JP2002528128A

JP2002528128A - 組換えアデノウイルスベクターの増殖のためのアデノウイルス必須機能を発現するウシ細胞

Info

Publication number: JP2002528128A
Application number: JP2000579767A
Authority: JP
Inventors: シュアーシュクマーティコー，; ローンエイ．バビューク，; ポリスセシッドハーレッディー，
Original assignee: ユニバーシティオブサスカチュワン
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-11-01
Publication date: 2002-09-03
Also published as: AU780822B2; WO2000026395A3; US20030008390A1; EP1127151A2; CA2349760C; AU1461900A; CA2349760A1; US6458586B1; WO2000026395A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、欠損組換えウイルスベクターの複製を支持し得る細胞株を提供する。１つの局面では、アデノウイルスＥ１機能を発現するウシ細胞株を提供する。本発明の細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域および他の必須領域において変異および／または欠失を有するアデノウイルスベクターの増殖のために有用である。１つの実施形態では、本発明のアデノウイルス複製のために必須のアデノウイルス機能を発現する組換え細胞は、この細胞により提供される必須機能に対応する遺伝子領域において変異を有する複製欠損組換えウシアデノウイルスベクターの複製を許容する。ここで、この細胞における複製のために必須の機能は、このアデノウイルスベクターとは異なる種の機能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本出願は、１９９８年１１月２日に出願された米国仮特許出願番号第６０／１
５５，２１９号に対する優先権を主張する。

【０００２】（技術分野）本発明は、組換え細胞株、組換え動物ウイルスベクター、欠損アデノウイルス
ベクター、サブユニットワクチンおよび遺伝子治療の分野にある。

【０００３】（背景）アデノウイルスは、近年、遺伝子発現、組換えサブユニットワクチンおよび遺
伝子治療のためのベクターとして使用され始めている。Ｙｅｈら（１９９７）Ｆ
ＡＳＥＢＪ．１１：６１５−６２３；およびＩｍｌｅｒ（１９９８）Ｖａｃｃ
ｉｎｅ１３：１１４３−１１５１。アデノウイルスは、多くの動物種において
検出されており、最小の病原性を示し、そして非組み込み性である。アデノウイ
ルスは、広範な種々の細胞型（分裂中および静止の両方）に感染し得、そして気
道上皮細胞に対する天然の向性を有する。アデノウイルスをワクチンとして使用
することの利点としては、遺伝子操作についての適切性、高力価まで複製する能
力、安定性、および産生の容易さが挙げられる。アデノウイルスは、優れた安全
プロフィールとともに、長年にわたって、生腸内ウイルスワクチンとして使用さ
れてきた。

【０００４】アデノウイルスは、感染する動物の種（例えば、ヒト、ウシ、イヌなど）に従
って区別される。特定の種のアデノウイルスは、型に従って、血清学的にさらに
特徴づけられる。

【０００５】アデノウイルスＥ１領域は、ウイルス複製に必須のいくつかの機能をコードす
る。Ｅ１Ａ領域は、初期および後期の転写を活性化し、感染細胞の細胞周期のＳ
期への進行を刺激し、そしてα−インターフェロンおよびβ−インターフェロン
の効果をアンタゴナイズする機能をコードすることを担う。Ｅ１Ｂ領域は、感染
細胞の細胞周期進行の刺激、感染細胞におけるアポトーシスのブロック、および
宿主細胞ｍＲＮＡの核原形質輸送のブロックに関与する機能をコードする。さら
に、Ｅ１領域の一部分またはすべては、細胞形質転換を担う。例えば、Ｓｈｅｎ
ｋ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒ
ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ編）第６
７章、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９
６，２１１１−２１４８頁を参照のこと。

【０００６】理想的には（安全性の考慮のためには）、アデノウイルスゲノムの１以上の必
須領域はアデノウイルベクターのゲノムにおいて不活化される。例えば、Ｅ１領
域（いくつかの必須機能（上記を参照のこと）および潜在的なアデノウイルス形
質転換機能をコードする）は、多くの型のアデノウイルスベクターにおいて不活
化される。しかし、Ｅ１領域は、正常なウイルス複製に必須であるので、Ｅ１領
域のすべてまたは一部分を欠くアデノウイルスベクターの増殖は、Ｅ１機能を提
供するヘルパー細胞株を必要とする。これまでは、このようなヘルパー細胞株は
、細胞株において増殖されるいくつかのアデノウイルス型由来のＥ１配列を含ま
せることによってＥ１機能を提供してきた。例えば、ヒト２９３細胞株（ヒトア
デノウイルス５型Ｅ１配列を含む）は、変異したＥ１領域を有するヒトアデノウ
イルスの増殖に使用され得る。Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ
ｏｌ．３６：５９−７２。同様に、Ｅ２変異アデノウイルスおよびＥ４変異アデ
ノウイルスの増殖に適切な細胞株が記載されている。Ｋｌｅｓｓｉｇら（１９８
４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１３５４−１３６２；Ｗｅｉｎｂｅｒｇ
ら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：５３８
３−５３８６。

【０００７】相同組換えは、野生型細胞および培養細胞の同時感染の間の両方において、同
じ型のアデノウイルス間で容易に起こる。Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、ＴｈｅＧｅｎ
ｅｔｉｃｓｏｆＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａ
ｔＨおよびＷａｇｎｅｒＲＲ編、「ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＶｉｒｏ
ｌｏｇｙ」第９巻、ＮｅｗＹｏｒｋ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，１９７７；
Ｔａｋｅｍｏｒｉ（１９７２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４７：１５７−１６７；およ
びＷｉｌｌｉａｍｓら（１９７５）Ｃｅｌｌ４：１１３−１１９。結果として
、変異体アデノウイルスが、相同なアデノウイルス配列を含むヘルパー細胞株を
通じて継代される場合、相同組換えは、野生型アデノウイルスの産生を生じ得る
。例えば、Ｅ１欠失を含む複製欠損アデノウイルスがアデノウイルスＥ１配列を
含む補完性細胞株において継代される場合、複製能のあるウイルス（ｒｅｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｖｉｒｕｓ）が出現し、ここで欠失したＥ
１領域は、ヘルパー細胞に存在する相同なＥ１配列との組換えを通じて回復され
た。例えば、Ｈｅｈｉｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８４５９−８４
６７；Ｆａｌｌａｕｘら（１９９８）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ
９：１９０９−１９１７を参照のこと。

【０００８】従って、Ｅ１を欠失したベクターがＥ１機能を提供する細胞株において増殖さ
れ得、野生型ウイルスが、ヘルパー細胞においてベクターゲノムとウイルス配列
との間の組換えによって産生される可能性がない、アデノウイルスベクター−ヘ
ルパー細胞系の必要性が存在する。

【０００９】（発明の要旨）本発明の目的は、複製欠損アデノウイルスベクターの成長および増殖のための
系を提供することであり、ここで、この系は複製能のある組換えアデノウイルス
を産生する可能性を有さない。

【００１０】従って、本発明は、欠損アデノウイルスベクター、特に、アデノウイルスゲノ
ムのＥ１領域（すなわち、Ｅ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、または両方）において変異
した組換えアデノウイルスの複製を許容する宿主細胞（好ましくは、ウシの細胞
）を提供する。Ｅ１変異は、欠失、挿入、置換、１以上の点変異、再配列、また
は任意の他の型のインビボもしくはインビトロ遺伝子変化であり得る。このよう
な欠損アデノウイルスベクターは、しばしば、異種配列を含む。Ｅ１における欠
失を有するアデノウイルスゲノムにおいて、異種配列が、欠失したＥ１配列によ
って以前に占有された部位もしくはその付近で、および／またはゲノムの任意の
他の領域で挿入され得る。それらのＥ１領域における変異体であるアデノウイル
スゲノムはまた、ゲノムの他の領域（例えば、Ｅ３領域またはＥ４とそのゲノム
の右末端との間の領域）における変異を含み得る。

【００１１】１つの実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞において増殖されるアデノウ
イルスベクターとは異なる型または異なる種のアデノウイルス由来のＥ１配列を
含む。好ましい実施形態において、宿主細胞は、ヒトアデノウイルスＥ１配列を
含み、そして宿主細胞において増殖されるベクターは、ウシアデノウイルスであ
る。

【００１２】１つの実施形態において、ウシ宿主細胞は、胎仔ウシ網膜に由来する。好まし
い実施形態において、胎仔ウシ網膜細胞は、トランスフェクションによって細胞
に導入されたアデノウイルスＥ１配列を含む。より好ましい実施形態において、
Ｅ１配列は、ヒトアデノウイルス、例えば、ヒトアデノウイルス５型（ＨＡｄ−
５）に由来する。なおより好ましい実施形態において、胎仔ウシ網膜細胞はＨＡ
ｄ５配列を含み、それらのＥ１領域において１つ以上の変異、および必要に応じ
て、それらのゲノムの他の領域において１つ以上の変異を有する複製欠損ウシア
デノウイルス（ＢＡＶ）ベクターの増殖に使用される。さらにより好ましい実施
形態において、複製欠損ＢＡＶベクターは、異種配列を含み、ここで、この異種
配列は、欠損ＢＡＶベクターのゲノムのＥ１領域および／またはゲノムの他の領
域に配置され得る。

【００１３】本発明は、上記の宿主細胞、およびそのＥ１領域にて変異している欠損ＢＡＶ
ベクターを含む宿主細胞を提供する。この欠損ＢＡＶベクターは、必要に応じて
、挿入された異種配列を含む。

【００１４】さらに、本発明は、本発明の宿主細胞を使用する、複製欠損組換えＢＡＶベク
ターの増殖のための方法、ならびに本発明の宿主細胞を使用して増殖されたベク
ターおよびベクターゲノムを提供する。本発明の方法および組成物を使用して産
生された、欠損組換えＢＡＶベクターおよびそのゲノムは、免疫原性組成物とし
て有用である。このような免疫原性組成物は、予防的および治療的の両方に使用
され得る。予防的には、免疫原性組成物は、防御的免疫応答を誘発するワクチン
接種目的のために使用される。その治療用途において、免疫原性組成物は、感染
に対する免疫応答を誘導またはブーストし、それにより疾患の症状を予防または
回復するために使用される。

【００１５】さらに、本発明の方法および組成物を使用して作製された、欠損組換えＢＡＶ
ベクターおよびそのゲノムは、レシピエント哺乳動物細胞への異種遺伝子の導入
のために有用である。このような異種遺伝子が、適切な転写調節エレメントと作
動可能に連結されている場合、レシピエント細胞におけるその異種遺伝子の発現
が達成される。このような発現は、治療的遺伝子（単数または複数）および／ま
たは遺伝子産物（単数または複数）の提供において有用であり、従って、疾患の
処置および遺伝子治療における、インビトロ、インビボおよびエキソビボでの遺
伝子介入の特定の局面において、役割を果たす。

【００１６】（詳細な説明）（Ａ．一般的方法）本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の範囲内である、微生物学、免疫
学、ウイルス学、分子生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を使用する。これ
らの技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（
１９８２）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａ
ｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）：Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編（１９８４））；Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ編（１９８５））；ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４））；Ａｎｉ
ｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６））；
Ｐｅｒｂａｌ、ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７、および毎年更新版；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ（第２版）；第１、ＩＩおよびＩＩＩ巻（１９８９）を参照のこと。

【００１７】（Ｂ．定義）作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）または操作可能に
連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙｌｉｎｋｅｄ）とは、その構成成分が、
通常の機能を実施するように配置された、近位の（ａｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉ
ｏｎｏｆ）構成成分（通常は、配列エレメント）をいう。従って、例えば、コ
ード配列に作動可能に連結された制御配列は、そのコード配列の発現に影響し得
る。この構成成分は、制御配列がこのコード配列に対するその正常な調節機能を
発揮し得る限り、互いに連続する必要がない。

【００１８】形質転換またはトランスフェクションとは、外因性核酸が細胞へ導入されるプ
ロセスをいう。細胞へ核酸を導入する方法は、当該分野で周知であり、例えば、
マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ₄共沈、ＤＥＡ
Ｅデキストラン媒介移入、脂質媒介移入、粒子バンバードメントなどが、挙げら
れる。

【００１９】異種配列とは、組換えＢＡＶゲノムへ挿入された、非ＢＡＶ配列をいう。いく
つかの場合、異種配列は、タンパク質またはポリペプチドのうちの、すべてまた
は一部分をコードする配列である。いくつかの場合、異種配列は、目的の遺伝子
またはそのフラグメントを含む。

【００２０】用語、宿主細胞およびヘルパー細胞は、他では複製欠損アデノウイルスベクタ
ーの複製を支持し得る、細胞または細胞のクローンを示すために、交換可能に使
用される。宿主細胞は、一般的に、そのアデノウイルスベクターが欠損している
必須のウイルス機能を提供する。用語、細胞株は、宿主細胞のクローンをいうた
めに使用され得る。

【００２１】（Ｃ．宿主細胞および細胞株）本発明は、必須のウイルス機能を提供する細胞または細胞株を含み、その結果
、その機能を欠如するウイルスベクターが、この細胞または細胞株中で増殖され
得る。１つの実施形態において、このウイルスベクターはアデノウイルスベクタ
ーであり、そしてこの細胞株によって提供される必須のウイルス機能は、アデノ
ウイルスの機能である。従って、１つの実施形態において、細胞または細胞株は
、ベクター自体が産生し得ない欠損アデノウイルスベクターの複製のために必要
な、少なくともいくつかのタンパク質を産生し得る。この細胞または細胞株によ
って提供されるタンパク質はまた、ウイルス性粒子の成熟および／またはアセン
ブリに必要な、構造タンパク質であり得る。このタンパク質は、複製、転写、こ
れらのプロセスの調節または任意の他の必須のウイルス機能に関与し得る。この
細胞株によって提供されるウイルス機能は、必ずしもタンパク質をコードする必
要はなく、これはまた、必須のＲＮＡをコードし得る。

【００２２】１つの実施形態において、この必須機能は、アデノウイルスゲノムのフラグメ
ントによってコードされ、アデノウイルスゲノムフラグメントが欠損アデノウイ
ルスベクターにおける欠損を補完する能力が変異によって低下されない限り、こ
のフラグメントは、この変異（例えば、ヌクレオチドの欠失および／もしくは付
加、点変異、転座、逆位、または再配列によって改変され得る。このアデノウイ
ルスゲノムフラグメントは、プラスミドまたはウイルスベクター中で、本発明の
細胞中に存在し得、あるいは、好ましくは、この細胞のゲノムに組み込まれ得る
。アデノウイルスゲノムのフラグメントをベクターに導入するための方法、その
ような目的のために適切なベクター、ベクターまたは核酸フラグメントを細胞に
導入するための方法、および核酸フラグメントの細胞性ゲノムへの組み込みを指
向するための方法は、当業者に周知の従来の技術である。従って、安定なヘルパ
ー細胞株（アデノウイルス核酸フラグメントによってコードされるアデノウイル
ス機能を発現する）が、樹立され得る。このような細胞株の構築において、選択
マーカー（例えば、抗生物質耐性を付与する遺伝子）を用いる（アデノウイルス
ゲノムフラグメントまたはアデノウイルスゲノムフラグメントを含むベクターの
）同時トランスフェクションが、トランスフェクトされた細胞の検出を補助する
ために使用され得る。いくつかの場合において、このヘルパー細胞株は、このア
デノウイルスゲノムフラグメントによって発現される産物の形質転換能力に基づ
いて、別々の選択マーカーの使用なしに樹立され得る。例えば、図２を参照のこ
と。

【００２３】好ましい実施形態において、このアデノウイルス機能はＥ１機能であり、そし
てこのアデノウイルスベクターは、欠損Ｅ１領域を含む。この欠損は、点変異、
置換、欠失、挿入、配列の再配列または機能の損失を生じる任意の他の型の遺伝
的改変であり得る。好ましくは、この欠損は、Ｅ１領域における欠失である。

【００２４】従って、１つの実施形態において、本発明の細胞および細胞株は、アデノウイ
ルスのＥ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、またはＥ１ＡとＥ１Ｂの両方の機能を提供し得
る。好ましい実施形態において、本発明の細胞および細胞株は、前述の機能をコ
ードするアデノウイルス配列を含む。より好ましくは、本発明の細胞および細胞
株は、ヒトアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス５型（ＨＡｄ−５）の
ような）によってコードされるＥ１Ａ機能およびＥ１Ｂ機能を発現する。これら
の実施形態において、ヒトアデノウイルスＥ１配列は、最も上流のＥ１Ａをコー
ドするポリペプチドの開始（ＡＴＧ）コドンから最も下流のＥ１Ｂをコードする
ポリペプチドの停止コドンまで広がり得る。しかし、Ｅ１配列はまた、５’末端
もしくは３’末端のいずれかまたはその両方にてさらなるアデノウイルス配列を
含み得る。好ましい実施形態において、本発明の細胞および細胞株は、ＨＡｄ−
５ゲノムのヌクレオチド５０５〜４０３４に広がるＥ１配列を含む。別の実施形
態において、本発明の細胞および細胞株は、ＨＡｄ−５ゲノムのヌクレオチド５
０５〜３５１０に広がるＥ１配列を含む。ＨＡｄ−５ゲノムの完全配列は、当業
者に公知である。Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８
６：２８０〜２８５。

【００２５】本発明の細胞中に存在するアデノウイルスの配列は、適切な制御エレメント（
転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレメントの両方）と作動可能に連
結して配置され得る。制御エレメントは、アデノウイルス配列に通常は付随する
エレメントまたは異種配列を含み得る。例えば、本発明の細胞中に存在するアデ
ノウイルス配列は、Ｅ１Ａプロモーター配列およびＥ１Ｂポリアデニル化シグナ
ルを保持し得る。別の実施形態において、アデノウイルス配列は、本発明のヘル
パー細胞株において機能的である、適切な異種プロモーターの制御下に配置され
る。異種ポリアデニル化部位の使用もまた、意図される。異種調節エレメントは
、任意の真核生物ゲノムまたはウイルスゲノムから単離され得る。転写調節エレ
メント（例えば、プロモーター）は、構成的であってもよいし、または調節可能
であってもよい。調節可能な制御エレメントは、正に調節され得るかもしくは負
に調節され得るかのいずれか、あるいはその両方であり得る。

【００２６】本発明の１つの実施形態において、組換え細胞株は、アデノウイルスＥ１領域
を含む発現カセットを構築すること、およびそれを用いて宿主細胞を形質転換し
て、Ｅ１機能を発現する補完性細胞株または培養物を提供することによって、産
生される。これらの組換え補完性細胞株は、欠失されたＥ１配列を用いて欠損組
換えアデノウイルスに所望の外来遺伝子またはそのフラグメント（必要に応じて
組換えアデノウイルス中にコードされる）を複製および発現させ得る。本発明の
細胞または細胞株中の欠失されたＥ１配列および挿入された異種配列を有する欠
損組換えアデノウイルスの複製は、その異種発現を発現し得る感染ビリオンの産
生を生じる。

【００２７】本発明に従う組換え補完性細胞株は、欠失されたＥ１遺伝子領域を有する欠損
組換えＢＡＶ（ここで、欠失された配列は、必要に応じて、異種ヌクレオチド配
列によって置換されている）が、この異種ヌクレオチド配列によってコードされ
る１つ以上の外来遺伝子またはそのフラグメントを複製および発現することを可
能にし得る。Ｅ１欠失を有するＢＡＶベクター（ここで、異種配列は、Ｅ１以外
の領域に挿入される）はまた、これらの補完性細胞株中で増殖され得、そして異
種配列がＢＡＶプロモーターの下流に挿入されるかまたは真核生物調節配列と作
動可能に連結されて挿入されている場合、この異種配列を発現する。例えば、本
発明の細胞および細胞株は、Ｅ３遺伝子欠失をさらに含む組換えアデノウイルス
を産生する際に有用であり、この異種ヌクレオチド配列は、欠失されたＥ３領域
の代わりに挿入された外来遺伝子またはそのフラグメントをコードする。

【００２８】好ましいヘルパー細胞株としては、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞（実施例１（前出）に
おいて記載される通り）が挙げられる。簡潔には、このＶＩＤＯＲ２細胞株は
、ヒトアデノウイルス５型（ＨＡｄ−５）Ｅ１領域からのＤＮＡを用いてトラン
スフェクトされた胎仔ウシ網膜細胞株であり、そしてこれは、Ｅ１欠失ＢＡＶベ
クターおよびＥ１欠失ヒトアデノウイルスの増殖を支持する。本発明は、ＶＩＤ
Ｏ−Ｒ２細胞によって産生されるヒトアデノウイルスＥ１ポリペプチドが、Ｅ１
機能においてウシアデノウイルス欠損を補完し得ることを示す。しかし、複製能
のある組換えウイルスを産生するリスクは、ＨＡｄＥ１領域とＢＡＶＥ１領
域との間のヌクレオチド配列における差異に起因して減少する。従って、Ｅ１欠
失ＢＡＶベクターは、組換えによって野生型ＢＡＶを産生するリスクなしにＶＩ
ＤＯ−Ｒ２細胞中で増殖され得る。

【００２９】より一般的には、欠損組換えＢＡＶベクター（１つ以上の必須機能を欠如する
）は、適切な補完性細胞株中で増殖され得る。ここで、特定の補完性細胞株は、
特定の欠損組換えＢＡＶベクター中で欠如している機能（単数または複数）を提
供する。補完性細胞株は、例えば、ベクターが欠如する機能を発現するヘルパー
ウイルスとの同時感染を通じてか、あるいは特定のウイルス機能をコードするウ
イルス性ゲノムのフラグメントを組み込むことによるかそうでなければ安定な形
態にて維持することによって、ウイルス機能を提供し得る。

【００３０】本発明はまた、本発明の宿主細胞を使用して構築されたＢＡＶベクター、およ
びこのＢＡＶベクターを含む発現系を含む。特定の実施形態において、本発明の
宿主細胞を使用して構築されたＢＡＶベクターは、１以上の異種ヌクレオチド配
列を含む。つまり、非ＢＡＶ配列は、Ｅ３領域の一部分またはすべて、Ｅ１領域
の一部分またはすべて、Ｅ２領域の一部分またはすべて、Ｅ４領域の一部分また
はすべて、Ｅ４とゲノムの右末端との間の領域の一部分またはすべて、後方の領
域（Ｌ１−Ｌ７）の一部分またはすべて、ならびに／あるいは３３ｋＤ、５２ｋ
Ｄ、１００ｋＤ、ＤＢＰ、ｐｏｌ、ｐＴＰおよびペントン遺伝子ならびに遺伝子
ＩＩＩＡ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩおよびｐＸによって占有される
領域の一部分またはすべて、を置換し得る。このゲノムの任意の上述の領域は、
Ｅ１領域と共に、またはＥ１領域に代わって、変異または欠失され得る。この発
現系が使用され得、ここで、異種ヌクレオチド配列は、必要に応じて、任意の他
の異種プロモーターの制御下にある。ＢＡＶベクターはまた、逆末端反復（ＩＴ
Ｒ）配列およびパッケージング配列を含み得る。

【００３１】ＢＡＶの３３ｋＤ、５２ｋＤ、１００ｋＤ、ＤＢＰ、ｐＴＰ、ペントン（ＩＩ
Ｉ）、ｐＩＩＩＡ、ｐＩＶａ２、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩおよびｐ
Ｘ遺伝子は、ウイルス複製に必須である。これらの遺伝子のいずれかにおいて欠
失を含むか、これらの遺伝子のいずれかによってコードされる機能を欠如する、
ＢＡＶベクターは、本発明の実施において使用され得る。しかし、このようなベ
クターは、このベクター中に失われている必須のウイルス機能を提供する適切な
補完性宿主細胞（すなわち、ヘルパー細胞株）において増殖させるべきである。
ヒトアデノウイルスにおいて、Ｅ４領域（ＯＲＦ３およびＯＲＦ６／７）におけ
る特定のオープンリーディングフレームは、ウイルス複製に必須である。ＢＡＶ
−３のＥ４領域における相同なオープンリーディングフレームにおける欠失は、
このウイルスベクターの増殖のためのヘルパー細胞株の使用に必要とし得る。従
って、上記遺伝子によってコードされる機能のいずれかを提供する宿主細胞は、
本発明の実施に有用である。好ましい宿主細胞株は、これらＢＡＶ遺伝子のヒト
アデノウイルス対応物をコードする配列を含む。

【００３２】本発明の細胞株および宿主細胞は、任意の哺乳動物種の任意の組織に由来し得
る。好ましい種の細胞は、ウシ細胞である。ウシ細胞の間で好ましいものは、腎
臓および胎仔網膜由来のものである。

【００３３】（Ｄ．アデノウイルスベクター）本発明の１つの実施形態において、組換え発現カセットが、１以上の適切な制
限酵素で野生型ＢＡＶゲノムを切断することによって、ＢＡＶベクター内に導入
されて、Ｅ１領域配列またはＥ３領域配列を、それぞれ含むＢＡＶ制限フラグメ
ントを産生し得る。ＢＡＶ制限フラグメントは、クローニングビヒクル（例えば
、プラスミド）内に挿入され得、そしてその後、少なくとも１つの異種配列（こ
れは、外来タンパク質をコードしてもよく、しなくてもよい）が、必要に応じて
、真核生物転写および／または翻訳調節配列と作動可能に連結されて、Ｅ１領域
またはＥ３領域内に挿入され得る。この得られたプラスミドまたは直線化された
フラグメントは、ＢＡＶゲノムと接触され、そして相同組換えまたは他の従来の
遺伝子工学方法によって、所望の組換え体が得られる。一般的な方法論は、例え
ば、Ｃｈａｒｔｉｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４８０５−４８１
０に記載される。発現カセットとＢＡＶゲノムとの間の組換えは、適切なヘルパ
ー細胞株（例えば、原核生物細胞またはＥ１形質転換細胞株（例えば、Ｇｒａｈ
ａｍら（１９９１）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ，第７巻、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１０９〜１２８頁に記載の株）のよう
な）内で生じ得る。異種配列はまた、Ｅ１領域およびＥ３領域以外の部位でＢＡ
Ｖゲノム内に導入され得る。適切な宿主細胞の形質転換またはトランスフェクシ
ョンの前後いずれかで、異種配列の挿入が所望されるＢＡＶゲノム領域を保有す
る制限フラグメントを単離すること、ＢＡＶゲノムのこのような単離されたフラ
グメント内に異種配列をクローニングすること、そして異種配列を含む単離され
たＢＡＶフラグメントをＢＡＶゲノムに再導入して、ＢＡＶベクターを産生する
ことは、当該分野の技術範囲内である。

【００３４】ＢＡＶベクターの構築のための適切な宿主細胞としては、ＢＡＶ配列（ＢＡＶ
ゲノムを含む）によるトランスフェクションに感受性である任意の細胞が挙げら
れ、これらのＢＡＶ配列は、ＢＡＶゲノムとＢＡＶ配列を含むプラスミド（必要
に応じて、異種配列を含む）との間、または互いにＢＡＶ配列を含む２以上のプ
ラスミド（その１つまたは両方が、必要に応じて異種配列を含む）の間の組換え
を支持する。組換えは、好ましくは、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中
で行われるが、一方、ウイルス粒子を産生するためのウイルスゲノム（必要胃応
じてプラスミド中に含まれる）のトランスフェクションは、真核生物細胞、好ま
しくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ウシ細胞、なおより好ましくは、ＭＤ
ＢＫまたはＰＦＢＲ細胞、最も好ましくは、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞中で行われる。
細菌細胞培養物の増殖、ならびに真核生物細胞および哺乳動物細胞株の培養およ
び維持は、当業者に周知である手順である。

【００３５】１以上の異種配列が、ＢＡＶゲノムの１以上の領域に挿入されて、組換えＢＡ
Ｖベクターを産生し得、これは、ＢＡＶゲノムの挿入能力および組換えＢＡＶベ
クターがその挿入された異種配列を発現する能力によってのみ制限される。異種
配列の挿入に適切なＢＡＶゲノムの領域は、Ｅ３領域の一部分またはすべて、Ｅ
１領域の一部分またはすべて、Ｅ２領域の一部分またはすべて、Ｅ４領域の一部
分またはすべて、Ｅ４とゲノムの右末端との間の領域の一部分またはすべて、後
方の領域（Ｌ１−Ｌ７）の一部分またはすべて、ならびに／あるいは３３ｋＤ、
５２ｋＤ、１００ｋＤ、ＤＢＰ、ｐｏｌ、ｐＴＰおよびペントン遺伝子ならびに
遺伝子ＩＩＩＡ、ｐＶ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩ、ｐＶＩＩＩおよびｐＸによって占有
される領域の一部分またはすべて、を含む。一般的に、正常なゲノム長の約１０
５％のアデノウイルスゲノムが、ウイルス粒子にパッケージングされる能力を保
持する。挿入能力は、非必須領域の欠失および／または必須の領域の欠失によっ
て増加され得、それらの領域の機能は、ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルス
によって提供される。従って、ベクターの挿入能力は、トランスで提供されるウ
イルス機能の性質および程度に依存し得；ここで、ヘルパー細胞株またはヘルパ
ーウイルスによって提供される必須のウイルス機能の数がより多いほど、欠失さ
れ得るベクターゲノムの部分がより大きく；それゆえ、このベクターの能力がよ
り高い。

【００３６】本発明の１つの実施形態において、挿入は、挿入が所望されるＢＡＶゲノムの
領域を含むプラスミドを構築することによって達成され得る。次いで、プラスミ
ドは、このプラスミドのＢＡＶ部分中の配列を認識する１以上の制限酵素で消化
され、そして異種配列は、この制限消化の部位で挿入される。異種配列が挿入さ
れたＢＡＶゲノムの一部分を含むプラスミド（または直線フラグメント）は、Ｂ
ＡＶゲノムまたはＢＡＶゲノムを含む直線化されたフラグメントと共に、細菌細
胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような）内に同時形質転換され、ここで、このＢＡ
Ｖゲノムは、全長ゲノムであり得るか、または１以上の欠失を含み得る。プラス
ミド（および／またはフラグメント）間の相同組換えは、挿入された異種配列を
含む組換えＢＡＶゲノムを含むプラスミド（または、フラグメント）を生じる。

【００３７】本発明の別の実施形態において、組換え発現カセットが、ＢＡＶゲノムを適切
な制限酵素で切断し、Ｅ１配列またはＥ３配列を含むゲノムのそれぞれ、左末端
または右末端を提示するＤＮＡフラグメントを生成し、この左末端フラグメント
または右末端フラグメントをクローニングビヒクル（例えば、プラスミド）内に
挿入し、そしてその後、少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列（この異種配列は、必
要に応じて、外来性の転写調節配列に作動可能に連結される）をＥ１配列または
Ｅ３配列に挿入することによって得られ得る。この組換え発現カセットを、適切
な細胞内でＢＡＶゲノムと接触させて、そして相同組換え、または他の従来の遺
伝子工学方法によって、組換えＢＡＶゲノムが得られる。適切な宿主細胞として
は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような）および真核生物細胞の両方
が挙げられる。適切な真核生物細胞の例としては、ＭＤＢＫ細胞、アデノウイル
スＥ１機能を発現するＭＤＢＫ細胞、初代胎仔ウシ網膜細胞、アデノウイルスＥ
１機能を発現する初代胎仔ウシ網膜細胞（例えば、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞）、およ
び先に列挙された細胞の機能に等価である機能を発現する細胞が挙げられるが、
これらに限定されない。

【００３８】Ｅ１およびＥ３領域を含むフラグメント以外のＢＡＶゲノムの制限フラグメン
トはまた、本発明の実施において有用であり、そして異種配列がＥ１およびＥ３
領域以外の配列に挿入され得るようにクローニングビヒクルの挿入され得る。次
いで、これらのＤＮＡ構築物は、上記のように、適切な宿主細胞の形質転換また
はトランスフェクションの前または後のいずれかに、インビトロまたはインビボ
において、ＢＡＶゲノムとの組換えを受け得る。本発明の目的のために、ＢＡＶ
ゲノムは全長ゲノム、または、得られる組換えＢＡＶゲノムが複製およびパッケ
ージングに必要なＢＡＶ配列を含む限りは、組換えフラグメントにおいて欠失さ
れた領域以外の領域において欠失を含むゲノムのいずれかであり得る。上記のよ
うな、原核生物細胞および真核生物細胞におけるトランスフェクション、細胞培
養および組換えのための方法は、当業者に周知である。

【００３９】異種配列の挿入のための部位を提供するか、または異なる部位での挿入のため
のさらなる能力を提供するためのＢＡＶ配列の欠失は、当業者に周知の方法によ
り達成され得る。例えば、プラスミド中でクローニングされたＢＡＶ配列につい
ては、１つ以上の制限酵素（ＢＡＶインサートにおいて少なくとも１つの認識配
列を有する）での消化、その後の連結が、ある場合には、制限酵素認識部位間の
配列の欠失を生じる。あるいは、ＢＡＶインサート内の単一の制限酵素認識部位
での消化、その後のエクソヌクレアーゼ処理、その後の連結が、制限部位に隣接
するＢＡＶ配列の欠失を生じる。上記のように構築された、１つ以上の欠失を有
するＢＡＶゲノムの１つ以上の部位を含むプラスミドが、ＢＡＶゲノム（全長ま
たは欠失）または全長ＢＡＶゲノムまたは欠失ＢＡＶゲノムのいずれかを含むプ
ラスミドとともに細菌細胞に同時トランスフェクトされて、相同組換えにより、
１つ以上の特定の部位で欠失を有する組換えＢＡＶゲノムを含むプラスミドが、
産生され得る。次いで、この欠失を有するＢＡＶビリオンは、この組換えＢＡＶ
ゲノムを含むプラスミドでの哺乳動物細胞（ＭＤＢＫ，ＰＦＢＲおよびＶＩＤＯ
−Ｒ２細胞およびそれらの等価物を含むがこれらに限定されない）のトランスフ
ェクションにより得られ得る。

【００４０】本発明の１つの実施形態において、挿入部位は、ＢＡＶプロモーターに近接し
そしてこのプロモーターの下流（転写センスで）である。ＢＡＶプロモーターの
位置、およびＢＡＶプロモーターの下流の制限酵素認識配列（挿入部位としての
使用のため）は、共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９４／００６７８および
ＰＣＴ／ＣＡ９８／００６２４に提供されるＢＡＶヌクレオチド配列から当業者
により容易に決定され得る。あるいは、種々のインビトロ技術が、特定の部位に
制限酵素認識配列を挿入するために、または制限酵素認識配列を含まない部位に
異種の配列を挿入するために用いられ得る。このような方法としては、１つ以上
の制限酵素認識配列の挿入のためのオリゴヌクレオチド媒介異種二重鎖形成（例
えば、Ｚｏｌｌｅｒら（１９８２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０
：６４８７〜６５００；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９０）Ｒｏｕｘ’ｓＡｒｃｈ
．Ｄｅｖ，Ｂｉｏｌ．１９９：８９〜９６；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５４：３６７〜３８２）ならびにより長い
配列の挿入のためのＰＣＲ媒介方法が挙げられるがこれらに限定されない。例え
ば、Ｚｈｅｎｇら（１９９４）ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ３１：１６３〜
１８６を参照のこと。

【００４１】異種配列が真核生物細胞中で活性な転写調節配列をさらに含む場合、ＢＡＶプ
ロモーターから下流でない部位に挿入されたこの異種配列の発現を得ることがま
た可能である。このような転写調節配列は、細胞性プロモーター（例えば、ウシ
ｈｓｐ７０プロモーターのような）およびウイルスプロモーター（例えば、ヘル
ペスウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、およびパホバウイル
スプロモーターのような）、ならびにレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）のＤ
ＮＡコピーを含み得る。

【００４２】別の実施形態において、原核生物細胞における異種組換えを用いて、Ｅ１欠失
を含むクローニングされたＢＡＶゲノムを産生し得る；そしてクローニングされ
た、Ｅ１欠失ＢＡＶゲノムは、プラスミドとして増殖され得る。感染性ウイルス
は、プラスミド含有細胞からレスキューされたこのクローニングされた、Ｅ１欠
失ＢＡＶゲノムを用いた、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞、またはそれらの等価物のトラン
スフェクションにより得られ得る。

【００４３】本発明の宿主細胞（必須のウイルス機能を提供する）は、組換えＢＡＶベクタ
ーに含まれる異種配列によりコードされるタンパク質またはペプチドの発現のた
めに用いられ得る。組換えタンパク質およびペプチドの発現および精製の方法は
、当業者に周知である；例えばＡｕｓｕｂｅｌら、前出。

【００４４】組換えアデノウイルスベクターを産生するための原核生物細胞中の組換えによ
る、組換えアデノウイルスゲノム（ＢＡＶゲノムを含む）の調製、およびそのよ
うに産生された組換えゲノムを用いる哺乳動物細胞（ウシ細胞を含む）の形質転
換のためのさらなる方法は、共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９４／００６
７８およびＰＣＴ／ＣＡ９８／００６２４（この開示は、その全体が参考として
本明細書に援用されている）に記載されている。

【００４５】（Ｅ．治療的遺伝子およびポリペプチド）本発明の細胞および細胞株を用いて増殖されるＢＡＶベクターは、例えば、イ
ンビトロポリペプチド産生、ワクチン産生、核酸免疫および遺伝子治療のような
適用における、治療的ポリペプチドおよび核酸の発現のために用いられ得る。

【００４６】１つの実施形態では、本発明の宿主細胞中で増殖されるＢＡＶベクターは、サ
ブユニットワクチンおよび核酸免疫における使用のための、種々の哺乳動物病原
体の防御決定基をコードする異種配列を含む。代表的な哺乳動物病原体抗原とし
ては以下が挙げられるがこれらに限定されない：細菌病原体、（例えば、Ｐａｓ
ｔｅｕｒｅｌｌａｓｐ．およびＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐ．）；ならびにウ
イルス病原体（例えば、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パライン
フルエンザウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、ウイルス性下痢ウイルス
（ｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス、アデノウ
イルス、レトロウイルス、レンチウイルスなど）。ＢＡＶベクターはまた、サイ
トカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキンおよびコロニー刺激因
子）（防御決定基をコードする配列に代わってまたはその配列に加えてのいずれ
か）および治療的ポリペプチド（例えば、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因
子（ｃｙｓｔｉｃｆｉｂｒｏｓｉｓｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｃｏｎｄ
ｕｃｔａｎｃｅｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（ＣＦＴＲ）および第ＩＸ血液凝固因子
）をコードする遺伝子を含み得る。

【００４７】種々の外来遺伝子またはヌクレオチド配列もしくはコード配列（原核生物また
は真核生物の）は、ＢＡＶベクターに挿入され得、それは本発明に従って増殖さ
れ、特に、広範な疾患に対する防御を提供する。防御は、本発明の方法により増
殖された組換えベクターを用いる、サブユニットワクチン、核酸免疫および／ま
たは遺伝子治療の方法により提供され得る。

【００４８】異種（すなわち、外来）ヌクレオチド配列は、目的（好ましくは治療目的）の
１つ以上の遺伝子から構成され得る。本発明の場合、目的の遺伝子は、構造ＲＮ
Ａ、リボソームＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムをコードし得るか、ま
たはそれはｍＲＮＡをコードし得、次いで目的のタンパク質に翻訳される。目的
の遺伝子は、ゲノム型の遺伝子、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）型の遺伝子、または
混合型の遺伝子（すなわち、少なくとも１つのイントロンが欠失しているミニ遺
伝子）であり得る。それは、以下をコードし得る：成熟タンパク質；成熟タンパ
ク質の前駆体（特に分泌されることが意図され、従ってシグナルペプチドを含む
前駆体）；様々な起源の配列の融合物に起源するキメラタンパク質；または改善
された生物学的特性または改変された生物学的特性を示す天然タンパク質の変異
体。このような変異体は、天然のタンパク質をコードする遺伝子の１つ以上のヌ
クレオチドの欠失、置換および／または付加により、または天然のタンパク質を
コードする配列中の任意の他の型の変化（例えば、転座または逆位）により得ら
れ得る。

【００４９】目的の遺伝子は、宿主細胞における発現のために適切な調節配列の制御下に配
置され得る。適切な調節配列は、遺伝子のＲＮＡ（構造的ＲＮＡ、リボソームＲ
ＮＡ、リボザイムＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）への転写のため
、ＲＮＡのプロセシングのため、およびｍＲＮＡのタンパク質への翻訳のために
必要なエレメントのセットを意味することが理解される。転写に必要なエレメン
トの中でも、プロモーターは、非常に重要であると想定される。プロモーターは
、構成性プロモーターまたは調節プロモーターであり得、そして真核生物起源、
原核生物起源またはウイルス起源（およびアデノウイルス起源ですらある）の任
意の遺伝子から単離され得る。あるいは、目的の遺伝子の天然のプロモーターで
あり得る。概して、本発明において使用されるプロモーターは、細胞特異的調節
配列を含むように選択され得るか、またはこのような配列を含むように改変され
得る。例えば、本発明において使用するための目的の遺伝子は、リンパ球宿主細
胞へその発現を標的化することが所望される場合、免疫グロブリン遺伝子プロモ
ーターの制御下におかれる。ＨＳＶ−１ＴＫ（ヘルペスウイルス１型チミジン
キナーゼ）遺伝子プロモーター、アデノウイルスＭＬＰ主要後期プロモーター（
ｍａｊｏｒｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）（特にヒトアデノウイルス２型）、
ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ（長末端反復）、ＣＭＶ（サイトメガロウ
イルス）初期プロモーター、およびＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝
子プロモーターもまた言及され、例えば、多数の細胞型での発現を可能にする。

【００５０】プロモーターに加えて、エンハンサー配列もまた、作動可能に連結される遺伝
子またはコード配列の発現の程度を調節する際に重要である。異種遺伝子または
コード配列は、ベクター中に存在する内因性アデノウイルスエンハンサーにより
調節され得るか、またはベクターにはないエンハンサーにより調節され得る。ベ
クターにはないエンハンサーは、天然の状態で異種遺伝子と通常関連しているエ
ンハンサーであり得るか、または遺伝子またはコード配列と通常は関連していな
いが、インビトロ技術により遺伝子またはコード配列と作動可能な連結に配置さ
れるエンハンサーであり得る。

【００５１】あるいは、組換えＢＡＶベクターを特定の細胞型へ標的化することは、組換え
ヘキソンおよび／または線維遺伝子を構築することにより達成され得る。これら
の遺伝子のタンパク質産物は、宿主細胞認識に関与し；従って、これらの遺伝子
は、ウイルスに別の宿主細胞を認識させるペプチド配列を含むように改変され得
る。

【００５２】本発明の状況において有用な、目的の遺伝子の中でも、以下が言及され得る：
−インターフェロンおよびインターロイキンのようなサイトカインをコードする
遺伝子； −リンホカインをコードする遺伝子； −病原体生物（ウイルス、細菌または寄生体）により、好ましくは、ＨＩＶウイ
ルス（ヒト免疫不全ウイルス）により認識されるレセプターのような膜レセプタ
ーをコードする遺伝子； −第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のような凝固因子をコードする遺伝子； −ジストロフィンをコードする遺伝子； −インスリンをコードする遺伝子； −例えば、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）タンパク質のよ
うな細胞イオンチャネルに直接的または間接的に関与しているタンパク質をコー
ドする遺伝子； −アンチセンスＲＮＡ、または病原体生物のゲノムに存在する病原性遺伝子によ
り産生されるタンパク質の活性を阻害し得るタンパク質、または発現が脱制御（
ｄｅｒｅｆｕｌａｔｅ）された細胞遺伝子（例えば、オンコジーン）の活性を阻
害し得るタンパク質（またはそれらをコードする遺伝子）をコードする遺伝子；
−例えば、α１アンチトリプシンまたはウイルスプロテアーゼインヒビターのよ
うな酵素活性を阻害するタンパク質をコードする遺伝子； −生物学的機能を損なうように変異している病原性タンパク質の改変体をコード
する遺伝子（例えば、標的配列への結合について、天然のタンパク質と競合し得
、これにより、ＨＩＶの活性化を妨げる、ＨＩＶウイルスのｔａｔタンパク質の
トランスドミナント改変体である）； −宿主の細胞免疫を増大させるために、抗原性エピトープをコードする遺伝子；
−主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩタンパク質をコードする遺伝
子、ならびにこれらの遺伝子のインデューサーであるタンパク質をコードする遺
伝子； −抗体をコードする遺伝子； −免疫毒素をコードする遺伝子； −毒素をコードする遺伝子； −増殖因子または成長ホルモンをコードする遺伝子； −細胞レセプターおよびそれらのリガンドをコードする遺伝子；腫瘍サプレッサ
をコードする遺伝子； −腫瘍サプレッサをコードする遺伝子； −細胞酵素または病原体生物により産生される酵素をコードする遺伝子；および
−自殺遺伝子。ＨＳＶ−１ＴＫ自殺遺伝子は、例示として言及され得る。この
ウイルスＴＫ酵素は、特定のヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビルまた
はガンシクロビル）について、細胞ＴＫ酵素と比較すると顕著に大きな親和性を
示す。このウイルスＴＫ酵素は、特定のヌクレオシドアナログを、モノリン酸化
分子に変換する。それ自体が細胞酵素によって、毒性であるヌクレオチド前駆体
に変換され得る。これらのヌクレオチドアナログは、複製ＤＮＡ分子に組み込ま
れ得、従って組み込みは、分裂している細胞のＤＮＡで主に生じる。この組み込
みは、癌細胞のような分裂している細胞の特異的破壊を生じ得る。

【００５３】任意の遺伝子または治療的に関連しているコード配列が本発明の実施に用いら
れ得るが、特定の遺伝子またはそのフラグメントは特に適切である。例えば、免
疫原性ポリペプチド、毒素、免疫毒素およびサイトカインをコードする遺伝子は
本発明の実施において有用である。本発明において有用なサイトカイン遺伝子は
、当業者に公知のように、αインターフェロン、βインターフェロン、γインタ
ーフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２のよ
うなインターロイキン（ＩＬ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−
ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、および他のサイトカインが挙げ
られるが、これらに限定されない。さらなる遺伝子としては、当業者に公知であ
るように、細胞レセプターまたは核レセプターおよびそれらのリガンド（例えば
、ｆａｓリガンド）、凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）、成長ホルモン
、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）
、神経増殖因子（ＮＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（Ｐ
ＤＧＦ）のような増殖因子、ならびに他の増殖因子をコードする遺伝子が挙げら
れる。本発明の実施における使用のために適切な遺伝子は、酵素（例えば、ウレ
アーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテアーゼ、一酸化窒素シンターゼ、ス
ーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼおよび当該分野で公知の他の酵素）、
酵素インヒビター（例えば、α１アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、
細胞プロテアーゼインヒビターまたはウイルスプロテアーゼインヒビター、プラ
スミノゲンアクチベーターインヒビター−１、メタロプロテアーゼの組織インヒ
ビターなど）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質
、インスリン、ジストロフィン、またはクラスＩもしくはクラスＩＩの主要組織
適合性複合体（ＭＨＣ）抗原をコードし得る。対応する遺伝子の発現を調節／調
整し得るポリペプチド、細菌感染、寄生体感染もしくはウイルス感染またはその
発症を阻害し得るポリペプチド（例えば、抗原性ポリペプチド、抗原性エピトー
プ、および競合により天然のタンパク質の作用を阻害するトランスドミナントタ
ンパク質改変体）、アポトーシスのインデューサーまたはインヒビター（例えば
、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃｌＸおよび当業者に公知の他のもの）、細胞増殖抑制
性薬剤（例えば、ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂなど）、アポリポタンパク質（例えば、
ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど）、脈管形成インヒビター（例えば、
アンジオスタチン、エンドスタチンなど）、酸素ラジカルスカベンジャー、抗腫
瘍効果を有するポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、マーカー（例えば、β−
ラクタマーゼ、ルシフェラーゼなど）をコードする遺伝子、あるいは臨床的状態
の処置または予防のために有用である、当該分野で認識される、任意の他の目的
の遺伝子もまた有用である。

【００５４】例えば、遺伝性の機能不全の処置に関して、欠損遺伝子の機能的なコピー（例
えば、血友病ＡまたはＢの状況においては、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子、
ミオパシーの状況においては、ジストロフィン（またはミニジストロフィン）、
糖尿病の状況においてはインスリン、または嚢胞性線維症の状況においては、Ｃ
ＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子））をコードする遺伝子を使用
し得る。腫瘍または癌の進行を遅延または阻害するための目的の適切な遺伝子に
は、必要に応じてサイトカイン遺伝子と組み合わせた、アンチセンスＲＮＡ、リ
ボザイム、１型単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１ＴＫ）
のような細胞毒性産物、リシン、細菌毒素、ＣＤａｓｅ（シトシンデアミナーゼ
）活性およびＵＰＲＴａｓｅ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ）活
性をそれぞれ有する酵母遺伝子ＦＣＹ１および／またはＦＵＲ１の産物、抗体、
細胞分裂またはシグナル伝達を阻害するポリペプチド、腫瘍抑制遺伝子（例えば
、ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３）、宿主免疫系を活性化するポリペプチド、腫瘍関連抗
原（例えば、ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶ−１初期または後期抗原（例え
ば、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２など））をコードする遺伝子が含まれるがこれらに
限定されない。最後に、抗ＩＩＩＶ治療の状況において、免疫防御的ポリペプチ
ド、抗原性エピトープ、抗体（２Ｆ５；Ｂｕｃｈａｃｈｅｒら、１９９２、Ｖａ
ｃｃｉｎｅｓ９２：１９１−１９５）、ＣＤ４の細胞外ドメイン（ｓＣＤ４；
Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３１：８４−８６）、免
疫付着因子（すなわち、ＣＤ４−ＩｇＧハイブリッド、ＣＤ４−２Ｆ５融合物；
Ｃａｐｏｎら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５−５３１；Ｂｙｒｎら
、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ３４４：６６７−６７０）、イムノトキシン（すな
わち、アンジオゲニンと２Ｆ５またはＣＤ４−２Ｆ５との間の融合物から得られ
る；Ｋｕｒａｃｈｉら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：５４９４
−５４９９）、トランスドミナント改変体（ＥＰ０６１４９８０、ＷＯ９５／
１６７８０）、細胞毒性産物（上記を参照のこと）、またはＩＦＮαもしくはβ
をコードする遺伝子を使用し得る。

【００５５】さらに、目的の遺伝子はまた、選択マーカーのすべてまたは一部分をコードし
得、トランスフェクトされた細胞および形質導入された細胞の選択を可能にする
。このような遺伝子には、Ｇ４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（ネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼをコードする）、ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸還
元酵素）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ｐａ
ｃ（ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）、およびｇｐｔ（キサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）が含まれるが、これらに限定さ
れない。選択マーカーをコードする遺伝子は、当該分野において公知である。

【００５６】上記で言及された遺伝子およびコード領域、ならびに当業者に公知の他のもの
は、本発明の任意の局面における使用のために適切であり、これらには、とりわ
け、タンパク質産生、ワクチン接種、核酸免疫、および／または遺伝子治療が含
まれる。

【００５７】上記のリストは非限定的であり、そして目的の任意の他の遺伝子が、本発明の
状況において使用され得る。いくつかの場合において、特定の抗原に関する遺伝
子は、多数のイントロンを含み得るかまたはＲＮＡウイルス由来であり得、これ
らの場合において、遺伝子転写物またはウイルスゲノムの相補的ＤＮＡのコピー
（ｃＤＮＡ）が使用され得る。野生型生物において見出されるような完全配列よ
りも、遺伝子のヌクレオチド配列のフラグメントのみが使用され得ること（ここ
で、これらのフラグメントの使用は、防御免疫応答または特定の生物学的な効果
を産生するに十分である）もまた可能である。利用可能である場合、合成遺伝子
またはそのフラグメントもまた、使用され得る。しかし、本発明は、広範な種々
の遺伝子、フラグメントなどを用いて使用され得、そして上記に示されたものに
限定されない。

【００５８】本発明の宿主細胞において増殖された組換えＢＡＶベクターは、例えば、サブ
ユニットワクチンの供給のために抗原を発現するために使用され得る。本発明に
おいて使用される抗原は、天然かまたは組換えのいずれかの抗原性ポリペプチド
またはフラグメントであり得る。これらは、部分配列、全長配列、または融合物
（例えば、組換え宿主のための適切なリーダー配列を有するか、または別の病原
体についてのさらなる抗原配列を有する）であり得る。本発明のウイルス系によ
って発現される好ましい抗原性ポリペプチドは、抗原をコードする全長（または
全長に近い）配列を含む。あるいは、抗原性である（すなわち、１つ以上のエピ
トープをコードする）より短い配列が使用され得る。このより短い配列は、「中
和エピトープ」をコードし得、これは、インビトロアッセイにおいて、ウイルス
の感染性を中和する抗体を誘発し得るエピトープとして定義される。好ましくは
、このペプチドは、宿主において「防御免疫応答」（すなわち、感染から免疫化
された宿主を防御する、体液性（すなわち、抗体媒介）免疫応答、細胞媒介免疫
応答、および／または粘膜免疫応答）を誘発し得る「防御エピトープ」をコード
するべきである。

【００５９】（Ｆ．治療的適用）本発明の宿主細胞を使用して産生される組換えウイルスを用いて、哺乳動物に
罹患する広範な種々の疾患に対する防御を提供することが可能である。本発明の
方法に従う、任意の組換え抗原決定基または増殖した組換え生ウイルスベクター
は、抗原決定基ワクチンまたは生ワクチンベクターについて記載されるのと実質
的に同じ様式で処方および使用され得る。

【００６０】本発明の方法に従って増殖したベクターによって発現される抗原は、特に、短
いオリゴヌクレオチドからなる場合に、ワクチンキャリアと結合体化され得る。
ワクチンキャリアは、当該分野において周知である：例えば、ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびキーホールリンペットヘ
モシアニン（ＫＬＨ）。好ましいキャリアタンパク質、ロタウイルスＶＰ６は、
ＥＰＯ公開番号０２５９１４９に開示され、この開示は、本明細書中で参考とし
て援用される。

【００６１】挿入され得る、所望の抗原またはそのコード配列についての遺伝子には、哺乳
動物において疾患を引き起こす生物（特に、細菌性およびウイルス性の病原体）
の遺伝子が含まれる。ヒト病原体の抗原をコードする遺伝子はまた、本発明の実
施において有用である。代表的な哺乳動物病原体抗原には、細菌病原体（例えば
、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｓｐ．およびＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐ．および
ウイルス病原体（例えば、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パライ
ンフルエンザウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、ウイルス性下痢ウイル
ス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなど
）が含まれるがこれらに限定されない。ＢＡＣベクターはまた、サイトカイン（
例えば、インターフェロン、インターロイキン、およびコロニー刺激因子（防御
決定基をコードする配列の代わりに、またはそれに加えてのいずれかで））、お
よび治療的ポリペプチド（例えば、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（Ｃ
ＦＴＲ）および第ＩＸ凝固因子）をコードする遺伝子を含み得る。

【００６２】本発明はまた、薬学的に受容可能なビヒクルおよび／またはアジュバントと組
み合わせた、本発明の方法に従って調製された治療的有効量の組換えベクター、
組換えウイルスまたは組換えタンパク質を含む薬学的組成物を含む。このような
薬学的組成物は、当該分野において周知である技術に従って調製され得、そして
投薬量が決定され得る。本発明の薬学的組成物は、任意の公知の投与経路によっ
て投与され得、これらには、全身的（例えば、静脈内、気管内、腹腔内、鼻内、
非経口、腸内、筋肉内、皮下、腫瘍内、または頭蓋内）、またはエーロゾル適用
もしくは肺内滴注によるものが含まれるがこれらに限定されない。投与は、単回
用量で、または特定の時間間隔の後に、１回以上の反復用量で行われ得る。適切
な投与経路および投薬量は、状況（例えば、処置される個体、個体の体重、処置
される障害、または目的の遺伝子もしくはポリペプチド）に従って変化するが、
当業者によって決定され得る。

【００６３】外来性の遺伝子またはフラグメントを有する本発明のワクチンは、適切な経口
キャリア（例えば、腸溶性の投薬形態にあるキャリア）中で、経口的に投与され
得る。経口処方物には、このような通常使用される賦形剤（例えば、医薬品グレ
ードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッ
カリンナトリウム、セルロース、カルボン酸マグネシウムなど）が含まれる。経
口ワクチン組成物は、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％の活
性成分を含む、溶液、懸濁物、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、または散
剤の形態をとり得る。経口ワクチンは、全身性免疫と組み合わせて、粘膜免疫（
これは、胃腸管に感染する病原体に対する防御において重要な役割を果たす）を
誘発することが好ましくあり得る。

【００６４】さらに、ワクチンは、坐剤中に処方され得る。坐剤について、ワクチン組成物
は、伝統的な結合剤およびキャリア（例えば、ポリアルカリグリコールまたはト
リグリセリド）を含む。このような坐剤は、約０．５重量％〜約１０重量％、好
ましくは約１重量％〜約２重量％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得
る。

【００６５】本発明のワクチン組成物を哺乳動物に投与するためのプロトコルは、本開示を
考慮して、当業者の範囲内である。当業者は、抗原フラグメントに対する抗体、
細胞媒介免疫応答および／または粘膜免疫応答を誘発するのに有効な用量のワク
チン組成物の濃度を選択する。広範な限定において、この投薬量は、重要である
とは考えられていない。代表的には、ワクチン組成物は、適切な容量（１〜１０
ｍｌ）のビヒクルにおいて、約１〜１，０００μｇの間の抗原サブユニット抗原
を送達する様式において投与される。好ましくは、一回の免疫の投薬量は、約１
〜約５００μｇのサブユニット抗原、より好ましくは、約５〜１０から約１００
〜２００μｇ（例えば、５〜２００μｇ）を送達する。

【００６６】投与のタイミングもまた、重要であり得る。例えば、主に接種は、好ましくは
、引き続く追加接種（例えば、必要ならば、最初の免疫後の数週間〜数ヶ月）が
伴い得る。疾患に対する高レベルに維持された防御を保証するために、規則正し
い間隔（例えば、数年に一回）で追加免疫を再投与することが有用であり得る。
あるいは、初回用量は、経口的に投与され、次いで後ほど接種され得る（または
その逆）。好ましくは、ワクチン接種プロトコルは、慣用的ワクチン接種プロト
コル実験を通じて、確立され得る。

【００６７】ヒトにおける免疫および遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの用途を
悩ます問題は、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄ）に対する免疫学的応答の迅速な発
生（または、実際、いくつかの場合において既存の免疫）である。組換えＢＡＶ
ベクターは、ヒトにおいて免疫原性が低いようであり、そしてこの理由または他
の理由のために、ＨＡｄベクターの代わりか、またはＨＡｄベクターとの組合せ
てのいずれかで有用である。例えば、ＨＡｄベクターでの初回免疫は、ＢＡＶベ
クターを用いる追加免疫の前であり得る；あるいは、組換えＢＡＶベクターでの
初回免疫は、ＨＡｄベクターおよび／またはＢＡＶベクターでの追加免疫の前で
あり得る。

【００６８】インビトロでの組換えウイルスワクチンの投与のすべての経路についての投与
量は、患者の体格、必要とされる防御に対する感染の性質、キャリアなどを含む
種々の因子に依存して、当業者により容易に決定され得る。制限されない例によ
り、約１０³ｐｆｕ〜１０¹³ｐｆｕ、好ましくは１０³〜１０¹⁰ｐｆｕ、より好ま
しくは、１０³〜１０⁸ｐｆｕの間の投薬量が用いられ得る。インビトロでのサブ
ユニットワクチンを用いる場合、さらなる用量の投薬量が、関与する臨床的要素
により決定されるように与えられ得る。

【００６９】本発明はまた、処置の方法を包含し、この処置に従って、治療上有効な量のＢ
ＡＶベクター、組換えＢＡＶ、または本発明の宿主細胞が、処置を必要とする哺
乳動物被験体に投与される。

【００７０】（Ｇ．遺伝子治療）本発明の宿主細胞を用いて産生される、組換えアデノウイルスベクターおよび
それらのゲノムは、哺乳動物に対する遺伝子治療を提供するための方法に用いら
れて、遺伝子欠損を制御し得る。１つの実施形態において、これらの方法は、組
換えウイルスベクターゲノムが、哺乳動物ゲノムに取り込まれるか、または独立
してかつ染色体外で維持されて、特定の標的器官または組織における非欠損遺伝
子の発現を提供する条件下で、この哺乳動物に欠損遺伝子の非欠損形態をコード
する異種核酸配列を含む生組換えＢＡＶを投与する工程を包含する。これらの技
術および関連する技術をまた用いて、欠損遺伝子またはそのタンパク質を置換し
得る。遺伝子治療に用いるために取り込まれ得る、外来遺伝子、異種核酸配列、
またはそれらの一部分の非制限的な例は、「遺伝子治療およびポリペプチド」と
題された上記Ｅ節において議論されている。

【００７１】詳細には、ヒトにおける遺伝子治療に関して本発明の宿主細胞において増殖さ
れるアデノウイルスベクターの用途は、遺伝子疾患（例えば、血友病、サラセミ
ア、筋障害、筋ジストロフィー、糖尿病、気腫、ゴシェ病、嚢胞性線維症、デュ
シェーヌ筋ジストロフィー、デュシェーヌ筋障害またはベッカー筋障害など）、
癌、ウイルス疾患（例えば、ＡＩＤＳ、ヘルペスウイルス感染、サイトメガロウ
イルス感染、およびパピローマウイルス感染）、免疫不全疾患、心血管疾患など
を含むが、これらに限定されない、疾患の予防または処置を意図される。本発明
の目的のために、本発明の方法により調製される、ベクター、細胞およびウイル
ス粒子は、エキソビボ（すなわち、患者から取り出された細胞において）か、ま
たは直接的に処置されるべき体内へインビトロでのいずれかで、任意の細胞型へ
と、被験体に投与される。好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞であり、そしてよ
り好ましくは、肺細胞、気道上皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞（平滑筋、横紋筋
、および心筋を含む）、肝細胞、リンパ球細胞、造血系統の細胞、内皮細胞、あ
るいはそれらの細胞または他の細胞の悪性形質転換した子孫である。

【００７２】以下に記載されるものは、本発明の実施例である。これらの実施例は、例示の
みを目的として提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲を限定す
ることを意図しない。本開示を考慮して、特許請求の範囲内の多数の実施形態は
、当業者に明らかである。本明細書中において引用される参考文献の内容は、本
明細書中で参考として援用される。

【００７３】（実施例）（一般的方法）ＢＡＶ−３をＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞または５％胎
仔ウシ血清を補充したイーグル最小必須培地において増殖されているＶＩＤＯ
Ｒ２細胞において培養した。ウイルスＤＮＡを、Ｈｉｒｔ（１９６７）Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３６５−３６９の方法により、ウイルス感染した細胞単層
から抽出した。製造元の手引きに従って、組換えプラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼおよび他のＤＮＡ修飾酵素を用いる標準的な手順により構築した。

【００７４】（実施例１：ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞株の構築および特性）胎仔ウシ網膜細胞（ＦＢＲＣ）の初代培養物に、カルシウムリン酸共沈（ｃｏ
−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）によって１０μｇのプラスミドｐＴＧ４６７１
（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）をトランスフェクトした。このプラスミドは、ヒトアデ
ノウイルス−５（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号Ｍ７３２６０）のＥ１Ａ配列および
Ｅ１Ｂ配列（ヌクレオチド５０５−４０３４）の全体を含み、構成的マウスホス
ホグリセレートキナーゼプロモーターの制御下でＥ１Ａ転写、ならびにこの天然
プロモーターおよびβ−グロビンポリアデニル化シグナルの制御下でＥ１Ｂ転写
を伴う（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら、（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８６：２
８０−２８５；Ａｄｒａら（１９８７）Ｇｅｎｅ６０：６５−７４）。構成的
ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下で、
選択可能なマーカープロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）をコー
ドする遺伝子もまた、プラスミドＴＧ４６７１に存在する。図１を参照のこと。

【００７５】形質転換細胞をプロマイシン耐性に対する選択なしに培養した。トランスフェ
クションの４週間後に、形質転換細胞の増殖巣（ｆｏｃｉ）を観察した。形質転
換細胞は、形質転換していない細胞よりより小さくそしてより丸い。図２を参照
のこと。形質転換細胞は、ビメンチンを発現したが、サイトケラチン（ｃｙｔｏ
ｋｅｒａｔｉｏｎ）を発現しない。このことは形質転換細胞が間葉起源の細胞で
あることを示す。細胞の増殖巣を、単一の細胞のクローニングに供した。得られ
たクローンの１つをＶＩＯＤＲ２と名付けた。

【００７６】Ｅ１ｍＲＮＡの発現を、ＨＡＶ−５のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域に特異的なプ
ライマーの対を使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析に
よって試験した。Ｒ２細胞のＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲは、同じプライマー
を使用してＥ１ＤＮＡテンプレートから産生したＰＣＲ産物の大きさと一致し
た産物を生じた。逆転写酵素を、Ｒ２細胞ＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲ反応か
ら取り除いた場合、産物は観察されなかった。このことは、増幅産物がＥ１ｍ
ＲＮＡに由来し、そして残留ＤＮＡに由来しないことを示した。

【００７７】Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質の発現を、Ｅ１Ａタンパク質を検出
するためにマウスモノクローナル抗体Ｍ７３、および１９ｋＤａＨＡＶＥ１Ｂ
タンパク質を検出するために抗体３Ｄ１１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏ
ｌｌａ、ＣＡ）を使用して、タンパク質ブロットの免疫学的分析（ウエスタンブ
ロッティング）によって分析した。Ｅ１Ａ（図３）ポリペプチドおよびＥ１Ｂ（
図４）ポリペプチドの両方をＶＩＤＯ−Ｒ２細胞株によって産生し、かつ親ＦＢ
ＲＣ株においては検出しなかった。

【００７８】細胞培養における倍加時間を、Ｒ２細胞株についても決定した。培養物の視覚
的検査は、ＶＩＯＤ−Ｒ２細胞が、１：３希釈のコンフルエントな細胞をプレー
ト後、２〜３日以内で単層を形成し、一方、親ＰＦＢＲ細胞は、同じ条件下で単
層を形成するのに１０〜１５日を必要としたことを示した。テンプレートとして
ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞ゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ実験は、ＶＩＤＯ−Ｒ２に存
在するＥ１配列をこの細胞ゲノムに融合したことを示した。

【００７９】（実施例２：ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞の補完特性）ＶＩＤＯＲ２の補完特性を調べるために、この細胞にＨＡＶ−５（Ａｄ５ｄ
１Ｅ１ＡｌａｃＺ）のＥ１Ａ欠失変異体を感染させた（Ｚｈｅｎｇら（１９９４
）ＶｉｒｕｓＲｅｓ．３１：１６３−１８６）。この細胞株は、１０⁷ｐｆｕ
／ｍｌまでの欠失変異体の増殖を支持した。このＶＩＤＯＲ２細胞株が、プラ
ーク形成を支持するか否かを決定するために、直径３５ｍｍのディッシュ中で培
養した細胞に、ＢＡＶ−３またはＨＡＶ−５を感染させ、ＣＯ₂インキュベータ
ーにおいてインキュベートした。透明プラーク形成は、ＨＡＶ−５およびＨＡＶ
−３に感染後それぞれ、５日および７日目に明らかだった。ウイルス細胞変性効
果の実質的により早い開始を、ＭＤＢＫ株およびＦＢＲＣ株と対照的に、Ｅ１−
発現細胞株において観察した。さらに、Ｒ２細胞株は、組換えＢＡＶ−３による
透明プラーク形成を支持した。

【００８０】（実施例３：ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞のトランスフェクション能力）大きなＤＮＡを摂取する細胞の能力を試験するために、直径３５ｍｍのディッ
シュ中でＭＤＢＫ細胞およびＶＩＤＯＲ２細胞に、リポフェクチンを使用して
、１〜３μｇのＰａｃＩ制限化プラスミドｐＦＢＡＶ３０４（ＧＩＢＣＯ／ＢＲ
Ｌ）を感染させた。このプラスミドは、サイトメガロウイルス免疫初期プロモー
ターの制御下で、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子によって置換された
Ｅ３領域を有するＢＡＶ−３ゲノムの全体を含む。実施例７を参照のこと。感染
後２４時間で蛍光顕微鏡検査によって観察した場合、３％より多いＶＩＤＯＲ
２細胞が蛍光を示し、対照的にＭＤＢＫ培養においては、０．１％未満の細胞が
蛍光を示した。トランスフェクトされたＶＩＤＯＲ２細胞の１０〜１４日間の
さらなるインキュベートは、ＧＦＰを発現する組換えウイルス（ＢＡＶ３０４
）の産生を生じた。これらの観察は、おそらくある程度より高いトランスフェク
ション効果および／またはＨＡＶ−５Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂの配列の存在のため
、ＶＩＤＯＲ２細胞が組換えＢＡＶ−３の産生に十分適していることを示唆す
る。

【００８１】 (実施例４：ＢＡＶ３．５００の構築、Ｅ１およびＥ３における欠失を有する
複製欠損組換えＢＡＶ) Ｅ１ＡおよびＥ３領域中に欠失を有するゲノムを有するＢＡＶ３を、以下のよ
うに構築した。

【００８２】プラスミドｐＴＧ５４３５（図５）（これは、ポリ（ｐｐｏｌｙ）ＩＩｓｎ１
４プラスミドの骨格（Ｌａｔｈｅら、（１９８７）Ｇｅｎｅ５７：１９３−２
０１）中に全長ＢＡＶ−３ゲノムを含む）を、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、
そして末端のＢＡＶ−３配列を含む４．９ｋｂのフラグメントを単離し、そして
再連結して、プラスミドｐＬｔ−Ｒｔ．Ｈｉｎｄ（ｐＢＡＶ−１０１）を作製し
た。このプラスミドｐＬｔ−Ｒｔ．ＨｉｎｄをＡｃｃＩおよびＳｐｅＩを用いて
消化して、２つのフラグメントを生じた。これらをＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて処理して、平滑末端を生じた。このより大きなフラグメント（４．４ｋｂ
）を単離し、そしてＸｂａＩリンカーに連結してプラスミドｐＬＲ．Ｈｉｎｄ−
ＸｂａＩ（ｐＢＡＶ−１０２）（これは、ＸｂａＩ部位によって置換された欠失
配列を有するＥ１における欠失を含む）を作製した。このプラスミドをＨｉｎｄ
ＩＩＩを用いて消化し、脱リン酸化し、そして直線状の脱リン酸化フラグメント
をゲル精製した。このゲル精製したフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉの同時形質転
換によって組換えＢＡＶＥ３ｄのゲノムＤＮＡ（Ｅ３領域における１．２４５
ｋｂ欠失を含むＢＡＶゲノム）と組換えて、プラスミドｐＢＡＶ３．５００（ｐ
ＦＢＡＶ５００）を作製した。図６を参照のこと。

【００８３】ＰａｃＩ−消化ｐＦＢＡＶ５００ＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧＩＢＣ
Ｏ／ＢＲＬ）を使用して、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞（直径６０ｍｍのディッシュあた
り５〜１０μｇの細胞単層）にトランスフェクトさせた。３７℃でインキュベー
ション後、細胞変性効果を示した細胞を回収し、そして２サイクルの凍結−解凍
に供し、そして組換えウイルス（ＢＡＶ３．５００）を、ＶＩＤＯＲ２細胞に
おいて、プラーク精製した。

【００８４】（実施例５：ＢＡＶ３．５０１（Ｅ１Ａ領域におけるウシヘルペスウイルス１
型糖タンパク質Ｄ遺伝子の挿入物を有する複製欠損組換えＢＡＶ）の構築）Ｅ１ＡおよびＥ３領域中に欠失を含むＢＡＶ３ゲノム（欠失Ｅ１Ａ配列の代わ
りにＢＨＶ−１ｇＤの挿入物を有する）を以下のように構築した。図７を参照
のこと。

【００８５】プラスミドｐＢＡＶ−１０２（実施例４を参照のこと）を、ＸｂａＩを用いて
消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理し、脱リン酸化し、そしてゲル精
製した。平滑末端の１．８ｋｂフラグメント（ウシヘルペスウイルス１型（ＢＨ
Ｖ−１）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）遺伝子を含み、１３７−ヌクレオチドキメライ
ントロンを含み、そしてＳＶ４０初期プロモーター上流、かつＳＶ４０後期ポリ
アデニル化部位の下流に隣接する）を、ゲル精製したＸｂａＩフラグメントに連
結して、プラスミドを作製した。ｐＬＲ．Ｈｂ．ｇＤ（ｐＢＡＶ−１０２ｇＤ）
は、ＢＨＶ−１ｇＤ遺伝子によって置換された欠失配列を有するＥ１Ａにおけ
る欠失を含む。このプラスミドを、組換えＢＡＶＥ３ｄのゲノムＤＮＡ（Ｅ３
領域における１．２４５ｋｂの欠失を含むＢＡＶゲノム）を用いて、Ｅ．ｃｏｌ
ｉＢＪ５１８３の同時−トランスフェクションによって組換えて、プラスミド
ｐＢＡＶ３．５０１（ｐＦＢＡＶ５０１）を作製した。

【００８６】ＰａｃＩ−消化ｐＦＢＡＶ５０１ＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧＩＢ
ＣＯ／ＢＲＬ）を使用してＶＩＤＯ−Ｒ２細胞（直径６０ｍｍのディッシュあた
り５〜１０μｇの細胞単層）にトランスフェクトした。３７℃でインキュベーシ
ョン後、細胞変性効果を示す細胞を回収し、そして２サイクルの凍結−解凍に供
し、そして組換えウイルス（ＢＡＶ３．５０１）をＶＩＤＯＲ２細胞において
プラーク精製した。

【００８７】ｇＤインサートの存在は、ＣｌａＩ消化によって確認された。このことは、Ｂ
ＡＶ３．５００に特有の２．５ｋｂのフラグメントの喪失、および４．４ｋｂの
フラグメントによるその置換を示した。ｇＤプローブを用いたサザンブロット分
析は、ｇＤ配列が４．４ｋｂフラグメント中に存在することを確認した。

【００８８】（実施例６：Ｅ３領域にウシコロナウイルスＨＥ遺伝子の挿入を有する複製欠
損組換えＢＡＶであるＢＡＶ３．５０２の構築）Ｅ３と同じ転写方向でＥ３領域にウシコロナウイルス（ＢＣＶ）赤血球凝集素
エステラーゼ（ＨＥ）遺伝子の挿入を含む、組換えＢＡＶゲノムを、以下の通り
に構築した。図８を参照のこと。

【００８９】ＢＣＶＨＥ遺伝子インサートは、１３７ヌクレオチドのキメライントロンを
含んでおり、そしてＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部
位と隣接していた。この組換えゲノムを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３にＨｉｎ
ｄＩＩＩ消化ｐＢＡＶ−１０２と共に導入した。これらの２つのＤＮＡ分子間の
インビボでの組換えは、ｐＦＢＡＶ５０２を産生した。

【００９０】ＰａｃＩ消化ｐＦＢＡＶ５０２ＤＮＡを、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞（１枚の、細胞
単層の６０ｍｍ直径のディッシュあたり５〜１０μｇ）中にＬｉｐｏｆｅｃｔｉ
ｎ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。３７℃でのインキュ
ベーション後、細胞生涯効果を示す細胞を収集し、そして２サイクルの凍結融解
に供し、そして組換えウイルス（ＢＡＶ３．５０２）を、ＶＩＤＯＲ２細胞で
プラーク精製した。

【００９１】ＨＥインサートの存在は、ＣｌａＩ消化によって確認された。このことは、Ｂ
ＡＶ３．５００に特有の１２．２ｋｂのフラグメントの喪失、および１４．１ｋ
ｂのフラグメントによるその置換を示した。ＨＥプローブを用いたサザンブロッ
ト分析は、ＨＥ配列が１４．１ｋｂフラグメント中に存在することを確認した。

【００９２】（実施例７：Ｅ３領域にグリーン蛍光タンパク質遺伝子の挿入を有する組換え
ＢＡＶであるＢＡＶ３．３０４の構築）サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニ
ル化シグナルの制御下のグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、ＢｇｌＩ
ＩおよびＤｒａＩＩＩ消化、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼでの処理によって
平滑末端を生成することにより、プラスミドｐＱＢＩ２５（ＱｕａｎｔｕｍＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手した。次いで、このフラグメントを、
Ｅ３と同じ転写配向のＧＦＰ遺伝子とともに、ｐＢＡＶ−３０１のＳｒｆＩ部位
に挿入して、ｐＢＡＶ−３０１．ｇｆｐを生成した。

【００９３】ｐＢＡＶ−３０１を、ｐＦＢＡＶ３０２の７，６３５塩基対のＫｐｎＩ−Ｓｓ
ｐＩフラグメントをＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ消化ＰポリＩＩｓｎ１４に対して連結す
ることにより構築した。ｐＦＢＡＶ３０２は、欠失したＥ３配列がＳｒｆＩ部位
によって置換されている、Ｅ３欠失を有するＢＡＶゲノムである。

【００９４】改変されたＥ３領域を含むｐＢＡＶ３０１．ｇｆｐのＫｐｎＩ／ＳｍａＩフラ
グメントを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＪ５１８３に、ＳｆｒＩ消化ｐＦＢＡＶ．３０
２と一緒に導入した。これらの２つのＤＮＡ分子間でのインビボでの組換えは、
欠失したＥ３領域にＧＦＰ遺伝子を含むＢＡＶゲノムである、ｐＦＢＡＶ．３０
４を生成した。図９を参照のこと。

【００９５】ＰａｃＩ消化ｐＦＢＡＶ．３０４ＤＮＡを、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞（１枚の、
細胞単層の６０ｍｍ直径のディッシュあたり５〜１０μｇ）中にＬｉｐｏｆｅｃ
ｔｉｎ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトした。３７℃でのイン
キュベーション後、細胞変性効果を示す細胞を収集し、そして２サイクルの凍結
融解に供し、そして組換えウイルス（ＢＡＶ３．３０４）を、ＶＩＤＯＲ２細
胞でプラーク精製した。

【００９６】ｐＦＢＡＶ．３０４ウイルスＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化、続いてアガロースゲ
ル電気泳動によって分析した。ｐＦＢＡＶ．３０４のＢａｍＨＩ消化は、親のＢ
ＡＶ．Ｅ３ｄゲノム中には存在しない２．３ｋｂフラグメントを生成した。ＧＦ
Ｐプローブを用いたサザンブロット分析は、ＧＦＰ配列が２．３ｋｂのＢａｍＨ
Ｉフラグメント中に存在することを確認した。

【００９７】（実施例８：Ｅ１変異ウイルスでの非補完性細胞株の不完全感染）ＦＢＲＣおよびＲ２細胞を、野生型または組換えのＢＡＶに１未満のＭＯＩで
感染させ、１週間培養し、２回の凍結融解サイクルに供し、そしてＶＩＤＯＲ
２細胞で力価測定した。野生型ＢＡＶ−３、Ｅ３欠失（ＢＡＶ−３．Ｅ３ｄ）お
よびＢＡＶ３．３０４は、試験した全ての細胞株において高力価まで（１０⁹ｐ
ｆｕ／ｍｌまで）増殖し、一方、Ｅ１およびＥ３に欠失を含む複製欠損組換えウ
イルス（ＢＡＶ３．５００、ＢＡＶ３．５０１およびＢＡＶ３．５０２）は、Ｖ
ＩＤＯＲ２細胞においてのみ増殖し、約１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの力価を生成した
。図１０を参照のこと。

【００９８】（実施例９：組換えウイルスからのｇＤ発現の反応速度）ＢＡＶ３．５０１（実施例５）によるｇＤ発現の反応速度を、免疫沈降によっ
て、ＶＩＤＯＲ２細胞またはＭＤＢＫ細胞の感染後の３つの時点で決定した（
図１１）。免疫沈降分析のために、６ウェルディッシュ中のＶＩＤＯＲ２細胞
のコンフルエントな単層を、５を超えるＭＯＩにてウイルスで感染させた。細胞
を、５０μＣｉの［³⁵Ｓ］メチオニン（Ｔｒａｎ³⁵Ｓ標識、リン酸緩衝化生理食
塩水、１，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＩＣＮＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉ
ｎｃ．Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いた４時間の標識の前にメチオニンおよびシス
テインを欠く最少必須培地中で２時間プレインキュベートした。細胞を、リン酸
緩衝化生理食塩水で洗浄し、掻き取ることにより収集し、次いで氷冷改変放射免
疫沈降アッセイ緩衝液を用いて溶解させた。放射性標識したタンパク質を、抗Ｂ
ＨＶ−１ｇＤモノクローナル抗体のプール（Ｈｕｇｈｅｓら（１９８８）Ａｒ
ｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１０３：４７−６０）を用いて免疫沈降させ、そしてＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。泳動後、ゲルを乾燥させ
、そして標識されたタンパク質のバンドを、オートラジオグラフィーによって可
視化した。

【００９９】ＢＡＶ３．５０１感染ＶＩＤＯＲ２細胞の溶解産物由来の代謝標識された免
疫沈降物の電気泳動分析は、それぞれ、非グリコシル化形態のｇＤおよびグリコ
シル化形態のｇＤに対応する、約６３ｋＤａおよび７１ｋＤａの分子量を有する
免疫反応性タンパク質を示した（図１１Ａ、レーン５および６）。これらの分子
量は、ＢＨＶ−１感染細胞抽出物から免疫沈降された確実なｇＤの分子量に対応
する（図１１Ａ、レーン３）。対応する分子量のタンパク質は、偽感染細胞にお
いても（図１１Ａ、レーン１）、ＢＡＶ−３感染細胞においても（図１１Ａ、レ
ーン２）検出されなかった。

【０１００】ＢＡＶ３．５０１感染細胞では、ｇＤの発現は、感染の２４時間後に初めて検
出され（図１１Ａ、レーン５）、そしてｇＤの発現は、本研究で用いられた最後
の時点である、感染後３６時間まで産生され続けた（図１１Ａ、レーン６）。Ｂ
ＡＶ３．５０１からのｇＤ発現の反応速度は、ＭＤＢＫ細胞において類似した（
図１１Ｂ、レーン５および６）。

【０１０１】（実施例１０：組換えウイルスからのＨＥ発現の反応速度）ＢＡＶ３．５０２（実施例６）によるＨＥ発現の反応速度を、ＶＩＤＯＲ２
細胞において決定した（図１２）。免疫沈降分析を、ウサギポリクローナル抗Ｂ
ＣＶ抗体を免疫沈降のために用いたことを除いて、実施例１０に記載の通りに行
った。Ｄｅｒｅｇｔら（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６１：４１０−４２０
およびＤｅｒｅｇｔら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０：９９３−９
９８。

【０１０２】抗ＢＣＶポリクローナルウサギ血清は、ＢＡＶ３．５０２で感染させたＲ２細
胞由来の６５ｋＤａのポリペプチドを免疫沈降させた（レーン５および６）。こ
のポリペプチドは、ＢＣＶ感染細胞によって産生された確実なＨＥタンパク質と
同時に移動し（レーン３）、そして対応するタンパク質は、偽感染細胞（レーン
１）からも野生型ＢＡＶ−３感染細胞（レーン２）からも免疫沈降しなかった。
ＨＥ発現の反応速度（レーン５および６）は、ＢＡＶ３．５０１感染細胞におけ
るｇＤについて観察された反応速度と類似していた。

【０１０３】（実施例１１：組換えｇＤおよびＨＥタンパク質のグリコシル化）組換えｇＤおよびＨＥタンパク質のグリコシル化を、［³Ｈ］グルコサミンに
感染させた細胞の標識、続いて免疫沈降によって試験した。これらの研究の結果
は、組換えウシアデノウイルスにより産生されるタンパク質が、グリコシル化さ
れており、そしてウイルス感染した細胞において合成された真正（ａｕｔｈｅｎ
ｔｉｃ）タンパク質と、移動速度（ゲルにおける）において識別不可能であるこ
とを確証した。

【０１０４】（実施例１２：ＢＡＶ３．３０４感染細胞におけるＧＦＰの発現）ＢＡＶ３．３０４に感染させた細胞の溶解産物を、ＧＦＰ特異的ポリクローナ
ル抗体（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を使用するタンパク質
ブロッティングによって試験した。実施例１３を参照のこと。細胞抽出物（１レ
ーンあたり５μｇ）を、１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで分離し、そし
てこのゲルをニトロセルロースメンブレンにブロットした。メンブレン上の非特
異的結合部位を、１％ウシ血清アルブミンでブロックし、そしてこのブロットを
抗ＧＦＰポリクローナル抗体と共にインキュベートした。抗体結合後、このブロ
ットを洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホ
スファターゼ（ＡＰ）に結合体化した抗マウスＩｇＧまたは抗ラットＩｇＧに曝
露し、そしてＨＲＰまたはＡＰ現像キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ
、ＣＡ）を用いて現像した。

【０１０５】抗ＧＦＰ血清は、ＢＡＶ３．３０４感染した細胞（レーン１〜３）において２
８ｋＤａのタンパク質を同定した。このタンパク質は、偽感染した細胞（レーン
４）にも野生型ＢＡＶ感染した細胞（レーン５）にも存在しなかった。組換えＧ
ＦＰは、感染後、１２時間と３６時間との間（レーン１〜３）で検出された。

【０１０６】（生物学的材料の寄託）以下の材料が、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤに寄託され、そして維持されている
。

【０１０７】（組換え細胞株）ＨＡｄ−５Ｅ１配列で形質転換した初代胎仔ウシ網膜細胞：材料受託番号寄託日ＶＩＤＯＲ２ＡＴＣＣＰＴＡ−１５６１９９９年６月１日。

【０１０８】上述の本発明は、理解の明確化の目的のために、例示および実施例によって幾
分詳細に記載されているが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変化お
よび改変が実施され得ることは当業者に明らかである。従って、前述の記載およ
び実施例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドＴＧ４６７１のマップを示す。ヒトアデノウイルス５型Ｅ
１領域由来の配列を、太い黒線により示す。

【図２】図２は、細胞形態を示す顕微鏡写真を含む。図２Ａは、胎仔ウシ網膜細胞（Ｆ
ＢＲＣ）を示す。図２Ｂは、ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞（ｐＴＧ４６７１により形質転
換されたＦＢＲＣ）を示す。

【図３】図３は、タンパク質イムノブロット分析による、ＦＢＲＣ細胞およびＶＩＤＯ
−Ｒ２細胞中のＥ１Ａ発現の分析を示す。ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａおよび
Ｅ１Ｂを発現するヒト２９３細胞が、ポジティブコントロールとして使用される
。レーン１：分子量マーカー；レーン２：２９３細胞；レーン３：ＦＢＲＣ；レ
ーン４：ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞。

【図４】図４は、タンパク質イムノブロット分析による、ＦＢＲＣ細胞およびＶＩＤＯ
−Ｒ２細胞中のＥ１Ｂ発現の分析を示す。ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａおよび
Ｅ１Ｂを発現するヒト２９３細胞が、ポジティブコントロールとして使用される
。レーン１：分子量マーカー；レーン２：２９３細胞；レーン３：ＦＢＲＣ；レ
ーン４：ＶＩＤＯ−Ｒ２細胞。

【図５】図５は、ＢＡＶゲノムを含む、プラスミドＴＧ５４３５のマップを示す。ＢＡ
Ｖ遺伝子を、円の内側の太い矢印により示す。

【図６】図６は、ＢＡＶ３．５００の構築を示す模式図である。実施例４を参照のこと
。

【図７】図７は、ＢＡＶ３．５０１の構築を示す模式図である。実施例５を参照のこと
。

【図８】図８は、ＢＡＶ３．５０２の構築を示す模式図である。実施例６を参照のこと
。

【図９】図９は、ＢＡＶ３．３０４の構築を示す模式図である。実施例７を参照のこと
。

【図１０】図１０は、ＦＢＲＣおよびＶＩＤＯＲ２細胞の感染後の、野生型ＢＡＶおよ
び組換えＢＡＶの力価を示す。実施例８を参照のこと。

【図１１】図１１は、ＢＡＶ３．５０１感染細胞におけるＢＨＶｇＤの発現を示す。実
施例９を参照のこと。細胞溶解物由来の³⁵Ｓ標識タンパク質を、抗ｇＤモノクロ
ーナル抗体を用いて免疫沈降し、そして１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲル
上で還元条件下で分離した。図１１Ａは、ＶＩＤＯＲ２細胞における結果を示
す；図１１Ｂは、ＭＤＢＫ細胞における結果を示す。レーン１：モック感染した
；レーン２：ＢＡＶ３感染した；レーン３：ＢＨＶ−１感染した；レーン４〜６
：ＢＡＶ３．５０１感染し、そして感染の１２時間後（レーン４）、２４時間後
（レーン５）および３６時間（レーン６）に収集した。分子量マーカー（ｋＤａ
）を、図の左側に示す。

【図１２】図１２は、ＢＡＶ３．５０２感染ＶＩＤＯＲ２細胞におけるＢＣＶＨＥの
発現を示す。実施例１０を参照のこと。細胞溶解物由来の³⁵Ｓ標識タンパク質を
、ポリクローナル抗ＢＣＶ血清を用いて免疫沈降し、そして１０％ポリアクリル
アミド−ＳＤＳゲル上で還元条件下で分離した。レーン１：モック感染した；レ
ーン２：ＢＡＶ３感染した；レーン３：ＢＣＶ感染した；レーン４〜６：ＢＡＶ
３．５０２感染し、そして感染の１２時間後（レーン４）、２４時間後（レーン
５）および３６時間（レーン６）に収集した。分子量マーカー（ｋＤａ）を、図
の左側に示す。ゲルの２つの異なるオートラジオグラフ暴露を示す。

【図１３】図１３は、ＢＡＶ３．３０４感染ＭＤＢＫ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。
感染細胞溶解物をゲル電気泳動により分離し、そしてこのゲルをブロットし、そ
して抗ＧＦＰ血清を用いて探索した。レーン１〜３：感染１２時間後（レーン１
）、２４時間後（レーン２）および３６時間後（レーン３）に収集した、ＢＡＶ
３．３０４感染細胞；レーン４：モック感染した；レーン５：野生型ＢＡＶ−３
感染した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 31/12 19/00 35/00 31/12 Ａ６１Ｋ 35/76 35/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者レッディー，ポリスセシッドハーアメリカ合衆国メリーランド 20878，ガイサーズバーグ，クロッパーロード 722，アパートメント１Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA32 CA04 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AA95Y AC14 BA02 CA44 CA45 4C084 AA02 AA03 AA13 BA03 CA53 NA14 ZA532 ZA592 ZA942 ZB012 ZB262 ZB332 ZC352 ZC552 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA14 ZA36 ZA53 ZA59 ZA94 ZB01 ZB26 ZB33 ZC35 ZC55

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノウイルスの複製のために必須のアデノウイルス機能を
発現する組換え細胞であって、ここで該細胞は、該細胞により提供される前記必
須機能に対応する遺伝子領域において変異を有する複製欠損組換えウシアデノウ
イルスベクターの複製を許容し、そして該細胞における複製のために必須の該機
能が、該アデノウイルスベクターとは異なる種の機能である、細胞。
【請求項２】前記細胞が、前記アデノウイルスの複製のために必須のヒト
アデノウイルス機能を発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】前記アデノウイルスの複製のために必須の前記機能が、Ｅ１
機能である、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】ヒトアデノウイルスＥ１配列を含む、請求項１に記載の細胞
。
【請求項５】前記細胞がウシ起源の細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】前記細胞が、ウシ腎臓細胞もしくはウシ網膜細胞、またはそ
れらの子孫である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】前記細胞を、該細胞により提供される前記必須機能に対応す
る遺伝子領域において変異を有する複製欠損組換えウシアデノウイルスベクター
で感染させる、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】前記細胞がウシ起源の細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】前記組換えウシアデノウイルスベクターが、Ｅ１領域で変異
している、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】前記変異が、前記Ｅ１領域の一部分またはすべての欠失で
ある、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】前記組換えウシアデノウイルスベクターが、Ｅ３領域で変
異している、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】前記組換えウシアデノウイルスベクターが、異種配列を含
む、請求項７に記載の細胞。
【請求項１３】前記異種配列が、前記アデノウイルスベクターにおいて欠
失したＥ１領域の部位に挿入されている、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】前記異種配列が、哺乳動物病原体の決定基をコードする、
請求項１２に記載の細胞。
【請求項１５】前記病原体が、細菌性またはウイルス性である、請求項１
４に記載の細胞。
【請求項１６】前記細菌性病原体が、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｓｐ．ま
たはＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓｓｐ．を含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】前記ウイルス性病原体が、ヘルペスウイルス、インフルエ
ンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、
ウイルス性下痢ウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス
、またはレンチウイルスを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】前記異種配列が、治療的ポリペプチドをコードする、請求
項１２に記載の細胞。
【請求項１９】複製欠損組換えウシアデノウイルスを増殖させるための方
法であって、ここで該方法は、複製能のある組換えウシアデノウイルスを産生せ
ず、複製のために必須のアデノウイルス機能を発現する組換え細胞において、ウ
イルス複製のために必須の機能に対応する遺伝子領域において変異を含む複製欠
損ウシアデノウイルスベクターを増殖させる工程を包含し、ここで該細胞により
発現される、複製のために必須の該機能は該ウシアデノウイルスベクターとは異
なる種であり、そしてここで該細胞は、該複製欠損ウシアデノウイルスベクター
の増殖を許容する、方法。
【請求項２０】前記細胞がウシ起源の細胞である、請求項１９に記載の方
法。
【請求項２１】前記細胞がヒトＥ１機能を発現する、請求項１９に記載の
方法。
【請求項２２】前記細胞が、ウシ腎臓細胞もしくはウシ網膜細胞、または
それらの子孫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】前記ウシアデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の一
部分またはすべての欠失を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】前記アデノウイルスベクターが異種配列を含む、請求項１
９に記載の方法。
【請求項２５】前記異種配列が、哺乳動物病原体の決定基をコードする、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】請求項１９に記載の方法によって得られる、組換えウシア
デノウイルスゲノム。
【請求項２７】請求項２６に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む、
免疫原性組成物。
【請求項２８】ウシ宿主において免疫応答を誘発する方法であって、請求
項２７に記載の免疫原性組成物を、必要とするウシ宿主に投与する工程を包含す
る、方法。