrannej ITR a potom vírusová produkcia takého vektora dosiahne produkciu jednoducho replikačne deficitného adenovírusového vektora, obzvlášť jednoducho replikačne deficitného adenovírusového vektora oblasti El.
Ak intergénová sekvencia nie je prítomná, produkcia proteínu vlákna a/alebo vírusový rast viacnásobne replikačne deficitného adenovírusového vektora je znížený v porovnaní s rastom jednoducho replikačne deficitným adenovírusovým vektorom. Avšak inklúzia intergénovej sekvencie v najmenej jednej deficitnej adenovírusovej oblasti, uprednostňuje sa oblasť E4, pôsobí proti defektu v raste a expresii vlákna.
Funkciu replikačne deficitnej oblasti poskytuje komplementárna bunková línia. Výsledkom je, že intergénová sekvencia nepotrebuje poskytovať deficitnú funkciu a môže ňou byť ľubovoľná sekvencia, limitovaná iba veľkosťou inzertu, ktorému je vektor schopný sa prispôsobiť. Samotná intergénová sekvencia môže napraviť defekt rastu a zosilniť expresiu vlákna, čo sa vyskytuje u viacnásobne replikačne deficitných adenovírusových vektorov. Intergénová sekvencia môže mať ľubovoľnú vhodnú veľkosť, požaduje sa najmenej okolo 15 párov báz (napr. 15 párov báz až 12 000 párov báz), uprednostňuje sa približne 100 párov báz až 10 000 párov báz, výhodné je približne 500 párov báz až 8 000 párov báz, dokonca viac sa uprednostňuje okolo 1 500 párov báz až 6 000 párov báz a najviac sa uprednostňuje približná, veľkosť 2 000 až 3 000 párov báz.
Intergénová sekvencia obsahuje ľubovoľnú sekvenciu alebo sekvencie, ktoré majú požadovanú dĺžku. Intergénové sekvencie sú kódujúce alebo nekódujíce a sú natívne alebo neprirodzené vzhľadom na adenovírusový genóm, ale nedokážu obnoviť replikačnú funkciu deficitnej oblasti. Intergénová sekvencia tiež môže obsahovať expresívnu kazetu s variabilným promótorom. Výhodnejšie je, keď intergénová sekvencia obsahuje naviac polyadenylačnú sekvenciu a/alebo cudzorodý gén. Je výhodné v prípade, že intergénová sekvencia je začlenená do deficitnej E4 oblasti, aby E4 polyadenylačná sekvencia a promótor E4 adenovírusového genómu alebo ľubovoľný iný (bunkový alebo vírusový) promótor zostal vo vektore. Intergénová sekvencia je umiestnená medzi E4 polyadenylačným miestom a promótorom E4 alebo ak promótor E4 nie je prítomný vo vektore, intergénová sekvencia je proximálné pravostranné ITR.
Intergénová sekvencia môže obsahovať ľubovoľnú polyadenylačnú sekvenciu. Príklady vhodných polyadenylačných sekvencií zahrnujú syntetické optimalizované sekvencie, BGH (bovinný rastový hormón), polyoma vírus, TK (tymidínovú kinázu), EBV (Epstein-Barrovej vírus) a papilomavírusy, ktoré zahrnujú ľudské papilomavírusy a BPV (bovinný papilomavírus). Uprednostňuje sa obzvlášť u deficitnej oblasti E4, aby intergénová sekvencia zahrnovala polya denylačnú sekvenciu SV40. Polyadenylačná sekvencia SV40 umožňuje silnejšiu vírusovú produkciu viacnásobne replikačne deficitných adenovírusových vektorov.
Hoci cudzorodý gén je typicky začlenený do El deficitnej oblasti adenovirusového genómu, cudzorodý gén môže tiež fungovať ako intergénová sekvencia v E4 deficitnej oblasti adenovírusového genómu. Cudzorodý gén je limitovaný iba veľkosťou fragmentu, ktorému sa vektor môže prispôsobiť a môže to byť ľubovoľný vhodný gén. Príklady vhodných cudzorodých génov zahrnujú sekvencie markerového génu, ako sú pGUS, sekrečná alkalická fosfatáza, luciferáza, β-galaktozidáza a ľudský anti-trypsín; zaujímavé terapeutické gény, ako je cystický fíbrózny transmembránový regulačný gén (CFTR); a potencionálne imúnne modifikátory, ako je B3-19K, E3-14.7, ICP47, ligandový gén fas a gén CTLA4.
Uprednostňuje sa viacnásobne replikaČný deficitný adenovírusový vektor podľa vynálezu, ktorý je deficitný v oblasti E2A, ďalej obsahuje časť oblasti E2A adenovirusového genómu v deficitnej oblasti E2A, ktorej veľkosť je menšia ako približne 230 párov báz. Všeobecne oblasť E2A adenovírusu kóduje DBP (proteín viažúci DNA), čo je polypeptid nutný pre replikáciu DNA. DBP sa skladá zo 473 až 529 aminokyselín v závislosti od vírusového sérotypu. Verí sa, že DBP je asymetrický proteín, ktorý existuje ako pretiahnutý elipsoid obsahujúci globulárnu Ct s rozšírenou Nt doménou. Štúdie indikujú, že Ct doména je zodpovedná za schopnosť DBP viazať sa na nukleové kyseliny, viazať sa na zinok a podielať sa na syntéze DNA na úrovni elongácie reťazca DNA. Verí sa však, že doména Nt funguje pri expresii neskorého génu ako na úrovni transkripcie, tak aj na úrovni post-transkripčných úprav, je zodpovedná za účinnú lokalizáciu proteínu v jadre a tiež sa podieľa na zosilnení svojej vlastnej expresie. Delécie v doméne Nt medzi aminokyselinami 2 až 38 indikovali, že táto oblasť je dôležitá pri fungovaní DBP. (Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)). Zatiaľ čo delécia v oblasti E2A kódujúca oblasť Ct proteínu DBP nemá účinok na produkciu vírusu, delécia v oblasti E2A kóduje aminokyseliny 2 až 38 domény Nt proteínu DBP, poškodzuje produkciu vírusu. Preto sa uprednostňuje, aby viacnásobne replikačne deficitný adenovírusový vektor obsahoval túto časť oblasti E2A adenovirusového genómu.
Obzvlášť sa požaduje, aby sa uchovala časť oblasti E2A, čo je tá časť oblasti E2A adenovirusového genómu, ktorá sa definuje 5'koncom oblasti E2A, špecificky pozíciami Ad5(23816) až Ad5(24032) oblasti E2A adenovirusového genómu sérotypu Ad5, ktorá prepožičiava vektoru replikačnú kompetenciu v komplementárnej bunkovej línii. Táto časť adenovíru sového genómu sa musí zahrnúť do adenovírusového genómu, pretože nie je doplnená v bunkových líniách E2Á a v jej neprítomnosti nemožno dosiahnuť v komplementárnych bunkových líniách požadovanú úroveň produkcie vírusu a expresie vlákna.
Jedna ľubovoľná z deletovaných oblastí môže byť nahradená expresívnou kazetou s variabilným promótorom za účelom produkcie produktu cudzieho génu, ktorý je cudzorodý vzhľadom k adenovírusu. Inzercia cudzorodého génu do oblasti E2A môže napríklad byť uskutočnená zavedením jediného reštrikčného miesta tak, že produkt cudzorodého génu sa môže exprimovať z promótora E2A. Tiež sa zahrnujú adenovírusové vektory, ktoré sú deficitné v neskorej oblasti genómu, adenovírusové vektory, ktoré sú deficitné v skorých a neskorých oblastiach genómu rovnako ako vektory, z ktorých sa odstránil v podstate celý genóm; v ich prípade sa preferuje, že najmenej buď vírusová obrátená terminálna repetícia a niektorý z promótorov alebo vírusová obrátená terminálna repetícia a signál balenia zostávajú nedotknuté. Odborník ocení, že čím väčšia oblasť adenovírusového genómu je odstránená, tým väčší kus exogénnej DNA môže byť do genómu začlenený. Ak adenovírusový genóm je 36 kb veľký a vírusová obrátená terminálna repetícia a niektorý z promótorov zostanú nedotknuté, potom kapacita adenovírusu je približne 35 kb. V inom prípade sa môže vytvoriť viacnásobne deficitný adenovírusový vektor, ktorý obsahuje iba ITR a signál balenia, čo umožňuje expresiu cudzorodej DNA s veľkosťou 37 až 38 kb. Samozrejme inklúzia intergénovej sekvencie v ľubovoľnej alebo vo všetkých adenovírusových oblastiach bude znižovať kapacitu adenovírusového vektora vo veľkosti, ktorá korešponduje s veľkosťou intergénovej sekvencie.
Konštrukcia vírusového vektora spolieha na vysokú úroveň rekombinácie medzi fragmentárni adenovírusovej DNA v bunke. Dva alebo tri fragmenty adenovírusovej DNA, ktoré obsahujú oblasti podobnosti (alebo presahu) fragmentov a ustanovujú dĺžku genómu sa transfekujú do bunky. Rekombináciou vyššie spomínaných fragmentov v hostiteľskej bunke sa konštruuje vírusový vektorový genóm v plnej dĺžke. Ďalšie vhodné postupy konštrukcie vírusov, ktoré obsahujú zmeny rôznych jednotlivých oblastí už boli opísané (Berkner et al., Nucleic Acids Res., 12, 925-941 (1984); Berkner et al., Nucleic Acids Res., 11, 6003-6020 (1983); Brough et al., Virol., 190, 624-634 (1992)) a môžu sa použiť na konštrukciu viacnásobne deficitných vírusov; môžu sa použiť ďalšie vhodné postupy zahrnujúce napríklad in vitro rekombináciu a ligáciu.
Prvý krok pri konštrukcii vektora je konštrukcia delécie alebo modifikácie (ako je pridanie intergénovej sekvencie alebo deiécia oblasti) určitej oblasti adenovírusového genómu v ka zete plazmidu s použitím štandardných molekulárnych biologických metód. Po extenzívnej analýze sa táto pozmenená DNA (obsahujúca deléciu alebo modifikáciu) prenesie do oveľa väčšieho plazmidu, ktorý obsahuje až jednu polovicu adenovírusového genómu. Ďalší krok je transfekcia plazmidovej DNA (ktorá obsahuje deléciu alebo modifikáciu) a veľkého kusa adenovírusového genómu do recipientnej bunky. Tieto dva kusy DNA dohromady zahrnujú celý adenovírusový genóm a oblasť podobnosti. V tejto oblasti podobnosti prebieha rekombinácia za vzniku rekombinovaného vírusového genómu, ktorý zahrnuje deléciu alebo modifikáciu. V prípade viacnásobne replikačne deficitných vektorov recipientná bunka zabezpečí nielen funkcie rekombinácie, ale tiež všetky chýbajúce vírusové funkcie, ktoré nie sú obsiahnuté v transfekovanom vírusovom genóme, tak sa doplní ľubovoľná nedostatočnosť rekombinovaného vírusového genómu. Viacnásobne replikačne deficitný vektor sa môže ďalej modifikovať zmenou ITR a/alebo signálu balenia, napríklad tak, že viacnásobne replikačne deficitný vektor funguje alebo rastie iba v komplementárnej bunkovej línii.
Vynález opisuje komplementárne bunkové línie vhodné na pomnoženie alebo rast viacnásobne deficitných adenovírusových vektorov. Preferované bunkové línie podľa vynálezu sú charakterizované komplementáciou najmenej jednej z génových funkcií, ktoré vykazujú oblasti El, E2 a E4 adenovírusového genómu. Iné bunkové línie zahrnujú tie, ktoré doplňujú adenovírusové vektory deficitné najmenej v jednej z génových funkcií, zahrnujúcich neskoré oblasti, tie, ktoré doplňujú kombináciu funkcií skorých a neskorých génov a tie, ktoré doplňujú všetky adenovírusové funkcie. Odborník ocení, keď je zvolená bunková línia taká, že špecificky doplňuje funkcie, ktoré chýbajú u daného rekombinantného viacnásobne deficitného adenovírusového vektora a ktoré sa vytvoria s použitím Štandardných molekulárno biologických metód. Bunkové línie sú ďalej charakterizované obsahom komplementárnych génov tak, že sa neprekrývajú, čo minimalizuje a prakticky eliminuje možnosť rekombinácie vektorového genómu s bunkovou DNA. Zo zásob vektorov sú tak eliminované replikačne kompetentné adenovírusy a tieto vektory sú preto vhodné na určité terapeutické účely, obzvlášť na účely génovej terapie. To tiež eliminuje replikáciu adenovírusov v nekomplementárnych bunkách.
Komplementárna bunková línia musí byť schopná exprimovať produkty dvoch alebo viacerých deficientných adenovírusových génových funkcií v množstve vhodnom pre tieto produkty za účelom vytvoriť vysoký titer zásobného rekombinantného adenovírusového vektora. Pre replikáciu adenovírusovej DNA je napríklad nevyhnutné exprimovať produkt E2A DBP v stechiometrickom množstve, t.j. na relatívne vysokej úrovni, ale produkt E2B Ad pol je pre replikáciu adenovírusovej DNA nevyhnutný iba v katalytickom množstve, t.j. v relatívne malom množstve. Aby sa zaistil vysoký titer rekombinantného adenovtrusového vektora, je nutné, aby nielen množstvo produktu bolo vhodné, ale tiež musí byť dočasná expresia produktu konzistentná s produkciou, ku ktorej dochádza pri normálnej vírusovej infekcii bunky. Napríklad sa musia komponenty nevyhnutné pre replikáciu vírusovej DNA exprimovať pred komponentami, ktoré sú nevyhnutné pri zostavení viriónov. Za účelom predísť bunkovej toxicite, ktorá často doprevádza silnú expresiu vírusových produktov a za účelom regulácie dočasnej expresie produktov sa používajú indukovateľné promótorové systémy. Pri expresii celej oblasti E4, otvoreného čítacieho rámca 6 oblasti E4 a oblasti E2A sa môže použiť napríklad ovčí metalotioneínový indukovateľný promótorový systém. Iné príklady vhodného indukovateľného promótorového systému zahrnujú napríklad bakteriálny lac operón, T7 polymerázový systém, tetracyklínový operón a kombinácie a chimérické konštrukcie eukaryontných a prokaryontných transkripčných faktorov, represorov a iných komponentov. V prípade, že exprimovaný produkt je vysoko toxický, je nutné použiť bipartitný indukovateľný systém, kde indukčné činidlo je nesené vírusovým vektorom a indukovateľný produkt je na chromatíne komplementárnej bunkovej línie. Môžu sa tiež použiť potlačiteľné/indukovateľné expresné systémy, ako je tetracyklínový expresívny systém a lac expresívny systém.
DNA, ktorá vstupuje do malého podielu transfektovaných buniek, sa môže stať stabilnou dokonca aj v malých frakciách. Izolácia bunkovej línie, ktorá exprimuje jeden alebo viac transfekovaných génov, sa dosiahne tým, že sa do rovnakej bunky zavedie druhý gén (reportný gén), ktorý napríklad odovzdá bunke rezistenciu na antibiotiká, lieky alebo inú látku. Tento výber je založený na skutočnosti, že v prítomnosti antibiotík, liekov alebo inej látky bunka, ktorá neobsahuje transferovaný gén, umiera, zatiaľ čo bunka, ktorá transferovaný gén obsahuje, prežije. Bunka, ktorá prežije, je potom klonálne izolovaná a vznikajú z nej jednotlivé bunkové línie. Do týchto bunkových línií patria tie, ktoré exprimujú reportný gén a gén alebo gény, o ktoré je záujem. Propagácia buniek závisí od rodičovskej bunkovej línie a spôsobu selekcie. Transfekcia bunky tiež závisí od typu bunky. Najbežnejším spôsobom transfekcie sú zrážanie fosforečnanom vápenatým, transfer DNA sprostredkovaný lipozómami alebo DEAE dextranom.
Je možný rad modifikácií a variácií ilustratívnych sekvencii DNA a plazmidov. Napríklad degenerácia genetického kódu umožňuje substitúciu nukleotidov v celej dĺžke kódujúcich oblasti polypeptidu a signálu terminácie translácie, bez toho, že sa zmení kódovaná polypeptidová kódujúca sekvencia. Také substituovateľné sekvencie sa môžu dedukovať zo známej aminokyselinovej sekvencie alebo sekvencie DNA daného génu a môžu sa konštruovať bežnou syntézou alebo spôsobom miestne špecifickej mutagenézy. Spôsoby syntézy DNA môžu prebehnúť v podstate v súlade so spôsobmi opísanými v publikáciách Itakura et al., Science, 198, 1056 (1,977) a Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978). Spôsoby miestne špecifickej mutagenézy sa opisujú v publikácii Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2nd ed. 1989). Preto vynález nie je žiadnym spôsobom obmedzený na sekvencie DNA a plazmidy, ktoré sú uvedené v tejto prihláške. Uvedené vektory sa používajú pri génovej terapii cystickej fíbrózy, pretože obsahujú a exprimujú cystický fibrózny transmembránový regulačný gén (CFTR), avšak opísané vektory možno ľahko pozmeniť za účelom liečby ďalších chorôb, ako sú napríklad iné chronické ochorenia pľúc, napr. emfyzém, astma, respiračný syndróm úzkosti u dospelých a chronická bronchitída, zhubné bujnenie, koronárne ochorenia srdca a ďalšie choroby, ktoré možno liečiť alebo im predchádzať génovou terapiou, vakcináciou a podobne. Do viacnásobne deficitného adenovírusového vektora je možné začleniť ľubovoľný gén alebo sekvenciu DNA. Voľba génu alebo sekvencie DNA ovplyvňuje terapeutický a/alebo profylaktický účinok, napríklad v kontexte s génovou terapiou, vakcináciou a podobne.
Odborník privíta existenciu vhodných metód pre aplikáciu zvieratám viacnásobne deficitného adenovírusového vektora podľa vynálezu na liečebné a profylaktické účely, napríklad génovú terapiu, vakcináciu a podobne (Rosenfeld et al., Science, 252, 431-434 (1991), Jaffe et al., Clin. Res., 39(2), 302A (1991), Rosenfeld et al., Clin. Res., 39(2), 311A (1991), Berkner, BioTechniques, 6, 616-629 (1988)), hoci pre aplikáciu jedného vektora sa môže použiť viac ako jeden spôsob, každý spôsob môže vykazovať iný účinok. Odborníci tiež dobre poznajú bežne dostupné farmaceutický prijateľné excipienty. Voľba excipientu je čiastočne daná určitým spôsobom aplikácie kompozície. Vzhľadom na to existuje veľký rad vhodných formulácií farmaceutickej kompozície podľa vynálezu. Nasledujúce formulácie a spôsoby podľa vynálezu sú iba príklady, ale v žiadnom prípade nie sú obmedzujúce. Preferujú sa však orálne, injekčné a aerosólové formulácie.
Formulácie vhodné na orálnu aplikáciu môžu obsahovať (a) kvapalné roztoky, účinné množstvo látky rozpustenej v riedidle, ktorým je napríklad voda, fyziologický roztok alebo pomarančový džús; (b) kapsuly, toboľky alebo tablety, pričom každá obsahuje vopred určené množstvo aktívnej látky v pevnej forme alebo v granulách; (c) suspenzie vo vhodných roztokoch; a (d) vhodné emulzie. Tabletové formy môžu zahrnovať jednu alebo viac látok zo skupiny, ktorá zahrnuje laktózu, manitol, kukuričný škrob, zemiakový škrob, mikrokryštalickú celulózu, arabskú gumu, želatínu, koloidný oxid kremičitý, kroskarmelózu sodíka, mastenec, stearát horčíka, kyselinu stearovú a iné excipienty, ako sú farbivá, riedidlá, pufre, zvlhčovacie činidlá, konzervačné a aromatizačné prísady a farmakologicky kompatibilné excipienty. Formy zdravotných bonbónov môžu obsahovať ochutenú aktívnu látku, obvykle sa používa sacharóza a arabská guma alebo tragakant. Pastilky zahrnujú aktívnu látku obsiahnutú v inertnej báze, ako je želatína a glycerín alebo sacharóza a arabská guma, v emulziách, géloch a podobne, ktoré obsahujú okrem aktívnej látky naviac excipienty známe v odbore.
Vektory podľa vynálezu samotné alebo v kombinácii s inými vhodnými komponentami sa môžu pripravovať do aerosólových formulácií, ktoré sa aplikujú inhaláciou. Tieto aerosólové formulácie sa plnia s tlakovanou prijateľnou hnacou látkou, ako je dichlórdifluórmetán, propán, dusík a podobne. Tiež sa môžu pripravovať ako lieky v netlakovaných formách, ako sú zhmlovače a rozprašovače.
Formulácie vhodné na parenterálnu aplikáciu zahrnujú vodné a nevodné izotonické sterilné injekčné roztoky, ktoré môžu obsahovať antioxidanty, pufre, bakteriostaty a rozpúšťadlá, ktoré tvoria formuláciu izotonickú s krvou recipienta a vodné a nevodné sterilné suspenzie, ktoré môžu obsahovať suspendujúce činidlá, solubilizátory, zahusťovacie činidlá, stabilizátory a konzervačné činidlá. Formulácie sa vyskytujú v jednotkovej dávke alebo vo viacnásobnej dávke v uzavretých kontajneroch, ako sú ampuly a fľaštičky, a môžu sa skladovať v lyofilizovanom stave, čo vyžaduje pre aplikáciu injekciou iba pridanie sterilného kvapalného excipienta, napríklad vody, tesne pred použitím. Injekčný roztok alebo suspenzia podľa predpisu sa pripraví z vyššie opísaného sterilného prášku, granúl a tabliet.
Naviac vektory, ktoré sa používajú podľa vynálezu, sa môžu aplikovať ako čapíky zmiešaním s rôznymi bázami, ako sú emulzifikačné alebo vo vode rozpustné bázy.
Formulácie vhodné pre vaginálnu aplikáciu sa pripravujú vo forme pesarov, tampónov, krémov, gélov, pást, pien alebo sprejov, ktoré obsahujú okrem aktívnej látky vhodné nosiče.
Dávka aplikovaná zvieraťu, obzvlášť potom ľuďom, podľa vynálezu sa bude meniť v závislosti od génu alebo inej sekvencie, použitej v kompozícii, spôsobu aplikácie a miesta a orga nizmu, ktorý sa lieči. Dávka by mala byť dostatočná, aby spôsobila požadovanú odozvu, napríklad terapeutickú alebo profylaktickú odozvu, v požadovanom časovom úseku.
Viacnásobne deficitné adenovírusové vektory a komplementárne bunkové línie podľa vynálezu sú využiteľné tiež w vitro. Môžu sa napríklad používať pri štúdiu funkcie adenovírusového génu a zostavení alebo expresii cudzorodej DNA vo vhodnej cieľovej bunke. Odborník môže určiť vhodnú cieľovú bunku tak, že vyberie bunku, ktorá môže byť transfikovaná adenovírusovým vektorom podľa vynálezu a/alebo infikovaná adenovírusovými časticami, čo vedie k expresii začleneného adenovírusového komplementu DNA. Prednostne sa volí taká cieľová bunka, ktorá má receptory na zachytenie a penetráciu adenovírusu do bunky. Také bunky zahrnujú, bez toho, aby sa na ne obmedzovali, bunky pôvodne izolované z akéhokoľvek cicavca. Len čo bola vybratá vhodná cieľová bunka, uvedie sa do styku s rekombinantným viacnásobne deficitným adenovírusovým vektorom alebo adenovírusovou časticou podľa vynálezu, ktorá obsahuje cudzorodú DNA, pričom dochádza k transfekcii, resp. infekcii. Potom sa meria známymi konvenčnými metódami expresia, toxicita a iné parametre týkajúce sa inzercie a aktivity cudzorodej DNA v cieľovej bunke. Pritom môžu výskumníci poznávať a osvetľovať javy súvisiace s adenovírusovou infekciou, ako aj účinnosť a účinok expresie rôznych sekvencií cudzorodej DNA, zavedených vektorom podľa vynálezu do rôznych bunkových typov, získaných z rôznych organizmov a študovaných v tkanivových kultúrach.
Naviac je možné výhodne manipulovať in vitro s bunkami, odobranými pacientovi, trpiacemu ochorením, ktoré sa vhodne ošetruje génovou terapiou v súvislosti s vynálezom. Napríklad sa bunky kultivované in vitro z takého jedinca uvedú do styku s adenovírusovým vektorom podľa vynálezu za vhodných podmienok pre transfekciu, ktoré odborník ľahko určí, pričom vektor zahrnuje vhodnú cudzorodú DNA. Výsledkom je výhodne transfekcia vektora do kultivovaných buniek, pričom sa transfikované bunky vyberajú pre použitie vhodného markera a selektívnych podmienok kultivácie. Pritom sa testovaním vitality buniek štandardnými metódami, a teda meraním toxicity, a zisťovaním prítomnosti génových produktov cudzorodého génu alebo génov daného vektora, a teda meraním expresie, bunky jedinca testujú na kompatibilitu, expresiu a toxicitu daného vektora obsahujúceho cudzorodý gén, čo poskytuje informácie ohľadne vhodnosti a účinnosti liečby jedinca týmto testovaným sytémom vektor/cudzorodá DNA. Také odobrané a transfikované bunky, okrem toho, že slúžia na testovanie potencionálnej účinnosti/toxicity režimu danej génovej terapie, môžu byť vrátené späť do tela jedinca vo forme in vivo. Môžu byť do tela jedinca vrátené bez zmeny s výnimkou in vitro transfekcie, alebo obalené matricou alebo zasadené do matrice, ktorá ich separuje od iných tkanív a buniek tela jedinca. Ako taká matrica môže slúžiť akýkoľvek vhodný biokompatibilný materiál, zahrnujúci kolagén, celulózu apod. Len čo sa pozoruje pozitívna odozva na in vitro test, je samozrejme možné namiesto toho alebo naviac uskutočniť transfekciu in silu spôsobom aplikácie, opísaným ďalej v texte.
Nasledujúce príklady ďalej osvetľujú vynález a samozrejme ho neobmedzujú. Enzýmy uvedené v príkladoch sú dostupné, ak nie je uvedené inak, z Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithesburg, MD 20877, New England Biolabs Inc. (ΝΈΒ), Beverly, MA 01915 alebo Boehringer Mannheim Biochemicals (BMB), 7941 Castleway Drive, Indianapolis, IN 46250 a používajú sa v podstate podľa návodu výrobcu. Rad ďalších tu používaných metód je odborníkom známy. Metódy molekulárnej biológie sú podrobne opísané vo vhodných laboratórnych príručkách, ako je Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989) a Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. (1987)). Alternatívne metódy sú odborníkovi známe. Hoci príklady a obrázky sa vzťahujú na AdGv.lO, AdGv.ll, AdGv.HS, AdGv-12 a AdGV. 13, ktoré napríklad obsahujú reportný gén alebo terapeutický gén, ako je cystický fibrózny transmembránový regulačný gén (CFTR), a zahrnujú napríklad Adcv.CFTR.10, Adcv.CFTR.il, Adcv.CFTR. 11S, AdOv.CFTR.12 a Adcv.CFTR. 13, nie sú tieto vektory obmedzené na expresiu génu CFTR a môžu sa použiť na expresiu iných génov a sekvencii DNA. Napríklad potom vynález zahrnuje vektory, zahrnujúce ľubovoľnú vhodnú sekvenciu DNA, ktorá môže byť cudzorodým génom, jeho fragmentom alebo inou sekvenciou DNA. Taká vhodná sekvencia DNA sa môže využiť v génovej terapii na liečbu chorôb, pre ktoré je génová terapia vhodnou liečbou. Vhodná sekvencia DNA sa môže tiež použiť profylaktický, napríklad keď je schopná expresie v cicavcovi, pričom vzniká napríklad polypeptid schopný vyvolať imunitnú odozvu, ako sa používa pri vakcinácii. Ďalším alternatívnym použitím vhodnej sekvencie DNA schopnej expresie v cicavcovi je poskytnutie iného vhodného terapeutického a/alebo profylaktického prostriedku, ako je antisense molekula, obzvlášť antisense molekula vybraná zo skupiny zahrnujúcej mRNA a syntetické oligonukleotidy.
Prehľad obrázkov na výkrese
Na obrázku č. 1 sú znázornené schematické diagramy vírusových vektorov AdcvCFTR. 10L a AdGVCFTR. 1 OR.
Na obrázku č. 2 je schematický diagram vírusového vektora AdcvCFTR. 11.
Na obrázku č. 3 je schematický diagram vírusového vektora AdcvCFTR. 13.
Na obrázku č. 4 je schematický diagram expresívneho vektora E2A.
Na obrázku č. 5 je uvedený imunoblot používaný na testovanie úrovne indukovanej DBP expresie v určitých klonálnych bunkových líniách 293/E2A.
Na obrázku č. 6 je uvedený imunoblot, ktorý sa používal pre analýzu akumulácie DBP určitými klonálnymi bunkovými líniami 293/E2A počas prvých 24 hodín indukcie.
Na obrázku č. 7 sú znázornené schematické diagramy vírusových vektorov AdcvCFTR. 10L a AdcvCFTR. 12B.
Na obrázku č. 8 je fotografia gélu s DNA zafarbeného v etidium bromide, ktorá poskytuje dáta vzťahujúce sa k detekcii pomocou PCR vírusového vektora AdcvCFTR z pasážovaných transfekovaných lyzátov.
Obrázok č. 9 je schematický diagram vírusového vektora AdcvLuc;E2GUS.
Obrázok č. 10 je schematický diagram expresívneho vektora E4-ORF6,
Obrázok č. 11 je fotografia gélu s DNA zafarbeného v etidium bromide, ktorá poskytuje dáta vzťahujúce sa k detekcii pomocou PCR E4 delečnej oblasti v pasážovaných lyzátoch AdcvPgal. 11.
Na obrázku č. 12 je stĺpcový graf zobrazujúci množstvo vírusu produkovaného (PFU/bunku na osi y) E4 delečným vírusom, ktorý si po infekcii rôznych bunkových línií udržuje funkciu oblasti E1.
Na obrázku č. 13 je schematický diagram vírusového vektora AdcvPgal. 11.
Obrázky č. 14 A až C sú schematické diagramy porovnávajúce oblasť vIákno/E4 vektorov, v ktorých: sekvencie E4 sú celkom deletované a sekvencia vlákna L5 fúzuje s pravostrannou ITR (obrázok č. 14A), E4 kódujúce sekvencie sú deletované a sekvencia vlákna L5 sa fúzuje s promótorom E4 a s pravostrannou ITR za vzniku vektora AdGv. 11 (obrázok č. 14B) a E4 kódujúce sekvencie sú deletované a medzi oblasť vlákna L5 a pravostrannú ITR sa pridali sekvencie (zahrnujúce polyadenylačnú sekvenciu SV40) za vzniku vektora AdGVCFTR. 11S (obrázok č. 14C) založenom na AdGv. 11S. Symboly: ITR, obrátená terminálna repetícia; Mfe I (izoschizomér Mun I), Pac I, Eag 1, palindromická rozpoznávajúca miesta týchto enzýmov; GUS, kódujúca sekvencia β-glukuronidázy; SV40 polyA, polyadenylačné miesto opičieho vírusu 40; E4p, promótor E4.
Obrázok č. 15 reprezentuje imunoblot rôznych bunkových lyzátov 293/ORF6 buď neinfikovaných vektorom (slepá infekcia) (dráha 1), infikovaných El deficitným vektorom AdGvPgal. 10 (dráha 2) alebo E1 a E4 deficitným vektorom AdcvPgal. 11 (dráha 3). Imunoblot sa pripravil s použitím králičieho séra, ktoré rozpoznáva všetky štrukturálne proteíny adenovírusového kapsidu.
Obrázok č, 16 ukazuje imunoblot izolovaných kapsidov získaných z rôznych bunkových lyzátov 293/ORF6 infikovaných buď E1 a E3 deficitným vektorom AdovPgal.lO (dráha 1) alebo E1 a E4 deficitným vektorom AdcvPgal.l 1 (dráha 2). Imunoblot sa pripravil s použitím protilátok proti adenovírusovému proteínu vlákna.
Obrázok č. 17 ukazuje imunoblot rôznych bunkových lyzátov 293/ORF 6 buď neinfikovaných vektorom (slepá infekcia) (dráha 1) alebo infikovaných E1 a E3 deficitným vektorom Adc,v3gal. 10 (dráha 2) alebo E1 a E4 deficitným vektorom AdcvPgal.l 1 (dráha 3) alebo El, E3 a E4 deficitným vektorom Adcv.l lS-založený vektor AdcvCFTR. 11S, ktorý obsahuje v oblasti delécie E4 intergénovú sekvenciu (dráha 4). Imunoblot sa pripravil s použitím protilátok proti adenovírusovému proteínu vlákna.
Obrázok č. 18 je graf množstva aktívneho vektora (fokálne tvoriace sa jednotky; flfú) na bunku verzus hodiny po infekcii pre bunky A232 infikované El a E3 deficitným Adcv.10založeným vektorom AdGVPgal.lO (plné štvorce), infikované El a E4 deficitným AdGv.llzaloženým vektorom AdcvPgal.ll (prázdne kosoštvorce), alebo El, E3 a E4 deficitným
Adcv-11 S-založeným vektorom AdovCFTR. 1 1S, ktorý obsahuje intergénovú sekvenciu v oblasti delécie E4 (prázdne krúžky).
Obrázok č. 19 je schematický diagram génu E2a preloženého do proteinu E2A divokého typu a zodpovedajúci oblastiam prekladaným v adenovírusových delečných vektoroch zZ/801, <7/802 a <7/803 a účinok takej translácie je rast. Skratky a symboly: Nt, oblasť génového produktu E2A implikovaného v lokalizácii jadra a expresia neskorého génu; Ct, oblasť génového produktu E2A implikovaného v replikách DNA, naviazaní ssDNA a naviazaní inRNA; DBP, génový produkt E2A (to je proteín viažúci sa na jednoreťazcovú DNA); rovná čiara, oblasť kódujúcej sekvencie E2A, ktorá sa prekladá v rámci v delečných vektoroch; lomená čiara, oblasť kódujúcej sekvencie E2A, ktorá sa prekladá mimo rámca v delečných vektoroch v dôsledku delécie sekvencií E2A; +++, chovanie rastu divokého typu; +, redukovaný vírusový rast; -/+, silnejšie redukovaný vírusový rast, čoho dôkazom je tvorenie malých plakov.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Tento príklad opisuje vznik jedného uskutočnenia, ktoré zahrnuje Adov.10, menovite AdovCFTR. 10, ktoré je deficitné v oblastiach E1 a E3.
AdovCFTR. 10 exprimuje gén CFTR zo skorého promótora cytomegalovírusu (CMV). Skonštruovali sa dve generácie tohto vektora a označili sa ako AdovCFTR. 10L a AdovCFTR. 10R, v závislosti od smeru, v ktorom je expresívna kazeta CFTR umiestnená v oblasti E1 vo vzťahu ku genómu vektora, ako ukazuje obrázok č. 1, ktorý znázorňuje schematický diagram AdovCFTR. 10L a AdovCFTR. 10R.
Konštrukcia expresívnej kazety CFTR bola uskutočnená nasledovne. PRK5 (Genentech Inc., South San Francisco, CA) sa štiepil reštrikčným enzýmom KpnI (New Englnd Biolabs (NEB), Beverly, MA), konce boli upravené na tupé konce nukleázou z fazúľ mungo (NEB) a do Κρη I reštrikčného miesta sa ligoval Xho I linker (NEB). Výsledný vektor sa pomenoval pRK5Xho I. pRK5-Xho I sa potom štiepil reštrikčnými enzýmami Srna 1 (NEB) a Hind III (NEB) a tupé konce sa upravili nukleázou z fazúľ mungo. Plazmid obsahujúci gén CFTR pBQ4.7 (Dr. Lap-Chee Tsui, Hospital for Sick Children, Toronto, Canada) sa štiepil reštrikčnými enzýmami
Ava I (NEB) a Sac I (NEB) a tupé konce sa upravili nukleázou z fazúľ mungo. Tieto dva fragmenty sa izolovali a ligovali sa dohromady za vzniku pRK5-CFTRl, čó je expresívna kazeta CFTR.
pRK5-CFTRl sa štiepila reštrikčnými enzýmami Spe I (NEB) a Xho I a tupé konce sa upravili Klenow enzýmom (NEB). pAd60.454 (Dr. L. E. Babiss, The Rockefeller University, New Yourk, NY), ktorý obsahuje Ad5 sekvencie z 1-454/3325-5788, sa štiepil reštrikčným enzýmom Bgl II (NEB) a tupé konce sa upravili s Klenow. Tieto dva fragmenty sa izolovali od sekvencií vektora na agaróze topiacej sa za nízkej teploty (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, ΝΎ (2nd ed. 1989)) a ligovali sa dohromady za vzniku ľavého ramena plazmidov pGVCFTR.IOL a pGVCFTR.lOR.
Ľavé rameno plazmidu pGVCFTR.IOL alebo pGVCFTR.lOR sa štiepilo reštrikčným enzýmom Nhe I (NEB). Pravé rameno vírusu vzniklo štiepením Ad5í//324 (Dr. Thomas E. Shenk, Princeton University, Princeton, NJ) pomocou reštrikčného enzýmu Cla I (NEB). Dva fragmenty, malý s veľkosťou 918 bp a veľký s približnou veľkosťou 32 800 bp, sa separovali na sacharózovom gradiente centrifugáciou (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (2d ed. 1989)). Veľký fragment sa zmiešal s fragmentárni ľavého ramena plazmidu a transfekoval sa do buniek 293 podľa štandardného protokolu fosforečnanom vápenatým (Graham et al., Virology, 52, 456 (1973)). Výsledné rekombinantné vírusy sa čistili pomocou plakov na bunkách 293 a pripravila sa zásoba vírusu podľa štandardnej virologickej metódy (napr. Berkner et al., Nucleic Acids Res., 12, 925-941 (1984); Berkner et al., Nucleic AcidsRes., 11,6003-6020(1983)).
Príklad 2
Tento príklad opisuje vznik jedného uskutočnenia, ktoré zahrnuje Adov-ll, menovite AdcvCFTR. 11, ktoré je deficitné v oblastiach El, E3 a E4.
Pre Adcv. 11 je charakteristická celková eliminácia oblasti E4. Táto veľká delécia umožňuje inzerciu exogénnej DNA až s veľkosťou lOkb. Dôležitejšie je, že iná oblasť genómu je náchylná na zavedenie expresívnych kaziet cudzorodej DNA S použitím vektorov AdcvCFTR.ll. Táto delécia umožňuje zavedenie väčších expresívnych kaziet iných produktov, napríklad roz pustných receptorov, to je TNF alebo IL-6 bez transmembránovej domény tak, že teraz nie sú pripojené na membránu a antisense molekuly, napríklad tie určené proti produktom regulujúcim bunkový cyklus, ako je cdc2, cdk kinázy, cyklíny, to je cyklín E alebo cyklín D a faktory transkripcie, to je E2F alebo c-myc, aby eliminovali zápal a imúnne odozvy.
Adc,vCFTR. 11 sa skonštruoval spôsobom jedinej in vivo rekombinácie medzi 1 až 27082, to znamená medzi ľavým ramenom AdovCFTR.lO a plazmidom (pGVllA, pGVllB, pGVl 1C alebo pGVl ID; detailne opísané ďalej v texte) obsahujúcim 21562 až 35935, to je pravé rameno Ad5 linearizovanej reštrikčnými enzýmami BamH I a Sal I (NEB), do ktorého sa zaviedli rôzne zmeny E3 a E4, ako sa opisuje ďalej v texte.
Ľavé rameno AdcvCFTR.10 sa izolovalo na konkávnom 10 až 40% sacharózovom gradiente, kde 1/4 celkového roztoku je 40 %. AdovCFTR.lO sa štiepil reštrikčnými enzýmami Spe I (NEB) a Srf I (Stratagene, La Jolla, CA) za vzniku fragmentu s veľkosťou 1 až 27082 bp.
Pravé rameno sa získalo štiepením modifikovaného vektora pGEM (pGBS) reštrikčnými enzýmami Bam Hl a Sal I. PGBS vznikol nasledovne. pGeml (Promega, Madison, WI) sa štiepil reštrikčným enzýmom EcoR 1 a tupé konce sa upravili Klenow. Do vektora sa ligoval Sal I linker. Výsledná DNA sa potom štiepila reštrikčným enzýmom Sal I a znovu sa ligovala, pričom reštrikčné miesto EcoR I sa nahradilo reštrikčným miestom Sal I a deletovala sa sekvencia medzi dvoma reštrikčnými miestami Sal I za vzniku pGEMH/P/S, ktoré sa štiepilo reštrikčným enzýmom Hind III a konce sa upravili Klenow. Do vektora sa ligoval BamH I linker za vzniku pGEMS/B. pGEMS/B sa štiepila reštrikčnými enzýmami Bam Hl a Sal I a ligovala sa s Bam Hl a Sal I fragmentom s veľkosťou 14 kb (21562 až 35935 z Ad5) z pBR plazmidu, ktorý sa nazýva p50-100 (Dr. Paul Freimuth, Colombia University, NY) za vzniku pGBS.
Pozmenil sa pGBSAE3 za vzniku plazmidu s pravým ramenom, v ktorom je deletovaná celá oblasť E4. Výsledný plazmid, v ktorom sú deletované celé oblasti E3 a E4 sa nazýva pGVl 1(0). To sa urobilo zavedením reštrikčného miesta Pac I do Afl III miesta v pozícii 32811 a Bsq I miesta v pozícii 35640. Delécia fragmentu Pac I medzi týmito dvoma miestami účinne eliminuje všetky sekvencie E4 zahrnujúce E4 TATA element s E4 promótorom a polyA miestom.
Tri rôzne verze plazmidu s pravým ramenom sa skonštruovali za účelom zavedenia produktov dvoch Ad E3 génu do adenovírusového vektora. Tieto produkty majú antiimunitné a protizápalové vlastnosti. Veľká delécia E3 v pGBSAE3ORF6, označená pGVll(O) (príklad 7) bola podstatne nahradená tromi rôznymi verziami expresívnej kazety obsahujúcej promótor dlhej terminálnej repetície vírusu Rousovho sarkómu, ktorý riadi expresiu bicistrónnej mRNA, ktorá obsahuje na 5'konci Ad2 E3 anti-imúnny génový produkt s molekulovou hmotnosťou 19 a na 3'konci Ad5 E3 protizápalový génový produkt s molekulovou hmotnosťou 14,7. Ďalší vírus sa skonštruoval deléciou fragmentu cDNA s molekulovou hmotnosťou 19 pomocou reštrikčného enzýmu Bst BI (NEB). Tento vírus, označený ako AdovCFTR. 11 (D), obsahuje RSV-LTR promótor, ktorý riadi expresiu monocistrónnej mRNA obsahujúcej iba E3 protizápalový génový produkt s molekulovou hmotnosťou 14,7.
Fragment reštrikčných enzýmov Spe I (27082) a Ndel (31089) z pGBSAE3 (príklad 4) sa subklonoval do pUC 19 pri prvom klonovaní fragmentu EcoR I (27331) a Nde I (31089) do identických miest v polylinkeri PUC 19. Fragment Hind III (26328) a EcoR I (27331) vytvorený z pGB sa potom klonoval do EcoR I miesta tohto klonu za vzniku ρΗΝΔΕ3. S použitím vhodných primérov sa vytvoril pomocou PCR fragment lemovaný reštrikčnými miestami Xba I. Tento fragment obsahuje promótor RSV-LTR, Ad2 E3 génový produkt s molekulovou hmotnosťou 19 a Ad5 E3 génový produkt s molekulovou hmotnosťou 14,7. Amplifikovaný fragment sa štiepil reštrikčným enzýmom Xbal a subklonoval sa do pUC 19 za vzniku pXA. Po analýze Xba I fragmentu sa fragment ligoval do ρΗΝΔΕ3 za vzniku pHNRA.
S použitím vhodných primérov pomocou PCR vznikli dva fragmenty lemované reštrikčnými miestami Bst BI, ktoré kódujú vnútorné ribozomálne vstupné miesta (IRES), o ktorých sa vie, že zosilňujú transláciu mRNA, ktorá ich obsahuje (Jobling et al., Náture, 325, 622-625 (1987); Jang et al., Genes and Development, 4, 1560-1572 (1990)). Jeden fragment (verzia B) obsahuje 34 bp IRES z neprekladanej vedúcej sekvencie obalového proteínu mRNA alfaalfa mozaikového vírusu (AMV RNA 4 vedúca sekvencia) (Jobling et al., Náture, 325, 622-625 (1987)). Ďalší fragment (verzia C) obsahuje 570 bp IRES z 5'neprekladanej oblasti mRNA vírusu encefalomyokarditídy (EMCV) (Jang et al., Genes and Development, 4, 1560-1572 (1990)). Každý Bst BI fragment z verzie B alebo C sa klonoval na miesto Bst BI fragmentu v pXA. Výsledné plazmidy, ktoré sa nazývajú pXB a pXC, sa preniesli po sekvenčnej analýze ^Xba I fragmentov do ρΗΝΔΕ3 za vzniku pHNRB a pHNRC.
Fragment Spel (27082) a Ndel (31089) z pGBSAE3ORF6 nahradili Spel a Ndel fragmenty z pHNRA, pHNRB, pHNRC a pHNRD za vzniku pGVHA, pGVHB, pGVllC a pGVHD.
- I ·
DNA plazmidu pGVX sa linearizovala reštrikčnými enzýmami BamHI a Sali a zmiešala sa s fragmentom DNA ľavého ramena v rôznych koncentráciách, kde bolo približne 20pg celkovej DNA, používa sa sperma lososa alebo DNA teľacieho týmusu (Life Technologies, Gaithersburg, MA). Zmes fragmentov sa potom transfekovala do buniek 293 s použitím štandardnej metódy s fosforečnanom vápenatým (Graham et al., Virology, 52, 456 (1973)). Používa sa buď bunková línia 293/E4 alebo 293/ORF6.
Päť dní po transfekcii sa izolovala monovrstva buniek zmrazením a rozmrazením v troch cykloch. Výsledný hybridný vírus sa titroval s použitím buniek 293 a vypichli sa izolované plaky. Proces izolácie plakov sa opakoval dvakrát. Zásoba izolovaných plakov sa potom pomnožila na veľkú zásobu vírusu podľa štandardných virologických metód, ako opisuje Burlseson et al., v Virology: aLaboratory Manual, Academic Press Inc. (1992).
Pretože E4 obsahuje podstatné génové produkty, ktoré sú nevyhnutné pre rast vírusu, výsledný mutantný vírus s deléciou E4 nemôže rásť v neprítomnosti exogénne exprimovanej E4. Preto všetky manipulácie vírusovej konštrukcie prebiehajú v novej bunkovej línii 293/E4 alebo 293/ORF6 (ako sa opisuje v príklade 6). Výsledným vírusom je AdcvCFTR.il, ktorý je uvedený na obrázku č.2, porovnáva sa s AdGvCFTR.10L.
Príklad 3
Tento príklad opisuje vznik Adcv-13, to je Adc,vCFTR.13, ktorý je deficitný v oblastiach E1,E2, E3 aE4.
Adcv-13 je charakterizovaný nie iba celkovou elimináciou E1 a E4 (ako u Adcv. H), ale tiež celkovou elimináciou E2A. Celá kódujúca oblasť E2A sa deletuje fúziou DNA z dvoch E2A mutantných vírusov, menovite H5in800a H5in804, ktoré obsahujú inzercie reštrikčných miest Cla 1 na oboch koncoch otvoreného čítacieho rámca (Vos et al., Virology, 172, 634-642 (1989); Brough et al., 190, 624-634 (1992)). Reštrikčné miesto Cla I H5in800 je v géne medzi kodónmi 2 a 3 a v H5in804 sa nachádza v terminačnom kodóne génu E2A. Výsledný vírus obsahuje otvorený čítací rámec, ktorý zahrnuje 23 aminokyselín, ktoré nemajú žiadnu podobnosť s otvoreným čítacím rámcom E2A. Dôležitejšie je, že táto kazeta ponúka ešte ďalšie oblasti vírusového genómu, kam je možné zaviesť jediný gén. To sa môže uskutočniť zavedením génu do vhodného otvoreného čítacieho rámca existujúceho mini-ORF alebo zavedením ďalšej expresívnej kazety, ktorá obsahuje vedľa génu svoje vlastné promótorové sekvencie, polyadenylačné signály a terminačné sekvencie.
Adenovírusová DNA sa pripravila z H5in800 a H5in804. Po štiepení reštrikčným enzýmom Hind III (NEB) sa Hind III A fragmenty z H5in800 a H5in804 klonovali do pKS+ (Stratagene). Výsledné plazmidy sa nazývali pKS+H5in800Hin dlIIA a pKS+H5in804Hin dlIIA. Z pKS+H5in800Hin dlIIA sa potom izoloval Cla I fragment a klonoval sa na miesto identického Cla I fragmentu z pKS+H5in804Hin dlIIA. Tento chimérický plazmid pHin dIIIA_E2A účinne odstraňuje všetky E2A čítacie rámce, ako sa opisuje vyššie. V tomto okamihu delécia E2A sa presunula do reštrikčných miest BamHI (NEB) a Spe I (NEB) za účelom nahradiť sekvencie divokého typu v pGV12(0) pri konštrukcii pGV13(0).
Vírus AdGvCFTR,13 (obrázok č. 3) sa skonštruoval ako sa opisuje vyššie v texte použitím DNA ľavého ramena AdGVCFTR. 10 a DNA pravého ramena plazmidu pGV13(0). Pre konštrukciu tohto vírusu sa ako recipientná bunková línia používa bunková línia 293/E4/E2A. Obrázok č. 3 znázorňuje schematický diagram vírusového vektora AdGvCFTR.13. Diagram sa porovnáva s AdcivCFTR. 10L.
Príklad 4
Tento príklad opisuje konštrukciu pGBSAE3. Tento plazmid vznikol za účelom odstrániť v pGBS väčšinu oblasti E3, čo znamená promótor E3 a existujúce gény E3, aby vznikol priestor pre iné konštrukcie a bolo možné zaviesť expresívne kazety E3. Tento plazmid obsahuje deléciu od pozície 28331 do 30469.
Fragment PCR vznikol s použitím pGBS ako templátu a Ad5s(27324) a A5a(28330)X ako primérov. Výsledný fragment sa štiepil reštrikčnými enzýmami Eco RI (27331) a Xba I (28330) a čistil sa na géle. Tento fragment sa potom zaviedol do pGBS do reštrikčných miest Eco RI (27331) a Xba I (30470).
Príklad 5
Tento príklad opisuje konštrukciu pGBSAE3AE4.
Veľká delécia oblasti Ad5 E4 sa zaviedla dp pGBSAE3 za účelom prenesenia exogénnych sekvencii do adenovirusového genómu. Deletovali sa kódujúce E4 sekvencie 32830 až 35566.
Reštrikčné miesto Pac I vzniklo na mieste reštrikčného miesta Mun I v pozícii 32830 aplikáciou Klenow fragmentu na DNA pGBS štiepenú reštrikčným enzýmom Mun I a ligáciou linkera Pac I. Modifikovaná DNA sa potom štiepila reštrikčným enzýmom Nde I a vzniknutý fragment s veľkosťou 1736 bp (Nde I 31089 až Pac I 32830) sa čistil na géle. Fragment PCR sa pripravil s použitím A5 (35564)P (IDT, Coralville, IA) a primérov T7 (IDT, Coralville, IA) a pGBS ako templátu. Výsledný fragment sa štiepil reštrikčnými enzýmami Pac I a Sal 1 za vzniku Pac I 35566 až Sal I 35935. Reštrikčné miesto Srna I v oblasti polylinkera pUC 19 sa ligáciou linkera Pac I zmenilo na reštrikčné miesto Pac I. Fragment Pac I 35566 až Sal I 35935 sa preniesol do modifikovaného vektora pUC 19 do reštrikčných miest Pac I a Sal I do oblasti polylinkera. Modifikovaný fragment Ndel 31089 až Pac 1 32830 sa preniesol do plazrnidu pUC 19, v ktorom sa už nachádza v reštrikčných miestach Nde 1 a Pac I zavedený fragment Pac I 35566 až Sal I 35935. Fragment Nde 1 31089 až Sal I 35935 z plazrnidu pUC 19 sa čistil na géle a klonoval sa na miesto reštrikčných miest Nde I a Sal I v pGBSAE3 za vzniku pGBSAE3AE4.
Príklad 6
Príklad opisuje prípravu bunkovej línie 293/E4.
Vektor pSMT/E4 sa vytvoril nasledovne. Fragment Mun I (pozice 32825 Ad2) až Sph I (polylinker) s veľkosťou 2753 bp sa izoloval z pE4(89-99), čo je plazmid pUC19, do ktorého sa subklonovala oblasť 32264 až 35577 z Ad2 s tupými koncami po aplikácii Klenow fragmentu a ošetrila sa tiež fosfatázou (NEB). Fragment Mun I až Sph I s veľkosťou 2752 bp sa ligoval do pMT010/A+ (McNeall et al., Gene, 76, 81-89 (1989)), ktorý sa linearizoval reštrikčným enzýmom Bam Hl a tupé konce sa upravili Klenow fragmentom a ošetril sa fosfatázou, za vzniku plazrnidu s expresívnou kazetou pSMT/E4.
Bunková línia 293 (ATCC CRL 1573; Američan Type Culture Collection, Rockville, MD) sa kultivovala v 10% fetálnom bovinnom sére v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (Life Technologies, Gaithersburg, MA). Bunky 293 sa transfikovali pSMT/E4, ktorý je linearizovaný reštrikčným enzýmom Eco RI, s použitím metódy s fosforečnanom vápenatým (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Približne 24 až 48 hodín po transfekcii sa pridalo vyššie opísané médium, ktoré obsahuje 100 μΜ metotrexátu a ametopterínu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Metotrexát v médiu sa používa na selekciu expresie génu dihydrofolátovej reduk.tázy(DHFR), ktorý je selekčný marker plazmidu pSMT/E4.
Daná koncentrácia metotrexátu (ktorý je špecifický pre typ bunky) inhibuje normálny bunkový gén DHFR, čo spôsobuje smrť bunky. Expresia pridaného génu DHFR v trans- fikovaných bunkách, ktoré obsahujú pSMT/E4, spôsobuje rezistenciu na metotrexát. Z toho dôvodu iba transfikované bunky, ktoré obsahujú nové gény, rastú za uvedených podmienok (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
V prípade, že malé kolónie buniek sa vytvorili z počiatočnej jednej bunky, ktorá má selekčný marker, boli klonálne izolované a pomnožené (Sambrook et al., Molecular Clo- ning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Tieto klony sa pomnožili za vzniku bunkovej línie, v ktorej sa testovala expresia produktu, v tomto prípade E4, a ďalej sa testovala funkčnosť komplementárnych defektívnych vírusov; v tomto prípa- de išlo o vírusy defektívne v oblastiach E1 a E4.
Výsledok tohto procesu je prvá bunková línia 293/E4, ktorá je schopná produkovať komplementárne adenovírusové vektory defektívne vo funkciách E1 a E4, ako je AdcvCFTR. 11.
Príklad 7
Tento príklad opisuje prípravu bunkovej línie 293/E4/E2A. Táto bunková línia umožňuje rast vírusových vektorov defektívnych v oblastiach El, E4 a E2A.
Expresívna kazeta E2A (obrázok č. 4), ktorá je vhodná pre zavedenie do buniek 293/E4, vzniká nasledovne. Prvým krokom je zmena báz obklopujúcich ATG E2A v zhode s Kozákovým pravidlom (Kozák, J. Molec. Biol., 196, 947-950 (1987)) za účelom optimalizácie expresie E2A.
Za účelom zmeniť 5'oblasť génu E2A sa vytvorili dva priméry. Oligonukleotid Ad5s(23884) s veľkosťou 18 bp a sekvenciou 5'GCCGCCTCATCCGCTTTT 3' (SEQ ID NO:3) sa používa ako primér pre vnútornú oblasť lemujúcu reštrikčné miesto Srna I génu E2A. Oligonukleotid DBP(ATG)R1 s veľkosťou 32 bp a sekvenciou
5'CCGGAATTCCACCATGGCGAGTCGGGAGTCGGGAAGAGG 3' (SEQ ID NO:4) sa používa pre zavedenie translačnej sekvencie okolo ATG do génu E2A, čím ho modifikuje na perfektnú rozšírenú sekvenciu podľa Kozákovho pravidla a zavádza reštrikčné miesto Eco RI práve na 5'koniec, čo umožňuje klonovanie. Výsledný produkt, ktorý vznikol s použitím vyššie uvedených primérov, sa štiepil reštrikčnými enzýmami Eco R1 a Srna I (NEB) a klonoval sa do identických reštrikčných miest polylinkera pBluescript IIKS+ (Stratagene, La Jolla, CA). Výsledný plazmid sa nazýva pKS/ESDP.
Fragment Srna I až Xba 1 sa izoloval z pHR Kauffman (Morin et al., Mol. Celí. Biol., 9, 4372-4380 (1989)) a klonoval sa do zodpovedajúcich miest Srna I a Xba I pKS/ESDBP za účelom doplnenia čítacieho rámca E2A. Výsledný plazmid sa nazýva pKSDBP. Za účelom eliminovať všetky homológne sekvencie z vektora, ktorý je obsiahnutý v expresívnej kazete, fragment Kpn 1 až Dra I z pKSDBP sa preniesol do korešpondujúcich reštrikčných miest Κρη I a Pme 1 do PNEB193 (NEB), v ktorom sa v polylinkeri porušilo reštrikčné miesto Eco RI (Gen Vec, Rockville, MD). Výsledný kloň pE2A obsahuje všetky čítacie rámce E2A a neobsahuje naviac žiadne sekvencie homológne s vektorom z príkladu 3, ktorý má deléciu E2A.
Kazeta zostrihu na 5'konci sa potom prenesie do pE2A, čo umožňuje správne spracovanie mRNA v jadre a zosilnenie expresie E2A. Za týmto účelom pRK.5 opísaný v príklade 1 sa štiepi reštrikčným enzýmom Sac II (NEB), tupé konce sú upravené nukleázou z fazúľ Mung (NEB) a štiepia sa reštrikčným enzýmom Eco RI (NEB). Výsledkom je fragment s veľkosťou okolo 240 bp, ktorý obsahuje signály zostrihu. Tento fragment sa klonuje do reštrikčných miest Cla I (tupé konce upravené Klenow fragmentom) až Eco RI pE2A za vzniku p5'E2A. Fragment Sal I až Hind III s tupými koncami (Klenow) z p5'E2A, ktorý obsahuje sekvencie E2A, sa preniesol do Xba I reštrikčného miesta s tupým koncom (Klenow) pSMT/puro a pSMT/neo. Výsledný E2A sa nazýva pKSE2A.
Fragment Xba I z pKSE2A, ktorý obsahoval celý gén E2A, sa preniesol do Xba 1 reštrikčného miesta pSMT/puro a pSMT/neo. Výsledné expresívne plazmidy, ktoré obsahujú E2A, pSMT/E2A/puro a pSMT/E2A/neo sa transfikovali do buniek 293/E4 a 203/ORF-6. Bunky transfikované pSMT/E2A/puro sa vybrali na základe rastu v štandardnom médiu s puromycinom a bunky transfikované pSMT/E2A/neo sa vybrali na základe rastu v štandardnom médiu s geneticínom (G418; Life Technologies, Gaithesburg, MD). Klonálna expanzia izolovaných kolónií sa opisuje v príklade 6. U výsledných bunkových línií sa testovala schopnosť doplniť vírusové vektory deficitné v oblastiach El, E4 a E2A.
Uvedené bunkové línie sú vhodné pre komplementárne vektory', ktoré sú deficitné v oblastiach El, E4 a E2A vírusu, ako sú tie opísané v sérii vírusových vektorov AdGvCFTR. 13.
Príklad 8
Tento príklad opisuje prípravu komplementárnych bunkových línií, kde sa ako rodičovská línia používa bunková línia A549 (ATCC).
DNA vírusu Ad2 sa pripravila predtým opísaným spôsobom. Genómová DNA sa štiepi reštrikčnými enzýmami Ssp I a Xho I a fragment s veľkosťou 5438 bp sa čistil a klonoval do miest Eco RV/Xho I pKS+ (Stratagene) za vzniku pKS341-5778. Keď sa určil kloň, fragment Xho I (tupé konce upravené Klenow fragmentom) až Eco RI sa preniesol Nru I (tupý koniec) až Eco RI reštrikčných miest v pRC/CMVneo za vzniku pElneo. Transformácia buniek A549 týmto klonom vedie ku vzniku komplementárnej bunkovej línie (podobnej 293), kam sa môžu začleniť ďalšie expresívne kazety spôsobom podobným spôsobu, ktorý sa opisuje v spojení s bunkami 293. Vznikajú multikomplementárne bunkové línie, ktoré majú skvelý potenciál pre tvorenie plakov.
Príklad 9
Tento príklad je protokol pre prípravu bunkových línií 293/E2A, ktoré sa používajú na konštrukciu adenovírusového vektora, ktorý je deficitný v oblastiach El a E2A.
Vektor s expresívnou kazetou s E2A sa získal v súlade s opisom v príklade 7 a je zobrazený na obrázku č.4. Vektor s expresívnou kazetou s E2A zahrnuje gén, ktorý prepožičiava rezistenciu na neomycín, čo funguje ako marker transfektovaných buniek.
Ako sa tiež opisuje v príklade 7, bunky 293 ša transfikovali pSMT/E2A/neo a transfikované bunky sa vybrali na základe rastu v štandardnom médiu s G418. Klonálna expanzia selektovaných buniek bola uskutočnená podľa príkladu 6. U výsledných bunkových línií sa testovala schopnosť expresie proteínu, ktorý viaže DNA (DBP; produkt génu E2A), a schopnosť doplniť vírusové vektory defektné v oblastiach E1 a E2A.
Pri testovaní schopnosti neomycín pozitívnych (neo+; to je rezistencia na neomycín) klonálnych izolátov bunkových línií 293/E2A exprimovať DBP, bunky rastú z dôvodu udržania selekcie v prítomnosti G418. Monovrstva z nezávislých klonálnych izolátov sa indukovala 100 μΜ ZnCh po dobu 24 hodín a expresia génu DBP sa detegovala imunoblotom s použitím štandardných metód. Zo 62 testovaných línií u 42% bunkových línií neo+ bola expresia DBP pozitívna (DBP+)· Všetky bunkové línie DBP+ vykazujú indukovateľnú expresiu DBP. Nasledujúca tabuľka č. 1 ukazuje dáta z testu expresie DBP:
Tabuľka č. 1
bunková línia expresia DBP bunková línia expresia DBP
> - 202 -
6 - 203 -
9 - 207 -
10 + 208 -
12 + 210 -
13 + 211 -
16 - 212 +
17 + 213 -
19 + 215 -
21 + 216 +
32 + 219 -
35 + 301 +
36 - 302 -
39 + 305 -
41 - 307 -
42 - 309 -
43 - 311 -
52 - 313 -
54 + 314 -
55 - 315 -
57 + 316 -
58 + 317 -
60 - 321 +
61 + 323 -
62 - 324 -
104 + 325 +
107 - 326 -
108 + 327 +
111 - 328 +
112 + 329 +
201 + 330 +
U klonálnych bunkových línií 293/E2A sa následne testovala úroveň indukovateľnej expresie DBP imunoblotom s použitím spôsobu podľa Brough et al., et al., Virology, 190, 624-634 (1992). Výsledky sú uvedené v autorádiograme označenom ako obrázky č. 5 a 6. Ďalej sa analyzovali také bunkové línie, ktoré akumulovali podobnú hladinu DBP, ako je v bunkách gmDBP2 založených na HeLa bunkách. Ako sa uvádza na obrázku č. 5, v lyzáte indukovaných buniek úroveň indukovateľnej expresie DBP kolíše v závislosti od klonálnych izolátov. Napríklad bunkové línie 104, 112 a 216 produkujú po indukcii podstatné množstvo DBP, ako sa vyššie opisuje, zatiaľ čo bunkové línie 19 a 61 neprodukujú väčšie množstvo ako bunky gmDBP2.
U klonálnej bunkovej línie 293/E2A sa tiež analyzovala jej schopnosť akumulovať DBP počas prvých 24 hodín indukcie, opäť s použitím metódy podľa Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992). Ako sa uvádza na obrázku č. 6, testovali sa lyzáty buniek zhromaždených 0, 2, 16 a 24 hodín po indukcii. U niektorých bunkových línií sa zaznamenala počas doby inkubácie progresívna akumulácia DBP, ktorá zodpovedá rastu vírusu.
Pri testovaní komplementácie výslednými bunkovými líniami 293/E2A sa testoval rast vírusu s deléciou E2A na týchto uvedených bunkách s použitím bežných metód. Ako je známe v odbore rast vírusu je možné merať semikvantitatívne jednoduchým pozorovaním tvorenia plakov v monovrstve hostiteľských buniek. U rovnakých línií sa testovala ich relatívna expresia génu E2A, to znamená, že relatívna expresia DBP sa merala prostredníctvom imunoblotu podľa Brought et al., Virology, 190, 624-634 (1992). Relatívna úroveň expresie alebo rastu vzhľadom na predtým uvedené parametre (najnižšia +/- až najvyššia +++++) každej z testovaných bunkových línií je uvedená v tabuľke č. 2.
Tabuľka č. 2
bunková línia relatívna úroveň expresie DBP schopnosť podporiť vírus s deléciou oblasti E2A pri tvorbe plakov
54 ++++++ +++++
61 ++ +
104 ++-H-+ -
112 ++++ ++++++
201 ++++ ++
208 - -
212 +++ +
216 ++++ +/-
325 + -
327 +++ -
328 +++ -
330 +++++ -
Ako je uvedené v tabuľke č. 2, výsledok tejto štúdie ukazuje, že dve bunkové línie 293/E2A (menovite 54 a 112) podporujú tvorenie plakov u vírusu s deléciou E2A a tak podporujú rast.
Vybrané bunkové línie tiež vykazujú schopnosť doplňovať vektory, ktoré sú deficitné v oblastiach E1 a E2A s použitím kultivačných metód, ktoré sú v odbore rutinou. Také dvojnásobne deficitné vektory sa tvoria spôsobom opísaným v príkladoch 1 a 2. Obrázok č. 7 dokladá štruktúru AdcvCFTR.12B, ktorý je adenovirusový vektor deficitný v oblastiach E1 a E2A. Prítomnosť vektora AdcvCFTR. 12B v troch rôznych lyzátoch transfektovaných pasážovaných bu niek sa určila detekciou sekvencií DNA spojených s vektorom pomocou štandardného PCR testu. U troch rôznych lyzátov sa oddelene testovala prítomnosť sekvencií CFTR (stĺpce označené písmenom “A” na obrázku č. 8), neprítomnosť sekvencií E2A, to je dôkaz delécie (stĺpce označené písmenom “B”) a prítomnosť sekvencií divokého typu E2A (stĺpce označené písmenom “C”). Experiment sa môže analyzovať na základe fotografie s obráteným kontrastom fragmentov DNA separovaných na géle, ktorý je zafarbený v etidium bromide, čo je zobrazené na obrázku č.
8.
Výsledky ukazujú, že všetky tri lyzáty obsahujú CFTR a deléciu E2A, čo je v súlade so štruktúrou vektora AdcvCFTR. 12B. U týchto lyzátov sa nedetegovali sekvencie E2A divokého typu. Na obrázku č. 8 písmeno “M” označuje DNA marker na určenie veľkosti produktu, znamienko “+” označuje vzorku, v ktorej sa použil pozitívny templát pre danú sadu priméru, znamienko označuje negatívny primér používaný pre každú danú sadu primérov a ako je uvedené vyššie, písmená A, B a C označujú tri testované vírusové lyzáty.
Vytvoril sa adenovírusový vektor, ktorý má delécie v oblastiach El a E2A, a bunkové línie, ktoré majú schopnosť doplniť dvojnásobne deficitný vektor.
Príklad 10
Tento príklad ilustruje použitie E2A delečného plazmidu na expresiu cudzorodej DNA.
Plazmid pGV13(0) s deléciou E2A, ako sa opisuje v príklade 3, sa použil na konštrukciu sérií vektorov GV12B. Modifikácie pGV13(0) zahrnujú substitúciu jediného reštrikčného miesta Sce I za Cla I a zmenu oblasti obklopujúcej ATG génu E2A za účelom optimalizácie sekvencie podľa Kozákovho pravidla. Reportný gén (β-glukuronidáza), ktorý je lemovaný reštrikčnými miestami Sce I, sa začlenil na miesto génu E2A tak, že reportný gén sa exprimuje ako odozva na všetky signály používané na expresiu väčšiny skorých génov, to je DBP. U výsledného plazmidu (pGBSE2GUS) sa testovala funkčnosť transfekciou a následným stanovením β-glukuronidázovej aktivity; všetky testované transfekované bunkové línie vykazujú vysokú úroveň expresie βglukuronidázy, ktorá sa deteguje tvorením modrej farby, keď β-glukuronidáza katalyzuje reakciu so substrátom X-glu.
Iný vírusový vektor (AdGvLuc;E2GUS), ktorý je zobrazený na obrázku č. 9 sa skonštruoval, aby demonštroval využitie deletovanej oblasti E2 pre umiestnenie cudzorodej DNA za účelom napríklad génovej terapie. Vektor AdcvLuc;E2GUS obsahuje v oblasti El marker CMV luciferázu a E2 β-glukuronidázu v oblasti E2A. Predchádzajúci vektor (AdevLuc. 10) sa používal na transfekciu buniek 293/E2A; pri následnom farbení výsledných vírusových plakov v prípade β-glukuronidázy s použitím X-glu sa neobjavilo modré zafarbenie, to znamená, že sa nedetegovala β-glukuronidázová aktivita. Plaky, ktoré sa vytvorili z buniek 293/E2A transfikovaných vektorom Adc,vLuc;E2GUS, tvoria po pridaní X-glu podstatné množstvo modrej farby.
V podstate cudzorodá DNA substituovaná v oblasti E2A adenovírusového vektora môže fungovať.
Príklad 11
Tento príklad uvádza protokol pre prípravu bunkovej línie 293/ORF6 a jej použitie na konštrukciu adenovírusového vektora, ktorý je defektný v oboch oblastiach El a E4.
Expresívna kazeta E4-ORF6 uvedená na obrázku č. 10 sa skonštruovala pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) (PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, lnnis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990)) s použitím primérov A5s(33190)P a A5a(34084)P, pričom sa amplifikuje ORF-6 gén Ad5 E4 a na koncoch vznikajú Pac I reštrikčné miesta vhodné na klonovanie. Amplifikovaný fragment sa upravil Klenow fragmentom a vznikli tak tupé konce. Tento fragment sa klonoval do pCR-Script SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA). Výsledný plazmid pCR/ORF-6 sa sekvenoval a potom sa inzert ORF-6 preniesol do expresívneho vektora pSMT/puro, ktorý sa vytvoril ligáciou fragmentu Eco R1 až Hin dlll s tupými koncami a ktorý obsahuje promótor SMT, do miesta Mlu 1 až Hin dlll v pRCpuro za vzniku pSMT/ORF-6.
Transfekcia buniek 293 sa uskutočnila s pSMT/ORF6/puro a transfekované bunky sa vybrali na základe rastu v štandardnom médiu s pyromycínom. Klonálna expanzia sa urobila spôsobom, ktorý sa opisuje v príklade 6. U výsledných bunkových línii sa testovala schopnosť exprimovať E4-ORF6 na základe indukcie a schopnosť doplniť vírusové vektory deficitné v oblastiach El a E4.
U klonálnych izolátov bunkových línií 293/ORF6 rezistentných na pyromycín (puro+; to znamená rezistentné na puromycín) sa testovala schopnosť exprimovať 0RF6. Bunky sa kultivovali v prítomnosti pyromycínu za účelom udržania selekcie. Monovrstva vytvorená z nezávislých klonálnych izolátov sa indukovala 100 μΜ ZnCh po dobu 24 hodín. Expresia génu ORF6 sa detegovala Northern prenosom, pričom sa určil transkript RNA. Relatívna úroveň expresie (najnižšia (+) až najvyššia +++++) každej testovanej bunkovej línie je uvedená v tabuľke č. 3:
Tabuľka č. 3
bunková línia expresia ORF6 bunková línia expresia ORF6
A2 +++ B8 ++
A2-1 (+) B8-1 (+)
A2-2 ω B8-2 +++
A2-3 - B8-3 +
A2-4 (+) B8-4 +
A2-5 (+) B8-5 (+)
A2-6 - B8-6 -
A2-7 (+) B8-7 +
A2-8 - B8-8 ++
A2-9 (+) B8-9B ++
A2-10 - 8-10 (+)
A2-11 - B8-14 (+)
A2-12 + B8-16
A2-13 - B8-18
A2-14 +++++ B8-19
A2-24 - B8-20
A2-32 ++++ B8-21
A2-59 - B8-23
B8-22 - B8-27
B8-24 - B8-27 -
Výsledkom testu expresie génu ORF6 je skutočnosť, že u 53% bunkových línií rezistentných na puromycin sa vyskytovali transkripty ORF6 a všetky také pozitívne bunkové línie vykazujú indukovateľnú expresiu 0RF6.
PCR sa tiež používala pri detekcii inzercie génu pri delécii oblasti E4 adenovírusového vektora, ktorej výsledky sa uvádzajú na obrázku č. 11. Pasážované lyzáty transfikovaných buniek s Adcvpgal.l I sa podrobili PCR, pričom sa amplifikovali isté génové sekvencie spojené s oblasťou E4 divokého typu, menovite s fragmentárni s veľkosťou 3087’ bp a 367 bp. DNA z lyzátov z buniek 293/ORF6 (dráha 1) slepo infikovaných, buniek infikovaných Adc,vPgal,10 (dráha 2) a buniek infikovaných AdovPgal. 11 (dráha 3) sa podrobili gélovej elektroforéze a zafarbeniu v etidium bromide. Fotografia na obrázku č. 11, ktorá zobrazuje výsledný farbený gél, indikuje, že vektoru AdovPgal. 10 chýba časť oblasti E4, ktorá zahrnuje sekvenciu s veľkosťou 367 bp a u vektora AdovPgal. 11 chýba časť oblasti E4, ktorá zahrnuje sekvenciu s veľkosťou 3087 bp.
Sledoval sa rast vektora, kde je deletovaná oblasť E4, v bunkovej línii 293/ORF6. Bunky sa infikovali pri multiplicite infekcie (moi) 10 a rast vírusu sa monitoroval komplementárnou plakovou analýzou po piatich dňoch rastu. Výsledky sú znázornené na obrázku č. 12, čo je stĺpcový graf, kde sa na os y vynášajú jednotky tvoriace plaky (PFU) na bunku a na osi x je identifikovaná testovaná bunková línia. Ako pozitívna kontrola rastu sa použila bunková línia W162, čo je bunková línia, ktorá je schopná doplniť funkciu E4. Ako negatívna kontrola sa použili bunky 293, ktoré doplňujú funkciu El. Bunkové línie A2, B8, 216 a 406 sú nezávislé izoláty bunkových línií 293/ORF6, ktoré vykazujú kolísavú kvantitatívnu komplementáciu E4 deletovaného vírusu (<7/3 66). Identifikovali sa bunkové línie, ktoré doplňujú funkciu E4, pričom umožňujú rast vírusu s deléciou E4, ktorý je schopný niesť funkčné cudzorodé DNA. Tieto bunkové línie sú vhodné na komplementáciu vektorov, ktoré sú dvojnásobne deficitné vo vírusových oblastiach El a E4, rovnako ako tie vyššie opísané zahrnuté v sériách AdovCFTR. 11 alebo ako ukazuje obrázok č. 13, ktorý schematicky zobrazuje vektor AdcvP-gal.il. Vektor AdcvP-gal.il nesie gén Pgalaktozidázy začlenený v oblasti El a deletovanú oblasť E4.
Príklad 12
Tento príklad opisuje použitie adenovirusových vektorov, ktoré majú delécie v oblastiach El a E4.
Piazmid deletovaný v oblasti E4, ktorý sa nazýva pGBSAE4 sa modifikoval, tak že obsahuje niekoľko jediných reštrikčných miest. Tieto miesta sa používajú na klonovanie vhodnej cudzorodej DNA do tejto oblasti s použitím adenovirusového promótora E4, ktorý je vhodný na expresiu. Ako sa opisuje vyššie, pri klonování β-glukuronidázy do tejto oblasti vzniká perfektne fungujúci vektor, ktorý exprimuje cudzorodú DNA. Ak sa do rovnakého vektora do oboch oblastí El a E4 umiestnia vhodné odlišné cudzorodé DNA, môžu sa obe exprimovať a ich expresia sa riadi promótormi El a E4 alebo ak je to nutné aj inými promótormi.
Druhá modifikácia oblasti E4 umožňuje expresiu vhodnej cudzorodej DNA prostredníctvom rôznych heterológnych riadiacich elementov. Konštrukcia plazmidu sa urobila tak, že veľmi ľahko sa môže uskutočniť rad zmien. Multiplazmid pGV. 11S obsahuje nasledujúce rysy, ktoré sa môžu ľahko meniť:
1. adenovírusový segment, ktorý sa môže použiť pri homológnej rekombinácii, pri ligácii pre začlenenie cudzorodej DNA buď na koniec El alebo na koniec E4 vektora;
2. segment promótora;
3. segment signálu zostrihu;
4. segment cudzorodej DNA;
5. polyadenylačný segment,
6. adenovírusová sekvencia pre balenie;
7. adenovírusová ITR; a
8. všetky sekvencie plazmidovej DNA nevyhnutné k selekcii a rastu plazmidu v baktériách, rovnako ako v cicavčej tkanivovej kultúre.
Príklad 13
Príklad opisuje prípravu jedného uskutočnenia vynálezu, ktoré zahrnuje Adov.llS, menovite AdcvCFTR. 1 1 S, ktorý obsahuje intergénovú sekvenciu, ktorá je začlenená do oblasti de letovanej E4 prítomnej v Adcv-ll· Podobne intergénová sekvencia sa môže začleniť do oblasti delécie E4, napríklad Adcv. 12S a Adcv.l3S.
Rekombinantný vírus AdcvCFTR. 11S sa skonštruoval, izoloval a pomnožil s použitím postupov opísaných v prípade prípravy AdcvCFTR. 11, ako sa uvádza v príklade 2. AdcvCFTR. 11S sa skonštruoval spôsobom jednoduchej in vivo rekombinácie medzi pozíciami 1 až 27082, to je ľavé rameno AdcvCFTR.10 a plazmid pGVllS, pravé rameno linearizované reštrikčnými enzýmami Bam Hl (NEB) a Sal I (NEB). Výsledný vektor AdcvCFTR. 11S je v podstate El a E4 deficitný a má začlenenú intergénovú sekvenciu v deletovanej oblasti E4, rovnako ako polyadenylačnú sekvenciu SV40. Vektor tiež obsahuje polyadenylačnú sekvenciu E4 a promótor E4, ktorý pochádza z oblasti E4 adenovirusového genómu.
Oblasť vlákno/E4 vektora AdcvCFTR. 11S je zobrazená na obrázku č. 14C. Za účelom porovnania rôzne iné vektory podľa vynálezu sú zobrazené na obrázkoch č. 14A a 14B. Vektor na obrázku č. 14A má deléciu celej oblasti E4 fuzujúcej vlákno L5 s pravostrannou ITR. Taký vektor v porovnaní s adenovírusom divokého typu obsahuje deléciu oblasti E4 s veľkosťou 2,5 kb. V nasledujúcich príkladoch sa opisujú rôzne charakteristiky AdcvCFTR. 11S (obrázok č. 14C), ktoré sa porovnávajú s vektormi založenými na Adcv.l 1 (obrázok č. 14B) a s ďalšími vektormi.
Príklad 14
Príklad opisuje charakterizáciu chovania rastu a produkciu proteínu vlákna vektora deficitného v oblastiach El a E4 v porovnaní s vektorom, ktorý je deficitný v oblasti El a nesie oblasť E4 divokého typu.
V týchto experimentoch sa použil vektor AdcvPgal.lO, ktorý je deficitný v oblastiach El a E3, a vektor Adcv3gal.l 1, ktorý je deficitný v oblastiach El a E4. Týmito vektormi sa infikovala kompetentná bunková línia 293/ORF-6. Analýza imunoblotom prebehla s použitím lyzátu buniek 293/ORF6, ako sa opisuje v príklade 9. V tomto experimente sa použilo králičie sérum určené proti adenovírusovému kapsidu. Uvedené protilátky rozpoznávajú všetky štrukturálne proteiny adenovirusového kapsidu.
4ô
Ako je uvedené na obrázku č. 15, viacnásobné replikačne deficitné ΕΓ E4' adenovírusové vektory v porovnaní s jednoducho replikačne deficitnými adenovírusovými vektormi s deléciou oblasti El vykazujú redukovanú expresiu vlákna a redukovaný rast vírusu. V bunkách infikovaných vektorom, ktorý obsahuje delécie EI a E4 (to je vektor Adovpgal. 11; dráha 3) v porovnaní s bunkami infikovanými vektorom Ε1Έ4+ (to je vektor AdGVPgal.lO; dráha 2) existuje deficit v produkcii niekoľkých neskorých proteínov, obzvlášť proteínu vlákna. Redukcia proteínu vlákna vo vektore Ε1Έ4+ zodpovedá približne 50 násobku.
Účinok tohto deficitu v zmysle produkcie zrelých viriónov sa skúmal odhadom množstva proteínu vlákna, ktorý je prítomný v čistenom kapside. Partikuly vírusu (kapsidy) sa izolovali pomocou troch sekvenčných gradientov cézium chloride s použitím štandardného protokolu pre produkciu vektora. Analýza imunoblotom s použitím protilátok určených proti adenovírusovému proteínu vlákna sa uskutočnila po porušení kapsidov povarením a elektroforéze na SDS/polyakrylamidovom géle.
Výsledky týchto experimentov sú znázornené na obrázku č. 16. Ako je zrejmé z obrázku č. 16, podobné hladiny proteínu vlákna sa produkujú v bunkách infikovaných vektorom deficitným v oblasti El (to je AdGV3gal.lO, dráha 1) v porovnaní s bunkami infikovanými vektorom Ε1Έ4’ (to je AdcvPgal.ll, dráha 2). Vzhľadom k tomu, že vektor Ε1Έ4' neprodukuje hladinu proteínu vlákna, ktorá by dosahovala produkciu jednoducho replikačne deficitného vektora (v tomto prípade vektora E ľ), tieto výsledky naznačujú, že redukovaná produkcia proteínu vlákna spôsobuje zníženie celkového počtu kapsidov, ktoré sa môžu vytvoriť v infikovaných bunkách.
Príklad 15
Tento príklad opisuje produkciu proteínu vlákna pozorovanú po infekcii bunky vektorom, ktorý je deficitný v oblasti E4 a ktorý obsahuje intergénovú sekvenciu v oblasti E4, čo sa porovnáva s infekciou bunky vektorom deficitným v oblasti E4, ktorému chýba v adenovírusovom genóme taká intergénová sekvencia.
V týchto experimentoch sa použili vektory opísané v príklade 14. Testoval sa vektor AdGvCFTR. 11 S, ktorý je deficitný v oblastiach El a E4 založený na vektore AdGv. 11S. Tento vektor ďalej obsahuje deléciu oblasti E3 a intergénovú sekvenciu začlenenú do deletovanej oblasti E4 v Adcv-l I, ako sa opisuje v príklade 13.
Výsledky týchto štúdií sú zobrazené na obrázku č. 17. Ako je možné vidieť na obrázku č. 17, inkorporácia intergénovej sekvencie do oblasti delécie E4 umožňuje produkciu proteínu vlákna L5, ktorej úroveň dosahuje produkciu získanú jednoducho replikačne deficitným adenovírusovým vektorom. Zatiaľ čo došlo v bunkách infikovaných vektorom Adcvpgal.l 1 (dráha 3) ku zrušeniu produkcie vlákna, množstvo vlákna pozorovaného v bunkách infikovaných viacnásobne replikačne deficitným E ľ E4‘ vektorom, ktorý obsahuje intergénovú sekvenciu, to znamená AdcvCFTR. 11S (dráha 4), sa blíži množstvu vlákna pozorovanému v bunkách infikovaných s jednoducho replikačne deficitným E ľ vektorom AdcvPgal.lO (dráha 2).
Tieto výsledky tak potvrdzujú, že inkorporácia intergénovej sekvencie do vektora Ε1Έ4' , obzvlášť do oblasti delécie E4, umožňuje produkciu vlákna, ktorá je podobná produkcii pozorovanej po infekcii bunky vektorom, ktorý má iba deléciu E1.
Príklad 16
Tento príklad opisuje chovanie rastu E4 deficitného vektora, ktorý obsahuje intergénovú sekvenciu v oblasti E4, čo sa porovnáva s E4 deficitným vektorom, ktorému chýba v adenovírusovom genóme intergénová sekvencia.
V týchto experimentoch sa skúmala schopnosť opraviť defekt rastu viacnásobne deficitných adenovírusových vektorov pridaním intergénovej sekvencie do najmenej jednej z deletovaných oblastí. Produkcia aktívnych vírusových partikúl (fokálne tvoriace sa jednotky; ffu) v bunke sa určila ako funkcia času uplynutého po infekcii buniek A232 buď vektorom AdcvPgal. 10 založeným na Adcv. 10, ktorý je deficitný v oblastiach E1 a E3, vektorom AdcvLacZ.l 1 založeným na Adcv-11, ktorý je deficitný v oblastiach E1 a E4 alebo vektorom AdcvCFTR. 11 S, ktorý obsahuje intergénovú sekvenciu v oblasti delécie E4. Bunky A232 sa použili na základe ich schopnosti produkovať vírusy s deléciou E1 a E4. Bunky A232 sú bunky 293/ORF6, ktoré rastú v štandardnom médiu a sú indukované k produkcii ORF6 po infekcii 100 μΜ ZnCI2. Fokálne tvoriace sa jednotky sa určili sériovým riedením a infekciou komplementárnej bunkovej monovrstvy zásobou vírusu. Počet infikovaných buniek sa určil imunochemickou detekciou s použitím proti látok proti DBP alebo produktu génu E2A. Produkcia aktívnych vírusových partikúl sa určila približne 20, 40, 60 a 80 hodín po infekcii.
Výsledky týchto experimentov sú znázornené na obrázku č. 18. Zdá sa, že neexistuje kinetická odlišnosť medzi vektorom Adcv.10 (plné štvorce) deficitným v oblastiach El a E3 a vektorom Adcv. 11S, ktorý je deficitný v oblastiach El, E3 a E4 a obsahuje intergénovú sekvenciu v oblasti delécie E4 (otvorené kolieska). Najslabšiu produkciu viriónov vykazuje vektor Adcv-llS deficitný v oblastiach El, E3 a E4, ktorý nezahrnuje intergénovú sekvenciu (prázdne kosoštvorce), pričom je možné pozorovať až 100 násobné rozdiely po 16 až 20 hodinách po infekcii.
Následne sa určil výťažok produkcie. Na čistenie vektorových kapsidov sa používajú tri cézium chloridové gradienty. Pri čistení kapsidov vektora musí vírus prejsť rigoróznym čistiacim protokolom. Ako všetky čistiace postupy aj pri tomto dochádza ku strate výťažku. Preto kritická hodnota v týchto experimentoch nie je najvyššia hodnota na rastových krivkách zobrazených na obrázku č. 18, ale skôr úroveň produkcie. Výťažok produkcie (udáva sa počet aktívnych vírusových partikúl v jednej bunke) v bunkách infikovaných rôznymi vektormi je uvedený v tabuľke č. 4.
Tabuľka č. 4
vektor výťažok produkcie
Adcv. 10 (to je AdcvPgal. 10) 650
Adov. 11 (to je AdcvPgal. 11) 22
AdGv. 11S (to je AdGVCFTR. 11 S) 720
Ako ukazujú tieto dáta, začlenenie intergénovej sekvencie do viacnásobne replikačne deficitného E ľ E4' vektora zvyšuje produkciu vírusových partikúl (a možno ju prevyšuje) na úroveň vírusovej produkcie pozorovanej u jednoducho replikačne deficitného vektora deletovaného v oblasti El. Tieto výsledky potvrdzujú, že intergénová sekvencia je schopná pôsobiť proti defektu rastu a znížiť expresiu vlákna pozorovanú u ΕΓ E4‘ viacnásobne replikačne deficitného adenovírusového vektora. Výsledky naznačujú, že začlenenie tejto intergénovej sekvencie do genómu adenovírusu, ktorý obsahuje delécie El a E4, obzvlášť inkorporácie do oblasti delécie E4, umožňuje produkciu vlákna a zvýšenie rastu vírusu podobne ako je tomu u jednoducho replikačne deficitného vektora, ktorý je E1 deficitný.
Príklad 17
Tento príklad opisuje charakteristiky vektorov, ktoré obsahujú delécie v oblasti E2, obzvlášť oblasti E2A, adenovírusového genómu.
Ako sa pozorovalo u E4 mutantov rastové chovanie jednoducho a viacnásobne replikačne deficitných adenovírusov, ktoré obsahujú mutácie v oblasti E2A, sa nepoškodilo. Testovala sa schopnosť rôznych E2A delečných mutantov, ktoré obsahujú sekvencie E1 divokého typu, doplniť bunkové línie podľa vynálezu. Obzvlášť sa študovali skôr opísané adenovirusové vektory ¢//801, ¢//802, ¢//803 a dľšQfl, ktoré obsahujú delécie v oblasti E2A (Rice et al., J. Virol., 56, 767778 (1985); Vos et al., Virology, 172, 634-632 (1988)).
Otvorený čítací rámec E2A obsahuje oblasť od Ad5 nukleotidu 22 443 až do Ad5 nukleotidu 24 032. Produkt génu E2A je proteín viažúci jednoreťazcovú DNA (to je DBP). Vírus ¢//803 obsahuje deléciu E2A ORF od Ad5 nukleotidu 22 542 do Ad5 nukleotidu 23816 a obsahuje E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 816 do Ad5 nukleotidu 24 032. Následne produkt génu ¢//803 oblasti E2A (a jeho varianty) zahrnuje chimérický proteín, ktorý obsahuje časť proteinu DBP, ktorý vznikol transláciou normálneho čítacieho rámca (to znamená divokého typu) spojeného s ďalšími proteínovými sekvenciami, ktorý vznikol použitím alternatívneho čítacieho rámca nasledujúceho po delécii. Oblasť proteinu DBP, ktorá nenesie chimérický proteín, čo spôsobuje deléciu (to je oblasť “Ct”), sa implikovala do replikácie DNA, viazania ssDNA a viazania mRNA (Brough et al., Virology, 196, 269-281 (1993)). Pre porovnanie oblasť poškodená z časti vektorom (to je oblasť “Nt”) sa zúčastňuje pri lokalizácii v jadre a expresii neskorých génov (Brough et al., Virology, 190, 624-634 (1992)).
Vírusy ¢//801 a ¢//802 zahrnujú modifikácie vírusu ¢//803. Vírus ¢//802 ďalej obsahuje delécie E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 816 až Ad5 nukleotidu 23 969 tak, že výsledný delečný vírus obsahuje E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 969 do Ad5 nukleotidu 24 02. Podobne vírus ¢//801 ďalej obsahuje v rámci delécie E2A ORF od Ad5 nukleotidu 23 816 do Ad5 nukleotidu 24 011 tak, že výsledný delečný vektor obsahuje E2A ORF od Ad5 nukleotidu 24 011 do Ad5 nukleotidu 24 032. Pre porovnanie rZ/807 obsahuje v rámci delécie E2A ORF od Ad5 nukleotidu
882 do Ad5 nukleotidu 23 954.
Pri štúdiu chovania rastu týchto rôznych delečných vektorov sa zistilo, že isté segmenty oblasti E2A adenovírusového genómu nemôžu byť komplementované a musia byť zahrnuté do (alebo dané späť do) adenovírusového vektora, aby umožnili rast vírusu. Výsledky týchto experimentov sú uvedené na obrázku č. 19. Delécia mutantu <7/803 (ktorý čiastočne obsahuje oblasť Nt a chýba mu oblasť Ct divokého typu) je plne funkčná a nevykazuje rastový deficit v komplementácii E2A bunkových línií. Pre porovnanie vektory ď/807, <7/802 (dáta nie sú uvedené) a <7/801 vykazujú oslabený fenotyp, ktorý nemôže byť komplementovaný v expresívnych E2A bunkových líniách. Vektor <7/801 vykazuje fenotyp extrémne malých plakov [-/+]. Tieto výsledky potvrdzujú, že oblasť, ktorá zostala v <7/803, obsahujúca Ad5 nukleotid 23 816 až Ad5 nukleotid
032 je nutná pre zlepšenie delécie E2A a replikáciu E2A delečných vektorov v súčasne dostupných komplementujúcich bunkových líniách.
SEKVENČNÝ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 32 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1
CACTTAATTA AACGCCTACA TGGGGGTAGA GT 32 (2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 34 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Opis sekvencie: SEQ ID NO:2
CACTTAATTA AGGAAATATG ACTACGTCCG GCGT (2) Údaje k SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 18 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (syntetická) (i i i) Opis sekvencie: SEQ ID NO:3
GCCGCCTCAT CCGCTTTT (2) Údaje k SEQ ID NO: 4 (i) Charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 32 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (syntetická) (i i i) Opis sekvencie. SEQ ID NO:4
CCGGAATTCC ACCATGGCGA GTCGGGAAGA GG

Claims (32)

1. Adenovírusový vektor, ktorý je deficitný v jednej alebo viacerých podstatných génových funkciách oblasti E4 adenovírusového genómu, kde tento adenovírusový vektor zahrnuje v oblasti E4 adenovírusového genómu intergénovú sekvenciu s aspoň asi 15 pármi báz.
2. Adenovírusový vektor podľa nároku 1, kde uvedená intergénová sekvencia zahrnuje polyadenylačnú sekvenciu.
3. Adenovírusový vektor podľa nároku 1 alebo 2, kde boli deletované všetky otvorené čítacie rámce oblasti E4 adenovírusového genómu.
4. Adenovírusový vektor podľa nároku 1 alebo 2, kde uvedená oblasť E4 uvedeného adenovírusového vektora je deletovaná a uvedená intergénová sekvencia sa nachádza medzi pravostrannou ITR a zvyškom genómu.
5. Adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 4, kde uvedený adenovírusový vektor je deficitný v jednej alebo viacerých podstatných génových funkciách oblasti E1 adenovírusového genómu.
6. Adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 5, kde uvedený adenovírusový vektor je deficitný v jednej alebo viacerých podstatných génových funkciách oblasti E2A adenovírusového genómu.
7. Adenovirusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 6, kde uvedený adenovírusový vektor je deficitný vo všetkých podstatných génových funkciách oblasti E1 adenovirusového genómu.
8. Vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 7, kde uvedený adenovírusový vektor je deficitný vo všetkých podstatných génových funkciách oblastí E1 a E2A adenovirusového genómu.
9. Adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 8, kde uvedený adenovírusový vektor je deficitný v oblasti E3 adenovirusového genómu.
10. Adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 9, kde v uvedenom vektore sú deletované všetky otvorené čítacie rámce oblasti E2A adenovirusového genómu iné ako otvorený čítací rámec kódujúci DBP a kde uvedený adenovírusový vektor zahrnuje menej ako asi 230 párov báz otvoreného čítacieho rámca DBP, pričom uvedené sekvencie otvoreného čítacieho rámca DBP kódujú časť domény Nt proteínu DBP, dostačujúcu pre rast vírusu v bunkovej línii, ktorá nedoplňuje nedostatočnosť otvoreného čítacieho rámca DBP.
11. Adenovírusový vektor s deletovanými všetkými otvorenými čítacími rámcami oblasti E2A adenovírusového genómu inými ako otvorený čítací rámec kódujúci DBP, kde uvedený adenovírusový vektor zahrnuje menej ako asi 230 párov báz otvoreného čítacieho rámca DBP, pričom uvedené sekvencie otvoreného čítacieho rámca DBP kódujú časť domény Nt proteínu DBP, dostačujúcu pre rast vírusu v bunkovej línii, ktorá nedoplňuje nedostatky otvoreného čítacieho rámca DBP.
12. Adenovirusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 11, kde uvedený adenovirusový vektor je pripravený v bunkovej línii, schopnej doplniť in trans deficitné podstatné génové funkcie uvedeného adenovirusového vektora.
13. Adenovírusový vektor podľa nároku 1, kde uvedený adenovírusový vektor je Adcv-11 modifikovaný začlenením sekvencie, zahrnujúcej polyadenylačnú sekvenciu, medzi pravostrannú ITR adenovirusového genómu a zvyšok genómu.
14. Adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 13, kde uvedený adenovírusový vektor zahrnuje cudzorodý gén.
15. Adenovírusový vektor podľa nároku 14, kde uvedený cudzorodý gén kóduje terapeutické činidlo.
16. Adenovírusový vektor podľa nároku 14, kde uvedený cudzorodý gén je cystický fibrózny transmembránový regulačný gén.
17. Adenovírusový vektor podľa nároku 14, kde uvedený cudzorodý gén kóduje antisense RNA.
18. Adenovírusový vektor podľa nároku 14, kde uvedený cudzorodý gén kóduje polypeptid schopný vyvolať imunitnú odozvu.
19. Adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 18, kde uvedený adenovírusový vektor je pripravený v bunke za neprítomnosti pomocného vírusu.
20. Použitie adenovirusového vektora podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 19 pri príprave farmaceutickej kompozície.
21. Replikačne kompetentná zásoba adenovírusovéhô vektora podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 19, bez adenovírusu.
22. Zásoba podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že uvedený adenovirusový vektor je pripravený v bunkovej línii schopnej podporiť rast uvedeného adenovírusového vektora, pričom genóm uvedenej bunkovej línie je bez sekvencií prekrývajúcich sa s uvedeným adenovírusovým vektorom, ktoré sú dostačujúce na sprostredkovanie rekombinácie, za vzniku replikačne kompetentného adenovírusového vektora.
23. Zásoba podľa nároku 21 alebo 22, vyznačujúca sa tým, že uvedený adenovirusový vektor je pripravený v bunkovej línii schopnej podporiť rast uvedeného adenovírusového vektora, pričom uvedená zásoba je po jedinej rekombinácii medzi genómom uvedeného adenovírusového vektora a genómom uvedenej bunky bez replikačne kompetentného adenovírusu.
24. Spôsob prípravy adenovírusového vektora podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 19, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje propagáciu uvedeného adenovírusového vektora v bunkovej línii v neprítomnosti pomocného vírusu, pričom uvedená bunková línia je schopná uvedený adenovírusový vektor doplniť in trans.
25. Spôsob zvýšenia propagácie adenovírusového vektora s deletovanou oblasťou E4 adenovírusového genómu v komplementárnej bunkovej línii, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje začlenenie intergénovej sekvencie medzi pravostrannú ITR a zvyšok genómu, pričom uvedená intergénová sekvencia obsahuje aspoň asi 15 párov báz.
26. Spôsob podľa nároku 25, vyznačujúci sa tým, že uvedená intergénová sekvencia je polyadenylačná sekvencia medzi pravostrannou ITR a zvyškom adenovírusového genómu.
27. Spôsob génovej modifikácie bunky, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kontakt uvedenej bunky s adenovirusovým vektorom podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 19.
28. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 19.
29. Hostiteľská bunka, zahrnujúca adenovírusový vektor podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 19.
30. Spôsob testovania toxicity ľubovoľného adenovírusového vektora podľa nárokov 1 až 19 na cieľové bunky, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (1) prípravu kultúry z alikvotu uvedených cieľových buniek, (2) kontakt uvedených cieľových buniek s uvedeným vektorom a (3) meranie vitality uvedených kultivovaných cieľových buniek.
31. Spôsob testovania expresie cudzorodého génu ľubovoľného adenovírusového vektora podľa nároku 14 až 18 pri transfekcii do cieľových buniek, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (1) prípravu kultúry z alikvotu uvedených cieľových buniek, (2) kontakt uvedených cieľových buniek s uvedeným vektorom a (3) meranie expresie uvedeného cudzorodého génu v uvedených cieľových bunkách.
32. Spôsob testovania expresie cudzieho génu ľubovoľného adenovírusového vektora podľa nárokov 14 až 18 pri transfekcii do cieľových buniek, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje (1) prípravu kultúry z alikvotu uvedených cieľových buniek, (2) kontakt uvedených cieľových buniek s uvedeným vektorom a (3) meranie expresie uvedeného cudzieho génu v uvedených cieľových bunkách.
SK785-98A 1995-12-14 1996-12-12 Complementary adenoviral vector systems and cell lines SK78598A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/572,126 US5851806A (en) 1994-06-10 1995-12-14 Complementary adenoviral systems and cell lines
PCT/US1996/019839 WO1997021826A2 (en) 1995-12-14 1996-12-12 Complementary adenoviral vector systems and cell lines

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK78598A3 true SK78598A3 (en) 1998-12-02

Family

ID=24286453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK785-98A SK78598A3 (en) 1995-12-14 1996-12-12 Complementary adenoviral vector systems and cell lines

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5851806A (sk)
EP (1) EP0870049B1 (sk)
JP (2) JP3299761B2 (sk)
AT (1) ATE320503T1 (sk)
AU (1) AU711366B2 (sk)
BG (1) BG62739B1 (sk)
BR (1) BR9612677A (sk)
CA (1) CA2238295C (sk)
CZ (1) CZ182798A3 (sk)
DE (1) DE69635931T2 (sk)
EA (1) EA199800566A1 (sk)
EE (1) EE9800185A (sk)
GE (1) GEP20012559B (sk)
HU (1) HUP9902310A3 (sk)
IL (1) IL124797A0 (sk)
IS (1) IS4762A (sk)
NO (1) NO982687L (sk)
NZ (1) NZ325627A (sk)
PL (1) PL327984A1 (sk)
SK (1) SK78598A3 (sk)
WO (1) WO1997021826A2 (sk)

Families Citing this family (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3816518B2 (ja) * 1994-06-10 2006-08-30 ジェンベク、インコーポレイティッド 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系
US20030148968A1 (en) * 1995-02-28 2003-08-07 Hammond H. Kirk Techniques and compositions for treating cardiovascular disease by in vivo gene delivery
EA001616B1 (ru) 1995-02-28 2001-06-25 Зе Риджентс Оф Зи Юнивесити Оф Кэлифоньэ Способ лечения болезни сердца, способ лечения недостаточности периферических сосудов и способ ограничения доставки и экспрессии трансгенной конструкции в определенном органе или структуре
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
DE69638058D1 (de) * 1995-06-15 2009-11-26 Crucell Holland Bv Verpackungssysteme für humane rekombinante Adenoviren zur Gentherapie
US6265212B1 (en) * 1995-06-15 2001-07-24 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US20060088938A1 (en) * 1995-12-15 2006-04-27 Mitchell Lloyd G Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing in plants
US20020193580A1 (en) * 1995-12-15 2002-12-19 Mitchell Lloyd G. Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US20030027250A1 (en) * 1995-12-15 2003-02-06 Mitchell Lloyd G. Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US7232899B2 (en) 1996-09-25 2007-06-19 The Scripps Research Institute Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
NZ508399A (en) * 1996-09-25 2003-06-30 Novartis Ag Packaging cell lines for use in facilitating the development of high capacity adenoviral vectors
EP1012291B1 (en) * 1997-01-29 2004-10-13 Cornell Research Foundation, Inc. Multiple site delivery of adenoviral vector for the induction of angiogenesis
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US6696423B1 (en) 1997-08-29 2004-02-24 Biogen, Inc. Methods and compositions for therapies using genes encoding secreted proteins such as interferon-beta
CN1342206A (zh) 1998-08-28 2002-03-27 杜克大学 在IVa2,100K和/或preterminal protein序列上有缺失的腺病毒
US6303362B1 (en) 1998-11-19 2001-10-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Adenoviral vector and methods for making and using the same
EP1198559A1 (en) * 1999-04-23 2002-04-24 Introgene B.V. Means and methods for nucleic acid transfer
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
US6627190B2 (en) * 1999-07-12 2003-09-30 Saint Louis University Recombinant adenovirus vectors that are replication-competent in tert-expressing cells
US6613516B1 (en) * 1999-10-30 2003-09-02 Affymetrix, Inc. Preparation of nucleic acid samples
US6867022B1 (en) * 2000-01-21 2005-03-15 Regents Of The University Of Michigan Replication deficient adenovirus vectors and methods of making and using them
US6821775B1 (en) * 2000-02-11 2004-11-23 Genvec, Inc. Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor
US7653769B2 (en) * 2006-12-14 2010-01-26 International Business Machines Corporation Management of devices connected to infiniband ports
US6591543B2 (en) * 2000-04-14 2003-07-15 Kenneth P. Sabine Top water lure with highly active propeller
JP4744771B2 (ja) 2000-05-26 2011-08-10 大日本住友製薬株式会社 副作用を軽減した新規な組換えアデノウイルスベクター
US6579522B1 (en) 2000-06-27 2003-06-17 Genvec, Inc. Replication deficient adenoviral TNF vector
EP1203819A3 (en) * 2000-10-06 2002-08-07 Transgene S.A. Anti-inflammatory vectors
US6573092B1 (en) 2000-10-10 2003-06-03 Genvec, Inc. Method of preparing a eukaryotic viral vector
US20040126774A1 (en) * 2001-01-08 2004-07-01 Mitchell Lioyd G. Correction of factor VIII genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
US6838285B2 (en) 2001-09-18 2005-01-04 Becton Dickinson Site specific recombinase based method for producing adenoviral vectors
US20030087438A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. E1-revertant-free adenoviral composition
US20030086903A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. Therapeutic regimen for treating cancer
US20030158112A1 (en) * 2002-02-15 2003-08-21 Johns Hopkins University School Of Medicine Selective induction of apoptosis to treat ocular disease
US7399753B2 (en) * 2002-02-25 2008-07-15 Virxsys Corporation Trans-splicing mediated photodynamic therapy
EP1504016A4 (en) * 2002-05-08 2006-11-22 Intronn Inc USE OF SPLICEOSOM-MEDIATED RNA-TRANS-SPLICING TO GIVE ADENOVIRES A CELLSELECTIVE REPLICATION
CA2503247A1 (en) * 2002-10-23 2004-05-06 Intronn, Inc. Screening methods for identification of efficient pre-trans-splicing molecules
AU2003297607A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-23 Genvec, Inc Materials and methods for treating ocular-related disorders
US20040166091A1 (en) * 2003-02-24 2004-08-26 Genvec, Inc. Materials and methods for treating disorders of the ear
EP1606313A2 (en) * 2003-03-19 2005-12-21 Isogenis, Inc. Specific inhibition of allograft rejection
ES2391975T3 (es) * 2003-07-25 2012-12-03 Genvec, Inc. Vacunas a base de vector adenovírico
ATE458500T1 (de) * 2003-11-14 2010-03-15 Genvec Inc Pharmazeutische verbindung zur behandlung von lokal fortgeschrittenem primär inoperablen pankreaskarzinom (lapc).
BRPI0416920A (pt) * 2003-11-24 2007-01-23 Canji Inc redução de cicatriz dérmica
US8053232B2 (en) 2004-01-23 2011-11-08 Virxsys Corporation Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
US20060177933A1 (en) * 2004-01-23 2006-08-10 Madaiah Puttaraju Expression of apoA-1 and variants thereof using spliceosome mediated RNA trans-splicing
US7968334B2 (en) * 2004-01-23 2011-06-28 Virxsys Corporation Expression of apoAI and variants thereof using spliceosome mediated RNA trans-splicing
NZ548495A (en) * 2004-02-23 2009-05-31 Crucell Holland Bv Virus purification methods
JP2007528903A (ja) * 2004-03-12 2007-10-18 ジェンベク、インコーポレイティッド 眼における血管漏出を処置するための物質
JP2007532656A (ja) 2004-04-12 2007-11-15 アメリカ合衆国 アデノウイルスベクターを用いて免疫応答を誘導するための方法
WO2006012416A2 (en) * 2004-07-20 2006-02-02 Isogenis, Inc. Specific inhibition of autoimmunity and diseases associated with autoantigens
US20060094110A1 (en) * 2004-07-30 2006-05-04 Mcgarrity Gerard J Use of spliceosome mediated RNA trans-splicing for immunotherapy
US20060134658A1 (en) * 2004-08-09 2006-06-22 Garcia-Blanco Mariano A Use of RNA trans-splicing for generation of interfering RNA molecules
EP1784493A2 (en) * 2004-09-01 2007-05-16 The Government of the United States of America as Represented by The Department of Health and Human Services Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation
DE102004047492B4 (de) * 2004-09-23 2006-07-20 Jost-Werke Gmbh & Co. Kg Verfahren zum Übertragen von elektrischer, pneumatischer oder hydraulischer Energie sowie ein Energieübertragungssystem
US7879321B2 (en) * 2004-10-08 2011-02-01 Virxsys Corporation Use of RNA trans-splicing for antibody gene transfer and antibody polypeptide production
US7871795B2 (en) 2004-10-08 2011-01-18 Virxsys Corporation Targeted trans-splicing of highly abundant transcripts for in vivo production of recombinant proteins
US20060188481A1 (en) * 2005-02-22 2006-08-24 Saitama Medical School Methods for prophylactically or therapeutically treating an animal for an ocular-related disorder
AU2006216671A1 (en) 2005-02-23 2006-08-31 The Uab Research Foundation Alkyl-glycoside enhanced vaccination
DK1869171T4 (en) * 2005-04-11 2016-01-18 Crucell Holland Bv Virus cleaning using ultrafiltration
US8450055B2 (en) * 2005-08-31 2013-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
WO2007027860A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
US9651543B2 (en) 2005-08-31 2017-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
EP1951297A2 (en) * 2005-11-10 2008-08-06 GenVec, Inc. Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine
WO2008086386A2 (en) * 2007-01-09 2008-07-17 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
ATE495239T1 (de) * 2007-03-09 2011-01-15 Vectorlogics Inc Zellen für adenovirusvektor- und proteinherstellung
US20100263066A1 (en) * 2007-04-30 2010-10-14 Medtronic, Inc Inert dna sequences for efficient viral packaging and methods of use
US20090202492A1 (en) * 2008-01-25 2009-08-13 University Of South Florida Adenovirus vaccine utilizing ikk as adjuvant
EP2342321B1 (en) 2008-09-17 2018-04-11 Isogenis, Inc. Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof
JP5770633B2 (ja) * 2008-11-03 2015-08-26 クルセル ホランド ベー ヴェー アデノウイルスベクターの産生方法
AU2010305768B2 (en) 2009-10-15 2015-05-14 Crucell Holland B.V. Process for adenovirus purification from high cell density cultures
BR112012008516B1 (pt) 2009-10-15 2021-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Método para purificar partículas de adenovírus a partir de uma suspensão de célula
US20120219583A1 (en) 2009-10-16 2012-08-30 Los Alamos National Security, Llc Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins
WO2011057254A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
AU2010314842A1 (en) 2009-11-09 2012-05-31 Genvec, Inc. Methods of propagating monkey adenoviral vectors
AU2011214262B2 (en) 2010-02-15 2015-05-21 Crucell Holland B.V. Method for the production of Ad26 adenoviral vectors
US9682133B2 (en) 2010-03-17 2017-06-20 Cornell University Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse
RU2612788C2 (ru) 2010-03-23 2017-03-13 Интрексон Корпорейшн Векторы, условно экспрессирующие терапевтические белки, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и их применение
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
AP3390A (en) 2010-09-20 2015-08-31 Crucell Holland Bv Therapeutic vaccination against active tuberculosis
CA2809463C (en) 2010-09-27 2021-05-25 Crucell Holland B.V. Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria
WO2012083297A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Genvec, Inc. Adenoviral vectors with modified hexon regions
WO2012088041A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based dengue fever vaccine
EP2681327B1 (en) 2011-03-04 2018-11-21 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
JP6757121B2 (ja) 2011-10-05 2020-09-16 ジェンヴェック エルエルシー シミアン（ゴリラ）アデノウイルス又はアデノウイルスベクター、及び使用方法
JP6757120B2 (ja) 2011-10-05 2020-09-16 ジェンヴェック エルエルシー アーフェンアデノウイルス（ゴリラ）又はアデノウイルスベクター、及び使用方法
US9580476B2 (en) 2011-10-05 2017-02-28 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (RSV) vaccine
EP2764012B1 (en) 2011-10-05 2022-02-23 GenVec, Inc. Adenoviral vectors and methods of use
EP2780034A1 (en) 2011-11-14 2014-09-24 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
WO2013116591A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccine
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
SI2825640T1 (sl) 2012-03-12 2016-08-31 Crucell Holland B.V. Šarže rekombinantnega adenovirusa s spremenjenimi konci
CN104334188B (zh) 2012-03-22 2016-08-24 克鲁塞尔荷兰公司 抗rsv疫苗
US9125870B2 (en) 2012-03-22 2015-09-08 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
EP2855669B1 (en) 2012-05-29 2018-10-10 GenVec, Inc. Modified serotype 28 adenoviral vectors
EP2855511B1 (en) 2012-05-29 2019-07-24 GenVec, Inc. Herpes simplex virus vaccine
PL2988780T3 (pl) 2013-04-25 2019-06-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilizowane rozpuszczalne prefuzyjne polipeptydy F RSV
AP2015008893A0 (en) 2013-06-17 2015-12-31 Crucell Holland Bv Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
EP3046536B1 (en) 2013-09-19 2018-11-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Improved adenovirus formulations
US10400015B2 (en) 2014-09-04 2019-09-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use
TWI710635B (zh) * 2014-10-09 2020-11-21 美商珍維克公司 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體
LT3215187T (lt) 2014-11-04 2018-12-27 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Terapinės hpv16 vakcinos
US10420834B2 (en) 2014-12-24 2019-09-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant metapneumovirus F proteins and their use
WO2016118642A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Recombinant human/bovine parainfluenza virus 3 (b/hpiv3) expressing a chimeric rsv/bpiv3 f protein and uses thereof
EP3261665A1 (en) 2015-02-24 2018-01-03 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
ES2836432T3 (es) 2015-03-18 2021-06-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Ensayos para sistemas de expresión recombinante
AU2016249798B2 (en) 2015-04-14 2022-05-26 Janssen Vaccines And Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
JP6840718B2 (ja) 2015-07-07 2021-03-10 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 安定化された可溶性融合前ｒｓｖ ｆポリペプチド
EA039065B1 (ru) 2015-07-07 2021-11-29 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Вакцина против rsv
SG10202001501QA (en) 2015-08-20 2020-04-29 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv18 vaccines
WO2017060329A1 (en) 2015-10-06 2017-04-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for preventing plastic-induced degradation of biologicals
WO2017139392A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
US10808011B2 (en) 2016-03-09 2020-10-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use
ES2858315T3 (es) 2016-04-05 2021-09-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteína F de prefusión de VRS soluble estabilizada para uso en la profilaxis de la infección por VRS
PE20190433A1 (es) 2016-04-05 2019-03-21 Janssen Vaccines And Prevention B V Vacuna contra vrs
JP7053491B2 (ja) 2016-05-02 2022-04-12 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ
IL264119B2 (en) 2016-05-30 2023-04-01 Janssen Vaccines Prevention B V f proteins of rsv are stabilized before fusion
MX2018015540A (es) 2016-06-20 2019-04-11 Janssen Vaccines & Prevention Bv Promotor bidireccional potente y equilibrado.
JP7229151B2 (ja) 2016-07-14 2023-02-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｈｐｖワクチン
CA3038968A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Genvec, Inc. Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into t cells
WO2018067582A2 (en) 2016-10-03 2018-04-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv-1 env fusion peptide immunogens and their use
EP3532095A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Prefusion coronavirus spike proteins and their use
WO2018109220A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof
CN110268061A (zh) 2017-02-09 2019-09-20 扬森疫苗与预防公司 用于表达异源基因的有效的短启动子
US11235056B2 (en) 2017-03-24 2022-02-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Glycan-masked engineered outer domains of HIV-1 gp120 and their use
JP2020519663A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． Ｒｓｖ感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物
AU2018333566A1 (en) 2017-09-15 2020-02-27 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for the safe induction of immunity against RSV
US11136356B2 (en) 2017-10-16 2021-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use
CN111295391B (zh) 2017-10-31 2023-12-05 扬森疫苗与预防公司 腺病毒及其用途
CA3077630A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Adenovirus vectors and uses thereof
MA50502A (fr) 2017-10-31 2020-09-09 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adénovirus et utilisations associées
MX2020004492A (es) 2017-10-31 2020-11-24 Janssen Vaccines & Prevention Bv Adenovirus y usos de los mismos.
SG11202006399VA (en) 2018-01-23 2020-08-28 Janssen Vaccines & Prevention Bv Influenza virus vaccines and uses thereof
CN112135622A (zh) 2018-03-06 2020-12-25 普莱西根股份有限公司 乙型肝炎疫苗及其用途
US20210340188A1 (en) 2018-10-22 2021-11-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
EP3959228A1 (en) 2019-04-25 2022-03-02 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant influenza antigens
US20220193219A1 (en) 2019-05-15 2022-06-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine
US20220273787A1 (en) 2019-05-15 2022-09-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine
CA3140019A1 (en) * 2019-05-30 2020-12-03 Gritstone Bio, Inc. Modified adenoviruses
CA3152957A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof
CA3156471A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. ADENOVIRUS VECTORS AND THEIR USES
CN114761546A (zh) 2019-10-08 2022-07-15 波士顿学院董事会 含有多个不同非天然氨基酸的蛋白质以及制备和使用此类蛋白质的方法
CR20220220A (es) 2019-11-18 2022-09-20 Janssen Biotech Inc Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos
WO2021163365A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sars-cov-2 vaccine
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
CN115484978A (zh) 2020-03-05 2022-12-16 尼奥克斯医疗有限公司 使用免疫细胞治疗癌症的方法和组合物
US11213482B1 (en) 2020-03-05 2022-01-04 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system
US11773391B2 (en) 2020-04-01 2023-10-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19
WO2021209897A1 (en) 2020-04-13 2021-10-21 Janssen Biotech, Inc. Psma and steap1 vaccines and their uses
CN116096407A (zh) 2020-04-29 2023-05-09 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 重组人偏肺病毒f蛋白及其用途
US20230024133A1 (en) 2020-07-06 2023-01-26 Janssen Biotech, Inc. Prostate Neoantigens And Their Uses
WO2022009051A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
WO2022035860A2 (en) 2020-08-10 2022-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Replication-competent adenovirus type 4-hiv env vaccines and their use
WO2022232648A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use
CA3228275A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Genoveffa Franchini Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection
WO2023091696A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Adenovirus delivery system for cancer treatment
WO2023192835A1 (en) 2022-03-27 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use
WO2023196898A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta globin mimetic peptides and their use
EP4338727A1 (en) 2022-09-14 2024-03-20 Roquette Freres Adenovirus formulations

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4405712A (en) * 1981-07-01 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services LTR-Vectors
US5585362A (en) * 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
DE69334238D1 (de) * 1992-09-25 2008-09-25 Aventis Pharma Sa Adenovirus vektoren für die übertragung fremder gene in zellen des zentralen nervensystems, insbesondere im gehirn
ATE307212T1 (de) * 1992-11-18 2005-11-15 Arch Dev Corp Adenovirus-gelenkter gen-transfer zum herz-und glatten vaskulären muskel
AU680459B2 (en) * 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
JP3532566B2 (ja) * 1993-06-24 2004-05-31 エル． グラハム，フランク 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター
FR2707664B1 (fr) * 1993-07-13 1995-09-29 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
KR100356615B1 (ko) * 1993-07-13 2003-04-03 아방티 파르마 소시에테 아노님 결함아데노바이러스벡터및유전자치료에서그의사용
LU88429A1 (fr) * 1993-11-23 1995-07-10 Wurth Paul Sa Dispositif de chargement d'un four à cuve
US5731172A (en) * 1994-03-09 1998-03-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. Recombinant adenovirus and process for producing the same
US5872005A (en) * 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors

Also Published As

Publication number Publication date
EE9800185A (et) 1998-12-15
CZ182798A3 (cs) 1998-11-11
HUP9902310A3 (en) 2001-11-28
HUP9902310A2 (hu) 1999-10-28
DE69635931T2 (de) 2006-11-30
DE69635931D1 (de) 2006-05-11
NO982687D0 (no) 1998-06-11
EP0870049B1 (en) 2006-03-15
JP3299761B2 (ja) 2002-07-08
JPH11502421A (ja) 1999-03-02
IL124797A0 (en) 1999-01-26
US5851806A (en) 1998-12-22
JP2002199894A (ja) 2002-07-16
CA2238295C (en) 2007-04-03
BG102612A (en) 1999-04-30
WO1997021826A3 (en) 1997-09-12
PL327984A1 (en) 1999-01-04
GEP20012559B (en) 2001-10-25
AU711366B2 (en) 1999-10-14
NZ325627A (en) 2000-01-28
CA2238295A1 (en) 1997-06-19
IS4762A (is) 1998-06-03
AU1417797A (en) 1997-07-03
NO982687L (no) 1998-07-13
WO1997021826A2 (en) 1997-06-19
ATE320503T1 (de) 2006-04-15
MX9804716A (es) 1998-10-31
BR9612677A (pt) 1999-07-20
EA199800566A1 (ru) 1999-02-25
EP0870049A2 (en) 1998-10-14
BG62739B1 (bg) 2000-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0870049B1 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
EP0784690B1 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
EP0988389B1 (en) Method for the production of non-group c adenoviral vectors
US5837511A (en) Non-group C adenoviral vectors
WO1997012986A9 (en) Non-group c adenoviral vectors
AU730278B2 (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
AU703768C (en) Complementary adenoviral vector systems and cell lines
MXPA98004716A (en) Complementary systems of adenoviral vectors and cell lines