KR20200051693A - 포유동물-특이적 성장-결함 아르보바이러스 - Google Patents

포유동물-특이적 성장-결함 아르보바이러스 Download PDF

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Abstract

아르보바이러스는 prE2 또는 prM과 같은, 전구체 폴리단백질의 향상된 절단을 야기시키는 변형된 퓨린 절단 부위를 갖는다. 뎅기 바이러스 입자는 prM의 아미노산 80 내지 130 내에 아미노산 변형을 가질 수 있다. 지카 바이러스 입자는 퓨린 절단 부위에서 및/또는 퓨린 절단 부위 주변의 아미노산 잔기에 변형을 가질 수 있다. 바이러스는 곤충 세포에서 생성될 수 있다. 바이러스는 포유동물 세포에서 자손 바이러스를 형성하지 않는다.

Description

포유동물-특이적 성장-결함 아르보바이러스
본 발명은 일반적으로, 곤충 세포 및 인간 세포에서 복제하는 독특하고 특이한 성질을 갖는 소수의 바이러스의 소그룹인 아르보바이러스(arbovirus)에 관한 것이다. 본 발명은 돌연변이된 아르보바이러스 및 면역원으로서의 이의 용도에 관한 것이다. 양태들에서, 본 발명은 포유동물 숙주 세포에서 더 이상 재생되지 않지만, 곤충 세포에서 계속 복제하고 이로부터 수확될 수 있지만 포유동물 면역 시스템에서 및 포유동물 면역 시스템에 대한 아르보바이러스 항원을 계속 발현시키고 존재하는 변형된 아르보바이러스에 관한 것이다.
본 발명은 아르보바이러스 그룹의 바이러스에 관한 것이다. 아르보바이러스의 기본 성질은 포유동물 세포 및 곤충 세포에서의 복제이다. 여러 아르보바이러스는 진드기에 의해 또는 모기에 의해 포유동물로 전염된다. 하나의 분류 방식에 따르면, 아르로바이러스는 플라비바이러스, 알파바이러스 및 오르쏘버냐바이러스 속을 포함한다. 다른 분류 방식에 따르면, 아르보바이러스는 부니아비리대, 플라비비리대, 레오비리대 및 토가비리대 과를 포함한다. 아르보바이러스의 예는 아프리카 돼지 열병 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 리프트 밸리열 바이러스, 콜로라도 진드기 열 바이러스, 말 뇌증 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 뎅기 바이러스(DV), 지카 바이러스(ZV) 및 웨스트 나일 바이러스를 포함한다.
플라비바이러스는 일부, 인간 병리(human pathology)로 인하여 연구되었다[예를 들어, Gubler & Kuno, eds.: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Wallingford, CAB International, 1997; 및 Porterfield; Exotic Viral Infections. Chapman and Hall Medical, London, 1995 참조].
플라비바이러스 게놈은 단일 선형, 단일 가닥, + 센스 RNA로 이루어진다. + 가닥 RNA는 적절한 숙주 세포를 감염시킨다. 전체 게놈은 10 내지 11 kb 범위일 수 있다. 3' 폴리아데닐화가 존재하지 않는다. 5' 단부는 메틸화된 캡을 갖는다.
플라비바이러스 게놈은 숙주 리보솜에 대한 번역 개시의 부위를 제공하는 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site; IRES)를 함유하지 않는다. 대신에, 플라비바이러스는 단백질 합성을 시작하기 위해 리보솜 스캐닝을 이용한다.
플라비바이러스 비리온은 직경이 40 내지 65 nm의 구체일 수 있다. 지질 피막 아래에 직경이 대략 25 내지 30 nm인 정20면체 캡시드 외피가 존재한다.
DV(타입 1 내지 5), 황열병 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스는 인간에서 유의미한 이병률 및 치사율의 원인 인자이다.
예를 들어, 황열병 바이러스는 유행병을 유발시킬 수 있다. 제1 사이클에서, 바이러스는 아프리카 숲모기(Aedes africanus) 및 다른 숲모기(아프리카)에 의해 또는 헤모고구스(Hemogogus) 모기(아메리카)에 의해 전염되며, 원숭이는 저수지로서 역할을 하며, 일반적으로, 감염된 인간은 깊은 숲 및 정글에 들어가고 그러한 벡터에 노출된 인간이다. 제2 사이클에서, 인간과 밀접한 관계로 살고 있는 집 모기, 숲모기(Aedes aegypti)는 바이러스를 사이클에서 단독 숙주인 인간에게 직접적으로 전염시킬 수 있다.
플라비바이러스는 머레이 계곡 뇌염, 로키오(Rocio) 및 포와산 뇌염, 및 아메리카에서 더욱 최근에 관찰된 바와 같이, 웨스트 나일열 및 지카열과 같은 다른 질병을 유발시킨다.
양에서 신경계 질병을 유발시키는 도약병 바이러스, 말에서 뇌염을 유발시키는 웨스트 나일 바이러스 및 말에서 뇌염뿐만 아니라 돼지에서 사산을 또한 유발시키는 일본 뇌염 바이러스를 포함하는, 수 개의 플라비바이러스는 상업적으로 중요한 동물 병원균이다.
아르보바이러스 치료를 위한 시급한 요구를 고려하여, 안전하고 효과적인 아르보바이러스 치료 조성물을 제조하는 강력한 방법이 요구된다. 이론적으로, 약화된 생백신은 가장 효과적이고 장기적인 특정 면역력을 이끌어내는 반면, 재조합 하위단위 백신을 포함하는 비활성화된 바이러스 백신은 더 높은 수준의 안전성을 제공한다. 이상적인 백신은 생백신의 효능 및 하위단위 백신의 안전성을 생성할 수 있는 백신일 것이다.
이러한 목표는 포유동물-특이적 성장-제한된 아르보바이러스를 제조하는 확장 가능한 방법의 개발에서 달성되었다. 고려되는 성장-결함 바이러스는 아르보바이러스 항원에 있고 아르보바이러스 항원을 발현시키고, 감염된 포유동물에서 아르보바이러스 항원(들)에 대한 면역 반응을 이끌어내지만 포유동물 세포에서 자손 바이러스를 생성하지 못하며, 이에 따라, 감염된 세포는 포유동물 숙주에서 세포 감염 및 병리를 퍼지게 하는데 기여하지 못한다. 고려되는 성장-제한된 바이러스의 전파는 곤충 세포에서 방해받지 않는다. 이에 따라, 고려되는 기능장애 바이러스는 곤충 세포주에서 경제적으로 생성될 수 있다.
본 발명은 곤충 세포에서 계속 복제하지만 포유동물 세포(예를 들어, 인간 세포)에서 더 이상 복제하지 않고(또는 낮은 수준으로 복제하고) 이에 따라, 감염된 포유동물 세포가 자손 바이러스를 생성하지 못하는, 성장-제한된 아르보바이러스 입자를 제조하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다. 고려되는 아르보바이러스는 숙주 포유동물 세포를 감염시키고, 예를 들어, 세포 및/또는 체액 반응과 함께 포유동물 숙주 면역 시스템에 의해 인식되는 아르보바이러스 단백질을 생성하기 위해 그러한 숙주 포유동물 세포에서 복제할 수 있지만, 자손 아르보바이러스 입자를 생성하지 못하고 방출하지 못할 수 있다. 고려되는 결함 바이러스는 아르보바이러스 단백질의 바이러스 게놈 복제 및 생성을 보장하기 위해 모든 필수적인 유전자를 포함하며, 이는 감염된 세포로부터 방출될 수 있거나, 숙주 세포의 표면에서 발현될 수 있지만, 감염된 숙주 포유동물 세포로부터 자손 바이러스를 생성하지 않는다. 이에 따라, 고려되는 아르보바이러스 입자는 야생형 바이러스만큼 면역원성일 수 있지만, 입자는, 고려되는 변형된 아르보바이러스가 포유동물 세포에서, 만약에 있다면, 복제 감소를 나타내기 때문에, 감염된 숙주에서 질병 또는 병리에 전혀 기여하지 않아야 한다.
고려되는 성장-제한된 아르보바이러스는 포유동물 세포 또는 인간 세포에서 용이하게 전파하지 않아서, 성장-제한적이 되도록 처리 전에 동일한 종 또는 샘플의 야생형 아르보바이러스에 의해 감염된 동일한 타입의 세포에서 생성된 자손 바이러스의 수준 또는 양과 비교하여 바이러스 입자에서의 4 log 이하, 5 log 이하, 6 log 이하, 7 log 이하, 8 log 이하, 9 log 이하의 자손 아르보바이러스의 감소를 생성시키고 방출시키거나, 자손 아르보바이러스를 생성시키거나 방출시키지 못한다.
다른 한편으로, 고려되는 성장-제한된 또는 성장-결함 아르보바이러스는 유사한 자손 아르보바이러스를 생성하기 위해 절지동물 세포와 같은 곤충 세포에서 용이하게 전파한다. 곤충 세포에 의해 생성된 자손 아르보바이러스의 수준은 그러한 동일한 곤충 세포에서 성장-제한적이 되도록 처리하기 위해 사용되는 동일한 종 또는 샘플의 적합한, 조절 야생형 아르보바이러스에 의해 생성된 자손 바이러스의 수준 또는 양과 대략 동일할 수 있거나, 이러한 수준 또는 양을 초과할 수 있다.
구현예들에서, 고려되는 결함 아르보바이러스는 향상된 퓨린 활성을 포함한다(즉, 성장-제한적이 되게 하는 처리 전에 동일한 종 또는 샘플의 야생형 아르보바이러스와 비교하여 더 높은 속도로 절단할 수 있거나, 더욱 효율적으로 절단할 수 있거나, 둘 모두일 수 있음). 전구체 폴리단백질의 퓨린 절단은 아르보바이러스 자손 입자 성숙에 필수적일 수 있다. 일부 아르보바이러스에서, 퓨린 절단은 pr 및 M의 경계(juncture)에서 일어난다. 이에 따라, 고려되는 결함 아르보바이러스는 prM 단백질 또는 폴리펩티드에서, 그 안에서 또는 그 주변에서 향상된 퓨린 활성을 포함한다. 일부 아르보바이러스에서, 퓨린 절단은 E3 및 E2의 경계에서 일어난다. 이에 따라, 고려되는 결함 아르보바이러스는 전구체 E2 단백질 또는 폴리펩티드에서, 그 안에서, 또는 그 주변에서 향상된 퓨린 활성을 포함한다.
고려되는 성장 제한된 아르보바이러스는 예를 들어, pr 및 M의 경계에 존재할 수 있는 퓨린 공통 테트라펩티드에서의 변형; 공통 테트라펩티드의 업스트림에서의(예를 들어, pr 폴리펩티드에서 아미노 말단 방향) 변형; 공통 테트라펩티드의 다운스트림에서의(예를 들어, M 단백질에서 카르복시 말단 방향) 변형; 또는 이들의 조합을 포함한다.
구현예들에서, 아르보바이러스는 prM 폴리단백질을 포함하는 뎅기 바이러스(DV)이다.
구현예들에서, pr과 M 사이의 퓨린 절단 부위에서 및/또는 그 주변에서의 하나 이상의 아미노산 치환은 prM의 향상된 퓨린 절단을 갖는 바이러스를 야기시키고; 곤충 세포에서 전파하고; 포유동물 세포 또는 인간 세포에서 전파하지 않는다.
구현예들에서, DV에서 향상된 퓨린 활성은 1) DV의 prM 폴리펩티드의 아미노산 80에서 시작하는 퓨린 인식 및 절단 부위의 업스트림에서의(아미노 말단 방향) 8개의 아미노산 스트레치(stretch), 즉, prM의 아미노산 80 내지 87에서의 변형; 2) 테트라펩티드 퓨린 인식 부위에서의 변형; 3) 퓨린 인식 및 절단 부위의 다운스트림에서의(카르복시 말단의 방향) 39개의 아미노산 스트레치, 즉, prM의 아미노산 92 내지 130에서의 변형; 4) 아미노산 80의 업스트림에서의 변형; 및 5) 아미노산 130의 다운스트림에서의 변형 중 하나 이상에 의해 얻어진다. 상기의 임의의 조합이 존재할 수 있으며, 예를 들어, 1), 2) 및 3)이 존재할 수 있다. 변형 1), 2) 및 3)이 존재할 수 있다.
구현예들에서, prM 단백질에서의 DV 퓨린 절단 부위, NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH/(서열번호 1)는, 절단이 Lys-Arg 잔기 이후에 일어나는 경우에(그리고, 상기에 나타낸 절단 인식 부위에서 "/"에 의해 명시된 경우에), 퓨린 절단을 향상시키기 위해 Glu 부위에서 변형된다.
구현예들에서, Glu는 임의의 아미노산에 의해 대체된다.
구현예들에서, Glu를 대체하는 아미노산은 비-산성, 비-중성 아미노산, 예를 들어, Gln, Asn, Gly, Lys, Arg, His, Thr, Ser, Tyr, Met 또는 Cys이다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 황을 함유하지 않는다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 R 기 측쇄에서 하이드록실 기를 함유하지 않는다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 염기성 아미노산이다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 Lys, Arg 또는 His이다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 Arg이다.
구현예들에서, 고려되는 결함 DV는 서열번호 1의 업스트림에서의 폴리펩티드 서열의, 예를 들어, Arg-Glu 잔기의 업스트림에서의 8개의 아미노산에서의 하나 이상의 변형을 포함한다. 구현예들에서, 고려되는 결함 DV는 서열번호 1의 다운스트림에서의 폴리펩티드 서열의, 예를 들어, Lys-Arg 잔기로부터의 다운스트림에서의 39개의 아미노산에서의 하나 이상의 변형을 포함한다. 변형은 퓨린 인식 또는 절단 부위일 수 있거나 그 안에 있을 수 있다. 변형은 M 단백질에서 이루어질 수 있다. 변형은 막 단백질의 최초 39개의 아미노 말단 아미노산 내에 위치될 수 있다. 변형은 pr 폴리펩티드에서 이루어질 수 있다. 변형은 pr 폴리펩티드의 마지막 8개의 카르복시 말단 아미노산 내에 위치될 수 있다.
이러한 변형 또는 변형들의 조합은 감염된 포유동물 세포로부터 DV의 복제, 성숙, 및 방출을 감소시키거나 무효화시킨다. 이에 따라, 감염된 포유동물 세포는 포유동물 숙주 면역 시스템에 대한 DV 항원을 함유하고 존재하지만, 감염된 포유동물 세포는 감염성 자손 DV 입자를 방출시키지 않는다.
그러나, 퓨린 절단 부위에서 또는 퓨린 절단 부위 주변에서의 이러한 변형은 곤충 세포에서 고려되는 DV의 복제를 무효화시켜, 포유동물 세포에서 감염시키지만 복제하지 못하게 하도록 사용하기 위해 본원에 개시된 변형된 퓨린 부위를 포함하는 DV 입자를 생성시키기 위한 방법 및 수단을 제공한다. 곤충 세포에서의 전파는 강력하여, 높은 바이러스 수율을 제공하며, 곤충 세포에서 DV의 성장 또는 생성은 더 큰 부피, 양, 및 반응에서 바이러스 입자를 생성시키기 위해 확장 가능하다.
구현예들에서, 아르보바이러스는 prM 폴리단백질을 포함하는 지카 바이러스(ZV)이다.
ZV의 퓨린 절단 부위는 prM의 아미노산 93 이후에 위치된다. 구현예들에서, ZV 퓨린 인식 부위를 포함하고 이의 업스트림에서의 prM 서열, His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/(서열번호 2)은 퓨린 절단을 향상시키도록 5개의 아르기닌 잔기의 서열을 제공하기 위해 테트라펩티드 퓨린 인식 부위의 세린 잔기에서 변형된다(절단은 상기 서열에서 네번째 Arg 이후에 일어난다). 구현예들에서, 그러한 영역의 글루탐산 잔기는 퓨린 절단을 향상시키기 위해 히스티딘으로 변형될 수 있다. 다른 변형은 잔기의 상기 서열에 대해 이루어질 수 있다. 변형은 아미노산 82의 업스트림에서 및/또는 아미노산 93의 다운스트림에서 이루어질 수 있다.
ZV에서 향상된 퓨린 활성은 (1) ZV 퓨린 절단 부위의 업스트림에서의, 예를 들어, prM의 N-말단으로부터 아미노산 잔기 82에서 시작하여 8개의 잔기 서열(즉, prM의 아미노산 잔기 82 내지 89)에서, 그러나 아미노산 82의 업스트림일 수 있는 하나 이상의 아미노산의 변형; (2) ZV 퓨린 테트라펩티드 절단 부위에서의 변형; 및 (3) 퓨린 절단 부위, 즉, 아미노산 94의 다운스트림에서 및 예를 들어, 테트라펩티드의 다운스트림에서의 아미노산의 26개의 잔기 스트레치에서 하향으로의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형 중 하나 이상에 의해 얻어질 수 있다. (1), (2) 및 (3)의 임의의 조합이 존재할 수 있다.
포유동물 세포에서 고려되는 ZV의 성장은 최소화되거나 실질적으로 존재하지 않으며, 곤충 세포에서 그러한 기능장애 ZV의 성장은 실질적으로 영향을 미치지 않는다.
본 발명의 추가적인 특징 및 장점은 본 발명의 하기 상세한 설명 및 도면에 기술되어 있고, 이로부터 명백할 것이다.
도 1은 야생형 DV로의 접종 전에, 대조군으로서 포스페이트-완충 염수(PBS) 또는 고려되는 DV 돌연변이체(D2-89R)를 수용한 마우스로부터 얻어진 데이터를 포함하는 생존 그래프를 도시한 것이다.
도 2는 야생형 SV로의 접종 전에, 대조군으로서 포스페이트-완충 염수(PBS) 또는 고려되는 SV 돌연변이체(M2)를 수용한 마우스로부터 얻어진 데이터를 포함하는 생존 그래프를 도시한 것이다.
도 3은 야생형 SV 또는 SV M2 돌연변이체를 수용한 마우스로부터 얻어진 데이터를 포함하는 안전성 그래프를 도시한 것이다.
본원에서 사용되는 "기능장애(dysfunction)," 또는 이의 문법적 형태는 그러한 변화 또는 변형 전 또는 그러한 변화 또는 변형 없이 관찰된 성질의 기능 수준 또는 존재와 비교하여, 변화 또는 변형으로부터 발생하는 성질 또는 기능의 향상을 명시한다. 예를 들어, 변형되고 기능 장애를 갖는 효소 부위는 효소에 의해 항상 인식되거나 더 큰 비율로, 더욱 효율적으로, 동족 효소에 의해 절단되는 것일 수 있으며, 결과는 효소 반응 산물의 수준 또는 양이 증가된다. 예를 들어, 구현예들에서, 기능장애 퓨린 절단 부위는 비-기능장애 퓨린 절단 부위에 대해 관찰된 것보다 향상되거나 더 큰 속도 또는 값으로 절단된다. 이에 따라, 그 결과는 감염된 세포에서 prM의 양 또는 수준의 감소이다. 기능장애의 동의어는 "결함(defective)", 또는 이의 문법적 형태이다.
"향상된" 또는 이의 문법적 형태는 기초 또는 기준 수준 또는 메트릭(metric) 이상의 메트릭 또는 수준이다. 기초 수준은 다수의 단위를 샘플링하고 평균 값을 얻음으로써, 또는 문헌으로부터 유도된 집단 평균 값을 획득함으로써 결정될 수 있다. 구현예들에서, 향상된 수준은 대조 샘플에서 발견된 것보다 더 높은 임의의 수준이다. 이에 따라, 바이오검정, 화학 검정, 등에서, 예를 들어, 2개의 샘플, 즉, 향상된 메트릭에 민감한 실험 샘플 및 대조군은 나란히(side-by-side) 실행될 수 있으며, 이는 공지된 야생형, 정상, 비변형된, 비-돌연변이된 것 등의 예시적인 집단으로부터의 샘플일 수 있으며, 실험 샘플에서, 더 높은 메트릭, 예를 들어, 더 큰 생성물의 양, 더 빠른 동력학, 더 큰 생성물, 등이 나타난다. 구현예들에서, 기초 수준은 야생형 단위에서 발견된 것이다. 구현예들에서, 향상된은 증가된 효소 활성 수준을 포함한다. 구현예들에서, 향상된은 증가된 촉매 활성 수준을 포함한다. 구현예들에서, 향상된(enhanced)은 증가된 용해 활성 수준을 포함한다. 구현예들에서, 향상된은 퓨린에 의한 증가된 폴리펩티드 절단 수준을 포함한다. 구현예들에서, 향상된 퓨린 활성은 고려되는 돌연변이체로 감염된 세포로부터 및 야생형 바이러스로 감염된 세포로부터의 샘플에서 prM의 양을 비교함으로써 나타날 수 있다. 구현예들에서, 향상된 퓨린 활성은 돌연변이체 및 야생형과 비교하여 감소된 prM 수준 또는 증가된 pr 또는 M 수준에 의해 나타날 수 있다.
"변형(alteration)," 또는 이의 문법적 형태는 하나 이상의 잔기에서 야생형 아미노산 서열의 변화 또는 변경이다. 이에 따라, 변형된 폴리펩티드는 대립 유전자를 포함할 수 있다. 변화는 아미노산 치환, 결실 또는 삽입일 수 있으며, 이는 야생형 서열의 부위에서 둘 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 변형은 고려되는 기능장애 바이러스를 생성한다.
"스트레치(stretch)" 또는 이의 문법적 형태는 핵산의 보존적 뉴클레오티드, 또는 단백질의 보존적 아미노산을 의미한다. 핵산의 보존적 뉴클레오티드(뉴클레오티드의 스트레치)는 선형 올리고뉴클레오티드로서 중합된다. 단백질의 보존적 아미노산(아미노산의 스트레치)은 선형 올리고펩티드로서 중합된다.
"전파(propagation)," 또는 이의 문법적 형태는 바이러스가 상용성 숙주 세포를 감염시키고; 자손 바이러스를 생성하기 위해 그러한 감염된 세포에서 복제하고; 감염된 세포가 세포외 공간 내로 자손 바이러스를 방출시키는 과정을 포함한다. 동의어는 "재생하다(reproduce)," "복제하다(replicate)," 성장하다(grow)" 등을 포함한다.
"면역원성(immunogenic)," 또는 이의 문법적 형태는 숙주에서 면역 반응을 발생시키거나 이끌어내는 것을 포함한다. 이에 따라, 면역원성은 구현예들에서, 에피토프 또는 결정인자를 지니는 것을 포함한다. 구현예들에서, 예를 들어, 면역원성 조성물은 숙주 내에 도입될 때, 숙주 면역 시스템에 의해 그러한 에피토프 또는 그러한 결정 인자에 대한 면역 반응을 이끌어내는 에포토프 또는 결정인자를 갖는 조성물이다. 면역 반응은 숙주로부터 면역원성 조성물을 어느 정도 "제거"할 수 있는 반응으로서, 여기서, "제거하는"은 조성물을 실제로 파괴하는 것, 즉, 조성물의 변성 또는 소화; 조성물이 구조 내에 함유되어 조성물을 불활성이게 만들도록 조성물을 격리시키는 것; 조성물을 해독시키는 것; 조성물을 중화시키는 것; 조성물을 생물학적으로 불활성이게 만드는 것; 숙주에 대해 및 숙주에서 조성물을 안전하게 만드는 것; 등을 포함할 수 있다. 면역원성은 임의의 하나의 노출된 숙주에서 면역 보호를 의미하거나 보장하지 않는다. 면역 반응은 체액성, 세포형, 등, 또는 이들의 조합일 수 있다.
"인간 또는 포유동물 세포에서 복제하지 못한다," "인간 또는 포유동물 세포에서 전파하지 못한다," "인간 또는 포유동물 세포에서 성장하지 못한다," "인간 또는 포유동물 세포에서 재생되지 않는다," "인간 또는 포유동물 세포에서 성장-제한된다," "성장-제한된," "성장-결함," 이러한 구의 균등물, 및 이러한 구의 문법적 형태, 등은 본원에 기술된 바와 같이 동의어 또는 동의 용어 또는 구이고, 동일한 종, 균주, 세포주, 등의 야생형 아르보바이러스로 감염된 동일한 타입의 세포에 의해; 본원에 기술된 바와 같은, 비-기능장애 바이러스로 감염된 유사 세포에 의해; 또는 적합하고 허용 가능한 음성 대조군에 의해 생성된 자손 바이러스의 수준 또는 양과 비교하여, 4 log 이하, 5 log 이하, 6 log 이하, 7 log 이하, 8 log 이하, 9 log 이하의 자손 아르보바이러스를 생성하거나 자손 아르보바이러스를 생성하지 않는 고려되는 돌연변이 바이러스로 감염된 인간 또는 포유동물 세포를 포함한다.
"곤충 세포에서 복제하다," "곤충 세포에서 전파하다," "곤충 세포에서 성장하다," "곤충 세포에서 재생하다," "곤충 세포에서 성장-제한되지 않는다," "성장 결함이 아니다," "성장-제한되지 않는다," 그러한 구의 균등물, 그러한 구의 문법적 형태, 등은 본원에 기술된 바와 같이, 동의어이거나, 동의 용어 또는 구이고, 동일한 종, 균주, 세포주, 등의 야생형 아르보바이러스로 감염된 동일한 타입의 곤충 세포에 의해; 본원에 기술된 바와 같은, 비-기능장애 바이러스로 감염된 유사한 세포에 의해; 또는 적합하고 허용 가능한 음성 대조군에 의해 생성된 자손 바이러스의 수준 또는 양과 비교하여 대략 자손 아르보바이러스만큼 또는 그 이상 생성하는 고려되는 돌연변이 바이러스로 감염된 곤충 세포를 포함한다.
"약"은 예를 들어, 범위의 한계가 특정 값을 포함하고 특정 값보다 10% 미만이고 특정 값보다 10% 초과하는 경우에 그러한 특정 값에 대한 범위를 제공하는 오차 또는 편차에서 반영되는 변동성의 양이 존재하는 특정 값에 대한 근사치이다. 이에 따라, 본원에서 사용되는 바와 같이, 약 50을 언급하는 경우에, 이러한 값은 45 내지 55의 범위일 수 있는 것으로 이해된다. 동의 용어는 "본질적으로" 및 "실질적으로"를 포함한다.
"확장 가능한(scalable)," 또는 이의 문법적 형태는 예를 들어, 식품, 음료, 소비재, 산업 화학물질, 등의 상업적 제작을 위해 실행되는 것과 같은 더 큰 스케일 또는 표현으로 번역될 수 있는 벤치 또는 실험실 스케일에서 실행되는 방법이며, 여기서, 반응 용기는 수백 또는 수천 리터의 부피를 가질 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 맥락에서, 곤충 세포 배양물은 10, 100, 또는 1000 리터 이상의 부피, 양, 반응, 등에서 실행될 수 있다.
"야생형(wild-type)," 또는 이의 문법적 형태는 일반적으로 집단에서 가장 일반적인 또는 관련된 형태, 형질, 유전자, 단백질, 표현형, 등인 자연 발생 아르보바이러스에 관한 것이다. 구현예들에서, 동의어는 "타입" 또는 "참조," 아르보바이러스이다. 집단 형질은 단일 유전자좌의 하나 초과의 대립 유전자에 의해 또는 다원 유전자에 의해 결정될 수 있다. 이에 따라, 대립 유전자 또는 다원 유전자가 동일한 형질 또는 실질적으로 동일한 형질을 산출하기 때문에, 대립 유전자 또는 다원 유전자의 세트는 본원에서 균등물로서 고려된다. 야생형 아르보바이러스는 고려되는 변형된 아르보바이러스에서 존재하기 때문에 향상된 퓨린 절단을 야기시키는 기능장애 퓨린 부위를 포함하지 않는다. 구현예들에서, 본원에서, 고려되는 기능장애 퓨린 절단 부위를 포함하지 않는 정상 또는 야생형 아르보바이러스에 대한 고려되는 변형된 아르보바이러스의 성질을 나타내기 위해 비교된다. 구현예들에서, 고려되는 아르보바이러스는 곤충 세포에서의 성장과 같은, 참조 아르보바이러스에서의 그러한 성질과 정상적이거나 대략 동일한 성질을 갖는다. 예를 들어, 구현예들에서, 참조 DV는 혈청형 2, ATCC로부터 입수 가능한 뉴기니아 균주이다(수탁 번호 VR-1584). 이에 따라, 본원에서 DV prM에 대한 언급 및 이의 아미노산 넘버링은 VR-1584의 prM; 또는 돌연변이체 DV의 야생형 형태의 prM 및 이의 아미노산 넘버링에 대한 것일 수 있다. 구현예들에서, 참조 ZV는 수탁 번호 VR-1838로 ATCC로부터 입수 가능하다. 이에 따라, 본원에서 ZV prM에 대한 언급 및 이의 아미노산 넘버링은 VR-1838의 prM, 또는 돌연변이체 ZV의 야생형 형태의 것에 대한 것일 수 있다. 고려되는 아르보바이러스는 야생형 아르보바이러스와 관련하여, 곤충 세포에서 전파한다. 그러나, 본원의 아미노산의 넘버링과 관련하여, 집단에서의 고유 집단 변동, 다형성 또는 변동성으로 인하여, 하나의 균주, 세포주, 종, 등에서의 넘버링은 다른 균주, 세포주, 종, 등에서의 넘버링과 직접적으로 대응하지 않을 수 있다. 이에 따라, 본원의 넘버링은 자연 발생 변동으로 인해 세포주, 균주, 종, 등 내에서도 넘버링이 변할 수 있기 때문에 임의의 하나의 폴리펩티드, 절단 부위, 등의 위치에 대해 절대적인 것은 아니다. 이에 따라, 본원에서 사용되는 넘버링은 특정 세포, 바이러스, 등에 관련된 것이고, 본원에 제시된 것과 모든 아르보바이러스에서 동일한 넘버링을 갖는 모든 아르보바이러스의 절대적인 예시인 것으로 해석되어서는 안된다. 대신에, 다양한 특징은 부위를 식별하고 당업자가 설계 선택으로서 임의의 아르보바이러스로 청구된 주제를 실행할 수 있게 하기 위한 랜드마크를 제공한다. 예를 들어, pr 및 M의 경계, pr의 다운스트림 또는 카르복시 말단, M의 업스트림 또는 아미노 말단에서의 퓨린 공통 테트라펩티드는 단백질의 조작 및 변경을 배향시키기 위해 사용될 수 있는 랜드마크이다. 이에 따라, 일 구현예에서, 넘버링은 pr 및 M의 크기의 변동성이 존재하는 지의 여부를 결정하기 위해 테트라펩티드의 아미노산의 수를 고려하고, 존재하는 경우에, 아르보바이러스에서 본원에서 교시하는 것과 상이한 당업자에 의해 사용되는 것 간의 조정 또는 상관 관계는 적절한 참조 프레임을 제공하기 위해 만들어진다.
"prM," DV의 단백질 또는 폴리펩티드는 DV의 혈청형 1 내지 4에서 길이가 166개 아미노산을 가지고, pr 폴리펩티드 및 M 단백질을 수득하기 위해 퓨린에 의해 아미노산 91 이후에 절단된다. DV2의 NGC 균주의 야생형 prM 아미노산 서열은 FHLTTRNGEP HMIVSRQEKG KSLLFKTEDG VNMCTLMAMD LGELCEDTIT YNCPLLRQNE PEDIDCWCNS TSTWVTYGTC TTTGEHRREK RSVALVPHVG MGLETRTETW MSSEGAWKHA QRIETWILRH PGFTIMAAIL AYTIGTTYFQ RVLIFILLTA VAPSMT (서열번호 8)이다. 공지된 바와 같이, 자연 변이는 퓨린에 의한 prM 절단의 파괴 또는 향상 없이, 및 포유동물 세포에서 전파 감소 없이, 서열번호 8에 제공된 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 야생형 균주를 발견할 수 있다. 고려되는 변형된 서열번호 8은 향상된 퓨린 절단과 함께 존재하는 것이며, 곤충 세포에서 바이러스를 전파시키지만, 포유동물 세포에서 그러한 바이러스를 거의 전파시키지 않거나, 전혀 전파시키지 않는다.
"prM," ZV의 단백질 또는 폴리펩티드는 길이가 168개 아미노산이고, pr 폴리펩티드 및 M 단백질을 수득하기 위해 퓨린에 의해 아미노산 93 이후에 절단된다. 야생형 prM 아미노산 서열은 AEITRRGSAY YMYLDRSDAG KAISFATTLG VNKCHVQIMD LGHMCDATMS YECPMLDEGV EPDDVDCWCN TTSTWVVYGT CHHKKGEARR SRRAVTLPSH STRKLQTRSQ TWLESREYTK HLIKVENWIF RNPGFALVAV AIAWLLGSST SQKVIYLVMI LLIAPAYS (서열번호 9)이다. 공지된 바와 같이, 자연 변이는 퓨린에 의한 prM 절단의 파괴 또는 향상 없이, 및 포유동물 세포에서 전파 감소 없이, 서열번호 9에 제공된 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 야생형 균주를 발견할 수 있다. 고려되는 변형된 서열번호 9는 향상된 퓨린 절단과 함께 존재하는 것이며; 곤충 세포에서 바이러스를 전파하지 않지만, 포유동물 세포에서 그러한 바이러스를 전파시킨다.
본원에 사용되는 "퓨린 절단 부위," "퓨린 인식 부위," 및 "퓨린 인식 및 절단 부위"는 상호 교환 가능하고, 공지된 바와 같이 균등한 것이며, 일반적으로, 퓨린은 Arg-X-Lys/Arg-Arg(서열번호 16)의 공통 테트라펩티드를 인식하며, 여기서, X는 임의의 아미노산(또한, 그러한 테트라펩티드의 업스트림 및/또는 다운스트림에서의 서열은 퓨린 절단 부위를 포함할 수 있음)이고, 테트라펩티드의 다운스트림에서 및 이의 카르복시 말단 측면 상에서 펩티드를 절단한다. 일반적으로, 아르보바이러스에서, 퓨린 절단 부위는 전구체 폴리단백질에서의 2개의 폴리펩티드, 예를 들어, prM 및 전구체 E2(prE2)의 경계에 존재한다. 일부 아르보바이러스에서, 퓨린 절단 부위는 pr 및 M의 경계에서 일어난다. 상이한 게놈 조직화를 갖고 prM을 함유하지 않는 다른 아르보바이러스, 예를 들어, 일부 알파바이러스에서, 퓨린 절단 부위는 E3 및 E2의 경계에서 일어난다.
본원에서 사용되는 "X log 이하," "X log 이하," 또는 "X log 또는 더 적은"(여기서, X는 유리수임)은 바이러스 입자의 수를 기술하기 위한 로그 스케일에 관한 것이다. 공지된 바와 같이, 스케일은 비-선형이고, 10의 밑을 가진 크기를 기초로 한 것이다. log 스케일은 파라미터의 값의 큰 범위가 존재할 때 사용한다. 이에 따라, 4 log는 104의 2개의 값 간의 차이를 반영하며, 즉, 하나의 값은 다른 값보다 10,000 단위 더 적거나 더 크며, 5 log는 105의 2개의 값 간의 차이를 반영하며, 즉, 하나의 값은 다른 값보다 100,000 단위 더 적거나 더 큰 것, 등이다. "더 낮은" "미만" 또는 "더 적은"이라는 단어를 포함하는 구는 값에 있어서 더 낮거나, 수에 있어서 더 적은 양, 본원의 문맥에서, 더 적은 수의 바이러스 입자에 관한 것이다. 이에 따라, "4 log 이하"는 2개의 수치 간의 차이가 104, 104.5, 105, 등임을 의미하는데, 이는 하나의 샘플에서 생성된 바이러스 입자의 수가 다른 샘플보다 10,000개 더 적거나, 약 31,600개 더 적거나, 약 100,000개 더 적음을 의미하고, 본원의 맥락에서, 하나의 샘플이 다른 샘플보다 10,000 더 적은 바이러스 입자를 함유함을 의미한다.
본 발명의 초점은 포유동물 세포-특이적, 성장-결함 아르보바이러스를 생성시키기 위해 아르보바이러스 게놈을 조작하는 것으로서, 여기서, 이러한 아르보바이러스로 감염된 포유동물 세포는 성숙한 자손 바이러스를 방출시키지 않고, 예를 들어, M 및 E 단백질에 의해 발현된 결정인자와 같은 포유동물 숙주에 의해 인식될 수 있는 아르보바이러스 에피토프 및 결정인자를 계속 발현시킨다. 아르보바이러스에 대한 세포 및/또는 체액 반응은 포유동물 숙주에서 발생될 수 있다. 고려되는 아르보바이러스는 본질적으로 야생형 바이러스와 닮았고, 이에 따라, 야생형 아르보바이러스에서, 포유동물 숙주 면역 시스템에 아르보바이러스에서 발견될 수 있는 아르보바이러스 에피토프의 유니버스가 존재한다. 고려되는 아르보바이러스는 단순하게 숙주 포유동물 세포에서 복제하지 못할 수 있고, 이에 따라, 다른 숙주 포유동물 세포의 감염 및 숙주에서의 병인 또는 질병에 기여하지 못할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 아르보바이러스에 대한 감염된 숙주에 의해 발생된 항체 또는 면역 세포의 결정인자 또는 에피토프를 포함하는 대부분(전부가 아님) 구조 단백질, 또는 적어도, 대부분의 폴리펩티드를 포함하고 발현시키는, 결함 또는 기능장애 아르보바이러스에 관한 것이다. 이에 따라, 예를 들어, 플라비바이러스에 대하여, 대부분의 pr, M 및/또는 E 단백질이 발현되고 이에 의해 이와 같이 야생형 바이러스의 면역원성 부위를 포함하는 것이 바람직하다. C 단백질은 숙주 면역 시스템에 대한 더 적은 타겟일 수 있지만, 존재할 수 있다.
모든 공지된 아르보바이러스는 숙주 세포로부터의 적절한 바이러스 성숙 및 방출을 위한 전구체 폴리단백질의 퓨린 절단, 예를 들어, 감염된 세포로부터 자손 바이러스의 적절한 바이러스 성숙 및 최종 방출을 위한, 일부 알파바이러스에서 prE2의 E3 및 E2로의 절단, 및 일부 플라비바이러스에서 prM의 pr 및 M으로의 절단을 필요로 한다.
고려되는 돌연변이 아르보바이러스는 예를 들어, prE2 또는 prM에서 변형된 또는 기능장애 퓨린 절단 부위, 곤충 세포에서 계속 복제하지만 포유동물(물론, 인간을 포함함) 세포에서 더 이상 복제하지 않거나 잘 복제하지 않는 바이러스를 생성하는 예를 들어, prE2 또는 prM의, 퓨린에 의한 향상된 절단을 야기시키는 퓨린 공통 절단 부위로부터의 업스트림 및/또는 다운스트림에서의 변경을 포함한다. 이에 따라, 아르보바이러스에서 예를 들어, prE2 또는 prM 퓨린 절단 부위에서 및/또는 이의 주변의 변경은 곤충 세포에서 계속 성장하지만, 인간 또는 포유동물 세포에서 더 이상 성장하지 않거나 잘 성장하지 않는 성장-제한된 바이러스를 수득하며, 여기서, 성장은 자손 바이러스가 감염된 세포에 의해 방출됨을 지시한다.
일반적으로, 골지 장비에서 초기 플라비바이러스 입자의 성숙 동안, 미성숙 입자는 prM 및 E 단백질의 트라이머를 포함하는 스파이크(spike)를 나타내며, 이는 골지를 통과하는 동안, 가능하게, pH의 변화로 인해, 입자 상에 매끄러운 표면을 형성하도록 재배열된다. 스파이크의 그러한 재배열 또는 변형은 prM의 퓨린 절단 부위를 노출시킨다. prM은 퓨린에 의해 절단되며, 아마도 골지에서의 pH를 기초로 하여, pr 단편 중 일부는 입자와 결합된 채로 유지된다. pr 단편은 막 융합을 방지하는 것으로 사료된다. 초기 입자가 골지로부터 세포외 환경으로 방출될 때, pr은 세포로부터 방출을 위해 세포막과 융합시킬 수 있는 성숙한 입자를 형성하기 위해 초기 입자로부터 방출된다. 일부 발달 중인 입자는 성숙하지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 바이러스 단백질은 세포내 막과 결합되고, 세포 표면에서 바이러스 단백질이 발현되는 세포막 내로의 도입을 위해 예정될 수 있다. 바이러스 입자 및 성분은 세포 사망 및 용해 시의 환경으로 방출될 수 있다.
이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, prM의 향상된 절단을 가능하게 하는 prM에서 변형된 퓨린 절단 부위를 포함하는 고려되는 돌연변이 바이러스 게놈은, 발달 중인 바이러스 입자가 가능하게, 상이한 pH 조건 하에서 골지 장비에 진입하기 전에 prM을 절단하도록 유도할 수 있어서, 입자가 골지에 진입하고 잔류하기 때문에 pr이 입자 표면과 결합되지 않게 할 수 있다. 이에 따라, 막 융합을 막기 위한 pr 없이, 바이러스 입자는 골지를 통과하는 동안 적절하게 성숙하는 것을 배제하고, 골지 내에 트랩핑된다. prM을 골지 내로 진입 전에 조기에 절단시킴으로써, 고려되는 아르보바이러스 입자는 pr을 함유하지 않고, 이에 따라, 골지에서 적절하게 처리되지 못할 수 있으며, 그 결과, 바이러스 입자는 골지 막에 결합하고, 골지 막에 융합하고, 이러한 막으로부터 방출되지 않고, 이에 따라, 세포로부터 방출할 수 없다.
그러나, 그러한 공정은 예를 들어, prE2 또는 prM의 퓨린 절단의 타이밍 및/또는 효능이 숙주 곤충 세포로부터 적절한 아르보바이러스 입자 성숙 및 방출과 관련이 없거나 배타적이지 않은 곤충 세포에서 변형되지 않는다. 이에 따라, 감염된 곤충 세포는 야생형 바이러스로 감염된 곤충 세포에서 발견된 것과 유사한, 이와 동일한 또는 이보다 큰 수준으로 자손 아르보바이러스를 생성시킨다.
고려되는 아르보바이러스의 퓨린 공통 테트라펩티드(R-X-K/R-R (서열번호 16))는 예를 들어, E3 및 E2의 경계에, 및 pr 폴리펩티드 및 M 단백질의 시점에 위치된다. 테트라펩티드의 아미노산은 예를 들어, 제2 또는 X 부위로서 Arg를 함유하기 위해 테트라펩티드를 작제하는 것과 같은, 공지된 방법을 실행하여, 그러한 아미노산 등을 엔코딩하는 핵산의 아미노산 치환, 부위 지향 돌연변이유발에 의해 변형된다. 변형된 퓨린 부위는 예를 들어, 공지된 방법을 실행시키는 상동 재조합에 의해 예를 들어, 전장 핵산 내에 배치된다. 핵산 조작은 이후에, 본원에 교시된 바와 같고 당해 분야에 공지된 방법을 실행하는 변형된 퓨린 절단 코딩 서열을 포함하는 바이러스 RNA를 형성하기 위해 전사되는 cDNA에 대해 이루어질 수 있다. 바이러스 핵산은 예를 들어, 바이러스 RNA의 적합한 숙주 세포 내로의 전기천공에 의해, 입자 내에 패키징될 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 배양되고, 바이러스 생성에 대해 모니터링되며, 변형된 퓨린 절단 부위 코딩 영역을 포함하는 RNA를 갖는 바이러스 입자가 수득된다. DNA, RNA, 벡터, 숙주 세포, 등이 공지되어 있으며, 일부 시약이 상업적으로 입수 가능하다[또한, 예를 들어, Polo et al., Zeng et al., Khromykh et al. J Virol 75(10)4633-4640, 2001; Gehrke et al., J Virol 77(6)8924-8933, 2003; 및 Shustov et al., J Virol 81(21)11737-11748, 2007 참조]. 이후에, 바이러스 입자는 적합한 세포를 감염시키기 위해 사용되고, 당해 분야에 공지된 바와 같이 배양된다. 자손 바이러스의 생성은 변형이 곤충 세포가 아닌 포유동물 세포에서 바이러스 복제에 영향을 미치는 지의 여부 및 2가지 타입의 세포에서의 전파가 어느 정도 변형되는 지를 결정하기 위해 본원에 교시된 방법을 이용하여 모니터링된다.
본 발명은 부분적으로, 일부가 prM 폴리단백질을 포함하는 플라비바이러스에 관한 것이다.
구현예들에서, 본 발명은 DV(예를 들어, 혈청형 1 내지 5 중 임의의 하나)에 관한 것이다.
DV 게놈은 단일 선형, 단일 가닥, + 센스 RNA로 이루어진다. 전체 게놈은 10 내지 11 kb의 범위일 수 있다. 3' 폴리아데닐화가 존재하지 않는다. 5' 단부는 메틸화된 캡을 갖는다. DV 게놈은 숙주 리보솜에 대한 번역 개시의 부위를 제공하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하지 않는다. 대신에, DV는 단백질 합성을 개시하는 리보솜 스캐닝을 사용한다.
뎅기 비리온은 직경이 40 내지 65 nm의 구체이다. 지질 피막 아래에, 직경이 대략 25 내지 30 nm인 정20면체 캡시드 외피가 존재한다.
뎅기열(dengue fever)은 이상 발열, 두통, 신체의 다양한 부분에서의 통증, 출산, 발진, 림프절병증 및 백혈구 감소증에 의해 특징되는 급성 전염병이다[Holstead, 1980, Immunological parameters of togavirus disease syndromes, p. 107-173, in Schlesinger (ed.), "The Togaviruses," Academic Press, Inc., NY; and Sabin, 1959, Dengue, p. 361-373, in Rivers & Horsfall (eds.), "Viral and Rickettsial Infections of Man," JB Lippincott Co., Philadelphia]. DV는 모기에 의해 운반된다. 하나의 뎅기 혈청형으로의 감염은 그러한 하위타입에 평생 면역을 제공하지만, 다른 혈청형에 교차 보호 면역을 제공하지 못할 수 있다.
뎅기 출혈열(DHF)은 지혈의 이상 및 혈관 침투성 증가에 의해 특징되는 중증 열성 질병으로서, 이는 일부 경우에, 저혈량 쇼크 증후군, 뎅기열 쇼크 증후군(DSS)을 초래한다[WHO: 1975. Technical Guides for Diagnosis, Treatment, Surveillance, Prevention and Control of Dengue Hemorrhagic Fever, Geneva, CH]. DHF/DSS의 메커니즘은 상이한 경우에 달라질 수 있다. DHF/DSS에 기여하는 주요 인자는 바이러스 독성, 환자 건강 상태 및 상이한 혈청형 DV의 2차 감염을 포함한다.
현재, 5개의 혈청형 DV, 1, 2, 3, 4 및 5가 존재한다. 하나의 혈청형에 대한 면역은 일반적으로, 다른 혈청형에 대한 면역을 부여하지 않는다.
혼동하여, 인간은 항상 동일하게 개개 혈청형에 반응하지 않는다. 이에 따라, DV의 적어도 2개의 혈청형으로 동시에 감염된 사람은 단지 하나의 혈청형에 대해 면역 반응을 마운팅할 수 있을 것이다. 또한, 일반적으로, 1차 또는 이전 감염과는 다른 혈청형의, 또한, 1차 또는 이전 감염이 양성, 경증 또는 무증상일 때 후속 감염은 더욱 증증의 질병 및 병인을 초래할 수 있다.
혈청형 우세, 선택성, 또는 간섭에 대한 이유는 알려져 있지 않다. 숙주 세포 또는 항원 제시로부터 인시튜로, 바이러스 복제, 성장, 성숙 및 방출이 특정 혈청형에 숙주 면역 반응을 유도할 수 있다는 것일 수 있다.
임의의 사건에서, 예측 가능한 것보다 낮은 숙주 반응, 혈청형 간섭 및 무증상 감염은 효과적인 다가 백신을 개발하는데 많은 장애를 제공한다.
현재 다가 생백신은, 심지어 백신에서 각 혈청형의 상대적인 양이 기울어진 면역 반응을 보상하기 위한 시도에서 변경될 때에도, 모든 혈청형에 대해 동등한 면역을 생성시키는데 무능하다.
고려되는 주제의 실행에서, 다양한 DV 게놈은 공통 테트라펩티드의 업스트림에서, 예를 들어, 공통, 즉, 아미노산 88 내지 91에 인접한 스트레치의 업스트림에서의 8개의 아미노산에서; 공통 테트라펩티드의 다운스트림에서, 예를 들어, 아미노산 88 내지 91의 공통, 즉, 아미노산 92 내지 130(즉, prM을 포함하는 아미노산 80 내지 130 내)에 인접한 스트레치의 다운스트림에서의 39개의 아미노산에서, 또는 이의 조합에서, prM 퓨린 절단 부위의 Glu 잔기에서 상이한 아미노산 치환으로 작제화되었다. 아미노산 변화(들)는 prM의 퓨린 절단을 향상시킨다. 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 복제가 일어나며, 발현은 바이러스 입자의 생성과 함께 일어난다. 그러나, 숙주 세포 밖으로 이동하는 것으로 예정된 성숙한 입자는 얻어지지 않았다. 이에 따라, 고려되는 입자는 포유동물 세포를 1회 감염시키며, 돌연변이 바이러스 게놈은 포유동물 숙주 세포에서 복제되고 발현되지만, 성숙한 자손 바이러스 입자는 감염된 숙주 포유동물 또는 인간 세포에 의해 방출되지 않는다.
구현예들에서, prM 단백질에서의 DV 퓨린 테트라펩티드 절단 부위, NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH (서열번호 1)(여기서, 절단은 Lys-Arg 잔기로부터 다운스트림에서 일어남)는 퓨린 절단을 향상시키기 위해 Glu 부위에서 변형된다.
구현예들에서, Glu는 임의의 아미노산에 의해 대체된다. 대체 아미노산은 비-산성, 비-중성 아미노산, 예를 들어, Gln, Asn, Gly, Lys, Arg, His, Thr, Ser, Tyr, Met 또는 Cys일 수 있다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 황을 함유하지 않는다. 이에 따라, 대체 아미노산은 Met 또는 Cys 이외의 비-산성, 비-중성 아미노산이다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 R 하이드록실 기를 함유하지 않는다. 이에 따라, 구현예들에서, 대체 아미노산은 Tyr, Ser 또는 Thr이 아니다. 구현예들에서, 대체 돌연변이 아미노산은 염기성 아미노산이다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 Lys, Arg 또는 His이다. 구현예들에서, 대체 아미노산은 Arg이다.
구현예들에서, 테트라펩티드 공통의 업스트림에서의 아미노산이 변형된다. 예를 들어, 퓨린 절단 부위의 공통(또는 아미노 말단 측면)의 바로 업스트림에서의 8개의 아미노산 스트레치에서의 아미노산은 prM의 퓨린 절단을 향상시키기 위해 변형된다("변형된 업스트림 부위"). 이에 따라, 변형은 prM 폴리펩티드의 아미노산 80 내지 87에서 일어날 수 있다.
구현예들에서, 테트라펩티드 공통의 다운스트림에서의 아미노산이 변형된다. 예를 들어, 퓨린 절단 부위의 공통(또는 카르복시 말단 측면)의 바로 다운스트림에서의 39개의 아미노산 스트레치에서의 아미노산은 prM의 퓨린 절단을 향상시키기 위해 변형된다("변형된 다운스트림 부위"). 변형은 M 폴리펩티드의 아미노산 92 내지 130에서 일어날 수 있다.
고려되는 DV는 (1) 변형된 퓨린 테트라펩티드 절단 부위; (2) 변형된 업스트림 부위; 및 (3) 변형된 다운스트림 부위 중 적어도 하나를 포함한다. 고려되는 DV는 (1), (2) 및 (3) 중 임의의 2개의 조합을 포함할 수 있다. 고려되는 DV는 모두 3가지 변형을 포함할 수 있다.
구현예들에서, 아르보바이러스는 ZV이며, 이는 prM 폴리단백질을 포함한다.
ZV 게놈은 10,794개의 염기의 단일, 단일 가닥, 양성 센스 RNA로 이루어진다[일부 단리물은 상이한 크기를 가짐[예를 들어, Baronti et al., Genome Announc 2(3)1-2, 2014]]. 구조 및 비구조 유전자 이외에, 3' 및 5' 비코딩 말단이 존재한다.
ZV에서 작은 수준의 다형성이 존재한다. 예를 들어, 적어도 2개의 하위타입, 즉, 아프리카 혈통의 바이러스 및 아시아/남아메리카 혈통의 바이러스가 인식되어 있다. 2개의 혈통은 혈청학적으로 구별될 수 있으며, 즉, 외막 단백질에서 변화가 있을 수 있다.
지카 열의 증상은 열, 적안, 관절 통증, 두통 및 반구진 발진을 포함하고, 일반적으로, 7일 미만 지속된다. 초기 감염이 정상 성인에 대해 치명적인 것으로 교시되어 있지 않지만, 임신 중 감염은 소두증과 같은, 발달 중인 배아 및/또는 태어에서 기형 및 이상을 유발시킬 수 있다. 성인에서의 감염은 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)과 관련이 있다.
ZV는 주로 모기-매개이다. 2015년에 브라질에서 지카의 대규모 발생 후에, ZV는 라틴 아메리카 및 카르브해를 통해, 및 현재 미국으로 확산되었다.
ZV 수명 사이클은 숙주 세포의 표면에 비리온 부착, 및 수용체-매개 엔도시토시스에 의한 세포의 후속 진입으로 시작된다. 현재 이해되는 바와 같이, 에도솜 소포의 산성화는 비리온에서의 형태적 변화, 바이러스 및 세포막의 융합, 및 입자 분해를 유발시킨다. 게놈이 세포질 내로 방출된 직후에, 양성-센스 RNA는 바이러스 및 숙주 프로테아제에 의해 하기 10개의 유전자 산물로 처리되는 단일 폴리단백질로 번역된다: 3개의 구조 단백질, 코어 단백질 (C), 전막 단백질(prM) 및 외막 단백질 (E), 및 7개의 비구조 (NS) 단백질, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5.
ZV의 퓨린 절단 부위는 prM의 아미노산 93 이후에 위치된다. 구현예들에서, 퓨린 테트라펩티드 절단 부위를 포함하고 이의 업스트림에서의 prM 단백질 서열, His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/(서열번호 2)(여기서, 절단은 말단 Arg 이후에 일어나고, 슬래셔(slash)로 나타내며, 여기서, 세린 잔기는 (테트라펩티드 부위, Arg-Ser-Arg-Arg(서열번호 10)의) Arg에 의해 대체됨))은 퓨린 절단을 향상시키기 위해 5개의 아르기닌 잔기의 서열을 제공한다. 또한, 업스트림 스트레치의 글루탐산 잔기는 퓨린 절단을 향상시키기 위해, 예를 들어, 히스티딘으로 변형될 수 있다. 업스트림 스트레치에서의 잔기의 다른 변형은 퓨린 절단을 향상시킨다. 테트라펩티드의 다운스트림에서의 변형은 퓨린 절단을 향상시킨다. 예를 들어, 변형은 테트라펩티드 향상 퓨린 절단의 다운스트림에서의 26개의 아미노산 스트레치 중 임의의 것 또는 모두에 대한 것일 수 있다.
향상된 퓨린 활성은 (1) 퓨린 절단 부위의 업스트림에서의 하나 이상의 아미노산, 예를 들어, ZV의 prM 폴리펩티드의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기 82에서 시작하는 8개의 잔기 서열(즉, prM의 아미노산 잔기 82 내지 89)에 대한 변형; (2) 퓨린 절단 부위의 변형; 및 (3) 퓨린 절단 부위의 다운스ㅌ림에서의(아미노산 94 및 하향으로부터의) 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어, 퓨린 절단 부위로부터 다운스트림에서의 26개의 잔기 서열의 변형 중 하나 이상에 의해 얻어진다. (1), (2) 및 (3)의 임의의 조합이 존재할 수 있다.
황열병 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 리프트 밸리열 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 말 뇌증 바이러스, 콜로라도 진드기 열 바이러스, 치쿤구니야 바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스 및 다른 아르보바이러스에 대해, 퓨린 공통 테트라펩티드 인식 부위는 공지된 공통 퓨린 인식 서열을 기초로 하여 위치되며, 아미노산 치환은 포유동물 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 저조하게 전파하는 돌연변이체를 식별하기 위해 이에 대해 이루어진다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 공통 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어질 수 있다.
세포주 및 동물에서 바이러스의 제조, 성장 및 유지가 공지되어 있다. 분자 기술을 이용하여 코딩 서열을 변형시킴으로써 아르보바이러스 돌연변이체를 제조하는 것은 공지되어 있다. 세포에서 바이러스의 성장, 세포로부터 자손 바이러스의 생성을 결정하기 위한 다양한 시험 및 본 발명의 실행에서 사용되는 다른 검정은 공지되어 있으며, 이의 선택은 설계 선택이다.
본 발명의 다른 목적은 고려되는 조성물의 면역원성 아르보바이러스를 생성하기 위한 확장 가능한 시스템을 개발하는 것이다. 그러한 목적은 곤충 세포주, 예를 들어, 절지동물 세포주, 예를 들어, 진드기 또는 모기 세포주에서 퓨린에 의해 향상된 수준으로 절단되는 기능장애 퓨린 절단 부위를 발현시키는 고려되는 아르보바이러스를 생성시킴으로써 달성되었으며 여기서, 곤충 세포에 의한 바이러스의 대량 생성을 위한 물질 및 방법은 공지되어 있고 입수 가능하다. 절지동물 세포주, 예를 들어, 누에 세포주 및 모기 세포주가 상업적으로 입수 가능하다.
고려되는 아르보바이러스는 곤충 세포에서 장애 없이 성장한다. 이에 따라, 기능장애 퓨린 절단 부위를 지니는 고려되는 아르보바이러스는 성장하고, 복제하고, 성숙하고, 숙주 곤충 세포에 의해 환경으로 야생형 아르보바이러스와 대략 동일한 정도 또는 동일한 수준으로 방출될 수 있다. 이에 따라, 고려되는 아르보바이러스는 자손 바이러스를, 곤충 세포에서 고려되는 기능장애 퓨린 절단 부위를 포함하지 않는 아르보바이러스와 동일한 정도로 또는 그보다 더 큰 수준으로 생성할 수 있다.
자손 바이러스 생성(또는 전파)의 정도는 예를 들어, 당해 분야에 공지되고 본원에 교시된 바와 같이, 플라크 검정 또는 헤마글루티닌 검정에서 검정될 수 있다. 바이러스 생성을 평가하기 위한 용이하고 민감한 방법은 문헌[Drayman & Oppenheim, "Rapid Titration of Viruses by Flow Cytometry," Curr Prot Cell Biol 26.11.1-26.11.7, 2011]에 기술된 바와 같이, 유세포 분석기에서 형광 표지된 세포를 카운팅하는 것이다. 이에 따라, 연속 희석된 감염된 세포는 필요한 경우에 분리되면서, 수확되며, 세포는 수집되고, 고정되고 바이러스 단백질에 대해 유도된 적어도 하나의 Ab 및 형광 표지된 적어도 하나의 Ab를 갖는 하나 이상의 항체 시약에 노출되며, 이후에, 예를 들어, 적어도 약 10,000개의 세포는 그러한 바이러스 단백질을 발현시키는 형광 표지된 세포의 수를 나타내기 위해 유세포 분석기에 의해 판독된다. 이에 따라, 고려되는 아르보바이러스는 C6/36 세포(ATCC 수탁번호 CRL-1660)에서 참조 아르보바이러스(예를 들어, DV의 경우, 혈청형 2, 뉴기니 균주 ATCC No. VR-1584)에 의해 또는 향상된 퓨린 활성을 포함하거나 향상된 퓨린 절단 또는 prM을 나타내는 고려되는 돌연변이 바이러스를 포함하지 않는 동일한 균주 또는 세포주의 야생형 바이러스에 의해 생성된 자손 바이러스의 양과 비교하여 대략 동일한 수준 또는 양 또는 더 많은 자손 바이러스를 생성시킬 수 있다.
고려되는 아르보바이러스는 포유동물 세포에서 적절하게 성숙하지 않으며, 입자는 숙주 포유동물 세포에 의해 방출되지 않고(또는 전파되지 않고), 미성숙 입자는 숙주 포유동물 세포 내에서 트랩핑되고 숙주 포유동물 세포에 축적된다. 이에 따라, 고려되는 아르보바이러스는 인간 또는 포유동물 세포에서 자손 바이러스를 거의 생성하지 못하거나 전혀 생성하지 못한다. 고려되는 아르보바이러스는 야생형 아르보바이러스와 비교하여, 더 적은 자손 바이러스, 예를 들어, HT1080 세포(ATCC 수탁번호 CCL-121)를 사용할 때, 예를 들어, 생성된 자손의 양과 비교하여 4 log 이하, 5 log 이하, 6 log 이하, 7 log 이하, 8 log 이하, 9 log 이하를 생성시키거나 자손을 생성시키지 않는다.
포유동물 세포에서 전파하지 않는 고려되는 돌연변이 바이러스는 질병 또는 병인이 최소화되거나 방지되기 때문에 요망된다. 그러나, 자손 바이러스의 매우 적은 방출 내지 방출되지 않음은 본질적이거나 필수적이지 않는다. 야생형 바이러스로 감염된 유사한 세포와 비교하여 예를 들어, 4 log 이하, 5 log 이하, 6 log 이하, 또는 그 미만의 자손 바이러스를 생성시키는 기능장애 바이러스는, 숙주 면역 시스템이 궁극적으로, 바이러스 및 바이러스를 발현시키는 세포를 제거할 것이기 때문에 적은 또는 소량의 자손 바이러스의 방출에도 불구하고 면원원으로서 사용될 수 있다.
고려되는 변형된 및 기능장애 퓨린 부위를 포함하는 바이러스는 감염성을 나타내지만, 포유동물 세포의 감염으로부터 감염성의 자손 비리온을 생성시키지 못할 수 있거나 생성시키지 못한다. 이에 따라, 비-복제 입자는 인간 세포와 같은 숙주 포유동물 세포를 감염시키지만 그러한 감염을 야기시키는 자손 바이러스 입자를 생산하거나 방출시키지 못하는 것이다. 그러나, 그러한 감염된 포유동물 숙주 세포는 감염된 세포 중에 및 감염된 세포 상에서 아르보바이러스 에피토프를 발현시킨다.
고려되는 결함 바이러스의 독특한 특징은 효과적이고 안전한 아르보바이러스 면역원성 조성물에 대한 소스를 제공하며, 대량의 바이러스는 곤충 세포에서 고려되는 바이러스를 비용 효과적으로 성장시킴으로써 얻어질 수 있다. 고려되는 기능장애 바이러스는 동일한 타입의 곤충 세포에 감염될 때, 참조 바이러스와 대략 동일한 양의 자손 바이러스를 생성할 수 있다. 구현예들에서, 고려되는 기능장애 바이러스는 그러한 곤충 세포 타입에 감염된 참조 바이러스보다 더 많은 바이러스를 곤충 세포로부터 생성한다. 구현예들에서, 고려되는 기능장애 바이러스는 참조 바이러스보다 적은 바이러스를 생성한다. 고도의 면역원성 기능장애 바이러스 균주는 아르보바이러스의 천연 감염의 과정과 유사하고, 포유동물 숙주가 병인이 없거나 최소 병인을 갖는 오래 지속하고 광범위한 아르보바이러스 면역을 발생시키고 생성시킬 수 있게 한다. 이에 따라, 고려되는 변형된 아르보바이러스는 야생형 prM, M 및 E 단백질, 및 아마도, C에 의해 발현된 에피토프 뿐만 아니라 야생형 아르보바이러스 중 다수 또는 모두를 발현시키기 위해 유전자 물질을 함유하는 것이다.
고려되는 아르보바이러스는 적절한 적정 후에 모두는 아니지만 다수의 감수성 세포를 감염시킬 수 있다. 감염성 정도는 표준 및 공지된 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 6-웰 접시에서의 베로 세포는 일련 희석으로 아르보바이러스로 감염되며, 세포는 로커 플랫폼에서 37℃에서 교반된다. 세포 배양 유체는 48시간에 수집된다. 배양 배지로 방출된 바이러스의 수는 본원에 교시된 방법과 같은 공지된 방법을 실행하여 결정될 수 있다.
일부 정제된 아르보바이러스 입자를 제조하기 위해, 예를 들어, 배양 유체는 예를 들어, 4℃에서 15분 동안 마이크로원심분리기에서 16,000 x g에서의 원심분리에 의해 정화되며, 입자는 Sorvall OTD55B 원심분리기의 AH650 로터(rotor)에서 4℃에서 2시간 동안 40,000 rpm에서의 초원심분리에 의해 상청액 유체로부터 펠렛화된다. 펠렛은 50 ㎕의 포스페이트-완충 염수(phosphate-buffered saline; PBS)에서 재현탁되고, 4℃에서 밤새 용해된다.
아르보바이러스의 역가를 결정하기 위해, 예를 들어, 8-웰 챔버 슬라이드 상의 새끼 햄스터 신장(baby hamster kidney; BHK) 21 세포는 37℃에서 2시간 동안 50 ㎕의 세포 배양 유체 또는 재현탁된 펠렛화된 물질의 일련 10배 희석액으로 감염된다. 이후에, 유체는 2% 우태아혈청이 보충된 1 ml의 둘베코 최소 필수 배지로 대체된다. 세포는 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션되고, 이후에, 아르보바이러스-특이적 Ab 또는 mAb(상업적으로 입수 가능하거나 당해 분야에 공지된 바와 같이 제조됨), 하기에 기술되는 HMAF 또는 필수 특이성을 갖는 폴리클로날 항혈청, 검출 가능한 리포터를 수반하는 바이러스-특이적 시약과 샌드위치를 형성하는 시약과 함께, 그리고 적절한 대조군을 사용하는 면역형광(immunofluorescence; IF) 분석으로 처리된다.
수확된 배양 유체(CF)에 존재하는 바이러스의 역가(밀리리터 당 감염성 단위(IU))는 또한, 예를 들어, 레수스(rhesus) 신장 상피 세포(예를 들어, LLC-MK2 (ATCC) 세포)를 감염시키고 이후에 아르보바이러스-특이적 시약 및 표지 시약, 예를 들어, mAb를 포함하는 과다면역 마우스 복수(hyperimmune mouse ascitic fluid; HMAF)로 간접 면역형광 분석(IF)을 수행함으로써 결정되었다.
체액성 항체 및 세포 면역 반응은 DV 감염으로부터의 보호 및 회복에 관여된다. 고려되는 아르보바이러스는 면역 반응의 두 아암(arm) 모두를 유도한다. 입자는 prM, M 및/또는 E 단백질을 포함하며, 이에 따라, 관심 입자는 광범위한 면역원이고, 야생형 바이러스로의 감염을 시뮬레이션한다. 그러나, 고려되는 입자는 포유동물 숙주 세포를 감염시키며, 그러한 세포에서, 추가적인 prM, M 및/또는 E 단백질은 숙주 세포에서 또는 숙주 세포에 의해 발현된다. prM, M 및/또는 E 단백질은 그러한 세포로부터 방출되어, 숙주에 대한 추가적인 항원성 자극을 제공할 수 있거나, 숙주에 대한 항원성 자극의 또 다른 모드를 제공하기 위해 감염된 숙주 세포 표면에서 발현될 수 있다. 고려되는 아르보바이러스는 NS1과 같은 비구조 단백질을 선택적으로 발현시킬 수 있다. 이전 보고서에서는 그러한 NS 바이러스 단백질이 보호 면역 반응을 유도할 수 있다는 것을 나타내었다[Heinz & Roehrig, 1990, in, "Immunochemistry of Viruses, Vol II," Amsterdam-NY-Oxford, Elsevier, p. 289 305; Heinz, 1986, Adv Virus Res 31:103-168; Bray & Lai, 1991, Virol, 185:505-508; Henchal et al., 1988, J Gen Virol 69:2101 2107; 및 Schlesinger et al., 1986, J Virol 60:1153 1155].
고려되는 약제 조성물의 효능을 시험하기 위한 적합한 모델은 아르보바이러스 감염을 시뮬레이션하는 동물 모델을 포함한다. 예를 들어, 마우스의 면역화 및 아르보바이러스로의 후속 접종을 위해 사용되는 프로토콜이 기술되었다[Bray et al., 1989, J Virol 63:2853-2856]. 간단하게, 각 그룹에 대해 10마리의 마우스에서, 암컷 BALB/c 마우스는 3주령(1일)에서 및 다시 14일에 DV와 같은 바이러스의 복강내(ip) 접종에 의해 면역화된다. 대조 동물은 포스페이트-완충 염수(PBS)을 수용한다. 모든 동물은 0일 및 21일에 출혈된다. DV의 경우에, 마우스는 22일에 50% 치사 용량(LD50)의 100배의 바이러스의 뇌내 주사에 의해 접종된다. 접종 후에, 마우스는 병인 징후에 대해 21일 동안 관찰되며, 증상(뇌염, 마비 또는 사망)을 갖는 마우스는 매일 기록된다. 혈청은 또한, 접종전 혈청과 비교하기 위해 생존체로부터 수집된다.
각 바이러스의 용량이 결정된다. 개개 아르보바이러스 단백질에 대한 면역화된 마우스의 혈청반응은 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 표지키트 및 항체를 사용하여 표지된 아르보바이러스 항원의 ELISA 또는 방사선면역침전에 의해 분석된다. 플라크 감소 검정은 마우스 혈청에서 아르보바이러스 특이적 중화 항체의 역가를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 대략 0.5 ml의 검정에서 사용되는 혈청 샘플은 먼저 56℃에서 30분 동안 인큐베이션에 의해 열 비활성화된다. 1:10 희석에서 시작하여 0.3 ml의 최종 부피의 4배 희석의 혈청은 희석제로서 2% 열 비활성화된 우태아혈청(FBS)을 갖는 배지 M199를 사용하여 제조된다. 각 0.3 ml 분취액의 희석된 혈청에 동일한 부피의 150 내지 180개의 플라크-형성 단위(PFU)의 바이러스를 함유한 배지가 첨가된다. 바이러스와 혈청이 혼합되고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션된다. 각 검정에서, 예를 들어, 2가지 희석에서 무혈청 대조군 및 각 아르보바이러스 타입-특이적 Ab로 이루어진 대조군이 또한, 포함된다. 바이러스/혈청 및 대조군 혼합물은 0.2 ml/웰로 Costar 6-웰 플레이트(Corning Inc., Corning, NY)에서 예를 들어, LLC-MK2의 컨플루언트 단일층 상에 플레이팅된다. 각 샘플에 대해 중복 웰이 감염된다. 바이러스 흡착은 15분 마다 손으로 흔들어주면서 실온에서 1시간 동안 수행된다. 이후에, 웰은 6 ml/웰로 필수 비타민 및 아미노산(Invitrogen)이 첨가된 10% FES 및 Earle' 균형 염 용액 중 1% 아가로오스(SeaKem LE; BioWhittaker, Rockland, ME)를 함유한 배지로 입혀진다. 플레이트는 5% CO2 중, 37℃에서 7일 동안 인큐베이션된다. 이후에, 웰은 1% 아가로오스를 함유한 4% 중성 적색 용액(96 ml의 PBS에 4 ml의 중성 적색 용액을 첨가함)으로 입혀진다. 플레이트는 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션된다. 플라크 카운트의 평균은 플라크 수 수준의 50% 감소를 계산하기 위해 사용된다.
구현예들에서, 고려되는 바이러스 조성물은 다가, 즉, 2가, 3가, 4가, 등인 것이고, 일ㅂ란적으로 하나의 바이러스의 복수의 아르보바이러스 혈청형에 대한 숙주를 면역시지만 예를 들어, 복수의 고려되는 돌연변이 바이러스를 포함하는 복수의 바이러스 종으로부터의 항원을 포함할 수 있는 것이다. 하나 이상의 다른 혈청형을 희생하여 하나 의 혈청형의 간섭 또는 우세가 관찰되지 않는다. 그러한 것은 면역원성이 바이러스 생성 및 신규한 바이러스의 일정한 복제에 의존적이지 않기 때문이다.
고려되는 아르보바이러스는 면역학 분야에서 공지된 바와 같이, 투여가 면역원으로서 역할을 하는데 적합한 약제 조성물 내에 도입된다. 이러한 조성물은 통상적으로, 활성 성분 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 언어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 투여와 혼화 가능한, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 등을 포함하도록 의도된다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 및 설계 선택으로서 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 혼화 가능하지 않는 한, 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 애주번트와 같은 보충적인 약리학적 활성 화합물이 또한 조성물 내에 도입될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이 사용하기 위한 본 발명의 약제 조성물은 의도된 투여 경로와 혼화 가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피부내, 피하, 경피(예를 들어, 국소를 포함함), 점막경유 및 직장 투여를 포함한다.
비경구, 피부내 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 등장성의 조정을 위한 제제, 예를 들어, 소듐 클로라이드 또는 덱스트로오스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, HCl 또는 NaOH로 조정될 수 있다. 비경구 제조물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 용량 바이알에 밀봉될 수 있다.
주사제 사용을 위해 적합한 약제 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조물을 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EL®(BASF; Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균이어야 하고, 시린지능력(syringability)이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요망되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 등에 의해 달성될 수 있다. 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예를 들어, 만니톨 및 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 지연 흡수는 조성물에, 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함함으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 활성 화합물을 요망되는 양으로 요망되는 경우에 상기에 나열된 구성성분들 중 하나 또는 조합물과 함께 적절한 용매에 도입하고 이후에 여과 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기에 나열된 것으로부터의 요망되는 다른 구성성분을 함유한 멸균 비히클 내에 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 활성 성분 및 이의 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 요망되는 구성성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조를 포함한다.
경구 조성물은 일반적으로, 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 조성물ㄹ은 예를 들어, 장용 조성물, 지연 방출 제형, 등을 제공하기 위해, 코팅되거나 처리될 수 있는, 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 도입되고, 정제, 트로키 또는 캡슐 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한, 시럽, 엘릭시르 또는 액체 제형을 수득하기 위해 또는 구강세척액으로서 사용하기 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있으며, 여기서, 유체 담체 중의 화합물은 구강으로 적용되고, 스위싱되고(swish) 뱉거나(expectorate) 삼킨다.
약제학적으로 혼화 가능한 결합제 및/또는 애쥬번트 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키, 등은 임의의 하기 구성성분 또는 유사한 특성의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들어, 미정질 셀룰로오스, 검 트래거캔스 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어, 전분 또는 락토오스; 붕해제, 예를 들어, 알긴산, Primogel 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트 또는 Sterotes; 활택제, 예를 들어, 콜로이드성 이산화규소; 습윤제, 예를 들어, 수크로오스 또는 사카린; 또는 착향제, 예를 들어, 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 착색제. 고려되는 입자는 위 환경을 통한 통과에서 생존하는 형태로 캡슐화될 수 있다. 이러한 형태는 장용 코팅 제형으로서 통상적으로 공지되어 있다.
흡입에 의한 투여를 위하여, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어, 이산화탄소와 같은 가스를 함유한 가압된 용기 또는 디스펜서 또는 네불라이저, 또는 미스트로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달될 수 있다. 제형은 액체, 건조물, 예를 들어, 미분된 분말, 등일 수 있다.
전신 투여는 또한, 점막경우 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 점막경유 또는 경피 투여를 위하여, 침투되는 장벽에 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로, 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 점막경유 투여를 위해, 세제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 점막경유 투여는 비강 스프레이 또는 관장제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위하여, 활성 화합물은 일반적으로 당해 분야에 공지된 바와 같이, 연고, 살브(salve), 포움, 젤, 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 조성물ㄹ은 피부에 적용된 패치를 이용하여 전달될 수 있다.
좌제 형태일 때, 고려되는 조성물은 통상적인 좌제 베이스, 예를 들어, 코코아 버터 및 다른 글리세라이드를 포함할 수 있다.
구현예들에서, 활성 화합물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 제어 방출 제형에서와 같이, 신체로부터 빠른 제거에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르쏘에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다.
이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 물질은 상업적 공급처, 예를 들어, Johnson & Johnson 및 Encapsula Nano Sciences(Brentwood, TN)로부터 획득될 수 있다.
리포솜 현탁액(모노클로날 항체 및 다른 이러한 타겟화 분자로 타겟화된 리포솜을 포함함)은 또한, 약제학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 그러한 것은 예를 들어, 미국특허 제4,522,811호에 기술된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 단위 투여 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리할 수 있다. 본원에서 사용되는 "단위 투여 형태"는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 요망되는 약제학적 담체와 관련하여 요망되는 치료 효과를 생성시키기 위해 계산된 사전 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
약제 조성물은 투여 설명서와 함께, 용기, 팩, 키트 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
다른 투여 방법은 고려되는 화합물의 식품 또는 음료 내에, 식품 보조제 또는 첨가제로서, 또는 비타민과 유사한 예방적 기준으로 복용되는 투약 형태로서 첨가하는 것을 포함한다.
투약, 예를 들어, 바람직한 투여 경로 및 양은 전임상 및 임상 연구, 당해 분야에 공지된 실행 방법으로부터 얻어진 경험적 데이터를 기초로 하여 얻어질 수 있다. 몇 일 이상에 걸친 반복된 투여를 위하여, 질환에 따라, 치료는 질병 증상의 요망되는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 치료의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 모니터링된다. 예시적인 투약 요법은 WO 94/04188호에 개시되어 있다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 사양은 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성되는 특정 치료 효과 및 개체의 치료를 위한 이러한 활성 화합물을 배합하는 당해 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존적일 수 있다. 이에 따라, 성인 인간에 투여되는 바이러스 입자의 수는 모델 동물, 예를 들어, 마우스, 랫트, 원숭이, 등에 전달되는 치료량으로부터 외삽될 수 있다. 예를 들어, 마우스 연구를 기초로 하여, 약 106개의 입자(또는 IU), 약 107개의 입자, 약 108개의 입자, 약 109개의 입자 또는 그 이상의 입자가 용량당 또는 분할된 용량으로 투여될 수 있다. 양 또는 용량은 당해 분야에 공지된 바와 같이, 경험 데이터가 이용 가능해짐에 따라 조정될 수 있다.
고려되는 바이러스는 개체에서 효과적인 면역 반응을 생성시키기 위해 사용될 수 있으며, 여기서, 효과적인은 개체에서 증상 또는 병인을 최소화하거나, 감소시키거나, 예방하는 것을 포함한다. 숙주 면역 반응이 임의의 약물과 같이, 임의의 하나의 개체에서 등급화될 수 있는, 치료 반응을 얻는데 결정적이기 때문에, 고려되는 바이러스는 치료적일 수 있거나 치료적이지 않을 수 있거나, 바이러스 수용자로부터의 요망되는 반응을 얻거나 얻지 못할 수 있다. 투약, 바이러스 제시 경로 및 수단, 애주번트의 사용 및 다른 면역학 인자는 개체에서 숙주 면역 반응의 결여 또는 미심쩍은 숙주 면역 반응을 해결할 수 있다.
그러한 현상은 집단 수준에서 나타날 뿐만 아니라 고려되는 바이러스의 집단에서 모든 수용자가 치료학적 면역 반응을 유발하지 않으며, 임의의 하나의 집단에서 응답자의 수는 다른 집다늬 응답자와 다를 수 있다.
고려되는 기능장애 바이러스의 유용성은 집단에서 더 큰 백분율의 응답자, 집단에서 더 높은 수준의 면역보호, 상업적 실행 가능성, 상업적 성공 등에 의존적이지 않지만, 하나의 개체에서도, 고려되는 기능장애 바이러스는 증상 또는 질병을 감소시키거나 예방하는 치료학적 면역 반응을 생성시킨다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에서 예시될 것이다.
실시예 1
DV 비리온은 6% RNA, 66% 단백질, 9% 탄수화물 및 17% 지질을 포함한다[Russell et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses, in, Schlesinger eds., "The Togaviruses: Biology, Structure, Replication," New York, Academic, 1980, p. 503-529; and Trent & Naeve, Biochemistry and Replication, in Monath, ed., "St. Louis Encephalitis," Washington, DC, American Public Health Association, 1980, p. 159-199]. 전자-조밀 뉴클레오캡시드는 C(캡시드) 단백질 및 게놈 RNA을 포함한다. 피막 단백질, E, 및 막(M) 단백질은 C-말단 소수성 앵커에 의해 지질 이중층에 임베딩된다. 그러나, 세포내 소포 내에서 발견된 미성숙 입자는 오로지 처리되지 않은 pre-M(prM)을 함유하고, 방출된 비리온보다 덜 감염성을 나타낸다[Morens, Clin Infect Dis, 1994, 19:500-512].
DV의 게놈은 균일하고, 대략 95%의 게놈을 구성하는 단일 ORF를 함유한 약 10 내지 11 kb의 단일 가닥, 포지티브 센스 RNA 분자이다[Chambers et al., Ann Rev Microbiol, 1990, 44:649-688]. 전장 게놈 RNA는 DV-감염된 세포에서 단지 바이러스-특이적 메신저 RNA(mRNA) 분자인 것으로 나타난다. 감염 시에, 바이러스 RNA는 하기 10개의 유전자 산물로 처리되는 약 3400개의 아미노산의 폴리단백질로 번역된다: 3개의 구조 단백질, C, prM 및 E; 및 7개의 비구조(NS) 단백질, 1, 2A, 2B, 3, 4A, 4B 및 5[Bhamarapravati & Yokan, Live attenuated tetravalent vaccine, in Gubler & Kuno, eds., "Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever," Wallingford, CAB International, 1997, pp 367-377; 및 Falgout & Markoff, 1995, The family flaviviridae and its diseases, p. 47-66, in, Porterfield, ed., "Exotic Viral Infections," Chapman and Hall Medical, London, United Kingdom].
실시예 2
돌연변이체 DV를 DV2 뉴기니 C 균주(ATCC No. VR-1584)의 전장 감염성 cDNA 클론으로부터 생성하였다. 돌연변이 DNA 단편을 PCR에 의해 생성시키고, 문헌[Zeng et al., J Virol. 1998 Sep;72(9):7510-22]에 기술된 바와 같은 상동 재조합에 의해 전장 클론 내에 도입하였다. 돌연변이체를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 돌연변이체 DV RNA를 문헌[Polo et al., J Virol. 1997;71(7):5366-74]에 기술된 바와 같은 시험관내 전사에 의해 합성하였다.
돌연변이체 DV의 성장 동력학은 감염된 베로 세포(ATCC CCL-81)(인간)와 감염된 C6/36 세포(CRL-1660)(모기) 사이에 바이러스 성장의 차이를 나타내었다. 야생형 DV2(DENV2) prM(서열번호 3) 및 4개의 돌연변이체(여기서, 퓨린 인식 부위의 Glu(DENV2의 E)가 Arg(R)(D2-89R, 서열번호 4)), Val (V)(D2-89V, 서열번호 5), Ser (S)(D2-89S, 서열번호 6) 또는 Gly (G) (D2-89G), 서열번호 7)에 의해 대체됨)는 인간 베로 세포 및 모기 C6/36 세포에서의 성장에 대해 시험되었다.
Glu가 R에 의해 대체된 D2-89R 돌연변이체는 곤충 세포에서 전파하고, 인간 세포에서 복제를 나타내지 않았다.
실시예 3
돌연변이체를 DV1, Western Pacific, 74 균주(Genbank No. U88536)의 전장 감염성 cDNA 클론으로부터의 DV의 제2 혈청형으로 생성시켰다. 돌연변이 DNA 단편을 PCR에 의해 생성시키고, 문헌[Markoff et al., J Virol. 2002;76(7):3318-28]에 기술된 바와 같이 상동 재조합에 의해 전장 클론에 도입하였다. 돌연변이를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 돌연변이체 DV RNA를 Polo 등의 문헌에 기술된 바와 같이 시험관내 전사에 의해 합성하였다.
돌연변이체 DV의 성장 동력학은 감염된 베로 세포(ATCC CCL-81)(인간)와 감염된 C6/36 세포(CRL-1660)(모기) 사이에 바이러스 성장의 차이를 나타내었다.
실시예 4
하기 서열을 포함하는 DV1 돌연변이를 실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이 제조하였다:
CSQTGEHRRRKRSVALAPHVGLGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRH (서열번호 17).
그러한 서열은 DV1 prM 폴리펩티드의 아미노산 80에서 시작하고, 공통 퓨린 테트라펩티드에서, D는 R로 변경되었다. 절단은 상기 서열에서 R과 S 사이에서 일어난다.
돌연변이체 DV1의 성장 동력학은 감염된 베로 세포(ATCC CCL-81)(인간)와 감염된 C6/36 세포(CRL-1660)(모기) 사이에 바이러스 성장의 차이를 나타내었다.
실시예 5
상업적으로 입수 가능한 DV prM mAb로의 공지된 방법을 실행하고 분자량을 추론하기 위한 밴드 세기 및 밴드 크기를 비교하는 웨스턴 블롯 분석은, 돌연변이체 DV의 퓨린 절단 효율이 베로 세포(CCL-81) 및 C6/36 세포(CRL-1660) 둘 모두에서 증가됨을 나타내었다.
실시예 6
포유동물 세포에서 돌연변이체 DV의 성장을 간접 면역형광 염색에 의해 조사하였다. ATCC(HB-112)로부터의 mAb 4G2를 Polo 등의 방법에서 사용하였다.
포지티브 형광은 부모 DV 바이러스를 사용하는 양성 대조군에 대해 휘도를 증가시키고 양성 세포의 수를 증가시키면서 감염후 1일 내지 3일에 관찰되었다. 다른 한편으로, 돌연변이 D2-89R로 감염될 때, 형광 세포의 세기 및 수는 시간에 따라 점진적으로 감소하였다. 감염 후 1 내지 3일에 새로운 콜로니가 형성되지 않았다.
이에 따라, 돌연변이 D2 89R은 인간 세포에서 단지 단일 라운드의 감염을 개시하였고, 감염성 자손 바이러스 입자를 생성하지 않았다.
실시예 7
인간 세포에서 돌연변이 D2-89R이 성장-제한됨을 입증하기 위해, 피부 섬유아세포 세포(CRL-2522, ATCC)를 DV2 또는 D2-89R로 시험관내로 감염시켰으며, 바이러스 외피 항원의 존재를 본원에 기술된 바와 같이 감염후 상이한 시간(시)(hpi)에서 면역형광에 의해 평가하였다. DV2는 CRL-2522 세포에서 자손 바이러스를 전파하고 생성하였으며, 돌연변이 D2-89R은 그렇지 않았다.
감염된 세포에서 활성 바이러스 복제를 지시하는, 시간에 따른 바이러스 입자의 생성의 점진적인 증가는 야생형 DV2 바이러스에 의해 감염된 세포에 대해 관찰되었다.
다른 한편으로, 돌연변이 D2-89R 감염된 세포는 임의의 바이러스 자손을 생성하지 않았다.
실시예 8
DV 접종에 대한 돌연변이체 DV의 포유동물 세포-특이적 성장 제한의 보호 효능을 평가하기 위해, 6주령 AG129 마우스의 그룹(N = 6/그룹)은 105 감염성 단위(IU)의 돌연변이 D2-89R의 단일 ip 면역화를 수용하였다. 대조군 마우스에 50 ㎕의 포스페이트 완충 염수(PBS)를 ip 주사하였다.
2 마우스 그룹은 면역화 후에 임의의 가시적인 상이한 이동성 및 행동을 나타내지 않았다.
면역화 후 10일에, D2-89R-주사된 마우스 및 PBS 대조군 AG129 마우스에 105 플라크-형성 단위(PFU)(100배 LD50 접종)의 DV2를 ip 주사하였다.
DV2로 접종된 PBS-주사된 대조 마우스는 바이러스혈증을 발달시켰다. 반대로, 돌연변이 D2-89R로의 단일 면역화는 임의의 시점(N=10)에서 검출 가능한 바이러스혈증(< 100개 카피/ml) 없이 DV2 접종에 대한 완전한 보호를 제공하였다.
또한, 모든 D2-89R-노출된 마우스는 실험 전반에 걸쳐 건강하였으며, 단지 PBS에 노출된 모든 마우스는 DV2 접종 후에 쓰러졌다. 도 1 참조.
실시예 9
DV 돌연변이체의 안전성을 평가하기 위해, AG129 마우스가 1 PFU의 바이러스 정도로 낮은 DV2에 의해 치명적으로 감염될 수 있기 때문에, AG129 마우스를 사용하였다.
6개의 성인 AG129의 그룹은 106 IU의 돌연변이 D2-89R을 ip로 수용하였다. 대조군을 위하여, 그룹 당 동일한 수의 마우스를 101, 102 및 103 PFU의 DV2로 ip 주사하였다. DV2 및 D2-89R 감염 후 바이러스 로드를 RT-PCR에 의해 정량화하였다.
마우스의 DV2 감염된 그룹은 검출 가능한 바이러스혈증을 발달시켰으며, 모두는 감염후 쓰러졌다.
다른 한편으로, 돌연변이 D2-89R에 노출된 마우스는 검출 가능한 바이러스혈증을 가지지 않았으며, 모두는 질병의 임의의 증상 및 체중 변화 없이 실험의 길이(15일) 동안 생존하였다.
실시예 10
ZV 전자-조밀 뉴클레오캡시드는 C(캡시드) 단백질 및 게놈 RNA를 포함한다. 외막 단백질, E, 및 막(M) 단백질은 지질 이중층에 임베딩된다[Russell et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses, in Schlesinger, ed., The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. New York: Academic; 1980:503-529; and Trent & Naeve, Biochemistry and Replication, in Monath, ed. St. Louis Encephalitis. Washington, DC: American Public Health Association; 1980 p. 159-199].
ZV 게놈은 대략 95%의 게놈을 구성하는 단일 ORF를 함유한, 약 10 내지 11 kbml 단일-가닥, 양성-센스 RNA 분자이다[Bhamarapravati & Yokan: Live attenuated tetravalent vaccine, in Gubler & Kuno, eds., Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Wallingford, CAB International, 1997, pp 367-377; and Falgout & Markoff, 1995, The family flaviviridae and its diseases, p.　47-66. in: JS Porterfield (ed.), Exotic Viral Infections. Chapman and Hall Medical, London, United Kingdom].
실시예 11
ATCC로부터의 ZV MR766의 전장 감염성 cDNA 클론은 포유동물 세포에서 성장 제한을 형성시키기 위해 점 돌연변이로 처리되었다. 돌연변이는 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다. 돌연변이 ZV 게놈 RNA는 시험관내 전사에 의해 합성되었으며, C6/36 모기 세포는 제조업체 설명서에 따라 TransIT®-mRNA(Mirus Bio, Madison, WI)에 의해 돌연변이 바이러스 RNA로 트랜스펙션되었다. 돌연변이 ZV는 트랜스펙션 후 7일에 수집되었다. 바이러스 성장 동력학은 포유동물 (Vero) 세포 및 C6/36 세포 둘 모두에서 결정되었다.
점 돌연변이는 하기와 같이 퓨린 절단 부위 부근에 서열을 변형시키기 위해 ZV 게놈에서 유도되었다:
야생형: HHKKGEARRSRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN (서열번호 11)
돌연변이체: HHKKGEARRRRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN (서열번호 12).
세린으로부터 아르기닌으로의 단일 변경은 베로 세포에서 전파의 감소를 야기시켰으며, 모기 세포에서의 전파는 대조군으로부터 비교적 변경되지 않았다.
실시예 12
실시예 11의 절차를 따랐다. 동일한 Ser의 Arg로의 치환, 뿐만 아니라 Glu(E)(G와 A 사이)의 His(H)로의 대체를 사용하여 2개의 점 돌연변이를 갖는 돌연변이체를 수득하였다.
인간 세포에서의 전파는 실시예 11의 돌연변이에서 관찰된 것보다 낮은 수준까지 감소되었으며, 곤충 세포에서 복제에 영향을 미치지 않았다.
실시예 13
실시예 11의 절차를 따랐다. 실시예 11에 나타낸 서열의 최초 12개의 아미노산을 TTTGEHRRRKRS(서열번호 13)로 대체하였다.
인간 세포에서의 전파는 실시예 11의 돌연변이에서 관찰된 것보다 낮은 수준까지 감소되었으며, 곤충 세포에서 복제에 영향을 미치지 않았다.
실시예 14
실시예 11의 절차를 따랐다. 실시예 11에 나타낸 서열의 최초 22개의 아미노산을 TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMG(서열번호 14)로 대체하였다.
인간 세포에서의 전파는 실시예 11의 돌연변이에서 관찰된 것보다 낮은 수준까지 감소되었으며, 곤충 세포에서 복제에 영향을 미치지 않았다.
실시예 15
실시예 11의 절차를 따랐다. 실시예 11에 나타낸 서열의 최초 37개의 아미노산을 TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAW(서열번호 15)로 대체하여 ZV M2 돌연변이체를 형성하였다.
인간 세포에서의 전파는 실시예 11의 돌연변이에서 관찰된 것보다 낮은 수준까지 감소되었으며, 곤충 세포에서 복제에 영향을 미치지 않았다.
실시예 16
SV 접종에 대해 고려되는 돌연변이 SV의 포유동물 세포-특이적 성장 제한의 보호 효능을 평가하기 위해, 6주령 AG129 마우스 그룹(N = 6/그룹)은 105 감염 단위(IV)의 실시예 15의 돌연변이 M2의 단일 ip 면역화를 수용하였다. 대조 마우스는 50 ㎕의 PBS로 ip 주사되었다.
2개의 마우스 그룹은 면역화 후에 눈에 띄는 상이한 이동성 및 행동을 나타내지 않았다.
면역화 후 14일에, M2-주사된 마우스 및 PBS 대조 AG129 마우스는 103개의 플라크-형성 단위PFU)(100배 LD50 접종됨)의 야생형 SV로 ip 주사되었다.
SV가 접종된 PBS-주사된 대조 마우스는 바이러스혈증을 발달시켰다. 반대로, 돌연변이 M2로의 단일 면역화는 임의의 시점에(N=10), 바이러스혈증이 검출되지 않으면서(< 100 카피/ml) SV 접종에 대한 완전 보호를 제공하였다.
또한, 모든 M2-노출된 마우스는 실험 전반에 걸쳐 건강하였으며, 단지 PBS에 노출된 모든 마우스는 SV 접종 후에 굴복되었다. 도 2 참조.
실시예 17
고려되는 돌연변이 SV의 포유동물 세포-특이적 성장 제한의 안전성을 평가하기 위해, 6주령 AG129 마우스의 그룹(N = 6/그룹)은 105 감염 단위(IU)의 돌연변이 M2 또는 야생형 ZV의 단일 ip 면역화를 수용하였다.
M2-노출된 마우스는 실험 전반에 걸쳐 건강하였으며, 단지 PBS에 노출된 모든 마우스는 SV 접종 후에 굴복되었다. 도 3 참조.
실시예 18
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 황열병 바이러스의 타입 균주를 이용하여 실시되었다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이 인간 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 식별된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실,, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 황열병 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 19
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 캘리포니아 뇌염 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이 인간 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 식별된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 캘리포니아 뇌염 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 20
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 리프트 밸리열 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이 인간 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 식별된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실,, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 리프트 밸리열 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 21
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 진드기-매개 뇌염 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이 인간 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 식별된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실,, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 진드기-매개 뇌염 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 22
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 웨스트 나일 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에서 제공된 바와 같이, 포유동물 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 확인된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실,, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
포유동물 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 웨스트 나일 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 23
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 말 뇌증 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이, 포유동물 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 확인된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실,, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 포유동물 세포에서 낮은 복제 성공을 갖는 말 뇌증 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 24
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 콜로라도 진드기 열 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이 인간 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 식별된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실,, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 콜로라도 진드기 열 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 25
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 치쿤구니야 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이 인간 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 식별된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 치쿤구니야 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 26
실시예 2 내지 9의 물질 및 방법은 아프리카 돼지 열병 바이러스의 타입 균주를 사용하여 실시된다.
상기에 제공되고 당해 분야에 공지된 바와 같이 prM 퓨린 인식 부위가 위치되며 아미노산 치환이 여기에 대해 이루어진다. 고려되는 돌연변이체는 상기에 제공된 바와 같이 인간 세포에서 더 이상 전파하지 않거나 더 낮은 수준으로 전파하는 것으로서 식별된다. 아미노산 변경, 예를 들어, 치환, 삽입, 결실,, 화학적 개질, 등은 또한, 퓨린 절단 부위의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 이루어진다.
곤충 세포에서 복제하지만 인간 세포에서 더 낮은 복제 성공을 갖는 아프리카 돼지 열병 바이러스 돌연변이체가 식별된다.
실시예 27
성인 레서스 원숭이는 그룹 당 4 내지 6마리 동물의 실험 그룹 및 대조군에 할당되었다. 실험 그룹 동물은 다양한 용량(105 내지 1010 IU)의 실시예 2의 돌연변이체 D2-89R을 수용하였다. 대조군의 동물은 동일한 부피의 PBS를 수용하였다.
동물은 4주 동안 유지되었으며, 그러한 기간 동안, 동물은 바이러스 및 이에 대한 숙주 반응의 존재, 크기 및 양을 검출하기 위해 순환하는 항-뎅기 항체, 바이러스 부하 및 세포 면역형광에 대해 뿐만 아니라, 뎅기열 감염증의 임의의 증상, 예를 들어, 열 및 체중 손실에 대해 모니터링하기 위해 시험되었다.
이후에, 동물은 야생형 DV2로 접종되고, 증상, 예를 들어, 열 및 체중 손실, 및 혈청학적 파라미터, 예를 들어, 바이러스 부하 및 뎅기 항체에 대해 모니터링되었다.
대조 동물은 뎅기열 감염증의 증상을 나타내며, 고려되는 돌연변이체를 수용한 원숭이는 무증상이다.
실시예 28
성인 레서스 원숭이는 그룹 당 4 내지 6마리 동물의 실험 그룹 및 대조군에 할당되었다. 실험 그룹 동물 다양한 용량(105 내지 1010 IU)의 실시예 4의 DV1 돌연변이체를 수용하였다. 대조군의 동물은 동일한 부피의 PBS를 수용하였다.
동물은 4주 동안 유지되었으며, 그러한 기간 동안, 동물은 바이러스 및 이에 대한 숙주 반응의 존재, 크기, 및 양을 검출하기 위한 순환하는 항-뎅기 항체, 바이러스 부하 및 세포 면역형광에 대해 시험될 뿐만 아니라 뎅기열 감염증의 임의의 증상, 예를 들어, 열 및 체중 손실에 대해 모니터링되었다.
이후에, 동물은 야생형 DV1로 접종되었고, 증상, 예를 들어, 열 및 체중 손실, 및 혈청학적 파라미터, 예를 들어, 바이러스 부하 및 뎅기 항체에 대해 모니터링되었다.
대조 동물은 뎅기열 감염증의 증상을 나타내며, 고려되는 돌연변이체를 수용한 원숭이는 무증상이다.
실시예 29
성인 레서스 원숭이는 그룹 당 4 내지 6마리의 동물의 2개의 실험 그룹 및 2개의 대조군에 대해 할당되었다. 실험 그룹 동물은 다양한 용량(105 내지 1010 IU)의 실시예 14의 돌연변이 지카 바이러스를 수용하였다. 대조군의 동물은 동일한 부피의 PBS를 수용하였다.
동물은 4주 동안 유지되었으며, 그러한 기간 동안, 동물은 바이러스 및 이에 대한 숙주 반응의 존재, 크기 및 양을 검출하기 위해순환하는 항-지카 항체, 바이러스 부하 및 세포 면역형광에 대해 시험될 뿐만 아니라 지카 감염증의 임의의 증상, 예를 들어, 열, 바이러스혈증, 발진, 및 체중 손실에 대해 모니터링되었다.
이후에, 동물은 야생형 ZV로 접종되었다. 한 쌍의 실험 그룹 및 대조군은 야생형 ZV 아프리카 균주로 접종되었으며, 다른 쌍의 실험 그룹 및 대조군은 야생형 ZV 아시아 균주로 접종되었다. 동물은 증상, 예를 들어, 열, 발진 및 체중 손실, 및 혈청학적 파라미터, 예를 들어, 바이러스 부하 및 지카 항체에 대해 모니터링되었다.
대조 동물은 지카 감염증의 증상을 나타내며, 고려되는 돌연변이체를 수용한 원숭이는 무증상이다.
실시예 30
성인 레서스 원숭이는 그룹 당 4 내지 6마리 동물의 2개의 실험 그룹 및 2개의 대조군에 할당되었다. 실험 그룹 동물은 다양한 용량(105 내지 1010 IU)의 실시예 15의 돌연변이 지카 바이러스를 수용하였다. 대조군의 동물은 동일한 부피의 PBS를 수용하였다.
동물은 4주 동안 유지되었으며, 그러한 기간 동안, 동물은 바이러스 및 이에 대한 숙주 반응의 존재, 크기 및 양을 검출하기 위해 순환하는 항-지카 항체, 바이러스 부하 및 세포 면역형광에 대해 시험될 뿐만 아니라, 지카 감염증의 임의의 증상, 예를 들어, 열, 바이러스혈증, 발진 및 체중 손실에 대해 모니터링되었다.
이후에, 동물은 야생형 ZV로 접종되었다. 한 쌍의 실험 그룹 및 대조군은 야생형 ZV 아프리카 균주로 접종되었으며, 다른 쌍의 실험 그룹 및 대조군은 야생형 ZV 아시아 균주으로 접종되었다. 동물은 증상, 예를 들어, 열, 발진 및 체중 손실, 및 혈청학적 파라미터, 예를 들어, 바이러스 부하 및 지카 항체에 대해 모니터링되었다.
대조 동물은 지카 감염증의 증상을 나타내며, 고려되는 돌연변이체를 수용한 원숭이는 무증상이다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기술된 본 발명의 바람직한 구현예에 대한 다양한 변경 및 변형이 다업자에게 명백한 것으로 이해되어야 한다. 이러한 변경 및 변형은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이의 의도된 장점을 감소시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 이에 따라, 이러한 변경 및 변형이 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> TENGEN BIOMEDICAL COMPANY <120> MAMMAL-SPECIFIC GROWTH-DEFECTIVE ARBOVIRUS <130> 14520201 <150> US 62/556,892 <151> 2017-11-09 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> DV furin cleavage site in the prM protein <400> 1 Arg Glu Lys Arg 1 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> prM sequence upstream of and including the ZV furin recognition site <400> 2 His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> Wild type DV2 (DENV2) prM <400> 3 Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn 20 25 30 Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 35 40 45 Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 85 90 95 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 115 120 125 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 145 150 155 160 Val Ala Pro Ser Met Thr 165 <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> Mutant DENV2 (D2-89R) <400> 4 Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn 20 25 30 Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 35 40 45 Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 85 90 95 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 115 120 125 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 145 150 155 160 Val Ala Pro Ser Met Thr 165 <210> 5 <211> 166 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> Mutant DENV2 (D2-89V) <400> 5 Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn 20 25 30 Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 35 40 45 Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Val Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 85 90 95 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 115 120 125 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 145 150 155 160 Val Ala Pro Ser Met Thr 165 <210> 6 <211> 166 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> Mutant DENV2 (D2-89S) <400> 6 Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn 20 25 30 Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 35 40 45 Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Ser Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 85 90 95 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 115 120 125 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 145 150 155 160 Val Ala Pro Ser Met Thr 165 <210> 7 <211> 166 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> Mutant DENV2 (D2-89G) <400> 7 Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn 20 25 30 Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 35 40 45 Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 85 90 95 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 115 120 125 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 145 150 155 160 Val Ala Pro Ser Met Thr 165 <210> 8 <211> 166 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> wild type prM amino acid sequence of the NGC strain of DV2 <400> 8 Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg 1 5 10 15 Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn 20 25 30 Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr 35 40 45 Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile 50 55 60 Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 85 90 95 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 100 105 110 Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu 115 120 125 Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile 130 135 140 Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala 145 150 155 160 Val Ala Pro Ser Met Thr 165 <210> 9 <211> 168 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> wild type prM amino acid sequence <400> 9 Ala Glu Ile Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg 1 5 10 15 Ser Asp Ala Gly Lys Ala Ile Ser Phe Ala Thr Thr Leu Gly Val Asn 20 25 30 Lys Cys His Val Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr 35 40 45 Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp 50 55 60 Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr 65 70 75 80 Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr 85 90 95 Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp 100 105 110 Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Lys Val Glu Asn Trp 115 120 125 Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ile Ala Trp 130 135 140 Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile 145 150 155 160 Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser 165 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> tetrapeptide site <400> 10 Arg Ser Arg Arg 1 <210> 11 <211> 50 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> Wild-type <400> 11 His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu 20 25 30 Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe 35 40 45 Arg Asn 50 <210> 12 <211> 50 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> Mutant <400> 12 His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Arg Arg Arg Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu 20 25 30 Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe 35 40 45 Arg Asn 50 <210> 13 <211> 12 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> Mutant <400> 13 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser 1 5 10 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> Mutant <400> 14 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 1 5 10 15 Pro His Val Gly Met Gly 20 <210> 15 <211> 37 <212> PRT <213> Zika virus <220> <221> misc_feature <223> ZV M2 Mutant <400> 15 Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val 1 5 10 15 Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser 20 25 30 Ser Glu Gly Ala Trp 35 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: consensus tetrapeptide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> X is K or R <400> 16 Arg Xaa Xaa Arg 1 <210> 17 <211> 51 <212> PRT <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <223> DV1 mutant <400> 17 Cys Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu 1 5 10 15 Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met 20 25 30 Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile 35 40 45 Leu Arg His 50

Claims (20)

  1. 전구체 폴리단백질에서 기능장애 퓨린 테트라펩티드 절단 부위(dysfunctional furin tetrapeptide cleavage site), 및 선택적으로, 상기 부위로부터 업스트림에서의 아미노산의 제1 스트레치(stretch)에서의 변형(alteration) 및/또는 상기 부위로부터 다운스트림에서의 아미노산의 제2 스트레치에서의 변형을 포함하는 성장-제한된 아르보바이러스(growth-restricted Arbovirus)를 포함하는 아르보바이러스 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 부위가 Arg-X-Lys/Arg-Arg(서열번호 16)의 공통 서열을 포함하는 입자.
  3. 제2항에 있어서, X가 Arg를 포함하는 입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 스트레치가 상기 부위에 인접한 8개의 아미노산을 포함하는 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 스트레치에서의 변형을 포함하는 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2 스트레치에서의 변형을 포함하는 입자.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리단백질이 prM을 포함하는 입자.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리단백질이 prE2를 포함하는 입자.
  9. 제1항에 있어서, 뎅기 바이러스(Dengue virus; DV)를 포함하는 입자.
  10. 제1항에 있어서, 지카 바이러스(Zika virus; ZV)를 포함하는 입자.
  11. 제1항의 입자, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  12. 제1항의 입자를 포함하는 곤충 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 곤충이 절지동물을 포함하는 세포.
  14. 제12항에 있어서, 상기 곤충이 진드기 또는 모기를 포함하는 세포.
  15. 제1항의 입자를 포함하는 포유동물 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포가 DV 항원을 발현시키는 세포.
  17. 제15항에 있어서, 상기 세포가 상기 세포의 표면에서 DV 항원을 발현시키는 세포.
  18. 제15항에 있어서, 상기 세포가 ZV 항원을 발현시키는 세포.
  19. 제15항에 있어서, 상기 세포가 상기 세포의 표면에서 ZV 항원을 발현시키는 세포.
  20. 제15항에 있어서, 인간 세포를 포함하는 세포.
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