KR20070004637A - 바이러스 벡터의 제조방법 - Google Patents

바이러스 벡터의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070004637A
KR20070004637A KR1020067016709A KR20067016709A KR20070004637A KR 20070004637 A KR20070004637 A KR 20070004637A KR 1020067016709 A KR1020067016709 A KR 1020067016709A KR 20067016709 A KR20067016709 A KR 20067016709A KR 20070004637 A KR20070004637 A KR 20070004637A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
protease
protein
vector
modified
Prior art date
Application number
KR1020067016709A
Other languages
English (en)
Inventor
마코토 이노우에
히로시 반
아키히로 이이다
마모루 하세가와
Original Assignee
가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 filed Critical 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼
Publication of KR20070004637A publication Critical patent/KR20070004637A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18811—Sendai virus
    • C12N2760/18851—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은, 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스를, 상기 프로테아제에 비의존적으로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바이러스 제조방법은, 바이러스 단백질에 있어서의 프로테아제의 절단서열이 다른 프로테아제의 절단서열로 개변된 바이러스 단백질의 의존하에서 바이러스를 생산하는 것을 특징으로 한다. 프로테아제의 절단서열을, 바이러스 생산세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제의 절단서열로 치환함으로써, 보다 효율적으로 바이러스 벡터를 생산시키는 것이 가능해진다. 본 발명의 방법에 의해, 폭 넓은 세포를 사용하여 고역가의 바이러스를 제조하는 것이 가능해진다.
바이러스 벡터, 프로테아제, 마이너스 가닥 RNA 바이러스, 파라믹소바이러스과 바이러스, 센다이 바이러스

Description

바이러스 벡터의 제조방법{Process for producing virus vector}
본 발명은, 증식을 프로테아제(protease)에 의존하는 바이러스 벡터의 개량된 제조방법에 관한 것이다.
많은 바이러스의 구조 단백질은, 프로테아제에 의한 프로세싱을 받아, 비로소 활성을 발현한다. 이와 같은 바이러스를 재조합 바이러스 벡터로 하여 제조하기 위해서는, 그 프로테아제의 존재하에서 바이러스를 증식시킬 필요가 있다. 예를 들면, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 엔벨로프(envelope)에 포함되는 F 단백질은 그와 같은 단백질의 하나로서, F 단백질(F0)은, 숙주 유래의 프로테아제에 의해 F1과 F2로 개열(cleave)되어 비로소 감염성을 나타내게 된다.
마이너스 가닥 RNA 바이러스인 센다이 바이러스(SeV)는, 유전자 도입효율(감염성)이 높고 탑재 유전자 발현량이 많다고 하는 특장을 가져, 유효한 유전자 도입용 벡터의 하나로서 기대되고 있다. 또한, 인간에 대하여 병원성이 알려져 있지 않고, 더욱이 게놈으로의 유전자 삽입 등의 유전적 독성은 전혀 없으며, 안전성도 높다고 생각되어지고 있다(Lamb, R.A. & Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: the viruses and their replication. p. 1177-1204. In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Fields virology. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa (1996)). 이런 점들로부터, 센다이 바이러스는 「세포질형 유전자 도입 벡터」로서, 종래형의 벡터와는 상이한 새로운 타입의 벡터로서의 연구·개발이 실시되고 있는 단계에 있다. 특히 인간으로의 유전자 치료를 목적으로서, 바이러스 게놈의 일부의 유전자를 게놈으로부터 결실시킴으로써, 안전성이 높은 바이러스 벡터로의 개량이 시도되고 있다.
예를 들면 F 유전자 결실형 SeV 등의 유전자 결실형 센다이 바이러스의 경우, 고역가(high titer)로의 회수를 가능하게 하기 위해서는 결실된 단백을 트랜스(trans)에 공급하는 패키징 세포(packaging cell)가 필요하고, 그 제작이야말로 가장 중요한 요소의 하나이다. 현재까지 F 유전자 결실형 SeV 벡터(SeV/△F: Li, H.-O. et al., J. Virol. 74, 6564-6569 (2000)), 또는 M 유전자 결실형 SeV 벡터(SeV/△M: Inoue, M. et al., J. Virol. 77, 6419-6429 (2003)) 등의 생산계가 개발되어 있고, F 단백질 또는 M 단백질을 트랜스에 공급 가능한 패키징 세포가 제작되고 있다. 게놈으로부터 감염·융합에 필수인 F 유전자를 결심시킴으로써, 감염세포로부터의 감염성 입자의 방출이 없어지고, 비전파형 벡터로 개변된다. 게놈으로부터 입자 형성에 필수인 M 유전자를 결실시킴으로써, 감염세포로부터의 입자 방출 자체가 검출한계 이하까지 억제된다. 특히, SeV/△F는, 도입세포 내에서는 게놈의 자율 복제가 가능하고, 탑재 유전자를 고발현시키는 능력을 유지한 채 비전파형이 되어 있어, 획기적인 기술이 되고 있다.
SeV는, 그 수용체로서 세포에 편재하고 있는(ubiquitous) 시알산(sialic acid)을 이용함에도 불구하고, 그의 호스트 동물(설치류 등)의 체내에 있어서, 매 우 좁은 범위에서의 조직 트로피즘(tissue tropism)을 나타낸다. 예를 들면, 마우스의 기도, 또는 닭 유정란(chicken fertile egg)의 장뇨액(chorioallantoic fluid) 중에서만 효율적으로 증식한다. 이 트로피즘의 제한은, F 단백의 활성화에 필요한 특이적 프로테아제의 국재(localization)로 인한 것으로(Nagai, Y. Trends Microbiol 1, 81-87 (1993)), 유정란의 장뇨막에 있어서는 blood clotting factor Xa(Gotoh, B. et al. EMBO J 9, 4189-4195 (1990))가, 마우스 기도의 상피세포에 있어서는 tryptase Clara(Kido, H. et al. J Biol Chem 267, 13573-13579 (1992))가 기능하고 있다. 이들의 프로테아제에 대한 F 단백(F0 단백)의 절단의 모티프(motif)는 Q-S-R이다. 거의 모든 세포종의 배양계에 있어서는, F 단백을 활성화하는(F0 단백의 Q-S-R 모티프를 절단하는) 프로테아제의 발현이 없기 때문에, in vitro에서 SeV를 늘리기 위해서는 천연의 프로테아제를 대신하여 저농도의 trypsin(7.5 ㎍/㎖)을 첨가하는 것이 필요해진다(Homma, M. & Ouchi, M. J Virol 12, 1457-1465 (1973)).
F 유전자 결실형 SeV 벡터(SeV/△F)를 조제하는 경우도, 동일하게 F 단백의 활성화가 필요하고, 벡터 생산시는 트립신을 첨가하며, 또한 트립신을 기능시키기 위해 무혈청 조건하에서 배양할 필요가 있다. 이와 같은, 무혈청 조건의 트립신 존재하에서의 배양은 세포에 있어서는 매우 과혹한 조건으로, 거의 모든 세포에서는 세포를 유지할 수 있는 기간이 매우 짧아져, 패키징 세포로서 기능할 수 없다. 실제로 패키징 세포로서 사용 가능한 것은, 원숭이 신장세포인 LLC-MK2 세포, 또는 햄스터 신장세포인 BHK-21 세포 등 몇가지 종으로 한정되어 있다. 즉, 무혈청 조건 하의 트립신 존재하라고 하는 배양조건에 의해, 패키징 세포에 이용 가능한 세포종이 극히 소수로 제한되어 있다.
비특허문헌 1: Lamb, R.A. & Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: the viruses and their replication. p. 1177-1204. In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Fields virology. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa (1996)
비특허문헌 2: Li, H.-O. et al., J. Virol. 74, 6564-6569 (2000)
비특허문헌 3: Inoue, M. et al., J. Virol. 77, 6419-6429 (2003)
비특허문헌 4: Nagai, Y. Trends Microbiol 1, 81-87 (1993)
비특허문헌 5: Gotoh, B. et al. EMBO J 9, 4189-4195 (1990)
비특허문헌 6: Kido, H. et al. J Biol Chem 267, 13573-13579 (1992)
비특허문헌 7: Homma, M. & Ouchi, M. J Virol 12, 1457-1465 (1973)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은, 증식을 프로테아제에 의존하는 바이러스를, 상기 프로테아제에 의존하지 않고, 다른 프로테아제를 사용하여 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 효율적으로 바이러스 벡터를 제조하는 것을 가능하게 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
전술한 바와 같이, 바이러스 생산시에 프로테아제가 필요한 경우, 그 프로테아제를 작용시키기 위해 세포의 생존력(viability)이 낮아져, 바이러스 생산에 사용할 수 있는 세포종이 극히 소수로 제한되어 버린다고 하는 문제가 있었다. 바이러스 벡터를 생산하는 경우, 바이러스 생산세포(패키징 세포)로부터의 출아(budding)나 방출에 의해 감염성을 갖는 딸 입자(daughter particle)를 생산한다. 이 경우, 딸 입자에는 액틴(actin) 등 패키징 세포 유래의 세포질 성분(및 세포막 성분)이 혼입될 것으로 예상되고 있다. 실제로 인간으로의 유전자 치료를 고려한 경우, 예를 들면 바이러스 벡터를 대량으로 투여할 필요가 있는 경우에는, 입자에 혼입하는 세포질 성분(및 세포막 성분)이, 원숭이 세포 유래 또는 햄스터 세포 유래가 아니라 인간 세포 유래인 것이 바람직하다고 생각된다. 그러나, 예를 들면 센다이 바이러스 등의 경우는, 상기와 같이 「무혈청 조건하의 트립신 존재하라고 하는 배양조건」에서 생존 가능한 세포를 사용할 필요가 있기 때문에, 패키징 세포로서 이용 가능한 세포종이 극히 소수로 제한되어, 인간 세포로의 응용이 곤란하였다. 따라서 본 발명자 등은, 배양조건을 거의 모든 세포에 응용 가능한 바이러스 제조의 수법의 개발을 시도하였다.
세포의 trans-Golgi network, 세포표면 및 엔도솜(endosome)에는, 퓨린(furin)이라고 불리우는 막 결합형 세린 엔도프로테아제(membrane bound serine endoprotease)가 존재하고 있다. furin의 발현은 편재적(ubiquitous)이고, 거의 모든 조직·세포에서 발현되고 있으며, 세포내 단백 뿐만 아니라, 막 단백 및 분비 단백의 프로세싱(processing)에 관여하고 있다(Seidah, N.G. & Chretien, M. Brain Res. 848, 45-62 (1999), Bergeron, F. et al., J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22 (2000), Steiner, D.F. Curr. Opin. Chem. Biol. 2 31-39 (1998)). 바이러스의 막 단백질도 furin에 의한 프로세싱(processing)을 받고 있는 것이 있고, 파라믹소바이러스과의 바이러스 F 단백질 중에서는, 모든 장기 향성의 바이러스 또는 일부의 강독주(virulent strain)에 있어서는, furin 인식서열을 갖는 것이 많다(Toyoda, T. et al., Virology 157, 242-247 (1987)). 예를 들면, NDV의 강독주(Nagai, Y. et al., Virology 72, 494-5-8 (1976)), 홍역 바이러스나 유행성 이하선염 바이러스(mumps virus), 또는 HRSV나 HPIV-3(Nagai, Y. Trends Microbiol. 1, 81-87 (1993)) 등이 furin의 인식서열을 갖고 있다. 한편, 전형적인 국소 감염형 SeV나 HPIV-1의 경우는 furin의 인식서열을 갖고 있지 않다(바이러스학, 하타나카 마사카즈 편집, 도쿄, 아사쿠라 쇼텐, 1997, pp. 247-248을 참조).
본 발명자 등은, 세포종에 상관 없이 편재적(ubiquitous)으로 발현하고 있는 furin의 활성을 이용하면, 세포주에 관계없이 바이러스 제조가 가능해진다고 생각하였다. 즉, furin 인식서열을 도입한 F 유전자를 도입한 패키징 세포를 제작할 수 있다면, F 단백질을 활성화하기 위한 trypsin을 배지에 첨가할 필요가 없고, 더욱이 그 때문에 무혈청 상태로 할 필요도 없어진다. 배양조건에 제약이 없어짐으로써, 패키징 세포로서 이용 가능한 세포의 선택지가 늘어나고, 특히 인간 세포를 이용한 패키징 세포의 제작이 가능해진다.
동일한 수법은 파라믹소바이러스과 이외의 바이러스 벡터의 생산에도 이용 가능하다. 예를 들면 다른 과의 바이러스에 대해서도, 막 융합 활성의 발현은 바이러스 전구체 당단백질의 프로테아제에 의한 절단 프로세싱을 전제로 하고 있고, 예를 들면, 인간 인플루엔자 바이러스 A는 국소 감염형 서열(furin 인식서열 없음)로서, 에이즈 바이러스를 포함하는 많은 바이러스는 모든 장기 향성의 서열(furin 인식서열 있음)을 갖고 있다. 이와 같이, 많은 바이러스에 대해서 바이러스 당단백질 전구체의 숙주 프로테아제에 의한 활성화는 바이러스 트로피즘을 지배하는 중요한 인자이기 때문에, 본 발명의 방법은, 파라믹소바이러스에 한정되지 않고, 많은 바이러스 벡터의 패키징 세포를 제작하는 경우에 응용할 수 있다고 생각된다.
즉 본 발명은, 증식을 프로테아제에 의존하는 바이러스를, 상기 프로테아제에 의존하지 않고 제조하는 방법에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 청구항의 각 항에 기재된 발명에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 청구항의 각 항에 기재된 발명의 하나 또는 복수(또는 전부)의 목적으로 하는 조합으로 되는 발명, 특히 동일한 독립항(다른 항에 기재된 발명에 포함되지 않는 발명에 관한 항)을 인용하는 항(종속항)에 기재된 발명의 하나 또는 복수(또는 전부)의 목적으로 하는 조합으로 되는 발명에 관한 것이기도 하다. 각 독립항에 기재된 발명에는, 그 종속항의 임의의 조합으로 되는 발명도 의도되어 있다. 즉 본 발명은,
〔1〕 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스를 제조하는 방법으로서, (ⅰ) 상기 바이러스 단백질의 상기 프로테아제에 의한 절단서열을 다른 프로테아제의 절단서열로 개변한 개변 바이러스 단백질, 및 (ⅱ) 상기 다른 프로테아제의 존재하에서 상기 바이러스를 생산시키는 공정을 포함하고, 생산되는 바이러스는, 절단된 상기 개변 바이러스 단백질을 포함하며, 상기 개변 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 방법,
〔2〕 〔1〕에 있어서, 제조되는 바이러스가, 야생형 절단서열을 갖는 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 보유하는 방법,
〔3〕 〔1〕에 있어서, 제조되는 바이러스가, 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자가 결실된 비전파성 바이러스인 방법,
〔4〕 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제가, 바이러스를 생산시키는 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제인 방법,
〔5〕 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제가 퓨린인 방법,
〔6〕 〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg를 포함하는 방법,
〔7〕 〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Arg-Arg-Arg를 포함하는 방법,
〔8〕 〔1〕 내지 〔7〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스가 마이너스 가닥 RNA 바이러스인 방법,
〔9〕 〔8〕에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 방법,
〔10〕〔8〕에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 방법,
〔11〕 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스에 있어서, 상기 바이러스 단백질의 상기 프로테아제에 의한 절단서열을, 다른 프로테아제의 절단서열로 개변한 개변 바이러스 단백질을 코드하는 벡터로서, 상기 바이러스의 생산세포에 있어서 증식할 수 없는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터인 벡터,
〔12〕 〔11〕에 있어서, 플라스미드인 벡터,
〔13〕 〔11〕 또는 〔12〕에 있어서, 상기 개변 바이러스 단백질이 리콤비나아제에 의해 발현 유도 가능한 벡터,
〔14〕 〔13〕에 있어서, 상기 리콤비나아제가 Cre 또는 Flp인 벡터,
〔15〕 〔11〕 내지 〔14〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제가, 바이러스를 생산시키는 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제인 벡터,
〔16〕 〔11〕 내지 〔15〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제가 퓨린인 벡터,
〔17〕 〔11〕 내지 〔16〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg를 포함하는 벡터,
〔18〕 〔11〕 내지 〔16〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Arg-Arg-Arg를 포함하는 벡터,
〔19〕 〔11〕 내지 〔18〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 단백질이 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 F 단백질인 벡터,
〔20〕 〔19〕에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 벡터,
〔21〕〔19〕에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 벡터,
〔22〕 〔11〕 내지 〔21〕 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 포유동물 세포,
〔23〕 〔22〕에 있어서, 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스의 생산용 세포인 세포,
〔24〕 〔22〕 또는 〔23〕에 있어서, 상기 개변 바이러스 단백질을 코드하는 유전자가, 상기 세포의 염색체에 삽입되어 있는 세포,
〔25〕 〔22〕 내지 〔24〕 중 어느 하나에 있어서, 인간 세포인 세포,
〔26〕 증식이 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 의존하는 바이러스의 개변 바이러스로서, 상기 바이러스 단백질의 상기 프로테아제에 의한 절단서열이, 다른 프로테아제의 절단서열로 개변된 개변 바이러스 단백질을 포함하고, 상기 개변 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 개변 바이러스,
〔27〕 〔26〕에 있어서, 제조되는 바이러스가, 야생형 절단서열을 갖는 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 보유하는 개변 바이러스,
〔28〕 〔26〕에 있어서, 바이러스가, 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자가 결실된 비전파형 바이러스인 개변 바이러스,
〔29〕 〔26〕 내지 〔28〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제가, 바이러스를 생산시키는 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제인 개변 바이러스,
〔30〕 〔26〕 내지 〔29〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제가 퓨린인 개변 바이러스,
〔31〕 〔26〕 내지 〔30〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg를 포함하는 개변 바이러스,
〔32〕 〔26〕 내지 〔30〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Arg-Arg-Arg를 포함하는 개변 바이러스,
〔33〕 〔26〕 내지 〔32〕 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스가 마이너스 가닥 RNA 바이러스이고, 상기 바이러스 단백질이 F 단백질인 개변 바이러스,
〔34〕 〔33〕에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 개변 바이러스.
〔35〕 〔33〕에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 개변 바이러스에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 바이러스 벡터란, 감염력을 갖는 바이러스 입자로서, 유전자를 세포에 도입하기 위한 담체(carrier)를 말한다. 여기에서 「감염력」이란, 바이러스 벡터가 세포로의 접촉에 의해 세포의 내부에 벡터에 포함되는 유전자를 도입할 수 있는 능력을 말한다. 또한 본 발명에 있어서 바이러스 벡터에는, 외래유전자를 갖는 것도 갖지 않는 것도 포함된다. 본 발명의 바이러스의 제조방법은, 전파능을 갖는 바이러스 벡터의 제조, 및 전파능을 갖지 않는 결손형 벡터의 제조의 양쪽에 적용할 수 있다. 여기에서 「전파능을 갖는다」는 것은, 바이러스 벡터가 숙주세포에 감염된 경우, 상기 세포에 있어서 바이러스가 복제되어, 감염성 바이러스 입자가 생산되는 것을 가리킨다.
재조합 바이러스란, 재조합 폴리뉴클레오티드를 매개로 하여 생성한 바이러스, 또는 그 바이러스의 증폭산물을 말한다. 재조합 폴리뉴클레오티드란, 양쪽 말단 또는 한쪽 말단이 자연 상태와 동일하게는 결합되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드를 말한다. 구체적으로는, 재조합 폴리뉴클레오티드는, 인위적으로 폴리뉴클레오티드 사슬의 결합이 개변(절단 및/또는 결합)된 폴리뉴클레오티드이다. 재조합 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 합성, 뉴클레아제처리, 리가아제처리 등을 조합하여, 공지의 유전자 재조합 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 재조합 바이러스는, 유전자조작에 의해 구축된 바이러스 게놈을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키고, 바이러스를 재구축함으로써 생성할 수 있다.
본 발명에 있어서 유전자란 유전물질을 가리키고, 전사단위를 코드하는 핵산을 말한다. 유전자는 RNA여도 DNA여도 된다. 본 발명에 있어서 단백질을 코드하는 핵산은 상기 단백질의 유전자라 부른다. 또한 일반적으로, 유전자는 단백질을 코드하고 있지 않아도 되고, 예를 들면 유전자는 리보자임(ribozyme) 또는 안티센스 RNA 등의 기능적 RNA를 코드하는 것이어도 된다. 일반적으로, 유전자는 천연 유래 또는 인위적으로 설계된 서열일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 「DNA」란 단일 가닥 DNA(single-stranded DNA) 및 이중 가닥 DNA(double-stranded DNA)를 포함한다. 또 단백질을 코드한다는 것은, 폴리뉴클레오티드가 상기 단백질을 적당한 조건하에서 발현할 수 있도록, 상기 단백질의 아미노산서열을 코드하는 ORF를 센스 또는 안티센스(예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스에 있어서)로 포함하는 것을 말한다.
도면의 간단한 설명
도 1은, 센다이 바이러스 F 단백질의 활성화 부위의 서열의 모식도이다.
도 2는, F 유전자 활성화 부위에 furin 인식서열(F(furin): R-Q-K-R)을 갖는 F 유전자 발현 플라스미드의 구축 스킴(scheme)을 나타내는 도면이다.
도 3은, F 유전자 활성화 부위에 furin 인식서열(F(5R): (R)-R-R-R-R)을 갖는 F 유전자 발현 플라스미드의 구축 스킴을 나타내는 도면이다.
도 4는, pCAGGS(B type) 및 pCAGGS(BSX)의 구축순서를 나타내는 도면이다.
도 5는, pCALNdLWE-zeo-NP(Z)의 구축순서를 나타내는 도면이다.
도 6은, pCAGGS-P4C(-)의 구축순서를 나타내는 도면이다.
도 7은, pCAGGS-L(TDK)의 구축순서를 나타내는 도면이다.
도 8은, pCAGGS-F의 구축순서를 나타내는 도면이다.
도 9는, pCAGGS-T7의 구축순서를 나타내는 도면이다.
도 10은, pCAGGS-SeV 및 pCAGGS-SeV/△F-GFP의 구축순서를 나타내는 도면이다..
도 11은, pCAGGS-SeV 및 pCAGGS-SeV/△F-GFP의 구축순서를 나타내는 도면이다(도 10에서 계속된다).
도 12는, pCAGGS-SeV의 구축순서를 나타내는 도면이다(도 11에서 계속된다).
도 13은, HamRbz법에 있어서 게놈 DNA의 양을 변화시킨 경우의 SeV/△F-GFP의 회수효율을 CIU 어세이에 의해 검토한 결과를 나타내는 도면이다. 2 ㎍ 이상에서 거의 변화는 없다.
도 14는, HamRbz법에 의한 SeV/△F-GFP의 회수시에 있어서 pCAGGS-F와 pCAGGS-F5R의 회수효율의 검토를 행한 결과를 나타내는 도면이다. pCAGGS-F5R을 사용한 경우 쪽이 회수효율이 훨씬 향상되었다.
도 15는, pCAGGS-T7법에 의해 회수한 전파형 SeV(SeV(TDK)18+GFP)의 HA 어세이의 결과를 나타내는 사진이다. BHK-21, BHK/T7, 293T로 희석하지 않고 계란에 접종했을 때만 HA 활성이 검출되었다.
도 16은, pCAGGS-T7법에 있어서 게놈 DNA의 양을 변화시킨 경우의 SeV/△F-GFP의 회수효율을 CIU 어세이에 의해 검토한 결과를 나타내는 도면이다. 0.5~5.0 ㎍에서 거의 변화는 없지만, 5 ㎍을 사용했을 때 가장 회수효율이 좋았다.
도 17은, pCAGGS-T7법에 있어서 도입시약을 변화시킨 경우의 SeV18+GFP/△F의 회수효율을 CIU 어세이에 의해 검토한 결과를 나타내는 도면이다. 인산칼슘을 사용한 경우에는 TransIT-LT-1을 사용한 경우와 동등 이상의 회수효율을 나타내었다.
도 18은, pCAGGS-T7법에 있어서 세포종을 변화시킨 경우의 SeV/△F-GFP의 회수효율을 CIU 어세이에 의해 검토한 결과를 나타내는 도면이다. 시험한 모든 세포로부터 바이러스가 회수되었다. 회수효율은 BHK/T7>BHK-21>293T>LLC-MK2의 순서였다(단, BHK/T7을 사용하는 경우는 pCAGGS-T7은 첨가되어 있지 않다.).
도 19는, 클론 F5R2의 패키징 세포로부터 생산한 F 유전자 결실형 SeV 벡터의 바이러스 입자 중의 F 단백질을, 항F1 항체를 이용한 웨스턴 블로팅(Western-blotting)에 의해 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은, 클론 F5R2 및 클론 F5R2-F22의 패키징 세포로부터 생산되는, F 유전자 결실형 SeV 벡터(SeV/△F-GFP)의 경시적인 감염성 입자 생산량을 나타내는 도면이다.
도 21은, 클론 F5R2 및 클론 F5R2-F22의 패키징 세포로부터 생산한 F 유전자 결실형 SeV 벡터의 바이러스 입자 중의 F 단백질을, 항F1 항체를 이용한 웨스턴 블로팅(Western-blotting)에 의해 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은, 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스를, 상기 프로테아제에 비의존적으로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바이러스의 제조방법은, 상기 바이러스 단백질의 상기 프로테아제에 의한 절단서열을 다른 프로테아제의 절단서열로 개변한 개변 바이러스 단백질을 트랜스에 공급(즉 생산되는 바이러스 게놈 이외로부터 발현)하는 세포를 사용하여, 상기 다른 프로테아제의 존재하에서 바이러스를 생산시키는 공정을 포함하는 방법이다. 예를 들면 숙주 유래의 프로테아제에 증식을 의존하는 바이러스를 증식시키기 위해서는, 본래, 그 프로테아제가 바이러스에 공급될 필요가 있다. 그러나 본 발명에 있어서는, 상기 프로테아제(임시로 본래의 프로테아제라고 칭한다)의 기질이 되는 바이러스 단백질의 절단서열을, 다른 프로테아제(제2의 프로테아제라고 칭한다)의 절단서열로 개변함으로써, 상기 본래의 프로테아제를 필요로 하지 않고, 제2의 프로테아제에 의해 바이러스를 생산시키는 것이 특징이다.
즉, 상기 바이러스 단백질의 본래의 프로테아제에 의한 절단서열을 제2의 프로테아제의 절단서열로 개변한 개변 바이러스 단백질과, 제2의 프로테아제와의 존재하에서 바이러스를 생산시키는 공정에 의해, 제2의 프로테아제의 절단서열을 갖는 개변 바이러스 단백질은, 제2의 프로테아제에 의한 절단을 받아 활성화되고, 바이러스는 증식할 수 있다. 따라서, 제2의 프로테아제는 생산되는 바이러스 자신은 발현하지 않는다. 즉, 생산되는 바이러스는, 제2의 프로테아제를 코드하는 유전자를 보유하지 않는다. 따라서, 생산된 바이러스는, 절단부위가 개변된 개변형 바이러스 단백질이 트랜스에 공급되지 않는 한, 제2의 프로테아제가 있어도 증식할 수 없는 점이 특징이다.
본 발명의 방법은, 바이러스에 트랜스에 공급하는 바이러스 단백질의 프로테아제 절단서열을 다른 서열로 치환하는 것은 필요하지만, 제조되는 바이러스 자체가 갖는 바이러스 유전자 또는 바이러스 단백질을 개변하는 것은 필수가 아니다. 따라서, 생산되는 바이러스와 본래의 바이러스의 유전자형은 완전히 동일하게 하는 것도 가능하다. 또한, 개변 바이러스 단백질과 야생형 바이러스 단백질과의 차이는 프로테아제 절단부위만이어도 되기 때문에, 형질적인 변화도 최소한으로 억제되어, 바이러스의 형성, 증식, 유전자 발현 등에 미치는 영향은 거의 없다고 생각되어진다. 따라서, 본 발명의 방법은 매우 범용성이 높고, 프로테아제에 증식을 의존하는 많은 바이러스의 제조에 적용하는 것이 가능하다고 생각된다.
본 발명의 방법을 적용할 수 있는 바이러스로서는, 프로테아제 의존성 증식이 furin으로는 상보될 수 없는 바이러스가 가장 적합하고, 예를 들면, 파라믹소바이러스과의 바이러스를 예로 들면, 원래 furin 인식서열을 갖지 않고, 전형적으로 국소 감염형 성질을 나타내는, Sendai virus(SeV) 및 human parainfluenza virus-1(HPIV-1), 더 나아가서는 Newcastle disease virus(NDV) 및 HPIV-2 등의 약독주(virulent viral strain)가 있다. 또한, 본래 furin 인식서열을 갖는 모든 장기 향성의 바이러스 또는 일부 강독주의 바이러스여도 동일하게 이용할 수 있고, 강독주의 NDV 및 HPIV-2, 또는 HPIV-3, mumps virus, measles virus, canine distemper virus(CDV), rinderpest virus(RPV), human respiratory syncytial virus(HRSV) 등도 본 발명의 방법을 적용할 수 있다. 더욱이, 파라믹소바이러스과 이외의 바이러스 벡터일지라도, 예를 들면, 레오 바이러스과(Reoviridae)의 로타 바이러스(rotavirus)속의 바이러스는, virion 상의 spike 단백인 VP4 단백이 trypsin으로 절단되어 활성화된다고 생각되어지고 있다(AriasCF, J Virol. 70(9): 5832-9 (1996), Konno T et al., Clin Infect Dis.16 Suppl 2: S92-7 (1993)). 따라서, VP4의 trypsin에 의한 절단부위를 furin 인식서열로 개변한 개변 단백질을 사용하여, 본 발명에 따라 로타 바이러스를 제조하는 것이 가능하다. 또한, 예를 들면, 국소 감염형 서열(furin 인식서열 없음)인 인간 인플루엔자 바이러스 A, 또는 모든 장기 향성의 서열(furin 인식서열 있음)을 갖는 에이즈 바이러스를 포함하는 많은 바이러스에 대해서도 적용 가능하다(Nagai Y., Trends Microbiol.1, 81-87 (1993); NagaiY. Microbiol Immunol. 39, 1-9 (1995), Klenk HD, Garten W. Trends Microbiol. 2, 39-43 (1994); Lamb, R. A., and D. Kolakofsky. Paramyxoviridae: the viruses and their replication. p. 1177-1204. In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Fields virology. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa. (1996), 바이러스학, 하타나카 마사카즈 편집, 도쿄, 아사쿠라 쇼텐, 247-248 (1997)). 예를 들면 furin 인식서열을 보다 효율적인 furin 인식서열로 치환하거나, 바이러스 생산세포에서 발현하는 furin 이외의 프로테아제의 인식서열로 치환할 수 있다.
본 발명의 방법은, 바이러스 증식에 필요한 프로테아제를, 바이러스 생산세포에 있어서 충분히 공급하는 것이 어려운 경우에 특히 유용하다. 이와 같은 경우로서는, 예를 들면 상기 프로테아제가, 바이러스 생산세포에 있어서 내인적으로 발현하고 있지 않은(또는 매우 미량 밖에 발현하고 있지 않은) 프로테아제인 경우나, 상기 프로테아제가, 바이러스 생산세포에 있어서 유해한 작용을 미치는 경우 등이 생각되어진다. 본 발명의 방법에 따르면, 이들의 프로테아제를 본래 필요로 하는 바이러스를, 상기 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제 또는 세포에 있어서 상해성이 낮은 프로테아제를 이용하여 제조하는 것이 가능해진다. 즉, 바이러스 단백질의 프로테아제 절단부위를, 상기 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제 또는 세포에 유해성이 낮은 프로테아제의 절단부위로 개변한 바이러스 단백질을 세포에 있어서 발현시킨다. 이 세포를 사용하여 바이러스를 생산시키면, 세포로부터 공급되는 개변 바이러스 단백질이 형성되는 바이러스에 삽입되어, 제2의 프로테아제에 의해 개변 바이러스 단백질이 활성형으로 변환된다. 따라서, 본래의 프로테아제를 필요로 하지 않고 바이러스를 생산하는 것이 가능해진다.
예를 들면, 바이러스 생산에 자주 사용되는 세포인 LLC-MK2(ATCC CCL-7), Vero(ATCC CCL-81), BHK-21(ATCC CCL-10), HEK293(ATCC CRL-1573), HT1080(ATCC CCL-121), HeLa(ATCC CCL-2), NIH3T3(ATCC CRL-1658), 3Y1(JCRB 0734), COS-1(ATCC CRL 1650), COS-7(ATCC CRL-1651), CHO(ATCC CRL-9606), CHO-K1(ATCC CCL 61), 또는 그들의 파생주 등이 내인적으로 두드러지게 발현하지 않는 프로테아제를 증식에 필요로 하는 바이러스의 생산에, 본 발명의 방법은 적합하게 적용된다. 특히, 바이러스 생산에 사용되는 포유동물 세포에 대하여 독성을 나타내는 프로테아제에 관하여 유용성이 높다. 이와 같은 프로테아제로서는, 예를 들면, 트립신 등을 들 수 있다. 트립신은, 세포 접착을 저해하고, 추가로 혈청에 의해 불활성화시키기 때문에 세포 밖에서 작용시키는데에는 혈청을 포함하지 않은 배양액을 사용해야 한다. 따라서, 트립신을 사용한 배양조건에서는 세포의 생존력(viability)(생존 및/또는 증식 등)은 저하되어 버린다. 따라서, 제2의 프로테아제로서 트립신 이외의 프로테아제를 사용함으로써, 트립신에 의한 세포 상해를 피할 수 있다. 프로테아제가 세포에 대하여 독성을 나타내는지의 여부는, 바이러스 생산에 필요한 프로테아제 활성을 나타내는 조건하에 있어서, 상기 프로테아제가 없는 경우에 비하여 세포의 생존력(viability)을 저하시키는지를 검사함으로써 조사할 수 있다. 세포의 생존력(viability)은, 예를 들면 산화 환원 색소인 레사주린(resazurin)이 생세포에 의해 형광산물 레조루핀(resorufin)으로 변환되는 것을 토대로 한 어세이법에 의해 측정할 수 있다(CellTiter-BlueTM Cell Viability Assay, Promega). 또는, LDH(유산 탈수소효소) 활성 측정, 산화 환원 색소의 Alamar Blue를 사용한 알라마 블루 형광법(Alamar Blue fluorescence method), 또는 테트라졸륨 화합물(tetrazolium compound)(MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 tetrazolium bromide]나 MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt])의 생세포에 의한 포르마잔(formazan) 산물로의 변환을 이용한 MTT법 및 MTS법 등에 의해 측정할 수 있다.
이들 바이러스의 바이러스 단백질의 프로테아제(즉 본래의 프로테아제) 절단부위를, 바이러스 생산세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제 또는 세포 독성이 보다 낮은 프로테아제 등(즉 제2의 프로테아제)의 절단서열로 치환함으로써, 본래 필요한 프로테아제의 비존재하에서 바이러스를 제조하는 것이 가능해진다. 제2의 프로테아제의 절단서열로서는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 상기의 포유동물 세포(LLC-MK2, Vero, BHK-21, HEK293, HT1080, 또는 그들의 파생주) 등이 내인적으로 발현하는 프로테아제의 절단서열을 사용하는 것이 적합하다. 바람직하게는 furin이 절단하는 서열을 사용하면 된다. furin의 발현은 편재적으로, 거의 모든 조직·세포에서 발현하고 있기 때문에, furin 절단서열로 치환함으로써, 효율적으로 바이러스를 생산하는 것이 가능해진다. furin의 절단서열의 예로서는, Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg(Xaa는 임의의 아미노산)을 들 수 있다. 구체적으로는, RTKR, RRRR, RHKR, RQR/KR, RHKR, RKRR 등을 예시할 수 있다. 예를 들면 본래 트립신 등에 의해 절단되는 절단서열(Xaa-Gln-Ser-Arg나 Xaa-Gln-Gly-Arg)을 갖는 바이러스 단백질의 상기 절단서열을, furin 절단서열(Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg)로 변환함으로써, 이 단백질은 furin에 의해 개열되어 활성형으로 변환되게 된다.
Furin 절단서열 이외에도, 목적으로 하는 프로테아제의 절단서열로 변환할 수 있다(WO01/20989). 특히, 세포가 내인적으로 발현하고 있거나, 또는 세포에 있어서 독성이 적은 프로테아제의 절단서열로 변환하는 것이 바람직하다. 이와 같은 프로테아제로 개열되는 서열을 갖는 바이러스 단백질 유전자를 사용함으로써, 세포의 생존력(viability)을 유지하고, 보다 효율적으로 바이러스를 생산시킬 수 있다. 엔벨로프 단백질의 개열을 위해서는, 세포 밖에 분비되는 프로테아제나, 막 표면에 발현되는 막형 프로테아제 등이 적합하다. 또한, 단백질이 세포내에 있어서 번역되어 세포 표면에 분비될 때까지의 수송 경로상에 존재하는 프로테아제여도 된다.
furin 이외의 프로테아제의 절단서열로서는, 예를 들면 MMP 및 콜라게나제(collagenase)에 특이적인 서열인, PLGMTS(서열번호: 1) 및 PQGMTS(서열번호: 2)의 서열을 이용할 수 있다(일본국 특허출원 제2002-129351). 이 경우, MMP 및 콜라게나제(collagenase)에 의한 절단은, 상기 인식서열의 3잔기째의 C 말단에서 발생하고, 예를 들면 센다이 바이러스의 F 단백에 있어서 F1 단백의 N 말단에 MTS가 부가된 형태로, F 단백의 활성을 갖는 것이 확인되어 있다. 또한, SeV의 F 단백에 있어서 트립신에 의해 인식되는 R116이 I로 변환된 변이체는, 키모트립신(chymotrypsin) 또는 엘라스타아제(elastase)에 의해 활성화되는 것이 명백해져 있고(Tashiro M et al., J Gen Virol. 73 (Pt 6): 1575-9 (1992), Itoh M, Homma M. J Gen Virol. 69 (Pt 11): 2907-11 (1988)), 이 서열도 이용 가능하다. 키모트립신(chymotrypsin) 또는 엘라스타아제(elastase)는 Y, F, W, L, I 등의 소수성 아미노산의 C 말단에서 절단하기 때문에, I 이외의 서열, 즉 Y, F, W, L로의 변이도 가능하다고 생각된다.
바이러스 생산세포는, 제2의 프로테아제를 고발현하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 바이러스 생산세포에는, 개변 바이러스 단백질을 개열시키는 제2의 프로테아제를 외래적으로 발현시키는 것도 가능하다. 제2의 프로테아제를 고발현시킴으로써, 개변 바이러스 단백질의 개열을 촉진시키고, 바이러스 생산의 효율을 더욱 향상시킬 수 있다. 이를 위해서는, 제2의 프로테아제를 코드하는 발현 벡터를 이 세포에 도입한다. 제2의 프로테아제의 발현에 사용되는 프로모터는, 포유동물 세포에서 유전자를 발현시키기 위한 목적으로 하는 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 재조합 효소 표적서열이나 유도성 프로모터를 사용하여, 자극에 따라 제2의 프로테아제의 발현이 유도되도록 구축하면 된다(후술).
제2의 프로테아제의 일례를 추가로 나타내면, 예를 들면 칼페인(calpain), 유비퀴틴·프로테아좀 시스템(ubiquitin-proteasome system), 네프릴라이신(neprilysin), MMP, 세린 프로테아제(serine protease), 아미노펩티다아제(aminopeptidase) 등을 들 수 있다. 칼페인은 칼슘과의 결합에 의해 활성화되는 프로테아제로서, 그 절단서열로서는, alpha-액티닌(actinin), 트로포닌(troponin), 코넥틴(connectin) 등의 단백질의 절단부위를 이용할 수 있다. 칼파인의 절단서열(Karlsson, J.O. et al. (2000) Cell Biol. Int. 24, 235-243)로서는, 예를 들면 Leu-Leu-Val-Tyr이 이용된다.
또한, 세포외 매트릭스(extracellular matrix; ECM)를 분해하는 MMP 및 근연(近緣) 유전자 패밀리의 ADAM(a disintegrin and metalloproteinase)의 절단서열을 사용해도 된다. 연골 프로테오글리칸(proteoglycan)(아그리칸(aggrecan))의 분해에 필수인 ADAMTS(ADAM with thrombospondin motif)가 분해하는 아그리칸의 절단서열은 알려져 있다(Tortorella, M.D. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 18566-18573). 이들 프로테아제의 인식서열을 사용함으로써, 상기 프로테아제를 사용하여 바이러스 벡터를 제조할 수 있다.
또한, ECM 분해성 세린 프로테아제로서는, 카텝신 G(cathepsin G), 엘라스타아제, 플라스민(plasmin), 플라스미노겐 액티베이터(plasminogen activator; PA), 종양 트립신, 키모토트립신 유사 중성 프로테이나아제, 트롬빈(thrombin) 등을 들 수 있다. 플라스민은, 생체 내에서 불활성의 상태에서 존재하는 플라스미노겐이 한정 분해되어 생성된다. PA에는, 혈액 응고에 관계하는 조직형 PA(tPA)와, ECM 분해에 관계하는 우로키나아제형 PA(urokinase PA)(uPA)가 있다(Blasi, F. and Verde, P. Semin. Cancer Bio. 1:117-126, 1990). uPA, tPA의 절단서열에 대해서는 잘 알려져 있다(Rijken, D.C. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257, 2920-2925; Wallen, P. et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta 719, 318-328; Tate, K.M. et al. (1987) Biochemistry 26, 338-343). 일반적으로 사용되고 있는 기질서열(substrate sequence)은 VGR(Dooijewaard, G., and KLUFT, C. (1983) Adv. Exp. Med. Biol. 156, 115-120)과, Substrate S-2288(Ile-Pro-Arg)(Matsuo, O. et al. (1983) Jpn. J. Physiol. 33, 1031-1037)이다. Butenas는 54종류의 형광기질을 사용하여, tPA에 대한 특이성이 높은 서열을 제시하고(Butenas, S. et al. (1997) Biochemistry 36, 2123-2131), FPR , VPR이 높은 tPA에 대한 분해 활성을 나타내었다. 따라서, 이들의 서열은 특히 적합하게 사용된다. 플라스민은 피브로넥틴, 테나신(tenascin), 라미닌 등을 분해한다.
또한, 시스테인 프로테아제 또는 아스파르틱 프로테아제(aspartic proteases)로 분류되는 ECM 분해효소도 알려져 있다. 구체적으로는, 라미닌, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 콜라겐, 프로콜라게나제(분해에 의해 활성화한다) 등을 기질로 하는 카텝신 B(Sloane, B.F., Semin. Cancer Biol. 1:137-152, 1990), 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스타아제(활성화) 등을 기질로 하는 카텝신 L(Kane, S.E. and Gottesman, M.M., Semin. Cancer Biol. 1:127-136, 1990), 및 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 카텝신 B 및 L(활성화)을 기질로 하는 카텝신 D(Rochefort, H., Semin. Cancer Biol. 1:153-160, 1990) 등을 들 수 있다.
메탈로프로테아제(metalloproteinase)는 Zn 등의 금속원소를 포함하는 금속효소로서, 카스파제(caspase), 아미노펩티다아제, 안지오텐신 I 변환효소(angiotensin I converting enzyme), 콜라게나제 등이 보고되어 있다. ECM을 분해하는 메탈로프로테아제로서는, 16종류 이상의 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinases; MMP)가 보고되어 있다. 대표적인 MMP로서는, 콜라게나제-1, 2, 3(MMP-1, 8, 13), 젤라티나아제 A, B(MMP-2, 9), 스트로멜리신(stromelysin) 1, 2, 3(MMP-3, 10, 11), 메트리라이신(matrilysin)(MMP-7), 막형 메탈로프로테아제(membrane metalloproteinase)(MT1-MMP, MT2-MMP) 등을 들 수 있다. 그 밖에, ECM 분해성의 메탈로프로테아제로서는, 아미노펩티다아제를 들 수 있고, 예를 들면, ECM 구성 단백질 등을 분해하는 아미노펩티다아제 N/CD13 및 아미노펩티다아제 B 등이 포함된다.
그 중에서 콜라게나제(collagenase)(MMP-1, 8, 13)는, 섬유성 콜라겐인 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ형 콜라겐 분자를 특이적 부위에서 절단한다. 젤라티나아제(gelatinase)는, 젤라티나아제 A(MMP-2) 및 젤라티나아제 B(MMP-9)의 2개의 타입이 알려져 있다. 젤라티나아제는 Ⅳ형 콜라게나제라고도 불리우고, 기저막의 주성분인 Ⅳ형 콜라겐을 분해하지만, Ⅴ형 콜라겐 및 엘라스틴도 분해한다. 또한, MMP-2는 Ⅰ형 콜라겐을 MMP-1과 동일한 부위에서 절단하는 것이 알려져 있다. MMP-9는 라미닌 및 피브로넥틴을 분해하지 않지만, MMP-2는 이들을 분해한다. 스트로멜리신(stromelysin)(MMP-3, 10)은 넓은 기질성을 갖고, 프로테오글리칸, Ⅲ, Ⅳ, Ⅸ형 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴 등을 분해한다. 메트리라이신(matrilysin)(MMP-7)은, 헤모펙신 도메인(hemopexin domain)을 갖지 않는 분자로서, 기질 특이성은 MMP-3와 공통되고, 특히 프로테오글리칸 및 엘라스틴에 대한 분해활성이 높다. 막형 메탈로프로테아제(membrane-type MMP; MT-MMP)(MT1, 2, 3, 4, 5, 6-MMP)는 막 관통구조를 갖는 MMP이다. MT-MMP는, 프로펩티드 도메인과 활성부위의 사이에 삽입서열(약 10 아미노산)을 갖는다. 이 삽입서열은 Arg-Xaa-Lys-Arg(Xaa는 임의의 아미노산)를 포함하고, 세포막 상에 수송되는 과정에서, 세포내 프로세싱에 의해 개열되어 활성화된다. MT-MMP로서는, MT1-MMP(MMP-14), MT2-MMP(MMP-15), MT3-MMP(MMP-16), MT4-MMP(MMP-17), MT5-MMP(MMP-23), 및 MT-6-MMP(MMP-25) 등이 알려져 있고, 예를 들면 MT1-MMP는 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ형 콜라겐을, MT3-MMP는 Ⅲ형 콜라겐을 분해한다.
MMP의 절단 기질은 다수 알려져 있다. MMP 전반을 분해하는 기질서열로서 PLGLWAR(서열번호: 3)(Bickett, D.M. et al. (1993) Anal. Biochem. 212, 58-64), GPLGMRGL(서열번호: 4)(Deng, S.J. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275, 31422-31427), PQGLEAK(서열번호: 5)(Beekman, B. et al. (1996) FEBS Lett. 390, 221-225), RPKPVEWREAK(서열번호: 6)(Beekman, B. et al. (1997) FEBS Lett. 418, 305-309), PLALWAR(서열번호: 7)(Jacobsen, E.J. et al. (1999) J. Med. Chem. 42, 1525-1536)이 있다. MMP-2, 9의 분해기질로서 PLGMWS(서열번호: 8)(Netzel-Arnett, S. et al. (1991) Anal. Biochem. 195, 86-92)와 PLGLG(서열번호: 9)(Weingarten, H. et al. (1985) Biochemistry 24, 6730-6734)가 있다.
최근, phage-displayed peptide library screening에 의해, MMP9(Kridel, S.J. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 20572-20578), MMP2(Chen, E.I. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 4485-4491), MT1-MMP(Kridel, S.J. et al. (2002) J. Biol. Chem. In JBC Papers in Press, April 16, 2002, Manuscript M111574200)에 대한 분해 기질서열이 명백하게 되어 있다. 이들의 논문에서, 특정된 아미노서열을 3개의 MMP에 대한 분해능의 유무에 의해 4개의 그룹으로 분류하고 있다. Group Ⅳ가 MT1-MMP에 특이적으로 분해되는 서열로서, Arg가 없는 서열로서 VFSIPL(서열번호: 10), IKYHS(서열번호: 11)의 서열이 MMP9, MMP2로 분해되지 않고 MT-MMP로만 분해할 수 있는 기질로서 나타내어져 있다.
예를 들면, MMP9의 절단서열로서는, Pro-X-X-Hy(X는 임의의 잔기, Hy는 소수성 잔기를 표시한다)를 들 수 있고, 특히 Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)가 바람직하다. 보다 구체적으로는, Pro-Arg-(Ser/Thr)-Hy-(Ser/Thr)를 예시할 수 있다(X-Hy 사이에서 절단이 발생한다). Hy(소수성 잔기)로서는, 이들에 한정되지 않지만, 예를 들면 Leu, Val, Tyr, Ile, Phe, Trp, Met를 들 수 있다. 또는 이들 이외의 절단서열도 동정되어 있어(예를 들면 이하 문헌의 Group Ⅰ, Ⅱ, ⅢA, ⅢB를 참조; Kridel, S.J. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 20572-20578), 이들의 목적으로 하는 서열을 사용할 수 있다. 또한 MMP2에 관해서도 상기의 Pro-X-X-Hy여도 되고, 그 밖에도 (Ile/Leu)-X-X-Hy, Hy-Ser-X-Leu, His-X-X-Hy 등을 예시할 수 있다(예를 들면, 이하 문헌의 Group Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ를 참조; Chen, E.I. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 4485-4491). MMP-7, MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-3, MT1-MMP(MMP-14)를 포함하는 MMP 패밀리의 절단서열은, 예를 들면 천연의 기질 단백질의 서열을 참조로 하거나, 또는 펩티드 라이브러리의 스크리닝 등에 의해 적절히 선택할 수 있다(Turk, B.E. et al., Nature Biotech. 19, 661-667 (2001); Woessner, J.F. and Nagase, H. Matrix metalloproteinases and TIMPs. (Oxford University Press, Oxford, UK, 2000); Fernandez-Patron, C. et al., Circ. Res. 85: 906-911, 1999; Nakamura, H. et al., J. Biol. Chem. 275: 38885-38890, 2000; McQuibban, G.A. et al., Science 289: 1202-1206, 2000; Sasaki, T. et al., J. Biol. Chem. 272: 9237-9243, 1997). 예를 들면 절단부위의 8 아미노산 P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'(P1-P1' 사이에서 절단된다)를 예시하면, MMP-1은 VPMS-MRGG(서열번호: 12), MMP-3는 RPFS-MIMG(서열번호: 13), MMP-7은 VPLS-LTMG(서열번호: 14), MT1-MMP는 IPES-LRAG(서열번호: 15) 등을 들 수 있지만 이들에 제한되지 않는다. MMP-8에는 예를 들면 PLAYWAR(서열번호: 16)(Nezel-Amett, S. et al., Anal. Biochem. 195: 86, 1991)를 들 수 있다. MMP의 합성기질은 여러 종류의 것이 입수 가능하여, 이들의 서열을 비교하는 것도 가능하다(예를 들면 Calbiochem 등록상표 카탈로그, Merk의 각 MMP Substrate 참조).
바이러스 단백질의 프로테아제 절단부위의 서열을, 상기의 프로테아제의 절단서열로 치환함으로써, 바이러스 단백질을 개열하는 프로테아제를 변환한다. 개변 바이러스 단백질이 제2의 프로테아제로 효율적으로 절단되는지는, 이 개변 단백질을 세포에서 발현시켜 웨스턴 블로팅에 의해 조사할 수 있다. 또한, 개열하여 활성화시킨 바이러스 단백질의 기능을 검출하여 확인할 수 있다(PCT/JP03/05528). 예를 들면 세포막 융합작용을 갖는 바이러스 단백질이라면, 개변 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드 벡터를 세포에 트랜스펙션하고, 제2의 프로테아제 존재하에서 배양하여 신시튬 형성(syncytial formation)을 검출한다. 이것을 측정함으로서 개변 바이러스 단백질이 제2의 프로테아제에 의해 개열되어 활성화되는 것을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서 제조되는 바이러스는, 바이러스 게놈에 절단부위가 개변된 단백질은 코드되어 있지 않다. 이와 같은 바이러스의 하나로서는, 절단서열이 개변되기 전의 본래의 절단서열을 갖는 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 갖는 바이러스를 들 수 있다. 즉, 이 바이러스는 개변 바이러스 단백질을 포함하고 있지만, 바이러스 게놈에는 야생형 절단서열을 갖는 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 보유하고 있다. 따라서 바이러스는,(만약 바이러스 증식에 필요한 바이러스 유전자를 갖고 있다면,) 야생형 절단서열을 절단하는 프로테아제에 의존적으로 증식한다. 야생형 절단서열을 갖는 바이러스 유전자를 갖는 바이러스를 제조할 때에는, 제2의 프로테아제 존재하에서 바이러스 생산세포에 있어서 개변 바이러스 단백질을 발현시키는 데에 첨가하여, 야생형 절단서열을 절단하는 프로테아제(즉 원래의 프로테아제)를 바이러스 생산세포에 첨가 또는 발현시켜도 된다. 개변 바이러스 단백질을 사용함으로써, 바이러스 생산량을 상승시키는 것을 기대할 수 있다(실시예 5 참조).
본 발명의 다른 하나의 태양에 있어서는, 제조되는 바이러스는, 절단서열을 개변하는 대상이 되는 바이러스 유전자가 결손되는 결손형 바이러스이다. 이 바이러스는 해당 바이러스 유전자를 결손하기 때문에, 바이러스가 표적 세포에 감염되어도, 그 세포에 있어서 기능적 바이러스 단백질을 발현할 수 없고,(프로테아제의 유무에 관계없이) 증식할 수 없다. 즉, 이 바이러스는 비전파성이 된다. 본 발명의 방법은, 특히, 고역가의 벡터 생산이 일반적으로 어려운, 전파능을 갖지 않는 결손형 벡터의 효율적인 제조를, 인간 세포를 포함하는 여러 종류의 세포종을 사용하여 가능하게 하는 이점을 갖는다.
본 발명의 바이러스 제조에 있어서는, 상기와 같이 절단부위를 제2의 프로테아제 절단서열로 변환한 개변 바이러스 단백질을 트랜스로(즉 바이러스 게놈 이외로부터) 공급한다. 이를 위해, 개변 바이러스 단백질을 발현하는 벡터를 별도 구축하고, 바이러스 생산세포에 도입하여 발현시키는 것이 바람직하다. 개변 바이러스 단백질을 발현하기 위한 벡터는 목적으로 하는 벡터를 사용해도 되지만, 만약 바이러스 벡터를 사용하는 경우는, 당연한 일이지만, 제조하려는 바이러스와 혼합되지 않도록, 바이러스 생산세포에 있어서 증식하지 않는 바이러스 벡터를 사용하도록 한다. 또한, 개변 단백질의 유전자가 제조하는 바이러스에 삽입되지 않도록, 별종의 바이러스 벡터를 사용하거나, 동종 바이러스라면, 바이러스로의 삽입에 필요한 시그날 서열을 제거해 둔다. 예를 들면, 증식능을 불활성화한 바이러스 벡터, 제조하는 바이러스와는 별종의 비전파성 바이러스 벡터, 또는 비바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 복제능을 결손시킨 이종 바이러스 벡터나, 플라스미드 벡터가 적합하다.
개변 바이러스 단백질을 발현시키기 위한 보다 바람직한 벡터로서는 플라스미드 벡터를 들 수 있다. 플라스미드의 세포로의 트랜스펙션에는, 예를 들면 인산칼슘법(Graham, F. L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223), 또는 여러 종류의 트랜스펙션 시약을 사용한 방법, 또는 전기천공법 등을 사용할 수 있다. 인산칼슘법에 대해서는, 예를 들면 Chen 및 Okayama(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)에 따라, 2~4% CO2, 35℃, 15~24시간, 침전혼액 중의 DNA 농도 20~30 micro-g/㎖의 조건에서 실시할 수 있다. 트랜스펙션 시약에 대해서는, DEAE-덱스트란(Sigma #D-9885 M.W. 5×105), DOTMA(Roche), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169), TransIT-LT1(Mirus, Product No. MIR 2300) 등을 사용할 수 있다. 트랜스펙션 시약과 DNA와의 복합체가 엔도솜 중에서 분해되어 버리는 것을 방지하기 위해, 클로로퀸을 첨가할 수 있다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). 또한, 전기천공법은, 세포선택성이 없다고 하는 점에서 범용성이 높고, 펄스전류의 지속시간, 펄스의 형태, 전계(전극간의 갭, 전압)의 강도, 버퍼의 도전율, DNA 농도, 세포밀도를 최적화하여 적용된다. 벡터 재구성을 위한 DNA의 세포로의 도입에는, 조작이 간편하고 다량의 세포를 사용하여 다수의 검체를 검토할 수 있는 점에서, 트랜스펙션 시약을 사용하는 방법이 적합하다. 적합하게는 Superfect Transfection Reagent(QIAGEN, Cat No. 301305), DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Roche, Cat No. 1811169), 또는 TransIT-LT1(Mirus, Product No. MIR 2300) 등이 사용되지만, 이들에 제한되지 않는다.
개변 단백질을 발현시키기 위해 사용하는 프로모터로서는, 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 목적으로 하는 프로모터를 사용할 수 있고, 예를 들면, 사이토메갈로 바이러스(CMV)의 프로모터, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus)(RSV) LTR 프로모터, 티미딘 키나아제(thymidine kinase)(TK) 프로모터, α- 또는 β-액틴의 프로모터, SV40 초기 유전자 프로모터, EF1α 프로모터, SRα 프로모터, 또는 이들의 하이브리드 프로모터 등을 이용할 수 있다(Kim DW et al., 1990, Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene 91(2): 217-23; Chapman BS et al., 1991, Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells, Nucleic Acids Res. 14: 3979-3986; Takebe Y et al., 1988, SR alpha promoter: an efficient and versatile mammalian cDNA expression system composed of the simian virus 40 early promoter and the R-U5 segment of human T-cell leukemia virus type 1 long terminal repeat. Mol. Cell Biol. 1: 466-472).
개변 단백질을 발현시키기 위해 사용하는 특히 바람직한 프로모터로서는, 사이토메갈로 바이러스 인핸서 및 닭 β-액틴 프로모터를 포함하는 프로모터(CA 프로모터라 칭한다)를 들 수 있다. CA 프로모터란, (i) 사이토메갈로바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 인핸서서열, 및 (ii) 닭 β-액틴 유전자 프로모터서열을 포함하는 하이브리드 프로모터를 말한다. CA 프로모터를 사용하여 개변 바이러스 단백질을 발현시킴으로써, 고역가의 바이러스 생산이 가능해진다. CMV IE 인핸서로서는, 목적으로 하는 CMV주의 immediately early 유전자의 인핸서를 사용할 수 있지만, 예를 들면 서열번호: 17의 염기서열을 포함하는 DNA를 예시할 수 있다.
또한, 닭 β-액틴 프로모터로서는, 닭 β-액틴 유전자의 게놈 DNA의 전사개시부위 및 TATA 박스(Ann. Rev. Biochem. 50, 349-383, 1981) 및 CCAA 박스(Nucl. Acids Res. 8, 127-142, 1980)를 포함하는 DNA 단편으로서, 프로모터 활성을 갖는 단편을 사용할 수 있다. 닭 β-액틴 유전자 프로모터의 염기서열에 대해서는, 예를 들면 T.A. Kost 등에 의해 보고되어 있다(Nucl. Acids Res. 11, 8287-8286, 1983). 닭의 β-액틴 프로모터에 있어서는, 본래의 β-액틴 구조 유전자의 번역개시코돈(ATG)의 상류-909 위치의 G(구아닌)로부터 -7 위치의 G(구아닌)까지의 영역은 인트론으로 생각된다. 이 인트론에는 전사를 촉진하는 활성이 있기 때문에, 이 인트론의 적어도 일부까지를 포함하는 게놈 DNA 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 닭 β-액틴 프로모터로서는, 구체적으로는, 예를 들면 서열번호: 18의 염기서열을 포함하는 DNA를 예시할 수 있다. 인트론의 액셉터서열은, 적절히 다른 유전자의 서열을 사용할 수 있고, 예를 들면 토끼 β-글로빈의 스플라이싱 액셉터서열을 사용해도 된다. 보다 구체적으로는, 토끼 β-글로빈의 개시코돈의 직전에 있는 제2 인트론의 액셉터 부위를 사용할 수 있다. 구체적으로는, 서열번호: 19에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA를 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서 CA 프로모터로서는, CMV IE 인핸서서열의 하류에, 인트론의 일부까지를 포함하는 닭 β-액틴 프로모터를 연결하고, 그 하류에 목적으로 하는 인트론 액셉터서열을 부가한 DNA가 적합하다. 일례를 서열번호: 20에 나타내었다. 단백질 발현을 위해서는, 이 서열의 마지막 ATG를 개시코돈으로 하여, 개변 바이러스 단백질의 코드서열을 부가하면 된다.
CA 프로모터에 사용하는 CMV 인핸서서열 및 닭 β-액틴 유전자 프로모터는, 단리주 또는 단리 개체에 의해 서열에 다양성이 있을 수 있다. 또한, 이들 서열은, 제한효소 인식부위를 추가 또는 삭제하거나, 링커서열을 삽입하기 위해, 경미하게 개변할 수 있다(Molecular cloning: a laboratory manual., 3rd ed., Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). 즉, 이들의 서열은, 서열번호: 20에 예시한 것과 완전히 동일한 서열이 아니어도, 동등 또는 그 이상(예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상)의 프로모터 활성을 갖는 한, 적절히 사용할 수 있다. CMV 인핸서서열 및 닭 β-액틴 유전자 프로모터서열의 배리언트(variant)로서는, 예를 들면 Genbank accession number AF334827, AY237157, AJ575208, 및 X00182 등에 기재된 서열을 사용할 수 있다. 이들 서열로부터 CA 프로모터의 구축에 필요한 서열을 특정하는데는, 서열번호: 17 및 18과 얼라이먼트(alignment)를 작성하여, 해당하는 영역을 선택하면 된다. 또한, CA 프로모터의 구축에는, pCAGGS(Niwa, H. et al. (1991) Gene. 108: 193-199, 일본국 특허공개 제(평)3-168087)나 pCALNdLw(Arai, T. et al. J. Virology 72, 1998, p1115-1121)로부터 DNA를 잘라내 이용할 수 있다.
상기와 같은 CMV IE 인핸서서열 및 닭 β-액틴 프로모터의 배리언트로서는, 서열번호: 17에 기재된 CMV IE 인핸서서열, 및 서열번호: 18에 예시된 닭 β-액틴 프로모터에 있어서, 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 보다 바람직하게는 15% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하, 보다 바람직하게는 3% 이하의 염기를 치환, 결실, 및/또는 삽입한 염기서열을 포함하고, 동등한 프로모터 활성을 나타내는 서열을 들 수 있다. 이들 서열은, 각각 서열번호: 17에 기재된 염기서열, 또는 서열번호: 18에 기재된 염기서열과 높은 호몰로지(homology)를 나타낸다. 높은 호몰로지로서는, 예를 들면 70% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 93% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상의 동일성을 갖는 염기서열이다. 염기서열의 동일성은, 예를 들면 BLAST 프로그램(Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)을 사용해서 결정할 수 있다. 예를 들면 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST의 웹페이지에 있어서 Low complexity를 포함하는 필터는 모두 OFF로 하여, 디폴트(default)의 파라미터를 사용하여 검색을 행한다(Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656). 예를 들면 2개의 서열의 비교를 행하는 blast2sequences 프로그램(Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)에 의해, 두 서열의 얼라이먼트를 작성하여, 서열의 동일성을 결정할 수 있다. 갭(gap)은 미스매치(mismatch)와 동일하게 취급하여, 예를 들면 서열번호: 17에 기재된 염기서열 전체 또는 서열번호: 18에 기재된 염기서열 전체에 대한 동일성의 값을 계산한다. 구체적으로는, 얼라이먼트에 있어서의 서열번호: 17 또는 18의 총 염기수(갭을 포함한다)에 있어서의 일치하는 염기수의 비율을 계산한다. 얼라이먼트에 있어서의 서열번호: 1 또는 2의 바깥쪽 갭은 계산에서 제외한다.
또한, CMV 인핸서서열 및 닭 β-액틴 프로모터서열은, CMV의 게놈 핵산 및 닭 게놈 DNA로부터 하이브리다이제이션에 의해 단리할 수 있다. 본 발명에 있어서 사용되는 CMV 인핸서 및 닭 β-액틴 프로모터는, 각각 서열번호: 17에 기재된 염기서열, 또는 서열번호: 18에 기재된 염기서열 또는 그의 상보서열과 스트린젠트(stringent)한 조건에서 하이브리다이즈하는 DNA로서, 이들과 동등한 프로모터 활성을 갖는 DNA여도 된다. 하이브리다이제이션에 있어서는, 예를 들면 서열번호: 17에 기재된 염기서열, 서열번호: 18에 기재된 염기서열, 또는 그들의 상보서열을 포함하는 핵산으로부터 프로브를 조제, 또는 하이브리다이즈의 대상으로 하는 DNA로부터 프로브를 조제하고, 그것이 다른 쪽의 DNA에 하이브리다이즈하는지를 검출함으로써 동정할 수 있다. 스트린젠트한 하이브리다이제이션의 조건은, 예를 들면 5×SSC, 7%(W/V) SDS, 100 micro-g/㎖ 변성 연어 정자 DNA, 5×덴하르트액(Denhardt's solution)(1×덴하르트용액은 0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 소혈청 알부민, 및 0.2% 피콜을 포함한다)을 포함하는 용액 중, 60℃, 바람직하게는 65℃, 보다 바람직하게는 68℃에서 하이브리다이제이션을 행한 후, 하이브리다이제이션과 동일한 온도에서 2×SSC 중, 바람직하게는 1×SSC 중, 보다 바람직하게는 0.5×SSC 중, 보다 바람직하게는 0.1×SSC 중에서, 진탕하면서 2시간 세정하는 조건이다.
개변 바이러스 단백질을 발현하기 위한 벡터에 있어서, 특정한 자극에 응답하여 발현을 유도할 수 있는 발현계를 사용하면, 바이러스 생산시에 특이적으로 개변 바이러스 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 바이러스 단백질은 세포에 대하여 독성을 나타내는 경우가 있기 때문에, 이와 같은 유도 발현계를 사용하는 것에 이점이 있다. 이 목적을 위해서는, 예를 들면 대장균의 테트라사이클린 내성 오페론(tetracycline resistance operon)을 이용한 계(Gossen, M., et al. (1995) Science 268:1766-1769; Tet Expression Systems and Cell Lines(July 1996) CLONTECHniques XI(3):2-5), 엑디손(ecdysone) 수용체, RXR 및 엑디손 수용체 응답서열을 이용한 엑디손 유도 발현계(pVgRXR, pIND; Ecdysone-inducible Mammalian Expression Kit, Invitrogen사), 또는 Cre/loxP 또는 FLP/FRT 등의 서열 특이적 재조합 효소를 이용한 계를 이용할 수 있다. 특히, 서열 특이적 재조합 효소를 이용한 유도 발현계는, 여러 종류의 프로모터와 조합하여 사용하는 것이 용이하고, 매우 엄격하게 발현의 on/off를 제어하는 것이 가능하기 때문에, 개변 바이러스 단백질의 발현계에 이용하기 위해 적합하다.
Cre는 박테리오파지 P1이 갖는 약 38 kDa의 cyclization 리콤비나아제로, loxP 부위의 사이를 특이적으로 재조합한다(Sauer B, Henderson N. 1988. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the Cre recombinase of bacteriophage P1. Proc Natl Acad Sci USA 85:5166-70; Sternberg N, Hamilton D. 1981. Bacteriophage P1 site-specific recombination. I. Recombination between loxP sites. J Mol Biol 150:467-86; Brian Sauer, Methods of Enzymology; 1993, Vol. 225, 890-900; Nagy A. 2000. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis 26:99-109). loxP는 8 bp의 스페이서를 갖는 13 bp의 어심매트릭 인버티드 리피트 서열(asymmetric inverted repeat sequence)인(ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT; 하선부가 인버티드 리피트)(서열번호: 21). 예를 들면 Cre/loxP 유도형 발현 플라스미드 pCALNdlw(Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, p1115-1121)를 사용하여, Cre에 의해 발현을 유도할 수 있는 벡터를 구축할 수 있다. Cre를 발현시키기 위해서는, 예를 들면 아데노바이러스 AxCANCre를 사이토 등의 방법(Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T. et al., J. Virol 72, 1115-1121 (1998))에 의해, 예를 들면 moi=3~5로 감염시킨다.
FLP 리콤비나아제는 효모 Saccharomyces cerevisiae의 2 micron 플라스미드에 유래하는 약 49 kDa의 flippase 리콤비나아제로, FLP recombinase target(FRT) 서열을 표적으로 하여 재조합을 일으킨다(Utomo AR, Nikitin AY, Lee WH. 1999. Temporal, spatial, and cell type-specific control of Cre-mediated DNA recombination in transgenic mice. Nat Biotechnol 17:1091-6; Broach, J. R., Guarascio, V. R. & Jayaram, M. (1982) Cell 29, 227-34; Cox, M. M. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4223-227; Vetter, D., Andrews, B. J., Roberts-Beatty, L. & Sadowski, P. D. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7284-288; Abremski, K. & Hoess, R. (1984) J. Biol. Chem. 259, 1509-514; Stark, W. M., Boocock, M. R. & Sherratt, D. J. (1992) Trends Genet. 8, 432-39; Kilby, N. J., Snaith, M. R. & Murray, J. A. H. (1993) Trends Genet. 9, 413-21). loxP와 마찬가지로, FRT 서열도 8 bp의 스페이서를 갖는 13 bp의 리피트서열로 된다(GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC; 서열번호: 22)(Andrews, B. J. et al. (1985). The FLP Recombinase of the 2 Micron Circle DNA of Yeast: Interaction with its Target Sequences. Cell 40, 795-803). 또한, 표적 특이적 재조합은, 상기의 loxP 부위 및 FRT 부위의 변이서열을 이용하여 행하는 것도 가능하다(Baszczynski, Christopher L. et al, US Patent Application 20040003435).
재조합 효소 의존적으로 발현이 유도되는 벡터를 구축하기 위해서는, 재조합 효소 표적서열에 끼여진 DNA 단편을, 프로모터와 개변 바이러스 단백질 코드서열 사이에 삽입한다. 이 상태에서는, 삽입된 DNA 단편에 방해를 받아, 개변 바이러스 단백질은 발현되지 않는다. 그러나, 재조합 효소를 작용시키면, 표적서열에서 끼여진 DNA가 잘라 내어져, 프로모터로부터 재조합 효소가 발현하게 된다. 이와 같이, 재조합 효소에 의해, 프로모터로부터의 발현을 유도할 수 있다. 재조합 효소의 표적서열에 끼여진 DNA 중에는, 전사 종결 시그날 및/또는 종지 코돈을 포함하도록 해두고, 재조합 효소를 작용시키지 않을 때에, 하류에 연결된 유전자의 발현을 확실하게 저해할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 재조합 효소의 표적서열에 끼여진 DNA 중에는, 적절히 마커 유전자를 삽입해 둘 수 있다.
개변 바이러스 단백질의 발현 벡터는, 벡터의 종류에 따라 트랜스펙션 또는 감염 등 적당한 방법에 의해 포유동물 세포에 도입하여 발현시킨다. 트랜스펙션에는, 여러 종류의 트랜스펙션 시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Roche), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169), TransIT-LT1(Mirus, Product No. MIR 2300) 등의 양이온 지질을 적합하게 사용할 수 있다. 개변 바이러스 단백질의 발현 벡터는, 바이러스 제조시에 일과적으로 도입하여, 바이러스 생산세포에서 에피소말하게(episomally) 발현시켜도 되고, 또는 바이러스 생산세포의 염색체 중에 도입된 안정형질 전환체를 수립해도 된다. 개변 바이러스 단백질의 발현 벡터가 안정 도입된 세포는, 바이러스 제조를 위한 헬퍼 세포로서 유용하다. 안정형질 전환체는, 벡터에 약제 내성 마커 유전자를 삽입해 두고, 약제 내성주를 선택하여 얻을 수 있다. 웨스턴 블로팅에 의해 개변 바이러스 단백질을 고발현시키는 세포 클론을 단리하는 것이 바람직하다. 또한, 실제로 바이러스 벡터를 생산시켜, 고역가에서 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 세포를 선택한다.
개변 바이러스 단백질의 발현 벡터를 도입하는 세포종은, 바이러스 증식 가능한 포유동물 세포라면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 마우스, 랫트, 원숭이 및 인간 유래의 세포주를 사용할 수 있다. 구체적으로는, NIH3T3, 3Y1, LLC-MK2, Vero, CV-1, HeLa, HEK293, COS-1, COS-7, CHO, CHO-K1, HT1080, 또는 그들의 파생주를 들 수 있다. 인간 세포로의 유전자 도입을 위해 바이러스 벡터를 제조하는 경우는, 인간 세포를 사용하여 바이러스를 생산하는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 전술한 바와 같이, 바이러스 생산세포로부터 방출된 딸 바이러스 입자에는, 바이러스 생산세포 유래의 세포질 및 세포막 성분을 혼입할 수 있다. 따라서 인간 세포 이외의 세포를 사용하여 바이러스를 제조하면, 이들의 성분이 인간에 있어서 유해작용을 미치거나, 또는 면역반응을 야기할 가능성이 있다. 이와 같은 문제는, 바이러스 벡터를 투여하는 대상과 동종의 세포를 사용하여 바이러스를 생산함으로써 해결할 수 있다.
개변 바이러스 단백질의 발현 벡터를 발현 가능한 세포주는, 상기 단백질이 유래하는 것과 동종의 바이러스의 제조 뿐만 아니라, 타종 바이러스에 있어서, 상기 개변 바이러스 단백질에서 슈도 타입화된(pseudotyped) 바이러스를 제조하기 위해서도 유용하다. 예를 들면, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 개변 F 단백질 및 HN 단백질의 존재하에서 아데노바이러스를 생산하여, 개변 F 단밸질로 슈도 타입화된 아데노바이러스 벡터를 구축하는 것도 가능하다(Galanis, E. et al., Hum. Gene Ther. 12, 811-821 (2001)). 더 나아가서는, 예를 들면 레트로바이러스를 개변 F 단백질 및 HN 단백으로 슈도 타입화하는 경우에(Spiegel, M. et al., J Virol. 72(6) 5296-5302 (1998)), 본 세포를 사용할 수 있다. 세포에는, 제조하는 바이러스에 따라, 추가로 다른 바이러스의 단백질 및/또는 바이러스 게놈 RNA를 발현하는 벡터를 삽입하는 것도 가능하다.
개변 바이러스 단백질을 갖는 바이러스 벡터의 제조는, 각각의 바이러스의 제조공정에 있어서, 상기의 세포(및 개변 바이러스 단백질을 절단하는 프로테아제)를 사용하여 행함으로써 실시하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 개변 바이러스 단백질을 발현하는 세포에 있어서, 개변 바이러스 단백질을 절단하는 프로테아제의 존재하, 바이러스 벡터의 게놈 RNA를 전사시킨다. 바이러스 입자의 형성에, 바이러스 단백질을 트랜스로 공급하는 것이 필요한 경우에는, 그 바이러스 단백질도 발현시킨다. 전사된 바이러스 게놈 RNA는, 바이러스 단백질을 복합체를 형성하고, 개변 바이러스 단백질이 삽입된 바이러스 입자가 형성된다. 이 바이러스 입자를 세포의 배양상청 또는 세포로부터 회수함으로써, 개변 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 벡터를 조제할 수 있다.
본 발명의 방법은 프로테아제 의존적인 목적으로 하는 바이러스 벡터의 제조에 적용하는 것이 가능하지만, 이하에 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터의 제조방법에 대해서, 예시로서 더욱 상세하게 설명한다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스란, 마이너스 가닥(바이러스 단백질을 센스에 코드하는 가닥과 상보적인 안티센스 가닥)의 RNA를 게놈으로서 포함하는 바이러스이다. 마이너스 가닥 RNA는 네거티브 가닥 RNA라고도 불리운다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스는 유전자 도입 벡터로서 우수하고, 숙주세포의 세포질에서만 전사·복제를 행하여, DNA 상(DNA phase)을 갖지 않기 때문에 염색체로의 통합(integration)은 일어나지 않는다(Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of Virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers: Philadelphia, 1996, pp. 1177-1204). 이 때문에 염색체 이상에 의한 암화(癌化) 및 불사화(不死化) 등의 안전면에 있어서의 문제가 발생하지 않는다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 이 특징은 벡터화되었을 때의 안전성에 크게 기여하고 있다. 이종 유전자 발현의 결과에서는, 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 하나인 센다이 바이러스(SeV)를 연속 다대계대(多代繼代)해도 거의 염기의 변이가 인정되지 않고 게놈의 안정성이 높아, 삽입 이종 유전자를 장기간에 걸쳐 안정하게 발현하는 것이 나타나 있다(Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466(1997)). 또한, 캡시드구조 단백질을 갖지 않는 것에 의한 도입 유전자의 사이즈 또는 팩키징의 유연성(flexibility) 등 성질상의 장점이 있다. 이와 같이, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터는, 인간의 유전자 치료를 위한 고효율 벡터의 새로운 클래스가 되는 것이 시사된다.
본 발명에 있어서 사용되는 마이너스 가닥 RNA 바이러스로서는, 특히 단일 가닥 네거티브 가닥[즉 마이너스 가닥] RNA를 게놈에 갖는 단일가닥 마이너스 가닥 RNA 바이러스(비분절형(non-segmented) 마이너스 가닥 RNA 바이러스라고도 한다)를 들 수 있다. 이러한 바이러스로서는, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus 및 Rubulavirus속 등을 포함한다), 라브도바이러스(Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, 및 Ephemerovirus속 등을 포함한다), 필로바이러스(Filoviridae), 오르토믹스바이러스(Orthomyxoviridae; Infuluenza virus A, B, C, 및 Thogoto-like viruses 등을 포함한다), 분야바이러스(Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, 및 Phlebovirus속 등을 포함한다), 아레나바이러스(Arenaviridae) 등의 과에 속하는 바이러스가 포함된다.
보다 구체적으로 예시하면, 예를 들면 Sendai virus(SeV), human parainfluenza virus-1(HPIV-1), human parainfluenza virus-3(HPIV-3), phocine distemper virus(PDV), canine distemper virus(CDV), dolphin molbillivirus(DMV), peste-des-petits-ruminants virus(PDPR), measles virus(MV), rinderpest virus(RPV), Hendra virus(Hendra), Nipah virus(Nipah), human parainfluenza virus-2(HPIV-2), simian parainfluenza virus 5(SV5), human parainfluenza virus-4a(HPIV-4a), human parainfluenza virus-4b(HPIV-4b), mumps virus(Mumps) 및 Newcastle disease virus(NDV) 등을 들 수 있다.
본 발명의 바이러스 제조방법이 주된 대상으로 하는 것은, 증식에 필요한 프로테아제가 furin 이외의 프로테아제인 바이러스이지만, 예를 들면 furin형 절단서열을 원래 F 단백질에 포함하는 바이러스에 관해서도, F 단백질이 변이하여 절단부위가 변화하고 있는 약독주를 제조할 때에, furin 절단형 F 단백질을 바이러스 생산세포로부터 트랜스로 공급하는 것을 생각할 수 있다.
마이너스 가닥 RNA 바이러스의 F 단백질의 개열부위를 개변하는 경우는, 절단 후의 F1 단편의 N 말단이 야생형 F 단백질의 F1 단편의 N 말단과 동일해지도록 절단서열을 설계하는 것이 바람직하다. 또한 효율적인 절단반응을 일으키기 위해 절단부위에 링커(linker)를 삽입하는 경우에는, 절단 후의 F1 단편의 N 말단에, 야생형 F1과 비교하여 최소한의 아미노산이 부가되도록 설계하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 절단 후의 N 말단에는, 야생형 F1에 비하여 5 아미노산 이내, 바람직하게는 4 아미노산 이내, 보다 바람직하게는 3 아미노산 이내(예를 들면 1, 2, 또는 3 아미노산)가 부가되도록 한다. 본래의 F 단백질의 F2 단편의 C 말단의 아미노산은 적절히 결실시키면 되고, 결실시키는 아미노산은, 예를 들면 삽입하는 아미노산수를 동일하게 하거나, 0~10 아미노산 정도의 범위에서 선택할 수 있다. 프로테아제에 의한 개열 및 막 융합의 과정이 장해(障害)되지 않는 한, 절단서열의 하류에 F1의 N 말단이 직접 연결되도록 F 단백질을 조제할 수 있지만, 개열서열과 F1 단편은 적당한 스페이서를 매개로 하여 연결해도 된다.
개변 F 단백질을 발현시키기 위한 벡터는, 목적으로 하는 벡터계를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 플라스미드 벡터가 사용된다. 벡터는, 바이러스 생산시에 세포에 트랜스펙션해도 되고, 또는 미리 세포의 염색체에 삽입한 형질전환세포를 수립해도 된다. 개변 F 단백질을 발현시키기 위한 프로모터로서는, 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 목적으로 하는 프로모터를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 CA 프로모터를 사용한다. 재조합 효소 표적서열을 사용하여, 재조합 효소 특이적으로 발현을 유도할 수 있도록 해두는 것이 바람직하다(실시예 9 참조).
본 발명에 있어서 제조되는 바이러스는, 보다 바람직하게는, 파라믹소바이러스 아과(레스피로바이러스속, 루블라바이러스속 및 모빌리바이러스속을 포함한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이고, 보다 바람직하게는 레스피로바이러스속(Respirovirus)(파라믹소바이러스속(Paramyxovirus)이라고도 한다)에 속하는 바이러스 또는 그의 유도체이다. 유도체에는, 바이러스에 의한 유전자 도입능을 손상시키지 않도록, 바이러스 유전자가 개변된 바이러스 등이 포함된다. 본 발명을 적용 가능한 레스피로바이러스속 바이러스로서는, 예를 들면, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형(HPIV-1), 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형(HPIV-3), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형(BPIV-3), 센다이 바이러스(Sendai virus; 마우스 파라인플루엔자 바이러스 1형으로도 불리운다) 및 원숭이 파라인플루엔자 바이러스 10형(SPIV-10) 등이 포함된다. 본 발명에 있어서 제조되는 바이러스는, 가장 바람직하게는 센다이 바이러스이다. 바이러스는 천연주, 야생주, 변이주, 라보계대주(laboratory-passaged strain) 및 인위적으로 구축된 주 등에 유래하는 바이러스여도 된다.
특히 센다이 바이러스는, 설치류에게 있어서는 병원성으로 폐렴을 발생시키는 것이 알려져 있지만, 인간에 대해서는 병원성이 없다. 이것은 또한, 야생형 센다이 바이러스의 경비적 투여에 의해 비인간 영장류에 있어서 심각한 유해작용을 나타내지 않는다고 하는 지금까지의 보고에 의해서도 지지되고 있다(Hurwitz, J. L. et al., Vaccine 15: 533-540, 1997; Bitzer, M. et al., J. Gene Med,. 5: 543-553, 2003; Slobod, K.S. et al., Vaccine 22: 3182-3186, 2004). 센다이 바이러스의 이들 특징은, 센다이 바이러스 벡터가 인간의 치료로 응용 가능한 것을 시사하는 것이다.
마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 바이러스 단백질과 함께 리보핵단백질(RNP)을 형성하여 상기 단백질에 의해 게놈 중의 유전자가 발현되고, 이 RNA가 복제되어 딸 RNP가 형성되는 기능을 갖는 RNA이다. 일반적으로 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈은 3'리더영역(3'-leader region)과 5'트레일러영역(5'-trailer region) 사이에, 바이러스 유전자가 안티센스서열로서 배치된 구성을 하고 있다. 각 유전자의 ORF 사이에는 전자종결서열(E서열)-개재서열(I서열)-전사개시서열(S서열)이 존재하고, 이것에 의해 각 유전자의 ORF를 코드하는 RNA가 각각의 시스트론으로서 전사된다. 게놈 RNA는 상기 RNA에 코드되는 유전자군의 발현 및 RNA 자신의 자율적인 복제에 필요한 바이러스 단백질인 N(뉴클레오캡시드(또는 핵단백이라고도 한다)), P(포스포) 및 L(라지)을 안티센스로 코드하고 있다. 게놈 RNA는, 추가로 엔벨로프 구성 단백질을 코드하고 있어도 되지만, 이들의 유전자를 결손하는 결손형 벡터를 구축하는 것도 가능하다.
예를 들면 파라믹소바이러스 아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 다음과 같이 표기된다. 일반적으로, N 유전자는 "NP"로도 표기된다. 또한, HN은 뉴라미니다아제 활성을 갖지 않는 경우에는 H로 표기된다.
레스피로바이러스속 N P/C/V M F HN - L
루블라바이러스속 N P/V M F HN (SH) L
모빌리바이러스속 N P/C/V M F H - L
예를 들면, 센다이 바이러스 각 유전자의 염기서열 데이터베이스의 액세션번호는 N 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886을 참조할 것. 또 그 밖의 바이러스가 코드하는 바이러스 유전자를 예시하면, N 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; 및 Tupaia, AF079780, P 유전자에 대해서는 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; 및 Tupaia, AF079780, C 유전자에 대해서는 CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311; SeV, AB005796; 및 Tupaia, AF079780, M 유전자에 대해서는 CDV, M12669; DMV, Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; 및 SV5, M32248, F 유전자에 대해서는 CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303; HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; 및 SV5, AB021962, HN(H 또는 G) 유전자에 대해서는 CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2, D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; 및 SV-5, S76876을 예시할 수 있다. 단, 각 바이러스는 복수의 주가 알려져 있어, 주의 차이에 의해 상기에 예시한 것 이외의 서열로 되는 유전자도 존재한다.
일반적으로 N, P, 및 L 유전자를 보유하고 있는 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터는, 세포 내에서 자율적으로 RNA 게놈으로부터 바이러스 유전자가 발현되고, 게놈 RNA가 복제된다. 더욱이 엔벨로프 구성 단백질의 존재하에서 감염성 바이러스 입자가 형성되어 세포 외로 방출된다. 감염성 바이러스 입자의 형성에 필요한 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자가 게놈에 탑재되어 있으면, 이 바이러스 벡터는 자율적으로 증식할 수 있어, 전파능을 갖는 바이러스 벡터가 된다. 엔벨로프 구성 단백질 유전자 중 어느 하나, 또는 모두를 게놈으로부터 결손시키는 바이러스 벡터는, 감염세포에 있어서 감염성 바이러스 입자를 결손시킬 수 없는 결손형 바이러스 벡터가 된다.
엔벨로프 구성 단백질이란, 바이러스의 엔벨로프의 성분이 되는 바이러스 단백질을 말하고, 엔벨로프 표면에 노출되어 세포로의 접착 또는 감염에 기능하는 스파이크 단백질 및 엔벨로프의 형성 등에 기능하는 라이닝 단백질(lining protein)이 포함된다. 구체적으로는, 엔벨로프 구성 단백질의 유전자로서는 F(퓨전), HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제)(또는 H(헤마글루티닌)), 및 M(매트릭스)을 들 수 있고, 바이러스종에 따라서는 H, M1, 및 G 등의 유전자를 갖는다. 스파이크 단백질인 F 단백질 결손 또는 HN(또는 H) 유전자 결손은, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터를 비전파성으로 하기 때문에 유효하고, 엔벨로프의 라이닝 단백질인 M 유전자 결손은 감염세포로부터의 입자 형성을 불가능하게 하기 때문에 유효하다(WO00/70055, WO00/70070, 및 WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14)6564-6569(2000); Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820). 또는 F, HN(또는 H) 및 M의 적어도 2개의 유전자의 임의의 조합을 결손시키는 벡터는, 보다 안전성이 보장된다. 유전자를 결손시키기 위해서는, 변이 도입(WO00/09700)에 의해 단백질의 기능을 상실시키거나, 단백질의 코드서열을 제거함으로써 유전자를 결손시킨다. 예를 들면, M 및 F 유전자 양쪽 결손 마이너스 가닥 RNA 바이러스(△M△F)는, 비전파성이고 또한 입자 형성이 결여된 벡터가 된다. △M△F 바이러스는 in vitro 및 in vivo에서 높은 레벨의 감염성 및 유전자 발현능을 유지하고 있어, 그 레벨은 야생형 바이러스와 동등하다. △M△F 바이러스는, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터의 안전성 향상에 더욱 기여할 것으로 생각된다. 엔벨로프 구성 단백질 유전자를 결손하는 바이러스는, 개변 F 단백질에 첨가하여, 결손하는 단백질을 공발현하는 포유동물 세포를 사용하여 구축할 수 있다. 어느 종의 세포에서는 감염에 HN 단백질은 필요 없고(Markwell, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(4):978-982(1985)), F 단백질만으로 감염이 성립된다. 이와 같은 세포로의 유전자 도입을 위한 바이러스 벡터 제작에는, 개변 F 단백질만을 공급하면 된다.
또한, 결손형 바이러스를 제작하는 경우는, 바이러스 게놈이 결손되는 엔벨로프 단백질 유전자와는 상이한 종류의 엔벨로프 단백질을 사용하여 슈도 타입화한 바이러스 벡터를 제조하는 것도 가능하다. 예를 들면, 바이러스 재구성시에, 베이스가 되는 바이러스의 게놈이 원래 코드하는 엔벨로프 단백질 이외의 엔벨로프 단백질을 세포에서 발현시킴으로써, 목적으로 하는 엔벨로프 단백질을 갖는 재조합 바이러스를 제조할 수 있다. 이러한 단백질에 특별히 제한은 없다. 세포로의 감염능을 부여하는 목적으로 하는 단백질이 사용된다. 예를 들면, 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 G 단백질(VSV-G)을 들 수 있다. VSV-G 단백질은, 임의의 VSV주에 유래하는 것이어도 된다. 예를 들면 Indiana 혈청형 주(J. Virology 39: 519-528(1981)) 유래의 VSV-G 단백을 사용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한 본 발명의 벡터는, 다른 바이러스 유래의 엔벨로프 단백질을 임의로 조합시켜 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 단백질로서, 인간 세포에 감염시키는 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질이 적합하다. 이러한 단백질로서는 특별히 제한은 없지만, 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질(retroviral amphotropic envelope protein) 등을 들 수 있다. 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스(MuLV) 4070A주 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수 있다. 또한, MuMLV 10A1 유래의 엔벨로프 단백질을 사용하는 것도 가능하다(예를 들면 pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705(1996)). 또한, 헤르페스바이러스과의 단백질(protein of Herpesviridae)로서는, 예를 들면 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus)의 gB, gD, gH, gp85 단백질, EB 바이러스의 gp350, gp220 단백질 등을 들 수 있다. 헤파드나바이러스과의 단백질(protein of Hepadnaviridae)로서는, B형 간염 바이러스의 S 단백질 등을 들 수 있다. 이들 단백질은, 세포외 도메인을 F 단백질 또는 HN 단백질의 세포내 도메인과 결합시킨 융합 단백질로서 사용해도 된다. 이와 같이 본 발명에 있어서는, VSV-G 단백질 등과 같이, 게놈이 유래하는 바이러스 이외의 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질을 포함하는 슈도 타입 바이러스 벡터를 제조하는 것도 가능하다. 바이러스의 게놈 RNA에는 이들 엔벨로프 단백질을 게놈에 코드되지 않도록 설계하면, 바이러스 입자가 세포에 감염된 후에는, 바이러스 벡터로부터 이 단백질이 발현되는 경우는 없다.
또한, 프로테아제 절단서열을 개변한 개변 F 단백질에 있어서, 절단부위 이외에, 다른 부위에도 개변을 첨가하는 것도 가능하다. 예를 들면, F 단백질의 세포질 도메인의 결실에 의해 세포 융합능을 높이는 것이 가능하다(PCT/JP03/05528). 예를 들면, 세포질 도메인에 0개~28개, 보다 바람직하게는 1~27개, 보다 바람직하게는 4~27개의 아미노산을 갖도록, 세포질 도메인의 일부 아미노산을 결실시킨 F 단백질은, 야생형 F 단백질에 비하여 유의하게 높은 세포 융합능을 나타낸다. 세포질 도메인이란, 막 단백질의 세포질측의 도메인이고, F 단백질에 있어서는 막 관통(TM)영역의 C 말단영역이다. 예를 들면, 세포질 도메인으로서 6~20개, 보다 바람직하게는 10~16개, 보다 바람직하게는 13~15개의 아미노산을 갖는 F 단백질을 갖는 바이러스 벡터를 조제하면, 야생형 F 단백질을 사용하는 것 보다도 높은 세포 융합능을 갖는 벡터를 얻을 수 있다.
또한, 2종의 스파이크 단백질의 융합 단백질을 갖는 바이러스를 구축해도 된다. 세포융합을 기능하는 F 단백질과, 세포로의 접착에 기능한다고 생각되는 HN 단백질(또는 H 단백질)을 융합 단백질로서 발현시키면, 각각 발현시키는 경우에 비하여 매우 강한 융합능을 발휘할 수 있다(PCT/JP03/05528). 이 융합 단백질은, 서로의 세포질 도메인 부분에서 양자의 단백질이 결합된 단백질이다. 구체적으로는, 융합 단백질의 N 말단측에 F 단백질을, C 말단측에 HN(또는 H) 단백질을 포함하고 있다. 양자의 단백질을 융합시키는 경우, 전장 단백질끼리 융합시켜도 되지만, F 단백질의 세포질 도메인의 일부 또는 전부를 결실시킨 단백질을 HN(또는 H) 단백질에 융합시켜도 된다.
또한 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터는, 액세서리 유전자가 결손된 것이어도 된다. 예를 들면 SeV의 액세서리 유전자 중 하나인 V 유전자를 녹 아웃(knocking-out)함으로써, 배양세포에 있어서의 유전자 발현 및 복제는 장해되지 않고, 마우스 등의 숙주에 대한 SeV의 병원성이 현저히 감소한다(Kato, A. et al., 1997, J. Virol. 71:7266-7272; Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al., WO01/04272, EP1067179). 이러한 약독화 벡터(attenuated vector)는 in vivo 또는 ex vivo에 있어서의 독성이 없는 유전자 도입용 바이러스 벡터로서 특히 유용하다.
마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터의 제조방법은, 구체적으로는, (a) (ⅰ) F 단백질의 프로테아제 절단서열을 다른 프로테아제의 절단서열로 개변한 개변 바이러스 단백질, (ⅱ) 상기 다른 프로테아제, 및 (ⅲ) 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 구성하는 단백질의 존재하에서, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 그의 상보 가닥을 포유동물 세포에 있어서 전사시키는 공정, 및 (b) 생성한 바이러스를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다. 여기서, 게놈 RNA는, 상기 개변 바이러스 단백질을 코드하고 있지 않다. 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 그의 상보 가닥(안티게놈 RNA)은, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 RNP를 구성하는 바이러스 단백질과 함께 RNP를 형성하고, 게놈에 코드되는 바이러스 단백질을 발현함과 동시에, 세포 내에서 게놈 RNA-안티게놈 RNA를 증폭시켜, 바이러스 입자를 형성한다. 이것을 회수함으로써 바이러스를 얻을 수 있다.
RNP를 구성하는 바이러스 단백질이란, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA와 복합체를 형성하고, 게놈 RNA의 복제 및 게놈에 코드되어 있는 유전자의 발현에 필요한 바이러스 단백질군을 말하고, 구체적으로는, N(뉴클레오캡시드)(또는 핵단백(NP)이라고도 한다)), P(포스포) 및 L(라지) 단백질이다. 바이러스종에 따라서는, 표기는 상이한 경우도 있지만, 대응하는 단백질은 당업자에게 있어서는 자명하다(Anjeanette Robert et al, Virology 247:1-6(1998)). 마이너스 가닥 게놈의 전사는, 게놈과 동일한 마이너스 가닥을 전사시켜도 되고, 또는 플러스 가닥(plus strand)(안티게놈. 게놈 RNA의 상보 가닥.)을 전사시켜도, 바이러스 RNP를 재구성할 수 있다. 벡터의 재구성 효율을 높이기 위해서는, 바람직하게는 플러스 가닥을 생성시킨다. RNA 말단은 천연 바이러스 게놈과 동일하게 3'리더서열과 5'트레일러서열의 말단을 가능한 한 정확하게 반영시키는 것이 바람직하다. 이를 위해서는, 전사산물의 5'말단에 자기 절단형 리보자임을 부가해 두고, 리보자임에 의해 마이너스 가닥 RNA 바이러스 게놈의 말단을 정확하게 잘라냄으로써 실현시킬 수 있다(Inoue, K. et al. J. Virol. Methods 107, 2003, 229-236), 또는, 다른 태양에 있어서는, 전사산물의 5'말단을 정확하게 제어하기 위해, 전사개시부위로서 박테리오파지(bacteriophage)의 RNA 폴리머라제 인식서열을 이용하여, 상기 RNA 폴리머라제를 세포내에서 발현시킨다. 박테리오파지의 RNA 폴리머라제로서는, 예를 들면, 대장균 T3 파지 및 T7 파지, 및 살모넬라 SP6 파지 등이 사용된다(Krieg, P.A. and Melton, D.A. 1987. In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. Methods Enzymol. 155: 397-15; Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W., and Uhlenbeck, O.C. 1987. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 15: 8783-798; Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V. 1994. In vitro transcription: Preparative RNA yields in analytical scale reactions. Anal. Biochem. 220: 420-23). 박테리오파지의 RNA 폴리머라제의 발현은, 예를 들면 이를 발현하는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986))를 사용할 수 있고, 또는 플라스미드 등의 비바이러스 벡터로부터 발현시키는 것도 가능하다(실시예 참조). 바이러스 생산세포의 염색체에 삽입하여, 박테리오파지의 RNA 폴리머라제를 유도 발현할 수 있는 세포주를 수립하는 것도 적합하다. 프로모터로서는, 상기에 예시한 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 목적으로 하는 프로모터를 사용하는 것이 가능하지만, 바람직하게는 CA 프로모터를 사용한다.
전사산물의 3'말단을 제어하기 위해서는, 예를 들면 전사산물의 3'말단에 자기절단형 리보자임을 코드시켜 두고, 이 리보자임에 의해 정확하게 3'말단이 잘려나가도록 할 수 있다(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466). 리보자임으로서는, 델타 간염 바이러스의 안티게놈 가닥(antigenomic strand) 유래의 자기개열 리보자임을 사용할 수 있다.
바이러스 게놈은 목적으로 하는 외래유전자를 코드할 수 있다. 외래유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터는, 바이러스 벡터의 게놈에 외래유전자를 삽입함으로서 얻어진다(Yu, D. et al., Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997). 외래유전자의 삽입위치는, 예를 들면 바이러스 게놈의 단백질 비코드영역의 목적으로 하는 부위를 선택할 수 있고, 예를 들면 게놈 RNA의 3'리더영역과 3'말단에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF의 사이, 각 바이러스 단백질 ORF 사이, 및/또는 5'말단에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF와 5'트레일러영역 사이에 삽입할 수 있다. 또한, M, F 또는 HN 유전자 등의 엔벨로프 구성 단백질 유전자를 결실하는 게놈에서는, 그 결실영역에 외래유전자를 코드하는 핵산을 삽입할 수 있다. 파라믹소바이러스에 외래유전자를 도입하는 경우는, 게놈으로의 삽입단편의 폴리뉴클레오티드의 사슬 길이가 6의 배수가 되도록 삽입하는 것이 바람직하다(Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993). 삽입한 외래유전자와 바이러스 ORF 사이에는, E-I-S서열이 구성되도록 한다(Tokusumi, T. et al. (2002) Virus Res 86(1-2), 33-8). E-I-S서열을 매개로 하여 2 또는 그 이상의 외래유전자를 직렬로 나열하여 삽입할 수 있다.
외래유전자를 용이하게 삽입할 수 있도록 하기 위해, 게놈 RNA를 코드하는 cDNA 중에 외래유전자를 삽입하기 위한 클로닝 사이트를 설계할 수 있다. 그 부위는, 예를 들면 게놈의 단백질 비코드영역의 목적으로 하는 위치여도 되고, 구체적으로는 3'리더영역과 3'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF의 사이, 각 바이러스 단백질 ORF의 사이 및/또는 5'에 가장 가까운 바이러스 단백질 ORF와 5'트레일러영역 사이에 삽입할 수 있다. 엔벨로프 구성 단백질 유전자를 결실하는 게놈에서는 그 결실영역에 클로닝 사이트를 설계할 수 있다. 클로닝 사이트는, 예를 들면 제한효소의 인식서열로 할 수 있다.
벡터에 탑재하는 외래유전자의 발현 레벨은, 그 유전자의 상류(마이너스 가닥(네거티브 가닥)의 3'측)에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다(WO01/18223). 또한, 게놈 상의 외래유전자의 삽입위치에 따라 제어할 수 있어, 마이너스 가닥의 3' 가까이에 삽입할수록 발현 레벨이 높고, 5' 가까이에 삽입할수록 발현 레벨이 낮아진다. 이와 같이, 외래유전자의 삽입위치는, 상기 유전자의 목적으로 하는 발현량을 얻기 위해, 또 전후의 바이러스 단백질을 코드하는 유전자와의 조합이 최적이 되도록 적절히 조절할 수 있다.
외래유전자를 코드하는 핵산을 게놈에 삽입할 때에 부가하는 S서열로서는, 예를 들면 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 목적으로 하는 S서열을 사용할 수 있지만, 센다이 바이러스라면, 3'-UCCCWVUUWC-5'(W=A 또는 C; V=A, C, 또는 G)(서열번호: 23)의 서열을 적합하게 사용할 수 있다. 특히, 3'-UCCCAGUUUC-5'(서열번호: 24), 3'-UCCCACUUAC-5'(서열번호: 25), 및 3'-UCCCACUUUC-5'(서열번호: 26)가 바람직하다. 이들 서열은, 플러스 가닥을 코드하는 DNA서열로 표시하면 각각 5'-AGGGTCAAAG-3'(서열번호: 27), 5'-AGGGTGAATG-3'(서열번호: 28), 및 5'-AGGGTGAAAG-3'(서열번호: 29)이다. 센다이 바이러스 벡터의 E서열로서는, 예를 들면 3'-AUUCUUUUU-5'(서열번호: 30)(플러스 가닥을 코드하는 DNA에서는 5'-TAAGAAAAA-3'(서열번호: 31))가 바람직하다. I서열은, 예를 들면 임의의 3 염기여도 되고, 구체적으로는 3'-GAA-5'(플러스 가닥 DNA에서는 5'-CTT-3')를 사용하면 된다.
마이너스 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 구체적인 방법의 하나로서는, 예를 들면 일과적으로 바이러스 제조를 행하는 방법을 들 수 있다. 이 방법의 하나는, 포유동물 프로모터의 제어하에 리보자임과 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 그의 상보 가닥을 코드하는 DNA를 전사시키는 벡터를, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 구성하는 바이러스 단백질을 발현하는 벡터와 함께 포유동물 세포에 트랜스펙션하는 방법이다. 이 때, 프로테아제 절단서열을 개변한 개변 단백질과 상기 프로테아제도 존재하도록 한다. RNP를 구성하는 바이러스 단백질의 존재하에서, 포유동물 프로모터로부터 마이너스 가닥 RNA 바이러스 게놈 RNA 또는 안티게놈 RNA가 전사됨으로써, 기능적 RNP가 형성되어 바이러스가 재구축된다. 세포에 있어서 생산된 마이너스 가닥 RNA 바이러스 또는 그 증식산물을 회수함으로써, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터를 얻을 수 있다.
또한, 다른 방법에 있어서는, 포유동물 프로모터의 제어하에 박테리오파지의 RNA 폴리머라제를 코드하는 DNA를 포함하는 벡터와, 상기 RNA 폴리머라제의 인식서열의 하류에 연결된 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA 또는 그의 상보 가닥을 코드하는 DNA를 포함하는 벡터를, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 구성하는 바이러스 단백질(N, L, 및 P)을 발현하는 벡터와 함께 포유동물 세포에 트랜스펙션한다. 이 때, 프로테아제 절단서열을 개변한 개변 단백질과 상기 프로테아제도 존재하도록 한다. RNP를 구성하는 바이러스 단백질의 존재하에서, 포유동물 프로모터로부터 RNA 폴리머라제가 발현되고, 이것에 의해 마이너스 가닥 RNA 바이러스 게놈 RNA 또는 안티게놈 RNA가 전사됨으로써, 기능적 RNP가 형성되어 바이러스가 재구축된다. 세포에 있어서 생산된 마이너스 가닥 RNA 바이러스 또는 그 증식산물을 회수함으로써, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터를 얻을 수 있다.
트랜스펙션에 사용하는 벡터로서는, 예를 들면 플라스미드가 적합하다. 각 플라스미드는, 각각 1종류의 단백질이 발현되도록 해도 되고, 복수의 단백질을 하나의 플라스미드로부터 발현시켜도 된다. 이를 위해서는, 하나의 플라스미드에 프로모터를 복수 갖게 하거나, 또는 IRES 등을 이용하여 하나의 프로모터로부터 복수의 단백질을 생성시키는 것도 가능하다. 트랜스펙션에 의한 바이러스 생산은, 특별한 세포를 사용하지 않아도 신속하게 바이러스를 제조할 수 있는 점에서 우수하다. 프로모터로서는, 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 목적으로 하는 프로모터를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 CA 프로모터를 사용한다.
박테리오파지의 RNA 폴리머라제를 발현시키기 위해, 바이러스 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 자외선(UV) 조사처리를 20분 처리로 불활성화한 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 vTF7-3(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126, 1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)를 사용하여 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법이 알려져 있다(WO00/70055, WO00/70070, 및 WO03/025570; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)); Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820). 얻어진 마이너스 가닥 RNA 바이러스 용액에 포함될 수 있는 백시니아 바이러스는, 바이러스 용액(배양상청)을 적절히 희석하여 재증폭을 3회 정도 반복함으로써 완전히 제거할 수 있다.
본 발명의 바이러스 제조방법의 다른 태양에서는, 바이러스의 생성에 필요한 단백질 및/또는 RNA를 바이러스 생산세포의 염색체로부터 발현시킨다. 이 방법의 하나는, 개변 단백질을 발현하는 DNA가 포유동물 세포의 염색체에 삽입된 세포주를 사용하는 방법이다. 또는, 포유동물 프로모터로부터 바이러스 게놈 RNA 또는 그의 상보 가닥을 전사하는 DNA, 또는 포유동물 프로모터로부터 박테리오파지 유래의 RNA 폴리머라제를 발현하는 DNA가, 포유동물 세포의 염색체에 삽입된 세포주를 사용하는 방법도 들 수 있다. 형질전환세포의 클로닝에 의해, 발현량이 높은 세포를 선택함으로써, 보다 고역가의 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 세포를 조제할 수 있다. 이 때문에, 고역가의 바이러스를 안정하게 제조하는데 유용하다. 이들 세포주에 있어서는, 보통은 포유동물 프로모터로부터 바이러스 게놈 RNA나 목적으로 하는 단백질을 발현하지 않지만, 자극에 응답하여 발현을 유도할 수 있도록 하는 것도 적합하다. 상기의 loxP나 FRT를 사용하여, 유도적으로 포유동물 프로모터로부터 유전자를 발현시킬 수 있다. 바이러스 제조시에 Cre 리콤비나아제나 FLP 리콤비나아제를 발현시켜, 포유동물 프로모터로부터의 발현을 유도한다. 프로모터로서는, 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 목적으로 하는 프로모터를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 CA 프로모터를 사용한다. 바이러스 게놈 RNA나 RNA 폴리머라제를 발현하는 세포에는, 이 세포의 염색체 상에 추가로 개변 F 단백질 유전자를 도입하면 된다.
이 세포에서, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈 RNA를 포함하는 RNP를 구성하는 바이러스 단백질(N, L 및 P)의 존재하, 바이러스 게놈 RNA 또는 그의 상보 가닥을 전사시켜, 개변 F 단백질의 발현을 유도함으로써, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 재구축을 행할 수 있다. RNP 구성 단백질은, 그들을 코드하는 플라스미드 벡터의 트랜스펙션에 의해 공급하면 된다.
트랜스펙션에 사용하는 각 플라스미드의 양을 예시하자면, 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈을 리보자임으로 잘라내는 방법(예를 들면 HamRbz법)에 있어서는, NP 발현 플라스미드를 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.3 ㎍), P 발현 플라스미드를 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍), L 발현 플라스미드를 0.5 ㎍~4.5 ㎍(보다 바람직하게는 2.0 ㎍), 개변 F 발현 플라스미드를 0.1 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍), 바이러스 게놈 RNA(플러스 가닥 또는 마이너스 가닥)를 코드하는 플라스미드를 0.5 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 5 ㎍) 사용하면 된다. 예를 들면 SeV의 제조를 위해서는, 실시예에 기재된 각 플라스미드를 이하의 양으로 트랜스펙션에 사용하면 된다.
pCAGGS-NP 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.3 ㎍)
pCAGGS-P 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍)
pCAGGS-L(TDK) 0.5 ㎍~4.5 ㎍(보다 바람직하게는 2.0 ㎍)
pCAGGS-F5R 0.1 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍)
pCAGGS-SeV 0.5 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 5 ㎍)
(pCAGGS-SeV/△F-GFP)
마이너스 가닥 RNA 바이러스의 게놈을 박테리오파지의 RNA 폴리머라제를 매개로 하여 전사시키는 방법에 있어서는, NP 발현 플라스미드를 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍), P 발현 플라스미드를 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍), L 발현 플라스미드를 0.5 ㎍~4.5 ㎍(보다 바람직하게는 2.0 ㎍), 개변 F 발현 플라스미드를 0.1 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍), 바이러스 게놈 RNA(플러스 가닥 또는 마이너스 가닥)를 코드하는 플라스미드를 0.5 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 5 ㎍) 사용하면 된다. 예를 들면 SeV의 제조를 위해서는, 실시예에 기재된 각 플라스미드를 이하의 양으로 트랜스펙션에 사용하면 된다.
pCAGGS-NP 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍)
pCAGGS-P 0.1 ㎍~2 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍)
pCAGGS-L(TDK) 0.5 ㎍~4.5 ㎍(보다 바람직하게는 2.0 ㎍)
pCAGGS-F5R 0.1 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 0.5 ㎍)
pCAGGS-SeV 0.5 ㎍~5 ㎍(보다 바람직하게는 5 ㎍)
(pCAGGS-SeV/△F-GFP)
바이러스 게놈을 코드하는 DNA에 있어서, F 유전자 이외의 엔벨로프 구성 단백질 유전자(예를 들면 HN 유전자 및/또는 M 유전자 등)도 결실시킨 경우에는, 그대로는 감염성 바이러스 입자를 형성하지 않지만, 숙주세포에 이들을 결실시킨 유전자 및/또는 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질을 코드하는 유전자 등을 별도로, 세포에 도입하여 발현시킴으로써, 감염성 바이러스 입자를 형성시킬 수 있다(WO00/70055 및 WO00/70070; Hirata, T. et al., 2002, J. Virol. Methods, 104: 125-133; Inoue, M. et al., 2003, J. Virol. 77:6419-6429). 바이러스 생산세포에 있어서 엔벨로프 구성 단백질을 발현시키는 경우는, 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 목적으로 하는 프로모터를 사용할 수 있지만, 바람직하게는 CA 프로모터를 사용한다.
트랜스펙션으로부터 48~72시간 정도 배양 후, 세포를 회수하고, 동결 융해를 3회 정도 반복하여 세포를 파쇄한 후, RNP를 포함하는 파쇄물을 세포에 재차 트랜스펙션하여 배양한다. 또는, 배양상청을 회수하고, 세포의 배양액에 첨가하여 감염시켜 배양한다. 트랜스펙션은 예를 들면 리포펙트아민 또는 폴리카티오닉 리포솜(polycationic liposome) 등과 함께 복합체를 형성시켜서 세포에 도입하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 여러 종류의 트랜스펙션시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Roche), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Roche #1811169), TransIT-LT1(Mirus, Product No. MIR 2300) 등을 들 수 있다. 엔도솜 중에서의 분해를 방지하기 위해 클로로퀸을 첨가하는 것도 가능하다(Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). RNP가 도입된 세포에서는, RNP로부터의 바이러스 유전자의 발현 및 RNP의 복제 과정이 진행되어 바이러스가 증폭된다. 회수된 벡터는 -80℃에서 보존할 수 있다. 엔벨로프 구성 단백질을 코드하는 유전자를 결손한 전파능을 갖지 않는 바이러스를 재구성시키기 위해서는, 엔벨로프 구성 단백질을 발현하는 세포(헬퍼세포)를 트랜스펙션에 사용하거나, 또는 엔벨로프 구성 단백질 발현 플라스미드를 함께 트랜스펙션하면 된다. 또한, 트랜스펙션을 행한 바이러스 생산세포에, 엔벨로프 구성 단백질을 발현하는 세포를 중층(重層)하여 추가로 배양함으로써 엔벨로프 구성 단백질 유전자 결손형 바이러스를 증폭하는 것도 가능하다(국제공개공보 WO00/70055 및 WO00/70070 참조).
마이너스 가닥 RNA 바이러스의 제조에 대한 보다 상세한 사항은, 공지의 방법을 참조할 수 있다(Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997, Kato, A. et al. 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO03/025570; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404). 이들 방법에 본 발명의 방법을 적용함으로써, 파라인플루엔자, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 우역 바이러스, 센다이 바이러스 등을 포함하는 마이너스 가닥 RNA 바이러스를 DNA로부터 높은 효율로 재구성시킬 수 있다.
회수된 바이러스의 역가는, 예를 들면 CIU(Cell Infecting Unit)측정 또는 적혈구 응집활성(HA)을 측정함으로써 결정할 수 있다(WO00/70070; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999). 또한, GFP(녹색 형광 단백질) 등의 마커 유전자를 탑재한 벡터에 대해서는, 마커를 지표로 직접적으로 감염세포를 카운트함으로써 역가를 정량할 수 있다(예를 들면 GFP-CIU로서). 이와 같이 하여 측정한 역가는 CIU와 동등하게 취급할 수 있다(WO00/70070).
바이러스가 재구성되는 한, 재구성에 사용하는 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 센다이 바이러스 벡터 등의 재구성에 있어서는, 원숭이 신장 유래의 LLC-MK2 세포 및 CV-1 세포, 햄스터 신장 유래의 BHK 세포 등의 배양세포, 인간 유래 세포 등을 사용할 수 있다. 특히 본 발명의 방법은, 종래에서는 곤란하였던 인간 세포를 사용하여 바이러스 제조를 행하는 것을 가능하게 한다. 또한, 대량으로 센다이 바이러스 벡터를 얻기 위해, 상기의 숙주로부터 얻어진 바이러스 벡터를 발육계란에 감염시켜, 벡터를 증폭시킬 수 있다. 계란을 사용한 바이러스 벡터의 제조방법은 이미 개발되어 있다(나카니시 등 편(1993), 「신경과학연구의 첨단기술 프로토콜 III, 분자신경세포생리학」, 고세이샤, 오사카, pp.153-172). 구체적으로는 예를 들면, 수정란을 배양기에 넣고 9~12일간 37~38℃에서 배양하여 배(embryo)를 성장시킨다. 바이러스 벡터를 요막강(allantoic membrane cavity)으로 접종하고, 수일간(예를 들면 3일간) 알을 배양하여 바이러스 벡터를 증식시킨다. 배양기간 등의 조건은 사용하는 재조합 센다이 바이러스에 의해 변할 수 있다. 그 후, 바이러스를 포함한 요액을 회수한다. 요액으로부터의 센다이 바이러스 벡터의 분리·정제는 통상적인 방법에 따라 행할 수 있다(다치요 마비토「바이러스 실험 프로토콜」, 나가이, 이시하마 감수, 메디컬뷰사, pp.68-73(1995)).
본 명세서에 기재된 바이러스 제조방법 따르면, 마이너스 가닥 RNA 바이러스 벡터는, 예를 들면 1×105 CIU/mL 이상, 바람직하게는 1×106 CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×106 CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 1×107 CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×107 CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 1×108 CIU/mL 이상, 보다 바람직하게는 5×108 CIU/mL 이상의 역가로 바이러스 생산세포를 세포외액 중에 방출시키는 것이 가능하다. 바이러스의 역가는 본 명세서 및 그 밖에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다(Kiyotani, K. et al., Virology 177(1), 65-74(1990); WO00/70070).
본 발명의 방법에 의해 제조한 바이러스 벡터는 실질적으로 순수해지도록 정제할 수 있다. 정제방법은 여과(filtration), 원심분리, 흡착, 및 칼럼 정제 등을 포함하는 공지의 정제·분리방법 또는 그의 임의의 조합에 의해 행할 수 있다. 「실질적으로 순수」란, 바이러스 벡터를 포함하는 용액 중에서 상기 바이러스의 성분이 주요한 비율을 차지하는 것을 말한다. 예를 들면 실질적으로 순수한 바이러스 벡터 조성물은, 용액 중에 포함되는 전체 단백질(total protein)(단 캐리어나 안정제로서 첨가한 단백질은 제외한다) 중, 바이러스 벡터의 성분으로서 포함되는 단백질 비율이 10%(중량/중량) 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상을 차지함으로써 확인할 수 있다. 예를 들면 파라믹소바이러스 벡터라면, 구체적인 정제방법으로서는 셀룰로오스 황산 에스테르 또는 가교 폴리사카라이드 황산 에스테르를 사용하는 방법(일본국 특허공고 제(소)62-30752호 공보, 일본국 특허공고 제(소)62-33879호 공보 및 일본국 특허공고 제(소)62-30753호 공보) 및 푸코오스(fucose) 황산 함유 다당 및/또는 그의 분해물에 흡착시키는 방법(WO97/32010) 등을 예시할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 제조에 있어서는, 벡터는 필요에 따라 약리학적으로 허용되는 목적으로 하는 담체 또는 매체와 조합시킬 수 있다. 「약학적으로 허용되는 담체 또는 매체」란, 벡터와 함께 투여하는 것이 가능하여, 벡터에 의한 유전자 도입을 유의하게 저해하지 않는 재료이다. 이러한 담체 또는 매체로서는, 예를 들면, 멸균수, 염화나트륨용액, 덱스트로오스용액, 유산 함유 링거용액(Ringer's solution), 배양액, 혈청, 인산완충 생리식염수(PBS) 등을 들 수 있고, 이들과 벡터를 적절히 조합시켜 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은, 리포솜의 막안정화제(예를 들면 콜레스테롤 등의 스테롤류)를 포함하고 있어도 된다. 또한, 항산화제(예를 들면 토코페롤 또는 비타민 E 등)를 포함하고 있어도 된다. 더욱이, 그 밖에도 식물유, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있어도 된다. 또한 보존제나 그 밖의 첨가제를 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 수용액, 캡슐, 현탁액, 시럽 등의 형태일 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 용액, 동결건조물, 또는 에어졸의 형태의 조성물이어도 된다. 동결건조물의 경우는 안정화제로서 소르비톨, 수크로오스, 아미노산 및 각종 단백질 등을 포함하고 있어도 된다. 제조된 바이러스 벡터 조성물은, 인간 및 비인간 포유동물을 포함하는 목적으로 하는 포유동물 및 동물세포로의 유전자 도입을 위한 시약 및 의약으로서 유용하다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스 벡터는, 특히 인간으로의 유전자 치료에 적합하게 사용된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서 중에 인용된 문헌은 모두 본 명세서의 일부로서 통합된다.
[실시예 1] F 유전자 발현 플라스미드로의 furin 인식서열의 도입
LLC-MK2 이외의 세포를 이용하여, F 유전자 결실형 SeV 벡터(SeV/△F)가 회수 가능한 패키징 세포(특히 인간 유래 세포를 이용한 패키징 세포)를 제작하기 위해, 패키징 세포에 있어서 발현하는 F 단백질에 furin 인식서열을 도입하였다. 도입하는 서열은, furin이 인식하는 콘센서스 서열(consensus sequence)인 R-(X)-R/K-R의 서열(Chambers, T.J. et al., Annu. Rev. Microbiol. 44, 649-688 (1990))을 토대로, 본래의 F 단백의 서열로부터 가장 변이가 적은 R-Q-K-R의 서열(F(furin))과 절단효율이 좋아지는 것이 기대되는(R)-R-R-R-R의 서열(F(5R))의 2종의 서열을 사용하였다(도 1). 또한, F 유전자의 발현은 Cre/loxP 발현 유도 시스템을 이용하였다. 해당 시스템의 구축을 위해, LLC-MK2를 이용한 F 단백의 패키징 세포(LLC-MK2/F7 세포)(Li, H.-O. et al., J. Virology 74, 6564-6569 (2000), WO00/70070)를 수립했을 때와 동일하게, Cre DNA 리콤비나아제에 의해 유전자 산물을 유도 발현하도록 설계된 플라스미드 pCALNdLw(Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121 (1988))를 이용하였다.
먼저, Zeocin 내성 유전자를 갖는 pCALNdLw에 F 유전자를 도입한 플라스미드(pCALNdLw-ZeoF: 일본국 특허출원 제2001-283451)를 사용하여, F 유전자로의 furin 인식서열(R-Q-K-R: F(furin))의 도입을 행하였다. 서브클로닝(subcloning)의 순서의 개략을 도2에 나타내었다. pCALNdLw-ZeoF를 템플레이트(template)로 하여 ploxF(5'-CATTTTGGCAAAGAATTGATTAATTCGAG-3'/서열번호: 32) 및 pFfurinR(5'-TCACAGCACCCAAGAATCTCTTCTGGCGAGCACCGGCATTTTGTGTC-3'/서열번호: 33)의 프라이머의 조합으로 Pfu Turbo(STRATAGENE, La Jolla, CA)를 사용하여 PCR을 행하였다(순서 1). 또한 동일하게 pCALNdLw-ZeoF를 템플레이트로 하여 pFfurinF(5'-GACACAAAATGCCGGTGCTCGCCAGAAGAGATTCTTGGGTGCTGTGA-3'/서열번호: 34) 및 pFXho2R(5'-GATCGTAATCACAGTCTCTCGAGAGTTGTACCATCTACCTAC-3'/서열번호: 35)의 프라이머의 조합으로 PCR을 행하였다(순서 2). 이 때에 사용하고 있는 pFfurinR 및 pFfurinF의 양 Primer에 furin 인식서열(이 경우는 R-Q-K-R)로의 변이를 위한 서열을 도입하고 있다. PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 분리 후, 순서 1의 1470 bp의 밴드와 순서 2의 1190 bp의 밴드를 각각 잘라내고, GENE CLEAN KIT(후나코시, 도쿄)를 사용하여 회수하였다(각각 프래그먼트(ⅰ), 프래그먼트(ⅱ)로 한다). 정제한 프래그먼트(ⅰ)과 프래그먼트(ⅱ)를 각각 10배 희석한 것을 1 ㎕씩 혼합하고, 추가로 ploxF 및 pXho2R의 프라이 머의 조합으로 Pfu Turbo를 사용하여 PCR을 행하였다(순서 3). PCR 산물 5 ㎕를 아가로스 겔 전기영동하고, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 염색한 결과, 예상되는 2.6 kbp의 밴드가 검출되었다. 따라서, 나머지 PCR 산물을 Qiaquick PCR Extraction kit(QIAGEN, Bothell, WA)로 정제하였다. 그 다음 DraⅢ와 MfeI으로 연속적으로 제한효소처리를 행하여, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 약 2.0 kbp의 밴드를 잘라내었다(프래그먼트 3). 별도, pCALNdLw-Zeo-F를 DraⅢ와 MfeI으로 연속적으로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하여, 약 6 kbp의 밴드를 잘라내고, GENE CLEAN KIT로 정제하였다(프래그먼트 4). 이들 프래그먼트 3과 프래그먼트 4를 라이게이션함으로써 pCALNdLw-Zeo-F(furin)(pCALNdLw-Zeo-F furin이라고도 기재)를 구축하였다.
이어서, pCALNdLw-ZeoF 상의 F 유전자로, 보다 절단이 효율적인 furin 인식서열((R)-R-R-R-R: F(5R))의 도입을 행하였다. 서브클로닝의 순서의 개략을 도 3에 나타내었다. 상기에서 조제한 pCALNdLw-Zeo-F(furin)를 템플레이트로 하여, ploxF 및 pF5R-R(5'-TCACAGCACCGAAGAATCTCCTCCGGCGACGACCGGCATTTTGTGTCGTATC-3'/서열번호: 36)의 프라이머의 조합을 사용하여 PCR을 행하였다(순서 5). 또한 동일하게 pCALNdLw-Zeo-F(furin)를 템플레이트로 하여 pF5R-F(5'-GATACGACACAAAATGCCGGTCGTCGCCGGAGGAGATTCTTCGGTGCTGTGA-3'/서열번호: 37) 및 R5437(5'-AAATCCTGGAGTGTCTTTAGAGC-3'/서열번호: 38)의 프라이머의 조합으로 PCR을 행하였다(순서 6). 이 때에 사용하고 있는 pF5R-R 및 pF5R-F의 양 primer에 furin 인식서열(이 경우는 (R)-R-R-R-R)로의 변이를 위한 서열을 도입하고 있다. PCR 산 물은 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 순서 5의 1470 bp의 밴드와 순서 6의 200 bp의 밴드를 각각 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 각각 정제하였다(각각 프래그먼트 5, 프래그먼트 6으로 한다). 정제한 프래그먼트 5와 프래그먼트 6을 각각 50배 희석한 것을 1 ㎕씩 혼합하고, 추가로 ploxF 및 R5437의 프라이머의 조합으로 Pfu Turbo를 사용하여 PCR을 행하였다(순서 7). 5 ㎕의 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 염색하여, 약 1.6 kbp의 밴드를 확인하였다. 여기서, 나머지를 Qiaquick PCR Purification kit로 정제하여 ClaI과 FseI으로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 약 1 kbp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick PCR Purification kit로 정제하였다(프래그먼트 7). 별도, pCALNdLw-Zeo-F(furin)를 laI과 FseI으로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 약 8 kbp의 밴드를 잘라내어 Qiaquick PCR Purification kit로 정제하였다(프래그먼트 8). 이들 프래그먼트 7과 프래그먼트 8을 라이게이션함으로써 pCALNdLw-Zeo-F(5R)(pCALNdLw-Zeo F5R이라고도 기재한다)를 구축하였다. 이 pCALNdLw-Zeo F5R을 XhoI로 소화하고, 정제 후 라이게이션을 행하여 Xho I 단편(Zeocin 저항성 유전자를 포함한다)을 포함하지 않는 것을 선택하여, pCAGGS-F5R을 얻었다.
[실시예 2] 그 밖의 플라스미드의 구축
·pCAGGS(B type)의 구축(도 4)
pCALNdLw(Arai, T. et al. J. Virology 72, 1998, p.1115-1121)를 XhoI로 소화하고, Qiaquick PCR Purification kit로 정제하여, 라이게이션을 행하였다. Xho I 단편이 제거된 것을 선별하여, 얻은 것을 pCAGGS(B type)로 하였다. pCAGGS(B type)를 Sal I로 소화하고, Pfu DNA polymerase로 블런트화하고, Qiaquick PCR Purification kit로 정제하여, 라이게이션을 행하였다. SalI 사이트가 무너진 것을 선별하여, pCAGGS(BSX)로 하였다.
·pCAGGS-NP의 구축(도 5)
pCALNdLw를 Spe I 및 EcoT22I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 2651 bp 단편과 3674 bp 단편을 잘라내고, Qiaquick gel Extraction kit로 정제하였다. 2651 bp 단편을 추가로 Xho I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 1761 bp의 밴드를 정제하였다. Zeocin 저항성 유전자를 pcDNA3.1/Zeo(+)를 템플레이트로하여 프라이머
5'-TCTCGAGTCGCTCGGTACGATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCAC-3'(서열번호: 39) 및 프라이머
5'-AATGCATGATCAGTAAATTACAATGAACATCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGT GCACGCAGTTG-3'(서열번호: 40)를 사용하여 PCR에 의해 증폭하여 Xho I 및 EcoT22I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하여, 438 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하였다. 이 Zeocin 저항성 유전자를 포함하는 밴드와 상기 3674 bp 및 1761 bp의 3종류의 단편을 라이게이션에 의해 연결하여 pCALNdLw-Zeo를 얻었다. 이 pCALNdLw-Zeo를 Swa I로 소화하고 Eco RI 링커(STRATAGENE)를 삽입함으로써 pCALNdLWE-Zeo를 얻었다. 멀티클로닝 사이트(multi-cloning site)가 도입된 센다이 바이러스 cDNA(일본국 특허공개 제2002-272465)(이하 pSeV(TDK)라 칭한다)를 Not I 및 Xho I로 소화하고, 아가로스 겔 전 기영동으로 분리하여, 1669 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하였다. 이 NP 유전자를 포함하는 단편을 Not I 및 Xho I로 소화한 pGEM11Zf(+)(Promega)로 삽입하여, pGEM-NP(Z)PCR14-3으로 하였다. 이것을 템플레이트로 하여 프라이머
5'-CCGGAATTCAACAAATGGCCGGGTTGTTGAGCACCTTCGA-3'(서열번호: 41) 및 5'-CCGGAATTCCTAGATTCCTCCTATCCCAGCTACTGCTGCTCG-3'(서열번호: 42)를 사용하여 PCR에 의해 증폭하고, Eco RI로 소화 후, pCALNdLWE-Zeo의 Eco RI 사이트에 도입하여, pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)를 얻었다. 이어서 pCALNdLWE-Zeo-NP(Z)를 Xho I로 소화하고, 라이게이션을 행하여, Xho I 단편을 제거한 플라스미드를 구축하고, 이것을 pCAGGS-NP로 하였다.
·pCAGGS-P4C(-)의 구축(도 6)
pCALNdLw-HygroM(Inoue, M. et al. J. Virology 77, 2003, p6419-6429)을 Xho I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, Hygromycin 저항성 유전자를 포함하는 1679 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하였다. pCALNdLw를 Xho I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동 후 4864 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하였다. 양쪽 단편을 사용하여 라이게이션을 행하고 pCALNdLw-Hygro를 구축하였다. 이 pCALNdLw-Hygro를 Swa I로 소화하고, Nhe I 링커(STRATAGENE)를 삽입함으로써 pCALNdLWN-Hygro를 얻었다. 4C(-)SeV cDNA(Kurotani, Kato, Nagai, et al Genes to Cells 3, 1998, p111-124)를 템플레이트로 하여
5'-CTAGCTAGCCCACCATGGATCAAGATGCCTTCATTCTAAAAGAAGATTCT-3'(서열번호: 43) 및
5'-CTAGCTAGCCTAGTTGGTCAGTGACTCTATGTCCTCTTCTACGAGTTCCA-3'(서열번호: 44)를 사용하여 KOD-PLUS DNA Polymerase(ToYoBo)로 PCR을 행하였다. gene clean kit를 사용하여 정제하고, PCR 산물을 Nhe I로 소화하고, gene clean kit로 정제하였다. 이것을, 상기의 pCALNdLWN-hygro의 Nhe I 사이트에 도입하고, pCALNdLWN-hygro-P(Z)k4C(-)를 얻었다. 이것을 Xho I로 소화하고, Qiaquick PCR Purification kit로 정제 후, 라이게이션을 행하고 Xho I 단편(Hygromycin 저항성 유전자영역)을 제거한 것을 선택하여, pCAGGS-P4C(-)를 얻었다.
·pCAGGS-L(TDK)의 구축(도 7)
pSeV(TDK)를 Fse I 및 Sac II로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 6732 bp의 밴드를 잘라내어, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하였다. Pfu DNA Polymerase와 dNTP를 사용하여, 72℃에서 10분간 반응시켜 블런트화하였다. Qiaquick PCR Purification kit로 정제 후, pCAGGS(BSX)의 Swa I 사이트에 도입하고 pCAGGS-L(TDK)을 얻었다.
·pCAGGS-F의 구축(도 8)
pCALNdLw/F(Li, H.-O. et al. J. Virology 74, 2000, p6564-6569)를 Xho I로 소화, 정제 후, 라이게이션을 행하고 Xho I 단편(Neomycin 내성 유전자영역)이 제거된 것을 선택하여, pCAGGS-F를 얻었다.
·pCAGGS-T7의 구축(도 9)
pTF7-3(ATCC No.67202)를 Bam HI로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분 리 후, T7 RNA Polymerase 유전자를 포함하는 2.65 kbp의 단편을 회수하고, pMW219 (Nippon Gene Co. Ltd)의 Bam HI 사이트에 삽입하여 pMW219-T7을 얻었다. 이 pMW219-T7을 Sal I로 소화 후, DNA Blunting kit(TaKaRa)를 사용하여 평활말단으로 하고, Eco RI 링커(Stratagene #901026)를 도입하여, pMW219-T7-Eco RI를 얻었다. 이 pMW219-T7-Eco RI를 Eco RI로 소화하고, T7 RNA Polymerase를 포함하는 Eco RI 단편을 정제하여, 상기 pCALNdLWE의 Eco RI 사이트에 도입함으로써 pCALNdLWE-T7을 얻었다.
·pCAGGS-SeV 및 pCAGGS-SeV/△F-GFP의 구축(도 10~12)
pSeV(TDK)를 Not I 및 Kpn I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 2995 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하였다. MlinkerF 5'-GGCCGCGTCGACATCGATGCTAGCCTCGAGCCGCGGTAC-3'(서열번호: 45) 및 MlinkerR 5'-CGCGGCTCGAGGCTAGCATCGATGTCGACGC-3'(서열번호: 46)를 각 2 ㎍(2 ㎕)과 H2O를 21 ㎕를 혼합하고, 95℃ 5분, 85℃ 15분, 65℃ 15분, 37℃ 15분, 25℃ 15분, 4℃에서 어닐링시켰다. 이 혼합액과 pSeV(TDK) Not I-Kpn I 정제액을 라이게이션하고, pSeV/Linker를 얻었다. 이 pSeV/Linker를 템플레이트로 하여, pGEM-F5 5'-CTTAACTATGCGGCATCAGAGC-3'(서열번호: 47) 및 pGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3'(서열번호: 48)를 사용하고, KOD-Plus(TOYOBO)를 사용해서 PCR 반응을 행하여 Qiaquick PCR Purification kit를 사용해서 정제하였다. 이 정제액을 템플레이트로 하여 RibLF1
5'-CTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAAACAAGAG-3'(서열번호: 49)와 pGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3'(서열번호: 48)를 사용하고, KOD-Plus(TOYOBO)를 사용해서 PCR 반응을 행하여 Qiaquick PCR Purification kit를 사용해서 정제하였다. 이 정제액을 템플레이트로 하여 RibLF2
5'-GATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTC-3'(서열번호: 50)와 pGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3'(서열번호: 48)를 사용하고, KOD-Plus(TOYOBO)를 사용해서 PCR 반응을 행하여 Qiaquick PCR Purification kit를 사용해서 정제하였다. 추가로 이 정제액을 템플레이트로 하여 RibLF3
5'-GCGGGCCCTCTCTTGTTTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGAC-3'(서열번호: 51) 및 pGEM-R1 5'-GCCGATTCATTAATGCAGCTGG-3'(서열번호: 48)를 사용하고, KOD-Plus(TOYOBO)를 사용해서 PCR 반응을 행하여 Qiaquick PCR Purification kit를 사용해서 정제하였다. 이 정제 PCR 산물을 pCAGGS(BSX)의 Swa I 사이트에 도입하고, pCAGGS-SeV(m)로 하였다. 이어서, pSeV18(+)/△F-EGFP(Li, H.-O. et al. J. Virology 74, 2000, p6564-6569)를 Not I 및 Sal I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 1972 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하여, Not I 및 Sal I로 소화하고, 정제한 pCAGGS-SeV(m)과 라이게이션하여, pCAGGS-SeV(m)A를 얻었다. pSeV(+)18/△F를 Nhe I 및 Kpn I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 3325 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하여, Not I 및 Sal I로 소화하고, 정제한 pCAGGS-SeV(m)과 라이게이션하여 pCAGGS-SeV(m)AC를 얻었다.
pSeV18+b(+)(Li, H.-O. et al. J. Virology 74, 2000, p6564-6569)를 Sal I 및 Nhe I로 소화하고, Qiaquick PCR purification kit로 정제하였다. 그리고, LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)의 Sal I-Nhe I 사이트에 도입하여 Litmus38/SeV Sal I-Nhe I를 얻었다. 이 Litmus38/SeV Sal I-Nhe I를 Sal I 및 Nhe I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 9886 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하여, pCAGGS-SeV(m)AC의 Sal I-Nhe I 사이트에 도입함으로써 pCAGGS-SeV를 얻었다.
pSeV/△F-EGFP(Li, H.-O. et al. J. Virology 74, 2000, p6564-6569)를 Sal I 및 Nhe I로 소화하고, Qiaquick PCR purification kit로 정제하였다. 그리고, LITMUS38(NEW ENGLAND BioLabs)의 Sal I-Nhe I 사이트에 도입하여 Litmus38/Sal I-Nhe I△F-GFP를 얻었다. 이 Litmus38/Sal I-Nhe I△F-GFP를 Sal I 및 Nhe I로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리 후, 8392 bp의 밴드를 잘라내고, Qiaquick Gel Extraction kit로 정제하여, pCAGGS-SeV(m)AC의 Sal I-Nhe I 사이트에 도입함으로써 pCAGGS-SeV/△F-GFP를 얻었다.
·pGEM-IRES-Luci의 구축
pMAMneo-Luci(Clontech)로부터 Bam HI로 소화하여 얻은 루시페라제 프래그먼트(luciferase fragment)를 pTM1(Nature, 348, 1, November, 1990, 91-92)의 Bam HI 사이트에 도입하여 pGEM-IRES-Luci를 구축하였다.
[실시예 3] T7 RNA Polymerase 발현 BHK-21(이하 BHK/T7으로 한다)의 수립
상기에서 구축한 pCALNdLWE-T7을 BHK-21 세포에 mammalian transfection kit(Stratagene) 또는, SuperFect(Qiagen)를 사용하여 트랜스펙션을 행하였다. 400 ㎍/㎖의 G418을 포함하는 D-MEM에서 37℃, 5% CO2하에서 2주간 배양하고, 단일 세포로부터 증식시킨 약제내성 클론을 얻었다. 얻어진 약제내성 클론은 Cre DNA recombinase를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AxCANCre)를 Moi=4로 감염시키고, 24시간 후에 세포를 PBS로 1회 세정한 후에, 세포를 회수하고, anti-T7 RNA Polymerase rabbit Polyclonal antibody를 사용한 웨스턴 블롯 해석에 의해 T7 RNA Polymerase의 발현을 확인하였다.
발현을 확인할 수 있었던 클론에 관하여 pGEM-IRES-Luci를 SuperFect를 사용하여 트랜스펙션하였다. 24시간 후에 세포를 회수하여 듀얼 루시페라제 리포터 시스템(Dual Luciferase Reporter System)(Promega) 키트를 사용하여 MiniLumat LB9506(EG&G BERTHOLD)로 루시페라제 활성을 측정하여 T7 RNA Polymerase의 활성을 확인하였다.
[실시예 4] F 결실형 SeV 벡터의 회수
해머헤드 리보자임을 부가한 센다이 바이러스 게놈을 전사하는 벡터를 사용한 바이러스 벡터 제조방법(이하 HamRbz법으로 한다)에 의해 F 유전자 결실형 SeV의 회수를 행하였다. 인간 태아 신장 유래 293T 세포를 트랜스펙션하는 전날에 1×106 cells/well/2 ㎖ 10% FBS가 든 D-MEM에서 6 well plate에 뿌렸다. 트랜스펙션은 이하와 같이 하여 행하였다. Opti-MEM 30 ㎕에 TransIT-LT1(Mirus)을 15 ㎕ 혼합하고, 실온에서 10~15분간 배양하였다. 배양하는 동안 DNA 용액을 조정하였다. Opti- MEM 20 ㎕에 pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pCAGGS-SeV/△F-GFP를 각각 0.3 ㎍, 0.5 ㎍, 2 ㎍, 0.5 ㎍, 0.5~5 ㎍으로 용해하였다. 10~15분 후에 TransIT-LT1 용액과 DNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 정치하였다. 정치하는 동안에 세포의 배지를 빼서 새로운 10% FBS가 든 D-MEM을 1 ㎖/well로 조용히 첨가하였다. 15분 후, Opti-MEM(GIBCO) 500 ㎕를 DNA-TransIT-LT1 혼합물에 첨가하고, 전량을 세포에 첨가해서 배양하였다. 37℃, 5% CO2하에서 72시간 배양 후, 배양액을 버리고, 트립신 7.5 ㎍/㎖를 포함하는(혈청을 포함하지 않는) MEM(이하 Try-MEM)에 1×106 cells/㎖가 되도록 현탁한 LLC-MK2/F7/A 세포(F 발현을 유도한 세포는 LLC-MK2/F7/A라고 기재한다; Li, H.-O. et al., J. Virology 74. 6564-6569 (2000), WO00/70070)를 1 ㎖/well로 중층하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 그로부터 24시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 48시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 72시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하였다. 회수한 배양액은 7.5% BSA를 133 ㎕ 첨가하고(최종농도 1% BSA), CIU를 측정할 때까지 -80℃에서 보존하였다.
이하와 같이, GFP 발현세포의 카운트에 의한 CIU의 측정(GFP-CIU)을 실시하였다. CIU 어세이의 2~3일 전에 LLC-MK2 세포를 12 well-plate에 뿌렸다. 2일 전의 경우는 1.5×105 cells/well의 비율로, 10% FBS가 든 MEM 1 ㎖/well로 뿌리고, 3일 전의 경우는 8.0×104 cells/well의 비율로, 10% FBS가 든 MEM 1 ㎖/well로 뿌렸다. CIU 어세이 당일에 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 1회 세정한 후, 중층 후 24, 48, 72시간째에 회수한 배양액의 1/10 희석계열을 MEM 배지에서 제작하고, 37℃에서 1시간 감염 후, MEM 배지로 1회 세정하고, MEM 배지 1 ㎖를 첨가하였다. 37℃에서 2일 배양 후, 세포를 형광현미경으로 관찰하고, 적절한 희석 웰의 GFP 양성 세포의 수를 세었다. 그 결과, 중층 72시간 후에 1×106~1×107 GFP-CIU/㎖의 바이러스 벡터가 회수되었다(도 13).
[실시예 5] F 유전자의 공급이 야생형 F(이하 F)의 경우에 대한 furin 인식서열을 도입한 F(이하 F5R)인 경우의 생산성의 비교
pCAGGS로 F 단백질을 공급할 때에, 야생형의 F 유전자를 사용한 경우와 furin 인식서열을 도입한 F5R의 경우에서 재구성효율의 비교를 행하였다. 293T 세포를 트랜스펙션하는 전날에 1×106 cells/well/2 ㎖ 10% FBS가 든 D-MEM에서 6 well plate에 뿌렸다. 트랜스펙션은 이하와 같이 하여 행하였다. Opti-MEM 30 ㎕에 TransIT-LT1(Mirus)을 15 ㎕ 혼합하고, 실온에서 10~15분간 배양하였다. 배양하는 동안 DNA 용액을 조정하였다. Opti-MEM 20 ㎕에 pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L, pCAGGS-SeV/△F-GFP를 각각 0.3 ㎍, 0.5 ㎍, 2 ㎍, 2 ㎍에 고정하고, pCAGGS-F 또는 pCAGGS-F5R을 0.1 ㎍, 0.3 ㎍, 0.5 ㎍, 0.7 ㎍, 0.9 ㎍으로 조건을 다양하게 하여 용해하였다. 10~15분 후에 TransIT-LT1 용액과 DNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 정치하였다. 정치하는 동안에 세포의 배지를 빼서 새로운 10% FBS 가 든 D-MEM을 1 ㎖/well로 조용히 첨가하였다. 15분 후, Opti-MEM(GIBCO) 500 ㎕를 DNA-TransIT-LT1 혼합물에 첨가하고, 전량을 세포에 첨가해서 배양하였다. 37℃, 5% CO2하에서 72시간 배양 후, 배양액을 버리고, 트립신 7.5 ㎍/㎖를 포함하는(혈청을 포함하지 않는) MEM(이하 Try-MEM)에 1×106 cells/㎖가 되도록 현탁한 LLC-MK2/F7/A 세포를 1 ㎖/well로 중층하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 그로부터 24시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 48시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 72시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하였다. 회수한 배양액은 7.5% BSA를 133 ㎕ 첨가하고(최종농도 1% BSA), CIU를 측정할 때까지 -80℃에서 보존하였다. 모든 샘플을 회수한 후에 CIU 어세이를 행하였다. 그 결과, pCAGGS-F는 0.7 ㎍일 때가 가장 재구성효율이 좋고, 중층 24시간째, 48시간째, 72시간째에서 각각 0 CIU/㎖, 7.9×102 CIU/㎖, 3.3×104 CIU/㎖의 바이러스 벡터를 포함하고 있었다. 한편으로, pCAGGS-F5R을 사용한 경우는, 0.5 ㎍일 때가 가장 좋고, 중층 24시간째, 48시간째, 72시간째에서 각각 3.2×104 CIU/㎖, 5.7×105 CIU/㎖, 1.2×107 CIU/㎖의 바이러스 벡터를 포함하고 있었다. 양자에서 재구성효율이 가장 좋았던 조건에서 비교해 보면, pCAGGS-F5R을 사용하는 경우 쪽이 pCAGGS-F를 사용하는 경우 보다도 재구성효율이 훨씬 좋고, 중층 72시간째에서 373배 높은 바이러스 벡터를 얻을 수 있었다(도 14).
[실시예 6] 전파형 SeV 벡터의 제조
pCAGGS-T7을 사용하여 T7 RNA 폴리머라제에 의해 SeV 게놈을 전사시키는 바이러스 벡터 제조방법(이하 pCAGGS-T7법으로 한다)에 의해 전파형 SeV의 회수를 행하였다. 트랜스펙션하는 전날에 각 세포를 6 well plate에 뿌렸다(293T 세포: 1×106 cells/well/2 ㎖ 10% FBS가 든 D-MEM, LLC-MK2 세포: 5.0×105 cells/well/2 ㎖ 10% FBS가 든 D-MEM, BHK-21 세포: 2.5×105 cells/well/2 ㎖ 10% FBS가 든 D-MEM, BHK/T7 세포: 2.5×105 cells/well/2 ㎖ 10% FBS가 든 D-MEM). 트랜스펙션은 이하와 같이 하여 행하였다. Opti-MEM 30 ㎕에 TransIT-LT1(Mirus)을 15 ㎕ 혼합하고, 실온에서 10~15분간 배양하였다. 배양하는 동안 DNA 용액을 조정하였다. Opti-MEM 20 ㎕에 pCAGGS-T7, pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pSeV(TDK)18+GFP를 각각 0.5 ㎍, 0.5 ㎍, 0.5 ㎍, 2 ㎍, 5 ㎍으로 용해하였다. 10~15분 후에 TransIT-LT1 용액과 DNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 정치하였다. 정치하는 동안에 세포의 배지를 빼서 새로운 10% FBS가 든 D-MEM을 1 ㎖/well로 조용히 첨가하였다. 15분 후, Opti-MEM(GIBCO) 500 ㎕를 DNA-TransIT-LT1 혼합물에 첨가하고, 전량을 세포에 첨가해서 배양하였다. 37℃, 5% CO2하에서 3일간 배양하였다. 이 때, GFP 양성 세포의 수를 카운트한 결과, 293T 세포에서 246개, LLC-MK2 세포에서 16개, BHK-21 세포에서 288개, BHK/T7 세포에서 405개였다. 그 다음, 배양액을 버리고, PBS(-) 1 ㎖를 세포에 첨가하고, 셀 스크래퍼(cell scraper)로 박리하여, 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 회수하였다. 1회 동결융해를 한 후에, 희석하지 않는 세포현탁액과 PBS(-)로 10배, 100배, 1000배 희석한 세포현탁액 100 ㎕를 10일 계란에 각각 접종하였다. 부란기로 35℃에서 3일간 배양한 후, 요액을 회수하여, HA 어세이를 행하였다. 그 결과, 희석하지 않는 293T 세포, BHK-21 세포, BHK/T7 세포현탁액을 접종한 계란에서 바이러스의 증식을 확인할 수 있었다(도 15).
[실시예 7] F 결실형 SeV 벡터의 제조 Ⅱ
293T 세포를 트랜스펙션하는 전날에 1×106 cells/well/2 ㎖ 10% FBS가 든 D-MEM에서 6 well plate에 뿌렸다. 트랜스펙션은 이하와 같이 하여 행하였다. Opti-MEM 30 ㎕에 TransIT-LT1(Mirus)을 15 ㎕ 혼합하고, 실온에서 10~15분간 배양하였다. 배양하는 동안 DNA 용액을 조정하였다. Opti-MEM 20 ㎕에 pCAGGS-T7, pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pSeV/△F-GFP(WO/70070)를 각각 0.5 ㎍, 0.5 ㎍, 0.5 ㎍, 2 ㎍, 0.5 ㎍, 0.5~5 ㎍으로 용해하였다. 10~15분 후에 TransIT-LT1 용액과 DNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 정치하였다. 정치하는 동안에 세포의 배지를 빼서 새로운 10% FBS가 든 D-MEM을 1 ㎖/well로 조용히 첨가하였다. 15분 후, Opti-MEM(GIBCO) 500 ㎕를 DNA-TransIT-LT1 혼합물에 첨가하고, 전량을 세포에 첨가해서 배양하였다. 37℃, 5% CO2하에서 72시간 배양 후, 배양액을 버리고, Try-MEM에 1×106 cells/㎖가 되도록 현탁한 LLC-MK2/F7/A 세포를 1 ㎖/well로 중층하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 그로부터 24시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 48시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 72시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하였다. 회수한 배양액은 7.5% BSA를 133 ㎕ 첨가하고(최종농도 1% BSA), CIU를 측정할 때까지 -80℃에서 보존하였다.
이하와 같이, GFP 발현세포의 카운트에 의한 CIU의 측정(GFP-CIU)을 실시하였다. CIU 어세이의 2~3일 전에 LLC-MK2 세포를 12 well-plate에 뿌렸다. 2일 전의 경우는 1.5×105 cells/well의 비율로, 10% FBS가 든 MEM 1 ㎖/well로 뿌리고, 3일 전의 경우는 8.0×104 cells/well의 비율로, 10% FBS가 든 MEM 1 ㎖/well로 뿌렸다. CIU 어세이 당일에 혈청을 포함하지 않는 MEM으로 1회 세정한 후, 중층 후 24, 48, 72시간째에 회수한 배양액의 1/10 희석계열을 MEM 배지에서 제작하고, 37℃에서 1시간 감염 후, MEM 배지로 1회 세정하고, MEM 배지 1 ㎖를 첨가하였다. 37℃에서 2일 배양 후, 세포를 형광현미경으로 관찰하고, 적절한 희석 웰의 GFP 양성 세포의 수를 세었다. 그 결과, 중층 72시간 후에 1×106~1×107 GFP-CIU/㎖의 바이러스 벡터가 회수되었다(도 16).
이 pCAGGS-T7법은 플라스미드의 도입 세포에 293T 세포를 사용했을 때는, 인산칼슘법으로도 SeV18+GFP/△F의 회수에 성공하였다. 효율은 TransIT-LT1과 동등 이상이었다(도 17).
[실시예 8] pCAGGS-T7법의 세포종의 검토
pCAGGS-T7법이 293T 이외의 세포에서도 센다이 바이러스 벡터의 회수가 가능한지의 여부를 검토하기 위해, LLC-MK2, BHK-21, BHK/T7, 293T 세포에서 회수하는 것이 가능한지를 시도하였다. 각 세포를 트랜스펙션하는 전날에 6 well plate에 뿌렸다(LLC-MK 세포: 5×105 cells/well, BHK-21 세포: 2.5×105 cells/well, BHK/T7 세포: 2.5×105 cells/well, 293T 세포: 1.0×106 cells/well). 트랜스펙션은 이하와 같이 하여 행하였다. Opti-MEM 30 ㎕에 TransIT-LT1(Mirus)을 15 ㎕ 혼합하고, 실온에서 10~15분간 배양하였다. 배양하는 동안 DNA 용액을 조정하였다. Opti-MEM 20 ㎕에 pCAGGS-T7, pCAGGS-NP, pCAGGS-P4C(-), pCAGGS-L(TDK), pCAGGS-F5R, pSeV/△F-GFP를 각각 0.5 ㎍, 0.5 ㎍, 0.5 ㎍, 2 ㎍, 0.5 ㎍, 2 ㎍으로 용해하였다(단, BHK/T7 세포를 사용할 때는 pCAGGS-T7은 첨가하고 있지 않다). 10~15분 후에 TransIT-LT1 용액과 DNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 정치하였다. 정치하는 동안에 세포의 배지를 빼서 새로운 10% FBS가 든 D-MEM을 1 ㎖/well로 조용히 첨가하였다. 15분 후, Opti-MEM(GIBCO) 500 ㎕를 DNA-TransIT-LT1 혼합물에 첨가하고, 전량을 세포에 첨가해서 배양하였다. 37℃, 5% CO2하에서 72시간 배양 후, 배양액을 버리고, Try-MEM에 1×106 cells/㎖가 되도록 현탁한 LLC-MK2/F7/A 세포를 1 ㎖/well로 중층하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 그로부터 24시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 48시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하고, 새로운 Try-MEM을 1 ㎖ 첨가하여, 37℃, 5% CO2하에서 배양하였다. 72시간 후에 배양액 1 ㎖를 회수하였다. 회수한 배양액은 7.5% BSA를 133 ㎕ 첨가하고(최종농도 1% BSA), CIU를 측정할 때까지 -80℃에서 보존하였다. n=3에서 행하였다. 그 결과, 테스트한 모든 세포종으로부터 벡터가 회수되었다. 벡터의 회수효율은 BHK/T7 세포>BHK-21 세포>293T 세포>LLC-MK2 세포의 순서였다(도 18). 또한, BHK/T7 발현주에는 pCAGGS-T7은 트랜스펙션하지 않았기 때문에, T7 발현주에 있어서 CA 프로모터를 사용해도, F 결실형 SeV/△F-GFP의 회수가 가능한 것이 나타내어졌다.
[실시예 9] furin 인식서열을 포함하는 F 단백을 유도 발현하는 패키징 세포의 클로닝
인간 세포인 HeLa 세포에 대해서, 패키징 세포의 제작을 시도하였다. 트랜스펙션에는 LipofectAMINE PLUS reagent(Invitrogen, Groningen, Netherlands)를 사용하여 프로토콜에 기재된 방법으로 행하였다. 즉 이하의 방법으로 행하였다. HeLa 세포를 2×105 cells/dish로 6 well 플레이트에 뿌리고, 10% FBS를 포함하는 D-MEM에서 24시간 배양하였다. pCALNdLw-Zeo-F(furin) 또는 pCALNdLw-Zeo-F(5R)의 1.5 ㎍을 FBS 및 항생물질을 포함하지 않는 D-MEM에 희석하여(총량으로 94 μL), 교반 후 LipofectAMINE PLUS reagent 6 μL를 첨가, 재차 교반하여 실온에서 15분간 방치하였다. 방치 후, 미리 LipofectAMINE reagent 4 μL를 FBS 및 항생물질을 포함 하지 않는 D-MEM에 희석한 것을(총량으로 100 μL) 첨가하여 실온에서 15분간 방치하였다. 방치 후, FBS 및 항생물질을 포함하지 않는 D-MEM을 1 μL 첨가하여 교반 후, PBS로 1회 세정한 HeLa 세포로 이 트랜스펙션 혼합액을 첨가하였다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 배양 후, 트랜스펙션 혼합액을 제거하지 않고, 20% FBS를
포함하는 D-MEM을 1 mL 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양 후, 트립신으로 세포를 박리하고, 96 well 플레이트에 약 5 cells/well 또는 25 cells/well의 비율로 희석하여, 500 ㎍/mL의 Zeocin(Gibco-BRL, Rockville, MD)을 포함하는 10% FBS가 든 D-MEM에서 약 2주간 배양하였다. 단일 세포로부터 퍼진 클론을 6 well 플레이트까지 확대 배양하였다. 이와 같이 하여 조정한 클론에 대해서 해석을 행하였다.
얻어진 클론에 대해서, F 단백의 발현량을 Western-blotting으로 반정량적으로 해석하였다. 각 클론을 6 well 플레이트에 뿌려, 거의 컨플루언트(confluent)의 상태에서, 5% FBS를 포함하는 MEM으로 희석한 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(AxCANCre)를 Saito 등의 방법(Saito, I. et al., Nucl. Acid. Res. 23, 3816-3821 (1995), Arai, T. et al., J. Virol 72, 1115-1121 (1998))으로 MOI=5로 감염시켰다. 32℃에서 2일간 배양 후, 배양상청을 제거하여 PBS로 1회 세정하고, 셀 스크래퍼로 세포를 박리하여 세포를 회수하였다. 1 lane당 이 1/10양을 어플라이하여 SDS-PAGE를 행한 후, 항F 항체(γ236: Segawa, H. et al., J. Biochem. 123, 1064-1072 (1998))를 이용한 Western-blotting을 햄함으로써, 세포 내의 F 단백질을 반정량적으로 해석하였다. 상기 Western-blotting은 이하의 방법 으로 행하였다. 6 well 플레이트의 1 well로부터 회수한 세포를 -80℃에서 동결 보존 후, 1×로 희석한 SDS-PAGE용 샘플 버퍼(sample buffer)(Red Loading Buffer Pack; New England Biolabs, Beverly, MA) 100 μL로 용해하고, 98℃에서 10분간 가열하였다. 원심 후, 상청 10 μL를 SDS-PAGE 겔(멀티겔(Multigel) 10/20; Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan)에 로드하였다. 15 mA에서 2.5 시간 영동 후, PVDF막(Immobilon PVDF transfer membrane; Millipore, Bedford, MA)에 세미드라이법(semi-dry method)으로 100 mA에서 1시간 전사하였다. 전사막을 블록킹 용액(Block Ace; Snow Brand Milk Products Co., Ltd, Sapporo, Japan)에서 4℃ 1시간 이상 방치한 후, 10% Block Ace를 포함하여 항F 항체를 1/1000 용량 첨가한 1차 항체 용액에 담구고, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 TBS(TBST)로 3회, 추가로 TBS로 3회 세정한 후, 10% Block Ace를 포함하고 HRP를 결합한 항마우스 IgG+IgM 항체(Goat F(ab')2 Anti-Mouse IgG+IgM, HRP; BioSource Int., Camarillo, CA)를 1/5000 용량 첨가한 2차 항체 용액에 담구어, 실온에서 1시간 진탕하였다. TBST로 3회, TBS로 3회 세정한 후, 화학발광법(ECL western blotting detection reagents; Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden)에 의해 검출하였다. 얻어진 클론 중에서 비교적 F 단백의 발현량이 많았던 것으로서, pCALNdLw-Zeo-F(furin) 또는 pCALNdLw-Zeo-F(5R)를 유전자 도입한 세포에 대해서, 각각 31 클론 및 23 클론이 얻어졌다.
이들의 클론에 대해서, 실제로 F 유전자 결실형 SeV(SeV/△F)의 바이러스 생산성을 조사하였다. 먼저 간편한 방법으로서, GFP 유전자를 탑재한 SeV/△F(SeV/△ F-GFP)를 감염시키고, 그의 GFP 형광의 퍼짐을 조사하였다. 구체적으로는, 각각의 클론의 세포를 6 well plate에 뿌리고 37℃에서 배양하였다. 전술한 방법(AxCANCre 감염)에 의해 F 단백의 발현을 유도 후, 32℃에 이행시키고, 감염 1일 후에 GFP 유전자를 탑재한 SeV/△F(SeV/△F-GFP)를 MOI=0.1에서 감염시키고, 경시적으로 GFP 형광의 퍼짐을 형광현미경하에서 관찰하였다. GFP 형광의 퍼짐이 관찰된 것은, pCALNdLw-Zeo-F(furin) 또는 pCALNdLw-Zeo-F(5R)를 유전자 도입한 클론에 대해서, 각각 8 클론 및 12 클론이었다. 이들의 클론에 대해서는, 실제로 바이러스 생산성을 조사하였다. SeV/△F-GFP를 MOI=0.5에서 감염 후, 10% FBS 존재하 또는 비존재하 32℃에서 배양하고, 감염 3일 후에 배양상청 중의 바이러스 벡터를 조사하였다. 모든 클론에서 FBS 비존재하 보다도 10% FBS 존재하 쪽이 10~20배 고역가가 얻어졌다. 특히, 클론 F5R2의 경우에 생산성이 높고, 10% FBS 존재하에서 3×106 CIU/㎖의 SeV/△F-GFP가 회수되었다. 종래 패키징 세포로서는 사용할 수 없었던 HeLa 세포를 사용한 경우도 SeV/△F를 생산 가능한 것이 확인되어, trypsin 첨가 없이, 또한 혈청 존재하에서의 SeV/△F의 생산에 성공하였다.
[실시예 10] 벡터 생산성 향상
클론 F5R2의 벡터 생산성은 비교적 높은(3×106 CIU/㎖) 것이지만, 실제의 벡터 생산에 이용하기 위해서는, 더욱 생산성을 향상시킬 필요가 있다. F5R2로 생산한 SeV 벡터(SeV/△F-GFP)에 대해서, F 단백의 개열 정도를 Western-blotting에 의해 조사하였다. 이 때, 항F1 항체를 이용하였다. 항F1 항체는, 새롭게 조제한 다 중 클론 항체로서, F1 단백질의 1-8(FFGAVIGT+Cys/서열번호: 52), 27-39(EAREAKRDIALIK/서열번호: 53) 및 285-297(CGTGRRPISQDRS/서열번호: 54)의 합성 펩티드를 3종 혼합하여 면역한 토끼혈청으로부터 조제한 것이다. 항F1 항체는, F0 및 F1의 양자의 검출이 가능한 항체이다. 실시예 9의 경우와 동일한 방법으로 F 단백의 발현 유도 및 벡터 생산을 행하였다. 또한, Western-blotting에 대해서는, 1차 항체로서 다중 클론 항체의 항F1 항체를 이용했기 때문에, 2차 항체로서, 항토끼 IgG 항체(Anti-rabbit IgG(Goat) H+L conj.; ICN P., Aurola, OH)를 사용하였다. F5R2 세포에서 생산한 SeV 벡터(SeV/△F-GFP)에 있어서의 F 단백의 검출결과를 도 19에 나타냈다. 활성화한 F 단백질인 F1의 경우가 비교적 적은 것이 명백해졌다.
보다 높은 바이러스 생산능을 갖는 개변 F 단백질 발현세포를 얻기 위해, F5R2의 세포의 리클로닝을 실시하여, F1로의 개열의 빈도가 상승한 세포의 선택을 행하였다. 32 클론이 얻어져, 벡터 생산성을 정밀 조사한 결과, 클론 F5R2-F22가 가장 높은 생산성을 나타내었다. SeV/△F-GFP를 MOI=0.5에서 감염 후, 10% FBS 존재하 32℃에서 배양하고, 경시적으로 배양상청 중의 SeV/△F-GFP의 역가를 조사한 결과를 도 20에 나타내었다. 리클로닝한 F5R2-F22는 친세포인 F5R2 보다도 10배 이상의 생산성을 나타내고, 감염 3일째에는 8×107 CIU/㎖의 SeV/△F-GFP를 생산하는 것이 가능하였다. 이 세포(클론 F5R2-F22)에 대해서도, 생산한 SeV 벡터(SeV/△F-GFP)에 있어서의 F 단백의 개열의 정도를, 항F1 항체를 이용한 Western-blotting에 의해 조사하였다. F5R2 세포의 경우 보다도 F1으로의 개열의 정도가 상승하고 있는 것이 명백해졌다(도 21). 이것이 생산성(=감염성 바이러스 입자의 산출)의 향상에 기여하고 있다고 생각되었다. 더욱이 생산성을 높이는 방법으로서, 예를 들면, 인간 furin 유전자 또는 유사한 활성을 갖는 단백질의 유전자를 세포에 도입하여, furin 유사 활성을 상승시키는 것이 생각되어진다. 생산한 SeV 벡터(SeV/△F-GFP) 중의 F 단백질량은 비교적 많기 때문에, F0 단백의 개열을 촉진하고, 활성형 F 단백(F1 단백)의 비율을 높임으로써, 더욱 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 방법에 의하면, 바이러스의 증식에 본래 필요한 프로테아제를 사용하지 않고, 그 바이러스를 제조하는 것이 가능해진다. 바이러스 생산세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제, 또는 세포에 유해한 효과가 적은 프로테아제의 절단서열을 사용함으로써, 바이러스 제조를 위한 세포의 선택의 폭이 넓어져, 바이러스 제조의 효율을 높일 수 있다. 본 발명의 방법은, 유전자 치료용 벡터를 포함하는 목적으로 하는 유전자 도입 벡터의 제조방법으로서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> DNAVEC RESEARCH INC. <120> Method for producing virus vectors <130> D3-A0401P <140> <141> <150> JP 2004-014654 <151> 2004-01-22 <160> 54 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 1 Pro Leu Gly Met Thr Ser 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 2 Pro Gln Gly Met Thr Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 3 Pro Leu Gly Leu Trp Ala Arg 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 4 Gly Pro Leu Gly Met Arg Gly Leu 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 5 Pro Gln Gly Leu Glu Ala Lys 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 6 Arg Pro Lys Pro Val Glu Trp Arg Glu Ala Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PLALWAR <400> 7 Pro Leu Ala Leu Trp Ala Arg 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 8 Pro Leu Gly Met Trp Ser 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 9 Pro Leu Gly Leu Gly 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 10 Val Phe Ser Ile Pro Leu 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 11 Ile Lys Tyr His Ser 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 12 Val Pro Met Ser Met Arg Gly Gly 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 13 Arg Pro Phe Ser Met Ile Met Gly 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 14 Val Pro Leu Ser Leu Thr Met Gly 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 15 Ile Pro Glu Ser Leu Arg Ala Gly 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an example of protease cleavage sequence <400> 16 Pro Leu Ala Tyr Trp Ala Arg 1 5 <210> 17 <211> 367 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 17 actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360 accatgg 367 <210> 18 <211> 1248 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 18 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120 ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180 cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240 ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg gagtcgctgc gacgctgcct 300 tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc 360 gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt 420 ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg ggctccggga 480 gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag 540 cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct 600 ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg 660 ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg 720 gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga 780 gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc 840 gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga 900 gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag 960 ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca 1020 aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc 1080 gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg 1140 ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg 1200 ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgg 1248 <210> 19 <211> 95 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 19 cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 60 ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aattc 95 <210> 20 <211> 1744 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an example of CA promoter <400> 20 actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60 cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120 ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 420 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 480 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 540 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 600 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcggggag tcgctgcgac 660 gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 720 tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 780 agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 840 tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 900 tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 960 cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1020 ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1080 gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1140 ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1200 ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1260 ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1320 cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1380 tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1440 gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1500 cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1560 gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1620 gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1680 tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcgg cttgatcgaa gcttgcccac 1740 catg 1744 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Bacteriophage P1 <400> 21 ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 22 gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34 <210> 23 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus S sequence (w= a or c; v= a or c or g) <400> 23 ucccwvuuwc 10 <210> 24 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus S sequence <400> 24 ucccaguuuc 10 <210> 25 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus S sequence <400> 25 ucccacuuac 10 <210> 26 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus S sequence <400> 26 ucccacuuuc 10 <210> 27 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus S sequence <400> 27 agggtcaaag 10 <210> 28 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus S sequence <400> 28 agggtgaatg 10 <210> 29 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus S sequence <400> 29 agggtgaaag 10 <210> 30 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus E sequence <400> 30 auucuuuuu 9 <210> 31 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an example of Sendai virus E sequence <400> 31 taagaaaaa 9 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 32 cattttggca aagaattgat taattcgag 29 <210> 33 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 33 tcacagcacc caagaatctc ttctggcgag caccggcatt ttgtgtc 47 <210> 34 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 34 gacacaaaat gccggtgctc gccagaagag attcttgggt gctgtga 47 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 35 gatcgtaatc acagtctctc gagagttgta ccatctacct ac 42 <210> 36 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 36 tcacagcacc gaagaatctc ctccggcgac gaccggcatt ttgtgtcgta tc 52 <210> 37 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 37 gatacgacac aaaatgccgg tcgtcgccgg aggagattct tcggtgctgt ga 52 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 38 aaatcctgga gtgtctttag agc 23 <210> 39 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 39 tctcgagtcg ctcggtacga tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcac 54 <210> 40 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 40 aatgcatgat cagtaaatta caatgaacat cgaaccccag agtcccgctc agtcctgctc 60 ctcggccacg aagtgcacgc agttg 85 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 41 ccggaattca acaaatggcc gggttgttga gcaccttcga 40 <210> 42 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 42 ccggaattcc tagattcctc ctatcccagc tactgctgct cg 42 <210> 43 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 43 ctagctagcc caccatggat caagatgcct tcattctaaa agaagattct 50 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 44 ctagctagcc tagttggtca gtgactctat gtcctcttct acgagttcca 50 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 45 ggccgcgtcg acatcgatgc tagcctcgag ccgcggtac 39 <210> 46 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 46 cgcggctcga ggctagcatc gatgtcgacg c 31 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 47 cttaactatg cggcatcaga gc 22 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 48 gccgattcat taatgcagct gg 22 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 49 ctataggaaa ggaattccta tagtcaccaa acaagag 37 <210> 50 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 50 gatgagtccg tgaggacgaa actataggaa aggaattc 38 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 51 gcgggccctc tcttgtttgg tctgatgagt ccgtgaggac 40 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 52 Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Cys 1 5 <210> 53 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 53 Glu Ala Arg Glu Ala Lys Arg Asp Ile Ala Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 54 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 54 Cys Gly Thr Gly Arg Arg Pro Ile Ser Gln Asp Arg Ser 1 5 10

Claims (35)

  1. 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스를 제조하는 방법으로서, (ⅰ) 상기 바이러스 단백질의 상기 프로테아제에 의한 절단서열을 다른 프로테아제의 절단서열로 개변한 개변 바이러스 단백질, 및 (ⅱ) 상기 다른 프로테아제의 존재하에서 상기 바이러스를 생산시키는 공정을 포함하고, 생산되는 바이러스는, 절단된 상기 개변 바이러스 단백질을 포함하며, 상기 개변 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제조되는 바이러스가, 야생형 절단서열을 갖는 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 보유하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제조되는 바이러스가, 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자가 결실된 비전파성 바이러스인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다른 프로테아제가, 바이러스를 생산시키는 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다른 프로테아제가 퓨린인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Arg-Arg-Arg를 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바이러스가 마이너스 가닥 RNA 바이러스인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 방법.
  11. 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스에 있어서, 상기 바이러스 단백질의 상기 프로테아제에 의한 절단서열을, 다른 프로테아제의 절단서열로 개변한 개변 바이러스 단백질을 코드하는 벡터로서, 상기 바이러스의 생산세포에 있어서 증식할 수 없는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터인 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
  13. 제11항에 있어서, 상기 개변 바이러스 단백질이 리콤비나아제에 의해 발현 유도 가능한 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 리콤비나아제가 Cre 또는 Flp인 벡터.
  15. 제11항에 있어서, 상기 다른 프로테아제가, 바이러스를 생산시키는 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제인 벡터.
  16. 제11항에 있어서, 상기 다른 프로테아제가 퓨린인 벡터.
  17. 제11항에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg를 포함하는 벡터.
  18. 제11항에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Arg-Arg-Arg를 포함하는 벡터.
  19. 제11항에 있어서, 상기 바이러스 단백질이 마이너스 가닥 RNA 바이러스의 F 단백질인 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 벡터.
  21. 제19항에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 벡터.
  22. 제11항의 벡터를 포함하는 포유동물 세포.
  23. 제22항에 있어서, 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 증식을 의존하는 바이러스의 생산용 세포인 세포.
  24. 제22항에 있어서, 상기 개변 바이러스 단백질을 코드하는 유전자가, 상기 세포의 염색체에 삽입되어 있는 세포.
  25. 제22항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  26. 증식이 프로테아제에 의한 바이러스 단백질의 절단에 의존하는 바이러스의 개변 바이러스로서, 상기 바이러스 단백질의 상기 프로테아제에 의한 절단서열이, 다른 프로테아제의 절단서열로 개변된 개변 바이러스 단백질을 포함하고, 상기 개 변 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 포함하지 않는 개변 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 제조되는 바이러스가, 야생형 절단서열을 갖는 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자를 보유하는 개변 바이러스.
  28. 제26항에 있어서, 바이러스가, 상기 바이러스 단백질을 코드하는 유전자가 결실된 비전파형 바이러스인 개변 바이러스.
  29. 제26항에 있어서, 상기 다른 프로테아제가, 바이러스를 생산시키는 세포가 내인적으로 발현하는 프로테아제인 개변 바이러스.
  30. 제26항에 있어서, 상기 다른 프로테아제가 퓨린인 개변 바이러스.
  31. 제26항에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Xaa-Lys/Arg-Arg를 포함하는 개변 바이러스.
  32. 제26항에 있어서, 상기 다른 프로테아제의 절단서열이 Arg-Arg-Arg-Arg를 포함하는 개변 바이러스.
  33. 제26항에 있어서, 상기 바이러스가 마이너스 가닥 RNA 바이러스이고, 상기 바이러스 단백질이 F 단백질인 개변 바이러스.
  34. 제33항에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 파라믹소바이러스과 바이러스인 개변 바이러스.
  35. 제33항에 있어서, 상기 마이너스 가닥 RNA 바이러스가 센다이 바이러스인 개변 바이러스.
KR1020067016709A 2004-01-22 2005-01-20 바이러스 벡터의 제조방법 KR20070004637A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2004-00014654 2004-01-22
JP2004014654 2004-01-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070004637A true KR20070004637A (ko) 2007-01-09

Family

ID=34805424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067016709A KR20070004637A (ko) 2004-01-22 2005-01-20 바이러스 벡터의 제조방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20070141705A1 (ko)
EP (1) EP1715048A4 (ko)
JP (1) JPWO2005071085A1 (ko)
KR (1) KR20070004637A (ko)
CN (1) CN1934257A (ko)
CA (1) CA2554198A1 (ko)
WO (1) WO2005071085A1 (ko)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2236378C (en) * 1995-11-01 2011-01-25 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US7402427B2 (en) * 2002-04-30 2008-07-22 Dnavec Research Inc. Vectors with modified protease-dependent tropism
CN101006172B (zh) * 2004-06-24 2012-09-05 株式会社载体研究所 包含导入了rna病毒的树突状细胞的抗癌剂
CA2612168A1 (en) * 2005-06-14 2006-12-21 Dnavec Corporation Methods for producing antibodies
CN101405389A (zh) * 2006-01-17 2009-04-08 生物载体株式会社 新型蛋白质表达系统
KR20090114431A (ko) 2007-02-07 2009-11-03 디나벡크 가부시키가이샤 약독화 마이너스 가닥 ｒｎａ 바이러스
US8450106B2 (en) * 2007-10-17 2013-05-28 The Ohio State University Research Foundation Oncolytic virus
EP2322611B1 (en) 2008-07-16 2016-06-01 IP Pharma Co., Ltd. Method for production of reprogrammed cell using chromosomally unintegrated virus vector
KR20120024819A (ko) * 2009-05-28 2012-03-14 오피케이오 큐알엔에이, 엘엘씨 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료
JP5908838B2 (ja) 2010-08-30 2016-04-26 株式会社Ｉｄファーマ 多能性幹細胞を誘導するための組成物およびその使用
CN110198712A (zh) * 2016-11-04 2019-09-03 费城儿童医院 用于治疗神经退行性疾病的基因转移组合物、方法和用途
WO2018092887A1 (ja) 2016-11-17 2018-05-24 国立感染症研究所長が代表する日本国 非感染性パラミクソウイルス粒子を用いた感染症ワクチン
KR20200051693A (ko) * 2017-09-11 2020-05-13 텐겐 바이오메디컬 컴퍼니 포유동물-특이적 성장-결함 아르보바이러스
WO2023277069A1 (ja) 2021-06-30 2023-01-05 株式会社レプリテック マイナス鎖ｒｎａウイルスベクターの製造方法および製造されたマイナス鎖ｒｎａウイルスベクター

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
KR100754091B1 (ko) * 1995-10-31 2007-08-31 가부시끼가이샤 디나벡 겡뀨쇼 자율 복제 능력을 갖는 (-)쇄 ｒｎａ 바이러스 벡터
CA2236378C (en) * 1995-11-01 2011-01-25 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
US5962274A (en) * 1998-03-13 1999-10-05 Wake Forest University Viral vector directed to predetermined target cells
US20020169306A1 (en) * 1999-05-18 2002-11-14 Kaio Kitazato Envelope gene-deficient paramyxovirus vector
US20030022376A1 (en) * 1999-05-18 2003-01-30 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
KR20070058607A (ko) * 1999-05-18 2007-06-08 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 엔벨로프 유전자 결손 파라믹소과 바이러스 벡터
US20030166252A1 (en) * 1999-05-18 2003-09-04 Kaio Kitazato Paramyxovirus-derived RNP
US7226786B2 (en) * 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
WO2001018223A1 (fr) * 1999-09-06 2001-03-15 Dnavec Research Inc. Paramoxyvirus possedant une sequence d'initiation de transcription modifiee
CA2383276A1 (en) * 1999-09-24 2001-03-29 Mayo Foundation For Medical Education And Research Therapeutic methods and compositions using viruses of the recombinant paramyxoviridae family
CN1418252A (zh) * 2000-01-19 2003-05-14 株式会社载体研究所 副粘病毒属载体在血管内基因转移中的用途
EP1270016A4 (en) * 2000-03-30 2005-10-19 Dnavec Research Inc VACCINE AGAINST AIDS VIRUS CONTAINING A VECTOR OF SENDAI VIRUS
CA2322057A1 (en) * 2000-05-18 2001-11-18 Dnavec Research Inc. Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
CN100531802C (zh) * 2000-06-01 2009-08-26 株式会社载体研究所 含有血凝素活性膜蛋白质的假型逆转录病毒载体
US20030170897A1 (en) * 2000-06-27 2003-09-11 Enyu Imai Virus vector for transferring gene into renal cells
EP1333088A4 (en) * 2000-10-06 2004-11-24 Dnavec Research Inc PARAMYXOVIRUS VECTOR FOR THE INTRODUCTION OF FOREIGN GENES IN SKELETAL MUSCLE
JP2002142770A (ja) * 2000-11-08 2002-05-21 Dnavec Research Inc 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター
WO2002042481A1 (fr) * 2000-11-27 2002-05-30 Dnavec Research Inc. Vecteur paramyxovirus codant pour un gene d'angiogenese et son utilisation
CN1633599A (zh) * 2001-09-18 2005-06-29 株式会社载体研究所 检查和制造降低了粒子形成能力的(－)链rna载体的方法
US7402427B2 (en) * 2002-04-30 2008-07-22 Dnavec Research Inc. Vectors with modified protease-dependent tropism
JPWO2004038029A1 (ja) * 2002-10-24 2006-02-23 株式会社ディナベック研究所 Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法
JPWO2004067752A1 (ja) * 2003-01-31 2006-05-18 株式会社ディナベック研究所 リボザイムをコードするパラミクソウイルスベクターおよびその利用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2554198A1 (en) 2005-08-04
JPWO2005071085A1 (ja) 2007-09-06
EP1715048A1 (en) 2006-10-25
CN1934257A (zh) 2007-03-21
EP1715048A4 (en) 2007-02-07
WO2005071085A1 (ja) 2005-08-04
US20070141705A1 (en) 2007-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20070004637A (ko) 바이러스 벡터의 제조방법
KR101279677B1 (ko) 사이토메갈로바이러스 인핸서 및 닭 β­액틴 프로모터를 포함하는 하이브리드 프로모터를 이용한 마이너스 가닥 ＲＮＡ 바이러스 벡터의 제조방법
US7709621B2 (en) Vectors with modified protease-dependent tropism
US6746860B1 (en) Paramyxovirus vectors used for transfer of foreign genes
JPWO2003025570A1 (ja) 粒子形成能が低下した（−）鎖ｒｎａウィルスベクターの検査方法および製造方法
KR20090052857A (ko) 비복제형 파라믹소바이러스과 바이러스 벡터
JP4791651B2 (ja) 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター
US20060216824A1 (en) Paramyxovirus vector encoding ribozyme and utilization thereof
KR20060028432A (ko) 고변이영역이 개변된 유전자를 탑재하는 마이너스가닥 ｒｎａ 바이러스 벡터

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid