MXPA99004449A - Procedimiento de produccion de virus recombinantes - Google Patents
Procedimiento de produccion de virus recombinantesInfo
- Publication number
- MXPA99004449A MXPA99004449A MXPA/A/1999/004449A MX9904449A MXPA99004449A MX PA99004449 A MXPA99004449 A MX PA99004449A MX 9904449 A MX9904449 A MX 9904449A MX PA99004449 A MXPA99004449 A MX PA99004449A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- baculovirus
- genome
- adenovirus
- region
- defective
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 88
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 190
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims abstract description 19
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 175
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 114
- 230000003612 virological Effects 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 35
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 23
- 108060006962 recR Proteins 0.000 claims description 22
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 21
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 15
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 13
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 claims description 12
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 claims description 12
- 230000001413 cellular Effects 0.000 claims description 11
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 9
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 claims description 8
- 101710030546 2.5 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700013246 GK Proteins 0.000 claims description 6
- 101700072470 LEF-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710025348 LLNZ_01795 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710018099 MDV066 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710027015 MIMI_R382 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710043203 P23p89 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700040790 PH Proteins 0.000 claims description 6
- 101700051775 Q0010 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710008993 R02471 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710044383 SIFV0006 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710012468 SPAC17C9.14 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700023711 YC06 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700043615 YCB6 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700023747 YLC6 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700072611 YNIU Proteins 0.000 claims description 6
- 101700077907 YO06 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700074007 YOR6 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700016729 YPC6 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700068842 YSC6 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710036780 ZNHIT2 Proteins 0.000 claims description 6
- 108060002873 feoA Proteins 0.000 claims description 6
- 101710013350 gra-orf6 Proteins 0.000 claims description 6
- 101700016844 modF Proteins 0.000 claims description 6
- 101700044617 ycxB Proteins 0.000 claims description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 5
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 2
- 229930002945 all-trans-retinaldehyde Natural products 0.000 claims description 2
- 230000003328 fibroblastic Effects 0.000 claims description 2
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 claims description 2
- 230000002207 retinal Effects 0.000 claims description 2
- 235000020945 retinal Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011604 retinal Substances 0.000 claims description 2
- 230000000576 supplementary Effects 0.000 claims description 2
- 230000001502 supplementation Effects 0.000 claims description 2
- 102100008005 GPR180 Human genes 0.000 claims 2
- 101710028548 GPR180 Proteins 0.000 claims 2
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 claims 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 209
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 6
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M Caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 4
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 4
- 229960005309 Estradiol Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 4
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 4
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 4
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 4
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 102100011343 GLB1 Human genes 0.000 description 3
- 210000003494 Hepatocytes Anatomy 0.000 description 3
- 229940088597 Hormone Drugs 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 241000432074 Adeno-associated virus Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101700086511 CAV2 Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N DEOXYTHYMIDINE Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101700037939 DNAPR Proteins 0.000 description 2
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 2
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 101700030310 FUS Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 229940047650 Haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 201000009030 carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940098124 cesium chloride Drugs 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 102000037240 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 101700018595 gp64 Proteins 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 108060005858 parA Proteins 0.000 description 2
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000002142 suicide Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 1
- CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 3,3-Bis(chloromethyl)oxetane Chemical compound ClCC1(CCl)COC1 CXURGFRDGROIKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CN=C2[C]1C(Cl)=C(Br)C=C2 BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-Derived Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-Derived Neurotrophic Factor Human genes 0.000 description 1
- 102100019230 CAV2 Human genes 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102100007493 CNTF Human genes 0.000 description 1
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 229920002759 Circular DNA Polymers 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000000311 EC 3.5.4.1 Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 EC 3.5.4.1 Proteins 0.000 description 1
- 241000210651 Enterobacteria phage 1 Species 0.000 description 1
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 241000702189 Escherichia virus Mu Species 0.000 description 1
- 102100007155 FGF1 Human genes 0.000 description 1
- 101700064732 FGF1 Proteins 0.000 description 1
- 102100008634 FGF2 Human genes 0.000 description 1
- 101700082364 FGF2 Proteins 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 230000035693 Fab Effects 0.000 description 1
- 229920002024 GDNA Polymers 0.000 description 1
- 101700014779 GLB1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004862 Gastrin releasing peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090001053 Gastrin releasing peptide Proteins 0.000 description 1
- PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N Gastrin-ReleasingPeptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 PUBCCFNQJQKCNC-XKNFJVFFSA-N 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001135574 Human adenovirus 12 Species 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701096 Human adenovirus 7 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 101700040665 IGF Proteins 0.000 description 1
- 102100014231 IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 101700074337 IGF1 Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 229940047124 Interferons Drugs 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 229940047122 Interleukins Drugs 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- 108020004391 Introns Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102100011960 MIR7-3HG Human genes 0.000 description 1
- 101710008473 MIR7-3HG Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 102100017063 NT5E Human genes 0.000 description 1
- 101710039712 NT5E Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 229920000890 Palindromic sequence Polymers 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 102000030951 Phosphotransferases Human genes 0.000 description 1
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-STHVQZNPSA-N Progesterone Natural products O=C(C)[C@@H]1[C@@]2(C)[C@H]([C@H]3[C@@H]([C@]4(C)C(=CC(=O)CC4)CC3)CC2)CC1 RJKFOVLPORLFTN-STHVQZNPSA-N 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 210000001525 Retina Anatomy 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 230000036191 S Phase Effects 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 102100007381 SORT1 Human genes 0.000 description 1
- 108060009346 SORT1 Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000713896 Spleen necrosis virus Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 208000003265 Stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Syngestrets Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 102100009534 TNF Human genes 0.000 description 1
- 101710040537 TNF Proteins 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229940104230 Thymidine Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000003501 Vero Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 1
- 108010073614 apolipoprotein A-IV Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000005047 biotechnology Methods 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned Effects 0.000 description 1
- 229920000407 conserved sequence Polymers 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive Effects 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 101710028189 lsc Proteins 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000006654 negative regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 1
- 230000036633 rest Effects 0.000 description 1
- 200000000008 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 101700057137 sacB Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004991 spatiotemporal regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Abstract
La presente invención se refiere a un método para la producción de virus recombinantes. Este método descansa en particular sobre la utilización de baculovirus para aportar las funciones de complementación. concierne igualmente construcciones utilizadas para la aplicación de este método, las células productoras, y los virus asíobtenidos.
Description
PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE VIRUS RECOMBINANTES
La presente invención concierne un método para la producción de virus recombinantes. Concierne igualmente construcciones utilizadas para aplicación de este método, las células productoras, y los virus asi producidos. Estos virus son utilizables como vectores de clonación y/ó de expresión de genes in vitro, ex vivo ó in vivo.
Los vectores de origen viral son ampliamente utilizados para la clonación. La transferencia y la expresión de genes in vitro (para la producción de proteínas recombinantes, la realización de pruebas de cribaje, el estudio de la regulación de genes, etc.) ex vivo ó in vivo (para la creación de modelos animales, ó en las aproximaciones terapéuticas) . Entre estos virus, se puede citar particularmente los adenovirus , los virus adenoasociados (AAV) , los retrovirus, los virus del herpes ó aún de la viruela vacuna.
La familia de adenoviridae está ampliamente extendida en los mamíferos y los pájaros y reagrupa mas de cien serotipos diferentes de virus no-recubiertos de ADN bicatenario, que poseen una cápsula de simetría icosaédrica (Horeitz. En: REF. 29961 "Fields BN. Knipe DM. Howley PM. de. Virology". Tercera edición en Filafelfia: Raven Publishers, 1996: 2149-2171). Además de su inocuidad el adenovirus posee un tropismo celular muy amplio. Contrariamente al retrovirus cuyo ciclo es dependiente de la división celular, puede infectar las células en división activa como las células quiescentes y su genoma se mantienen bajo forma episomática. Además puede ser producido con títulos elevados (lOn ufp/ml) . De estos intermediarios mayores se hace un vector de selección para el clonaje y la expresión de genes heterólogos. Los adenovirus del grupo C, particularmente de tipo 2 y 5, asi como los adenovirus caninos de tipo CAV-2, cuya biología molecular es la mejor conocida, son el origen de los vectores utilizados actualmente.
El adenovirus posee un genoma lineal de 36 kb, terminado en cada una de sus extremos por secuencias invertidas repetidas (ITR) de 103 bp que comprenden un origen de réplica asi como un indicador de encapsulación situado cerca del ITR izquierdo, (Shenk, Adenovirae: The Viruses Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM. Howley PM, de. Virology. Philadelphia: Raven publishers, 1996: 2111-2148) . Tres familias de genes se expresan el curso del ciclo viral.
- Los genes precoces inmediatos (El, E2, E3 y E4) que están implicados en la regulación de genes celulares que permitan particularmente la entrada de la célula en fase S (E1A) y la inhibición de la apoptosis (E1B) . Intervienen también en la regulación de genes virales precoces ó tardíos al nivel de la transcripción del entrelazado ó del transporte de los ARN mensajeros (E1A, E2A, E4) . Juegan también un papel en la réplica y en las evasiones a la respuesta inmunitaria.
- Los genes precoces tardíos (pIX y Iva2) están relacionados con la regulación de la transcripción de los genes tardíos (Iva2) ó a la reunión del virión (pIX) .
- Los genes tardíos (Y.l a Y.5) son transcritos a partir del promotor fuerte (MLP) . Un transcrito primario de 28 kb permite generar los transcritos correspondientes a las diferentes proteínas estructurales (core, penton, hexon) y no estructurales que participan en la reunión y maduración de las partículas virales, por entrelazado alternativo e utilización de 5 sitios de poliadenilación.
Vectores adenovirales han sido utilizados para la clonación y la expresión de genes in vitro (Gluzman y colaboradores, Cold spring Harbor, New York 11724, p. 187) . Para la creación de animales transgénicos (W095/22616) para la transferencia de genes en ce 'lulas ex vivo (W095/14785; O95/06120) ó aún para la tranferencia de genes en células in vivo (ver particualrmente 093/19191, W094/24297, WO94/08026) .
En lo que concierne los virus adeno-asociados (AAV) , se trata de virus con ADN de tamaño relativamente reducido, que se integran al genoma de las células que infectan, de manera estable y relativamente sitio-especifica. Son capaces de infectar un amplio espectro de células, sin inducir efecto sobre el crecimiento, la morfología ó la diferenciación celulares. Por otra parte, no parecen implicados en patologías en el hombre, el genoma de los AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. comprende aproximadamente 4700 bases, y contienen en cada extremo una región repetida invertida (ITR) de 145 bases aproximadamente, que sirven de origen de réplica para el virus, el resto del genoma es dividido en dos regiones esenciales que contienen las funciones de encapsulación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la réplica viral y la expresión de los genes virales; la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica para las proteínas de cápsula del virus.
La utilización de vectores derivados de AAV para la transferencia de genes in vitro e in vivo ha sido descrito en la literatura (ver particularmente WO 91/18088: WO 93/09239: US4,797,368, US5,139,941, EP 488 528).
En lo que concierne los retrovirus, se trata de virus integrativos, que infectan selectivamente las células en división. Constituyen entonces vectores de interés para aplicaciones en cáncer ó restenosis por ejemplo. El genoma de los retrovirus comprende esencialmente dos LTR, una secuencia de encapsulación y tres regiones codificantes (gag, pol y env) , la construcción de vectores recombinantes y su utilización in vitro ó in vivo ha sido ampliamente descrita en la literatura: ver particularmente Breakfield y colaboradores, New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, Bernstein y colaboradores Genet. Eng. 7(1985)235; McCormick, Bio Technology 3 (1985) 689.
Para su utilización como vectores recombinantes, diferentes construcciones derivadas de los virus han sido preparadas, incorporando diferentes genes de interés, en cada una de estas construcciones, el genoma viral ha sido modificado de manera de convertir al virus capaz de réplica autónoma en la célula infectada. De esa manera las construcciones descritas en la especialidad anterior son virus defectuosos para ciertas regiones de su genoma esenciales a la réplica, en particular, tratándose de adenovirus, las construcciones de primera generación presentan una eliminación en la región El, esencial a la réplica viral, al nivel de la cual son insertadas las secuencias de ADN heterólogas (Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195: Gosh-Cloudhury y colaboradores, Gene 50 (1986) 161) . Por otra parte, para mejorar las propiedades del vector, ha sido propuesto crear otras eliminaciones ó modificaciones en el genoma de los adenovirus. Asi, una mutación puntual termosensible ha sido introducida en el mutante tsl25, que permite inactivar la proteina 72kDa de relación al ADN (DBP) codificado por la región E2 (Van der Vliet y colaboradores, 1975) . Otros vectores comprenden una eliminación de otra región esencial a la réplica y/ó a la propagación viral, la región E4. Vectores adenovirales en los cuales las regiones El y E4 son eliminadas poseen una interferencia a la transcripción y una expresión de genes virales muy reducida. Tales vectores han sido descritos por ejemplo en las solicitudes W094/28152, WO95/02697, W096/22378) . Por otra parte, vectores que llevan una modificación al nivel del gen Iva2 han sido igualmente descritos (WO96/10088) . Además vectores llamados "adenovirus mínimo" ó "pseudo-adenovirus" (ó aún AD?) no conteniendo más que las regiones necesarias en cis a la producción del virus (secuencias ITRs y de encapsulación) y desprovistos de toda secuencia viral codificante han sido igualmente descritos (W094/12649, W094/28152, WO95/02697), aunque su producción permanezca muy difícil, como se explica a continuación.
Tratándose de AAV, los vectores descritos están generalmente desprovistos del conjunto de regiones codificantes Rep y Cap, que son substituidas por ácidos nucleicos de interés.
En los vectores recombinantes derivados de los retrovirus, los genes gag, pol y env son generalmente eliminados, total ó parcialmente, y reemplazados por una secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés. Por otra parte los retrovirus recombinantes pueden contener modificaciones al nivel de los LTR para suprimir la actividad transcripcional, asi como secuencias de encapsulación extendidas, que contienen una parte del gen gag (bender y colaboradores, J. Virol. 61 (1987) 1639).
Teniendo en cuenta su carácter defectuoso para la réplica, la producción de estos diferentes virus recombinantes implica la posibilidad de transcomplementar las funciones eliminadas del genoma. La transcomplementación es precisamente el origen de dificultades mayores para la producción de estos virus, y particularmente la aportación de las funciones de transcomplementación.
Dos aproximaciones han sido desarrolladas a este respecto. La primera respuesta sobre la construcción de lineas celulares transcomplementarias, llamadas lineas celulares de encapsulación. La segunda respuesta sobre la utilización de adenovirus helper ó de plásmidos helper.
Diferentes lineas celulares de encapsulación de virus defectuosos han sido construidas. Estás lineas celulares son capaces de producir funciones deficientes en el vector viral. Generalmente, estas lineas celulares contienen, integrada en us genoma, la ó las regiones eliminadas del genoma viral (El, E2, y/ó por ejemplo para el adenovirus; gag, pol y/ó env para el retrovirus, rep y/ó capa para el AAV) .
Una de las lineas celulares conocidas para la producción de adenovirus defectuosos es por ejemplo la linea celular 293 en la cual una parte del genoma del adenovirus ha sido integrada. Más precisamente, la linea celular 293 es una linea de células embrionarias humanas de riñon que contienen el extremo izquierdo (aproximadamente 11-12 %) del genoma del adenovirus serotipo (Ad5) , que comprende el ITR izquierdo, la región de encapsulación, la región El, que incluye Ela y Elb, la región que codifica para la proteina pIX y una parte de la región codificante para la proteina pIVa2. Esta linea celular es capaz de transcomplementar adenovirus recombinantes defectuosos para la región El. Es decir desprovistos de toda ó parte de la región El, y de producir reservas virales que tengan títulos elevados. Esta linea celular es igualmente capaz de producir, a temperatura permitida (32 °C) . reservas de virus que contengan además la mutación E2 termosensible, Otras lineas celulares capaces de complementar la región El han sido descritas, basadas particularmente sobre células de carcinoma de pulmón humano A549 (W094/28152) ó sobre retinoblastos humanos (Hum. Gen. Ther. (1996)215). Por otra parte, lineas celulares capaces de transcomplementar varias funciones del adenovirus han sido igualmente sido desritas. en particular, se puede citar lineas celulares que complementan las regiones El y E4 (Yeh y colaboradores, J. Virol. 70 (1996) 559; Cáncer Gen. Ther. 2 (1995) 322: Krougliak y colaboradores, Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) y lineas celulares que complementan las regiones El y E2 (W094/28152, WO95/02697, WO95/27071).
Diferentes lineas celulares han sido descritas igualmente para la producción de retrovirus defectuosos, generalmente capaces de expresar los genes gag, pol y env. Tales lineas celulares son por ejemplo la linea celular PA317 (US4,861,719), la linea celular PsiCRIP (WO90/02806) , la linea celular GP + envAm-12 (WO89/07150) , la linea celular BOSC (W094/19478) , etc. Para construir retrovirus recombinantes que contengan un ácido nucleico de interés, un plásmido que contenga particularmente los LTR, la secuencia de encapsulación y el mencionado ácido nucleico es construido, luego utilizado para tranfectar una linea celular de encapsulación tal como la descrita anteriormente, capaz de llevar en trans las funciones retrovirales deficientes en el plásmido. Los retrovirus productos son luego purificados por técnicas clásicas.
La utilización de lineas celulares puede no obstante presentar ciertos inconvenientes, costos y que constriñe al nivel industrial construir y validar tales lineas celulares. en efecto, estas lineas celulares deben ser estables y compatibles con utilizaciones industriales. Además, las lineas descritas permiten difícilmente separar la producción de virus replicables contaminantes (RCA) . Por otra parte, estas lineas celulares no permiten actualmente, de manera satisfactoria para una utilización industrial, transcomplementar genomas virales muy fuertemente defectuosos, como por ejemplo adenovirus mínimos tales como los descritos anteriormente. En efecto, el adenovirus posee un genoma organizado en diferentes unidades de transcripción cuya regulación espacio-temporal es muy compleja. La transcomplementación de un adenovirus eliminado de todas las secuencias virales codificantes expresando cada unidad de transcripción separadamente, de forma constitutiva ó condicional a partir de unalinea celular no ha podido ser realizado de manera satisfactoria hasta la fecha. Asi, solo una débil proporción del genoma correspondiente a las regiones El, E4, pIX, y a las tres proteínas codificadas por E2 (pol, DBP y p-TP) ha sido expresado de forma constitutiva a partir de lineas celulares, el resto del genoma corresponde a la unidad mayor de transcripción tardia (MLTU) que produce todos los mensajes de las proteínas estructurales y no-estructurales a partir de un transcrito primario de 28 kb y es activada después de la réplica del genoma. O, para generar adenovirus mínimos, la transcomplementación de estas regiones es indispensable. Estas lineas celulares no permiten tampoco obtener títulos muy elevados de retrovirus recombinantes.
La segunda aproximación consiste en co-transfectar con el genoma viral defectuoso una construcción (plásmido ó adenovirus) que aportan las funciones de complementación. en particular, los AAV recombinantes defectuosos son generalmente preparados por co-transfección, en una linea celular infectada por un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus) , de un plásmido que contenga una secuencia nucleica de interés bordeada de dos regiones repetidas invertidas (ITR) de AAV, y de un plásmido que contenga las funciones de complementación (genes rep y cap) de AAV, .Se han descrito variantes en las solicitudes W095/14771; W095/13365; W095/13392 ó WO95/06743. El inconveniente de utilizar un adenovirus helper reside principalmente en los riesgos de recombinación acrecentados entre el vector adenoviral y el adenovirus helper, y en la dificultad de separar el recombinante del helper en ocasión de la producción y de la purificación de las reservas virales. El inconveniente de utilizar un plásmido helper, por ejemplo un plásmido Rep/cap reside en los niveles de transfección obtenidos, que no permiten producir títulos elevados de virus .
La presente solicitud describe actualmente un nuevo sistema de producción de virus que permite sobremontar estos inconvenientes. El sistema de la invención descansa sobre la utilización de un baculovirus para aportar las funciones de complementación.
El sistema de producción según la invención permite de manera particularmente favorable de liberarse del empleo de lineas celulares de complementación establecidas, evitar los problemas de RCA, y de transcomplementar genomas altamente defectuosos. -Además, el sistema de la invención es aplicanle a toda célula infectable por el virus deseado y por un baculovirus, y ofrece también una gran facilidad de utilización.
Un primer objeto de la invención reside entonces en un procdimiento de producción de virus recombinante defectuosos según el cual se introduce, en una población de células competentes, el genoma del virus recombinante defectuoso y un baculovirus que contenga todo ó parte de las funicones necesarias para la recomplementación del genoma recombinante defectuoso.
El procedimiento de la invención descansa entonces en sobre la utilización de un baculovirus para aportar las funciones complementantes. Diferentes aproximaciones son posibles. Se puede primeramente utilizar células competetentes que no expresen ninguna función de transcomplementación del genoma recombinante defectuoso, en este caso, es posible utilizar ya sea un baculovirus que contenga el conjunto de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso, ó bien varios baculovirus conteniendo cada una ó varias de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso. Es igualmente posible utilizar una población de células competentes capaces de transcomplementar ya una ó varias funciones del genoma recombinante defectuoso (linea celular de encapsulación) . en ese caso, el ó los baculovirus utilizados aportaran únicamente las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso que no son ya transcomplementadas por las células competentes.
Como se indicó anteriormente, las ventajas del sistema de la invención son numerosas en términos de industrialización (no necesita de lineas celulares, ni de RCA, etc.), y en términos de aplicaciones (producción de virus recombinantes aportando todo tipo de eliminaciones, y particularmente adenovirus recombinantes altamente defectuosos) . Además, en la medida en que los baculovirus no se replican en las células humanas, la preparación viral obtenida no está contaminada por el baculovirus. Además, el baculovirus estando muy alejado filogenéticamente de los adenovirus, no hay riesgo de recombinación ó transcomplementación entre los dos. Este sistema permite entonces, de manera favorable, producir reservas concentradas de virus defectuosos, desprovistos de RCA. Este sistema es muy particularmente favorable para la producción de adenovirus recombinantes defectuosos.
Los baculovirus son virus envueltos en ADN bicatenario circular específicos de invertebrados. Su prototipo, AcNPV, tiene un genoma de 133 kb. Es muy utilizado como vector de expresión de genes eucariotas en células de insectos, a partir de dos promotores fuertes (poliedrina (Ph) y PÍO) . (King y Posee. The baculovirus baculovirus expression systeme. London: chapman&Hall, 1992.) AcNPV es capaz de infectar ciertas células de mamíferos pero el genoma no es ni transcrito ni traducido. Recientemente, Hofmann y colaboradores, (PNAS 92 (1995) 10099) han mostrado que invitro células hepatocitarias pueden ser transducidas por un baculovirus recombinado purificado que expresa el gen LacZ. Ninguna toxicidad celular ha sido reportada, igual con una multiplicidad de infecciones de 1000, y la eficiencia de transfección descrita en este articulo es de 50 % aproximadamente para una MOI de 100.
La solicitante ha demostrado actualmente que es posible infectar diferentes tipos celulares con un baculovirus recombinado, en particular, la solicitante ha mostrado que era posible, con un baculovirus recombinado, infectar células de origen humano tales como ce 'lulas embrionarias inmortalizadas. La solicitante ha demostrado igualmente que es posible obtener una eficiencia de transducción muy elevada (> 80 ) . La solicitante ha mostrado igualmente que es posible introducir, en un baculovirus, funciones de complementación de un adenovirus, y expresar estas funciones en una población de células competentes. La solicitante ha también permitido mostrar que el baculovirus constituye un vector inerte que puede ser utilizado favorablemente para la transferencia y la expresión de funciones de complementación de virus en células de mamíferos, particularmente humanos. Otras ventajas del sistema de la invención son particualrmente (i) la gran capacidad de clonación que permite complementar un genoma adenoviral entero y (ii) el desarrollo avanzado de la tecnología del baculovirus.
El baculovirus conteniendo las funciones de complementación del virus es igualmente designado en lo que sigue al baculovirus helper. Puede contener diferentes funciones de complementación del virus.
Asi, el baculovirus helper puede contener la región El del adenovirus. Un baculo-El puede ser utilizado para la producción del adenovirus de primera generación. Es decir adenovirus defectuosos para la región El (Ad?El), cual sea su estatus E3 (por ejemplo defectuoso AdE!?El.?E3 ó no). La producción de adenovirus recombinantes defectuosos de primera generación (defectuosos para la región El, y eventualmente E3) constituye una primera aplicación particularmente ventajosa del procedimientoo de la invención. Como se indicó anteriormente, diferentes lineas celulares han sido descritas en la literatura capaces de transcomplementar la función El (células 293, células A549, células 911, etc.) No obstante, existen zonas de homología entre la región que contiene las funciones de transcomplementación integrada al genoma de la linea celular y el ADN del virus recombinante que se desea producir. De este hecho, en el curso de la producción, difeentes eventos de recombinación pueden producirse, generando partículas virales replicables, particularmente adenocirus de tipo E1+. Puede tratarse de un evento simple de recombinación seguido de una rotura del cromosoma, ó de una doble recombinación. Estos dos tipos de modificaciones conducen a reintegrar en su locus inicial en el seno del genoma adenoviral la región E! contenida en el genoma celular, Por otra parte, teniendo en cuenta títulos elevados de vector recombinante producido por la linea celular 293 (superior a 10?2) , la probabilidad de que esos eventos de combinación tengan lugar es elevada. De hecho, se ha comprobado que numerosos lotes de vectores adenovirales recombinantes defectuosos de primera generación estaban contaminados por partículas virales replicables, lo que puede constituir un inconveniente importante para utilizaciones farmacéuticas, en efecto, la presencia de tales partículas en composiciones terapéuticas inducirían in vivo una propagación viral y una diseminación incontrolada, con riesgos de reacción inflamatoria, de recombinaciones, etc. Los lotes contaminados no pueden entonces ser utilizados en terapia humana .
La presente invención permite remediar estos inconvenientes, en efecto, según una modalidad de aplicación del procedimiento de la invención, el genoma del adenovirus recombinante defectuoso para la región El y eventualmente E3 es introducido en las células competentes, estas células son infectadas, de forma simultánea ó no por un baculovirus que contiene la región El, la región El de adenovirus presente en el baculovirus y el genoma del adenovirus recombinante defectuoso no conteniendo ninguna zona de homología (recubrimiento) susceptible de dar lugar a una recombinación. Según esta modalidad de aplicación, es también posible producir rápidamente, sin linea celular establecida, reservas de adenovirus recombinantes de primera generación desprovistos de RCA. Por otra parte, como se indica a continuación, las reservas de adenovirus recombinantes asi generados, desprovistos de RCA, pueden ser utilizados como material de inicio para una nueva producción, por coinfección en las células competentes con un baculovirus.
El baculovirus helper auxiliar puede igualmente contener la región E2 del adenovirus, en toda ó en parte, particularmente la región E2a y/ó E2b. Un baculo-E2 puede ser utilizado para producir, en células competentes, adenovirus defectuosos para la región E2 (Ad-?E2), y eventualmente para la región E3 (Ad- ?E2, ?E3) . Además, en células competentes capees de complementar la región El del adenovirus, el baculo-E2 puede permitir la producción de adenovirus recombinantes defectuosos para las regiones El y E2 (Ad-?El, ?E2) y eventualmente E3 (Ad-?El, ?E2, ?E3) . asimismo, en células competentes capaces de complementarlas regiones El y E4 del adenovirus (por ejemplo en las células IGRP2), el baculo-E2 puede permitir la producción de adenovirus recombinantes defectuosos para las regiones El, E2 y E4 (Ad-?El, ?E2,?E4) y eventualmente E3 (Ad- ?E1, ?E2, ?E3, ?E4) .
El baculovirus helper puede aún contener la región E4 ( total ó parcial) del adenovirus. Un baculo-E4 puede ser utilizado para producir, en células competentes, adenovirus defectuosos para la región (Ad-?E4), y eventualmente para la región E3 (Ad-?E4, ?E3) . Además, en células competentes capaces de complementar la región El del adenovirus, el baculo-E4 puede permitir la producción de adenovirus recombinantes defectuosos para las regiones El y E4 (Ad-?El, ?E4) y eventualmente E3 (Ad-?El, ?E4, ?E3) .
El baculovirus helper puede también contener las regiones El y E4 (total ó parcial) del adenovirus. Un baculo-El, E4 puede ser utilizado para producir, en células competentes, adenovirus defectuosos para las regiones El y E4
(Ad-?El, ?E4) y eventualmente E3 (Ad-?El, ?E4, ?E3) , como se ilustra en la Figura 1.
Además, para generar virus defectuosos para las regiones El y E4, es igualmente posible utilizar dos baculovirus helper, uno que exprese la función El, el otro la función E4, total ó parcial.
De la misma manera, el baculovirus helper puede contener las regiones El, E2, y E4 (total ó parcial), y eventualmente las regiones que contienen los genes tardíos (L1-L5) .
El baculovirus helper puede igualmente contener las regiones Rep y/ó Cap del AAV. Un baculo-Rep/Cap permite también de complementar, en una linea de células competentes, un genoma de AAV desprovisto de toda secuencia viral codificante (Figura 5) .
El baculovirus puede igualmente contener las regiones gag, pol y/ó de un retrovirus. Un baculo-gag/pol/env permite también complementar, en una linea de células competentes, un genoma retroviral desprovisto de toda secuencia viral codificante. Es igualmente posible utilizar un baculovirus que contenga las regiones gag/po y un segundo baculovirus que contenga la región env.
De una manera general, es preferible que el genoma del virus recombinante defectuoso y las regiones de complementación presentes en el baculovirus no presenten recubrimiento, esto permite en efecto evitar los riesgos de recombinación y asi, la generación de RCA. Esto es particularmente importante para la generación de adenovirus de primera generación (Ad-?El). En este caso, la región El introducida en el baculovirus es definida de modo que no posea secuencia común con el genoma recombinante. Para hacer ésto, es posible por ejemplo eliminar del genoma recombinante una región mas grande que la región complementaria insertada en el baculovirus, como se ilustra en los ejemplos. Esto es igualmente ventajoso para la generación de adenovirus Ad—
?E1, ?E4.
Asi, en una modalidad de realización particular del procedOimiento de la invención, el genoma del virus recombinante defectuoso es introducido en las células competentes, estas células son infectadas, de modo simultáneo ó no, por un baculovirus que contenga total ó parcialmente funciones necesarias para la complementación del genoma defectuoso, las funciones de complementación presentes en el baculovirus y el genoma del virus recombinante defectuoso no contienen zona de homología susceptible de dar lugar a una recombinación. Ventajosamente, el genoma viral es un genoma de adenovirus recombinante defectuoso para la región El y el baculovirus contiene una región del adenovirus capaz de trans-complementar la región El. según otra variante, el genoma viral es un genoma de adenovirus recombinante defectuoso para las regiones El y E4 y el baculovirus contiene dos regiones de adenovirus capaces de transcomplementar dichas regiones en las que dos baculovirus son utilizados, uno conteniendo una región del adenovirus capaz de trans-complementar la región El y la otra una región del adenovirus capaz de trans-complementar la región E4, sin zonas de homología con el genoma adenoviral defectuoso.
Según una modalidad de realización particular, el conjunto de las regiones codificantes del adenovirus es está contenida en uno ó varios baculovirus helper. Según una modalidad de realización más particular, se utiliza un solo baculovirus helper que contenga el conjunto de las regiones codificantes del adenovirus. Un baculovirus helper tal es también utilizable para trans-complementar adenovirus recombinantes mínimos. Un baculovirus tal puede particularmente contener el conjunto de un genoma adenoviral, con excepción de la región de encapsulación y eventualmente de los ITRs, como se ilustró en los ejemplos.
Preparación de las funciones de complementación
Las funciones de complementación introducidas en el baculovirus helper pueden provenir de virus de serotipos diferentes .
Tratándose de adenovirus, existe en efecto diferentes serotipos cuya estructura y propiedades varian un poco, pero que presentan una organización genética comparable. Mas particularmente, las funciones de complementación utilizadas para la construcción de los baculovirus según la invención son procedentes de un adenovirus de origen humano ó animal.
En lo que concierne los aenovirus de origen humano, se puede citar preferencialmente aquellos clasificados en el grupo C. Mas preferencialmente aún, entre los diferentes serotipos de adenovirus humanos, se prefiere utilizar en el marco de la presente invención los adenovirus de tipo 2 ó 5 (Ad2 ó Ad5) . Es igualmente posible utilizar regiones que provienen de adenovirus de tipo 7 ó 12, pertenecientes a los grupos A y B. Entre los diferentes adenovirus de origen animal, se prefiere utilizar en el marco de la invención adenocirus de origen canino, y particularmente todas las cepas de los adenovirus CAV2 [cepa manhattan ó A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo] . Otros adenovirus de origen animal son citados particularmente en la solicitud W094 26914 incorporada a la presente como referencia.
En una modalidad preferida de aplicación de la invención, la función de complementación procede de un genoma de adenovirus humano del grupo C. De manera mas preferencial, procede del genoma de un adenovirus Ad2 ó Ad5.
Las regiones que contienen las diferentes funciones de complementación pueden ser obtenidas a partir de un genoma adenoviral, por cortes enzimáticos según los métodos conocidos del experto en la materia. Estas regiones pueden eventualmente ser modificadas para reducir su tamaño, óreemplazar ciertos elementos de regulación (promotor, mejorador, etc.) por elementos heterólogos. de manera general, estas regiones son preparadas como sigue. El ADN de un adenovirus es purificado por centrifugación sobre gradiente de cloruro de cesio u obtenido in vitro a partir de un plásmido pxocariota (WO96/25506) ó eucariota (WO95/03400) . el ADN es entonces dividido por enzimas de restricción apropiadas y los fragmentos obtenidos, que contienen las funciones de complementación investigadas son identificadas y selecciondas. La selección de las enzimas de restricción utilizadas dependen de las funciones de complementación investigadas. Es a continuación dirigidopor las cartas de restricción y las secuencias publicadas de los genomas adenovirales. Asi, la región El puede ser aislada bajo forma de fragmentos que contienen todos los marcos de lectura de E1A y E1B hacia arriba del promotor E1A. La región E4 puede ser aislada bajo forma de fragmentos que contienen el conjunto de las fases de lectura, ó solamente una parte de entre ellas, y preferencialmente las fases ORF3 ó 0RF6 ó ORF6-ORF6/7.
Metodologías similares son aplicadas para preparar las regiones de complementación de AAV y de retrovirus recombinantes. Asi, las regiones rep y ó cap del AAV pueden ser obtenidas por corte enzimático a partir del ADN viral aislado de diferentes serotipos de AAV. Se trata preferencialmente de AAV-2. Para los retrovirus, las regiones gag, pol y/ó env pueden igualmente ser obtenidos según las técnicas clásicas de biología molecular, a partir de diferentes tipos de retrovirus tales como particularmente el MoMuLV ("Murine Moloney Leukemia Virus"; aún designado MoMLV) . el MSV ("Murine Moloney Sarcoma Virus"), el HaSV ("Harvey Sarcoma Virus") ; el SNV ("Spleen Necrosis Virus") ; el RSV ("Rous Sarcoma Virus") ó aún el virus de Friend.
Construcción del baculovirus helper auxiliar
Los fragmentos que contienen las regiones de complementación son luego subclonados en un vector plasmidico que permite su manipulación (digestión mas finas, PCR, adiciones de secuencias de regulación, etc) , por ejemplo en un organismo procariota ó eucariota. El fragmento final obtenido, que codifica para la ó las funciones de complementación, es entonces introducido en el baculovirus helper utilizando las técnicas clásicas de biología molecular. Precisamente, el fragmento es clonado entre dos secuencias homologas en una región del genoma de un baculovirus en células de insectos (clásicamente Sf9 y Sf21, células de spodoptera frugiperda, pero igualmente Tn-368 y High-five™ BT1-TN-5B1-4 (Gibco) , células de trichopulsia ni ó otra célula de insecto permitida en los baculovirus y utilizable para su producción) . La recombinación homologa entre plásmido ó fragmento y el genoma del baculovirus genera el baculovirus recombinante deseado, que puede ser recuperado y purificado según los métodos clásicos (ver particularmente King y Poss: el baculovirus expression system. London: chapman & Hall, 1992) . Para la construcción de los baculovirus recombinantes, diferentes equipos que contienen vectores puentes son comercializados y pueden ser utilizados siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. Particularmente, se puede utilizar vectores puente pBAC comercializados por la sociedad Clontech, los vectores pAc (verne y colaboradores, Biotechnology 6 (1988) 47, Pharmigen, USA) , los vectores pBlue-Bac (invitrogen) ó aún los vectores pBSV (boehringer) . Las funciones de complementación pueden asi ser insertadas en diferentes sitios del baculovirus, y particularmente en el locus del gen de la poliedina ó del gen plO. Por otra parte, diferentes cepas de baculovirus pueden ser utilizadas, tales como particularmente AcNPV ó Bombyx mori (Maeda y colaboradores, Nature 315 (1988) 592) . Por otra parte, el baculovirus utilizado puede ser modificado para mejorar/cambiar su tropismo. Es en efecto posible modular el ttropismo de los vectores virales modificando sus proteínas de superficie afin (i) de restringirlo para fusión de proteínas virales con un ligando especifico (cadena ligera de inmunoglobulina, Gastrin-Releasing-Peptide) ó (ii) de ensancharlo por formación de pseudotipos con una glicoproteina viral heteróloga [G del virus de la estomatitis Vesiculosa (VSV)], [Liu y colaboradores, J. Virol 70(4) (1996) 2497; Michael y colaboradores, Gene Ther. 2 (1995) 660] . Recientemente se ha mostrado que la glicoproteina de superficie del baculovirus (gp64) fusionada a la gpl20 del virus VIH era capaz de fijarse sobre el receptor CD4 (Boublik y colaboradores Bio/Technology 13 (1995) 1079. esta modificación de la gp64 no afecta la viabilidad del baculovirus en células de insectos. Una combinación análoga con la G de VSV deberla permitir mejorar el tropismo del baculovirus para las ce 'lulas de mamíferos y aún aumentar la eficiencia de transducción de las células Huh7 asi como otras lineas celulares.
En el baculovirus helper, las funciones de complementación son favorablemente colocadas bajo el control de un promotor heterólogo (por ejemplo de un origen diferente del baculovirus), funcional en las células competente. Parece en efecto que los promotores del baculovirus no permiten obtener niveles de expresión suficientes de las funciones de complementación en las células diferentes a la células de insectos, y no son mas apropiadas para las aplicaciones de la invención, el promotor puede ser primeramente el propio promotor (promotor homólogo) de las funciones complementarias del virus (promotor E1A, E4, E2, MLP para el adnovirus, promotores P5 ó P1 del AAV, el promotor del LTR del RSV, etc.). Puede tratarse de todo promotor de origen diferente funcional en la célula competente utilizada. Para este efecto, se puede citar por ejemplo los promotores de genes expresados en esta célula, ó promotores ubiquitarios conocidos como por ejemplo el promotor del gen PGK, el promotor del inmediato precoz del CMV, el promotor del gen TK del virus del herpes ó aún el promotor del LTR del RSV. Puede igualmente tratarse de promotores regulados, como por ejemplo el promotor del virus MMTV, un promotor que responda a las hormonas, por ejemplo de tipo GRES, ó un promotor regulado por la tetraciclina (WO) . Favorablemente, se trata de un promotor homólogo, ubiquitario, fuerte ó inducible.
Asi, otro objeto de la presente invención concierne un baculovirus recombinante que comprenda, insertado en su genoma, un ácido nucleico codificante para una función de complementación de un virus colocado bajo el control de un promotor heterólogo. Mas particularmente, la función de complementación es una proteina necesaria para la producción de dicho virus, y entonces la región codificante es inactiva ( utada, elinada, etc.) en el genoma viral defectuoso. Para los adenovirus, la función de complementación es mas particularmente seleccionada entre todo ó parte de las funci ones codificadas por las regiones El, E2, E4, L1-L5, pIX y Iva2 del adenovirus, solas ó en combinaciones. Para el AAV, se trata de las funciones codificadas por las regiones Rep y/ó Cap; y para el retrovirus, gag, pol y/ó env.
Favorablemente, el ácido nucleico corresponde a una región de un genoma viral que contiene la región codificante para la función de complementación seleccionada. En particular, se trata de un fragmento de un genoma de serotipo Ad2 ó Ad5, MoMLV ó AAV-2. De manera particularmente preferida, el ácido nucleico comprende igualmente la región promotora naturalmente responsable de la expresión de las funciones de complementación seleccionadas.
A titulo de ejemplo particular, la presente invención concierne un baculovirus que contenga toda ó parte de la región El de un adenovirus. Mas particularmente, se trata de un baculovirus que contenga la región Ela, Elb ó Ela y Elb. La región El del adenovirus, está localizada al nivel de los nucleótidos 104 (promotor Ela) a 4070 (poliA Elb) del Ad5. En particular, la caja TATA del promotor Ela está localizada al nivel del nucleótido 470, el codón ATG de Ela al nivel del nucleótido 560, y el codón stop Elb al nivel del nucleótido 3511. Se puede citar a titulo de ejemplo preciso un baculovirus que contenga un fragmento 391-3511, Este baculovirus helper está particularmente adaptado a la producción de adenovirus recombinantes defectuosos para la región El, conteniendo una eliminación mas amplia que este fragmento 391-3511. Particularmente, está adaptado a la producción de adenovirus de primera generación, sin RCA, conteniendo una eliminación El que cubre los nucleótidos 383- 3512 incluidos.
Otro ejemplo particular de baculovirus según la invención contiene por ejemplo todo ó parte de las regiones El y E4 del adenovirus. La región E4 del adenovirus está constituida de 7 fases aabiertas de lectura, designadas 0RF1, 0RF2, 0RF3, 0RF4 , ORF3/4, 0RF6 y ORF6/7. entre las proteínas codificadas por estos diferentes ORFs, aquellas producidas por ORF3 y ORF6 parecen permitir la "réplica" del virus, y entonces la transcomplementación de un adenovirus defectuoso para la región E4, igualmente en su integridad. De este hecho, el baculovirus helper de la invención contiene favorablemente toda la región E4 ó una parte solamente de ésta conteniendo al menos la fase ORF3 u ORF6. Las diferentes partes de la región E4 pueden ser obtenidas por cortes enzimáticos ó modificados según los métodos conocidos del experto en la materia, en particular, la fase de lectura ORF6 puede ser aislada de la región E4 bajo forma de un fragmento BglII-PvuII, correspondiente a los nucleótidos 34115-33126, y las fases de lectura ORF6-ORF6/7 pueden ser aislados de la región E4 bajo forma de un fragmento BglII-BglII correspondiente a los nucleótidos 34115-32490 del genoma del Ad5. el baculovirus puede igualmente contener el conjunto de las fases de lectura ORF1-ORF7 (por ejemplo bajo forma de un fragmento 32800-35826 ó 32811-35614 ó 32811-35640) . Se entiende que otros fragmentos pueden ser determinados sobre la base de las secuencias publicadas de los genomas adenovirales. La utilización de un baculovirus conteniendo una unidad reducida de la región E4 es favorable ya que permite la transcomplementación de un genoma adenoviral defectuoso que contiene una eliminación más amplia de la región E4, entonces sin zona de homología, y asi evitar toda posibilidad de recombinación.
Según una primera modalidad de realización , el ácido nucleico codificante para la ó las funciones de complementación es introducido en el baculovirus helper bajo forma de cartucho de expresión. Este modo de realización es mas simple de aplicar, está particularmente adapatado a la producción de adenovirus recombinantes defectuosos para genes precoces inmediatos y para la producción de retrovirus y de AAV recombinantes defectuosos.
Según otro modo de realización, el ácido nucleico codificante para la ó las funciones de complementación es introducido en el baculovirus helper bajo forma de un cartucho extirpable, que genera una molécula replicadora en la ce 'lula competente. La réplica del cartucho en la célula permite favorablemente aumentar el número de copias de los genes que comple tantes, y asi mejorar los niveles de producción del sistema. Esta modalidad de realización está particularmente adapatada a la producción de adenovirus recombinantes muy altamente defectuosos, particularmente defectuosos para los genes de estructura, en particular, este modo de aplicación está particularmente adaptado a la producción de adenovirus "mínimos", en efecto, la cantidad de proteina estructural es un factor limitante para la producción en títulos importantes de adenovirus altamente defectuosos (tipo adenovirus mínimo) . Esta modalidad de realización permite para la primera vez aumentar considerablemente los niveles intracelulares de proteínas transcomplementantes, particularmente proteínas estructurales del adenovirus (codificados por las regiones Ll a L5) , hasta niveles compatibles con la transcomplementación del adenovirus mínimo.
Asi, la solicitante ha mostrado que es posible construir baculovirus recombinantes que comprendan una región heteróloga susceptible de ser extirpada en una célula, preferencialmente de manera inducible y regulada, para generar una molécula circular y replicadora. (de tipo episomático) .
La extirpación es favorablemente realizada por un mecanismo de recombinación sitio-especifica, y la réplica en la célula es asegurada por un origen de réplica, independiente del estado de división celular.
Mas preferencialmente, la recombinación sitio-especifico utilizada según el procedimiento de la invención es obtenida por medio de dos secuencias especificas que son capaces de recombinar entre ellas en presencia de una proteina especifica, generalmente designada recombinasa. Estas secuencias especificas, dispuestas en la orientación apropiada, anmarcan en el baculovirus las secuencias que codifican para las funciones de complementación. Asi, la invención tiene igualmente por objeto un baculovirus recombinante que comprenda, insertada en su genoma, al menos una región de ADN enmarcada por dos secuencias que permitan una recombinación sitio-especifica y posicionada en orientación directa, dicha región de ADN que contenga al menos un origen de réplica funcional en las células competentes y un ácido nucleico que codifica para una función de complementación de un virus.
Las secuencias que permiten la recombinación utilizadas en el marco de la invención comprenden generalmente de 5 a 100 pares bases, y, mas preferencialmente, menos de 50 pares de bases. Pueden pertenecer a diferentes clases estructurales, y particualrmente a la familia de la recombinasa del bacteriófago Pl ó de la resolvasa de un transposon.
Entre las recombinasas pertenecientes a la familia de la integrasa del bacteriófago 1, se puede citar particularmente la integrasa de los fagos lambda (Landy y colaboradores, Science 197 (1977)1147), P22 y F80 (Leong y colaboradores, J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 de Haemophilus influenzae (hauser y colaboradores, J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), la integrasa Cre del fago Pl, la integrasa del plásmido pSAM2 (EP 350 341) ó aún la FLP recombinasa del plásmido 2 µm de la levadura Gin del bacteriófago mu ó aún la resolvasa sw plásmidos, tal como aquella del fragmento par de RP4 (Abert y colaboradores, Mol. Microbiol. 12 (1994) 131).
Según una modalidad de realización preferida, en los baculovirus recombinantes de la presente invención, las secuencias que permiten la recombinación sitio-especifica son derivados de un bacteriófago. Mas preferencialmente, se trata de las secuencias de fijación (secuencias attP y attB) de un bacteriófago ó de secuencias derivadas. Estas secuencias son capaces de recombinar específicamente entre ellas en presencia de una recombinasa designada integrasa. A titulo de ejemplos precisos, se puede citar particularmente las secuencias de fijación de los fagos lambda. P22, F80, Pl, HP1 de Haemophilus influenzae ó aún del plásmido pSAM2, ó 2 µm.
Aún mas preferencialmente , las secuencias que permiten la recombinación sitio-especifica están represnetadas por el sistema de recombinación del fago Pl. el fago Pl posee una recombinasa del nom de Cre que reconoce específicamente una secuencia nucleótida de 34 pares de bases llamada sitio lox P (Sternberg y colaboradores, J. Mol. Biol. 150 (1981) 467). Esta secuencia está compuesta de dos secuencias palindrómicas de 13 pb separados por por una secuencia conservada de 8pb. La recombinación sitio especificas es favorablemente obtenida utilizando secuencias LoxP ó secuencias derivadas, y la recombinación Cre.
El término secuencia derivado incluye las secuencias obtenidas por modificaciones de las secuencias de recombinación anteriores, que conservan la capacidad de recombinar específicamente en presencia de la recombinasa apropiada. Asi, puede tratarse de fragmentos reducidos de estas secuencias ó por el contrario extendidos por adición de otras secuencias (sitios de restricción, etc.). Puede igualmente tratarse de variantes obtenidas por mutaciones, particularmente por mutaciones puntuales.
Según una modalidad privilegiada de la invención, las secuencias que permiten una recombinación sitio-especifico son entonces secuencias LoxP del bacteriófago Pl, y la recombinación es obtenida en presencia de la proteina Cre. A este respecto, la recombinación puede ser obtenida por puesta en contacto directo de células competentes con la recombinasa Cre, ó por expresión del gen que codifica para la recombinasa Cre en las células competentes. Favorablemente, la recombinasa Cre es producida en la célula por inducción de la expresión del gen correspondiente. Asi, el gen que codifica para la recombinasa es favorablemente colocado bajo control de un promotor inducible, ó construido bajo forma regulable. A este respecto, se utiliza favorablemente una fusión entre Cre y la región de fijación de hormonas esteridanas
(estradiol, progesterona, etc.) que permite regular la actividad de Cre y entonces inducir el evento de recombinación (Metzger y colaboradores, PNAS 92 (1995) 6991) .
Mas generalmente, la expresión de la recombinasa puede ser controlada por todo promotor fuerte, regulado ó no. el cartucho de expresión puede ser transfectado en las células competentes, como se ilustró en los ejemplos.
Este sistema permite entonces generar moléculas replicables que produzcan, en las células competentes, niveles elevados de función de complementación de virus, particularmente de adenovirus. Este tipo de construcción está particularmente adaptado a la complementación de genomas altamente defectuosos, y en particular de genomas adenovirales defectuosos para los genes tardíos. Asi, una construcción particular según la invención está representada por un baculovirus que comprende, insertado en su genoma, al menos una región de ADN enmarcada por dos secuencias LoxP posicionada en orientación directa, dicha región de ADN que contenga al menos un origen de réplica funcional en las células competentes y un ácido nucleico que codifica para una función de complementación de un adenovirus. Favorablemente, las funciones de complementación comprenden todo ó parte de los genes precoces inmediatos presentes en las regiones El, E2 y E4, Aún mas preferencialmente, las funciones de complementación comprenden todo ó parte de los genes precoces inmediatos y de los genes precoces retardados. Preferencialmente, las funciones de complementación permiten la complementación de un adenovirus recombinante desprovisto de toda secuencia viral codificante, en particular, las funciones de complementación están constituidas del conjunto del genoma adenoviral, con excepción de los ITRs y de la región de "packaging". Según una variante particular, las funciones de complementación están constituidas de un genoma adenoviral completo desprovisto sin embargo de la de "packaging" (Ad, Psi-) . Este genoma comprende en particular los ITRs que sirven a la réplica del genoma en las células competentes, después de extirpación.
Para asegurar la réplica de la molécula episomática, ésta contiene entonces un origen de réplica funcional en las células competentes utilizadas. Este origen de réplica está preferencialmente constituida de las propias secuencias ITR del adenovirus, que permiten una amplificación importante de la molécula. Puede igualmente tratarse de otro origen de réplica que permita, de preferencia, una amplificación de un factor superior a 20 del ADN viral en la célula competente. Se puede citar a titulo ilustrativo el origen OriP/EBNAl del virus EBV ó la región E2 del virus del papiloma. Se entiende que las secuencias ITR del adenovirus constituyen una modalidad de realización preferido.
Para la aplicación del procedimiento de la invención, el ó los baculovirus helper son generalmente utilizados en una Multiplicidad de infecciones (MOI) que permite infectar una amplia población de las células, sin dañar de manera significativa la viabilidad celular. Generalmente, ésta está más particularmente comprendida entre 10 y 1000. La MOI corresponde al número de partículas virales por célula, la MOI puede fácilmente ser ajustada por el experto en la materia en función de las células competentes utilizadas, sobre la base esencialmente de dos criterios: la eficiencia de infecciones y la toxicidad eventual. Favorablemente, la MOI utilizada para el baculovirus helper está comprendida entre 20 y 500.
Introducción del genoma viral
Como se indicó anteriormente, el procedimiento de la invención comprende la introducción en las células competentes, del baculovirus helper y del genoma viral recombinante. A este respecto, el genoma del adenovirus recombinante defectuoso puede ser introducido de diferentes formas en la célula competente.
Puede primeramente tratarse de un adenovirus recombinante defectuoso purificado, favorablemente desprovisto de RCA. en ese caso, las células competentes son infectadas por el adenovirus recombinante defectuoso y por el baculovirus helper. la infección por el adenovirus recombinante permite introducir en la célula competente el genoma correspondiente, que es enseguida amplificado y encapsulado para producir reservas de titulo elevado, desprovistas de RCA. Esta modalidad de aplicación es particularmente interesante para generar virus de primera generación (Ad-?El; Ad-?El, ?E3) . en efecto, estos virus son difíciles de producir de títulos elevados, sin contaminación por RCA. Según el procedimiento de la invención, es actualmente posible, partiendo de un adenovirus recombinante defectuoso de primera generación, por co-infección en una célula competente con un baculovirus que contenga la región El, obtener reservas concentradas, de calidad elevada. Este modo de realización es igualmente favorable para la producción de virus defectuosos en dos ó tres regiones esenciales de su genoma (El, E2, E4 particualrmente) . De una manera general, esta modalidad de aplicación es ventajosa ya que la eficiencia de infección por el adenovirus es muy elevada (superior a la eficiencia de transfección por ADN), y permite entonces generar reservas concentradas. En esta modalidad de realización, el adenovirus recombinante y el baculovirus recombinantes son utilizados para múltiples infecciones (MOI) que permite infectar una amplia población de las células, sin dañar de manera significativa la viabilidad celular. La MOI utilizada para el baculovirus es aquella mencionada anteriormente (entre 10 y 1000) . En lo que concierne el adenovirus, está ventajosamente comprendida entre 1 y 1000, de preferencia entre 1 y 500, aún mas preferencialmente entre 1 y 100. La MOI utilizada para el adenovirus está igualmente adaptadaa en función del tipo celular seleccionado. El rango de MOI puede ser fácilmente determinado por el experto en la materia utilizando por ejemplo un adenovirus y un baculovirus que contenga un gen marcador distinto, a fin de medir la eficiencia de infección y una eventual composición, más preferencialmente, la MOI del adenovirus es inferior a 50, por ejemplo comprendido entre 1 y 20.
Según otra modalidad de realización particularmente ventajosa, el genoma del adenovirus recombinante defectuoso es introducido bajo forma de ADN. en ese caso, el genoma es introducido por transfección, eventualmente en presencia de agente que facilite la transfección (lipidos, fosfato de calcio, etc.). el genoma recombinante asi introducido puede ser preparado in vitro según diferentes técnicas, y en particular en E. Coli (WO96/25506) ó en una levadura
(WO95/03400) . Esta modalidad de aplicación es sobretodo útil para generar un primer lote de virus recombinante defectuoso, desprovisto de RCA, que puede luego a su vez ser utilizado para producir reservas de titulo elevado según la modalidad de realización precedente.
El genoma del adenovirus recombinante defectuoso puede también ser introducido utilizando otro baculovirus recombinante. Según esta modalidad de realización, el genoma del adenovirus recombinante defectuoso es preparado in vitro, por ejemplo como se indicó anteriormente, luego introducido en un baculovirus, bajo forma de un cartucho extirpable en la célula competente, según esta modalidad de aplicación, las células competentes son puestas en presencia de un baculovirus que contenga el genoma del adenovirus recombinante defectuoso, y uno ó varios baculovirus helper
(que contengan las funciones de complementación) . esta modalidad de realización es particularmente ventajosa para la producción de adenovirus recombinantes altamente defectuosos. Gracias a este sistema, es en efecto posible introducir en la población de células competentes cantidades elevadas a la vez de genoma recombinante altamente defectuoso y funciones de complementación correspondientes .
A este respecto, un procedimiento de la invención comprende entondes la co-infección de las células competentes con un baculovirus que contenga el genoma del adenovirus recombinante defectuoso, y en uno ó varios baculovirus helper que contengan las funciones de complementación. Los MOI utilizados en esta modalidad de realización están igualmente comprendidos entre 10 y 1000 para cada uno de los baculovirus utilizados .
Dos tipos de construcciones han sido realizadas en la especialidad anterior para la producción de adenovirus mínimo: (1) el transgen (ß-galactosidasa) clonado entre los ITRs bordeados por un sitio de restricción único ó (2) los ITR derecho e izquierdo clonados en orientación directa en 5' del transgen (Fisher y colaboradores, Virology 217 (1996) 11; Kumar-Singh y colaboradores; Hum, Mol. Gen. 5 (1996) 913). Adenovirus mínimos han sido producidos en las células 293 por transfección del ADN linearizado (1) ó circular (2), las proteínas virales necesarias para la réplica y para la encapsulación del mini-genoma siendo aportadas en trans por un virus helper (Ad?El) . Los adenovirus mínimos se comportan como partículas defectuosas interferentes (DI) y son progresivamente amplificados en el curso de los pasos sucesivos. El problema mayor planteado por la utilización de esta metodología es la separación de dos tipos de partículas producidas responsables de la contaminación de las reservas por el virus helper, y los títulos muy débiles de los adenovirus mínimos asi obtenidos (inferiores a 10s ufp/ml.)
La presente solicitud permite por primera vez generar adenovirus mínimos utilizando un baculovirus para liberar el minigenoma adenoviral y un baculovirus para aportar el conjunto de las funciones de transcomplementación (genoma complementante) .
El genoma adenoviral recombinante es favorablemente introducido en el baculovirus, entre dos secuencias que permitan una recombinación sitio-especifica en las células competentes, como se describió para los baculovirus helper.
La presente solicitud describe en particular un sistema de producción de adenovirus mínimos que utiliza un baculovirus para liberar el mini-genoma adenoviral con la ayuda del sistema loxP/Cre y un baculovirus para aportar el conjunto de las funciones de transcomplementación (genoma complementante) , igualmente con la ayuda de un sistema Cre/loxP (ver figuras 2-4) .
Según otra modalidad de realización, el sistema de recombinación sitio-especifica utilizada para liberar las funciones de complementación es diferente de aquella utilizada para liberar el genoma del adenovirus recombinante. en particular, el sistema LoxP/Cre puede ser utilizado para liberar el genoma adenoviral defectuoso y el sistema AttP/AttB para liberar la ó las funciones de complementación.
El procedimeinto de la invención permite asi construir un vector adenoviral eliminado de todas secuencias virales codificantes y conteniendo solo los ITRs y el indicador de encapsulación (adenovirus minimo) . Este vector puede teóricamente acomodar hasta 37 kb de secuencia exógena ya que la capacidad de clonación de los vectores actuales no rebasa 8.5 kb. permite también clonar genes de gran tamaño como el gen de la distrofina (14 kb) , con todos sus elementos de regulación (promotor, mejorador, intrones, ... etc.) a fin de obtener una expresión óptima, en el tejido objetivo. Además la ausencia de toda secuencia viral inmunógena deberla aumentar la duración de expresión del transgen en los tejidos quiescentes.
El genoma del AAV ó del retrovirus defectuoso puede igualmente ser introducido bajo forma de un virus, de un genoma, ó de un plásmido, según las técnicas descritas anteriormente .
Células competentes
El procedimiento de la invención puede ser aplicado en diferentes tipos de células. Se entiende en el sentido de la invención por "célula competente" una célula que permite la infección por el baculovirus y el virus a producir, y que permite un ciclo viral productivo para éste último. la capacidad de infectar células con estos virus puede ser determinada utilizando virus recombinantes que expresan un gen marcador tal como el genn LacZ de E. coli. Se trata de preferencia de una células mamifera, aún mas preferencialmente una célula de origen humano. Las células competentes utilizadas pueden ser células quiescentes ó células en división activa, de las lineas celulares establecidas ó de cultivos primarios. Se trata favorablemente de células mamiferas compatibles con una utilización industrial. es decir sin carácter patógeno reconocido, cultivables y en caso contrario almacenables en condiciones apropiadas. Favorablemente, las células utilizadas son células hepáticas, musculares, fibroblásticas, embrionarias, nerviosas, epiteliales (pulmonares) u oculares (retinianas) . Se puede citar a titulo de ejemplo no limitativo las células 293 ó toda célula derivada que contenga una función de compelementación suplementaria (293E4, 293E2a, etc.) las células A549, las células HuH7, las células Hep3B, las células HepG2, las células retinoblásticas humanas (HER, 911), las células HeLa, las células 373 ó aún las células KB.
Para la aplicación del procedimiento de la invención, el genoma del virus recombinante y el baculovirus pueden ser introducidos en la población de células competentes de manera simultánea ó espaciada en el tiempo. Ventajosamente, las células son puestas en contacto a la vez con el genoma recombinante y el baculovirus helper. en el caso de un sistema que genera moléculas replicables in vivo, la recombinasa es introducida ó expresada previamente, simultáneamente ó ulteriormente.
La producción de los virus conduce generalmente a la lisis de las células. Los virus producidos pueden entonces ser recolectados después de la lisis celular, según los métodos conocidos de purificación. Pueden enseguida ser condicionados de difernetes maneras según la utilización investigada. Por otra parte, para evitar todo riesgo de contaminación de la reserva viral para trazas eventuales de baculovirus que no hayan penetrado las células competentes
(baculovirus helper ó baculovirus que aporten el genoma viral recombinante). Es posible aplicar las técnicas siguientes:
- Es posible purificar los adenovirus por cromatografía según el método descrito en la solicitud FR96/08164. esta técnica permite separar el adenovirus de todo baculovirus residual eventual.
- Es igualmente posible hacer actuar solventes orgánicos (por ejemplo, éter, cloroformo) sobre las reservas de adenovirus purificado, en efecto, el baculovirus es un virus envuelto (envoltura glicoproteica) , entonces muy sensible a todo solvente orgánico (que extrae los lipidos de su envoltura) ; al contrario, el aenovirus no está envuelto, y los mismos solventes no tienen ningún efecto sobre el.
- Es aún posible, por purificación sobre gradiente de CsCl, separar por densidad el baculovirus residual eventual y el virus recombinante.
Estos tres métodos pueden ser utilizados independientemente ó conjuntamente. Por otra parte Todo método conocido del experto en la materia puede igualmente ser utilizado.
La utilización de los virus
Los virus asi producidos pueden ser utilizados para la clonación , la tranferencia y la expresión de genes de interés in vitro ó in vivo. Tales genes de interés son por ejemplo genes que codifican para enzimas, derivados sanguíneos, hormonas, linfocinas: interleucinas, interferones, TNF, etc. (FR 9203120) . factores de crecimiento, neurotransmisores ó sus precursores ó enzimas de síntesis, factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteinas: ApoAl, ApoAIV ApoE, etc. (WO94/25073) , la distrofina ó una minidistrofina (WO93/06223) , genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (W094/24297, los genes que codifican para factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX, etc., los genes suicidas: Timidina, cinasa, citosina desaminasa, etc.: ó aún toda ó parte de una inmunoglobulina natural ó artificial (Fab, ScFv, etc. W094/29446) , etc. el gen de interés puede igualmente ser un gen de una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula objetivo permite controlar la expresión de genes ó la transcripción de ARNm celulares. Tales secuencias pueden por ejemplo ser transcritas, en la célula objetivo, en ARN complementarios de ARNm celulares y bloquear asi su traducción en proteina, según la técnica descrita en la patente EP 140 308. El gen de interés puede ser también un gen codificante para un péptido antigénicoo, capaz de generar una respuesta inmunitaria, en vista de la realización de vacunas. Puede tratarse particularmnete de péptidos antigénicos específicos del virus de epstein barr, del . virus HIV, del virus de la hepatitis B (EP 185 573), del virus de la pseudo-rabia, ó aún específicos de tumores (EP 259 212) . El gen puede ser todo ADN (ADNg, ADNc, etc.) que codifique para un producto de interés. que incluya potencialmente los indicadores de expresión apropiados (promotor, terminador, etc.)
Estos virus pueden ser utilizados in vitro para la producción de estas proteínas recombinantes. Pueden igualmente ser utilizados, siempre in vitro, para estudiar el mecanismo de acción de estas proteínas ó para estudiar la regulación de la expresión de genes ó la actividad de promotores. Pueden igualmente ser utilizados in vivo, para la creación de modelos animales ó de animales transgénicos, pueden igualmente ser utilizados para la transferencia y la expresión de genes in vivo, en el animal ó en el hombre, en aproximaciones de terapia génica ó celular.
La presente solicitud será descrita mas en detalle con la ayuda de los ejemplos que siguen, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
Subtítulos de las Figuras.
Figura 1 : Esquema de producción de un adenovirus recombinante defectuoso de tercera generación (defectuoso para las funciones El y E4) que utilizan un baculo-El, E4.
Figura 2-4: Esquema de producción de un adenovirus minimo que utiliza un primer baculovirus para introducir el genoma adenoviral defectuoso y un segundo baculovirus para introducir las funciones complementarias.
Figura 5: Esquema de producción de un AAV recombinante defectuoso para las funciones Rep y Cap que utilizan un baculo-Rep/Cap.
Ejemplos
1. Células utilizadas .
Las células utilizadas en el marco de la invención pueden provenir de toda linea celular ó población celular infectable por un adenovirus ó un AAV ó un retrovirus y por un baculovirus, compatible con una utilización para fines terapéuticos. Se trata mas preferencialmente de una célula mamifera, particularmente humana. Se puede citar mas particularmente:
- Las células de la linea 293:
La linea 293 es una linea de células embrionarias de riñon humanas que contienen el extremo izquierdo aproximadamente 11-12 %) del genoma del adenovirus serotipo 5 (Ad5) . que comprenden el ITR izquierdo, la región de encapsulación, la región El, que incluye Ela, Elb, la región codificante para la proteina pIX y una parte de la región codificante para la proteina pIVa2 (Graham y colaboradores, J. Gen. Virol. 36 (1997) 59). esta linea celular es capaz de trans-complementar adenovirus recombinantes defectuosos para la región El, Es decir desprovistos de toda ó parte de la región El, y de producir reservas virales que tengan títulos elevados.
- Las células de la linea A549
Células que complementan la región El del adenovirus han sido construidas a partir de células A549 (Imler y colaboradores, Gene Ther. (1996 75). Estas células contienen un fragmento restringido de la región El, desprovisto de ITR izquierdo, colocado bajo el control de un promotor inducible.
- Las células de la linea HER
Las células embrionarias de la retina humana (HER) pueden ser infectadas por un adenovirus (Byrd y colaboradores, Oncogene 2 (1988) 477) . Células de encapsulación de adenovirus preparadas a partir de estas células han sido descritas por ejemplo en la solicitud W094/28152 ó en el articulo de Fallaux y colaboradores (Hum. Gene Ther. (1996) 215). Se puede citar mas particularmente la linea 911 que comprende la región El del genoma del adenovirus Ad5, del nucleótido 79 al nucleótido 5789 integrado en el genoma de células GER. Esta linea de células permite la producción de virus defectuosos para la región El.
Las células IGRP2
Las células IGRP2 son células obtenidas a partir de células 293, por integración de una unidad funcional de la región E4 bajo control de un promotor inducible. estas células permiten la producción de virus defectuosos para las regiones El y E4 (Yeh y colaboradores, J. Virol (1996) 70) .
- Las células VK
Las células VK (VK2-20 y VK10-9) son células obtenidas a partir de células 293, por integración de la integralidad de la región E4 bajo control de un promotor inducible, y de la región codificante para la proteina pIX. Estas células permiten la producción de virus defectuosos para las regiones El y E4 (Krougliak y colaboradores, Hum. Gene. Ther. 6 (1995) 1575).
- Las células 293E4
Las células 293E4 son células obtenidas a partir de células 293, por integración de la integralidad de la región E4. Estas células permiten la producción de virus defectuosos para las regiones El y E4 (WO95/02697; Cáncer Gene Ther. (1995) 322).
Las células Sf9 y Sf21 son células embrionarias de lépidoptéres. Estas células están accesisbles en las colecciones (no. CRL-1711 ATCC) asi como sus condiciones de cultivo. Están igualmente disponibles en el comercio (Gibco). Ver igualmente King y Possee: The baculovirus expression system, London: Chapman y Hall, 1992.
- Las células hepatocitarias humanas
Las células hepatocitarias HepG2 y Hep3B y HuH7 son lineas humanas procedentes de hepatocarcinomas. son accesibles en las colecciones de deósito y sus propiedades han sido descritas por ejemplo en las patentes US4,393,133 y
US4,393,133.
- Linea de células humanas KB: Procedente de un carcinoma epidérmico humano, esta linea es accesible al ATCC (ref. CCL17) asi como las condiciones que permiten su cultivo.
Linea de células humanas Hela: procedente de un carcinoma del epitelio humano, esta linea es accesible en el ATCC (ref. CCL2) asi como las condiciones que permiten su cultivo.
- Linea de células W162: Estas células son células Vero que comprenden, integrada en su genoma, la región E4 del adenovirus Ad2. Estas células han sido descritas por Weinberg y colaboradores (PNAS 80 (1983) 5383) .
2. Infección de células humanas por un baculovirus recombinante
Este ejemplo describe la capacidad de los baculovirus de infectar células de origen humano.
Células humanas (particularmente 293 ó sus derivados) son infectados con diferentes diluciones de una solución de baculovirus recombinante que expresa el gen LacZ bajo control del LTR del RSV. 48 horas después de la infección, la aparición de células azules es puesta en evidencia, demostrando la infectabilidad de estas células por un baculovirus.
3. Construcción de baculovirus que exprese la región El del adenovirus y de un adenovirus defectuosos correspondiente.
3-1 Clonación de dos cartuchos de expresión de El
El plásmido AE2 proviene de la clonación, en PCRII (Invitrogen), del producto de la PCR hecha sobre pBREl con los oligonucleótidos 5' -TCCTTGCATTTGGGTAACAG-3' y 5'GCGGCCGCTCAATCTGTATCTTC-3' : este producto de PCR contienen los nucleótidos 3198 a 3511 de Ad5, es decir el extremo 3' de la región E1B. el plásmido pBREl contienen los nucleótidos 1 a 5788 del Ad5 clonado en pBR322, eliminado aproximadamente de los nucleótidos 1300 a 2300.
El plásmido AE3 es procedente de la clonación del fragmento Notl-Kpnl de AE2, que contiene el producto de PCR, en pCDNA3 (Invitrogen) digerido por Notl-Kpnl. Contiene los nucleótidos 3198 a 3511 de Ad5 seguidos del sitio de poliadenilación de la BGH.
El plásmido AE4 es procedente de la clonación del fragmento BglII-PvuII de AE3 en pBREl . AE4 es un plásmido que contiene el cartucho de expresión de El siguiente: - nucleótidos 1 a 3511 del Ad5, es decir ITR izquierdo, secuencias de encapsulación, promotor E1A, gen E1A, promotor E1B, gen E1B.
- el poliA de la hormona de crecimiento bovino (BGH) que proviene del pCDNA3.
pBREl ha sido digerido por BstNL, luego digerido por la T4 DNA polimerasa para llenar el extremo 5' saliente, luego digerido por Xbal. el fragmento asi generado que contiene los nucleótidos 391 a 1339 de Ad5 ha sido introducido en el pico 20H digerido por Smal-Xbal (sitio no metilado) , para generar el plásmido AE5.
El plásmido AE6 es procedente de la clonación del fragmento EcoRI-Smal de AE5 en AE4 digerido por EcoRl-Smal. AE6 es un plásmido que contiene el cartucho de expresión de El siguiente:
- nucleótidos 391 a 3511 de Ad5, es decir promotor "reducido" de E1A, gen E1A, promotor E1B, gen E1B.
- el poliA de la hormona de crecimiento bovino (BGH) proveniente del pCDNA3.
3-2 Clonación de estos dos cartuchos El en un baculovirus
Los fragmentos EcoRl-Sphl (el extremo 5' saliente Sphl habiendo sido previamente afrancado por digestión a la polimerasa T4 DNA polimerasa) plásmidos AE4 y AE6 son clonados en el plásmido pAcSG2 (Pharmigen) entre los sitios EcoRl y EcoRV. Esto genera respectivamente los plásmidos AE14 y AE15. En los dos casos, la región El es introducida en el, locus del gen de la poliedrina (gen+promotor de la poliedrina ssiendo suprimidas) .
Los plásmidos AE14 y 15 son cotransfectados con el ADN del baculovirus BacuGold derivado de la cepa AcNPV (Pharmigen) en células de insectos Sf9, a fin de generar los dos baculovirus recombinantes correspondientes BacAE14 y BacAE15, portadores de dos cartuchos de expresión de El integrados en el locus del gen de la poliedrina.
3-3 Clonación de un adenovirus recombinante que contiene una nueva eliminación El
El plásmido pCOl (WO96/10088) ha sido digerida por
BstXI, luego digerido por la T4 DNA polimerasa para eliminar el extremo 3' saliente, luego digerido por Rsal. El fragmento asi generado que contiene los nucleótidos 3513 1 4607 de Ad5 ha sido introducido en pBS-SK+ (Stratagene) linearizado por EcoRV y digerido por la fosfatasa alcalina de ternera, para generar el plásmido AEO.
El plásmido pMA37 es obtenido por ligado de fragmentos:
- EcoRV-Nsil de pXL2756, que contiene sacB. El pXL2756, posee el gen de contra-selección SacB deshecho de sus sitios EcoRl y Kpnl, el gen de resitencia a la kanamicina, un multisitio de clonación y un origen de réplica ColEl.
- Ndel-Nsil de pCOl (que contiene las secuencias de adeno)
Salí (extremo 5' -saliente lleno por la T4 DNA polimerasa) -Asel de pXL2756 (vector kanamicina resistente).
pMA37 conteniendo entonces:
- el gen de la resitencia a la kanamicina
el gen SacB que confiere una sensibilidad a la sacarosa a las bacterias que la expresaan - las secuencias 1 a 382 (Hinfl) de Ad5 seguidas de las secuencias 3446 a 4415 (Nsil) de Ads; no hay transgen.
El plásmido AE1 ha sido construido por introducción del fragmento Xhol-Nsil de AEO en el pMA37 digerido por Sall-Nsil. Contiene también:
- el gen de la resitencia a la kanamicina
- el gen SacB que confiere una sensibilidad a la sacarosa a las bacterias que la expresan,
- las secuencias 1 a 382 (Hinfl) de Ad5 seguidas de las secuencias 3513 a 4415 (Nsil) de Ad5; nohay transgen.
A partir del plásmido AEll son entonces construidos los vectores transportadores suicidas (por inserción del transgen de interés) que permite la construcción de adenovirus recombinantes por recombinación en e. coli AEll no contiene ninguna secuencia homologa con el plásmido AE6. Los plásmidos AEll y AE4 tienen en común las secuencias 1 a 382 (Hinfl) de Ad5 hacia arriba de E1A, pero no hay homología hacia abajo del cartucho El entre estos dos plásmidos. Asi, puede haber generación de RCA por recombinación homologa entre un adeno portador de la eliminación El existente en AEll (es decir 382-3513) y los baculovirus BacAE14 ó Bac AE15.
3-4 Construcción de un Adenovirus recambinante de primera generación
En una primera etapa, una reserva de BacAE14 ó 15 es preparado según las técnicas clásicas. A continuación, las células competentes (por ejemplo HuH7) son transfectadas por 5 µg de plásmido pXL2822 digerido por Pací (el plásmido pXL2822 contiene todo el Ad5 eliminado para El (382-3446 ó 382-3513) y E3 (28592-30470) y lleva un cartucho CMV-ßGal) , e infectada, simultáneamente ó no, en una MOI comprendida entre 10 y 1000, por el BacAE14 ó 15. cuando las células son lisadas, el sobrenadante de transfección es recolectado, luego aplicado sobre células competentes "frescas" previamente ó simultáneamente infectadas con el BacAE14 ó 15 (MOI 10 a 1000), a fin de amplificar el adenovirus Ad822, y seguiendo asi, hasta la obtención de una reserva de Ad2822. La continuación de la amplificación del Ad2822 es facilitada por la presencia de lacZ en este virus, a cada amplificación, el sobrenadante es también pseudotitulado sobre W162. el genoma del virus es analizado en ocasión de las amplificaciones a fin de verificar su integridad. Finalmente, esta estrategia presenta la ventaja de no poder generar RCA en las reservas de adenovirus asi producidas. Esta ausencia de contaminación es igualmente verificada.
. construcción de un baculovirus que expresa las regiones El y E4 del adenovirus
4-1 construcción del baculovirus El, E4 (Bac.El-E4)
El protocolo utilizado es el siguiente: Las regiones El y E4 son clonadas en orientación inversa al locus del gen de la poliedrina (Ph), en el vector transportador pBacPAK8
(Clontech, USA) para dar pBacEl-E4. el baculovirus recombinado es a continuación aislado según las técnicas clásicas por co-transfección de pBacEl-E4 y del ADN del baculovirus BacPAK6 en las células Sf9 (Kitts y Possee,
Biotechniques 14 (5) (1993) 819) . La presencia de El y E4 en el genoma de los baculovirus recombinados es a continuación verificada por PCR a partir de células Sf9 infectadas. La transcripción de El y E4 en las células Huh infectadas por el baculovirus recombinado purificado es analizado por RT-PCR a partir de los ARN citoplásmicos .
Para la construcción del baculovirus E1-E4, diferentes fragmentos que contengan El pueden ser introducidos. Los fragmentos utilizados en este ejemplo son aquellos descritos en el ejemplo 3 para la construcción del Baculovirus-El, que contenga las regiones El bajo control de su propio promotor (promotor Ela y el promotor Elb) . Los fragmentos E4 utilizados son los siguientes:
fragmento Maell-Mscl 32720-35835 conteniendo la integralidad de E4
- fragmento BglII-PvuII 34115 conteniendo la fase ORF6
fragmento BglII-BglII 34115-32490 conteniendo las fases ORF6-ORF6-ORF6/7
- fragmento PvuII-AluI 34801-334329 conteniendo la fase ORF3
Estos fragmentos son colocados alternativamente bajo el control del promotor E4 ó de promotores diferentes, particularmente del promotor HSV-TK, CMV ó del LTR-RSV.
Las posiciones dadas a anteriormente hacen referencia a la secuencia del adenovirus Ad5 silvestre tal como ha sido publicado y accesible sobre base de datos. Aunque ciertas variaciones menores puedan existir entre los diferentes serotipos de adenovirus, estas posiciones son generalmente transpuestas a los otros serotipos, y particularmente a los Ad2, Ad7, Adl2 y AdCAV-2.
4-2 Transcomplementación del Ad?El?E4-LacZ por el Bac.El-E4
La producción del adenovirus Ad?El?E4-LacZ es obtenida por introducción en las células competentes del baculovirus
El, E4 preparado en el ejemplo 4-1 y del genoma adenoviral defectuoso para El y E4 (ver figura 1) . Las condiciones óptimas de producción del Ad?El?E4-LacZ en las células competentes, por transcomplementación por el Bac.El-E4 purificada son analizadas. El titulo del Ad?El?E4 es determinada en número de unidades de transducción de la ß-galactosidasa ("t.d.u.") en la linea celular W162 y la eficiencia de trancomplementación obtenida es comparada a aquella de la linea celular de encapsulación IGRP2.
. Construcción de un baculovirus que complementa el conjunto del genoma del adenovirus .
Aunque la expresión simultánea de varias proteínas, que pueden representar hasta 13 kb de secuencia, a partir de un solo virus habia sido reportado (Belyaev y Roy, NAR 21 (1993) 1219) . la capacidad máxima de clonación del baculovirus no está muy documentada, este ejemplo muestra ahora que es posible clonar el genoma del adenovirus eliminado de su indicador de encapsulación (Ad.Psi-) y bordeado por dos sitios loxP [loxP-ITR-ITR a E4 -loxP] en el baculovirus. la infección de células competentes que expresan la recombinasa Cre, de forma inducible ó no (linea celular Cre ó cre-ER. ver ejemplo 7), por este baculovirus recombinado y la activación de la recombinasa Cre, permite la extirpación y la circularización del genoma adenoviral. Este es entonces capaz de transducir los genes precoces, de replicarse y activar los gens tradios pero incapaz de ser encapsulado, y sirve también de helper para la producción de un adenovirus minimo (ver figuras 2-4). en este sistema la producción de los adenovirus mínimos descansa sobre la co-infección por dos baculovirus y la realización de 2 eventos de recombinación entre los sitios loxP. Esta aproximación presenta la ventaja de no generar partículas adenovirales a partir del virus helper.
La construcción del genoma Ad-Psi- es realizada en E. coli. Por esto, el genoma completo del adenovirus Ad5 es clonado en un vector de clonación procariota, ITR juntos. La secuencia Psi eliminada por división enzimática y ligación, ó por mutagénesis dirigida. Una secuencia LoxP es a continuación introducida de una parte y de otra del genoma adenoviral, "en orientación paralela. La construcción resultante [loxP-ITR-ITR.?Psi a E4 -loxP] es a continuación clonado en un vector transportador que permita la recombinación con un baculovirus , según la estrategia descrita en el ejemplo 3. el baculovirus recombinante obtenido, designado BacAd.Psi-, es a continuación aislado según los métodos clásicos.
6. Construcción de un baculovirus que contenga el genoma del adenovirus recombinante defectuoso bajo forma extirpable.
Este ejemplo describe la construcción de un baculovirus que permita aportar en las células competentes el genoma del adenovirus recombinante defectuoso. Mas particularmente, el adenovirus recombinante es defectuoso para el conjunto de las regiones codificantes, y no retiene mas que las regiones ITR y Psi (adenovirus minimo, ó Ad?) .
6-1 Construcción de un mini-genoma (Ad?) en E. coli
Un plásmido p [loxP- ( ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA) -loxP] es construido. Para ésto, una copia de la secuencia ITR del adenovirus es aislada por corte enzimático y/ó amplificada por PCR, luego clonada hacia arriba de la secuenica ITR-Psi contenida en el vector transportador del adenovirus pGY63.
Este vector derivado del pCOI (WO96/10088) y posee el gen LacZ bajo control del promotor precoz inmediato del citomegalovirus (P.CMV) terminado por la indicación de poliadenilación del virus SV40 (pA) , clonado entre la secuencia ITR-Psi y el gen codificante para la pIX. La región (ITR-ITR-Psi-P,CMV-LacZ-pA) de este vector (correspondiente a un genoma de adenovirus minimo) es a continuación aislado por corte enzimático luego clonado entre los sitios LoxP en el multisitio de clonación del plásmido pBS246 (Gibco) , para generar el plásmido p [loxP- (ITR-ITR-Psi-P.CMV-LacZ-pA) -loxP] . La capacidad de producir minigenomas de adenovirus a partir de un ADN circular y de encapsularlos es a continuación examinada por transfección de este plásmido en la linea celular IGRP2 infectada por un Ad.?El?E4 que expresa la recombinasa Cre (AdCre) . Los adenovirus mínimos son amplificados por algunos pasos sucesivos del sobrenadante de la transfección en la linea IGGRP2. Son a continuación purificados por centrifugación isopicnica en gradiente de cloruro de cesio y cuantificadas por pseudo-titulación en la linea celular W162. Se entiende que el gen LacZ puede ser fácilmente substituido por cualquier otro ácido nucleico de interés, por las técnicas de biología molecular clásicas.
6-2 clonación de un minigenoma extirpable en un baculovirus .
La construcción que contiene el minigenoma Ad? bordeada por dos sitios loxP descrita anteriormente es clonada en el locus PÍO del baculovirus en el vector transportador pAcUWl (Pharmingen, USA) . El baculovirus Bac.Ad? es a continuación producido y aislado por las técnicas clásicas de co-transfección en las células Sf9 precedentemente citadas, y selecciondas por su genotipo de playa (blanco) después de coloración al X-Gal, este baaculovirus contiene entonces un genoma adenoviral altamente defectuoso, enmarcado por dos regiones loxP en orientación directa.
6-3 Producción del Ad? por trans-complementación con el baculovirus BacAdPsi- .
Células competentes son co-infectadas simultáneamente con el baculovirus BacAdPsi- (descrito en el ejemplo 5) , que contiene las funciones de transcomplementación del conjunto del genoma adenoviral, y con el baculovirus Bac.Ad? que contiene el genoma del PseudoAdenovirus (descrito anteriormente) . La recombinasa Cre aportada ya sea por añadido de la proteina en el medio de cultivo, ó bien por transfección de las células con un plásmido ó un virus (baculovirus) que expresan Cre, ya sea por expresión de un cartucho establemente integrado en el genoma de la linea celular (tal como se describe en el ejemplo 7) . El adenovirus minimo es amplificado por pasos sucesivos de los sobrenadantes de cultivo de las células co-infectadas por BacAd.Psi- y por el sobrenadante, luego purificada y titulada según las técnicas citadas precedentemente. Esta técnica permite obtener, como solo virus, el Ad?, que permite su aislamiento y su purificación por los métodos clásicos. Además, los títulos obtenidos son compatibles con una utilización industrial.
7. Construcción de una linea celular que expresa la proteina Cre.
Una linea que expresa Cre, de manera inducible ó no, es contruida a fin de aumentar la eficiencia de recombinación entre los sitios loxP en el baculovirus de la invención (por ejemplo el Bac.Ad? y el BacAd.Psi-) y controlar la expresión de Cre. en esta construcción, Cre es expresada sola ó bajo forma de una proteina de fusión C-final con la región de fijación del receptor al estradiol (ER) , (Metzger y colaboradores, 1996, citado previamente) . bajo control de un promotor ubiquitario, de preferencia fuerte, inducible ó no. Mas particularmente, los promotores utilizados son el promotor pGRES5, el promotor de la metalotionina, el promotor SV40 ó el promotor del gen HSV-TK.
Para construir estas lineas celulares Cre, las células competentes son co-transfectadas por dos plásmidos, una que contenga el cartucho de expresión Cre (Cre ó Cre-ER) y otro aquella de un marcador de selección (Neo) . Clones resistentes al G418 son seleccionados, la actividad de Cre en estos clones es examinada por transfección del plásmido p(P.CMV-loxP-ATG-stop-pA-LoxP-LacZ) . Este plásmido contiene el gen LacZ inactivado por la introducción entre el promotor (P.CMV) y el inicio de LacZ de una sucesión de codones en las tres fases de lectura y del indicador de fin de transcripción y de poliadenilación del virus SV40, bordeados por dos sitios loxP. La expresión de Cre en los clones, en presencia ó no del inductor (estradiol), es a continuación revelada por la actividad ß-galactosidasa inducida por la recombinación entre los dos sitios loxP. varios clones que expresan establemente la proteina de fusión Cre-ER ó la proteina Cre sola a partir de los promotores y de las células competentes precisadas a continuación son asi seleccionadas. Estos clones son utilizables para la producción de virus según la invención.
Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad en las siguientes,
Claims (43)
1. Procedimiento de producción de virus recombinantes defectuosos que está caracterizado porque se introduce, en una población de células competentes, el genoma del virus recombinante defectuoso y un baculovirus que contenga toas ó parte de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 que está caracterizado porque el baculovirus contiene el conjunto de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 que está caracterizado porque el baculovirus contiene una parte de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso, la otra parte siendo aportada por la célula competente.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 que está caracterizado porque las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso son aportadas por varios baculovirus.
5. Procedimiento según la reivindicación 1 que está caracterizado porque el virus recombinante defectuoso es un adenovirus recombinante defectuoso.
6. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el genoma del adenovirus recombinante es defectuoso para una ó varias funciones seleccionadas entre El, E2, E3, E4, L1-L5, pIX y Iva2 y el baculovirus contiene el conjunto de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso.
7. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el genoma del adenovirus recombinante es defectuoso para una ó varias funciones seleccionadas entre El, E2, E3, E4, L1-L5, pIX y Iva2, el baculovirus contiene una parte de las funciones necesarias para la transcomplementación del genoma recombinante defectuoso, la otra parte de las funciones aportadas por uno ó varios baculovirus y/ó por la célula competente.
8. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el baculovirus helper contiene toda ó parte de la región El del adenovirus, que permite la complementación de un genoma de adenovirus recombinante defectuoso para la región El.
9. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el baculovirus helper contiene toda ó parte de la región E2 del adenovirus, que permite la complementación de un genoma de adenvorus recombinante defectuoso para la región E2.
10. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el baculovirus helper contiene toda ó parte de la región E4 del adenovirus, que permite la complementación de un genoma de adenovirus recombinante defectuoso para la región E4.
11. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el baculovirus helper contiene toda ó parte de las regiones El y E4 del adenovirus, que permite la complementación de un genoma de adenovirus recombinante defectuoso para las regiones El y E4.
12. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el genoma de adenovirus recombinante está desprovisto de toda región codificante y el baculovirus helper contiene el conjunto de las funciones que permiten su complementación .
13. procedimiento según la reivindicación 12 que está caracterizado porque el baculovirus contiene el conjunto de un genoma adenoviral, con excepción de la región de encapsulación y eventualmente de los ITRs.
14. procedimiento según la reivindicación 1 que está caracterizado porque las funciones de complementación presentes en el baculovirus y el genoma del virus recombinante defectuoso no contienen zonade homología susceptible de dar lugar a una recombinación.
15. Procedimiento según la reivindicación 14 que está caracterizado porque un genoma de adenovirus recombinante defectuoso para la región El y eventualmente E3 es introducido en las células competentes, estas células son infectadas, de forma simultánea ó no, por un baculovirus que contiene la región El, la región El de adenovirus presente en el baculovirus y el genoma del adenovirus recombinante defectuoso que no contienen zona de homología susceptible de dar lugar a una recombinación.
16. Procedimiento según la reivindicación 15 que está caracterizado porque el baculovirus contiene un fragmento 391-3511 del adenovirus Ad5 y en que el genoma del adenovirus recombinante defectuoso para la región El lleva una eliminación más amplia.
17. Procedimiento según la reivindicación 16 que está caracterizado porque el baculovirus contiene un fragmento 391-3511 del adenovirus Ad5 y en que el genoma del adenovirus recombinante defectuoso para la región El lleva una eliminación que cubre los nucleótidos 383-3512 incluidos.
18. Baculovirus recombinante que comprende, insertado en su genoma, un ácido nucleico que codifica para una función de compelemntación de un virus defectuoso colocado bajo el control de un promotor heterólogo.
19. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque la función de complementación es seleccionada entre toda ó parte de las funciones codificadas por las regiones El, E2, E4, L1-L5, pIX y Iva2 del adenovirus, solas ó en combinaciones.
20. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque la función de complementación es seleccionada entre todas ó parte de las funciones codificadas por las regiones Rep y Cap del AAV, solas ó en combinaciones.
21. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque la función de complementación es seleccionada entre todo ó parte de las funciones codificadas por las regiones gag, pol y env de un retrovirus, solas ó en combinaciones.
22. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque el ácido nucleico que codifica para la función de complementación está constituido de un ADN correspondiente a un fragmento de un genoma del virus que contiene la región correspondiente.
23. Baculovirus según la reivindicación 22 que está caracterizado porque el ácido nucleico que codifica para la función de complementación está constituida de un ADN correspondiente a un fragmento de un genoma de adenovirus de serotipo Ad2 ó Ad5.
24. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque el promotor está constituido por la región promotora naturalmente responsable de la expresión de las funciones de complementación.
25. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque el promotor es un promotor celular ó viral fuerte, regulado ó no.
26. Baculovirus según la reivindicación 19 que está caractreizado porque la función de complementación comprende la región El de un genoma adenoviral ó una parte solamente de ésta que contenga al menos la región Ela.
27. Baculovirus según la reivindicación 19 que está caracterizado porque la función de complementación comprende la región E4 de un genoma adenoviral ó una parte solamente de ésta que contenga al menos la fase ORF3 ó ORF6.
28. Baculovirus según la reivindicación 19 que está caracterizado porque comprende el conjunto de las regiones codificantes de un genoma adenoviral.
29. Baculovirus según la reivindicación 28 que está caracterizado porque comprende un genoma adenoviral completo, desprovisto de la región de encapsulación.
30. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque se trata de una cepa AcNPV.
31. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque el ácido nucleico es introducido al nivel del locus de la poliedrina ó del locus plO.
32. Baculovirus según la reivindicación 18 que está caracterizado porque el ácido nucleico es introducido bajo forma de un cartucho extirpable en la célula competente.
33. Baculovirus recombinante que comprende, insertado en su genoma, al menos una región de ADN enmarcada por dos secuencias que permitan una recombinación sitio-especifico y posicionada en orientación directa, dicha región de ADNque contenga al menos un origen de réplica funcional en las células competentes y un ácido nucleico codificante para una función de complementación de un virus.
34. Baculovirus según la reivindicación 33 que está caracterizado porque las secuencias que permitan una combinación sitio-especifica son secuencias LoxP del bacteriófago Pl, y la recombinación es obtenida en presencia de la proteina Cre.
35. Procedimiento según la reivindicación 5 caractreizado porque el genoma recombinante defectuoso es introducido en la célula por infección con un adenovirus que contiene dicho genoma.
36. Procedimiento según la reivindicación 5 que está caracterizado porque el genoma recombinante defectuoso es introducido en la célula por transfección.
37. Procedimiento según la reivindicación 1 que está caracterizado porque el genoma recombinante defectuoso es introducido en la célula con un baculovirus recombinante, distinto del baculovirus que contiene las funciones de complementación .
38. Baculovirus recombinante que comprende, insertado en su genoma, al menos una región de ADN enmarcada por dos secuencias que permitan una recombinación sitio-especifica y posicionada en orientación directa, dicha región de ADN que contenga al menos un origen de réplica funcional en las células competentes y un genoma de adenovirus defectuoso.
39. Baculovirus según la reivindicación 38 que está caracterizado porque el genoma de adenovirus recombinante defectuoso comprende esencialmente las regiones ITRs, la secuencia de encapsulación, y un ácido nucleico de interés.
40. Procedimiento de producción de adenovirus recombinantes defectuosos que está caracterizado porque se infecta una población de células competentes con un baculovirus según la reivindicación 33 con un baculovirus según la reivindicación 38, se pone las células en presencia de la recombinasa que permita la recombinación sitio-especifica, luego se recupera los adenovirus producidos.
41. Procedimiento según la reivindicación 1 que está caracterizado porque la población de células competentes es una población de células hepáticas, musculares, fibroblásticas, embrionarias, epiteliales (particularmente pulmonares), oculares (particularmente retinianas) ó nerviosas .
42. Procedimiento según la reivindicación 41 que está caracterizado porque la población de células competentes es selccionada entre las células 293 ó toda célula derivada que contenga una función de complementación suplementaria, A549, HuH7, Hep7, Hep3B, HepG2, HER, 911, HeLa ó KB.
43. Preparación viral purificada que está caracterizada porque es obtenida por aplicación del procedimiento según la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR96/14278 | 1996-11-22 | ||
| FR9614278 | 1996-11-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MXPA99004449A true MXPA99004449A (es) | 2000-04-24 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU731106B2 (en) | Method for producing recombinant virus | |
| EP1226264B1 (en) | Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus | |
| JP4190028B2 (ja) | 欠陥組換えアデノウイルスベクター及び遺伝子治療での使用 | |
| HU224679B1 (hu) | Rekombináns adenovírusok és felhasználásuk adeno-asszociált vírusok (AAV) előállítására, komplementáló sejtvonalak és a rekombináns adenovírusokat tartalmazó gyógyszerkészítmények | |
| AU2437200A (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| MXPA99004449A (es) | Procedimiento de produccion de virus recombinantes | |
| WO2000073424A1 (en) | A novel baculovirus/adenovirus hybrid vector for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors | |
| CA2388365A1 (en) | Helper vectors and cell lines for the production of pseudoadenoviral vectors | |
| AU7560500A (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy | |
| JP2002535961A (ja) | ヘルパー依存性アデノウイルスベクター生産用細胞の製法およびその使用法 | |
| WO2000072887A1 (en) | A novel packaging cell line for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors | |
| EP1083228A1 (en) | Modified adenoviral vectors for use in gene therapy |