ES2338288T3 - Metodo mejorado para la produccion y purificacion de vectores adenovirales. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para preparar adenovirus recombinante, comprendiendo el procedimiento: (a) preparar un cultivo de células productoras en un medio seleccionado; (b) infectar las células productoras en el cultivo con adenovirus recombinante, en el que las células productoras se infectan entre la fase semilogarítmica de crecimiento y fase estacionaria de crecimiento; y (c) recoger adenovirus recombinantes del cultivo celular.

Description

Método mejorado para la producción y purificación de vectores adenovirales.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los campos de cultivo celular y producción de virus. Más particularmente, se refiere a métodos mejorados para el cultivo de células de mamífero, la infección de esas células con adenovirus y la producción de partículas de adenovirus infecciosas a partir de las mismas.

2. Descripción de técnica relacionada

Actualmente están evaluándose en la práctica clínica vectores adenovirales, que llevan transgenes que pueden transcribirse y traducirse para expresar proteínas terapéuticas, para el tratamiento de una variedad de indicaciones de cáncer, incluyendo canceres de pulmón y de cabeza y cuello. A medida que avanzan los ensayos clínicos, la demanda de vectores adenovirales de calidad clínica está aumentando drásticamente. La demanda anual proyectada para un ensayo clínico de 300 pacientes puede alcanzar aproximadamente 1,08 x 10^{16} partículas virales.

Tradicionalmente, los adenovirus se producen en matraces de cultivo tisular, "factorías celulares" o RB disponibles comercialmente. Las células infectadas por virus se recogen y se someten a múltiple congelaciones-descongelaciones para liberar los virus de las células en forma de lisado celular sin procesar. El lisado celular sin procesar (CCL) producido se purifica entonces mediante múltiples etapas de ultracentrifugación en gradiente de CsCl. La producción de virus notificada normalmente a partir de 100 factorías celulares de una sola bandeja es de aproximadamente 1 x 10^{4} partículas virales. Claramente, resulta inviable producir la cantidad requerida de virus usando este procedimiento tradicional. Deben desarrollarse nuevos procedimientos de purificación y producción escalables y que puedan validarse para satisfacer la demanda creciente.

El rendimiento de purificación de la ultracentrifugación en gradiente de CsCl es tan limitado que no puede satisfacer la demanda de vectores adenovirales para aplicaciones de terapia génica. Por tanto, con el fin de lograr la producción de vectores adenovirales a gran escala, deben desarrollarse métodos de purificación distintos de la ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Las notificaciones sobre la purificación cromatográfica de los virus son muy limitadas, a pesar de la extensa aplicación de cromatografía para la purificación de proteínas recombinantes. Se han evaluado la cromatografía por exclusión de tamaño, de intercambio iónico y de afinidad para la purificación de retrovirus, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, y los virus de plantas con grados variables de éxito (Crooks, et al., 1990; Aboud, et al., 1982; McGrath et al., 1978, Smith y Lee, 1978; O'Neil y Balkovic, 1993). Se han realizado incluso menos investigaciones sobre la purificación cromatográfica de adenovirus. Esta falta de actividad de investigación puede ser parcialmente atribuible a la existencia del método de purificación por ultracentrifugación en gradiente de CsCl, eficaz, aunque no escalable, para adenovirus.

Huyghe et al. (1996) han notificado la purificación de vectores adenovirales usando cromatografía de intercambio iónico conjuntamente con cromatografía de afinidad de quelación de metales. Se notificó una pureza de virus similar a la de la ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Desafortunadamente, sólo se recuperó el 23% de los virus tras el procedimiento de purificación en doble columna. Los factores del procedimiento que contribuyen a esta baja recuperación de virus son la etapa de congelación/descongelación utilizada por los autores para lisar células con el fin de liberar el virus de las células y el procedimiento de purificación en dos columnas.

El documento WO 98/22588 da a conocer un método mejorado para la producción y purificación de vectores adenovirales.

Claramente, existe una demanda de un método eficaz y escalable de producción de vectores adenovirales que dará como resultado una alta producción del producto para satisfacer la demanda creciente de tales productos. Recientemente, Blanche et al en el documento WO 98/00524 describen métodos de producción adenoviral que son útiles como técnica descriptiva. La publicación PCT n.º WO 98/00524 se cita específicamente en el presente documento por su descripción de técnicas para la producción y purificación de adenovirus recombinantes.

Sumario de la invención

La presente invención describe un nuevo procedimiento a gran escala para la producción y purificación de adenovirus. Este nuevo procedimiento de producción no sólo ofrece escalabilidad y capacidad de validación sino también una pureza de virus comparable con la lograda usando ultracentrifugación en gradiente de CsCl.

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar cantidades a gran escala de adenovirus. De hecho, se cree que pueden producirse cantidades muy grandes de partículas de adenovirus usando los procedimientos de la presente invención, cantidades de hasta aproximadamente 1 x 10^{18} partículas, y preferiblemente al menos aproximadamente 5 x 10^{14} partículas. Esto es sumamente deseable, ya que actualmente no existen técnicas disponibles para producir las cantidades muy grandes, comerciales de partículas de adenovirus requeridas para aplicaciones clínicas al alto nivel de pureza necesario.

En una realización, el procedimiento generalmente implica preparar un cultivo de células productoras sembrando células productoras en un medio de cultivo, infectar las células en el cultivo después que hayan alcanzado un crecimiento en fase semilogarítmica con un adenovirus seleccionado (por ejemplo, un adenovirus recombinante), y recoger las partículas de adenovirus del cultivo celular. Esto es porque los inventores sorprendentemente han descubierto que la producción máxima de virus se logra en las células productoras cuando se infectan en la parte final del crecimiento en fase logarítmica y antes del crecimiento estacionario. Preferiblemente, las partículas de adenovirus así obtenidas se someten entonces a técnicas de purificación o bien conocidas en la técnica o bien expuestas en el presente documento.

En ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, por tanto, las células productoras se infectan con adenovirus en entre aproximadamente la fase semilogarítmica y la fase estacionaria de crecimiento. La fase logarítmica de la curva de crecimiento es donde las células alcanzan su máxima tasa de división celular (es decir, crecimiento). El término fase semilogarítmica de crecimiento se refiere al punto medio de transición de una curva de crecimiento logarítmico. El crecimiento en fase estacionaria se refiere al tiempo en una curva de crecimiento (es decir, una meseta) en el que el crecimiento celular y la muerte celular han llegado al equilibrio.

En realizaciones incluso más preferidas, las células productoras se infectan con el adenovirus durante o después de la fase logarítmica tardía de crecimiento y antes de la fase estacionaria. La fase logarítmica tardía se define como el crecimiento celular que se aproxima al final del crecimiento logarítmico, y antes de alcanzar la fase estacionaria de crecimiento. La fase logarítmica tardía normalmente puede identificarse en una curva de crecimiento como un punto secundario o terciario de inflexión que se produce a medida que se ralentiza la fase de crecimiento logarítmico, que se aproxima al crecimiento estacionario.

En una realización preferida de la presente invención, las células productoras se siembran en el medio de cultivo celular usando un conjunto esencialmente homogéneo de células. Los inventores han descubierto sorprendentemente que el uso de un conjunto homogéneo de células para sembrar puede proporcionar una confluencia y una densidad celular muy mejoradas así como una mejor maduración del virus, lo que a su vez proporciona mayores cantidades de producción y pureza final del virus recuperado. En efecto, la siembra a través del uso de poblaciones celulares independientes en lugar de homogéneas, por ejemplo, a partir de dispositivos de cultivo celular individuales usados en la fase de expansión celular, puede dar como resultado una densidad celular irregular, y por tanto, niveles de confluencia irregulares en el momento de la infección. Se cree que el uso de un conjunto homogéneo de células para la siembra supera estos problemas.

En otra realización preferida de la presente invención, el medio de cultivo se perfunde al menos parcialmente durante un tiempo durante el crecimiento celular de las células productoras o tras la infección. La perfusión se usa con el fin de mantener niveles deseados de ciertos metabolitos y para eliminar y reducir de ese modo impurezas en el medio de cultivo. Las tasas de perfusión pueden medirse de diversas maneras, tales como en términos de volúmenes de sustitución/unidad de tiempo o en términos de niveles de ciertos metabolitos que se desean mantener durante los tiempos de perfusión. Por supuesto, el caso es normalmente que la perfusión no se lleve a cabo en todo momento durante el cultivo, etc., y generalmente se lleve a cabo solamente de vez en cuando durante el cultivo según se desee. Por ejemplo, la perfusión no se inicia normalmente hasta después de que ciertos componentes de los medios tal como la glucosa comiencen a agotarse y necesiten ser sustituidos.

Los inventores han descubierto que se prefieren particularmente tasas de perfusión bajas, porque las tasas de perfusión bajas tienden a mejorar la capacidad para obtener partículas de virus altamente purificadas. Los inventores prefieren definir la tasa de perfusión en términos del nivel de glucosa que se logra o se mantiene por medio de la perfusión. Por ejemplo, en la presente invención la concentración de glucosa en el medio se mantiene preferiblemente a una concentración de entre aproximadamente 0,5 g/l y aproximadamente 3,0 g/l. En una realización más preferida, la concentración de glucosa se mantiene a entre aproximadamente 0,70 g/l y 2,0 g/l. En una realización aún más preferida, la concentración de glucosa se mantiene a entre aproximadamente 1,0 g/l y 1,5 g/l.

También en ciertas realizaciones preferidas, los inventores prefieren recircular los medios de cultivo celular mientras que se llevan a cabo los procedimientos según la presente invención, e incluso más preferiblemente, la recirculación se lleva a cabo de manera continua. La recirculación es deseable porque permite una distribución más uniforme de nutrientes por toda la cámara de crecimiento celular.

En ciertas otras realizaciones, las células se siembran en el medio de cultivo y se permite que se adhieran a la superficie de cultivo durante entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 24 horas antes del comienzo de la recirculación del medio. La adhesión de células a una superficie celular permite generalmente un crecimiento celular más consistente y uniforme y una mayor tasa de producción de virus, lo que a su vez permite la producción de virus de mayor calidad. Se ha encontrado por los inventores que la recirculación algunas veces puede impedir la adhesión celular consistente y uniforme, y que interrumpir la recirculación durante las fases de adhesión celular puede proporcionar ventajas significativas.

Con respecto a la siembra, en una realización preferida de la presente invención, el medio de cultivo celular se siembra con entre aproximadamente 0,5 x 10^{4} y aproximadamente 3 x 10^{4} células/cm^{2}, y más preferiblemente con desde aproximadamente 1-2 x 10^{4} células/cm^{2}. El motivo de esto es que se ha encontrado que con el fin de lograr la expansión y el crecimiento celular máximos, lo más preferible es inocular a la cámara de crecimiento seleccionada un número de células menor que el que podría usarse normalmente en otras situaciones de crecimiento celular. Los inventores han encontrado que mayores números de células usadas en la etapa de la inoculación celular dan como resultado una densidad celular que es demasiado alta y puede dar como resultado un exceso de confluencia de células en el momento de la infección viral, disminuyendo así la producción. Un experto en la técnica podrá perfectamente determinar que en otros tipos de sistemas de cultivo celular, la optimización similar de la densidad de siembra para un sistema particular puede determinarse fácilmente. No obstante, en una realización particularmente preferida, el medio de cultivo celular se siembra con entre aproximadamente 7,5 x 10^{3} y aproximadamente 2,0 x 10^{4} células/cm^{2}. En una realización incluso más preferida, el medio de cultivo celular se siembra con entre aproximadamente 9 x 10^{3} y 1,5 x 10^{4} células/cm^{2}.

En otra realización preferida de la presente invención, el adenovirus recogido se purifica y se coloca en una composición farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéuticamente aceptable se define como una que cumple la seguridad minima requerida expuesta por la FDA u otro organismo de administración farmacéutica similar, y puede por tanto, administrarse de manera segura a un paciente. La presente invención proporciona procedimientos para la purificación del adenovirus. Por ejemplo, el adenovirus se purifica mediante etapas que incluyen la separación cromatográfica. Mientras que más de una etapa de cromatografía puede usarse según la presente invención para purificar el adenovirus, esto con frecuencia dará como resultado pérdidas significativas en términos de producción. Por tanto, los inventores han descubierto que pueden lograrse niveles sorprendentes de pureza cuando solamente se lleva a cabo una única etapa de cromatografía, particularmente cuando esa etapa de cromatografía se lleva a cabo usando cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico es una excelente elección para la purificación de partículas de adenovirus debido a la presencia de una carga negativa neta sobre la superficie de los adenovirus a pH fisiológico, permitiendo el aislamiento de partículas de adenovirus de alta pureza.

En realizaciones particulares de la presente invención, el adenovirus recombinante es un adenovirus de replicación deficiente que codifica para un gen terapéutico ligado operativamente a un promotor. Un adenovirus de replicación deficiente que lleva un gen terapéutico ligado a un promotor permite la expresión controlada del gen terapéutico mediante la activación del promotor. La elección precisa de un promotor permite además la regulación específica de tejidos y la expresión del gen terapéutico. En realizaciones particulares, el promotor es un promotor SV40 IE, VRS LTR, de \beta-actina, CMV-IE, tardío principal de adenovirus, de polioma F9-1 o un promotor de tirosinasa.

En otras realizaciones, el adenovirus de replicación deficiente carece de al menos una parte de la región E1 del genoma adenoviral. Se desea que los adenovirus de replicación deficiente que carecen de una parte de la región E1 reduzcan la reacción de toxicidad e inmunológica para células huéspedes. En otra realización de la presente invención, las células productoras complementan el crecimiento de los adenovirus de replicación deficiente. Ésta es una característica importante de las células productoras requerida para mantener un número alto de partículas virales del adenovirus de replicación deficiente. En ciertas realizaciones de este tipo, las células productoras son células 293, PER.C6, 911 o IT293SF. En una realización preferida, las células productoras son células 293.

En una realización preferida de la presente invención se contempla que el adenovirus recombinante codifique para un gen recombinante terapéutico. Por ejemplo, el gen terapéutico puede codificar para ras antisentido, myc antisentido, raf antisentido, erb antisentido, src antisentido, fms antisentido, jun antisentido, trk antisentido, ret antisentido, gsp antisentido, hst antisentido, bcl antisentido, abl antisentido, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF, mda-7, timidina quinasa o p53. En una realización incluso más preferida, el gen terapéutico es p53. Una de las anomalías más frecuentes que dan como resultado cáncer humano son las mutaciones en p53, por tanto, la capacidad para sustituir un gen p53 deficiente usando la presente invención es sumamente deseable.

En otra realización particular de la presente invención, el adenovirus se recoge mediante etapas que incluyen lisar las células productoras por medios distintos de congelación-descongelación. El motivo de esto es que el método de congelación-descongelación es algo problemático y no particularmente adecuado para la producción de cantidades comerciales. En realizaciones preferidas las células productoras se lisan por medio de lisis con detergente o autolisis. La recogida del adenovirus mediante lisis con detergente y autolisis da como resultado una recuperación de virus mucho mayor que el procedimiento de congelación-descongelación y es, por tanto, una mejora de la producción a gran escala de los adenovirus.

En una realización particular de la presente invención, el adenovirus recombinante purificado tiene una o más de las siguientes propiedades. Por ejemplo, la propiedad puede ser un título de virus de entre aproximadamente 1 x 10^{9} y aproximadamente 1 x 10^{13} ufp/ml, una concentración de partículas de virus de entre aproximadamente 1 x 10^{10} y aproximadamente 2 x 10^{13} partículas/ml, un ratio partícula:ufp de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60, menos de 50 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales, entre aproximadamente 50 pg y 1 ng de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas virales o un solo pico de elución de HPLC que consiste esencialmente en del 98 al 99,9% del área bajo el pico. Estos criterios seleccionan un adenovirus altamente purificado.

Además, para imponer adicionalmente límites sobre el procedimiento de purificación del adenovirus, se desean entre aproximadamente 5 x 10^{14} y 1 x 10^{18} partículas virales. Además, una o más de las siguientes propiedades mejoran adicionalmente la selección de partículas de adenovirus de alta pureza. Por ejemplo, la propiedad puede ser un título de virus de entre aproximadamente 1 x 10^{9} y aproximadamente 1 x 10^{13} ufp/ml, más preferiblemente 1 x 10^{11} y aproximadamente 1 x 10^{13} ufp/ml, y lo más preferiblemente 1 x 10^{12} y aproximadamente 1 x 10^{13} ufp/ml. Además, una concentración de partículas de virus de entre aproximadamente 1 x 10^{10} y aproximadamente 2 x 10^{13} partículas/ml, más preferiblemente 1 x 10^{11} y aproximadamente 2 x 10^{13} partículas/ml, y lo más preferiblemente 1 x 10^{12} y aproximadamente 1 x 10^{13} partículas/ml.

Adicionalmente, un ratio partícula:ufp de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60, más preferiblemente un ratio partícula:ufp de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50, incluso más preferible un ratio partícula:ufp de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40, y lo más preferiblemente un ratio partícula:ufp de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 40.

Para limitar la concentración de BSA, es preferible tener menos de 50 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ng y 50 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales, y más preferiblemente entre aproximadamente 5 ng y 40 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales.

También se desean bajas concentraciones de contaminación de ADN. Por tanto, es aceptable entre aproximadamente 50 pg y 1 ng de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas virales, incluso es más preferible entre aproximadamente 50 pg y 1000 pg de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas virales, y es lo más preferible entre aproximadamente 100 pg y 1000 pg de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas virales. Finalmente, se desea un adenovirus que eluye como un solo pico de HPLC, más preferiblemente es un adenovirus que eluye como un pico de HPLC que contiene entre aproximadamente el 98 y el 99,99% del área total bajo el pico.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, sólo se proporcionan a modo de ilustración, puesto que resultarán evidentes diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia de uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

Figura 1A y figura 1B. Perfiles de HPLC de las disoluciones virales a partir de series de producción usando tasas de perfusión de medio caracterizadas como "altas" (figura 1A) y "bajas" (figura 1B).

Figura 2. El perfil de HPLC del lisado celular sin procesar (CCL) de CellCube^{TM} (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 3A, figura 3B, figura 3C, figura 3D y figura 3E. Los perfiles de HPLC de disoluciones de lisis de CellCube^{TM} usando diferentes detergentes. Figura 3A Thesit®. Figura 3B Triton®X-100. Figura 3C. NP-40®. Figura 3D. Brij®80. Figura 3E. Tween®20. Concentración del detergente: 1% (p/v) temperatura de lisis: temperatura ambiente (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 4A y figura 4B. Los perfiles de HPLC de disoluciones de virus antes (figura 4A) y después (figura 4B) del tratamiento con Benzonase (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 5. El perfil de HPLC de una disolución de virus tras el tratamiento con Benzonase en presencia de NaCl 1 M (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 6. Purificación del virus AdCMVp53 en una condición de tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2 M, pH = 7,5.

Figura 7. Purificación del virus AdCMVp53 en una condición de tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2 M, pH = 9,0.

Figura 8A, figura 8B y figura 8C. Análisis por HPLC de fracciones obtenidas durante la purificación, figura 8A fracción 3, figura 8B fracción 4, figura 8C fracción 8 (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 9. Purificación del virus AdCMVp53 en una condición de tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,3 M, pH = 9.

Figura 10A, figura 10B, figura 10C, figura 10D y figura 10E. Análisis por HPLC de fracciones de virus sin procesar obtenidas durante la purificación y virus purificado en gradiente de CsCl. Figura 10A disolución de virus sin procesar. Figura 10B flujo continuo. Figura 10C. Pico número 1. Figura 10D. Pico número 2. Figura 10E. Virus purificado en CsCl (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 11. Perfil de purificación por HPLC en una columna de 5 cm de d.i.

Figura 12. La proteínas estructurales de adenovirus principales detectadas en SDS-PAGE.

Figura 13. La concentración de BSA en el virus purificado como nivel detectado del ensayo de inmunotransferencia de tipo Western.

Figura 14. El cromatograma para el material del lisado celular sin procesar generado de CellCube^{TM}.

Figura 15. El perfil de elución de la disolución de virus tratada purificada usando el método de la presente invención usando resina Toyopearl SuperQ.

Figura 16A y figura 16B. Análisis por HPLC de la fracción de virus del protocolo de purificación. Figura 16A perfiles de HPLC de la fracción de virus de la primera etapa de purificación. Figura 16B perfiles de HPLC de la fracción de virus de la segunda purificación (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 17. Purificación de disolución de virus recogido con Tween® al 1% a una baja tasa de perfusión del medio.

Figura 18. Análisis por HPLC de la fracción de virus producida a una baja tasa de perfusión del medio.

Figura 19A, figura 19B y figura 19C. Análisis del virus purificado en columna. Figura 19A análisis por SDS-PAGE. Figura 19B Inmunotransferencia de tipo Western para BSA. Figura 19C transferencia en ranura de ácido nucleico para determinar la concentración de ácido nucleico contaminante.

Figura 20A, figura 20B, figura 20C, figura 20D, figura 20E y figura 20F. Estudio de la capacidad de la resina Toyopearl SuperQ 650M. Figura 20A flujo continuo a partir de un ratio de carga de 1:1. Figura 20B. Virus purificado a partir de un ratio de carga de 1:1. Figura 20C flujo continuo de un ratio de carga de 2:1. Figura 20D. Virus purificado a partir de un ratio de carga de 2:1. Figura 20E flujo continuo a partir de un ratio de carga de 3:1. Figura 20F. Virus purificado a partir de un ratio de carga de 3:1 (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 21. Virus purificado en columna de ultracentrifugación en CsCl isopícnica.

Figura 22A y figura 22B. Los perfiles de HPLC de virus intactos presentes en el virus purificado en columna. A. Virus intacto B. Virus deficiente (línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).

Figura 23. Un diagrama de flujo de producción y purificación para AdCMVp53.

Figura 24. Cinética de la liberación de virus en el sobrenadante en un CellCube^{TM} de 4x100.

Figura 25. Cromatograma usando resina Source 15Q para la purificación.

Figura 26. Perfil de HPLC del producto Ad5CMV-p53 purificado de la resina Source 15Q.

Figura 27A y figura 27B. Comparación de la bioactividad del procedimiento original frente al procedimiento optimizado para producir el producto Ad5CMV-p53.

Figura 28. Diagrama de flujo de producción y purificación para el procedimiento optimizado de Ad5CMV-p53.

Figura 29. Ciclo de liofilización para formulaciones de adenovirus.

Figura 30A y figura 30B. Datos de estabilidad en almacenamiento usando secado secundario a 10ºC sin inertización con N_{2}. Figura 30A, secado secundario a 10ºC sin inertización con N_{2} para el conjunto de formulación 10; manitol al 6%, HAS al 0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM (pH-7,5 MgCl_{2} 1 1 mM). Figura 30B, secado secundario a 10ºC sin inertización con N_{2} para el conjunto de formulación 11; manitol al 5%, HAS al 0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM (pH-7,5, MgCl_{2} 1 mM).

Figura 31A y figura 31B. Datos de estabilidad en almacenamiento usando secado secundario a 30ºC sin inertización con N_{2}. Figura 31A, secado secundario a 30ºC sin inertización con N_{2} para el conjunto de formulación 10; manitol al 6%, HAS al 0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM (pH-7,5 MgCl_{2} 1 1 mM). Figura 31B, secado secundario a 30ºC sin inertización con N_{2} para el conjunto de formulación 11; manitol al 5%, HAS al 0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM (pH-7,5, MgCl_{2} 1 mM).

Figura 32A y figura 32B. Datos de estabilidad en almacenamiento usando secado secundario a 30ºC con inertización con N_{2}. Figura 32A, secado secundario a 30ºC con inertización con N_{2} para el conjunto de formulación 10; manitol al 6%, HAS al 0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM (pH-7,5 MgCl_{2} 1 1 mM). Figura 32B, secado secundario a 30ºC con inertización con N_{2} para el conjunto de formulación 11; manitol al 5%, HAS al 0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM (pH-7,5, MgCl_{2} 1 mM).

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Figura 33. Datos de estabilidad para el conjunto de formulación líquida n.º 1. G: glicerol; S: sacarosa; PEG: PEG-3500; T2: trehalosa. El glicerol está en tampón PBS (al 10%). Otras formulaciones están en tampón tris 10 mM con NaCl 0,15 M y MgCl_{2} mM (pH-8,2).

Figura 34A y figura 34B. Datos de estabilidad para el conjunto de formulación líquida n.º 2. Los excipientes están en tampón Tris 10 mM (pH-8,2) que consiste en glicerol al 0,5%, NaCl 0,15 M y MgCl_{2} 1 mM. Las formulaciones se almacenan a 4ºC y a temperatura ambiente bajo nitrógeno.

Figura 35. Datos de estabilidad para el conjunto de formulación líquida n.º 3.

Figura 36. Datos de estabilidad para el conjunto de formulación líquida n.º 4. Los excipientes están en tampón Tris 10 mM (pH-8,2) que consiste en glicerol al 1%, NaCl 0,15 M y MgCl_{2} 1 mM. Las formulaciones con virus se almacenan a 4ºC y a temperatura ambiente bajo nitrógeno.

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Descripción de las realizaciones ilustrativas

Se ha mostrado que los vectores adenovirales pueden usarse satisfactoriamente en la expresión de genes eucariotas y en el desarrollo de vacunas. Recientemente, estudios en animales han demostrado que puede usarse adenovirus recombinante para terapia génica. Estudios satisfactorios en la administración de adenovirus recombinante a diferentes tejidos han demostrado la eficacia de los vectores adenovirales en el tratamiento. Este éxito ha dado lugar al uso de tales vectores en ensayos clínicos en seres humanos. Existe actualmente un aumento de la demanda para la producción de vectores adenovirales para su uso en diversos tratamientos. Las técnicas disponibles actualmente son insuficientes para satisfacer tal demanda. La presente invención proporciona métodos para la producción de grandes cantidades de adenovirus para su uso en tales tratamientos.

La presente invención implica un procedimiento que se ha desarrollado para la producción y purificación de un adenovirus recombinante de replicación deficiente. El procedimiento de producción se basa en el uso de un biorreactor de cultivo celular para el crecimiento celular y la producción de virus. Tras la infección viral de las células productoras, el virus puede recogerse mediante cualquiera de varios de métodos, incluyendo autolisis o lisis química de virus. La disolución de virus sin procesar recogida puede purificarse entonces usando una serie de cromatografía de intercambio iónico simple, tras concentración/diafiltración y tratamiento con nucleasa para reducir la concentración del ácido nucleico contaminante en la disolución de virus sin procesar. El virus purificado en columna tiene una pureza equivalente con respecto a la del virus purificado mediante bandeo por cesio. La recuperación de procedimiento total del producto de virus es del 70% \pm 10%. Ésta es una mejora significativa sobre los resultados notificados por Huyghe et al. (1996). En comparación con la ultracentrifugación en gradiente de CsCl doble, la purificación en columna tiene la ventaja de ser más consistente, escalable, puede validarse, más rápida y menos costosa. Este nuevo procedimiento representa una mejora significativa en la tecnología para la fabricación de vectores adenovirales para terapia génica.

Por tanto, la presente invención se diseña para aprovechar estas mejoras en los sistemas de cultivo a gran escala y purificación con el propósito de producir y purificar vectores adenovirales. Los diversos componentes de un sistema de este tipo, y métodos para producir adenovirus con el mismo, se exponen en detalle a continuación.

1. Células huésped A) Células

En una realización preferida, la generación y propagación de los vectores adenovirales dependen de una única línea de células cooperadoras, denominada 293, que se transformó a partir de células de riñón embrionario humano mediante fragmentos de ADN del serotipo 5 de adenovirus (Ad5), y expresa constitutivamente proteínas E1 (Graham et al., 1977). Puesto que la región E3 es prescindible del genoma de Ad (Jones y Shenk, 1978), los actuales vectores de Ad, con la ayuda de las células 293, llevan ADN foráneo o bien en la región E1, la región E3 o bien en ambas (Graham y Prevec, 1991; Bett et al., 1994).

En un primer aspecto, la presente invención describe las líneas de células recombinantes que expresan parte del genoma adenoviral. Estas líneas celulares pueden apoyar la replicación de vectores recombinantes de adenovirus y los virus auxiliares que tienen defectos en ciertos genes adenovirales, es decir, son "permisivos" para el crecimiento de estos virus y vectores. La célula recombinante también se denomina célula cooperadora debido a su capacidad para complementar defectos en, y apoyar la replicación de, vectores adenovirales de replicación incompetente. El prototipo para una célula cooperadora adenoviral es la línea celular 293, que contiene la región E1 adenoviral. Las células 293 apoyan la replicación de vectores adenovirales que carecen de funciones E1 proporcionando in trans los elementos activos de E1 necesarios para la replicación. Otras líneas celulares que también apoyan el crecimiento de los adenovirus que carecen de la función E1 incluyen PER.C6 (IntroGene, NL), 911 (IntroGene, NL) e IT293SF.

Las células cooperadoras según la presente invención se derivan de una célula de mamífero y, preferiblemente, de una célula de primate tal como célula de riñón embrionario humano. Aunque se prefieren diversas células de primates y humanas o incluso son lo más preferidas las células de riñón embrionario humano, sería aceptable en la práctica de la invención cualquier tipo de célula que pueda apoyar la replicación del virus. Otros tipos celulares pueden incluir, pero no se limitan a, células Vero, células HeLa o cualquiera de las células eucariotas para las que se hayan establecido técnicas de cultivo celular siempre que las células sean permisivas para adenovirus. El término "permisivo para adenovirus" significa que el adenovirus o vector adenoviral puede completar todo el ciclo de vida del virus intracelular dentro del entorno celular.

La célula cooperadora puede derivarse de una línea celular existente, por ejemplo, de una línea de células 293, o desarrollada de novo. Tales células cooperadoras expresan los genes adenovirales necesarios para complementar in trans deleciones en un genoma adenoviral o que apoya la replicación de un vector adenoviral deficiente de otra manera, tales como la funciones E1, E2, E4, E5 y tardías. Una parte particular del genoma de adenovirus, la región E1, ya se ha usado para generar líneas celulares de complementación. Ya sean integradas o episómicas, las partes del genoma de adenovirus que carecen de un origen viral de replicación, cuando se introducen en una línea celular, no se replicarán incluso cuando la célula se superinfecte con adenovirus de tipo natural. Además, puesto que la transcripción de la unidad tardía principal es después de la replicación del ADN viral, las funciones tardías del adenovirus no pueden expresarse suficientemente a partir de una línea celular. Por tanto, las regiones E2, que se solapan con las funciones tardías (L1-5), se proporcionarán por los virus auxiliares y no por la línea celular. Normalmente, una línea celular según la presente invención expresará E1 y/o E4.

Tal como se usa en el presente documento, el término célula "recombinante" pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido un gen, tal como un gen del genoma adenoviral o de otra célula. Por tanto, las células recombinantes pueden distinguirse de células que se producen de manera natural que no contienen un gen introducido mediante recombinación. Las células recombinantes son por tanto células que tienen un gen o genes introducidos por "la mano del hombre".

La replicación se determina poniendo en contacto una capa de células no infectadas, o células infectadas con uno o más virus auxiliares, con partículas virales, seguido de la incubación de las células. La formación de placas virales, o zonas libres de células en la capa celular, es el resultado de la lisis provocada por la expresión de ciertos productos virales. La lisis celular es indicativa de replicación viral.

Ejemplos de otras líneas celulares de mamífero útiles que pueden usarse con un virus de replicación competente o convertido en células huésped de complementación para su uso con el virus de replicación deficiente son las células Vero y Hela y las líneas celulares de ovario de hámster chino, células W138, BHK, COS-7, HepG2, 3T3, RIN, MDCK y A549.

B) Crecimiento en medios de selección

En ciertas realizaciones, puede ser útil emplear sistemas de selección que impiden el crecimiento de células no deseables. Esto puede llevarse a cabo en virtud de la transformación permanente de una línea celular con un marcador seleccionable o mediante la transducción o infección de una línea celular con un vector viral que codifica para un marcador seleccionable. En cualquier situación, el cultivo de la célula transformada/transducida con un fármaco apropiado o compuesto selectivo dará como resultado la potenciación, en la población celular, de aquellas células que llevan el marcador.

Ejemplos de marcadores incluyen, pero no se limitan a, timidina quinasa de VHS, genes de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a antimetabolito puede usarse como base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G418; e hygro, que confiere resistencia a higromicina.

C) Crecimiento con retirada de suero

La adaptación a la retirada de suero de células dependientes del anclaje en cultivos en suspensión libre de suero, se han usado para la producción de proteínas recombinantes (Berg, 1993) y vacunas virales (Perrin, 1995). Hasta hace poco, ha habido pocas notificaciones sobre la adaptación de células 293A en cultivos en suspensión libre de suero. Gilbert notificó la adaptación de células 293A en cultivos en suspensión libre de suero para la producción de proteínas recombinantes y adenovirus (Gilbert, 1996). Se ha usado un método de adaptación similar para la adaptación de células A549 en cultivo en suspensión libre de suero para la producción de adenovirus (Morris et al., 1996). Sin embargo, la producción de virus específico de células en las células en suspensión adaptadas, es aproximadamente 5-10 veces menor que aquellas logradas en las células adheridas parentales.

Usando el procedimiento de retirada de suero similar, los inventores han adaptado satisfactoriamente las células 293A en cultivo en suspensión libre de suero (células 293SF). En este procedimiento, las células 293 se adaptaron a unos medios 293 disponibles comercialmente reduciendo secuencialmente la concentración de FBS en matraces T. En resumen, la concentración sérica inicial en los medios fue de FBS aproximadamente al 10% en medios DMEM en matraz T-75 y las células se adaptaron a los medios IS 293 libres de suero en matraces T reduciendo secuencialmente la concentración de FBS en los medios. Tras 6 pases en los matraces T-75 se estimó que el % de FBS era de aproximadamente el 0,019% en las células 293. Las células se subcultivaron dos veces más en los matraces T antes de que se trasfirieran a matraces con agitación. Los resultados descritos a continuación en el presente documento muestran que las células crecieron satisfactoriamente en el medio libre de suero (medio IS293, Irvine Scientific, Santa Ana, CA). El tiempo de duplicación promedio de las células fue de 18-24 h logrando concentraciones celulares estacionarias del orden de 4-10 x 10^{6} células/ml sin intercambio de medio.

D) Adaptación de las células para el cultivo en suspensión

Se han usado dos metodologías para adaptar células 293 en cultivos en suspensión. Graham adaptó células 293A en cultivo en suspensión (células 293N3S) mediante 3 pases en serie en ratones atímicos (Graham, 1987). Se encontró que las células 293N3S en suspensión podían apoyar a los vectores adenovirales E1. Sin embargo, Garnier et al. (1994) observó que las células 293N3S tenían una fase de latencia inicial relativamente larga en suspensión, una baja tasa de crecimiento y una fuerte tendencia a aglomerarse.

El segundo método que se ha usado es una adaptación gradual de células 293A en crecimiento en suspensión (Cold Spring Harbor Laboratories, células 293S). Garnier et al. (1994) notificó el uso de células 293S para la producción de proteínas recombinantes a partir de vectores adenovirales. Los autores encontraron que las células 293S se aglomeraron mucho menos en los medios libres de calcio y que un intercambio de medio nuevo en el momento de la infección por el virus podría aumentar significativamente la producción de proteína. Se encontró que la glucosa era el factor limitante en el cultivo sin intercambio de medio.

En la presente invención, las células 293 adaptadas para crecer en condiciones libres de suero se adaptaron en un cultivo en suspensión. Las células se transfirieron en un cultivo en suspensión con agitación de 250 ml libre de suero (volumen de trabajo 100 ml) para el cultivo en suspensión a una densidad celular inicial de entre aproximadamente 1,18E+5 cv/ml y aproximadamente 5,22E+5 células viables/ml. Los medios pueden complementarse con heparina para evitar la agregación de las células. Este sistema de cultivo celular permite cierto aumento de la densidad celular mientras se mantiene la viabilidad celular. Una vez que estas células están creciendo en el cultivo, las células se subcultivan en los matraces con agitación durante aproximadamente 7 pases más. Puede observarse que el tiempo de duplicación de las células se reduce progresivamente hasta que al final de los pases sucesivos el tiempo de duplicación es aproximadamente de 1,3 días, es decir, comparable con 1,2 días de las células en medios de FBS al 10% en el cultivo de células adheridas. En los medios IS 293 libres de suero complementados con heparina casi todas las células existían como células individuales que no forman agregados de células en el cultivo en suspensión.

2. Sistemas de cultivo celular

En cualquier sistema de cultivo celular, hay un patrón de crecimiento característico tras la inoculación que incluye una fase de latencia, una fase de crecimiento acelerado, una fase exponencial o "logarítmica", una fase de aceleración de crecimiento negativo y una meseta o fase estacionaria. Las fases logarítmica y de meseta proporcionan información vital sobre la línea celular, el tiempo de duplicación de la población durante el crecimiento logarítmico, la tasa de crecimiento, y la densidad celular máxima lograda en la meseta. En la fase logarítmica, a medida que continúa el crecimiento, las células alcanzan su máxima tasa de división celular. Los números de células aumentan en relación logarítmica con el tiempo. Durante este periodo de la multiplicación más activa, los logaritmos de los números de células contados a intervalos cortos, representados frente al tiempo, producen una línea recta. Haciendo un recuento en un momento específico y un segundo recuento tras un intervalo durante la fase logarítmica de crecimiento y conociendo el número de unidades de tiempo transcurridas, puede calcularse el número total de divisiones celulares o duplicaciones, y tanto la tasa de crecimiento como el tiempo de generación. En el plazo de pocas horas o días tras el comienzo de la fase logarítmica, la tasa de división celular empieza a disminuir y algunas de las células empiezan a morir. Esto se refleja en la curva de crecimiento por un aplanamiento gradual de la línea. Finalmente, la tasa de células que mueren es esencialmente igual a la tasa de células que se dividen, y la población viable total permanece igual durante un periodo de tiempo. Esto se conoce como la fase estacionaria o de meseta y se representa en la curva de crecimiento como un aplanamiento de la línea en el que la pendiente se aproxima a cero.

La medición del tiempo de duplicación de la población puede usarse para cuantificar la respuesta de las células a diferentes condiciones de cultivo inhibidoras o estimulantes tales como variaciones en la concentración de nutrientes, efectos hormonales, o fármacos tóxicos. También es una buena monitorización del cultivo durante el pase en serie y permite el cálculo de la producción celular y el factor de dilución requerido en el subcultivo.

El tiempo de duplicación de la población, es un valor promedio y describe el resultado neto de un intervalo amplio de tasas de división celular, incluyendo cero, dentro del cultivo. El tiempo de duplicación también diferirá con los tipos celulares, condiciones de cultivo y recipientes de cultivo variables. Los puntos de tiempo individuales son insatisfactorios para monitorizar el crecimiento cuando la forma de la curva de crecimiento celular no se conoce. Por tanto, es importante determinar la curva de crecimiento para cada tipo celular que se usa, en las condiciones que se usan para el cultivo celular. Las curvas de crecimiento típicas son de forma sigmoidea, representando la primera parte de la curva la fase de latencia, representando la parte central de la curva la fase logarítmica, y representando la última parte de la curva la fase de meseta. La fase logarítmica es cuando las células crecen a la tasa más alta, y a medida que las células alcanzan su densidad de saturación, su crecimiento se ralentizará y el cultivo entrará en la fase de meseta. Una descripción detallada de la teoría y las técnicas de cultivo celular puede encontrarse en Freshney, 1992 y Freshney, 1987.

Un aspecto importante de la presente invención es la infección de las células productoras con adenovirus recombinante, en un momento apropiado para lograr la máxima producción de virus. Los inventores han encontrado que la máxima producción de virus, se obtiene cuando las células productoras se infectan entre aproximadamente cuando las células alcanzan el primer punto de inflexión en la fase logarítmica de la curva de crecimiento celular, es decir, la fase semilogarítmica, y antes del 2º punto de inflexión en la fase de meseta de la curva de crecimiento celular, es decir, fase de semimeseta. Este intervalo puede determinarse fácilmente para cualquier tipo celular y cualquier condición de cultivo con cualquier aparato de cultivo celular. Los puntos de inflexión sobre una curva de crecimiento celular se encuentran cuando la forma de la línea cambia de una forma convexa a una cóncava, o de una forma cóncava a una convexa.

Para la mayoría de las curvas de crecimiento representadas en escalas semilogarítmicas, la fase logarítmica de crecimiento puede representarse aproximadamente mediante un aumento lineal en la pendiente de la línea frente al tiempo. Es decir, en cualquier intervalo corto entre dos puntos en la línea de la fase logarítmica de la curva, el logaritmo del número de células aumenta de una forma lineal en relación con el tiempo. Por tanto, la fase semilogarítmica puede definirse aproximadamente como el punto o intervalo dentro de la fase logarítmica en el que las células se dividen a su tasa máxima, y el aumento en los logaritmos del número de células es lineal con respecto al tiempo. La fase logarítmica tardía puede definirse como aproximadamente el punto o intervalo de tiempo en el que se ha ralentizado la tasa de división celular, y el logaritmo del número de células ha dejado de aumentar de una forma lineal con respecto al tiempo. Cuando se mira una curva de crecimiento, esta zona podría representarse por la caída o el aplanamiento gradual de la pendiente de la línea. En la fase estacionaria temprana, la tasa del crecimiento celular disminuye y se acerca más a la tasa de muerte celular y, por tanto, la pendiente de la línea en la curva de crecimiento es incluso menor que la de la fase logarítmica tardía. En la fase semiestacionaria, la tasa de crecimiento celular es aproximadamente igual a la tasa de división celular y, por tanto, la línea en la curva de crecimiento es relativamente plana y tiene una pendiente que se aproxima a cero. Se entenderá que el experto puede formular curvas de crecimiento para cualquier línea celular de este tipo e identificar las regiones mencionadas anteriormente en la curva.

La capacidad para producir vectores virales infecciosos es cada vez más importante para la industria farmacéutica, especialmente en el contexto de la terapia génica. En la última década, los avances en biotecnología han dado lugar a la producción de un número de vectores virales importantes que tiene usos potenciales como máquinas de producción de proteínas, vacunas y tratamientos. El uso de vectores virales en cultivos de mamíferos tiene ventajas con respecto a las proteínas producidas en huésped bacterianos u otros de forma de vida inferior en su capacidad para procesar de manera postraduccional, estructuras de proteínas complejas tales como el plegamiento dependiente de disulfuro y la glicosilación.

El desarrollo del cultivo celular para la producción de vectores de virus se ha visto ayudado enormemente por el desarrollo en biología molecular de técnicas para el diseño y la construcción de sistemas de vectores sumamente eficaces en cultivos celulares de mamíferos, una batería de marcadores de selección útiles, esquemas de amplificación génica y un entendimiento más amplio de los mecanismos bioquímicos y celulares implicados en conseguir la molécula biológicamente activa final a partir del vector introducido.

Frecuentemente, no se consideraron los factores que afectan al lado posterior (en este caso, más allá de la lisis celular) de la ampliación a escala de fabricación, antes de seleccionar la línea celular como huésped para el sistema de expresión. Además, el desarrollo de sistemas de biorreactores capaces de mantener cultivos de densidad muy alta durante periodos de tiempo prolongados no ha cumplido con la demanda creciente para aumentar la producción a costes más bajos.

La presente invención aprovechará la tecnología de biorreactores recientemente disponible. Hacer crecer células según la presente invención en un biorreactor que permite una producción a gran escala de células biológicamente activas de manera total que pueden infectarse mediante los vectores adenovirales de la presente invención. Haciendo funcionar el sistema a una baja tasa de perfusión y aplicando un esquema diferente para la purificación de las partículas infecciosas, la invención proporciona una estrategia de purificación que es fácilmente escalable para producir grandes cantidades de producto altamente purificado.

Los biorreactores se han usado ampliamente para la producción de productos biológicos a partir de cultivos de células animales dependientes tanto de suspensión como de anclaje. Las células productoras más ampliamente usadas para la producción de vectores adenovirales son las células de riñón embrionario humano dependientes de anclaje (células 293). Los biorreactores que van a desarrollarse para la producción de vectores adenovirales deben tener la característica de un área superficial de cultivo específica de alto volumen con el fin de lograr una alta densidad de células productoras y una alta producción de virus. El cultivo celular en microportadores en un biorreactor de tanque agitado proporciona un área superficial de cultivo específica de muy alto volumen y se ha usado para la producción de vacunas virales (Griffiths, 1986). Además, industrialmente se ha demostrado que los biorreactores de tanque agitado son escalables. El sistema de cultivo celular Cellcube^{TM} de múltiples placas fabricado por Corning-Costar también ofrece un área superficial de cultivo específica de muy alto volumen. Las células crecen sobre ambos lados de las placas de cultivo, selladas herméticamente entre sí en forma de un cubo compacto. A diferencia de los biorreactores de tanque agitado, la unidad de cultivo Cellcube^{TM} es desechable. Esto es muy deseable en la producción de etapa temprana del producto clínico debido a la reducción de los costes de gastos de capital, control de calidad y garantía de calidad asociados con los sistemas desechables. Considerando las ventajas ofrecidas por los diferentes sistemas, se evaluaron tanto el sistema Cellcube^{TM} como el biorreactor de tanque agitado para la producción de adenovirus.

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La tabla 1 enumera varias técnicas a modo de ejemplo para el cultivo celular y la producción de partículas virales. Actualmente, no hay métodos empleados que den como resultado tanto una alta pureza como un alto número de partículas virales. Por tanto, los siguientes métodos se consideran en combinación con el procedimiento a gran escala para la producción y purificación de adenovirus descrito en la presente invención.

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TABLA 1

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A) Cultivos dependientes de anclaje frente a no dependientes de anclaje

Las células de animales y seres humanos pueden propagarse in vitro de dos modos: como células no dependientes de anclaje que crecen libremente en suspensión por todo el volumen del cultivo; o como células dependientes de anclaje que requieren la adhesión a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un tipo monocapa de crecimiento celular).

Los cultivos no dependientes de anclaje o en suspensión a partir de líneas celulares establecidas continuas son los medios de producción a gran escala de células y de productos celulares más ampliamente usados. El cultivo en suspensión a gran escala basado en la tecnología de fermentación microbiana (bacteriana y de levaduras), tiene claras ventajas para la fabricación de productos celulares de mamíferos. Los procedimientos son de funcionamiento relativamente simple y fáciles de ampliar a escala. Pueden proporcionarse condiciones homogéneas en el reactor lo que permite una monitorización y control precisos de la temperatura, el oxígeno disuelto y el pH, y garantizan que puedan tomarse las muestras representativas del cultivo.

Sin embargo, las células cultivadas en suspensión no siempre pueden usarse en la producción de productos biológicos. Aún se considera que los cultivos en suspensión tienen potencial tumorígeno y, por tanto, su uso como sustratos para la producción impone límites sobre el uso de los productos resultantes en aplicaciones en seres humanos y veterinarias (Petricciani, 1985; Larsson, 1987). Los virus propagados en los cultivos en suspensión en contraposición a los cultivos dependientes de anclaje algunas veces pueden provocar cambios rápidos en los marcadores virales, lo que lleva a reducir la inmunogenicidad (Bahnemann, 1980). Finalmente, incluso algunas veces las líneas celulares recombinantes pueden secretar cantidades considerablemente mayores de productos cuando se propagan como cultivos dependientes de anclaje en comparación con la misma línea celular en suspensión (Nilsson y Mosbach, 1987). Por estos motivos, se usan ampliamente diferentes tipos de células dependientes de anclaje en la producción de diferentes productos biológicos.

B) Reactores y procedimientos para la suspensión

Se llevó a cabo el cultivo en suspensión a gran escala de células de mamífero en tanques agitados. Se adaptaron los instrumentos y los controles para los biorreactores, junto con el diseño de los fermentadores, a partir de aplicaciones microbianas relacionadas. Sin embargo, al reconocer la creciente demanda para controlar la contaminación en los cultivos de mamífero que crecen más lentamente, se implementaron rápidamente diseños asépticos mejorados, mejorando la fiabilidad de estos reactores. Los instrumentos y los controles son básicamente los mismos que se encuentran en otros fermentadores e incluyen controles de agitación, temperatura, oxígeno disuelto y pH. Están disponibles sondas y autoanalizadores más avanzados para las mediciones en línea y fuera de línea de turbidez (una función de las partículas presentes), capacitancia (una función de las células viables presentes), glucosa/lactato, carbonato/bicarbonato y dióxido de carbono. Las densidades celulares máximas que pueden obtenerse en los cultivos en suspensión son relativamente bajas a aproximadamente 2-4 x 10^{6} células/ml de medio (que es menos que 1 mg de peso seco celular por ml), muy por debajo de los números logrados en la fermentación microbiana.

En la industria, dos diseños de reactores de cultivo en suspensión son los más ampliamente usados debido a su simplicidad y robustez de funcionamiento, el reactor agitado y el reactor de agitación con aire. El diseño del reactor agitado se ha usado satisfactoriamente en una escala de 8000 litros de capacidad para la producción de interferón (Phillips et al., 1985; Mizhari, 1983). Las células crecen en un tanque de acero inoxidable con un ratio de altura con respecto a diámetro de 1:1 a 3:1. El cultivo se mezcla normalmente con uno o más agitadores, a base de discos de paletas o patrones de propulsor marino. Se han descrito sistemas agitadores que ofrecen menos esfuerzos cortantes que las paletas. La agitación puede activarse o bien directamente o bien indirectamente mediante accionamientos acoplados magnéticamente. Los accionamientos indirectos reducen el riesgo de contaminación microbiana a través de juntas herméticas en los ejes de los agitadores.

El reactor de agitación con aire, también descrito inicialmente para la fermentación microbiana y adaptado después para el cultivo de células de mamífero, se basa en una corriente de gas tanto para mezclar como para oxigenar el cultivo. La corriente de gas entra en una sección de elevación del reactor y activa la circulación. El gas se desprende en la superficie de cultivo, lo que provoca que el líquido más denso libre de burbujas de gas se desplace hacia abajo en la sección de bajada del reactor. La principal ventaja de este diseño es la simplicidad y la ausencia de necesidad de mezclado mecánico. Normalmente, el ratio de altura con respecto a diámetro es de 10:1. El reactor de agitación con aire puede ampliarse a escala de manera relativamente fácil, tiene una buena transferencia de masa de los gases y genera esfuerzos cortantes relativamente bajos.

La mayoría de los cultivos en suspensión a gran escala se hacen funcionar como procedimientos discontinuos o semicontinuos porque son los de funcionamiento y ampliación a escala más sencillos. Sin embargo, están disponibles procedimientos continuos basados en principios de quimiostato o perfusión.

Un procedimiento discontinuo es un sistema cerrado en el que se observa un perfil de crecimiento típico. Una fase de latencia va seguida de las fases exponencial, estacionaria y declive. En un sistema de este tipo, el entorno cambia continuamente a medida que se agotan los nutrientes y se acumulan los metabolitos. Esto hace del análisis de los factores que influyen en el crecimiento celular y la productividad y, por tanto, la optimización del procedimiento, una tarea compleja. La productividad de un procedimiento discontinuo puede aumentarse mediante la alimentación controlada de los nutrientes clave para prolongar el ciclo de crecimiento. Un procedimiento semicontinuo de este tipo todavía es un sistema cerrado porque no se eliminan las células, los productos ni los productos de desecho.

En lo que todavía es un sistema cerrado, puede lograrse la perfusión del medio nuevo a través del cultivo reteniendo las células con una variedad de dispositivos (por ejemplo, filtro de centrifugación de malla fina, filtros de membrana de placa plana o fibra hueca, tubos de sedimentación). Los cultivos en filtros de centrifugación pueden producir densidades celulares de aproximadamente 5 x 10^{7} células/ml. Un sistema abierto verdadero y el procedimiento de perfusión más simple es el quimiostato en el que hay un flujo de entrada de medio y un flujo de salida de células y productos. El medio de cultivo se alimenta al reactor a una tasa predeterminada y constante que mantiene la tasa de dilución del cultivo a un valor menor que la tasa de crecimiento específico máxima de las células (para evitar el arrastre de la masa celular desde el reactor). El fluido de cultivo que contiene células y productos celulares y subproductos se elimina a la misma tasa.

C) Sistemas de adhesión no perfundidos

Tradicionalmente, los cultivos celulares dependientes de anclaje se propagan en el fondo de pequeños recipientes de vidrio o plástico. E ratio de superficie con respecto a volumen restringida ofrecida por las técnicas clásicas y tradicionales, adecuada para escala de laboratorio, ha creado un cuello de botella en la producción de células y productos celulares a gran escala. En un intento por proporcionar sistemas que ofrezcan grandes superficies accesibles para el crecimiento celular en pequeño volumen de cultivo, se han propuesto varias técnicas: el sistema de botellas rotativas, el propagador de placas apiladas, las botellas de película en espiral, el sistema de fibra hueca, el lecho fijo, el sistema intercambiador de placas y el rollo de tubos de membrana. Puesto que estos sistemas son de naturaleza no homogénea y algunas veces se basan en múltiples procedimientos, sufren de las siguientes deficiencias, potencial limitado para ampliar a escala, dificultades en la toma de las muestras celulares, potencial limitado para medir y controlar los parámetros clave del procedimiento y dificultad en mantener las condiciones del entorno homogéneas durante todo el cultivo.

A pesar de estas desventajas, la botella rotativa es un procedimiento usado comúnmente para la producción celular dependiente de anclaje a gran escala. Al ser poco más que un matraz T con diferente forma, grande, la simplicidad del sistema lo hace muy fiable y, por tanto, atractivo. Están disponibles robots completamente automatizados, que pueden manipular miles de botellas rotativas por día, eliminando por tanto el riesgo de contaminación e inconsistencia asociado con la manipulación humana intensa requerida de lo contrario. Con frecuentes cambios de medios, los cultivos en botellas rotativas pueden lograr densidades celulares de cerca de 0,5 x 10^{6} células/cm^{2} (que corresponden a aproximadamente 10^{9} células/botella o casi 10^{7} células/ml de medios de cultivo).

D) Cultivos en microportadores

En un esfuerzo por superar las deficiencias de los procedimientos de cultivo dependiente de anclaje tradicionales, van Wezel (1967) desarrolló el concepto de los sistemas de cultivo en microportadores. En este sistema, las células se propagan sobre la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio de crecimiento mediante agitación lenta. Las células se adhieren a los microportadores y crecen gradualmente hasta confluencia sobre la superficie del microportador. De hecho, este sistema de cultivo a gran escala mejora el cultivo dependiente de adhesión desde un procedimiento de disco individual hasta un procedimiento de unidad en el que se han reunido el cultivos tanto en monocapa como en suspensión. Por tanto, combinar la superficie necesaria para que una célula crezca con las ventajas del cultivo en suspensión homogéneo, aumenta la producción.

Las ventajas de los cultivos en microportadores con respecto a la mayoría de los demás métodos de cultivo dependiente de anclaje, a gran escala, son múltiples. En primer lugar, los cultivos en microportadores ofrecen un alto ratio de superficie con respecto al volumen (variable cambiando la concentración de portador) lo que lleva a producciones de alta densidad celular y un potencial para obtener productos celulares altamente concentrados. La producción celular es de hasta 1-2 x 10^{7} células/ml cuando los cultivos se propagan en un modo de reactor perfundido. En segundo lugar, las células pueden propagarse en recipientes de un procedimiento de unidad en lugar de usar muchos recipientes pequeños de productividad baja (es decir, matraces o placas). Esto da como resultado utilización de nutrientes mucho mejor y un ahorro considerable de medio de cultivo. Además, la propagación en un reactor individual lleva a la reducción de la necesidad del espacio de instalación y en el número de etapas de manipulación requeridas por célula, reduciendo de ese modo el coste de mano de obra y el riesgo de contaminación. En tercer lugar, el cultivo en suspensión en microportadores homogéneo y bien mezclado hace posible monitorizar y controlar las condiciones del entorno (por ejemplo, pH, pO_{2} y la concentración de los componentes del medio), llevado así a una propagación celular más reproducible y mayor recuperación del producto. En cuarto lugar, es posible tomar una muestra representativa para la observación microscópica, pruebas químicas o enumeración. En quinto lugar, puesto que los microportadores sedimentan rápidamente fuera de la suspensión, puede hacerse uso con relativa facilidad de un procedimiento semidiscontinuo o la recogida de células. En sexto lugar, el modo de la propagación en cultivo dependiente de anclaje sobre los microportadores hace posible usar este sistema para otras manipulaciones celulares, tales como transferencia celular sin el uso de enzimas proteolíticas, cocultivo de células, trasplante en animales y perfusión del cultivo usando decantadores, columnas, lechos fluidizados o fibras huecas para mantener el microportador. En séptimo lugar, los cultivos en microportadores se amplían a escala con relativa facilidad usando equipo convencional usado para el cultivo de células microbianas y de animales en suspensión.

E) Microencapsulación de células de mamífero

Un método que ha demostrado ser particularmente útil para el cultivo de células de mamífero es la microencapsulación. Las células de mamífero se mantienen dentro de una membrana de hidrogel semipermeable. Una membrana porosa se forma alrededor de las células permitiendo el intercambio de nutrientes, gases y productos metabólicos con el medio en masa que rodea a la cápsula. Se han desarrollado varios métodos que son benévolos, rápidos y no tóxicos y en los que la membrana resultante es suficientemente porosa y fuerte para sostener la masa celular en crecimiento durante todo el periodo del cultivo. Todos estos métodos se basan en alginato soluble gelificado mediante el contacto por gotas con una disolución que contiene calcio. Lim (1982, patente estadounidense nº 4.352.883, incorporado al presente documento como referencia), describe células concentradas en una disolución de alginato de sodio aproximadamente al 1% que se fuerza a través de un orificio pequeño, para formar gotas, y que se liberan en una disolución de cloruro de calcio aproximadamente al 1%. Las gotas entonces se echan en una capa de ácido poliamino que se une iónicamente a la superficie de alginato. Finalmente, el alginato se licua de nuevo tratando la gota con un agente quelante para eliminar los iones de calcio. Otros métodos usan células en una disolución de calcio que va a echarse en una disolución de alginato, creando así una esfera de alginato hueca. Un enfoque similar implica células en una disolución de quitosano que también se echa en alginato, para crear esferas huecas.

Las células microencapsuladas se propagan fácilmente en reactores de tanque agitado y, con tamaño de perla en el intervalo de 150-1500 \mum de diámetro, se retienen fácilmente en un reactor perfundido usando una criba de malla fina. El ratio de volumen de la cápsula con respecto al volumen total de los medios puede mantenerse desde tan denso como 1:2 hasta 1:10. Con densidades celulares intracapsulares de hasta 10^{8}, la densidad celular eficaz en el cultivo es de 1-5 x 10^{7}.

Las ventajas de la microencapsulación con respecto a otros procedimientos incluye la protección de los efectos perjudiciales de las tensiones de corte que se producen a partir del burbujeo y la agitación, la capacidad de retener fácilmente las perlas con el propósito de usar sistemas perfundidos, la ampliación a escala es relativamente sencilla y la capacidad para usar las perlas para su implantación.

La presente invención incluye células que son de naturaleza dependiente de anclaje. Las células 293, por ejemplo, son dependientes de anclaje, y cuando crecerán en suspensión, las células adherirán entre sí y crecerán en aglomerados, eventualmente, ahogando las células en el núcleo interno de cada aglomerado a medida que alcanzan un tamaño que deja a las células del núcleo insostenibles por las condiciones de cultivo. Por tanto, es necesario un medio eficaz de cultivo a gran escala de células dependientes de anclaje con el fin de emplear eficazmente estas células para generar grandes cantidades de adenovirus.

F) Sistemas de adhesión perfundidos

Los sistemas de adhesión perfundidos son una forma preferida de la presente invención. La perfusión se refiere a un flujo continuo a una tasa constante, a través o por encima de una población de células (de una disolución de nutrientes fisiológica). Esto implica la retención de las células dentro de la unidad de cultivo en contraposición al cultivo de flujo continuo que arrastra las células con los medios retirados (por ejemplo, quimiostato). La idea de la perfusión se ha conocido desde el comienzo del siglo, y se ha aplicado para mantener pequeñas piezas de tejido viables para la observación microscópica extendida. La técnica se inició para imitar el medio de las células in vivo en el que las células se suministran continuamente con sangre, linfa u otros fluidos corporales. Sin la perfusión, las células en cultivo van a través de las fases alternantes de alimentación y privación de alimentación, limitando así la expresión completa de su crecimiento y potencial metabólico.

El uso actual del cultivo perfundido es en respuesta a la exposición de las células en crecimiento a altas densidades (es decir, 0,1-5 x 10^{8} células/ml). Con el fin de aumentar las densidades más allá de 2-4 x 10^{6} células/ml, el medio debe sustituirse constantemente con un suministro nuevo con el fin de compensar las deficiencias nutricionales y eliminar los productos tóxicos. La perfusión permite un control mucho mejor del entorno de cultivo (pH, pO_{2}, niveles de nutrientes, etc.) y es un medio para aumentar significativamente la utilización del área superficial dentro de un cultivo para la adhesión celular.

El desarrollo de un reactor de lecho fijo perfundido usando una matriz de lecho de un material textil no tejido ha proporcionado un medio para mantener un cultivo de perfusión a densidades que superan las 10^{8} células/ml del volumen de lecho (CelliGen^{TM}, New Brunswick Scientific, Edison, NJ: Wang et al., 1992; Wang et al., 1993; Wang et al., 1994). Descrito en resumen, este reactor comprende un reactor mejorado para cultivar células tanto dependientes como no dependientes de anclaje. El reactor se diseña como un lecho fijo con un medio para proporcionar recirculación interna. Preferiblemente, se coloca un portador de matriz de fibra en una cesta dentro del recipiente del reactor. Una parte superior e inferior de la cesta tiene orificios, permitiendo que el medio fluya a través de la cesta. Un impulsor especialmente diseñado proporciona la recirculación del medio a través del espacio ocupado por la matriz de fibra para asegurar un suministro uniforme de nutriente y la eliminación de desechos. Esto asegura simultáneamente que se suspende en el medio una cantidad insignificante de la masa celular total. La combinación de la cesta y la recirculación también proporciona un flujo libre de burbujas de medio oxigenado a través de la matriz de fibra. La matriz de fibra es una estructura no tejida que tiene un diámetro de "poro" de desde 10 \mum hasta 100 \mum, proporcionando un volumen interno alto con volúmenes de poro que corresponden a de 1 a 20 veces los volúmenes de las células individuales.

En comparación con otros sistemas de cultivo, este enfoque proporciona varias ventajas significativas. Con un portador de la matriz de fibra, las células se protegen contra la tensión mecánica de la agitación y la espumación. El flujo libre de medio a través de la cesta proporciona a las células niveles regulados óptimos de oxígeno, pH y nutrientes. Los productos pueden eliminarse de manera continua del cultivo y los productos recogidos están libres de células y pueden producirse en un medio con bajo contenido en proteína lo que facilita las etapas de purificación posteriores. Además, el diseño único de este sistema de reactor proporciona una manera más fácil para ampliar a escala el reactor. Actualmente, se dispone de tamaños de hasta 30 litros. Versiones de cien litros y 300 litros están en desarrollo y los cálculos teóricos apoyan un reactor de hasta 1000 litros. Esta tecnología se explica en detalle en el documento WO 94/17178 (4 de agosto de 1994, Freedman et al.), que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad.

El módulo Cellcube^{TM} (Corning-Costar) proporciona un área superficial estirénica grande para la inmovilización y el crecimiento de células adheridas al sustrato. Éste es un dispositivo de un solo uso estéril encapsulado integralmente que tiene una serie de placas de cultivo paralelas unidas para crear espacios de flujo laminar sellados finos entre las placas adyacentes.

El módulo Cellcube^{TM} tiene orificios de entrada y salida que están opuestos diagonalmente entre sí y ayudan a regular el flujo de los medios. Durante los primeros pocos días de crecimiento el cultivo generalmente se satisface mediante los medios contenidos dentro del sistema tras la siembra inicial. La cantidad de tiempo entre la siembra inicial y el comienzo de la perfusión de los medios depende de la densidad de las células en el inóculo de siembra y la tasa de crecimiento celular. La medición de la concentración de nutrientes en los medios en circulación es un buen indicador del estado del cultivo. Cuando se establece un procedimiento, puede ser necesario monitorizar la composición de los nutrientes a una variedad de diferentes tasas de perfusión para determinar los parámetros de funcionamiento más económicos y productivos.

Las células dentro del sistema alcanzan una densidad de disolución más alta (células/ml) que en sistemas de cultivo tradicionales. Muchos medios basales usados normalmente se diseñan para apoyar 1-2 x 10^{6} células/ml/día. Un Cellcube^{TM} típico, ejecutado con una superficie de 85.000 cm^{2}, contiene aproximadamente 6 l de medios dentro del módulo. La densidad celular con frecuencia supera las 10^{7} células/ml en el recipiente de cultivo. En confluencia, se requieren por día 2-4 volúmenes de reactor de los medios.

El momento y los parámetros de la fase de producción de los cultivos dependen del tipo y el uso de una línea celular particular. Muchos cultivos requieren unos medios diferentes para la producción que los que se requieren para la fase de crecimiento del cultivo. La transición de una fase a otra probablemente requerirá de múltiples etapas de lavado en cultivos tradicionales. Sin embargo, el sistema Cellcube^{TM} emplea un sistema de perfusión. Uno de los beneficios de un sistema de este tipo es la capacidad de proporcionar una transición suave entre diversas fases de funcionamiento. El sistema de perfusión elimina la necesidad de etapas de lavado tradicionales que pretenden eliminar los componentes séricos en un medio de crecimiento.

En una descripción a modo de ejemplo de la presente invención, el sistema Cellcube^{TM} se usa para hacer crecer células transfectadas con AdCMVp53. Se inocularon células 293 en el Cellcube^{TM} según la recomendación del fabricante. Las densidades celulares de inoculación estaban en el intervalo de 1-1,5 x 10^{4}/cm^{2}. Se permitió que las células crecieran durante 7 días a 37ºC en condiciones de cultivo de pH = 7,20, DO = 60% de saturación de aire. La tasa de la perfusión del medio se reguló según la concentración de glucosa en el Cellcube^{TM}. Un día antes de la infección viral, el medio para la perfusión se cambió de un tampón que comprendía FBS al 10% a un tampón que comprendía FBS al 0%. En el día 8, se infectaron las células con el virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. La perfusión del medio se detuvo durante 1 hora inmediatamente tras la infección, luego se reanudó durante el periodo restante de la fase de producción de virus. Se recogió el cultivo 45-48 horas tras la infección. Naturalmente estas condiciones de cultivo son a modo de ejemplo y pueden variarse según las necesidades nutricionales y los requisitos de crecimiento de una línea celular particular. Tal variación puede realizarse sin excesiva experimentación y se encuentra dentro de la habilidad del experto en la técnica.

G) Cultivo en suspensión libre de suero

En realizaciones particulares, los vectores adenovirales para terapia génica se producen a partir de cultivos de células 293 (células 293A) dependientes de anclaje tal como se describió anteriormente. La ampliación a escala de la producción de vectores adenovirales está limitada por la dependencia de anclaje de las células 293A. Para facilitar la ampliación a escala y satisfacer la demanda futura de vectores adenovirales, se han consagrado esfuerzos significativos al desarrollo de procedimientos de producción alternativos que sean susceptibles de ampliación a escala. Los métodos incluyen hacer crecer células 293A en cultivos en microportadores y la adaptación de las células productoras 293A en cultivos en suspensión. Se han descrito anteriormente las técnicas de cultivo en microportadores. Esta técnica se basa en la adhesión de las células productoras sobre las superficies de microportadores que se suspenden en medios de cultivo mediante agitación mecánica. El requisito de adhesión celular puede presentar algunas limitaciones para la escalabilidad de cultivos en microportadores.

Hasta la presente solicitud, no ha habido notificaciones sobre el uso de las células 293 en suspensión para la producción de vectores adenovirales para terapia génica. Además, las células 293 en suspensión notificadas requieren la presencia de FBS al 5-10% en los medios de cultivo para el crecimiento celular y la producción de virus óptimos. Históricamente, la presencia de proteínas de fuente bovina en medios de cultivo celular ha sido una preocupación regulatoria, de manera especial recientemente debido al brote de la Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) en algunos países. Debe desarrollarse un procedimiento de purificación posterior riguroso y complejo para eliminar las proteínas contaminantes y cualquier virus adventicio del producto final. Se considera que el desarrollo de cultivo en suspensión 293 libre de suero va a ser una mejora del procedimiento principal para la producción de vector adenoviral para terapia génica.

Los resultados de la producción de virus en matraces rotativos y un biorreactor de tanque agitado de 3 l indican que la productividad de virus específica de células de las células 293SF fue de aproximadamente 2,5 x 10^{4} pv/célula, que es aproximadamente el 60-90% de la de las células 293A. Sin embargo, debido a la concentración de células estacionarias mayor, la productividad de virus volumétrica a partir del cultivo 293SF es esencialmente equivalente a la del cultivo celular 293A. Los inventores también observaron que la producción de virus aumentó significativamente llevando a cabo un intercambio del medio fresco en el momento de la infección por virus. Los inventores van a evaluar los factores limitantes en el medio. Estos hallazgos permiten un procedimiento escalable, eficaz y que puede validarse fácilmente para la producción de vector adenoviral. Este método de adaptación no se limita solamente a células 293A y será igualmente útil cuando se aplique para otras células productoras de vectores adenovirales.

3. Métodos de lisis y recogida de células

La infección adenoviral da como resultado la lisis de las células que están infectándose. Las características líticas de la infección por adenovirus permiten dos modos diferentes de producción de virus. Uno es recoger células infectadas antes de la lisis celular. El otro modo es recoger el sobrenadante con virus tras la lisis celular completa por el virus producido. Para el último modo, se requieren tiempos de incubación más largos con el fin de lograr la lisis celular completa. Este tiempo de incubación prolongado tras la infección por virus crea una grave preocupación con respecto a un aumento de la posibilidad de generación de adenovirus de replicación competente (RCA), particularmente para los vectores adenovirales de primera generación actuales (vector con deleción en E1). Por tanto, se eligió recoger células infectadas antes de la lisis celular como el modo de producción de elección. La tabla 2 enumera los métodos más comunes que se han usado para lisar células tras la recogida de células.

TABLA 2 Métodos usados para lisis celular

2

A) Detergentes

Las células están limitadas por membranas. Con el fin de liberar los componentes de la célula, es necesario romper las células abriéndolas. La manera más ventajosa en la que puede llevarse a cabo esto, según la presente invención, es solubilizar las membranas con el uso de detergentes. Los detergentes son moléculas anfipáticas con un extremo apolar de naturaleza alifática o aromática y un extremo polar que puede estar cargado o no cargado. Los detergentes son más hidrófilos que los lípidos y por tanto tienen mayor solubilidad en agua que los lípidos. Permiten la dispersión de compuestos insolubles en agua en medios acuosos y se usan para aislar y purificar proteínas en forma nativa.

Los detergentes pueden ser desnaturalizantes o no desnaturalizantes. Los primeros pueden ser aniónicos tal como dodecilsulfato de sodio o catiónicos tal como bromuro de etiltrimetilamonio. Estos detergentes alteran totalmente las membranas y desnaturalizan la proteína rompiendo las interacciones proteína-proteína. Los detergentes no desnaturalizantes pueden dividirse en detergentes no aniónicos tales como Triton® X-100, sales biliares tales como colatos y detergentes zwitteriónicos tales como CHAPS. Los zwitteriónicos contienen grupos tanto catiónicos como aniónicos en la misma molécula, la carga eléctrica positiva se neutraliza por la carga negativa en la misma molécula o la adyacente.

Los agentes desnaturalizantes tales como SDS se unen a las proteínas como monómeros y la reacción se lleva en equilibrio hasta que se satura. Por tanto, la concentración libre de monómeros determina la concentración de detergente necesaria. La unión de SDS es cooperativa, es decir, la unión de una molécula de SDS aumenta la probabilidad de que otra molécula se una a esa proteína, y altera las proteínas en barras cuya longitud es proporcional a su peso molecular.

Los agentes no desnaturalizantes tales como Triton® X-100 no se unen a las conformaciones nativas ni tienen un mecanismo de unión cooperativo. Estos detergentes tienen restos apolares voluminosos y rígidos que no penetran en las proteínas solubles en agua. Se unen a las partes hidrófobas de las proteínas. Triton® X100 y otros detergentes no aniónicos de polioxietileno son ineficaces a la hora de romper la interacción proteína-proteína y pueden provocar agregaciones de artefactos de proteína. Sin embargo, estos detergentes alterarán las interacciones proteína-lípido pero son mucho más suaves y pueden mantener la forma nativa y capacidades funcionales de las proteínas.

La eliminación del detergente puede intentarse de varias maneras. La diálisis funciona bien con detergentes que existen como monómeros. La diálisis es algo ineficaz con detergentes que se agregan fácilmente para formar micelas porque las micelas son demasiado grandes para pasar a través de la diálisis. La cromatografía de intercambio iónico puede utilizarse para evitar este problema. Se aplica la disolución de proteína alterada a una columna de cromatografía de intercambio iónico y se lava entonces la columna con tampón sin detergente. Se eliminará el detergente como resultado del equilibrio del tampón con la disolución de detergente. Alternativamente, puede hacerse pasar la disolución de proteína a través de un gradiente de densidad. A medida que la proteína sedimenta a través de los gradientes, se desprenderá el detergente debido al potencial químico.

Con frecuencia, un único detergente no es lo suficientemente versátil para la solubilización y el análisis del medio de las proteínas encontrado en una célula. Las proteínas pueden solubilizarse en un detergente y colocarse después en otro detergente adecuado para el análisis de proteínas. Las micelas de detergente con proteínas formadas en la primera etapa deben separarse de las micelas de detergente puro. Cuando se añaden éstas a un exceso del detergente para análisis, la proteína se encuentra en micelas con ambos detergentes. Puede llevarse a cabo la separación de las micelas de detergente-proteína con cromatografía de filtración en gel o de intercambio iónico, diálisis o separaciones de tipo densidad de flotación.

Detergentes Triton®X: Esta familia de detergentes (Triton®X-100, X114 y NP-40) tienen las mismas características básicas pero son diferentes en su naturaleza hidrófoba-hidrófila específica. Todos estos detergentes heterogéneos tienen una cadena de 8 carbonos ramificada unida a un anillo aromático. Esta parte de la molécula es la que más contribuye a la naturaleza hidrófoba del detergente. Los detergentes Triton®X se usan para solubilizar proteínas de membrana en condiciones no desnaturalizantes. La elección del detergente para solubilizar proteínas dependerá de la naturaleza hidrófoba de la proteína que va a solubilizarse. Las proteínas hidrófobas requieren detergentes hidrófobos para solubilizarlas eficazmente.

Triton®X-100 y NP-40 son muy similares en estructura e hidrofobicidad y son intercambiables en la mayoría de aplicaciones incluyendo lisis celular, deslipidación, disociación de proteínas y solubilización de lípidos y proteínas de membrana. Generalmente, se usan 2 mg de detergente para solubilizar 1 mg de proteína de membrana o 10 mg de detergente/1 mg de membrana lipídica. Triton®X-114 es útil para separar proteínas hidrófobas de hidrófilas.

Detergentes Brij®: Éstos son similares en estructura a los detergentes Triton®X porque tienen longitudes variables de cadenas de polioxietileno unidas a una cadena hidrófoba. Sin embargo, a diferencia de los detergentes Triton®X, los detergentes Brij® no tienen un anillo aromático y puede variar la longitud de las cadenas de carbono. Los detergentes Brij® son difíciles de eliminar de la disolución usando diálisis pero pueden eliminarse mediante geles de eliminación de detergente. Brij®58 es el más similar a Triton®X100 en sus características hidrófobas/hidrófilas. Brij®-35 es un detergente usado comúnmente en aplicaciones de HPLC.

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Detergentes no iónicos dializables: \eta-Octil-\beta-D-glucósido (octilglucopiranósido) y \eta-octil-\beta-D-tioglucósido (octiltioglucopiranósido, OTG) son detergentes no iónicos no desnaturalizantes que se dializan fácilmente de la disolución. Estos detergentes son útiles para solubilizar proteínas de membrana y tienen bajas absorbancias UV a 280 nm. Octilglucósido tiene una alta CMC de 23-25 mM y se ha usado a concentraciones del 1,1-1,2% para solubilizar proteínas de membrana.

Octiltioglucósido se sintetizó por primera vez para ofrecer una alternativa a octilglucósido. Octilglucósido es costoso de fabricar y existen algunos problemas inherentes en los sistemas biológicos porque \beta-glucosidasa puede hidrolizarlo.

Detergentes Tween®: Los detergentes Tween® son detergentes no iónicos, no desnaturalizantes. Son ésteres de polioxietileno-sorbitano de ácidos grasos. Los detergentes Tween® 20 y Tween® 80 se usan como agentes bloqueantes en aplicaciones bioquímicas y se añaden habitualmente a disoluciones de proteína para impedir la unión no específica a materiales hidrófobos tales como plásticos o nitrocelulosa. Se han usado como agentes bloqueantes en aplicaciones de transferencia y ELISA. Generalmente, estos detergentes se usan a concentraciones del 0,01-1,0% para impedir la unión no específica a materiales hidrófobos.

Se ha demostrado que Tween® 20 y otros detergentes no iónicos retiran algunas proteínas de la superficie de nitrocelulosa. Se ha usado Tween® 80 para solubilizar proteínas de membrana, impedir la unión no específica de proteína a placas de cultivo tisular de plástico multipocillos y reducir la unión no específica por proteínas séricas y proteína A biotinilada a placas de poliestireno en ELISA.

La diferencia entre estos detergentes es la longitud de la cadena de ácido graso. Tween® 80 se deriva del ácido oleico con una cadena C_{18} mientras que Tween® 20 se deriva del ácido láurico con una cadena C_{12}. La cadena de ácido graso más larga hace que el detergente Tween® 80 sea menos hidrófilo que el detergente Tween® 20. Ambos detergentes son muy solubles en agua.

Los detergentes Tween® son difíciles de eliminar de la disolución mediante diálisis, pero Tween® 20 puede eliminarse mediante geles de eliminación de detergente. La cadena de polioxietileno encontrada en estos detergentes los hace susceptibles de oxidación (formación de peróxido) como ocurre con los detergentes de las series Brij® y Triton® X.

Detergentes zwitteriónicos: El detergente zwitteriónico, CHAPS, es un derivado de sulfobetaína de ácido cólico. Este detergente zwitteriónico es útil para la solubilización de proteínas de membrana cuando la actividad de la proteína es importante. Este detergente es útil en un amplio intervalo de pH (pH 2-12) y se elimina fácilmente de la disolución mediante diálisis debido a sus altas CMC (8-10 mM). Este detergente tiene bajas absorbancias a 280 nm, haciéndolo útil cuando la monitorización de proteínas en esta longitud de onda es necesaria. CHAPS es compatible con el ensayo de proteína de BCA y puede eliminarse de la disolución mediante un gel de eliminación de detergente. Las proteínas pueden yodarse en presencia de CHAPS.

Se ha usado satisfactoriamente CHAPS para solubilizar receptores y proteínas de membrana intrínsecos y mantener la capacidad funcional de la proteína. Cuando se solubiliza el citocromo P-450 en o bien Triton® X-100 o bien colato de sodio, se forman agregados.

B) Métodos sin detergente

Pueden emplearse diversos métodos sin detergente, aunque no preferidos, conjuntamente con otros aspectos ventajosos de la presente invención:

Congelación-descongelación: Ésta ha sido una técnica ampliamente usada para lisar células de manera suave y eficaz. De manera general se congelan rápidamente las células en, por ejemplo, un baño de nieve carbónica/etanol hasta que se congelan completamente, se transfieren entonces a un baño a 37ºC hasta que se descongelan completamente. Se repite este ciclo varias veces para lograr la lisis celular completa.

Sonicación: Se ha encontrado que las oscilaciones ultrasónicas de alta frecuencia son útiles para la alteración de células. El método por el que ondas ultrasónicas rompen células no se entiende completamente pero se sabe que se producen altas presiones transitorias cuando se someten suspensiones a vibración ultrasónica. La principal desventaja con esta técnica es que se generan cantidades considerables de calor. Con el fin de minimizar los efectos del calor, se usan recipientes de vidrio específicamente diseñados para contener la suspensión celular. Tales diseños permiten que la suspensión circule fuera desde la sonda ultrasónica hasta el exterior del recipiente donde se enfría ya que el matraz está suspendido en hielo.

Extrusión a alta presión: Éste es un método usado frecuentemente para alterar una célula microbiana. La celda de presión francesa emplea presiones de 10,4 x 10^{7} Pa (16.000 p.s.i.) para romper las células abriéndolas. Este aparato consiste en una cámara de acero inoxidable que se abre al exterior por medio de una válvula de aguja. Se coloca la suspensión celular en la cámara con la válvula de aguja en la posición cerrada. Tras invertir la cámara, se abre la válvula y se presiona el pistón para hacer que salga todo el aire de la cámara. Con la válvula en la posición cerrada, se reestablece la cámara a su posición original, se coloca sobre una base sólida y se ejerce la presión requerida en el pistón mediante una prensa hidráulica. Cuando se ha conseguido la presión, se abre de manera fraccionada la válvula de aguja para liberar ligeramente la presión, y a medida que las células se expanden, estallan. Se mantiene abierta la válvula mientras se mantiene la presión de manera que existe un goteo de célula rota que puede recogerse.

Métodos de cizalla sólida: Puede lograrse la cizalla mecánica con abrasivos en agitadores Mickle que hacen oscilar vigorosamente la suspensión (300-3000 veces/min.) en presencia de perlas de vidrio de 500 nm de diámetro. Este método puede dar como resultado daño de orgánulos. Un método más controlado es usar una prensa Hughes en la que un pistón hace que la mayoría de las células junto con abrasivos o pasta ultracongelada de células pase a través de una ranura de 0,25 mm de diámetro en la cámara de presión. Pueden usarse presiones de hasta 5,5 x 10^{7} Pa (8000 p.s.i.) para lisar preparaciones bacterianas.

Métodos de cizalla líquida: Estos métodos emplean mezcladoras, que usan paletas rotativas o alternativas de alta velocidad, homogenizadores que usan movimiento hacia arriba/hacia abajo de un émbolo y esfera y microfluidizadores o chorros de impacto que usan el pase de alta velocidad a través de tubos de diámetro pequeño o el impacto a alta velocidad de dos corrientes de fluido. Las paletas de las mezcladoras se inclinan a diferentes ángulos para permitir un mezclado eficaz. Los homogenizadores se hacen funcionar habitualmente en estallidos de alta velocidad cortos de unos pocos segundos para minimizar el calor local. Estas técnicas no son generalmente adecuadas para células microbianas pero incluso una cizalla líquida muy suave es habitualmente adecuada para alterar células animales.

Métodos hipotónicos/hipertónicos: Se exponen las células a una disolución con una concentración de soluto mucho menor (hipotónica) o mayor (hipertónica). La diferencia de concentración de soluto crea un gradiente de presión osmótica. El flujo resultante de agua hacia el interior de la célula en un entorno hipotónico provoca que las células se hinchen y estallen. El flujo de agua hacia fuera de la célula en un entorno hipertónico provoca que las células se encojan y posteriormente estallen.

Métodos de lisis viral: En algunas situaciones, puede ser ventajoso usar el método de lisis viral, y con modificaciones al protocolo experimental, puede minimizarse la formación de RCA. Dado que los adenovirus son virus líticos, tras la infección de las células huésped, los virus maduros lisan la célula y se liberan en el sobrenadante y pueden recogerse entonces mediante métodos convencionales. Una de las ventajas de usar el método de lisis viral es la generación de partículas virales más maduras, dado que la lisis temprana por medios químicos o mecánicos puede conducir a un aumento del número de partículas deficientes. Además, el procedimiento permite un seguimiento más preciso y más fácil de la cinética de producción directamente en las muestras homogéneas de sobrenadante, lo que produce una mejor reproducibilidad de las series de producción. La lisis química presenta también una etapa adicional en el procedimiento y requiere la eliminación del agente de lisis, ambos de los cuales pueden conducir a pérdidas potenciales de producto y/o actividad disminuida.

Al utilizar el método de lisis viral, puede seguirse la cinética de liberación de viriones de diferentes maneras y podrá indicar el tiempo óptimo para la recogida del sobrenadante. Por ejemplo, puede usarse HPLC, IEC, PCR, exclusión por tinción, espectrofotometría, ELISA, RIA o métodos nefelométricos. La recogida se realiza preferiblemente cuando se ha liberado aproximadamente el 50% de los viriones. Más preferiblemente, se recoge el sobrenadante cuando se libera al menos el 70% de los viriones, y lo más preferiblemente, se recoge el sobrenadante cuando se libera al menos el 90% de los viriones, o cuando la liberación viral alcanza una meseta según se mide mediante uno de los métodos indicados anteriormente. Pueden observarse variaciones en el tiempo necesario para que la liberación de virus alcance una meseta cuando se usa una modificación del vector de transferencia génica, sin embargo, el experto en la técnica puede modificar fácilmente el programa de recogida cuando se usa uno o más de los métodos anteriores para seguir la cinética de liberación de virus.

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4. Métodos de concentración y filtración

Un aspecto de la presente invención emplea métodos de purificación sin procesar de adenovirus a partir de un lisado celular. Estos métodos incluyen clarificación, concentración y diafiltración. La etapa inicial en este procedimiento de purificación es la clarificación del lisado celular para eliminar material particulado grande, particularmente componentes celulares, del lisado celular. Puede lograrse la clarificación del lisado usando un filtro de profundidad o mediante filtración de flujo tangencial. En una descripción preferida de la presente invención, se hace pasar el lisado celular a través de un filtro de profundidad, que consiste en una columna de relleno de material relativamente no adsorbente (por ejemplo resinas de poliéster, arena, tierra de diatomeas, coloides, geles y similares). En la filtración de flujo tangencial (TFF), la disolución de lisado fluye a través de una superficie de membrana que facilita la difusión de retorno del soluto desde la superficie de membrana hacia la disolución en masa. Las membranas se disponen generalmente dentro de diversos tipos de aparatos de filtro incluyendo estructura y placa de conducto abierto, fibras huecas y túbulos.

Tras la clarificación y filtración previa del lisado celular, se concentra en primer lugar el sobrenadante con virus resultante y se intercambia después el tampón mediante diafiltración. Se concentra el sobrenadante con virus mediante filtración de flujo tangencial a través de una membrana de ultrafiltración de punto de corte de peso molecular nominal de 100-300 K. La ultrafiltración es un procedimiento convectivo modificado con presión que usa membranas semipermeables para separar especies por tamaño molecular, forma y/o carga. Separa disolventes de solutos de diversos tamaños, independientemente del tamaño molecular del soluto. La ultrafiltración es suave, eficaz y puede usarse para desalar y concentrar simultáneamente disoluciones. Las membranas de ultrafiltración tienen generalmente dos capas diferenciadas: una película densa, delgada (0,1-1,5 \mum), con un diámetro de poro de 10-400 angstroms y una subestructura abierta de huecos progresivamente más grandes que se abren en su mayor parte hacia el lado de permeado del ultrafiltro. Cualquier especie que pueda pasar a través de los poros de la película puede pasar, por tanto, libremente a través de la membrana. Para una máxima retención de soluto, se selecciona una membrana que tiene un punto corte de peso molecular nominal muy por debajo de aquél de las especies que se retienen. En la concentración macromolecular, la membrana enriquece el contenido de las especies biológicas deseadas y proporciona un filtrado aclarado de sustancias retenidas. Los microsolutos se eliminan de manera convectiva con el disolvente. A medida que aumenta la concentración del soluto retenido, disminuye la tasa de ultrafiltración.

La diafiltración, o el intercambio de tampón, usando ultrafiltros es una forma ideal para la eliminación y el intercambio de sales, azúcares, disolventes no acuosos, separación de especies libres de las unidas, eliminación de material de bajo peso molecular, o cambio rápido de entornos iónicos y de pH. Los microsolutos se eliminan de la manera más eficaz añadiendo disolvente a la disolución que se somete a ultrafiltración a una tasa igual a la tasa de ultrafiltración. Esto lava las microespecies de la disolución a volumen constante, purificando las especies retenidas. La presente invención utiliza una etapa de diafiltración para intercambiar el tampón del sobrenadante con virus antes del tratamiento con Benzonase®.

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5. Infección viral

La presente invención emplea, en un ejemplo, la infección adenoviral de células con el fin de generar vectores terapéuticamente significativos. Normalmente, el virus se expondrá simplemente a la célula huésped apropiada en condiciones fisiológicas, permitiendo la captación del virus. Aunque, se muestra a modo de ejemplo el adenovirus, los presentes métodos pueden emplearse ventajosamente con otros vectores virales, tal como se trata a continuación.

A) Adenovirus

El adenovirus es particularmente adecuado para su uso como vector de transferencia génica debido a su genoma de ADN de tamaño medio, facilidad de manipulación, alto título, amplia gama de células diana y alta infectividad. El genoma viral de aproximadamente 36 kb está limitado por repeticiones terminales invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases (pb), en las que están contenidas elementos que actúan sobre cis necesarios para la replicación y el empaquetamiento del ADN viral. La regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma que contienen diferentes unidades de transcripción se dividen por el comienzo de la replicación del ADN viral.

La región E1 (E1A y E1B) codifica para proteínas responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B) da como resultado la síntesis de las proteínas para la replicación del ADN viral. Estas proteínas están implicadas en la replicación del ADN, la expresión de genes de expresión tardía y el silenciamiento de células huésped (Renan, 1990). Los productos de los genes de expresión tardía (L1, L2, L3, L4 y L5), incluyendo la mayoría de las proteínas de la cápside viral, se expresan sólo tras un procesamiento significativo de un único transcrito primario emitido por el promotor tardío principal (MLP). El MLP (ubicado a 16,8 unidades de mapeo) es particularmente eficaz durante la fase tardía de la infección, y todos los ARNm emitidos de este promotor tienen una secuencia líder triparental (TL) en 5' que los hace ARNm preferidos para la traducción.

Con el fin de optimizar el adenovirus para la terapia génica, es necesario maximizar la capacidad de carga de manera que puedan incluirse grandes segmentos de ADN. También es muy deseable reducir la toxicidad y la reacción inmunológica asociada con ciertos productos adenovirales. La eliminación de grandes partes del genoma adenoviral, y proporcionar los productos génicos de deleción en trans, mediante virus auxiliar y/o células cooperadoras, permite la inserción de grandes partes de ADN heterólogo en el vector. Esta estrategia dará como resultado también inmunogenicidad y toxicidad reducidas de los productos génicos de adenovirus.

El gran desplazamiento de ADN es posible porque los elementos cis requeridos para la replicación del ADN viral se localizan todos en las repeticiones terminales invertidas (ITR) (100-200 pb) en cualquier extremo del genoma viral lineal. Los plásmidos que contienen las ITR pueden replicarse en presencia de un adenovirus no deficiente (Hay et al., 1984). Por tanto, la inclusión de estos elementos en un vector adenoviral debe permitir la replicación.

Además, la señal de empaquetamiento para la encapsidación viral está ubicada entre los pb 194-385 (0,5-1,1 unidades de mapeo) en el extremo izquierdo del genoma viral (Hearing et al., 1987). Esta señal imita el sitio de reconocimiento de proteína en el ADN del bacteriófago \lambda en el que una secuencia específica cerca del extremo izquierdo, pero fuera de la secuencia de extremo cohesivo, media en la unión a proteínas que se requieren para la inserción del ADN en la estructura principal. Los vectores de sustitución de E1 de Ad han demostrado que un fragmento de 450 pb (0-1,25 unidades de mapeo) en el extremo izquierdo del genoma viral puede empaquetarse directamente en células 293 (Levrero et al., 1991).

Previamente, se ha demostrado que ciertas regiones del genoma adenoviral pueden incorporarse en el genoma de células de mamífero y los genes codificados expresarse de ese modo. Estas líneas celulares pueden apoyar la replicación de un vector adenoviral que es deficiente en la función adenoviral codificada por la línea celular. También ha habido notificaciones de complementación de vectores adenovirales de replicación deficiente por vectores "auxiliares", por ejemplo, virus de tipo natural o mutantes condicionalmente deficientes.

Los vectores adenovirales de replicación deficiente pueden complementarse, en trans, por un virus auxiliar. Sin embargo, esta observación sola no permite el aislamiento de los vectores de replicación deficiente, dado que la presencia de virus auxiliar, necesario para proporcionar funciones replicativas, contaminaría cualquier preparación. Por tanto, era necesario un elemento adicional que añadiera especificidad a la replicación y/o el empaquetamiento del vector de replicación deficiente. Ese elemento, según lo previsto en la presente invención, deriva de la función de empaquetamiento del adenovirus.

Se ha demostrado que existe una señal de empaquetamiento para adenovirus en el extremo izquierdo del mapa de adenovirus convencional (Tibbetts, 1977). Estudios posteriores mostraron que un mutante con una deleción en la región E1A (194-358 pb) del genoma crecía escasamente incluso en una línea celular que complementaba la función temprana (E1A) (Hearing y Shenk, 1983). Cuando se recombinó un ADN adenoviral compensador (0-353 pb) en el extremo derecho del mutante, el virus se empaquetaba normalmente. El análisis mutacional adicional identificó un elemento dependiente de posición, repetido, corto en el extremo izquierdo del genoma de Ad5. Se encontró que una copia de la repetición era suficiente para el empaquetamiento eficaz si estaba presente en cualquier extremo del genoma, pero no cuando se movía hacia el interior de la molécula de ADN de Ad5 (Hearing et al., 1987).

Usando versiones mutadas de la señal de empaquetamiento, es posible crear virus auxiliares que se empaquetan con eficacias variables. Normalmente, las mutaciones son deleciones o mutaciones puntuales. Cuando se hacen crecer virus auxiliares con empaquetamiento de baja eficiencia en células cooperadoras, se empaqueta el virus, aunque a tasas reducidas en comparación con virus de tipo natural, permitiendo de ese modo la propagación del auxiliar. Sin embargo, cuando se hacen crecer estos virus auxiliares en células junto con virus que contiene señales de empaquetamiento de tipo natural, se reconocen preferentemente las señales de empaquetamiento de tipo natural con respecto a las versiones mutadas. Dada una cantidad limitante de factor de empaquetamiento, el virus que contiene las señales de tipo natural se empaqueta selectivamente cuando se compara con los auxiliares. Si la preferencia es lo suficientemente grande, deben lograrse disoluciones madre que se aproximan a la homogeneidad.

B) Retrovirus

Aunque la infección adenoviral de células para la generación de vectores terapéuticamente significativos es una realización preferida de la presente invención, se contempla que la presente invención pueda emplear la infección retroviral de células para los fines de la generación de tales vectores. Los retrovirus son un grupo de virus de ARN monocatenario caracterizados por una capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en células infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin, 1990). Entonces, el ADN resultante se integra de manera estable en los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de proteínas virales. La integración da como resultado la retención de las secuencias génicas virales en la célula receptora y sus descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y env, que codifican para proteínas de la cápside, enzima polimerasa y componentes de la envuelta, respectivamente. Una secuencia encontrada en el sentido de 5' desde el gen gag, denominada Y, funciona como señal para el empaquetamiento del genoma en los viriones. Dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) están presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Éstas contienen secuencias potenciadoras y promotoras fuertes y se requieren también para la integración en el genoma de la células huésped (Coffin, 1990).

Con el fin de construir un vector retroviral, se inserta un ácido nucleico que codifica para un promotor en el genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es de replicación deficiente. Con el fin de producir viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes LTR y Y (Mann et al., 1983). Cuando un plásmido recombinante que contiene un ADNc humano, junto con las secuencias LTR y Y retrovirales se introduce en esta línea celular (por ejemplo mediante precipitación con fosfato de calcio), la secuencia Y permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en las partículas virales, que se secretan entonces en los medios de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Entonces se recogen los medios que contienen los retrovirus recombinantes, se concentra opcionalmente y se usa para transferencia génica. Los vectores retrovirales pueden infectar una amplia variedad de tipos celulares. Sin embargo, la integración y la expresión estable requieren la división de las células huésped (Paskind et al., 1975).

Un enfoque novedoso diseñado para permitir la dirección específica de vectores de retrovirus se diseñó recientemente basándose en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de galactosa a la envuelta viral. Esta modificación podría permitir la infección específica de células tales como hepatocitos por medio de receptores de asialoglicoproteínas, si se desease.

Se diseñó un enfoque diferente para dirigir retrovirus recombinantes en el que se usaron anticuerpos biotinilados contra una proteína de la envuelta retroviral y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron por medio de los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux et al., 1989). Usando anticuerpos contra antígenos de clase I y clase II del complejo principal de histocompatibilidad, se demostró la infección de una variedad de células humanas que tenían estos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in vitro (Roux et al., 1989).

C) Virus adenoasociado

El VAA utiliza un ADN monocatenario, lineal de aproximadamente 4700 pares de bases. Las repeticiones terminales invertidas flanquean el genoma. Dos genes están presentes en el genoma, dando lugar a varios productos génicos distintos. El primero, el gen cap, produce tres proteínas de virión (VP) diferentes, denominadas VP-1, VP-2 y VP-3. El segundo, el gen rep, codifica para cuatro proteínas no estructurales (NS). Uno o más de estos productos del gen rep es responsable de la transcripción de VAA transactivadora.

Los tres promotores en VAA se denominan por su ubicación, en unidades de mapeo, en el genoma. Éstos son, de izquierda a derecha, p5, p19 y p40. La transcripción da lugar a seis transcritos, dos que se inician en cada uno de los tres promotores, estando uno de cada par cortado y empalmado. El sitio de corte y empalme, derivado de las unidades de mapeo 42-46, es el mismo para cada transcrito. Las cuatro proteínas no estructurales aparentemente se derivan del más largo de los transcritos, y tres proteínas de virión surgen todas del transcrito más pequeño.

El VAA no está asociado con ningún estado patológico en seres humanos. De manera interesante, para una replicación eficiente, el VAA requiere funciones "auxiliares" de virus tales como virus del herpes simple I y II, citomegalovirus, virus de la pseudorrabia y, por supuesto, adenovirus. El mejor caracterizado de los auxiliares es adenovirus, y se ha demostrado que muchas funciones "tempranas" para este virus ayudan con la replicación de VAA. Se cree que la expresión de bajo nivel de proteínas rep de VAA controla la expresión estructural de VAA, y se cree que la infección por virus auxiliar elimina este bloqueo.

Pueden obtenerse las repeticiones terminales del vector VAA mediante digestión con endonucleasa de restricción de VAA o un plásmido tal como p201, que contiene un genoma de VAA modificado (Samulski et al. 1987), o mediante otros métodos conocidos para el experto en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a síntesis enzimática o química de las repeticiones terminales basada en la secuencia publicada de VAA. El experto habitual en la técnica puede determinar, mediante métodos bien conocidos tales como análisis de deleción, la parte o secuencia mínima de las ITR de VAA que se requiere para permitir la función, es decir, la integración específica de sitio y estable. El experto habitual en la técnica puede determinar también qué modificaciones menores de la secuencia pueden tolerarse mientras se mantiene la capacidad de las repeticiones terminales para dirigir la integración específica de sitio, estable.

Se ha demostrado que los vectores a base de VAA son vehículos eficaces y seguros para el suministro de genes in vitro, y están desarrollándose y sometiéndose a prueba estos vectores en fases preclínicas y clínicas para una amplia gama de aplicaciones en terapia génica potencial, tanto ex vivo como in vivo (Carter y Flotte, 1996; Chatterjee et al., 1995; Ferrari et al., 1996; Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Goodman et al., 1994; Kaplitt et al., 1994; 1996, Kessler et al., 1996; Koeberl et al., 1997; Mizukami et al., 1996; Xiao et al., 1996).

La expresión y transferencia génica eficaz mediada por VAA en el pulmón ha conducido a ensayos clínicos para el tratamiento de la fibrosis quística (Carter y Flotte, 1996; Flotte et al., 1993). De manera similar, las perspectivas para el tratamiento de la distrofia muscular mediante el suministro de genes mediado por VAA del gen de la distrofina al músculo esquelético, de la enfermedad de Parkinson mediante el suministro del gen de la tirosina hidroxilasa al cerebro, de la hemofilia B mediante el suministro del gen del factor IX al hígado, y potencialmente del infarto miocárdico por el gen del factor de crecimiento endotelial vascular al corazón, parecen prometedoras dado que se ha demostrado recientemente que la expresión transgénica mediada por VAA en estos órganos es sumamente eficaz (Fisher et al., 1996; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994).

D) Herpesvirus

Puesto que el virus del herpes simple (VHS) es neurotrópico, ha generado interés considerable en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso. Además, la capacidad del VHS para establecer infecciones latentes en células neuronales sin división sin integrarse en el cromosoma de la célula huésped o alterar de otra manera el metabolismo de la célula huésped, junto con la existencia de un promotor que está activo durante la latencia hace que VHS sea un vector atractivo. Y aunque se ha centrado mucha atención en las aplicaciones neurotrópicas de VHS, este vector puede explotarse también para otros tejidos dada su amplia gama de huéspedes.

Otro factor que hace que VHS sea un vector atractivo es el tamaño y la organización del genoma. Puesto que VHS es grande, la incorporación de casetes de expresión o genes múltiples es menos problemática que en otros sistemas virales más pequeños. Además, la disponibilidad de secuencias control virales diferentes con rendimiento variable (temporal, fuerza, etc.) hace posible controlar la expresión en mayor medida que en otros sistemas. También es una ventaja que el virus tenga relativamente pocos mensajes de corte y empalme, facilitando además las manipulaciones genéticas.

Además, el VHS es relativamente fácil de manipular y puede hacerse crecer a altos títulos. Por tanto, el suministro es un problema menor, en cuanto a tanto volúmenes necesarios para conseguir suficiente MOI como en una necesidad disminuida para dosificaciones repetidas. Para una revisión de VHS como vector de terapia génica, véase Glorioso et al. (1995).

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Los VHS, denominados con subtipos 1 y 2, son virus con envuelta que están entre los agentes infecciosos más comunes a los que se enfrentan los seres humanos, infectando a millones de sujetos humanos en todo el mundo. El genoma de ADN bicatenario, complejo, grande codifica para docenas de productos génicos diferentes, algunos de los cuales derivan de transcritos cortados y empalmados. Además de los componentes estructurales de la envuelta y el virión, el virus codifica para otras numerosas proteínas que incluyen una proteasa, una ribonucleótido reductasa, una ADN polimerasa, una proteína de unión a ADNmc, una helicasa/primasa, una ATPasa dependiente de ADN, una dUTPasa y otras.

Los genes de VHS forman varios grupos cuya expresión se regula coordinadamente y se ordena secuencialmente en un modo de cascada (Honess y Roizman, 1974; Honess y Roizman, 1975; Roizman y Sears, 1995). La expresión de genes \alpha, el primer conjunto de genes que va a expresarse tras la infección, se potencia por la proteína de virión número 16 o factor \alpha-transinductor (Post et al., 1981; Batterson y Roizman, 1983; Campbell, et al., 1983). La expresión de genes \beta requiere productos de los genes \alpha funcionales, sobre todo ICP4, que es codificado por el gen \alpha4 (DeLuca et al., 1985). Los genes \gamma, un grupo heterogéneo de genes que codifican en su mayor parte para proteínas estructurales del virión, requieren el comienzo de la síntesis de ADN viral para su expresión óptima (Holland et al., 1980).

De acuerdo con la complejidad del genoma, el ciclo de vida de VHS es bastante complicado. Además del ciclo lítico, que da como resultado la síntesis de partículas de virus y, finalmente, la muerte celular, el virus tiene la capacidad de entrar en un estado latente en el que el genoma se mantiene en los ganglios neurales hasta que algo como de una señal todavía sin definir provoca una recurrencia del ciclo lítico. Se han desarrollado variantes virulentas de VHS y están fácilmente disponibles para su uso en contextos de terapia génica (patente estadounidense n.º 5.672.344).

E) Virus vaccinia

Se han usado ampliamente vectores de virus vaccinia debido a la facilidad de su construcción, niveles relativamente altos de expresión obtenida, amplia gama de huéspedes y gran capacidad para portar ADN. Vaccinia contiene un genoma de ADN bicatenario, lineal de aproximadamente 186 kb que presenta una preferencia "A-T" marcada. Las repeticiones terminales invertidas de aproximadamente 10,5 kb flanquean el genoma. La mayoría de los genes esenciales parecen mapear dentro de la región central, que es la más altamente conservada entre los poxvirus. Los marcos de lectura abiertos estimados en el virus vaccinia ascienden a desde 150 hasta 200. Aunque ambas cadenas son codificantes, una amplia superposición de los marcos de lectura no es común.

Pueden insertarse al menos 25 kb en el genoma de virus vaccinia (Smith y Moss, 1983). Los vectores de vaccinia prototípicos contienen transgenes insertados en el gen de la timidina quinasa viral por medio de recombinación homóloga. Los vectores se seleccionan en base a un fenotipo de tk. La inclusión de la secuencia líder sin traducir del virus de la encefalomiocarditis, el nivel de expresión es mayor que aquél de vectores convencionales, acumulándose los transgenes al 10% o más de la proteína de la célula infectada en 24 h (Elroy-Stein et al., 1989).

F) Virus SV40

El virus de simio 40 (SV40) se descubrió en 1960 como contaminante en vacunas contra la polio preparadas a partir de cultivos celulares de riñón de mono rhesus. Se encontró que provocaban tumores cuando se inyectaban en hámsters recién nacidos. El genoma es un ADN circular, bicatenario de aproximadamente 5000 bases que codifica para los antígenos T grande (708 AA) y pequeño (174 AA), agnoproteína y las proteínas estructurales VP1, VP2 y VP3. El respectivo tamaño de estas moléculas es de 362, 352 y 234 aminoácidos.

Se sabe poco sobre la naturaleza de los receptores para cualquier poliomavirus. El virus se incorpora mediante endocitosis y se transporta al núcleo en el que tiene lugar la pérdida de la envuelta. ARNm tempranos inician la replicación viral y es necesaria, junto con la replicación de ADN, para la expresión de genes de expresión tardía. Cerca del origen de replicación, están ubicados promotores para la transcripción temprana y tardía. Las repeticiones de veintiún pares de bases, ubicadas 40-103 nucleótidos en el sentido de 5' del sitio de iniciación de la transcripción, son los principales elementos promotores y son sitios de unión para Sp1, mientras que las repeticiones de 72 bases de pares actúan como potenciadores.

El antígeno T grande, una de las proteínas tempranas, desempeña un papel crítico en la replicación y la expresión de genes de expresión tardía y se modifica de varias maneras, incluyendo acetilación N-terminal, fosforilación, poli-ADP-ribosilación, glicosilación y acilación. El otro antígeno T se produce mediante el corte y empalme del transcrito T grande. No se requiere estrictamente la proteína T pequeña correspondiente para la infección, pero desempeña un papel en la acumulación del ADN viral.

La replicación del ADN se controla, en cierta medida, mediante una región del núcleo definida genéticamente que incluye el origen viral de replicación. El elemento SV40 tiene una longitud de aproximadamente 66 pb y tiene subsecuencias de motivos AT, motivos GC y una repetición invertida de 14 pb en el lado del gen de expresión temprana. El antígeno T grande se requiere para la iniciación de la replicación del ADN, y se ha demostrado que esta proteína se une en la proximidad del origen. También tiene actividades helicasa, adenilante y ATPasa.

Tras comenzar la replicación viral, se inicia la expresión de la región tardía. Los transcritos se solapan y, en algunos aspectos, reflejan diferentes marcos de lectura (VP1 y VP2/3). La expresión tardía se inicia en la misma región general que la expresión temprana, pero en la dirección opuesta. Las proteínas del virión se sintetizan en el citoplasma y se transportan al núcleo en el que entran como complejo. El ensamblaje del virión tiene lugar también en el núcleo, seguido por lisis y liberación de las partículas de virus infecciosas.

Se contempla que la presente invención abarcará vectores de SV40 que carecen de todas las secuencias codificantes. La región desde aproximadamente 5165-5243 y aproximadamente 0-325 contiene todos los elementos de control necesarios para la replicación y el empaquetamiento del vector y la expresión de cualquier gen incluido. Por tanto, los vectores de SV40 mínimos se derivan de esta región y contienen al menos un origen completo de replicación.

Puesto que se cree que el antígeno T grande está implicado en la expresión de genes de expresión tardía, y ningún antígeno T grande se expresa en la célula diana, se deseará que el promotor que dirige el gen heterólogo sea un promotor temprano de poliomavirus, o más preferiblemente, un promotor heterólogo. Por tanto, cuando se utilicen elementos de control heterólogos, son imprescindibles los elementos potenciadores y promotores de SV40.

G) Otros vectores virales

Otros vectores virales pueden emplearse como construcciones de expresión en la presente invención. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como los papilomavirus, papovavirus y lentivirus. Estos virus ofrecen varias características para su uso en transferencia génica en diversas células de mamífero, y se entenderá que pueden hacerse diversas modificaciones a tales virus para potenciar por ejemplo la infectividad y la selección como diana. Un experto en la técnica puede construir también virus quiméricos, que emplean partes ventajosas de diferentes virus.

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6. Modificación mediante ingeniería de vectores virales

En ciertas realizaciones, la presente invención implica además la manipulación de vectores virales. Tales métodos implican el uso de un constructo de vector que contiene, por ejemplo, un ADN heterólogo que codifica para un gen de interés y un medio para su expresión, replicar el vector en una célula cooperadora apropiada, obtener partículas virales producidas a partir de la misma, e infectar células con las partículas de virus recombinantes. El gen puede simplemente codificar para una proteína para la que se desean grandes cantidades de la proteína, es decir, métodos de producción in vitro a gran escala. Alternativamente, el gen puede ser un gen terapéutico, por ejemplo para tratar células cancerosas, expresar genes inmunomoduladores para combatir infecciones virales, o sustituir la función de un gen como resultado de un defecto génico. En el contexto del vector de terapia génica, el gen será un ADN heterólogo, que pretende incluir ADN derivado de una fuente diferente del genoma viral que proporciona la estructura principal del vector. Finalmente, el virus puede actuar como una vacuna viral viva y expresar un antígeno de interés para la producción de anticuerpos contra el mismo. El gen puede derivarse de una fuente procariota o eucariota tal como una bacteria, un virus, una levadura, un parásito, una planta o incluso un animal. El ADN heterólogo puede derivarse también de más de una fuente, es decir, un constructo multigénico o una proteína de fusión. El ADN heterólogo puede incluir también una secuencia reguladora que puede derivarse de una fuente y el gen, de una fuente diferente.

A) Genes terapéuticos

Actualmente, se reconoce p53 como un gene supresor de tumores (Montenarh, 1992). Se han encontrado altos niveles de p53 mutante en muchas células transformadas mediante carcinogénesis química, radiación ultravioleta y varios virus, incluyendo SV40. El gen p53 es una diana frecuente de inactivación por mutación en una amplia variedad de tumores humanos y ya está documentado como el gen más frecuentemente mutado en una amplia variedad de tumores humano y ya está documentado que es el gen más frecuentemente mutado en cánceres comunes en seres humanos (Mercer, 1992). Está mutado en más del 50% de NSCLC humano (Hollestein et al., 1991) y en un amplio espectro de otros tumores.

El gen p53 codifica para una fosfoproteína de 393 aminoácidos que puede formar complejos con las proteínas huésped tales como antígenos T grandes y E1B. La proteína se encuentra en tejidos y células normales, pero a concentraciones que son generalmente inapreciables en comparación con las células transformadas o tejido tumoral. De manera interesante, parece que p53 de tipo natural es importante en la regulación del crecimiento y división celulares. Se ha demostrado que la sobreexpresión de p53 de tipo natural en algunos casos es antiproliferativa en líneas de células tumorales humanas. Por tanto, p53 puede actuar como un regulador negativo del crecimiento celular (Weinberg, 1991) y puede suprimir directamente el crecimiento celular incontrolado o directa o indirectamente activar genes que suprimen este crecimiento. Por tanto, la ausencia o inactivación de p53 de tipo natural puede contribuir a la transformación. Sin embargo, algunos estudios indican que la presencia de p53 mutante puede ser necesaria para la expresión completa del potencial transformante del gen.

Se reconoce que p53 de tipo natural es un importante regulador del crecimiento en muchos tipos de células. Las mutaciones de sentido erróneo son comunes para el gen p53 y se sabe que se producen en al menos 30 codones diferenciados, creando a menudo alelos dominantes que producen cambios en el fenotipo de la célula sin una reducción hasta homocigotismo. Además, muchos de estos alelos negativos dominantes parecen tolerarse en el organismo y se pasan en la línea germinal. Diversos alelos mutantes parecen oscilar desde alelos negativos dominantes mínimamente disfuncionales hasta fuertemente penetrantes (Weinberg, 1991).

Casey y colegas han notificado que la transfección de ADN que codifica para p53 de tipo natural en dos líneas celulares de cáncer de mama humano, restaura el control de supresión del crecimiento en tales células (Casey et al., 1991). También se ha demostrado un efecto similar en la transfección de p53 de tipo natural, pero no mutante, en líneas celulares de cáncer de pulmón humano (Takahasi, et al., 1992). p53 parece dominar sobre el gen mutado y se seleccionará frente a la proliferación cuando se transfecte en células con el gen mutado. La expresión normal del p53 transfectado no es nociva para las células normales con p53 de tipo natural endógeno. Por tanto, las células normales pueden captar tales construcciones sin efectos adversos. Por tanto, se propone que el tratamiento de cánceres asociados a p53 con construcciones de expresión de p53 de tipo natural reducirá el número de células malignas o su tasa de crecimiento. Además, estudios recientes sugieren que algunos tumores p53 de tipo natural también son sensibles a los efectos de la expresión de p53 exógeno.

Las principales transiciones del ciclo celular eucariota se desencadenan mediante las quinasas dependientes de ciclina, o CDK. Una CDK, quinasa 4 dependiente de ciclina (CDK4) regula la progresión a través de la fase G_{1}. La actividad de esta enzima puede ser fosforilar Rb en G_{1} tardía. La actividad de CDK4 se controla mediante una subunidad de inactivación, ciclina de tipo D, y mediante una subunidad inhibidora, por ejemplo p16^{INK4}, que se ha caracterizado bioquímicamente como una proteína que se une específicamente a e inhibe CDK4, y por tanto puede regular la fosforilación de Rb (Serrano et al., 1993, Serrano et al., 1995). Dado que la proteína p16^{INK4} es un inhibidor de CDK4 (Serrano, 1993), la deleción de este gen puede aumentar la actividad de CDK4, dando como resultado la hiperfosforilación de la proteína Rb. También se sabe que p16 regula la función de CDK6.

P16^{INK4} pertenece a una clase recientemente descrita de proteínas inhibidoras CDK que también incluye p16^{B}, p21^{WAF21, \ CIP1, \ SDI1} y p27^{KIP1}. El gen p16^{INK4} mapea a 9p21, una región del cromosoma delecionada frecuentemente en muchos tipos de tumores. Las deleciones homocigotas y las mutaciones del gen p16^{INK4} son frecuentes en las líneas de células tumorales humanas. Esta evidencia sugiere que el gen p16^{INK4} es un gen supresor tumoral. Se ha desafiado esta interpretación, sin embargo, mediante la observación de que la frecuencia de las alteraciones del gen p16^{INK4} es mucho menor en tumores primarios no cultivados que en líneas celulares cultivadas (Caldas et al., 1994, Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994b; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). La restauración de la función de p16^{INK4} de tipo natural mediante la transfección con un vector de expresión plasmídico, redujo la formación de colonias en algunas líneas celulares de cáncer humano (Okamoto, 1994; Arap, 1995).

C-CAM se expresa en prácticamente todas las células epiteliales (Odin y Obrink, 1987). C-CAM, con un peso molecular aparente de 105 kD, se aisló originariamente de la membrana plasmática del hepatocito de rata mediante su reacción con anticuerpos específicos que neutralizan la agregación celular (Obrink, 1991). Estudios recientes indican que, estructuralmente, C-CAM pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig) y su secuencia es altamente homóloga con el antígeno carcinoembrionario (ACE) (Lin y Guidotti, 1989). Usando un sistema de expresión de baculovirus, Cheung et al., (1993a; 1993b y 1993c) demostró que el primer dominio de Ig de C-CAM es crítico para la actividad de adhesión celular.

Se sabe que las moléculas de adhesión celular, o CAM, están implicadas en una red compleja de interacciones moleculares que regulan el desarrollo de órganos y la diferenciación celular (Edelman, 1985). Datos recientes indican que la expresión aberrante de las CAM puede estar implicada en la tumorigénesis de varios neoplasmas; por ejemplo disminuir la expresión de cadherina E, que se expresa predominantemente en células epiteliales, se asocia con la progresión de varias clases de neoplasias (Edelman y Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992). También, Giancotti y Ruoslahti (1990) demostraron que la creciente expresión de integrina \alpha_{5}\beta_{1} mediante la transferencia génica puede reducir la tumorigenicidad de células de ovario de hámster chino in vivo. Ahora se ha demostrado que C-CAM suprime el crecimiento tumoral in vitro e in vivo.

Otros supresores de tumores que pueden emplearse según la presente reivindicación incluyen RB, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, BRCA1, VHL, FCC, MMAC1, MCC, p16, p21, p57, pTEN, C-CAM, p27, mda-7 y BRCA2. Inductores de apoptosis, tales como proteasas Bax, Bak, Bcl-X_{s}, Bik, Bid, Harakiri, Ad E1B y ICE-CED3, pueden encontrar uso de manera similar según la presente invención.

Diversos genes de enzimas son de interés según la presente invención. Tales enzimas incluyen citosina desaminasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, fenilalanina hidroxilasa, glucocerebrosidasa, esfingomielinasa, \alpha-L-iduronidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, timidina quinasa de VHS y timidina quinasa humana.

Las hormonas son otro grupo de genes que pueden usarse en los vectores descritos en el presente documento. Se incluyen hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placentario, hormona luteinizante, hormona folículo estimulante, gonadotropina coriónica, hormona estimulante del tiroides, leptina, adrenocorticotropina (ACTH), angiotensina I y II, \beta-endorfina, hormona estimulante de \beta-melanocitos (\beta-MSH), colecistocinina, endotelina I, galanina, péptido inhibidor gástrico (GIP), glucagón, insulina, lipotropinas, neurofisinas, somatostatina, calcitonina, péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP), péptido relacionado con el gen de \beta-calcitonina, hipercalcemia por factor de malignidad (1-40), proteína relacionada con la hormona paratiroidea (107-139) (PHT-rP), proteína relacionada con la hormona paratiroidea (107-111) (PTH-rP), péptido similar al glucagón (GLP-1), pancreastatina, péptido pancreático, péptido YY, PHM, secretina, péptido intestinal vasoactivo (VIP), oxitocina, vasopresina (AVP), vasotocina, encefalinamida, metorfinamida, hormona estimulante de alfa-melanocitos (alfa-MSH), factor natriurético auricular (5-28) (ANF), amilina, componente P amiloideo (SAP-1), hormona liberadora de corticotropina (CRH), factor liberador de hormona de crecimiento (GHRH), factor liberador de hormona luteinizante (LHRH), neuropéptido Y, sustancia K (neurocinina A), sustancia P y hormona liberadora de tirotropina (TRH).

Otras clases de genes que se contempla que se inserten en los vectores de la presente invención incluyen interleucinas y citocinas. Interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF y G-CSF.

Ejemplos de enfermedades para las que el presente vector viral sería útil incluyen, pero no se limitan a, deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia del factor IX de coagulación sanguínea humano en hemofilia B, y fibrosis quística, que implicarían la sustitución del gen del receptor transmembrana de fibrosis quística. Los vectores realizados en la presente invención también pueden usarse para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos tales como artritis reumatoide o reestenosis mediante la transferencia de genes que codifican para inhibidores de la angiogénesis o inhibidores del ciclo celular. La transferencia de activadores de profármacos tales como el gen VHS-TK también puede usarse en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, incluyendo cáncer.

B) Construcciones antisentido

También son dianas adecuadas oncogenes tales como ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl y abl. Sin embargo, para su beneficio terapéutico, estos oncogenes se expresarían como un ácido nucleico antisentido, de modo que inhiben la expresión del oncogén. El término "ácido nucleico antisentido" pretende hacer referencia a los oligonucleótidos complementarios a las secuencias de base del ADN y ARN que codifican para el oncogén. Cuando se introducen en una célula diana, los oligonucleótidos antisentido, se unen específicamente a su ácido nucleico diana e interfieren con la transcripción, y el procesamiento, transporte y/o traducción de ARN. La selección como diana de ADN bicatenario (bc) con oligonucleótidos conduce a la formación de una triple hélice; la selección como diana de ARN conducirá a la formación de una doble hélice.

Pueden diseñarse construcciones antisentido para unirse al promotor y otras regiones de control, exones, intrones o incluso los límites de exón-intrón de un gen. Las construcciones de ARN antisentido, o ADN que codifica para tales ARN antisentido, pueden emplearse para inhibir la transcripción o traducción génica o ambos, dentro de una célula huésped, o bien in vitro o bien in vivo, tal como dentro de un animal huésped, incluyendo un sujeto humano. Las secuencias de ácido nucleico que comprenden "nucleótidos complementarios" son aquéllas que pueden aparearse entre bases según las reglas de complementariedad de Watson-Crick convencionales. Es decir, que unas purinas más grandes se aparearan entre bases con unas pirimidinas más pequeñas para formar sólo combinaciones de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con cada timidina (A:T), en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso de ARN.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "complementario" o "secuencias antisentido" significan secuencias antisentido que son sustancialmente complementarias por toda su longitud y tienen muy pocos apareamientos erróneos de bases. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico de quince bases de longitud pueden denominarse complementarias cuando tienen un nucleótido complementario en las posiciones trece o catorce con sólo uno o dos apareamientos erróneos. Naturalmente, las secuencias de ácido nucleico que son "completamente complementarias" serán secuencias de ácido nucleico que son completamente complementarias por toda su longitud y no tienen apareamientos erróneos de bases.

Mientras que toda o parte de la secuencia del gen puede emplearse en el contexto de construcción antisentido, estadísticamente, cualquier secuencia de 17 bases de largo debe producirse sólo una vez en el genoma humano y, por tanto, ser suficiente para especificar una secuencia diana única. Aunque los oligómeros más cortos son más fáciles de preparar y aumentar la accesibilidad in vivo, otros numerosos factores están implicados en la determinación de la especificidad de hibridación. Tanto la afinidad de unión como la especificidad de secuencia de un oligonucleótido a su diana complementaria aumentan con el aumento de la longitud. Se contempla que se usen oligonucleótidos de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más pares de bases. Puede determinarse fácilmente si un ácido nucleico antisentido dado es eficaz en la selección como diana del gen de la célula huésped correspondiente, simplemente sometiendo a prueba las construcciones in vivo para determinar si se ve afectada la función del gen endógeno o si se ve afectada la expresión de genes relacionados que tienen secuencias complementarias.

En ciertas realizaciones, puede desearse emplear construcciones antisentido que incluyan otros elementos, por ejemplo, aquéllos que incluyen propina C-5-pirimidinas. Se ha demostrado que los oligonucleótidos que contienen análogos propina C-5 de uridina y citidina se unen al ARN con alta afinidad y son potentes inhibidores antisentido de la expresión génica (Wagner et al., 1993).

Como alternativa al suministro de antisentido dirigido, pueden usarse ribozimas dirigidas. El término "ribozima" se refiere a una enzima a base de ARN que puede seleccionar como diana y escindir secuencias de bases particulares en ADN y ARN del oncogén. Las ribozimas pueden o bien dirigirse directamente a las células, en forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de ribozima, o bien introducirse en la célula como un constructo de expresión que codifica para el ARN ribosómico deseado. Las ribozimas pueden usarse y aplicarse de manera muy similar a la descrita para los ácidos nucleicos antisentido.

C) Antígenos para vacunas

Otros genes terapéuticos pueden incluir genes que codifican para antígenos tales como antígenos virales, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos o antígenos parasitarios. Los virus incluyen picornavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus, rhabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenvirus, reovirus, retrovirus, papovavirus, parvovirus, herpesvirus, poxvirus, hepadnavirus y virus espongiforme. Dianas virales preferidas incluyen influenza, virus del herpes simples 1 y 2, sarampión, viruela, polio o VIH. Los patógenos incluyen tripanosomas, tenias, lombrices, helmintos. Además, pueden seleccionarse como diana de esta manera marcadores tumorales tales como antígeno fetal o antígeno específico prostático. Ejemplos preferidos incluyen proteínas de envuelta de VIH y antígenos de superficie de hepatitis B. La administración de un vector según la presente invención para los fines de vacunación requeriría que los antígenos asociados al vector fueran suficientemente no inmunógenos para permitir la expresión a largo plazo del transgén, para el que se desearía una fuerte respuesta inmunológica. Preferiblemente, la vacunación de un individuo sólo se requeriría con poca frecuencia, tal como cada año o cada dos años, y proporciona protección inmunológica a largo plazo frente al agente infeccioso.

D) Regiones de control

Con el fin de que el vector viral efectúe la expresión de un transcrito que codifica para un gen terapéutico, el polinucleótido que codifica para el gen terapéutico estará bajo el control transcripcional de un promotor y una señal de poliadenilación. Un "promotor" hace referencia a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria de síntesis de la célula huésped, o maquinaria de síntesis introducida, que se requiere para iniciar la transcripción específica de un gen. Una señal de poliadenilación hace referencia a la secuencia de ADN reconocida por la maquinaria de síntesis de la célula huésped, o maquinaria de síntesis introducida, que se requiere para dirigir la adición de una serie de nucleótidos al final del transcrito de ARNm para su apropiado procesamiento y tráfico del transcrito fuera del núcleo al citoplasma para su traducción. La frase "bajo control transcripcional" significa que el promotor está en la ubicación correcta en relación con el polinucleótido para controlar el inicio y la expresión de ARN polimerasa del polinucleótido.

El término promotor se usará en este caso para hacer referencia a un grupo de módulos de control transcripcional que se agrupan alrededor del sitio de iniciación para la ARN polimerasa II. Muchos de los pensamientos acerca de cómo se organizan los promotores derivan de los análisis de varios promotores virales, incluyendo aquéllos para la timidina quinasa (tk) de VHS y las unidades de transcripción tempranas de SV40. Estos estudios, que aumentaron con trabajo más reciente, han demostrado que los promotores se componen de módulos funcionales diferenciados, consistiendo cada uno en aproximadamente 7-20 pb de ADN, y que contienen uno o más sitios de reconocimiento para las proteínas activadoras o represoras de la transcripción.

Al menos un módulo en cada promotor funciona para colocar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo más conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de caja TATA, tales como el promotor para el gen desoxinucleotil transferasa terminal de mamíferos y el promotor para los genes de expresión tardía de SV40, un elemento diferenciado que se superpone al propio sitio de inicio ayuda a fijar el lugar de iniciación.

Elementos de promotor adicionales regulan la frecuencia de iniciación de la transcripción. Normalmente, se ubican en la región 30-110 pb en sentido de 5' del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que varios promotores contienen también elementos funcionales en el sentido de 3' del sitio de inicio. Frecuentemente, el espacio entre los elementos de promotor es flexible, de modo que se conserva la función de promotor cuando se invierten o mueven los elementos de promotor unos con respecto a otros. En el promotor tk, puede aumentarse el espacio entre los elementos de promotor hasta separados por 50 pb antes de que comience a disminuir la actividad. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar o bien cooperativamente o bien independientemente para activar la transcripción.

Se cree que no es importante el promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés, siempre que pueda dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula seleccionada como diana. Por tanto, cuando se selecciona como diana una célula humana, es preferible colocar la región codificante de ácido nucleico adyacente a y bajo el control de un promotor puede expresarse en una célula humana. Hablando de manera general, un promotor de este tipo puede incluir un promotor o bien humano o bien viral.

En diversas realizaciones, pueden usarse el promotor del gen de expresión precoz de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano de SV40, repetición terminal larga de virus de sarcoma de Rous, \beta-actina, el promotor de insulina de rata y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, para obtener un alto nivel de expresión de la secuencia codificante de interés. También se contempla el uso de otros promotores de fagos virales o celulares de mamíferos o bacterianos que se conocen bien en la técnica para lograr la expresión de una secuencia codificante de interés, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un fin dado. Empleando un promotor con propiedades bien conocidas, puede optimizarse el nivel y patrón de expresión de la proteína de interés tras la transfección o transformación.

La selección de un promotor que se regula en respuesta a señales sintéticas o fisiológicas específicas puede permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo, en el caso en el que la expresión de un transgén, o transgenes cuando se utiliza un vector multicistrónico, es tóxica para las células en las que el vector se produce, puede ser deseable impedir o reducir la expresión de uno o más de los transgenes. Ejemplos de transgenes que pueden ser tóxicos para la línea de células productoras son genes proapoptóticos y de citocinas. Varios sistemas de promotores inducibles están disponibles para la producción de vectores virales en los que el producto del transgén puede ser tóxico.

El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, CA) es un sistema de este tipo. Se diseña este sistema para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamífero. Consiste en un mecanismo de expresión estrechamente regulado que prácticamente no permite expresión de nivel basal del transgén, pero una inducibilidad de más de 200 veces. El sistema se basa en el receptor heterodimérico de ecdisona de Drosophila, y cuando la ecdisona o un análogo tal como muristerona A se une al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión del transgén en sentido de 3' consiguiéndose altos niveles de transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente a partir de un vector, mientras que el promotor de respuesta a ecdisona, que activa la expresión del gen de interés, está en otro plásmido. Por tanto, sería útil la modificación mediante ingeniería de este tipo de sistema en el vector de transferencia génica de interés. La cotransfección de plásmidos que contienen el gen de interés y los monómeros del receptor en la línea de células productoras permitiría entonces la producción del vector de transferencia génica sin la expresión de un transgén potencialmente tóxico. En el momento apropiado, la expresión del transgén podría activarse con ecdisona o muristerona A.

Otro sistema inducible que sería útil es el sistema Tet-Off^{TM} o Tet-On^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA) desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, 1992; Gossen et al., 1995). Este sistema también permite que se regulen altos niveles de expresión génica en respuesta a tetraciclina o derivados de tetraciclina tales como doxiciclina. En el sistema Tet-On^{TM}, la expresión génica se activa en presencia de doxicicilina, mientras que en el sistema Tet-Off^{TM}, la expresión génica se activa en ausencia de doxiciclina. Estos sistemas se basan en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a tetraciclina de E. coli. La secuencia de operador de tetraciclina a la que se une el represor de tetraciclina, y la proteína represora de tetraciclina. Se clona el gen de interés en un plásmido detrás de un promotor que tiene elementos de respuesta a tetraciclina presentes en él. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador denominado transactivador controlado por tetraciclina, que se compone, en el sistema Tet-Off^{TM}, del dominio VP16 del virus del herpes simple y el represor de tetraciclina de tipo natural. Por tanto, en ausencia de doxiciclina, la transcripción está activada constitutivamente. En el sistema Tet-On^{TM}, el represor de tetraciclina no es de tipo natural y en presencia de doxiciclina activa la transcripción. Para la producción de vectores de terapia génica, sería preferible el sistema Tet-Off^{TM} de modo que las células productoras puedan hacerse crecer en presencia de tetraciclina o doxiciclina e impedir la expresión de un transgén potencialmente tóxico, pero cuando se introduce el vector en el paciente, la expresión génica estaría activa constitutivamente.

En algunas circunstancias, sería deseable regular la expresión de un transgén en un vector de terapia génica. Por ejemplo, pueden utilizarse diferentes promotores virales con intensidades de actividad variables dependiendo del nivel de expresión deseado. En células de mamífero, se usa a menudo el promotor temprano inmediato de CMV para proporcionar una activación transcripcional intensa. También se han usado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas, se usan a menudo promotores retrovirales tales como las LTR de VLM o VTMM. Otros promotores virales que pueden usarse dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, LTR de VRS, LTR de VIH-1 y VIH-2, promotores de adenovirus tales como de la región E1A, E2A o MLP, LTR de VAA, virus del mosaico de coliflor, VHS-TK y virus de sarcoma aviar.

De manera similar, pueden usarse promotores específicos de tejidos para efectuar la transcripción en tejidos específicos o células de modo que se reduzca la toxicidad potencial o efectos no deseados a tejidos no seleccionados como diana. Por ejemplo, pueden usarse promotores tales como el PSA, probasina, fosfatasa de ácido prostático o calicreína glandular específica de la próstata (hK2), para dirigir la expresión génica en la próstata. De manera similar, pueden usarse los siguientes promotores para dirigir la expresión génica en otros tejidos (tabla 3).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Promotores específicos de tejidos

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En ciertas indicaciones, puede ser deseable activar la transcripción en momentos específicos tras la administración del vector de terapia génica. Esto puede hacerse con promotores tales como aquéllos que son regulables por hormonas o citocinas. Por ejemplo, en las aplicaciones de terapia génica en las que la indicación es un tejido gonadal en el que se producen o al que se envían esteroides específicos, puede ser ventajoso el uso de promotores regulados por andrógenos o estrógenos. Tales promotores que son regulables por hormonas incluyen VTMM, MT-1, ecdisona y RuBisco. Se espera que otros promotores regulados por hormonas tales como aquéllos que responden a hormonas tiroideas, pituitarias o adrenales, sean útiles en la presente invención. Los promotores que responden a citocinas y proteínas inflamatorias que pueden usarse, incluyen cininógeno K y T (Kageyama et al., 1987), c-fos, TNF-alfa, proteína reactiva-C (Arcone et al., 1988), haptoglobina (Oliviero et al., 1987), suero amiloide A2, C/EBP alfa, IL-1,
IL-6 (Poli y Cortese, 1989), complemento C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, alfa-1 glicoproteína ácida (Prowse y Baumann, 1988), alfa-1 antitripsina, lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1998), angiotensinógeno (Ron et al., 1991), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por glucocorticoide y metal pesado), estromelisina (inducible por éster de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2-macroglobulina y alfa-1-antiquimotripsina.

Se prevé que los promotores que son regulables en el ciclo celular pueden ser útiles en la presente invención. Por ejemplo, en un vector de terapia génica bicistrónico, el uso de un promotor de CMV fuerte para activar la expresión de un primer gen tal como p16 que detiene las células en la fase G1, puede seguirse mediante la expresión de un segundo gen tal como p53 bajo el control de un promotor que es activo en la fase G1 del ciclo celular, proporcionando así un "segundo golpe" que empuje la célula hacia la apoptosis. Pueden usarse otros promotores tales como aquéllos de diversas ciclinas, PCNA, galectina-3, E2F1, p53 y BRCA1.

También pueden usarse promotores específicos de tumores tales como osteocalcina, elemento que responde a la hipoxia (HRE), MAGE-4, ACE, alfa-fetoproteína, GRP78/BiP y tirosinasa, para regular la expresión génica en células tumorales. Otros promotores que pueden usarse según la presente invención incluyen promotores regulables por Lac, inducibles por quimioterapia (por ejemplo, MDR) e inducibles por calor (hipertermia), inducibles por radiación (por ejemplo, EGR (Joki et al., 1995)), alfa-inhibina, promotores de ARN pol III, ARNt met y de otros de aminoácidos, ARNnp U1 (Bartlett et al.), MC-1, PGK, -actina y alfa-globina. En Walther y Stein (1996) se enumeran muchos otros promotores que pueden ser útiles.

Se prevé que cualquiera de los promotores mencionados anteriormente solo o en combinación con otros puede ser útil según la presente invención dependiendo de la acción deseada. Además, la lista de promotores no debe interpretarse como que es exhaustiva o limitante, los expertos en la técnica conocerán otros promotores que pueden usarse junto con los promotores y métodos dados a conocer en el presente documento. Una lista adicional de promotores se proporciona en la tabla 4.

TABLA 4

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Además el promotor puede caracterizarse como un promotor inducible. Un promotor inducible es un promotor que es inactivo o presenta baja actividad excepto en presencia de una sustancia inductora. Algunos ejemplos de promotores que pueden incluirse como parte de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, MT II, VTMM, colagenasa, estromelisina, SV40, gen MX murino, \alpha-2-macroglobulina, gen h-2kb del MHC de clase I, HSP70, proliferina, factor de necrosis tumoral, o gen \alpha de hormona estimulante del tiroides. Los inductores asociados se muestran en la tabla 5. Se entiende que puede usarse cualquier promotor inducible en la práctica de la presente invención y que todos los promotores de este tipo se encontrarán dentro del alcance de la invención reivindicada.

TABLA 5

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En diversas realizaciones, el promotor del gen de expresión precoz de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous pueden usarse para obtener una expresión de alto nivel del polinucleótido de interés. También se contempla el uso de otros promotores virales o celulares de mamíferos o de fagos bacterianos que se conocen bien en la técnica para lograr la expresión de polinucléotidos, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para producir un efecto de inhibición del crecimiento.

Empleando un promotor con propiedades bien conocidas, puede optimizarse el nivel y patrón de expresión de un polinucleótido tras la trasfección. Por ejemplo, la selección de un promotor que es activo en células específicas, tales como tirosinasa (melanoma), alfa-fetoproteína y albúmina (tumores de hígado), CC10 (tumor pulmonar) y antígeno específico de próstata (tumor de próstata) permitirá la expresión específica de tejidos del gen terapéutico.

Originariamente, se detectaron potenciadores como elementos genéticos que aumentaban la transcripción desde un promotor ubicado en una posición distante en la misma molécula de ADN. Esta capacidad de actuar sobre una gran distancia tuvo poco precedente en estudios clásicos de regulación transcripcional procariota. Un trabajo posterior demostró que las regiones de ADN con actividad potenciadora se organizan de manera muy similar a los promotores. Es decir, están compuestas de muchos elementos individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas transcripcionales.

La distinción básica entre potenciadores y promotores es operacional. Una región potenciadora como un todo debe poder estimular la transcripción a distancia; esto no es necesariamente cierto de una región promotora o sus elementos componentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno o más elementos que dirijan el inicio de la síntesis de ARN en un sitio particular y en una orientación particular, mientras que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y potenciadores a menudo se solapan y son contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organización modular muy similar.

Además, también puede usarse cualquier combinación promotor/potenciador (según la base de datos de promotores eucariotas (EPDB)) para activar la expresión de un constructo particular. El uso de un sistema de expresión citoplasmático T3, T7 o SP6 es otra posible realización. Las células eucarióticas pueden apoyar la transcripción citoplasmática desde ciertos promotores bacteriófagos si se proporciona la bacteriófago polimerasa apropiada, o bien como parte del complejo de suministro o bien como un vector de expresión genética adicional.

Cuando se emplea un inserto de ADNc, normalmente se deseará incluir una señal de poliadenilación para efectuar una poliadenilación apropiada del transcrito génico. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y puede emplearse cualquier secuencia de este tipo. Se ha encontrado que tales señales de poliadenilación como aquéllas de SV40, hormona de crecimiento bovino y el gen de la timidina quinasa del virus de la herpes simple, funcionan bien en varias células diana.

7. Métodos de transferencia génica

Con el fin de crear las líneas de células cooperadoras y crear vectores de adenovirus recombinantes para su uso con las mismas, deben suministrarse a la célula diversas construcciones genéticas (es decir, ADN). Una manera de lograr esto es por medio de transducciones virales usando partículas virales infecciosas, por ejemplo, mediante la transformación con un vector de adenovirus de la presente invención. Alternativamente, puede emplearse virus retrovirales o de papiloma bovino, ambos de los cuales permiten la transformación permanente de una célula huésped con un(os) gen(es) de interés. En otras situaciones, el ácido nucleico que va transferirse no es infeccioso, es decir, está contenido en una partícula viral infecciosa. Este material genético debe basarse en métodos no virales para su transferencia.

También se contemplan varios métodos no virales para la transferencia de construcciones de expresión a células de mamífero cultivadas. Éstos incluyen precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Ebm 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985), liposomas cargados de ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et al., 1979), sonicación celular (Fechheimer et al., 1897), bombardeo de genes usando microproyectiles de alta velocidad (Yang et al., 1990) y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988).

Una vez que se ha suministrado el constructo a la célula, el ácido nucleico que codifica para el gen terapéutico puede colocarse y expresarse en diferentes sitios. El ácido nucleico que codifica para el gen terapéutico puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula. Esta integración puede estar en la ubicación y orientación afines mediante recombinación homóloga (sustitución génica) o puede integrase en una ubicación aleatoria, no específica (incremento de la expresión génica). El ácido nucleico puede mantenerse de manera estable en la célula como un segmento separado, episómico de ADN. Tales segmentos de ácidos nucleicos o "episomas" codifican para secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independientes de o en sincronización con el ciclo de la célula huésped. Cómo se suministra el constructo de expresión a una célula y dónde en la célula permanece el ácido nucleico depende del tipo de constructo de expresión empleado.

El constructo de expresión puede consistir simplemente en el ADN recombinante desnudo o plásmidos. La transferencia del constructo puede realizarse mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente que permeabilizan física o químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro, sin embargo, también puede aplicarse para su uso in vivo. Dubensky et al. (1984) inyectó satisfactoriamente ADN de poliomavirus en forma de precipitados con CaPO_{4} en el hígado y bazo de ratones adultos y recién nacidos demostrando replicación viral activa e infección aguda. Benvenistry y Neshif (1986) también demostraron que la inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con CaPO_{4} da como resultado la expresión de los genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica para CAM también puede transferirse de manera similar in vivo y expresar CAM.

La transferencia de un constructo de expresión de ADN desnudo a las células puede implicar el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad de acelerar microproyectiles cubiertos con ADN a una alta velocidad permitiéndoles atravesar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han desarrollado varios dispositivos para la aceleración de pequeñas partículas. Un dispositivo de este tipo se basa en una descarga de alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles usados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales como perlas de oro o tungsteno.

El constructo de expresión puede quedar atrapado en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de doble capa de fosfolípidos y un medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de disolución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan autotransposición antes de la formación de estructuras cerradas y atrapar agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991).

El suministro de ácido nucleico mediado por liposomas y la expresión de ADN foráneo in vitro ha sido muy satisfactoria. Usando el gen de \beta-lactamasa, Wong et al. (1980) demostraron la viabilidad del suministro mediado por liposomas y la expresión de ADN foráneo en células de embrión de pollo, HeLa y hepatoma cultivadas. Nicolau et al., (1987) consiguió una transferencia génica mediada por liposomas satisfactoria en ratas tras inyección intravenosa. También se incluyen distintos enfoques comerciales que implican la tecnología de "lipofección".

El liposoma puede complejarse con un virus hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusión con la membrana celular y promueve la entrada a la célula de ADN encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989). El liposoma puede complejarse o emplearse junto con proteínas cromosómicas nucleares que no son histonas (HMG-1) (Kato et al., 1991). Además, el liposoma puede complejarse o emplearse junto con tanto HVJ como HMG-1. Dado que tales construcciones de expresión se han empleado satisfactoriamente en la transferencia y expresión de ácido nucleico in vitro e in vivo, entonces éstos son aplicables para la presente invención.

Otras construcciones de expresión que pueden emplearse para suministrar un ácido nucleico que codifica para un gen terapéutico a células, son vehículos de suministro mediado por receptores. Éstos aprovechan la absorción selectiva de macromoléculas mediante endocitosis mediada por receptores en casi todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica del tipo de célula de diversos receptores, el suministro puede ser altamente específico (Wu y Wu, 1993).

Generalmente, los vehículos que se dirigen a genes mediados por receptores consisten en dos componentes: un ligando específico del receptor celular y un agente de unión al ADN. Se han usado varios ligandos para la transferencia de genes mediada por receptores. Los ligandos más extensamente caracterizados son asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner et al., 1990). Recientemente, una neoglicoproteína sintética, que reconoce el mismo receptor que ASOR, se ha usado como vehículo de suministro de genes (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) y también se ha usado el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para suministrar genes a células de carcinoma escamoso (Myers, documento EPO 0273085).

El vehículo de suministro puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al., (1987) emplearon lactosilceramida, un asialogangliósido con galactosa terminal, incorporado en liposomas, y observó un aumento en la absorción del gen de insulina mediante los hepatocitos. Por tanto, es factible que un ácido nucleico que codifique para un gen terapéutico también pueda suministrarse específicamente a un tipo de célula tal como células prostáticas, epiteliales o tumorales, mediante cualquier número de sistemas receptor-ligando con o sin liposomas. Por ejemplo, puede usarse el antígeno específico de próstata humana (Watt et al., 1986) como receptor para el suministro mediado de un ácido nucleico en el tejido de la próstata.

8. Eliminación de contaminantes de ácido nucleico

En el contexto de la presente invención, pueden usarse nucleasas para eliminar ácidos nucleicos contaminantes. Las nucleasas a modo de ejemplo incluyen Benzonase®, Pulmozyme®; o cualquier otra ADNasa o ARNasa usada comúnmente en la técnica.

Enzimas tales como Benzonaze® degradan el ácido nucleico y no tienen actividad proteolítica. La capacidad de Benzonase® para hidrolizar rápidamente ácidos nucleicos hace que la enzima sea ideal para reducir la viscosidad del lisado celular. Se conoce bien que los ácidos nucleicos pueden adherirse a partículas derivadas de células tales como virus. La adhesión puede interferir con la separación debido a aglomeración, el cambio en el tamaño de la partícula o el cambio en la carga de la partícula, dando como resultado poco si algún producto se recupera con un esquema de purificación dado. Benzonase® es muy adecuada para reducir la carga de ácido nucleico durante la purificación, eliminando así la interferencia y mejorando la producción.

Como con todas las endonucleasas, Benzonase® hidroliza enlaces fosfodiéster internos entre nucleótidos específicos. Tras la digestión completa, todos los ácidos nucleicos libres presentes en la disolución se reducen a oligonucleótidos de 2 a 4 bases de longitud.

9. Técnicas de purificación

La presente invención emplea varias purificaciones diferentes para purificar los vectores adenovirales de la presente invención. Tales técnicas incluyen aquéllas basadas en sedimentación y cromatografía y se describen en más detalle a continuación en el presente documento.

A) Centrifugación en gradiente de densidad

Existen dos métodos de centrifugación en gradiente de densidad, la técnica zonal de tasa y la técnica isopícnica (densidades iguales), y pueden usarse ambas cuando se requiera la separación cuantitativa de todos los componentes de una mezcla de partículas. También se usan para la determinación de densidades de flotación y para la estimación de los coeficientes de sedimentación.

La separación de partículas mediante la técnica zonal de tasa se basa en las diferencias de tamaño o tasas de sedimentación. La técnica implica la aplicación en capa cuidadosa de una disolución de muestra en la parte superior de un gradiente de densidad líquida preformado, cuya densidad más alta supera la de las partículas más densas que van a separase. Entonces, la muestra se centrifuga hasta que se efectúa el grado de separación deseado, es decir, durante suficiente tiempo para que las partículas se desplacen a través del gradiente para formar bandas o zonas diferenciadas que se separan según las velocidades relativas de las partículas. Dado que la técnica depende del tiempo, la centrifugación debe terminarse antes de que cualquiera de las zonas separadas sedimente en el fondo del tubo. Se ha usado el método para la separación de enzimas, hormonas, híbridos de ARN-ADN, subunidades ribosómicas, orgánulos subcelulares, para el análisis de distribución de tamaños de las muestras de polisomas y para los fraccionamientos de lipoproteína.

La muestra se aplica en capa en la parte superior de un gradiente de densidad continuo que abarca todo el intervalo de densidades de partícula que van a separarse. Por tanto, la densidad máxima del gradiente siempre debe superar la densidad de la partícula más densa. Durante la centrifugación, la sedimentación de las partículas se produce hasta que la densidad de flotación de la partícula y la densidad del gradiente son iguales (es decir, cuando p_{p} = p_{m} en la ecuación 2.12). En este punto, no se produce sedimentación adicional, independientemente de cuánto tiempo continúe la centrifugación, porque las partículas están flotando sobre un colchón de material que tiene una densidad mayor que la suya propia.

La centrifugación isopícnica, a diferencia de la técnica zonal de tasa, es un método de equilibrio, agrupándose las partículas para formar zonas cada una a su propia densidad de flotación característica. En los casos en los que, tal vez, no se requieran todos los componentes en una mezcla de partículas, puede seleccionarse un intervalo de gradiente en el que los componentes no deseados de la mezcla sedimenten en el fondo del tubo de centrifugación, mientras que las partículas de interés sedimenten a sus respectivas posiciones isopícnicas. Una técnica de este tipo implica una combinación de los enfoques tanto zonales de tasa como isopícnicos.

La centrifugación isopícnica depende solamente de la densidad de flotación de la partícula y no su forma o tamaño y es independiente del tiempo. Por tanto, las proteínas solubles que tienen una densidad muy similar (por ejemplo,
p = 1,3 g cm^{-3} en disolución de sacarosa), normalmente no pueden separarse mediante este método, mientras que los orgánulos subcelulares (por ejemplo, aparato de Golgi, p = 1,11 g cm^{-3}, mitocondria, p = 1,19 g cm^{-3} y peroxisomas, p = 1,23 g cm^{-3} en disolución de sacarosa) pueden separarse eficazmente.

Como alternativa a la aplicación en capa de la mezcla de partículas que va a separase en un gradiente preformado, la muestra se mezcla inicialmente con el medio de gradiente para dar una disolución de densidad uniforme, "autoformándose" el gradiente por el equilibrio de sedimentación, durante la centrifugación. En este método (denominado método de isodensidades en equilibrio), generalmente se hace uso de las sales de metales pesados (por ejemplo, cesio o rubidio), sacarosa, sílice coloidal o metrizamida.

La muestra (por ejemplo, ADN) se mezcla homogéneamente con, por ejemplo, una disolución concentrada de cloruro de cesio. La centrifugación de la disolución de cloruro de cesio concentrado da como resultado la sedimentación de las moléculas de CsCl para formar un gradiente de concentración y por tanto un gradiente de densidad. Las moléculas de muestra (ADN), que se distribuyen inicialmente de manera uniforme por todo el tubo ahora o bien suben o bien sedimentan hasta que alcanzan una región en la que la densidad de la disolución es igual a su propia densidad de flotación, es decir, su posición isopícnica, en la que se agruparan para formar zonas. Esta técnica tiene la desventaja de que a menudo se requieren tiempos de centrifugación muy largos (por ejemplo, 36 a 48 horas) para establecer el equilibrio. Sin embargo, comúnmente se usa en centrifugación analítica para determinar la densidad de flotación de una partícula, la composición de base del ADN bicatenario y para separar las formas de ADN lineares de las
circulares.

Muchas de las separaciones pueden mejorarse aumentando las diferencias de densidad entre las diferentes formas de ADN mediante la incorporación de isótopos pesados (por ejemplo, ^{15}N) durante la biosíntesis, una técnica usada por Leselson y Stahl para elucidar el mecanismo de replicación de ADN en Escherichia coli, o mediante la unión de iones de metales pesados o de colorantes tales como bromuro de etidio. También se han usado gradientes isopícnicos para separar y purificar virus y analizar lipoproteínas de plasma humano.

B) Cromatografía

En ciertas realizaciones de la invención, sería deseable producir adenovirus purificado. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de purificación. Estas técnicas tienden a implicar el fraccionamiento del medio celular para separar las partículas de adenovirus de otros componentes de la mezcla. Habiendo separado las partículas adenovirales de los otros componentes, puede purificarse el adenovirus usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación completa. Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de una partícula adenoviral pura de la presente invención son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por exclusión de tamaño; electroforesis en gel de poliacrilamida. Un método de purificación particularmente eficiente que se emplea junto con la presente invención es HPLC.

Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a la purificación, y en realizaciones particulares, la purificación sustancial, de una partícula adenoviral. El término "purificado" tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una composición, aislable de otros componentes, en la que se purifica la partícula adenoviral hasta cualquier grado en relación con su forma que puede obtenerse de manera natural. Por tanto, una partícula adenoviral purificada también hace referencia a un componente adenoviral, libre del ambiente en que puede producirse de manera natural.

Generalmente, "purificado" hará referencia a una partícula adenoviral que se ha sometido a un fraccionamiento para eliminar otros diversos compuestos, y cuya composición conserva sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se usa el término "sustancialmente purificado", esta denominación hará referencia a una composición en la que la partícula, proteína o péptidos forma el principal componente de la composición, tal como constituyendo aproximadamente el 50% o más de los constituyentes en la composición.

Los expertos en la técnica conocerán diversos métodos para cuantificar el grado de purificación de una proteína o péptido a la luz de la presente descripción. Éstos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa, o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción mediante análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial, y calcular así el grado de pureza, evaluado en el presente documento con un "número de veces de purificación". Naturalmente, las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerán de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación, y si la proteína o el péptido expresado exhiben o no una actividad detectable.

No hay un requisito general sobre que el adenovirus se proporcione siempre en su estado más purificado. De hecho, se contempla que productos sustancialmente menos purificados tendrán utilidad en ciertas realizaciones. La purificación parcial puede conseguirse usando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que un cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC generalmente dará como resultado una purificación de más veces que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía a baja presión. Los métodos que presentan un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto de proteína, o en mantener la actividad de una proteína expresada.

Naturalmente, se entiende que las técnicas cromatográficas y otras técnicas de purificación conocidas por los expertos en la técnica también pueden emplearse para purificar proteínas expresadas por los vectores adenovirales de la presente invención. La cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía líquida de alta resolución son técnicas de purificación a modo de ejemplo empleadas en la purificación de partículas adenovirales y se describen en más detalle a continuación en el presente documento.

Cromatografía de intercambio iónico. El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que la afinidad de una sustancia por el intercambiador depende tanto de las propiedades eléctricas del material como de la afinidad relativa de otras sustancias cargadas en el disolvente. Por tanto, el material unido puede eluirse cambiando el pH, alterando así la carga del material, o añadiendo materiales de competición, de las cuales las sales son sólo un ejemplo. Dado que diferentes sustancias tienen propiedades eléctricas diferentes, las condiciones para la liberación varían con cada especie molecular unida. En general, para conseguir una buena separación, los métodos de elección son o bien elución en gradiente de fuerza iónica continua o bien elución gradual (A menudo no se usa un gradiente de pH solo, porque es difícil establecer un gradiente de pH sin aumentar simultáneamente la fuerza iónica). Para un intercambiador aniónico, o bien se aumenta gradualmente cada pH y fuerza iónica o bien se aumenta la fuerza iónica sola. Para un intercambiador catiónico, se aumenta tanto el pH como la fuerza iónica. La elección real del procedimiento de elución normalmente es un resultado de ensayo y error y de consideraciones de estabilidad. Por ejemplo, para materiales inestables, es mejor mantener el pH bastante constante.

Un intercambiador iónico es un sólido que tiene grupos cargados unidos químicamente a los que están unidos electrostáticamente iones; puede intercambiar estos iones por iones en disolución acuosa. Los intercambiadores iónicos pueden usarse en cromatografía en columna para separar moléculas según la carga,; en realidad otras características de la molécula son normalmente importantes de modo que el comportamiento cromatográfico es sensible a la densidad de carga, distribución de carga y el tamaño de la molécula.

El principio de la cromatografía de intercambio iónico es que las moléculas cargadas se adsorben de manera reversible en intercambiadores iónicos de modo que puedan unirse o eluirse las moléculas cambiando el entorno iónico. La separación en intercambiadores iónicos se consigue normalmente en dos fases: en primer lugar, las sustancias que van a separarse se unen al intercambiador, usando las condiciones que proporcionan una unión estable y estrecha; entonces la columna se eluye con tampones de diferente pH, fuerza iónica, o composición y los componentes del tampón compiten con el material unido por los sitios de unión.

Normalmente, un intercambiador iónico es una red o matriz tridimensional que contiene grupos cargados unidos covalentemente. Si un grupo está cargado negativamente, intercambiará iones positivos y es un intercambiador catiónico. Un grupo típico usado en los intercambiadores catiónicos es el grupo sulfónico, SO_{3}^{-}. Si un H^{+} está unido al grupo, se dice que el intercambiador está en forma ácida; por ejemplo, puede intercambiar un H^{+} por un Na^{+} o dos H^{+} por un Ca^{2-}. El grupo ácido sulfónico se denomina intercambiador catiónico fuertemente ácido. Otros grupos comúnmente usados son carboxilo e hidroxilo fenólico, ambos intercambiadores catiónicos débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo (por ejemplo, un grupo amino cuaternario) es un intercambiador aniónico fuertemente básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente básicos más comunes son grupos aminoalifáticos o aromáticos.

La matriz puede prepararse de diversos materiales. Los materiales usados comúnmente son dextrano, celulosa, agarosa y copolímeros de estireno y vinilbenceno en los que el divinilbenceno tanto reticula las cadenas de poliestireno como contiene los grupos cargados. La tabla 6 proporciona la composición de muchos intercambiadores iónicos.

La capacidad total de un intercambiador de iones mide su capacidad para captar grupos intercambiables por miligramo de peso seco. Este número se suministra por el fabricante y es importante porque, si se supera la capacidad, los iones pasarán a través de la columna sin unirse.

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TABLA 6

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La capacidad disponible es la capacidad en condiciones experimentales particulares (es decir, pH, fuerza iónica). Por ejemplo, la medida en que se carga un intercambiador iónico depende del pH (el efecto del pH es menor con intercambiadores iónicos fuertes). Otro factor es la fuerza iónica porque los iones pequeños cerca de los grupos cargados compiten con la molécula de la muestra por estos grupos. Esta competición es bastante eficaz si la muestra es una macromolécula porque un coeficiente de difusión más alto de los iones pequeños significa un mayor número de encuentros. Claramente, a medida que la concentración de tampón aumenta, la competición pasa a ser más reñida.

La porosidad de la matriz es una característica importante porque los grupos cargados están tanto dentro como fuera de la matriz y porque la matriz también actúa como tamiz molecular. Puede que moléculas grandes no puedan penetrar en los poros; así la capacidad disminuirá con el aumento de las dimensiones moleculares. La porosidad de las resinas a base de poliestireno se determina mediante la cantidad de reticulación por el divinilbenceno (la porosidad disminuye con cantidades crecientes de divinilbenceno). Con las series Dowex y AG, el porcentaje de divinilbenceno se indica mediante un número tras un X-, por tanto, Dowex 50-X8 es divinilbenceno al 8%.

Los intercambiadores iónicos vienen en una variedad de tamaños de partículas, denominados tamaño de malla. Una malla más fina significa un ratio de superficie con respecto a volumen aumentada y por tanto, capacidad aumentada y menos tiempo para que se produzca el intercambio para un volumen dado del intercambiador. Por otro lado, malla fina significa una velocidad de flujo lenta, que puede aumentar la propagación por difusión. El uso de partículas muy finas, aproximadamente 10 \mum de diámetro y alta presión para mantener un flujo adecuado se denomina cromatografía de líquidos de alta resolución o a alta presión o simplemente HPLC.

Una colección de este tipo de intercambiadores que tienen propiedades tan diferentes (carga, capacidad, porosidad, malla) hace que la selección del apropiado para conseguir una separación particular sea difícil. En los siguientes ejemplos se describe cómo decidir sobre el tipo de material de la columna y las condiciones para la unión y
elución.

Existen varias decisiones que han de tomarse cuando se emplea cromatografía de intercambio iónico como técnica. La primera decisión que ha de tomarse es si el intercambiador debe ser aniónico o catiónico. Si los materiales que van a unirse a la columna tienen una sola carga (es decir, o bien positiva o bien negativa), la elección es clara. Sin embargo, muchas sustancias (por ejemplo, proteínas, virus), tienen cargas tanto negativas como positivas y la carga neta depende del pH. En tales casos, el factor primario es la estabilidad de la sustancia a diversos valores de pH. La mayoría de las proteínas tienen un intervalo de estabilidad de pH (es decir, en el que no se desnaturalizan) en el que están cargadas o bien positivamente o bien negativamente. Por tanto, si una proteína es estable a valores de pH por encima del punto isoeléctrico, debe usarse un intercambiador aniónico; si es estable a valores por debajo del punto isoeléctrico, se requiere un intercambiador catiónico.

La elección entre intercambiadores fuertes y débiles también se basa en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad. Por ejemplo, si se somete a cromatografía una sustancia ionizada débilmente que requiere muy bajo o alto pH para su ionización, se busca un intercambiador iónico fuerte porque funciona por todo el intervalo de pH. Sin embargo, si la sustancia es lábil, se prefieren intercambiadores iónicos débiles porque los intercambiadores fuertes a menudo pueden distorsionar una molécula de modo que se desnaturaliza la molécula. Naturalmente, el pH al que la sustancia es estable debe coincidir con el estrecho intervalo de pH en el que se carga un intercambiador débil particular. Los intercambiadores iónicos débiles también son excelentes para la separación de moléculas con una alta carga de aquéllas con una carga pequeña, porque los iones cargados débilmente no se unen normalmente. Los intercambiadores débiles también muestran mayor resolución de sustancias si las diferencias de carga son muy pequeñas. Si una macromolécula tiene una carga muy fuerte, puede ser imposible eluir desde un intercambiador fuerte y de nuevo puede ser preferible un intercambiador débil. En general, los intercambiadores débiles son más útiles que los intercambiadores fuertes.

Los intercambiadores Sephadex y Bio-gel ofrecen una ventaja particular para macromoléculas que son inestables a baja fuerza iónica. Dado que las reticulaciones en estos materiales mantienen la insolubilidad de la matriz incluso si la matriz es altamente polar, puede hacerse que la densidad de los grupos ionizables sea varias veces mayor que lo que es posible con intercambiadores iónicos de celulosa. El aumento de la densidad de carga significa un aumento en la afinidad de modo que puede llevarse a cabo la adsorción a mayores fuerzas iónicas. Por otro lado, estos intercambiadores conservan algunas de sus propiedades de tamizado molecular, de modo que a veces diferencias de peso molecular anulan la distribución provocada por las diferencias de carga; el efecto de tamizado molecular también puede potenciar la separación.

Dado que la capacidad disponible es grande, las moléculas pequeñas se separan de la mejor manera en matrices con un tamaño de poro pequeño (alto grado de reticulación), mientras que las macromoléculas necesitan un tamaño de poro grande. Sin embargo, a excepción del tipo Sephadex, la mayoría de los intercambiadores iónicos no ofrecen la oportunidad de hacer coincidir la porosidad con el peso molecular.

Los intercambiadores iónicos de celulosa han demostrado ser los mejores para purificar moléculas grandes tales como proteínas y polinucleótidos. Esto es porque la matriz es fibrosa, y por tanto todos los grupos funcionales, están en la superficie y disponibles incluso para las moléculas más grandes. Sin embargo, en muchos casos, formas perladas tales como DEAE-Sephacel y DEAE-Biogel P son más útiles porque hay una velocidad de flujo y el efecto de tamizado molecular ayuda en la separación.

La selección de un tamaño de malla es siempre difícil. Un tamaño de malla pequeño mejora la resolución pero reduce la velocidad de flujo, que aumenta la propagación de zona y reduce la resolución. Por tanto, el tamaño de malla apropiado normalmente se determina de manera empírica.

Dado que los tampones mismos consisten en iones, también pueden intercambiarse, y puede verse afectado el equilibrio de pH. Para evitar estos problemas, se adopta la regla de tampones: usar tampones catiónicos con intercambiadores aniónicos y tampones aniónicos con intercambiadores catiónicos. Dado que la fuerza iónica es un factor en la unión, debe elegirse un tampón que tenga una alta capacidad de tamponamiento, de modo que su fuerza iónica no necesite ser muy alta. Además, para la mejor resolución, generalmente se ha encontrado que las condiciones iónicas usadas para aplicar la muestra a la columna (las denominadas condiciones iniciales) deben estar cerca de aquéllas usadas para eluir la columna.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se caracteriza por una separación muy rápida con extraordinaria resolución de picos. Esto se logra mediante el uso de partículas muy finas y alta presión para mantener una velocidad de flujo adecuada. La separación puede conseguirse en cuestión de minutos, o a lo mucho una hora. Además, sólo se necesita un volumen muy pequeño de la muestra, porque las partículas son tan pequeñas y bien empaquetadas que el volumen de huecos es una fracción muy pequeña del volumen de lecho. Además, la concentración de la muestra no necesita ser muy grande porque las bandas son tan estrechas que hay muy poca dilución de la muestra.

La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), contemplada para su uso en la presente invención para la separación de partículas virales, se basa en las propiedades hidrófobas de las partículas presentadas al disolvente (Arakawa y Narhi, 1991). HIC a menudo obvia el uso de grandes columnas de exclusión por tamaño y aditivos tales como detergentes, PEG y disolventes orgánicos.

Se han usado resinas de HIC TosoHass para purificar ADN de plásmidos de impurezas del lisado tales como proteína residual, ARN y ADN genómico. Por ejemplo, pueden purificarse concentrados de ADN mediante cromatografía de interacción hidrófoba usando resina de HIC ToyoPearl Butyl 650 (Bio Science Contract Production Corp.). Además, se han definido condiciones propicias para la reducción de 4 a 6 logaritmos de endotoxina, dependiendo de la elección de la resina. De manera significativa, estas resinas no son costosas y son escalables. Partiendo de ADN plasmídico de calidad relativamente alta, se purifican preparaciones de ADN plasmídico concentrado mediante dos pases a través de un solo tipo resina, dando como resultado una pureza de ADN plasmídico consistente con las especificaciones establecidas por la FDA para vacunas de ADN plasmídico en masa. Además, se ha descrito un método para la producción a gran escala y purificación en una sola etapa de anticuerpos biespecíficos (Manzke et al., 1997). En este estudio, se usó HIC para resolver anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoespecíficos y complementos de medio de cultivo en una sola etapa cromatográfica. Por tanto, HIC ofrece reducciones potenciales en el tiempo de trabajo, coste, pérdida de partículas y riesgo de contaminación.

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10. Ensayos de control de calidad

Se someten a prueba vectores de adenovirus recombinantes preparados según la presente invención, para garantizar que cumplen las especificaciones de liberación de producto deseadas. Estas especificaciones se definen mediante ensayos para determinar la actividad biológica, el título de virus, la pureza del producto final, la identidad y las características fisicoquímicas. Estos ensayos se realizan en diversas fases de producción incluyendo el análisis del lisado celular sin procesar, masa en proceso (antes del filtro), masa en proceso (tras el filtro) y el producto final. El lisado celular sin procesar se define como el material que se elimina del aparato de cultivo celular antes de que se haga cualquier procesamiento. La masa en proceso (antes del filtro) se define como el material que se ha procesado mediante la etapa de purificación por HPLC, pero no se ha sometido a filtración estéril antes de dispensar en viales. La masa en proceso (tras el filtro) se define como el material que se ha sometido a filtración estéril y está listo para dispensarse en viales. El producto final se define como el material que se ha colocado en viales individuales y está listo para su almacenamiento o uso. Se entenderá que pueden usarse protocolos similares como pruebas para Ad5CMV-p53 así como otros vectores adenovirales que contienen los mismos o diferentes transgenes. La siguiente sección describe ensayos representativos usados para someter a prueba el producto de adenovirus recombinante.

A) Ensayos de seguridad Ensayo de seguridad general

La prueba de ensayo de seguridad general (C.F.R. 610.11) se realiza para detectar la presencia de contaminantes tóxicos extraños. Se inoculan cobayas (Hartley albinos, cualquier sexo) y ratones (Swiss no consanguíneos, cualquier sexo), por vía intraperitoneal, con el artículo de prueba diluido en agua estéril para inyección y se observan signos manifiestos de mala salud, pérdida de peso o muerte durante el periodo de prueba. Se miden sus pesos justo antes de y tras la finalización del periodo de prueba de 7 días. Una prueba que pasa es una en la que los controles funcionan tal como se esperaba y los animales inoculados con el artículo de prueba tienen respuestas satisfactorias.

Ensayo de PCR para la detección de virus adenoasociados (VAA) en muestras biológicas

Este ensayo detecta la presencia de secuencias de ácido nucleico de VAA mediante amplificación por PCR con un conjunto de cebadores dirigidos hacia una región conservada en el gen de la cápside. El ADN amplificado a partir del artículo de prueba se ejecuta en gel de agarosa que contienen bromuro de etidio y se visualiza mediante fotografía. En resumen, se extrae el ADN de la muestra de prueba y se analizan 0,5 microgramos mediante PCR. La amplificación por PCR se realiza usando cebadores oligonucleotídicos de VAA específicos para la región de la cápside de VAA. También se analiza el ADN control negativo y positivo. Se determina la aceptación del ensayo mediante la ausencia de cualquier banda en la muestra control negativo, y la banda de tamaño esperado en la muestra control positivo. Para el presente ensayo, una banda específica de 459 pb es el tamaño esperado. Una prueba que pasa para el artículo de prueba es la ausencia de la banda de 459 pb.

Ensayo in vitro para determinar la presencia de contaminantes virales

Este ensayo determina si están presentes contaminantes virales adventicios en el artículo de prueba, mediante la inoculación y observación de tres tipos de células indicadoras. La presencia de contaminación viral se determina mediante observaciones del efecto citopático (CPE) u otros efectos visualmente discernibles, hemaglutinación, y hemadsorción. Las células indicadoras incluyen MRC-5, una línea diploide de pulmón humano; Vero, una línea de riñón de mono verde africano; y HeLa, una línea celular de carcinoma epitelioide humano. En resumen, se siembran las tres líneas celulares indicadoras en placas de 6 pocillos y se mantienen durante aproximadamente 24 horas. Entonces, se inoculan los cultivos con 0,5 ml de muestra adenoviral o controles de virus y se permite que haya absorción durante 1 hora a 36ºC. Entonces, se retira el virus y se reemplaza por medio de cultivo, y se observan los pocillos durante 14 días para determinar evidencia de CPE. También se sometió a prueba cada pocillo para determinar hemadsorción y hemaglutinación usando tres tipos de eritrocitos. Todos los fluidos de cultivo se traspasan de forma ciega a placas de cultivo adicionales de células indicadoras y se observan para determinar CPE durante otros 14 días.

Para aceptar este ensayo, preferiblemente deben cumplirse ciertos criterios. Éstos incluyen: 1) cada uno de los virus control positivo provocan preferiblemente CPE en las líneas de células indicadoras en las que se inoculan; 2) cada uno de los virus control positivo debe producir preferiblemente hemadsorción y/o hemaglutinación con al menos un tipo de eritrocito a 4ºC y/o 36ºC en uno o más puntos de tiempo con cada una de las líneas de células indicadoras en las que se inoculan; 3) las líneas de células indicadoras inoculadas con el control negativo no deben presentar preferiblemente ningún CPE, hemadsorción o hemaglutinación. Una prueba que pasa para el artículo de prueba preferiblemente es la ausencia de CPE, hemadsorción y hemaglutinación.

Ensayo de virus adventicio in vivo

Se diseña este ensayo para detectar la presencia de virus que no provocan un efecto discernible en sistemas de cultivo celular in vitro, pero pueden provocar efectos indeseados in vivo. El diseño experimental utiliza inoculaciones de ratones adultos y lactantes, cobayas y huevos de gallina embrionados, y es similar a aquel usado por el Instituto Británico para Normas y Controles Biológicos (British Institute for Biological Standards and Control). Esta prueba incluye pases de manera ciega de homogeneizados a animales y/o huevos de gallina sucesivos para aumentar la probabilidad de detección de contaminantes virales a bajo nivel.

Este método de prueba es tal como sigue. Se inocularán ratones lactantes por vía intraperitoneal, per os, y por vía intracraneal y se observarán durante 14 días. Se usará una sola fuente de tejido emulsionado (sin piel ni tracto gastrointestinal) de todos los ratones que sobreviven, para inocular ratones adicionales usando las mismas vías. También se inocularan ratones control con tratamiento simulado. Se inocularán ratones adultos de ambos sexos por vía intraperitoneal, per os, por vía intradérmica y por vía intracraneal y se observarán durante 28 días. También se inocularán controles de tratamiento simulado. Se inocularán cobayas adultos de ambos sexos por vía intraperitoneal y por vía intracraneal, y se observarán durante 28 días. También, se inocularán cobayas control de tratamiento simulado. Se inoculará el saco vitelino de huevos de gallina embrionados de 6-7 días de edad y se incubarán al menos nueve días. Los sacos vitelinos se recogerán, agruparán y se someterá a subpase una suspensión al 10% a nuevos huevos de gallina embrionados. Nueve días después, se evaluará la viabilidad de los huevos.

Los criterios de aceptación para los ensayos incluyen animales saludables al inicio de las pruebas, y las pruebas se considerarán válidas si aproximadamente el 90% de los ratones adultos control, aproximadamente el 80% de ratones lactantes control, aproximadamente el 80% de los huevos de gallina embrionados, y aproximadamente el 75% de las cobayas control sobreviven el periodo de incubación y no muestran lesiones en el sitio de inoculación o no muestran signos de infección viral. El artículo de prueba no se considerará contaminado, si aproximadamente el 80% de los animales permanecen saludables y sobreviven el periodo de observación y si aproximadamente el 95% de los animales usados en la prueba no muestra ninguna lesión de cualquier tipo en el sitio de inyección y no muestra ningún signo de infección viral.

B) Ensayos de pureza Ensayo BCA para determinar la proteína total

Este ensayo permite una determinación cuantitativa de la proteína total en el producto final. El ensayo usa el procedimiento del kit Pierce BCA. En resumen, se preparan las muestras por duplicado y se colocan en una placa de microtitulación. Se prepara un patrón de albúmina sérica bovina (BSA) y se coloca en una placa de microtitulación como control. Para un control negativo, se coloca diluyente en una placa de microtitulación. Se dispensa el reactivo BCA en las placas de microtitulación y se incuban las placas para permitir desarrollo de color. Entonces las placas se leen espectrofotométricamente a 550 nm, y se calculan las concentraciones de la muestra de prueba basándose en el patrón de BSA. El contenido de proteína preferido en BCA es de 200 a 500 microgramos por 1 x 10e12 partículas virales. El contenido de proteína más preferible es de 260 a 320 microgramos por 1 x 10e12 partículas virales. La concentración de proteína determinada mediante este ensayo se usa para calcular la cantidad de proteína que debe cargarse en el gel de SDS-PAGE para el análisis de restricción.

Ensayo de esterilidad

Se usan ensayos de esterilidad (documentados en U.S.P. XXIII <71>) tanto en la fase de producto en masa como final. Las pruebas de esterilidad son mediante filtración en membrana y se realizan en un sistema de aislamiento de pared blanda para minimizar la contaminación en el laboratorio de las muestras sometidas a prueba. Preferiblemente, todos los artículos de prueba deben pasar la prueba de esterilidad.

Prueba de carga microbiana

La prueba de carga microbiana se usa para detectar la carga microbiana en una muestra de prueba mediante el filtrado de la muestra de prueba en un filtro de membrana, colocando el filtro de membrana sobre placas de agar de soja tríptica y agar Sabouraud y para observar el crecimiento después de 2-5 días de incubación. También se someten a ensayo suspensiones con niveles conocidos de Bacillus subtilis y Candida albicans para confirmar la idoneidad del ensayo.

En resumen, el método de prueba es tal como sigue. Se deben almacenar las muestras de prueba hasta 24 horas a 2-8ºC antes de someter a prueba. Pueden congelarse las muestras de reserva que no se van a someter a prueba en el plazo de 24 horas, a menos de -60ºC. Se preparan controles negativos (diluyente estéril) mediante el filtrado de 100 mL de diluyente estéril a través de una unidad de filtro para análisis usando un vacío. Se retira el filtro de membrana de la unidad y se coloca sobre una placa de agar de soja tríptica precalentada. El procedimiento se repite usando una segunda unidad de filtro y se coloca el filtro sobre una placa de agar Sabouraud precalentada. Se someten a prueba las muestras de prueba en proceso mediante el filtrado de 5 x 10 mL de lisado celular sin procesar en 5 filtros separados ó 10 mL de producto en masa prefiltrado en un único filtro. Se retira cada membrana de la unidad y se coloca sobre una placa de agar de soja tríptica precalentada. El procedimiento se repite usando un segundo conjunto de unidades de filtro y se coloca el filtro sobre placas de agar Sabouraud precalentadas. Se preparan controles positivos de Bacillus subtilis mediante el filtrado de 50 mL de diluyente estéril a través de una unidad de filtro para análisis usando un vacío. Se retira el filtro de membrana de la unidad y se coloca sobre una placa de agar de soja tríptica precalentada. Se repite el procedimiento usando un control positivo de Candida albicans usando una segunda unidad de filtro y el filtro se coloca sobre una placa de agar Sabouraud precalentada. Las placas de agar de soja tríptica se incuban a 30-35ºC durante 2-5 días. Las placas de agar Sabouraud se incuban a 22-27ºC durante 5-7 días. Tras el periodo de incubación, se cuentan las colonias en los filtros de membrana. Los ensayos son aceptables cuando los controles negativos no presentan crecimiento y los controles positivos presentan 1-100 colonias por filtro de membrana. Preferiblemente, el artículo de prueba debe contener menos de o igual a 1000 unidades formadoras de colonias por 100 mL del lisado celular sin procesar. Es más preferible que el lisado celular sin procesar contenga menos de o igual a 500 unidades formadoras de colonias por 100 mL, y lo más preferible es que el lisado sin procesar contenga menos de o igual a 10 unidades formadoras de colonia por 100 mL. Lo más preferible es que el producto en masa prefiltrado contenga menos de o igual a una unidad formadora de colonia por 10 mL. Usando las técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de carga microbiana menores de 1 en la etapa de lisado celular sin procesar, y de menos de 1 en la etapa de producto en masa prefiltrado.

Prueba de endotoxina bacteriana

El fin de esta prueba es medir la cantidad de endotoxina bacteriana gram negativa en una muestra dada. Se realiza el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) según la USPXXIII usando un kit de prueba cromogénico comercial. Se usa para cuantificar el nivel de endotoxina bacteriana gram negativa en las muestras de prueba. Se realizan diluciones de las muestras con y sin adición conocida de endotoxina, para la evaluación de los efectos de inhibición o intensificación.

El método de prueba se realiza según las indicaciones resumidas en el prospecto del kit de prueba, y es tal como sigue. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos y se usa agua libre de LAL como blanco de ensayo. Se prepara una curva patrón que oscila desde 0,01 hasta 5,0 unidades de endotoxina/ml, usando un patrón de endotoxina comercialmente disponible. Las muestras de prueba se someten a prueba o bien puras o bien diluidas apropiadamente en agua libre de endotoxina. Se preparan controles positivos mediante la adición conocida de muestras de prueba a cada dilución con 0,05 UE/mL. Todas las manipulaciones se realizan en tubos de vidrio o poliestireno libres de pirógenos, usando puntas de pipetas libres de pirógenos. Se incuba la placa de 96 pocillos con blanco, curva patrón, muestras de prueba y control positivo durante 10 minutos, tras lo cual se añade el reactivo LAL a cada pocillo. Se lee la placa en un lector cinético a 405 nm durante 150 segundos y se expresan los resultados en UE/mL.

Para que el ensayo sea aceptable, preferiblemente la curva patrón debe ser lineal con un valor de r de -0,980 a 1,000, preferiblemente la pendiente de la curva deber ser de -0,0.. a -0,100, preferiblemente la ordenada en el origen debe ser de 2,5000 a 3,5000 y preferiblemente la recuperación de endotoxina en el control positivo debe ser del 5-150% de la adición conocida. Es preferible que la muestra tenga menos de cinco (5) UE/mL, más preferiblemente la muestra tiene menos de 3 UE/mL, y lo más preferible es que la muestra tenga menos de 0,05 UE/mL. Usando las técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de endotoxina de tan solo 0,15 en la etapa de producto en masa prefiltrado y de tan solo 0,3 en la etapa de producto final.

Prueba para la determinación de la presencia de Mycoplasmas cultivables en agar y no cultivables

Este ensayo detecta la presencia de Mycoplasma en un artículo de prueba basándose en la capacidad del Mycoplasma para crecer en uno cualquiera de los sistemas de prueba: Aislamiento en agar y sistema de cultivo de células Vero. El crecimiento se expresa mediante la formación de colonias, el cambio en los indicadores de pH o la presencia de Mycoplasma mediante tinción, dependiendo del sistema usado. El ensayo se realiza usando un gran volumen de muestra. Los métodos de prueba son tal como sigue. Se inoculan el artículo de prueba y los controles positivos directamente sobre las placas de agar para Mycoplasma y en caldo semisólido para Mycoplasma que se subcultiva tres veces en placas de agar. Las muestras se incuban tanto aeróbica como anaeróbicamente. En el día 14 tras la infección, se examinan las placas de agar para evidenciar el crecimiento. También se inocula el artículo de prueba directamente en cultivos de células Vero y se incuban durante 3-5 días. Los cultivos se tiñen con fluorocromo que se une a ADN y se evalúan microscópicamente mediante epifluorescencia para determinar la presencia de Mycoplasma.

Para el ensayo de aislamiento en agar, preferiblemente los controles positivos deben mostrar crecimiento de Mycoplasma en al menos dos de las cinco placas directas de cada tipo de medios y para cada condición de incubación, y en semicaldo. Preferiblemente, las placas y botellas control negativo deben mostrar ausencia de crecimiento de Mycoplasma. Para el ensayo de cultivo en células Vero, preferiblemente los controles positivos deben mostrar la presencia de Mycoplasma, preferiblemente los controles negativos no deben mostrar presencia de Mycoplasma, y preferiblemente todos los controles deben mostrar la ausencia de contaminantes bacterianos o fúngicos. Preferiblemente, el artículo de prueba será negativo para la presencia de Mycoplasma.

Ensayo para ADN contaminante de la célula huésped

Este método permite la evaluación de ADN contaminante de la célula huésped en un producto final. Se extraen y examinan las muestras de prueba para el ADN contaminante. El método de prueba es tal como sigue. Se extraen las muestras y se transfieren a nitrocelulosa. Se realiza la adición conocida de ADN humano a las muestras de referencia diluidas, y se transfieren a nitrocelulosa. Se preparan controles positivos mediante la adición conocida de ADN humano en alícuotas de BSA y se transfieren a nitrocelulosa. Se examina la nitrocelulosa, con todas las muestras y controles, con una sonda de ADN humano marcado con ^{32}P. Se aclara el filtro y se mide la radioactividad híbrida usando un sistema de obtención de imágenes radioanalítico AMBIS. Se determina el rendimiento aceptable del ensayo mediante controles que funcionan tal como se esperaba, y preferiblemente un artículo de prueba debe tener menos de o igual a 10 ng de ADN contaminante de la célula huésped por 1 x 10^{12} partículas virales. Es más preferible que el nivel de ADN humano contaminante sea inferior a 7 ng/1 x 10^{12} partículas virales, incluso más preferible que el nivel de ADN humano contaminante sea inferior a 5 ng/ 1 x 10^{12} partículas virales, incluso más preferible que el nivel de ADN humano contaminante sea inferior a 3 ng/1 x 10^{12} partículas virales y lo más preferible es que el nivel de ADN humano contaminante sea inferior a 5 pg/1 x 10^{12} partículas virales. Usando las técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de ADN contaminante de tan solo 200 pg/mL en la etapa de producto final y de 80 pg/mL en un lote en desarrollo.

Ensayo cuantitativo de adenovirus de replicación competente (RCA)

Se detecta el RCA presente en una población de adenovirus de recombinación deficiente tal como Ad5CMV-p53 mediante infección de células de carcinoma humano A549 no competentes. Se hacen crecer las células A549 en placas de cultivo celular para dar una monocapa de células y entonces se infectan con la muestra de adenovirus que va someterse a prueba. Tras 4 horas de tiempo de infección, se descarta el sobrenadante y se cubre la monocapa de A549 con una mezcla que contiene tanto medios de cultivo como agarosa. Tras la solidificación, la agarosa limita cualquier célula infectada a la formación de una única placa. Tras 14 días a 37ºC, se tiñe la agarosa con rojo neutro y se cuentan las placas visualizadas. Se preparan los controles positivos concomitantemente y contienen o bien solo adenovirus de tipo natural o bien el artículo de prueba con adiciones conocidas del adenovirus de tipo natural de modo que pueda detectarse cualquier efecto inhibidor que proceda de la muestra. Con el fin de caracterizar cualquier RCA observado, se subcultivaron todas las placas y se caracterizaron por PCR. El análisis por PCR se realiza usando sondas dirigidas contra la región E1 con el fin de demostrar la presencia de la región E1 en el vector, y contra la región E3 para excluir la presencia de virus de tipo natural. Se ha demostrado que la presencia de E1 excluye la presencia del gen p53 y que el RCA consiste en sólo construcciones homólogas dobles.

La metodología de prueba es tal como sigue. Se hace crecer una línea de carcinoma de pulmón humano, A549, hasta subconfluencia en placas de cultivo celular y después se infectan con la muestra de Ad5CMV-p53 que va someterse a prueba a una MOI de menos de 200 partículas virales por célula. Entonces, las células se exponen al virus durante un tiempo de infección de 4 horas, se descarta el sobrenadante y se cubre la monocapa de células con una superposición de medios/agarosa. De manera concomitante, se prepara un control positivo que contiene adenovirus de tipo natural y uno que contiene la muestra de prueba con adición conocida de adenovirus de tipo natural, para garantizar la sensibilidad del ensayo. Tras una incubación de 14 días a 37ºC, se tiñe la superposición con rojo neutro para permitir la visualización de alguna placa. Se cuentan las placas, se seleccionan y transfieren a 0,8 mL de medios de cultivo y se someten a tres ciclos de congelación-descongelación para liberar el virus. Entonces, se usa el sobrenadante de la placa para infectar placas de múltiples pocillos adicionales de células A549. Se observan las células para determinar el CPE y se recoge el sobrenadante de esas placas. El sobrenadante recogido se somete a amplificación mediante PCR usando sondas dirigidas contra la región E1 del genoma de adenovirus de tipo natural y contra la región E3 del virus adenovirus de tipo natural. Si está presente la región E3, se clasifica el RCA como de tipo natural. Si sólo está presente la región E1, se clasifica el RCA como un producto de recombinación homóloga doble. Para que el ensayo se considere válido, todos los controles deben funcionar tal como se espera. Es preferible que el artículo de prueba contenga menos de 40 unidades formadoras de placas en 1 x 10^{11} partículas virales. Es más preferible que el artículo de prueba contenga menos de 4 unidades formadoras de placas en 1 x 10^{11} partículas virales, y lo más preferible es que el artículo de prueba contenga menos de 0,4 unidades formadoras de placas en 1 x 10^{11} partículas virales. Usando las técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de RCA \leq 1 en 2,5 x 10^{11} partículas de virus en la etapa de producto final.

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Determinación de los niveles de BSA

Se usa este ensayo para determinar niveles de albúmina sérica bovina (BSA) contaminante en preparaciones adenovirales. En ciertas series de producción de adenovirus recombinante, se produce el vector en un sistema de cultivo celular que contiene suero bovino. Este ensayo es un análisis de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) que detecta la presencia y la cantidad de bajos niveles de BSA que permanecen en el producto final.

El método de prueba es tal como sigue. Se prepara una curva patrón que oscila desde 1,9 ng hasta 1125 ng/mL de BSA purificado. Se prepara un control positivo mediante la adición conocida de gelatina al 0,2% con 3,9, 15 y 62,5 ng /mL de BSA. Una muestra control negativo es gelatina al 0,2% en solución salina tamponada con Tris. Se somete a prueba la muestra de prueba pura y en diluciones de 1:10 a 1:320. Se transfieren todas las muestras y los controles a una placa de ensayo de ELISA, y se detecta el contenido de BSA con un anticuerpo sonda específico para BSA. Se leen las placas a 492 nm. Para que el ensayo se considere válido, preferiblemente la DO_{492} del blanco deber ser inferior a 0,350. Preferiblemente, el artículo de prueba debe contener menos de 100 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales. Es más preferible que el artículo de prueba contenga menos de 85 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales, incluso es más preferible que el artículo de prueba contenga menos de 75 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales, incluso es más preferible que el artículo de prueba contenga menos de 65 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales y lo más preferible es que el artículo contenga menos de 1 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales. Usando las técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de BSA < 1,9 ng/1 x 10^{12} partículas de virus en la etapa de producto final.

Ensayo de mutación de p53

Este ensayo es para demostrar la capacidad de p53 expresado a partir del producto final de AdCMV-p53 para activar la transcripción. La función bioquímica crítica de p53, que sustenta su actividad supresora de tumores, es la capacidad para activar la transcripción. Las proteínas mutantes no activan la transcripción en células de mamífero. La actividad transcripcional de p53 humano se conserva en levaduras, y los mutantes que son inactivos en células humanas también son inactivos en levaduras. La detección de mutaciones en p53 es posible en levaduras al someter a prueba la competencia transcripcional de p53 humano expresado en Saccharomyces cerevisiae deficiente en la síntesis de adenina debido a la mutación en ADE2 pero que contiene una segunda copia de ADE2 en un marco de lectura abierto controlado por un promotor que responde a p53. La cepa de Saccharomyces cerevisae se cotransforma con un plásmido linealizado y el fragmento p53 aislado de Ad5CMV-p53. Los recombinantes expresarán constitutivamente p53. Cuando se hace crecer en medios pobres en adenina, la cepa de levadura aparecerá roja. Si la levadura lleva un gen p53 de tipo natural, las colonias aparecerán blancas.

El método de prueba es tal como sigue. Se extrae ADN del artículo de prueba usando un procedimiento de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se aísla el inserto de ADN de p53 del genoma viral tras la digestión de restricción. Se linealiza un vector de expresión que contienen el promotor ADH1. Se cotransforma la levadura (cepa yIG397) con el fragmento de ADN que lleva el gen p53 del artículo de prueba y el vector de expresión linealizado. Se forma un vector de expresión de p53 in vivo mediante recombinación homóloga. Se hacen crecer los cultivos de levadura durante de dos a tres días a 30ºC. El promotor ADH1 provoca recombinantes que expresan constitutivamente p53. La cepa yIG397 de levadura es deficiente en síntesis de adenina debido a la mutación en el gen endógeno ADE2, pero contiene una segunda copia del marco de lectura abierto de ADE2 controlado mediante el promotor ADH1 que responde a p53. Las colonias de yID397 que son mutantes de ADE2 se vuelven rojas cuando se hacen crecer en placas con baja adenina. Las colonias de yIG397 con p53 mutante también son rojas, y las colonias que contienen p53 de tipo natural son blancas. Las colonias rojas y las blancas se cuentan al final del ensayo. El ensayo se considera válido si todos los controles funcionan tal como se esperan, y preferiblemente el artículo de prueba debe contener mutaciones en p53 a una frecuencia inferior al 3% para pasar las especificaciones de liberación del producto. Es más preferible que el artículo de prueba contenga menos del 2% de mutaciones en p53, y lo más preferible es que el artículo de prueba contenga un 0% de mutaciones en p53. Usando las técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de mutaciones en p53 \leq 1% en la etapa de producto final.

Ensayo de placa para vectores adenovirales

Este ensayo se usa para determinar el título del material adenoviral en el producto final mediante la medición del desarrollo de placas en células 293 humanas, que derivan de riñón embrionario humano. Ad5CMV-p53 es de replicación deficiente en células normales debido a la deleción de la región E1. La función de E1 se proporciona en trans en células 293 que contienen la región E1 del adenovirus tipo 5. Se utilizan diluciones de cinco veces del artículo de prueba para cuantificar el título.

El método de prueba es tal como sigue. Se siembran las células 293 humanas en placas de cultivo tisular de 66 pocillos y se permite que crezcan las células hasta más del 90% de confluencia antes de la infección. Se preparan diluciones del vector para dirigirlos a 5-80 placas por pocillo. Se usa un virus de referencia como control. Se someten a prueba dos concentraciones para el control positivo usando seis repeticiones. Se someten a prueba cuatro concentraciones por cada muestra usando seis repeticiones. Se permite al vector infectar durante una hora durante la cual las placas se sacuden cada 15 minutos para garantizar una cobertura uniforme del virus. Tras el periodo de incubación, las células se superponen con una disolución de agarosa al 0,5%, y se incuban las células infectadas con virus durante seis días, tiempo en el que se tiñen con rojo neutro. Las placas se cuentan entre las cuatro y las 25 horas tras la tinción, dependiendo del tamaño de las placas. Los pocillos que contienen más de 80 placas se clasifican como TNTC (demasiado numerosas para contar), y los pocillos que no pueden contarse se marcan como NC (no contados) y el ratio se anota en el registro. Se usan los recuentos de placas y sus respectivas diluciones para calcular el título de la muestra. Para que el ensayo se considere válido, preferiblemente los pocillos control negativo no deben contener placas, preferiblemente el título del control positivo debe estar dentro de un cuarto (0,25) de logaritmo del título oficial del virus que va usarse como control positivo, preferiblemente el % de CV para el control positivo debe ser menor que o igual al 25%, y para cualquier dilución en el control positivo, preferiblemente no debe haber más de tres pocillos designados "NC".

En la etapa de prueba del producto final, preferiblemente el artículo de prueba debe tener un título de 1 x 10^{7} a 1 x 19^{12} ufp /mL. Es más preferible que tenga un título de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{12} ufp (ufc)/mL, incluso más preferible que tenga un título de 1 x 10^{10} a 1 x 10^{12} ufp/mL, incluso más preferible que tenga un título de 5 x 10^{10} a 1 x 10^{12} ufp/mL, y lo más preferible es que tenga un título de 8 x 10^{10} a 1 x 10^{12} ufp/mL. Usando las técnicas de purificación según la presente
descripción, se han obtenido valores de título de hasta 5 x 10^{12} partículas de virus/mL en la etapa de producto final.

Determinación de concentración de partículas virales y ratio de partículas/UFP

Este ensayo mide la concentración, en partículas virales/mL, para una muestra de material adenoviral. Este ensayo es un ensayo espectrofotométrico que determina el número de partículas totales en una muestra basada en la absorbancia a 260 nm. El coeficiente de extinción usado para convertir partículas virales es 1 DO_{260} = 10^{12} partículas virales.

El método de prueba es tal como sigue. Se preparan tres repeticiones para cada muestra usando una dilución apropiada que caiga dentro del intervalo lineal del espectrofotómetro. Se combina la muestra de virus con SDS al 1% (o SDS al 10% para muestras de prueba diluidas) y agua hasta lograr un volumen total de 150 microlitros. La muestra se incuba a temperatura ambiente durante 15-30 minutos para alterar el virión. Cada muestra se lee a A_{260} y A_{280} y la densidad óptica media para las muestras repetidas se multiplica por el factor de dilución para determinar las partículas virales/mL. El ratio de partículas/UFP se determina usando el título determinado mediante el ensayo de placas descrito anteriormente. Para que el ensayo se considere válido, preferiblemente el % de CV para las tres repeticiones de muestra deben ser menor que o igual al 10%. Preferiblemente, la muestra de prueba debe contener de 1 x 10^{7} a 2 x 10^{13} partículas virales/mL en la etapa de producto final. Es más preferible que la muestra de prueba contenga entre aproximadamente 0,8 x 10^{12} y 2 x 10^{13} partículas virales/mL, y lo más preferible es que la muestra contenga entre aproximadamente 1,2 x 10^{12} y 2 x 10^{13} partículas/mL. Lo más preferible es que la A_{260}/A_{280} sea de 1,2 a 1,4. Es preferible que el ratio de partículas/UFP sea inferior a 100, incluso más preferible que sea inferior a 75, lo más preferible es que sea de 10 a 60. Usando técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de concentración de partículas virales de hasta 5 x 10^{12} partículas de virus/mL en la etapa de producto final.

Ensayo de bioactividad de p53 adenoviral

El ensayo SAOS LM es un ensayo de bioactividad que se realiza con el fin de determinar la actividad del componente p53 de Ad5CMV-p53. El ensayo mide la inhibición del crecimiento de células SAOS-LM (línea celular de osteocarcinoma humano con una deleción de p53 homocigota). Cualquier pérdida significativa de la actividad inhibidora en comparación con un patrón indicaría la presencia de una cantidad inaceptable de vector inactivo. La inhibición del crecimiento de las células SAOS se sigue usando el colorante indicador azul de Alamar, que se usa para medir cuantitativamente la proliferación celular. Este colorante contiene un indicador de oxidación/reducción (REDOX) colorimétrico. Dado que la actividad celular da como resultado la reducción química del entorno celular, la inhibición del crecimiento da como resultado un entorno oxidado que permite la medida de la actividad de p53.

El método de prueba es tal como sigue. Se siembran en placas de 96 pocillos las células SAOS y se hacen crecer durante la noche a 37ºC hasta más del 75% de confluencia. Se eliminan los medios de los pocillos y se exponen las células o bien a control de medios, virus control positivo (MOI = 100) o bien a diluciones variables de la muestra de prueba. Tras la exposición, las células se incuban a 37ºC durante cuatro días. Se añade azul de Alamar a los pocillos y se incuban las placas aproximadamente ocho horas a 37ºC. Se determina la densidad celular mediante la lectura de las placas a 570 nm. Para aceptar el ensayo, la DO_{570} del control positivo debe ser inferior a 0,1 y la densidad celular del control de los medios debe ser de al menos el 75% de confluencia. Es preferible que la MOI del artículo de prueba que provoca el 50% de la muerte celular sea de menos de 1000 partículas virales. Es más preferible que el artículo de prueba tenga una MOI que provoque el 50% de muerte celular de menos de 700 partículas virales, y lo más preferible es que la MOI que provoca el 50% de muerte celular sea de menos de 400 partículas virales. Usando las técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de bioactividad de hasta 250-260 en la etapa de producto final.

Ensayo por HPLC para p53

Este ensayo es una evaluación cuantitativa del número de partículas de Ad5CMV-p53 y la pureza de muestras en proceso y de la estabilidad de las muestras del producto final. El método permite la cuantificación de partículas de Ad5CMV-p53 mediante un método por HPLC de intercambio iónico.

El método de prueba es tal como sigue. Se usa una columna Toso Haas TSK-Gel-Q-5PW con una fase móvil de gradiente salino tamponado para la separación de partículas de virus e impurezas. Se prepara una curva de calibración control de referencia en una columna recientemente instalada y se explora a A_{260}. Se prepara un blanco y se prueba usando la misma columna y método. La muestra que va someterse a prueba se prepara mediante dilución con el mismo tampón de baja salinidad usado en la formación del gradiente. La absorbancia de la muestra se detecta a las longitudes de onda de 260 y 280 nm, y se determina el total para todos los picos detectados. Se determina el ratio del área para el pico de A_{260}/A_{280}, y se determina la concentración para el pico de 260 nm mediante la comparación con la curva de calibración de referencia. Los criterios de aceptación del ensayo incluyen un perfil similar a muestras históricas y un ratio A_{260}/A_{280} de 1,3 +/- 0,1. Preferiblemente, la muestra de prueba debe tener una pureza de más de o igual al 98%. Es más preferible que la pureza sea de más del 99%, y lo más preferible es que la pureza sea más del 99,9%. Usando técnicas de purificación según la presente descripción, se han obtenido valores de pureza del virus de hasta el 99,8% en la etapa de producto final.

C. Ensayos de identidad Ensayo por mapeo con enzimas de restricción para Ad5CMV-p53

Este método permite la evaluación de ADN de Ad5CMV-p53 mediante análisis con enzimas de restricción. Las enzimas de restricción reconocen secuencias específicas de pares de bares en el ADN, cortando el ADN en esos sitios de restricción. Existe un número limitado de sitios de reconocimiento dentro de un vector para cualquier enzima de restricción particular. El ADN de la muestra de prueba se digiere con dos enzimas de restricción y los fragmentos se separan electroforéticamente en una matriz de gel de agarosa. Se comprueban los fragmentos para determinar su número y tamaño.

El método de prueba es tal como sigue. El ADN se extrae de partículas de vector usando una columna de centrifugación de intercambio iónico comercialmente disponible. El ADN extraído se cuantifica y se comprueba para determinar su pureza mediante el análisis del ratio A_{260}/A_{280}. Se digieren aproximadamente 0,4-5 microgramos del ADN extraído, con una mezcla de dos enzimas de restricción, Eco RI y Cla I. El ADN digerido se carga en un gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio junto a una cantidad igual de ADN no sometido a enzimas de restricción de la misma muestra. Las muestras se separan por electroforesis y se visualizan usando una fuente de luz ultravioleta. Los datos se reúnen mediante fotografía. Los criterios de aceptación del ensayo que deben cumplirse preferiblemente para que el ensayo se considere válido es un ratio A_{260}/A_{280} del ADN extraído de más de 1,6. Preferiblemente, el artículo de prueba debe tener tamaños de los fragmentos de restricción que coinciden con los tamaños de los fragmentos teóricos esperados de la secuencia de Ad5CMV-p53. Los tamaños de banda esperados son 486, 2320, 8494 y 24008 pares de bases.

Ensayo SDS-PAGE

Este método permite la evaluación de proteínas totales en el producto final, que oscilan en tamaño desde 5 hasta 100 kDa mediante la separación según el peso molecular.

El método de prueba es tal como sigue. Las proteínas totales se determinan usando un método de Pierce BCA según el protocolo descrito anteriormente en esta sección. La muestra de prueba, el patrón interno y los patrones de peso molecular se preparan en tampón de muestra y se desnaturalizan por calor. Todas las muestras y patrones se cargan en pocillos de un gel de Tris-glicina previamente colado y se coloca en un tanque de electroforesis que contiene tampón de desplazamiento. El gel se procesa en un entorno de corriente constante durante aproximadamente 90 minutos. Entonces, el gel se retira del casete, se tiñe usando tinción de azul brillante de Coomassie y elimina el tinte. Entonces, el gel se analiza usando instrumento de exploración densitométrica, y se reúnen los datos mediante fotografía. Alternativamente, se seca el gel para su archivo. En todos los controles, es preferible la presencia de proteínas esperadas y preferiblemente no debe haber proteínas contaminantes. En la muestra de prueba, preferiblemente deben observarse las bandas esperadas, sin bandas extras significativas.

Ensayo de inmunotransferencia de tipo Western

Este método somete a prueba la presencia de proteína p53 en células transducidas con Ad5CMV-p53. Este método es tal como sigue. Se siembran placas individuales de cultivo tisular de 60 mm para las muestras de producto y las muestras de control, a una densidad de 7 x 10^{5} células y se hacen crecer a más del 80% de confluencia. El artículo de prueba se diluye en medios para proporcionan 3,5 x 10^{8} partículas virales/mL. Un control de referencia se diluye hasta 3,5 x 10^{8} pv/ml y se prepara también un control negativo sin vector. Las células se exponen a los medios que contienen producto durante una hora durante la que se sacuden las placas, para garantizar la distribución homogénea del vector. Al final de la hora, se añaden a las placas medios adicionales y se incuban durante aproximadamente cinco horas para dejar tiempo para la expresión de p53. Al final del periodo de incubación, las células se tratan con tripsina y se permite la recogida, se lavan con DPBS y se solubilizan con un tampón de detergente. Se determina la cantidad total de proteína de cada muestra y control mediante un método de cuantificación colorimétrica (Pierce BCA). Para cada muestra y método, se cargan 3-5 microgramos de proteína en un gel junto con una referencia de proteína p53 comercialmente adquirida, y se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Las proteínas en el gel se transfieren a una membrana PVDF y la membrana se expone a un tampón de leche para bloquear sitios de unión no específicos y entonces de manera secuencial se exponen a los anticuerpos. El anticuerpo primario, un anticuerpo de ratón anti-p53 humano se une específicamente a p53. El anticuerpo secundario es una IgG de cabra anti-ratón con peroxidasa de rábano (HRP) unida covalentemente. Se expone un sustrato colorimétrico a la enzima HRP unida, lo que permite la visualización de la proteína p53 en la inmunotransferencia. Para que el ensayo se considere válido, preferiblemente la banda control de p53 debe ser visible, y preferiblemente el control negativo no debe mostrar expresión de p53. Preferiblemente, el artículo de prueba debe mostrar expresión de p53.

Ensayo de volumen de llenado recuperable

Este método es una determinación gravimétrica del volumen recuperable desde el cierre del recipiente para el producto final de Ad5CMV-p53. El producto se recupera a partir de siete viales usando jeringas de 3 cc taradas y agujas de 1,25 pulg de calibre 21. Se pesa el producto y los pesos se convierten en volumen usando el peso específico del producto de 1,03 g/mL. Debe cumplirse la calibración de la balanza antes de pesar las muestras y es preferible que los siete viales sometidos a prueba cumplan las especificaciones de 1,0 a 1,4 mL de volumen de llenado recuperable. Es más preferible que el volumen de llenado recuperable sea de 1,1 a 1,3 mL. El experto en la técnica entenderá que el ensayo es un ejemplo para el producto de Ad5CMV-p5, y que los expertos en la técnica podrán modificar este ensayo para otros productos en otros tipos de cierres de recipientes.

Ensayo de descripción física

Este método permite la evaluación de la descripción física del producto final. Se reúnen aproximadamente siete mililitros de producto en un tubo de plástico transparente. Un analista inspecciona el producto para documentar el color, la transparencia y la presencia de cualquier materia particulada macroscópica. Preferiblemente, el artículo de prueba debe ser de transparente a opalescente y no contener materia particulada macroscópica determinada mediante inspección visual.

Ensayo de pH

Este método es una determinación del pH del producto final de Ad5CMV-p53. Se colocan aproximadamente 0,5 mL del producto en un tubo. El pH se determina usando un pHmetro calibrado a una temperatura de 25 +/-5ºC. Preferiblemente, las disoluciones patrón de pH deben demostrar un intervalo de pendiente del 80-102%. Preferiblemente, el pH del producto final debe estar entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9. Es más preferible que el pH esté entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8,8, aún más preferible es que el pH esté entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,6, y lo más preferible es que el pH esté entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 8,5.

Mapeo con enzimas de restricción para someter a prueba la identidad del banco de virus primario o el banco de células de trabajo

El objetivo de esta prueba es evaluar la identidad del genoma de Ad5CMV-p53 mediante la medición de fragmentos de ADN generados tras la escisión de todo el genoma viral (aproximadamente 35308 pares de bases). Cuando los virus no purificados están contenidos en una mezcla de células tales como un banco de virus, primero tiene que extraerse el ADN viral del lisado celular sin procesar. Se digiere una alícuota de la muestra con proteinasa K en presencia de SDS. Entonces, se extrae el ADN usando una mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se precipita con etanol. La concentración de ADN se mide mediante espectrometría UV. Entonces, se somete aproximadamente un microgramo de ADN viral a digestión con enzimas de restricción. Se realizan cuatro digestiones individuales, utilizando una batería de tres enzimas de restricción en diferentes combinaciones. Entonces, se separan los digestos y los marcadores de tamaño de ADN en un gel de agarosa usando electroforesis y se tiñen con Syb-Green. Los geles se integran usando una cámara y una curva de calibración calculada para los patrones. Entonces, se determina el tamaño de los fragmentos mayores de 500 pb y menores de 8000 pb. Preferiblemente, el tamaño de los fragmentos obtenidos debe corresponder al tamaño teórico de los fragmentos obtenidos de la secuencia teórica esperada. Preferiblemente, los tamaños de fragmentos de la muestra de prueba deben corresponder con los esperados de la secuencia de ADN.

PCR para detectar secuencia de ADN de E1 en MCB y BCT de 293.

Se usa este ensayo para determinar la identidad de los bancos de células primarios y de trabajo de 293 mediante la demostración de la presencia de la región E1. Usando dos pares de cebadores de PCR específicos, uno dirigido contra la región E1 presente tanto en células 293 como en adenovirus de tipo natural y otro dirigido contra la región E1 presente sólo en el adenovirus de tipo natural. El método debe demostrar la identidad de las línea celular 293 contenida en el artículo de prueba.

El método de prueba es tal como sigue. Tras la descongelación, se cultivan las células del artículo de prueba usando condiciones estándar en una placa de cultivo celular hasta que se obtenga una monocapa de células. Entonces, se digieren las células con proteinasa K para eliminar las proteínas, y se aísla el ADN usando extracciones con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico seguidas de precipitación con etanol. Se cuantifica el ADN extraído y se comprueba para determinar la pureza mediante una exploración de absorbancia de DO260 - DO280. Se realiza la reacción de PCR usando los dos pares de cebadores dirigidos hacia E1 en el artículo de prueba, y tanto en los controles de ADN positivos como negativos. El control negativo es una línea de células de mamífero que no contienen la región E1. El control positivo es un adenovirus de tipo natural. Los productos de PCR para cada reacción se cargan en un gel de agarosa y se registran los fragmentos obtenidos tras la electroforesis y la tinción, usando fotografía. La línea de células de mamífero que no portan E1 no debe presentar producto de amplificación con ambos pares de cebadores de PCR, mientras que el adenovirus de tipo natural debe mostrar el correcto producto de amplificación con ambos pares de cebadores de PCR. El artículo de prueba debe demostrar el correcto producto de amplificación con el par de cebadores ubicado en la región E1, que se describe que está presente en la célula 293, y debe ser negativo con el segundo para de cebadores, que se sabe que sólo está presente en el genoma adenoviral de tipo natural.

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11. Composiciones y formulaciones farmacéuticas

Cuando se purifica según los métodos expuestos anteriormente, se considera que las partículas virales de la presente invención pueden administrarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por tanto, será deseable preparar el complejo como una composición farmacéutica apropiada para la aplicación propuesta. Generalmente, esto implicará preparar una composición farmacéutica que está esencialmente libre de pirógenos, así como cualquier otra impureza que pueda ser perjudicial para seres humanos o animales. Generalmente, también se deseará emplear sales y tampones apropiados para hacer que el complejo sea estable y para permitir la captación del complejo mediante células diana.

Las composiciones acuosas comprenden una cantidad eficaz del constructo de expresión y el ácido nucleico disuelto y dispersado en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones también pueden denominarse inóculos. Las expresiones "farmacéutica o farmacológicamente aceptables" hacen referencia a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción desfavorable cuando se administra a un animal, o a un ser humano, según corresponda. Tal como se usa en el presente documento, "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retardan la absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para principios activos farmacéuticamente se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier agente o medios convencionales sean incompatibles con el principio activo, se considera su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse en las composiciones principios activos complementarios.

Pueden prepararse disoluciones de los principios activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables, en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las partículas virales pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas para su uso en regímenes terapéuticos, incluyendo su administración a seres humanos. La administración de composiciones terapéuticas según la presente invención será mediante cualquier vía común siempre que el tejido diana esté disponible mediante esta ruta. Esto incluye la vía oral, nasal, bucal, recta, vaginal o tópica. Alternativamente, la administración será mediante inyección ortotópica, intradérmica subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Tales composiciones normalmente se administrarían como composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen vehículos fisiológicamente aceptables, tampones u otros excipientes. Para su aplicación frente a tumores, se contempla la inyección intratumoral directa, inyectar en un lecho tumoral resecado (es decir, linfático) o la administración general. También se desearía realizar una perfusión continua durante horas o días mediante un catéter a un sitio enfermo, por ejemplo, un tumor o sitio de tumor.

Las composiciones terapéuticas se administran ventajosamente en forma de composiciones inyectables o bien como disoluciones líquidas o bien como suspensiones; también deben prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. Estas preparaciones también deben emulsionarse. Una composición típica para tal fin comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición puede contener aproximadamente 100 mg de albúmina sérica humana por mililitro de solución salina tamponada con fosfato. También pueden usarse otros vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyen disoluciones acuosas, excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos parenterales tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc. Los vehículos intravenosos incluyen agentes de reabastecimiento de fluidos y nutrientes. Los conservantes incluyen agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la composición farmacéutica se ajustan según parámetros bien conocidos.

Formulaciones adicionales que son adecuadas para su administración oral. Las formulaciones orales incluyen excipientes típicos tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones adquieren la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. Cuando la vía es tópica, la forma puede ser una crema, ungüento, pomada o aerosol.

Una cantidad eficaz del agente terapéutico se determina basándose en el objetivo propuesto, por ejemplo (i) inhibición de la proliferación celular del tumor, (ii) eliminación o inactivación de células tumorales, (iii) vacunación, o (iv) transferencia génica para la expresión a largo plazo de un gen terapéutico. El término "dosis unitaria" hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas para su uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición terapéutica calculada para producir las respuestas deseadas, tratada anteriormente, en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen de tratamiento apropiados. La cantidad que va administrarse, según tanto el número de tratamientos como la dosis unitaria, depende del sujeto que va tratarse, del estado del sujeto y del resultado deseado. Se esperan regímenes terapéuticos de múltiples genes, especialmente para adenovirus.

En el contexto de la presente invención, puede usarse un vector adenoviral que codifica para un gen supresor de tumores para tratar pacientes con cáncer. Las cantidades típicas de un vector de adenovirus usadas en terapia génica de cáncer son 10^{3} - 10^{15} partículas virales/dosis. (10^{3}, 10^{4}, 10^{5}, 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9}, 10^{10}, 10^{11}, 10^{12}, 10^{13}, 10^{14}, 10^{15}) en las que la dosis puede dividirse en varias inyecciones en diferentes sitios dentro de un tumor sólido. El régimen de tratamiento también puede implicar varios ciclos de administración del vector de transferencia génica durante un periodo de 3-10 semanas. Puede ser necesaria la administración del vector durante periodos de tiempo más prolongados desde meses hasta años, para su beneficio terapéutico continuo.

En el contexto de la presente invención, puede usarse un vector adenoviral que codifica para un gen terapéutico, para vacunar seres humanos u otros animales. Normalmente, una cantidad de virus eficaz para producir el efecto deseado, en el caso de vacunación, se administraría a un ser humano o mamífero de modo que se logre la expresión a largo plazo del transgén y se desarrolle una fuerte respuesta inmunitaria del huésped. Se considera que una serie de inyecciones, por ejemplo, una inyección primaria seguida de dos inyecciones de administración de refuerzo, serían suficientes para inducir una respuesta inmunitaria a largo plazo. Una dosis típica sería desde 10^{6} hasta 10^{15} UFP/inyección dependiendo del resultado deseado. Generalmente, bajas dosis de antígeno inducen una respuesta fuerte mediada por células, mientras que, generalmente, altas dosis de antígeno inducen una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos. Las cantidades precisas de la composición terapéutica también dependen del criterio del médico y son peculiares para cada individuo.

12. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos a continuación representan las técnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y, por tanto, pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la presente descripción, deben apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se dan a conocer y obtener todavía un resultado parecido o similar sin apartarse del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Materiales y métodos A) Células

Para los estudios, se usaron células 293 (células epiteliales de riñón embrionario humano) del banco de células primario.

B) Medios@

Para la fase de crecimiento celular, se usó medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, glucosa, 4,5 g/L) + suero bovino fetal (FBS) al 10%. Para la fase de producción de virus, se disminuyó la concentración de FBS en DMEM hasta el 2%.

C) Virus

AdCMvp53 es un adenovirus humano de tipo 5 de replicación incompetente, modificado por ingeniería genética, que expresa la proteína humana p53 de tipo natural bajo el control del promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV).

D) Biorreactor Celligen

Se usó un biorreactor Celligen (New Brunswick Scientific, Co. Inc.) con 5 L de volumen total (3,5 L de volumen de trabajo) para producir un sobrenadante con virus usando un cultivo de microportadores. Se usó microportador recubierto de vidrio 13 g/L (SoloHill) para el cultivo de células en el birreactor.

E) Producción de sobrenadante con virus en el biorreactor Celligen

Se descongelaron células 293 del banco de células primario (MCB) y se expandieron en factorías celulares (Nunc). Generalmente, las células se dividieron a una confluencia de aproximadamente el 85-90%. Las células se inocularon en el biorreactor a una concentración de inoculación de 1 x 10^{5} células/ml. Se permitió que las células se adhirieran a los microportadores mediante agitación intermitente. Se inició agitación continua a una velocidad de 30 rpm, 6-8 horas tras la inoculación de las células. Las células se cultivaron durante 7 días con los parámetros del procedimiento establecidos a pH = 7,20, oxígeno disuelto (DO)= 60% de saturación de aire, temperatura = 37ºC. En el día 8, las células se infectaron con AdCMVp53 en una MOI de 5. Cincuenta horas tras la infección por virus, se aumentó la velocidad de agitación desde 30 rpm hasta 150 rpm para facilitar la lisis celular y la liberación del virus en el sobrenadante. Se recogió el sobrenadante con virus 74 horas tras la infección. Entonces, se filtró el sobrenadante con virus para concentración/diafiltración adicional.

F) Sistema de biorreactor Cellcube^{TM}

También se usó un sistema de biorreactor Cellcube^{TM} (Corning-Costar) para la producción de virus AdCMVp53. Está compuesto de un módulo de cultivo celular desechable, un elemento oxigenador, una bomba de recirculación de medio y una bomba de medio para perfusión. El módulo de cultivo celular usado tiene un área superficial de cultivo de 21.550 cm^{2} (1-mero).

G) Producción de virus en el Cellcube^{TM}

Se descongelaron y expandieron las células 293 del banco de células primario (MCB) en factorías celulares (Nunc). Generalmente, las células se dividieron a una confluencia de aproximadamente el 85-90%. Las células se inocularon en el Cellcube^{TM} según la recomendación del fabricante. Las densidades celulares de inoculación estuvieron en el intervalo de 1-1,5 x 10^{4}/cm^{2}. Se permitió que las células crecieran durante 7 días a 37ºC en condiciones de cultivo de pH = 7,20, DO = 60% de saturación de aire. Se reguló la tasa de perfusión del medio según la concentración de glucosa en el Cellcube^{TM}. Un día antes de la infección viral, se cambió el medio para perfusión de DMEM + FBS al 10% a DMEM + FBS al 2%. En el día 8, se infectaron las células con el virus AdCMVp53 a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Se detuvo la perfusión del medio durante 1 h, inmediatamente después de la infección, entonces se reanudó durante el periodo restante de la fase de producción de virus. Se recogió el cultivo 45-48 horas tras la infección.

H) Disolución de lisis

Se usó Tween-20 (Fischer Chemicals) a una concentración del 1% (v/v) en tampón Tris 20 mM + NaCl 0,25 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50, para lisar las células al final de la fase de producción de virus en el Cellcube^{TM}.

I) Clarificación y filtración

Primero, se clarificaron el sobrenadante con virus del biorreactor Celligen y la disolución de virus del Cellcube^{TM} usando un filtro de profundidad (Preflow, GelmanScience), entonces se filtró a través de un filtro de 0,8/0,22 \mum (SuporCap 100, GelmanScience).

J) Concentración/diafiltración

Se usó filtración de flujo tangencial (TFF) para concentrar e intercambiar con tampón del sobrenadante con virus del biorreactor Celligen y la disolución de virus del Cellcube^{TM}. Se usó un minicasete de Pellicon II (Millipore) de punto de corte de peso molecular nominal (NMWC) de 300 K para la concentración y diafiltración. Primero, se concentró la disolución de virus 10 veces. A esto le siguieron 4 volúmenes de muestra de intercambio con frente al tampón Tris 20 mM + NaCl 1,0 mM + MgCl_{2} 1 nM, pH = 9,00 usando el método de diafiltración a volumen constante.

Se llevó a cabo la concentración/diafiltración similar para el virus purificado en columna. Se usó un minicasete de Pellicon II de NMWC de 100 K en vez del casete de NMWC de 300 K. La diafiltración se realizó frente a Tris 20 mM + NaCl 0,25 M + MgCl_{2} 1 mM, tampón a pH = 9,00 o solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS).

K) Tratamiento con Benzonase

Se trató la disolución de virus concentrada/diafiltrada con Benzonase^{TM} (American International Chemicals) a una concentración de 100 u/ml, temperatura ambiente durante la noche para reducir la concentración de ácido nucleico contaminante en la disolución de virus.

L) Ultracentrifugación en gradiente de CsCl

Se purificó la disolución de virus sin procesar usando ultracentrifugación en gradiente doble de CsCl que usa un rotor SW40 en una ultracentrífuga Beckman (XL-90). En primer lugar, se recubrió con 7 ml de disolución de virus sin procesar en la parte superior de un gradiente de CsCl gradual preparado con igual volumen de 2,5 ml de disolución de CsCl 1,25 g/ml y 1,40 g/ml, respectivamente. Se centrifugó el gradiente de CsCl a 35.000 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente. Se recuperó la banda de virus en la interfase del gradiente. Entonces, el virus recuperado se purificó adicionalmente mediante gradiente isopícnico de CsCl. Esto se realizó mezclando la disolución de virus con al menos un volumen de 1,5 veces de disolución de CsCl 1,33 g/ml. Se centrifugó la disolución de CsCl a 35.000 rpm durante al menos 18 horas a temperatura ambiente. Se recuperó la banda inferior como el virus intacto. Inmediatamente, se dializó el virus frente a un tampón Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH=7,50 para eliminar el CsCl. Se almacenó el virus dializado a -70ºC para su uso futuro.

M) Purificación por cromatografía de intercambio iónico (IEC)

Se purificó la disolución de virus tratada con Benzonase usando IEC. Para la purificación, se usó resina aniónica fuerte Toyopearl SuperQ 650M (Tosohaas). Se usó un sistema FPLC (Pharmacia) con una columna XK16 (Pharmacia) para el desarrollo del método inicial. Se llevaron a cabo estudios adicionales de ampliación a escala usando un sistema BioPilot (Pharmacia) con una columna XK50 (Pharmacia). En resumen, se rellenó la resina dentro de las columnas y se limpiaron con NaOH 1 N, entonces se cargaron con tampón B que fue seguido por el acondicionamiento con tampón A. Los tampones A y B estaban compuestos de Tris 20 mM + NaCl 0,25 M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,00 y Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,00, respectivamente. Se cargó la muestra de disolución viral en la columna acondicionada, seguido por el lavado de la columna con tampón A hasta que la absorción UV alcanzó la referencia. Se eluyó el virus purificado de la columna mediante el uso de un volumen de 10 columnas de gradiente lineal de NaCl.

N) Análisis por HPLC

Se desarrolló un procedimiento de análisis por HPLC para la evaluación de la eficacia de la producción y purificación de virus. Se obtuvo tris(hidroximetil)aminometano (tris) de FischerBiotech (N.º de cat. BP154-1; Fair Lawn, Nueva Jersey, EE.UU.); se obtuvo cloruro de sodio (NaCl) de Sigma (N.º de cat. S-7653, San Luis, MO, EE.UU.). Ambos se usaron directamente sin purificación adicional. Se realizaron análisis por HPLC en un sistema de gradiente analítico de Beckman, con el software Gold Workstation (bomba binaria 126 y detector por red de diodos 168) equipado con una columna de intercambio aniónico TosoHaas (DI de 7,5 cm x 7,5 mm, tamaño de partícula de 10 \mum, N.º de cat. 18257). Se usó una columna de intercambio aniónico de 1 mL Resource Q (Pharmacia) para evaluar el método desarrollado por Huyghe et al. usando su sistema de tampón HEPES. Sólo se probó este método para el sistema de biorreactor.

Los tampones usados en el presente sistema de HPLC fueron tampón A: tampón Tris 10 mM, pH 9,0. Tampón B: NaCl 1,5 M en tampón A, pH 9,0. Los tampones se filtraron a través de un filtro de cuello de botella de 0,22 \mum de Corning (N.º de cat. 25970-33). Se filtraron todas las muestras a través de un Acrodisc PF de 0,8/0,22 \mum de Gelman Sciences (N.º de cat. 4187) antes de la inyección.

Se inyectó la muestra en la columna de HPLC en un volumen de 60-100 \mul. Tras la inyección, se lavó la columna (TosoHaas) con B al 20% durante 3 min. a una velocidad de flujo de 0,75 ml/min. Entonces se inicia un gradiente, en el que B se aumenta desde el 20% hasta el 50% durante 6 min. Entonces se cambia el gradiente desde el 50% hasta el 100% de B durante 3 min., seguido por el 100% de B durante 6 min. Entonces, se cambia de nuevo la concentración salina de manera gradual hasta el 20% nuevamente durante 4 min., y se mantiene al 20% de B durante otros 6 min. El tiempo de retención de Adp53 es de 9,5 \pm 0,3 min. con A_{260}/A_{280} \cong 1,26 \pm 0,03. La limpieza de la columna tras cada serie cromatográfica se consigue mediante la inyección de 100 \mul de NaOH 0,15 M y entonces se hace pasar el gradiente.

Ejemplo 2 Efecto de la tasa de perfusión del medio en Cellcube^{TM} en la producción y la purificación del virus

Para un sistema de cultivo celular de perfusión, tal como Cellcube^{TM}, la tasa de perfusión del medio desempeña un papel importante en la producción y la calidad del producto. Se examinaron dos estrategias diferentes de perfusión del medio. Una estrategia fue mantener la concentración de glucosa en el Cellcube^{TM} \geq 2 g/L (alta tasa de perfusión). La otra fue mantener la concentración de glucosa \geq 1 g/L (baja tasa de perfusión del medio).

No se observaron cambios significativos en los parámetros de cultivo, tales como pH, DO, entre las dos tasas de perfusión diferentes. Aproximadamente, se produjo una cantidad equivalente de virus sin procesar (antes de la purificación) tras la recogida usando disolución de lisis con Tween-20 al 1% tal como se muestra en la tabla 7. Sin embargo, se observó una diferencia espectacular en los perfiles de HPLC de las disoluciones virales de series de producción de tasa de perfusión del medio alta y baja.

TABLA 7 Efecto de la concentración de glucosa del medio en la producción del virus

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Tal como se muestra en la figura 1, se produjo un pico de virus muy bien separado (tiempo de retención 9,39 min.) a partir de la disolución viral usando una baja tasa de perfusión del medio. Se encontró que se consiguió virus con pureza y actividad biológica adecuada tras una sola etapa de purificación cromatográfica de intercambio iónico de la disolución de virus producida en baja tasa de perfusión del medio. Por otro lado, no se observó pico separado del virus en el tiempo de retención de 9,39 min. de la disolución viral producida usando una alta tasa de perfusión del medio. Esto sugiere que los contaminantes que tienen el mismo perfil de elución que el virus se produjeron en alta tasa de perfusión del medio. Aunque, aún no está clara la naturaleza de los contaminantes, se espera que los contaminantes estén relacionados con el aumento de la producción de proteínas de la matriz extracelular en alta tasa de perfusión del medio (alta alimentación con suero) de las células productoras. Esta mala característica de separación observada en la HPLC creó dificultades para el procedimiento de purificación por IEC tal como se muestra en los siguientes ejemplos. Como resultado, la tasa de perfusión del medio usada durante el crecimiento celular y las fases de producción de virus en el Cellcube^{TM} tienen un efecto significativo en la posterior purificación por IEC del virus. Se recomienda baja tasa de perfusión del medio. Esto no sólo produce la fácil purificación del producto sin procesar sino que también ofrece una producción más rentable debido al consumo reducido del medio.

Ejemplo 3 Métodos de recogida de células y lisis

Basándose en la experiencia anterior, los inventores evaluaron en primer lugar el método de congelación-descongelación. Se recogieron las células del Cellcube^{TM} 45-48 horas tras la infección. En primer lugar, se aisló el Cellcube^{TM} del sistema de cultivo y se extrajo el medio gastado. Entonces, se bombeó disolución de EDTA 50 mM en el Cube para desprender las células de la superficie del cultivo. La suspensión celular así obtenida se centrifugó a 1.500 rpm (Beckman GS-6KR) durante 10 min. Se resuspendió el sedimento celular resultante en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DBPS). Se sometió la suspensión celular a 5 ciclos de congelación/descongelación entre baño de agua a 37ºC y baño de etanol-nieve carbónica para liberar virus de las células. El lisado celular sin procesar (CCL) así generado se analizó en HPLC.

La figura 2 muestra el perfil de HPLC. No se observó pico del virus en el tiempo de retención de 9,32 min. En cambio, se produjeron dos picos en los tiempos de retención de 9,11 y 9,78 min. Este perfil sugiere que los otros contaminantes que tienen un tiempo de elución similar al del virus salen en el CCL e interfieren con la purificación del virus. Como resultado, se observó muy baja eficacia de purificación cuando se purificó el CCL por IEC usando FPLC.

Además de la baja eficacia de purificación, hubo una pérdida de producto significativa durante la etapa de recogida de células en la disolución de EDTA tal como se indica en la tabla 8. Aproximadamente se perdió el 20% del producto en la disolución de EDTA que se descartó. Además, aproximadamente el 24% del producto de virus sin procesar está presente en el medio gastado que también se descartó. Por tanto, sólo el 56% del producto de virus sin procesar está en el CCL. Además, la congelación-descongelación es un procedimiento de gran variación y ampliación a escala muy limitada. Es necesario desarrollar un procedimiento de lisis celular más eficaz con menor pérdida de producto.

TABLA 8 Pérdida de virus durante la recogida con EDTA de células de Cellcube^{TM}

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Los datos se generaron a partir de Cellcube^{TM} de 1-mero.

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Se han usado detergentes para lisar células para liberar los orgánulos intracelulares. En consecuencia, los inventores evaluaron el método de lisis con detergentes para la liberación de adenovirus. La tabla 9 enumera los 5 detergentes no iónicos diferentes que se evaluaron para la lisis celular. Se recogieron las células de Cellcube^{TM} 48 horas tras la infección usando EDTA 50 mM. Se resuspendió el sedimento celular en los diferentes detergentes a diversas concentraciones enumeradas en la tabla 9.

Se llevó a cabo la lisis celular o bien a temperatura ambiente o bien en hielo durante 30 minutos. Se obtuvo una disolución de lisis transparente tras la centrifugación para eliminar el precipitado y los residuos celulares. Se trataron las disoluciones de lisis con Benzonase y entonces se analizaron por HPLC. La figura 3 muestra los perfiles de HPLC de las disoluciones de lisis de los diferentes detergentes. Thesit y NP-40 se comportaron de manera similar a Triton X-100. La disolución de lisis generada a partir de Tween-20 al 1% dio la mejor resolución del virus, observándose la menor resolución del virus con Brij-58. Se encontró lisis celular más eficaz a una concentración de detergente del 1% (p/v). La temperatura de lisis no contribuyó significativamente a la resolución del virus en las concentraciones de detergente examinadas. Para el fin de simplicidad del procedimiento, se recomienda lisis a temperatura ambiente. Se empleó disolución de lisis compuesta de Tween-20 al 1% en Tris 20 mM + NaCl 0,25 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 para la lisis celular y recogida del virus en el Cellcube^{TM}.

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Ejemplo 4 Efectos de la concentración/diafiltración en la recuperación de virus

Se clarificó y filtró la disolución de virus de la etapa de lisis antes de la concentración/diafiltración. Se evaluaron membranas de TFF de diferentes NMWC, incluyendo 100 K, 300 K, 500 K y 1000 K, para su determinar su eficaz concentración/diafiltración. Se obtuvo el flujo del medio más alto con pérdida mínima de virus para el filtrado con una membrana de NMWC de 300 K. Las membranas de mayor NMWC ofrecieron flujo del medio más alto, pero dieron como resultado una mayor pérdida de virus para el filtrado, mientras que las membranas de menor NMWC lograron un flujo insuficiente del medio. En primer lugar, se concentró la disolución de virus 10 veces, lo que fue seguido por 4 volúmenes de muestra de diafiltración frente a tampón Tris 20 mM + NaCl 0,25 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,00 usando el método de volumen constante. Durante el procedimiento de concentración/diafiltración la disminución de la presión a través de la membrana se mantuvo \leq 5 psi. Se demostró la recuperación consecuente, de alto nivel de virus durante la etapa de concentración/diafiltración tal como se indica en la tabla 10.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 5 Efecto de la adición de sales en el tratamiento con Benzonase

Se trató la disolución de virus tras la concentración/diafiltración con Benzonase (nucleasa) para reducir la concentración de ácido nucleico contaminante en la disolución de virus. Se evaluaron diferentes concentraciones de trabajo de Benzonase, que incluyen 50, 100, 200, 300 unidades/ml, para determinar la reducción de las concentraciones de ácido nucleico. Para el fin de simplicidad del procedimiento, el tratamiento se llevó a cabo a temperatura ambiente durante la noche. Se observó reducción significativa de ácido nucleico contaminante que se hibrida a una sonda de ADN genómico humano tras el tratamiento con Benzonase.

La tabla 11 muestra la reducción de la concentración de ácido nucleico antes y tras el tratamiento con Benzonase. Se analizó la disolución de virus en HPLC antes y tras el tratamiento con Benzonase. Tal como se muestra en la figura 4A y en la figura 4B, se observó una reducción espectacular en el pico de ácido nucleico contaminante tras el tratamiento con Benzonase. Esto está de acuerdo con el resultado del ensayo de hibridación de ácidos nucleicos. Debido a la eficacia, se empleó una concentración de Benzonase de 100 u/ml para el tratamiento de la disolución de virus sin procesar.

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TABLA 11 Reducción de la concentración de ácido nucleico contaminante en la disolución de virus

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Condición de tratamiento: concentración de Benzonase: 100 u/ml, temperatura: temperatura ambiente, tiempo: durante la noche.

Se observó un cambio considerable en el perfil de HPLC antes y tras el tratamiento con Benzonase. No se detectó pico separado del virus en el tiempo de retención de 9,33 min. tras el tratamiento con Benzonase. Al mismo tiempo, se desarrolló un pico principal con alta adsorción a 260 nm en el tiempo de retención de 9,54 min. Los resultados del ensayo de titulación indicaron que el tratamiento con Benzonase no afectó negativamente al titulo del virus y el virus permaneció intacto e infeccioso tras el tratamiento con Benzonase. Se dedujo que el ácido nucleico celular liberado durante la etapa de lisis celular interaccionaba con el virus y o bien formaba agregados con el virus o bien se adsorbía en la superficie del virus durante el tratamiento con Benzonase.

Para minimizar la posible interacción del virus con el ácido nucleico durante el tratamiento con Benzonase, se añadieron diferentes concentraciones de NaCl a la disolución de virus antes del tratamiento con Benzonase. No se produjo un cambio espectacular en el perfil de HPLC tras el tratamiento con Benzonase en presencia de NaCl 0,1 M en la disolución de virus. La figura 5 muestra el perfil de HPLC de la disolución de virus tras el tratamiento con Benzonase en presencia de NaCl 1 M. A diferencia de lo que se muestra en la figura 4B, el pico del virus en el tiempo de retención de 9,35 min. aún existe tras el tratamiento con Benzonase. Este resultado indica que la presencia de NaCl previene la interacción del ácido nucleico con el virus durante el tratamiento con Benzonase y facilita la purificación adicional de virus del ácido nucleico contaminante.

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Ejemplo 6 Purificación cromatográfica de intercambio iónico

La presencia de carga negativa en la superficie del adenovirus en condiciones fisiológicas de pH motivó la evaluación de los intercambiadores de iones aniónicos para la purificación de adenovirus. Se usó el intercambiador de iones aniónicos fuertes Toyopearl Super Q 650M para el desarrollo de un método de purificación. Se evaluaron los efectos de la concentración de NaCl y el pH del tampón de carga (tampón A) en la purificación de virus usando el sistema FPLC.

A) Desarrollo del método

Para la cromatografía de intercambio iónico, el pH del tampón es uno de los parámetros más importantes y puede tener una influencia espectacular en la eficacia de la purificación. En referencia al pH y a la conductividad del medio usado durante la producción de virus, los inventores formularon Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2 mM, pH = 7,50 como tampón A. Se acondicionó con tampón A una columna XK16 rellenada con Toyopearl SuperQ 650M con una altura de 5 cm.

Se cargó en la columna una muestra de 5 ml de sobrenadante con virus del biorreactor Celligen, concentrado/diafiltrado tratado con Benzonase. Tras el lavado de la columna, se llevó a cabo la elución con un gradiente lineal de más de 10 volúmenes de columna para alcanzar el tampón B (Tris 20 mM + MgCl_{2} + NaCl 2M, pH = 7,50).

La figura 6 muestra el perfil de elución. Se observaron tres picos durante la elución sin separación satisfactoria entre ellos. El estudio control realizado con medio acondicionado de células 293 (sin virus) mostró que los dos primeros picos están relacionados con el virus. Para mejorar adicionalmente la eficacia de la separación, se evaluó el efecto del pH del tampón. Se aumentó el pH del tampón a 9,00 mientras se mantenían otras condiciones constantes. Se observó una separación más mejorada, tal como se muestra en la figura 7, en comparación con la del tampón de pH de 7,50. Se analizaron las fracciones n.º 3, n.º 4 y n.º8 en HPLC.

Tal como se muestra en la figura 8, se encontró la mayoría de virus en la fracción n.º 4, sin que se detecte virus en las fracciones n.º 3 y n.º 8. Se encontró que la fracción n.º 8 está compuesta principalmente de ácido nucleico contaminante. Sin embargo, la purificación aún no fue óptima. Existe un solapamiento entre las fracciones n.º 3 y n.º 4 detectándose todavía contaminantes en la fracción n.º 4.

Basándose en el cromatograma en la figura 7, se infirió que la mejora adicional de la purificación del virus podría lograrse mediante el aumento de la concentración salina en el tampón A. Como resultado, los contaminantes presentes en la fracción n.º 3, que es anterior al pico del virus, pueden cambiarse a la fracción de flujo continuo. Se aumentó la concentración de NaCl en el tampón A hasta 0,3 M mientras que otras condiciones se mantenían constantes. La figura 9 muestra el perfil de elución en la condición de NaCl 0,3 M en el tampón A.

Se logró la mejora espectacular en la eficacia de la purificación. Tal como se esperaba, se eliminó el pico del contaminante observado en la figura 7 en la condición de mayor concentración salina. Se analizaron por HPLC, las muestras del pico n.º 1, y del pico n.º 2, del flujo continuo, del sobrenadante con virus sin procesar, y los resultados se muestran en la figura 10. No se detectó virus en la fracción de flujo continuo. En el flujo continuo se encontró la mayoría de los contaminantes presentes en el material sin procesar. El análisis por HPLC del pico n.º 1 mostró un único pico del virus bien definido. El perfil de HPLC es equivalente al que se obtiene a partir del virus purificado en gradiente doble de CsCl. Los picos observados en los tiempos de retención de 3,14 y 3,61 min., en virus purificado con gradiente doble de CsCl fueron picos relacionados con el glicerol. El virus purificado tiene un ratio A_{260}/A_{280} de 1,27 \pm 0,03. Esto es similar al valor del virus purificado en gradiente doble de CsCl, así como a los resultados notificados por Huyghe et al. (1996). El pico n.º 2 se compone principalmente de ácido nucleico contaminante. Basándose en el resultado de la purificación, los inventores propusieron el siguiente método para la purificación por IEC de sobrenadante con adenovirus del biorreactor.

Tampón A: Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,3 M, pH = 9,00

Tampón B: Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 2 M, pH = 9,00

Elución: gradiente lineal de 10 volúmenes de columna.

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B) Método de ampliación a escala

Tras el desarrollo del método, se amplió a escala la purificación e la columna XK16 (D.I. 1,6 cm) hasta una columna XK50 (D.I. 5 cm, ampliación a escala de 10 veces) usando el mismo método de purificación. Se logró un perfil de elución similar en la columna XK50 tal como se muestra en la figura 11. Se analizó la fracción de virus en HPLC, que indicó una pureza del virus equivalente a la obtenida de la columna XK16.

Durante los estudios de ampliación a escala, se encontró que era más conveniente y consecuente usar la conductividad para cuantificar la concentración salina en el tampón A. La conductividad óptima del tampón A está en el intervalo de 25 \pm 2 mS/cm a aproximadamente temperatura ambiente (21ºC). Se analizaron en SDS-PAGE, las muestras producidas durante el procedimiento de purificación junto con el virus purificado con doble CsCl.

Tal como se muestra en la figura 12, se detectaron todas las principales proteínas de la estructura del adenovirus en el SDS-PAGE. El virus purificado por IEC muestra tinción equivalente a la del virus purificado en doble CsCl. Durante la purificación, se logró la reducción significativa en concentración de albúmina sérica bovina (BSA). La concentración de BSA en el virus purificado estuvo por debajo del nivel de detección del ensayo de inmunotransferencia de tipo Western tal como se muestra en la figura 13.

Se determinó la reducción de la concentración de ácido nucleico contaminante en la disolución de virus durante el procedimiento de purificación, usando membrana de trasferencia en ranura de ácidos nucleicos. Se usó ADN genómico de humano marcado con ^{32}P como la sonda de hibridación (porque las células 293 son células de riñón embrionario humano). La tabla 12 muestra la concentración de ácido nucleico en diferentes fases del procedimiento de purificación. Se redujo la concentración de ácido nucleico en la disolución final de virus purificado final hasta 60 pg/ml, una reducción aproximada de 3,6 x 10^{6} veces en comparación con el sobrenadante inicial con virus. Se determinó el título de virus y el ratio de partículas infecciosas con respecto a partículas totales para el virus purificado, y los resultados se compararon con los de la purificación doble en CsCl de la tabla 11. Tanto la recuperación de virus como el ratio de partículas/UFP son muy similares entre los dos métodos de purificación. El título de la disolución de virus purificado en columna puede aumentarse adicionalmente mediante la realización de la etapa de concentración.

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TABLA 12 Eliminación de ácido nucleico contaminante durante la purificación

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Ejemplo 7 Otros métodos de purificación

Además de la cromatografía de intercambio de iones aniónicos fuertes, también se evaluaron otros modos de métodos cromatográficos para la purificación de virus AdCMVp53 (por ejemplo, cromatografía por exclusión por tamaños, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio catiónico, o cromatografía de afinidad a iones metálicos). En comparación con el Toyopearl Super Q, todos esos modos de purificación ofrecieron una purificación mucho menos eficaz con baja recuperación de producto. Por tanto, se recomienda resina Toyopearl Super Q para la purificación de AdCMVp53. Sin embargo, es probable que otros intercambiadores aniónicos fuertes a base de la química del amonio sean adecuados para la purificación de AdCMVp53 con algunas modificaciones del procedimiento.

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Ejemplo 8 Purificación de virus AdCMVp53 sin procesar generado de Cellcube^{TM}

Se desarrollaron dos métodos diferentes de producción para producir virus AdCMVp53. Uno se basó en el cultivo de microportadores en un biorreactor de tanque con agitación. El otro se basó en un biorreactor Cellcube^{TM}. Tal como se describió anteriormente, se desarrolló el método de purificación usando sobrenadante con virus sin procesar generado del biorreactor de tanque con agitación. Se observó que aunque se usó el mismo medio, células y virus para la producción de virus tanto en el biorreactor como en el Cellcube^{TM}, la superficie del cultivo en la que las células se adhirieron fue diferente.

En el biorreactor, se hicieron crecer las células en un microportador recubierto de vidrio, mientras que en el Cellcube^{TM} las células se hicieron crecer en superficies de cultivo patentadas de poliestireno tratado. Se usó constante perfusión del medio en el Cellcube^{TM}, por otro lado, no se usó perfusión del medio en el biorreactor. En el Cellcube^{TM}, se recogió el producto de virus sin procesar en forma de células viralmente infectadas, que es diferente del sobrenadante con virus recogido del biorreactor.

El lisado de células sin procesar (CCL), producido tras 5 ciclos de congelación-descongelación de las células recogidas viralmente infectadas, se purificó mediante el uso de IEC usando el método descrito anteriormente. A diferencia del sobrenadante con virus del biorreactor, no se logró purificación satisfactoria para el material de CCL generado a partir del Cellcube^{TM}. La figura 14 muestra el cromatograma. El resultado sugiere que la disolución de virus sin procesar generada a partir del Cellcube^{TM} mediante la congelación-descongelación de células recogidas no se purifica fácilmente mediante el método de IEC.

Se examinaron otros métodos de purificación, incluyendo cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de quelación de metales, para la purificación de virus en CCL. Desgraciadamente, no se observó mejora en la purificación por cualquiera de los métodos. Considerando las dificultades de la purificación del virus en CCL y las desventajas asociadas con la etapa de congelación-descongelación en el procedimiento de producción, los inventores decidieron explorar otros métodos de lisis celular.

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A) Purificación de disolución de virus sin procesar en tampón de lisis

Tal como se describe en los ejemplos 1 y 3, se usó análisis de HPLC para examinar diferentes métodos de lisis con detergentes. Basándose en los resultados de la HPLC, se empleó tampón Tween-20 al 1% en Tris 20 mM + NaCl 0,25 M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 como el tampón de lisis. Al final de la fase de producción del virus, en vez de recoger las células infectadas, se bombeó tampón de lisis en el Cellcube^{TM} tras extraer el medio gastado. Se lisaron las células y se liberaron los virus en el tampón de lisis mediante la incubación durante 30 min.

Tras la clarificación y filtración, se concentró/diafiltró la disolución de virus y se trató con Benzonase para reducir la concentración de ácido nucleico contaminante. Se purificó la disolución de virus tratada mediante el método desarrollado anteriormente usando resina Toyopearl SuperQ. Durante la elución se logró la separación satisfactoria, similar a la que se obtuvo usando el sobrenadante con virus del biorreactor. La figura 15 muestra el perfil de elución. Sin embargo, cuando se analizó la fracción de virus en HPLC, se detectó otro pico además del pico del virus. El resultado se muestra en la figura 16A.

Para purificar adicionalmente el virus, se purificó nuevamente la fracción de virus recogida usando el mismo método. Tal como se muestra en la figura 16B, la pureza de la fracción de virus mejoró considerablemente tras la segunda purificación. También se evaluó la cromatografía de quelación de metales como un candidato para la segunda purificación. Se logró una mejora similar en la pureza del virus tal como se observa con la segunda IEC. Sin embargo, debido a su simplicidad, se prefirió IEC como el método de elección para la segunda purificación.

Tal como se describe en el ejemplo 2, la tasa de perfusión del medio empleada durante las fases de crecimiento celular y de producción del virus tiene un efecto considerable en el perfil de separación por HPLC de la recogida de virus sin procesar con Tween-20. Para la disolución de virus sin procesar producida en alta tasa de perfusión del medio, se requieren dos columnas de intercambio iónico para lograr la pureza del virus requerida.

Basándose en la separación más mejorada observada en HPLC para la disolución de virus producidos en baja tasa de perfusión del medio, es probable que la purificación mediante una columna de intercambio iónico pueda lograr la pureza del virus requerida. La figura 17 muestra el perfil de elución usando la disolución de virus sin procesar producida en baja tasa de perfusión del medio. Durante la elución, se consiguió un pico de virus agudo. El análisis por HPLC de la fracción de virus indica una pureza del virus equivalente a la del virus purificado en gradiente de CsCl tras una etapa de cromatografía de intercambio iónico. La figura 18 muestra el resultado del análisis por
HPLC.

El virus purificado se analizó adicionalmente mediante SDS-PAGE, inmunotransferencia de tipo Western para BSA, y transferencia en ranura de ácidos nucleicos, para determinar la concentración del ácido nucleico contaminante. Los resultados del análisis se facilitan en la figura 19A, figura 19B y figura 19C, respectivamente. Todos esos análisis indican que el virus purificado en columna tiene pureza equivalente en comparación con el virus purificado en gradiente doble de CsCl. La tabla 13 muestra el título y la recuperación de virus antes y después de la purificación en columna. Para fines comparativos, también se incluyen la recuperación de virus típica lograda mediante la purificación en gradiente doble de CsCl. Se lograron recuperaciones de virus similares mediante ambos métodos.

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TABLA 13 Comparación de purificación por ultracentrifugación de gradiente doble de CsCl y por IEC, de AdCMVp53 de Cellcube^{TM}

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A) Estudio de la capacidad de la resina

Se evaluó la capacidad dinámica de la resina Toyopearl SuperQ para determinar la purificación de la disolución de virus recogida con Tween-20 producida en baja tasa de perfusión del medio. Se rellenaron cien ml de resina en una columna XK50. Se purificaron diferentes cantidades de disolución de virus sin procesar, a través de la columna usando los métodos descritos en el presente documento.

Se analizó en HPLC la ruptura del virus y la eficacia de la purificación. La figura 20 muestra los resultados del análisis por HPLC. A un factor de carga de columna mayor que el ratio muestra/volumen de columna de 2:1, se redujo la pureza de la fracción de virus. Los contaminantes coeluyeron con el virus. A un factor de carga mayor de 3:1, se observó la ruptura del virus en el flujo continuo. Por tanto, se propuso que la capacidad de carga de trabajo de la resina esté en el intervalo del ratio muestra/volumen de columna de 1:1.

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B) Concentración/diafiltración tras la purificación

Una etapa de concentración/diafiltración tras la purificación en columna sirve no sólo para aumentar el título de virus, si es necesario, sino también para intercambiar al sistema de tampones especificado para el producto de virus. Se empleó una membrana de TFF de NMWC de 300 K para la etapa de concentración. Debido a la ausencia de contaminantes proteicos y de ácido nucleico en el virus purificado, se logro un flujo de tampón muy alto sin notable descenso de la presión a través de la membrana.

Se logró aproximadamente el 100% de la recuperación de virus durante esta etapa mediante el cambio del tampón en Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,15 M, pH = 7,50. También se intercambió satisfactoriamente el tampón del virus purificado en DPBS durante la etapa de concentración/diafiltración. El factor de concentración puede determinarse mediante el título del virus que se desea en el producto final y el título de disolución de virus eluido de la columna. La flexibilidad ayudará a mantener la regularidad del producto final de virus purificado.

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C) Evaluación de adenovirus deficientes en el AdCMVp53 purificado por IEC

Debido a la eficacia de empaquetamiento inferior al 100% de adenovirus en las células productoras, generalmente existen algunos adenovirus deficientes en la disolución de virus sin procesar. Los virus deficientes no tienen ADN empaquetado dentro de la cápside viral y por tanto pueden separarse del virus intacto en ultracentrifugación en gradiente de CsCl basada en la diferencia de densidades. Es probable que sea difícil separar los virus deficientes de los intactos basándose en la cromatografía de intercambio iónico, suponiendo que ambos virus tienen propiedades químicas de superficie similares. La presencia de una excesiva cantidad de virus deficientes afectará a la calidad del producto purificado.

Para evaluar el porcentaje de partículas víricas deficientes presentes, los virus concentrados y purificados se sometieron a ultracentrifugación isopícnica en CsCl. Tal como se muestra en la figura 21, se observó una banda tenue por encima de la banda de virus intactos tras la centrifugación. Se recuperaron y dializaron ambas bandas frente al tampón Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 para eliminar el CsCl. Se analizaron los virus dializados en HPLC y los resultados se muestran en la figura 22. Ambos virus muestran un tiempo de retención similar. Sin embargo, el virus deficiente tiene un ratio A260/A280 más pequeño que el del virus intacto. Esto es indicativo de menos ADN viral en el virus deficiente.

Los picos observados en los tiempos de retención entre 3,02 y 3,48 min se producen con glicerol que se añade a los virus (10% v/v) antes de congelar a -70ºC. El porcentaje de virus deficientes fue menor del 1% de los virus totales. Es poco probable que este bajo porcentaje de virus deficientes afecte al ratio de partículas totales con respecto a los virus infecciosos (UFP) en el producto de virus purificado. Se analizaron ambos virus mediante SDS-PAGE (mostrado en la figura 19A). En comparación con los virus intactos, los virus deficientes carecen de proteínas nucleares asociadas al ADN que forman bandas a 24 y 48,5 KD. Este resultado está de acuerdo con la ausencia de ADN en virus deficientes.

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D) Visión general del procedimiento de producción y purificación del virus AdCMVp53

Basándose en los resultados del desarrollo del procedimiento anterior, los inventores proponen un diagrama de flujo de producción y purificación para AdCMVp53 tal como se muestra en la figura 23. Se incluye la recuperación de virus acumulativa y por etapas con la correspondiente producción del virus basándose en un Cellcube^{TM} de 1-mero. La recuperación final de virus es aproximadamente del 70 \pm 10%. Esto es aproximadamente 3 veces superior a la recuperación de virus notificada por Huyghe et al. (1996) usando un intercambiador iónico de DEAE y un procedimiento de purificación cromatográfica de quelación de metales, para la purificación de adenovirus que codifican la proteína p53. Se produjeron aproximadamente 3 x 10^{12} UFP de producto final de virus purificado a partir de un Cellcube^{TM} de 1-mero. Esto representa una producción similar de producto final en comparación con el método de producción actual que usa para la purificación ultracentrifugación en gradiente doble de CsCl.

E) Ampliación a escala

Se han realizado estudios de ampliación a escala satisfactorios con el sistema Cellcube^{TM} de 4-meros, y actualmente está en marcha evaluar la producción de virus en el sistema de Cellcube^{TM} de 16-meros. Se filtrará, concentrará y diafiltrará la disolución de virus sin procesar producida, usando un casete más grande de Pellicon. Se determinará la calidad y la recuperación de virus. Tras el tratamiento con Benzonase, se purificará la disolución de virus sin procesar usando una columna de bioproceso de 20 cm y 30 cm para 4-meros y 16-meros, respectivamente.

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Ejemplo 9 Producción mejorada de Ad-p53 en cultivo en suspensión libre de suero Adaptación de células 293

Se adaptaron células 293 a unos medios IS293 libres de suero disponibles comercialmente (Irvine Scientific; Santa Ana, CA) reduciendo secuencialmente la concentración de FBS en matraces T. Se descongelaron las células congeladas en un vial de PDWB y se colocaron en medios DMEM con FBS al 10% en matraz T-75, y las células se adaptaron a los medios IS 293 libres de suero en matraces T reduciendo secuencialmente la concentración de FBS en los medios. Tras 6 pases en los matraces T-75 se estimó que el% de FBS era de aproximadamente el 0,019%. Las células se subcultivaron dos veces más en los matraces T antes de que se trasfirieran a matraces con agitación.

Células 293 adaptadas libres de suero en matraces T se adaptaron al cultivo en suspensión

Se transfirieron las células adaptadas libres de suero anteriores en matraces T, a un cultivo en suspensión por agitación de 250 mL libre de suero (volumen de trabajo 100 mL) para el cultivo en suspensión. La densidad celular inicial fue de 1,85E+5 vc/mL. Durante el cultivo celular, la viabilidad disminuyó y se observaron grandes aglomerados de células. Tras 2 pases más en los matraces T, se intentó de nuevo la adaptación al cultivo en suspensión. En un segundo intento, los medios se complementaron con heparina, a una concentración de 100 mg/L, para prevenir la agregación de células y se incrementó la densidad celular inicial hasta 5,22E+5 vc/mL. Durante el cultivo celular, hubo algún aumento de la densidad celular y se mantuvo la viabilidad celular. Después se subcultivaron las células en matraces con agitación durante 7 pases más y durante los pases, se redujo progresivamente el tiempo de duplicación de las células y al final de los siete pases, fue aproximadamente de 1,3 días que es comparable con los 1,2 días de las células en medios con FBS al 10%, en el cultivo celular adherido. En los medios IS 293 libres de suero complementados con heparina, casi todas las células existían como células individuales sin formar agregados de células en el cultivo en suspensión (tabla 14).

TABLA 14 Cultivo en suspensión libre de suero: adaptación a la suspensión

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Producción viral y crecimiento de células en cultivo en suspensión libre de suero en matraces con agitación

Para someter a prueba la producción de vectores Ad5-CMVp53 en el cultivo en suspensión libre de suero, se hicieron crecer las células anteriores adaptadas al cultivo en suspensión libre de suero en 100 mL de medios IS293 libres de suero complementados con Pluronic F-68 al 0,1% y heparina (100 mg/L) en matraces con agitación de 250 mL. Se infectaron las células a 5 MOI cuando las células alcanzaron 1,36E+06 células viables/mL en el día 3. Se analizó el sobrenadante cada día para partículas virales por HPLC/mL tras la infección. No se detectaron virus distintos de la muestra del día 3. En el día 3, fue de 2,2E+09 vps/mL. Las ufp/mL en el día 6 fueron 2,6 +/-0,6E+07 ufp/mL. Se estimó que la producción de ufp por célula era de 19, que es aproximadamente 46 veces inferior al cultivo adherido en los medios complementados con suero. Como control, se comprobó el crecimiento de las células en ausencia de infección.

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TABLA 15 Cultivo en suspensión libre de suero: Producción viral y crecimiento celular

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Preparación de bancos de células 293 adaptadas en suspensión libre de suero

Tal como se describió anteriormente, tras demostrarse que las células producen los vectores Ad-p53, las células se propagaron en los medios IS293 libres de suero con F-68 al 0,1% y heparina 100 mg/L en los matraces con agitación, para preparar bancos de células adaptadas en suspensión libre de suero que contenían 1,0E+07 células viables/mL/vial. Para recoger las células, se separaron por centrifugación cuando estaban en fase semilogarítmica de crecimiento y la viabilidad fue superior al 90%, y se resuspendieron en medios IS293 complementados, libres de suero, y se separaron por centrifugación de nuevo para lavar las células. Entonces, se resuspendieron las células de nuevo en los medios de crioconservación que es IS293 helado con F-68 al 0,1%, heparina 100 mg/L, DMSO al 10% y metilcelulosa al 0,1% dando como resultado 1E+07 células viables/mL. Se transfirió la suspensión celular a viales de crioconservación estériles y se sellaron y congelaron en un criocontenedor a -70ºC durante la noche. Los viales se transfirieron a almacenamiento en nitrógeno líquido. La prueba para micoplasma fue negativa.

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Para reactivar las células congeladas, se descongeló un vial en 50 mL de medios IS293 libres de suero con F-68 al 0,1% y heparina 100 mg/L en un matraz T-150. Desde entonces, los cultivos se subcultivaron tres veces en matraces con agitación de 250 mL. En otro estudio, se descongeló un vial en 100 mL de medios IS293 complementados, libres de suero en un matraz con agitación de 250 mL. Desde entonces, se subcultivaron 2 veces en matraces con agitación libres de suero. En ambos estudios las células crecieron muy bien.

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Sustitución de medios y producción viral en cultivo en suspensión libre de suero en matraz con agitación

En la producción viral libre de suero anterior en el cultivo en suspensión en el matraz con agitación, la producción viral por célula fue demasiado baja como para que la producción en suspensión libre de suero sea práctica. Se supuso que esto podría deberse a la reducción de los nutrientes y/o a la producción de subproductos inhibidores. Para sustituir los medios gastados con medios recientes IS293 complementados, libres de suero, se separaron por centrifugación las células en el día 3 y se resuspendieron en medio IS-293 reciente libre de suero, complementado con F-68 y heparina (100 mg/L) y la densidad celular resultante fue de 1,20E+06 vc/mL, y se infectaron las células con vectores Ad5-CMVp53 a 5 MOI. Las vps extracelulares por HPLC/mL fueron 7,7E+09 vps/mL en el día 3, 1,8E+10 vps/mL en el día 4, 1,2E+10 vps/mL en el día 5 y 1,3E+10 vps/mL en el día 6, y las ufp/mL en el día 6 fueron 2,75+/-0,86E+08 tvps/mL. El ratio de partículas virales por HPLC con respecto a las ufp fue de aproximadamente 47. Además, las células se separaron por centrifugación y se lisaron con el mismo tipo de tampón de lisis con detergente tal como se usó en la recogida de Cellcube. Las vps celulares por HPLC/mL fueron 1,6E+10 vps/mL en el día 2, 6,8E+09 vps/ml en el día 3, 2,2E+09 vps/mL en el día 4, 2,24E+09 vps/mL en el día 5 y 2,24E+09 vps/mL en el día 6.

La sustitución de los medios gastados con medios IS293 recientes complementados, libres de suero dio como resultado el aumento significativo en la producción de vectores Ad-p53. La sustitución de los medios aumentó la producción de partículas virales extracelulares por HPLC, 3,6 veces más por encima del nivel anterior en el día 3 y la producción de título de ufp extracelulares, diez veces más por encima del nivel anterior en el día 6. Se estimó que la producción por célula de los vectores Ad-p53 era de aproximadamente 1,33E+04 vps por HPLC.

Las partículas virales intracelulares por HPLC alcanzaron punto máximo en el día 2 tras la infección, y luego disminuyeron los números de partículas. En cambio, las partículas virales extracelulares aumentaron progresivamente hasta el día 6 de la recogida. Casi todos los vectores Ad-p53 se produjeron durante los 2 días tras la infección y se localizaron intracelularmente, y luego los virus se liberaron fuera de la célula. Casi la mitad de los virus se liberaron fuera de las células en el sobrenadante entre el día 2 y el día 3 tras la infección y la tasa de liberación disminuyó a medida que transcurría el tiempo.

Todas las células infectadas con vectores Ad-p53 perdieron su viabilidad al final de 6 días tras la infección, mientras que las células en ausencia de infección fueron viables en un 97%. En presencia de infección, el pH del medio gastado sin el intercambio de medios y con el intercambio de medios fue de 6,04 y de 5,97, respectivamente, mientras que en ausencia de la infección fue de 7,00 (tabla 14).

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Producción viral y cultivo celular en el biorreactor con agitación con sustitución de medios y superposición de gas

Para aumentar la producción de vectores Ad-p53, se usó un biorreactor Celligen de 5L para proporcionar un entorno más controlado. En el biorreactor Celligen de 5 L, se controlaron el pH y el oxígeno disuelto así como la temperatura. Se conectó el gas oxígeno y dióxido de carbono a la válvula de solenoide para suministrar oxígeno y ajustar el pH, respectivamente. Para una mejor mezcla mientras que se genera un entorno de bajo esfuerzo cortante, se implementó un impulsor de paletas marinas. Se suministró aire todo el tiempo durante la operación para mantener una presión positiva dentro del biorreactor.

Para inocular el biorreactor, se descongeló un vial de células en 100 mL de medios libres de suero en un matraz con agitación de 250 mL, y las células se expandieron en matraces con agitación de 250 ó 500 mL. Se mezclaron 800 mL del inóculo celular, hechas crecer en matraces de 500 mL, con 2700 ml de medios frescos en un bidón de 10 L y se transfirieron al biorreactor CelliGen con presión de gas. El volumen de trabajo inicial del biorreactor CelliGen fue de aproximadamente 3,5 L de cultivo. La velocidad de agitación del impulsor de paletas marinas se estableció a 80 rpm, la temperatura a 37ºC, el pH a 7,1 al inicio y a 7,0 tras la infección y la DO al 40% todo el tiempo durante la
serie.

La densidad celular inicial fue de 4,3E+5 vc/mL (viabilidad del 97%) y 4 días más tarde, cuando la densidad celular alcanzó 2,7E+6 vc/mL (viabilidad del 93%), se separaron las células por centrifugación y se resuspendieron las células en medios frescos y se trasfirieron al biorreactor CelliGen. Tras el intercambio de medios, la densidad celular fue de 2,1E+6 vc/mL y las células se infectaron a una MOI de 10. Desde entonces, la DO descendió por debajo del 40%. Para mantener la DO por encima del 40%, se retiraron aproximadamente 500 mL de cultivo del biorreactor CelliGen para disminuir la demanda de oxígeno del cultivo celular, y se colocaron las paletas marinas superiores cerca de la interfase entre la fase de gas y de líquido para mejorar la transferencia de oxígeno mediante el aumento de la renovación de la superficie. Desde entonces, la DO pudo mantenerse por encima del 40% hasta el final de la
serie.

Para el control de pH, se usó gas CO_{2} para acidificar el cultivo celular y disolución de NaHCO_{3} 1 N para hacer alcalino el cultivo celular. El control del pH se estableció inicialmente a 7,10. El pH inicial del cultivo celular fue de aproximadamente 7,41. Aproximadamente se consumieron 280 mL de disolución de NaHCO_{3} 1 N hasta que el pH del cultivo celular se estabilizó aproximadamente a pH 7,1. Tras la infección viral del cultivo celular, se disminuyó el control de pH a pH 7,0 y se cerró la línea de suministro de gas CO_{2} para reducir el consumo de la disolución de NaHCO_{3}. El consumo de demasiada disolución de NaHCO_{3} para el ajuste del pH incrementaría indeseablemente el volumen del cultivo celular. Desde entonces, se consumieron 70 mL de disolución de NaHCO_{3} 1 N y el pH estuvo en el intervalo entre 7,0 y 7,1 la mayoría del tiempo durante la serie. La temperatura se controló entre 35ºC y
37ºC.

Tras la infección, la viabilidad de las células disminuyó constantemente hasta el día 6 de la recogida tras la infección. En el día de la recogida, ninguna de las células fue viable. La producción viral volumétrica del biorreactor CelliGen fue de 5,1E+10 vps por HPLC/mL en comparación con 1,3E+10 vps/mL en los matraces con agitación. El entorno controlado en el biorreactor CelliGen aumentó 4 veces la producción de vectores Ad-p53 en comparación con los matraces con agitación con sustitución de medios. Esto se debe tanto al aumento de la densidad celular en el momento de la infección desde 1,2E+6 hasta 2,1E+6 vc/mL, como al aumento de la producción viral por célula desde 1,3E+4 hasta 2,5E+4 vps/mL. 2,5E+4 vps/mL es comparable a 3,5E+4 vps/célula en el cultivo celular adherido, complementado con suero.

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Producción viral y cultivo celular en biorreactor con agitación y con inyección de vapor

En el primer estudio, las células se hicieron crecer satisfactoriamente en un biorreactor con agitación para la producción viral, y se suministraron el oxígeno y el CO_{2} mediante solapamiento de gas en el espacio de cabeza del biorreactor. Sin embargo, este método limitará la ampliación a escala del sistema de cultivo celular debido a su ineficaz transferencia de gas. Por tanto en el segundo estudio, para someter a prueba la factibilidad de la ampliación a escala del cultivo en suspensión libre de suero, se investigó el crecimiento de las células y la producción de Ad-p53 en un biorreactor con inyección de vapor. Se suministraron los gases oxígeno puro y CO_{2} mediante burbujeo a través de los medios IS293 libres de suero, complementados con F-68 (0,1%) y heparina (100 mg/L).

Se burbujeó oxígeno puro a través de los medios líquidos para suministrar el oxígeno disuelto a las células y se controló el suministro de oxígeno puro mediante una válvula de solenoide para mantener el oxígeno disuelto por encima del 40%. Para el suministro eficaz de oxígeno mientras que se minimiza el daño a las células, se usó un difusor de aire sinterizado de acero inoxidable, con un tamaño de poro nominal de aproximadamente 0,22 micrómetros, para suministrar oxígeno puro. También se suministró gas CO_{2} a los medios líquidos mediante burbujeo desde el mismo difusor que el oxígeno puro para mantener el pH aproximadamente a 7,0. Para el control del pH, también se conectó al biorreactor a una disolución de Na_{2}CO_{3} (106 g/L). Se suministró aire al espacio de cabeza del biorreactor para mantener una presión positiva dentro del biorreactor. Otra configuración del biorreactor fue la misma que la del primer estudio.

Se desarrollaron células de inóculo a partir de un vial congelado. Se descongeló un vial de células congeladas (1,0E+7 vc) en 50 mL de medios en un matraz T-150 y se subcultivaron 3 veces en 200 mL de medios en matraces con agitación de 500 mL. Se mezclaron 400 mL de células de inóculo hechas crecer en 2 matraces con agitación de 500 mL, con medios IS293 con F-38 y heparina en un bidón de 10 L para preparar 3,5 L de suspensión celular y se transfirieron al biorreactor CelliGen de 5 L.

La densidad celular inicial en el biorreactor fue de 3,0E+4 vc/mL. La densidad celular inicial es menor que la del primer estudio. En el primer estudio, se usaron cuatro matraces con agitación de 500 mL como el inóculo. Incluso con la menor densidad celular inicial, las células crecieron hasta 1,8E+6 vc/mL en el día 7 en el entorno con inyección de vapor y la viabilidad fue del 98%. Durante el crecimiento de 7 días, la concentración de glucosa disminuyó desde 5,4 g/L hasta 3,0 g/L y la de lactato aumentó desde 0,3 g/L hasta 1,8 g/L.

En el día 7, cuando la densidad celular alcanzó 1,8E+6 vc/mL, se separaron por centrifugación las células en el biorreactor y se resuspendieron en medios recientes IS293 libres de suero con F-68 y heparina en un bidón de 10 L. Se infectaron las células 293 con 1,25E+11 ufp de Ad-p53 y se transfirieron al biorreactor CelliGen. En el biorreactor, la viabilidad celular fue del 100% pero la densidad celular fue sólo de 7,2E+5 vc/mL. Hubo una pérdida de células durante la operación de intercambio de medios. El título viral en los medios se midió como 2,5E+10 vps en HPLC/mL en el día 2, 2,0E+10 en el día 3, 2,8E+10 en el día 4, 3,5E+10 en el día 5 y 3,9E+10 vps por HPLC/mL en el día 6 de la recogida. El primer estudio con el biorreactor Celligen con solapamiento de gas produjo 5,1E+10 vps por HPLC/mL. La menor concentración de virus en la segunda serie se debió probablemente a la menor densidad celular en el momento de la infección. En comparación con 7,2E+5 vc/mL en la segunda serie, se usó 2,1E+6 vc/mL en la primera serie. En realidad, se estimó que la producción por célula de Ad-p53 en el segundo biorreactor CelliGen con inyección de vapor es de 5,4E+4 vps/célula, que es la producción por célula más alta jamás lograda hasta ahora. La producción por célula en el primer biorreactor CelliGen libre de suero sin inyección de vapor y en el matraz T complementado con suero fue de 2,5E+4 vps/célula y de 3,5E+4 vps/célula, respectiva-
mente.

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Tras la infección viral, la viabilidad de las células disminuyó desde el 100% hasta el 13% en el día 6 de la recogida. Durante esos 6 días tras la infección, la concentración de glucosa disminuyó desde 5,0 g/L hasta 2,1 g/L y la de lactato aumentó desde 0,3 g/L hasta 2,9 g/L. Durante todo el periodo de operación, se consumieron aproximadamente 20 mL de disolución de Na_{2}CO_{3} (106 g/L).

Los resultados experimentales demuestran que es técnica y económicamente factible producir Ad-p53 en el
biorreactor con agitación y con inyección de vapor. Está bien establecida la operación unitaria de ampliación a escala y a gran escala del biorreactor con agitación y con inyección de vapor.

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Ejemplo 10 Procedimiento de producción de Blanche et al.

El siguiente ejemplo es un texto extraído de Blanche et al. en el documento WO 98/00524. Este texto es descriptivo de los métodos usados por Blanche et al. en la producción de adenovirus recombinante.

Los adenovirus recombinantes se producen usualmente mediante la introducción de ADN viral en la línea de encapsulación, seguido de lisis de células tras aproximadamente 2 ó 3 días (siendo la cinética del ciclo adenoviral de 24 a 36 horas). Tras la lisis de las células, se aíslan las partículas virales recombinantes mediante centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio.

Para la implementación del procedimiento, el ADN viral introducido puede ser el genoma viral recombinante completo, posiblemente construido en una bacteria (ST 95010) o en una levadura (documento WO95/03400) transfectado en las células. También puede ser un virus recombinante usado para infectar la línea de encapsulación. Además, es posible introducir el ADN viral en forma de fragmentos, llevando cada uno una parte del genoma viral recombinante y una zona de homología que permite que el genoma viral recombinante se reorganice mediante recombinación homóloga entre los diferentes fragmentos, tras la introducción en la célula de encapsulación. Por tanto, un procedimiento clásico de producción de adenovirus incluye las siguientes etapas: se infectan las células (por ejemplo, células 293) en una placa de cultivo con una disolución madre viral previa a la tasa de 3 a 5 partículas virales por célula (multiplicidad de infección (MOI) = de 3 a 5), o se transfectan con ADN viral. Entonces, la incubación dura de 40 a 72 horas. Posteriormente, el virus se libera del núcleo mediante la lisis de las células, generalmente mediante varios ciclos sucesivos de descongelación. Entonces, se centrifuga el lisado celular obtenido a baja velocidad (de 2000 a 4000 rpm), después de lo cual se purifica el sobrenadante (lisado celular clarificado) mediante centrifugación en la presencia de cloruro de cesio en dos etapas:

-

Una primera centrifugación rápida de 1,5 horas en dos capas de cloruro de cesio de densidades de 1,25 y 1,40 que está entorno a la densidad del virus (1,34) de tal modo que se separa el virus de las proteínas del medio;

-

Una segunda centrifugación más larga en un gradiente (desde 10 hasta 40 horas según el rotor usado), que constituye una sola y verdadera etapa de purificación del virus.

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Generalmente, tras la segunda etapa de centrifugación, la banda del virus se intensifica. Sin embargo, se observan dos bandas más finas, menos densas. La observación en el microscopio electrónico ha demostrado que estas bandas están constituidas de partículas virales vacías o rotas para la banda más densa y de subunidades virales (pentones, hexones) para la banda menos densa. Tras esta etapa, el virus se recoge mediante la punción con aguja en el tubo de centrifugación y se elimina el cesio mediante diálisis o desionización.

Aunque los niveles de pureza obtenidos son satisfactorios, este tipo de procedimiento presenta ciertas desventajas. En particular, se basa en el uso del cloruro de cesio, que es un reactivo incompatible con el uso terapéutico en el hombre. Por tanto, es imperativo eliminar el cloruro de cesio al final de la purificación. También este procedimiento tiene algunas otras desventajas mencionadas más adelante, limitando su uso a una escala industrial.

Para remediar estos problemas, se ha propuesto purificar el virus obtenido después de la lisis, no por gradiente de cloruro de cesio, sino por cromatografía. Por tanto, el artículo de Huyghe et al. (Hum. Gen. Ther. 6(1996) 1403) describe un estudio de diferentes tipos de cromatografías aplicadas a la purificación de adenovirus recombinantes. Este artículo describe en particular un estudio de purificación de adenovirus recombinante usando cromatografía de intercambio aniónico débil (DEAE). Estudios anteriores ya habían descrito el uso de este tipo de cromatografía dirigido a ese objetivo (Klemperer et al. Virology 9 (1959) 536; Philipson L., Virology 10 (1960) 459; Haruna et al., Virology 13 (1961) 264). Los resultados presentados en el artículo de Huyghe et al. mostraron una eficacia bastante escasa del protocolo de cromatografía de intercambio iónico recomendado. Por tanto, la resolución obtenida es promedio, indicando los autores que las partículas virales están presentes en varios picos cromatográficos; la producción es baja (producción de partícula viral: 67%, producción de partícula infecciosa: 49%); y la preparación viral obtenida tras esta etapa cromatográfica es impura. Además, es necesario el tratamiento previo del virus con diferentes enzimas/proteínas. También, el mismo artículo describe un estudio del uso de cromatografía de permeación en gel, mostrando una resolución muy mala y producciones muy bajas (15-20%).

El documento WO 98/00524 describe un nuevo procedimiento para la producción de adenovirus recombinantes. El procedimiento según el documento WO 98/00524 resulta de cambios en los procedimientos anteriores en la fase de producción y/o en la fase de purificación. El procedimiento según el documento WO 98/00524 posibilita ahora de una manera muy rápida y de tipo industrial, obtener disoluciones madre de virus de muy alta cantidad y cali-
dad.

Una de las primeras características se refiere más particularmente a un procedimiento para la preparación de adenovirus recombinantes en el que se recogen los virus del sobrenadante del cultivo. Otro aspecto, se refiere a un procedimiento para la preparación de adenovirus incluyendo una etapa de ultrafiltración. Según aún otro aspecto, el documento WO 98/00524 refiere a un procedimiento para la purificación de adenovirus recombinantes incluyendo una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. El documento WO 98/00524 también describe un procedimiento de purificación mejorado, usando cromatografía de permeación en gel, posiblemente acoplada con cromatografía de intercambio aniónico. El procedimiento según el documento WO 98/00524 posibilita obtener virus de alta calidad en lo que se refiere a la pureza, estabilidad, morfología e infectividad, con producciones muy altas y en condiciones de producción completamente compatibles con los requisitos industriales y con las regulaciones que se refieren a la producción de moléculas terapéuticas.

En particular, en lo que se refiere a la industrialización, el procedimiento según el documento WO 98/00524 usa métodos del tratamiento de sobrenadantes de cultivos sometidos a prueba en una gran escala para proteínas recombinantes, tales como microfiltración y filtración profunda, y ultrafiltración tangencial. Además, debido a la estabilidad del virus a 37ºC, este procedimiento permite una mejor organización en la fase industrial puesto que, al contrario del método intracelular, no es necesario que el tiempo de recogida sea preciso en el plazo de medio día. Además, esto garantiza la recogida máxima del virus, que es particularmente importante en el caso de virus deficientes en varias regiones. Además, el procedimiento según el documento WO 98/00524 permite un seguimiento más fácil y más preciso de las cinéticas de producción, directamente en muestras homogéneas del sobrenadante, sin tratamiento previo, lo que permite la mejor reproducibilidad de las producciones. El procedimiento según el documento WO 98/00524 posibilita eliminar la etapa de lisis celular. La lisis de las células presenta varias desventajas. Por tanto, puede ser difícil considerar la ruptura de las células mediante ciclos de congelación/descongelación al nivel industrial. Además, los métodos de lisis alternativos (de Dounce, X-press, sonicación, cizallamiento mecánica, etc.) también presentan desventajas: son potenciales generadores de pulverizados que son difíciles de confinar para los virus L2 ó L3 (nivel de confinamiento de los virus, dependiendo de su patogenicidad o de su modo de diseminación), con estos virus que tienen una tendencia a ser infecciosos a través de medios aéreos; generan esfuerzos cortantes y/o una liberación de calor que es difícil de controlar, disminuyendo la actividad de las preparaciones. La solución de usar detergentes para lisar las células demandaría la validación y también requeriría que se validara la eliminación del detergente. Finalmente, la lisis celular conduce a la presencia en el medio de una gran cantidad de residuos celulares, lo que hace más difícil la purificación. En lo que se refiere a calidad de virus, el procedimiento según el documento WO 98/00524 permite potencialmente la mejor maduración del virus, lo que conduce a una población más homogénea. En particular, siempre que el empaquetamiento del ADN viral sea la última etapa en el ciclo viral, la lisis prematura de las células libera potencialmente partículas vacías que, aunque no son replicativas, son a priori infecciosas y pueden participar en el efecto tóxico distintivo del virus y aumentar el ratio de la actividad específica de las preparaciones obtenidas. El ratio de infectividad específica de una preparación se define como el ratio del número total de partículas virales, medido mediante métodos bioquímicos (DO a 260 nm, HPLC, CRP, métodos inmuno-enzimáticos, etc.) para varias partículas virales que generan un efecto biológico (formación de placas de lisis en las células en cultivo y en medio sólido, traslado de células). En la práctica, para una preparación purificada, el ratio se determina mediante la división de la concentración de las partículas medidas a DO de 260 nm, por la concentración de unidades formadoras de placas en la preparación. Este ratio debe ser inferior a 100.

Los resultados obtenidos muestran que el procedimiento según el documento WO 98/00524 posibilita obtener un virus de una pureza comparable con la del homólogo purificado mediante centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en una única etapa y sin tratamiento preliminar, partiendo de un sobrenadante viral concentrado.

Por tanto, el documento WO 98/00524 se refiere a un procedimiento para la producción de adenovirus recombinantes caracterizado por el hecho que se introduce el ADN viral en un cultivo de células de encapsulación, y se recogen los virus producidos tras la liberación en el sobrenadante del cultivo. Al contrario de los procedimientos anteriores en los que los virus se recogen tras la lisis celular prematura realizada mecánica o químicamente, en el procedimiento según el documento WO 98/00254 las células no se lisan por medio de un factor externo. Se sigue con el cultivo durante un periodo de tiempo más largo y se recogen los virus directamente en el sobrenadante, tras la liberación espontánea por las células de encapsulación. De esta manera, se recupera el virus en el sobrenadante celular, mientras que en los procedimientos anteriores está implicado un virus intracelular y más particularmente un virus intra-
nuclear.

El solicitante ha demostrado ahora que a pesar de que la prolongación de la duración del cultivo y a pesar del uso de volúmenes más grandes, el procedimiento según la invención posibilita generar partículas virales en gran cantidad y de mejor calidad.

Además, como se indicó anteriormente, este procedimiento posibilita evitar las etapas de lisis, que son problemáticas desde un punto de vista industrial y generan numerosas impurezas.

Por tanto, el principio del procedimiento radica en la recogida de los virus liberados en el sobrenadante. Este procedimiento puede implicar un tiempo de cultivo más largo que el usado en las técnicas anteriores basado en la lisis de las células. Tal como se indicó anteriormente, el tiempo de recogida no tiene que ser preciso en el plazo de medio día. Esto se determina esencialmente mediante las cinéticas de liberación de los virus en el sobrenadante del
cultivo.

Las cinéticas de liberación de los virus pueden seguirse de diferentes formas. En particular, es posible usar métodos de análisis tales como HPLC en fase inversa, cromatografía analítica de intercambio iónico, PCR semicuantitativa (ejemplo 4.3), tinción de células muertas con azul de tripano, medición de la liberación de enzimas intracelulares de tipo LDH, medición de partículas en el sobrenadante mediante equipos de tipo Coulter o mediante difracción de la luz, métodos inmunológicos (ELISA, RIA, etc.) o nefelométricos, titulación mediante la agregación en la presencia de anticuerpos, etc.

La recogida se realiza preferiblemente cuando se ha liberado al menos el 50% de los virus en el sobrenadante. El punto en el tiempo en el que se ha liberado el 50% de los virus puede determinarse fácilmente haciendo un estudio cinético según los métodos descritos anteriormente. Incluso más preferiblemente, la recogida se realiza cuando se ha liberado al menos el 70% de los virus en el sobrenadante. Se prefiere particularmente realizar la recogida cuando al menos se ha liberado el 90% de los virus en el sobrenadante, es decir, cuando la cinética alcanza una meseta. Las cinéticas de liberación del virus se basan esencialmente en el ciclo de replicación del adenovirus y pueden resultar influidas por ciertos factores. En particular, pueden variar según el tipo de virus usado, y especialmente según el tipo de deleción realizada en el genoma viral recombinante. En particular, la deleción de la región E3 parece retardar la liberación del virus. Por tanto, en presencia de la región E3, puede recogerse el virus entre 24 y 48 tras la infección. Por el contrario, en ausencia de la región E3, parecen ser necesarios tiempos de cultivo más prolongados. Con respecto a esto, el solicitante ha tenido la experiencia con las cinéticas de liberación de un adenovirus deficiente en regiones E1 y E3 en el sobrenadante de las células, y ha demostrado que la liberación comienza aproximadamente de 4 a 5 días tras la infección y dura hasta aproximadamente el día 14. Generalmente, la liberación alcanza una meseta entre el día 8 y el día 14, y el título permanece estable durante al menos 20 días tras la infección.

Preferiblemente, en el procedimiento según el documento WO 98/00254, las células se cultivan durante un periodo que oscila entre 2 y 14 días. Además, la liberación del virus puede inducirse mediante la expresión de una proteína en la célula de encapsulación, por ejemplo, una viral, implicada en la liberación del virus. Por tanto, en el caso del adenovirus, la liberación puede modularse mediante la expresión de la proteína Death codificada por la región E3 del adenovirus (proteína E3-11.6K), expresada posiblemente bajo el control de un promotor inducible. En consecuencia, es posible reducir el tiempo de liberación del virus y recoger en el sobrenadante del cultivo más del 50% de los virus 24-48 horas tras la infección.

Para recuperar las partículas virales, ventajosamente se filtra primero el sobrenadante del cultivo. Dado que el adenovirus tiene un tamaño de aproximadamente 0,1 \mum (120 nm), la filtración se realiza con membranas cuyos poros son suficientemente grandes como para dejar pasar el virus a través, pero suficientemente finos como para retener los contaminantes. Preferiblemente, la filtración se realiza con membranas que tienen una porosidad superior a 0,2 \mum. Según una realización a modo de ejemplo particularmente ventajosa, la filtración se realiza mediante filtraciones sucesivas en membranas de porosidad decreciente. Particularmente, se han obtenido buenos resultados haciendo filtración en filtros con un intervalo de porosidad decreciente - 10 \mum, 1,0 \mum, luego 0,8 - 0,2 \mum. Según otra variante preferida, la filtración se realiza mediante microfiltración tangencial en membranas planas o fibras huecas. Más particularmente, es posible usar membranas Millipore planas o fibras huecas cuya porosidad oscila entre 0,2 y 0,6 \mum. Los resultados presentados en los ejemplos muestran que esta etapa de filtración tiene una producción del 100% (no se observó pérdida de virus por retención en el filtro que tenía la menor porosidad).

Según otro aspecto del documento WO 98/00524, el solicitante ha desarrollado ahora un procedimiento que posibilita recoger y purificar el virus del sobrenadante. Hacia este objetivo, un sobrenadante así filtrado (o clarificado) se somete a ultrafiltración. Esta ultrafiltración posibilita (i) concentrar el sobrenadante, siendo importantes los volúmenes usados; (ii) realizar una primera purificación del virus y (iii) ajustar el tampón de la preparación en las etapas de preparación posteriores. Según una realización preferida a modo de ejemplo, el sobrenadante se somete a ultrafiltración tangencial. La ultrafiltración tangencial consiste en concentrar y fraccionar una disolución entre dos compartimentos, retener y filtrar, separar mediante membranas de umbrales de punto de corte especificado, mediante la producción de un flujo en el compartimiento de material retenido del aparato y mediante la aplicación de una presión transmembrana entre este compartimento y el compartimento de material filtrado. Generalmente, el flujo se produce con una bomba en el compartimiento de material retenido del aparato, y la presión transmembrana se controla mediante una válvula en el canal de líquido del circuito de material retenido o mediante una bomba de velocidad variable en el canal de líquido del circuito de material filtrado. Se eligen la velocidad del flujo y la presión transmembrana de modo que se generen bajos esfuerzos cortantes (número de Reynolds inferior a 5000 s^{-1}, preferiblemente menor de 3000 s^{-1}, presión menor de 1,0 bar) mientras que se previene el taponamiento de las membranas. Pueden usarse diferentes sistemas para llevar a cabo la ultrafiltración, por ejemplo, membranas en espiral (Millipore, Amicon) así como membranas planas o fibras huecas (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, y Sepracor). Dado que el adenovirus tiene una masa de aproximadamente 1000 kDa, es ventajoso dentro del alcance de la invención usar membranas que tengan un umbral de punto de corte menor de 1000 kDa y preferiblemente que oscile entre 100 kDa y 1000 kDa. El uso de membranas que tiene un umbral de punto de corte de 1000 kDa o superior, provoca en efecto una gran pérdida de virus en esta fase. Es preferible usar membranas que tengan un umbral de punto de corte que oscile entre 200 y 600 kDa, e incluso más preferible, entre 300 y 500 kDa. Las experiencias presentadas en los ejemplos muestran que el uso de una membrana que tiene un umbral de punto de corte en 300 kDa permite que se retenga más del 90% de las partículas virales, mientras que se eliminan los contaminantes del medio (ADN, proteínas en el medio, proteínas celulares, etc.). El uso de un umbral de punto de corte de 500 kDa ofrece las mismas ventajas.

Los resultados presentados en el documento WO 98/00524 muestran que esta etapa posibilita concentrar grandes volúmenes de sobrenadante sin pérdida de virus (redimiendo del 90%), con generación de mejor calidad de virus. En particular, pueden obtenerse fácilmente factores de concentración de 20- a 100- veces.

Por tanto, esta etapa de ultrafiltración incluye una purificación adicional en comparación con el modelo clásico puesto que se eliminan los contaminantes de masa por debajo del umbral de punto de corte (300 ó 500 kDa) al menos en parte. Puede observarse una mejora clara en la calidad de la preparación viral, tras comparar el aspecto de la separación después de la primera etapa de ultracentrifugación según los dos procedimientos. En el procedimiento clásico que implica lisis, el tubo de preparación viral presenta un aspecto turbio con un coágulo (lípidos, proteínas) que algunas veces toca la banda de virus, mientras que en el procedimiento según la invención, tras la liberación y la ultrafiltración, la preparación presenta una banda que previamente se ha resuelto bien de los contaminantes del medio que persisten en la fase superior.

También se demuestra una mejora en la calidad tras comparar los perfiles sobre la cromatografía de intercambio iónico de un virus obtenido mediante lisis celular con un virus obtenido mediante ultrafiltración, tal como se describe en el documento WO 98/000524. Además, es posible mejorar adicionalmente la calidad mediante la aplicación de ultrafiltración con diafiltración del concentrado. Esta diafiltración se realiza basándose en al mismo principio que la ultrafiltración tangencial, y posibilita eliminar más completamente los contaminantes de gran tamaño en el umbral de punto de corte de la membrana, mientras que se logra el equilibrio del concentrado en el tampón de purifica-
ción.

Además, el solicitante también ha mostrado que esta ultrafiltración posibilita purificar el virus directamente mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante cromatografía de permeación en gel, permitiendo la excelente resolución del pico de la partícula viral sin que requiera de antemano tratamiento de la preparación con cromatografía. Esto es particularmente inesperado y ventajoso. De hecho, tal como se indica en el artículo de Huyghe et al. mencionado anteriormente, la purificación por cromatografía de preparaciones virales da pobres resultados y requiere también tratamiento previo de la suspensión viral con Benzonase y ciclodextrinas.

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Ejemplo 11 Optimización del procedimiento de producción

Para llegar a un procedimiento optimizado que pueda usarse para la producción de adenovirus para la producción terapéutica clínica, se han modificado algunas etapas en el procedimiento anterior así como en de Blanche et al. en la publicación PCT n.º WO 98/00524, para mejorar la producción a gran escala. Estas etapas implican la modificación de la etapa de recogida del virus, la etapa de tratamiento con nucleasa y la resina usada para la purificación. El procedimiento optimizado se representa en el diagrama de flujo en la figura 28.

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Etapa de recogida del virus

En el procedimiento descrito anteriormente, los virus se recogían mediante la lisis de células 293 usando una disolución de lisis de Tween-20 al 1%, 2 días tras la infección viral. Este método de recogida requería la introducción de una etapa de lisis en el procedimiento y la adición de una sustancia (Tween-20) en la recogida viral sin procesar. Considerando la naturaleza lítica del ciclo de vida del adenovirus, se usó una estrategia alternativa para recoger el sobrenadante que contenía virus tras la lisis completa de células 293 mediada por virus. Se determinó la cinética de liberación viral mediante el análisis de muestras diarias de sobrenadante del sistema Cellcube^{TM} tras la infección. La liberación viral en el sobrenadante alcanzó una meseta en el día 5 tras la infección. Se encontró que las cinéticas de la liberación viral son constantes. La figura 24 muestra la cinética de liberación viral típica para Ad5CMV-p53. Se obtuvo una producción viral equivalente mediante el uso de o bien lisis con Tween-20 ó bien métodos de recogida de sobrenadante por autolisis. Sin embargo, el método de recogida de sobrenadante simplificó el procedimiento de producción mediante la eliminación de la etapa de lisis en el procedimiento y el agente de lisis añadido (Tween-20) en la recogida viral sin procesar. Como resultado, se usará preferiblemente el método de recogida del sobrenadante para el procedimiento optimizado.

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Etapa de tratamiento con nucleasa

En el procedimiento anterior y en el de Blanche et al en la publicación PCT n.º WO 98/00524, se incluyó NaCl 1 M en el tampón de tratamiento con Benzonase^{TM} para prevenir la precipitación viral durante el tratamiento con enzimas. Desgraciadamente, se encontró que la presencia de NaCl 1 M en el tampón, inhibe significativamente la actividad enzimática de Benzonase^{TM}. Como resultado, se examinaron otros tampones que podrían prevenir la precipitación viral sin retardar la actividad enzimática de Benzonase^{TM}. Se encontró que un tampón Tris 0,5 M/HCl + MgCl_{2} 1 mM, pH = 8,0, reunía ambos criterios. Además, este tampón tiene una conductividad de 19 mS/cm lo que posibilita cargar la disolución viral tratada con Benzonase^{TM}, directamente en la columna cromatográfica para la purificación. Como resultado, el cambio del tampón Tris 0,5 M/HCl + MgCl_{2} 1 mM, pH = 8,0, no solo mejorará la eficacia del tratamiento con Benzonase^{TM}, sino que también simplificará el procedimiento posterior.

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Resina para la purificación

La resina Fractogel TMAE(s) y la resina Toyopearl SuperQ 650M empleadas en el procedimiento anterior y la de Blanche et al. funcionaron bien de manera sistemática. Sin embargo, debido a problemas de suministro y soporte técnico, se eligieron resinas alternativas para su uso en la purificación de virus. Se encontró que la resina Source 15Q fabricada por Pharmacia Biotech funciona tan bien como las resinas Fractogel y Toyopearl. La figura 25 muestra un cromatograma típico de la resina Source 15Q. Sorprendentemente, se encontró que el material viral interacciona ligeramente más fuerte con la resina Source 15Q que con la resina Fractogel y Toyopearl. Como resultado, se observó un gran pico de proteína viral al inicio del gradiente de elución. También se eluyó la fracción de virus purificada relativamente más tarde en el gradiente. Sin embargo, el perfil de purificación global no fue significativamente diferente del de la resina Fractogel o Toyopearl. El análisis por HPLC de la fracción viral purificada de la resina Source 15Q mostró un perfil equivalente al de la resina Fractogel. La figura 26 muestra el perfil por HPLC.

También se evaluó Ad5CMV-p53 preparado mediante el procedimiento optimizado para determinar su actividad biológica en comparación con el material preparado mediante el procedimiento anterior y el de Blanche et al. Las dos líneas celulares, H1299 y SAOS-LM, que no expresaron p53 endógeno, se transdujeron con materiales preparados mediante los dos procedimientos a iguales multiplicidades de infección (partículas virales/célula). Se monitorizó la expresión de p53 a las 6 horas tras la transducción en H1299 y a las 24 horas tras la transducción en SAOS-2. El nivel de expresión de p53 mediando por los dos materiales fue equivalente y dependiente de la dosis en ambas líneas celulares receptoras (figura 27).

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Puntos de control del procedimiento

Se evaluó la estabilidad de la congelación y descongelación de la fracción viral purificada eluida de una columna de cromatografía (masa purificada). La fracción viral purificada eluida de la columna se congeló en masa a \leq -60ºC tras complementar con glicerol hasta una concentración final del 10% (v/v). La masa congelada se descongeló satisfactoriamente sin efectos nocivos para el título. Los datos de congelación y descongelación se facilitan en la
tabla 16.

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TABLA 16 Congelación y descongelación de la masa purificada

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Además, no se observaron cambios en los perfiles de HPLC antes y tras la congelación y descongelación. Por tanto, el material viral en la etapa tras la cromatografía puede mantenerse a < -60ºC para su procesamiento adicional, y puede introducirse un control del procedimiento en la etapa tras la cromatografía (masa purificada).

Se observó una estabilidad de congelación y descongelación similar para el producto en masa estéril formulado. La tabla 17 muestra los datos de congelación y descongelación.

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TABLA 17 Congelación y descongelación del producto en masa estéril formulado

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Como resultado, el producto en masa estéril formulado puede mantenerse a < -60ºC antes de su llenado aséptico sin efectos dañinos en el título viral y puede introducirse un punto de control del procedimiento en la etapa tras la formulación (masa estéril).

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Ejemplo 12 Parámetros para la producción a gran escala

Durante la ampliación a escala y la optimización del procedimiento a gran escala (16-meros), los inventores encontraron varios parámetros que son deseables para series de producción satisfactorias y alta producción del virus. Estos parámetros deseables se centran entorno al sistema de cultivo celular, la parte más anterior del procedimiento de producción de adenovirus, y se cree que es aplicable a otros tipos de sistemas de cultivo celular y a escalas más grandes. En particular, puede preverse fácilmente que los cambios descritos a continuación que dan como resultado cambios funcionales en el sistema, serán útiles para permitir la modificación y la optimización de otros sistemas de cultivo celular.

Para el presente ejemplo, los parámetros de control del cultivo son tal como sigue. Las células se cultivan a 37ºC con CO_{2} al 10%. El medio de cultivo es DMEM + FBS al 10%, y la densidad celular de inoculación para la expansión celular es < 4 x 10^{4} células/cm^{2}. Los parámetros que están implicados en la configuración y ejecución del sistema Cellcube^{TM} y se enumeran a continuación.

Configuración de Cellcube^{TM}: En una configuración a escala completa (4 x 100 ó "16-meros"), es deseable usar un circuito separado de recirculación del medio de cultivo para cada módulo de cubo (4-mero) para lograr incluso la perfusión del medio. Por ejemplo, en la presente configuración de 16-meros, los 16-meros se componen de cuatro de 4-meros unidos entre sí en una serie, teniendo cada 4-meros su propio circuito de recirculación de medio. Los 16-meros se consideran una unidad y se controlan mediante un único módulo de control que modula la tasa de perfusión del medio, y mide los parámetros de control del cultivo. Otras configuraciones tales como el uso de un circuito de recirculación del medio para cada dos módulos de 4-meros dan como resultado desigual perfusión del medio debido al descenso de la presión en el sistema, y es nocivo para la salud de las células en el segundo cubo con menores niveles de nutrientes y medio recientemente oxigenado. Por tanto, en un sistema de cultivo celular usado para la producción de adenovirus, es preferible que la perfusión del medio de cultivo celular se mantenga a una presión y velocidad constante, garantizando la salud sistemática y óptima de las células productoras. La tasa de perfusión se determina mediante la monitorización de uno o más de los parámetros de control del cultivo celular, tales como la concentración de glucosa.

Densidad de siembra: Con el fin de lograr expansión y crecimiento celular máximos, es más preferible inocular el Cellcube^{TM} con 1-2 x 10^{4} células/cm^{2}. Números superiores de células usadas en la etapa de inoculación celular dan como resultado una densidad celular que es demasiado alta y el resultado es un exceso de confluencia de células en el momento de la infección viral, disminuyendo por tanto las producciones. Un experto en la técnica podrá perfectamente determinar que en otros tipos de sistemas de cultivo celular, podría determinarse fácilmente una optimización similar de la densidad de siembra para un sistema particular.

Método de siembra: Se ha encontrado que para la producción a escala completa es ventajoso usar un conjunto homogéneo de células para la siembra de todos los módulos de Cellcube^{TM}. Antes de sembrar en el aparato de cultivo celular, se expanden las células productoras del banco de células de trabajo a partir de los cultivos de disolución madre. Esta expansión celular se lleva a cabo mediante el crecimiento de células en matraces de cultivo celular u otros dispositivos similares de cultivo celular, y la división continua de las células en dispositivos de cultivo celular más grandes. Tras alcanzar el número total de células necesarias para la inoculación del aparato de cultivo celular a gran escala, se reúnen todas las células de cada uno de los dispositivos de cultivo celular usados para la expansión celular. Este conjunto homogéneo de células se usa para inocular cada uno de los módulos del Cellcube^{TM} de los 16-meros. La siembra de cada uno de los módulos usando poblaciones celulares separadas, por ejemplo a partir de dispositivos de cultivo celular individuales en la fase de expansión celular, puede dar como resultado desigual densidad celular, y por tanto, desiguales niveles de confluencia. Se cree que el uso de un conjunto homogéneo de células para la siembra supera estos problemas.

Duración de la inoculación celular: Durante la inoculación de cada uno de los módulos de Cellcube^{TM}, se añaden células al módulo y se permite un periodo de algunas horas para adherirse a la superficie del módulo. Durante este tiempo, no hay perfusión o recirculación del medio. Los inventores han encontrado que es ventajoso completar esta siembra de células en un día (24 horas). Por tanto por ejemplo, se inocula un lado del módulo y se deja durante un periodo de tiempo de 6-8 horas para permitir la adhesión celular, y por tanto el otro lado del módulo se inocula y se deja durante la noche para permitir que las células se adhieran a la superficie del módulo. Durante este procedimiento de siembra, se conserva separado el medio del cultivo celular de cada lada del módulo, y no se permite que fluya al otro lado del módulo. Se ha observado que si se realiza el procedimiento de inoculación celular durante un periodo de tiempo de más de un día, y/o con intercambio de medio entre los lados del módulo, hay una mayor probabilidad de desprendimiento celular de la superficie de cultivo celular debido a una débil adhesión. Las posibles razones para esta adhesión débil pueden incluir: 1) el intercambio del medio entre los lados del módulo que puede producir esfuerzos cortantes con el potencial para desprender las células que se someten al proceso de adhesión, y 2) mayor periodo de tiempo antes de que se inicie la perfusión del medio puede dar como resultado bajos niveles de nutrientes en los medios, y por tanto que se deteriore la salud de las células, lo que conduce a una adhesión menos eficaz.

Parámetros de control del cultivo: Los inventores han encontrado han encontrado que la concentración de glucosa del medio de cultivo celular debe preferiblemente mantenerse a 1-2 g/L. Estudios anteriores usando concentraciones de glucosa a niveles más altos, han demostrado la reducción de la producción del producto.

Método de infección: Ocho días tras la siembra de las células, se infectaron las células con adenovirus. Durante el proceso de infección, se detuvo la perfusión del medio durante una hora, sin embargo se mantuvo la recirculación del medio, conservando por tanto niveles altos de oxígeno fresco en el medio. Los inventores han encontrado que si también se detiene la recirculación del medio durante la etapa de infección, existe una creciente posibilidad de muerte celular debido a la falta de oxígeno.

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Ejemplo 13 Producción optimizada a gran escala y purificación de adenovirus

El ejemplo descrito a continuación es descriptivo de los métodos y materiales usados en el procedimiento de producción y purificación a gran escala para el adenovirus Ad5CMV-p53 recombinante. Este procedimiento usa un aparato biorreactor Cellcube^{TM} como el sistema de cultivo celular, y gran escala en este ejemplo se refiere a una configuración de Cellcube de 4 x 100 o múltiplos del mismo. Las producciones de virus máximos totales que pueden obtenerse a partir de un sistema Cellcube de 4 x 100 son aproximadamente 1-5 x 101^{5} partículas virales en la recogida.

Expansión y cultivo celular

El Cellcube^{TM} de 4 x 100 se configuró como se describió anteriormente, con 4 módulos de Cellcube^{TM} de 100 en paralelo, todo en un circuito de recirculación de medio, y siendo controlado todo el sistema mediante una sola unidad de control. Las células productoras, células 293 del banco de células de trabajo (BCT), se descongelaron y expandieron en matraces T y factorías celulares (Nunc) que se siembran a densidades de desde 1-8 x 10e4 células/cm^{2}. Generalmente, las células se dividieron en una confluencia de aproximadamente el 85-90% y se expandieron continuamente hasta que se obtuvieron suficientes células para la inoculación del Cellcube^{TM}. Al final de la fase de expansión celular, todas las células de cada una de las factorías celulares se agruparon para preparar una mezcla homogénea de células 293. Se usó esta fuente de células para inocular el Cellcube^{TM} con un número de células total en el intervalo de 1-3 x 10e9 células viables por lado. Durante la inoculación celular, se suspendió la perfusión y la recirculación del medio durante un periodo de tiempo para permitir que las células se adhirieran al sustrato. Se permiten que las células adhieran a un lado durante 4-6 horas; entonces se inocula el lado dos y se permite que las células se adhieran durante no más de 18 horas antes de reiniciar la recirculación. Tras la adhesión celular, se reinició la perfusión y la recirculación del medio y se permitió que las células crecieran durante 7 días a 37ºC en condiciones de cultivo de pH = 6,90-7,45, DO = 40-50% de saturación de aire. Se reguló la tasa de perfusión del medio según la concentración de glucosa en el Cellcube^{TM}, y se mantuvo a entre 1-2 g/L. Un día después de la infección viral, se cambió el medio para la perfusión de DMEM + FBS al 10% a DMEM basal (sin FBS). En el día 8, se infectaron las células con virus AdCMVp53 a una multiplicidad de infección (MOI) de 5-50 partículas virales por células basándose en un total de 8 x 10^{10} células. Se detuvo la perfusión del medio durante 1 hora en el momento de la infección y luego se reanudó durante aproximadamente dos días. Se mantuvo la recirculación del medio a través del periodo de infección del virus.

Recogida y purificación del virus

Estudios anteriores que analizaron las cinéticas de liberación del virus tras la infección por Ad5CMV-p53 de células 293 determinaron que se obtuvo la liberación de virus máxima de las células productoras debido a la naturaleza lítica del adenovirus, cuatro a seis días tras la infección. Por tanto, cuatro a seis días tras la infección, se eliminó el sobrenadante de los módulos de Cellcube^{TM} como conjunto. Entonces, se clarificó el sobrenadante con virus mediante filtración a través de dos filtros Polyguard de 5,0 micras, seguido por un filtro Polysep de 5,0 micras (Millipore). Entonces se concentró el sobrenadante aproximadamente 10 veces usando filtración de flujo tangencial a través de un casete Pellicon (Millipore) de punto de corte de peso molecular nominal (NMWC) de 300 K. Entonces, se intercambió el tampón mediante diafiltración frente a Tris 0,5 M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 8. Entonces se trató el sobrenadante a temperatura ambiente con Benzonase^{TM} 100 U/ml en un tampón Tris 0,5 M/HCl + MgCl_{2} 1 mM, pH = 8,0, filtrado en 0,2 micras, y se incubó durante la noche a temperatura ambiente para eliminar ácidos nucleicos celulares contaminantes. Entonces, se filtró la preparación de virus sin procesar en 0,2 micras y se cargó directamente en una columna de intercambio iónico (BPG 200/500, Pharmacia) que contenía resina Source 15Q en equilibrio con Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, NaCl 250 mM, pH = 8. Se eluyó el virus con un gradiente lineal de 40 volúmenes de columna que usa un tampón de elución compuesto de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, + NaCl 2M, pH = 8. Entonces se sometió el virus purificado a otra etapa de concentración y diafiltración para colocar el virus en la formulación viral final para el producto de virus. La etapa de concentración usó una membrana de TFF Pellicon de NMWC de 300, y para la diafiltración se intercambió el tampón usando 8-10 volúmenes de columna de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco + glicerol al 10%. Entonces, se filtró hasta esterilidad el virus purificado a través de un filtro Milipak (Millipore) de 0,2 micras. Entonces, el producto formulado se llenó en los viales estériles de vidrio con tapones. Se aplicaron tapas onduladas con cierre de fácil apertura antes de la inspección y el etiquetado del producto final.

En el procedimiento pueden introducirse dos puntos de control del procedimiento tal como se describe en el ejemplo 10. El primer control del procedimiento puede introducirse tras la etapa de IEC, momento en el que puede añadirse glicerol al 10% al eluato y congelarse para el procesamiento posterior. La segunda etapa de control del procedimiento puede introducirse después que obtener el producto final pero antes de la filtración hasta esterilidad y la dispensación en viales. En este punto, el producto en masa final puede congelarse y mantenerse para la filtración y dispensación en viales final.

Se midió la siguiente lista de parámetros a lo largo de toda la producción y el procedimiento de purificación. La especificación es la medida deseada que el artículo sometido a prueba debe cumplir. El resultado de cada prueba se muestra a la derecha de la tabla.

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Ejemplo 14 Sumario del desarrollo de la formulación para adenovirus

En la actualidad, el producto Adp53 clínico se almacena congelado a \leq 60ºC. Esta condición de almacenamiento de ultracongelación no sólo es cara, sino que también crea problemas para el transporte e inconvenientes para su uso clínico. El objetivo del esfuerzo para desarrollo de una formulación es desarrollar una formulación o bien líquida o bien liofilizada para Asp53 que pueda almacenarse a condición de refrigeración y que sea estable durante un periodo de tiempo prolongado. El desarrollo de la formulación para Adp53 se centra tanto en formulaciones de liofilización como líquidas. Desde el punto de vista de la economía de fabricación y de comercialización, se prefiere la formulación líquida a la formulación liofilizada. En este caso se resumen resultados preliminares de ambos frentes de desarrollo de formulación.

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Materiales y equipo Liofilizador

Se usó un liofilizador de \mup Dura-stop (FTSsystems) con un dispositivo de recuperación de muestras en proceso. Se equipó el liofilizador tanto con un manómetro de termopar como con un manómetro de capacitancia para la medición a vacío. Se programó la temperatura del condensador para alcanzar -80ºC. Los viales se detuvieron al final de cada serie con un dispositivo de parada mecánica incorporado.

Medición de la humedad residual

Se analizó la humedad residual en el producto liofilizado mediante un voltámetro de tipo Karl-Fischer (Mettler DL37, voltámetro KF).

Análisis por HPLC

Se realizó el análisis por HPLC de las muestra en un sistema de HPLC Beckman Gold.

Viales y tapones

Se usaron viales de liofilización de borosilicato de 3 ml con 13 mm de apertura y sus correspondientes tapones de caucho de butilo (ambos de Wheaton) tanto para la liofilización como para el desarrollo de la formulación líquida. Los viales taponados se cubrieron con tapas de fácil apertura de aluminio usando un dispositivo de colocación de tapones (LW 312 Westcapper, The West company).

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Resultados Liofilización Ciclo inicial y desarrollo de la formulación

Existen tres variables del procedimiento principales que pueden programarse para lograr la liofilización óptima. Éstas son la temperatura de la bandeja, la presión de la cámara y el tiempo de duración de la etapa de liofilización. Para evitar el colapso por aglutinación, es necesario que se establezca la temperatura de la bandeja a temperaturas 2-3ºC por debajo de la temperatura eutéctica o de transición vítrea de la formulación congelada. Tanto las temperaturas de transición vítrea como las temperaturas eutécticas de una formulación pueden determinarse mediante el análisis calorimetría diferencial de barrido (DSC). Generalmente, la presión de la cámara se establece por debajo de la presión de vapor del hielo de la formulación congelada. La presión de vapor del hielo es dependiente de la temperatura de la bandeja y de la presión de la cámara. Una presión demasiado alta de la cámara reducirá la velocidad de secado mediante la reducción de la presión diferencial entre el hielo y los alrededores, mientras que una presión demasiado baja también retardará la velocidad de secado mediante la reducción de la tasa de transferencia de calor de las bandejas a los viales. El desarrollo del un ciclo de liofilización está estrechamente relacionado con la formulación y los viales elegidos para la liofilización. La selección de los excipientes de la formulación se basa en los excipientes clásicos encontrados en la mayoría de productos farmacéuticos liofilizados. Los excipientes en una formulación de liofilización deben proporcionar las funciones de carga, crioprotección, y lioprotección. Los excipientes elegidos fueron manitol (M, agente de carga), sacarosa (S, crioprotector y lioprotector), y albúmina sérica humana (HSA, lioprotector). Estos excipientes se formularon en Tris 10 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 a distintos porcentajes y se llenaron en viales de 3 ml a un volumen de llenado de 1 mL. Para comenzar, se programó un ciclo preliminar para cribar una variedad de formulaciones basándose en los criterios de humedad residual y en el aspecto físico tras el secado. El ciclo usado se representa gráficamente en la figura 29. Se llevó a cabo una amplia selección mediante la variación de los porcentajes de los excipientes individuales. La tabla 18 muestra brevemente algunos de los resultados.

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TABLA 18 Evaluación de diferentes formulaciones en el mismo ciclo

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Los resultados sugieren que se requiere una cantidad mínima del 3% de manitol en la formulación con el fin de lograr una aglutinación farmacéuticamente elegante. También se examinaron los porcentajes de sacarosa en la formulación. No se observó efecto significativo en la liofilización a concentraciones de sacarosa \leq al 10%. La concentración de HSA se mantuvo constante al 0,5% durante la fase de selección inicial.

Tras la evaluación de las formulaciones, se optimizó el ciclo de liofilización mediante el cambio de la temperatura de la bandeja, el vacío de la cámara y la duración de cada etapa del ciclo. Basándose en la amplia optimización del ciclo, se usó el siguiente ciclo (ciclo n.º 14) para el desarrollo adicional de la liofilización de virus.

Cargar la muestra a temperatura ambiente en la bandeja

Establecer la temperatura de la bandeja a -45ºC y congelar la muestra. Tiempo de la etapa 2 h.

Establecer la temperatura de la bandeja a -45ºC, girar la bomba de vacío y establecer el vacío a 400 mT. Tiempo de la etapa 5 h.

Establecer la temperatura de la bandeja a -35ºC, establecer el vacío a 200 mT. Tiempo de la etapa 13 h.

Establecer la temperatura de la bandeja a -22ºC, establecer el vacío a 100 mT. Tiempo de la etapa 15 h.

Establecer la temperatura de la bandeja a -10ºC, establecer el vacío a 100 mT. Tiempo de la etapa 5 h

Establecer la temperatura de la bandeja a 10ºC, establecer el vacío a 100 mT, tiempo de la etapa 4 h

Taponar los viales a vacío.

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Desarrollo del ciclo y la formulación con virus en la formulación Efecto de la concentración de sacarosa en la formulación

Se optimizaron adicionalmente el ciclo y la formulación según la recuperación de virus tras la liofilización analizada tanto por HPLC como por ensayos de unidades formadoras de placas (UFP). La tabla 19 muestra las recuperaciones de virus inmediatas tras el secado de diferentes formulaciones usando el ciclo de secado anterior. La variación del porcentaje de sacarosa en la formulación tuvo efecto significativo en las recuperaciones de virus.

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TABLA 19 Recuperaciones de virus tras la liofilización

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La humedad residual en el producto liofilizado aumentó a medida que aumentaba el porcentaje de sacarosa. Se requiere una concentración mínima de sacarosa del 5% en la formulación para mantener una buena recuperación de virus tras la liofilización. Se observaron efectos similares de la sacarosa en la formulación que tenía el 5% en vez del 6% de manitol. Sin embargo, la buena recuperación de virus inmediatamente después del secado no apoya necesariamente una estabilidad en almacenamiento a largo plazo. Como resultado, se incorporaron formulaciones que tenían 4 concentraciones de sacarosa diferentes del 6, 7, 8 y 9%, para su evaluación adicional.

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Efecto de HSA en la formulación

Se examinó la contribución de las concentraciones de HSA en la formulación sobre la recuperación de virus tras el secado, usando el mismo ciclo de liofilización. La tabla 20 muestra los resultados.

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TABLA 20 Efectos de la concentración de HSA en la liofilización

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Los resultados indican que la inclusión de HSA en la formulación tuvo un efecto positivo en la recuperación de virus tras el secado. Concentraciones superiores al 0,5% no mejoraron adicionalmente la recuperación de virus tras el secado. Como resultado, se formuló HSA al 0,5% en todas las formulaciones de liofilización.

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Optimización del ciclo

Tal como se indica en la tabla 19, humedades residuales relativamente altas estuvieron presentes en el producto seco. Aunque, no ha habido una humedad residual óptima conocida para los virus liofilizados, podría ser beneficioso para la estabilidad en almacenamiento a largo plazo, reducir adicionalmente la humedad residual en el producto seco. Tras revisar el ciclo de secado, se decidió aumentar la temperatura de secado secundario desde 10ºC hasta 30ºC sin aumentar el tiempo total del ciclo. Tal como se indica en la tabla 21, se había logrado una reducción significativa en la humedad residual en todas las formulaciones, sin efectos negativos en las recuperaciones de virus. Con el ciclo de secado mejorado, la humedad residual fue inferior al 2% en todas las formulaciones inmediatamente tras el secado. Se espera que la humedad residual reducida mejorará la estabilidad en almacenamiento a largo plazo del producto seco.

TABLA 21 Efectos de la temperatura de secado secundario en la liofilización

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Relleno con N_{2} (inertización)

Se realizó la liofilización de manera similar a la anterior, excepto que se usó N_{2} seco para la extracción de gas para el control de la presión durante el secado y relleno al final del ciclo. Al final de la serie de secado, la cámara se llenó con N_{2} seco hasta aproximadamente un 80% de presión atmosférica. Posteriormente, se taponaron los viales. No se observó diferencia entre las series de inertización con N_{2} y con aire inmediatas tras el secado. Sin embargo, si el oxígeno presente en el vial durante la relleno con aire provoca efectos dañinos (oxidación) en el virus o en los excipientes usados durante el almacenamiento a largo plazo, el relleno con N_{2} seco es probable que mejore los efectos dañinos y mejore la estabilidad en almacenamiento a largo plazo del virus.

Eliminación de glicerol de la formulación

Durante la preparación de formulaciones que contienen virus, se añade la disolución madre de virus a las formulaciones previamente formuladas a un factor de dilución de 10. Debido a la presencia de glicerol al 10% en la disolución madre de virus, se introdujo glicerol al 1% en las formulaciones. Para examinar cualquier posible efecto de la presencia de glicerol al 1% en la liofilización, se realizó una serie de liofilización usando virus diafiltrados en la formulación de 5%(M)/7%(S)/0,5%(HSA). Se realizó dialfiltración con 5 volúmenes de intercambio de tampón usando un modo de intercambio de tapón de volumen constante para garantizar la eliminación adecuada del glicerol residual (99% de eliminación). Tras la diafiltración, se llenó la disolución de virus en viales y luego se liofilizaron de manera similar. La tabla 22 muestra los resultados de la liofilización.

TABLA 22 Liofilización sin glicerol

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No se observó diferencia significativa tras la liofilización, entre las formulaciones con y sin glicerol al 1%. Se evaluarán las posibles implicaciones de este cambio en el almacenamiento a largo plazo.

Estabilidad en almacenamiento a largo plazo

Durante la evaluación de la estabilidad en almacenamiento a largo plazo, se colocó el virus Adp53 liofilizado en diferentes formulaciones y diferentes ciclos, a -20ºC, 4ºC y temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Los parámetros medidos durante el estudio de estabilidad fueron UFP, HPLC, partículas virales, humedad residual y vacío dentro del vial (integridad). La figura 30A y la figura 30B muestran los datos tras almacenar durante 12 meses con el secado secundario a 10ºC sin inertización con N_{2}. El virus liofilizado es estable tanto a -20ºC como a 4ºC de almacenamiento durante hasta 12 meses. Sin embargo, el virus no fue estable en almacenamiento a temperatura ambiente. Se observó más del 50% de pérdida e infectividad a TA tras un almacenamiento de 1 mes. El ratio para esta rápida pérdida de infectividad a TA no está claro. Sin embargo, es probable que la TA esté por encima de la temperatura de transición vítrea de la formulación seca y dé como resultado en la degradación acelerada del virus. Un análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la formulación podría proporcionar información muy útil. No se detectó cambio de la presión dentro de los viales durante el almacenamiento, lo que indica que los viales mantuvieron su integridad. El ligero aumento en la humedad residual durante el almacenamiento puede atribuirse a la liberación de la humedad desde la tapa de caucho al interior del producto seco.

La figura 31 y figura 32 muestran los datos de la estabilidad en almacenamiento con secado secundario a 30ºC sin y con relleno con N_{2}, respectivamente. Debido a la estabilidad casi idéntica observada a las condiciones de almacenamiento de -20ºC y 4ºC, y para reducir el consumo de virus, no se incluyó -20ºC en el estudio de estabilidad en almacenamiento a largo plazo. De manera similar a las muestras secas con secado secundario a 10ºC, el virus es estable a 4ºC pero no es estable a TA. Sin embargo, se observó relativamente mejor estabilidad en el almacenamiento a TA que los secados en secado secundario a 10ºC. Es probable que eso sea el resultado de la menor humedad residual lograda en el secado secundario a 30ºC. Este resultado sugiere que la humedad residual es un parámetro importante que afecta la estabilidad en almacenamiento durante el almacenamiento a largo plazo. Es necesario el almacenamiento durante un plazo mayor para revelar cualquier efecto beneficioso de realizar la inertización con N_{2} durante la liofilización, dado que no se observó ningún efecto significativo durante hasta 3 meses de almacenamiento. Durante el almacenamiento, el análisis por HPLC indica que el virus es estable tanto a -20ºC como a 4ºC de almacenamiento y que no es estable a TA, lo que está de acuerdo con los resultados del ensayo de UFP.

Alternativas a la HSA

La presencia de HSA en las formulaciones puede ser una potencial preocupación reguladora. Como resultados, se ha evaluado una variedad de excipientes para sustituir a la HSA en la formulación.

Los sustitutos examinados incluyeron PEG, aminoácidos (glicina, arginina), polímeros (polivinilpirrolidona) y tensoactivos (Tween-20 y Tween-80).

Formulación líquida

Junto al desarrollo de la liofilización del producto Adp53, se llevó a cabo experimentación para examinar la posibilidad de desarrollar una formulación para el producto Adp53. El objetivo fue desarrollar una formulación que pueda proporcionar suficiente estabilidad al virus cuando se almacene a temperaturas por encima de la de congelación. Se han evaluado cuatro conjuntos de formulaciones líquidas. En el primer conjunto de formulación, la formulación actual de glicerol al 10% se comparó con formulaciones que contenían HSA y PEG. En el segundo grupo de formulación, se examinaron diversos aminoácidos para la formulación de Adp53. En el tercer conjunto de formulación, se uso la formulación óptima desarrollada para la liofilización para formular Adp53 en una forma líquida. En la cuarta formulación, se evaluaron detergentes para la formulación de Adp53. Los virus formulados con todas esas diferentes formulaciones se sometieron a prueba para determinar la estabilidad en almacenamiento a largo plazo a -20ºC,
4ºC y TA.

Conjunto de formulación líquida n.º 1

Se comparó la formulación que contenía HSA (sacarosa al 5% + HSA al 5% en tampón Tris 10 mM, NaCl 150 mM, y MgCl_{2} 1 mM, tampón de pH = 8,20), con glicerol al 10% en tampón de DPBS y formulaciones de sacarosa/PEG y trealosa/PEG. Se ha recomendado PEG como un buen agente de exclusión preferencial en las formulaciones (Wong y Parasrampurita, Pharmaceutical excipients for the stabilization of proteins. BioPharm, 10(11) 52-61, 1997). Se incluye en este conjunto de formulación examinar si puede proporcionar el efecto de estabilización en Adp53. Las formulaciones se llenaron en viales de liofilización de 3 ml a un volumen de llenado de 0,5 ml. Se taparon los viales o bien en condiciones atmosféricas o bien en inertización con N_{2}, para examinar cualquier efecto positivo que pueda tener la inertización con N_{2} en la estabilidad en almacenamiento a largo plazo de Adp53. Para garantizar la desgasificación adecuada de la formulación y la posterior inertización con N_{2}, se taponaron parcialmente los viales llenos con tapones de liofilización y se cargaron en la bandeja del liofilizador a TA. La cámara del liofilizador se cerró y se estableció el vacío mediante el encendido de la bomba de vacío. Se evacuó la cámara a 25 en.Hg. Entonces, se purgó la cámara completamente con N_{2} seco. La evacuación y la gasificación se repitieron dos veces para garantizar la inertización con N_{2} completa. Los viales inertizados con N_{2} se colocaron con los viales no inertizados con N_{2} a diversas condiciones de almacenamiento para la evaluación de la estabilidad en almacenamiento. La figura 33 muestra el análisis de datos durante hasta 9 meses de almacenamiento a 4ºC y TA.

Se observaron descensos estadísticamente significativos en las UFP de virus y partículas virales por HPLC para la formulación de glicerol al 10% tras 3 meses de almacenamiento tanto a 4º como a TA. No se observó degradación de virus estadísticamente significativa para el resto de las formulaciones en almacenamiento a 4ºC. Sin embargo, se observó disminución de la infectividad del virus cuando se almacenó a TA. Se necesita un mayor tiempo de almacenamiento para evaluar la eficacia de las diferentes formulaciones.

Formulación líquida n.º 2

Se evaluaron diversas combinaciones de aminoácidos, azucares, PEG y urea para la estabilización de Adp53 durante el almacenamiento prolongado. La figura 34 muestra los datos de estabilidad de 6 meses. Los resultados indican que la combinación de manitol al 5% y sacarosa al 5% con otros excipientes dieron mejor estabilidad en almacenamiento a TA. En este grupo de formulación, no se incluyeron excipientes derivados de humanos o animales.

Conjunto de formulación líquida n.º 3

Se evaluó el desarrollo de formulaciones óptimas para liofilización, para la formulación de Adp53 en forma líquida. Este enfoque sería una buena conexión entre la formulación líquida y la liofilización si puede lograrse una estabilidad de Adp53 satisfactoria usando la formulación de liofilización para el llenado líquido. Se almacenaron las muestras llenas a -20ºC y 4ºC para el estudio de estabilidad. La figura 35 muestra los datos de estabilidad de 3 meses. El virus es estable tanto a -20ºC como a 4ºC para las cuatro diferentes formulaciones. Esto está de acuerdo con los resultados del conjunto de formulación n.º 2 que sugiere que se espera mejor estabilidad del virus con la presencia tanto de manitol como de sacarosa en la formulación. Se obtuvieron datos de estabilidad en almacenamiento a mayores tiempos.

Conjunto de formulación líquida n.º 4

Se han usado detergentes en las formulaciones para una variedad de proteínas recombinantes. En este conjunto de formulaciones, se examinaron diversas concentraciones de detergentes para la formulación de Adp53. Los detergentes usados fueron no-iónicos (Tween-80) y zwitteriónicos (Chaps). La figura 36 muestra los datos de estabilidad de 6 meses. El virus es estable en almacenamiento a 4ºC. Se observó mejor estabilidad del virus en formulaciones que contenían Tween-80. La adicional acumulación de datos de estabilidad ayudará a optimizar la concentración de detergente. De manera similar al conjunto de formulación n.º 2, en este conjunto de formulaciones no se incluye una proteína exógena.

Tanto la liofilización como la formulación líquida han producido datos e información muy interesantes y prometedores. Se ha desarrollado un ciclo de liofilización y las formulaciones correspondientes para producir Adp53 liofilizado que es estable a 4ºC durante al menos 12 meses. Se está recogiendo estabilidad en almacenamiento a tiempos más prolongados. Debido al enfoque conservativo tomado en el desarrollo inicial del ciclo de liofilización, además se está investigando la reducción significativa del tiempo del ciclo de liofilización y la mejora de la eficacia del proceso de liofilización. Sorprendentemente, se generaron datos de estabilidad muy prometedores para la formulación líquida en el almacenamiento a 4ºC. Sin embargo, se necesitan datos de almacenamiento a tiempos más prolongados para evaluar la factibilidad del desarrollo de una formulación liquida para Adp53.

Todas las composiciones y/o los métodos dados a conocer y reivindicados en el presente documento pueden prepararse y ejecutarse sin excesiva experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque se han descrito las composiciones y los métodos de esta invención en lo que se refiere a realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito en el presente documento sin apartarse del concepto de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están relacionados tanto química como biológicamente, pueden sustituirse por los agentes descritos en el presente documento mientras que se lograrían los mismos o similares resultados.

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Bibliografía

La siguiente bibliografía, en la medida que proporcionan un procedimiento a modo de ejemplo u otros detalles complementarios a los expuestos en el presente documento, se cita específicamente en el presente documento como referencia.

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Claims (18)

1. Procedimiento para preparar adenovirus recombinante, comprendiendo el procedimiento:

(a)

preparar un cultivo de células productoras en un medio seleccionado;

(b)

infectar las células productoras en el cultivo con adenovirus recombinante, en el que las células productoras se infectan entre la fase semilogarítmica de crecimiento y fase estacionaria de crecimiento; y

(c)

recoger adenovirus recombinantes del cultivo celular.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se infectan las células productoras con el adenovirus entre la fase logarítmica tardía de crecimiento y la fase estacionaria de crecimiento.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se siembran las células productoras usando un conjunto esencialmente homogéneo de células.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cultivo de las células productoras incluye perfusión.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que las células productoras se perfunden a una tasa que mantendrá un nivel de glucosa de entre 0,5 y 3,0 g de glucosa/litro, en particular entre 0,7 y 2,0 g de glucosa/litro, y más en particular entre 1 a 1,5 g de glucosa/litro.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células productoras se siembran en el medio de cultivo y se permite que se adhieran a una superficie de cultivo durante entre 3 horas y 24 horas antes de iniciar la recirculación de los medios.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de infección adenoviral incluye la recirculación del medio de cultivo.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se siembra el cultivo con entre 0,5 x 10^{4} y 3 x 10^{4} células/cm^{2}, en particular entre 7,5 x 10^{3} y 2,0 x 10^{4} células/cm^{2}, y más en particular entre 9 x 10^{3} y 1,5 x 10^{4} células/cm^{2}.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se somete el adenovirus recogido a purificación y se coloca en una composición farmacéuticamente aceptable.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el adenovirus se purifica mediante etapas que incluyen cromatografía.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la etapa de cromatografía implica someter el adenovirus a más de una separación cromatográfica, o en el que la etapa de cromatografía implica someter el adenovirus a sólo una separación cromatográfica, en particular en el que la separación cromatográfica incluye cromatografía de intercambio iónico.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho adenovirus recombinante es un adenovirus de replicación deficiente que codifica para un gen terapéutico ligado operativamente a un promotor

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho adenovirus de replicación deficiente carece de al menos una parte de la región E1, en particular en el que dichas células productoras complementan la parte de la región E1 que falta.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas células productoras se seleccionan del grupo que consiste en células 293, PER.C6, 911 e IT293SF, en particular en el que dichas células productoras son células
293.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste en ras antisentido, myc antisentido, raf antisentido, erb antisentido, src antisentido, fms antisentido, jun antisentido, trk antisentido, ret antisentido, gsp antisentido, hst antisentido, bcl antisentido, abl antisentido, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV ras, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, GM-CSF, G-CSF, mda-7, timidina quinasa o p53, en particular en el que dicho gen terapéutico es un gen p53.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicho promotor es un promotor SV40-IE, VRS-LTR, de \beta-actina, CMV-IE, tardío principal de adenovirus, de polioma F9-1 o de tirosinasa.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el adenovirus se recoge mediante etapas que incluyen lisar las células productoras por medios distintos de congelación-descongelación, en particular en el que las células productoras se lisan por medio de una lisis con detergente, o en el que las células productoras se lisan por medio de lisis de adenovirus.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además purificar el adenovirus recogido para obtener una composición de adenovirus recombinante purificado que tiene uno o más de las siguientes propiedades:

(a)

un título de virus de entre 1 x 10^{9} y 1 x 10^{13} ufp/ml;

(b)

una concentración de partículas de virus de entre 1 x 10^{10} y 2 x 10^{13} partículas/ml;

(c)

un ratio partícula:ufp de entre 10 y 60;

(d)

tener menos de 50 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales;

(e)

entre 50 pg y 1 ng de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas virales,

(f)

un solo pico de elución de HPLC.