JPH07509616A

JPH07509616A - 欠陥アデノウイルスおよび対応補足系

Info

Publication number: JPH07509616A
Application number: JP7500317A
Authority: JP
Inventors: イムラー，ジャン‐リュック; メタリ，マジッド; パビラニ，アンドレア
Original assignee: トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 1995-10-26
Anticipated expiration: 2024-02-18
Also published as: DE69425989D1; GR3035841T3; GR3034956T3; JP4226071B2; DE919627T1; EP0919624A2; EP1149916A3; EP0919625A2; EP0652968B1; EP0919627B1; US20030170885A1; DE69426722D1; DK0919627T3; DE69426722T2; ATE196502T1; PT652968E; DE69431372D1; WO1994028152A1; DK0919625T3; ES2155090T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】欠陥アデノウィルスおよび対応補足系本発明は宿主真核細胞または生物への対象遺伝子の移入と発現とが可能な新規欠陥アデノウィルスベクター、およびこれら組換えアデノウィルスのゲノムから欠失された必須ウィルス機能をインドランス（ｉｎｔＩｎｓ）で補う新規補足系に関する。本発明は、特にヒトにおける、遺伝子治療の展望上特別な関心がもたれるものである。

アデノウィルスは広い宿主範囲を示すＤＮＡウィルスである。それらは多数の動物種および多数の細胞で実証されている。ゲノム配列に関して特に異なる多数の血清型が存在する。はとんどのヒトアデノウィルスはほんのわずかに病原性であり、通常良性の症状を示すだけである。

アデノウィルスは特定レセプターを介して受容宿主細胞に入り、その後それはエンドソーム中に取り込まれる。

それらの酸性化が、ウィルスのコンホメーション変化と細胞質中へのその出現に寄与している。複製サイクルの第一工程に必要とされるある種のウィルスタンパク質に関係するウィルスＤＮＡが、次いで感染細胞の核に入り、そこでその転写が細胞酵素により開始される。アデノウィルスＤＮＡの複製は感染細胞の核で起こり、細胞複製を必要としない。新たなピリオンのアセンブリーも核で起こる。

第一段階において、ウィルスタンパク質は二十面体構造の中空キャプシドを形成するように集合化して、それからアデノウィルスＤＮＡが粗膜（ｃｎｃａｐｓｉｄａ＋ｅｄ）される。ウィルス粒子またはピリオンが感染細胞から放出され、他の受容細胞に感染することができる。

アデノウィルスの感染サイクルは二つの工程、即ちニーアデノウィルスゲノムの複製の開始の前であって、かつウィルスＤＮＡの複製および転写に関与する調節タンパク質の生産が行なわれる前期、および−構造タンパク質の合成を導く後期で生じる。

一般的には、アデノウィルスゲノムは、３０以上のタンパク質をコードする配列を含んだ、長さ約３６ｋｂの二本直鎖ＤＮＡ分子からなる。その両末端には、ＩＴＲ（逆方向末端反復）と呼ばれる、血清型に応じた１００〜１５０ヌクレオチドの短逆方向配列が存在している。ＩＴＲはアデノウィルスゲノムの複製に関与する。

約３００ヌクレオチドの粗膜化領域は、ゲノムの５′末端において５−ＩＴＲの直後に位置している。

初期遺伝子は、アデノウィルスゲノム中に分散した、Ｅ１〜Ｅ４（Ｅは“初期” を表す）と表示される４領域に分布している。初期領域はそれら自体のプロモーターを有した少くとも６つの転写単位を含んでいる。初期遺伝子の発現はそれ自体調節され、一部の遺伝子は他よりも前に発現される。３つの領域Ｅ１、Ｅ２およびＥ４は各々ウィルス複製にとり必須である。このため、アデノウィルスがこれら機能の１つに欠陥がある場合、即ちアデノウィルスがこれら領域の１つによりコードされる少くとも１つのタンパク質を生産できない場合には、このタンパク質はインドランスでそれに供給されねばならない。

Ｅ１初期領域はアデノウィルスゲノムの５′末端に位置し、２つのウィルス転写単位ＥＩＡおよびＥＩＢを各々含んでいる。この領域はウィルスサイクルに非常に初期に関与するタンパク質をコードし、アデノウィルスのほぼすべての他の遺伝子の発現にとり必須である。特に、ＥＩＡ転写単位は、他のウィルス遺伝子の転写をトランス活性化するタンパク質をコードしており、ＥＩＢＳＥ２ＡＳＥ２ＢおよびＥ４領域のプロモーターからの転写を誘導する。

２つの転写単位Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂをもまた含んだＥ２領域の産物は、ウィルスＤＮＡの複製に直接関与している。この領域は、−重鎖ＤＮＡと強い親和性を示す７２　ｋＤａタンパク質と、ＤＮＡポリメラーゼの合成とを特に支配している。

Ｅ３領域はウィルスの複製にとり必須ではないがアデノウィルス感染の際に宿主免疫反応の阻害に関与するらしい少くとも６つのタンパク質をコードしている。

特に、ｇ　ｌ）　１９　ｋＤｚ糖タンパク質は、宿主細胞毒性Ｔ細胞による感染細胞の細胞溶解に関与するＣＴＬ応答を妨げると考えられる。

Ｅ４領域はアデノウィルスゲノムの３′末端に位置する。そして、それは後期遺伝子の発現、後期メツセンジャーＲＮ　Ａ　（ｍ　ＲＮ　Ａ）の安定性、前期から後期への移行、そして更に細胞タンパク質合成の阻害に関与する多数のポリペプチドをコードしている。

ウィルスＤＮＡの複製が開始されると、後期遺伝子の転写が始まる。これらはアデノウィルスゲノムの大部分を占め、初期遺伝子の転写単位と一部重複している。しかし、それらは異なるプロモーターから別のスプライシング様式に従い転写され、そのため同一配列が異なる目的に用いられる。後期遺伝子のほとんどは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から転写される。このプロモーターは長鎖−次転写産物の合成を行い、その後これは約２０のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の形で成熟化され、そこからピリオンのキャプシドタンパク質が生産される。

キャプシドを構成する構造タンパク質ＩＸをコードする遺伝子は、アデノウィルスゲノムの５″末端に位置し、その３′末端でＥＩＢ領域と重っている。タンパク質ＩＸ転写単位は、ＥＩＢ転写単位と同じ転写終結シグナルを利用している。

いくつかのアデノウィルスは現在遺伝的および生化学的にかなり特徴付けされている。ヒトアデノウィルスタイプ５（Ａｄ５）の場合、その配列は参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバンクで開示されている。アデノウィルスゲノムで異なる遺伝子を正確に位置決めすることができた。そこでは５″から３′にかけて１０３ｂｐ５＝ＩＴＲ，その後に約３００ｂｐ包膜化領域（Ｈｅａ「ｉｎｇ　ｅｌａｌ、、　１９８７．１．　Ｖｉｔａｌ、、　６１．２５５５− ２５５８）　、次いでその位置が図１に示されている初期および後期領域と、最後に３′ＩＴＲを含んでいる。

アデノウィルスが、対象遺伝子移入用の選択ベクターとしうる有利な特徴を備えていることは、前記から明らかである。多数の組換えアデノウィルスが文献に記載されている（Ｒｏｓｅｎｌｅｌｄ　ｅｌ　ａｌ、、　１９９１５ｃｉｅｎｃｅ、　２５２．４３１−４３４　；Ｒｏｉｅｎｌｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９９２．Ｃｅ１１，６８．１４３−１５５）。一般的に言えば、それらはＡｄ５から誘導され、環境および宿主生物でのそれらの伝播を避けうるように８１機能に欠陥がある。加えて、非必須Ｅ３領域も欠失させることができる。外来配列か、ＥｌまたはＥ３領域に代えて組み込まれる。

このため、これらの欠陥アデノウィルスは、ウィルス複製に必須である８１機能をインドランスで補うセルラインでのみ増殖させることができる。現在、使用しうる唯一の補足系は胚腎臓系２９３　（Ｇ＋ａｈａｍ　ｅｔ　！＋、、１９７７、Ｊ。

Ｇｅｎ　、　Ｖｉｔａｌ、、３６．５９−７２）であって、これは特にウィルスゲノムの５′末端を含んだＡｄ５ゲノムの断片の染色体への組込みにより得られ、それによって系２９３は８１機能に欠陥があるアデノウィルスを補う。２９３細胞は欠陥組換えアデノウィルスにおいてまた見出される配列、例えば５−ＩＴＲと、粗膜化領域と、初期タンパク質をコードする配列を含んだＥＩＢ領域の３ ′末端側の部分とを含んでいる。

アデノウィルスを用いた遺伝子移入の実施の可能性は現在確立されている。しかしながら、それらの安全性の問題はなお解決されていない。実際に、それらは培養で一部の細胞系を形質転換することができ、少くとも一部の血清型において、本質的にＥｌとおそら＜Ｅ４領域におけるアデノウィルスゲノムの発現産物の一部のものとしての潜在的な発癌性がもたらされる。更に、従来の欠陥アデノウィルス（特に組換えアデノウィルス）と、天然もしくは野生型アデノウィルス（宿主生物の偶発的汚染または日和見感染に起因する）または補足系２９３に組込まれたアデノウィルスゲノム断片との間の遺伝子組換えの蓋然性は微々たるものではない。実際に、１回の組換え現象は、８１機能を回復させ、環境に伝播しうる非欠陥組換えアデノウィルスを生じるのに十分である。

欠陥アデノウィルスと同様の細胞に同時感染する野生型天然アデノウィルスが８１機能に関して前者を補って、２ウイルスの同時伝播を起こすという状況も考えられるさらに、一部タイプの真核細胞はＥＩＡ様活性を示すタンパク質を生産し、これはそれらに感染する欠陥アデノウィルスを部分的に補うこともできる。

このため、有効な治療方法がないｉｎマ１マＯの重度の遺伝子欠陥を修正して、ある障害を治療するための遺伝子治療に用いるにあたり、最少の危険性を示し、自由に扱える有用なアデノウィルスベクターが望まれている。ヒトに適用される遺伝子治療の成否は、それを入手できるかどうかに依存している。

更に、系２９３の入手に関しては疑問が存在している。

その疑問により、それに由来するヒト用とされる産物の受容性が損なわれる傾向にある。ヒト用の組換えアデノウィルス粒子を生産するためには、起源および由来が正確に知られている、自由に扱える補足系があることが有用である。

今般、（１）アデノウィルスゲノムのある特定領域が欠失された、インビボでの外来ヌクレオチド配列の移入により適した新規欠陥アデノウィルスベクター、および（２）薬学的観点から許容され、このためヒト用の産物の生産上要求されるすべての安全性を示す、新規の特徴付けされた補足系が見出された。

これら新規ベクターの価値は、それらが１以上の太きな対象遺伝子の挿入が可能な高いクローニング能力を示し、かつ使用上最大の安全性を示すことである。有害変異は、対象遺伝子を移入および発現しうるそれらの能力を損うことなく、アデノウィルスを自律複製および細胞形質転換できなくする。

このため、本発明の主題は、複製に欠陥があり、補足細胞中に色層することができて、５′から３′にかけて５−ＩＴＲ，包膜化領域、ＥＩＡ領域、ＥＩＢ領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域、および３”ＩＴＲを含んだアデノウィルスのゲノムから、（ｉ）ＥＩＡ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするＥＩＢ領域の部分全体、または（ｉｉ）ＥＩＡ領域の全部または一部、およびＥ２およびＥ４領域から選択される少くとも１つの領域の全部または一部、または（ｉｉｉ）　Ｅ　Ｉ　Ａ領域の全部または一部、および包膜化領域の部分の欠失により誘導される、アデノウィルスベクターである。

本発明の目的において、“欠失“または“欠く”という用語は標的領域における少くとも１つのヌクレオチドの除去に関し、欠失は当然ながら連続でもまたは不連続でもよい。全部または一部とは、該当する領域の全体または部分のみの場合を意味する。上記領域によりコードされる少くとも１つの発現産物の生産を妨げる欠失が好ましい。このため、それらはコード領域または調節領域、例えばプロモーター領域に存在してよく、遺伝子の読取枠を壊すかまたはプロモーター領域を無機能化するように少くとも１つのヌクレオチドに影響を与えてもよい。

欠失には、上記領域の１以上の遺伝子の部分的欠失またはその領域の全体の部分的欠失をも含む。

本発明によるアデノウィルスベクターは複製に欠陥がきる。宿主細胞にそのベクターを送達しうる能力を有しているために、宿主細胞で自律複製できないにもかかわらず感染性であるアデノウィルス粒子（欠陥アデノウィルスとも呼ぶこととする）を生じるように、欠陥があるものに産物をインドランスでそれを提供する。

第一の例によると、本発明によるアデノウィルスベクターは、ＥＩＡ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードする配列の全体を含んだＥＩＢ領域部分の欠失により、天然または野生型アデノウィルスのゲノムから誘導される。

好ましい態様によれば、欠失はＥＩＢ領域の発現産物（即ち初期タンパク質をコードする配列）とプロモーターとに影響を与え、後期タンパク質ＩＸをコードする配列と重複する転写終結シグナルの全部または一部を含まない。ヒトアデノウィルスタイプ５から誘導される本発明によるアデノウィルスベクターに関して、上記欠失にはアデノウィルスゲノムのヌクレオチド１６３４〜３５０９間にある配列から少くともなり、その配列は参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバンクで開示されている。この欠失の目的は、本発明によるアデノウィルスベクターと、補足系（例えば系２９３）に組み込まれるアデノウィルスゲノム断片とに共通した配列を減少または消失させることである。更に、少くともＥＩＡ領域の発現産物と一緒に、発現産物が潜在的に発癌性である配列を本発明によるアデノウィルスベクターから除去することである。

しかも、本発明によるアデノウィルスベクターは、天然または野生型アデノウィルスのゲノムから、ニーＥ３領域の、および／または −Ｅ２領域の、および／または −Ｅ４領域の全部または一部の欠失によって更に誘導される。

本発明によるアデノウィルスベクターが上記３欠失のうち１つ、またはいずれかの組合せでそれらのうち２つ、またはすべての欠失を含むことができることは自明である。

特に有利な態様によると、Ｅ３領域の一部のみ、好ましくはｇ　ｐｌ　９　ｋＤａタンパク質、をコードする配列を含まない部分が、本発明によるアデノウィルスベクターから欠失される。本発明によるアデノウィルスベクターにｇ　ｐｌ　９　ｋＤｚタンパク質をコードする配列が存在することにより、感染細胞は宿主の免疫監視（即ち治療プロトコールがいくつかの反復投与を要するときの重要な基準）からのがれることができる。選択は、ｇｐ１９ｋＤｌをコードする配列を、宿主細胞でそれらを発現させる適切な要素、即ちｍＲＮＡへの上記配列の転写とタンパク質への後者の翻訳に必要な要素のコントロール下において行うことが好ましい。これらの要素には特にプロモーターがある。このようなプロモーターは当業者に周知であり、遺伝子工学の慣用的技術で上記コード配列の上流に挿入される。選択されるプロモーターはＥＲＡ領域の発現産物の１つにより活性化されない構成プロモーターであることが好ましい。例として、ＨＭＧ　（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ）遺伝子プロモーター、ＳＶ４０　（シミアンウィルス４０）ウィルス初期プロモーター、Ｒ３Ｖ　（ラウス肉腫ウィルス）ＬＴＲ（長反復末端）または高等真核生物のＰＧＫ　（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子のプロモーターが挙げられる。

更に、プロモーター領域に相当するＥ３領域の部分は本発明によるアデノウィルスベクターから場合により欠失させることができ、そのプロモーター領域は上記のような異種プロモーター領域に代えられる。

第二の例によると、本発明によるアデノウィルスベクターは、ＥＩＡ領域の全部または一部と、少くともＥ２および／またはＥ４領域の全部または一部とにおける連続または不連続欠失により、天然または野生型アデノウィルスのゲノムから誘導される。このような欠失により、対象遺伝子のクローニング可能性を増加させることができる。更に、Ｅ４領域の全部または一部の除去により、潜在的な発癌性産物をコードする配列を減少または消失させることもできる。

上記のように、本発明によるアデノウィルスベクターは、特に上記のような態様に従い、ＥＩＢおよび／またはＥ３領域の全部または一部を更に欠くことができる（例えば、初期タンパク質をコードする配列の全体を含むＥＩＢ領域の部分、およびｇｐ１９ｋＤ！タンパク質をコードしないＥ３領域の部分の欠失）。

最後に、第三の例によると、本発明によるアデノウィルスベクターは、ＥＩＡ領域の全部または一部と、粗膜化領域の部分の欠失とにより、アデノウィルスのゲノムから誘導される。

粗膜化領域の部分的欠失により、本発明によるアデノウィルスベクターの無制御の伝播の可能性を、野生型アデノウィルスの存在下にあるとき有意に減少させることができる。このような欠失は、野生型アデノウィルスによるベクターの欠陥機能のインドランス相補によっても、競合野生型アデノウィルスのゲノムと比べて効率的に粗膜できないように、その粗膜化機能に影響を与えることができる。

粗膜化領域からの欠失は、２つの基準、即ち粗膜される能力の減少と、同時に工業的生産に適合する残りの効力とに基づいて選択される。換言すれば、本発明によるアデノウィルスベクターの粗膜化機能は実質上、但しもっと低い程度に維持される。弱毒化は、慣用的滴定技術により、適切な系を感染させて溶解プラークの数を調べることにより判定できる。このような技術は当業者に知られている。

本発明において、粗膜化効力は、野生株包膜化領域を有するコントロールアデノウィルスと比較して、２〜５０分の１、有利には３〜２０分の１、好ましくは５〜１０分の１に減少している。

当然ながら、本発明による弱毒化アデノウィルスベクターは上記欠失の少くとも１つまたは何らかの組合せも更に含むことができる。

本発明によるアデノウィルスベクターは、天然または野生型アデノウィルス、有利にはイヌ、トリまたはヒトアデノウィルス、好ましくはヒトアデノウィルスタイプ２．３．４．５または７、最も好ましくはヒトアデノウィルスタイプ５　（Ａｄ５）のゲノムから誘導される。この後者の場合には、本発明によるアデノウィルスベクターの欠失は参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバンクで特定されているＡｄ５ゲノムのヌクレオチドの位置を参照して示される。

ヒトアデノウィルスタイプ５のゲノムから、（ｉ）ＥＩＢ領域の初期タンパク質をコードし、ヌクレオチド１６３４から始まり、ヌク・レオチド４ｏ４７で終わる部分の全体、および／または（１１）ヌクレオチド３２８００〜３５８２６にわたるＥ４領域、および／または（ｉ　ｉ　ｉ）ヌクレオチド２７８７１〜３０７４８にわたるＥ３領域の部分、および／または（１ｖ）下記包膜化領域の部分ニーヌクレオチド２７０〜ヌクレオチド３４６の範囲、または一ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３の範囲、または −ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３５８の範囲の欠失により誘導される本発明によるアデノウィルスベクターが最も好ましい。

好ましくは、本発明によるアデノウィルスベクターは野生型または天然アデノウィルスのゲノムから、そのゲノムの少くとも１８％、少くとも２２％、少くとも２５％、少くとも３０％、少くとも４０％、少くとも５０％、少くとも６０％、少くとも７０％、少くとも８０％、少くとも９０％または少くとも９５％、特に９８．５％の欠失により誘導される。

特に好ましい態様によると、本発明によるアデノウイルスベクターは、５′および：３”ｌＴＲと、粗膜化領域の全部または一部とを除いたアデノウィルスゲノムの全体の欠失により、アデノウィルスのゲノムから誘導される。この例によると、それは組換えのリスクおよび発癌性のリスクを制限して最大のクローニング能力を有するような最少数のウィルス配列のみを含んでいる。このようなベクターは“最小”アデノウィルスベクターと称され、３０ｋｂ以内の外来ヌクレオチド配列を挿入することが可能である。本発明による好ましいアデノウィルスベクターは、ヌクレオチド４５９〜３５８３２にわたるウィルスゲノムの部分の欠失により、ヒトアデノウィルスタイプ５から誘導される。

本発明に関して、本発明によるアデノウィルスベクターは、宿主細胞への外来ヌクレオチド配列の移入と、そこでのその発現をその目的として有する。“外来ヌクレオチド配列”は、コード配列とそのコード配列を発現させる調節配列を含んだ、コード配列がアデノウィルスのゲノムに通常存在しない配列である核酸を意味すると理解されている。調節配列はいかなる起源であってもよ０゜外来ヌクレオチド配列は、粗膜化領域と３−ＩＴＲとの間に、遺伝子工学の標準技術で本発明によるアデノウィルスベクター中に導入される。

外来ヌクレオチド配列は対象の、好ましくは治療対象の遺伝子１以上からなる。

本発明に関して、対象遺伝子はアンチセンスＲＮＡ、または対象タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡのいずれかをコードすることができる。対象遺伝子はゲノムタイプ、相補性ＤＮＡ　（ＣＤＮＡ）タイプまたは混合タイプ（少くとも１つのイントロンが欠失されているミニ遺伝子）である。それは成熟タンパク質、成熟タンパク質の前駆体、特に分泌されてこのためシグナルペプチドを含む前駆体、別間源の配列の融合によるキメラタンパク質、あるいは改善または改質された生物学的性質を示す天然タンパク質の変異体をコードすることができる。このような変異体は天然タンパク質をコードする遺伝子の１以上のヌクレオチドの変異、欠失、置換および／または付加により得られる。

対象遺伝子は、宿主細胞でのその発現に適した要素のコントロール下においてよい。′適切な要素”とは、ＲＮＡ　（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）へのその転写とタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳とに必要な一連の要素を意味すると理解されている。転写に必要な要素の中では、プロモーターが特に重要と思われる。それは構成プロモーターまたは調節プロモーターであって、真核生物またはウィルス起源と更にはアデノウィルス起源の遺伝子から単離することができる。一方、それは該当する対象遺伝子の天然プロモーターであってもよい。一般的に言えば、本発明で用いられるプロモーターは調節配列を含むように修飾してもよい。例として、本発明で使用の対象遺伝子は、リンパ球宿主細胞へのその移入を目標にすることが望まれるときに、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターのコントロール下におかれる。多数の細胞タイプで発現を行う、ＴＫ−ＨＳＶ−１（ヘルペスウィルス、タイプ１チミジンキナーゼ）遺伝子プロモーター、または一方で特にヒトアデノウィルスタイプ２のアデノウィルスＭＬＰプロモーターも挙げられる。

本発明に関して使用しつる対象遺伝子の中では、以下が挙げられる：一すイト力イン、例えばインターフェロンα、インターフェロンγ、インターロイキンをコードする遺伝子、−膜レセプター、例えば病原生物（ウィルス、細菌または寄生虫）、好ましくはＨＩＶウィルス（ヒト免疫不全ウィルス）により認識されるレセプターをコードする遺伝子、一凝固因子、例えば因子Ｖｌ１１および因子１ｘをコードする遺伝子、一シストロフィンをコードする遺伝子、−インスリンをコードする遺伝子、 −細胞イオンチャンネルに直接または間接的審こ関与するタンパク質、例えばＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症経膜伝達レギュレーター）タンパク質をコードする遺伝子、−病原生物のゲノムに存在する病原遺伝子による力Ａまた（よ発現が調節解除される細胞遺伝子、例えば癌遺伝子（こより生産されるタンパク質の活性を阻害できるアンチセンスＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子、−酵素活性を阻害するタンパク質、例えばα１−アンチトリプシンまたはウィルスプロテアーゼ阻害物質をコードする遺伝子、一生物学的機能を損うように変異された病原タンパク質の変異体、例えば標的配列に結合する上で天然タンパク質と競合して、それによりＨＩ■の活性化を妨げうる、例えばＨＩＶウィルスのＴＡＴタンパク質のトランス優性変異体をコードする遺伝子、一宿主細胞免疫を増加させるために抗原性エピトープをコードする遺伝子、一主要組織適合性複合体りラスＩおよび１１タンパク質をコードする遺伝子と、これら遺伝子のインデューサーであるタンパク質をコードする遺伝子、−細胞酵素または病原生物により生産されるものをコードする遺伝子、および一自殺遺伝子。ＴＫ−ＨＳＶ−１自殺遺伝子が特に挙げられる。ウィルスＴＫ酵素は、あるヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビアまたはガンシクロビア）に対して細胞ＴＫ酵素と比べ著しく大きな親和性を示す。

それはそれらを−リン酸分子に変換するが、これは毒性であるヌクレオチド前駆体にそれ自体が細胞酵素により変換されつる。これらのヌクレオチドアナログは合成中のＤＮＡ分子、ひいては主に複製状態にある細胞のＤＮＡ中に組み込むことができる。この組込みにより分裂細胞、例えば癌細胞を特に破壊することができる。

上記リストは限定的なものではなく、他の対象遺伝子も本発明に関して用いてよい。

更に、本発明のもう１つの態様によると、本発明によるアデノウィルスベクターは、非アデノウィルス転写をトランス活性化するタンパク質をコードする非治療遺伝子を更に含むことができる。当然ながら、トランス活性化タンパク質をコードするＥＩＡ領域の遺伝子、その発現はアデノウィルスを非欠陥にするリスクを生じる、は避けられる。５ｘｅｃｈａ＋ｏｍ７ｃｅｓ　ｃｅ＋ｅｙｉｓｉａｃ　Ｇ！＋４タンパク質をコードする遺伝子が選択されることが好ましい。その発現により、ベクターを補足系、例えば下記で増殖させることができる。このような系はより洗練させて、アデノウィルス補足性タンパク質の連続生産による起こりうる毒性の問題を軽減することができる。転写をトランス活性化するタンパク質をコードする遺伝子は、必要であれば、その発現に適した要素、例えば対象遺伝子を発現させる要素のコントロール下においてもよい。

本発明は、アデノウィルス粒子に加えて、本発明によるアデノウィルスベクターを含んだ真核宿主細胞にも関する。上記細胞は有利には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞であり、ゲノム中に組込み形で、または好ましくは非組込み（エピゾーム）形で上記ベクターを含むことができる。

本発明によるアデノウィルス粒子は、本発明によるアデノウィルスベクターに欠陥がある機能をインドランスで付与するいずれかの補足系、例えば従来の系２９３、で継代により生産してもよい。これらの生産技術は当業者に知られている（Ｇ＋ａｈａｍ　ａｎｄ　Ｐ＋ｃｖｅｃ、１９９１．Ｍｓｔｈｏｄｓ　１ｎＬｌｅｃｕｌａ＋　ＢｉａｌＢ２．ｖｏｌ、７．　ｌＮ−１２８，Ｅｄ：Ｂ、Ｉ、Ｍｕｔｔ７．ＴｈｅＨｕｍａｎ　Ｐｒｅ＋ｓ　Ｉｎｃ、）　。場合により、本発明によるアデノウィルス粒子は、下記のような本発明による補足系で作製してもよい。

よって、本発明は、特に！ＭＩＴＲを除くアデノウィルスのゲノムのＥ１領域の部分を含む補足要素を含んだ補足系にも関し、上記補足要素は欠陥アデノウィルスベクターをインドランスで補い、上記補足系のゲノムに組込むかまたは発現ベクター中に挿入することができる。

本発明に関して、“補足系”という用語は、アデノウィルスベクターに欠陥がある機能をインドランスで付与しうる真核細胞に関する。換言すれば、それは上記アデノウィルスベクターの複製および粗膜に必要なタンパク質、それ自ら生産できないウィルス粒子を作る上で要求される初期および／または後期タンパク質を生産することができる。当然ながら、上記部分はヌクレオチドの変異、欠失および／または付加により修飾してもよいが、但しこれらの修飾は補足性に関してその能力を損ってはならない。このため、８１機能に欠陥があるアデノウィルスベクターは（ベクターが生産できないＥ１領域によりコードされるタンパク質または一連のタンパク質をインドランスで供給できる）Ｅｌ用の補足系で増殖されなければならず、Ｅｌおよび８４機能に欠陥があるベクターは（ＥｌおよびＥ４領域によりコードされる必要タンパク質を供給する）ＥｌおよびＥ４用の補足系で増殖され、最後にＥｌ、Ｅ２および８４機能に欠陥があるベクターはその３機能用の補足系で増殖される。冒頭に挙げられたＥ３領域は非必須であり、特に補足される必要はない。

本発明による補足系は、無制限に分裂しつる不死化細胞系または一次系から誘導される。本発明により追求される目的によると、本発明による補足系はいずれかの欠陥アデノウィルスベクター、特に本発明による欠陥アデノウィルスベクターの粗膜に有用である。このため、“欠陥アデノウィルスベクター”という用語が以下で用いられるとき、それは従来または本発明いずれかの欠陥ベクターに関すると理解されるべきである。

“補足要素”は、本発明に関して使用上アデノウィルスゲノムの部分を少くとも含んだ核酸を意味すると理解される。それは例えばプラスミドまたはウィルスタイプのベクター、例えばレトロウィルスまたはアデノウィルスベクター、あるいはポックスウィルスに由来するものに挿入することができる。それでも、それが本発明による補足系のゲノムに組込まれている場合が好ましい。ベクターまたは核酸を細胞系中に導入して、できればそれを細胞のゲノムに組込む方法は、このような目的に使用できるベクターのように、当業者に周知の慣用的技術である。

補足要素は本発明による補足系中に予めまたは欠陥アデノウィルスベクターに伴い導入することができる。

特別の態様によると、本発明による補足系は８１機能に関して欠陥アデノウィルスベクターをインドランスで補うように考えられている。このような系は組換えのリスクを減少させるという利点を有しているが、その理由は従来の系２９３と異なりベクター中に存在する５”ＩＴＲを欠いているからである。

本発明に関して、本発明による補足系はアデノウィルスのゲノムのＥＩＡ領域の全部または一部と、（ｉ）　Ｅ　Ｉ　Ｂ、　Ｅ２およびＥ４領域から選択されるアデノウィルスのゲノムのうち少くとも１領域の全部または一部、または（１１）上記ゲノムのＥＩＢ、Ｅ２およびＥ４領域のうち少くとも２領域の全部または一部、または（ｉ　ｉ　ｉ）上記ゲノムのＥＩＢ、Ｅ２およびＥ４領域の全部または一部を含むことができる。

本発明に関して、上記領域はそれらを発現させる適切な要素のコントロール下に必要であればおいてもよいが、ＥＩＡ領域によりコードされる転写をトランス活性化するタンパク質により誘導しうるそれら自体のプロモーターのコントロール下にそれらをおくことが好ましい。

指針として、ＥＩＡ、ＥＩＢおよびＥ４領域を含んだ例（ＩＩ）による補足系は、ＥｌおよびＥ４領域に欠陥があって対応領域の全部または一部が欠失されたアデノウィルスの生産に向けられる。

有利な態様によると、本発明による補足系は、特にＥＩＡ領域の全部または一部と、ＥＩＢ領域の初期タンパク質をコードする配列の全体を含んでいる。

更に、この態様の例によると、本発明による補足系はＥＩＡ領域のプロモーター領域を更に欠くことができる。

この場合に、上記ＥＩＡ領域の初期タンパク質をコードするアデノウィルスのゲノムの部分は、上記補足系で機能する適切な異種プロモーターのコントロール下におかれる。それはいずれの真核またはウィルス遺伝子からも単離することができる。しかしながら、初期領域のアデノウィルスプロモーターの使用は避けつる。該当するプロモーターは構成プロモーターである。例として、５ｖ４０ウイルス、ＴＫ−Ｈ３Ｖ−１遺伝子およびネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターも挙げられる。

一方、選択されるプロモーターは、非アデノウィルス転写をトランス活性化するタンパク質により調節および有利には誘導しつる。それは天然誘導性遺伝子から単離されたプロモーターであっても、あるいは上記トランス活性化タンパク質に応答する活性化配列（または上流活性化配列を表すＵＡＳ）の付加により修飾されたいずれのプロモーターであってもよい。更に具体的には、Ｓａｃｃｈａｕｍ７ｃｅｓ　ｃｅ＋ｅｙｉｓｉｘｅ　Ｇ！＋４タンパク質により誘導されうるプロモーター、好ましくは何らがの種類の遺伝子（例えば、ＴＫ−Ｈ３Ｖ−１遺伝子またはＡｄ２ＭＬＰ）の転写開始配列（ＴＡＴＡボックスおよび開始部位）のみを含むいわゆる“最小”プロモーターからなるハイブリッドプロモーターを用いることが好ましく、その上流にはＳａｃｃｈａｒｏｍ７ｃｅｓ　ｃｅ＋ｅｖｉｓｉｘｅ　Ｇ！１１０遺伝子の少くとも１つの活性化配列が挿入される（Ｗｅｈｓｔｅｒ　ｅｊａｔ、、　１９８８．　Ｃｅ１ｌ、　５２．１６９−１７８）　、後者の配列は化学的に合成しても、または遺伝子工学の標準技術に従いＧａ１ｌＧ遺伝子から単離してもよい。こうしてハイブリッドプロモーターは活性化され、Ｇａ１４タンパク質の存在下のみで、そのコントロール下におがれたＥＩＡ領域によりコードされる遺伝子の発現を誘導する。次いでＥＩＡ領域の発現産物は、本発明による補足系に場合により含まれる他のＥＩＢＳＥ２および／またはＥ４初期領域の発現を誘導することができるようになる。本発明のこの具体的態様は、補足性に必要なアデノウィルスタンパク質の構成的生産（おそらく毒性）を回避する。このため、誘導はＧａ１４タンパク質を発現する本発明による欠陥アデノウィルスベクターの存在下で誘発される。しかしながら、このような系はインドランスでＧａ１４タンパク質を供給する条件でいずれかの欠陥アデノウィルスベクターを生産するために用いてもよい。インドランスでタンパク質を供給する手段は当業者に知られている。

一般的に、補足系は動物アデノウィルスから有利に誘導されるアデノウィルス、例えばイヌまたはトリアデノウィルス、あるいは好ましくはヒトアデノウィルス、最も好ましくはタイプ２または５のゲノムの部分を含んでなる。

本発明による補足系は、（１）参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂｘｎｋデータバンクで開示されている配列のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５２９７、または（１１）ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド４０３４、または（ｉｉｉ）ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド４０３４にわたるヒトアデノウィルスタイプ５のゲノムの部分を特に含んでいる。

有利には、（１１）によるゲノムの部分は転写終結シグナル、例えばＳＶ４０　（シミアンウィルス４０）またはウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルの上流に挿入される。一方、ＥＩＡ領域のプロモーター配列もＥＩＢ領域の転写終結シグナルも含まない（ｉｉｉ）の部分は、適切なプロモーター、特にＧａ１４タンパク質により誘導しうるプロモーターと、転写終結シグナル、例えばウサギβ−グロビン遺伝子とのコントロール下におかれる。このような補足系は特に安全であると考えられ、その理由はそれが欠陥アデノウィルスと共通した配列の大部分を欠いているからである。

更に、本発明による補足系は、参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバンクで開示されている配列のヌクレオチド３２８００から始まりヌクレオチド３５８２６で終わるヒトアデノウィルスタイプ５のＥ４領域の部分を含むことができる。

更に、本発明による補足系は、粗膜化領域と、５′および３”ＩＴＲと、そして最も好ましくは参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバンクで開示されている配列のヌクレオチド５０５から始まりヌクレオチド３５８２６で終わるヒトアデノウィルスタイプ５のゲノムの部分とを除いて、天然アデノウィルスのゲノムの全体を含むことができる。本発明の目的から、この部分は適切なプロモーターのコントロール下におかれる。５ｘｃｃｈａ＋ａｍ７ｃｅ＋ｃｅｒｅｖロｉａｅ　Ｇａ１４タンパク質により誘導されうるプロモーターを用いるのが好ましい。このような系によれば、Ｅｌ、Ｅ２および８４機能に欠陥があるアデノウイルスベクター、特に本発明による最小アデノウィルスベクターの複製および粗膜化に必須な機能のすべてをインドランスで補うことができる。

好ましい態様によると、本発明による補足系は、それを含有した細胞を検出および単離できる選択マーカーをコードする遺伝子を更に含んだ補足要素を含有することができる。本発明に関して、これは選択マーカーをコードするいずれの遺伝子であってもよく、このような遺伝子、有利には抗生物質耐性に関する遺伝子、好ましくはプロマイシン耐性を付与するプロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ遺伝子）をコードする遺伝子は通常当業者に知られている。

本発明に関して、選択マーカーをコードする遺伝子は、その発現を行う適切な要素のコントロール下においてもよい。これらには構成プロモーター、例えばＳＶ４０ウィルス初期プロモーターがある。しかしながら、ＥＩＡ領域によりコードされるトランス活性化タンパク質で誘導されうるプロモーター、特にＥ２Ａアデノウィルスプロモーターが好ましい。このような組合せは、本発明による補足系でＥＩＡ領域の遺伝子の発現を維持するための選択の圧力を誘導する。本発明の目的から、選択されるプロモーターはヌクレオチドの欠失、変異、置換および／または付加により修飾されていてもよい。

最も好ましい態様によると、本発明による補足系は薬学的観点から許容される細胞系から誘導される。“薬学的観点から許容される細胞系”は、特徴付けられて（その起源および由来が知られている）および／またはヒト用の産物の大規模生産（高度臨床試験用バッチまたは販売用バッチのアセンブリー）に既に用いられた細胞系を意味すると理解されている。このような系はＡＴＣＣのような組織から入手できる。この点においては、Ｖｅｔｏアフリカミドリザル腎臓、ＢＨＫゴールデンまたは５７ｒｉｘｎハムスター腎臓系、肺癌腫に由来するＡ３４９ヒト系と、ＭＲＣ５ヒト肺、Ｗ１３８ヒト肺およびＣＨＯチャーニーズハムスター卵巣系が挙げられる。

一方、本発明による補足系は一次細胞、特にヒト胚から採取される網膜細胞から誘導することができる。

本発明は本発明によるアデノウィルス粒子の生産方法にも関し、それによれば一本発明によるアデノウィルスベクターが、トランスフェクトされた補足系を得るために、上記ベクターをインドランスで補える補足系中に導入され、−上記補足系が上記アデノウィルス粒子の生産を行うために適した条件に従い培養され、および−上記粒子が細胞培養で回収される。

当然ながら、アデノウィルス粒子は培養上澄から、但し慣用的プロトコールにより細胞からも回収される。

好ましくは、本発明による方法では本発明による補足系を用いる。

本発明の主題は、本発明によるアデノウィルスベクター、アデノウィルス粒子、真核宿主細胞または補足系の治療または予防のための使用にも関する。

最後に、本発明は、薬学的観点から許容されるビヒクルとともに、本発明によるアデノウィルスベクター、アデノウィルス粒子、真核細胞または相補細胞を治療または予防剤として含んでなる、医薬組成物に関する。

本発明による組成物は、疾患、例えば −遺伝障害、例えば血友病、嚢胞性繊維症またはデュシエーヌおよびベラカータイプ筋障害、−癌、例えば癌遺伝子またはウィルスにより誘導される癌、 −レトロウイルス疾患、例えばエイズ（ＨＩ　Ｖ感染に起因する後天性免疫不全症候群）、および−再発ウィルス疾患、例えばヘルペスウィルス誘導感染の予防または治療用として特に考えられている。

本発明による医薬組成物は常法で製造される。特に、治療有効量の治療または予防剤が、ビヒクル、例えば希釈剤と組み合わされる。本発明による組成物はエアゾールにより、あるいは当業界で使用上慣用的ないずれかの経路、特に経口、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、肺内または気管内経路により投与される。投与は１回分の用量で、またはある時間間隔後に１回以上繰返される用量で行う。適切な投与経路および投与量は様々なパラメーター、例えば治療される個体または治療される障害、あるいは移入される対象遺伝子に応じて変わる。一般的に言えば、本発明による医薬組成物は１０〜１ｏ１４、有利には１０〜１０　、好ましくは１０〜１ｏ１１の本発明によるアデノウィルスの投与量を含む。医薬組成物、特に予防目的に用いられるものは、薬学的観点から許容されるアジュバントを更に含むことができる。

本発明は、本発明によるアデノウィルスベクター、アデノウィルス粒子、真核細胞または補足系の治療有効量がこのような治療を要する患者に投与される治療方法も包含している。

本発明は下記図面を参照して下記例により詳細に記載されている。

図１は、異なる遺伝子の位置を示した、ヒトアデノウィルスタイプ５のゲノムの（０〜１００の任意単位で表される）略図である。

図２はベクターｐＴＧ６５４６の略図である。

図３はベクターｐＴＧ６５８１の略図である。

図４はベクターｐＴＧ６３０３の略図である。

図５はベクターｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１の略図である。

図６はベクターｐＴＧ１６５３、ｐＴＧ１６５４およびｐＴＧ１６５５の略図である。

図７はベクターｐＴＧ５９１３の略図テある。

図８はベクターｐＴＧ８５１２の略図である。

図９はベクターｐＴＧ８５１３の略図である。

図１０はベクターｐＴＧ８５１４の略図である。

図１１はベクターｐＴＧ８５１５の略図である。

撚下記例は本発明の一態様のみを示している。

下記構築は、Ｍｘｎｉａ山ｅｔ　ａｌ、　（１９８９，Ｌｘｂｏｒａｊｏｒ７Ｍ！ｎｕｘｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ＋ｂｏ＋、Ｌｘｂｏｒａ）ｏｒ７　Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）で詳述された遺伝子工学および分子クローニングの一般的技術に従い行う。細菌プラスミドを用いるクローニングの選択工程はε５ｃｈｅ＋１ｃｈｉｘ　ｃｏ［ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）株５ＫまたはＢＪで継代により行なわれ、一方ファージＭ１３から誘導されたベクターを用いる場合はＥ、ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２で継代により行なわれる。ＰＣＲ増幅の工程に関しては、ＰＣＲＰ＋ｏｔｏｃｏｌ＋　−Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔ。

ｍｅｌｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｆｉａｎｓ（１！１９（１，ｅｄＨ！ｄ　ｂ７１ｎｎｉｓ。

Ｇｅ１ｆｘｎｄ、５ｎｉｎｓｋ７　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、）で記載されたプロトコールが適用される。

更に、細胞は当業者に周知の標準技術に従いトランスフェクトする。リン酸カルシウム技術（Ｍｘｎｉｕ口ｅｊ　ｔｌ。

、　ｔｅｒａ）　も挙げられる。しがしながら、核酸を細胞内に導入させつる他のプロトコール、例えばＤＥＡＥデキストラン技術、エレクトロポレーション、浸透圧ショックに基づく方法、選択細胞のマイクロインジェクションまたはリポソームの使用に基づく方法も用いてよい。

下記の異なる構築体に挿入された断片は、−参照番号Ｍ７３２６０（！：　Ｌ　テＧｅｎｅｂａｎｋチー　９　バンクｔ’開示されているＡｄ５ゲノム、一参照番号１０１９４９としてＧｅｎｅｂａｎげ一タバンクで開示されているアデノウィルスタイプ２（Ａｄ２）ゲノム、−参照番号ＪＯ２４００としてＧｃｎｅｂｘｎｋデータバンクで開示されているＳＶ４０ウィルスゲノムのヌクレオチド配列でそれらの位置に従い正確に示されている。

ＮＩ：ａｌ［ｆ［呈旦４幻りＣ＊Ｇａ／ｕ亙二！！　１１１　（［Ｓ　”　７７ ’７３の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立て以下を含んだベクターニーＡｄ５ゲノムの５１ＴＲ（ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１０３）、 −ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３にわたる部分が欠失されて、１７６位のチミン（Ｔ）がＡａｔｌｌ制限部位を作るためにシトシン（ｃ）に変えられた、ヌクレオチド１０４〜４５８にあるＡｄ５包膜化膜化領域５′から３′にかけてＡｄ２　ＭＬＰ　（ヌクレオチド５７７９〜６０３８）　、ＫｐｎＩ−Ｘｂａｌ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位、ＣＦＴＲタンパク質をコードするヒトｃ　ＤＮＡ　（Ｒｉｏ＋ｄａｎ　ｅｌｌｌ、　、　１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ、　２４５．１０６６−１０７３　で公表された配列に相当するアミノ酸組成；但し４７０位はメチオニンの代わりにバリン）、ＰｓｔＩ、Ｘｈｏｌおよび５ａｌＩ部位と、最後にＳＶ４０ウイルス転写終結シグナル（ヌクレオチド２６６５〜２５３８）を含んでなる、対象遺伝子の発現用カセット、および −ヌクレオチド３３２９〜ヌクレオチド６２４１にわたるＡｄ５ゲノムの断片を組み立てる。

第一段階では、ｐＭＬＰｌｌから単離されたＥｃｏＲｌ　−Ｓｍａ　Ｉ断片をベクターＭｌ　３ＴＧ１３１　（Ｋｉｅｎ７Ｎ　ｘｉ、　、　１９８３．　Ｇｅｎｅ、　２６．９ｌ−９９）　のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位間に組み込んでクローニングする。この組立てはｐ　Ｍ　Ｌ　Ｐ　１０　（Ｌｅｖｒｅ＋ｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１．Ｇｅｎｅ、　１０１゜１９５−２０２）から始めるが、Ｈｉｎｄｌ１１部位におけるＳｍａ　Ｉ部位の導入により親ベクターとは異なる。ベクターＭ１３ＴＧ６５０１を得る。後者は、粗膜化領域のヌクレオチド１８４〜２７３間にある配列を欠失させるために、特定部位変異誘発に付す。特定部位変異誘発では供給業者の勧めに従い市販キット（Ａｍｅｒｓｈｘｍ）を用いて行い、配列確認Ｎα１（配列番号１）で示されたオリゴヌクレオチド○ＴＧ４１７４を用いる。変異ベクターをＭｌ　３７Ｇ６５０２と命名した。こうして欠失された粗膜化領域はＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉで切断されたベクター９ＭＬＰ１１中にＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片の形で再導入するが、そのＢｇｌ１１部位はフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されている。

得られたベクターｐＴＧ６５００をＰｓｔＩで部分的に切断し、ファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後Ｐｖｕ　Ｉで切断する。（ｐＭＬＰｌｌから誘導された）ｐＴＧ５９５５から単離されたＰｖｕＩ−ＨｐａＩ断片をこのベクター中に挿入する。この断片はＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルとヌクレオチド３３２９〜ヌクレオチド６２４１にわたるＡｄ５ゲノムの部分を含んでいる。こうして形成されたベクターｐＴＧ６５０５を５ｐｈＩで部分的に切断し、ファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、再結合させるが、この目的はポリリンカーの５′末端に位置するｓｐｈ　Ｉ部位を壊すことである。これによりｐＴＧ６５１１を得て、その中に、ＢａｍＨＩ切断およびフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理後に、ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡ＠ＸｈｏＩ−ＡｖａＩ切断およびフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理により形成された平滑末端化断片の形で組み込んでクローニングする。

ｐＴＧ６５２５を得る。指針として、ＣＦＴＲｃＤＮＡは従来のプラスミド、例えばｐＴＧ５９６０（Ｄａｌｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９９１．Ｎａｔｕｒｅ、３５４．５２６−５２８）から単離する。

４６の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立てベクターＭｌ　３ＴＧ６５０１を、オリゴヌクレオチド０ＴＧ４１７３（配列番号２）を用いる特定部位変異誘発に付す。次いで変異断片を前記のようにｐＭＬＰ１１中に再導入して、ベクターｐＴＧ６５０１を得る。後者をｓｐｈ　Ｉで切断し、ファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ、その後Ｐｖｕ　Ｉで処理する。ｐＴＧ６５４６　（図２）は、ｐＴＧ６５２５から単離されたＰｖｕ　Ｉ　−Ｋｐｎ　Ｉ断片（ＫｐｎＩ部位は平滑化されている）をクローニングして、ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡを含有させることにょ３５８の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立てベクターＭ１３ＴＧ６５０１を、粗膜化領域のヌクレオチド２８７〜３５８間にある配列を欠失させるために特定部位変異誘発に付し、Ｎｃｏ１部位を導入するために２７５および２７６位のチミンをグアニンに変えて、Ｎｃｏ１部位を導入する。変異誘発はオリゴヌクレオチド０ＴＧ４１９１　（配列番号３）を用いて行い、Ｍ１３ＴＧ６５０７を得る。後者をＢｇｌｌ＋で開裂させ、フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後ＥｃｏＲＩで切断し、対応変異断片を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで切断されたｐＭＬＰ１１中に導入する。

ｐＴＧ６５０４を得て、それから５ｐｈＩ　（ファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化された部位）−Ｐｖｕ　Ｉ断片を単離し、ｐＴＧ６５１１のＫｐｎＩ部位（Ｔ４ポリメラーゼ処理で平滑化）とＰｖｕ　１部位との間に挿入する。ｐＴＧ６５１３を得て、これをＢａｍＨＩおよびフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してから、ｐＴＧ５９６０のＡｖａＩおよびＸｈｏＩ断片を挿入して、ｐＴＧ６５２６を得る。

４、欠陥および弱毒化組換えアデノウィルスの作製欠陥組換えアデノウィルスは、相同的組換えで組換えウィルスを得るために、Ｃ１ａＩおよびＡｄ−ｄ１３２４ゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（Ｔｈｉｍｍａｐｐａ７ｘ　ｅｌ　ａｌ、、　１９８２．　Ｃｅ１１．３１．５４３−５５１）で直鎖化されて更にＣ１ａＩで切断されたｐＴＧ６５２５、ｐＴＧ６５２６またはｐＴＧ６５４６の２９３細胞中へのコトランスフェクションにより作製する。８〜１０日後、個々のプラークを単離し、２９３細胞で増幅させ、制限地図作製により分析する。ウィルスストック（ＡｄＴＧ６５２５、ＡｄＴＧ６５２６およびＡｄＴＧ６５４６）を集め、それらの力価を慣用的技術に従い調べる。

ＡｄＴＧ６５４６ウイルスは、野生型粗膜化領域を含むＡ　ｄ　−ＣＦ　ＴＲ（Ｒｏｓｅｎｌｅｌｄ　ｅｌ　ａｌ、、１９９２．Ｃｅ１ｌ、６８，１４３−１５５１　との同時感染により、競合状況下におく。２９３細胞を細胞当たり５ｐｌｕ（、、’リーダ形成単位）のＡｄ−ＣＦＴＲおよび５　ｐｌｕのＡｄＴＧ６５４６で感染させる。

並行して、全ウィルスＤＮＡをＨｉＮ’ｉ法（Ｇｌｕｘｍａｎ　ａｎｄＶａｎ　Ｄｏｚｅｎ、　１９８３．１．　Ｖｉ＋ｏ１．、４５９ｌ−１０３）　により単離し、粗膜化ウィルスＤＮＡを０．　％デオキシコール酸とその後１０μｇ／ｍ　ｌのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）■で細胞を処理した後に単離して、ピリオンで保護されていないＤＮＡを除去すＺ０全Ａｄ−ＣＦＴＲおよびＡｄＴＧ６５４６　ＤＮＡの量は同一であるが、粗膜化ＡｄＴＧ６５４６　ＤＮＡの約３倍の粗膜化Ａｄ−ＣＦＴＲＤＮＡがある。

ＡｄＴＧ６５４６感染２９３細胞の細胞抽出物中におけるＣＦＴＲタンパク質の発現のレベルを測定する。分析はＤａｌｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１，Ｎａｔｕｒｅ、５ｕｐｒａ）に記載された技術に従いウェスタンブロッティングによりモノクローナル抗体ＭＡＴＧ１０３１を用いて行う。しかしながら、ＣＦＴＲタンパク質の抗原性エピトープを認識するいずれの他の抗体も用いてよい。約１７０　ｋＤａの予想分子量の産物を検出する。指針として、生産のレベルは未刊毒化Ａｄ−ＣＦＴＲウィルスで感染された細胞抽出物で得られる場合におおよそ等しい。

例２：ＥＩＡ領域とＥＩＢ領域の初期タンパク質をコードする配列の全体が欠失された欠陥アデノウィルスの作このようなアデノウィルスは、５′から３′にかけて−Ａｄ５　５−ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１ｏ３）、−Ａｄ５包膜化膜化領域クレオチド１０４〜４５８）、−下記要素を含んだ発現カセットを含む外来ヌクレオチド。

・Ａｄ２　ＭＬＰ　（ヌクレオチド５７７９〜６０３８）、その後Ａｄ２の３つの三部分リーダー（ヌクレオチド６０３９〜６０７９　；ヌクレオチド７１０１〜７１７５；ヌクレオチド９６３７〜９７１２）；これらのリーダーは下流に挿入された配列の翻訳の効率を増加させるために含まれる、・対象遺伝子のクローニングに使用しうるＸｂａＩ、Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ　、ＢａｍＨＩＳＥｃｏＲＶ、Ｈｐａ　ＩおよびＮｏｔＩ制限部位を５′から３′にかけて含んだポリリンカー、・対象遺伝子、例えばＣＦＴＲタンパク質をコードする遺伝子、・ＳＶ４０ウイルスから単離された転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜２６１８）、−ヌクレオチド４０４７〜６２４１にわたるＡｄ５アデノウィルスゲノムの部分を含んだプラスミドベクターｐＴＧ６５８１から作製する。

ヌクレオチド４０４７〜ヌクレオチド４６１４にわたるＡｄ５ゲノムの断片をＡｄ５ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅させる。ＰＣＲ反応では、後のクローニング工程を容易にするためにＢａｍＨ１部位を５′末端に含むセンスプライマー０ＴＧ５０２１　（配列番号４）とアンチセンスプライマー０ＴＧ５１５７　（配列番号５）を用いる。こうして形成された断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してから、Ｍ　１３　ｍ　ｌ）　１８　（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）のＳｍａ　Ｉ部位中に組み込んでクローニングして、Ｍ１３ＴＧ６５１７を得る。ＰＣＲで形成された断片の配列は、標準酵素方法（Ｓａｎｇｅ【ｅｌ　ａｌ、、１９７７、Ｐ＋ｏｃ、ＮａＮ、Ａｃ１ｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３）に従い確認する。

別に、Ｐｖｕ　Ｉ　−Ｓｍａ　Ｉ断片をｐＭＬＰｌｌから単離する。それをｐＴＧ６５１１　（例１．１）のＰｖｕ　Ｉと〜ｐｎ１部位間に組み込んでクローニングするが、ＫｐｎＩ部位は標準方法に従いファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されている。ベクターｐＴＧ６５４７はこうして形成する。

後者を酵素５ａｌｌおよびＢｓ　ｔＸＩで切断し、２つの断片に結合させるが、一方はＭ１３ＴＧ６５１７の精製ＢａｍＨＩ　−Ｂｓ　ｔＸＩ断片で、他方はｐＴＧ６１８５のＸｈｏ　Ｉ　−Ｂｇ　ＩＩＩ断片である。後者はＸｈｏＩおよびＢ　ｇ　ｌ　ｌ！制限部位に隣接するＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルを特に含んでいる。しかしながら、同様の終結配列と適切な制限部位を含んだいずれか他のプラスミドも使用できる。ベクターｐＴＧ６５５５を得るが、その中に、２つの制限部位形成平滑末端ＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを含むアダプターを唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入する。このアダプターはオリゴヌクレオチド０ＴＧ５５６４および０ＴＧ５５６５　（配列番号：６および７）の組換えから形成する。ｐＴＧ６５８０を得る。最後に、末端が平滑化されてヒトｃＦＴＲｃＤＮＡを含むｐＴＧ６５２５の５ａｃｌ−Ｐｓｔｌ断片を、ｐＴＧ６５８０のＥｃｏＲＶ部位中に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ６５８１　（図３）を得る。

対応組換えアデノウィルスＡｄＴＧ６５８１は、標準プロトコールに従い、Ｅ１機能用の補足系、例えば系２９３または例６の系中への、双方ともＣ１ａＩで開裂されたｐＴＧ６５８１およびＡｄ　ｄ１３２４のコトランスフエクションにより得る。

２、ＩＦＮ−７発現用の組換えアデノウィルスの生産ベクターｐＴＧ６３０３　（図４）を、Ｍ１３ＴＧ２４３７のＨｐａｌ−５ｍａＩ断片をｐＴＧ６５８０のＨｐａＩ部位中に組み込んでクローニングすることにより得る。上記断片は、配列がＧｒｉ７　ｅｔ１＋、　（１９８２，Ｎｘｔｕｒｅ。

２９５、５０３−５０８）で特定されているインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）をコードする遺伝子をベクターＭ　ｌ　３　Ｔ　Ｇ　１３０　（ＫｉｅＢ　ｃｌ　ｓｌ、、１９８３，５ｕｐｒｚ）　に組み込んでクローニングすることにより得る。組換えアデノウィルスＡｄＴＧ６３０３は、標準技術に従い、Ｅ１機能に関する補足系中へのＣ１ａＩで直鎖化されたｐＴＧ６３０３およびＡｄ　ｄ１３２４のコトランスフエクションに基づく相同的組換えにより得る。

３、Ｅ１領域が欠失されてＥ３領域が構成プロモーターのコントロール下におかれているアデノウィルスの作製ベクターｐＴＧ１６７０は、ベクターｐポリＩＩ（Ｌａｔｈｅｃｌ　１１．、１９８７．　Ｇｅｎｅ、　５７．１９３−２０１）のＡａｔｌｌ−ＢａｍＨ■部位間にＲ３Ｖウィルス（ラウス肉腫ウィルス）３′ ＬＴＲ（、長末端反復）を含むＰＣＲ断片をクローニングすることにより得る。

ＰＣＲ反応では、鋳型としてベクターｐ　ＲＳ　Ｖ／　Ｌ　（Ｄｅ　Ｗｅｔ　ｅｔ　！１．．１９８７．Ｍｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ。

７、７２５−７３７）と、プライマー○ＴＧ５８９２および○ＴＧ５８９３　（配列番号８および９）を用いる。

別に、Ｅ３領域の５′部分（ヌクレオチド２７５８８〜２８６０７）は、ベクターｐＴＧ１６５９からプライマー０ＴＧ５９２０および０ＴＧ５８９１　（配列番号１０および１１）を用いたＰＣＲにより増幅させる。後者のベクターは数工程で組み立てる。ＢａｍＨＩ−Ａｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド２１５６２〜２８７５２）をＡｄ５ゲノムＤＮＡから得て、その後ｐＴＧ７４５７の同部位間に組み込んでクローニングして、ｐＴＧ１６４９を得る。

ベクターｐＴＧ７４５７は、特にＡｖｒ１１部位を含むようにポリリンカー中で修飾されたｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）である。次いでＭ１３７Ｇ１６４６　（例８）のＥｃｏＲＩ　（フレノウ）−Ａｖｒｌｌ断片をＡｖｒｌｌＮｄｅＩ（フレノウ）で開裂されたｐＴＧ１６４９中に導入して、ベクターｐＴＧ１６５１を得る。最後に、ｐＴＧ１６５９を、Ａｖｒｌｌで直鎖化されたｐＴＧ１６５１中にＡｄ５ゲノムＤＮＡの精製Ａｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド２８７５２〜３５４６３）を挿入することにより得る。ＰＣＲ断片をｐポリ１１のＸｂａＩ〜ＢａｍＨＩ部位間に組み込んで、ｐＴＧ１６７１を得る。次いでｐＴＧ１６７０から得られたＥｃｏＲＶ−Ａａｔｌｌ断片をｐＴＧ１６７１のＡａｔ１１部位に挿入して、ｐＴＧ１６７６を得る。

ヌクレオチド２７３３１〜３００４９に相当するＡｄ５のＥｃｏＲＩ断片をゲノムＤＮＡ調製物から単離し、ＥｃｏＲＩで既に開裂されたｐ　ＢＩｕｅｔｃ＋ｉｐｊ　−Ｓ　ｋ　＋（Ｓ＋ｒａ１ｇｏｎｅ）中に組み込んでサブクローニングする。

ｐＴＧ１６６９を得る。後者は２７８６７位（変異原性オリゴヌクレオチド０ＴＧ６０７９；配列番号１２）または２８２４９位（変異原性オリゴヌクレオチドＯＴＧ６０８０；配列番号１３）でＢａｍＨ１部位を導入することにより変異させる（Ａｍｅ＋ｓｈａｍ　ｋＮ）。ｐＴＧ１６７２およびｐＴＧ１６７３３を各々得る。Ｒ３Ｖ　３−ＬＴＲＩ、：続いてＥ３領域の５′部分を含むＢａｍＨＩ −ＢｓｉＷＩ断片をベクターｐＴＧ１６７６から単離し、先の工程で得られたベクターのＢａｍＨＩ部位（２７３３１または３００４９位）とＢｓｌＷ部位（２８３９０位）との間に挿入して、ｐＴＧ１９７７およびｐＴＧ１９７８を得る。

次いでこれら２つのベクターの各々から得られたＥｃｏＲＩ断片を野生型ＥｃｏＲＩ断片の代わりとしてｐＴＧ１６７９に組込む。ｐＴＧ１６７９−Ｅ３　を得る。参考のため、ベクターｐＴＧ１６７９はｐＴＧ６５８４（例３．１）のＢｓｔＥＩ１部位とＢａｍＨ１部位（クレノウボリメラーゼ処理により平滑化された部位）との間に組み込まれたｐＴＧ６５９０　（例３．１）のＢｓｔＥＩＩ−Ｋｐｎｌ断片（Ｔ４ポリメラーゼ処理によ　゛り平滑化された部位）のクローニングから得る。

アデノウィルス粒子は、ｐＴＧ１６７９−Ｅ３＋のＡａｔｌｌ断片とアデノウィルスベクター、例えばＡｄｄ１３２４またはＡｄ−Ｒ３Ｖβ−ｇａｌとの間でＥ１機能用の補足系における相同的組換えにより作製する。後者はＥ１領域の代わりにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んている（Ｓｔ＋ａｌｌｏ＋ｄ−Ｐｅ＋＋１ｃａｕｄｅｔ　ｅ＋　！＋、、１９９２゜］、　Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖｅｕ、、　９０．６２６−６３０）。

例３　ＥｌおよびＥ３領域の部分的欠失による改善されたクローニング能力を有した組換えアデノウィルスベタヌクレオチド２フ３２５〜２フ８フ１間にあるＡｄ５ゲノムの部分を有した断片を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマー〇ＴＧ６０６４およびプライマー０ＴＧ６０６５　（配列番号１４および１５）を用イたＰｃＲにより増幅させる。０ＴＧ６０６５はその５′末端にＢｓｍＩ部位を含むが、これはＥ３領域でも（３０７５０位に）存在している。

増幅された断片をＭｌ　３ｍｐ　１８のＳｍａ　１部位に組み込んでクローニングし、Ｍ１３７Ｇ６５２３を得る。

ＥｃｏＲＩ−ＢｓｍＩ断片を後者から単離し、同酵素で開裂されたベクターｐＴＧ６５９０中に導入する。ｐＴＧ６５９０Δ３が得られ、これはアデノウィルスゲノムの３″部分（ヌクレオチド２７０８２〜３５９３５）を含んでいるが、その部分からはヌクレオチド２７８７２〜３０７４０間にあるＥ３領域が欠失され、一方Ｅ３領域のもっと小さな部分（２８５９２〜３０４７０位）はｐＴＧ６５９０から欠失されていた。ベクターｐＴＧ６５９０は下記のようにして得る。ヌクレオチド３５２２８〜３５９３５にわたる断片（３−ＩＴＲを含む）をＡｄ５ゲノム調製物からプライマー０ＴＧ５４８１および０ＴＧ５４８２　（配列番号１６および１７）ニよるＰＣＲで形成する。次いでこの断片をＭｌ　３ｍｐ　１８のＳｍａ■部位に組み込んでクローニングし、Ｍ１３７Ｇ６５１９を得る。別に、ベクターｐＴＧ６５８４をＸｂａＩで切断し、その後Ｅ３領域の対応断片を除去するために再結合させる。ｐＴＧ６５８９を得て、これをＢａｍＨＩで開裂させ、フレノウで処理し、その後ＢｓｔＥＩｌで切断する。Ｍ　１３　Ｔ　Ｇ　６５１９の精製ＥｃｏＲＩ　（フレノウ）−ＢｓｔＥＩＩ断片をこうして処理されたベクター中に導入して、ｐＴＧ６５９０を得る。

参考のため、ベクターｐＴＧ６５８４は唯一の５ｐｅｌ部位（２７０８２位）〜Ｅ４領域のプロモーター領域の開始部（３５８２６位）にわたるＡｄ５配列を含んだｐｌＪｃ１９ベクター（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）である。それはｐＴＧ１６５９　（例２．３）を５ａｌｌおよび５ｐｅｌで切断し、フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後再結合させることにより得る。

ｇ　＋）　１９　ｋＤａをコードするＡｄ５のＥ３領域の部分（ヌクレオチド２８７３１〜２９２１７）を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡｆｉ製物からプライマー０ＴＧ５４５５および０ＴＧ５４５６　（配列番号１８および１９）を用いたＰ　Ｃ’ Ｒにより得る。形成された断片をＭｌ　３ｍｐ　１８のＳｍａ１部位中に導入して、Ｍ１３７Ｇ６５２０を得る。後者のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片を単、離して、ｐＴＧ１６７０（例２．３）のＡａｔ１１部位に組み込んでクローニングするが、その部位はフレノウＤＮＡポリンラーゼ処理で平滑化されている。次いで先の工程のベクターの精製Ｘｂａｌ断片をベクターｐＴＧ６５９０ΔＥ３（例３゜１）のＸｂａ１部位中に挿入する。

３、アデノウィルス粒子の生産組換えウィルス粒子を、ＡｄＴＧ６３０３またはＡｄＴＧ６５８１ゲノムＤＮＡから単離された５ｐｅｌ断片と例３．１および３．２のベクターのどれかとの結合により得る。次いで結合混合物を８１機能に関する補足系中にトランスフェクトする。

ヌクレオチド３１８０３〜３２７９９および３５８２７〜３５９３５にわたるアデノウィルスゲノムの部分を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマーＯＴＧ　５７２８および０ＴＧ５７２９　（配列番号２０および２１）と０ＴＧ５７３０および０ＴＧ５７８１　（配列番号２２および１６）を各々用いて増幅させる。約１０回の増幅サイクル後に、反応はオリゴヌクレオチド０ＴＧ５７２８および○ＴＧ５７８１を用いて２反応混合物の一部に基づき続ける。増幅断片はヌクレオチド３１８０３〜３５９３５にわたり、Ｅ４領域の全部（３２８００〜３５８２６位）が欠失している。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌ切断後に、それをＭｌ　３ｍｐ　１８の同部位間に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５２１を得る。

Ｍ１３ＴＧ６５２１をＥｃｏＲＩで切断し、フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後Ｂｓ　ｔＸＩで開裂する。３−　ＬＴＲを含んだ０．４６ｋｈ断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されたＢａｍＨ１部位とｐＴＧ６５８４　（例３，１）のＢｓｔＸＩ部位との間に挿入する。ｐＴＧ６５８７を得て、これをＸｂａｌで切断し、その後それ自体と再結合させ、ｐＴＧ６５８８（Ｅ３の欠失）を得る。

オリゴヌクレオチド０ＴＧ６０６０．０ＴＧ６０６１．０ＴＧ６０６２および０ＴＧ６０６３　（発刊番号２３〜２６）の組換えから得た合成りＮＡ断片をｐＴＧ６５８８のＰａｃＩ部位中に導入する。これによりｐＴＧ８５００を得て、その中におけるＬ５後期遺伝子の転写終結シグナルを改善する。

Ｅ４領域の全部（ヌクレオチド３２８００〜３５８２６）とＥ３領域のＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２８５９２〜３０４７０）が欠失されたゲノムを有するアデノウィルス粒子（ＡｄΔＥ４）を、ｐＴＧ８５００またはｐＴＧ６５８８とＡｄ５から単離された５ｐｅＩ断片の結合により形成する。結合混合物を８４機能に関する相補細胞系、例えば系Ｗ　１６２　（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｋｅｌｎｅｒ、　１９８３゜Ｐ＋ｏｃ、　Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０．５３８３−５３８６）中にトランスフェクトする。Ｅｌおよび８４機能に欠陥があるアデノウィルス（ΔＥ１、ΔＥ４）は、Ａｄ　ｄ１３２４ゲノムとＳｐｅ　Ｉで直鎖化されたプラスミドｐＴＧ８５００またはｐＴＧ６５８８との結合混合物のＥｌおよびＥ４に関する補足系（例えば、例８の系）中へのトランスフェクションにより得る。

更に、下記のように行うことも可能である。ｐＴＧ１６５９（例２，３）から単離された５ｐｅＩ−３ｃａＩ断片をこれら同酵素で開裂されたベクターｐＴＧ６５８８中に組み込んでクローニングし、ｐＴＧ６５９１を得る。後者はヌクレオチド２１０６２〜３５９３５のＡｄ５配列を含んでいるが、そこからは上記のようにＥ４領域の全部とＥ３領域のＸｂａＩ断片が欠失されている。

上記の合成りＮＡ断片をＰａｃＩで切断されたベクターｐＴＧ６５９１中に導入して、ｐＴＧ６５９７を形成する。アデノウィルス粒子は、５ｐｅＩで開裂されたＡｄｄ１３２４ゲノムＤＮＡとＢａｍＨＩで開裂されたプラスミドｐＴＧ６５９１またはＩ）ＴＧ６５９７との相同的組換えにより得てもよい。

例５：　“最小”ウィルスの作製いわゆる“最小”アデノウィルスベクターは、プラスミド中に下記要素。

−Ａｄ５　５−ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１０３）、−Ａｄ５包膜化膜化領域クレオチド１０４〜４５８）、−下記を含む外来ヌクレオチド配列：・自然調節にできるだけ近い発現の調節を得るために、好ましくは自己のプロモーターの存在下におかれた、治療対象の第一遺伝子、・ＴＫ−Ｈ３Ｖ−１遺伝子からなる対象の第二遺伝子、・場合により、粗膜化されるゲノムの全サイズが３０〜３６ｋｂであるような粗膜化または複製の効率の理由から加えられる、何らかの種類のヌクレオチド配列、・高等真核細胞で機能的なプロモーターのコントロール下におかれた５ｘｃｃｈａ＋ｏｍｙｃｅ＋　ｃｅ＋ｅｖｉｓｉａｅ　Ｇａ１４タンパク質（Ｌａｕｇｈｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅ５ｌｅｌａｎｄ、　１９８４．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　４゜２６０ −２６７）をコードする配列、および−Ａｄ５　３−ＩＴＲ（ヌクレオチド３５８３３〜３５を組み込んでクローニングすることにより形成する。

これらの異なる要素のアセンブリーは分子生物学の標準技術に従い行う。このようなベクターを含んだ感染性ピリオンの生産は例７の補足系で上記のように行う。

例６・８１機能をインドランスで補える相補細胞の形成この細胞は以下を含んでいる；一遺伝子が５Ｖ４Ｑウィルス初期プロモーター（ヌクレオチド５１７１〜５２４３）のコントロール下におかレテ、３′末端にＳＶ４０転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜２６１８）を含んだ、ｐａｃ遺伝子の発現用カセット。用いられたｐａｃ遺伝子は、Ｌｘｃｘｌｌｅ　ｅｊａｌ、　（１９８９，Ｇｅｎｅ、　７９．３７５−３８０）に開示された配列のヌクレオチド２５２〜ヌクレオチド９０５にわたり、公表配列と比べて４つの変更点（３０５位でＣの代わりにＡ；３６７位でＣの代わりにＴ　；　８０４位でＧの挿入；８２０位でＧの欠失）を含んだ断片に相当する。

−ヌクレオチド１００〜５２９７にわたるＡｄ５ゲノムの断片。この断片は、自己のプロモーターおよび転写終結シグナルをもったＥＩＡおよびＥＩＢ領域と、Ｅ２領域のフラクションを含んでおり、このためタンパク質１ｘをコードする配列と重複している。指針として、系２９３は機能性タンパク質ＩＸを生産することができないらしい。

組立ては以下で詳述されたいくつかの工程で行う。ベクターｐポリｌ１ｌ−Ｉ　（Ｌａｔｈｅ　ｅ＋　ａｌ、、ｌ９８７ｔＧｅｎｅ、５７゜１９３−２０１）を酵素ＡｃｃｌおよびＥｃｏＲＩによる切断に付す。プラスミドｐＴＧ６１６４から単離されたＥｃ。

ＲＩ−Ｃ１ａＩ断片をこうして処理されたベクター中に組み込んでクローニングする。ベクターｐＴＧ６５２８を得る。

プラスミドｐＴＧ６１６４はｐ　Ｌ　Ｘ　Ｓ　Ｎ　（Ｍｉｌｌｃ＋　Ｄ。

１９８９、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ＋、　７．９８０）から誘導し、ＳＶ４０ウィルス初期プロモーターのコントロール下におかれたｐａｃ遺伝子を含んでいる。簡単に言えば、ｐＬＸＳＮのＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌ−Ｋｐ　ｎ　Ｉ断片をＭ１３ＴＧ１３１中に導入して、Ｍ１３ＴＧ４１９４を得る。ｐＭＰＳＶ　Ｈ２Ｋ　Ｉ　Ｌ　２　Ｒ（Ｔａｋｅｄａ　ｅｌ　ａｌ、、１９８８．Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆｘｃｔｏｒ＋。

１、５９−６６）　のＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ断片を後者に挿入し、ＮｈｅＩおよびＫｐｎｌで切断して、Ｍｌ　３７Ｇ４１９６を得る。後者をＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＬＫ　ｐ　ｎ　Ｉで切断し、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ切断および部分的Ｋｐｎｌ切断から得たｐＬＸＳＨの精製断片をクローニングする。ｐＴＧ５１９２を得る。

後者をＨｉｎｄｌｌｌ　と部分的にＮｈｅＩで切断し、ｐ　Ｂａｂｃ　Ｐｕ＋ｏ（Ｌａｎｄ　ｅｌ　ａｌ、、　１９９０．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｄ、　、　１８．３５８７）のＨｉｎｄｌｌｌ−ＮｈｅＩ断片を導入して、ｐＴＧ６１６４を得る。

ベクターｐＴＧ６５２８をＰｓ　ｔ　Ｉテ切断し、ＳＶ４０転写終結シグナルを含んだｐＴＧ６１８５　（例２．１）から単離されたＰｓｔＩ断片をこの部位に導入する。

ｐＴＧ６５２９を得る。後者をＥｃｏＲＩ−Ｈｐａｌ切断に付し、２断片と結合させるが、一方はＡｄ５ゲノムＤＮＡの精製ＢｓｐＥＩ−Ｂｃｇｌ断片（８２６〜５２９７位）で、他方はＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩ末端でＰＣＲにより形成された断片であって、ｐＴＧ６５３１を得る。ＰＣＲ断片はＡｄ５ゲノムＤＮＡとプライマー０ＴＧ４５６４および０ＴＧ４５６５　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：２７および２８で記載）からの遺伝子増幅により得る。増幅断片を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩで切断し、先の段落で記載されたように結合させる。

ベクターｐＴＧ６５３１は同方向に２つの転写単位（Ｅｌ領域の単位とｐａｃ遺伝子の単位）を含んでいる。

転写で干渉を避けるためには、それらはｐＴＧ６５３１をＢａｍＨｌで処理して再結合させることにより頭−尾（互いに逆）方向におく。ベクターｐＴＧ６５３３は２単位の逆方向を示すクローンに相当する。

ベクターｐＴＧ６５３３をリン酸カルシウム技術により哺乳動物細胞系、例えばＶｅｒｔｒ　（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ８１）またはＡｓ２９　（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ１８５）系中にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を供給業者の勧めに従い培養し、プロマイシン（濃度６μｇ／ｍｌ）含有選択培地にトランスフェクション後２４時間おく。耐性クローンを選択し、そこではＥ１領域の遺伝子の発現について最も生産的なりローンを調べるために評価するが、これは８１機能に欠陥があるアデノウィルス、例えば例２で詳述されたものの生産用の補足系として用いてよい。

Ｅ１領域の初期タンパク質をコードする配列の発現は、アイソトープ３２Ｐで標識された適切なプローブを用いて、ノーザンブロツティングにより分析する。

ＥＩＡ領域でコードされたタンパク質の生産は、細胞をアイソトープ３５Ｓで標識した後に市販抗体（Ｏｎ　ＣＯｇ　ｔ　ｎ　ｅＳｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、、ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＤＰＩＩ）を用いた免疫沈降により検出する。

（Ｅ　Ｉ　Ｂ　ｍＲＮＡのノーザンプロット分析により）ＥＩＢ領域のプロモーターを活性化するか、または（Ｅ２プロモーターのコントロール下におかれたＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含む“リポータ− ”プラスミドの一時トランスフエクション後に酵素活性を調べることにより）Ｅ２領域のプロモーターを活性化する、ＥＩＡ領域の発現産物の能力を確認することもできる。

最後に、これらの細胞をＡｄ−Ｒ３Ｖ−βｇａｌ（ＳＨａｔｌｏ＋ｄ−Ｐ＋＋＋１ｃａｕｄｅｔ　＋ｔ　ａｌ、、ｌ９９２．ｓｕｐ＋ａ）で感染させて、細胞変性効果が観察されるとすぐに寒天技術でウィルスを滴定することができる。一般的に、操作は下記のとおりである。細胞を１０のｍｏｉ（感染多重度）で感染させる。感染の約４８時間後、細胞変性効果がみられたときに、細胞を溶解させて、β−ガラクトシダーゼ活性を慣用的プロトコールに従い調べる（例えば、Ｍａｎｉａ１口ｅ＋　ａｌ、、１９８９．ｓａｐ＋ａ参照）。陽性クローンをもっと低いｍｏｉで再感染させる。感染の約４８時間後に、上澄および細胞を標準技術に従い集める。ウィルス力価は２９３細胞を用いて寒天積層法により決める。得られた力価対初期力価の比率が増幅ファクターになる。

ベクターｐＴＧ６５５７、ｐＴＧ６５５８およびｐ’ｒＧ６５５９は以下を含んでいる：（１）以下のコントロール下にあるｐａｃ遺伝子（前記のようなヌクレオチド２５２〜９０５）の発現用カセットニーＡｄ２　Ｅ２Ａプロモーター（ヌクレオチド２７３４１〜２７０３０）（ｐＴＧ６５５８の場合）−ヌクレオチド２フ１６３〜２フ１８２間にある配列が欠失されたＡｄ２　Ｅ２Ａプロモーター（ｐＴＧ６５５７の場合）。このような変異から、ＥＩＡでコードされたトランス活性化タンパク質による誘導能に影響を与えることなく、Ｅ２Ａプロモーターの基準レベルを減少させることができる。または −ｐＴＧ６５５９の場合ＳＶ４０初期プロモーター上記３つの場合において、それは３−末端にＳＶ４０ウィルス転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜２６１８）も含んでいる；および（１１）ヌクレオチド５０５〜４０３４にわたるＡｄ５Ｅ１領域の部分を含んだ発現カセット。アデノウィルスゲノムのこの部分は、ＥＩＡ領域の初期タンパク質をコードする配列の全部、ＥＩＡ単位の転写終結シグナル、ＥＩＢプロモーター（ＥＩＡでコードされるトランス活性化タンパク質により誘導しうる）と、ＥＩＢ領域のコード配列の全部を含んでいる。それはタンパク質１ｘをコードする配列も含んでおり、ＥＩＢ領域と重複している。

しかしながら、それはＥＩＡ領域のプロモーターとＥＩＢおよびＩＸ転写単位の転写終結シグナルを欠く。Ｅ１領域の配列を発現させるためには、ネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターをアデノウィルス断片の５′末端に導入し、ウサギβ−グロビン遺伝子の転写終結シグナル（Ｇｅｎｃｂｓｎｋデータバンクで参照番号ＫＯ３２５６として開示されている配列のヌクレオチド１５４２〜２０６４）を３′ 末端に導入する。

場合により、何らかの種類の、例えばｐＢＲ３２２（ＢｏｌｉｖａＩｅ＋　ａｌ、、ｌ９７７、Ｇｅｎｅ、２．９５−１１３）から単離されたヌクレオチド配列も、転写で生じうる干渉を避けるために、ｐａＣ遺伝子とＥ１領域との発現用カセット間に導入してよい。

これらベクターの組立ては下記のいくつかの工程で行う。

最初に、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド８２６にわたるＡｄ５ゲノムの部分は、ゲノム調製物から、後のクローニング工程に有用なＰｓｔ１部位を５′末端に含むプライマー０ＴＧ５０１３　（配列番号２９）とＢｓｐＥＩ部位と重複する０ＴＧ４５６５　（配列番号２８）を用いたＰＣＲにより増幅させる。ＰＣＲにより形成された断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後Ｍｌ　３ｍｐ　１８のＳｍａ　Ｉ部位中に挿入して、Ｍ１３７Ｇ６５１２を得る。ＰＣＲ断片の配列を確認する。

ベクターｐＴＧ６５３３　（例６，１）を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩで切断する。こうして処理されたベクターを、一方ではＭ１３７Ｇ６５１２から単離されたＰｓｔ　Ｉ−ＢｓｐＥＩ断片、他方ではｐＫＪ　−１から単離されたＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片と結合させる。後者の断片はヌクレオチド−５２４〜 −１９間にあるネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターの部分を含んでいるが、その配列はＡｄ＋ａ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８７，Ｇｃｎｅ、６０．６５−７４）で報告されている。この工程ではｐＴＧ６５５２を生じ、ヌクレオチド５０５で始まるＡｄ５のＥ１領域の上流にネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターを挿入することができる。

別に、Ｘｈｏ　Ｉで形成された末端がフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理後に平滑化されているＸｈｏ　Ｉ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片を、ｐ　Ｂ　ＣＭ　Ｇ　Ｎ　ｅ　ｏ　（ＫａｒａｓＢａｍｘ　ｅｌａ　１．　、１９８９．１．　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　１６９．１３−２５）から精製する。ウサギβ−グロビン遺伝子の転写終結シグナルを含んだこの断片を、ベクターｐポリＩｆ−５ｆｉ／Ｎｏｔ −１４’　（Ｌａｔｈｅ　ｅｔ！＋、、　１９８７．　Ｇｅｎｅ、　５７．１９３−２０１）のＳｍａ　ＩおよびＢａｍ８１部位間に導入する。得られたベクターｐＴＧ６５５１は、ヌクレオチド３６６５〜ヌクレオチド４０３４にわたるＡｄ５ゲノムの断片をその中に挿入するために、酵素ｓｐｈ　ＩおよびＥｃｏＲＶでその一部について切断する。この断片は標準プロトコールに従いＰＣＲで形成する。用いられた操作では、鋳型としてＡｄ５ゲノムＤＮＡ調製物と、３６６５位で内部Ｓｐｈ　ｉ部位と重複するプライマー０ＴＧ５０１５（配列番号３０）および５′末端にＢｇ１１１部位を含む０ＴＧ５０１４　（配列番号３１）を用いる。

ＰＣＲ断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してから、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　１８のＳｍａ　１部位中に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５１６を得る。その配列の確認後に、ＰＣＲ断片をＢｇｌ１１切断、フレノウＤＮＡポリメラーゼ処理およびｓｐｈ　Ｉ切断により抽出する。

それをｐＴＧ６５５１のＳｐｈ　ＩおよびＥ　ｃ　ｏ　ＲＶ　部位間に挿入する。これによりｐＴＧ６５５４を得る。

別に、ベクターｐＴＧ６５２９　（例６．１）を酵素ＨｐａｌおよびＨｉｎｄｌｌｌ切断に付す。ｐａＣ遺伝子とその後にＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルを含んだ２．９ｋｂ断片を精製する。この断片を、Ａｄ２　Ｅ２Ａプロモーターを有するｐ　Ｅ　２　Ｌ　ａ　ｃ　（Ｂｏｅｕｌ　ｅｔ　１１．。

＋９９０．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、　５．６９１−６９９）から単離されたＳｍａ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片に結合させる。ベクターｐＴＧ６５５６を得る。一方、それはＡｄ２の変異Ｅ２Ａプロモーターを有するｐＥ２　Ｌａｃ　Ｄ９１７０（２ａｉｃｈｏｖｓｋｉ　ｅｔａｌ、　、　１９８５．　ＥＭＢＯ，１，、４，１２９３−１３００）から単離されたＳｍａ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ断片に結合させてもよい。この場合には、ベクターｐＴＧ６５５０を得る。

ｐＴＧ６５５６を酵素ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩで切断する。ｐＴＧ６５５２から単離されたＥｃｏＲＩ　−３ａ　ｃ　Ｉｆ断片とｐＴＧ６５５４から単離されたＳ　ａ　ｃ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をこれらの部位間に挿入する。ベクターｐＴＧ６５５８を得る。ｐＴＧ６５５０およびｐＴＧ１６４３　（例７．１）で行う同様の工程では、各々ｐＴＧ６５５７およびｐＴＧ６５５９を得る。

ｐＴＧ６５５７およびｐＴＧ６５５８をＥｃｏＲＶで切断するが、唯一の部位は２つの発現カセット（ｐａｃ遺伝子およびＥ１領域）間に位置している。ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａ＋　ｅｔ　ａｌ、、＋ｕｐ＋ａ）から単離された１、８８ｋｂＥｃｏＲ■−Ｐｖｕｌｌ断片は、２プロモ一ター間の距離をあけるために、この部位中に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ６５６４およびｐＴＧ６５６５を各々得る。

ベクターｐＴＧ６５５７、ｐＴＧ６５５８、ｐＴＧ６５５９、ｐＴＧ６５６４およびｐＴＧ６５６５を細胞系Ａ３４９中にトランスフェクトする。前記のように、プロマイシン耐性クローンを選択し、Ｅ１領域の発現を確認する。Ｅ１発現クローンは、Ｅ１機能に欠陥があるアデノウィルスを増幅および増殖させるためにある。Ｅ１発現産物の生産には細胞毒性効果を伴うが、サザン分析ではベクター再配列を実証できない。Ａｄ−Ｒ３Ｖ−βｇａｌ感染後、いくつかのクローンはウィルスを１００倍以上増幅させることができる。

これらのベクターは、前記のように、ヌクレオチド５０５〜４０３４にわたるＡｄ５　Ｅｌ領域の部分を含んでいる。しかしながら、ＥＩＡ領域の配列の発現は、一方ではＡｄ２　ＭＬＰ最小プロモーター（ＴＡＴＡボックスおよび転写開始シグナル；ヌクレオチド−３４〜＋３３）と他方ではＧａ１４タンパク質により活性化できるＧａ１ｌＯ遺伝子の活性化配列からなる誘導性プロモーターのコントロール下におかれている。Ｇａ１４結合部位に相当する１７ヌクレオチド（１７ＭＸ）の共通活性化配列はＷｅｂ＋ｔｅ＋　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８，Ｃｅ１１．５２，１６９）で特定されている。ウサギβ−グロビン遺伝子の転写終結シグナルをＥＩＢ転写単位の３′末端におく。

１７ＭＸ配列のダイマー（配列番号３２および３３）とその後にＡｄ２　ＭＬＰ最小プロモーターを含み、その５′末端に５ａｌＩ部位およびその３′末端にＢａｍＨＩ部位を含んだ第−ＤＮＡ断片を合成する。５ａｌＩ部位をフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑化する。別に、配列のペンタマーとその後に同様のプロモーターを含み、その５′および３′末端にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を含んだ第二ＤＮＡ断片を合成する。

Ｘｂａｌ切断後に、その末端をクレノウボリメラーゼ処理で平滑化する。

これら断片の各々をｐポリＩＩのＢｇｌ１１部位中に導入して、ｐＴＧ１６５６およびｐＴＧ１６５７を各々得る。

次いで下記２断片、即ちｐＴＧ６５５２　（例６．２）から単離されたＰｓｔｌ −Ｘｂａｌ断片とｐＴＧ６５５９（例６．２）から単離されたＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片をＰｓ　ｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩで既に切断されたベクターの各々の中に導入する。ｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１を各々得る（図５）。

Ａ３４９細胞をｐＴＧ１６４３　（ｐａＣ遺伝子発現用のベクター）とｐＴＧ１６６０またはｐＴＧ１６６１でコトランスフエクトする。クローンをそれらのプロマイシン耐性について選択し、上記のように試験する。Ａ３４９−１６６０およびＡ３４９−１６６１の約５０％はＥ１領域の発現産物を生産する。しかしながら、生産には細胞毒性効果を伴い、細胞の形態的外観を変える。

細胞ゲノムにおけるプラスミドの組込みおよび非再配列をサザン分析により確認する。組込みプラスミド（ｐＴＧ１６４３、ｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１）の実質的変化は、分析された生産クローンで実証できない。Ｇａ１４の存在下でＥＩＡ領域によりコードされた配列の発現の誘導能も（Ｇａ１４タンパク質の構成的発現を行うプラスミドでの形質転換により）確認することができる。

約２のｍｏｉでＡｄ−Ｒ３Ｖ−βｇａｌによるいくつかの生産クローンの感染後に、２つのＡ３４９−１６６０クローンはウィルスストックを１００倍以上増幅させることができる。

例７：アデノウイルスの複製に必須な機能のすべてに関ｔａ補足系の形成５″ＩＴＲ，３”ｌＴＲおよび化膜化領域を除いてＡｄ５アデノウィルスゲノムの全部を含んだベクターを組み立てる。

ベクターｐＴＧ６５２８　（例６，１）を酵素ＰｓｔＩおよびＢｇｌｌｌで切断するが、その間にはＯＴＧ　５０３９および０ＴＧ５０４０　（配列番号３４および３５）のオリゴヌクレオチドからなる標準プロトコールに従い化学的に合成されたＤＮＡ断片が挿入されている。オリゴヌクレオチド配列はＰｓｔＩクローニング部位を再形成せずにＥｃｏＲＶ部位を導入できるようにデザインされている。ｐＴＧ１６３９を得て、これをＥｃｏＲＶ切断で直鎖化し、末端がフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化さｈたＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片に結合させる。この断片はＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルを有している。

適切な制限部位で囲まれたシグナルを含むいずれのプラスミドもこの工程で用いてよい。

こうして形成されたベクターｐＴＧ１６４０をＢａｍＨＩおよびＢ　ｇ　ｌ　ＩＩで切断し、ｐａｃ遺伝子発現用のカセットを有する断片をベクターｐポリｌｔ −３ｌｉ／Ｎｏｔ孝 −１４のＢ　ｇ　ｌ　１１部位中に導入する。ｐＴＧ１６４１を得る。後者をＮｏｔｌで直鎖化し、フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理する。ｐ　Ｂ　Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｙｘｒ　ｔｔ　Ｉｌ、。

＋ｏｐ＋ａ）から単離されて更にフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理された０、２７６ｋｂＢａｍＨＩ−３ａｉｌ断片を導入する。これによりｐＴＧ１６４３を得る。

ｐＴＧ１６４３をＸｈｏＩで直鎖化し、１７１Ｘダイマーとその後にＴＫ−Ｈ８Ｖ−１遺伝子最小プロモーター（Ｇｅｎｅｂａｎｋデータバンクで参照番号ＶＯＯ４６７として開示された配列のヌクレオチド３０３〜４５０，３−末端においてＸｈｏＩ部位で補充されている）を含んだＸｈｏＩハイブリッド断片をこの部位中に挿入する。ｐＴＧ１６４７を得るが、そコテは２ｘ１７ＭＸ−ＴＫ−Ｈ３Ｖ−１ハイブリツドプロモーターがｐａｃ遺伝子発現用のカセットと同方向に挿入されている。

この組立体ｐＴＧ１６４７は、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド３５８２６にわたるＡｄ５ゲノムの断片をＰｓｔＩおよびＢａｍＨ１部位間に導入するための親ベクターとして用いる。第一段階では、ｐＴＧ１６４７をＰｓｔｌおよびＢａｍＨＩで切断し、その後一方ではヌクレオチド５０５〜９１８のＡｄ５ゲノムの部分を含んだｐＴＧ６５５２　（例６．２）のＰｓｔＩ−Ｃ１ａＩ断片と、他方ではＡｄ５ゲノムＤＮＡから調製されたＣ１ａＩ−ＢａｍＨＩ断片（９１８〜２１５６２位）とに結合させる。それにより得られたベクターは、５′ＩＴＲおよび化膜化領域を除いたＡｄ５の５′部分を含んでいる。

別に、Ａｄ５ゲノムの３′部分をベクターｐポリ１ｌ−３ｌｉ／Ｎｏ＋−１４でアセンブリー化する。後者をＢａｍＨＩで直鎖化し、Ａｄ５ゲノムのＢａｍＨＩ −Ａｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド２１５６２〜２８７５２）とＡｄ５のヌクレオチド３５４６３〜３５８２６に相当するＰＣＲ断片を導入する。後者の断片はＡｄ５ゲノムＤＮＡからプライマー０ＴＧ５０２４　（配列番号３６）および０ＴＧ５０２５　（配列番号３７）を用いて形成し、５′末端にＢａｍ８１部位を含んでいる。得られたベクターをＡｖｒｌｌで切断し、Ａｄ５ゲノムＤＮＡから単離された２　８７５３〜３５４６２位にわたるＡｖｒｌｌ断片を挿入する。

アデノウィルス配列を含んだＢａｍＨＩ断片を、５′ＩＴＲおよび化膜化領域を欠くアデノウィルスゲノムの５′部分を含んだ先の工程のベクターのＢａｍＨＩ部位中に導入する。

欠陥アデノウィルスの機能のすべてを補える補足系は、前例で記載されたプロトコールに従い、細胞系、例えばＡ３４９中へのトランスフェクションにより形成する。

アデノウィルスゲノムの事実上全体を含む下記４つのベクターを組み立てることにより行うことも可能であり、これは最終工程において単一ベクターでリアセンブリ−化させる。

−ｐＴＧ１６６５は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＢｓｐＥＩ断片（ヌクレオチド８２６〜７２６９）をｐポリｌ　Ｉ−Ｓ　Ｉ　ｉ／Ｎｏ　ｔ−１４のＸｍａ１部位中に組込むクローニングに相当する； −ｐＴＧ１６６４は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＮｏｔＩ断片（ヌクレオチド６５０３〜１５０４）を同ベクターのＮｏｔＩ部位中に挿入することにより形成する； −ｐＴＧ１６６２は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＡ　ａ、ｔ　ＩＩ断片（ヌクレオチド１０７５４〜２３９７０）をｐポリＩＩのＡａｔｌ１部位中に導入することにより得る； −Ａｄ５ゲノムの３′部分を含むｐＴＧ１６５９　（例２．３）次いで誘導発現系、例えばＧａ１４により誘導しうる例６．３または７で記載されたプロモーター、あるいは従来のプロモーター、例えばメタロチオネインまたはテトラサイクリンプロモーターを含んだ断片を導入する。

このような断片はＡａｔｌｌおよびＣ１ａＩで切断されたベクターｐＴＧ１６６５においてＡｄ５の５′配列（ヌクレオチド５０５〜９１８）の上流に位置させる。最後に、ｐＴＧ１６６４のＮｏｔｌ断片、ｐｒＧ１６６２のＡａｔｌｌ断片と、最後にｐＴＧ１６５９のＢａｍＨＩ断片を上記ベクター中に対応部位で連続的に組み込んでクローニングする。

補足系を上記ベクターおよび１）ＴＧ１６４３のコトランスフエクションにより形成し、プロマイシン耐性クローンを単離する。この系は、更に詳しく言うと、Ｅｌ、Ｅ２および８４機能と後期機能に欠陥がある例５のアデノウイルスヘクターを増幅および化膜化するためにある。

ＢａｍＨＩで切断し、下記３つの断片ニーヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド１３３９のＡｄ５配列を有するｐＴＧ６５５２　（例６．２）のＰｓ　ｔ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉ断片、一ヌクレオチド１３４０〜ヌクレオチド３６６５のＡｄ５配列を有するｐＴＧ６５５２のＸｂａ　Ｉ　−Ｓｐｈ■断片、および一ヌクレオチド３６６５〜ヌクレオチド４０３４のＡｄ５配列と転写終結シグナルを有するｐＴＧ６５５４（例６．２）のＳｐｈ　１−　ＢａｍＨＩ断片をこうして処理されたベクター中に導入する。

それにより得られたベクターをＢａｍＨＩで切断し、下記３つの断片ニ −３２８００〜３３１０４位間に位置するＡｄ５配列に相当する、ＰＣＲにより形成される、ＢａｍＨＩ−Ａｆｌｌ＋で切断された断片。用いられる操作では、鋳型としてＡｄ５ゲノムＤＮＡとプライマー０ＴＧ５０７８（配列番号３８）および○ＴＧ５０７９　（配列番号３９）を用いる。

−Ａｄ５ゲノムＤＮＡから単離されたＡｆｌｌｌＡｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド３３１０５〜３５４６３）、−プライマー０ＴＧ５０２４および０ＴＧ５０２５（例７参照）を用いるＰＣＲにより形成されたＡｖｒｌｌ−ＢａｍＨＩ断片をこの部位中に導入する。

これにより形成されたベクターを上記プロトコールに従い細胞系中に導入して、Ｅｌおよび８４機能に関する補足系を形成する。

しかも、このような系は下記プロトコールに従い得てもよい：Ａｄ５ゲノムのＥ４領域（ヌクレオチド３２８００〜３５８２６）をいくつかの工程で再形成させる。ヌクレオチド３３１１６〜３２８００にわたる部分をＡｄ５ゲノムＤＮＡからプライマ一対０ＴＧ５０７８および０ＴＧ５０７９　（配列番号３８および３９）でＰＣＨにより合成し、その後Ｍ１３ＴＧ１３０のＥｃｏＲＶ部位中に挿入して、Ｍ１３ＴＧ１６４５を得る。

後者のＢａｍＨＩ−Ａｆｌｌｌ断片をＡｄ５のＡｆｌｌｌ−Ａｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド３３１０４〜３５４６３）との結合反応に付し、ベクターｐＴＧ７４５７をＢａｍＨＩおよびＡｖｒｌｌで切断する。ｐＴＧ１６５０を得る。

次いでＥ４領域を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマー０ＴＧ５０２４および０ＴＧ５０２５　（配列番号３６および３７）を用いるＰＣＲでヌクレオチド３５８２６〜３５４５７に相当する断片を得ることにより完成させる。この断片をＭ　１３　ｍ　ｐ　１８のＳｍａＩ部位に挿入して、Ｍ１３ＴＧ１６４６を得る。ＡｖｒｌｌＥｃｏＲＩ断片を後者から単離し、ｐＴＧ１６５０のＡｖｒｌｌおよびＥｃｏＲＩ部位間に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ１６５２を得る。

Ａｄ５のＥ４領域を含んだＢａｍＨＩ断片をｐＴＧ１６５２から単離し、ｐＴＧ１６４３およびｐＴＧ６５５９（例６．２）のＢａｍＨ１部位またはｐＴＧ６５６４（例６．２）の５ｓｐ１部位中に、その部位が平滑化された後に組み込んでクローニングし、ｐＴＧ１６５３、ｐＴＧ１６５４およびｐＴＧ１６５５　（図６）を各々得る。

Ｅｌおよび６４機能をインドランスで補える相補細胞は、慣用的技術で：（１）細胞系２９３へのｐＴＧ１６５３の形質転換、または（２）細胞系Ａ３４９へのｐＴＧ１６５４またはｐ’ｒｃ１６５５の形質転換により作製する。

一般的に言えば、ＥｌおよびＥ４領域の産物の発現には細胞毒性効果を伴う。いくつかの２９３−１６５３クローンは、Ｅｌが欠失されたアデノウィルスとＥ４が欠失されたアデノウィルスの双方を補うことができる。

別法では下記のように行う。

ベクターＭ１３ＴＧ１６４６を、Ｅ４領域のプロモーターを欠失させてＨｐａＩ部位を挿入する目的から、変異原性オリゴヌクレオチド０ＴＧ５９９１　（配列番号４０）で特定部位変異誘発に付す。変異ベクターはＭ１３ＴＧ６５２２と命名する。それをＰｓｔｌで切断し、ファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼとその後Ａｖｒｌｌで処理し、ｐＴＧ１６５２　（例８）の精製ＥｃｏＲＩ　（フレノウ）−Ａｖｒｌｌ断片と結合させて、ｐＴＧ６５９５を得る。

後者をＨｐａｌで開裂し、ＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩ切断とフレノウ処理後にｐＴＧ５９１３　（ｌｆｆ１７）から得られた０、８ｋｂ断片を導入する。ｐＴＧ６５９６を得るが、そこではＥ４領域（３２８００〜３５８２６位）はＴＫプロモーターのコントロール下にある。参考のため、ｐＴＧ５９１３はＴＫ−Ｈ３Ｖ−１遺伝子を有し、Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片はこの遺伝子のプロモーターに相当する（Ｗｘｇｎｅ＋　Ｎ　ａｌ、、１９８１．Ｐｒｏｃ、Ｎｘｊｌ、Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、　７８．１４４１−１４４５）。

並行して、ベクターｐＴＧ１６４３およびｐＴＧ６５５９（例６）をＢａｍＨＩで直鎖化し、オリゴヌクレオチド０ＴＧ６１４１および０ＴＧ６１４２　（配列番号４１および４２）の組換えから得た合成断片を挿入して、ｐＴＧ８５０８およびｐＴＧ８５０７を各々得る。

これらの後者をＢ　ａｍＨＩで開裂してから、Ｅ４発現用のカセットを含んだｐＴＧ６５９６の精製ＢａｍＨＩ断片を導入する。ベクターｐＴＧ８．５１２（図８）およびｐＴＧ８５１３　（例９）を得る。

更に、同酵素で直鎖化されたベクターｐＴＧ８５０８またはｐＴＧ８５０７中へのｐＴＧｌ、６５２のＢａｍＨＩ断片の導入から、ｐＴＧ８５１４およびｐＴＧ８５１５を各々得る（図１０および１１）。

ｐＴＧ８５１２またはｐＴＧ８５１５でトランスフェクトされた細胞系は６４機能に欠陥があるアデノウィルスを補うことができ、一方ｐＴＧ８５１３またはｐＴＧ８５１４トランスフェクションによるものはＥｌおよび６４機能に欠陥があるアデノウィルスを増幅および増殖させるためにある。同様に、２９３細胞中へのｐＴＧ８５１２またはｐＴＧ８５１５のトランスフェクションでは、ＥｌおよびＥ４に欠陥があるアデノウィルスを補うことができる。

配列表配列番号ＩＨ）配列の特徴ＦＡ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ（１マ）起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４１７４）（！１）　配列・配列番号ＩＧＴＧＡＣＧＴＣＴＴ　ＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣ３０配列番号２（１）配列の特徴（Ａ）長さ　３０塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数・−重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｎｏ（ｉマ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４１７３）（ｘｌ）　配列：配列番号　２ＡＣＣＧＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ　ＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧ　３０配列番号３（ｉ）配列の特徴（＾）長さ＝３３塩基対（Ｂｊ型　核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖（１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル：Ｎ０（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス、Ｎｏ（１ｖ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４１９１）（ｘｉ　配列：配列番号３ＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＧＧＧＡＡＡＧＧ　ＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴ　３３配列番号４（１）配列の特徴（人）長さ＝３１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃｌ鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル、Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｎ。

（１ｖ）　起源（局生物名；合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０２１）（ｘｌ）　配列：配列番号４ＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧ　ＴＴＴＧＧＡＴＴＴに　Ｇ　３１配列番号５（：）　配列の特徴（Ａ）・長ざ　３０塩基対（３）型　核酸ｊ（）鎖の数　−重鎖（Ｄ）トポロン−１直鎖（１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｈｎｏｍｉｃ　）！Ｉｔ：ｊ　ハイポセティカル　Ｎ。

、’１ｌｉ）アンチセンス　Ｙｅｓ（ｉ　ｖ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５１５７）（！１）　配列：配列番号５ＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴ　ＣττＣＧＣＣＣｋＧ　ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣ３０配列番号６（１）配列の特徴（Ａ）長さ＝２０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル：Ｎ０（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス二Ｎ０（１ｖ）　起源（Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５５６４）（ｘｌ）　配列：配列番号６ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴ　ＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣ２０配列番号７い）配列の特徴ＩＡ）長さ　２０塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ＩＩ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ（１マ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（○ＴＧ５５６５）（ｘｉ）　配列：配列番号７ＧＡＴＣＧＧＴＴＡＡ　ＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧ　２０配列番号８（ｉ）配列の特徴ＦＡ）長さ・４７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数・一本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖（１１）配列の種類　１）　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｉｉｊ　アンチセンス二Ｎ。

（１ｖ）　起源（Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５８９２）（ｘｉ）　配列：配列番号８ＧＴＣＧＴＡＧＧＡＴ　ＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＴＧ　ＴＧＴＴＧＧＡＧＧＴ　ＣＧＣＴＧＡＧ　４７配列番号９（１）配列の特徴（Ａ）長さ＝４７塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉ　ｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル二Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（１ｖ）　起源（Ａ）生物８二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５８９３）（ｘｌ）　配列：配列番号９ＧＴＡＧＣＴＧＡＣＧ　ＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＴ　ＧＧＴＧＭＴＧＧＴ　ＣＡＡＡＴＧＧ　４７配列番号１０（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４６塩基対ＦＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ＩＩ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス・Ｎｏ（１マ）起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５９２０９）（！１）　配列：配列番号１０ＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴ　ＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧ　ＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＧ　４６配列番号１１（１）配列の特徴（Ａ）長さ：２４塩基対ＣＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数・一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　ＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ’、ハイポセティカル：Ｎ。

ｆｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（ｌ　Ｖ）起源（八）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５８９１）（１１）　配列　配列番号１１ＣＡＡＣＣＣＣＧＡＴ　ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＡ　ＣＣＴＧ　２４配列番号１２（１）配列の特徴（Ａｌ長さ：３５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（夏１１）アンチセンス：Ｙｅｓ（ｉ　ｖｌ　起源（＾）生物８二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０７９）（ｘｉ）　配列：配列番号１２ＧＣＧＣＡＧＴτＧＣＴＣＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＴＭＣＡＴ　ＴＣＡＧＴ　３５配列番号１３（ｉ）配列の特徴ＦＡ＋長さ、３８塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃｌ　鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロン−・直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｓｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル　ＮＯｆ＋ｉｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ（ｉｉ）　起源（＾）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０８０）（ｗｉ）　配列：配列番号１３ＴＡＡＡＡＧＴＡＣＣＡＧＧＴＭＧＧＡＴ　ＣＣＣＣＴＴＧＧＴｒ　ＴＧＣＴＴＧＧＧ　３８配列番号１４（１）配列の特徴（Ａｌ長さ＝２１塩基対（８）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｅ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル：Ｎ０（ｉ　ｉ　ｉ）　アンチセンス：Ｎｏ（１ｖ）　起源（Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６４）ｆｘｉ）　配列：配列番号１４ＧＡＡＡＣＣＧＡＡＴ　ＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡ　Ｃ２１配列番号１５（１）配列の特徴（Ａ）長さ、３２塩基対（Ｋ１）　配列：配列番号１６（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ｉｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセティカル＝ＮＯ（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅ　ｓ（１マ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６５）（Ｘｌ）　配列：配列番号１５ＡＣＧＡＡＴＧＣＡＧ　ＣＴＣＴＣＣＡＣＴＴ　ＡＡＣＡＴＴＣＡＧＴ　ＣＧ　３２配列番号１６（１）配列の特徴（Ａ）長さ、２７塩基対（Ｂｊ型：核酸（Ｃ）鎖の数、−重鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉｉ　ハイポセティカル　Ｎｏ（ｉ　ｉ　ｉｌ　アンチセンス：Ｙｅ　５（（Ｖ）起源（＾）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５４８１）（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡ　ＡＴＡＴＡＣＣ”（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス＝Ｎ０配列番号２０（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１８塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセティカル＝ＮＯ（ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０（１ｖ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５７２８）（１１）　配列：配列番号２０ＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡ　ＧＧＡＣＴＭＧ　１８配列番号２１（１）配列の特徴（＾）長さ　３９塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数　−重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ＩＩ）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル、Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（ｉ　ｖ）　起源（Ａ）生物名０合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５７２９）（！１）　配列：配列番号２１ＣＣＧＣＡＴＴＡＡＴ　ＴＡＡＣＣＧＣＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＣＴ　ＴＴＡＴＴＣＴＴＧ　３９配列番号２２（ｉｌ配列の特徴（八）長さ：３６塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖（１１）配列の種類、ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル、Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（１ｖ）　起源（Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５７３０）（ｘｌ）　配列：配列番号２２ＣＧＣＧＧＴＴＡＡＴ　ＴＭＴＧＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴ　ＣＡＣＣＣＧ　３１１ｉ配列番号２３（１）配列の特徴（Ａ）長さ　３０塩基対（８）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセテイカル二Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ（１マ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６０）（！１）　配列：配列番号２３ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴ　ＣＡττＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＡＣＴＧ　３０配列番号２４（１）配列の特徴（、〜）長さ：２４塩基対（３）型、核酸（ｃ）鎖の数　−重鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（！、ｌ）ハイポセティカル　Ｎｏ（ｉｉｉｊ　アンチセンス、Ｎｏ（１７）　起源：へ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６１）（ｘｌ）　配列：配列番号２４丁ＧＴＧＴＴＧＧＴ丁　ＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴ　ＴＭＴ　２４配列番号２５（１）配列の特徴（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル＝ＮＯ（ｉｉｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ（１ｖ）　起源（Ａ）生物名工合成オリゴヌクレオチド（○ＴＧ６０６２）（１１）　配列：配列番号２５ＴＭＣＡＣＡＣＡＡ　ＭＡＡＣＣＡＡＣＡ　ＣＡＣＡＧＴＴＣＴＡ　３０配列番号２６（１）配列の特徴・（Ａｌ　長さ：２４塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（目■）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（１マ）起源（Ａｌ生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６３）（ｘｉ）　配列、配列番号２６配列番号２７（１）配列の特徴（杓長さ＝３２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ１鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖ｌｉ　ｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉｊ　ハイポセティカルコＮ。

（ｉｉｉ）アンチセンス・Ｎｏ（１ｖ）起源（、へ）生物８二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４５６４）（１１）　配列　配列番号２７ＴＣＣＧＴＧＡＡＴＴ　ＣＴＡＧＴＡＧＴＧＴ　ＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧ　ＴＧ　３２配列番号２８（ｉｌ　配列の特徴（Ａ）長さ：２３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ１鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉｌ　ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（１マ）起源（Ａｌ生物名名二成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４５６５）（ｘｉ）　配列：配列番号２８ＴＣＣＡＧＴＣＣＧＧ　ＡＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣ２３配列番号２９（１）配列の特徴（Ａ）長さ　２８塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数、−重鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖（１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉｌ　ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０（１ｖ）　起源（Ａ）生物名二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５０１３）（Ｘｌ）　配列：配列番号２９ τｋｋＣＣＴＧＣｋＧ　ＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧτ八ＧＡへ　２Ｂ配列番号３０（１）配列の特徴（Ａ）長さ＝２１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス、Ｎｏ（１ｖ）　起源ＦＡ）生物名９合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０１５）（ｘｌ：　配列、配列番号３０ＣＡＡＣＧＣＧＣＡＴ　ＧＣＣＣＣＣＡＴＧＧ　Ｇ　”配列番号３１１：１）配列の特徴（八）長さ、３１塩基対（３）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー；直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセティヵル二Ｎ０（ｉ　ｉ　ｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ（！Ｖ）起源（Ａ）生物名二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０１４）（Ｘり　配列：配列番号３１ＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴ　ＧＴＴＴＴＡＭＣＣＧＣＡＴＴＧＧＧＡＧ　Ｇ　３１配列番号３２（１）配列の特徴（Ａ’長さ：３４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖（ＩＩ；配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇ！ｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティヵル：Ｎ０（ｉｉｉｊ　アンチセンス二Ｎ。

（１ｖ）　起源（Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ｘｌ）　配列・配列番号３２ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧ　ＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧ　ＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ　３４配列番号３３（ｉ）配列の特徴（入）長さ、３４塩基対（Ｂｊ型、核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセテイカル：Ｎ０（１目）アンチセンス：Ｙｅｓ（１ｖ）起源（入）生物名・合成オリゴヌクレオチド（！１）　配列、配列番号３３ＣＧＧＡＧＧＡＣＭ；　ＴＡＣＴＣＣＧＣＧＧ　ＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧ　３４配列番号３４（１）配列の特徴（入）長さ　１６塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数　−重鎖（Ｄ）トポロン−直鎖（１１）配列の種類　［）　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル　Ｎ。

（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス、ＮＯいマ）　起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０３９）（ｘｉ）　配列：配列番号３４ＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴ　ＣＡＧＴＣＡ配列番号３５い）配列の特徴（Ａ）長さ＝２４塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（０）トポロジー；直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇ！ｎｏｍｉｃ　）（口Ｉ）ハイボセテイカル、Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（巨）　起源（Ａ）生物名８合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０４０）（１１）　配列・配列番号３５ＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧ　ＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡ　ＴＧＣＡ　”配列番号３６（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：２０塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数、−重鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖（目）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｃｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル＝ＮＯ（ｉ　ｉ　Ｉ　アンチセンス＋Ｎ。

（ｉｖ）　起源（＾）生物名・合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５０２４）（！Ｉ）　配列、配列番号３６ＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡ　ＧＧＣＡＡＡＡＴＡＧ　２０配列番号３７い）配列の特徴（島長さ　３２塩基対ｆＢｊ型　核酸（Ｃ）鎖の数　−重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ロ）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテイカル、Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス　Ｙｅｓ（口・）　起源（入）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０２５）（１１）　配列：配列番号３７　・配列番号３８（ｉ）配列の特徴（杓長さ＝３１塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ’ｌ　鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏａ＋ｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテイカル：ＮＯ（日Ｉ）アンチセンス−ＮＯ（ｉ　ｖｌ　起源（入）生物名：合成オリゴヌクレオチド（○ＴＧ５０７８）（日）　配列；配列番号３８ＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴ　ＣＡＡＣＧＴＧＴＴＴ八　３１配列番号３９（１）配列の特徴（八）長さ・２０塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ（−Ｖ）起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０７９）（日）　配列：配列番号３つＡＣＡＴＧＭＣＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧ　”配列番号４０（１）配列の特徴（Ａｌ長さ、３８塩基対（Ｂ）型、核酸ｔｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｈｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｌ　ハイボセテイカル：Ｎ０（ｉｉｉ）　アンチセンス、ＮＯ［ｉ　ｙｌ　起源（Ａ）生物名−合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５９９１）（Ｘｌ）　配列：配列番号４０ＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡ　ＧＣＴＣＭＧＴＴＡ　ＡＣＧＧ入τＣＣＡＴ　ｃｒａｃａｃｃｉｒ　３Ｂ配列番号４１（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：２７塩基対（Ｉｌｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（肖）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏａ＋ｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティカル：Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯいマ）　起源（Ａ’ｌ生物名二名二オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６１４１）（！１）　配列：配列番号４１Ｇ入ＴＣＣＴＧＴＧＴ　ＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴ　ＴＧＴＧＴＧＣ２７配列番号４２（１）配列の特徴（Ａ）長さ、２７塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｔｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル＝Ｎ。

（目１）アンチセンス：Ｙｅｓ（１マ）起源（Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６１４２）（ｘｉ）　配列：配列番号４２ＧＡＴＣＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ　ＣＡＣＡＣＡＧ　２７Ｆ工ＧＵＲＥ　１゜ｐＴＧ６５４６Ｆ工ＧＵＲＥ　２ｐＴＧ６５８１Ｆ工ＧＵＲＥ　３ｐＴＧ６３０３Ｆ工ＧＵＲＥ　４Ｆ工ＧＵＲＥ　５Ｆ工ＧＵＲＥ　６ｐＴＧ５９１３Ｆ工ＧＵＲＥ　７ｐＴＧ８５１２Ｆ工ＧＵＲＥ　８ｐＴＧ８５１３Ｆ工ＧＵＲＥ　９ｐＴＧ８５１４Ｆ工ＧＵＲＥ　１−０ｐＴＧ８５１５Ｆ工ＧＵＲＥ　１１゜フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　７１０４　８９３１−４ＢＩ

Claims

【特許請求の範囲】１．複製に欠陥があり、補足細胞中において包膜することができ、５′から３′ にかけて５′ＩＴＲ、包膜化領域、Ｅ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域および３′ＩＴＲを含んだアデノウイルスのゲノムから、（ｉ）Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするＥ１Ｂ領域の部分の全体、または（ｉｉ）Ｅ１Ａ領域の全部または一部、およびＥ２およびＥ４領域から選択される少くとも１つの領域の全部または一部、または（ｉｉｉ）Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および包膜化領域の部分の欠失により誘導されてなる、アデノウイルスベクター。２．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするＥ１Ｂ領域の部分の全体の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。３．Ｅ３領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。４．Ｅ２領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項２または３に記載のアデノウイルスベクター。５．Ｅ４領域の全部または一部のさらなる欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項２〜４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。６．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、およびＥ２領域の全部または一部の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。７．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、およびＥ４領域の全部または一部の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１に記載のアデノウイルスベクター。８．Ｅ１Ｂ領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項６または７に記載のアデノウイルスベクター。９．Ｅ３領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項６〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。１０．Ｅ４領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項６、８または９に記載のアデノウイルスベクター。１１．ｇｐ１９ｋＤａタンパク質をコードするＥ３領域の部分を保持し、ゲノムのＥ３領域の部分的欠失により、アデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項３〜５、９または１０のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。１２，ｇｐ１９ｋＤａタンパク質をコードするＥ３領域の部分が、宿主細胞において上記タンパク質の発現に適した要素のコントロール下におかれてなる、請求項１１に記載のアデノウイルスベクター。１３．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および包膜化領域の部分の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。１４．（ｉ）ヌクレオチド２７０〜ヌクレオチド３４６、（ｉｉ）ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３、または（ｉｉｉ）ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３５８にわたる包膜化領域の部分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項１３に記載のアデノウイルスベクター。１５．イヌ、トリおよびヒトアデノウイルスから選択されたアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。１６．ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項１５に記載のアデノウイルスベクター。１７．少くともヌクレオチド１６３４〜ヌクレオチド４０４７にわたるＥ１Ｂ領域の部分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項１６に記載のアデノウイルスベクター。１８．特にヌクレオチド２７８７１〜ヌクレオチド３０７４８にわたるＥ３領域の部分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項１６または１７に記載のアデノウイルスベクター。１９．ヌクレオチド３２８００〜ヌクレオチド３５８２６にわたるＥ４領域の部分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。２０．ウイルスのゲノムの少くとも１８％の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。２１．ウイルスのゲノムの少くとも２２％の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。２２．ウイルスのゲノムの少くとも４０％の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項２１に記載のアデノウイルスベクター。２３．ウイルスのゲノムの少くとも９５％の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項２２に記載のアデノウイルスベクター。２４．５′および３′ＩＴＲと包膜化領域の全部または一部とを除くアデノウイルスのゲノムの全体の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項２３に記載のアデノウイルスベクター。２５．ヌクレオチド４５９〜３５８３２にわたるウイルスゲノムの部分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項２４に記載のアデノウイルスベクター。２６．外来ヌクレオチド配列を更に含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。２７．発現に必要な要素のコントロール下におかれた対象遺伝子を更に含んでなる、請求項２６に記載のアデノウイルスベクター。２８．非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパク質をコードする遺伝子を更に含んでなり、その遺伝子が宿主細胞で上記タンパク質の発現に必要な要素のコントロール下におかれてなる、請求項２６または２７に記載のアデノウイルスベクター。２９．転写をトランス活性化するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧａｌ４タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる、請求項２８に記載のアデノウイルスベクター。３０．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含んでなる、アデノウイルス粒子。３１．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターまたは請求項３０に記載のアデノウイルス粒子を含んでなる、真核宿主細胞。３２．特に５′ＩＴＲ以外のアデノウイルスのゲノムのＥ１領域の部分を含んだ補足要素を含んでなる補足系であって、上記補足要素が欠陥アデノウイルスベクターをイントランスで補うことができ、上記補足系のゲノムに組込まれているかまたは発現ベクター中に挿入されてなる、補足系。３３．特に：（ｉ）アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の全部または一部、および（ｉｉ）Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域から選択される上記ゲノムの少くとも１つの領域の全部または一部を含んでなる、請求項３２に記載の補足系。３４．特に：（ｉ）アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の全部または一部、および（ｉｉ）上記ゲノムのＥ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域のうち少くとも２つの全部または一部を含んでなる、請求項３２に記載の補足系。３５．特に：（ｉ）アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の全部または一部、および（ｉｉ）上記ゲノムのＥ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域の全部または一部を含んでなる、請求項３２に記載の補足系。３６．特に、Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするアデノウイルスのゲノムのＥ１Ｂ領域の全体を含んでなる、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の補足系。３７．特に、イヌ、トリおよびヒトアデノウイルスから選択されるアデノウイルスのゲノムの部分を含んでなる、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の補足系。３８．特に、ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分を含んでなる、請求項３７に記載の補足系。３９．特に、（ｉ）ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５２９７、（ｉｉ）ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド４０３４、または（ｉｉｉ）ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド４０３４にわたるヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分を含んでなる、請求項３８に記載の補足系。４０．特に、ヌクレオチド３２８００〜ヌクレオチド３５８２６にわたるヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムのＥ４領域の部分を含んでなる、請求項３８または３９に記載の補足系。４１．特に、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド３５８２６にわたるヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分を含んでなる、請求項３８に記載の補足系。４２．天然プロモーターを欠くアデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の部分を含み、その部分が適切なプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の補足系。４３．Ｅ１Ａ領域の部分が、非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパク質により誘導しうるプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項４２に記載の補足系。４４．Ｅ１Ａ領域の部分が、請求項２８または２９に記載のアデノウイルスベクターによりコードされる転写をトランス活性化するタンパク質により誘導しうるプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項４３に記載の補足系。４５．Ｅ１Ａ領域の部分が、転写をトランス活性化するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧａｌ４タンパク質により誘導しうるプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項４３または４４に記載の補足系。４６．選択マーカーをコードする遺伝子を更に含んでなる、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載の補足系。４７．選択遺伝子がプロマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするものである、請求項４６に記載の補足系。４８．選択遺伝子が、野生型アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域によりコードされる転写をトランス活性化するタンパク質により誘導されうるプロモーターのコントロール下、特に上記ゲノムのＥ２領域のプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項４６または４７に記載の補足系。４９．薬学的観点から許容される細胞系に由来する、請求項３２〜４８のいずれか一項に記載の補足系。５０．Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、Ａ５４９、ＭＲＣ５、Ｗ１３８およびＣＨＯ系から選択される細胞系に由来する、請求項４９に記載の補足系。５１．ヒト胚網膜細胞に由来する、請求項３２〜４８のいずれか一項に記載の補足系。５２．（ｉ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターが、トランスフェクトされた補足系を得るために、上記アデノウイルスベクターをイントランスで補える補足系中に導入され、（ｉｉ）上記トランスフェクトされた補足系がアデノウイルス粒子の生産を行うために適した条件下で培養され、（ｉｉｉ）上記アデノウイルス粒子が細胞培養物中で回収される、請求項３０に記載のアデノウイルス粒子の生産方法。５３．請求項３２〜５１のいずれか一項に記載の補足系が用いられる、請求項５２に記載の方法。５４．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター、請求項３０に記載されたまたは請求項５２または５３に記載の方法を用いて得られたアデノウイルス粒子、請求項３１に記載の真核宿主細胞、または請求項３２〜５１のいずれか一項に記載の補足系の治療または予防における使用。５５．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター、請求項３０に記載されたあるいは請求項５２または５３に記載の方法を用いて得られたアデノウイルス粒子、請求項３１に記載の真核細胞、または請求項３２〜５１のいずれか一項に記載の補足系を治療または予防剤として、薬学的観点から許容されるビヒクルとともに含んでなる、医薬組成物。