BRPI1011072B1

BRPI1011072B1 - Composto de gla, composições de vacina e farmacêutica compreendendo dito composto, bem como uso dos mesmos para estimular, induzir ou acentuar uma resposta imune em um indivíduo

Info

Publication number: BRPI1011072B1
Application number: BRPI1011072-0A
Authority: BR
Inventors: Steven G. Reed; Darrick Carter
Original assignee: Infectious Disease Research Institute
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2021-09-28
Also published as: EP2437753A1; JP6251431B2; US8722064B2; US20180028649A1; CN102481312A; ES2606563T3; IL216669A; TWI549688B; US20100310602A1; HUE031051T2; AU2010256461A1; PT2437753T; JP2016028042A; CY1118347T1; CA2764374A1; US20140322268A1; RU2015129468A; CN105131051B; EP2437753B1; BRPI1011072A2

Abstract

composto de gla, composição de vacina, uso do composto, composição farmacêutica e uso da composição farmacêutica compostos, particularmente, compostos de adjuvante glicopiranosil lipídico (gla), que têm a seguinte estrutura (i), são fornecidos: (i) ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em que l1, l2, l3, l4, l5, l6, l7, l8, l9, l10, y1, y2, y3, y4, r1, r2, r3, r4, r5, r6, são definidos neste relatório. composições farmacêuticas, composições de vacina e métodos relacionados para induzir ou acentuar respostas imunes também são fornecidos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[001]Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente Provisório U.S. No 61/184.703, depositado em 5 de Junho de 2009. Tal pedido provisório é integralmente incorporado neste relatório como referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[002]A presente invenção refere-se ao campo de composições farmacêuticas e vacinas. Mais especificamente, as modalidades descritas neste relatório se referem a composições farmacêuticas e vacinas, assim como métodos profiláticos e terapêuticos relacionados, em que as composições compreendem um adjuvante glicopiranosil lipídico (GLA), conforme descrito neste relatório.

Descrição da Técnica Relacionada

[003]O sistema imune de organismos superiores foi caracterizado através da diferenciação entre agentes estranhos (ou “não próprios”) e componentes familiares ou “próprios”, tal que os agentes estranhos induzem respostas imunes, enquanto os componentes “próprios” são ignorados ou tolerados. As respostas imunes foram tradicionalmente caracterizadas como respostas humorais, em que os anticorpos específicos para os antígenos são produzidos através de linfócitos B diferenciados conhecidos como células plasmáticas, ou respostas mediadas por células, em que vários tipos de linfócitos T atuam para eliminar antígenos através de vários mecanismos. Por exemplo, células T auxiliares CD4+, que são capazes de reconhecer antígenos específicos, podem responder pela liberação de mediadores solúveis, tais como citocinas, para recrutar células adicionais do sistema imune para participarem em uma resposta imune. Além disso, as células T citotóxicas CD8+, que também são capazes de reconhecimento ao antígeno específico, podem responder pela ligação a, e destruição ou danificação de uma célula ou partícula transportadora de antígeno. É conhecido nas técnicas imunológicas o fornecimento de certas vacinas, de acordo com uma variedade de formulações, usualmente, para o propósito de induzir uma resposta imune desejada em um hospedeiro.

[004]Várias estratégias para induzir respostas imunes específicas através da administração de uma vacina a um hospedeiro incluem imunização com patógenos infecciosos mortos por calor ou vivos atenuados, tais como vírus, bactérias ou certos patógenos eucarióticos; imunização com um agente infeccioso não virulento capaz de direcionar a expressão do material genético que codifica o(s) antígeno(s) ao(s) qual(is) uma resposta imune é desejada; e imunização com vacinas de subunidade que contêm imunógenos isolados (tais como proteínas) a partir de um patógeno particular, de modo a induzir imunidade contra o patógeno. (Veja, por exemplo, Liu, 1998 Nature Medicine 4(5 supl.): 515.) Para certos antígenos, pode existir um ou mais tipos de imunidade desejável para os quais nenhuma destas abordagens tenha sido particularmente eficaz, incluindo o desenvolvimento de vacinas que são eficazes na proteção imunológica de um hospedeiro contra o vírus da imunodeficiência humana ou outros patógenos infecciosos, câncer, doença autoimune ou outras condições clínicas.

[005]Foi mostrado que o lipopolissacarídeo enterobacteriano (LPS) é um estimulador potente do sistema imune, embora seu uso em adjuvantes tenha sido reduzido devido aos seus efeitos tóxicos. Um derivado não tóxico de LPS, monofosforil lipídio A (MPL), produzido pela remoção do grupo carboidrato do núcleo e do fosfato a partir da extremidade redutora de glicosamina, foi descrito por Ribi et al., (1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, páginas 407-419).

[006]Uma outra versão desentoxicada de MPL resulta da remoção da cadeia acila da posição 3 da cadeia principal do dissacarídeo, e é chamada monofosforil lipídio A 3-O-desacilado (3D-MPL). Ele pode ser purificado e preparado pelos métodos descritos em GB 2122204B, o qual também divulga a preparação de difosforil lipídio A, e variantes 3-O-desaciladas do mesmo. Por exemplo, 3D-MPL foi preparado na forma de uma emulsão que tem um pequeno tamanho de partícula, menor do que 0,2 μm em diâmetro, e seu método de preparação é divulgado no WO 94/21292. As formulações aquosas que compreendem monofosforil lipídio A e um tensoativo foram descritas no WO 9843670A2.

[007]Adjuvantes derivados de lipopolissacarídeos bacterianos a serem formulados em combinações de adjuvantes podem ser purificados e processados a partir de fontes bacterianas ou, alternativamente, podem ser sintéticos. Por exemplo, monofosforil lipídio A purificado é descrito em Ribi et al., 1986 (supra), e monofosforil ou difosforil lipídio A 3-O-desacilado derivado de Salmonella sp. é descrito em GB 2220211 e Patente U.S. No 4.912.094. 3D-MPL e os β(1-6) glicosamina dissacarídeos, assim como outros lipopolissacarídeos purificados e sintéticos, foram descritos (WO 98/01139; Patente U.S. No 6.005.099 e EP 0 729 473 B1, Hilgers et al., 1986 Int. Arch. Allergy Immunol., 79(4): 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1); 141-6; e EP 0 549 074 B1). As combinações de adjuvantes 3D-MPL e saponina derivados da casca de árvore de Quillaja Saponaria molina foram descritas em EP 0 761 231B. O WO 95/17210 divulga um sistema de emulsão adjuvante com base em esqualeno, α-tocoferol e mono-oleato de polioxietileno sorbitano (TWEEN™-80), formulado com a QS21 imunoestimulante, e, opcionalmente, incluindo 3D-MPL. Apesar da acessibilidade de tais combinações, o uso de adjuvantes derivados de produtos naturais está associado a altos custos de produção, incompatibilidade entre lotes, dificuldades associadas à produção em larga escala e incerteza com respeito à presença de impurezas na composição de qualquer preparação fornecida.

[008]Consequentemente, há uma necessidade quanto a vacinas aperfeiçoadas e, em particular, quanto a vacinas que, vantajosamente, contêm componentes de adjuvante de alta pureza, quimicamente definidos, que exibam consistência entre lotes e possam ser eficazmente fabricados em uma escala industrial, sem introduzir contaminantes indesejados ou estruturalmente indefinidos. A presente invenção fornece composições e métodos para tais vacinas e oferece outras vantagens relacionadas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009]A presente invenção, em seus vários aspectos, é dirigida aos compostos, composições e métodos que, vantajosamente, utilizam certos adjuvantes glicopiranosil lipídicos sintéticos (GLA) como imunomoduladores ou adjuvantes. Portanto, de acordo com um aspecto da invenção descrita neste relatório, são fornecidos compostos de GLA que têm uma estrutura, de acordo com a seguinte fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em que L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, Y1,Y2, Y3, Y4, R1, R2, R3 , R4, R5, R6 são definidos neste relatório.

[010]Os compostos de GLA da presente invenção têm utilidade sobre uma ampla faixa de aplicações terapêuticas, onde a indução de respostas imunes específicas ou não específicas é desejada. Por exemplo, em certos aspectos da invenção, são fornecidas composições de vacina compreendendo um ou mais compostos de GLA apresentados neste relatório em combinação com um antígeno. Tais composições de vacina podem ser vantajosamente usadas em métodos para estimular respostas imunes específicas do antígeno em pacientes em necessidade das mesmas. Em outros aspectos da invenção, são fornecidas composições farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos de GLA apresentados neste relatório, em que as composições são substancialmente desprovidas de antígeno. Tais composições farmacêuticas podem ser vantajosamente usadas em métodos para estimular respostas imunes não específicas em pacientes em necessidade das mesmas, por exemplo, no tratamento de infecção, rinite sazonal e semelhantes.

[011]Estes e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão evidentes sob referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos. Além disso, várias referências são apresentadas neste relatório, as quais descrevem em mais detalhes certos aspectos desta invenção e são, portanto, integralmente incorporadas como referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[012]A Figura 1 demonstra a produção de citocina IFN-Y induzida in vivo após a vacinação de camundongos com composições da invenção que compreendem antígeno e GLA.

[013]As Figuras 2A a 2F mostram respostas do anticorpo induzidas in vivo após a vacinação de camundongos com composições da invenção que compreendem antígeno e GLA.

[014]A Figura 3 mostra o aumento de NF-kB observado em concentrações diferentes de um composto de GLA ilustrativo da invenção (Composto IX).

[015]As Figuras 4A a 4D mostram a indução de citocinas imunoestimulantes (MIP-1b e TNF-α) em concentrações diferentes de um composto de GLA ilustrativo da invenção (Composto IX).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[016]Monofosforil lipídio A (MPL) e outros adjuvantes relacionados são conhecidos para mediar seus efeitos, pelo menos em parte, através da ação como agonistas de receptores do tipo Toll (TLR). Os compostos de adjuvante glicopiranosil lipídico (GLA) da presente invenção foram racionalmente projetados com base nas considerações da estrutura 3D em relação ao estímulo do receptor TLR. Mais especificamente, de acordo com a presente invenção, através da definição seletiva dos comprimentos da cadeia acila dos compostos de GLA da invenção, tal que eles obtenham um fundo “plano” na estrutura tridimensional dos compostos, um ajuste aperfeiçoado pode ser obtido dentro do sítio de ligação de um receptor TLR, desse modo, resultando no estímulo acentuado de TLR e propriedades imunoestimulantes acentuadas. Além disso, a solubilidade dos compostos de GLA da invenção (por exemplo, em soluções aquosas) é vantajosamente aperfeiçoada, devido aos comprimentos da cadeia acila encurtados, desse modo, facilitando a formulação eficaz do composto. Além disso, pelo fato de que os comprimentos da cadeia acila são adaptados para tornar a molécula tridimensionalmente “plana” ao longo do fundo da molécula, os compostos podem ser mais eficazmente incorporados dentro de vesículas, por exemplo, para formulações lipossômicas.

[017]Além disso, os compostos da invenção fornecem perfis vantajosos de potência em relação à toxicidade. Por exemplo, os compostos da invenção podem ser usados em uma faixa ampla e relativamente alta de dosagens para obter um nível desejado de atividade (por exemplo, atividade de adjuvante) e não tóxicas a células humanas e a pacientes humanos, conforme avaliado, por exemplo, pelos níveis de fator de necrose tumoral produzidos a partir das células humanas em uma faixa de concentrações, que rapidamente se elevam e nivelam, ao contrário de outros agonistas de TLR4 mais tóxicos, tais como lipopolissacarídeos. Este ensaio com base celular deve ser preditivo de marcadores inflamatórios menores semelhantes à proteína C reativa envolvidos em eventos adversos na farmacologia humana. A potência favorável versus perfil de toxicidade para os compostos da invenção pode ser particularmente importante, por exemplo, quando administrados a crianças, cujas tolerâncias às citocinas podem ser menores, ou quando os compostos são usados em formulações alvejadas em uma grande população onde respostas mais niveladas se traduzirão em resultados clínicos mais compatíveis para pessoas com uma responsividade variada ao agonismo de TLR. Similarmente, a aprovação regulatória será simplificada, visto que a dosagem alvo será mais complacente e a fabricação simplificada quando a faixa de ingrediente farmacêutico ativo não precisa ser controlada de forma tão rigorosa quanto a um nível de tolerância.

[018]Portanto, a presente invenção, em suas diversas modalidades, fornece compostos, composições de vacina, composições de adjuvante, composições farmacêuticas e formulações e métodos relacionados que incluem compostos de GLA sintéticos, conforme descrito neste relatório. Os compostos de GLA representam imunomoduladores sintéticos que, vantajosamente, em relação a adjuvantes da técnica anterior, e, em particular, em relação aos adjuvantes de produto natural, podem ser preparados na forma substancialmente homogênea. Além disso, os compostos de GLA da invenção podem ser eficazes e economicamente preparados através de fabricação sintética e química de larga escala, diferente de adjuvantes derivados de produtos naturais. Pelo fato de que um adjuvante sintético que é quimicamente sintetizado a partir de materiais de partida definidos para obter um produto quimicamente definido exibe consistência entre lotes qualitativa e quantitativa, os compostos de GLA da invenção oferecem benefícios, incluindo controle de qualidade do produto aperfeiçoado.

[019]Conforme descrito neste relatório, compostos de GLA, composições e métodos para seu uso incluem, em algumas modalidades, o uso de GLA por si só com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável para atividade imunológica de adjuvante (por exemplo, atividade imunoestimulante não específica), incluindo “adjuvantar”, em que a administração de GLA a um paciente pode ser totalmente independente de, e/ou temporária e/ou espacialmente separada da administração ao paciente de um ou mais antígenos contra os quais a indução ou aumento de uma resposta imune (por exemplo, uma resposta específica do antígeno) no paciente é desejado. Outras modalidades incluem o uso de GLA em uma composição de vacina que também inclui um ou uma pluralidade de antígenos aos quais uma resposta imune induzida ou acentuada por tal vacina é desejada.

[020]Conforme descrito neste relatório, estas composições de vacina também podem incluir, em certas modalidades relacionadas, um ou mais agonistas do receptor do tipo Toll (TLR) e/ou um ou uma pluralidade de um ou mais entre um coadjuvante, um modificador de resposta imune de imidazoquinolina e um imunomodificador em forma de anel de hélice dupla (dSLIM). Em outras modalidades relacionadas, uma composição de vacina fornecida neste relatório pode compreender GLA e um ou mais constructos de expressão recombinante compreendendo um promotor ligado de maneira operável a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica o antígeno contra o qual a indução ou aumento de uma resposta imune (por exemplo, uma resposta específica do antígeno) no paciente é desejado. GLA

[021]Conforme observado acima, pelo fato de que GLA é um adjuvante quimicamente sintetizado, ele pode ser preparado na forma substancialmente homogênea, que se refere a uma preparação de GLA que é pelo menos 80 %, preferivelmente, pelo menos 85 %, mais preferivelmente, pelo menos 90 %, mais preferivelmente, pelo menos 95 % e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % pura com respeito à molécula de GLA.

[022]Os compostos de GLA da presente invenção têm a seguinte fórmula (I):

ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, em que: L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são iguais ou diferentes e independentemente -O-, -NH- ou -(CH2)-; L7, L8, L9, e L10 são iguais ou diferentes e independentemente ausentes ou -C(=O)-; Y1 é um grupo funcional ácido; Y2 e Y3 são iguais ou diferentes e independentemente -OH, -SH, ou um grupo funcional ácido; Y4 é -OH ou -SH; R1, R3, R5 e R6 são iguais ou diferentes e independentemente alquila C8-13; e R2 e R4 são iguais ou diferentes e independentemente alquila C6-11.

[023]Conforme usado neste relatório, os termos acima têm os seguintes significados:

[024]“Alquila” significa um hidrocarboneto alifático de cadeia reta ou ramificada, não cíclico ou cíclico, insaturado ou saturado, contendo de 1 a 20 átomos de carbono, e, em certas modalidades preferidas, contendo de 11 a 20 átomos de carbono. Alquilas de cadeia reta saturada representativos incluem metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n-hexila e semelhantes, incluindo undecila, dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, hexadecila, heptadecila, octadecila, etc.; enquanto alquilas ramificados saturados incluem isopropila, sec-butila, isobutila, terc-butila, isopentila e semelhantes. Alquilas cíclicos saturados representativos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila e semelhantes; enquanto alquilas cíclicos insaturados incluem ciclopentenila e ciclo-hexenila e semelhantes. Alquilas cíclicos também são referidos neste relatório como “homociclos” ou “anéis homocíclicos.” Alquilas insaturados contêm pelo menos uma ligação dupla ou tripla entre átomos de carbono adjacentes (referidos como um “alquenila” ou “alquinila”, respectivamente). Alquenilas de cadeia reta e ramificada representativos incluem etilenila, propilenila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3- metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3-dimetil-2-butenila e semelhantes; enquanto alquinilas de cadeia reta e ramificada representativos incluem acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila, 3-metil-1-butinila e semelhantes.

[025]“Alquila C8-13” e “alquila C6-11” significam um alquila, conforme definido acima, contendo de 8 a 13 ou 6 a 11 átomos de carbono, respectivamente.

[026]“Grupo funcional ácido” significa um grupo funcional capaz de doar um próton em meio aquoso (isto é, um ácido de Bronsted-Lowry). Depois de doar um próton, o grupo funcional ácido se torna uma espécie negativamente carregada (isto é, a base conjugada do grupo funcional ácido). Exemplos de grupos funcionais ácidos incluem, mas não são limitados a: -OP(=O)(OH)2 (fosfato), -OS(=O)(OH)2 (sulfato), -OS(OH)2 (sulfito), -C(=O)OH (carboxilato), -OC(=O)CH(NH2)CH2C(=O)OH (aspartato), -OC(=O)CH2CH2C(=O)OH (succinato) e -OC(=O)CH2OP(=O)(OH)2 (carboximetilfosfato).

[027]Em modalidades mais específicas, a presente invenção fornece compostos de GLA da fórmula (I), em que L5 e L6 são -O- e L7, L8, L9 e L10 são - C(=O)-, e os compostos de GLA têm a seguinte fórmula (II):

[028]Em modalidades mais específicas, a presente invenção fornece compostos de GLA da fórmula (II), em que R1, R3, R5 e R6 são alquila Cx, onde x é constante e é selecionado a partir de um número inteiro de 8 a 13, e R2 e R4 são alquila Cx-2, e os compostos de GLA têm a seguinte fórmula (III):

[029]Em outras modalidades mais específicas, a presente invenção fornece compostos de GLA da fórmula (III), em que x é selecionado a partir de um número inteiro de 10 a 12.

[030]Em outras modalidades mais específicas, a presente invenção fornece compostos de GLA da fórmula (III), em que x é 11, e os compostos de GLA têm a seguinte estrutura (IV):

[031]Em outras modalidades específicas, a GLA da fórmula (II), em que Y1 é -OP(=O)(OH)2 e Y2, Y3 e Y4 são -OH, e os compostos de GLA têm a seguinte fórmula (V):

[032]Em outras modalidades específicas, a invenção fornece compostos de GLA da fórmula (II), em que L1 e L3 são -O- e L2 e L4 são -NH-, e os compostos de GLA têm a seguinte fórmula (VI):

[033]Em modalidades mais específicas, a invenção fornece compostos de GLA da fórmula (II), em que Y1 é -OP(O)(OH)2, Y2, Y3 e Y4 são -OH, L1 e L3 são -O- e L2 e L4 são -NH-, e os compostos de GLA têm a seguinte fórmula (VII):

[034]Em outras modalidades específicas, a presente invenção fornece compostos de GLA da fórmula (II), em que Y1 é -OP(O)(OH)2, Y2, Y3 e Y4 são -OH, L1 e L3 são -O-, L2 e L4 são -NH-, R1, R3, R5 e R6 são alquila Cx, onde x é constante e é selecionado a partir de um número inteiro de 8 a 13, e R2 e R4 são alquila Cx-2, e

[035]Em uma modalidade mais específica da fórmula (VIII), x é 11, e a invenção fornece um composto de GLA que tem a seguinte estrutura (IX):

Compostos de GLA

[036]Conforme mencionado acima, a presente invenção fornece compostos de GLA. Os compostos de GLA da presente invenção podem ser preparados através de técnicas de síntese orgânica conhecidas, incluindo os métodos descritos em mais detalhes nos Exemplos. Em geral, os compostos de GLA da estrutura (I) podem ser preparados pelos seguintes Esquemas de Reação, em que todos os substituintes são definidos acima, a menos que de outro modo indicado. Esquema de Reação 1

[037]A cadeia principal de açúcar dos compostos de GLA representativos pode ser preparada, em geral, de acordo com o Esquema de Reação 1, em que G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9 e G10 são iguais ou diferentes e independentemente um grupo de proteção apropriado ou hidrogênio. Um açúcar apropriado, tal como (i), pode ser adquirido ou preparado, de acordo com métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica. Os grupos funcionais de açúcar (i) depois podem ser completamente protegidos usando métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica para obter (ii). Neste respeito, uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que uma estratégia de grupo de proteção ortogonal apropriado que permite desproteção seletiva dos grupos funcionais açúcar pode ser utilizada. Grupos de proteção adequados incluem, mas não são limitados a éteres silílicos, éteres benzílicos, aliloxicarbonila, acetais, Fmoc, azida e semelhantes. A desproteção de G1 resulta em álcool livre (iii) que depois pode ser ligado com açúcar protegido (iv) através do uso de condições de ligação apropriadas, por exemplo, CCl3CN/NaH, para obter a cadeia principal de açúcar desejada (v). Esquema de Reação 2

[038]Partes da cauda do composto de GLA representativo, em que L5 e L6 são -O- e L7, L8, L9 e L10 são -C(=O)-, podem ser preparadas, em geral, de acordo com o Esquema de Reação 2, em que G11 representa um grupo de proteção apropriado. Compostos de ácido da estrutura (vi) podem ser adquiridos ou preparados, de acordo com métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica. A reação de (vi) com um reagente apropriado, tal como hidrogenomalonato de metila, produz cetoéster (vii). A redução de (vii) produz álcool (viii). Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que, sob condições apropriadas, o grupo ceto de (vii) pode ser estereoespecificamente reduzido, conforme exemplificado nos Exemplos. A saponificação de (viii) produz ácido (ix) que pode ser subsequentemente protegido para fornecer (x). O tratamento de (x) com cloreto de ácido (xi) produz (xii), que, sob desproteção, produz (xiii). Os compostos (ix) e (xiii) podem ser convertidos em um derivado de cloreto de ácido adequadamente protegido através de métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica e ligados à cadeia principal de açúcar do composto de GLA, conforme mostrado no Esquema de Reação 3 abaixo. Embora o Esquema de Reação 2 represente a síntese de uma parte da cauda do composto de GLA que compreende R1 e R2, deve ser entendido que outras partes da cauda que compreendem outros grupos alquila (por exemplo, R3, R4, R5 e R6) também podem ser preparadas através de um método análogo. Outras partes da cauda com grupos L5, L6, L7, L8, L9, e L10 diferentes também podem ser preparadas através de métodos análogos. Esquema de Reação 3

[039]Compostos de GLA representativos podem ser preparados, em geral, de acordo com o Esquema de Reação 3, em que G12 e G13 são iguais ou diferentes e representam independentemente um grupo de proteção apropriado. A remoção do grupo de proteção G5 de (v), seguido por reação com cloreto de ácido (xiv), produz (xv). Similarmente, a remoção do grupo de proteção G8 a partir de (xv), seguido por reação com cloreto de ácido (xvi), resulta em (xvii). A desproteção de (xvii) e a reação com cloreto de ácido (xviii) produz (xix). A remoção de G9 e a reação com (xx) depois produz o composto de GLA protegido (xxi). A desproteção global de (xxi) resulta em um composto da estrutura (II). Embora o Esquema de Reação 3 represente a síntese de um composto da estrutura (II), uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que métodos análogos podem ser utilizados para produzir qualquer composto da estrutura (I). Além disso, uma pessoa habilitada na técnica também reconhecerá que com a seleção dos grupos de proteção apropriados, a desproteção final resulta no composto desejado.

[040]Os compostos da presente invenção, em geral, podem ser utilizados como a base livre ou ácido livre. Alternativamente, os compostos desta invenção podem ser usados na forma de sais de adição de ácido ou base. Os sais de adição de ácido dos compostos de amino livre da presente invenção podem ser preparados através de métodos bem conhecidos na técnica e podem ser formados a partir de ácidos orgânicos e inorgânicos. Ácidos orgânicos adequados incluem ácidos maleicos, fumáricos, benzoicos, ascórbicos, succínicos, metanossulfônicos, acéticos, oxálicos, propiônicos, tartáricos, salicílicos, cítricos, glicônicos, lácticos, mandélicos, cinâmicos, aspárticos, esteáricos, palmíticos, glicólicos, glutâmicos e benzenossulfônicos. Ácidos inorgânicos adequados incluem ácidos clorídricos, bromídricos, sulfúricos, fosfóricos e nítricos.

[041]Similarmente, sais de adição de base dos compostos de ácido da presente invenção podem ser preparados através de métodos bem conhecidos na técnica e podem ser formados a partir de bases orgânicas e inorgânicas. Bases orgânicas adequadas incluem, mas não são limitadas a, trietilamina e piridina. Bases inorgânicas adequadas incluem, mas não são limitadas a, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio e amônia. Desse modo, o termo “sal farmaceuticamente aceitável” da estrutura (I) abrange quaisquer e todas as formas de sal aceitáveis.

[042]Além disso, pró-fármacos também são incluídos no contexto desta invenção. Pró-fármacos são quaisquer carreadores covalentemente ligados que liberam um composto da estrutura (I) in vivo quando tal pró-fármaco é administrado a um paciente. Os pró-fármacos são, em geral, preparados através da modificação de grupos funcionais em uma maneira, tal que a modificação é clivada, tanto por manipulação de rotina quanto in vivo, produzindo o composto precursor. Os pró- fármacos incluem, por exemplo, compostos desta invenção, em que os grupos hidróxi, amina ou sulfidrila são ligados a qualquer grupo que, quando administrado a um paciente, é clivado para formar os grupos hidróxi, amina ou sulfidrila. Desse modo, exemplos representativos de pró-fármacos incluem (mas não são limitados a) derivados de acetato, formiato e benzoato de grupos funcionais álcool e amina dos compostos da estrutura (I). Além disso, no caso de um ácido carboxílico (COOH), ésteres podem ser utilizados, tais como ésteres metílicos, ésteres etílicos e semelhantes.

[043]Com respeito aos estereoisômeros, os compostos da estrutura (I) podem ter centros quirais e podem ocorrer como racematos, misturas racêmicas e como enantiômeros ou diastereômeros individuais. Todas as formas isoméricas estão incluídas na presente invenção, incluindo misturas das mesmas. Além disso, algumas das formas cristalinas dos compostos da estrutura (I) podem existir como polimorfos, que estão incluídos na presente invenção. Além disso, alguns dos compostos da estrutura (I) também podem formar solvatos com água ou outros solventes orgânicos. Tais solvatos são similarmente incluídos no escopo desta invenção. Antígeno

[044]Um antígeno, para o uso em certas modalidades das composições de vacina e métodos descritos utilizando GLA neste relatório, pode ser qualquer epítopo, molécula (incluindo uma biomolécula), complexo molecular (incluindo complexos moleculares que contêm biomoléculas), construção subcelular, célula ou tecido alvo contra os quais a indução ou aumento de imunorreatividade em um paciente é desejado. Frequentemente, o termo antígeno se refere a um antígeno polipeptídico de interesse. Entretanto, antígeno, conforme usado neste relatório, também pode se referir a um constructo recombinante que codifica um antígeno polipeptídico de interesse (por exemplo, um constructo de expressão). Em certas modalidades preferidas, o antígeno pode ser, ou pode ser derivado de, ou pode ser imunologicamente reativo de forma cruzada com, um patógeno infeccioso e/ou um epítopo, biomolécula, célula ou tecido que está associado com infecção, câncer, doença autoimune, alergia, asma ou qualquer outra condição onde o estímulo de uma resposta imune específica ao antígeno seria desejável ou benéfico.

[045]Preferivelmente, e em certas modalidades, as formulações de vacina da presente invenção contêm um antígeno ou composição antigênica capaz de induzir uma resposta imune contra um patógeno humano ou de outro mamífero, em que o antígeno ou composição antigênica pode incluir uma composição derivada de um vírus, tal como a partir de HIV-1, (tal como tat, nef, gp120 ou gp160), herpesvírus humano, tal como gD ou derivados do mesmo ou proteína Precoce Imediata, tal como ICP27 a partir de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus ((esp. Humana) (tal como gB ou derivados do mesmo), Rotavírus (incluindo vírus atenuado vivo), vírus Epstein Barr (tal como gp350 ou derivados do mesmo), Vírus Varicela-Zóster (tal como gpI, II e IE63), ou a partir de um vírus da hepatite, tal como vírus da hepatite B (por exemplo, antígeno Superficial da Hepatite B ou um derivado do mesmo), vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E, ou a partir de outros patógenos virais, tais como paramixovírus: vírus Sincicial Respiratório (tal como proteínas F e G ou derivados das mesmas), vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, papilomavírus humanos (por exemplo HPV6, 11, 16, 18, etc.), flavivírus (por exemplo, Vírus da Febre Amarela, Vírus da Dengue, Vírus da Encefalite Transmitida por Carrapato, Vírus da Encefalite Japonesa) ou vírus da Influenza (vírus total vivo ou inativado, vírus da influenza fracionado (split), cultivado em ovos ou células MDCK, ou virossomas totais da gripe (conforme descrito por Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou proteínas purificadas ou recombinantes dos mesmos, tais como proteínas HA, NP, NA ou M, ou combinações das mesmas).

[046]Em outras modalidades preferidas, as formulações de vacina da presente invenção contêm um antígeno ou composição antigênica capaz de induzir uma resposta imune contra um patógeno humano ou de outro mamífero, em que o antígeno ou composição antigênica pode incluir uma composição derivada de um ou mais patógenos bacterianos, tais como Neisseria spp, incluindo N. gonorreia e N. meningitidis (por exemplo, polissacarídeos capsulares e conjugados dos mesmos, proteínas de ligação à transferrina, proteínas de ligação à lactoferrina, PilC, adesinas); S. pyogenes (por exemplo, proteínas M ou fragmentos das mesmas, C5A protease, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi; Moraxella spp, incluindo M catarrhalis, também conhecido como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de alto e baixo peso molecular); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por exemplo, pertactina, toxina da coqueluche ou derivados das mesmas, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fímbria), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp, incluindo M. tuberculosis (por exemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionelose spp, incluindo L. pneumophila; Escherichia spp, incluindo E. coli enterotóxico (por exemplo, fatores de colonização, toxina lábil ao calor ou derivados da mesma, toxina estável ao calor ou derivados da mesma), E. coli entero-hemorrágico, E. coli enteropatogênico (por exemplo, toxina do tipo toxina shiga ou derivados da mesma); Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo, toxina da cólera ou derivados da mesma); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo, uma proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo toxinas, adesinas e invasinas) e C. coli; Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp, incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo urease, catalase, toxina vacuolizante); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa; Staphylococcus spp, incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp, incluindo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp, incluindo C. tetani (por exemplo, toxina do tétano e derivados da mesma), C. botulinum (por exemplo, toxina botulínica e derivados da mesma), C. difficile (por exemplo, toxinas A ou B de Clostridium e derivados das mesmas); Bacillus spp, incluindo B. anthracis (por exemplo, toxina botulínica e derivados da mesma); Corynebacterium spp, incluindo C. diphtheriae (por exemplo, toxina da difteria e derivados da mesma); Borrelia spp, incluindo B. burgdorferi (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp, incluindo E. equi e o agente da Erliquiose Granulocítica Humana; Rickettsia spp, incluindo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação à heparina), C. pneumoniae (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação à heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo, as proteínas de membranas externas raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; ou outros patógenos bacterianos.

[047]Em outras modalidades preferidas, as formulações de vacina da presente invenção contêm um antígeno ou composição antigênica capaz de induzir uma resposta imune contra um patógeno humano ou de outro mamífero, em que antígeno ou composição antigênica pode incluir uma composição derivada de um ou mais parasitas (Veja, por exemplo, John, D.T. e Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology - 9a Ed., 2006, WB Saunders, Filadélfia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians - 8a Ed., 2002, WB Saunders, Filadélfia), tais como Plasmodium spp, incluindo P. falciparum; Toxoplasma spp, incluindo T. gondii (por exemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp, incluindo E. histolytica; Babesia spp, incluindo B. microti; Trypanosoma spp, incluindo T. cruzi; Giardia spp, incluindo G. lamblia; Leishmania spp, incluindo L. major; Pneumocystis spp, incluindo P. carinii; Trichomonas spp, incluindo T. vaginalis; ou a partir de um helminto capaz de infectar um mamífero, tal como: (i) infecções por nematódeos (incluindo, mas não limitados a, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis e Strongyloides stercoralis); (ii) infecções por trematódeos (incluindo, mas não limitados a, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp, Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); e (iii) infecções por cestoides (incluindo, mas não limitados a, Taenia saginata e Taenia solium). Certas modalidades podem, portanto, considerar composições de vacina que incluem um antígeno derivado de Schisostoma spp, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium e/ou Schistosoma japonicum, ou derivado de levedura, tal como Candida spp, incluindo C. albicans; Cryptococcus spp, incluindo C. neoformans.

[048]Outros antígenos específicos preferidos para M. tuberculosis são, por exemplo, Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCC1 (WO 99/51748). Proteínas para M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e variantes das mesmas, onde pelo menos dois, preferivelmente, três polipeptídeos de M. tuberculosis são fundidos em uma proteína maior. Fusões preferidas incluem Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV- MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99151748).

[049]Certos antígenos preferidos para Clamídia incluem, por exemplo, a Proteína de Alto Peso Molecular (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412), CT622, CT610, pmpD, UVEB e proteínas de membrana putativa (Pmps). Outros antígenos para Clamídia da formulação de vacina podem ser selecionados a partir do grupo descrito no WO 99128475. Vacinas bacterianas preferidas compreendem antígenos derivados de Streptococcus spp, incluindo S. pneumoniae (por exemplo, polissacarídeos capsulares e conjugados dos mesmos, PsaA, PspA, PdB, estreptolisina, proteínas de ligação à lisina) e o antígeno da proteína de Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), e derivados desentoxicados de mutantes do mesmo (WO 90/06951; WO 99/03884). Outras vacinas bacterianas preferidas compreendem antígenos derivados de Haemophilus spp, incluindo H. influenzae tipo B (por exemplo PRP e conjugados da mesma), H. influenzae não tipável, por exemplo OMP26, adesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D e lipoproteína D, e fimbrina e peptídeos derivados de fimbrina (Patente U.S. No 5.843.464) ou variantes de múltiplas cópias ou proteínas de fusão das mesmas.

[050]Derivados do antígeno superficial da hepatite B são bem conhecidos na técnica e incluem, inter alia, aqueles antígenos PreS1, Pars2 S apresentados nos Pedidos de Patentes Europeus EP-A414 374, EP-A-0304 578 e EP 198474. Em um aspecto preferido, a formulação de vacina da invenção compreende o antígeno de HIV-1, gp120, especialmente quando expressado em células CHO. Em uma outra modalidade, a formulação de vacina da invenção compreende gD2t, conforme definido acima neste relatório.

[051]Em uma modalidade preferida da presente invenção, vacinas que contêm o adjuvante reivindicado compreendem o antígeno derivado do papilomavírus humano (HPV) considerado ser responsável pelas verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros), e o vírus HPV responsável pelo câncer cervical (HPV16, HPV18 e outros). Formas particularmente preferidas de vacina profilática ou terapêutica para verrugas genitais compreendem partículas L1 ou capsômeros, e proteínas de fusão que compreendem um ou mais antígenos selecionados a partir das proteínas de HPV 6 e HPV 11 E6, E7, L1 e L2. Certas formas preferidas de proteína de fusão incluem L2E7, conforme divulgado no WO 96/26277, e proteínaD(1/3)-E7 divulgada no GB 9717953,5 (PCT/EP98/05285). Uma composição de vacina profilática ou terapêutica preferida para infecção ou câncer cervical por HPV pode compreender antígenos de HPV 16 ou 18. Por exemplo, os monômeros de antígeno L1 ou L2, ou antígenos L1 ou L2 apresentados juntos como um vírus do tipo partícula (VLP) ou L1 apresentado sozinho em um VLP ou estrutura de capsômero. Tais antígenos, vírus do tipo partículas e capsômeros são conhecidos per se. Veja, por exemplo, o WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 e WO 93/02184.

[052]Proteínas precoces adicionais podem ser incluídas sozinhas ou como proteínas de fusão, tais como E7, E2 ou preferivelmente F5, por exemplo. Modalidades particularmente preferidas incluem um VLP compreendendo proteínas de fusão L1E7 (WO 96/11272). Antígenos de HPV 16 particularmente preferidos compreendem as proteínas precoces E6 ou F7 em fusão com um carreador de proteína D para formar a Proteína D-E6 ou fusões E7 a partir de HPV 16, ou combinações dos mesmos; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (WO 96/26277). Alternativamente, as proteínas precoces E6 e E7 de HPV 16 ou 18 podem ser apresentadas em uma molécula única, preferivelmente, uma fusão da Proteína D- E6/E7. Tal vacina pode conter, opcionalmente, as proteínas precoces E6 e E7 de HPV 18, preferivelmente na forma de uma Proteína D-E6 ou proteína de fusão Proteína D-E7 ou proteína de fusão Proteína D E6/E7. A vacina da presente invenção pode compreender adicionalmente antígenos a partir de outras cepas de HPV, preferivelmente, a partir de cepas de HPV 31 ou 33.

[053]As vacinas da presente invenção ainda compreendem antígenos derivados de parasitas que causam malária. Por exemplo, antígenos preferidos a partir de Plasmodia falciparum incluem RTS,S e TRAP. RTS é uma proteína híbrida que compreende substancialmente toda a porção C-terminal da proteína circunsporozoíta (CS) de P.falciparum ligada por intermédio de quatro aminoácidos da porção preS2 do antígeno superficial da hepatite B ao antígeno superficial (S) do vírus da hepatite B. Sua estrutura completa é divulgada no Pedido de Patente Internacional No PCT/EP92/02591, publicado como WO 93/10152 reivindicando prioridade a partir do Pedido de Patente UK No 9124390.7. Quando expressada em levedura, RTS é produzida como uma partícula de lipoproteína e quando é coexpressada com o antígeno S a partir de HBV, produz uma partícula mista conhecida como RTS,S.

[054]Antígenos de TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional No PCT/GB89/00895 publicado como WO 90/01496. Uma modalidade preferida da presente invenção é uma vacina para Malária, em que a preparação antigênica compreende uma combinação dos antígenos de RTS,S e TRAP. Outros antígenos de plasmódios que provavelmente são candidatos a componentes de uma vacina para Malária de múltiplos estágios são MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. faciparum e seus análogos em Plasmodium spp.

[055]Consequentemente, certas modalidades divulgadas neste relatório consideram um antígeno que é derivado de pelo menos um patógeno infeccioso, tal como uma bactéria, um vírus ou um fungo, incluindo uma Actinobactéria, tal como M. tuberculosis ou M. leprae ou uma outra micobactéria; uma bactéria, tal como um membro do gênero Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia ou Bordetella; um vírus, tal como um vírus do herpes simples, um vírus da imunodeficiência humana (HIV), um vírus da imunodeficiência felina (FIV), citomegalovírus, Vírus da Varicela- Zóster, vírus da hepatite, Vírus Epstein Barr (EBV), vírus sincicial respiratório, papilomavírus humano (HPV) e um citomegalovírus; HIV, tal como HIV-1 ou HIV-2; um fungo, tal como Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides e Pneumocysti ou uma levedura, incluindo espécies de Candida, tais como C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis e C. parapsilosis; um parasita, tal como um protozoário, por exemplo, uma espécie de Plasmodium, incluindo P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale; ou um outro parasita, tal como um ou mais entre Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia e Leishmania.

[056]Por exemplo, em modalidades de vacina contendo GLA contendo antígenos derivados de Borrelia sp., os antígenos podem incluir ácido nucleico, antígenos ou preparações antigênicas derivados do patógeno, proteína ou peptídeos recombinantemente produzidos e proteínas de fusão quiméricas. Tal antígeno é OspA. O OspA pode ser uma proteína madura completa em uma forma lipidificada em virtude de sua biossíntese em uma célula hospedeira (Lipo-OspA) ou pode ser, alternativamente, um derivado não lipidificado. Tais derivados não lipidificados incluem a proteína de fusão NS1-OspA não lipidificada que tem os primeiros 81 aminoácidos N-terminais da proteína não estrutural (NS1) do vírus influenza, e a proteína OspA completa, e uma outra, MDP-OspA é uma forma não lipidificada de OspA transportando os 3 aminoácidos N-terminais adicionais.

[057]As composições e métodos são conhecidos na técnica para identificar pacientes que têm, ou suspeitos de estar em risco de ter uma infecção com um patógeno infeccioso, conforme descrito neste relatório.

[058]Por exemplo, a bactéria Mycobacterium tuberculosis causa tuberculose (TB). As bactérias usualmente atacam os pulmões, mas também podem atacar os rins, espinha dorsal, e cérebro. Se não adequadamente tratada, a doença TB pode ser fatal. A doença é propagada de uma pessoa a outra no ar quando uma pessoa infectada espirra ou tosse. Em 2003, mais do que 14.000 casos de TB foram relatados nos Estados Unidos.

[059]Embora a tuberculose possa, em geral, ser controlada usando terapia prolongada com antibióticos, tal tratamento não é suficiente para prevenir a propagação da doença e existe a preocupação com respeito à seleção potencial para cepas resistentes ao antibiótico. Indivíduos infectados podem ser assintomáticos, porém contagiosos, por algum tempo. Além disso, embora a complacência com o regime de tratamento seja crítica, é difícil monitorar o comportamento do paciente. Alguns pacientes não completam o curso do tratamento, o que pode levar à ineficácia do tratamento e ao desenvolvimento de resistência ao fármaco. (por exemplo, Patente U.S. 7.087.713).

[060]Correntemente, a vacinação com bactérias vivas é o método mais eficaz para induzir imunidade protetora contra tuberculose. A micobactéria mais comum utilizada para este propósito é Bacillus Calmette-Guerin (BCG), uma cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Entretanto, a segurança e eficácia de BCG é uma fonte de controvérsia e alguns países, tais como os Estados Unidos, não vacinam o público geral. O diagnóstico é comumente obtido usando um teste na pele, que envolve a exposição intradérmica à tuberculina PPD (derivado proteico purificado). As respostas de células T específicas do antígeno resultam em endurecimento mensurável no sítio de injeção em 48 a 72 horas depois da injeção, o que indica a exposição aos antígenos micobacterianos. A sensibilidade e especificidade, entretanto, foram um problema com relação a este teste e indivíduos vacinados com BCG não podem ser distinguidos de indivíduos infectados. (por exemplo, Patente U.S. 7.087.713).

[061]Embora os macrófagos tenham sido mostrados na atuação como os principais efetores de imunidade para M. tuberculosis, as células T são os indutores predominantes de tal imunidade. O papel essencial de células T na proteção contra infecção por M. tuberculosis é ilustrado pela ocorrência frequente de M. tuberculosis em pacientes com AIDS, devido à depleção de células T CD4 associada com infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV). Foi mostrado que as células T CD4 reativas à micobactéria são produtoras potentes de interferon gama (IFN- gama), que, por sua vez, foi mostrado acionar os efeitos antimicobacterianos de macrófagos em camundongos. Embora o papel de IFN-gama em seres humanos seja menos evidente, estudos mostraram que 1,25-di-hidróxi-vitamina D3, sozinho ou em combinação com IFN-gama ou fator de necrose tumoral alfa, ativa os macrófagos humanos para inibir a infecção por M. tuberculosis. Além disso, é conhecido que IFN-gama estimula os macrófagos humanos a produzirem 1,25-di- hidróxi-vitamina D3. Similarmente, foi mostrado que IL-12 desempenha um papel em estimular a resistência à infecção por M. tuberculosis. Para uma revisão da imunologia de infecção por M. tuberculosis, veja Chan e Kaufmann, em Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press. Washington, D.C. (1994).

[062]Compostos e métodos existentes para diagnosticar tuberculose ou para induzir imunidade protetora contra tuberculose incluem o uso de polipeptídeos que contêm pelo menos uma porção imunogênica de uma ou mais proteínas de micobactéria e moléculas de DNA que codificam tais polipeptídeos. Kits de diagnóstico contendo tais sequências de polipeptídeos ou DNA e um reagente de detecção adequado podem ser usados para a detecção de infecção por micobactéria em pacientes e amostras biológicas. Anticorpos dirigidos contra tais polipeptídeos também são fornecidos. Além disso, tais compostos podem ser formulados em vacinas e/ou composições farmacêuticas para imunização contra infecção por micobactérias. (Patentes U.S. Nos 6.949.246 e 6.555.653).

[063]A malária foi eliminada em diversas partes do mundo na década de 1960, mas a doença ainda persiste e novas cepas da doença estão emergindo, as quais são resistentes aos fármacos existentes. A malária é um problema de saúde pública principal em mais de 90 países. Nove entre os dez casos de malária ocorrem na África ao sul do Sahara. Mais do que um terço da população mundial está em risco e entre 350 e 500 millhões de pessoas são infectadas com malária a cada ano. Quarenta e cinco milhões de gestantes estão em risco de contrair malária este ano. Entre os indivíduos já infectados, mais do que 1 milhão daqueles infectados morrem a cada ano de uma doença que é evitável. A maioria daqueles que morrem são crianças na África.

[064]A malária é usualmente transmitida quando uma pessoa é picada por um mosquito anófeles fêmea infectado. Para a transmissão, o mosquito deve ter sido infectado pela retirada de sangue de uma pessoa já infectada com malária. A malária é causada por um parasita e os sintomas clínicos da doença incluem febre e enfermidade do tipo gripe, tal como calafrios, dor de cabeça, dores musculares e fadiga. Estes sintomas podem estar acompanhados por náusea, vômito e diarreia. A malária também pode causar anemia e icterícia, devido à perda de glóbulos vermelhos. A infecção com um tipo de malária, Plasmodium falciparum, se não rapidamente tratada, pode causar insuficiência renal, convulsões, confusão mental, coma e morte.

[065]Um método de diagnóstico in vitro para malária em um indivíduo é conhecido, o qual compreende colocar um tecido ou um fluido biológico tomado a partir de um indivíduo em contato com uma molécula ou composição de polipeptídeo, em que a dita molécula ou composição de polipeptídeo compreende uma ou mais sequências de peptídeos transportando todos ou parte de um ou mais epítopos T das proteínas resultantes da atividade infecciosa de P. falciparum, sob condições que permitam que uma reação imunológica in vitro ocorra entre a dita composição e os anticorpos que podem estar presentes no tecido ou fluido biológico, e detecção in vitro dos complexos antígeno-anticorpo formados (veja, por exemplo, Patente U.S. 7.087.231).

[066]A expressão e purificação de um ectodomínio AMA-1 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante foram descritas. Métodos anteriores produziram uma proteína altamente purificada que retém a dobra e ponte dissulfeto da molécula nativa. O AMA-1 recombinante é útil como um reagente de diagnóstico, assim como na produção de anticorpos, e como uma proteína para o uso sozinho, ou como parte de uma vacina para prevenir malária. (Patente U.S. 7.029.685).

[067]Os polinucleotídeos foram descritos na técnica, os quais codificam antígenos peptídicos maláricos de P. vivax específicos da espécie que são proteínas ou fragmentos de proteínas secretados no plasma de um mamífero hospedeiro suscetível depois da infecção, quando têm anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos contra estes antígenos. Os antígenos peptídicos, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos policlonais são utilizados em ensaios usados para diagnosticar malária, assim como determinar se Plasmodium vivax é a espécie responsável pela infecção (Patente U.S. 6.706.872). Antígenos peptídicos maláricos de P. vivax específicos da espécie também foram relatados, os quais são proteínas ou fragmentos de proteínas secretados no plasma de um mamífero hospedeiro suscetível depois da infecção, quando têm anticorpos monoclonais ou policlonais dirigidos contra estes antígenos. Os antígenos peptídicos, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos policlonais são utilizados em ensaios usados para diagnosticar malária, assim como determinar se Plasmodium vivax é a espécie responsável pela infecção (veja, por exemplo, a Patente U.S. 6.231.861).

[068]Um ectodomínio AMA-1 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante também foi expressado por um método que produz uma proteína altamente purificada que retém a dobra e ponte dissulfeto da molécula nativa. O AMA-1 recombinante é útil como um reagente de diagnóstico, para o uso na produção de anticorpos, e como uma vacina. (Patente U.S. 7.060.276). Similarmente conhecidas são a expressão e purificação de um MSP-142 de Plasmodium falciparum (3D7) recombinante, que retém a dobra e ponte dissulfeto da molécula nativa. O MSP-142 recombinante é útil como um reagente de diagnóstico, para o uso na produção de anticorpos e como uma vacina (Patente U.S. 6.855.322).

[069]Métodos de diagnóstico para a detecção de infecções por malária humana para identificar um paciente que tem ou é suspeito de estar em risco de ter uma infecção com um patógeno infeccioso da malária são conhecidos, de acordo com estas divulgações e outras relacionadas. Especificamente, por exemplo, amostras sanguíneas são combinadas com um reagente contendo 3-acetil piridina adenina dinucleotídeo (APAD), um substrato (por exemplo, um sal de lactato ou ácido láctico) e um tampão. O reagente é designado para detectar a presença de uma única enzima glicolítica produzida pelo parasita da malária. Esta enzima é conhecida como ácido láctico desidrogenase (PLDH) do parasita. A PLDH é facilmente distinguível da LDH do hospedeiro usando o reagente descrito acima. A combinação do reagente com uma amostra sanguínea parasitizada resulta na redução de APAD. Entretanto, APAD não é reduzida pela LDH do hospedeiro. A APAD reduzida depois pode ser detectada por várias técnicas, incluindo análise espectral, fluorimétrica, eletroforética ou colorimétrica. A detecção da APAD reduzida na maneira antecedente fornece uma indicação positiva de infecção por malária (por exemplo, Patente U.S. 5.124.141). Em uma outra metodologia para diagnosticar malária, um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos característica derivada do antígeno de Plasmodium falciparum GLURP é reconhecido em uma amostra de teste através de um anticorpo específico contra ou reativo com o polipeptídeo (Patente U.S. 5.231.168).

[070]A leishmaniose é uma doença parasítica comum com epidemias frequentes no subcontinente Indiano, África e América Latina e é uma prioridade da Organização Mundial de Saúde quanto ao desenvolvimento de vacina. Um complexo de doenças diferentes, parasitas leishmânia causam infecções fatais de orgãos internos, assim como sérias doenças de pele. Uma das formas mais devastadoras de leishmaniose é uma infecção que disfigura o nariz e boca. O número de casos de leishmaniose é crescente e, no momento, está fora de controle em algumas áreas. A leishmaniose também é crescente em alguns países desenvolvidos, especificamente, sul da Europa, como um resultado da infecção por HIV. Os fármacos disponíveis são tóxicos, caros e exigem injeções diárias a longo prazo.

[071]Leishmânia são parasitas protozoários que residem em macrófagos ou glóbulos brancos do sistema imune. Os parasitas são transmitidos pela picada de pequenos insetos sugadores de sangue (mosquitos pólvora), que são difíceis de controlar, pois habitam grandes áreas do planeta.

[072]Leishmaniose visceral é a mais perigosa entre as três manifestações da doença. Estima-se que cerca de 500.000 novos casos da forma visceral (kala-azar ou “a doença mortal”) ocorram a cada ano. Mais do que 200 milhões de pessoas estão correntemente em risco de contrair leishmaniose visceral. Mais do que 90 por cento de casos viscerais de leishmaniose ocorrem na Índia, Bangladesh, Sudão, Brasil e Nepal. A maioria das mortes ocorre entre as crianças. Frequentemente, aquelas pessoas com as formas cutâneas se tornam permanentemente desfiguradas.

[073]As infecções por leishmânia são difíceis de diagnosticar e tipicamente envolvem análise histopatológica de amostras para biópsia de tecido. Entretanto, vários ensaios de diagnóstico sorológico e imunológico foram desenvolvidos. (Patente U.S. 7.008.774; Senaldi et al., (1996) J. Immunol. Methods 193:9 5; Zijlstra, et al., (1997) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91:671 673; Badaro, et al., (1996) J. Inf. Dis. 173:758 761; Choudhary, S., et al., (1992) J. Comm. Dis. 24:32 36; Badaro, R., et al., (1986) Am. J. Trop. Med. Hyg. 35:72 78; Choudhary, A., et al., (1990) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84:363 366; e Reed, S. G., et al., (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 43:632 639). Os promastigotas liberam produtos metabólicos no meio de cultura para produzir meio condicionado. Estes produtos metabólicos são imunogênicos ao hospedeiro. Veja Schnur, L. F., et al., (1972) Isrl. J. Med. Sci. 8:932 942; Sergeiev, V. P., et al., (1969) Med. Parasitol. 38:208 212; El-On, J., et al., (1979) Exper. Parasitol. 47:254-269; e Bray, R. S., et al., (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60:605 609; Patente U.S. No 6.846.648, Patente U.S. 5.912.166; Patente U.S. 5.719.263; Patente U.S. 5.411.865).

[074]Cerca de 40 milhões de pessoas no mundo estão infectadas com HIV, o vírus que causa AIDS. Cerca de 3 milhões de pessoas morrem da doença a cada ano, 95 por cento delas no mundo em desenvolvimento. A cada ano, aproximadamente 5 milhões de pessoas serão infectadas com HIV. Correntemente, a África ao sul do Sahara apresenta o índice mais alto da doença, mas a mesma já se propagou rapidamente para outros países, tais como Índia, China e Rússia. A epidemia é mais rapidamente crescente entre populações minoritárias. Nos Estados Unidos mais do que 950.000 casos de AIDS foram relatados desde 1981. A AIDS atinge pessoas durante sua fase mais produtiva. Mulheres, por razões biológicas e sociais, apresentam um risco aumentado para HIV/AIDS.

[075]A AIDS é causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), que mata e danifica células do sistema imune do corpo e, progressivamente, destrói a capacidade de o corpo combater infecções e certos cânceres. O HIV é mais comumente propagado através de sexo sem proteção com um parceiro infectado. A solução mais robusta para o problema é a prevenção contra a propagação do vírus. O fornecimento de uma vacina contra o HIV segura, eficaz e de preço acessível é uma maneira de atingir este objetivo. Em todo o mundo, menos do que uma entre cinco pessoas em alto risco para infecção por HIV têm acesso à prevenção eficaz.

[076]Métodos para diagnosticar infecções por HIV são conhecidos, incluindo cultura do vírus, PCR da sequência de ácidos nucleicos definitiva a partir de amostras de pacientes e testes de anticorpos quanto à presença de anticorpos antiHIV no soro do paciente (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos 6.979.535, 6.544.728, 6.316.183, 6.261.762, 4.743.540).

[077]De acordo com outras modalidades divulgadas neste relatório, as composições de vacina e formulações e métodos relacionados de uso podem incluir um antígeno que é derivado de uma célula cancerosa, à medida que pode ser útil para o tratamento imunoterapêutico de cânceres. Por exemplo, a formulação de adjuvante pode encontrar utilidade com antígenos de rejeição ao tumor, tais como aqueles para cânceres de próstata, mama, colorretal, pulmão, pancreático, renal ou melanoma. Antígenos derivados de câncer ou células cancerosas exemplares incluem MAGE 1, 3 e MAGE 4 ou outros antígenos MAGE, tais como aqueles divulgados no WO 99/40188, PRAME, BAGE, Lage (também conhecido como NY Eos 1) SAGE e HAGE (WO 99/53061) ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, páginas 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al., (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, página 293. Estes exemplos não limitantes de antígenos de câncer são expressados em uma ampla faixa de tipos de tumor, tais como melanoma, carcinoma pulmonar, sarcoma e carcinoma de bexiga. Veja, por exemplo, Patente U.S. No 6.544.518.

[078]Outros antígenos específicos de tumores são adequados para o uso com GLA, de acordo com certas modalidades presentemente divulgadas, e incluem, mas não são limitados a, gangliosídeos específicos de tumores ou associados a tumores, tais como GM2 e GM3 ou conjugados dos mesmos a proteínas carreadoras; ou um antígeno para o uso em uma composição de vacina de GLA para induzir ou acentuar uma resposta imune anticâncer pode ser um hormônio peptídico próprio, tal como hormônio que libera hormônio Gonadotrofina de comprimento total (GnRH, WO 95/20600), um peptídeo longo de 10 aminoácidos curtos, útil no tratamento de muitos cânceres. Em uma outra modalidade, antígenos prostáticos são usados, tais como antígeno prostático específico (PSA), PAP, PSCA (por exemplo, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998), PSMA ou, em uma modalidade preferida, um antígeno conhecido como Prostase (por exemplo, Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119; WO 98/12302; Patente U.S. No 5.955.306; WO 98/20117; Patentes U.S. Nos 5.840.871 e 5.786.148; WO 00/04149). Outros antígenos prostáticos específicos são conhecidos a partir do WO 98/137418 e WO/004149. Um outro é STEAP (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).

[079]Outros antígenos associados a tumores úteis no contexto da presente invenção incluem: Plu -1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al., Bioessays 199, 21:61-70, Patente U.S. No 5.654.140) e Criptina (Patente U.S. No 5.981.215). Adicionalmente, os antígenos particularmente relevantes para vacinas na terapia de câncer também compreendem tirosinase e survivina.

[080]As modalidades divulgadas neste relatório pertencentes às composições de vacina contendo GLA que compreendem um antígeno de câncer serão úteis contra qualquer câncer caracterizado pela expressão de antígeno associada a tumores, tal como expressão de HER-2/neu ou outros antígenos específicos de cânceres ou associados a cânceres.

[081]O diagnóstico de câncer em um paciente que tem ou suspeito de estar em risco de ter câncer pode ser realizado por uma ampla faixa de metodologias aceitas na técnica, que podem variar, dependendo de uma variedade de fatores, incluindo apresentação clínica, grau de progressão do câncer, do tipo de câncer e de outros fatores. Exemplos de diagnósticos de câncer incluem exame histopatológico, histocitoquímico, imuno-histocitoquímico e imuno-histopatológico de amostras do paciente (por exemplo, amostras sanguíneas, biópsia da pele, outra biópsia de tecido, amostras cirúrgicas, etc.), testes de PCR para marcadores genéticos definidos (por exemplo, ácido nucleico), testes sorológicos para antígenos associados a cânceres circulantes ou células que transportam tais antígenos, ou para anticorpos de especificidade definida, ou outras metodologias que são evidentes àqueles habilitados na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos 6.734.172; 6.770.445; 6.893.820; 6.979.730; 7.060.802; 7.030.232; 6.933.123; 6.682.901; 6.587.792; 6.512.102; 7.078.180; 7.070.931; JP5-328975; Waslylyk et al., 1993 Eur. J Bioch. 211(7):18.

[082]Composições e métodos de vacina, de acordo com certas modalidades da presente invenção, também podem ser usados para a profilaxia ou terapia de doenças autoimunes, que incluem doenças, condições ou transtornos, em que um sistema imune do hospedeiro ou paciente medeia de forma prejudicial uma resposta imune que é dirigida contra tecidos, células, biomoléculas (por exemplo, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, proteolipídios, lipídios, glicolipídios, ácidos nucleicos, tais como RNA e DNA, oligossacarídeos, polissacarídeos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos “próprios” ou semelhantes, e outros componentes moleculares das células e tecidos de pacientes) ou epítopos (por exemplo, estruturas de reconhecimento específicas imunologicamente definidas, tais como aquelas reconhecidas por uma região determinante de complementaridade (CDR) da região variável do anticorpo ou através de uma CDR do receptor de células T.

[083]Doenças autoimunes são caracterizadas por uma resposta imune anormal envolvendo células ou anticorpos, que são, em cada caso, dirigidas contra tecidos autólogos normais. Doenças autoimunes em mamíferos, em geral, podem ser classificadas em uma entre duas categorias diferentes: doença mediada por células (isto é, células T) ou transtornos mediados por anticorpos. Exemplos não limitantes de doenças autoimunes mediadas por células incluem esclerose múltipla, artrite reumatoide, tireoidite de Hashimoto, diabetes mellitus tipo I (diabetes com ínício na infância) e uveorretinite autoimune. Os transtornos autoimunes mediados por anticorpos incluem, mas não são limitados a, miastenia gravis, lúpus eritematoso sistêmico (ou SLE), doença de Graves, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia autoimune, asma autoimune, crioglobulinemia, púrpura trombocitopênica trombótica, esclerose biliar primária e anemia perniciosa. Os antígenos associados com: lúpus eritematoso sistêmico são pequenas proteínas de ácido ribonucleico nuclear (snRNP); doença de Graves é o receptor de tirotropina, tiroglobulina e outros componentes de células epiteliais da tireoide (Akamizu et al., 1996; Kellerman et al., 1995; Raju et al., 1997; e Texier et al., 1992); pênfigo são antígenos de pênfigo do tipo caderina, tais como desmogleína 3 e outras moléculas de adesão (Memar et al., 1996: Stanley, 1995; Plott et al., 1994; e Hashimoto, 1993); e púrpura trombocitopênica trômbica são antígenos de plaquetas. (Veja, por exemplo, Patente U.S. 6.929.796; Gorski et al., (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch e Lipsky, P.E. (Eds.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY).

[084]A autoimunidade desempenha um papel em mais do que 80 doenças diferentes, incluindo diabetes tipo 1, esclerose múltipla, lúpus, artrite reumatoide, esclerodermia e doenças da tireoide. Estimativas quantitativas vigorosas de morbidez para a maioria das doenças autoimunes são ausentes. A maioria dos estudos recentes feitos na década de 1990 revelou que doenças autoimunes são a terceira enfermidade principal mais comum nos Estados Unidos; e as doenças autoimunes mais comuns afetam mais do que 8,5 milhões de americanos. Estimativas correntes da prevalência da doença variam de 5 a 8 por cento da população dos Estados Unidos. A maioria das doença autoimunes afeta as mulheres de forma desproporcional. As mulheres apresentam probabilidade de 2,7 mais do que os homens de adquirir uma doença autoimune. As mulheres são mais suscetíveis às doenças autoimunes. Os homens parecem ter níveis mais altos de atividade de células matadoras naturais em relação às mulheres. (Jacobsen et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997.)

[085]Doenças autoimunes ocorrem quando o sistema imune confunde tecidos próprios com não próprios e produz um ataque inadequado. O corpo pode ser afetado de maneiras diferentes a partir das doenças autoimunes, incluindo, por exemplo, o intestino (doença de Crohn) e o cérebro (esclerose múltipla). É conhecido que um autoanticorpo ataca células próprias ou tecidos próprios para prejudicar sua função e, como um resultado, causa doenças autoimunes, e que o autoanticorpo pode ser detectado no soro do paciente antes da ocorrência real de uma doença autoimune (por exemplo, aparecimento de sinais clínicos e sintomas). A detecção de um autoanticorpo permite a descoberta ou reconhecimento precoce da presença ou risco para o desenvolvimento de uma doença autoimune. Com base nestas descobertas, uma variedade de autoanticorpos contra autoantígenos foi descoberta e os autoanticorpos contra autoantígenos foram medidos em testes clínicos (por exemplo, Patentes U.S. 6.919.210, 6.596.501, 7.012.134, 6.919.078), embora outros diagnósticos autoimunes possam envolver a detecção de um metabólito relevante (por exemplo, Patente U.S. No 4.659.659) ou reatividade imunológica (por exemplo, Patentes U.S. Nos 4.614.722 e 5.147.785, 4.420.558, 5.298.396, 5.162.990, 4.420.461, 4.595.654, 5.846.758, 6.660.487).

[086]Em certas modalidades, as composições da invenção serão particularmente aplicáveis no tratamento de pessoas idosas e/ou imunossuprimidas, incluindo pacientes em diálise renal, pacientes em quimioterapia e/ou terapia de radiação, pessoas que receberam transplantes e semelhantes. Tais indivíduos geralmente exibem respostas imunes reduzidas a vacinas e, portanto, o uso das composições da invenção pode acentuar as respostas imunes obtidas nestes pacientes.

[087]Em outras modalidades, o antígeno ou antígenos usados nas composições da invenção incluem antígenos associados com doenças respiratórias, tais como aquelas causadas ou exacerbadas por infecção bacteriana (por exemplo, pneumocócica), para a profilaxia e terapia de condições, tais como doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD). COPD é fisiologicamente definida pela presença de obstrução das vias aéreas irreversível ou parcialmente reversível em pacientes com bronquite crônica e/ou enfisema (Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov; 152(5 Pt 2):S77-121). Exacerbações de COPD são frequentemente causadas por infecção bacteriana (por exemplo, pneumocócica) (Clin Microbiol Rev. 2001 Abr; 14(2):336- 63). Em uma modalidade particular, uma composição da invenção compreende um adjuvante GLA, conforme descrito neste relatório, em combinação com a vacina Pneumocócica Prevnar® (Wyeth).

[088]Em outras modalidades, as composições da invenção, compreendendo GLA, conforme descrito neste relatório, são usadas no tratamento de condições alérgicas. Por exemplo, em uma modalidade particular, as composições são usadas em terapia de dessensibilização de alergia. Tal terapia envolve o estímulo do sistema imune com doses gradualmente aumentadas das substâncias as quais uma pessoa é alérgica, em que as substâncias são formuladas em composições compreendendo GLA. Em modalidades específicas, as composições são usadas no tratamento de alergias a produtos alimentícios, pólen, ácaros, gatos ou picadas de insetos (por exemplo, abelhas, vespões, vespas americanas, vespas, formigas- feiticeiras, formigas-lava-pés). TLR

[089]Conforme descrito neste relatório, certas modalidades da presente invenção consideram composições de vacina e composições de adjuvante imunológicas, incluindo composições farmacêuticas, que incluem, além dos compostos de GLA da invenção, um ou mais agonistas do receptor do tipo Toll (agonista de TLR). Os receptores do tipo Toll (TLR) incluem receptores transmembrana de superfície celular do sistema imune inato que conferem capacidade de reconhecimento em fase precoce às células hospedeiras para uma variedade de estruturas moleculares microbianas conservadas, tais como podem estar presentes em um grande número de patógenos infecciosos. (por exemplo, Armant et al., 2002 Genome Biol. 3(8): revisões 3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien et al., 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda et al., 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect. 6:1388; Datta et al., 2003 J. Immunol. 170:4102).

[090]A indução de transdução de sinal mediada por TLR para potencializar a iniciação de respostas imunes por intermédio do sistema imune inato pode ser efetuada por agonistas de TLR, que ligam TLR de superfície celular. Por exemplo, o lipopolissacarídeo (LPS) pode ser um agonista de TLR através de TLR2 ou TLR4 (Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Physiol. 286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206); poli(inosina-citidina) (poliI:C) pode ser um agonista de TLR através de TLR3 (Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119); sequências de CpG (oligodesoxinucleotídeos contendo citosina-guanosina não metilada ou motivos de dinucleotídeos “CpG”, por exemplo, CpG 7909, Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes et al., Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al., Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng et al., 2004 J. Immunol. 173:5148) podem ser agonistas de TLR através de TLR9 (Andaloussi et al., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol. 177:2373); peptidoglicanos podem ser agonistas de TLR2 e/ou TLR6 (Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol. 174:1566); 3M003 (4-amino-2-(etoximetil)-α,α-dimetil-6,7,8,9-tetra- hidro-1H-imidazo[4,5-c]quinolino-1-etanol hidratado, Mol. Wt. 318 Da da 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, que também é uma fonte dos compostos 3M001 e 3M002 relacionados; Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1259) pode ser um agonista de TLR7 (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) e/ou um agonista de TLR8 (Johansen 2005); flagelina pode ser um agonista de TLR5 (Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487); e antígenos da hepatite C podem atuar como agonistas de TLR através de TLR7 e/ou TLR9 (Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol. 42:724). Outros agonistas de TLR são conhecidos (por exemplo, Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5198) e podem ser usados, de acordo com certas modalidades presentemente descritas.

[091]Por exemplo, e por via de fundamentos (veja, por exemplo, Patente U.S. No 6.544.518), os oligonucleotídeos imunoestimuladores contendo dinucleotídeos de CpG não metilados (“CpG”) são conhecidos como adjuvantes quando administrados por vias sistêmicas e mucosas (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998. 160(2):870-876; McCluskie e Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG é uma abreviação para motivos de citosina-guanosina dinucleotídeo presentes no DNA. O papel central do motivo CG no imunoestímulo foi elucidado por Krieg, Nature 374, página 546, 1995. A análise detalhada mostrou que o motivo CG precisa estar em um determinado contexto de sequência, e que tais sequências são comuns no DNA bacteriano, mas são raras no DNA de vertebrados. A sequência imunoestimulante é frequentemente: Purina, Purina, C, G, pirimidina, em que o motivo CG de dinucleotídeo não é metilado, porém outras sequências de CpG não metiladas são conhecidas como imunoestimulantes e podem ser usadas em certas modalidades da presente invenção. CpG, quando formulado em vacinas, pode ser administrado em solução livre junto com antígeno livre (WO 96/02555; McCluskie e Davis, supra) ou covalentemente conjugado a um antígeno (Publicação PCT No WO 98/16247), ou formulado com um carreador, tal como hidróxido de alumínio (por exemplo, Davis et al., supra, Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).

[092]Os oligonucleotídeos preferidos para o uso em adjuvantes ou vacinas da presente invenção preferivelmente contêm dois ou mais motivos dinucleotídeo CpG separados por pelo menos três, mais preferivelmente, pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Os oligonucleotídeos da presente invenção são tipicamente desoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida, o internucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato ou, mais preferivelmente, uma ligação fosforotioato, embora fosfodiéster e outras ligações internucleotídeos estejam dentro do escopo da invenção, incluindo oligonucleotídeos com ligações internucleotídeos mistas. Métodos para produzir fosforotioatos oligonucleotídeos ou fosforoditioato são descritos nas Patentes U.S. Nos 5.666.153, 5.278.302 e WO 95/26204.

[093]Exemplos de oligonucleotídeos preferidos têm sequências que são divulgadas nas seguintes publicações; para certas modalidades divulgadas neste relatório, as sequências contêm, preferivelmente, ligações internucleotídeos modificadas com fosforotioato:

[094]CPG 7909: Cooper et al., “CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults.” AIDS, 2005 Sep 23;19(14):1473-9.

[095]CpG 10101: Bayes et al., “Gateways to clinical trials.” Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 2005 Apr; 27(3): 193-219.

[096]Vollmer J., “Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9.” Expert Opinion on Biological Therapy. Maio 2005; 5(5): 673-682.

[097]Os oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender variantes das sequências preferidas descritas nas publicações citadas acima que diferem em substituições, inserções, deleções e/ou adições de sequências de nucleotídeos secundárias nas mesmas. Os oligonucleotídeos CpG utilizados em certas modalidades da presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automático. Os oligonucleotídeos são tipicamente desoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida, a ligação internucleotídeos no oligonucleotídeo é fosforoditioato ou, mais preferivelmente, ligação fosforotioato, embora fosfodiésteres também estejam dentro do escopo das modalidades presentemente consideradas. Os oligonucleotídeos compreendendo ligações internucleotídeos diferentes também são considerados, por exemplo, fosforotioato fosfodiésteres mistos. Outras ligações internucleotídeos que estabilizam o oligonucleotídeo também podem ser usadas. Coadjuvante

[098]Certas modalidades fornecidas neste relatório incluem composições de vacina e composições de adjuvante imunológicas, incluindo composições farmacêuticas, que contêm, além dos compostos de GLA, pelo menos um coadjuvante, que se refere a um componente de tais composições que tem atividade de adjuvante, mas difere de GLA. Um coadjuvante que apresenta tal atividade de adjuvante inclui uma composição que, quando administrada a um paciente, tal como um ser humano (por exemplo, um paciente humano), um primata não humano, um mamífero ou um outro organismo eucariótico superior que apresenta um sistema imune reconhecido, é capaz de alterar (isto é, aumentar ou diminuir, em uma maneira estatisticamente significante, e, em certas modalidades preferidas, acentuar ou aumentar) a potência e/ou longevidade de uma resposta imune. (Veja, por exemplo, Powell e Newman, “Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Method”, 1995, Plenum Press, Nova Iorque). Em certas modalidades divulgadas neste relatório, GLA e um antígeno desejado e, opcionalmente, um ou mais coadjuvantes, podem alterar, por exemplo, induzir ou acentuar, uma resposta imune que é dirigida contra o antígeno desejado que pode ser administrado ao mesmo tempo de GLA ou pode ser separado em tempo e/ou espaço (por exemplo, em um sítio anatômico diferente) em sua administração, mas certas modalidades da invenção não são limitantes e, desse modo, também consideram a administração de GLA em uma composição que não inclui um antígeno especificado, mas que também pode incluir um ou mais agonistas de TLR, um coadjuvante, um modificador de resposta imune de imidazoquinlina e um imunomodificador em forma de anel de hélice dupla (dSLIM).

[099]Consequentemente, e conforme observado acima, os coadjuvantes incluem composições, exceto GLA, que têm efeitos adjuvantes, tais como saponinas e miméticos de saponina, incluindo miméticos de QS21 e QS21 (veja, por exemplo, Patente U.S. No 5.057.540; EP 0 362 279 B1; WO 95/17210), alume, alcaloides de plantas, tais como tomatina, detergentes, tais como (mas não limitados a) saponina, polissorbato 80, Span 85 e estearil tirosina, uma ou mais citocinas (por exemplo, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, TNF-alfa, IFN-gama), um modificador de resposta imune de imidazoquinolina e um imunomodificador em forma de anel de hélice dupla (dSLIM, por exemplo, Weeratna et al., 2005 Vaccine 23:5263).

[0100]Detergentes, incluindo saponinas, são mostrados, por exemplo, na Patente U.S. 6.544.518; Lacaille-Dubois, M e Wagner H. (1996 Phytomedicine 2:363-386), Patente U.S. No 5.057.540 , Kensila, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55, e EP 0 362 279 B1. Estruturas particuladas, denominadas Complexos Imunoestimulantes (ISCOMS), compreendendo frações de Quil A (saponina) são hemolíticos e foram usados na fabricação de vacinas (Morein, B., EP 0 109 942 B1). Foi relatado que estas estruturas têm atividade de adjuvante (EP 0 109 942 B1; WO 96/11711). As saponinas hemolíticas QS21 e QS17 (frações purificadas por HPLC de Quil A) foram descritas como adjuvantes sistêmicos potentes, e o método de sua produção é divulgado na Patente U.S. No 5.057.540 e EP 0 362 279 B1. Também descrito nestas referências é o uso de QS7 (uma fração não hemolítica de Quil A) que atua como um adjuvante potente para vacinas sistêmicas. O uso de QS21 é ainda descrito em Kensil et al., (1991. J. Immunology 146:431-437). Combinações de QS21 e polissorbato ou ciclodextrina também são conhecidas (WO 99/10008). Sistemas de adjuvantes particulados compreendendo frações de QuilA, tais como QS21 e QS7, são descritos no WO 96/33739 e WO 96/11711. Outras saponinas que foram usadas em estudos sistêmicos de vacinação incluem aquelas derivadas de outras espécies de plantas, tais como Gypsophila e Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

[0101]Escina é um outro detergente relacionado às saponinas para o uso nas composições de adjuvante das modalidades neste relatório divulgado. Escina é descrita no índice da Merck (12a Ed.: registro de entrada 3737) como uma mistura de saponina que ocorre na semente do castanheiro de cavalo (horse chestnut tree), Aesculus hippocastanum. Seu isolamento é descrito através de cromatografia e purificação (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), e através de resinas de troca iônica (Erbring et a/., Patente U.S. No 3.238.190). Frações de escina (também conhecida como aescina) foram purificadas e foi mostrado que as mesmas são biologicamente ativas (Yoshikawa M, et al., (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Agosto; 44(8): 1454-1464)). A digitonina é um outro detergente, também descrito no índice da Merck (12a Ed., registro de entrada 3204) como uma saponina, derivada das sementes de Digitalis purpurea e purificada, de acordo com o procedimento descrito por Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664; e Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621.

[0102]Outros coadjuvantes para o uso, de acordo com certas modalidades divulgadas neste relatório, incluem um copolímero em bloco ou polímero biodegradável, que se refere a uma classe de compostos poliméricos com os quais aqueles na técnica relevante serão familiares. Exemplos de um copolímero em bloco ou polímero biodegradável que pode ser incluído em uma composição de vacina de GLA ou um adjuvante imunológico GLA incluem Pluronic® L121 (BASF Corp., Mount Oliva, NJ; veja, por exemplo, Yeh et al., 1996 Pharm. Res. 13:1693; Patente U.S. No 5.565.209), CRL1005 (por exemplo, Triozzi et al., 1997 Clin Canc. Res. 3:2355), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), poli(ácido láctico) (PLA), poli-(D,L-lactídeo-co- glicolídeo) (PLG), e poliI:C. (Veja, por exemplo, Powell e Newman, “Vaccine design - The Subunit and Adjuvante Approach”, 1995, Plenum Press, Nova Iorque).

[0103]Certas modalidades consideram vacinas de GLA e adjuvantes imunológicos GLA que incluem um óleo, que em tais modalidades podem contribuir para a coatividade de adjuvante e, em outras modalidades, podem adicional ou alternativamente fornecer um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Qualquer número de óleos adequados é conhecido e pode ser selecionado para inclusão em composições de vacina e composições de adjuvantes imunológicos com base na presente divulgação. Exemplos de tais óleos, por via de ilustração e não limitação, incluem esqualeno, óleo mineral, óleo de oliva, colesterol e um mono- oleato de manida.

[0104]Modificadores de resposta imune, tais como modificadores de resposta imune de imidazoquinolina, também são conhecidos na técnica e também podem ser incluídos como coadjuvantes em certas modalidades presentemente divulgadas. Certos modificadores de resposta imune de imidazoquinolina preferidos incluem, por via de exemplo não limitante, resiquimode (R848), imiquimode e gardiquimode (Hemmi et al., 2002 Nat. Immunol. 3:196; Gibson et al., 2002 Cell. Immunol. 218:74; Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1259); estes e outros modificadores de resposta imune de imidazoquinolina também podem, sob condições apropriadas, apresentar atividade agonista de TLR, conforme descrito neste relatório. Outros modificadores de resposta imune são os imunomodificadores em forma de anel de hélice dupla com base em ácidos nucleicos (dSLIM). Exemplos específicos de dSLIM que são considerados para o uso em certas modalidades presentemente divulgadas podem ser encontrados em Schmidt et al., 2006 Allergy 61:56; Weihrauch et al.. 2005 Clin Cancer Res. 11(16):5993-6001; Modern Biopharmaceuticals, J. Knablein (Editor). John Wiley & Sons, 6 de Dezembro de 2005. (dSLIM debatidos nas páginas 183 a ~200), e a partir de Mologen AG (Berlin, FRG: [obtido on-line em 8/18/06 em http://www.mologen.com/English/04.20- dSLIM.shtml].

[0105]Conforme também observado acima, um tipo de coadjuvante para o uso com GLA, conforme descrito neste relatório, pode ser o coadjuvante de alumínio, que é, em geral, referido como “alume.” Coadjuvantes de alume são fundamentados nos seguintes: óxi-hidróxido de alumínio; hidroxifosfoato de alumínio; ou vários sais próprios. Vacinas que utilizam coadjuvantes de alume podem incluir vacinas para cepas de tétano, HPV, hepatite A, poliovírus inativado e outros antígenos, conforme descrito neste relatório. Os coadjuvantes de alume são vantajosos, pois eles têm um registro de segurança satisfatório, respostas de anticorpos aumentada, antígenos estabilizados e são relativamente simples para produção em larga escala. (Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21:129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2:370-383.)

[0106]Outros coadjuvantes que podem ser combinados com GLA para estímulo imune eficaz incluem saponinas e miméticos de saponina, incluindo QS21 e compostos estruturalmente relacionados que conferem efeitos similares e referidos neste relatório como miméticos de QS21. QS21 foi reconhecido como um coadjuvante preferido. QS21 pode compreender uma fração não tóxica purificada por HPLC derivada da casca de árvore de Quillaja Saponaria Molina. A produção de QS21 é divulgada na Patente U.S. No 5.057.540. (Veja também as Patentes U.S. Nos 6.936.255, 7.029.678 e 6.932.972.)

[0107]GLA, em certas modalidades, também pode ser combinado com “complexos imunoestimulantes” conhecidos como ISCOMS (por exemplo, Patentes U.S. Nos 6.869.607, 6.846.489, 6.027.732, 4.981.684), incluindo ISCOMATRIX® derivado de saponina, que é comercialmente disponível, por exemplo, a partir da Iscotec (Estocolmo, Suécia) e CSL Ltd. (Parkville, Victoria, Austrália). Constructo de Expressão Recombinante

[0108]De acordo com certas modalidades divulgadas neste relatório, a composição de vacina de GLA pode conter pelo menos um constructo de expressão recombinante que compreende um promotor ligado de maneira operável a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um antígeno. Em outras modalidades, o constructo de expressão recombinante está presente em um vetor viral, tal como um vetor de adenovírus, vírus adeno-associado, herpesvírus, lentivírus, poxvírus ou retrovírus. Composições e métodos para fabricar e usar tais constructos e vetores de expressão são conhecidos na técnica, para a expressão de antígenos polipeptídicos, conforme fornecido neste relatório, por exemplo, de acordo com Ausubel et al., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NY. Exemplos não limitantes de constructos de expressão recombinante, em geral, podem ser encontrados, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 6.844.192; 7.037.712; 7.052.904; 7.001.770; 6.106.824; 5.693.531; 6.613.892; 6.875.610; 7.067.310; 6.218.186; 6.783.981; 7.052.904; 6.783.981; 6.734.172; 6.713.068; 5.795.577 e 6.770.445 e em outros documentos, com ensinamentos que podem ser adaptados à expressão de antígenos polipeptídicos, conforme fornecido neste relatório, para o uso em certas modalidades presentemente divulgadas. Resposta Imune

[0109]A invenção fornece composições para alterar (isto é, aumentar ou diminuir em uma maneira estatisticamente significante, por exemplo, em relação a um controle apropriado como será familiar a pessoas habilitadas na técnica) respostas imunes em um hospedeiro capaz de elevar uma resposta imune. Conforme será conhecido a pessoas habilitadas na técnica, uma resposta imune pode ser qualquer alteração ativa do estado imune de um hospedeiro, que pode incluir qualquer alteração na estrutura ou função de um ou mais tecidos, órgãos, células ou moléculas que participam na manutenção e/ou regulação de estado imune do hospedeiro. Tipicamente, as respostas imunes podem ser detectadas por uma variedade de parâmetros bem conhecidos, incluindo, mas não limitados à determinação in vivo ou in vitro de: imunoglobulinas ou anticorpos solúveis; mediadores solúveis, tais como citocinas, linfocinas, quimiocinas, hormônios, fatores de crescimento e semelhantes, assim como outros pequenos peptídeos solúveis, carboidratos, nucleotídeos e/ou mediadores lipídicos; mudanças de estado de ativação celular, conforme determinado por propriedades funcionais ou estruturais alteradas de células do sistema imune, por exemplo, proliferação celular, motilidade alterada, indução de atividades especializadas, tais como expressão gênica específica ou comportamento citolítico; diferenciação celular através de células do sistema imune, incluindo perfis de expressão superficial de antígeno alterados ou o início de apoptose (morte celular programada); ou qualquer outro critério pelo qual a presença de uma resposta imune pode ser detectada.

[0110]Frequentemente, respostas imunes podem ser observadas, por exemplo, como diferenciação entre estruturas próprias e não próprias pelas células e tecidos de um sistema imune do hospedeiro nos níveis moleculares e celulares, mas a invenção não deve ser, desse modo, limitada. Por exemplo, as respostas imunes também podem incluir mudanças do estado do sistema imune que resultam do reconhecimento imune de moléculas, células ou tecidos próprios, quando podem se associar a qualquer número de condições normais, tais como regulação típica de componentes do sistema imune, ou quando podem estar presentes em condições patológicas, tais como as respostas autoimunes inadequadas observadas em doenças autoimunes e degenerativas. Como um outro exemplo, além da indução através da suprarregulação de atividades particulares do sistema imune (tais como produção de anticorpos e/ou citocinas, ou ativação da imunidade mediada por células), as respostas imunes também podem incluir supressão, diminuição ou qualquer outra infrarregulação de imunidade detectável, que podem ser a consequência do antígeno selecionado, da via de administração do antígeno, indução de tolerância específica ou outros fatores.

[0111]A determinação da indução de uma resposta imune pelas vacinas da presente invenção pode ser estabelecida por vários ensaios imunológicos bem conhecidos com os quais aqueles habilitados na técnica serão familiares. Tais ensaios incluem, mas não são limitados a, determinação in vivo ou in vitro de: anticorpos solúveis; mediadores solúveis, tais como citocinas, linfocinas, quimiocinas, hormônios, fatores de crescimento e semelhantes assim como outros pequenos peptídeos solúveis, carboidratos, nucleotídeos e/ou mediadores lipídicos; mudanças de estado de ativação celular, conforme determinado por propriedades funcionais ou estruturais alteradas de células do sistema imune, por exemplo, proliferação celular, motilidade alterada, indução de atividades especializadas, tais como expressão gênica específica ou comportamento citolítico; diferenciação celular através de células do sistema imune, incluindo perfis de expressão superficial de antígeno alterados ou o início de apoptose (morte celular programada). Procedimentos para realizar estes e outros ensaios similares são amplamente conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, em Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; veja, também, Current Protocols in Immunology; veja, além disso, por exemplo, Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell e Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green e Reed, 1998 Science 281:1309 e referências citadas nos mesmos).

[0112]A detecção da proliferação de células T reativas ao antígeno pode ser realizada através de uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, a proliferação de células T pode ser detectada através da medição da taxa de síntese de DNA, e a especificidade do antígeno pode ser determinada através do controle dos estímulos (tais como, por exemplo, células apresentadoras de antígeno pulsadas com antígeno específico desejado ou um antígeno controle) aos quais as células T reativas ao antígeno candidato são expostas. As células T que foram estimuladas quanto à proliferação exibem uma taxa aumentada de síntese de DNA. Uma maneira típica para medir a taxa de síntese de DNA, por exemplo, se dá através de culturas de marcação de pulso de células T com timidina tritiada, um precursor de nucleosídeo que é incorporado em DNA recém sintetizado. A quantidade de timidina tritiada incorporada pode ser determinada através do uso de um espectrofotômetro de cintilação líquida. Outras maneiras para detectar a proliferação de células T incluem medir os aumentos na produção de interleucina-2 (IL-2), fluxo de Ca2+, ou absorção de pigmento, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil-tetrazólio. Alternativamente, a síntese de linfocinas (tais como interferon gama) pode ser medida ou o número relativo de células T que pode responder a um antígeno particular pode ser quantificado.

[0113]A detecção de produção de anticorpos específicos do antígeno pode ser obtida, por exemplo, através da avaliação de uma amostra (por exemplo, uma amostra contendo imunoglobulina, tal como soro, plasma ou sangue) a partir de um hospedeiro tratado com uma vacina, de acordo com a presente invenção, através do uso de metodologias in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA), ensaios imunossorventes ligados por enzimas (ELISA), diálise de equilíbrio ou immunoblotting em fase sólida, incluindo Western blotting. Em modalidades preferidas, ensaios ELISA podem incluir imobilização de captura de antígeno do antígeno alvo com um anticorpo monoclonal em fase sólida específico para o antígeno, por exemplo, para acentuar a sensibilidade do ensaio. A elaboração de mediadores solúveis (por exemplo, citocinas, quimiocinas, linfocinas, prostaglandinas, etc.) também pode ser facilmente determinada através do ensaio imunossorvente ligado por enzimas (ELISA), por exemplo, usando métodos, aparelho e reagentes que são facilmente disponíveis a partir de fontes comerciais (por exemplo, Sigma, St. Louis, MO; veja, também, R & D Systems 2006 Catalog, R & D Systems, Mineápolis, MN).

[0114]Qualquer número de outros parâmetros imunológicos pode ser monitorado através do uso de ensaios de rotina que são bem conhecidos na técnica. Estes podem incluir, por exemplo, ensaios de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), respostas do anticorpo in vitro secundárias, análise imunocitofluorimétrica de fluxo de várias subpopulações de sangue periférico ou células mononucleares linfoides através do uso de sistemas de antígeno marcador bem estabelecidos, imuno-histoquímica ou outros ensaios relevantes. Estes e outros ensaios podem ser encontrados, por exemplo, em Rose et al., (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5a Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC.

[0115]Consequentemente, é considerado que a vacina e composições de adjuvante fornecidas neste relatório serão capazes de induzir ou acentuar em um hospedeiro pelo menos uma resposta imune que é selecionada a partir de uma resposta de linfócitos T tipo TH1, uma resposta de linfócitos T do tipo TH2, uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL), uma resposta de anticorpos, uma resposta de citocinas, uma resposta de linfocinas, uma resposta de quimiocinas e uma resposta inflamatória. Em certas modalidades, a resposta imune pode compreender pelo menos a produção de uma pluralidade de citocinas, em que a citocina é selecionada a partir de interferon gama (IFN-Y), fator de necrose tumoral alfa (TNF- α), produção de uma pluralidade de interleucinas, em que a interleucina é selecionada a partir de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 e IL-23, produção de uma pluralidade de quimiocinas, em que a quimiocina é selecionada a partir de MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCL4 e CCL5, e uma resposta linfocítica que é selecionada a partir de uma resposta de células T de memória, uma resposta de células B de memória, uma resposta de células T efetoras, uma resposta de células T citotóxicas e uma resposta de células B efetoras. Veja, por exemplo, WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; U.S. 6.692.752; U.S. 7.084.256; U.S. 6.977.073; U.S. 6.749.856; U.S. 6.733.763; U.S. 6.797.276; U.S. 6.752.995; U.S. 6.057.427; U.S. 6.472.515; U.S. 6.309.847; U.S. 6.969.704; U.S. 6.120.769; U.S. 5.993.800; U.S. 5.595.888; Smith et al., 1987 J Biol Chem. 262:6951; Kriegler et al., 1988 Cell 53:45 53; Beutler et al., 1986 Nature 320:584; U.S. 6.991.791; U.S. 6.654.462; U.S. 6.375.944. Composições Farmacêuticas

[0116]As composições farmacêuticas, em geral, compreendem pelo menos um composto de GLA da invenção, e podem ainda compreender um ou mais componentes fornecidos neste relatório que são selecionados, por exemplo, a partir do antígeno, agonista de TLR, coadjuvante (incluindo, opcionalmente, uma citocina, um modificador de resposta imune de imidazoquinolina e/ou um dSLIM), e/ou um constructo de expressão recombinante, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0117]Portanto, em certos aspectos, a presente invenção é direcionada à “monoterapia” de GLA, em que GLA, conforme descrito neste relatório, é formulado em uma composição que é substancialmente desprovida de outros antígenos, e é administrada a um paciente, de modo a estimular uma resposta imune, por exemplo, uma resposta imune não específica, para o propósito de tratar ou prevenir uma doença ou outra condição, tal como tratar uma infecção em um organismo, tratar rinite sazonal ou semelhantes. Em uma modalidade, por exemplo, as composições e métodos da invenção utilizam um composto de GLA para estimular uma resposta imune em um paciente. Em uma outra modalidade, o GLA está na forma de uma pulverização, opcionalmente, fornecida em um kit.

[0118]O GLA pode ser, preferivelmente, formulado em uma emulsão estável. Em uma modalidade particular, por exemplo, uma composição é fornecida compreendendo um composto de GLA da invenção em uma emulsão estável substancialmente desprovida de outros antígenos.

[0119]Em outras modalidades, a composição farmacêutica é uma composição de vacina que compreende GLA e um antígeno e pode ainda compreender um ou mais componentes, conforme fornecido neste relatório, que são selecionados a partir do agonista de TLR, coadjuvante (incluindo, por exemplo, uma citocina, um modificador de resposta imune de imidazoquinolina e/ou um dSLIM) e semelhantes e/ou um constructo de expressão recombinante, em combinação com um carreador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0120]Carreadores ilustrativos não serão tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações utilizadas. Para vacinas com base em GLA e ácido nucleico, ou para vacinas compreendendo GLA e um antígeno, cerca de 0,001 μg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo, em geral, serão administrados, tipicamente, através da via intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intravenosa, ou através de outras vias.

[0121]Em uma modalidade mais específica, a dosagem é de cerca de 0,001 μg/kg a cerca de 1 mg/kg. Em uma outra modalidade específica, a dosagem é de cerca de 0,001 a cerca de 50 μg/kg. Em uma outra modalidade específica, a dosagem é de cerca de 0,001 a cerca de 15 μg/kg.

[0122]Em uma outra modalidade específica, a quantidade de GLA administrado é de cerca de 0,01 μg/dose a cerca de 5 mg/dose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de GLA administrado é de cerca de 0,1 μg/dose a cerca de 1 mg/dose. Em uma outra modalidade específica, a quantidade de GLA administrado é de cerca de 0,1 μg/dose a cerca de 100 μg/dose. Em uma outra modalidade específica, o GLA administrado é de cerca de 0,1 μg/dose a cerca de 10 μg/dose.

[0123]Será evidente àqueles habilitados na técnica que o número e frequência de administração serão dependentes da resposta do hospedeiro. “Carreadores farmaceuticamente aceitáveis” para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Por exemplo, solução salina estéril e solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico podem ser usadas. Preservantes, estabilizadores, corantes e outros agentes flavorizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Por exemplo, benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico podem ser adicionados como preservantes. Id. em 1449. Além disso, antioxidantes e agentes de suspensão podem ser usados. Id.

[0124]“Sal farmaceuticamente aceitável” se refere a sais dos compostos da presente invenção derivados da combinação de tais compostos e um ácido orgânico ou inorgânico (sais de adição de ácido) ou uma base orgânica ou inorgânica (sais de adição de base). As composições da presente invenção podem ser usadas nas formas de base livre ou sal, com as duas formas consideradas dentro do escopo da presente invenção.

[0125]As composições farmacêuticas podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um sólido, líquido ou gás (aerossol). Vias típicas de administração incluem, sem limitação, administração oral, tópica, parenteral (por exemplo, sublingual ou bucal), sublingual, retal, vaginal e intranasal (por exemplo, como uma pulverização). O termo parenteral, conforme usado neste relatório, inclui administração iontoforética (por exemplo, U.S. 7.033.598; 7.018.345; 6.970.739), sonoforética (por exemplo, U.S. 4.780.212; 4.767.402; 4.948.587; 5.618.275; 5.656.016; 5.722.397; 6.322.532; 6.018.678), térmica (por exemplo, U.S. 5.885.211; 6.685.699), transdérmica passiva (por exemplo, U.S. 3.598.122; 3.598.123; 4.286.592; 4.314.557; 4.379.454; 4.568.343; 5.464.387; Relatório Descritivo de Patente UK No 2232892; U.S. 6.871.477; 6.974.588; 6.676.961), microagulhas (por exemplo, U.S. 6.908.453; 5.457.041; 5.591.139; 6.033.928) e também injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intraesternais, intracavernodas, intratecais, intrameatal, intrauretral, técnicas de injeção ou infusão. Em uma modalidade particular, uma composição descrita neste relatório (incluindo composições de vacina e farmacêuticas) é intradermicamente administrada através de uma técnica selecionada a partir de iontoforese, microcavitação, sonoforese ou microagulhas.

[0126]A composição farmacêutica é formulada, de modo a permitir que os ingredientes ativos contidos na mesma estejam biodisponíveis sob administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um paciente tomam a forma de uma ou mais unidades de dosagem, onde, por exemplo, um tablete pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um ou mais compostos da invenção na forma de aerossol pode manter uma pluralidade de unidades de dosagem.

[0127]Para administração oral, um excipiente e/ou aglutinante podem estar presentes. Exemplos são sacarose, caulim, glicerina, dextrinas de amido, alginato de sódio, carboximetilcelulose e etilcelulose. Agentes corantes e/ou flavorizantes podem estar presentes. Um revestimento pode ser utilizado.

[0128]A composição pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para liberação através de injeção, como dois exemplos. Quando intencionadas para administração oral, as composições preferidas contêm um ou mais entre agentes adoçantes, preservantes, pigmentos/corantes e realçadores de flavor. Em uma composição intencionada para administração através de injeção, um ou mais entre tensoativos, preservantes, agentes umectantes, agentes dispersantes, agentes de suspensão, tampões, estabilizadores e agentes isotônicos podem ser incluídos.

[0129]Uma composição farmacêutica líquida usada neste relatório, se for apresentada na forma de uma solução, suspensão ou outra forma parecida, pode incluir um ou mais entre os seguintes carreadores ou excipientes: diluentes estéreis, tais como água para injeção, solução salina, preferivelmente, solução salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, tais como esqualeno, óleo mineral, um mono-oleato de manida, colesterol e/ou mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como o solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetra-acético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode estar envolvida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses fabricados a partir de vidro ou plástico. Uma composição farmacêutica injetável é preferivelmente estéril.

[0130]Em uma modalidade particular, uma composição farmacêutica ou vacina da invenção compreende uma suspensão aquosa estável com menos do que 0,2 μm e compreende ainda pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de fosfolipídios, ácidos graxos, tensoativos, detergentes, saponinas, lipídios fluorados e semelhantes.

[0131]Em uma outra modalidade, uma composição da invenção é formulada em uma maneira que pode ser aerossolizada.

[0132]Também pode ser desejável incluir outros componentes em uma composição de vacina ou farmacêutica, tais como veículos de liberação, incluindo, mas não limitados a sais de alumínio, emulsões água em óleo, veículos oleosos biodegradáveis, emulsões óleo em água, microcápsulas biodegradáveis e lipossomas. Exemplos de substâncias imunoestimulantes adicionais (coadjuvantes) para o uso em tais veículos também são descritos acima e podem incluir N- acetilmuramil-L-alanina-D-isoglutamina (MDP), glicano, IL-12, GM-CSF, interferon gama e IL-12.

[0133]Embora qualquer carreador adequado conhecido àqueles de habilidade comum na técnica possa ser utilizado nas composições farmacêuticas desta invenção, o tipo de carreador variará dependendo do modo de administração e se uma liberação sustentada for desejada. Para administração parenteral, tal como injeção subcutânea, o carreador, preferivelmente, compreende água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para a administração oral, qualquer um entre os carreadores acima ou um carreador sólido, tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de magnésio, podem ser utilizados. Microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactídeo poliláctico) também podem ser utilizadas como carreadores para as composições farmacêuticas desta invenção. Microesferas biodegradáveis adequadas são divulgadas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 4.897.268 e 5.075.109. Neste respeito, é preferível que a microesfera seja maior do que aproximadamente 25 mícrons.

[0134]As composições farmacêuticas (incluindo vacinas de GLA e adjuvantes GLA imunológicos) também podem conter diluentes, tais como tampões, antioxidantes, tais como ácido ascórbico, polipeptídeos de baixo peso molecular (menores do que cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, carboidratos incluindo glicose, sacarose ou dextrinas, agentes quelantes, tais como EDTA, glutationa e outros estabilizadores e excipientes. Solução salina tamponada neutra ou solução salina mista com albumina de soro não específica são diluentes apropriados exemplares. Preferivelmente, o produto pode ser formulado como um liofilizado usando soluções de excipiente apropriado (por exemplo, sacarose) como diluentes.

[0135]Conforme descrito acima, em certas modalidades a invenção objeto inclui composições capazes de liberar moléculas de ácidos nucleicos que codificam antígenos desejados. Tais composições incluem vetores virais recombinantes (por exemplo, retrovírus (veja WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 e WO 94/03622), adenovírus (veja Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5:130-134, 1993; e Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994), poxvírus (veja Patente U.S. No 4.769.330; Patente U.S. No 5.017.487; e WO 89/01973)), moléculas de ácidos nucleicos de constructo de expressão recombinante complexadas a uma molécula policatiônica (veja WO 93/03709), e ácidos nucleicos associados com lipossomas (veja Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987). Em certas modalidades, o DNA pode ser ligado para matar ou inativar o adenovírus (veja Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992). Outras composições adequadas incluem DNA-ligante (veja Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989) e combinações lipídio-DNA (veja Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989).

[0136]Além dos procedimentos in vivo diretos, os procedimentos ex vivo podem ser usados, nos quais as células são removidas a partir de um hospedeiro, modificadas e colocadas no mesmo ou em um outro animal hospedeiro. Será evidente que uma pessoa habilitada na técnica pode utilizar qualquer uma das composições observadas acima para a introdução de moléculas de ácido nucleico que codificam antígenos em células de tecido em um contexto ex vivo. Os protocolos para os métodos virais, físicos e químicos de absorção são bem conhecidos na técnica.

[0137]Consequentemente, a presente invenção é útil para acentuar ou induzir, em um hospedeiro, um paciente ou em cultura celular, uma resposta imune. Conforme usado neste relatório, o termo “paciente” se refere a qualquer animal de sangue quente, preferivelmente um ser humano. Um paciente pode ser afligido com uma doença infecciosa, câncer, tal como câncer de mama ou uma doença autoimune, ou pode ser normal (isto é, livre de doença e/ou infecção detectável). Uma “cultura celular” é qualquer preparação contendo células imunocompetentes ou células isoladas do sistema imune (incluindo, mas não limitadas a, células T, macrófagos, monócitos, células B e células dendríticas). Tais células podem ser isoladas por uma variedade de técnicas bem conhecidas àqueles de habilidade comum no ramo (por exemplo, centrifugação em densidade por Ficoll-hypaque). As células podem (mas não precisam) ser isoladas a partir de um paciente afligido com câncer, e podem ser reintroduzidas em um paciente depois do tratamento.

[0138]Em certas modalidades, uma composição líquida intencionada para administração parenteral ou oral deve conter uma quantidade de composição de vacina de GLA, tal que uma dosagem adequada seja obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos 0,01 % em peso de um antígeno na composição. Quando intencionada para administração oral, esta quantidade pode variar entre 0,1 % e cerca de 70 % do peso da composição. As composições orais preferidas contêm entre cerca de 4 % e cerca de 50 % do antígeno. As composições e preparações preferidas são preparadas, de modo que uma unidade de dosagem parenteral contenha entre 0,01 a 1 % em peso de composição ativa.

[0139]A composição farmacêutica pode ser intencionada para administração tópica, caso este em que o carreador pode compreender adequadamente uma solução, emulsão, unguento ou base de gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais entre os seguintes: petrolato, lanolina, polietilenoglicóis, cera virgem, óleo mineral, diluentes, tais como água e álcool, e emulsificadores e estabilizadores. Agentes espessantes podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se intencionada para administração transdérmica, a composição pode incluir um emplastro transdérmico ou dispositivo de iontoforese. As formulações tópicas podem conter uma concentração do antígeno (por exemplo, composição de vacina de GLA-antígeno) ou GLA (por exemplo, composição imunológica adjuvante; GLA está disponível a partir da Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; por exemplo, produto no 699800) de cerca de 0,1 a cerca de 10 % p/v (peso por volume).

[0140]A composição pode ser intencionada para a administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório que se fundirá no reto e liberará o fármaco. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietilenoglicol. Nos métodos da invenção, as composições de vacina/adjuvantes podem ser administradas através do uso de insertos, pérolas, formulações de liberação programada, emplastros ou formulações de liberação rápida.

[0141]Também considerados em certas modalidades são os kits compreendendo as composições de vacina de GLA e/ou composições de adjuvantes imunológicas GLA descritas neste relatório, que podem ser fornecidas em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, todos os componentes das composições de vacina de GLA e/ou composições de adjuvantes imunológicas GLA estão presentes em um único recipiente, porém as modalidades da invenção não são intencionadas a serem limitadas e também consideram dois ou mais recipientes em que, por exemplo, uma composição de adjuvante imunológica GLA é separada e não está em contato com o componente de antígeno. Por via de teoria não limitante, acredita-se que, em alguns casos, a administração sozinha da composição de adjuvante imunológica GLA pode ser vantajosamente realizada, embora, em outros casos, tal administração pode ser vantajosamente temporária e/ou espacialmente separada (por exemplo, em um sítio anatômico diferente) a partir da administração do antígeno, embora, em outros casos, a administração ao paciente seja vantajosamente conduzida de uma composição de vacina de GLA, conforme descrito neste relatório, e contendo tanto o antígeno quanto o GLA, e opcionalmente outros componentes descritos neste relatório.

[0142]Um recipiente, de acordo com tais modalidades de kit, pode ser qualquer recipiente adequado, vaso, frasco, ampola, tubo, copo, caixa, garrafa, jarra, placa, poço de um aparelho de poço único ou de múltiplos poços, reservatório, tanque ou semelhantes, ou outro dispositivo em que as composições divulgadas neste relatório podem ser colocadas, armazenadas e/ou transportadas, e acessadas para remover os conteúdos. Tipicamente, tal recipiente pode ser feito de um material que é compatível com o uso intencionado e a partir do qual a recuperação dos conteúdos contidos pode ser facilmente obtida. Os exemplos preferidos de tais recipientes incluem tubos e ampolas vedados, ou que podem ser novamente vedados, de vidro e/ou plástico, incluindo aqueles que apresentam um septo de borracha ou outro meio de vedação que é compatível com a retirada dos conteúdos através do uso de uma agulha e seringa. Tais recipientes, por exemplo, podem ser feitos de vidro ou um plástico ou resina quimicamente compatível, que pode ser feita de, ou pode ser revestida com um material que permite recuperação eficaz do material a partir do recipiente e/ou protege o material, por exemplo, a partir das condições degradantes, tais como luz ultravioleta ou temperaturas extremas, ou a partir da introdução de contaminantes indesejáveis, incluindo contaminantes microbianos. Os recipientes são preferivelmente estéreis ou esterilizáveis, e feitos de materiais que serão compatíveis com qualquer carreador, excipiente, solvente, veículo ou semelhantes, tais como podem ser usados para suspender ou dissolver as composições de vacina e/ou composições de adjuvante imunológicas e/ou antígenos e/ou constructos de expressão recombinante descritos neste relatório, etc.

[0143]Sistemas de emulsão também podem ser usados em composições de formulação da presente invenção. Por exemplo, diversos sistemas de emulsão únicos ou de múltiplas fases foram descritos. Emulsões adjuvantes de óleo em água por si foram sugeridas como úteis para composição de adjuvante (EP 0 399 843B), além disso, combinações de emulsões de óleo em água e outros agentes ativos foram descritos como adjuvantes para vacinas (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Outras emulsões adjuvantes oleosas foram descritas, tais como as emulsões de água em óleo (Patente U.S. No 5.422.109; EP 0 480 982 B2) e emulsões de óleo em água (Patente U.S. No 5.424.067; EP 0 480 981 B). As emulsões adjuvantes oleosas para o uso na presente invenção podem ser naturais ou sintéticas e podem ser minerais ou orgânicas. Exemplos de óleos minerais e orgânicos serão facilmente evidentes a uma pessoa habilitada na técnica.

[0144]Em uma modalidade particular, uma composição da invenção compreende uma emulsão de óleo em água, em que o GLA é incorporado na fase oleosa. Em uma outra modalidade, uma composição da invenção compreende uma emulsão de óleo em água, em que o GLA é incorporado na fase oleosa e em que um componente adicional está presente, tal como um coadjuvante, agonista de TLR, ou semelhantes, conforme descrito neste relatório.

[0145]Para qualquer composição de óleo em água adequada para a administração a seres humanos, a fase oleosa do sistema de emulsão preferivelmente compreende um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem conhecido na técnica. Metabolizável pode ser definido como “capaz de ser transformado por metabolismo” (Dorland’s illustrated Medical Dictionary, W. B. Saunders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou sintético, que não seja tóxico ao receptor e seja capaz de ser transformado por metabolismo. Nozes (tais como óleo de amendoim), sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéticos também são parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis, tais como NEOBEE® e outros.

[0146]Esqualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosa- hexaeno), por exemplo, é um óleo insaturado que é encontrado em grandes quantidades no óleo de fígado de tubarão e, em menores quantidades, em óleo de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura, e é um óleo particularmente preferido para o uso nesta invenção. Esqualeno é um óleo metabolizável, devido ao fato de que é um intermediário na biossíntese de colesterol (Merck index, 10a Edição, registro de entrada no 8619). As emulsões de óleo particularmente preferidas são emulsões de óleo em água e, em particular, emulsões de esqualeno em água. Além disso, as emulsões adjuvantes oleosas mais preferidas da presente invenção compreendem um antioxidante, que é preferivelmente o alfa-tocoferol oleoso (vitamina E, EP 0 382 271 B1). WO 95/17210 e WO 99/11241 divulgam emulsões adjuvantes com base em esqualeno, alfa- tocoferol e TWEEN® 80, opcionalmente formuladas com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL (que são debatidos acima). WO 99/12565 divulga um aperfeiçoamento nestas emulsões de esqualeno com a adição de um esterol na fase oleosa. Adicionalmente, um triglicerídeo, tal como tricaprilina (C27H50O6), pode ser adicionado à fase oleosa de modo a estabilizar a emulsão (WO 98/56414).

[0147]O tamanho das gotículas de óleo encontradas na emulsão estável de óleo em água é preferivelmente menor do que 1 mícron, pode estar na faixa de substancialmente 30 a 600 nm, preferível e substancialmente em torno de 30 a 500 nm em diâmetro e, mais preferível e substancialmente 150 a 500 nm em diâmetro e, em particular, cerca de 150 nm em diâmetro conforme medido por espectroscopia de correlação de fótons. A este respeito, 80 % das gotículas de óleo por número devem estar dentro das faixas preferidas, mais preferivelmente, mais do que 90 % e, mais preferivelmente, mais do que 95 % das gotículas de óleo por número estão dentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentes presentes nas emulsões de óleo da presente invenção estão convencionalmente na faixa de 2 a 10 % de óleo, tal como esqualeno; e quando presente, de 2 a 10 % de alfa tocoferol; e de 0,3 a 3 % de tensoativo, tal como mono-oleato de polioxietileno sorbitano. Preferivelmente, a razão de óleo:alfa tocoferol é igual ou menor do que 1, uma vez que oferece uma emulsão mais estável. Span 85 também pode estar presente em um nível de cerca de 1 %. Em alguns casos, pode ser vantajoso que as vacinas da presente invenção contenham um estabilizador.

[0148]O método de produzir emulsões de óleo em água é bem conhecido às pessoas habilitadas na técnica. Comumente, o método compreende misturar a fase oleosa com um tensoativo, tal como uma solução de PBS/TWEEN80®, seguido por homogeneização através do uso de um homogeneizador. Por exemplo, um método que compreende passar a mistura uma, duas ou mais vezes através de uma agulha de seringa seria adequado para homogeneizar volumes pequenos de líquido. De maneira idêntica, o processo de emulsificação em um microfluidizador (equipamento de microfluídicos M110S, máximo de 50 passagens, durante um período de 2 minutos em pressão de entrada máxima de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar)) pode ser adaptado para produzir menores ou maiores volumes de emulsão. Esta adaptação pode ser obtida através da experimentação de rotina compreendendo a medição da emulsão resultante até que uma preparação seja obtida com gotículas de óleo do diâmetro necessário.

[0149]Os exemplos seguintes são apresentados por via de ilustração e não por via de limitação. EXEMPLOS Exemplo 1 2-Azido-2-deóxi-D-glicopiranosídeo (2)

[0150]Azida sódica (2,78 g, 42,7 mmols) foi dissolvida em água (7 mL) e tolueno (7 mL). A mistura foi esfriada a 0 °C sob agitação vigorosa. Anidrido tríflico (4,57 mL, 27,2 mmols) foi adicionado às gotas e a mistura foi agitada durante 30 min a 0 °C. A temperatura foi elevada à 10 °C e a mistura bifásica foi agitada durante 2 h. Uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio foi adicionada, às gotas, até que a evolução de gás foi interrompida. As duas fases foram separadas e a camada aquosa foi extraída com tolueno (2 x 7 mL). As camadas orgânicas combinadas foram usadas na reação de transferência de diazo subsequente.

[0151]Glicose amina 1 (2,04 g, 9,45 mmols), hidrogenocarbonato de sódio (3,21 g, 38,22 mmols) e sulfato de cobre(II) penta-hidratado (90,5 mg, 0,362 mmol) foram dissolvidos em água (12,3 mL). A solução estoque de azida tríflica preparada acima (21 mL) foi adicionada, seguido pela adição de metanol (81 mL) para fornecer um sistema homogêneo. A mistura azul foi vigorosamente agitada na temperatura ambiente. O consumo completo da amina foi monitorado por TLC (coloração de ninidrina) e também foi indicado por uma mudança de cor da mistura de azul para verde. Os solventes foram removidos a vácuo com um evaporador rotativo, mantendo a temperatura estritamente abaixo de 25 °C. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de metanol 0 a 40 %/diclorometano durante 50 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 2 (1,93 g, 99 %) como um líquido incolor. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) (mistura de diastereômeros 1/1) δ 5,18 (d, J = 3,4 Hz, 0,5 H), 4,51 (d, J = 8,0 Hz, 0,5 H), 3,89 - 3,63 (m, 3 H), 3,32 - 3,26 (m, 2 H), 3,11 - 3,06 (m, 1 H). Exemplo 2 2-Azido-2-deóxi-4,6-O-benzilideno-D-glicopiranosídeo (3)

[0152]A uma solução do composto 2 (2,00 g, 9,75 mmols) em DMF (40 mL) foi adicionado benzaldeído dimetil acetal (1,65 g, 10,8 mmols) e ácido canforsulfônico (90 mg). O frasco foi conectado a um sistema a vácuo e a mistura foi aquecida a 50 °C em um banho em óleo. Depois de 3 h, a mistura foi concentrada usando um evaporador rotativo. O resíduo foi novamente dissolvido em éter dietílico (50 mL) e Et3N (2 mL), seguido por bicarbonato de sódio saturado (50 mL). A camada aquosa foi extraída com éter dietílico (3 x 50 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio e filtrados. Depois da remoção de solventes usando um evaporador rotativo, o resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 100 %/hexanos durante 50 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 3 (2,58 g, 90 %) como um líquido incolor. RMN de 1H (300 MHz, CD3OD) δ 7,49 - 7,32 (m, 5 H), 5,58 (s, 1 H), 4,64 (d, J = 3,8 Hz, 1 H), 4,25 - 341 (m, 5 H), 3,23 - 3,20 (m, 1 H). Exemplo 3 terc-Butildimetilsilil-2-azido-4,6-O-benzilideno-2-deóxi-e-D-glicopiranosídeo

[0153]Cloreto de t-butildimetilsilila (820 mg, 5,44 mmols) foi adicionado a uma mistura do composto 3 (1,45 g, 4,94 mmols) e imidazol (768 mg, 11,3 mmols) em CH2Cl2 (40 mL) a 0 °C. Depois que a solução foi agitada durante a noite, bicarbonato de sódio saturado (20 mL) foi adicionado e a mistura foi extraída com éter dietílico (3 x 30 mL). A camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4, filtradas e concentradas a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna (coluna RediSep 80 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 70 %/hexanos durante 40 min, 60 mL/min) para fornecer o produto 4 (1,5 g, 74 %) como um sólido incolor. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,46 - 7,43 (m, 2 H), 7,35 - 7,32 (m, 3 H), 5,48 (s, 1 H), 4,59 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 4,23 (dd, J = 10,2, 5,0 Hz, 1 H), 3,73 (t, J = 10,2 Hz, 1 H), 3,56 - 3,51 (m, 2 H), 3,31 - 3,28 (m, 2 H), 2,72 (d, J = 2,2 Hz, 1 H), 0,91 (s, 9 H), 0,14 (s, 3 H), 0,13 (s, 3 H). Exemplo 4 terc-Butildimetilsilil-3-O-aliloxicarbonil-2-azido-4,6-O-benzildidino-2-deóxi-D- glicopiranosídeo (5)

[0154]A uma solução do composto 4 (1,50 g, 3,68 mmols) e tetrametiletilenodiamina (TMEDA) (0,78 mL, 5,2 mmols) em diclorometano (DCM) (50 mL) a 0 °C foi adicionado cloroformiato de alila (0,78 mL, 7,3 mmols) às gotas. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente e a mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 10 h. A mistura foi diluída com DCM (50 mL) e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 100 mL) e salmoura (2 x 50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4, filtradas e concentradas a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna (coluna RediSep 80 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 50 %/hexanos durante 40 min, 60 mL/min) para fornecer o produto 5 (1,57 g, 87 %) como um sólido incolor. Rf = 0,40 (hexanos/acetato de etila, 3/1, v/v). RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,44 - 7,41 (m, 2 H), 7,35 - 7,32 (m, 3 H), 5,98 - 5,85 (m, 1 H), 5,48 (s, 1 H), 5,38 - 5,22 (m, 2 H), 4,88 (t, J = 11,4 Hz, 1 H), 4,72 - 4,64 (m, 3 H), 4,32 - 4,27 (m, 1 H), 3,81 - 3,65 (m, 2 H), 3,50 - 3,42 (m, 2 H), 0,94 (s, 9 H) , 0,18 (s, 3 H) , 0,17 (s, 3 H). Exemplo 5 terc-Butildimetilsilil-3-O-aliloxicarbonil-2-azido-6-O-benzil-2-deóxi-D- glicopiranosídeo (6)

[0155]Uma suspensão do composto 5 (320 mg, 0,651 mmol) e peneiras moleculares (4 A, 200 mg) em THF (5 mL) foi agitada na temperatura ambiente durante 1 h, e depois NaCNBH3 (246 mg, 3,91 mmols) foi adicionado. Uma solução de cloreto de hidrogênio (2 M em éter dietílico) foi adicionada, às gotas, a esta mistura, até que a mistura se tornou ácida (~5 mL, pH = 5). Depois de ser agitada durante 0,5 h adicional, a mistura de reação foi interrompida com NaHCO3 sólido, diluída com éter dietílico (100 mL) e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 100 mL) e salmoura (2 x 50 mL). A camada orgânica foi seca em Na2SO4, filtrada, concentrada a vácuo e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna (coluna RediSep 40 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 100 %/hexanos durante 40 min, 40 mL/min) para fornecer o produto 6 (273 mg, 85 %) como um sólido incolor. Rf = 0,42 (hexanos/acetato de etila, 4/1, v/v). RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,39 - 7,34 (m, 5 H), 5,99 - 5,89 (m, 1 H), 5,40 - 5,26 (m, 2 H), 4,67 - 4,56 (m, 5 H), 3,72 - 3,70 (m, 3 H), 3,48 - 3,46 (m, 2 H), 3,37 (dd, J = 9,6, 8,4 Hz, 1 H), 3,01 (s largo, 1 H), 0,94 (s, 9 H), 0,17 (s, 6 H). Exemplo 6 terc-Butildimetilsilil-3-O-aliloxicarbonil-2-azido-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3\5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-D-glicopiranosídeo (7)

[0156]A uma solução do composto 6 (5,47 g, 11,1 mmols) e 1H-tetrazol (3 % em peso em acetonitrila, 35,5 mmols, 104 mL) foi adicionada N,N-dietil-1,5-di-hidro- 3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-amina (5,3 g, 22 mmols). Depois que a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 15 min, ela foi esfriada a -20 °C, agitada durante 10 min adicionais nesta temperatura e depois mCPBA (8,40 g, 50 a 55 % em peso, 24,4 mmols) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a -20 °C durante 20 min e concentrada a vácuo. O resíduo foi novamente dissolvido em DCM (30 mL) e lavado com NaHCO3 aquoso saturado (40 mL). A camada aquosa foi extraída com DCM (3 x 50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas em Na2SO4, filtradas e concentradas a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia flash em coluna (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 100 %/hexanos durante 60 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 7 (4,85 g, 65 %) como um óleo amarelo claro. Rf = 0,40 (hexanos/acetato de etila, 1/1, v/v). RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,35 - 7,18 (m, 9 H), 5,98 - 5,85 (m, 1 H), 5,41 - 5,05 (m, 6 H), 4,64 (t, J = 10,1 Hz, 1 H), 4,58 - 4,52 (m, 6 H), 3,83 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 3,72 - 3,61 (m, 2 H), 3,41 (dd, J = 10,5, 7,4 Hz, 1 H), 0,92 (s, 9 H), 0,16 (s, 3 H), 0,15 (s, 3 H). Exemplo 7 terc-Butildimetilsilil-3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3- oxo-3A5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-(9-fluorenilmetoxicarbonilamino)-D- glicopiranosídeo (8)

[0157]Ácido acético (0,30 mL, 5,2 mmols) foi adicionado, às gotas, a um suspensão agitada de 7 (700 mg, 1,04 mmol) e pó de zinco (676 mg, 10,4 mmols) em DCM (15 mL). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 4 h, depois que ela foi diluída com acetato de etila (50 mL). Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com acetato de etila (2 x 10 mL). Os filtrados combinados foram lavados com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 40 mL) e salmoura (2 x 40 mL). A fase orgânica foi seca (MgSO4) e filtrada, e o filtrado foi concentrado a vácuo para fornecer a amina intermediária bruta como um óleo amarelo claro. Rf = 0,21 (hexanos/acetato de etila, 1/1, v/v). Cloreto de 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc-Cl) (323 mg, 1,25 mmol) foi adicionado a uma solução agitada da amina bruta e di-isopropiletilamina (DIPEA) (0,22 mL, 1,3 mmol) em DCM (15 mL) a 0 °C. A mistura de reação foi aquecida e agitada na temperatura ambiente durante 5 h, depois que ela foi diluída com DCM (40 mL) e lavada com salmoura (2 x 50 mL). A fase orgânica foi seca (MgSO4) e filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (coluna RediSep 40 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 100 %/hexanos durante 30 min, 40 mL/min) para fornecer o produto 8 (337 mg, 73 % em duas etapas) como um sólido branco. Rf = 0,54 (hexanos/acetato de etila, 1/1, v/v). RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,78 - 7,20 (m, 17 H), 5,92 - 5,82 (m, 1 H), 5,49 - 5,16 (m, 8 H), 4,69 - 4,06 (m, 5 H), 4,49 - 4,28 (m, 2 H), 3,88 - 3,61 (m, 3 H), 3,60 - 3,51 (m, 2 H), 3,32 (s largo, 1 H), 0,94 (s, 9 H), 0,14 (s, 3 H), 0,10 (s, 3 H). Exemplo 8 3-O-Aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3A5-3H-2,4,3- benzodioxafosfepin-3-il)-2-(9-fluorenilmetoxicarbonilamino)-D-glicopiranosídeo (9)

[0158]Fluoreto de hidrogênio/piridina (6 mL, 0,2 mol) foi adicionado, às gotas, a uma solução agitada de 8 (6,00 g, 6,88 mmols) em THF (50 mL). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 12 h, depois de que ela foi diluída com éter dietílico (100 mL), e depois lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 40 mL) e salmoura (2 x 40 mL). A fase orgânica foi seca (MgSO4) e filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 80 %/hexanos durante 60 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 9 (4,34 g, 83 %) como um óleo amarelo claro. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,75 - 7,20 (m, 17 H), 5,92 - 5,82 (m, 1 H), 5,27 - 5,06 (m, 9 H), 4,59 - 4,55 (m, 5 H), 4,41 - 4,39 (m, 1 H), 4,25 - 4,01 (m, 5 H), 3,85 - 3,65 (m, 2 H). Exemplo 9 terc-Butildimetilsilil-6-O-{3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3\5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoilóxi- tetradecanoilamino]-β-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-benzil0xi-

[0159]Uma suspensão de 10 (veja a preparação abaixo) (350 mg, 0,172 mmol), zinco (1,3 g, 21 mmols) e ácido acético (0,70 mL, 12 mmols) em DCM (20 mL) foi agitada na temperatura ambiente durante 12 h. A mistura foi diluída com éter dietílico. Os sólidos foram removidos por filtração e o resíduo foi lavado com éter dietílico (2 x 10 mL). Os filtrados combinados foram lavados com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 15 mL) e salmoura (2 x 15 mL). A fase orgânica foi seca (MgSO4) e filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (coluna RediSep 12 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 60 %/hexanos durante 35 min, 30 mL/min) para fornecer o produto 11 (220 mg, 64 %) como um xarope amarelo claro. Rf = 0,29 (hexanos/acetato de etila, 5/2, v/v). RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,37 - 7,24 (m, 20 H), 6,20 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 5,59 (t, J = 9,6 Hz, 1 H), 5,31 (m, 1 H), 5,12 - 4,97 (m, 6 H), 4,62 - 4,44 (m, 7 H), 4,05 - 3,24 (m, 9 H), 2,68 - 2,12 (m, 9 H), 1,64 - 1,59 (m, 13 H), 1,27 (m largo, 95 H), 0,94 (m, 25 H), 0,13 (s, 6 H). HRMS (m/z) (pos) calculada para C117H193N2O20PSi, 2005,37; encontrada, 2006,3729 [M + H]+. Exemplo 10 terc-Butildimetilsilil-6-O-{3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3\5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoilóxi- tetradecanoilamino]-β-D-glicopiranosil}-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-benzil0xi-dodecanoil]- 2-[(R)-3-4-metoxibenzilóxi-tetradecanoil]-2-deóxi-e—D-glicopiranosídeo (12)

[0160]A uma solução de amina 11 (93 mg, 0,046 mmol) em DCM (10 mL) foram adicionados piridina (21 mg, 0,27 mmol), cloreto de (R)-3-(4- metoxibenzilóxi)tetradecanoila (veja a preparação abaixo, composto 35) (40 mg, 0,12 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (1 mg) na temperatura ambiente, e a mistura foi agitada durante a noite. A mistura foi transferida a um funil separatório e diluída com éter dietílico (20 mL) e bicarbonato de sódio saturado (20 mL). A camada aquosa foi extraída com éter dietílico (3 x 20 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio, filtrados e concentrados sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 12 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 80 %/hexanos durante 35 min, 30 mL/min) para fornecer o produto 12 (81 mg, 74 %) como um líquido incolor. Rf = 0,34 (hexanos/acetato de etila, 3/2, v/v). RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,34 - 7,20 (m, 20 H), 6,89 - 6,86 (m, 4 H), 6,15 (t, J = 9,0 Hz, 1 H), 5,57 - 5,55 (m, 1 H), 5,31 - 4,99 (m, 8 H), 4,57 - 4,44 (m, 11 H), 4,06 - 3,33 (m, 15 H), 2,63 - 2,57 (m, 5 H), 2,33 - 2,27 (m, 9 H), 1,57 (m, 8 H), 1,27 (m largo, 112 H), 0,88 - 0,82 (m, 27 H), 0,08 (s, 3 H), 0,04 (s, 3 H). HRMS (m/z) (pos) calculada para C139H227N2O23PSi, 2351,62; encontrada, 2352,6343 [M + H]+.

[0161]Uma suspensão de 12 (10 mg, 0,0042 mmol) e negro de Pd (15,0 mg) em THF anidro (5 mL) foi agitada sob uma atmosfera de H2 (50 psi) na temperatura ambiente durante 30 h. O catalisador foi removido por filtração. O resíduo foi lavado com THF (2 x 1 mL). A solução foi esfriada a -40 °C e neutralizada com amônia em metanol (0,1 mL, 7 M) e concentrada sem aquecimento a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia (coluna RediSep 12 g, eluindo com clorofórmio/metanol/água 8/2/0,1 durante 30 min, 30 mL/min) para fornecer 13a (4 mg, 54 %) como uma película incolor. O produto foi novamente dissolvido em água e metanol (v/v, 1/1, 2mL) e liofilizado para obter o produto 13a como um pó branco. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 6,00 - 5,00 (m, 1 H), 4,50 - 3,50 (m, 2 H), 3,00 - 2,00 (m, 3 H), 2,00 - 1,00 (m, 50 H), 0,81 (m, 18 H). MS (Multimodo, neg) calculado para C96H181N2O22P, 1745,28; encontrado, 1745,0 [M - H]-. Exemplo 12

[0162]Uma suspensão de 12 (27 mg, 0,011 mmol) e negro de Pd (41,0 mg) em THF anidro (12 mL) foi agitada sob uma atmosfera de H2 (50 psi) na temperatura ambiente durante 30 h. O catalisador foi removido por filtração. O resíduo foi lavado com THF (2 x 3 mL). A solução foi neutralizada com trietilamina (TEA) (0,1 mL) e concentrada sem aquecimento a vácuo. Os filtrados combinados foram concentrados a vácuo e purificados por cromatografia em sílica (coluna RediSep 12 g, eluindo com clorofórmio/metanol/água 8/2/0,1 30 min, 30 mL/min) para fornecer 13b (5 mg, 25 %) como uma película incolor. O produto foi novamente dissolvido em água e metanol (v/v, 1/1, 2 mL) e liofilizado para obter o produto 13b como um pó branco. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 5,17 (largo, 2 H), 4,23 - 3,62 (m, 5 H), 3,11 - 3,07 (q, J = 2,8 Hz, 2 H), 2,51 - 2,12 (m, 6 H), 1,56 - 1,00 (m, 69 H), 0,92 - 0,84 (m, 18 H). MS (Multimodo, neg) calculada para C96H181N2O22P, 1745,28; encontrada, 1744,1 [M - H]-. Exemplo 13 terc-Butildimetilsilil-6-O-[3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3\5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-(9-fluorenilmetoxicarbonilamino)-

[0163]O composto 9 (89 mg, 0,12 mmol) foi dissolvido em DCM anidro (3 mL). Tricloroacetonitrila (1,0 mL) foi adicionado, seguido por hidreto de sódio (1,0 mg, 60 % em óleo mineral). Depois de 15 min, TLC indicou a presença de 9, assim, uma quantidade adicional de hidreto de sódio (1 mg, 60 % em óleo mineral) foi adicionada. Depois de 15 min, TLC indicou que a reação foi concluída. A mistura foi concentrada sob vácuo e carregada em uma coluna em SiO2 que foi pré tratada com Et3N e eluída com acetato de etila a 50 %/hexanos para fornecer o tricloroacetimidato intermediário (76,9 mg, 71 %) que foi usado sem purificação adicional. Uma suspensão de tricloroacetimidato (76,9 mg, 0,0852 mmol), aceitante 14 (veja a preparação abaixo) (52,34 mg, 0,1277 mmol) e peneiras moleculares (4 A, 500 mg) em DCM (5,0 mL) foi agitada na temperatura ambiente durante 1 h. A mistura foi esfriada (-60 °C) e TMSOTf (1,54 μL, 0,0851 mmol) foi adicionado. Depois que a mistura de reação foi agitada durante 30 min, ela foi interrompida com NaHCO3 sólido. Os sólidos foram removidos por filtração e o filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 2:1 (v/v)) para fornecer 15 (55 mg, 40 %) como um sólido incolor. RMN de 1H (500 MHz, CD3COCD3) δ 7,86 - 7,22 (m, 22 H), 6,98 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 5,85 (m, 1 H), 5,41 (t, J = 9,0 Hz, 1 H), 5,38 - 5,21 (m, 3 H), 5,10 - 5,02 (m, 3 H), 4,91 (d, J = 11,0 Hz, 2 H), 4,72 - 4,46 (m, 7 H), 4,23 - 4,15 (m, 4 H), 3,93 - 3,80 (m, 4 H), 3,69 - 3,66 (m, 1 H), 3,54 (s largo, 3 H), 3,20 (dd, J1 = 8,0 Hz, J2 = 8,0 Hz, 1 H), 0,95 (s, 9 H), 0,17 (s, 6 H); RMN de 13C (125 MHz, CD3COCD3) δ 207,00, 156,61, 155,51, 145,22, 144,82, 142,06, 142,01, 139,98, 139,57, 136,68, 136,62, 133,02, 132,94, 129,85, 129,83, 129,15, 129,05, 128,95, 128,91, 128,82, 128,61, 128,49, 128,41, 128,21, 128,17, 128,0, 127,92, 126,19, 126,09, 125,98, 120,79, 118,60, 118,52, 101,41, 97,57, 78,78, 78,10, 76,84, 75,98, 75,88, 75,43, 75,30, 75,17, 74,70, 74,07, 70,63, 69,76, 69,64, 69,27, 69,15, 69,10, 69,02, 68,97, 67,73, 67,17, 57,29, 54,94, 26,11, 18,51; HRMS (m/z) calculada para C59H69N4O16PSi [M + H]+, 1149,4293; encontrada, 1149,4238. Exemplo 14 terc-Butildimetilsilil-6-O-{3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3\5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoilóxi- tetradecanoilamino]-β-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-2-de0xi-β-D-

[0164]1,8-Diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno (220 μL, 1,47 mmol) foi adicionado, às gotas, a uma solução de 15 (800 mg, 0,696 mmol) em DCM (10 mL). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 1 h, depois de que ela foi concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (DCM/metanol, 100:1 a 100:3 (v/v)) para fornecer a amina livre (648 mg, 99 %) como um xarope incolor. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,36 - 7,17 (m, 14 H), 5,96 - 5,88 (m, 1 H), 5,40 - 5,06 (m, 7 H), 4,84 - 4,50 (m, 9 H), 4,21 (d, J = 13,5 Hz, 1 H), 4,15 - 4,11 (m, 1 H), 3,82 (m, 1 H), 3,79 - 3,42 (m, 5 H), 3,34 - 3,19 (m, 2 H), 2,96 - 2,90 (m, 1 H), 2,34 (d, J = 4,5 Hz, 1 H), 0,90 (s, 9 H), 0,13 (s, 6 H). HRMS (m/z) calculada para C44H59N4O14PSi [M + H]+, 927,3613; encontrada, 927,3569.

[0165]N,N-Diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) (230 mg, 1,11 mmol) foi adicionada a uma solução agitada de ácido (R)-3-dodecanoil-tetradecanóico (veja a preparação abaixo, composto 40) (381 mg, 0,81 mmol) em DCM (10 mL). Depois que a mistura de reação foi agitada durante 10 min, a amina livre (648 mg, 0,699 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionada e a agitação foi continuada durante 12 h adicionais. Os materiais insolúveis foram removidos por filtração e o resíduo foi lavado com DCM (2 x 2 mL). Os filtrados combinados foram concentrados a vácuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 2:1 (v/v)) para fornecer 16 (450 mg, 47 %) como um sólido branco. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,35 - 7,17 (m, 14 H), 5,94 - 5,86 (m, 2 H), 5,47 (t, J = 9,0, 10,5 Hz, 1 H), 5,37 (d, J = 2,5 Hz, 1 H), 5,34 (d, J = 2,5 Hz, 1 H), 5,24 (d, J = 13,5 Hz, 1 H), 5,13 - 4,97 (m, 6 H), 4,75 (d, J = 11,0 Hz, 1 H), 4,66 - 4,49 (m, 7 H), 4,00 (d, J = 17,0 Hz, 2 H), 3,83 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 3,75 - 3,56 (m, 4 H), 3,49 - 3,36 (m, 5 H), 3,20 (m, 1 H), 2,42 - 2,17 (m, 4 H), 1,93 (d, J = 11,5 Hz, 1 H), 1,70 (m, 2 H), 1,23 (s largo, 36 H), 0,92 (s, 9 H), 0,89 - 0,86 (m, 6 H), 0,14 (s, 6 H); HRMS (m/z) calculada para C72H111N4O17PSi [M + H]+, 1363,7529; encontrada, 1363,7487. Exemplo 15 terc-Butildimetilsilil-6-O-{3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3\5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoilóxi-

[0166]Uma mistura de ácido (R)-3-benziloxitetradecanóico (veja a preparação abaixo, composto 33) (120 mg, 0,540 mmol) e DCC (171 mg, 0,830 mmol) em DCM (5 mL) foi agitada na temperatura ambiente durante 10 min e depois dissacarídeo 16 (451 mg, 0,331 mmol) em DCM (5 mL) e DMAP (25 mg, 0,21 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 14 h, depois que os sólidos foram removidos por filtração. O resíduo foi lavado com DCM (2 x 4 mL). Os filtrados combinados foram concentrados a vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 4:1(v/v)) para fornecer 17 (540 mg, 97 %) como um sólido branco. Rf = 0,41 (hexanos/acetato de etila, 2:1(v/v)). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,33 - 7,15 (m, 19 H), 5,94 - 5,85 (m, 2 H), 5,47 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,37 (d, J = 17,5 Hz, 1 H), 5,22 (d, J = 10,0 Hz, 1 H), 5,10 - 4,95 (m, 7 H), 4,62 - 4,43 (m, 10 H), 4,0 - 3,96 (m, 3 H), 3,90 - 3,81 (m, 2 H), 3,74 - 3,67 (m, 3 H), 3,56 - 3,42 (m, 6 H), 3,33 - 3,27 (m, 1 H), 2,60 - 2,21 (m, 6 H), 1,24 (s largo, 54 H), 0,91 (s, 9 H), 0,87 - 0,84 (m, 9 H), 0,14 (s, 6 H). HRMS (m/z) calculada para C93H143N4O19PSi [M + H]+, 1679,9931; encontrada, 1679,9934. Exemplo 16 terc-Butildimetilsilil-6-O-{6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3\5-3H - 2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoil0xi-tetradecanoilamino]-β-D- glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-benzilóxi-tetradecanoil]-2-deóxi-e—D-

[0167]Tetracis(trifenilfosfino)paládio (228 mg, 0,198 mmol) foi adicionado a uma solução de 17 (1,66 g, 0,980 mmol), n-BuNH2 (0,19 mL, 1,97 mmol) e HCOOH (74,5 μL, 1,98 mmol) em THF (20 mL). Depois que a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 20 min, ela foi diluída com DCM (40 mL) e lavada sucessivamente com água (40 mL), NaHCO3 aquoso saturado (2 x 40 mL) e salmoura (40 mL). A fase orgânica foi seca (MgSO4) e filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 4:3 (v/v)) para fornecer o composto 18 (1,43 g, 91 %). Rf = 0,5 (hexanos/acetato de etila, 1:1 (v/v)). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,33 - 7,11 (m, 19 H), 6,2 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 5,46 (t, J = 9,0 Hz, 1 H), 5,04 - 4,90 (m, 9 H), 4,55 - 4,38 (m, 8 H), 3,92 (d, J = 10,0 Hz, 1 H), 3,84 - 3,76 (m, 1 H), 3,75 - 3,7 (m, 4 H), 3,53 - 3,44 (m, 2 H), 3,43 - 3,32 (m, 2 H), 3,25 - 3,20 (m, 1 H), 2,61 - 2,10 (m, 12 H), 1,23 (s largo, 54 H), 0,90 (s, 9 H), 0,88 - 0,84 (m, 9 H), 0,12 (s, 6 H). HRMS (m/z) calculada para C89H139N4O17PSi [M + H]+, 1595,972; encontrada, 1595,9713. Exemplo 17 terc-Butildimetilsilil-6-O-{6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3À5-3H- 2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoilóxi-tetradecanoilamino]-3-O-[(R)-3- (p-met0xi)benziloxitetradecanoil]-β-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3- benzilóxi-tetradecanoil]-2-deóxi-e—D-glicopiranosídeo (19)

[0168]Uma solução de ácido (R)-3-(p-metóxi)benzilóxi-tetradecanóico (veja a preparação abaixo, composto 34, 424 mg, 1,16 mmol) e DCC (369 mg, 1,79 mmol) em DCM (15 mL) foi agitada na temperatura ambiente durante 10 min e o álcool 18 (1,43 g, 0,896 mmol) em DCM (10 mL) e DMAP (54,72 mg, 0,4479 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada durante 14 h adicionais, depois que os sólidos foram removidos por filtração e lavados com DCM (2 x 5 mL). Os filtrados combinados foram concentrados a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 4:1 (v/v)) para fornecer 19 (1,15 g, 66 %) como um sólido branco. Rf = 0,46 (hexanos/acetato de etila, 2:1 (v/v)). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,38 - 6,79 (m, 23 H), 5,73 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 5,55 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,20 - 4,88 (m, 8 H), 4,66 - 4,47 (m, 12 H), 4,33 (d, J = 12,5 Hz, 1 H), 4,0 - 3,66 (m, 12 H), 3,61 - 3,40 (m, 5 H), 3,36 - 3,27 (m, 3 H), 2,67 (d, J = 6,0 Hz, 2 H), 2,60 - 2,22 (m, 6 H), 1,27 (s largo, 72 H), 0,93 (s, 9 H), 0,92 - 0,87 (m, 12 H), 0,16 (s, 6 H). HRMS (m/z) calculado para C111H173N4O20PSi [M + H]+, 1942,2228; encontrado, 1942,2289. Exemplo 18 terc-Butildimetilsilil-6-O-{6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3À5-3H- 2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoilóxi-tetradecanoilamino]-3-O-[(R)-3- tetradecanoil0xi-tetradecanoil]-β-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-

[0169]A uma solução agitada de 19 (1,15 g, 0,592 mmol) em uma mistura de DCM e H2O (11 mL, 10:1 (v/v)) foi adicionada 2,3-Dicloro-5,6-diciano-1,4- benzoquinona (DDQ) (202 mg, 0,890 mmol). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 1 h, depois que ela foi diluída com DCM. A mistura foi lavada com salmoura (20 mL), seca (MgSO4) e concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 3:1 (v/v)) para fornecer o álcool como um xarope incolor (1,01 g, 94 %). Rf = 0,50 (hexanos/acetato de etila, 5:3 (v/v)). Cloreto de miristoila (0,74 mL, 2,7 mmols) foi adicionado a uma solução do álcool (1,01 g, 0,554 mmol), e piridina (0,35 mL, 4,33 mmols) em DCM (20 mL). Depois que a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 12 h, ela foi diluída com DCM e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 40 mL) e salmoura (40 mL). A fase orgânica foi seca (MgSO4) e filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 4:1 (v/v)) para fornecer 10 (680 mg, 57 %) como um sólido branco. Rf = 0,46 (hexanos/acetato de etila, 5:2 (v/v)). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,37 - 7,24 (m, 19 H), 6,23 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 5,58 (t, J1 = J2 = 9,5 Hz, 1 H), 5,32 - 5,27 (m, 1 H), 5,16 - 4,99 (m, 6 H), 4,78 - 4,44 (m, 7 H), 4,03 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 3,99 - 3,20 (m, 10 H), 2,65 - 2,21 (m, 10 H), 1,61 - 1,51 (m, 10 H), 1,27 (s largo, 94 H), 1,21 (s largo, 25 H), 0,12 (s, 6 H). Exemplo 19 terc-Butildimetilsilil-6-O-{3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3À5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-decanoilóxi- tetradecanoilamino]-β-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-2-de0xi-β-D-

[0170]O composto 15 (1,23 g, 1,07 mmol) foi acilado em uma maneira similar à síntese do composto 16 (Exemplo 14) usando (DCC, 430 mg, 2,08 mmols), lipídio necessário (Composto 40, Exemplo 36, 630 mg, 1,59 mmol) e trietilamina (161 mg, 1,59 mmol) para fornecer 20 (1,05 g, 81 %) como um óleo incolor. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,35 - 7,17 (m, 14 H), 5,91 - 5,86 (m, 2 H), 5,47 (t, J = 9,0, 10,5 Hz, 1 H), 5,34 (d, J = 17 Hz, 1 H), 5,24 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 5,10 - 4,98 (m, 8 H), 4,75 (d, J = 11,5 Hz, 1 H), 4,66 - 4,49 (m, 8 H), 4,00 (d, J = 11,0 Hz, 2 H), 3,83 (d, J = 11,0 Hz, 1 H), 3,75 - 3,69 (m, 2 H), 3,49 - 3,36 (m, 4 H), 3,20 (m, 1 H), 2,40 - 2,26 (m, 4 H), 1,24 (s largo, 32 H), 0,92 (s, 9 H), 0,89 - 0,86 (m, 6 H), 0,14 (s, 6 H); MS (Multimodo, pos) m/z = 1307 [M + H]+. Exemplo 20 terc-Butildimetilsilil-6-O-{3-O-aliloxicarbonil-6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di- hidro-3-oxo-3\5-3H-2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-decanoilóxi- tetradecanoilamino]-β-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-benzil0xi- tetradecanoil]-2-deóxi-e—D-glicopiranosídeo (21)

[0171]O composto 20 (1,43 g, 1,18 mmol) foi acilado em uma maneira similar à síntese do composto 17 (Exemplo 15) usando (DCC, 453 mg, 2,20 mmols), lipídio necessário (477 mg, 1,43 mmol) e N,N-dimetil-4-aminopiridina (67 mg, 0,548 mmol) para fornecer 21 (1,60 g, 83 %) como um óleo incolor. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,33 - 7,15 (m, 19 H), 5,94 - 5,85 (m, 2 H), 5,48 (t, J = 9,0 Hz, 1 H), 5,34 (d, J = 17,5 Hz, 1 H), 5,22 (d, J = 10,0 Hz, 1 H), 5,12 - 4,96 (m, 7 H), 4,63 - 4,46 (m, 11 H), 3,97 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 3,89 - 3,85 (m, 2 H), 3,74 - 3,68 (m, 3 H), 3,55 - 3,52 (m, 2 H), 3,47 - 3,41 (m, 1 H), 3,28 (m, 1 H), 2,61 - 2,22 (m, 8 H), 1,59 - 1,52 (m, 6 H), 1,98 (m, 2 H), 1,23 (s largo, 44 H), 0,90 (s, 9 H), 0,88 - 0,84 (m, 9 H), 0,12 (s, 6 H); MS (Multimodo, pos) m/z = 1625 [M + H]+. Exemplo 21 terc-Butildimetilsilil-6-O-{6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3\5-3H - 2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-dodecanoil0xi-tetradecanoilamino]-β-D- glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-benzilóxi-tetradecanoil]-2-deóxi-e-D-

[0172]O composto 21 (1,60 g, 0,985 mmol) foi reagido em uma maneira análoga à síntese do composto 18 (Exemplo 16). Consequentemente, tetracis(trifenilfosfino)paládio, (227 mg, 0,196 mmol), ácido fórmico (74 μL, 1,97 mmol) e n-butilamina (144 mg, 1,97 mmol) para fornecer 22 (1,25 g, 82 %) como um sólido amarelo. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,33 - 7,15 (m, 19 H), 6,20 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 5,38 - 4,95 (m, 6 H), 4,86 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 4,60 - 4,46 (m, 10 H), 3,97 - 3,71 (m, 8 H), 3,68 - 3,48 (m, 5 H), 3,31 - 3,27 (m, 3 H), 2,62 - 2,55 (m, 2 H), 2,50 - 2,42 (m, 3 H), 2,40 - 2,22 (m, 5 H), 1,23 (s largo, 44 H), 0,90 (s, 9 H), 0,88 - 0,84 (m, 9 H), 0,12 (s, 6 H); MS (Multimodo, pos) m/z = 1539 [M+H]+. Exemplo 22 terc-Butildimetilsilil-6-O-{6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3A5-3H- 2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-decanoilóxi-tetradecanoilamino]-3-O-[(R)-3-(p- met0xi)benziloxitetradecanoil]-β-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3- benzilóxi-tetradecanoil]-2-deóxi-e—D-glicopiranosídeo (23)

[0173]O composto 22 (1,25 g, 0,811 mmol) foi acilado em uma maneira similar à síntese do composto 19 (Exemplo 17) usando (DCC, 335 mg, 1,62 mmol), lipídio necessário (Composto 34, Exemplo 32, 386 mg, 1,06 mmol) e N,N-dimetil-4- aminopiridina (50 mg, 0,41 mmol) para fornecer 23 (440 mg, 29 %) como um óleo incolor. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,38 - 6,79 (m, 23 H), 5,71 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 5,55 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,06 - 4,85 (m, 9 H), 4,66 - 4,45 (m, 12 H), 3,97 (d, J = 11,0 Hz, 1 H), 3,90 - 3,69 (m, 9 H), 3,60 - 3,55 (m, 3 H), 3,37 - 3,29 (m, 2 H), 2,65 (d, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,61 - 2,55 (m, 1 H), 2,48 - 2,42 (m, 1 H), 2,35 - 2,21 (m, 3 H), 2,11 - 2,05 (m, 1 H),1,62 - 1,59 (m, 8 H), 1,27 (s largo, 62 H), 0,93 (s, 9 H), 0,92 - 0,87 (m, 12 H), 0,16 (s, 6 H); MS (Multimodo, pos) m/z = 1886 [M + H]+. Exemplo 23 terc-Butildimetilsilil-6-O-{6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3\5-3H- 2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-decanoilóxi-tetradecanoilamino]-3-O-[(R)-3- decanoilóxi-tetradecanoil]-e-D-glicopiranosil}-2-azido-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-benzilóxi- tetradecanoil]-2-deóxi-e—D-glicopiranosídeo (24)

[0174]O composto 23 (446 mg, 0,236 mmol) foi primeiro desprotegido usando DDQ (80 mg, 0,35 mmol), seguindo o procedimento para o intermediário 10 para o Alvo A. Este intermediário (343 mg, 0,194 mmol) depois foi acilado em uma maneira similar à síntese do composto 10 para o Alvo A usando cloreto de decanoila (185 mg, 0,970 mmol) e piridina (123 mg, 1,55 mmol) para fornecer 24 (343 mg, 76 %) como um óleo incolor. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,39 - 7,22 (m, 14 H), 6,15 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 5,54 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,28 - 5,24 (m, 1 H), 5,14 - 4,96 (m, 8 H), 4,60 - 4,45 (m, 10 H), 3,99 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 3,90 - 3,85 (m, 1 H), 3,80 - 3,65 (m, 4 H), 3,55 (m, 3 H), 3,46 - 3,39 (m, 1 H), 3,32 - 3,27 (m, 1 H), 2,66 - 2,53 (m, 3 H), 2,46 - 2,41 (m, 1 H), 2,35 - 2,18 (m, 7 H), 1,61 - 1,51 (m, 10 H), 1,26 (s largo, 78 H), 0,95 (s, 9 H), 0,92 - 0,90 (m, 15 H), 0,19 (s, 3 H), 0,18 (s, 3 H). Exemplo 24 terc-Butildimetilsilil-6-O-{6-O-benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3\5-3H- 2,4,3-benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-decanoilóxi-tetradecanoilamino]-3-O-[(R)-3- decanoil0xi-tetradecanoil]-β-D-glicopiranosil}-4-O-benzil-3-O-[(R)-3- benziloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-benzilóxi-tetradecanoilamino]-2-deóxi-e—D- glicopiranosídeo (25)

[0175]Uma suspensão de 24 (296 mg, 0,154 mmol), zinco (100 mg, 1,52 mmol) e ácido acético (53 μL, 0,93 mmol) em DCM (10 mL) foi agitada na temperatura ambiente durante 12 h, depois que ela foi diluída com acetato de etila (25 mL). Os sólidos foram removidos por filtração e lavados com acetato de etila (2 x 25 mL), e os filtrados combinados foram lavados com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 100 mL) e salmoura (200 mL). A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 2,5:1 (v/v)) para fornecer a amina como um xarope amarelo claro (245 mg, 84 %). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,39 - 7,22 (m, 14 H), 6,15 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 5,54 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,29 - 5,23 (m, 1 H), 5,13 - 4,93 (m, 8 H), 4,62 - 4,30 (m, 9 H), 4,00 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 3,88 - 3,65 (m, 6 H), 3,56 - 3,53 (m, 2 H), 3,46 - 3,41 (m, 1 H), 2,66 - 2,58 (m, 4 H), 2,54 - 2,45 (m, 2 H), 2,35 - 2,17 (m, 7 H), 1,64 - 1,42 (m, 12 H), 1,26 (s largo, 78 H), 0,87 (s, 24 H), 0,13 (s, 6 H).

[0176]A amina foi adicionada a uma solução agitada de (R)-3- benziloxitetracloreto de decanoila (228 mg, 0,646 mmol), DMAP (15,79 mg, 0,1292 mmol) e piridina (83 μL, 1,0 mmol) em DCM (5,0 mL). A mistura de reação foi agitada durante 14 h. A mistura foi diluída com CH2Cl2 e foi lavada com NaHCO3 saturado/salmoura, seca sob Na2SO4 e concentrada sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia TLC em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 3,5:1 (v/v)) para fornecer 25 (450 mg, >100 %) como um sólido branco. Rf = 0,54 (hexanos/acetato de etila, 2:1 (v/v)). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,39 - 7,22 (m, 19 H), 6,14 - 6,10 (m, 2 H), 5,57 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,29 - 5,24 (m, 1 H), 5,13 - 4,93 (m, 7 H), 4,61 - 4,41 (m, 10 H), 4,00 (d, J = 10,5 Hz, 1 H), 3,89 - 3,79 (m, 8 H), 3,72 - 3,66 (m, 4 H), 3,57 - 3,35 (m, 3 H), 2,73 - 2,57 (m, 10 H), 2,39 - 2,15 (m, 10 H), 1,71 - 1,64 (m, 7 H), 1,26 (s largo, 93 H), 0,88 (s, 24 H), 0,83 (s, 9 H). Exemplo 25 6-O-{6-O-Benzil-2-deóxi-4-O-(1,5-di-hidro-3-oxo-3A5-3H-2,4,3- benzodioxafosfepin-3-il)-2-[(R)-3-decanoilóxi-tetradecanoilamino]-3-O-[(R)-3- decanoilóxi-tetradecanoil]-e-D-glicopiranosil}-4-O-benzil-3-O-[(R)-3-benzilóxi- tetradecanoil]-2-[(R)-3-benzilóxi-tetradecanoilamino]-2-deóxi-a-D-glicopiranose (26)

[0177]Fluoreto de hidrogênio/piridina (1,12 mL, 43,1 mmols) foi adicionado, às gotas, a uma solução agitada de 25 (450 mg, 0,204 mmol) em THF (5 mL). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 14 h. A mistura foi diluída com acetato de etila (100 mL) e lavada com NaHCO3 aquoso saturado (2 x 80 mL) e salmoura. A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 3:1 a 4:3 (v/v)) para fornecer 26 (180 mg, 42 %) como um sólido branco. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,39 - 7,19 (m, 19 H), 6,31 (d, J = 7,0 Hz, 1 H), 6,24 (d, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,57 - 5,48 (m, 2 H), 5,40 (t, J = 9,5 Hz, 1 H), 5,28 - 5,21 (m, 1 H), 5,14 - 4,96 (m, 8 H), 4,68 - 4,41 (m, 12 H), 4,23 - 4,19 (m, 1 H), 4,13 - 4,06 (m, 1 H), 3,94 - 3,66 (m, 9 H), 3,38 - 3,28 (m, 2 H), 2,67 - 2,58 (m, 3 H), 2,44 - 2,20 (m, 11 H), 1,58 (s largo, 12 H), 1,26 (s largo, 93 H), 0,91 - 0,81 (m, 18 H). Exemplo 26 (3R)-((2R,3S,4R,5S)-3-((R)-3-(Decanoilóxi)tetradecanamido)-2-(((3S,4R,5S)- 3,6-di-hidróxi-5-((R)-3-hidroxitetradecanamido)-4-((R)-3-hidroxitetradecanoilóxi)tetra- hidro-2H-piran-2-il)metóxi)-6-(hidroximetil)-5-(fosfono-óxi)tetra-hidro-2H-piran-4-il) 3-

[0178]O composto 26 (180 mg, 0,0858 mmol) foi dissolvido em THF anidro (15 mL). Negro de paládio (0,225 g) foi adicionado à mistura e foi hidrogenado sob atmosfera de hidrogênio (50 psi) durante a noite. A mistura foi filtrada através de um leito de terra de diatomácea. O filtrado foi esfriado a -40 °C e uma solução de amônia em metanol (1,8 mL, 4 M) foi adicionada. A mistura foi concentrada sob vácuo sem aquecimento. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica, eluindo com uma mistura de clorofórmio/metanol/água, 80:20:1 (v/v) para fornecer o composto desejado (IX) (102 mg, 73 %). A análise por TLC e RMN de 1H mostrou a presença de gordura e uma mancha corrente desbotada (TLC em CH2Cl2/CMA, 4:1). O resíduo foi submetido à cromatografia (coluna RediSep 12 g, eluída com um gradiente de CH2Cl2 isocrático para 5 volumes de coluna (CVs), um gradiente através de CMA a 25 % em 10 CVs, isocrático para 10 CVs, um gradiente através de CMA a 100 % em 10 CVs, isocrático a CMA a 100 % para 10 CVs, 20 mL/min) para fornecer o produto desejado (57 mg, 25 %). A análise por TLC das frações combinadas e concentradas ainda indicou uma quantidade muito pequena de impurezas um pouco acima do produto desejado. O resíduo foi purificado novamente por cromatografia em gel de sílica (duas colunas em série RediSep 12 g, mesmo gradiente citado acima) para fornecer 8,9 mg do produto puro desejado por TLC e 11,9 mg de produto levemente impuro depois de dissolver em metanol/água/clorofórmio e liofilização. Rendimento total (20,8 mg, 14 %) como um sólido branco amarelado. Rf = 0,40 CMA. RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 5,40 - 5,30 (s largo, 2 H), 4,10 - 4,00 (m, 4 H), 3,70 - 3,60 (m, 4 H), 2,83 - 2,76 (m, 1 H), 2,75 - 2,20 (m, 13 H), 2,10 - 1,90 (largo, 9 H), 1,40 - 1,00 (largo, 106 H), 0,90 - 0,70 (largo, 18 H). MS (Multimodo, neg) m/z = 1632 [M - H]-. Exemplo 27 3-Oxotetradecanoato de metila (29)

[0179]A uma suspensão de etóxido de magnésio (10,82 g, 94,61 mmols) em 1,4-dioxano (100 mL) foi adicionado hidrogenomalonato de metila (25,0 g, 189 mmols) em 1,4-dioxano (100 mL). A pasta fluida resultante foi agitada durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo. Em um frasco separado, ácido láurico (28, 20,85 g, 104,1 mmols) foi dissolvido em 1,4-dioxano (50 mL) e uma solução de CDI (16,88 g, 104,1 mmols) em 1,4-dioxano (150 mL) foi adicionada na temperatura ambiente. A solução resultante foi agitada durante a noite. A mistura depois foi transferida ao frasco de magnésio-malonato de metila. A suspensão resultante foi submetida ao refluxo durante a noite. A mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi novamente dissolvido em DCM (300 mL) e filtrado através de um tampão de sílica (10 g). O solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (coluna RediSep 360 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 30 %/hexanos durante 80 min, 100 mL/min) para fornecer o produto 29 (17 g, 61 %) como um xarope amarelo claro. Exemplo 28 3-Hidroxitetradecanoato de (R)-metila (30)

[0180]Uma pasta fluida de 3-oxotetradecanoato de metila (29, 29,0 g, 113 mmols) em metanol (120 mL) foi purgada em uma luva de vidro de reator de alta pressão de 300 mL com N2 durante 10 minutos. Dicloro-R-2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1’- binaftil-rutênio (897 mg, 1,10 mmol) foi adicionado. A mistura foi colocada em um reator compacto série Parr 5500. O reator foi carregado com H2 (60 psi) e ventilado 3 vezes. O reator foi carregado com H2 (60 psi) e agitado (1200 rpm) e aquecido a 50 °C durante 20 h. O reator foi esfriado até a temperatura ambiente e a solução laranja resultante foi concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 40 %/hexanos durante 60 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 30 (28,5 g, rendimento de 97 %) como um sólido branco. Exemplo 29 3-(Benzilóxi)tetradecanoato de (R)-metila (31)

[0181]A uma solução do composto 30 (2,8 g, 10,83 mmols) e tricloroacetimidato de benzila (3,4 g, 14 mmols) em DCM (100 mL) foi adicionado ácido trifluorometanossulfônico (0,24 mL, 2,7 mmols), às gotas, a 0 °C. A mistura resultante foi agitada a 0 °C durante 6 h e aquecida até a temperatura ambiente. A mistura foi lavada com uma solução saturada de NaHCO3 (300 mL) e água (300 mL) e a camada orgânica seca em Na2SO4. O agente de secagem foi removido por filtração e os solventes removidos usando um evaporador rotativo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 80 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 30 %/hexanos durante 60 min, 60 mL/min) para fornecer o produto 31 (1,2 g, 32 %) como um líquido incolor. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,30 - 7,05 (m, 5 H), 4,51 (s, 2 H), 3,90 - 3,80 (m, 1 H), 3,70 (s, 3 H), 2,58 - 2,45 (m, 2 H), 1,80 - 1,60 (m, 2 H), 1,50 - 1,20 (m, 18 H), 0,85 (t, J = 5,8 Hz, 3 H). Exemplo 30

[0182]Éster 31 (1,3 g, 3,73 mmols) foi dissolvido na mistura de THF/MeOH/CH3CN (v/v/v, 1/1/1, 90 mL). Hidróxido de lítio mono-hidratado (235 mg, 5,6 mmols) como uma solução em água (30 mL) foi adicionado e a mistura agitada durante a noite. A quantidade de solvente foi reduzida, a vácuo, a cerca de 30 mL. À solução aquosa remanescente foi adicionado ácido clorídrico 1 M, resultando no pH menor que 3. A camada aquosa foi extraída com éter dietílico (3 x 40 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio. O agente de secagem foi removido por filtração e os solventes removidos usando um evaporador rotativo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 40 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 50 %/hexanos durante 40 min, 40 mL/min) para fornecer o produto 33 (990 mg, 79 %) como um líquido incolor. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,30 - 7,05 (m, 5 H), 4,51 (s, 2 H), 3,90 - 3,80 (m, 1 H), 2,58 - 2,45 (m, 2 H), 1,80 - 1,60 (m, 2 H), 1,50 - 1,20 (m, 18 H), 0,85 (t, J = 5,8 Hz, 3 H). Exemplo 31 3-(4-Metoxibenzilóxi)tetradecanoato de (R)-metila (32)

[0183]A uma solução do composto 30 (3,50 g, 12,9 mmols) e 4- metoxitricloroacetimidato de benzila (4,65 g, 17,3 mmols) em DCM (100 mL) foi adicionado ácido canforsulfônico (450 mg, 1,92 mmols). A mistura foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. A mistura foi lavada com uma solução saturada de NaHCO3 (300 mL) e água (300 mL) e seca em Na2SO4. O agente de secagem foi removido por filtração e os solventes removidos usando um evaporador rotativo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 30 %/hexanos durante 70 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 32 (4,01 g, 81 %) como um líquido incolor. Exemplo 32

[0184]Éster 32 (4,01 g, 10,4 mmols) foi dissolvido na mistura de THF/MeOH/CH3CN (v/v/v, 1/1/1, 90 mL). Hidróxido de lítio mono-hidratado (874 mg, 20,8 mmols) como uma solução em água (30 mL) foi adicionado e a mistura agitada durante a noite. A quantidade de solvente foi reduzida, a vácuo, a cerca de 30 mL. À solução aquosa remanescente foi adicionado ácido clorídrico (1 M), resultando no pH menor do que 3. A camada aquosa foi extraída com éter dietílico (3 x 40 mL). Os extratos orgânicos combinados foram secos em sulfato de sódio. O agente de secagem foi removido por filtração e os solventes removidos usando um evaporador rotativo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 50 %/hexanos durante 60 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 34 (3,37 g, 89 %) como um líquido incolor. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 7,22 (d, J = 6,1 Hz, 2 H), 6,82 (d, J = 6,1 Hz, 2 H), 4,46 (s, 2 H), 3,81 (m, 1 H), 3,75 (s, 3 H), 2,65 - 2,49 (m, 2 H), 1,80 - 1,60 (m, 2 H), 1,50 - 1,20 (m, 18 H), 0,85 (t, J = 5,8 Hz, 3 H). Exemplo 33 (R)-3-(4-Metoxibenzilóxi)tetracloreto de decanoila (35)

[0185]A uma solução de ácido 34 (500 mg, 1,37 mmol) em DCM (5 mL) foi adicionado dimetilformamida (DMF) (100 mg, 1,37 mmol) e a mistura resultante foi esfriada a -10 °C. Cloreto de oxalila (174 mg, 1,37 mmol) em DCM (5 mL) foi adicionado às gotas. A solução foi aquecida até a temperatura ambiente durante 1 h. Depois que a análise por TLC não apresentou ácidos, a mistura foi concentrada a vácuo e usada sem purificação adicional. Exemplo 34 3-Hidroxitetradecanoato de (R)-2-oxo-2-feniletila (37)

[0186]A uma solução de ácido (R)-3-hidroxitetradecanóico (36, veja a preparação abaixo) (9,55 g, 39,1 mmols) e trietilamina (5,90 g, 58,6 mmols) em acetato de etila (500 mL) foi adicionado 2-bromoacetofenona (7,90 g, 39,1 mmols) na temperatura ambiente. A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 14 h. O precipitado foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 30 %/hexanos durante 50 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 37 (10,2 g, rendimento de 72 %) como um sólido branco. Exemplo 35

[0187]A uma solução de 37 (4,80 g, 13,2 mmols) e piridina (2,10 g, 26,5 mmols) em DCM (100 mL) a 0 °C foi adicionado cloreto de decanoila (38, 2,8 g, 4,8 mmols). A mistura foi agitada durante 14 h, possibilitando a elevação da temperatura da mistura até a temperatura ambiente. A mistura foi lavada com uma solução saturada de NaHCO3 (100 mL) e salmoura (100 mL) e seca em Na2SO4. O agente de secagem foi removido por filtração e os solventes removidos usando um evaporador rotativo. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 40 %/hexanos durante 50 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 39 (6,68 g, 97 %) como um líquido incolor. Exemplo 36 Ácido (R)-3-(decanoilóxi)tetradecanóico (40)

[0188]Éster 39 (10,15 g, 20,77 mmols) foi dissolvido em ácido acético (100 mL). Zinco (15,5 g, 237 mmols) foi adicionado e a mistura aquecida em refluxo durante 4 h. O ácido acético foi removido sob vácuo e o resíduo submetido à azeotropia com tolueno à secura. O resíduo foi purificado por cromatografia em gel de sílica (coluna RediSep 120 g, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 60 %/hexanos durante 50 min, 85 mL/min) para fornecer o produto 40 (7,2 g, 89 %) como um líquido incolor. RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) δ 5,23 - 5,19 (m, 1 H), 2,62 - 2,55 (m, 2 H), 2,34 - 2,25 (m, 2 H), 1,65 - 1,58 (m, 2 H), 1,28 - 1,20 (m, 32 H), 0,85 (m, 6 H). Exemplo 37 3-Hidroxitetradecanoato de (R)-metila (39)

[0189]Uma pasta fluida de 3-oxotetradecanoato de metila (41, 5,27 g, 20,6 mmols) em metanol (30 mL) em uma luva de vidro de reator de alta pressão de 300 mL foi espalhada com N2 durante 10 minutos. Dicloro-R-2,2’-bis(difenilfosfino)-1,1’- binaftilrutênio (142 mg, 1,1 mmol) foi adicionado e a mistura foi colocada em um reator compacto série Parr 5500. O reator foi carregado com H2 (60 psi) e ventilado três vezes. O reator depois foi carregado com uma porção final de H2 (60 psi) agitada (600 rpm) e aquecida a 50 °C durante 20 h. O reator depois foi esfriado até a temperatura ambiente e a mistura concentrada a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 50 %/hexanos para fornecer 42 (3,97 g, 74 %) como um sólido branco amarelado. RMN de 1H (CDCl3) δ 4,00 - 3,98 (m, 1 H), 3,71 (s, 3 H), 2,82 (d, J = 6,5 Hz, 1 H), 2,62 - 2,30 (m, 2 H), 1,54 - 1,39 (m, 3 H), 1,27 (s largo, 17 H), (m, 20 H), 0,86 (t, J = 7,0 Hz, 3 H). Exemplo 38 Ácido (R)-3-hidroxitetradecanóico (36)

[0190]Hidróxido de lítio mono-hidratado (1,98 g, 47,2 mmols) foi adicionado a uma solução de 3-hidroxitetradecanoato de (R)-metila (42, 8,17 g, 31,5 mmols) em THF (66 mL) e água (66 mL) e agitado na temperatura ambiente durante 2 h. A mistura depois foi diluída com éter dietílico (1 L) e o pH ajustado a ~3 com uma solução de ácido clorídrico (1 N). A solução depois foi extraída com éter dietílico (200 mL) e as frações orgânicas foram combinadas e secas em Na2SO4. Na2SO4 foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado a vácuo para fornecer ácido (R)-3- hidroxitetradecanóico (36, 7,59 g, 98 %) como um sólido branco amarelado. RMN de 1H (CDCl3) δ 3,99 - 3,94 (m, 1 H), 2,45 - 2,39 (m, 2 H), 1,47 (s largo, 3 H), 1,29 (s largo, 17 H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 3 H). Exemplo 39 (R)-2-Oxo-2-feniletil-3-tetradecanoiloxitetradecanoato (46)

[0191]Cloreto de miristoila (45, 8,83 g, 35,8 mmols) foi adicionado a uma solução de 3-hidroxitetradecanoato de (R)-2-oxo-2-feniletila (37, preparado de acordo com Exemplo 34, 10,8 g, 29,8 mmols) em piridina (40 mL). A mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente durante 14 h. A mistura depois foi concentrada a vácuo e a piridina residual removida, dissolvendo o resíduo em tolueno (100 mL) e concentrando a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 20 %/hexanos, para fornecer 46 (16,31 g, 83 %) como um óleo incolor. RMN de 1H (CDCl3) δ 7,90 (m, 2 H), 7,64 - 7,57 (m, 1 H), 7,50 - 7,45 (m, 2 H), 5,33 (s, 2 H), 5,31 - 5,27 (m, 1 H), 2,80 - 2,70 (m, 2 H), 2,33 - 2,26 (t, J = 4,5 Hz, 2 H), 1,65 - 1,58 (m, 2 H), 1,31 - 1,21 (m, 40 H), 0,85 (t, J = 10,0 Hz, 6 H). Exemplo 40

[0192]Pó de zinco (24,42 g, 373,3 mmols) foi adicionado a uma solução de 46 (16,28 g, 28,42 mmols) em ácido acético (150 mL). A mistura depois foi aquecida em refluxo (115 °C) durante 3 h. A mistura depois foi concentrada a vácuo e a piridina residual removida, dissolvendo o resíduo em tolueno (100 mL) e concentrando a vácuo. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em gel de sílica, eluindo com um gradiente de acetato de etila 0 a 30 %/hexanos para fornecer ácido (R)-benzil 3-(tetradecanoilóxi)tetradecanóico (47, 11,14 g, rendimento de 86 %) como um óleo incolor. RMN de 1H (CDCl3) δ 5,29 - 5,18 (m, 1 H), 2,62 - 2,55 (m, 2 H), 2,34 - 2,25 (m, 2 H), 1,65 - 1,58 (m, 3 H), 1,28 - 1,20 (m, 40 H), 0,85 (m, 6 H). Exemplo 41 terc-Butildimetilsilil-2-azido-4-O-benzil-2-deóxi-e—D-glicopiranosídeo (47)

[0193]O composto 4 (preparado de acordo com o Exemplo 3, 1,32 g, 3,36 mmols) foi dissolvido em uma solução de BH3 (1 M) em THF (18,1 mL, 18,1 mmols). Depois que a mistura foi agitada as 0 °C durante 5 min, triflato de dibutilboro (1 M em DCM, 3,62 mL, 3,62 mmols) foi adicionado às gotas e a mistura de reação foi agitada a 0 °C durante 1 h adicional. Subsequentemente, trietilamina (0,5 mL) e metanol (~0,5 mL) foram adicionados até que a evolução de gás H2 foi interrompida. Os solventes foram evaporados a vácuo e o resíduo foi coevaporado com metanol (3 x 50 mL). O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexanos/acetato de etila, 8:1 (v/v)) para fornecer 14 (0,67 g, 49 %) como um óleo incolor. Rf = 0,40 (hexanos/acetato de etila, 3:1 (v/v)). RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 7,32 - 7,31 (m, 5 H), 4,81 (d, J = 11,4 Hz, 1 H), 4,70 (d, J = 11,4 Hz, 1 H), 4,55 (d, J = 7,5 Hz, 1 H), 3,84 (m, 1 H), 3,70 (dd, 1H, J = 12,0, 1,5 Hz, 1 H), 3,49 - 3,43 (m, 2 H), 3,33 (s largo, 1 H), 3,22 - 3,17 (m, 1 H), 0,92 (s, 9 H), 0,14 (s, 6 H). Exemplo 42 Indução de resposta imune do tipo Th1 in vivo

[0194]Este exemplo demonstra a atividade imunoestimulante do tipo Th1 in vivo para um composto ilustrativo de GLA da invenção tendo a seguinte estrutura (IX):

[0195]O composto IX foi usado em uma vacina contendo um polipeptídeo antigênico de Mycobacterium tuberculosis referido como ID83. Metodologias imunológicas padrão e reagentes foram utilizados (Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY). Camundongos (quatro animais C57BL/6 por grupo) foram imunizados, três vezes, em intervalos de três semanas com antígeno de ID83 (8 μg por animal para cada imunização) em água, antígeno de ID83 (8 μg por animal para cada imunização) formulado em um veículo de emulsão estável ou antígeno de ID83 (8 μg por animal para cada imunização) formulado em uma emulsão estável contendo (i) GLA-SE (10 μg por animal para cada imunização) ou (ii) Composto IX (10 μg por animal para cada imunização).

[0196]Uma semana depois de cada injeção, os camundongos foram submetidos à sangria para avaliar as respostas de anticorpo específico para o antígeno (IgG1 e IgG2c). Três semanas depois da última imunização, os camundongos foram sacrificados e os baços coletados para a análise das respostas da citocina IFN-Y dependente de células T ao estímulo do antígeno in vitro através de ELISPOT, de acordo com os métodos publicados (Id.). As respostas da citocina IFN-y foram associadas com um fenótipo protetor TH1 contra infecção por M. tuberculosis.

[0197]A Figura 1 mostra os dados de ELISPOT da produção de citocina IFN- y anti-ID83 induzida em camundongos três semanas depois da terceira imunização usando antígeno de ID83 e antígenos de componente de ID83 (Rv2608, Rv1813 e Rv3620) formulados com uma emulsão estável (SE) de Composto IX 10 μg, em comparação ao ID83 formulado em GLA-SE, SE ou água. Médias e SEM de células que secretam IFN-y por milhão de esplenócitos em cada grupo são mostradas. “GLA-SE”, conforme usado nos Exemplos neste relatório, se refere a uma emulsão estável de um composto, conforme descrito na Publicação de Patente U.S. No 20080131466, em que R1, R3, R5 e R6 são alquila linear C11; e R2 e R4 são alquila linear C13.

[0198]Todos os animais responderam de modo equivalente a ConA, um ativador celular potente e mitogênio. A vacinação de ID83 + Composto IX induziu respostas de citocina específicas do antígeno de ID83 robustas, enquanto pouca ou nenhuma resposta foi observada nos grupos controle ID83 + água ou ID83 + SE. Níveis similares de células que secretam IFN-Y foram induzidos em esplenócitos purificados a partir de camundongos imunizados com ID83 + Composto IX ou ID83 + GLA-SE sob re-estímulo com os antígenos de componente de ID83, Rv2608, Rv1813 e Rv3620.

[0199]Em conclusão, o Composto IX em uma formulação oleosa estável com candidato de antígeno de ID83 para vacina contra M. tuberculosis induziu predominantemente respostas imunes específicas do antígeno do tipo celular (células T) associadas com o fenótipo TH1 protetor. Exemplo 43 Indução de respostas imunes do tipo Th1 e Th2 in vivo

[0200]Este exemplo demonstra a atividade imunoestimulante do tipo Th1 e Th2 in vivo do Composto IX em uma vacina contendo um antígeno de Mycobacterium tuberculosis referido como ID83. As metodologias imunológicas padrão e reagentes foram utilizados (Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (Eds.) 2006 John Wiley & Sons, NY).

[0201]Os camundongos (quatro animais C57BL/6 por grupo) foram imunizados, três vezes, em intervalos de três semanas com o antígeno de ID83 (8 μg por animal para cada imunização) usado sozinho ou formulado em uma emulsão estável contendo o Composto IX (10 μg por animal para cada imunização). Os soros foram coletados através da sangria dos animais uma semana depois de cada imunização e os níveis de soro de anticorpos IgG1 e IgG2c específicos para ID83 foram examinados por ELISA, de acordo com os métodos publicados (Id.). A predominância de isotipo de anticorpo IgG1 ou IgG2c está associada com as respostas TH2 ou TH1, respectivamente. Foi demonstrado que uma resposta TH1 é necessária para a proteção contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis.

[0202]Conforme mostrado na Figura 2, a vacinação com ID83 em água induziu predominantemente o anticorpo IgG1 específico do antígeno. Ao contrário, a vacinação com ID83 + SE, ID83 + Composto IX-SE ou ID83 + GLA-SE induziu títulos do anticorpo IgG2c mais altos e converteu o fenótipo em uma resposta do anticorpo IgG1:IgG2c misto específico do antígeno. Exemplo 44 Indução de imunoestímulo dependente de TLR4 em células humanas

[0203]Este exemplo demonstra a atividade imunoestimulante do Composto IX em células humanas. O Composto IX foi testado in vitro usando células HEK 293 (InvivoGen) com vetores de expressão que codificam 1) TLR4, MD-2, e CD14, ou 2) TLR2 e TLR6 para definir a atividade do composto e dependência de TLR4, e excluir a ativação de TLR2. Estas linhagens celulares HEK 293 foram transfectadas de maneira estável com o vetor repórter de NF-kB pNifty-2, tal que a fosfatase alcalina foi secretada no meio de crescimento na ativação da via de sinalização de TLR. As linhagens celulares transfectadas foram plaqueadas em 5 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços e estimuladas durante 16 a 24 horas, cultivadas em meio contendo diluções em série do Composto IX e outros adjuvantes. A atividade da fosfatase alcalina secretada foi medida no meio de cultura usando o ensaio QUANTIBlue® (InvivoGen). Os dados foram medidos como aumento de NF-kB acima do controle negativo PBS. Através do uso deste ensaio, o Composto IX mostrou aumento maior do que duas vezes de NF-kB em concentrações menores do que 0,1 μg/ml (Figura 3). Os resultados destes experimentos demonstraram claramente a atividade agonista de TLR4 para o Composto IX que não parece estar associada com a indução de TLR2. O Composto IX foi designado com base em considerações estruturais da estrutura atômica relatada de MD2 e TLR4. Como tal, o fato de que ele se liga e induz um perfil que é similar àquele de um agonista de TLR4 comercialmente aprovado (MPL®), é um resultado surpreendente e inesperado. Mais especificamente, o perfil para o Composto IX, vantajosamente, se eleva rapidamente, à medida que as concentrações são aumentadas, antes de esperar que os níveis de citocina subam a um ponto onde os efeitos colaterais negativos podem ser exercidos por si só. Assim, espera-se que o Composto IX e outros compostos ilustrativos da invenção possam ser seguramente administrados em uma faixa ampla de concentrações, o que é altamente desejável no contexto da reprodutividade de efeitos clínicos entre pacientes e para a segurança na variação de uma dose para adultos e crianças. Neste respeito, a atividade de citocina mais baixa para o Composto IX é um resultado surpreendente e desejável, o que ainda facilitará seu uso seguro em formulações clínicas. Exemplo 45 Indução de citocinas imunoestimulantes em células sanguíneas humanas

[0204]Neste exemplo, as células sanguíneas totais humanas foram estimuladas com Composto IX e os ensaios ELISA foram realizados para detectar a indução de citocinas imunoestimulantes. Diluções em série (1:5) do Composto IX e outros adjuvantes foram realizadas com solução salina tamponada com fosfato em uma placa de 96 poços para um total de 7 diluções. 100 μl de sangue humano recém coletado a partir de dois doadores diferentes foram misturados e incubados com 100 μl de diluções de adjuvante. Após uma incubação de 20 horas, as placas foram centrifugadas e os sobrenadantes (~70 μl) foram coletados, evitando glóbulos vermelhos, e armazenados a -20 °C antes da realização de ELISAs MIP-1-α e TNF-α usando procedimentos bioquímicos padrão. Os resultados destes experimentos ainda confirmaram que o Composto IX apresenta atividade imunoestimulante em células sanguíneas humanas primárias (Figura 4). Adicionalmente, estes resultados de doador primário imitaram os resultados observados em linhagens celulares humanas e ampliam descobertas importantes em relação às faixas de dose e perfis de segurança possíveis para este composto.

[0205]Todos as patentes U.S., publicações de pedido de patente U.S., pedidos de patente U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patente estrangeiros e publicações que não são de patentes acima referidas neste relatório descritivo e/ou listadas na Application Data Sheet, são integralmente incorporados neste relatório como referência.

[0206]A partir da descrição precedente, será avaliado que, embora as modalidades específicas da invenção tenham sido descritas neste relatório para propósitos de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, a invenção não é limitada, exceto pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Composto de GLA CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a seguinte estrutura (IV: io OH,

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: L1, L2, L3 e L4 são iguais ou diferentes e independentemente -O-, -NH- ou -(CH2)-; Y 1 é um grupo funcional ácido; Y 2 e Y3 são iguais ou diferentes e independentemente -OH, -SH ou um grupo funcional ácido; e Y 4 é -OH ou -SH.

2. Composto de GLA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que Y1 é -OP(=O)(OH)2 e Y2, Y3 e Y4 são, cada um, -OH.

3. Composto de GLA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que L1 e L3 são ambos -O- e L2 e L4 são ambos -NH.

4. Composto de GLA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que Y1 é -OP(O)(OH)2, Y2, Y3 e Y4 são, cada um, -OH, L1 e L3 são ambos -O- e L2 e L4 são ambos -NH.

5. Composto de GLA, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a seguinte estrutura (IX):

ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Composição de vacina CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em combinação com um antígeno ou um vetor de expressão recombinante que codifica um antígeno.

7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o constructo de expressão recombinante é um vetor viral.

8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o vetor viral é selecionado do grupo que consiste em um vetor de adenovírus, um vetor associado ao adenovírus, um vetor de herpesvírus, um vetor de lentivírus, um vetor de poxvírus e um vetor de retrovírus.

9. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o antígeno compreende um antígeno polipeptídico.

10. Uso do composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de uma vacina para induzir ou acentuar uma resposta imune específica ao antígeno em um indivíduo.

11. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Uso da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a produção de uma vacina para estimular uma resposta imune não específica em um indivíduo.