ES2338288T3 - Metodo mejorado para la produccion y purificacion de vectores adenovirales. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar adenovirus recombinante, comprendiendo el procedimiento: (a) preparar un cultivo de células productoras en un medio seleccionado; (b) infectar las células productoras en el cultivo con adenovirus recombinante, en el que las células productoras se infectan entre la fase semilogarítmica de crecimiento y fase estacionaria de crecimiento; y (c) recoger adenovirus recombinantes del cultivo celular.
Description
Método mejorado para la producción y
purificación de vectores adenovirales.
La presente invención se refiere en general a
los campos de cultivo celular y producción de virus. Más
particularmente, se refiere a métodos mejorados para el cultivo de
células de mamífero, la infección de esas células con adenovirus y
la producción de partículas de adenovirus infecciosas a partir de
las mismas.
Actualmente están evaluándose en la práctica
clínica vectores adenovirales, que llevan transgenes que pueden
transcribirse y traducirse para expresar proteínas terapéuticas,
para el tratamiento de una variedad de indicaciones de cáncer,
incluyendo canceres de pulmón y de cabeza y cuello. A medida que
avanzan los ensayos clínicos, la demanda de vectores adenovirales
de calidad clínica está aumentando drásticamente. La demanda anual
proyectada para un ensayo clínico de 300 pacientes puede alcanzar
aproximadamente 1,08 x 10^{16} partículas virales.
Tradicionalmente, los adenovirus se producen en
matraces de cultivo tisular, "factorías celulares" o RB
disponibles comercialmente. Las células infectadas por virus se
recogen y se someten a múltiple
congelaciones-descongelaciones para liberar los
virus de las células en forma de lisado celular sin procesar. El
lisado celular sin procesar (CCL) producido se purifica entonces
mediante múltiples etapas de ultracentrifugación en gradiente de
CsCl. La producción de virus notificada normalmente a partir de 100
factorías celulares de una sola bandeja es de aproximadamente 1 x
10^{4} partículas virales. Claramente, resulta inviable producir
la cantidad requerida de virus usando este procedimiento
tradicional. Deben desarrollarse nuevos procedimientos de
purificación y producción escalables y que puedan validarse para
satisfacer la demanda creciente.
El rendimiento de purificación de la
ultracentrifugación en gradiente de CsCl es tan limitado que no
puede satisfacer la demanda de vectores adenovirales para
aplicaciones de terapia génica. Por tanto, con el fin de lograr la
producción de vectores adenovirales a gran escala, deben
desarrollarse métodos de purificación distintos de la
ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Las notificaciones sobre
la purificación cromatográfica de los virus son muy limitadas, a
pesar de la extensa aplicación de cromatografía para la purificación
de proteínas recombinantes. Se han evaluado la cromatografía por
exclusión de tamaño, de intercambio iónico y de afinidad para la
purificación de retrovirus, virus de la encefalitis transmitido por
garrapatas, y los virus de plantas con grados variables de éxito
(Crooks, et al., 1990; Aboud, et al., 1982; McGrath
et al., 1978, Smith y Lee, 1978; O'Neil y Balkovic, 1993). Se
han realizado incluso menos investigaciones sobre la purificación
cromatográfica de adenovirus. Esta falta de actividad de
investigación puede ser parcialmente atribuible a la existencia del
método de purificación por ultracentrifugación en gradiente de CsCl,
eficaz, aunque no escalable, para adenovirus.
Huyghe et al. (1996) han notificado la
purificación de vectores adenovirales usando cromatografía de
intercambio iónico conjuntamente con cromatografía de afinidad de
quelación de metales. Se notificó una pureza de virus similar a la
de la ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Desafortunadamente,
sólo se recuperó el 23% de los virus tras el procedimiento de
purificación en doble columna. Los factores del procedimiento que
contribuyen a esta baja recuperación de virus son la etapa de
congelación/descongelación utilizada por los autores para lisar
células con el fin de liberar el virus de las células y el
procedimiento de purificación en dos columnas.
El documento WO 98/22588 da a conocer un método
mejorado para la producción y purificación de vectores
adenovirales.
Claramente, existe una demanda de un método
eficaz y escalable de producción de vectores adenovirales que dará
como resultado una alta producción del producto para satisfacer la
demanda creciente de tales productos. Recientemente, Blanche et
al en el documento WO 98/00524 describen métodos de producción
adenoviral que son útiles como técnica descriptiva. La publicación
PCT n.º WO 98/00524 se cita específicamente en el presente
documento por su descripción de técnicas para la producción y
purificación de adenovirus recombinantes.
La presente invención describe un nuevo
procedimiento a gran escala para la producción y purificación de
adenovirus. Este nuevo procedimiento de producción no sólo ofrece
escalabilidad y capacidad de validación sino también una pureza de
virus comparable con la lograda usando ultracentrifugación en
gradiente de CsCl.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar cantidades a gran escala de adenovirus.
De hecho, se cree que pueden producirse cantidades muy grandes de
partículas de adenovirus usando los procedimientos de la presente
invención, cantidades de hasta aproximadamente 1 x 10^{18}
partículas, y preferiblemente al menos aproximadamente 5 x
10^{14} partículas. Esto es sumamente deseable, ya que actualmente
no existen técnicas disponibles para producir las cantidades muy
grandes, comerciales de partículas de adenovirus requeridas para
aplicaciones clínicas al alto nivel de pureza necesario.
En una realización, el procedimiento
generalmente implica preparar un cultivo de células productoras
sembrando células productoras en un medio de cultivo, infectar las
células en el cultivo después que hayan alcanzado un crecimiento en
fase semilogarítmica con un adenovirus seleccionado (por ejemplo, un
adenovirus recombinante), y recoger las partículas de adenovirus
del cultivo celular. Esto es porque los inventores sorprendentemente
han descubierto que la producción máxima de virus se logra en las
células productoras cuando se infectan en la parte final del
crecimiento en fase logarítmica y antes del crecimiento
estacionario. Preferiblemente, las partículas de adenovirus así
obtenidas se someten entonces a técnicas de purificación o bien
conocidas en la técnica o bien expuestas en el presente
documento.
En ciertas realizaciones preferidas de la
presente invención, por tanto, las células productoras se infectan
con adenovirus en entre aproximadamente la fase semilogarítmica y la
fase estacionaria de crecimiento. La fase logarítmica de la curva
de crecimiento es donde las células alcanzan su máxima tasa de
división celular (es decir, crecimiento). El término fase
semilogarítmica de crecimiento se refiere al punto medio de
transición de una curva de crecimiento logarítmico. El crecimiento
en fase estacionaria se refiere al tiempo en una curva de
crecimiento (es decir, una meseta) en el que el crecimiento celular
y la muerte celular han llegado al equilibrio.
En realizaciones incluso más preferidas, las
células productoras se infectan con el adenovirus durante o después
de la fase logarítmica tardía de crecimiento y antes de la fase
estacionaria. La fase logarítmica tardía se define como el
crecimiento celular que se aproxima al final del crecimiento
logarítmico, y antes de alcanzar la fase estacionaria de
crecimiento. La fase logarítmica tardía normalmente puede
identificarse en una curva de crecimiento como un punto secundario
o terciario de inflexión que se produce a medida que se ralentiza
la fase de crecimiento logarítmico, que se aproxima al crecimiento
estacionario.
En una realización preferida de la presente
invención, las células productoras se siembran en el medio de
cultivo celular usando un conjunto esencialmente homogéneo de
células. Los inventores han descubierto sorprendentemente que el
uso de un conjunto homogéneo de células para sembrar puede
proporcionar una confluencia y una densidad celular muy mejoradas
así como una mejor maduración del virus, lo que a su vez proporciona
mayores cantidades de producción y pureza final del virus
recuperado. En efecto, la siembra a través del uso de poblaciones
celulares independientes en lugar de homogéneas, por ejemplo, a
partir de dispositivos de cultivo celular individuales usados en la
fase de expansión celular, puede dar como resultado una densidad
celular irregular, y por tanto, niveles de confluencia irregulares
en el momento de la infección. Se cree que el uso de un conjunto
homogéneo de células para la siembra supera estos problemas.
En otra realización preferida de la presente
invención, el medio de cultivo se perfunde al menos parcialmente
durante un tiempo durante el crecimiento celular de las células
productoras o tras la infección. La perfusión se usa con el fin de
mantener niveles deseados de ciertos metabolitos y para eliminar y
reducir de ese modo impurezas en el medio de cultivo. Las tasas de
perfusión pueden medirse de diversas maneras, tales como en
términos de volúmenes de sustitución/unidad de tiempo o en términos
de niveles de ciertos metabolitos que se desean mantener durante
los tiempos de perfusión. Por supuesto, el caso es normalmente que
la perfusión no se lleve a cabo en todo momento durante el cultivo,
etc., y generalmente se lleve a cabo solamente de vez en cuando
durante el cultivo según se desee. Por ejemplo, la perfusión no se
inicia normalmente hasta después de que ciertos componentes de los
medios tal como la glucosa comiencen a agotarse y necesiten ser
sustituidos.
Los inventores han descubierto que se prefieren
particularmente tasas de perfusión bajas, porque las tasas de
perfusión bajas tienden a mejorar la capacidad para obtener
partículas de virus altamente purificadas. Los inventores prefieren
definir la tasa de perfusión en términos del nivel de glucosa que se
logra o se mantiene por medio de la perfusión. Por ejemplo, en la
presente invención la concentración de glucosa en el medio se
mantiene preferiblemente a una concentración de entre
aproximadamente 0,5 g/l y aproximadamente 3,0 g/l. En una
realización más preferida, la concentración de glucosa se mantiene a
entre aproximadamente 0,70 g/l y 2,0 g/l. En una realización aún
más preferida, la concentración de glucosa se mantiene a entre
aproximadamente 1,0 g/l y 1,5 g/l.
También en ciertas realizaciones preferidas, los
inventores prefieren recircular los medios de cultivo celular
mientras que se llevan a cabo los procedimientos según la presente
invención, e incluso más preferiblemente, la recirculación se lleva
a cabo de manera continua. La recirculación es deseable porque
permite una distribución más uniforme de nutrientes por toda la
cámara de crecimiento celular.
En ciertas otras realizaciones, las células se
siembran en el medio de cultivo y se permite que se adhieran a la
superficie de cultivo durante entre aproximadamente 3 horas y
aproximadamente 24 horas antes del comienzo de la recirculación del
medio. La adhesión de células a una superficie celular permite
generalmente un crecimiento celular más consistente y uniforme y
una mayor tasa de producción de virus, lo que a su vez permite la
producción de virus de mayor calidad. Se ha encontrado por los
inventores que la recirculación algunas veces puede impedir la
adhesión celular consistente y uniforme, y que interrumpir la
recirculación durante las fases de adhesión celular puede
proporcionar ventajas significativas.
Con respecto a la siembra, en una realización
preferida de la presente invención, el medio de cultivo celular se
siembra con entre aproximadamente 0,5 x 10^{4} y aproximadamente 3
x 10^{4} células/cm^{2}, y más preferiblemente con desde
aproximadamente 1-2 x 10^{4} células/cm^{2}. El
motivo de esto es que se ha encontrado que con el fin de lograr la
expansión y el crecimiento celular máximos, lo más preferible es
inocular a la cámara de crecimiento seleccionada un número de
células menor que el que podría usarse normalmente en otras
situaciones de crecimiento celular. Los inventores han encontrado
que mayores números de células usadas en la etapa de la inoculación
celular dan como resultado una densidad celular que es demasiado
alta y puede dar como resultado un exceso de confluencia de células
en el momento de la infección viral, disminuyendo así la
producción. Un experto en la técnica podrá perfectamente determinar
que en otros tipos de sistemas de cultivo celular, la optimización
similar de la densidad de siembra para un sistema particular puede
determinarse fácilmente. No obstante, en una realización
particularmente preferida, el medio de cultivo celular se siembra
con entre aproximadamente 7,5 x 10^{3} y aproximadamente 2,0 x
10^{4} células/cm^{2}. En una realización incluso más preferida,
el medio de cultivo celular se siembra con entre aproximadamente 9 x
10^{3} y 1,5 x 10^{4} células/cm^{2}.
En otra realización preferida de la presente
invención, el adenovirus recogido se purifica y se coloca en una
composición farmacéuticamente aceptable. Una composición
farmacéuticamente aceptable se define como una que cumple la
seguridad minima requerida expuesta por la FDA u otro organismo de
administración farmacéutica similar, y puede por tanto,
administrarse de manera segura a un paciente. La presente invención
proporciona procedimientos para la purificación del adenovirus. Por
ejemplo, el adenovirus se purifica mediante etapas que incluyen la
separación cromatográfica. Mientras que más de una etapa de
cromatografía puede usarse según la presente invención para
purificar el adenovirus, esto con frecuencia dará como resultado
pérdidas significativas en términos de producción. Por tanto, los
inventores han descubierto que pueden lograrse niveles sorprendentes
de pureza cuando solamente se lleva a cabo una única etapa de
cromatografía, particularmente cuando esa etapa de cromatografía se
lleva a cabo usando cromatografía de intercambio iónico. La
cromatografía de intercambio iónico es una excelente elección para
la purificación de partículas de adenovirus debido a la presencia de
una carga negativa neta sobre la superficie de los adenovirus a pH
fisiológico, permitiendo el aislamiento de partículas de adenovirus
de alta pureza.
En realizaciones particulares de la presente
invención, el adenovirus recombinante es un adenovirus de
replicación deficiente que codifica para un gen terapéutico ligado
operativamente a un promotor. Un adenovirus de replicación
deficiente que lleva un gen terapéutico ligado a un promotor permite
la expresión controlada del gen terapéutico mediante la activación
del promotor. La elección precisa de un promotor permite además la
regulación específica de tejidos y la expresión del gen
terapéutico. En realizaciones particulares, el promotor es un
promotor SV40 IE, VRS LTR, de \beta-actina,
CMV-IE, tardío principal de adenovirus, de polioma
F9-1 o un promotor de tirosinasa.
En otras realizaciones, el adenovirus de
replicación deficiente carece de al menos una parte de la región E1
del genoma adenoviral. Se desea que los adenovirus de replicación
deficiente que carecen de una parte de la región E1 reduzcan la
reacción de toxicidad e inmunológica para células huéspedes. En otra
realización de la presente invención, las células productoras
complementan el crecimiento de los adenovirus de replicación
deficiente. Ésta es una característica importante de las células
productoras requerida para mantener un número alto de partículas
virales del adenovirus de replicación deficiente. En ciertas
realizaciones de este tipo, las células productoras son células
293, PER.C6, 911 o IT293SF. En una realización preferida, las
células productoras son células 293.
En una realización preferida de la presente
invención se contempla que el adenovirus recombinante codifique
para un gen recombinante terapéutico. Por ejemplo, el gen
terapéutico puede codificar para ras antisentido, myc
antisentido, raf antisentido, erb antisentido,
src antisentido, fms antisentido, jun
antisentido, trk antisentido, ret antisentido,
gsp antisentido, hst antisentido, bcl
antisentido, abl antisentido, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57,
p73, C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV
ras, DCC, NF-1, NF-2,
WT-1, MEN-I, MEN-II,
BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12,
GM-CSF, G-CSF,
mda-7, timidina quinasa o p53. En una realización
incluso más preferida, el gen terapéutico es p53. Una de las
anomalías más frecuentes que dan como resultado cáncer humano son
las mutaciones en p53, por tanto, la capacidad para sustituir un
gen p53 deficiente usando la presente invención es sumamente
deseable.
En otra realización particular de la presente
invención, el adenovirus se recoge mediante etapas que incluyen
lisar las células productoras por medios distintos de
congelación-descongelación. El motivo de esto es que
el método de congelación-descongelación es algo
problemático y no particularmente adecuado para la producción de
cantidades comerciales. En realizaciones preferidas las células
productoras se lisan por medio de lisis con detergente o autolisis.
La recogida del adenovirus mediante lisis con detergente y autolisis
da como resultado una recuperación de virus mucho mayor que el
procedimiento de congelación-descongelación y es,
por tanto, una mejora de la producción a gran escala de los
adenovirus.
En una realización particular de la presente
invención, el adenovirus recombinante purificado tiene una o más de
las siguientes propiedades. Por ejemplo, la propiedad puede ser un
título de virus de entre aproximadamente 1 x 10^{9} y
aproximadamente 1 x 10^{13} ufp/ml, una concentración de
partículas de virus de entre aproximadamente 1 x 10^{10} y
aproximadamente 2 x 10^{13} partículas/ml, un ratio partícula:ufp
de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60, menos de 50 ng de
BSA por 1 x 10^{12} partículas virales, entre aproximadamente 50
pg y 1 ng de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas
virales o un solo pico de elución de HPLC que consiste
esencialmente en del 98 al 99,9% del área bajo el pico. Estos
criterios seleccionan un adenovirus altamente purificado.
Además, para imponer adicionalmente límites
sobre el procedimiento de purificación del adenovirus, se desean
entre aproximadamente 5 x 10^{14} y 1 x 10^{18} partículas
virales. Además, una o más de las siguientes propiedades mejoran
adicionalmente la selección de partículas de adenovirus de alta
pureza. Por ejemplo, la propiedad puede ser un título de virus de
entre aproximadamente 1 x 10^{9} y aproximadamente 1 x 10^{13}
ufp/ml, más preferiblemente 1 x 10^{11} y aproximadamente 1 x
10^{13} ufp/ml, y lo más preferiblemente 1 x 10^{12} y
aproximadamente 1 x 10^{13} ufp/ml. Además, una concentración de
partículas de virus de entre aproximadamente 1 x 10^{10} y
aproximadamente 2 x 10^{13} partículas/ml, más preferiblemente 1 x
10^{11} y aproximadamente 2 x 10^{13} partículas/ml, y lo más
preferiblemente 1 x 10^{12} y aproximadamente 1 x 10^{13}
partículas/ml.
Adicionalmente, un ratio partícula:ufp de entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 60, más preferiblemente un
ratio partícula:ufp de entre aproximadamente 10 y aproximadamente
50, incluso más preferible un ratio partícula:ufp de entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 40, y lo más preferiblemente un
ratio partícula:ufp de entre aproximadamente 15 y aproximadamente
40.
Para limitar la concentración de BSA, es
preferible tener menos de 50 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas
virales, por ejemplo, entre aproximadamente 1 ng y 50 ng de BSA por
1 x 10^{12} partículas virales, y más preferiblemente entre
aproximadamente 5 ng y 40 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas
virales.
También se desean bajas concentraciones de
contaminación de ADN. Por tanto, es aceptable entre aproximadamente
50 pg y 1 ng de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas
virales, incluso es más preferible entre aproximadamente 50 pg y
1000 pg de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas
virales, y es lo más preferible entre aproximadamente 100 pg y 1000
pg de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas virales.
Finalmente, se desea un adenovirus que eluye como un solo pico de
HPLC, más preferiblemente es un adenovirus que eluye como un pico
de HPLC que contiene entre aproximadamente el 98 y el 99,99% del
área total bajo el pico.
Otros objetos, características y ventajas de la
presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente
descripción detallada. Sin embargo, debe entenderse, que la
descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican
realizaciones preferidas de la invención, sólo se proporcionan a
modo de ilustración, puesto que resultarán evidentes diversos
cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención para los
expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar
adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La
invención puede entenderse mejor haciendo referencia de uno o más
de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las
realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
Figura 1A y figura 1B. Perfiles de HPLC de las
disoluciones virales a partir de series de producción usando tasas
de perfusión de medio caracterizadas como "altas" (figura 1A) y
"bajas" (figura 1B).
Figura 2. El perfil de HPLC del lisado celular
sin procesar (CCL) de CellCube^{TM} (línea continua A_{260};
línea de puntos A_{280}).
Figura 3A, figura 3B, figura 3C, figura 3D y
figura 3E. Los perfiles de HPLC de disoluciones de lisis de
CellCube^{TM} usando diferentes detergentes. Figura 3A Thesit®.
Figura 3B Triton®X-100. Figura 3C.
NP-40®. Figura 3D. Brij®80. Figura 3E. Tween®20.
Concentración del detergente: 1% (p/v) temperatura de lisis:
temperatura ambiente (línea continua A_{260}; línea de puntos
A_{280}).
Figura 4A y figura 4B. Los perfiles de HPLC de
disoluciones de virus antes (figura 4A) y después (figura 4B) del
tratamiento con Benzonase (línea continua A_{260}; línea de puntos
A_{280}).
Figura 5. El perfil de HPLC de una disolución de
virus tras el tratamiento con Benzonase en presencia de NaCl 1 M
(línea continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).
Figura 6. Purificación del virus AdCMVp53 en una
condición de tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2 M,
pH = 7,5.
Figura 7. Purificación del virus AdCMVp53 en una
condición de tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2 M,
pH = 9,0.
Figura 8A, figura 8B y figura 8C. Análisis por
HPLC de fracciones obtenidas durante la purificación, figura 8A
fracción 3, figura 8B fracción 4, figura 8C fracción 8 (línea
continua A_{260}; línea de puntos A_{280}).
Figura 9. Purificación del virus AdCMVp53 en una
condición de tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,3 M,
pH = 9.
Figura 10A, figura 10B, figura 10C, figura 10D y
figura 10E. Análisis por HPLC de fracciones de virus sin procesar
obtenidas durante la purificación y virus purificado en gradiente de
CsCl. Figura 10A disolución de virus sin procesar. Figura 10B flujo
continuo. Figura 10C. Pico número 1. Figura 10D. Pico número 2.
Figura 10E. Virus purificado en CsCl (línea continua A_{260};
línea de puntos A_{280}).
Figura 11. Perfil de purificación por HPLC en
una columna de 5 cm de d.i.
Figura 12. La proteínas estructurales de
adenovirus principales detectadas en SDS-PAGE.
Figura 13. La concentración de BSA en el virus
purificado como nivel detectado del ensayo de inmunotransferencia de
tipo Western.
Figura 14. El cromatograma para el material del
lisado celular sin procesar generado de CellCube^{TM}.
Figura 15. El perfil de elución de la disolución
de virus tratada purificada usando el método de la presente
invención usando resina Toyopearl SuperQ.
Figura 16A y figura 16B. Análisis por HPLC de la
fracción de virus del protocolo de purificación. Figura 16A
perfiles de HPLC de la fracción de virus de la primera etapa de
purificación. Figura 16B perfiles de HPLC de la fracción de virus
de la segunda purificación (línea continua A_{260}; línea de
puntos A_{280}).
Figura 17. Purificación de disolución de virus
recogido con Tween® al 1% a una baja tasa de perfusión del
medio.
Figura 18. Análisis por HPLC de la fracción de
virus producida a una baja tasa de perfusión del medio.
Figura 19A, figura 19B y figura 19C. Análisis
del virus purificado en columna. Figura 19A análisis por
SDS-PAGE. Figura 19B Inmunotransferencia de tipo
Western para BSA. Figura 19C transferencia en ranura de ácido
nucleico para determinar la concentración de ácido nucleico
contaminante.
Figura 20A, figura 20B, figura 20C, figura 20D,
figura 20E y figura 20F. Estudio de la capacidad de la resina
Toyopearl SuperQ 650M. Figura 20A flujo continuo a partir de un
ratio de carga de 1:1. Figura 20B. Virus purificado a partir de un
ratio de carga de 1:1. Figura 20C flujo continuo de un ratio de
carga de 2:1. Figura 20D. Virus purificado a partir de un ratio de
carga de 2:1. Figura 20E flujo continuo a partir de un ratio de
carga de 3:1. Figura 20F. Virus purificado a partir de un ratio de
carga de 3:1 (línea continua A_{260}; línea de puntos
A_{280}).
Figura 21. Virus purificado en columna de
ultracentrifugación en CsCl isopícnica.
Figura 22A y figura 22B. Los perfiles de HPLC de
virus intactos presentes en el virus purificado en columna. A. Virus
intacto B. Virus deficiente (línea continua A_{260}; línea de
puntos A_{280}).
Figura 23. Un diagrama de flujo de producción y
purificación para AdCMVp53.
Figura 24. Cinética de la liberación de virus en
el sobrenadante en un CellCube^{TM} de 4x100.
Figura 25. Cromatograma usando resina Source 15Q
para la purificación.
Figura 26. Perfil de HPLC del producto
Ad5CMV-p53 purificado de la resina Source 15Q.
Figura 27A y figura 27B. Comparación de la
bioactividad del procedimiento original frente al procedimiento
optimizado para producir el producto Ad5CMV-p53.
Figura 28. Diagrama de flujo de producción y
purificación para el procedimiento optimizado de
Ad5CMV-p53.
Figura 29. Ciclo de liofilización para
formulaciones de adenovirus.
Figura 30A y figura 30B. Datos de estabilidad en
almacenamiento usando secado secundario a 10ºC sin inertización con
N_{2}. Figura 30A, secado secundario a 10ºC sin inertización con
N_{2} para el conjunto de formulación 10; manitol al 6%, HAS al
0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón
Tris 10 mM (pH-7,5 MgCl_{2} 1 1 mM). Figura 30B,
secado secundario a 10ºC sin inertización con N_{2} para el
conjunto de formulación 11; manitol al 5%, HAS al 0,5%, glicerol al
1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM
(pH-7,5, MgCl_{2} 1 mM).
Figura 31A y figura 31B. Datos de estabilidad en
almacenamiento usando secado secundario a 30ºC sin inertización con
N_{2}. Figura 31A, secado secundario a 30ºC sin inertización con
N_{2} para el conjunto de formulación 10; manitol al 6%, HAS al
0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón
Tris 10 mM (pH-7,5 MgCl_{2} 1 1 mM). Figura 31B,
secado secundario a 30ºC sin inertización con N_{2} para el
conjunto de formulación 11; manitol al 5%, HAS al 0,5%, glicerol al
1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM
(pH-7,5, MgCl_{2} 1 mM).
Figura 32A y figura 32B. Datos de estabilidad en
almacenamiento usando secado secundario a 30ºC con inertización con
N_{2}. Figura 32A, secado secundario a 30ºC con inertización con
N_{2} para el conjunto de formulación 10; manitol al 6%, HAS al
0,5%, glicerol al 1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón
Tris 10 mM (pH-7,5 MgCl_{2} 1 1 mM). Figura 32B,
secado secundario a 30ºC con inertización con N_{2} para el
conjunto de formulación 11; manitol al 5%, HAS al 0,5%, glicerol al
1% y diferentes porcentajes de sacarosa en tampón Tris 10 mM
(pH-7,5, MgCl_{2} 1 mM).
\newpage
Figura 33. Datos de estabilidad para el conjunto
de formulación líquida n.º 1. G: glicerol; S: sacarosa; PEG:
PEG-3500; T2: trehalosa. El glicerol está en tampón
PBS (al 10%). Otras formulaciones están en tampón tris 10 mM con
NaCl 0,15 M y MgCl_{2} mM (pH-8,2).
Figura 34A y figura 34B. Datos de estabilidad
para el conjunto de formulación líquida n.º 2. Los excipientes
están en tampón Tris 10 mM (pH-8,2) que consiste en
glicerol al 0,5%, NaCl 0,15 M y MgCl_{2} 1 mM. Las formulaciones
se almacenan a 4ºC y a temperatura ambiente bajo nitrógeno.
Figura 35. Datos de estabilidad para el conjunto
de formulación líquida n.º 3.
Figura 36. Datos de estabilidad para el conjunto
de formulación líquida n.º 4. Los excipientes están en tampón Tris
10 mM (pH-8,2) que consiste en glicerol al 1%, NaCl
0,15 M y MgCl_{2} 1 mM. Las formulaciones con virus se almacenan
a 4ºC y a temperatura ambiente bajo nitrógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha mostrado que los vectores adenovirales
pueden usarse satisfactoriamente en la expresión de genes eucariotas
y en el desarrollo de vacunas. Recientemente, estudios en animales
han demostrado que puede usarse adenovirus recombinante para
terapia génica. Estudios satisfactorios en la administración de
adenovirus recombinante a diferentes tejidos han demostrado la
eficacia de los vectores adenovirales en el tratamiento. Este éxito
ha dado lugar al uso de tales vectores en ensayos clínicos en seres
humanos. Existe actualmente un aumento de la demanda para la
producción de vectores adenovirales para su uso en diversos
tratamientos. Las técnicas disponibles actualmente son
insuficientes para satisfacer tal demanda. La presente invención
proporciona métodos para la producción de grandes cantidades de
adenovirus para su uso en tales tratamientos.
La presente invención implica un procedimiento
que se ha desarrollado para la producción y purificación de un
adenovirus recombinante de replicación deficiente. El procedimiento
de producción se basa en el uso de un biorreactor de cultivo
celular para el crecimiento celular y la producción de virus. Tras
la infección viral de las células productoras, el virus puede
recogerse mediante cualquiera de varios de métodos, incluyendo
autolisis o lisis química de virus. La disolución de virus sin
procesar recogida puede purificarse entonces usando una serie de
cromatografía de intercambio iónico simple, tras
concentración/diafiltración y tratamiento con nucleasa para reducir
la concentración del ácido nucleico contaminante en la disolución de
virus sin procesar. El virus purificado en columna tiene una pureza
equivalente con respecto a la del virus purificado mediante bandeo
por cesio. La recuperación de procedimiento total del producto de
virus es del 70% \pm 10%. Ésta es una mejora significativa sobre
los resultados notificados por Huyghe et al. (1996). En
comparación con la ultracentrifugación en gradiente de CsCl doble,
la purificación en columna tiene la ventaja de ser más consistente,
escalable, puede validarse, más rápida y menos costosa. Este nuevo
procedimiento representa una mejora significativa en la tecnología
para la fabricación de vectores adenovirales para terapia
génica.
Por tanto, la presente invención se diseña para
aprovechar estas mejoras en los sistemas de cultivo a gran escala y
purificación con el propósito de producir y purificar vectores
adenovirales. Los diversos componentes de un sistema de este tipo,
y métodos para producir adenovirus con el mismo, se exponen en
detalle a continuación.
En una realización preferida, la generación y
propagación de los vectores adenovirales dependen de una única
línea de células cooperadoras, denominada 293, que se transformó a
partir de células de riñón embrionario humano mediante fragmentos
de ADN del serotipo 5 de adenovirus (Ad5), y expresa
constitutivamente proteínas E1 (Graham et al., 1977). Puesto
que la región E3 es prescindible del genoma de Ad (Jones y Shenk,
1978), los actuales vectores de Ad, con la ayuda de las células
293, llevan ADN foráneo o bien en la región E1, la región E3 o bien
en ambas (Graham y Prevec, 1991; Bett et al., 1994).
En un primer aspecto, la presente invención
describe las líneas de células recombinantes que expresan parte del
genoma adenoviral. Estas líneas celulares pueden apoyar la
replicación de vectores recombinantes de adenovirus y los virus
auxiliares que tienen defectos en ciertos genes adenovirales, es
decir, son "permisivos" para el crecimiento de estos virus y
vectores. La célula recombinante también se denomina célula
cooperadora debido a su capacidad para complementar defectos en, y
apoyar la replicación de, vectores adenovirales de replicación
incompetente. El prototipo para una célula cooperadora adenoviral es
la línea celular 293, que contiene la región E1 adenoviral. Las
células 293 apoyan la replicación de vectores adenovirales que
carecen de funciones E1 proporcionando in trans los
elementos activos de E1 necesarios para la replicación. Otras líneas
celulares que también apoyan el crecimiento de los adenovirus que
carecen de la función E1 incluyen PER.C6 (IntroGene, NL), 911
(IntroGene, NL) e IT293SF.
Las células cooperadoras según la presente
invención se derivan de una célula de mamífero y, preferiblemente,
de una célula de primate tal como célula de riñón embrionario
humano. Aunque se prefieren diversas células de primates y humanas
o incluso son lo más preferidas las células de riñón embrionario
humano, sería aceptable en la práctica de la invención cualquier
tipo de célula que pueda apoyar la replicación del virus. Otros
tipos celulares pueden incluir, pero no se limitan a, células Vero,
células HeLa o cualquiera de las células eucariotas para las que se
hayan establecido técnicas de cultivo celular siempre que las
células sean permisivas para adenovirus. El término "permisivo
para adenovirus" significa que el adenovirus o vector adenoviral
puede completar todo el ciclo de vida del virus intracelular dentro
del entorno celular.
La célula cooperadora puede derivarse de una
línea celular existente, por ejemplo, de una línea de células 293,
o desarrollada de novo. Tales células cooperadoras expresan
los genes adenovirales necesarios para complementar in trans
deleciones en un genoma adenoviral o que apoya la replicación de un
vector adenoviral deficiente de otra manera, tales como la
funciones E1, E2, E4, E5 y tardías. Una parte particular del genoma
de adenovirus, la región E1, ya se ha usado para generar líneas
celulares de complementación. Ya sean integradas o episómicas, las
partes del genoma de adenovirus que carecen de un origen viral de
replicación, cuando se introducen en una línea celular, no se
replicarán incluso cuando la célula se superinfecte con adenovirus
de tipo natural. Además, puesto que la transcripción de la unidad
tardía principal es después de la replicación del ADN viral, las
funciones tardías del adenovirus no pueden expresarse
suficientemente a partir de una línea celular. Por tanto, las
regiones E2, que se solapan con las funciones tardías
(L1-5), se proporcionarán por los virus auxiliares
y no por la línea celular. Normalmente, una línea celular según la
presente invención expresará E1 y/o E4.
Tal como se usa en el presente documento, el
término célula "recombinante" pretende hacer referencia a una
célula en la que se ha introducido un gen, tal como un gen del
genoma adenoviral o de otra célula. Por tanto, las células
recombinantes pueden distinguirse de células que se producen de
manera natural que no contienen un gen introducido mediante
recombinación. Las células recombinantes son por tanto células que
tienen un gen o genes introducidos por "la mano del
hombre".
La replicación se determina poniendo en contacto
una capa de células no infectadas, o células infectadas con uno o
más virus auxiliares, con partículas virales, seguido de la
incubación de las células. La formación de placas virales, o zonas
libres de células en la capa celular, es el resultado de la lisis
provocada por la expresión de ciertos productos virales. La lisis
celular es indicativa de replicación viral.
Ejemplos de otras líneas celulares de mamífero
útiles que pueden usarse con un virus de replicación competente o
convertido en células huésped de complementación para su uso con el
virus de replicación deficiente son las células Vero y Hela y las
líneas celulares de ovario de hámster chino, células W138, BHK,
COS-7, HepG2, 3T3, RIN, MDCK y A549.
En ciertas realizaciones, puede ser útil emplear
sistemas de selección que impiden el crecimiento de células no
deseables. Esto puede llevarse a cabo en virtud de la transformación
permanente de una línea celular con un marcador seleccionable o
mediante la transducción o infección de una línea celular con un
vector viral que codifica para un marcador seleccionable. En
cualquier situación, el cultivo de la célula
transformada/transducida con un fármaco apropiado o compuesto
selectivo dará como resultado la potenciación, en la población
celular, de aquellas células que llevan el marcador.
Ejemplos de marcadores incluyen, pero no se
limitan a, timidina quinasa de VHS, genes de
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y
adenina fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt
o aprt, respectivamente. Además, la resistencia a
antimetabolito puede usarse como base de selección para dhfr,
que confiere resistencia a metotrexato; gpt, que confiere
resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere
resistencia al aminoglicósido G418; e hygro, que confiere
resistencia a higromicina.
La adaptación a la retirada de suero de células
dependientes del anclaje en cultivos en suspensión libre de suero,
se han usado para la producción de proteínas recombinantes (Berg,
1993) y vacunas virales (Perrin, 1995). Hasta hace poco, ha habido
pocas notificaciones sobre la adaptación de células 293A en cultivos
en suspensión libre de suero. Gilbert notificó la adaptación de
células 293A en cultivos en suspensión libre de suero para la
producción de proteínas recombinantes y adenovirus (Gilbert, 1996).
Se ha usado un método de adaptación similar para la adaptación de
células A549 en cultivo en suspensión libre de suero para la
producción de adenovirus (Morris et al., 1996). Sin embargo,
la producción de virus específico de células en las células en
suspensión adaptadas, es aproximadamente 5-10 veces
menor que aquellas logradas en las células adheridas
parentales.
Usando el procedimiento de retirada de suero
similar, los inventores han adaptado satisfactoriamente las células
293A en cultivo en suspensión libre de suero (células 293SF). En
este procedimiento, las células 293 se adaptaron a unos medios 293
disponibles comercialmente reduciendo secuencialmente la
concentración de FBS en matraces T. En resumen, la concentración
sérica inicial en los medios fue de FBS aproximadamente al 10% en
medios DMEM en matraz T-75 y las células se
adaptaron a los medios IS 293 libres de suero en matraces T
reduciendo secuencialmente la concentración de FBS en los medios.
Tras 6 pases en los matraces T-75 se estimó que el %
de FBS era de aproximadamente el 0,019% en las células 293. Las
células se subcultivaron dos veces más en los matraces T antes de
que se trasfirieran a matraces con agitación. Los resultados
descritos a continuación en el presente documento muestran que las
células crecieron satisfactoriamente en el medio libre de suero
(medio IS293, Irvine Scientific, Santa Ana, CA). El tiempo de
duplicación promedio de las células fue de 18-24 h
logrando concentraciones celulares estacionarias del orden de
4-10 x 10^{6} células/ml sin intercambio de
medio.
Se han usado dos metodologías para adaptar
células 293 en cultivos en suspensión. Graham adaptó células 293A
en cultivo en suspensión (células 293N3S) mediante 3 pases en serie
en ratones atímicos (Graham, 1987). Se encontró que las células
293N3S en suspensión podían apoyar a los vectores adenovirales E1.
Sin embargo, Garnier et al. (1994) observó que las células
293N3S tenían una fase de latencia inicial relativamente larga en
suspensión, una baja tasa de crecimiento y una fuerte tendencia a
aglomerarse.
El segundo método que se ha usado es una
adaptación gradual de células 293A en crecimiento en suspensión
(Cold Spring Harbor Laboratories, células 293S). Garnier et
al. (1994) notificó el uso de células 293S para la producción
de proteínas recombinantes a partir de vectores adenovirales. Los
autores encontraron que las células 293S se aglomeraron mucho menos
en los medios libres de calcio y que un intercambio de medio nuevo
en el momento de la infección por el virus podría aumentar
significativamente la producción de proteína. Se encontró que la
glucosa era el factor limitante en el cultivo sin intercambio de
medio.
En la presente invención, las células 293
adaptadas para crecer en condiciones libres de suero se adaptaron
en un cultivo en suspensión. Las células se transfirieron en un
cultivo en suspensión con agitación de 250 ml libre de suero
(volumen de trabajo 100 ml) para el cultivo en suspensión a una
densidad celular inicial de entre aproximadamente 1,18E+5 cv/ml y
aproximadamente 5,22E+5 células viables/ml. Los medios pueden
complementarse con heparina para evitar la agregación de las
células. Este sistema de cultivo celular permite cierto aumento de
la densidad celular mientras se mantiene la viabilidad celular. Una
vez que estas células están creciendo en el cultivo, las células se
subcultivan en los matraces con agitación durante aproximadamente 7
pases más. Puede observarse que el tiempo de duplicación de las
células se reduce progresivamente hasta que al final de los pases
sucesivos el tiempo de duplicación es aproximadamente de 1,3 días,
es decir, comparable con 1,2 días de las células en medios de FBS
al 10% en el cultivo de células adheridas. En los medios IS 293
libres de suero complementados con heparina casi todas las células
existían como células individuales que no forman agregados de
células en el cultivo en suspensión.
En cualquier sistema de cultivo celular, hay un
patrón de crecimiento característico tras la inoculación que
incluye una fase de latencia, una fase de crecimiento acelerado, una
fase exponencial o "logarítmica", una fase de aceleración de
crecimiento negativo y una meseta o fase estacionaria. Las fases
logarítmica y de meseta proporcionan información vital sobre la
línea celular, el tiempo de duplicación de la población durante el
crecimiento logarítmico, la tasa de crecimiento, y la densidad
celular máxima lograda en la meseta. En la fase logarítmica, a
medida que continúa el crecimiento, las células alcanzan su máxima
tasa de división celular. Los números de células aumentan en
relación logarítmica con el tiempo. Durante este periodo de la
multiplicación más activa, los logaritmos de los números de células
contados a intervalos cortos, representados frente al tiempo,
producen una línea recta. Haciendo un recuento en un momento
específico y un segundo recuento tras un intervalo durante la fase
logarítmica de crecimiento y conociendo el número de unidades de
tiempo transcurridas, puede calcularse el número total de
divisiones celulares o duplicaciones, y tanto la tasa de crecimiento
como el tiempo de generación. En el plazo de pocas horas o días
tras el comienzo de la fase logarítmica, la tasa de división
celular empieza a disminuir y algunas de las células empiezan a
morir. Esto se refleja en la curva de crecimiento por un
aplanamiento gradual de la línea. Finalmente, la tasa de células que
mueren es esencialmente igual a la tasa de células que se dividen,
y la población viable total permanece igual durante un periodo de
tiempo. Esto se conoce como la fase estacionaria o de meseta y se
representa en la curva de crecimiento como un aplanamiento de la
línea en el que la pendiente se aproxima a cero.
La medición del tiempo de duplicación de la
población puede usarse para cuantificar la respuesta de las células
a diferentes condiciones de cultivo inhibidoras o estimulantes tales
como variaciones en la concentración de nutrientes, efectos
hormonales, o fármacos tóxicos. También es una buena monitorización
del cultivo durante el pase en serie y permite el cálculo de la
producción celular y el factor de dilución requerido en el
subcultivo.
El tiempo de duplicación de la población, es un
valor promedio y describe el resultado neto de un intervalo amplio
de tasas de división celular, incluyendo cero, dentro del cultivo.
El tiempo de duplicación también diferirá con los tipos celulares,
condiciones de cultivo y recipientes de cultivo variables. Los
puntos de tiempo individuales son insatisfactorios para monitorizar
el crecimiento cuando la forma de la curva de crecimiento celular
no se conoce. Por tanto, es importante determinar la curva de
crecimiento para cada tipo celular que se usa, en las condiciones
que se usan para el cultivo celular. Las curvas de crecimiento
típicas son de forma sigmoidea, representando la primera parte de
la curva la fase de latencia, representando la parte central de la
curva la fase logarítmica, y representando la última parte de la
curva la fase de meseta. La fase logarítmica es cuando las células
crecen a la tasa más alta, y a medida que las células alcanzan su
densidad de saturación, su crecimiento se ralentizará y el cultivo
entrará en la fase de meseta. Una descripción detallada de la teoría
y las técnicas de cultivo celular puede encontrarse en Freshney,
1992 y Freshney, 1987.
Un aspecto importante de la presente invención
es la infección de las células productoras con adenovirus
recombinante, en un momento apropiado para lograr la máxima
producción de virus. Los inventores han encontrado que la máxima
producción de virus, se obtiene cuando las células productoras se
infectan entre aproximadamente cuando las células alcanzan el
primer punto de inflexión en la fase logarítmica de la curva de
crecimiento celular, es decir, la fase semilogarítmica, y antes del
2º punto de inflexión en la fase de meseta de la curva de
crecimiento celular, es decir, fase de semimeseta. Este intervalo
puede determinarse fácilmente para cualquier tipo celular y
cualquier condición de cultivo con cualquier aparato de cultivo
celular. Los puntos de inflexión sobre una curva de crecimiento
celular se encuentran cuando la forma de la línea cambia de una
forma convexa a una cóncava, o de una forma cóncava a una
convexa.
Para la mayoría de las curvas de crecimiento
representadas en escalas semilogarítmicas, la fase logarítmica de
crecimiento puede representarse aproximadamente mediante un aumento
lineal en la pendiente de la línea frente al tiempo. Es decir, en
cualquier intervalo corto entre dos puntos en la línea de la fase
logarítmica de la curva, el logaritmo del número de células aumenta
de una forma lineal en relación con el tiempo. Por tanto, la fase
semilogarítmica puede definirse aproximadamente como el punto o
intervalo dentro de la fase logarítmica en el que las células se
dividen a su tasa máxima, y el aumento en los logaritmos del número
de células es lineal con respecto al tiempo. La fase logarítmica
tardía puede definirse como aproximadamente el punto o intervalo de
tiempo en el que se ha ralentizado la tasa de división celular, y el
logaritmo del número de células ha dejado de aumentar de una forma
lineal con respecto al tiempo. Cuando se mira una curva de
crecimiento, esta zona podría representarse por la caída o el
aplanamiento gradual de la pendiente de la línea. En la fase
estacionaria temprana, la tasa del crecimiento celular disminuye y
se acerca más a la tasa de muerte celular y, por tanto, la
pendiente de la línea en la curva de crecimiento es incluso menor
que la de la fase logarítmica tardía. En la fase semiestacionaria,
la tasa de crecimiento celular es aproximadamente igual a la tasa
de división celular y, por tanto, la línea en la curva de
crecimiento es relativamente plana y tiene una pendiente que se
aproxima a cero. Se entenderá que el experto puede formular curvas
de crecimiento para cualquier línea celular de este tipo e
identificar las regiones mencionadas anteriormente en la curva.
La capacidad para producir vectores virales
infecciosos es cada vez más importante para la industria
farmacéutica, especialmente en el contexto de la terapia génica. En
la última década, los avances en biotecnología han dado lugar a la
producción de un número de vectores virales importantes que tiene
usos potenciales como máquinas de producción de proteínas, vacunas
y tratamientos. El uso de vectores virales en cultivos de mamíferos
tiene ventajas con respecto a las proteínas producidas en huésped
bacterianos u otros de forma de vida inferior en su capacidad para
procesar de manera postraduccional, estructuras de proteínas
complejas tales como el plegamiento dependiente de disulfuro y la
glicosilación.
El desarrollo del cultivo celular para la
producción de vectores de virus se ha visto ayudado enormemente por
el desarrollo en biología molecular de técnicas para el diseño y la
construcción de sistemas de vectores sumamente eficaces en cultivos
celulares de mamíferos, una batería de marcadores de selección
útiles, esquemas de amplificación génica y un entendimiento más
amplio de los mecanismos bioquímicos y celulares implicados en
conseguir la molécula biológicamente activa final a partir del
vector introducido.
Frecuentemente, no se consideraron los factores
que afectan al lado posterior (en este caso, más allá de la lisis
celular) de la ampliación a escala de fabricación, antes de
seleccionar la línea celular como huésped para el sistema de
expresión. Además, el desarrollo de sistemas de biorreactores
capaces de mantener cultivos de densidad muy alta durante periodos
de tiempo prolongados no ha cumplido con la demanda creciente para
aumentar la producción a costes más bajos.
La presente invención aprovechará la tecnología
de biorreactores recientemente disponible. Hacer crecer células
según la presente invención en un biorreactor que permite una
producción a gran escala de células biológicamente activas de
manera total que pueden infectarse mediante los vectores
adenovirales de la presente invención. Haciendo funcionar el
sistema a una baja tasa de perfusión y aplicando un esquema
diferente para la purificación de las partículas infecciosas, la
invención proporciona una estrategia de purificación que es
fácilmente escalable para producir grandes cantidades de producto
altamente purificado.
Los biorreactores se han usado ampliamente para
la producción de productos biológicos a partir de cultivos de
células animales dependientes tanto de suspensión como de anclaje.
Las células productoras más ampliamente usadas para la producción
de vectores adenovirales son las células de riñón embrionario humano
dependientes de anclaje (células 293). Los biorreactores que van a
desarrollarse para la producción de vectores adenovirales deben
tener la característica de un área superficial de cultivo específica
de alto volumen con el fin de lograr una alta densidad de células
productoras y una alta producción de virus. El cultivo celular en
microportadores en un biorreactor de tanque agitado proporciona un
área superficial de cultivo específica de muy alto volumen y se ha
usado para la producción de vacunas virales (Griffiths, 1986).
Además, industrialmente se ha demostrado que los biorreactores de
tanque agitado son escalables. El sistema de cultivo celular
Cellcube^{TM} de múltiples placas fabricado por
Corning-Costar también ofrece un área superficial de
cultivo específica de muy alto volumen. Las células crecen sobre
ambos lados de las placas de cultivo, selladas herméticamente entre
sí en forma de un cubo compacto. A diferencia de los biorreactores
de tanque agitado, la unidad de cultivo Cellcube^{TM} es
desechable. Esto es muy deseable en la producción de etapa temprana
del producto clínico debido a la reducción de los costes de gastos
de capital, control de calidad y garantía de calidad asociados con
los sistemas desechables. Considerando las ventajas ofrecidas por
los diferentes sistemas, se evaluaron tanto el sistema
Cellcube^{TM} como el biorreactor de tanque agitado para la
producción de adenovirus.
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La tabla 1 enumera varias técnicas a modo de
ejemplo para el cultivo celular y la producción de partículas
virales. Actualmente, no hay métodos empleados que den como
resultado tanto una alta pureza como un alto número de partículas
virales. Por tanto, los siguientes métodos se consideran en
combinación con el procedimiento a gran escala para la producción y
purificación de adenovirus descrito en la presente invención.
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Las células de animales y seres humanos pueden
propagarse in vitro de dos modos: como células no
dependientes de anclaje que crecen libremente en suspensión por
todo el volumen del cultivo; o como células dependientes de anclaje
que requieren la adhesión a un sustrato sólido para su propagación
(es decir, un tipo monocapa de crecimiento celular).
Los cultivos no dependientes de anclaje o en
suspensión a partir de líneas celulares establecidas continuas son
los medios de producción a gran escala de células y de productos
celulares más ampliamente usados. El cultivo en suspensión a gran
escala basado en la tecnología de fermentación microbiana
(bacteriana y de levaduras), tiene claras ventajas para la
fabricación de productos celulares de mamíferos. Los procedimientos
son de funcionamiento relativamente simple y fáciles de ampliar a
escala. Pueden proporcionarse condiciones homogéneas en el reactor
lo que permite una monitorización y control precisos de la
temperatura, el oxígeno disuelto y el pH, y garantizan que puedan
tomarse las muestras representativas del cultivo.
Sin embargo, las células cultivadas en
suspensión no siempre pueden usarse en la producción de productos
biológicos. Aún se considera que los cultivos en suspensión tienen
potencial tumorígeno y, por tanto, su uso como sustratos para la
producción impone límites sobre el uso de los productos resultantes
en aplicaciones en seres humanos y veterinarias (Petricciani, 1985;
Larsson, 1987). Los virus propagados en los cultivos en suspensión
en contraposición a los cultivos dependientes de anclaje algunas
veces pueden provocar cambios rápidos en los marcadores virales, lo
que lleva a reducir la inmunogenicidad (Bahnemann, 1980).
Finalmente, incluso algunas veces las líneas celulares
recombinantes pueden secretar cantidades considerablemente mayores
de productos cuando se propagan como cultivos dependientes de
anclaje en comparación con la misma línea celular en suspensión
(Nilsson y Mosbach, 1987). Por estos motivos, se usan ampliamente
diferentes tipos de células dependientes de anclaje en la producción
de diferentes productos biológicos.
Se llevó a cabo el cultivo en suspensión a gran
escala de células de mamífero en tanques agitados. Se adaptaron los
instrumentos y los controles para los biorreactores, junto con el
diseño de los fermentadores, a partir de aplicaciones microbianas
relacionadas. Sin embargo, al reconocer la creciente demanda para
controlar la contaminación en los cultivos de mamífero que crecen
más lentamente, se implementaron rápidamente diseños asépticos
mejorados, mejorando la fiabilidad de estos reactores. Los
instrumentos y los controles son básicamente los mismos que se
encuentran en otros fermentadores e incluyen controles de agitación,
temperatura, oxígeno disuelto y pH. Están disponibles sondas y
autoanalizadores más avanzados para las mediciones en línea y fuera
de línea de turbidez (una función de las partículas presentes),
capacitancia (una función de las células viables presentes),
glucosa/lactato, carbonato/bicarbonato y dióxido de carbono. Las
densidades celulares máximas que pueden obtenerse en los cultivos
en suspensión son relativamente bajas a aproximadamente
2-4 x 10^{6} células/ml de medio (que es menos
que 1 mg de peso seco celular por ml), muy por debajo de los números
logrados en la fermentación microbiana.
En la industria, dos diseños de reactores de
cultivo en suspensión son los más ampliamente usados debido a su
simplicidad y robustez de funcionamiento, el reactor agitado y el
reactor de agitación con aire. El diseño del reactor agitado se ha
usado satisfactoriamente en una escala de 8000 litros de capacidad
para la producción de interferón (Phillips et al., 1985;
Mizhari, 1983). Las células crecen en un tanque de acero inoxidable
con un ratio de altura con respecto a diámetro de 1:1 a 3:1. El
cultivo se mezcla normalmente con uno o más agitadores, a base de
discos de paletas o patrones de propulsor marino. Se han descrito
sistemas agitadores que ofrecen menos esfuerzos cortantes que las
paletas. La agitación puede activarse o bien directamente o bien
indirectamente mediante accionamientos acoplados magnéticamente. Los
accionamientos indirectos reducen el riesgo de contaminación
microbiana a través de juntas herméticas en los ejes de los
agitadores.
El reactor de agitación con aire, también
descrito inicialmente para la fermentación microbiana y adaptado
después para el cultivo de células de mamífero, se basa en una
corriente de gas tanto para mezclar como para oxigenar el cultivo.
La corriente de gas entra en una sección de elevación del reactor y
activa la circulación. El gas se desprende en la superficie de
cultivo, lo que provoca que el líquido más denso libre de burbujas
de gas se desplace hacia abajo en la sección de bajada del reactor.
La principal ventaja de este diseño es la simplicidad y la ausencia
de necesidad de mezclado mecánico. Normalmente, el ratio de altura
con respecto a diámetro es de 10:1. El reactor de agitación con
aire puede ampliarse a escala de manera relativamente fácil, tiene
una buena transferencia de masa de los gases y genera esfuerzos
cortantes relativamente bajos.
La mayoría de los cultivos en suspensión a gran
escala se hacen funcionar como procedimientos discontinuos o
semicontinuos porque son los de funcionamiento y ampliación a escala
más sencillos. Sin embargo, están disponibles procedimientos
continuos basados en principios de quimiostato o perfusión.
Un procedimiento discontinuo es un sistema
cerrado en el que se observa un perfil de crecimiento típico. Una
fase de latencia va seguida de las fases exponencial, estacionaria y
declive. En un sistema de este tipo, el entorno cambia
continuamente a medida que se agotan los nutrientes y se acumulan
los metabolitos. Esto hace del análisis de los factores que
influyen en el crecimiento celular y la productividad y, por tanto,
la optimización del procedimiento, una tarea compleja. La
productividad de un procedimiento discontinuo puede aumentarse
mediante la alimentación controlada de los nutrientes clave para
prolongar el ciclo de crecimiento. Un procedimiento semicontinuo de
este tipo todavía es un sistema cerrado porque no se eliminan las
células, los productos ni los productos de desecho.
En lo que todavía es un sistema cerrado, puede
lograrse la perfusión del medio nuevo a través del cultivo
reteniendo las células con una variedad de dispositivos (por
ejemplo, filtro de centrifugación de malla fina, filtros de
membrana de placa plana o fibra hueca, tubos de sedimentación). Los
cultivos en filtros de centrifugación pueden producir densidades
celulares de aproximadamente 5 x 10^{7} células/ml. Un sistema
abierto verdadero y el procedimiento de perfusión más simple es el
quimiostato en el que hay un flujo de entrada de medio y un flujo
de salida de células y productos. El medio de cultivo se alimenta al
reactor a una tasa predeterminada y constante que mantiene la tasa
de dilución del cultivo a un valor menor que la tasa de crecimiento
específico máxima de las células (para evitar el arrastre de la
masa celular desde el reactor). El fluido de cultivo que contiene
células y productos celulares y subproductos se elimina a la misma
tasa.
Tradicionalmente, los cultivos celulares
dependientes de anclaje se propagan en el fondo de pequeños
recipientes de vidrio o plástico. E ratio de superficie con
respecto a volumen restringida ofrecida por las técnicas clásicas y
tradicionales, adecuada para escala de laboratorio, ha creado un
cuello de botella en la producción de células y productos celulares
a gran escala. En un intento por proporcionar sistemas que ofrezcan
grandes superficies accesibles para el crecimiento celular en
pequeño volumen de cultivo, se han propuesto varias técnicas: el
sistema de botellas rotativas, el propagador de placas apiladas, las
botellas de película en espiral, el sistema de fibra hueca, el
lecho fijo, el sistema intercambiador de placas y el rollo de tubos
de membrana. Puesto que estos sistemas son de naturaleza no
homogénea y algunas veces se basan en múltiples procedimientos,
sufren de las siguientes deficiencias, potencial limitado para
ampliar a escala, dificultades en la toma de las muestras
celulares, potencial limitado para medir y controlar los parámetros
clave del procedimiento y dificultad en mantener las condiciones
del entorno homogéneas durante todo el cultivo.
A pesar de estas desventajas, la botella
rotativa es un procedimiento usado comúnmente para la producción
celular dependiente de anclaje a gran escala. Al ser poco más que un
matraz T con diferente forma, grande, la simplicidad del sistema lo
hace muy fiable y, por tanto, atractivo. Están disponibles robots
completamente automatizados, que pueden manipular miles de botellas
rotativas por día, eliminando por tanto el riesgo de contaminación
e inconsistencia asociado con la manipulación humana intensa
requerida de lo contrario. Con frecuentes cambios de medios, los
cultivos en botellas rotativas pueden lograr densidades celulares de
cerca de 0,5 x 10^{6} células/cm^{2} (que corresponden a
aproximadamente 10^{9} células/botella o casi 10^{7} células/ml
de medios de cultivo).
En un esfuerzo por superar las deficiencias de
los procedimientos de cultivo dependiente de anclaje tradicionales,
van Wezel (1967) desarrolló el concepto de los sistemas de cultivo
en microportadores. En este sistema, las células se propagan sobre
la superficie de pequeñas partículas sólidas suspendidas en el medio
de crecimiento mediante agitación lenta. Las células se adhieren a
los microportadores y crecen gradualmente hasta confluencia sobre
la superficie del microportador. De hecho, este sistema de cultivo a
gran escala mejora el cultivo dependiente de adhesión desde un
procedimiento de disco individual hasta un procedimiento de unidad
en el que se han reunido el cultivos tanto en monocapa como en
suspensión. Por tanto, combinar la superficie necesaria para que una
célula crezca con las ventajas del cultivo en suspensión homogéneo,
aumenta la producción.
Las ventajas de los cultivos en microportadores
con respecto a la mayoría de los demás métodos de cultivo
dependiente de anclaje, a gran escala, son múltiples. En primer
lugar, los cultivos en microportadores ofrecen un alto ratio de
superficie con respecto al volumen (variable cambiando la
concentración de portador) lo que lleva a producciones de alta
densidad celular y un potencial para obtener productos celulares
altamente concentrados. La producción celular es de hasta
1-2 x 10^{7} células/ml cuando los cultivos se
propagan en un modo de reactor perfundido. En segundo lugar, las
células pueden propagarse en recipientes de un procedimiento de
unidad en lugar de usar muchos recipientes pequeños de productividad
baja (es decir, matraces o placas). Esto da como resultado
utilización de nutrientes mucho mejor y un ahorro considerable de
medio de cultivo. Además, la propagación en un reactor individual
lleva a la reducción de la necesidad del espacio de instalación y
en el número de etapas de manipulación requeridas por célula,
reduciendo de ese modo el coste de mano de obra y el riesgo de
contaminación. En tercer lugar, el cultivo en suspensión en
microportadores homogéneo y bien mezclado hace posible monitorizar
y controlar las condiciones del entorno (por ejemplo, pH, pO_{2} y
la concentración de los componentes del medio), llevado así a una
propagación celular más reproducible y mayor recuperación del
producto. En cuarto lugar, es posible tomar una muestra
representativa para la observación microscópica, pruebas químicas o
enumeración. En quinto lugar, puesto que los microportadores
sedimentan rápidamente fuera de la suspensión, puede hacerse uso
con relativa facilidad de un procedimiento semidiscontinuo o la
recogida de células. En sexto lugar, el modo de la propagación en
cultivo dependiente de anclaje sobre los microportadores hace
posible usar este sistema para otras manipulaciones celulares, tales
como transferencia celular sin el uso de enzimas proteolíticas,
cocultivo de células, trasplante en animales y perfusión del
cultivo usando decantadores, columnas, lechos fluidizados o fibras
huecas para mantener el microportador. En séptimo lugar, los
cultivos en microportadores se amplían a escala con relativa
facilidad usando equipo convencional usado para el cultivo de
células microbianas y de animales en suspensión.
Un método que ha demostrado ser particularmente
útil para el cultivo de células de mamífero es la
microencapsulación. Las células de mamífero se mantienen dentro de
una membrana de hidrogel semipermeable. Una membrana porosa se
forma alrededor de las células permitiendo el intercambio de
nutrientes, gases y productos metabólicos con el medio en masa que
rodea a la cápsula. Se han desarrollado varios métodos que son
benévolos, rápidos y no tóxicos y en los que la membrana resultante
es suficientemente porosa y fuerte para sostener la masa celular en
crecimiento durante todo el periodo del cultivo. Todos estos métodos
se basan en alginato soluble gelificado mediante el contacto por
gotas con una disolución que contiene calcio. Lim (1982, patente
estadounidense nº 4.352.883, incorporado al presente documento como
referencia), describe células concentradas en una disolución de
alginato de sodio aproximadamente al 1% que se fuerza a través de un
orificio pequeño, para formar gotas, y que se liberan en una
disolución de cloruro de calcio aproximadamente al 1%. Las gotas
entonces se echan en una capa de ácido poliamino que se une
iónicamente a la superficie de alginato. Finalmente, el alginato se
licua de nuevo tratando la gota con un agente quelante para eliminar
los iones de calcio. Otros métodos usan células en una disolución
de calcio que va a echarse en una disolución de alginato, creando
así una esfera de alginato hueca. Un enfoque similar implica
células en una disolución de quitosano que también se echa en
alginato, para crear esferas huecas.
Las células microencapsuladas se propagan
fácilmente en reactores de tanque agitado y, con tamaño de perla en
el intervalo de 150-1500 \mum de diámetro, se
retienen fácilmente en un reactor perfundido usando una criba de
malla fina. El ratio de volumen de la cápsula con respecto al
volumen total de los medios puede mantenerse desde tan denso como
1:2 hasta 1:10. Con densidades celulares intracapsulares de hasta
10^{8}, la densidad celular eficaz en el cultivo es de
1-5 x 10^{7}.
Las ventajas de la microencapsulación con
respecto a otros procedimientos incluye la protección de los efectos
perjudiciales de las tensiones de corte que se producen a partir
del burbujeo y la agitación, la capacidad de retener fácilmente las
perlas con el propósito de usar sistemas perfundidos, la ampliación
a escala es relativamente sencilla y la capacidad para usar las
perlas para su implantación.
La presente invención incluye células que son de
naturaleza dependiente de anclaje. Las células 293, por ejemplo,
son dependientes de anclaje, y cuando crecerán en suspensión, las
células adherirán entre sí y crecerán en aglomerados,
eventualmente, ahogando las células en el núcleo interno de cada
aglomerado a medida que alcanzan un tamaño que deja a las células
del núcleo insostenibles por las condiciones de cultivo. Por tanto,
es necesario un medio eficaz de cultivo a gran escala de células
dependientes de anclaje con el fin de emplear eficazmente estas
células para generar grandes cantidades de adenovirus.
Los sistemas de adhesión perfundidos son una
forma preferida de la presente invención. La perfusión se refiere a
un flujo continuo a una tasa constante, a través o por encima de una
población de células (de una disolución de nutrientes fisiológica).
Esto implica la retención de las células dentro de la unidad de
cultivo en contraposición al cultivo de flujo continuo que arrastra
las células con los medios retirados (por ejemplo, quimiostato). La
idea de la perfusión se ha conocido desde el comienzo del siglo, y
se ha aplicado para mantener pequeñas piezas de tejido viables para
la observación microscópica extendida. La técnica se inició para
imitar el medio de las células in vivo en el que las células
se suministran continuamente con sangre, linfa u otros fluidos
corporales. Sin la perfusión, las células en cultivo van a través de
las fases alternantes de alimentación y privación de alimentación,
limitando así la expresión completa de su crecimiento y potencial
metabólico.
El uso actual del cultivo perfundido es en
respuesta a la exposición de las células en crecimiento a altas
densidades (es decir, 0,1-5 x 10^{8} células/ml).
Con el fin de aumentar las densidades más allá de
2-4 x 10^{6} células/ml, el medio debe sustituirse
constantemente con un suministro nuevo con el fin de compensar las
deficiencias nutricionales y eliminar los productos tóxicos. La
perfusión permite un control mucho mejor del entorno de cultivo
(pH, pO_{2}, niveles de nutrientes, etc.) y es un medio para
aumentar significativamente la utilización del área superficial
dentro de un cultivo para la adhesión celular.
El desarrollo de un reactor de lecho fijo
perfundido usando una matriz de lecho de un material textil no
tejido ha proporcionado un medio para mantener un cultivo de
perfusión a densidades que superan las 10^{8} células/ml del
volumen de lecho (CelliGen^{TM}, New Brunswick Scientific, Edison,
NJ: Wang et al., 1992; Wang et al., 1993; Wang et
al., 1994). Descrito en resumen, este reactor comprende un
reactor mejorado para cultivar células tanto dependientes como no
dependientes de anclaje. El reactor se diseña como un lecho fijo
con un medio para proporcionar recirculación interna.
Preferiblemente, se coloca un portador de matriz de fibra en una
cesta dentro del recipiente del reactor. Una parte superior e
inferior de la cesta tiene orificios, permitiendo que el medio
fluya a través de la cesta. Un impulsor especialmente diseñado
proporciona la recirculación del medio a través del espacio ocupado
por la matriz de fibra para asegurar un suministro uniforme de
nutriente y la eliminación de desechos. Esto asegura
simultáneamente que se suspende en el medio una cantidad
insignificante de la masa celular total. La combinación de la cesta
y la recirculación también proporciona un flujo libre de burbujas
de medio oxigenado a través de la matriz de fibra. La matriz de
fibra es una estructura no tejida que tiene un diámetro de
"poro" de desde 10 \mum hasta 100 \mum, proporcionando un
volumen interno alto con volúmenes de poro que corresponden a de 1
a 20 veces los volúmenes de las células individuales.
En comparación con otros sistemas de cultivo,
este enfoque proporciona varias ventajas significativas. Con un
portador de la matriz de fibra, las células se protegen contra la
tensión mecánica de la agitación y la espumación. El flujo libre de
medio a través de la cesta proporciona a las células niveles
regulados óptimos de oxígeno, pH y nutrientes. Los productos pueden
eliminarse de manera continua del cultivo y los productos recogidos
están libres de células y pueden producirse en un medio con bajo
contenido en proteína lo que facilita las etapas de purificación
posteriores. Además, el diseño único de este sistema de reactor
proporciona una manera más fácil para ampliar a escala el reactor.
Actualmente, se dispone de tamaños de hasta 30 litros. Versiones de
cien litros y 300 litros están en desarrollo y los cálculos teóricos
apoyan un reactor de hasta 1000 litros. Esta tecnología se explica
en detalle en el documento WO 94/17178 (4 de agosto de 1994,
Freedman et al.), que se incorpora al presente documento
como referencia en su totalidad.
El módulo Cellcube^{TM}
(Corning-Costar) proporciona un área superficial
estirénica grande para la inmovilización y el crecimiento de
células adheridas al sustrato. Éste es un dispositivo de un solo uso
estéril encapsulado integralmente que tiene una serie de placas de
cultivo paralelas unidas para crear espacios de flujo laminar
sellados finos entre las placas adyacentes.
El módulo Cellcube^{TM} tiene orificios de
entrada y salida que están opuestos diagonalmente entre sí y ayudan
a regular el flujo de los medios. Durante los primeros pocos días de
crecimiento el cultivo generalmente se satisface mediante los
medios contenidos dentro del sistema tras la siembra inicial. La
cantidad de tiempo entre la siembra inicial y el comienzo de la
perfusión de los medios depende de la densidad de las células en el
inóculo de siembra y la tasa de crecimiento celular. La medición de
la concentración de nutrientes en los medios en circulación es un
buen indicador del estado del cultivo. Cuando se establece un
procedimiento, puede ser necesario monitorizar la composición de
los nutrientes a una variedad de diferentes tasas de perfusión para
determinar los parámetros de funcionamiento más económicos y
productivos.
Las células dentro del sistema alcanzan una
densidad de disolución más alta (células/ml) que en sistemas de
cultivo tradicionales. Muchos medios basales usados normalmente se
diseñan para apoyar 1-2 x 10^{6} células/ml/día.
Un Cellcube^{TM} típico, ejecutado con una superficie de 85.000
cm^{2}, contiene aproximadamente 6 l de medios dentro del módulo.
La densidad celular con frecuencia supera las 10^{7} células/ml en
el recipiente de cultivo. En confluencia, se requieren por día
2-4 volúmenes de reactor de los medios.
El momento y los parámetros de la fase de
producción de los cultivos dependen del tipo y el uso de una línea
celular particular. Muchos cultivos requieren unos medios diferentes
para la producción que los que se requieren para la fase de
crecimiento del cultivo. La transición de una fase a otra
probablemente requerirá de múltiples etapas de lavado en cultivos
tradicionales. Sin embargo, el sistema Cellcube^{TM} emplea un
sistema de perfusión. Uno de los beneficios de un sistema de este
tipo es la capacidad de proporcionar una transición suave entre
diversas fases de funcionamiento. El sistema de perfusión elimina la
necesidad de etapas de lavado tradicionales que pretenden eliminar
los componentes séricos en un medio de crecimiento.
En una descripción a modo de ejemplo de la
presente invención, el sistema Cellcube^{TM} se usa para hacer
crecer células transfectadas con AdCMVp53. Se inocularon células 293
en el Cellcube^{TM} según la recomendación del fabricante. Las
densidades celulares de inoculación estaban en el intervalo de
1-1,5 x 10^{4}/cm^{2}. Se permitió que las
células crecieran durante 7 días a 37ºC en condiciones de cultivo de
pH = 7,20, DO = 60% de saturación de aire. La tasa de la perfusión
del medio se reguló según la concentración de glucosa en el
Cellcube^{TM}. Un día antes de la infección viral, el medio para
la perfusión se cambió de un tampón que comprendía FBS al 10% a un
tampón que comprendía FBS al 0%. En el día 8, se infectaron las
células con el virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5.
La perfusión del medio se detuvo durante 1 hora inmediatamente tras
la infección, luego se reanudó durante el periodo restante de la
fase de producción de virus. Se recogió el cultivo
45-48 horas tras la infección. Naturalmente estas
condiciones de cultivo son a modo de ejemplo y pueden variarse
según las necesidades nutricionales y los requisitos de crecimiento
de una línea celular particular. Tal variación puede realizarse sin
excesiva experimentación y se encuentra dentro de la habilidad del
experto en la técnica.
En realizaciones particulares, los vectores
adenovirales para terapia génica se producen a partir de cultivos
de células 293 (células 293A) dependientes de anclaje tal como se
describió anteriormente. La ampliación a escala de la producción de
vectores adenovirales está limitada por la dependencia de anclaje de
las células 293A. Para facilitar la ampliación a escala y
satisfacer la demanda futura de vectores adenovirales, se han
consagrado esfuerzos significativos al desarrollo de procedimientos
de producción alternativos que sean susceptibles de ampliación a
escala. Los métodos incluyen hacer crecer células 293A en cultivos
en microportadores y la adaptación de las células productoras 293A
en cultivos en suspensión. Se han descrito anteriormente las
técnicas de cultivo en microportadores. Esta técnica se basa en la
adhesión de las células productoras sobre las superficies de
microportadores que se suspenden en medios de cultivo mediante
agitación mecánica. El requisito de adhesión celular puede
presentar algunas limitaciones para la escalabilidad de cultivos en
microportadores.
Hasta la presente solicitud, no ha habido
notificaciones sobre el uso de las células 293 en suspensión para
la producción de vectores adenovirales para terapia génica. Además,
las células 293 en suspensión notificadas requieren la presencia de
FBS al 5-10% en los medios de cultivo para el
crecimiento celular y la producción de virus óptimos.
Históricamente, la presencia de proteínas de fuente bovina en medios
de cultivo celular ha sido una preocupación regulatoria, de manera
especial recientemente debido al brote de la Encefalopatía
Espongiforme Bovina (EEB) en algunos países. Debe desarrollarse un
procedimiento de purificación posterior riguroso y complejo para
eliminar las proteínas contaminantes y cualquier virus adventicio
del producto final. Se considera que el desarrollo de cultivo en
suspensión 293 libre de suero va a ser una mejora del procedimiento
principal para la producción de vector adenoviral para terapia
génica.
Los resultados de la producción de virus en
matraces rotativos y un biorreactor de tanque agitado de 3 l indican
que la productividad de virus específica de células de las células
293SF fue de aproximadamente 2,5 x 10^{4} pv/célula, que es
aproximadamente el 60-90% de la de las células 293A.
Sin embargo, debido a la concentración de células estacionarias
mayor, la productividad de virus volumétrica a partir del cultivo
293SF es esencialmente equivalente a la del cultivo celular 293A.
Los inventores también observaron que la producción de virus aumentó
significativamente llevando a cabo un intercambio del medio fresco
en el momento de la infección por virus. Los inventores van a
evaluar los factores limitantes en el medio. Estos hallazgos
permiten un procedimiento escalable, eficaz y que puede validarse
fácilmente para la producción de vector adenoviral. Este método de
adaptación no se limita solamente a células 293A y será igualmente
útil cuando se aplique para otras células productoras de vectores
adenovirales.
La infección adenoviral da como resultado la
lisis de las células que están infectándose. Las características
líticas de la infección por adenovirus permiten dos modos diferentes
de producción de virus. Uno es recoger células infectadas antes de
la lisis celular. El otro modo es recoger el sobrenadante con virus
tras la lisis celular completa por el virus producido. Para el
último modo, se requieren tiempos de incubación más largos con el
fin de lograr la lisis celular completa. Este tiempo de incubación
prolongado tras la infección por virus crea una grave preocupación
con respecto a un aumento de la posibilidad de generación de
adenovirus de replicación competente (RCA), particularmente para
los vectores adenovirales de primera generación actuales (vector
con deleción en E1). Por tanto, se eligió recoger células infectadas
antes de la lisis celular como el modo de producción de elección.
La tabla 2 enumera los métodos más comunes que se han usado para
lisar células tras la recogida de células.
Las células están limitadas por membranas. Con
el fin de liberar los componentes de la célula, es necesario romper
las células abriéndolas. La manera más ventajosa en la que puede
llevarse a cabo esto, según la presente invención, es solubilizar
las membranas con el uso de detergentes. Los detergentes son
moléculas anfipáticas con un extremo apolar de naturaleza alifática
o aromática y un extremo polar que puede estar cargado o no
cargado. Los detergentes son más hidrófilos que los lípidos y por
tanto tienen mayor solubilidad en agua que los lípidos. Permiten la
dispersión de compuestos insolubles en agua en medios acuosos y se
usan para aislar y purificar proteínas en forma nativa.
Los detergentes pueden ser desnaturalizantes o
no desnaturalizantes. Los primeros pueden ser aniónicos tal como
dodecilsulfato de sodio o catiónicos tal como bromuro de
etiltrimetilamonio. Estos detergentes alteran totalmente las
membranas y desnaturalizan la proteína rompiendo las interacciones
proteína-proteína. Los detergentes no
desnaturalizantes pueden dividirse en detergentes no aniónicos tales
como Triton® X-100, sales biliares tales como
colatos y detergentes zwitteriónicos tales como CHAPS. Los
zwitteriónicos contienen grupos tanto catiónicos como aniónicos en
la misma molécula, la carga eléctrica positiva se neutraliza por la
carga negativa en la misma molécula o la adyacente.
Los agentes desnaturalizantes tales como SDS se
unen a las proteínas como monómeros y la reacción se lleva en
equilibrio hasta que se satura. Por tanto, la concentración libre de
monómeros determina la concentración de detergente necesaria. La
unión de SDS es cooperativa, es decir, la unión de una molécula de
SDS aumenta la probabilidad de que otra molécula se una a esa
proteína, y altera las proteínas en barras cuya longitud es
proporcional a su peso molecular.
Los agentes no desnaturalizantes tales como
Triton® X-100 no se unen a las conformaciones
nativas ni tienen un mecanismo de unión cooperativo. Estos
detergentes tienen restos apolares voluminosos y rígidos que no
penetran en las proteínas solubles en agua. Se unen a las partes
hidrófobas de las proteínas. Triton® X100 y otros detergentes no
aniónicos de polioxietileno son ineficaces a la hora de romper la
interacción proteína-proteína y pueden provocar
agregaciones de artefactos de proteína. Sin embargo, estos
detergentes alterarán las interacciones
proteína-lípido pero son mucho más suaves y pueden
mantener la forma nativa y capacidades funcionales de las
proteínas.
La eliminación del detergente puede intentarse
de varias maneras. La diálisis funciona bien con detergentes que
existen como monómeros. La diálisis es algo ineficaz con detergentes
que se agregan fácilmente para formar micelas porque las micelas
son demasiado grandes para pasar a través de la diálisis. La
cromatografía de intercambio iónico puede utilizarse para evitar
este problema. Se aplica la disolución de proteína alterada a una
columna de cromatografía de intercambio iónico y se lava entonces
la columna con tampón sin detergente. Se eliminará el detergente
como resultado del equilibrio del tampón con la disolución de
detergente. Alternativamente, puede hacerse pasar la disolución de
proteína a través de un gradiente de densidad. A medida que la
proteína sedimenta a través de los gradientes, se desprenderá el
detergente debido al potencial químico.
Con frecuencia, un único detergente no es lo
suficientemente versátil para la solubilización y el análisis del
medio de las proteínas encontrado en una célula. Las proteínas
pueden solubilizarse en un detergente y colocarse después en otro
detergente adecuado para el análisis de proteínas. Las micelas de
detergente con proteínas formadas en la primera etapa deben
separarse de las micelas de detergente puro. Cuando se añaden éstas
a un exceso del detergente para análisis, la proteína se encuentra
en micelas con ambos detergentes. Puede llevarse a cabo la
separación de las micelas de detergente-proteína con
cromatografía de filtración en gel o de intercambio iónico,
diálisis o separaciones de tipo densidad de flotación.
Detergentes Triton®X: Esta familia de
detergentes (Triton®X-100, X114 y
NP-40) tienen las mismas características básicas
pero son diferentes en su naturaleza
hidrófoba-hidrófila específica. Todos estos
detergentes heterogéneos tienen una cadena de 8 carbonos ramificada
unida a un anillo aromático. Esta parte de la molécula es la que
más contribuye a la naturaleza hidrófoba del detergente. Los
detergentes Triton®X se usan para solubilizar proteínas de membrana
en condiciones no desnaturalizantes. La elección del detergente para
solubilizar proteínas dependerá de la naturaleza hidrófoba de la
proteína que va a solubilizarse. Las proteínas hidrófobas requieren
detergentes hidrófobos para solubilizarlas eficazmente.
Triton®X-100 y
NP-40 son muy similares en estructura e
hidrofobicidad y son intercambiables en la mayoría de aplicaciones
incluyendo lisis celular, deslipidación, disociación de proteínas y
solubilización de lípidos y proteínas de membrana. Generalmente, se
usan 2 mg de detergente para solubilizar 1 mg de proteína de
membrana o 10 mg de detergente/1 mg de membrana lipídica.
Triton®X-114 es útil para separar proteínas
hidrófobas de hidrófilas.
Detergentes Brij®: Éstos son similares en
estructura a los detergentes Triton®X porque tienen longitudes
variables de cadenas de polioxietileno unidas a una cadena
hidrófoba. Sin embargo, a diferencia de los detergentes Triton®X,
los detergentes Brij® no tienen un anillo aromático y puede variar
la longitud de las cadenas de carbono. Los detergentes Brij® son
difíciles de eliminar de la disolución usando diálisis pero pueden
eliminarse mediante geles de eliminación de detergente. Brij®58 es
el más similar a Triton®X100 en sus características
hidrófobas/hidrófilas. Brij®-35 es un detergente usado comúnmente
en aplicaciones de HPLC.
\newpage
Detergentes no iónicos dializables:
\eta-Octil-\beta-D-glucósido
(octilglucopiranósido) y
\eta-octil-\beta-D-tioglucósido
(octiltioglucopiranósido, OTG) son detergentes no iónicos no
desnaturalizantes que se dializan fácilmente de la disolución.
Estos detergentes son útiles para solubilizar proteínas de membrana
y tienen bajas absorbancias UV a 280 nm. Octilglucósido tiene una
alta CMC de 23-25 mM y se ha usado a concentraciones
del 1,1-1,2% para solubilizar proteínas de
membrana.
Octiltioglucósido se sintetizó por primera vez
para ofrecer una alternativa a octilglucósido. Octilglucósido es
costoso de fabricar y existen algunos problemas inherentes en los
sistemas biológicos porque \beta-glucosidasa puede
hidrolizarlo.
Detergentes Tween®: Los detergentes
Tween® son detergentes no iónicos, no desnaturalizantes. Son ésteres
de polioxietileno-sorbitano de ácidos grasos. Los
detergentes Tween® 20 y Tween® 80 se usan como agentes bloqueantes
en aplicaciones bioquímicas y se añaden habitualmente a disoluciones
de proteína para impedir la unión no específica a materiales
hidrófobos tales como plásticos o nitrocelulosa. Se han usado como
agentes bloqueantes en aplicaciones de transferencia y ELISA.
Generalmente, estos detergentes se usan a concentraciones del
0,01-1,0% para impedir la unión no específica a
materiales hidrófobos.
Se ha demostrado que Tween® 20 y otros
detergentes no iónicos retiran algunas proteínas de la superficie de
nitrocelulosa. Se ha usado Tween® 80 para solubilizar proteínas de
membrana, impedir la unión no específica de proteína a placas de
cultivo tisular de plástico multipocillos y reducir la unión no
específica por proteínas séricas y proteína A biotinilada a placas
de poliestireno en ELISA.
La diferencia entre estos detergentes es la
longitud de la cadena de ácido graso. Tween® 80 se deriva del ácido
oleico con una cadena C_{18} mientras que Tween® 20 se deriva del
ácido láurico con una cadena C_{12}. La cadena de ácido graso más
larga hace que el detergente Tween® 80 sea menos hidrófilo que el
detergente Tween® 20. Ambos detergentes son muy solubles en
agua.
Los detergentes Tween® son difíciles de eliminar
de la disolución mediante diálisis, pero Tween® 20 puede eliminarse
mediante geles de eliminación de detergente. La cadena de
polioxietileno encontrada en estos detergentes los hace
susceptibles de oxidación (formación de peróxido) como ocurre con
los detergentes de las series Brij® y Triton® X.
Detergentes zwitteriónicos: El detergente
zwitteriónico, CHAPS, es un derivado de sulfobetaína de ácido
cólico. Este detergente zwitteriónico es útil para la
solubilización de proteínas de membrana cuando la actividad de la
proteína es importante. Este detergente es útil en un amplio
intervalo de pH (pH 2-12) y se elimina fácilmente
de la disolución mediante diálisis debido a sus altas CMC
(8-10 mM). Este detergente tiene bajas absorbancias
a 280 nm, haciéndolo útil cuando la monitorización de proteínas en
esta longitud de onda es necesaria. CHAPS es compatible con el
ensayo de proteína de BCA y puede eliminarse de la disolución
mediante un gel de eliminación de detergente. Las proteínas pueden
yodarse en presencia de CHAPS.
Se ha usado satisfactoriamente CHAPS para
solubilizar receptores y proteínas de membrana intrínsecos y
mantener la capacidad funcional de la proteína. Cuando se
solubiliza el citocromo P-450 en o bien Triton®
X-100 o bien colato de sodio, se forman
agregados.
Pueden emplearse diversos métodos sin
detergente, aunque no preferidos, conjuntamente con otros aspectos
ventajosos de la presente invención:
Congelación-descongelación:
Ésta ha sido una técnica ampliamente usada para lisar células de
manera suave y eficaz. De manera general se congelan rápidamente
las células en, por ejemplo, un baño de nieve carbónica/etanol
hasta que se congelan completamente, se transfieren entonces a un
baño a 37ºC hasta que se descongelan completamente. Se repite este
ciclo varias veces para lograr la lisis celular completa.
Sonicación: Se ha encontrado que las
oscilaciones ultrasónicas de alta frecuencia son útiles para la
alteración de células. El método por el que ondas ultrasónicas
rompen células no se entiende completamente pero se sabe que se
producen altas presiones transitorias cuando se someten suspensiones
a vibración ultrasónica. La principal desventaja con esta técnica
es que se generan cantidades considerables de calor. Con el fin de
minimizar los efectos del calor, se usan recipientes de vidrio
específicamente diseñados para contener la suspensión celular.
Tales diseños permiten que la suspensión circule fuera desde la
sonda ultrasónica hasta el exterior del recipiente donde se enfría
ya que el matraz está suspendido en hielo.
Extrusión a alta presión: Éste es un
método usado frecuentemente para alterar una célula microbiana. La
celda de presión francesa emplea presiones de 10,4 x 10^{7} Pa
(16.000 p.s.i.) para romper las células abriéndolas. Este aparato
consiste en una cámara de acero inoxidable que se abre al exterior
por medio de una válvula de aguja. Se coloca la suspensión celular
en la cámara con la válvula de aguja en la posición cerrada. Tras
invertir la cámara, se abre la válvula y se presiona el pistón para
hacer que salga todo el aire de la cámara. Con la válvula en la
posición cerrada, se reestablece la cámara a su posición original,
se coloca sobre una base sólida y se ejerce la presión requerida en
el pistón mediante una prensa hidráulica. Cuando se ha conseguido
la presión, se abre de manera fraccionada la válvula de aguja para
liberar ligeramente la presión, y a medida que las células se
expanden, estallan. Se mantiene abierta la válvula mientras se
mantiene la presión de manera que existe un goteo de célula rota
que puede recogerse.
Métodos de cizalla sólida: Puede lograrse
la cizalla mecánica con abrasivos en agitadores Mickle que hacen
oscilar vigorosamente la suspensión (300-3000
veces/min.) en presencia de perlas de vidrio de 500 nm de diámetro.
Este método puede dar como resultado daño de orgánulos. Un método
más controlado es usar una prensa Hughes en la que un pistón hace
que la mayoría de las células junto con abrasivos o pasta
ultracongelada de células pase a través de una ranura de 0,25 mm de
diámetro en la cámara de presión. Pueden usarse presiones de hasta
5,5 x 10^{7} Pa (8000 p.s.i.) para lisar preparaciones
bacterianas.
Métodos de cizalla líquida: Estos métodos
emplean mezcladoras, que usan paletas rotativas o alternativas de
alta velocidad, homogenizadores que usan movimiento hacia
arriba/hacia abajo de un émbolo y esfera y microfluidizadores o
chorros de impacto que usan el pase de alta velocidad a través de
tubos de diámetro pequeño o el impacto a alta velocidad de dos
corrientes de fluido. Las paletas de las mezcladoras se inclinan a
diferentes ángulos para permitir un mezclado eficaz. Los
homogenizadores se hacen funcionar habitualmente en estallidos de
alta velocidad cortos de unos pocos segundos para minimizar el
calor local. Estas técnicas no son generalmente adecuadas para
células microbianas pero incluso una cizalla líquida muy suave es
habitualmente adecuada para alterar células animales.
Métodos hipotónicos/hipertónicos: Se
exponen las células a una disolución con una concentración de soluto
mucho menor (hipotónica) o mayor (hipertónica). La diferencia de
concentración de soluto crea un gradiente de presión osmótica. El
flujo resultante de agua hacia el interior de la célula en un
entorno hipotónico provoca que las células se hinchen y estallen.
El flujo de agua hacia fuera de la célula en un entorno hipertónico
provoca que las células se encojan y posteriormente estallen.
Métodos de lisis viral: En algunas
situaciones, puede ser ventajoso usar el método de lisis viral, y
con modificaciones al protocolo experimental, puede minimizarse la
formación de RCA. Dado que los adenovirus son virus líticos, tras
la infección de las células huésped, los virus maduros lisan la
célula y se liberan en el sobrenadante y pueden recogerse entonces
mediante métodos convencionales. Una de las ventajas de usar el
método de lisis viral es la generación de partículas virales más
maduras, dado que la lisis temprana por medios químicos o mecánicos
puede conducir a un aumento del número de partículas deficientes.
Además, el procedimiento permite un seguimiento más preciso y más
fácil de la cinética de producción directamente en las muestras
homogéneas de sobrenadante, lo que produce una mejor
reproducibilidad de las series de producción. La lisis química
presenta también una etapa adicional en el procedimiento y requiere
la eliminación del agente de lisis, ambos de los cuales pueden
conducir a pérdidas potenciales de producto y/o actividad
disminuida.
Al utilizar el método de lisis viral, puede
seguirse la cinética de liberación de viriones de diferentes maneras
y podrá indicar el tiempo óptimo para la recogida del sobrenadante.
Por ejemplo, puede usarse HPLC, IEC, PCR, exclusión por tinción,
espectrofotometría, ELISA, RIA o métodos nefelométricos. La recogida
se realiza preferiblemente cuando se ha liberado aproximadamente el
50% de los viriones. Más preferiblemente, se recoge el sobrenadante
cuando se libera al menos el 70% de los viriones, y lo más
preferiblemente, se recoge el sobrenadante cuando se libera al
menos el 90% de los viriones, o cuando la liberación viral alcanza
una meseta según se mide mediante uno de los métodos indicados
anteriormente. Pueden observarse variaciones en el tiempo necesario
para que la liberación de virus alcance una meseta cuando se usa
una modificación del vector de transferencia génica, sin embargo,
el experto en la técnica puede modificar fácilmente el programa de
recogida cuando se usa uno o más de los métodos anteriores para
seguir la cinética de liberación de virus.
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Un aspecto de la presente invención emplea
métodos de purificación sin procesar de adenovirus a partir de un
lisado celular. Estos métodos incluyen clarificación, concentración
y diafiltración. La etapa inicial en este procedimiento de
purificación es la clarificación del lisado celular para eliminar
material particulado grande, particularmente componentes celulares,
del lisado celular. Puede lograrse la clarificación del lisado
usando un filtro de profundidad o mediante filtración de flujo
tangencial. En una descripción preferida de la presente invención,
se hace pasar el lisado celular a través de un filtro de
profundidad, que consiste en una columna de relleno de material
relativamente no adsorbente (por ejemplo resinas de poliéster,
arena, tierra de diatomeas, coloides, geles y similares). En la
filtración de flujo tangencial (TFF), la disolución de lisado fluye
a través de una superficie de membrana que facilita la difusión de
retorno del soluto desde la superficie de membrana hacia la
disolución en masa. Las membranas se disponen generalmente dentro de
diversos tipos de aparatos de filtro incluyendo estructura y placa
de conducto abierto, fibras huecas y túbulos.
Tras la clarificación y filtración previa del
lisado celular, se concentra en primer lugar el sobrenadante con
virus resultante y se intercambia después el tampón mediante
diafiltración. Se concentra el sobrenadante con virus mediante
filtración de flujo tangencial a través de una membrana de
ultrafiltración de punto de corte de peso molecular nominal de
100-300 K. La ultrafiltración es un procedimiento
convectivo modificado con presión que usa membranas semipermeables
para separar especies por tamaño molecular, forma y/o carga. Separa
disolventes de solutos de diversos tamaños, independientemente del
tamaño molecular del soluto. La ultrafiltración es suave, eficaz y
puede usarse para desalar y concentrar simultáneamente disoluciones.
Las membranas de ultrafiltración tienen generalmente dos capas
diferenciadas: una película densa, delgada (0,1-1,5
\mum), con un diámetro de poro de 10-400 angstroms
y una subestructura abierta de huecos progresivamente más grandes
que se abren en su mayor parte hacia el lado de permeado del
ultrafiltro. Cualquier especie que pueda pasar a través de los
poros de la película puede pasar, por tanto, libremente a través de
la membrana. Para una máxima retención de soluto, se selecciona una
membrana que tiene un punto corte de peso molecular nominal muy por
debajo de aquél de las especies que se retienen. En la concentración
macromolecular, la membrana enriquece el contenido de las especies
biológicas deseadas y proporciona un filtrado aclarado de sustancias
retenidas. Los microsolutos se eliminan de manera convectiva con el
disolvente. A medida que aumenta la concentración del soluto
retenido, disminuye la tasa de ultrafiltración.
La diafiltración, o el intercambio de tampón,
usando ultrafiltros es una forma ideal para la eliminación y el
intercambio de sales, azúcares, disolventes no acuosos, separación
de especies libres de las unidas, eliminación de material de bajo
peso molecular, o cambio rápido de entornos iónicos y de pH. Los
microsolutos se eliminan de la manera más eficaz añadiendo
disolvente a la disolución que se somete a ultrafiltración a una
tasa igual a la tasa de ultrafiltración. Esto lava las
microespecies de la disolución a volumen constante, purificando las
especies retenidas. La presente invención utiliza una etapa de
diafiltración para intercambiar el tampón del sobrenadante con
virus antes del tratamiento con Benzonase®.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención emplea, en un ejemplo, la
infección adenoviral de células con el fin de generar vectores
terapéuticamente significativos. Normalmente, el virus se expondrá
simplemente a la célula huésped apropiada en condiciones
fisiológicas, permitiendo la captación del virus. Aunque, se muestra
a modo de ejemplo el adenovirus, los presentes métodos pueden
emplearse ventajosamente con otros vectores virales, tal como se
trata a continuación.
El adenovirus es particularmente adecuado para
su uso como vector de transferencia génica debido a su genoma de
ADN de tamaño medio, facilidad de manipulación, alto título, amplia
gama de células diana y alta infectividad. El genoma viral de
aproximadamente 36 kb está limitado por repeticiones terminales
invertidas (ITR) de 100-200 pares de bases (pb), en
las que están contenidas elementos que actúan sobre cis
necesarios para la replicación y el empaquetamiento del ADN viral.
La regiones temprana (E) y tardía (L) del genoma que contienen
diferentes unidades de transcripción se dividen por el comienzo de
la replicación del ADN viral.
La región E1 (E1A y E1B) codifica para proteínas
responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral
y unos pocos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y
E2B) da como resultado la síntesis de las proteínas para la
replicación del ADN viral. Estas proteínas están implicadas en la
replicación del ADN, la expresión de genes de expresión tardía y el
silenciamiento de células huésped (Renan, 1990). Los productos de
los genes de expresión tardía (L1, L2, L3, L4 y L5), incluyendo la
mayoría de las proteínas de la cápside viral, se expresan sólo tras
un procesamiento significativo de un único transcrito primario
emitido por el promotor tardío principal (MLP). El MLP (ubicado a
16,8 unidades de mapeo) es particularmente eficaz durante la fase
tardía de la infección, y todos los ARNm emitidos de este promotor
tienen una secuencia líder triparental (TL) en 5' que los hace ARNm
preferidos para la traducción.
Con el fin de optimizar el adenovirus para la
terapia génica, es necesario maximizar la capacidad de carga de
manera que puedan incluirse grandes segmentos de ADN. También es muy
deseable reducir la toxicidad y la reacción inmunológica asociada
con ciertos productos adenovirales. La eliminación de grandes partes
del genoma adenoviral, y proporcionar los productos génicos de
deleción en trans, mediante virus auxiliar y/o células
cooperadoras, permite la inserción de grandes partes de ADN
heterólogo en el vector. Esta estrategia dará como resultado
también inmunogenicidad y toxicidad reducidas de los productos
génicos de adenovirus.
El gran desplazamiento de ADN es posible porque
los elementos cis requeridos para la replicación del ADN
viral se localizan todos en las repeticiones terminales invertidas
(ITR) (100-200 pb) en cualquier extremo del genoma
viral lineal. Los plásmidos que contienen las ITR pueden replicarse
en presencia de un adenovirus no deficiente (Hay et al.,
1984). Por tanto, la inclusión de estos elementos en un vector
adenoviral debe permitir la replicación.
Además, la señal de empaquetamiento para la
encapsidación viral está ubicada entre los pb
194-385 (0,5-1,1 unidades de mapeo)
en el extremo izquierdo del genoma viral (Hearing et al.,
1987). Esta señal imita el sitio de reconocimiento de proteína en
el ADN del bacteriófago \lambda en el que una secuencia específica
cerca del extremo izquierdo, pero fuera de la secuencia de extremo
cohesivo, media en la unión a proteínas que se requieren para la
inserción del ADN en la estructura principal. Los vectores de
sustitución de E1 de Ad han demostrado que un fragmento de 450 pb
(0-1,25 unidades de mapeo) en el extremo izquierdo
del genoma viral puede empaquetarse directamente en células 293
(Levrero et al., 1991).
Previamente, se ha demostrado que ciertas
regiones del genoma adenoviral pueden incorporarse en el genoma de
células de mamífero y los genes codificados expresarse de ese modo.
Estas líneas celulares pueden apoyar la replicación de un vector
adenoviral que es deficiente en la función adenoviral codificada por
la línea celular. También ha habido notificaciones de
complementación de vectores adenovirales de replicación deficiente
por vectores "auxiliares", por ejemplo, virus de tipo natural o
mutantes condicionalmente deficientes.
Los vectores adenovirales de replicación
deficiente pueden complementarse, en trans, por un virus
auxiliar. Sin embargo, esta observación sola no permite el
aislamiento de los vectores de replicación deficiente, dado que la
presencia de virus auxiliar, necesario para proporcionar funciones
replicativas, contaminaría cualquier preparación. Por tanto, era
necesario un elemento adicional que añadiera especificidad a la
replicación y/o el empaquetamiento del vector de replicación
deficiente. Ese elemento, según lo previsto en la presente
invención, deriva de la función de empaquetamiento del
adenovirus.
Se ha demostrado que existe una señal de
empaquetamiento para adenovirus en el extremo izquierdo del mapa de
adenovirus convencional (Tibbetts, 1977). Estudios posteriores
mostraron que un mutante con una deleción en la región E1A
(194-358 pb) del genoma crecía escasamente incluso
en una línea celular que complementaba la función temprana (E1A)
(Hearing y Shenk, 1983). Cuando se recombinó un ADN adenoviral
compensador (0-353 pb) en el extremo derecho del
mutante, el virus se empaquetaba normalmente. El análisis mutacional
adicional identificó un elemento dependiente de posición, repetido,
corto en el extremo izquierdo del genoma de Ad5. Se encontró que
una copia de la repetición era suficiente para el empaquetamiento
eficaz si estaba presente en cualquier extremo del genoma, pero no
cuando se movía hacia el interior de la molécula de ADN de Ad5
(Hearing et al., 1987).
Usando versiones mutadas de la señal de
empaquetamiento, es posible crear virus auxiliares que se empaquetan
con eficacias variables. Normalmente, las mutaciones son deleciones
o mutaciones puntuales. Cuando se hacen crecer virus auxiliares con
empaquetamiento de baja eficiencia en células cooperadoras, se
empaqueta el virus, aunque a tasas reducidas en comparación con
virus de tipo natural, permitiendo de ese modo la propagación del
auxiliar. Sin embargo, cuando se hacen crecer estos virus auxiliares
en células junto con virus que contiene señales de empaquetamiento
de tipo natural, se reconocen preferentemente las señales de
empaquetamiento de tipo natural con respecto a las versiones
mutadas. Dada una cantidad limitante de factor de empaquetamiento,
el virus que contiene las señales de tipo natural se empaqueta
selectivamente cuando se compara con los auxiliares. Si la
preferencia es lo suficientemente grande, deben lograrse
disoluciones madre que se aproximan a la homogeneidad.
Aunque la infección adenoviral de células para
la generación de vectores terapéuticamente significativos es una
realización preferida de la presente invención, se contempla que la
presente invención pueda emplear la infección retroviral de células
para los fines de la generación de tales vectores. Los retrovirus
son un grupo de virus de ARN monocatenario caracterizados por una
capacidad de convertir su ARN en ADN bicatenario en células
infectadas mediante un proceso de transcripción inversa (Coffin,
1990). Entonces, el ADN resultante se integra de manera estable en
los cromosomas celulares como un provirus y dirige la síntesis de
proteínas virales. La integración da como resultado la retención de
las secuencias génicas virales en la célula receptora y sus
descendientes. El genoma retroviral contiene tres genes, gag, pol y
env, que codifican para proteínas de la cápside, enzima polimerasa
y componentes de la envuelta, respectivamente. Una secuencia
encontrada en el sentido de 5' desde el gen gag, denominada Y,
funciona como señal para el empaquetamiento del genoma en los
viriones. Dos secuencias de repetición terminal larga (LTR) están
presentes en los extremos 5' y 3' del genoma viral. Éstas contienen
secuencias potenciadoras y promotoras fuertes y se requieren también
para la integración en el genoma de la células huésped (Coffin,
1990).
Con el fin de construir un vector retroviral, se
inserta un ácido nucleico que codifica para un promotor en el
genoma viral en lugar de ciertas secuencias virales para producir un
virus que es de replicación deficiente. Con el fin de producir
viriones, se construye una línea celular de empaquetamiento que
contiene los genes gag, pol y env pero sin los componentes LTR y Y
(Mann et al., 1983). Cuando un plásmido recombinante que
contiene un ADNc humano, junto con las secuencias LTR y Y
retrovirales se introduce en esta línea celular (por ejemplo
mediante precipitación con fosfato de calcio), la secuencia Y
permite que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se
empaquete en las partículas virales, que se secretan entonces en los
medios de cultivo (Nicolas y Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann
et al., 1983). Entonces se recogen los medios que contienen
los retrovirus recombinantes, se concentra opcionalmente y se usa
para transferencia génica. Los vectores retrovirales pueden
infectar una amplia variedad de tipos celulares. Sin embargo, la
integración y la expresión estable requieren la división de las
células huésped (Paskind et al., 1975).
Un enfoque novedoso diseñado para permitir la
dirección específica de vectores de retrovirus se diseñó
recientemente basándose en la modificación química de un retrovirus
mediante la adición química de residuos de galactosa a la envuelta
viral. Esta modificación podría permitir la infección específica de
células tales como hepatocitos por medio de receptores de
asialoglicoproteínas, si se desease.
Se diseñó un enfoque diferente para dirigir
retrovirus recombinantes en el que se usaron anticuerpos
biotinilados contra una proteína de la envuelta retroviral y contra
un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron por
medio de los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux
et al., 1989). Usando anticuerpos contra antígenos de clase
I y clase II del complejo principal de histocompatibilidad, se
demostró la infección de una variedad de células humanas que tenían
estos antígenos de superficie con un virus ecotrópico in
vitro (Roux et al., 1989).
El VAA utiliza un ADN monocatenario, lineal de
aproximadamente 4700 pares de bases. Las repeticiones terminales
invertidas flanquean el genoma. Dos genes están presentes en el
genoma, dando lugar a varios productos génicos distintos. El
primero, el gen cap, produce tres proteínas de virión (VP)
diferentes, denominadas VP-1, VP-2
y VP-3. El segundo, el gen rep, codifica para cuatro
proteínas no estructurales (NS). Uno o más de estos productos del
gen rep es responsable de la transcripción de VAA
transactivadora.
Los tres promotores en VAA se denominan por su
ubicación, en unidades de mapeo, en el genoma. Éstos son, de
izquierda a derecha, p5, p19 y p40. La transcripción da lugar a seis
transcritos, dos que se inician en cada uno de los tres promotores,
estando uno de cada par cortado y empalmado. El sitio de corte y
empalme, derivado de las unidades de mapeo 42-46,
es el mismo para cada transcrito. Las cuatro proteínas no
estructurales aparentemente se derivan del más largo de los
transcritos, y tres proteínas de virión surgen todas del transcrito
más pequeño.
El VAA no está asociado con ningún estado
patológico en seres humanos. De manera interesante, para una
replicación eficiente, el VAA requiere funciones "auxiliares"
de virus tales como virus del herpes simple I y II, citomegalovirus,
virus de la pseudorrabia y, por supuesto, adenovirus. El mejor
caracterizado de los auxiliares es adenovirus, y se ha demostrado
que muchas funciones "tempranas" para este virus ayudan con la
replicación de VAA. Se cree que la expresión de bajo nivel de
proteínas rep de VAA controla la expresión estructural de VAA, y se
cree que la infección por virus auxiliar elimina este bloqueo.
Pueden obtenerse las repeticiones terminales del
vector VAA mediante digestión con endonucleasa de restricción de
VAA o un plásmido tal como p201, que contiene un genoma de VAA
modificado (Samulski et al. 1987), o mediante otros métodos
conocidos para el experto en la técnica, incluyendo pero sin
limitarse a síntesis enzimática o química de las repeticiones
terminales basada en la secuencia publicada de VAA. El experto
habitual en la técnica puede determinar, mediante métodos bien
conocidos tales como análisis de deleción, la parte o secuencia
mínima de las ITR de VAA que se requiere para permitir la función,
es decir, la integración específica de sitio y estable. El experto
habitual en la técnica puede determinar también qué modificaciones
menores de la secuencia pueden tolerarse mientras se mantiene la
capacidad de las repeticiones terminales para dirigir la
integración específica de sitio, estable.
Se ha demostrado que los vectores a base de VAA
son vehículos eficaces y seguros para el suministro de genes in
vitro, y están desarrollándose y sometiéndose a prueba estos
vectores en fases preclínicas y clínicas para una amplia gama de
aplicaciones en terapia génica potencial, tanto ex vivo como
in vivo (Carter y Flotte, 1996; Chatterjee et al.,
1995; Ferrari et al., 1996; Fisher et al., 1996;
Flotte et al., 1993; Goodman et al., 1994; Kaplitt
et al., 1994; 1996, Kessler et al., 1996; Koeberl
et al., 1997; Mizukami et al., 1996; Xiao et
al., 1996).
La expresión y transferencia génica eficaz
mediada por VAA en el pulmón ha conducido a ensayos clínicos para
el tratamiento de la fibrosis quística (Carter y Flotte, 1996;
Flotte et al., 1993). De manera similar, las perspectivas
para el tratamiento de la distrofia muscular mediante el suministro
de genes mediado por VAA del gen de la distrofina al músculo
esquelético, de la enfermedad de Parkinson mediante el suministro
del gen de la tirosina hidroxilasa al cerebro, de la hemofilia B
mediante el suministro del gen del factor IX al hígado, y
potencialmente del infarto miocárdico por el gen del factor de
crecimiento endotelial vascular al corazón, parecen prometedoras
dado que se ha demostrado recientemente que la expresión transgénica
mediada por VAA en estos órganos es sumamente eficaz (Fisher et
al., 1996; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al.,
1994).
Puesto que el virus del herpes simple (VHS) es
neurotrópico, ha generado interés considerable en el tratamiento de
trastornos del sistema nervioso. Además, la capacidad del VHS para
establecer infecciones latentes en células neuronales sin división
sin integrarse en el cromosoma de la célula huésped o alterar de
otra manera el metabolismo de la célula huésped, junto con la
existencia de un promotor que está activo durante la latencia hace
que VHS sea un vector atractivo. Y aunque se ha centrado mucha
atención en las aplicaciones neurotrópicas de VHS, este vector
puede explotarse también para otros tejidos dada su amplia gama de
huéspedes.
Otro factor que hace que VHS sea un vector
atractivo es el tamaño y la organización del genoma. Puesto que VHS
es grande, la incorporación de casetes de expresión o genes
múltiples es menos problemática que en otros sistemas virales más
pequeños. Además, la disponibilidad de secuencias control virales
diferentes con rendimiento variable (temporal, fuerza, etc.) hace
posible controlar la expresión en mayor medida que en otros
sistemas. También es una ventaja que el virus tenga relativamente
pocos mensajes de corte y empalme, facilitando además las
manipulaciones genéticas.
Además, el VHS es relativamente fácil de
manipular y puede hacerse crecer a altos títulos. Por tanto, el
suministro es un problema menor, en cuanto a tanto volúmenes
necesarios para conseguir suficiente MOI como en una necesidad
disminuida para dosificaciones repetidas. Para una revisión de VHS
como vector de terapia génica, véase Glorioso et al.
(1995).
\newpage
Los VHS, denominados con subtipos 1 y 2, son
virus con envuelta que están entre los agentes infecciosos más
comunes a los que se enfrentan los seres humanos, infectando a
millones de sujetos humanos en todo el mundo. El genoma de ADN
bicatenario, complejo, grande codifica para docenas de productos
génicos diferentes, algunos de los cuales derivan de transcritos
cortados y empalmados. Además de los componentes estructurales de la
envuelta y el virión, el virus codifica para otras numerosas
proteínas que incluyen una proteasa, una ribonucleótido reductasa,
una ADN polimerasa, una proteína de unión a ADNmc, una
helicasa/primasa, una ATPasa dependiente de ADN, una dUTPasa y
otras.
Los genes de VHS forman varios grupos cuya
expresión se regula coordinadamente y se ordena secuencialmente en
un modo de cascada (Honess y Roizman, 1974; Honess y Roizman, 1975;
Roizman y Sears, 1995). La expresión de genes \alpha, el primer
conjunto de genes que va a expresarse tras la infección, se potencia
por la proteína de virión número 16 o factor
\alpha-transinductor (Post et al., 1981;
Batterson y Roizman, 1983; Campbell, et al., 1983). La
expresión de genes \beta requiere productos de los genes \alpha
funcionales, sobre todo ICP4, que es codificado por el gen
\alpha4 (DeLuca et al., 1985). Los genes \gamma, un grupo
heterogéneo de genes que codifican en su mayor parte para proteínas
estructurales del virión, requieren el comienzo de la síntesis de
ADN viral para su expresión óptima (Holland et al.,
1980).
De acuerdo con la complejidad del genoma, el
ciclo de vida de VHS es bastante complicado. Además del ciclo
lítico, que da como resultado la síntesis de partículas de virus y,
finalmente, la muerte celular, el virus tiene la capacidad de
entrar en un estado latente en el que el genoma se mantiene en los
ganglios neurales hasta que algo como de una señal todavía sin
definir provoca una recurrencia del ciclo lítico. Se han
desarrollado variantes virulentas de VHS y están fácilmente
disponibles para su uso en contextos de terapia génica (patente
estadounidense n.º 5.672.344).
Se han usado ampliamente vectores de virus
vaccinia debido a la facilidad de su construcción, niveles
relativamente altos de expresión obtenida, amplia gama de huéspedes
y gran capacidad para portar ADN. Vaccinia contiene un genoma de
ADN bicatenario, lineal de aproximadamente 186 kb que presenta una
preferencia "A-T" marcada. Las repeticiones
terminales invertidas de aproximadamente 10,5 kb flanquean el
genoma. La mayoría de los genes esenciales parecen mapear dentro de
la región central, que es la más altamente conservada entre los
poxvirus. Los marcos de lectura abiertos estimados en el virus
vaccinia ascienden a desde 150 hasta 200. Aunque ambas cadenas son
codificantes, una amplia superposición de los marcos de lectura no
es común.
Pueden insertarse al menos 25 kb en el genoma de
virus vaccinia (Smith y Moss, 1983). Los vectores de vaccinia
prototípicos contienen transgenes insertados en el gen de la
timidina quinasa viral por medio de recombinación homóloga. Los
vectores se seleccionan en base a un fenotipo de tk. La inclusión de
la secuencia líder sin traducir del virus de la
encefalomiocarditis, el nivel de expresión es mayor que aquél de
vectores convencionales, acumulándose los transgenes al 10% o más
de la proteína de la célula infectada en 24 h
(Elroy-Stein et al., 1989).
El virus de simio 40 (SV40) se descubrió en 1960
como contaminante en vacunas contra la polio preparadas a partir de
cultivos celulares de riñón de mono rhesus. Se encontró que
provocaban tumores cuando se inyectaban en hámsters recién nacidos.
El genoma es un ADN circular, bicatenario de aproximadamente 5000
bases que codifica para los antígenos T grande (708 AA) y pequeño
(174 AA), agnoproteína y las proteínas estructurales VP1, VP2 y
VP3. El respectivo tamaño de estas moléculas es de 362, 352 y 234
aminoácidos.
Se sabe poco sobre la naturaleza de los
receptores para cualquier poliomavirus. El virus se incorpora
mediante endocitosis y se transporta al núcleo en el que tiene
lugar la pérdida de la envuelta. ARNm tempranos inician la
replicación viral y es necesaria, junto con la replicación de ADN,
para la expresión de genes de expresión tardía. Cerca del origen de
replicación, están ubicados promotores para la transcripción
temprana y tardía. Las repeticiones de veintiún pares de bases,
ubicadas 40-103 nucleótidos en el sentido de 5' del
sitio de iniciación de la transcripción, son los principales
elementos promotores y son sitios de unión para Sp1, mientras que
las repeticiones de 72 bases de pares actúan como potenciadores.
El antígeno T grande, una de las proteínas
tempranas, desempeña un papel crítico en la replicación y la
expresión de genes de expresión tardía y se modifica de varias
maneras, incluyendo acetilación N-terminal,
fosforilación,
poli-ADP-ribosilación, glicosilación
y acilación. El otro antígeno T se produce mediante el corte y
empalme del transcrito T grande. No se requiere estrictamente la
proteína T pequeña correspondiente para la infección, pero
desempeña un papel en la acumulación del ADN viral.
La replicación del ADN se controla, en cierta
medida, mediante una región del núcleo definida genéticamente que
incluye el origen viral de replicación. El elemento SV40 tiene una
longitud de aproximadamente 66 pb y tiene subsecuencias de motivos
AT, motivos GC y una repetición invertida de 14 pb en el lado del
gen de expresión temprana. El antígeno T grande se requiere para la
iniciación de la replicación del ADN, y se ha demostrado que esta
proteína se une en la proximidad del origen. También tiene
actividades helicasa, adenilante y ATPasa.
Tras comenzar la replicación viral, se inicia la
expresión de la región tardía. Los transcritos se solapan y, en
algunos aspectos, reflejan diferentes marcos de lectura (VP1 y
VP2/3). La expresión tardía se inicia en la misma región general
que la expresión temprana, pero en la dirección opuesta. Las
proteínas del virión se sintetizan en el citoplasma y se
transportan al núcleo en el que entran como complejo. El ensamblaje
del virión tiene lugar también en el núcleo, seguido por lisis y
liberación de las partículas de virus infecciosas.
Se contempla que la presente invención abarcará
vectores de SV40 que carecen de todas las secuencias codificantes.
La región desde aproximadamente 5165-5243 y
aproximadamente 0-325 contiene todos los elementos
de control necesarios para la replicación y el empaquetamiento del
vector y la expresión de cualquier gen incluido. Por tanto, los
vectores de SV40 mínimos se derivan de esta región y contienen al
menos un origen completo de replicación.
Puesto que se cree que el antígeno T grande está
implicado en la expresión de genes de expresión tardía, y ningún
antígeno T grande se expresa en la célula diana, se deseará que el
promotor que dirige el gen heterólogo sea un promotor temprano de
poliomavirus, o más preferiblemente, un promotor heterólogo. Por
tanto, cuando se utilicen elementos de control heterólogos, son
imprescindibles los elementos potenciadores y promotores de
SV40.
Otros vectores virales pueden emplearse como
construcciones de expresión en la presente invención. Pueden
emplearse vectores derivados de virus tales como los papilomavirus,
papovavirus y lentivirus. Estos virus ofrecen varias
características para su uso en transferencia génica en diversas
células de mamífero, y se entenderá que pueden hacerse diversas
modificaciones a tales virus para potenciar por ejemplo la
infectividad y la selección como diana. Un experto en la técnica
puede construir también virus quiméricos, que emplean partes
ventajosas de diferentes virus.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, la presente invención
implica además la manipulación de vectores virales. Tales métodos
implican el uso de un constructo de vector que contiene, por
ejemplo, un ADN heterólogo que codifica para un gen de interés y un
medio para su expresión, replicar el vector en una célula
cooperadora apropiada, obtener partículas virales producidas a
partir de la misma, e infectar células con las partículas de virus
recombinantes. El gen puede simplemente codificar para una proteína
para la que se desean grandes cantidades de la proteína, es decir,
métodos de producción in vitro a gran escala.
Alternativamente, el gen puede ser un gen terapéutico, por ejemplo
para tratar células cancerosas, expresar genes inmunomoduladores
para combatir infecciones virales, o sustituir la función de un gen
como resultado de un defecto génico. En el contexto del vector de
terapia génica, el gen será un ADN heterólogo, que pretende incluir
ADN derivado de una fuente diferente del genoma viral que
proporciona la estructura principal del vector. Finalmente, el virus
puede actuar como una vacuna viral viva y expresar un antígeno de
interés para la producción de anticuerpos contra el mismo. El gen
puede derivarse de una fuente procariota o eucariota tal como una
bacteria, un virus, una levadura, un parásito, una planta o incluso
un animal. El ADN heterólogo puede derivarse también de más de una
fuente, es decir, un constructo multigénico o una proteína de
fusión. El ADN heterólogo puede incluir también una secuencia
reguladora que puede derivarse de una fuente y el gen, de una fuente
diferente.
Actualmente, se reconoce p53 como un gene
supresor de tumores (Montenarh, 1992). Se han encontrado altos
niveles de p53 mutante en muchas células transformadas mediante
carcinogénesis química, radiación ultravioleta y varios virus,
incluyendo SV40. El gen p53 es una diana frecuente de inactivación
por mutación en una amplia variedad de tumores humanos y ya está
documentado como el gen más frecuentemente mutado en una amplia
variedad de tumores humano y ya está documentado que es el gen más
frecuentemente mutado en cánceres comunes en seres humanos (Mercer,
1992). Está mutado en más del 50% de NSCLC humano (Hollestein et
al., 1991) y en un amplio espectro de otros tumores.
El gen p53 codifica para una fosfoproteína de
393 aminoácidos que puede formar complejos con las proteínas
huésped tales como antígenos T grandes y E1B. La proteína se
encuentra en tejidos y células normales, pero a concentraciones que
son generalmente inapreciables en comparación con las células
transformadas o tejido tumoral. De manera interesante, parece que
p53 de tipo natural es importante en la regulación del crecimiento
y división celulares. Se ha demostrado que la sobreexpresión de p53
de tipo natural en algunos casos es antiproliferativa en líneas de
células tumorales humanas. Por tanto, p53 puede actuar como un
regulador negativo del crecimiento celular (Weinberg, 1991) y puede
suprimir directamente el crecimiento celular incontrolado o directa
o indirectamente activar genes que suprimen este crecimiento. Por
tanto, la ausencia o inactivación de p53 de tipo natural puede
contribuir a la transformación. Sin embargo, algunos estudios
indican que la presencia de p53 mutante puede ser necesaria para la
expresión completa del potencial transformante del gen.
Se reconoce que p53 de tipo natural es un
importante regulador del crecimiento en muchos tipos de células.
Las mutaciones de sentido erróneo son comunes para el gen p53 y se
sabe que se producen en al menos 30 codones diferenciados, creando
a menudo alelos dominantes que producen cambios en el fenotipo de la
célula sin una reducción hasta homocigotismo. Además, muchos de
estos alelos negativos dominantes parecen tolerarse en el organismo
y se pasan en la línea germinal. Diversos alelos mutantes parecen
oscilar desde alelos negativos dominantes mínimamente
disfuncionales hasta fuertemente penetrantes (Weinberg, 1991).
Casey y colegas han notificado que la
transfección de ADN que codifica para p53 de tipo natural en dos
líneas celulares de cáncer de mama humano, restaura el control de
supresión del crecimiento en tales células (Casey et al.,
1991). También se ha demostrado un efecto similar en la transfección
de p53 de tipo natural, pero no mutante, en líneas celulares de
cáncer de pulmón humano (Takahasi, et al., 1992). p53 parece
dominar sobre el gen mutado y se seleccionará frente a la
proliferación cuando se transfecte en células con el gen mutado. La
expresión normal del p53 transfectado no es nociva para las células
normales con p53 de tipo natural endógeno. Por tanto, las células
normales pueden captar tales construcciones sin efectos adversos.
Por tanto, se propone que el tratamiento de cánceres asociados a
p53 con construcciones de expresión de p53 de tipo natural reducirá
el número de células malignas o su tasa de crecimiento. Además,
estudios recientes sugieren que algunos tumores p53 de tipo natural
también son sensibles a los efectos de la expresión de p53
exógeno.
Las principales transiciones del ciclo celular
eucariota se desencadenan mediante las quinasas dependientes de
ciclina, o CDK. Una CDK, quinasa 4 dependiente de ciclina (CDK4)
regula la progresión a través de la fase G_{1}. La actividad de
esta enzima puede ser fosforilar Rb en G_{1} tardía. La actividad
de CDK4 se controla mediante una subunidad de inactivación, ciclina
de tipo D, y mediante una subunidad inhibidora, por ejemplo
p16^{INK4}, que se ha caracterizado bioquímicamente como una
proteína que se une específicamente a e inhibe CDK4, y por tanto
puede regular la fosforilación de Rb (Serrano et al., 1993,
Serrano et al., 1995). Dado que la proteína p16^{INK4} es
un inhibidor de CDK4 (Serrano, 1993), la deleción de este gen puede
aumentar la actividad de CDK4, dando como resultado la
hiperfosforilación de la proteína Rb. También se sabe que p16
regula la función de CDK6.
P16^{INK4} pertenece a una clase recientemente
descrita de proteínas inhibidoras CDK que también incluye
p16^{B}, p21^{WAF21, \ CIP1, \ SDI1} y p27^{KIP1}. El gen
p16^{INK4} mapea a 9p21, una región del cromosoma delecionada
frecuentemente en muchos tipos de tumores. Las deleciones
homocigotas y las mutaciones del gen p16^{INK4} son frecuentes en
las líneas de células tumorales humanas. Esta evidencia sugiere que
el gen p16^{INK4} es un gen supresor tumoral. Se ha desafiado
esta interpretación, sin embargo, mediante la observación de que la
frecuencia de las alteraciones del gen p16^{INK4} es mucho menor
en tumores primarios no cultivados que en líneas celulares
cultivadas (Caldas et al., 1994, Cheng et al., 1994;
Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994b; Mori
et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et
al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al.,
1995). La restauración de la función de p16^{INK4} de tipo natural
mediante la transfección con un vector de expresión plasmídico,
redujo la formación de colonias en algunas líneas celulares de
cáncer humano (Okamoto, 1994; Arap, 1995).
C-CAM se expresa en
prácticamente todas las células epiteliales (Odin y Obrink, 1987).
C-CAM, con un peso molecular aparente de 105 kD, se
aisló originariamente de la membrana plasmática del hepatocito de
rata mediante su reacción con anticuerpos específicos que
neutralizan la agregación celular (Obrink, 1991). Estudios recientes
indican que, estructuralmente, C-CAM pertenece a la
superfamilia de inmunoglobulinas (Ig) y su secuencia es altamente
homóloga con el antígeno carcinoembrionario (ACE) (Lin y Guidotti,
1989). Usando un sistema de expresión de baculovirus, Cheung et
al., (1993a; 1993b y 1993c) demostró que el primer dominio de Ig
de C-CAM es crítico para la actividad de adhesión
celular.
Se sabe que las moléculas de adhesión celular, o
CAM, están implicadas en una red compleja de interacciones
moleculares que regulan el desarrollo de órganos y la diferenciación
celular (Edelman, 1985). Datos recientes indican que la expresión
aberrante de las CAM puede estar implicada en la tumorigénesis de
varios neoplasmas; por ejemplo disminuir la expresión de cadherina
E, que se expresa predominantemente en células epiteliales, se
asocia con la progresión de varias clases de neoplasias (Edelman y
Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et
al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al.,
1992). También, Giancotti y Ruoslahti (1990) demostraron que la
creciente expresión de integrina \alpha_{5}\beta_{1}
mediante la transferencia génica puede reducir la tumorigenicidad
de células de ovario de hámster chino in vivo. Ahora se ha
demostrado que C-CAM suprime el crecimiento tumoral
in vitro e in vivo.
Otros supresores de tumores que pueden emplearse
según la presente reivindicación incluyen RB, APC, DCC,
NF-1, NF-2, WT-1,
MEN-I, MEN-II, zac1, p73, BRCA1,
VHL, FCC, MMAC1, MCC, p16, p21, p57, pTEN, C-CAM,
p27, mda-7 y BRCA2. Inductores de apoptosis, tales
como proteasas Bax, Bak, Bcl-X_{s}, Bik, Bid,
Harakiri, Ad E1B y ICE-CED3, pueden encontrar uso
de manera similar según la presente invención.
Diversos genes de enzimas son de interés según
la presente invención. Tales enzimas incluyen citosina desaminasa,
hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa,
galactosa-1-fosfato
uridiltransferasa, fenilalanina hidroxilasa, glucocerebrosidasa,
esfingomielinasa,
\alpha-L-iduronidasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
timidina quinasa de VHS y timidina quinasa humana.
Las hormonas son otro grupo de genes que pueden
usarse en los vectores descritos en el presente documento. Se
incluyen hormona de crecimiento, prolactina, lactógeno placentario,
hormona luteinizante, hormona folículo estimulante, gonadotropina
coriónica, hormona estimulante del tiroides, leptina,
adrenocorticotropina (ACTH), angiotensina I y II,
\beta-endorfina, hormona estimulante de
\beta-melanocitos (\beta-MSH),
colecistocinina, endotelina I, galanina, péptido inhibidor gástrico
(GIP), glucagón, insulina, lipotropinas, neurofisinas,
somatostatina, calcitonina, péptido relacionado con el gen de
calcitonina (CGRP), péptido relacionado con el gen de
\beta-calcitonina, hipercalcemia por factor de
malignidad (1-40), proteína relacionada con la
hormona paratiroidea (107-139)
(PHT-rP), proteína relacionada con la hormona
paratiroidea (107-111) (PTH-rP),
péptido similar al glucagón (GLP-1), pancreastatina,
péptido pancreático, péptido YY, PHM, secretina, péptido intestinal
vasoactivo (VIP), oxitocina, vasopresina (AVP), vasotocina,
encefalinamida, metorfinamida, hormona estimulante de
alfa-melanocitos (alfa-MSH), factor
natriurético auricular (5-28) (ANF), amilina,
componente P amiloideo (SAP-1), hormona liberadora
de corticotropina (CRH), factor liberador de hormona de crecimiento
(GHRH), factor liberador de hormona luteinizante (LHRH),
neuropéptido Y, sustancia K (neurocinina A), sustancia P y hormona
liberadora de tirotropina (TRH).
Otras clases de genes que se contempla que se
inserten en los vectores de la presente invención incluyen
interleucinas y citocinas. Interleucina 1 (IL-1),
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12, GM-CSF
y G-CSF.
Ejemplos de enfermedades para las que el
presente vector viral sería útil incluyen, pero no se limitan a,
deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia del factor IX de
coagulación sanguínea humano en hemofilia B, y fibrosis quística,
que implicarían la sustitución del gen del receptor transmembrana de
fibrosis quística. Los vectores realizados en la presente invención
también pueden usarse para el tratamiento de trastornos
hiperproliferativos tales como artritis reumatoide o reestenosis
mediante la transferencia de genes que codifican para inhibidores
de la angiogénesis o inhibidores del ciclo celular. La transferencia
de activadores de profármacos tales como el gen
VHS-TK también puede usarse en el tratamiento de
trastornos hiperproliferativos, incluyendo cáncer.
También son dianas adecuadas oncogenes tales
como ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst,
bcl y abl. Sin embargo, para su beneficio terapéutico,
estos oncogenes se expresarían como un ácido nucleico antisentido,
de modo que inhiben la expresión del oncogén. El término "ácido
nucleico antisentido" pretende hacer referencia a los
oligonucleótidos complementarios a las secuencias de base del ADN y
ARN que codifican para el oncogén. Cuando se introducen en una
célula diana, los oligonucleótidos antisentido, se unen
específicamente a su ácido nucleico diana e interfieren con la
transcripción, y el procesamiento, transporte y/o traducción de
ARN. La selección como diana de ADN bicatenario (bc) con
oligonucleótidos conduce a la formación de una triple hélice; la
selección como diana de ARN conducirá a la formación de una doble
hélice.
Pueden diseñarse construcciones antisentido para
unirse al promotor y otras regiones de control, exones, intrones o
incluso los límites de exón-intrón de un gen. Las
construcciones de ARN antisentido, o ADN que codifica para tales
ARN antisentido, pueden emplearse para inhibir la transcripción o
traducción génica o ambos, dentro de una célula huésped, o bien
in vitro o bien in vivo, tal como dentro de un animal
huésped, incluyendo un sujeto humano. Las secuencias de ácido
nucleico que comprenden "nucleótidos complementarios" son
aquéllas que pueden aparearse entre bases según las reglas de
complementariedad de Watson-Crick convencionales. Es
decir, que unas purinas más grandes se aparearan entre bases con
unas pirimidinas más pequeñas para formar sólo combinaciones de
guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada con cada
timidina (A:T), en el caso de ADN, o adenina apareada con uracilo
(A:U) en el caso de ARN.
Tal como se usa en el presente documento, los
términos "complementario" o "secuencias antisentido"
significan secuencias antisentido que son sustancialmente
complementarias por toda su longitud y tienen muy pocos
apareamientos erróneos de bases. Por ejemplo, las secuencias de
ácido nucleico de quince bases de longitud pueden denominarse
complementarias cuando tienen un nucleótido complementario en las
posiciones trece o catorce con sólo uno o dos apareamientos
erróneos. Naturalmente, las secuencias de ácido nucleico que son
"completamente complementarias" serán secuencias de ácido
nucleico que son completamente complementarias por toda su longitud
y no tienen apareamientos erróneos de bases.
Mientras que toda o parte de la secuencia del
gen puede emplearse en el contexto de construcción antisentido,
estadísticamente, cualquier secuencia de 17 bases de largo debe
producirse sólo una vez en el genoma humano y, por tanto, ser
suficiente para especificar una secuencia diana única. Aunque los
oligómeros más cortos son más fáciles de preparar y aumentar la
accesibilidad in vivo, otros numerosos factores están
implicados en la determinación de la especificidad de hibridación.
Tanto la afinidad de unión como la especificidad de secuencia de un
oligonucleótido a su diana complementaria aumentan con el aumento de
la longitud. Se contempla que se usen oligonucleótidos de 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más pares de bases. Puede
determinarse fácilmente si un ácido nucleico antisentido dado es
eficaz en la selección como diana del gen de la célula huésped
correspondiente, simplemente sometiendo a prueba las construcciones
in vivo para determinar si se ve afectada la función del gen
endógeno o si se ve afectada la expresión de genes relacionados que
tienen secuencias complementarias.
En ciertas realizaciones, puede desearse emplear
construcciones antisentido que incluyan otros elementos, por
ejemplo, aquéllos que incluyen propina
C-5-pirimidinas. Se ha demostrado
que los oligonucleótidos que contienen análogos propina
C-5 de uridina y citidina se unen al ARN con alta
afinidad y son potentes inhibidores antisentido de la expresión
génica (Wagner et al., 1993).
Como alternativa al suministro de antisentido
dirigido, pueden usarse ribozimas dirigidas. El término
"ribozima" se refiere a una enzima a base de ARN que puede
seleccionar como diana y escindir secuencias de bases particulares
en ADN y ARN del oncogén. Las ribozimas pueden o bien dirigirse
directamente a las células, en forma de oligonucleótidos de ARN que
incorporan secuencias de ribozima, o bien introducirse en la célula
como un constructo de expresión que codifica para el ARN ribosómico
deseado. Las ribozimas pueden usarse y aplicarse de manera muy
similar a la descrita para los ácidos nucleicos antisentido.
Otros genes terapéuticos pueden incluir genes
que codifican para antígenos tales como antígenos virales, antígenos
bacterianos, antígenos fúngicos o antígenos parasitarios. Los virus
incluyen picornavirus, coronavirus, togavirus, flavivirus,
rhabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenvirus,
reovirus, retrovirus, papovavirus, parvovirus, herpesvirus,
poxvirus, hepadnavirus y virus espongiforme. Dianas virales
preferidas incluyen influenza, virus del herpes simples 1 y 2,
sarampión, viruela, polio o VIH. Los patógenos incluyen
tripanosomas, tenias, lombrices, helmintos. Además, pueden
seleccionarse como diana de esta manera marcadores tumorales tales
como antígeno fetal o antígeno específico prostático. Ejemplos
preferidos incluyen proteínas de envuelta de VIH y antígenos de
superficie de hepatitis B. La administración de un vector según la
presente invención para los fines de vacunación requeriría que los
antígenos asociados al vector fueran suficientemente no inmunógenos
para permitir la expresión a largo plazo del transgén, para el que
se desearía una fuerte respuesta inmunológica. Preferiblemente, la
vacunación de un individuo sólo se requeriría con poca frecuencia,
tal como cada año o cada dos años, y proporciona protección
inmunológica a largo plazo frente al agente infeccioso.
Con el fin de que el vector viral efectúe la
expresión de un transcrito que codifica para un gen terapéutico, el
polinucleótido que codifica para el gen terapéutico estará bajo el
control transcripcional de un promotor y una señal de
poliadenilación. Un "promotor" hace referencia a una secuencia
de ADN reconocida por la maquinaria de síntesis de la célula
huésped, o maquinaria de síntesis introducida, que se requiere para
iniciar la transcripción específica de un gen. Una señal de
poliadenilación hace referencia a la secuencia de ADN reconocida por
la maquinaria de síntesis de la célula huésped, o maquinaria de
síntesis introducida, que se requiere para dirigir la adición de
una serie de nucleótidos al final del transcrito de ARNm para su
apropiado procesamiento y tráfico del transcrito fuera del núcleo
al citoplasma para su traducción. La frase "bajo control
transcripcional" significa que el promotor está en la ubicación
correcta en relación con el polinucleótido para controlar el inicio
y la expresión de ARN polimerasa del polinucleótido.
El término promotor se usará en este caso para
hacer referencia a un grupo de módulos de control transcripcional
que se agrupan alrededor del sitio de iniciación para la ARN
polimerasa II. Muchos de los pensamientos acerca de cómo se
organizan los promotores derivan de los análisis de varios
promotores virales, incluyendo aquéllos para la timidina quinasa
(tk) de VHS y las unidades de transcripción tempranas de SV40. Estos
estudios, que aumentaron con trabajo más reciente, han demostrado
que los promotores se componen de módulos funcionales
diferenciados, consistiendo cada uno en aproximadamente
7-20 pb de ADN, y que contienen uno o más sitios de
reconocimiento para las proteínas activadoras o represoras de la
transcripción.
Al menos un módulo en cada promotor funciona
para colocar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo
más conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que
carecen de caja TATA, tales como el promotor para el gen
desoxinucleotil transferasa terminal de mamíferos y el promotor para
los genes de expresión tardía de SV40, un elemento diferenciado que
se superpone al propio sitio de inicio ayuda a fijar el lugar de
iniciación.
Elementos de promotor adicionales regulan la
frecuencia de iniciación de la transcripción. Normalmente, se
ubican en la región 30-110 pb en sentido de 5' del
sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que varios
promotores contienen también elementos funcionales en el sentido de
3' del sitio de inicio. Frecuentemente, el espacio entre los
elementos de promotor es flexible, de modo que se conserva la
función de promotor cuando se invierten o mueven los elementos de
promotor unos con respecto a otros. En el promotor tk, puede
aumentarse el espacio entre los elementos de promotor hasta
separados por 50 pb antes de que comience a disminuir la actividad.
Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales
pueden funcionar o bien cooperativamente o bien independientemente
para activar la transcripción.
Se cree que no es importante el promotor
particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de
ácido nucleico de interés, siempre que pueda dirigir la expresión
del ácido nucleico en la célula seleccionada como diana. Por tanto,
cuando se selecciona como diana una célula humana, es preferible
colocar la región codificante de ácido nucleico adyacente a y bajo
el control de un promotor puede expresarse en una célula humana.
Hablando de manera general, un promotor de este tipo puede incluir
un promotor o bien humano o bien viral.
En diversas realizaciones, pueden usarse el
promotor del gen de expresión precoz de citomegalovirus (CMV)
humano, el promotor temprano de SV40, repetición terminal larga de
virus de sarcoma de Rous, \beta-actina, el
promotor de insulina de rata y gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa, para obtener un alto nivel
de expresión de la secuencia codificante de interés. También se
contempla el uso de otros promotores de fagos virales o celulares
de mamíferos o bacterianos que se conocen bien en la técnica para
lograr la expresión de una secuencia codificante de interés,
siempre que los niveles de expresión sean suficientes para un fin
dado. Empleando un promotor con propiedades bien conocidas, puede
optimizarse el nivel y patrón de expresión de la proteína de
interés tras la transfección o transformación.
La selección de un promotor que se regula en
respuesta a señales sintéticas o fisiológicas específicas puede
permitir la expresión inducible del producto génico. Por ejemplo, en
el caso en el que la expresión de un transgén, o transgenes cuando
se utiliza un vector multicistrónico, es tóxica para las células en
las que el vector se produce, puede ser deseable impedir o reducir
la expresión de uno o más de los transgenes. Ejemplos de transgenes
que pueden ser tóxicos para la línea de células productoras son
genes proapoptóticos y de citocinas. Varios sistemas de promotores
inducibles están disponibles para la producción de vectores virales
en los que el producto del transgén puede ser tóxico.
El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad,
CA) es un sistema de este tipo. Se diseña este sistema para
permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de
mamífero. Consiste en un mecanismo de expresión estrechamente
regulado que prácticamente no permite expresión de nivel basal del
transgén, pero una inducibilidad de más de 200 veces. El sistema se
basa en el receptor heterodimérico de ecdisona de Drosophila,
y cuando la ecdisona o un análogo tal como muristerona A se une al
receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión
del transgén en sentido de 3' consiguiéndose altos niveles de
transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor
heterodimérico se expresan constitutivamente a partir de un vector,
mientras que el promotor de respuesta a ecdisona, que activa la
expresión del gen de interés, está en otro plásmido. Por tanto,
sería útil la modificación mediante ingeniería de este tipo de
sistema en el vector de transferencia génica de interés. La
cotransfección de plásmidos que contienen el gen de interés y los
monómeros del receptor en la línea de células productoras
permitiría entonces la producción del vector de transferencia génica
sin la expresión de un transgén potencialmente tóxico. En el
momento apropiado, la expresión del transgén podría activarse con
ecdisona o muristerona A.
Otro sistema inducible que sería útil es el
sistema Tet-Off^{TM} o
Tet-On^{TM} (Clontech, Palo Alto, CA)
desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard,
1992; Gossen et al., 1995). Este sistema también permite que
se regulen altos niveles de expresión génica en respuesta a
tetraciclina o derivados de tetraciclina tales como doxiciclina. En
el sistema Tet-On^{TM}, la expresión génica se
activa en presencia de doxicicilina, mientras que en el sistema
Tet-Off^{TM}, la expresión génica se activa en
ausencia de doxiciclina. Estos sistemas se basan en dos elementos
reguladores derivados del operón de resistencia a tetraciclina de
E. coli. La secuencia de operador de tetraciclina a la que se
une el represor de tetraciclina, y la proteína represora de
tetraciclina. Se clona el gen de interés en un plásmido detrás de un
promotor que tiene elementos de respuesta a tetraciclina presentes
en él. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador denominado
transactivador controlado por tetraciclina, que se compone, en el
sistema Tet-Off^{TM}, del dominio VP16 del virus
del herpes simple y el represor de tetraciclina de tipo natural. Por
tanto, en ausencia de doxiciclina, la transcripción está activada
constitutivamente. En el sistema Tet-On^{TM}, el
represor de tetraciclina no es de tipo natural y en presencia de
doxiciclina activa la transcripción. Para la producción de vectores
de terapia génica, sería preferible el sistema
Tet-Off^{TM} de modo que las células productoras
puedan hacerse crecer en presencia de tetraciclina o doxiciclina e
impedir la expresión de un transgén potencialmente tóxico, pero
cuando se introduce el vector en el paciente, la expresión génica
estaría activa constitutivamente.
En algunas circunstancias, sería deseable
regular la expresión de un transgén en un vector de terapia génica.
Por ejemplo, pueden utilizarse diferentes promotores virales con
intensidades de actividad variables dependiendo del nivel de
expresión deseado. En células de mamífero, se usa a menudo el
promotor temprano inmediato de CMV para proporcionar una activación
transcripcional intensa. También se han usado versiones modificadas
del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles
reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión
de un transgén en células hematopoyéticas, se usan a menudo
promotores retrovirales tales como las LTR de VLM o VTMM. Otros
promotores virales que pueden usarse dependiendo del efecto deseado
incluyen SV40, LTR de VRS, LTR de VIH-1 y
VIH-2, promotores de adenovirus tales como de la
región E1A, E2A o MLP, LTR de VAA, virus del mosaico de coliflor,
VHS-TK y virus de sarcoma aviar.
De manera similar, pueden usarse promotores
específicos de tejidos para efectuar la transcripción en tejidos
específicos o células de modo que se reduzca la toxicidad potencial
o efectos no deseados a tejidos no seleccionados como diana. Por
ejemplo, pueden usarse promotores tales como el PSA, probasina,
fosfatasa de ácido prostático o calicreína glandular específica de
la próstata (hK2), para dirigir la expresión génica en la próstata.
De manera similar, pueden usarse los siguientes promotores para
dirigir la expresión génica en otros tejidos (tabla 3).
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas indicaciones, puede ser deseable
activar la transcripción en momentos específicos tras la
administración del vector de terapia génica. Esto puede hacerse con
promotores tales como aquéllos que son regulables por hormonas o
citocinas. Por ejemplo, en las aplicaciones de terapia génica en las
que la indicación es un tejido gonadal en el que se producen o al
que se envían esteroides específicos, puede ser ventajoso el uso de
promotores regulados por andrógenos o estrógenos. Tales promotores
que son regulables por hormonas incluyen VTMM, MT-1,
ecdisona y RuBisco. Se espera que otros promotores regulados por
hormonas tales como aquéllos que responden a hormonas tiroideas,
pituitarias o adrenales, sean útiles en la presente invención. Los
promotores que responden a citocinas y proteínas inflamatorias que
pueden usarse, incluyen cininógeno K y T (Kageyama et al.,
1987), c-fos, TNF-alfa, proteína
reactiva-C (Arcone et al., 1988),
haptoglobina (Oliviero et al., 1987), suero amiloide A2,
C/EBP alfa, IL-1,
IL-6 (Poli y Cortese, 1989), complemento C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, alfa-1 glicoproteína ácida (Prowse y Baumann, 1988), alfa-1 antitripsina, lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1998), angiotensinógeno (Ron et al., 1991), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por glucocorticoide y metal pesado), estromelisina (inducible por éster de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2-macroglobulina y alfa-1-antiquimotripsina.
IL-6 (Poli y Cortese, 1989), complemento C3 (Wilson et al., 1990), IL-8, alfa-1 glicoproteína ácida (Prowse y Baumann, 1988), alfa-1 antitripsina, lipoproteína lipasa (Zechner et al., 1998), angiotensinógeno (Ron et al., 1991), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por glucocorticoide y metal pesado), estromelisina (inducible por éster de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2-macroglobulina y alfa-1-antiquimotripsina.
Se prevé que los promotores que son regulables
en el ciclo celular pueden ser útiles en la presente invención. Por
ejemplo, en un vector de terapia génica bicistrónico, el uso de un
promotor de CMV fuerte para activar la expresión de un primer gen
tal como p16 que detiene las células en la fase G1, puede seguirse
mediante la expresión de un segundo gen tal como p53 bajo el
control de un promotor que es activo en la fase G1 del ciclo
celular, proporcionando así un "segundo golpe" que empuje la
célula hacia la apoptosis. Pueden usarse otros promotores tales
como aquéllos de diversas ciclinas, PCNA,
galectina-3, E2F1, p53 y BRCA1.
También pueden usarse promotores específicos de
tumores tales como osteocalcina, elemento que responde a la hipoxia
(HRE), MAGE-4, ACE,
alfa-fetoproteína, GRP78/BiP y tirosinasa, para
regular la expresión génica en células tumorales. Otros promotores
que pueden usarse según la presente invención incluyen promotores
regulables por Lac, inducibles por quimioterapia (por ejemplo, MDR)
e inducibles por calor (hipertermia), inducibles por radiación (por
ejemplo, EGR (Joki et al., 1995)),
alfa-inhibina, promotores de ARN pol III, ARNt met
y de otros de aminoácidos, ARNnp U1 (Bartlett et al.),
MC-1, PGK, -actina y alfa-globina.
En Walther y Stein (1996) se enumeran muchos otros promotores que
pueden ser útiles.
Se prevé que cualquiera de los promotores
mencionados anteriormente solo o en combinación con otros puede ser
útil según la presente invención dependiendo de la acción deseada.
Además, la lista de promotores no debe interpretarse como que es
exhaustiva o limitante, los expertos en la técnica conocerán otros
promotores que pueden usarse junto con los promotores y métodos
dados a conocer en el presente documento. Una lista adicional de
promotores se proporciona en la tabla 4.
Además el promotor puede caracterizarse como un
promotor inducible. Un promotor inducible es un promotor que es
inactivo o presenta baja actividad excepto en presencia de una
sustancia inductora. Algunos ejemplos de promotores que pueden
incluirse como parte de la presente invención incluyen, pero no se
limitan a, MT II, VTMM, colagenasa, estromelisina, SV40, gen MX
murino, \alpha-2-macroglobulina,
gen h-2kb del MHC de clase I, HSP70, proliferina,
factor de necrosis tumoral, o gen \alpha de hormona estimulante
del tiroides. Los inductores asociados se muestran en la tabla 5.
Se entiende que puede usarse cualquier promotor inducible en la
práctica de la presente invención y que todos los promotores de este
tipo se encontrarán dentro del alcance de la invención
reivindicada.
En diversas realizaciones, el promotor del gen
de expresión precoz de citomegalovirus (CMV) humano, el promotor
temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de sarcoma
de Rous pueden usarse para obtener una expresión de alto nivel del
polinucleótido de interés. También se contempla el uso de otros
promotores virales o celulares de mamíferos o de fagos bacterianos
que se conocen bien en la técnica para lograr la expresión de
polinucléotidos, siempre que los niveles de expresión sean
suficientes para producir un efecto de inhibición del
crecimiento.
Empleando un promotor con propiedades bien
conocidas, puede optimizarse el nivel y patrón de expresión de un
polinucleótido tras la trasfección. Por ejemplo, la selección de un
promotor que es activo en células específicas, tales como
tirosinasa (melanoma), alfa-fetoproteína y albúmina
(tumores de hígado), CC10 (tumor pulmonar) y antígeno específico de
próstata (tumor de próstata) permitirá la expresión específica de
tejidos del gen terapéutico.
Originariamente, se detectaron potenciadores
como elementos genéticos que aumentaban la transcripción desde un
promotor ubicado en una posición distante en la misma molécula de
ADN. Esta capacidad de actuar sobre una gran distancia tuvo poco
precedente en estudios clásicos de regulación transcripcional
procariota. Un trabajo posterior demostró que las regiones de ADN
con actividad potenciadora se organizan de manera muy similar a los
promotores. Es decir, están compuestas de muchos elementos
individuales, cada uno de los cuales se une a una o más proteínas
transcripcionales.
La distinción básica entre potenciadores y
promotores es operacional. Una región potenciadora como un todo
debe poder estimular la transcripción a distancia; esto no es
necesariamente cierto de una región promotora o sus elementos
componentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno o más
elementos que dirijan el inicio de la síntesis de ARN en un sitio
particular y en una orientación particular, mientras que los
potenciadores carecen de estas especificidades. Los promotores y
potenciadores a menudo se solapan y son contiguos, pareciendo a
menudo que tienen una organización modular muy similar.
Además, también puede usarse cualquier
combinación promotor/potenciador (según la base de datos de
promotores eucariotas (EPDB)) para activar la expresión de un
constructo particular. El uso de un sistema de expresión
citoplasmático T3, T7 o SP6 es otra posible realización. Las células
eucarióticas pueden apoyar la transcripción citoplasmática desde
ciertos promotores bacteriófagos si se proporciona la bacteriófago
polimerasa apropiada, o bien como parte del complejo de suministro
o bien como un vector de expresión genética adicional.
Cuando se emplea un inserto de ADNc, normalmente
se deseará incluir una señal de poliadenilación para efectuar una
poliadenilación apropiada del transcrito génico. No se cree que la
naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la
práctica satisfactoria de la invención, y puede emplearse cualquier
secuencia de este tipo. Se ha encontrado que tales señales de
poliadenilación como aquéllas de SV40, hormona de crecimiento
bovino y el gen de la timidina quinasa del virus de la herpes
simple, funcionan bien en varias células diana.
Con el fin de crear las líneas de células
cooperadoras y crear vectores de adenovirus recombinantes para su
uso con las mismas, deben suministrarse a la célula diversas
construcciones genéticas (es decir, ADN). Una manera de lograr esto
es por medio de transducciones virales usando partículas virales
infecciosas, por ejemplo, mediante la transformación con un vector
de adenovirus de la presente invención. Alternativamente, puede
emplearse virus retrovirales o de papiloma bovino, ambos de los
cuales permiten la transformación permanente de una célula huésped
con un(os) gen(es) de interés. En otras situaciones,
el ácido nucleico que va transferirse no es infeccioso, es decir,
está contenido en una partícula viral infecciosa. Este material
genético debe basarse en métodos no virales para su
transferencia.
También se contemplan varios métodos no virales
para la transferencia de construcciones de expresión a células de
mamífero cultivadas. Éstos incluyen precipitación con fosfato de
calcio (Graham y Van Der Ebm 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe
et al., 1990), DEAE-dextrano (Gopal, 1985),
electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986;
Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland y
Weintraub, 1985), liposomas cargados de ADN (Nicolau y Sene, 1982;
Fraley et al., 1979), sonicación celular (Fechheimer et
al., 1897), bombardeo de genes usando microproyectiles de alta
velocidad (Yang et al., 1990) y transfección mediada por
receptores (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988).
Una vez que se ha suministrado el constructo a
la célula, el ácido nucleico que codifica para el gen terapéutico
puede colocarse y expresarse en diferentes sitios. El ácido nucleico
que codifica para el gen terapéutico puede integrarse de manera
estable en el genoma de la célula. Esta integración puede estar en
la ubicación y orientación afines mediante recombinación homóloga
(sustitución génica) o puede integrase en una ubicación aleatoria,
no específica (incremento de la expresión génica). El ácido nucleico
puede mantenerse de manera estable en la célula como un segmento
separado, episómico de ADN. Tales segmentos de ácidos nucleicos o
"episomas" codifican para secuencias suficientes para permitir
el mantenimiento y la replicación independientes de o en
sincronización con el ciclo de la célula huésped. Cómo se suministra
el constructo de expresión a una célula y dónde en la célula
permanece el ácido nucleico depende del tipo de constructo de
expresión empleado.
El constructo de expresión puede consistir
simplemente en el ADN recombinante desnudo o plásmidos. La
transferencia del constructo puede realizarse mediante cualquiera
de los métodos mencionados anteriormente que permeabilizan física o
químicamente la membrana celular. Esto es particularmente aplicable
para la transferencia in vitro, sin embargo, también puede
aplicarse para su uso in vivo. Dubensky et al. (1984)
inyectó satisfactoriamente ADN de poliomavirus en forma de
precipitados con CaPO_{4} en el hígado y bazo de ratones adultos y
recién nacidos demostrando replicación viral activa e infección
aguda. Benvenistry y Neshif (1986) también demostraron que la
inyección intraperitoneal directa de plásmidos precipitados con
CaPO_{4} da como resultado la expresión de los genes
transfectados. Se prevé que el ADN que codifica para CAM también
puede transferirse de manera similar in vivo y expresar
CAM.
La transferencia de un constructo de expresión
de ADN desnudo a las células puede implicar el bombardeo de
partículas. Este método depende de la capacidad de acelerar
microproyectiles cubiertos con ADN a una alta velocidad
permitiéndoles atravesar las membranas celulares y entrar en las
células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han
desarrollado varios dispositivos para la aceleración de pequeñas
partículas. Un dispositivo de este tipo se basa en una descarga de
alto voltaje para generar una corriente eléctrica, que a su vez
proporciona la fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los
microproyectiles usados han consistido en sustancias biológicamente
inertes tales como perlas de oro o tungsteno.
El constructo de expresión puede quedar atrapado
en un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares
caracterizadas por una membrana de doble capa de fosfolípidos y un
medio acuoso interno. Los liposomas multilaminares tienen múltiples
capas lipídicas separadas por medio acuoso. Se forman
espontáneamente cuando se suspenden fosfolípidos en un exceso de
disolución acuosa. Los componentes lipídicos experimentan
autotransposición antes de la formación de estructuras cerradas y
atrapar agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh
y Bachhawat, 1991).
El suministro de ácido nucleico mediado por
liposomas y la expresión de ADN foráneo in vitro ha sido muy
satisfactoria. Usando el gen de \beta-lactamasa,
Wong et al. (1980) demostraron la viabilidad del suministro
mediado por liposomas y la expresión de ADN foráneo en células de
embrión de pollo, HeLa y hepatoma cultivadas. Nicolau et
al., (1987) consiguió una transferencia génica mediada por
liposomas satisfactoria en ratas tras inyección intravenosa.
También se incluyen distintos enfoques comerciales que implican la
tecnología de "lipofección".
El liposoma puede complejarse con un virus
hemaglutinante (HVJ). Se ha demostrado que esto facilita la fusión
con la membrana celular y promueve la entrada a la célula de ADN
encapsulado en liposomas (Kaneda et al., 1989). El liposoma
puede complejarse o emplearse junto con proteínas cromosómicas
nucleares que no son histonas (HMG-1) (Kato et
al., 1991). Además, el liposoma puede complejarse o emplearse
junto con tanto HVJ como HMG-1. Dado que tales
construcciones de expresión se han empleado satisfactoriamente en la
transferencia y expresión de ácido nucleico in vitro e in
vivo, entonces éstos son aplicables para la presente
invención.
Otras construcciones de expresión que pueden
emplearse para suministrar un ácido nucleico que codifica para un
gen terapéutico a células, son vehículos de suministro mediado por
receptores. Éstos aprovechan la absorción selectiva de
macromoléculas mediante endocitosis mediada por receptores en casi
todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica
del tipo de célula de diversos receptores, el suministro puede ser
altamente específico (Wu y Wu, 1993).
Generalmente, los vehículos que se dirigen a
genes mediados por receptores consisten en dos componentes: un
ligando específico del receptor celular y un agente de unión al ADN.
Se han usado varios ligandos para la transferencia de genes mediada
por receptores. Los ligandos más extensamente caracterizados son
asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y transferrina (Wagner
et al., 1990). Recientemente, una neoglicoproteína sintética,
que reconoce el mismo receptor que ASOR, se ha usado como vehículo
de suministro de genes (Ferkol et al., 1993; Perales et
al., 1994) y también se ha usado el factor de crecimiento
epidérmico (EGF) para suministrar genes a células de carcinoma
escamoso (Myers, documento EPO 0273085).
El vehículo de suministro puede comprender un
ligando y un liposoma. Por ejemplo, Nicolau et al., (1987)
emplearon lactosilceramida, un asialogangliósido con galactosa
terminal, incorporado en liposomas, y observó un aumento en la
absorción del gen de insulina mediante los hepatocitos. Por tanto,
es factible que un ácido nucleico que codifique para un gen
terapéutico también pueda suministrarse específicamente a un tipo de
célula tal como células prostáticas, epiteliales o tumorales,
mediante cualquier número de sistemas
receptor-ligando con o sin liposomas. Por ejemplo,
puede usarse el antígeno específico de próstata humana (Watt et
al., 1986) como receptor para el suministro mediado de un ácido
nucleico en el tejido de la próstata.
En el contexto de la presente invención, pueden
usarse nucleasas para eliminar ácidos nucleicos contaminantes. Las
nucleasas a modo de ejemplo incluyen Benzonase®, Pulmozyme®; o
cualquier otra ADNasa o ARNasa usada comúnmente en la técnica.
Enzimas tales como Benzonaze® degradan el ácido
nucleico y no tienen actividad proteolítica. La capacidad de
Benzonase® para hidrolizar rápidamente ácidos nucleicos hace que la
enzima sea ideal para reducir la viscosidad del lisado celular. Se
conoce bien que los ácidos nucleicos pueden adherirse a partículas
derivadas de células tales como virus. La adhesión puede interferir
con la separación debido a aglomeración, el cambio en el tamaño de
la partícula o el cambio en la carga de la partícula, dando como
resultado poco si algún producto se recupera con un esquema de
purificación dado. Benzonase® es muy adecuada para reducir la carga
de ácido nucleico durante la purificación, eliminando así la
interferencia y mejorando la producción.
Como con todas las endonucleasas, Benzonase®
hidroliza enlaces fosfodiéster internos entre nucleótidos
específicos. Tras la digestión completa, todos los ácidos nucleicos
libres presentes en la disolución se reducen a oligonucleótidos de
2 a 4 bases de longitud.
La presente invención emplea varias
purificaciones diferentes para purificar los vectores adenovirales
de la presente invención. Tales técnicas incluyen aquéllas basadas
en sedimentación y cromatografía y se describen en más detalle a
continuación en el presente documento.
Existen dos métodos de centrifugación en
gradiente de densidad, la técnica zonal de tasa y la técnica
isopícnica (densidades iguales), y pueden usarse ambas cuando se
requiera la separación cuantitativa de todos los componentes de una
mezcla de partículas. También se usan para la determinación de
densidades de flotación y para la estimación de los coeficientes de
sedimentación.
La separación de partículas mediante la técnica
zonal de tasa se basa en las diferencias de tamaño o tasas de
sedimentación. La técnica implica la aplicación en capa cuidadosa de
una disolución de muestra en la parte superior de un gradiente de
densidad líquida preformado, cuya densidad más alta supera la de las
partículas más densas que van a separase. Entonces, la muestra se
centrifuga hasta que se efectúa el grado de separación deseado, es
decir, durante suficiente tiempo para que las partículas se
desplacen a través del gradiente para formar bandas o zonas
diferenciadas que se separan según las velocidades relativas de las
partículas. Dado que la técnica depende del tiempo, la
centrifugación debe terminarse antes de que cualquiera de las zonas
separadas sedimente en el fondo del tubo. Se ha usado el método para
la separación de enzimas, hormonas, híbridos de
ARN-ADN, subunidades ribosómicas, orgánulos
subcelulares, para el análisis de distribución de tamaños de las
muestras de polisomas y para los fraccionamientos de
lipoproteína.
La muestra se aplica en capa en la parte
superior de un gradiente de densidad continuo que abarca todo el
intervalo de densidades de partícula que van a separarse. Por tanto,
la densidad máxima del gradiente siempre debe superar la densidad
de la partícula más densa. Durante la centrifugación, la
sedimentación de las partículas se produce hasta que la densidad de
flotación de la partícula y la densidad del gradiente son iguales
(es decir, cuando p_{p} = p_{m} en la ecuación 2.12). En este
punto, no se produce sedimentación adicional, independientemente de
cuánto tiempo continúe la centrifugación, porque las partículas
están flotando sobre un colchón de material que tiene una densidad
mayor que la suya propia.
La centrifugación isopícnica, a diferencia de la
técnica zonal de tasa, es un método de equilibrio, agrupándose las
partículas para formar zonas cada una a su propia densidad de
flotación característica. En los casos en los que, tal vez, no se
requieran todos los componentes en una mezcla de partículas, puede
seleccionarse un intervalo de gradiente en el que los componentes
no deseados de la mezcla sedimenten en el fondo del tubo de
centrifugación, mientras que las partículas de interés sedimenten a
sus respectivas posiciones isopícnicas. Una técnica de este tipo
implica una combinación de los enfoques tanto zonales de tasa como
isopícnicos.
La centrifugación isopícnica depende solamente
de la densidad de flotación de la partícula y no su forma o tamaño
y es independiente del tiempo. Por tanto, las proteínas solubles que
tienen una densidad muy similar (por ejemplo,
p = 1,3 g cm^{-3} en disolución de sacarosa), normalmente no pueden separarse mediante este método, mientras que los orgánulos subcelulares (por ejemplo, aparato de Golgi, p = 1,11 g cm^{-3}, mitocondria, p = 1,19 g cm^{-3} y peroxisomas, p = 1,23 g cm^{-3} en disolución de sacarosa) pueden separarse eficazmente.
p = 1,3 g cm^{-3} en disolución de sacarosa), normalmente no pueden separarse mediante este método, mientras que los orgánulos subcelulares (por ejemplo, aparato de Golgi, p = 1,11 g cm^{-3}, mitocondria, p = 1,19 g cm^{-3} y peroxisomas, p = 1,23 g cm^{-3} en disolución de sacarosa) pueden separarse eficazmente.
Como alternativa a la aplicación en capa de la
mezcla de partículas que va a separase en un gradiente preformado,
la muestra se mezcla inicialmente con el medio de gradiente para dar
una disolución de densidad uniforme, "autoformándose" el
gradiente por el equilibrio de sedimentación, durante la
centrifugación. En este método (denominado método de isodensidades
en equilibrio), generalmente se hace uso de las sales de metales
pesados (por ejemplo, cesio o rubidio), sacarosa, sílice coloidal o
metrizamida.
La muestra (por ejemplo, ADN) se mezcla
homogéneamente con, por ejemplo, una disolución concentrada de
cloruro de cesio. La centrifugación de la disolución de cloruro de
cesio concentrado da como resultado la sedimentación de las
moléculas de CsCl para formar un gradiente de concentración y por
tanto un gradiente de densidad. Las moléculas de muestra (ADN), que
se distribuyen inicialmente de manera uniforme por todo el tubo
ahora o bien suben o bien sedimentan hasta que alcanzan una región
en la que la densidad de la disolución es igual a su propia
densidad de flotación, es decir, su posición isopícnica, en la que
se agruparan para formar zonas. Esta técnica tiene la desventaja de
que a menudo se requieren tiempos de centrifugación muy largos (por
ejemplo, 36 a 48 horas) para establecer el equilibrio. Sin embargo,
comúnmente se usa en centrifugación analítica para determinar la
densidad de flotación de una partícula, la composición de base del
ADN bicatenario y para separar las formas de ADN lineares de
las
circulares.
circulares.
Muchas de las separaciones pueden mejorarse
aumentando las diferencias de densidad entre las diferentes formas
de ADN mediante la incorporación de isótopos pesados (por ejemplo,
^{15}N) durante la biosíntesis, una técnica usada por Leselson y
Stahl para elucidar el mecanismo de replicación de ADN en
Escherichia coli, o mediante la unión de iones de metales
pesados o de colorantes tales como bromuro de etidio. También se han
usado gradientes isopícnicos para separar y purificar virus y
analizar lipoproteínas de plasma humano.
En ciertas realizaciones de la invención, sería
deseable producir adenovirus purificado. Los expertos en la técnica
conocen bien las técnicas de purificación. Estas técnicas tienden a
implicar el fraccionamiento del medio celular para separar las
partículas de adenovirus de otros componentes de la mezcla. Habiendo
separado las partículas adenovirales de los otros componentes,
puede purificarse el adenovirus usando técnicas cromatográficas y
electroforéticas para lograr la purificación completa. Los métodos
analíticos particularmente adecuados para la preparación de una
partícula adenoviral pura de la presente invención son cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía por exclusión de tamaño;
electroforesis en gel de poliacrilamida. Un método de purificación
particularmente eficiente que se emplea junto con la presente
invención es HPLC.
Ciertos aspectos de la presente invención se
refieren a la purificación, y en realizaciones particulares, la
purificación sustancial, de una partícula adenoviral. El término
"purificado" tal como se usa en el presente documento,
pretende hacer referencia a una composición, aislable de otros
componentes, en la que se purifica la partícula adenoviral hasta
cualquier grado en relación con su forma que puede obtenerse de
manera natural. Por tanto, una partícula adenoviral purificada
también hace referencia a un componente adenoviral, libre del
ambiente en que puede producirse de manera natural.
Generalmente, "purificado" hará referencia
a una partícula adenoviral que se ha sometido a un fraccionamiento
para eliminar otros diversos compuestos, y cuya composición conserva
sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se usa el
término "sustancialmente purificado", esta denominación hará
referencia a una composición en la que la partícula, proteína o
péptidos forma el principal componente de la composición, tal como
constituyendo aproximadamente el 50% o más de los constituyentes en
la composición.
Los expertos en la técnica conocerán diversos
métodos para cuantificar el grado de purificación de una proteína o
péptido a la luz de la presente descripción. Éstos incluyen, por
ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa,
o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción
mediante análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la
pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la
fracción, compararla con la actividad específica del extracto
inicial, y calcular así el grado de pureza, evaluado en el presente
documento con un "número de veces de purificación".
Naturalmente, las unidades reales usadas para representar la
cantidad de actividad dependerán de la técnica de ensayo particular
elegida para seguir la purificación, y si la proteína o el péptido
expresado exhiben o no una actividad detectable.
No hay un requisito general sobre que el
adenovirus se proporcione siempre en su estado más purificado. De
hecho, se contempla que productos sustancialmente menos purificados
tendrán utilidad en ciertas realizaciones. La purificación parcial
puede conseguirse usando menos etapas de purificación en
combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de
purificación general. Por ejemplo, se aprecia que un cromatografía
en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato
de HPLC generalmente dará como resultado una purificación de más
veces que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía a
baja presión. Los métodos que presentan un menor grado de
purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación
total del producto de proteína, o en mantener la actividad de una
proteína expresada.
Naturalmente, se entiende que las técnicas
cromatográficas y otras técnicas de purificación conocidas por los
expertos en la técnica también pueden emplearse para purificar
proteínas expresadas por los vectores adenovirales de la presente
invención. La cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía
líquida de alta resolución son técnicas de purificación a modo de
ejemplo empleadas en la purificación de partículas adenovirales y se
describen en más detalle a continuación en el presente
documento.
Cromatografía de intercambio iónico. El
principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que
la afinidad de una sustancia por el intercambiador depende tanto de
las propiedades eléctricas del material como de la afinidad
relativa de otras sustancias cargadas en el disolvente. Por tanto,
el material unido puede eluirse cambiando el pH, alterando así la
carga del material, o añadiendo materiales de competición, de las
cuales las sales son sólo un ejemplo. Dado que diferentes sustancias
tienen propiedades eléctricas diferentes, las condiciones para la
liberación varían con cada especie molecular unida. En general, para
conseguir una buena separación, los métodos de elección son o bien
elución en gradiente de fuerza iónica continua o bien elución
gradual (A menudo no se usa un gradiente de pH solo, porque es
difícil establecer un gradiente de pH sin aumentar simultáneamente
la fuerza iónica). Para un intercambiador aniónico, o bien se
aumenta gradualmente cada pH y fuerza iónica o bien se aumenta la
fuerza iónica sola. Para un intercambiador catiónico, se aumenta
tanto el pH como la fuerza iónica. La elección real del
procedimiento de elución normalmente es un resultado de ensayo y
error y de consideraciones de estabilidad. Por ejemplo, para
materiales inestables, es mejor mantener el pH bastante
constante.
Un intercambiador iónico es un sólido que tiene
grupos cargados unidos químicamente a los que están unidos
electrostáticamente iones; puede intercambiar estos iones por iones
en disolución acuosa. Los intercambiadores iónicos pueden usarse en
cromatografía en columna para separar moléculas según la carga,; en
realidad otras características de la molécula son normalmente
importantes de modo que el comportamiento cromatográfico es
sensible a la densidad de carga, distribución de carga y el tamaño
de la molécula.
El principio de la cromatografía de intercambio
iónico es que las moléculas cargadas se adsorben de manera
reversible en intercambiadores iónicos de modo que puedan unirse o
eluirse las moléculas cambiando el entorno iónico. La separación en
intercambiadores iónicos se consigue normalmente en dos fases: en
primer lugar, las sustancias que van a separarse se unen al
intercambiador, usando las condiciones que proporcionan una unión
estable y estrecha; entonces la columna se eluye con tampones de
diferente pH, fuerza iónica, o composición y los componentes del
tampón compiten con el material unido por los sitios de unión.
Normalmente, un intercambiador iónico es una red
o matriz tridimensional que contiene grupos cargados unidos
covalentemente. Si un grupo está cargado negativamente,
intercambiará iones positivos y es un intercambiador catiónico. Un
grupo típico usado en los intercambiadores catiónicos es el grupo
sulfónico, SO_{3}^{-}. Si un H^{+} está unido al grupo, se
dice que el intercambiador está en forma ácida; por ejemplo, puede
intercambiar un H^{+} por un Na^{+} o dos H^{+} por un
Ca^{2-}. El grupo ácido sulfónico se denomina intercambiador
catiónico fuertemente ácido. Otros grupos comúnmente usados son
carboxilo e hidroxilo fenólico, ambos intercambiadores catiónicos
débilmente ácidos. Si el grupo cargado es positivo (por ejemplo, un
grupo amino cuaternario) es un intercambiador aniónico fuertemente
básico. Los intercambiadores aniónicos débilmente básicos más
comunes son grupos aminoalifáticos o aromáticos.
La matriz puede prepararse de diversos
materiales. Los materiales usados comúnmente son dextrano, celulosa,
agarosa y copolímeros de estireno y vinilbenceno en los que el
divinilbenceno tanto reticula las cadenas de poliestireno como
contiene los grupos cargados. La tabla 6 proporciona la composición
de muchos intercambiadores iónicos.
La capacidad total de un intercambiador de iones
mide su capacidad para captar grupos intercambiables por miligramo
de peso seco. Este número se suministra por el fabricante y es
importante porque, si se supera la capacidad, los iones pasarán a
través de la columna sin unirse.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La capacidad disponible es la capacidad en
condiciones experimentales particulares (es decir, pH, fuerza
iónica). Por ejemplo, la medida en que se carga un intercambiador
iónico depende del pH (el efecto del pH es menor con
intercambiadores iónicos fuertes). Otro factor es la fuerza iónica
porque los iones pequeños cerca de los grupos cargados compiten con
la molécula de la muestra por estos grupos. Esta competición es
bastante eficaz si la muestra es una macromolécula porque un
coeficiente de difusión más alto de los iones pequeños significa un
mayor número de encuentros. Claramente, a medida que la
concentración de tampón aumenta, la competición pasa a ser más
reñida.
La porosidad de la matriz es una característica
importante porque los grupos cargados están tanto dentro como fuera
de la matriz y porque la matriz también actúa como tamiz molecular.
Puede que moléculas grandes no puedan penetrar en los poros; así la
capacidad disminuirá con el aumento de las dimensiones moleculares.
La porosidad de las resinas a base de poliestireno se determina
mediante la cantidad de reticulación por el divinilbenceno (la
porosidad disminuye con cantidades crecientes de divinilbenceno).
Con las series Dowex y AG, el porcentaje de divinilbenceno se
indica mediante un número tras un X-, por tanto, Dowex
50-X8 es divinilbenceno al 8%.
Los intercambiadores iónicos vienen en una
variedad de tamaños de partículas, denominados tamaño de malla. Una
malla más fina significa un ratio de superficie con respecto a
volumen aumentada y por tanto, capacidad aumentada y menos tiempo
para que se produzca el intercambio para un volumen dado del
intercambiador. Por otro lado, malla fina significa una velocidad
de flujo lenta, que puede aumentar la propagación por difusión. El
uso de partículas muy finas, aproximadamente 10 \mum de diámetro y
alta presión para mantener un flujo adecuado se denomina
cromatografía de líquidos de alta resolución o a alta presión o
simplemente HPLC.
Una colección de este tipo de intercambiadores
que tienen propiedades tan diferentes (carga, capacidad, porosidad,
malla) hace que la selección del apropiado para conseguir una
separación particular sea difícil. En los siguientes ejemplos se
describe cómo decidir sobre el tipo de material de la columna y las
condiciones para la unión y
elución.
elución.
Existen varias decisiones que han de tomarse
cuando se emplea cromatografía de intercambio iónico como técnica.
La primera decisión que ha de tomarse es si el intercambiador debe
ser aniónico o catiónico. Si los materiales que van a unirse a la
columna tienen una sola carga (es decir, o bien positiva o bien
negativa), la elección es clara. Sin embargo, muchas sustancias
(por ejemplo, proteínas, virus), tienen cargas tanto negativas como
positivas y la carga neta depende del pH. En tales casos, el factor
primario es la estabilidad de la sustancia a diversos valores de
pH. La mayoría de las proteínas tienen un intervalo de estabilidad
de pH (es decir, en el que no se desnaturalizan) en el que están
cargadas o bien positivamente o bien negativamente. Por tanto, si
una proteína es estable a valores de pH por encima del punto
isoeléctrico, debe usarse un intercambiador aniónico; si es estable
a valores por debajo del punto isoeléctrico, se requiere un
intercambiador catiónico.
La elección entre intercambiadores fuertes y
débiles también se basa en el efecto del pH sobre la carga y la
estabilidad. Por ejemplo, si se somete a cromatografía una sustancia
ionizada débilmente que requiere muy bajo o alto pH para su
ionización, se busca un intercambiador iónico fuerte porque funciona
por todo el intervalo de pH. Sin embargo, si la sustancia es lábil,
se prefieren intercambiadores iónicos débiles porque los
intercambiadores fuertes a menudo pueden distorsionar una molécula
de modo que se desnaturaliza la molécula. Naturalmente, el pH al
que la sustancia es estable debe coincidir con el estrecho intervalo
de pH en el que se carga un intercambiador débil particular. Los
intercambiadores iónicos débiles también son excelentes para la
separación de moléculas con una alta carga de aquéllas con una
carga pequeña, porque los iones cargados débilmente no se unen
normalmente. Los intercambiadores débiles también muestran mayor
resolución de sustancias si las diferencias de carga son muy
pequeñas. Si una macromolécula tiene una carga muy fuerte, puede ser
imposible eluir desde un intercambiador fuerte y de nuevo puede ser
preferible un intercambiador débil. En general, los intercambiadores
débiles son más útiles que los intercambiadores fuertes.
Los intercambiadores Sephadex y
Bio-gel ofrecen una ventaja particular para
macromoléculas que son inestables a baja fuerza iónica. Dado que
las reticulaciones en estos materiales mantienen la insolubilidad de
la matriz incluso si la matriz es altamente polar, puede hacerse
que la densidad de los grupos ionizables sea varias veces mayor que
lo que es posible con intercambiadores iónicos de celulosa. El
aumento de la densidad de carga significa un aumento en la afinidad
de modo que puede llevarse a cabo la adsorción a mayores fuerzas
iónicas. Por otro lado, estos intercambiadores conservan algunas de
sus propiedades de tamizado molecular, de modo que a veces
diferencias de peso molecular anulan la distribución provocada por
las diferencias de carga; el efecto de tamizado molecular también
puede potenciar la separación.
Dado que la capacidad disponible es grande, las
moléculas pequeñas se separan de la mejor manera en matrices con un
tamaño de poro pequeño (alto grado de reticulación), mientras que
las macromoléculas necesitan un tamaño de poro grande. Sin embargo,
a excepción del tipo Sephadex, la mayoría de los intercambiadores
iónicos no ofrecen la oportunidad de hacer coincidir la porosidad
con el peso molecular.
Los intercambiadores iónicos de celulosa han
demostrado ser los mejores para purificar moléculas grandes tales
como proteínas y polinucleótidos. Esto es porque la matriz es
fibrosa, y por tanto todos los grupos funcionales, están en la
superficie y disponibles incluso para las moléculas más grandes. Sin
embargo, en muchos casos, formas perladas tales como
DEAE-Sephacel y DEAE-Biogel P son
más útiles porque hay una velocidad de flujo y el efecto de
tamizado molecular ayuda en la separación.
La selección de un tamaño de malla es siempre
difícil. Un tamaño de malla pequeño mejora la resolución pero
reduce la velocidad de flujo, que aumenta la propagación de zona y
reduce la resolución. Por tanto, el tamaño de malla apropiado
normalmente se determina de manera empírica.
Dado que los tampones mismos consisten en iones,
también pueden intercambiarse, y puede verse afectado el equilibrio
de pH. Para evitar estos problemas, se adopta la regla de tampones:
usar tampones catiónicos con intercambiadores aniónicos y tampones
aniónicos con intercambiadores catiónicos. Dado que la fuerza iónica
es un factor en la unión, debe elegirse un tampón que tenga una
alta capacidad de tamponamiento, de modo que su fuerza iónica no
necesite ser muy alta. Además, para la mejor resolución,
generalmente se ha encontrado que las condiciones iónicas usadas
para aplicar la muestra a la columna (las denominadas condiciones
iniciales) deben estar cerca de aquéllas usadas para eluir la
columna.
La cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) se caracteriza por una separación muy rápida con
extraordinaria resolución de picos. Esto se logra mediante el uso
de partículas muy finas y alta presión para mantener una velocidad
de flujo adecuada. La separación puede conseguirse en cuestión de
minutos, o a lo mucho una hora. Además, sólo se necesita un volumen
muy pequeño de la muestra, porque las partículas son tan pequeñas y
bien empaquetadas que el volumen de huecos es una fracción muy
pequeña del volumen de lecho. Además, la concentración de la
muestra no necesita ser muy grande porque las bandas son tan
estrechas que hay muy poca dilución de la muestra.
La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC),
contemplada para su uso en la presente invención para la separación
de partículas virales, se basa en las propiedades hidrófobas de las
partículas presentadas al disolvente (Arakawa y Narhi, 1991). HIC a
menudo obvia el uso de grandes columnas de exclusión por tamaño y
aditivos tales como detergentes, PEG y disolventes orgánicos.
Se han usado resinas de HIC TosoHass para
purificar ADN de plásmidos de impurezas del lisado tales como
proteína residual, ARN y ADN genómico. Por ejemplo, pueden
purificarse concentrados de ADN mediante cromatografía de
interacción hidrófoba usando resina de HIC ToyoPearl Butyl 650 (Bio
Science Contract Production Corp.). Además, se han definido
condiciones propicias para la reducción de 4 a 6 logaritmos de
endotoxina, dependiendo de la elección de la resina. De manera
significativa, estas resinas no son costosas y son escalables.
Partiendo de ADN plasmídico de calidad relativamente alta, se
purifican preparaciones de ADN plasmídico concentrado mediante dos
pases a través de un solo tipo resina, dando como resultado una
pureza de ADN plasmídico consistente con las especificaciones
establecidas por la FDA para vacunas de ADN plasmídico en masa.
Además, se ha descrito un método para la producción a gran escala y
purificación en una sola etapa de anticuerpos biespecíficos (Manzke
et al., 1997). En este estudio, se usó HIC para resolver
anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monoespecíficos y
complementos de medio de cultivo en una sola etapa cromatográfica.
Por tanto, HIC ofrece reducciones potenciales en el tiempo de
trabajo, coste, pérdida de partículas y riesgo de contaminación.
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Se someten a prueba vectores de adenovirus
recombinantes preparados según la presente invención, para
garantizar que cumplen las especificaciones de liberación de
producto deseadas. Estas especificaciones se definen mediante
ensayos para determinar la actividad biológica, el título de virus,
la pureza del producto final, la identidad y las características
fisicoquímicas. Estos ensayos se realizan en diversas fases de
producción incluyendo el análisis del lisado celular sin procesar,
masa en proceso (antes del filtro), masa en proceso (tras el
filtro) y el producto final. El lisado celular sin procesar se
define como el material que se elimina del aparato de cultivo
celular antes de que se haga cualquier procesamiento. La masa en
proceso (antes del filtro) se define como el material que se ha
procesado mediante la etapa de purificación por HPLC, pero no se ha
sometido a filtración estéril antes de dispensar en viales. La masa
en proceso (tras el filtro) se define como el material que se ha
sometido a filtración estéril y está listo para dispensarse en
viales. El producto final se define como el material que se ha
colocado en viales individuales y está listo para su almacenamiento
o uso. Se entenderá que pueden usarse protocolos similares como
pruebas para Ad5CMV-p53 así como otros vectores
adenovirales que contienen los mismos o diferentes transgenes. La
siguiente sección describe ensayos representativos usados para
someter a prueba el producto de adenovirus recombinante.
La prueba de ensayo de seguridad general (C.F.R.
610.11) se realiza para detectar la presencia de contaminantes
tóxicos extraños. Se inoculan cobayas (Hartley albinos, cualquier
sexo) y ratones (Swiss no consanguíneos, cualquier sexo), por vía
intraperitoneal, con el artículo de prueba diluido en agua estéril
para inyección y se observan signos manifiestos de mala salud,
pérdida de peso o muerte durante el periodo de prueba. Se miden sus
pesos justo antes de y tras la finalización del periodo de prueba de
7 días. Una prueba que pasa es una en la que los controles
funcionan tal como se esperaba y los animales inoculados con el
artículo de prueba tienen respuestas satisfactorias.
Este ensayo detecta la presencia de secuencias
de ácido nucleico de VAA mediante amplificación por PCR con un
conjunto de cebadores dirigidos hacia una región conservada en el
gen de la cápside. El ADN amplificado a partir del artículo de
prueba se ejecuta en gel de agarosa que contienen bromuro de etidio
y se visualiza mediante fotografía. En resumen, se extrae el ADN de
la muestra de prueba y se analizan 0,5 microgramos mediante PCR. La
amplificación por PCR se realiza usando cebadores oligonucleotídicos
de VAA específicos para la región de la cápside de VAA. También se
analiza el ADN control negativo y positivo. Se determina la
aceptación del ensayo mediante la ausencia de cualquier banda en la
muestra control negativo, y la banda de tamaño esperado en la
muestra control positivo. Para el presente ensayo, una banda
específica de 459 pb es el tamaño esperado. Una prueba que pasa
para el artículo de prueba es la ausencia de la banda de 459 pb.
Este ensayo determina si están presentes
contaminantes virales adventicios en el artículo de prueba, mediante
la inoculación y observación de tres tipos de células indicadoras.
La presencia de contaminación viral se determina mediante
observaciones del efecto citopático (CPE) u otros efectos
visualmente discernibles, hemaglutinación, y hemadsorción. Las
células indicadoras incluyen MRC-5, una línea
diploide de pulmón humano; Vero, una línea de riñón de mono verde
africano; y HeLa, una línea celular de carcinoma epitelioide humano.
En resumen, se siembran las tres líneas celulares indicadoras en
placas de 6 pocillos y se mantienen durante aproximadamente 24
horas. Entonces, se inoculan los cultivos con 0,5 ml de muestra
adenoviral o controles de virus y se permite que haya absorción
durante 1 hora a 36ºC. Entonces, se retira el virus y se reemplaza
por medio de cultivo, y se observan los pocillos durante 14 días
para determinar evidencia de CPE. También se sometió a prueba cada
pocillo para determinar hemadsorción y hemaglutinación usando tres
tipos de eritrocitos. Todos los fluidos de cultivo se traspasan de
forma ciega a placas de cultivo adicionales de células indicadoras y
se observan para determinar CPE durante otros 14 días.
Para aceptar este ensayo, preferiblemente deben
cumplirse ciertos criterios. Éstos incluyen: 1) cada uno de los
virus control positivo provocan preferiblemente CPE en las líneas de
células indicadoras en las que se inoculan; 2) cada uno de los
virus control positivo debe producir preferiblemente hemadsorción
y/o hemaglutinación con al menos un tipo de eritrocito a 4ºC y/o
36ºC en uno o más puntos de tiempo con cada una de las líneas de
células indicadoras en las que se inoculan; 3) las líneas de células
indicadoras inoculadas con el control negativo no deben presentar
preferiblemente ningún CPE, hemadsorción o hemaglutinación. Una
prueba que pasa para el artículo de prueba preferiblemente es la
ausencia de CPE, hemadsorción y hemaglutinación.
Se diseña este ensayo para detectar la presencia
de virus que no provocan un efecto discernible en sistemas de
cultivo celular in vitro, pero pueden provocar efectos
indeseados in vivo. El diseño experimental utiliza
inoculaciones de ratones adultos y lactantes, cobayas y huevos de
gallina embrionados, y es similar a aquel usado por el Instituto
Británico para Normas y Controles Biológicos (British Institute
for Biological Standards and Control). Esta prueba incluye
pases de manera ciega de homogeneizados a animales y/o huevos de
gallina sucesivos para aumentar la probabilidad de detección de
contaminantes virales a bajo nivel.
Este método de prueba es tal como sigue. Se
inocularán ratones lactantes por vía intraperitoneal, per os,
y por vía intracraneal y se observarán durante 14 días. Se usará
una sola fuente de tejido emulsionado (sin piel ni tracto
gastrointestinal) de todos los ratones que sobreviven, para inocular
ratones adicionales usando las mismas vías. También se inocularan
ratones control con tratamiento simulado. Se inocularán ratones
adultos de ambos sexos por vía intraperitoneal, per os, por
vía intradérmica y por vía intracraneal y se observarán durante 28
días. También se inocularán controles de tratamiento simulado. Se
inocularán cobayas adultos de ambos sexos por vía intraperitoneal y
por vía intracraneal, y se observarán durante 28 días. También, se
inocularán cobayas control de tratamiento simulado. Se inoculará el
saco vitelino de huevos de gallina embrionados de
6-7 días de edad y se incubarán al menos nueve días.
Los sacos vitelinos se recogerán, agruparán y se someterá a subpase
una suspensión al 10% a nuevos huevos de gallina embrionados. Nueve
días después, se evaluará la viabilidad de los huevos.
Los criterios de aceptación para los ensayos
incluyen animales saludables al inicio de las pruebas, y las
pruebas se considerarán válidas si aproximadamente el 90% de los
ratones adultos control, aproximadamente el 80% de ratones
lactantes control, aproximadamente el 80% de los huevos de gallina
embrionados, y aproximadamente el 75% de las cobayas control
sobreviven el periodo de incubación y no muestran lesiones en el
sitio de inoculación o no muestran signos de infección viral. El
artículo de prueba no se considerará contaminado, si aproximadamente
el 80% de los animales permanecen saludables y sobreviven el
periodo de observación y si aproximadamente el 95% de los animales
usados en la prueba no muestra ninguna lesión de cualquier tipo en
el sitio de inyección y no muestra ningún signo de infección
viral.
Este ensayo permite una determinación
cuantitativa de la proteína total en el producto final. El ensayo
usa el procedimiento del kit Pierce BCA. En resumen, se preparan
las muestras por duplicado y se colocan en una placa de
microtitulación. Se prepara un patrón de albúmina sérica bovina
(BSA) y se coloca en una placa de microtitulación como control.
Para un control negativo, se coloca diluyente en una placa de
microtitulación. Se dispensa el reactivo BCA en las placas de
microtitulación y se incuban las placas para permitir desarrollo de
color. Entonces las placas se leen espectrofotométricamente a 550
nm, y se calculan las concentraciones de la muestra de prueba
basándose en el patrón de BSA. El contenido de proteína preferido en
BCA es de 200 a 500 microgramos por 1 x 10e12 partículas virales.
El contenido de proteína más preferible es de 260 a 320 microgramos
por 1 x 10e12 partículas virales. La concentración de proteína
determinada mediante este ensayo se usa para calcular la cantidad
de proteína que debe cargarse en el gel de SDS-PAGE
para el análisis de restricción.
Se usan ensayos de esterilidad (documentados en
U.S.P. XXIII <71>) tanto en la fase de producto en masa como
final. Las pruebas de esterilidad son mediante filtración en
membrana y se realizan en un sistema de aislamiento de pared blanda
para minimizar la contaminación en el laboratorio de las muestras
sometidas a prueba. Preferiblemente, todos los artículos de prueba
deben pasar la prueba de esterilidad.
La prueba de carga microbiana se usa para
detectar la carga microbiana en una muestra de prueba mediante el
filtrado de la muestra de prueba en un filtro de membrana, colocando
el filtro de membrana sobre placas de agar de soja tríptica y agar
Sabouraud y para observar el crecimiento después de
2-5 días de incubación. También se someten a ensayo
suspensiones con niveles conocidos de Bacillus subtilis y
Candida albicans para confirmar la idoneidad del ensayo.
En resumen, el método de prueba es tal como
sigue. Se deben almacenar las muestras de prueba hasta 24 horas a
2-8ºC antes de someter a prueba. Pueden congelarse
las muestras de reserva que no se van a someter a prueba en el
plazo de 24 horas, a menos de -60ºC. Se preparan controles negativos
(diluyente estéril) mediante el filtrado de 100 mL de diluyente
estéril a través de una unidad de filtro para análisis usando un
vacío. Se retira el filtro de membrana de la unidad y se coloca
sobre una placa de agar de soja tríptica precalentada. El
procedimiento se repite usando una segunda unidad de filtro y se
coloca el filtro sobre una placa de agar Sabouraud precalentada. Se
someten a prueba las muestras de prueba en proceso mediante el
filtrado de 5 x 10 mL de lisado celular sin procesar en 5 filtros
separados ó 10 mL de producto en masa prefiltrado en un único
filtro. Se retira cada membrana de la unidad y se coloca sobre una
placa de agar de soja tríptica precalentada. El procedimiento se
repite usando un segundo conjunto de unidades de filtro y se coloca
el filtro sobre placas de agar Sabouraud precalentadas. Se preparan
controles positivos de Bacillus subtilis mediante el filtrado
de 50 mL de diluyente estéril a través de una unidad de filtro para
análisis usando un vacío. Se retira el filtro de membrana de la
unidad y se coloca sobre una placa de agar de soja tríptica
precalentada. Se repite el procedimiento usando un control positivo
de Candida albicans usando una segunda unidad de filtro y el
filtro se coloca sobre una placa de agar Sabouraud precalentada. Las
placas de agar de soja tríptica se incuban a
30-35ºC durante 2-5 días. Las placas
de agar Sabouraud se incuban a 22-27ºC durante
5-7 días. Tras el periodo de incubación, se cuentan
las colonias en los filtros de membrana. Los ensayos son aceptables
cuando los controles negativos no presentan crecimiento y los
controles positivos presentan 1-100 colonias por
filtro de membrana. Preferiblemente, el artículo de prueba debe
contener menos de o igual a 1000 unidades formadoras de colonias
por 100 mL del lisado celular sin procesar. Es más preferible que el
lisado celular sin procesar contenga menos de o igual a 500
unidades formadoras de colonias por 100 mL, y lo más preferible es
que el lisado sin procesar contenga menos de o igual a 10 unidades
formadoras de colonia por 100 mL. Lo más preferible es que el
producto en masa prefiltrado contenga menos de o igual a una unidad
formadora de colonia por 10 mL. Usando las técnicas de purificación
según la presente descripción, se han obtenido valores de carga
microbiana menores de 1 en la etapa de lisado celular sin procesar,
y de menos de 1 en la etapa de producto en masa prefiltrado.
El fin de esta prueba es medir la cantidad de
endotoxina bacteriana gram negativa en una muestra dada. Se realiza
el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) según la
USPXXIII usando un kit de prueba cromogénico comercial. Se usa para
cuantificar el nivel de endotoxina bacteriana gram negativa en las
muestras de prueba. Se realizan diluciones de las muestras con y
sin adición conocida de endotoxina, para la evaluación de los
efectos de inhibición o intensificación.
El método de prueba se realiza según las
indicaciones resumidas en el prospecto del kit de prueba, y es tal
como sigue. El ensayo se realiza en placas de 96 pocillos y se usa
agua libre de LAL como blanco de ensayo. Se prepara una curva
patrón que oscila desde 0,01 hasta 5,0 unidades de endotoxina/ml,
usando un patrón de endotoxina comercialmente disponible. Las
muestras de prueba se someten a prueba o bien puras o bien diluidas
apropiadamente en agua libre de endotoxina. Se preparan controles
positivos mediante la adición conocida de muestras de prueba a cada
dilución con 0,05 UE/mL. Todas las manipulaciones se realizan en
tubos de vidrio o poliestireno libres de pirógenos, usando puntas
de pipetas libres de pirógenos. Se incuba la placa de 96 pocillos
con blanco, curva patrón, muestras de prueba y control positivo
durante 10 minutos, tras lo cual se añade el reactivo LAL a cada
pocillo. Se lee la placa en un lector cinético a 405 nm durante 150
segundos y se expresan los resultados en UE/mL.
Para que el ensayo sea aceptable,
preferiblemente la curva patrón debe ser lineal con un valor de r de
-0,980 a 1,000, preferiblemente la pendiente de la curva deber ser
de -0,0.. a -0,100, preferiblemente la ordenada en el origen debe
ser de 2,5000 a 3,5000 y preferiblemente la recuperación de
endotoxina en el control positivo debe ser del
5-150% de la adición conocida. Es preferible que la
muestra tenga menos de cinco (5) UE/mL, más preferiblemente la
muestra tiene menos de 3 UE/mL, y lo más preferible es que la
muestra tenga menos de 0,05 UE/mL. Usando las técnicas de
purificación según la presente descripción, se han obtenido valores
de endotoxina de tan solo 0,15 en la etapa de producto en masa
prefiltrado y de tan solo 0,3 en la etapa de producto final.
Este ensayo detecta la presencia de
Mycoplasma en un artículo de prueba basándose en la capacidad
del Mycoplasma para crecer en uno cualquiera de los sistemas
de prueba: Aislamiento en agar y sistema de cultivo de células
Vero. El crecimiento se expresa mediante la formación de colonias,
el cambio en los indicadores de pH o la presencia de
Mycoplasma mediante tinción, dependiendo del sistema usado.
El ensayo se realiza usando un gran volumen de muestra. Los métodos
de prueba son tal como sigue. Se inoculan el artículo de prueba y
los controles positivos directamente sobre las placas de agar para
Mycoplasma y en caldo semisólido para Mycoplasma que
se subcultiva tres veces en placas de agar. Las muestras se incuban
tanto aeróbica como anaeróbicamente. En el día 14 tras la
infección, se examinan las placas de agar para evidenciar el
crecimiento. También se inocula el artículo de prueba directamente
en cultivos de células Vero y se incuban durante 3-5
días. Los cultivos se tiñen con fluorocromo que se une a ADN y se
evalúan microscópicamente mediante epifluorescencia para determinar
la presencia de Mycoplasma.
Para el ensayo de aislamiento en agar,
preferiblemente los controles positivos deben mostrar crecimiento de
Mycoplasma en al menos dos de las cinco placas directas de
cada tipo de medios y para cada condición de incubación, y en
semicaldo. Preferiblemente, las placas y botellas control negativo
deben mostrar ausencia de crecimiento de Mycoplasma. Para el
ensayo de cultivo en células Vero, preferiblemente los controles
positivos deben mostrar la presencia de Mycoplasma,
preferiblemente los controles negativos no deben mostrar presencia
de Mycoplasma, y preferiblemente todos los controles deben
mostrar la ausencia de contaminantes bacterianos o fúngicos.
Preferiblemente, el artículo de prueba será negativo para la
presencia de Mycoplasma.
Este método permite la evaluación de ADN
contaminante de la célula huésped en un producto final. Se extraen
y examinan las muestras de prueba para el ADN contaminante. El
método de prueba es tal como sigue. Se extraen las muestras y se
transfieren a nitrocelulosa. Se realiza la adición conocida de ADN
humano a las muestras de referencia diluidas, y se transfieren a
nitrocelulosa. Se preparan controles positivos mediante la adición
conocida de ADN humano en alícuotas de BSA y se transfieren a
nitrocelulosa. Se examina la nitrocelulosa, con todas las muestras
y controles, con una sonda de ADN humano marcado con ^{32}P. Se
aclara el filtro y se mide la radioactividad híbrida usando un
sistema de obtención de imágenes radioanalítico AMBIS. Se determina
el rendimiento aceptable del ensayo mediante controles que funcionan
tal como se esperaba, y preferiblemente un artículo de prueba debe
tener menos de o igual a 10 ng de ADN contaminante de la célula
huésped por 1 x 10^{12} partículas virales. Es más preferible que
el nivel de ADN humano contaminante sea inferior a 7 ng/1 x
10^{12} partículas virales, incluso más preferible que el nivel de
ADN humano contaminante sea inferior a 5 ng/ 1 x 10^{12}
partículas virales, incluso más preferible que el nivel de ADN
humano contaminante sea inferior a 3 ng/1 x 10^{12} partículas
virales y lo más preferible es que el nivel de ADN humano
contaminante sea inferior a 5 pg/1 x 10^{12} partículas virales.
Usando las técnicas de purificación según la presente descripción,
se han obtenido valores de ADN contaminante de tan solo 200 pg/mL en
la etapa de producto final y de 80 pg/mL en un lote en
desarrollo.
Se detecta el RCA presente en una población de
adenovirus de recombinación deficiente tal como
Ad5CMV-p53 mediante infección de células de
carcinoma humano A549 no competentes. Se hacen crecer las células
A549 en placas de cultivo celular para dar una monocapa de células
y entonces se infectan con la muestra de adenovirus que va
someterse a prueba. Tras 4 horas de tiempo de infección, se descarta
el sobrenadante y se cubre la monocapa de A549 con una mezcla que
contiene tanto medios de cultivo como agarosa. Tras la
solidificación, la agarosa limita cualquier célula infectada a la
formación de una única placa. Tras 14 días a 37ºC, se tiñe la
agarosa con rojo neutro y se cuentan las placas visualizadas. Se
preparan los controles positivos concomitantemente y contienen o
bien solo adenovirus de tipo natural o bien el artículo de prueba
con adiciones conocidas del adenovirus de tipo natural de modo que
pueda detectarse cualquier efecto inhibidor que proceda de la
muestra. Con el fin de caracterizar cualquier RCA observado, se
subcultivaron todas las placas y se caracterizaron por PCR. El
análisis por PCR se realiza usando sondas dirigidas contra la región
E1 con el fin de demostrar la presencia de la región E1 en el
vector, y contra la región E3 para excluir la presencia de virus de
tipo natural. Se ha demostrado que la presencia de E1 excluye la
presencia del gen p53 y que el RCA consiste en sólo construcciones
homólogas dobles.
La metodología de prueba es tal como sigue. Se
hace crecer una línea de carcinoma de pulmón humano, A549, hasta
subconfluencia en placas de cultivo celular y después se infectan
con la muestra de Ad5CMV-p53 que va someterse a
prueba a una MOI de menos de 200 partículas virales por célula.
Entonces, las células se exponen al virus durante un tiempo de
infección de 4 horas, se descarta el sobrenadante y se cubre la
monocapa de células con una superposición de medios/agarosa. De
manera concomitante, se prepara un control positivo que contiene
adenovirus de tipo natural y uno que contiene la muestra de prueba
con adición conocida de adenovirus de tipo natural, para garantizar
la sensibilidad del ensayo. Tras una incubación de 14 días a 37ºC,
se tiñe la superposición con rojo neutro para permitir la
visualización de alguna placa. Se cuentan las placas, se
seleccionan y transfieren a 0,8 mL de medios de cultivo y se someten
a tres ciclos de congelación-descongelación para
liberar el virus. Entonces, se usa el sobrenadante de la placa para
infectar placas de múltiples pocillos adicionales de células A549.
Se observan las células para determinar el CPE y se recoge el
sobrenadante de esas placas. El sobrenadante recogido se somete a
amplificación mediante PCR usando sondas dirigidas contra la región
E1 del genoma de adenovirus de tipo natural y contra la región E3
del virus adenovirus de tipo natural. Si está presente la región
E3, se clasifica el RCA como de tipo natural. Si sólo está presente
la región E1, se clasifica el RCA como un producto de recombinación
homóloga doble. Para que el ensayo se considere válido, todos los
controles deben funcionar tal como se espera. Es preferible que el
artículo de prueba contenga menos de 40 unidades formadoras de
placas en 1 x 10^{11} partículas virales. Es más preferible que el
artículo de prueba contenga menos de 4 unidades formadoras de
placas en 1 x 10^{11} partículas virales, y lo más preferible es
que el artículo de prueba contenga menos de 0,4 unidades formadoras
de placas en 1 x 10^{11} partículas virales. Usando las técnicas
de purificación según la presente descripción, se han obtenido
valores de RCA \leq 1 en 2,5 x 10^{11} partículas de virus en
la etapa de producto final.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se usa este ensayo para determinar niveles de
albúmina sérica bovina (BSA) contaminante en preparaciones
adenovirales. En ciertas series de producción de adenovirus
recombinante, se produce el vector en un sistema de cultivo celular
que contiene suero bovino. Este ensayo es un análisis de
inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) que detecta la presencia y
la cantidad de bajos niveles de BSA que permanecen en el producto
final.
El método de prueba es tal como sigue. Se
prepara una curva patrón que oscila desde 1,9 ng hasta 1125 ng/mL
de BSA purificado. Se prepara un control positivo mediante la
adición conocida de gelatina al 0,2% con 3,9, 15 y 62,5 ng /mL de
BSA. Una muestra control negativo es gelatina al 0,2% en solución
salina tamponada con Tris. Se somete a prueba la muestra de prueba
pura y en diluciones de 1:10 a 1:320. Se transfieren todas las
muestras y los controles a una placa de ensayo de ELISA, y se
detecta el contenido de BSA con un anticuerpo sonda específico para
BSA. Se leen las placas a 492 nm. Para que el ensayo se considere
válido, preferiblemente la DO_{492} del blanco deber ser inferior
a 0,350. Preferiblemente, el artículo de prueba debe contener menos
de 100 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales. Es más
preferible que el artículo de prueba contenga menos de 85 ng de BSA
por 1 x 10^{12} partículas virales, incluso es más preferible que
el artículo de prueba contenga menos de 75 ng de BSA por 1 x
10^{12} partículas virales, incluso es más preferible que el
artículo de prueba contenga menos de 65 ng de BSA por 1 x 10^{12}
partículas virales y lo más preferible es que el artículo contenga
menos de 1 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales. Usando
las técnicas de purificación según la presente descripción, se han
obtenido valores de BSA < 1,9 ng/1 x 10^{12} partículas de
virus en la etapa de producto final.
Este ensayo es para demostrar la capacidad de
p53 expresado a partir del producto final de
AdCMV-p53 para activar la transcripción. La función
bioquímica crítica de p53, que sustenta su actividad supresora de
tumores, es la capacidad para activar la transcripción. Las
proteínas mutantes no activan la transcripción en células de
mamífero. La actividad transcripcional de p53 humano se conserva en
levaduras, y los mutantes que son inactivos en células humanas
también son inactivos en levaduras. La detección de mutaciones en
p53 es posible en levaduras al someter a prueba la competencia
transcripcional de p53 humano expresado en Saccharomyces
cerevisiae deficiente en la síntesis de adenina debido a la
mutación en ADE2 pero que contiene una segunda copia de ADE2 en un
marco de lectura abierto controlado por un promotor que responde a
p53. La cepa de Saccharomyces cerevisae se cotransforma con
un plásmido linealizado y el fragmento p53 aislado de
Ad5CMV-p53. Los recombinantes expresarán
constitutivamente p53. Cuando se hace crecer en medios pobres en
adenina, la cepa de levadura aparecerá roja. Si la levadura lleva
un gen p53 de tipo natural, las colonias aparecerán blancas.
El método de prueba es tal como sigue. Se extrae
ADN del artículo de prueba usando un procedimiento de
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se aísla el inserto de ADN de
p53 del genoma viral tras la digestión de restricción. Se linealiza
un vector de expresión que contienen el promotor ADH1. Se
cotransforma la levadura (cepa yIG397) con el fragmento de ADN que
lleva el gen p53 del artículo de prueba y el vector de expresión
linealizado. Se forma un vector de expresión de p53 in vivo
mediante recombinación homóloga. Se hacen crecer los cultivos de
levadura durante de dos a tres días a 30ºC. El promotor ADH1
provoca recombinantes que expresan constitutivamente p53. La cepa
yIG397 de levadura es deficiente en síntesis de adenina debido a la
mutación en el gen endógeno ADE2, pero contiene una segunda copia
del marco de lectura abierto de ADE2 controlado mediante el promotor
ADH1 que responde a p53. Las colonias de yID397 que son mutantes de
ADE2 se vuelven rojas cuando se hacen crecer en placas con baja
adenina. Las colonias de yIG397 con p53 mutante también son rojas, y
las colonias que contienen p53 de tipo natural son blancas. Las
colonias rojas y las blancas se cuentan al final del ensayo. El
ensayo se considera válido si todos los controles funcionan tal
como se esperan, y preferiblemente el artículo de prueba debe
contener mutaciones en p53 a una frecuencia inferior al 3% para
pasar las especificaciones de liberación del producto. Es más
preferible que el artículo de prueba contenga menos del 2% de
mutaciones en p53, y lo más preferible es que el artículo de prueba
contenga un 0% de mutaciones en p53. Usando las técnicas de
purificación según la presente descripción, se han obtenido valores
de mutaciones en p53 \leq 1% en la etapa de producto final.
Este ensayo se usa para determinar el título del
material adenoviral en el producto final mediante la medición del
desarrollo de placas en células 293 humanas, que derivan de riñón
embrionario humano. Ad5CMV-p53 es de replicación
deficiente en células normales debido a la deleción de la región E1.
La función de E1 se proporciona en trans en células 293 que
contienen la región E1 del adenovirus tipo 5. Se utilizan diluciones
de cinco veces del artículo de prueba para cuantificar el
título.
El método de prueba es tal como sigue. Se
siembran las células 293 humanas en placas de cultivo tisular de 66
pocillos y se permite que crezcan las células hasta más del 90% de
confluencia antes de la infección. Se preparan diluciones del
vector para dirigirlos a 5-80 placas por pocillo. Se
usa un virus de referencia como control. Se someten a prueba dos
concentraciones para el control positivo usando seis repeticiones.
Se someten a prueba cuatro concentraciones por cada muestra usando
seis repeticiones. Se permite al vector infectar durante una hora
durante la cual las placas se sacuden cada 15 minutos para
garantizar una cobertura uniforme del virus. Tras el periodo de
incubación, las células se superponen con una disolución de agarosa
al 0,5%, y se incuban las células infectadas con virus durante seis
días, tiempo en el que se tiñen con rojo neutro. Las placas se
cuentan entre las cuatro y las 25 horas tras la tinción, dependiendo
del tamaño de las placas. Los pocillos que contienen más de 80
placas se clasifican como TNTC (demasiado numerosas para contar), y
los pocillos que no pueden contarse se marcan como NC (no contados)
y el ratio se anota en el registro. Se usan los recuentos de placas
y sus respectivas diluciones para calcular el título de la muestra.
Para que el ensayo se considere válido, preferiblemente los
pocillos control negativo no deben contener placas, preferiblemente
el título del control positivo debe estar dentro de un cuarto
(0,25) de logaritmo del título oficial del virus que va usarse como
control positivo, preferiblemente el % de CV para el control
positivo debe ser menor que o igual al 25%, y para cualquier
dilución en el control positivo, preferiblemente no debe haber más
de tres pocillos designados "NC".
En la etapa de prueba del producto final,
preferiblemente el artículo de prueba debe tener un título de 1 x
10^{7} a 1 x 19^{12} ufp /mL. Es más preferible que tenga un
título de 1 x 10^{9} a 1 x 10^{12} ufp (ufc)/mL, incluso más
preferible que tenga un título de 1 x 10^{10} a 1 x 10^{12}
ufp/mL, incluso más preferible que tenga un título de 5 x 10^{10}
a 1 x 10^{12} ufp/mL, y lo más preferible es que tenga un título
de 8 x 10^{10} a 1 x 10^{12} ufp/mL. Usando las técnicas de
purificación según la presente
descripción, se han obtenido valores de título de hasta 5 x 10^{12} partículas de virus/mL en la etapa de producto final.
descripción, se han obtenido valores de título de hasta 5 x 10^{12} partículas de virus/mL en la etapa de producto final.
Este ensayo mide la concentración, en partículas
virales/mL, para una muestra de material adenoviral. Este ensayo es
un ensayo espectrofotométrico que determina el número de partículas
totales en una muestra basada en la absorbancia a 260 nm. El
coeficiente de extinción usado para convertir partículas virales es
1 DO_{260} = 10^{12} partículas virales.
El método de prueba es tal como sigue. Se
preparan tres repeticiones para cada muestra usando una dilución
apropiada que caiga dentro del intervalo lineal del
espectrofotómetro. Se combina la muestra de virus con SDS al 1% (o
SDS al 10% para muestras de prueba diluidas) y agua hasta lograr un
volumen total de 150 microlitros. La muestra se incuba a
temperatura ambiente durante 15-30 minutos para
alterar el virión. Cada muestra se lee a A_{260} y A_{280} y la
densidad óptica media para las muestras repetidas se multiplica por
el factor de dilución para determinar las partículas virales/mL. El
ratio de partículas/UFP se determina usando el título determinado
mediante el ensayo de placas descrito anteriormente. Para que el
ensayo se considere válido, preferiblemente el % de CV para las
tres repeticiones de muestra deben ser menor que o igual al 10%.
Preferiblemente, la muestra de prueba debe contener de 1 x 10^{7}
a 2 x 10^{13} partículas virales/mL en la etapa de producto final.
Es más preferible que la muestra de prueba contenga entre
aproximadamente 0,8 x 10^{12} y 2 x 10^{13} partículas
virales/mL, y lo más preferible es que la muestra contenga entre
aproximadamente 1,2 x 10^{12} y 2 x 10^{13} partículas/mL. Lo
más preferible es que la A_{260}/A_{280} sea de 1,2 a 1,4. Es
preferible que el ratio de partículas/UFP sea inferior a 100,
incluso más preferible que sea inferior a 75, lo más preferible es
que sea de 10 a 60. Usando técnicas de purificación según la
presente descripción, se han obtenido valores de concentración de
partículas virales de hasta 5 x 10^{12} partículas de virus/mL en
la etapa de producto final.
El ensayo SAOS LM es un ensayo de bioactividad
que se realiza con el fin de determinar la actividad del componente
p53 de Ad5CMV-p53. El ensayo mide la inhibición del
crecimiento de células SAOS-LM (línea celular de
osteocarcinoma humano con una deleción de p53 homocigota).
Cualquier pérdida significativa de la actividad inhibidora en
comparación con un patrón indicaría la presencia de una cantidad
inaceptable de vector inactivo. La inhibición del crecimiento de
las células SAOS se sigue usando el colorante indicador azul de
Alamar, que se usa para medir cuantitativamente la proliferación
celular. Este colorante contiene un indicador de oxidación/reducción
(REDOX) colorimétrico. Dado que la actividad celular da como
resultado la reducción química del entorno celular, la inhibición
del crecimiento da como resultado un entorno oxidado que permite la
medida de la actividad de p53.
El método de prueba es tal como sigue. Se
siembran en placas de 96 pocillos las células SAOS y se hacen crecer
durante la noche a 37ºC hasta más del 75% de confluencia. Se
eliminan los medios de los pocillos y se exponen las células o bien
a control de medios, virus control positivo (MOI = 100) o bien a
diluciones variables de la muestra de prueba. Tras la exposición,
las células se incuban a 37ºC durante cuatro días. Se añade azul de
Alamar a los pocillos y se incuban las placas aproximadamente ocho
horas a 37ºC. Se determina la densidad celular mediante la lectura
de las placas a 570 nm. Para aceptar el ensayo, la DO_{570} del
control positivo debe ser inferior a 0,1 y la densidad celular del
control de los medios debe ser de al menos el 75% de confluencia.
Es preferible que la MOI del artículo de prueba que provoca el 50%
de la muerte celular sea de menos de 1000 partículas virales. Es
más preferible que el artículo de prueba tenga una MOI que provoque
el 50% de muerte celular de menos de 700 partículas virales, y lo
más preferible es que la MOI que provoca el 50% de muerte celular
sea de menos de 400 partículas virales. Usando las técnicas de
purificación según la presente descripción, se han obtenido valores
de bioactividad de hasta 250-260 en la etapa de
producto final.
Este ensayo es una evaluación cuantitativa del
número de partículas de Ad5CMV-p53 y la pureza de
muestras en proceso y de la estabilidad de las muestras del
producto final. El método permite la cuantificación de partículas
de Ad5CMV-p53 mediante un método por HPLC de
intercambio iónico.
El método de prueba es tal como sigue. Se usa
una columna Toso Haas
TSK-Gel-Q-5PW con
una fase móvil de gradiente salino tamponado para la separación de
partículas de virus e impurezas. Se prepara una curva de calibración
control de referencia en una columna recientemente instalada y se
explora a A_{260}. Se prepara un blanco y se prueba usando la
misma columna y método. La muestra que va someterse a prueba se
prepara mediante dilución con el mismo tampón de baja salinidad
usado en la formación del gradiente. La absorbancia de la muestra se
detecta a las longitudes de onda de 260 y 280 nm, y se determina el
total para todos los picos detectados. Se determina el ratio del
área para el pico de A_{260}/A_{280}, y se determina la
concentración para el pico de 260 nm mediante la comparación con la
curva de calibración de referencia. Los criterios de aceptación del
ensayo incluyen un perfil similar a muestras históricas y un ratio
A_{260}/A_{280} de 1,3 +/- 0,1. Preferiblemente, la muestra de
prueba debe tener una pureza de más de o igual al 98%. Es más
preferible que la pureza sea de más del 99%, y lo más preferible es
que la pureza sea más del 99,9%. Usando técnicas de purificación
según la presente descripción, se han obtenido valores de pureza del
virus de hasta el 99,8% en la etapa de producto final.
Este método permite la evaluación de ADN de
Ad5CMV-p53 mediante análisis con enzimas de
restricción. Las enzimas de restricción reconocen secuencias
específicas de pares de bares en el ADN, cortando el ADN en esos
sitios de restricción. Existe un número limitado de sitios de
reconocimiento dentro de un vector para cualquier enzima de
restricción particular. El ADN de la muestra de prueba se digiere
con dos enzimas de restricción y los fragmentos se separan
electroforéticamente en una matriz de gel de agarosa. Se comprueban
los fragmentos para determinar su número y tamaño.
El método de prueba es tal como sigue. El ADN se
extrae de partículas de vector usando una columna de centrifugación
de intercambio iónico comercialmente disponible. El ADN extraído se
cuantifica y se comprueba para determinar su pureza mediante el
análisis del ratio A_{260}/A_{280}. Se digieren aproximadamente
0,4-5 microgramos del ADN extraído, con una mezcla
de dos enzimas de restricción, Eco RI y Cla I. El ADN digerido se
carga en un gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio
junto a una cantidad igual de ADN no sometido a enzimas de
restricción de la misma muestra. Las muestras se separan por
electroforesis y se visualizan usando una fuente de luz
ultravioleta. Los datos se reúnen mediante fotografía. Los criterios
de aceptación del ensayo que deben cumplirse preferiblemente para
que el ensayo se considere válido es un ratio A_{260}/A_{280}
del ADN extraído de más de 1,6. Preferiblemente, el artículo de
prueba debe tener tamaños de los fragmentos de restricción que
coinciden con los tamaños de los fragmentos teóricos esperados de la
secuencia de Ad5CMV-p53. Los tamaños de banda
esperados son 486, 2320, 8494 y 24008 pares de bases.
Este método permite la evaluación de proteínas
totales en el producto final, que oscilan en tamaño desde 5 hasta
100 kDa mediante la separación según el peso molecular.
El método de prueba es tal como sigue. Las
proteínas totales se determinan usando un método de Pierce BCA
según el protocolo descrito anteriormente en esta sección. La
muestra de prueba, el patrón interno y los patrones de peso
molecular se preparan en tampón de muestra y se desnaturalizan por
calor. Todas las muestras y patrones se cargan en pocillos de un
gel de Tris-glicina previamente colado y se coloca
en un tanque de electroforesis que contiene tampón de
desplazamiento. El gel se procesa en un entorno de corriente
constante durante aproximadamente 90 minutos. Entonces, el gel se
retira del casete, se tiñe usando tinción de azul brillante de
Coomassie y elimina el tinte. Entonces, el gel se analiza usando
instrumento de exploración densitométrica, y se reúnen los datos
mediante fotografía. Alternativamente, se seca el gel para su
archivo. En todos los controles, es preferible la presencia de
proteínas esperadas y preferiblemente no debe haber proteínas
contaminantes. En la muestra de prueba, preferiblemente deben
observarse las bandas esperadas, sin bandas extras
significativas.
Este método somete a prueba la presencia de
proteína p53 en células transducidas con Ad5CMV-p53.
Este método es tal como sigue. Se siembran placas individuales de
cultivo tisular de 60 mm para las muestras de producto y las
muestras de control, a una densidad de 7 x 10^{5} células y se
hacen crecer a más del 80% de confluencia. El artículo de prueba se
diluye en medios para proporcionan 3,5 x 10^{8} partículas
virales/mL. Un control de referencia se diluye hasta 3,5 x 10^{8}
pv/ml y se prepara también un control negativo sin vector. Las
células se exponen a los medios que contienen producto durante una
hora durante la que se sacuden las placas, para garantizar la
distribución homogénea del vector. Al final de la hora, se añaden a
las placas medios adicionales y se incuban durante aproximadamente
cinco horas para dejar tiempo para la expresión de p53. Al final del
periodo de incubación, las células se tratan con tripsina y se
permite la recogida, se lavan con DPBS y se solubilizan con un
tampón de detergente. Se determina la cantidad total de proteína de
cada muestra y control mediante un método de cuantificación
colorimétrica (Pierce BCA). Para cada muestra y método, se cargan
3-5 microgramos de proteína en un gel junto con una
referencia de proteína p53 comercialmente adquirida, y se separan
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Las
proteínas en el gel se transfieren a una membrana PVDF y la
membrana se expone a un tampón de leche para bloquear sitios de
unión no específicos y entonces de manera secuencial se exponen a
los anticuerpos. El anticuerpo primario, un anticuerpo de ratón
anti-p53 humano se une específicamente a p53. El
anticuerpo secundario es una IgG de cabra anti-ratón
con peroxidasa de rábano (HRP) unida covalentemente. Se expone un
sustrato colorimétrico a la enzima HRP unida, lo que permite la
visualización de la proteína p53 en la inmunotransferencia. Para que
el ensayo se considere válido, preferiblemente la banda control de
p53 debe ser visible, y preferiblemente el control negativo no debe
mostrar expresión de p53. Preferiblemente, el artículo de prueba
debe mostrar expresión de p53.
Este método es una determinación gravimétrica
del volumen recuperable desde el cierre del recipiente para el
producto final de Ad5CMV-p53. El producto se
recupera a partir de siete viales usando jeringas de 3 cc taradas y
agujas de 1,25 pulg de calibre 21. Se pesa el producto y los pesos
se convierten en volumen usando el peso específico del producto de
1,03 g/mL. Debe cumplirse la calibración de la balanza antes de
pesar las muestras y es preferible que los siete viales sometidos a
prueba cumplan las especificaciones de 1,0 a 1,4 mL de volumen de
llenado recuperable. Es más preferible que el volumen de llenado
recuperable sea de 1,1 a 1,3 mL. El experto en la técnica entenderá
que el ensayo es un ejemplo para el producto de
Ad5CMV-p5, y que los expertos en la técnica podrán
modificar este ensayo para otros productos en otros tipos de cierres
de recipientes.
Este método permite la evaluación de la
descripción física del producto final. Se reúnen aproximadamente
siete mililitros de producto en un tubo de plástico transparente.
Un analista inspecciona el producto para documentar el color, la
transparencia y la presencia de cualquier materia particulada
macroscópica. Preferiblemente, el artículo de prueba debe ser de
transparente a opalescente y no contener materia particulada
macroscópica determinada mediante inspección visual.
Este método es una determinación del pH del
producto final de Ad5CMV-p53. Se colocan
aproximadamente 0,5 mL del producto en un tubo. El pH se determina
usando un pHmetro calibrado a una temperatura de 25 +/-5ºC.
Preferiblemente, las disoluciones patrón de pH deben demostrar un
intervalo de pendiente del 80-102%. Preferiblemente,
el pH del producto final debe estar entre aproximadamente 6 y
aproximadamente 9. Es más preferible que el pH esté entre
aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8,8, aún más preferible es que
el pH esté entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 8,6, y lo
más preferible es que el pH esté entre aproximadamente 7,5 y
aproximadamente 8,5.
El objetivo de esta prueba es evaluar la
identidad del genoma de Ad5CMV-p53 mediante la
medición de fragmentos de ADN generados tras la escisión de todo el
genoma viral (aproximadamente 35308 pares de bases). Cuando los
virus no purificados están contenidos en una mezcla de células tales
como un banco de virus, primero tiene que extraerse el ADN viral
del lisado celular sin procesar. Se digiere una alícuota de la
muestra con proteinasa K en presencia de SDS. Entonces, se extrae
el ADN usando una mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y
se precipita con etanol. La concentración de ADN se mide mediante
espectrometría UV. Entonces, se somete aproximadamente un
microgramo de ADN viral a digestión con enzimas de restricción. Se
realizan cuatro digestiones individuales, utilizando una batería de
tres enzimas de restricción en diferentes combinaciones. Entonces,
se separan los digestos y los marcadores de tamaño de ADN en un gel
de agarosa usando electroforesis y se tiñen con
Syb-Green. Los geles se integran usando una cámara y
una curva de calibración calculada para los patrones. Entonces, se
determina el tamaño de los fragmentos mayores de 500 pb y menores de
8000 pb. Preferiblemente, el tamaño de los fragmentos obtenidos
debe corresponder al tamaño teórico de los fragmentos obtenidos de
la secuencia teórica esperada. Preferiblemente, los tamaños de
fragmentos de la muestra de prueba deben corresponder con los
esperados de la secuencia de ADN.
Se usa este ensayo para determinar la identidad
de los bancos de células primarios y de trabajo de 293 mediante la
demostración de la presencia de la región E1. Usando dos pares de
cebadores de PCR específicos, uno dirigido contra la región E1
presente tanto en células 293 como en adenovirus de tipo natural y
otro dirigido contra la región E1 presente sólo en el adenovirus de
tipo natural. El método debe demostrar la identidad de las línea
celular 293 contenida en el artículo de prueba.
El método de prueba es tal como sigue. Tras la
descongelación, se cultivan las células del artículo de prueba
usando condiciones estándar en una placa de cultivo celular hasta
que se obtenga una monocapa de células. Entonces, se digieren las
células con proteinasa K para eliminar las proteínas, y se aísla el
ADN usando extracciones con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico
seguidas de precipitación con etanol. Se cuantifica el ADN extraído
y se comprueba para determinar la pureza mediante una exploración de
absorbancia de DO260 - DO280. Se realiza la reacción de PCR usando
los dos pares de cebadores dirigidos hacia E1 en el artículo de
prueba, y tanto en los controles de ADN positivos como negativos.
El control negativo es una línea de células de mamífero que no
contienen la región E1. El control positivo es un adenovirus de tipo
natural. Los productos de PCR para cada reacción se cargan en un
gel de agarosa y se registran los fragmentos obtenidos tras la
electroforesis y la tinción, usando fotografía. La línea de células
de mamífero que no portan E1 no debe presentar producto de
amplificación con ambos pares de cebadores de PCR, mientras que el
adenovirus de tipo natural debe mostrar el correcto producto de
amplificación con ambos pares de cebadores de PCR. El artículo de
prueba debe demostrar el correcto producto de amplificación con el
par de cebadores ubicado en la región E1, que se describe que está
presente en la célula 293, y debe ser negativo con el segundo para
de cebadores, que se sabe que sólo está presente en el genoma
adenoviral de tipo natural.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Cuando se purifica según los métodos expuestos
anteriormente, se considera que las partículas virales de la
presente invención pueden administrarse in vitro, ex
vivo o in vivo. Por tanto, será deseable preparar el
complejo como una composición farmacéutica apropiada para la
aplicación propuesta. Generalmente, esto implicará preparar una
composición farmacéutica que está esencialmente libre de pirógenos,
así como cualquier otra impureza que pueda ser perjudicial para
seres humanos o animales. Generalmente, también se deseará emplear
sales y tampones apropiados para hacer que el complejo sea estable y
para permitir la captación del complejo mediante células diana.
Las composiciones acuosas comprenden una
cantidad eficaz del constructo de expresión y el ácido nucleico
disuelto y dispersado en un vehículo o medio acuoso
farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones también pueden
denominarse inóculos. Las expresiones "farmacéutica o
farmacológicamente aceptables" hacen referencia a entidades y
composiciones moleculares que no producen una reacción adversa,
alérgica u otra reacción desfavorable cuando se administra a un
animal, o a un ser humano, según corresponda. Tal como se usa en el
presente documento, "vehículos farmacéuticamente aceptables"
incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión,
recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
isotónicos y que retardan la absorción y similares. El uso de tales
medios y agentes para principios activos farmacéuticamente se conoce
bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier agente o
medios convencionales sean incompatibles con el principio activo, se
considera su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden
incorporarse en las composiciones principios activos
complementarios.
Pueden prepararse disoluciones de los principios
activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables, en
agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como
hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en
glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en
aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas
preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento
de microorganismos.
Las partículas virales pueden incluir
preparaciones farmacéuticas clásicas para su uso en regímenes
terapéuticos, incluyendo su administración a seres humanos. La
administración de composiciones terapéuticas según la presente
invención será mediante cualquier vía común siempre que el tejido
diana esté disponible mediante esta ruta. Esto incluye la vía oral,
nasal, bucal, recta, vaginal o tópica. Alternativamente, la
administración será mediante inyección ortotópica, intradérmica
subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa. Tales
composiciones normalmente se administrarían como composiciones
farmacéuticamente aceptables que incluyen vehículos
fisiológicamente aceptables, tampones u otros excipientes. Para su
aplicación frente a tumores, se contempla la inyección intratumoral
directa, inyectar en un lecho tumoral resecado (es decir, linfático)
o la administración general. También se desearía realizar una
perfusión continua durante horas o días mediante un catéter a un
sitio enfermo, por ejemplo, un tumor o sitio de tumor.
Las composiciones terapéuticas se administran
ventajosamente en forma de composiciones inyectables o bien como
disoluciones líquidas o bien como suspensiones; también deben
prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o
suspensión en, líquido antes de la inyección. Estas preparaciones
también deben emulsionarse. Una composición típica para tal fin
comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la
composición puede contener aproximadamente 100 mg de albúmina
sérica humana por mililitro de solución salina tamponada con
fosfato. También pueden usarse otros vehículos farmacéuticamente
aceptables que incluyen disoluciones acuosas, excipientes no
tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y similares.
Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol,
polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos inyectables
tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua,
disoluciones alcohólicas/acuosas, soluciones salinas, vehículos
parenterales tales como cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, etc.
Los vehículos intravenosos incluyen agentes de reabastecimiento de
fluidos y nutrientes. Los conservantes incluyen agentes
antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes.
El pH y la concentración exacta de los diversos componentes de la
composición farmacéutica se ajustan según parámetros bien
conocidos.
Formulaciones adicionales que son adecuadas para
su administración oral. Las formulaciones orales incluyen
excipientes típicos tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas
de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de
sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Las
composiciones adquieren la forma de disoluciones, suspensiones,
comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación
sostenida o polvos. Cuando la vía es tópica, la forma puede ser una
crema, ungüento, pomada o aerosol.
Una cantidad eficaz del agente terapéutico se
determina basándose en el objetivo propuesto, por ejemplo (i)
inhibición de la proliferación celular del tumor, (ii) eliminación o
inactivación de células tumorales, (iii) vacunación, o (iv)
transferencia génica para la expresión a largo plazo de un gen
terapéutico. El término "dosis unitaria" hace referencia a
unidades físicamente discretas adecuadas para su uso en un sujeto,
conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la
composición terapéutica calculada para producir las respuestas
deseadas, tratada anteriormente, en asociación con su
administración, es decir, la vía y el régimen de tratamiento
apropiados. La cantidad que va administrarse, según tanto el número
de tratamientos como la dosis unitaria, depende del sujeto que va
tratarse, del estado del sujeto y del resultado deseado. Se esperan
regímenes terapéuticos de múltiples genes, especialmente para
adenovirus.
En el contexto de la presente invención, puede
usarse un vector adenoviral que codifica para un gen supresor de
tumores para tratar pacientes con cáncer. Las cantidades típicas de
un vector de adenovirus usadas en terapia génica de cáncer son
10^{3} - 10^{15} partículas virales/dosis. (10^{3}, 10^{4},
10^{5}, 10^{6}, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9}, 10^{10},
10^{11}, 10^{12}, 10^{13}, 10^{14}, 10^{15}) en las que
la dosis puede dividirse en varias inyecciones en diferentes sitios
dentro de un tumor sólido. El régimen de tratamiento también puede
implicar varios ciclos de administración del vector de transferencia
génica durante un periodo de 3-10 semanas. Puede
ser necesaria la administración del vector durante periodos de
tiempo más prolongados desde meses hasta años, para su beneficio
terapéutico continuo.
En el contexto de la presente invención, puede
usarse un vector adenoviral que codifica para un gen terapéutico,
para vacunar seres humanos u otros animales. Normalmente, una
cantidad de virus eficaz para producir el efecto deseado, en el
caso de vacunación, se administraría a un ser humano o mamífero de
modo que se logre la expresión a largo plazo del transgén y se
desarrolle una fuerte respuesta inmunitaria del huésped. Se
considera que una serie de inyecciones, por ejemplo, una inyección
primaria seguida de dos inyecciones de administración de refuerzo,
serían suficientes para inducir una respuesta inmunitaria a largo
plazo. Una dosis típica sería desde 10^{6} hasta 10^{15}
UFP/inyección dependiendo del resultado deseado. Generalmente, bajas
dosis de antígeno inducen una respuesta fuerte mediada por células,
mientras que, generalmente, altas dosis de antígeno inducen una
respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos. Las cantidades
precisas de la composición terapéutica también dependen del
criterio del médico y son peculiares para cada individuo.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en
la técnica deben apreciar que las técnicas dadas a conocer en los
ejemplos a continuación representan las técnicas que el inventor ha
descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención y, por
tanto, pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su
práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica, a la luz de la
presente descripción, deben apreciar que pueden realizarse muchos
cambios en las realizaciones específicas que se dan a conocer y
obtener todavía un resultado parecido o similar sin apartarse del
alcance de la invención.
Para los estudios, se usaron células 293
(células epiteliales de riñón embrionario humano) del banco de
células primario.
Para la fase de crecimiento celular, se usó
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, glucosa, 4,5 g/L) +
suero bovino fetal (FBS) al 10%. Para la fase de producción de
virus, se disminuyó la concentración de FBS en DMEM hasta el
2%.
AdCMvp53 es un adenovirus humano de tipo 5 de
replicación incompetente, modificado por ingeniería genética, que
expresa la proteína humana p53 de tipo natural bajo el control del
promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV).
Se usó un biorreactor Celligen (New Brunswick
Scientific, Co. Inc.) con 5 L de volumen total (3,5 L de volumen de
trabajo) para producir un sobrenadante con virus usando un cultivo
de microportadores. Se usó microportador recubierto de vidrio 13
g/L (SoloHill) para el cultivo de células en el birreactor.
Se descongelaron células 293 del banco de
células primario (MCB) y se expandieron en factorías celulares
(Nunc). Generalmente, las células se dividieron a una confluencia
de aproximadamente el 85-90%. Las células se
inocularon en el biorreactor a una concentración de inoculación de
1 x 10^{5} células/ml. Se permitió que las células se adhirieran
a los microportadores mediante agitación intermitente. Se inició
agitación continua a una velocidad de 30 rpm, 6-8
horas tras la inoculación de las células. Las células se cultivaron
durante 7 días con los parámetros del procedimiento establecidos a
pH = 7,20, oxígeno disuelto (DO)= 60% de saturación de aire,
temperatura = 37ºC. En el día 8, las células se infectaron con
AdCMVp53 en una MOI de 5. Cincuenta horas tras la infección por
virus, se aumentó la velocidad de agitación desde 30 rpm hasta 150
rpm para facilitar la lisis celular y la liberación del virus en el
sobrenadante. Se recogió el sobrenadante con virus 74 horas tras la
infección. Entonces, se filtró el sobrenadante con virus para
concentración/diafiltración adicional.
También se usó un sistema de biorreactor
Cellcube^{TM} (Corning-Costar) para la producción
de virus AdCMVp53. Está compuesto de un módulo de cultivo celular
desechable, un elemento oxigenador, una bomba de recirculación de
medio y una bomba de medio para perfusión. El módulo de cultivo
celular usado tiene un área superficial de cultivo de 21.550
cm^{2} (1-mero).
Se descongelaron y expandieron las células 293
del banco de células primario (MCB) en factorías celulares (Nunc).
Generalmente, las células se dividieron a una confluencia de
aproximadamente el 85-90%. Las células se
inocularon en el Cellcube^{TM} según la recomendación del
fabricante. Las densidades celulares de inoculación estuvieron en
el intervalo de 1-1,5 x 10^{4}/cm^{2}. Se
permitió que las células crecieran durante 7 días a 37ºC en
condiciones de cultivo de pH = 7,20, DO = 60% de saturación de aire.
Se reguló la tasa de perfusión del medio según la concentración de
glucosa en el Cellcube^{TM}. Un día antes de la infección viral,
se cambió el medio para perfusión de DMEM + FBS al 10% a DMEM + FBS
al 2%. En el día 8, se infectaron las células con el virus AdCMVp53
a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Se detuvo la perfusión
del medio durante 1 h, inmediatamente después de la infección,
entonces se reanudó durante el periodo restante de la fase de
producción de virus. Se recogió el cultivo 45-48
horas tras la infección.
Se usó Tween-20 (Fischer
Chemicals) a una concentración del 1% (v/v) en tampón Tris 20 mM +
NaCl 0,25 mM, MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50, para lisar las células al
final de la fase de producción de virus en el Cellcube^{TM}.
Primero, se clarificaron el sobrenadante con
virus del biorreactor Celligen y la disolución de virus del
Cellcube^{TM} usando un filtro de profundidad (Preflow,
GelmanScience), entonces se filtró a través de un filtro de 0,8/0,22
\mum (SuporCap 100, GelmanScience).
Se usó filtración de flujo tangencial (TFF) para
concentrar e intercambiar con tampón del sobrenadante con virus del
biorreactor Celligen y la disolución de virus del Cellcube^{TM}.
Se usó un minicasete de Pellicon II (Millipore) de punto de corte
de peso molecular nominal (NMWC) de 300 K para la concentración y
diafiltración. Primero, se concentró la disolución de virus 10
veces. A esto le siguieron 4 volúmenes de muestra de intercambio
con frente al tampón Tris 20 mM + NaCl 1,0 mM + MgCl_{2} 1 nM, pH
= 9,00 usando el método de diafiltración a volumen constante.
Se llevó a cabo la concentración/diafiltración
similar para el virus purificado en columna. Se usó un minicasete
de Pellicon II de NMWC de 100 K en vez del casete de NMWC de 300 K.
La diafiltración se realizó frente a Tris 20 mM + NaCl 0,25 M +
MgCl_{2} 1 mM, tampón a pH = 9,00 o solución salina tamponada con
fosfato de Dulbecco (DPBS).
Se trató la disolución de virus
concentrada/diafiltrada con Benzonase^{TM} (American International
Chemicals) a una concentración de 100 u/ml, temperatura ambiente
durante la noche para reducir la concentración de ácido nucleico
contaminante en la disolución de virus.
Se purificó la disolución de virus sin procesar
usando ultracentrifugación en gradiente doble de CsCl que usa un
rotor SW40 en una ultracentrífuga Beckman (XL-90).
En primer lugar, se recubrió con 7 ml de disolución de virus sin
procesar en la parte superior de un gradiente de CsCl gradual
preparado con igual volumen de 2,5 ml de disolución de CsCl 1,25
g/ml y 1,40 g/ml, respectivamente. Se centrifugó el gradiente de
CsCl a 35.000 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente. Se
recuperó la banda de virus en la interfase del gradiente. Entonces,
el virus recuperado se purificó adicionalmente mediante gradiente
isopícnico de CsCl. Esto se realizó mezclando la disolución de
virus con al menos un volumen de 1,5 veces de disolución de CsCl
1,33 g/ml. Se centrifugó la disolución de CsCl a 35.000 rpm durante
al menos 18 horas a temperatura ambiente. Se recuperó la banda
inferior como el virus intacto. Inmediatamente, se dializó el virus
frente a un tampón Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH=7,50 para
eliminar el CsCl. Se almacenó el virus dializado a -70ºC para su uso
futuro.
Se purificó la disolución de virus tratada con
Benzonase usando IEC. Para la purificación, se usó resina aniónica
fuerte Toyopearl SuperQ 650M (Tosohaas). Se usó un sistema FPLC
(Pharmacia) con una columna XK16 (Pharmacia) para el desarrollo del
método inicial. Se llevaron a cabo estudios adicionales de
ampliación a escala usando un sistema BioPilot (Pharmacia) con una
columna XK50 (Pharmacia). En resumen, se rellenó la resina dentro
de las columnas y se limpiaron con NaOH 1 N, entonces se cargaron
con tampón B que fue seguido por el acondicionamiento con tampón A.
Los tampones A y B estaban compuestos de Tris 20 mM + NaCl 0,25 M +
MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,00 y Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH =
9,00, respectivamente. Se cargó la muestra de disolución viral en la
columna acondicionada, seguido por el lavado de la columna con
tampón A hasta que la absorción UV alcanzó la referencia. Se eluyó
el virus purificado de la columna mediante el uso de un volumen de
10 columnas de gradiente lineal de NaCl.
Se desarrolló un procedimiento de análisis por
HPLC para la evaluación de la eficacia de la producción y
purificación de virus. Se obtuvo
tris(hidroximetil)aminometano (tris) de FischerBiotech
(N.º de cat. BP154-1; Fair Lawn, Nueva Jersey,
EE.UU.); se obtuvo cloruro de sodio (NaCl) de Sigma (N.º de cat.
S-7653, San Luis, MO, EE.UU.). Ambos se usaron
directamente sin purificación adicional. Se realizaron análisis por
HPLC en un sistema de gradiente analítico de Beckman, con el
software Gold Workstation (bomba binaria 126 y detector por red de
diodos 168) equipado con una columna de intercambio aniónico
TosoHaas (DI de 7,5 cm x 7,5 mm, tamaño de partícula de 10 \mum,
N.º de cat. 18257). Se usó una columna de intercambio aniónico de 1
mL Resource Q (Pharmacia) para evaluar el método desarrollado por
Huyghe et al. usando su sistema de tampón HEPES. Sólo se
probó este método para el sistema de biorreactor.
Los tampones usados en el presente sistema de
HPLC fueron tampón A: tampón Tris 10 mM, pH 9,0. Tampón
B: NaCl 1,5 M en tampón A, pH 9,0. Los tampones se filtraron a
través de un filtro de cuello de botella de 0,22 \mum de Corning
(N.º de cat. 25970-33). Se filtraron todas las
muestras a través de un Acrodisc PF de 0,8/0,22 \mum de Gelman
Sciences (N.º de cat. 4187) antes de la inyección.
Se inyectó la muestra en la columna de HPLC en
un volumen de 60-100 \mul. Tras la inyección, se
lavó la columna (TosoHaas) con B al 20% durante 3 min. a una
velocidad de flujo de 0,75 ml/min. Entonces se inicia un gradiente,
en el que B se aumenta desde el 20% hasta el 50% durante 6 min.
Entonces se cambia el gradiente desde el 50% hasta el 100% de B
durante 3 min., seguido por el 100% de B durante 6 min. Entonces, se
cambia de nuevo la concentración salina de manera gradual hasta el
20% nuevamente durante 4 min., y se mantiene al 20% de B durante
otros 6 min. El tiempo de retención de Adp53 es de 9,5 \pm 0,3
min. con A_{260}/A_{280} \cong 1,26 \pm 0,03. La limpieza
de la columna tras cada serie cromatográfica se consigue mediante la
inyección de 100 \mul de NaOH 0,15 M y entonces se hace pasar el
gradiente.
Para un sistema de cultivo celular de perfusión,
tal como Cellcube^{TM}, la tasa de perfusión del medio desempeña
un papel importante en la producción y la calidad del producto. Se
examinaron dos estrategias diferentes de perfusión del medio. Una
estrategia fue mantener la concentración de glucosa en el
Cellcube^{TM} \geq 2 g/L (alta tasa de perfusión). La otra fue
mantener la concentración de glucosa \geq 1 g/L (baja tasa de
perfusión del medio).
No se observaron cambios significativos en los
parámetros de cultivo, tales como pH, DO, entre las dos tasas de
perfusión diferentes. Aproximadamente, se produjo una cantidad
equivalente de virus sin procesar (antes de la purificación) tras
la recogida usando disolución de lisis con Tween-20
al 1% tal como se muestra en la tabla 7. Sin embargo, se observó
una diferencia espectacular en los perfiles de HPLC de las
disoluciones virales de series de producción de tasa de perfusión
del medio alta y baja.
Tal como se muestra en la figura 1, se produjo
un pico de virus muy bien separado (tiempo de retención 9,39 min.) a
partir de la disolución viral usando una baja tasa de perfusión del
medio. Se encontró que se consiguió virus con pureza y actividad
biológica adecuada tras una sola etapa de purificación
cromatográfica de intercambio iónico de la disolución de virus
producida en baja tasa de perfusión del medio. Por otro lado, no se
observó pico separado del virus en el tiempo de retención de 9,39
min. de la disolución viral producida usando una alta tasa de
perfusión del medio. Esto sugiere que los contaminantes que tienen
el mismo perfil de elución que el virus se produjeron en alta tasa
de perfusión del medio. Aunque, aún no está clara la naturaleza de
los contaminantes, se espera que los contaminantes estén
relacionados con el aumento de la producción de proteínas de la
matriz extracelular en alta tasa de perfusión del medio (alta
alimentación con suero) de las células productoras. Esta mala
característica de separación observada en la HPLC creó dificultades
para el procedimiento de purificación por IEC tal como se muestra
en los siguientes ejemplos. Como resultado, la tasa de perfusión
del medio usada durante el crecimiento celular y las fases de
producción de virus en el Cellcube^{TM} tienen un efecto
significativo en la posterior purificación por IEC del virus. Se
recomienda baja tasa de perfusión del medio. Esto no sólo produce
la fácil purificación del producto sin procesar sino que también
ofrece una producción más rentable debido al consumo reducido del
medio.
Basándose en la experiencia anterior, los
inventores evaluaron en primer lugar el método de
congelación-descongelación. Se recogieron las
células del Cellcube^{TM} 45-48 horas tras la
infección. En primer lugar, se aisló el Cellcube^{TM} del sistema
de cultivo y se extrajo el medio gastado. Entonces, se bombeó
disolución de EDTA 50 mM en el Cube para desprender las células de
la superficie del cultivo. La suspensión celular así obtenida se
centrifugó a 1.500 rpm (Beckman GS-6KR) durante 10
min. Se resuspendió el sedimento celular resultante en solución
salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DBPS). Se sometió la
suspensión celular a 5 ciclos de congelación/descongelación entre
baño de agua a 37ºC y baño de etanol-nieve carbónica
para liberar virus de las células. El lisado celular sin procesar
(CCL) así generado se analizó en HPLC.
La figura 2 muestra el perfil de HPLC. No se
observó pico del virus en el tiempo de retención de 9,32 min. En
cambio, se produjeron dos picos en los tiempos de retención de 9,11
y 9,78 min. Este perfil sugiere que los otros contaminantes que
tienen un tiempo de elución similar al del virus salen en el CCL e
interfieren con la purificación del virus. Como resultado, se
observó muy baja eficacia de purificación cuando se purificó el CCL
por IEC usando FPLC.
Además de la baja eficacia de purificación, hubo
una pérdida de producto significativa durante la etapa de recogida
de células en la disolución de EDTA tal como se indica en la tabla
8. Aproximadamente se perdió el 20% del producto en la disolución
de EDTA que se descartó. Además, aproximadamente el 24% del producto
de virus sin procesar está presente en el medio gastado que también
se descartó. Por tanto, sólo el 56% del producto de virus sin
procesar está en el CCL. Además, la
congelación-descongelación es un procedimiento de
gran variación y ampliación a escala muy limitada. Es necesario
desarrollar un procedimiento de lisis celular más eficaz con menor
pérdida de producto.
Los datos se generaron a partir de
Cellcube^{TM} de 1-mero.
\newpage
Se han usado detergentes para lisar células para
liberar los orgánulos intracelulares. En consecuencia, los
inventores evaluaron el método de lisis con detergentes para la
liberación de adenovirus. La tabla 9 enumera los 5 detergentes no
iónicos diferentes que se evaluaron para la lisis celular. Se
recogieron las células de Cellcube^{TM} 48 horas tras la
infección usando EDTA 50 mM. Se resuspendió el sedimento celular en
los diferentes detergentes a diversas concentraciones enumeradas en
la tabla 9.
Se llevó a cabo la lisis celular o bien a
temperatura ambiente o bien en hielo durante 30 minutos. Se obtuvo
una disolución de lisis transparente tras la centrifugación para
eliminar el precipitado y los residuos celulares. Se trataron las
disoluciones de lisis con Benzonase y entonces se analizaron por
HPLC. La figura 3 muestra los perfiles de HPLC de las disoluciones
de lisis de los diferentes detergentes. Thesit y
NP-40 se comportaron de manera similar a Triton
X-100. La disolución de lisis generada a partir de
Tween-20 al 1% dio la mejor resolución del virus,
observándose la menor resolución del virus con
Brij-58. Se encontró lisis celular más eficaz a una
concentración de detergente del 1% (p/v). La temperatura de lisis no
contribuyó significativamente a la resolución del virus en las
concentraciones de detergente examinadas. Para el fin de simplicidad
del procedimiento, se recomienda lisis a temperatura ambiente. Se
empleó disolución de lisis compuesta de Tween-20 al
1% en Tris 20 mM + NaCl 0,25 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 para la
lisis celular y recogida del virus en el Cellcube^{TM}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clarificó y filtró la disolución de virus de
la etapa de lisis antes de la concentración/diafiltración. Se
evaluaron membranas de TFF de diferentes NMWC, incluyendo 100 K, 300
K, 500 K y 1000 K, para su determinar su eficaz
concentración/diafiltración. Se obtuvo el flujo del medio más alto
con pérdida mínima de virus para el filtrado con una membrana de
NMWC de 300 K. Las membranas de mayor NMWC ofrecieron flujo del
medio más alto, pero dieron como resultado una mayor pérdida de
virus para el filtrado, mientras que las membranas de menor NMWC
lograron un flujo insuficiente del medio. En primer lugar, se
concentró la disolución de virus 10 veces, lo que fue seguido por 4
volúmenes de muestra de diafiltración frente a tampón Tris 20 mM +
NaCl 0,25 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,00 usando el método de
volumen constante. Durante el procedimiento de
concentración/diafiltración la disminución de la presión a través
de la membrana se mantuvo \leq 5 psi. Se demostró la recuperación
consecuente, de alto nivel de virus durante la etapa de
concentración/diafiltración tal como se indica en la tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se trató la disolución de virus tras la
concentración/diafiltración con Benzonase (nucleasa) para reducir
la concentración de ácido nucleico contaminante en la disolución de
virus. Se evaluaron diferentes concentraciones de trabajo de
Benzonase, que incluyen 50, 100, 200, 300 unidades/ml, para
determinar la reducción de las concentraciones de ácido nucleico.
Para el fin de simplicidad del procedimiento, el tratamiento se
llevó a cabo a temperatura ambiente durante la noche. Se observó
reducción significativa de ácido nucleico contaminante que se
hibrida a una sonda de ADN genómico humano tras el tratamiento con
Benzonase.
La tabla 11 muestra la reducción de la
concentración de ácido nucleico antes y tras el tratamiento con
Benzonase. Se analizó la disolución de virus en HPLC antes y tras
el tratamiento con Benzonase. Tal como se muestra en la figura 4A y
en la figura 4B, se observó una reducción espectacular en el pico de
ácido nucleico contaminante tras el tratamiento con Benzonase. Esto
está de acuerdo con el resultado del ensayo de hibridación de ácidos
nucleicos. Debido a la eficacia, se empleó una concentración de
Benzonase de 100 u/ml para el tratamiento de la disolución de virus
sin procesar.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Condición de tratamiento: concentración de
Benzonase: 100 u/ml, temperatura: temperatura ambiente, tiempo:
durante la noche.
Se observó un cambio considerable en el perfil
de HPLC antes y tras el tratamiento con Benzonase. No se detectó
pico separado del virus en el tiempo de retención de 9,33 min. tras
el tratamiento con Benzonase. Al mismo tiempo, se desarrolló un
pico principal con alta adsorción a 260 nm en el tiempo de retención
de 9,54 min. Los resultados del ensayo de titulación indicaron que
el tratamiento con Benzonase no afectó negativamente al titulo del
virus y el virus permaneció intacto e infeccioso tras el tratamiento
con Benzonase. Se dedujo que el ácido nucleico celular liberado
durante la etapa de lisis celular interaccionaba con el virus y o
bien formaba agregados con el virus o bien se adsorbía en la
superficie del virus durante el tratamiento con Benzonase.
Para minimizar la posible interacción del virus
con el ácido nucleico durante el tratamiento con Benzonase, se
añadieron diferentes concentraciones de NaCl a la disolución de
virus antes del tratamiento con Benzonase. No se produjo un cambio
espectacular en el perfil de HPLC tras el tratamiento con Benzonase
en presencia de NaCl 0,1 M en la disolución de virus. La figura 5
muestra el perfil de HPLC de la disolución de virus tras el
tratamiento con Benzonase en presencia de NaCl 1 M. A diferencia de
lo que se muestra en la figura 4B, el pico del virus en el tiempo
de retención de 9,35 min. aún existe tras el tratamiento con
Benzonase. Este resultado indica que la presencia de NaCl previene
la interacción del ácido nucleico con el virus durante el
tratamiento con Benzonase y facilita la purificación adicional de
virus del ácido nucleico contaminante.
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La presencia de carga negativa en la superficie
del adenovirus en condiciones fisiológicas de pH motivó la
evaluación de los intercambiadores de iones aniónicos para la
purificación de adenovirus. Se usó el intercambiador de iones
aniónicos fuertes Toyopearl Super Q 650M para el desarrollo de un
método de purificación. Se evaluaron los efectos de la
concentración de NaCl y el pH del tampón de carga (tampón A) en la
purificación de virus usando el sistema FPLC.
Para la cromatografía de intercambio iónico, el
pH del tampón es uno de los parámetros más importantes y puede
tener una influencia espectacular en la eficacia de la purificación.
En referencia al pH y a la conductividad del medio usado durante la
producción de virus, los inventores formularon Tris 20 mM +
MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2 mM, pH = 7,50 como tampón A. Se
acondicionó con tampón A una columna XK16 rellenada con Toyopearl
SuperQ 650M con una altura de 5 cm.
Se cargó en la columna una muestra de 5 ml de
sobrenadante con virus del biorreactor Celligen,
concentrado/diafiltrado tratado con Benzonase. Tras el lavado de la
columna, se llevó a cabo la elución con un gradiente lineal de más
de 10 volúmenes de columna para alcanzar el tampón B (Tris 20 mM +
MgCl_{2} + NaCl 2M, pH = 7,50).
La figura 6 muestra el perfil de elución. Se
observaron tres picos durante la elución sin separación
satisfactoria entre ellos. El estudio control realizado con medio
acondicionado de células 293 (sin virus) mostró que los dos
primeros picos están relacionados con el virus. Para mejorar
adicionalmente la eficacia de la separación, se evaluó el efecto
del pH del tampón. Se aumentó el pH del tampón a 9,00 mientras se
mantenían otras condiciones constantes. Se observó una separación
más mejorada, tal como se muestra en la figura 7, en comparación con
la del tampón de pH de 7,50. Se analizaron las fracciones n.º 3,
n.º 4 y n.º8 en HPLC.
Tal como se muestra en la figura 8, se encontró
la mayoría de virus en la fracción n.º 4, sin que se detecte virus
en las fracciones n.º 3 y n.º 8. Se encontró que la fracción n.º 8
está compuesta principalmente de ácido nucleico contaminante. Sin
embargo, la purificación aún no fue óptima. Existe un solapamiento
entre las fracciones n.º 3 y n.º 4 detectándose todavía
contaminantes en la fracción n.º 4.
Basándose en el cromatograma en la figura 7, se
infirió que la mejora adicional de la purificación del virus podría
lograrse mediante el aumento de la concentración salina en el tampón
A. Como resultado, los contaminantes presentes en la fracción n.º
3, que es anterior al pico del virus, pueden cambiarse a la fracción
de flujo continuo. Se aumentó la concentración de NaCl en el tampón
A hasta 0,3 M mientras que otras condiciones se mantenían
constantes. La figura 9 muestra el perfil de elución en la condición
de NaCl 0,3 M en el tampón A.
Se logró la mejora espectacular en la eficacia
de la purificación. Tal como se esperaba, se eliminó el pico del
contaminante observado en la figura 7 en la condición de mayor
concentración salina. Se analizaron por HPLC, las muestras del pico
n.º 1, y del pico n.º 2, del flujo continuo, del sobrenadante con
virus sin procesar, y los resultados se muestran en la figura 10.
No se detectó virus en la fracción de flujo continuo. En el flujo
continuo se encontró la mayoría de los contaminantes presentes en el
material sin procesar. El análisis por HPLC del pico n.º 1 mostró
un único pico del virus bien definido. El perfil de HPLC es
equivalente al que se obtiene a partir del virus purificado en
gradiente doble de CsCl. Los picos observados en los tiempos de
retención de 3,14 y 3,61 min., en virus purificado con gradiente
doble de CsCl fueron picos relacionados con el glicerol. El virus
purificado tiene un ratio A_{260}/A_{280} de 1,27 \pm 0,03.
Esto es similar al valor del virus purificado en gradiente doble de
CsCl, así como a los resultados notificados por Huyghe et
al. (1996). El pico n.º 2 se compone principalmente de ácido
nucleico contaminante. Basándose en el resultado de la
purificación, los inventores propusieron el siguiente método para la
purificación por IEC de sobrenadante con adenovirus del
biorreactor.
Tampón A: Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl
0,3 M, pH = 9,00
Tampón B: Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 2
M, pH = 9,00
Elución: gradiente lineal de 10 volúmenes de
columna.
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Tras el desarrollo del método, se amplió a
escala la purificación e la columna XK16 (D.I. 1,6 cm) hasta una
columna XK50 (D.I. 5 cm, ampliación a escala de 10 veces) usando el
mismo método de purificación. Se logró un perfil de elución similar
en la columna XK50 tal como se muestra en la figura 11. Se analizó
la fracción de virus en HPLC, que indicó una pureza del virus
equivalente a la obtenida de la columna XK16.
Durante los estudios de ampliación a escala, se
encontró que era más conveniente y consecuente usar la conductividad
para cuantificar la concentración salina en el tampón A. La
conductividad óptima del tampón A está en el intervalo de 25 \pm
2 mS/cm a aproximadamente temperatura ambiente (21ºC). Se analizaron
en SDS-PAGE, las muestras producidas durante el
procedimiento de purificación junto con el virus purificado con
doble CsCl.
Tal como se muestra en la figura 12, se
detectaron todas las principales proteínas de la estructura del
adenovirus en el SDS-PAGE. El virus purificado por
IEC muestra tinción equivalente a la del virus purificado en doble
CsCl. Durante la purificación, se logró la reducción significativa
en concentración de albúmina sérica bovina (BSA). La concentración
de BSA en el virus purificado estuvo por debajo del nivel de
detección del ensayo de inmunotransferencia de tipo Western tal
como se muestra en la figura 13.
Se determinó la reducción de la concentración de
ácido nucleico contaminante en la disolución de virus durante el
procedimiento de purificación, usando membrana de trasferencia en
ranura de ácidos nucleicos. Se usó ADN genómico de humano marcado
con ^{32}P como la sonda de hibridación (porque las células 293
son células de riñón embrionario humano). La tabla 12 muestra la
concentración de ácido nucleico en diferentes fases del
procedimiento de purificación. Se redujo la concentración de ácido
nucleico en la disolución final de virus purificado final hasta 60
pg/ml, una reducción aproximada de 3,6 x 10^{6} veces en
comparación con el sobrenadante inicial con virus. Se determinó el
título de virus y el ratio de partículas infecciosas con respecto a
partículas totales para el virus purificado, y los resultados se
compararon con los de la purificación doble en CsCl de la tabla 11.
Tanto la recuperación de virus como el ratio de partículas/UFP son
muy similares entre los dos métodos de purificación. El título de
la disolución de virus purificado en columna puede aumentarse
adicionalmente mediante la realización de la etapa de
concentración.
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Además de la cromatografía de intercambio de
iones aniónicos fuertes, también se evaluaron otros modos de
métodos cromatográficos para la purificación de virus AdCMVp53 (por
ejemplo, cromatografía por exclusión por tamaños, cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio catiónico, o
cromatografía de afinidad a iones metálicos). En comparación con el
Toyopearl Super Q, todos esos modos de purificación ofrecieron una
purificación mucho menos eficaz con baja recuperación de producto.
Por tanto, se recomienda resina Toyopearl Super Q para la
purificación de AdCMVp53. Sin embargo, es probable que otros
intercambiadores aniónicos fuertes a base de la química del amonio
sean adecuados para la purificación de AdCMVp53 con algunas
modificaciones del procedimiento.
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Se desarrollaron dos métodos diferentes de
producción para producir virus AdCMVp53. Uno se basó en el cultivo
de microportadores en un biorreactor de tanque con agitación. El
otro se basó en un biorreactor Cellcube^{TM}. Tal como se
describió anteriormente, se desarrolló el método de purificación
usando sobrenadante con virus sin procesar generado del biorreactor
de tanque con agitación. Se observó que aunque se usó el mismo
medio, células y virus para la producción de virus tanto en el
biorreactor como en el Cellcube^{TM}, la superficie del cultivo
en la que las células se adhirieron fue diferente.
En el biorreactor, se hicieron crecer las
células en un microportador recubierto de vidrio, mientras que en
el Cellcube^{TM} las células se hicieron crecer en superficies de
cultivo patentadas de poliestireno tratado. Se usó constante
perfusión del medio en el Cellcube^{TM}, por otro lado, no se usó
perfusión del medio en el biorreactor. En el Cellcube^{TM}, se
recogió el producto de virus sin procesar en forma de células
viralmente infectadas, que es diferente del sobrenadante con virus
recogido del biorreactor.
El lisado de células sin procesar (CCL),
producido tras 5 ciclos de
congelación-descongelación de las células recogidas
viralmente infectadas, se purificó mediante el uso de IEC usando el
método descrito anteriormente. A diferencia del sobrenadante con
virus del biorreactor, no se logró purificación satisfactoria para
el material de CCL generado a partir del Cellcube^{TM}. La figura
14 muestra el cromatograma. El resultado sugiere que la disolución
de virus sin procesar generada a partir del Cellcube^{TM} mediante
la congelación-descongelación de células recogidas
no se purifica fácilmente mediante el método de IEC.
Se examinaron otros métodos de purificación,
incluyendo cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía
de quelación de metales, para la purificación de virus en CCL.
Desgraciadamente, no se observó mejora en la purificación por
cualquiera de los métodos. Considerando las dificultades de la
purificación del virus en CCL y las desventajas asociadas con la
etapa de congelación-descongelación en el
procedimiento de producción, los inventores decidieron explorar
otros métodos de lisis celular.
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Tal como se describe en los ejemplos 1 y 3, se
usó análisis de HPLC para examinar diferentes métodos de lisis con
detergentes. Basándose en los resultados de la HPLC, se empleó
tampón Tween-20 al 1% en Tris 20 mM + NaCl 0,25 M +
MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 como el tampón de lisis. Al final de la
fase de producción del virus, en vez de recoger las células
infectadas, se bombeó tampón de lisis en el Cellcube^{TM} tras
extraer el medio gastado. Se lisaron las células y se liberaron los
virus en el tampón de lisis mediante la incubación durante 30
min.
Tras la clarificación y filtración, se
concentró/diafiltró la disolución de virus y se trató con Benzonase
para reducir la concentración de ácido nucleico contaminante. Se
purificó la disolución de virus tratada mediante el método
desarrollado anteriormente usando resina Toyopearl SuperQ. Durante
la elución se logró la separación satisfactoria, similar a la que
se obtuvo usando el sobrenadante con virus del biorreactor. La
figura 15 muestra el perfil de elución. Sin embargo, cuando se
analizó la fracción de virus en HPLC, se detectó otro pico además
del pico del virus. El resultado se muestra en la figura 16A.
Para purificar adicionalmente el virus, se
purificó nuevamente la fracción de virus recogida usando el mismo
método. Tal como se muestra en la figura 16B, la pureza de la
fracción de virus mejoró considerablemente tras la segunda
purificación. También se evaluó la cromatografía de quelación de
metales como un candidato para la segunda purificación. Se logró
una mejora similar en la pureza del virus tal como se observa con la
segunda IEC. Sin embargo, debido a su simplicidad, se prefirió IEC
como el método de elección para la segunda purificación.
Tal como se describe en el ejemplo 2, la tasa de
perfusión del medio empleada durante las fases de crecimiento
celular y de producción del virus tiene un efecto considerable en el
perfil de separación por HPLC de la recogida de virus sin procesar
con Tween-20. Para la disolución de virus sin
procesar producida en alta tasa de perfusión del medio, se
requieren dos columnas de intercambio iónico para lograr la pureza
del virus requerida.
Basándose en la separación más mejorada
observada en HPLC para la disolución de virus producidos en baja
tasa de perfusión del medio, es probable que la purificación
mediante una columna de intercambio iónico pueda lograr la pureza
del virus requerida. La figura 17 muestra el perfil de elución
usando la disolución de virus sin procesar producida en baja tasa
de perfusión del medio. Durante la elución, se consiguió un pico de
virus agudo. El análisis por HPLC de la fracción de virus indica
una pureza del virus equivalente a la del virus purificado en
gradiente de CsCl tras una etapa de cromatografía de intercambio
iónico. La figura 18 muestra el resultado del análisis por
HPLC.
HPLC.
El virus purificado se analizó adicionalmente
mediante SDS-PAGE, inmunotransferencia de tipo
Western para BSA, y transferencia en ranura de ácidos nucleicos,
para determinar la concentración del ácido nucleico contaminante.
Los resultados del análisis se facilitan en la figura 19A, figura
19B y figura 19C, respectivamente. Todos esos análisis indican que
el virus purificado en columna tiene pureza equivalente en
comparación con el virus purificado en gradiente doble de CsCl. La
tabla 13 muestra el título y la recuperación de virus antes y
después de la purificación en columna. Para fines comparativos,
también se incluyen la recuperación de virus típica lograda
mediante la purificación en gradiente doble de CsCl. Se lograron
recuperaciones de virus similares mediante ambos métodos.
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Se evaluó la capacidad dinámica de la resina
Toyopearl SuperQ para determinar la purificación de la disolución
de virus recogida con Tween-20 producida en baja
tasa de perfusión del medio. Se rellenaron cien ml de resina en una
columna XK50. Se purificaron diferentes cantidades de disolución de
virus sin procesar, a través de la columna usando los métodos
descritos en el presente documento.
Se analizó en HPLC la ruptura del virus y la
eficacia de la purificación. La figura 20 muestra los resultados
del análisis por HPLC. A un factor de carga de columna mayor que el
ratio muestra/volumen de columna de 2:1, se redujo la pureza de la
fracción de virus. Los contaminantes coeluyeron con el virus. A un
factor de carga mayor de 3:1, se observó la ruptura del virus en el
flujo continuo. Por tanto, se propuso que la capacidad de carga de
trabajo de la resina esté en el intervalo del ratio muestra/volumen
de columna de 1:1.
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Una etapa de concentración/diafiltración tras la
purificación en columna sirve no sólo para aumentar el título de
virus, si es necesario, sino también para intercambiar al sistema de
tampones especificado para el producto de virus. Se empleó una
membrana de TFF de NMWC de 300 K para la etapa de concentración.
Debido a la ausencia de contaminantes proteicos y de ácido nucleico
en el virus purificado, se logro un flujo de tampón muy alto sin
notable descenso de la presión a través de la membrana.
Se logró aproximadamente el 100% de la
recuperación de virus durante esta etapa mediante el cambio del
tampón en Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,15 M, pH = 7,50.
También se intercambió satisfactoriamente el tampón del virus
purificado en DPBS durante la etapa de concentración/diafiltración.
El factor de concentración puede determinarse mediante el título
del virus que se desea en el producto final y el título de
disolución de virus eluido de la columna. La flexibilidad ayudará a
mantener la regularidad del producto final de virus purificado.
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Debido a la eficacia de empaquetamiento inferior
al 100% de adenovirus en las células productoras, generalmente
existen algunos adenovirus deficientes en la disolución de virus sin
procesar. Los virus deficientes no tienen ADN empaquetado dentro de
la cápside viral y por tanto pueden separarse del virus intacto en
ultracentrifugación en gradiente de CsCl basada en la diferencia de
densidades. Es probable que sea difícil separar los virus
deficientes de los intactos basándose en la cromatografía de
intercambio iónico, suponiendo que ambos virus tienen propiedades
químicas de superficie similares. La presencia de una excesiva
cantidad de virus deficientes afectará a la calidad del producto
purificado.
Para evaluar el porcentaje de partículas víricas
deficientes presentes, los virus concentrados y purificados se
sometieron a ultracentrifugación isopícnica en CsCl. Tal como se
muestra en la figura 21, se observó una banda tenue por encima de
la banda de virus intactos tras la centrifugación. Se recuperaron y
dializaron ambas bandas frente al tampón Tris 20 mM + MgCl_{2} 1
mM, pH = 7,50 para eliminar el CsCl. Se analizaron los virus
dializados en HPLC y los resultados se muestran en la figura 22.
Ambos virus muestran un tiempo de retención similar. Sin embargo,
el virus deficiente tiene un ratio A260/A280 más pequeño que el del
virus intacto. Esto es indicativo de menos ADN viral en el virus
deficiente.
Los picos observados en los tiempos de retención
entre 3,02 y 3,48 min se producen con glicerol que se añade a los
virus (10% v/v) antes de congelar a -70ºC. El porcentaje de virus
deficientes fue menor del 1% de los virus totales. Es poco probable
que este bajo porcentaje de virus deficientes afecte al ratio de
partículas totales con respecto a los virus infecciosos (UFP) en el
producto de virus purificado. Se analizaron ambos virus mediante
SDS-PAGE (mostrado en la figura 19A). En comparación
con los virus intactos, los virus deficientes carecen de proteínas
nucleares asociadas al ADN que forman bandas a 24 y 48,5 KD. Este
resultado está de acuerdo con la ausencia de ADN en virus
deficientes.
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Basándose en los resultados del desarrollo del
procedimiento anterior, los inventores proponen un diagrama de
flujo de producción y purificación para AdCMVp53 tal como se muestra
en la figura 23. Se incluye la recuperación de virus acumulativa y
por etapas con la correspondiente producción del virus basándose en
un Cellcube^{TM} de 1-mero. La recuperación final
de virus es aproximadamente del 70 \pm 10%. Esto es
aproximadamente 3 veces superior a la recuperación de virus
notificada por Huyghe et al. (1996) usando un intercambiador
iónico de DEAE y un procedimiento de purificación cromatográfica de
quelación de metales, para la purificación de adenovirus que
codifican la proteína p53. Se produjeron aproximadamente 3 x
10^{12} UFP de producto final de virus purificado a partir de un
Cellcube^{TM} de 1-mero. Esto representa una
producción similar de producto final en comparación con el método
de producción actual que usa para la purificación
ultracentrifugación en gradiente doble de CsCl.
Se han realizado estudios de ampliación a escala
satisfactorios con el sistema Cellcube^{TM} de
4-meros, y actualmente está en marcha evaluar la
producción de virus en el sistema de Cellcube^{TM} de
16-meros. Se filtrará, concentrará y diafiltrará la
disolución de virus sin procesar producida, usando un casete más
grande de Pellicon. Se determinará la calidad y la recuperación de
virus. Tras el tratamiento con Benzonase, se purificará la
disolución de virus sin procesar usando una columna de bioproceso de
20 cm y 30 cm para 4-meros y
16-meros, respectivamente.
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Se adaptaron células 293 a unos medios IS293
libres de suero disponibles comercialmente (Irvine Scientific;
Santa Ana, CA) reduciendo secuencialmente la concentración de FBS en
matraces T. Se descongelaron las células congeladas en un vial de
PDWB y se colocaron en medios DMEM con FBS al 10% en matraz
T-75, y las células se adaptaron a los medios IS
293 libres de suero en matraces T reduciendo secuencialmente la
concentración de FBS en los medios. Tras 6 pases en los matraces
T-75 se estimó que el% de FBS era de aproximadamente
el 0,019%. Las células se subcultivaron dos veces más en los
matraces T antes de que se trasfirieran a matraces con
agitación.
Se transfirieron las células adaptadas libres de
suero anteriores en matraces T, a un cultivo en suspensión por
agitación de 250 mL libre de suero (volumen de trabajo 100 mL) para
el cultivo en suspensión. La densidad celular inicial fue de
1,85E+5 vc/mL. Durante el cultivo celular, la viabilidad disminuyó y
se observaron grandes aglomerados de células. Tras 2 pases más en
los matraces T, se intentó de nuevo la adaptación al cultivo en
suspensión. En un segundo intento, los medios se complementaron con
heparina, a una concentración de 100 mg/L, para prevenir la
agregación de células y se incrementó la densidad celular inicial
hasta 5,22E+5 vc/mL. Durante el cultivo celular, hubo algún aumento
de la densidad celular y se mantuvo la viabilidad celular. Después
se subcultivaron las células en matraces con agitación durante 7
pases más y durante los pases, se redujo progresivamente el tiempo
de duplicación de las células y al final de los siete pases, fue
aproximadamente de 1,3 días que es comparable con los 1,2 días de
las células en medios con FBS al 10%, en el cultivo celular
adherido. En los medios IS 293 libres de suero complementados con
heparina, casi todas las células existían como células individuales
sin formar agregados de células en el cultivo en suspensión (tabla
14).
Para someter a prueba la producción de vectores
Ad5-CMVp53 en el cultivo en suspensión libre de
suero, se hicieron crecer las células anteriores adaptadas al
cultivo en suspensión libre de suero en 100 mL de medios IS293
libres de suero complementados con Pluronic F-68 al
0,1% y heparina (100 mg/L) en matraces con agitación de 250 mL. Se
infectaron las células a 5 MOI cuando las células alcanzaron
1,36E+06 células viables/mL en el día 3. Se analizó el sobrenadante
cada día para partículas virales por HPLC/mL tras la infección. No
se detectaron virus distintos de la muestra del día 3. En el día 3,
fue de 2,2E+09 vps/mL. Las ufp/mL en el día 6 fueron 2,6 +/-0,6E+07
ufp/mL. Se estimó que la producción de ufp por célula era de 19, que
es aproximadamente 46 veces inferior al cultivo adherido en los
medios complementados con suero. Como control, se comprobó el
crecimiento de las células en ausencia de infección.
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Tal como se describió anteriormente, tras
demostrarse que las células producen los vectores
Ad-p53, las células se propagaron en los medios
IS293 libres de suero con F-68 al 0,1% y heparina
100 mg/L en los matraces con agitación, para preparar bancos de
células adaptadas en suspensión libre de suero que contenían 1,0E+07
células viables/mL/vial. Para recoger las células, se separaron por
centrifugación cuando estaban en fase semilogarítmica de
crecimiento y la viabilidad fue superior al 90%, y se resuspendieron
en medios IS293 complementados, libres de suero, y se separaron por
centrifugación de nuevo para lavar las células. Entonces, se
resuspendieron las células de nuevo en los medios de
crioconservación que es IS293 helado con F-68 al
0,1%, heparina 100 mg/L, DMSO al 10% y metilcelulosa al 0,1% dando
como resultado 1E+07 células viables/mL. Se transfirió la suspensión
celular a viales de crioconservación estériles y se sellaron y
congelaron en un criocontenedor a -70ºC durante la noche. Los
viales se transfirieron a almacenamiento en nitrógeno líquido. La
prueba para micoplasma fue negativa.
\newpage
Para reactivar las células congeladas, se
descongeló un vial en 50 mL de medios IS293 libres de suero con
F-68 al 0,1% y heparina 100 mg/L en un matraz
T-150. Desde entonces, los cultivos se subcultivaron
tres veces en matraces con agitación de 250 mL. En otro estudio, se
descongeló un vial en 100 mL de medios IS293 complementados, libres
de suero en un matraz con agitación de 250 mL. Desde entonces, se
subcultivaron 2 veces en matraces con agitación libres de suero. En
ambos estudios las células crecieron muy bien.
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En la producción viral libre de suero anterior
en el cultivo en suspensión en el matraz con agitación, la
producción viral por célula fue demasiado baja como para que la
producción en suspensión libre de suero sea práctica. Se supuso que
esto podría deberse a la reducción de los nutrientes y/o a la
producción de subproductos inhibidores. Para sustituir los medios
gastados con medios recientes IS293 complementados, libres de suero,
se separaron por centrifugación las células en el día 3 y se
resuspendieron en medio IS-293 reciente libre de
suero, complementado con F-68 y heparina (100 mg/L)
y la densidad celular resultante fue de 1,20E+06 vc/mL, y se
infectaron las células con vectores Ad5-CMVp53 a 5
MOI. Las vps extracelulares por HPLC/mL fueron 7,7E+09 vps/mL en el
día 3, 1,8E+10 vps/mL en el día 4, 1,2E+10 vps/mL en el día 5 y
1,3E+10 vps/mL en el día 6, y las ufp/mL en el día 6 fueron
2,75+/-0,86E+08 tvps/mL. El ratio de partículas virales por HPLC con
respecto a las ufp fue de aproximadamente 47. Además, las células
se separaron por centrifugación y se lisaron con el mismo tipo de
tampón de lisis con detergente tal como se usó en la recogida de
Cellcube. Las vps celulares por HPLC/mL fueron 1,6E+10 vps/mL en el
día 2, 6,8E+09 vps/ml en el día 3, 2,2E+09 vps/mL en el día 4,
2,24E+09 vps/mL en el día 5 y 2,24E+09 vps/mL en el día 6.
La sustitución de los medios gastados con medios
IS293 recientes complementados, libres de suero dio como resultado
el aumento significativo en la producción de vectores
Ad-p53. La sustitución de los medios aumentó la
producción de partículas virales extracelulares por HPLC, 3,6 veces
más por encima del nivel anterior en el día 3 y la producción de
título de ufp extracelulares, diez veces más por encima del nivel
anterior en el día 6. Se estimó que la producción por célula de los
vectores Ad-p53 era de aproximadamente 1,33E+04 vps
por HPLC.
Las partículas virales intracelulares por HPLC
alcanzaron punto máximo en el día 2 tras la infección, y luego
disminuyeron los números de partículas. En cambio, las partículas
virales extracelulares aumentaron progresivamente hasta el día 6 de
la recogida. Casi todos los vectores Ad-p53 se
produjeron durante los 2 días tras la infección y se localizaron
intracelularmente, y luego los virus se liberaron fuera de la
célula. Casi la mitad de los virus se liberaron fuera de las
células en el sobrenadante entre el día 2 y el día 3 tras la
infección y la tasa de liberación disminuyó a medida que
transcurría el tiempo.
Todas las células infectadas con vectores
Ad-p53 perdieron su viabilidad al final de 6 días
tras la infección, mientras que las células en ausencia de
infección fueron viables en un 97%. En presencia de infección, el
pH del medio gastado sin el intercambio de medios y con el
intercambio de medios fue de 6,04 y de 5,97, respectivamente,
mientras que en ausencia de la infección fue de 7,00 (tabla 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Para aumentar la producción de vectores
Ad-p53, se usó un biorreactor Celligen de 5L para
proporcionar un entorno más controlado. En el biorreactor Celligen
de 5 L, se controlaron el pH y el oxígeno disuelto así como la
temperatura. Se conectó el gas oxígeno y dióxido de carbono a la
válvula de solenoide para suministrar oxígeno y ajustar el pH,
respectivamente. Para una mejor mezcla mientras que se genera un
entorno de bajo esfuerzo cortante, se implementó un impulsor de
paletas marinas. Se suministró aire todo el tiempo durante la
operación para mantener una presión positiva dentro del
biorreactor.
Para inocular el biorreactor, se descongeló un
vial de células en 100 mL de medios libres de suero en un matraz
con agitación de 250 mL, y las células se expandieron en matraces
con agitación de 250 ó 500 mL. Se mezclaron 800 mL del inóculo
celular, hechas crecer en matraces de 500 mL, con 2700 ml de medios
frescos en un bidón de 10 L y se transfirieron al biorreactor
CelliGen con presión de gas. El volumen de trabajo inicial del
biorreactor CelliGen fue de aproximadamente 3,5 L de cultivo. La
velocidad de agitación del impulsor de paletas marinas se
estableció a 80 rpm, la temperatura a 37ºC, el pH a 7,1 al inicio y
a 7,0 tras la infección y la DO al 40% todo el tiempo durante
la
serie.
serie.
La densidad celular inicial fue de 4,3E+5 vc/mL
(viabilidad del 97%) y 4 días más tarde, cuando la densidad celular
alcanzó 2,7E+6 vc/mL (viabilidad del 93%), se separaron las células
por centrifugación y se resuspendieron las células en medios
frescos y se trasfirieron al biorreactor CelliGen. Tras el
intercambio de medios, la densidad celular fue de 2,1E+6 vc/mL y
las células se infectaron a una MOI de 10. Desde entonces, la DO
descendió por debajo del 40%. Para mantener la DO por encima del
40%, se retiraron aproximadamente 500 mL de cultivo del biorreactor
CelliGen para disminuir la demanda de oxígeno del cultivo celular, y
se colocaron las paletas marinas superiores cerca de la interfase
entre la fase de gas y de líquido para mejorar la transferencia de
oxígeno mediante el aumento de la renovación de la superficie. Desde
entonces, la DO pudo mantenerse por encima del 40% hasta el final
de la
serie.
serie.
Para el control de pH, se usó gas CO_{2} para
acidificar el cultivo celular y disolución de NaHCO_{3} 1 N para
hacer alcalino el cultivo celular. El control del pH se estableció
inicialmente a 7,10. El pH inicial del cultivo celular fue de
aproximadamente 7,41. Aproximadamente se consumieron 280 mL de
disolución de NaHCO_{3} 1 N hasta que el pH del cultivo celular
se estabilizó aproximadamente a pH 7,1. Tras la infección viral del
cultivo celular, se disminuyó el control de pH a pH 7,0 y se cerró
la línea de suministro de gas CO_{2} para reducir el consumo de
la disolución de NaHCO_{3}. El consumo de demasiada disolución de
NaHCO_{3} para el ajuste del pH incrementaría indeseablemente el
volumen del cultivo celular. Desde entonces, se consumieron 70 mL
de disolución de NaHCO_{3} 1 N y el pH estuvo en el intervalo
entre 7,0 y 7,1 la mayoría del tiempo durante la serie. La
temperatura se controló entre 35ºC y
37ºC.
37ºC.
Tras la infección, la viabilidad de las células
disminuyó constantemente hasta el día 6 de la recogida tras la
infección. En el día de la recogida, ninguna de las células fue
viable. La producción viral volumétrica del biorreactor CelliGen
fue de 5,1E+10 vps por HPLC/mL en comparación con 1,3E+10 vps/mL en
los matraces con agitación. El entorno controlado en el biorreactor
CelliGen aumentó 4 veces la producción de vectores
Ad-p53 en comparación con los matraces con agitación
con sustitución de medios. Esto se debe tanto al aumento de la
densidad celular en el momento de la infección desde 1,2E+6 hasta
2,1E+6 vc/mL, como al aumento de la producción viral por célula
desde 1,3E+4 hasta 2,5E+4 vps/mL. 2,5E+4 vps/mL es comparable a
3,5E+4 vps/célula en el cultivo celular adherido, complementado con
suero.
\vskip1.000000\baselineskip
En el primer estudio, las células se hicieron
crecer satisfactoriamente en un biorreactor con agitación para la
producción viral, y se suministraron el oxígeno y el CO_{2}
mediante solapamiento de gas en el espacio de cabeza del
biorreactor. Sin embargo, este método limitará la ampliación a
escala del sistema de cultivo celular debido a su ineficaz
transferencia de gas. Por tanto en el segundo estudio, para someter
a prueba la factibilidad de la ampliación a escala del cultivo en
suspensión libre de suero, se investigó el crecimiento de las
células y la producción de Ad-p53 en un biorreactor
con inyección de vapor. Se suministraron los gases oxígeno puro y
CO_{2} mediante burbujeo a través de los medios IS293 libres de
suero, complementados con F-68 (0,1%) y heparina
(100 mg/L).
Se burbujeó oxígeno puro a través de los medios
líquidos para suministrar el oxígeno disuelto a las células y se
controló el suministro de oxígeno puro mediante una válvula de
solenoide para mantener el oxígeno disuelto por encima del 40%.
Para el suministro eficaz de oxígeno mientras que se minimiza el
daño a las células, se usó un difusor de aire sinterizado de acero
inoxidable, con un tamaño de poro nominal de aproximadamente 0,22
micrómetros, para suministrar oxígeno puro. También se suministró
gas CO_{2} a los medios líquidos mediante burbujeo desde el mismo
difusor que el oxígeno puro para mantener el pH aproximadamente a
7,0. Para el control del pH, también se conectó al biorreactor a
una disolución de Na_{2}CO_{3} (106 g/L). Se suministró aire al
espacio de cabeza del biorreactor para mantener una presión positiva
dentro del biorreactor. Otra configuración del biorreactor fue la
misma que la del primer estudio.
Se desarrollaron células de inóculo a partir de
un vial congelado. Se descongeló un vial de células congeladas
(1,0E+7 vc) en 50 mL de medios en un matraz T-150 y
se subcultivaron 3 veces en 200 mL de medios en matraces con
agitación de 500 mL. Se mezclaron 400 mL de células de inóculo
hechas crecer en 2 matraces con agitación de 500 mL, con medios
IS293 con F-38 y heparina en un bidón de 10 L para
preparar 3,5 L de suspensión celular y se transfirieron al
biorreactor CelliGen de 5 L.
La densidad celular inicial en el biorreactor
fue de 3,0E+4 vc/mL. La densidad celular inicial es menor que la
del primer estudio. En el primer estudio, se usaron cuatro matraces
con agitación de 500 mL como el inóculo. Incluso con la menor
densidad celular inicial, las células crecieron hasta 1,8E+6 vc/mL
en el día 7 en el entorno con inyección de vapor y la viabilidad
fue del 98%. Durante el crecimiento de 7 días, la concentración de
glucosa disminuyó desde 5,4 g/L hasta 3,0 g/L y la de lactato
aumentó desde 0,3 g/L hasta 1,8 g/L.
En el día 7, cuando la densidad celular alcanzó
1,8E+6 vc/mL, se separaron por centrifugación las células en el
biorreactor y se resuspendieron en medios recientes IS293 libres de
suero con F-68 y heparina en un bidón de 10 L. Se
infectaron las células 293 con 1,25E+11 ufp de
Ad-p53 y se transfirieron al biorreactor CelliGen.
En el biorreactor, la viabilidad celular fue del 100% pero la
densidad celular fue sólo de 7,2E+5 vc/mL. Hubo una pérdida de
células durante la operación de intercambio de medios. El título
viral en los medios se midió como 2,5E+10 vps en HPLC/mL en el día
2, 2,0E+10 en el día 3, 2,8E+10 en el día 4, 3,5E+10 en el día 5 y
3,9E+10 vps por HPLC/mL en el día 6 de la recogida. El primer
estudio con el biorreactor Celligen con solapamiento de gas produjo
5,1E+10 vps por HPLC/mL. La menor concentración de virus en la
segunda serie se debió probablemente a la menor densidad celular en
el momento de la infección. En comparación con 7,2E+5 vc/mL en la
segunda serie, se usó 2,1E+6 vc/mL en la primera serie. En realidad,
se estimó que la producción por célula de Ad-p53 en
el segundo biorreactor CelliGen con inyección de vapor es de 5,4E+4
vps/célula, que es la producción por célula más alta jamás lograda
hasta ahora. La producción por célula en el primer biorreactor
CelliGen libre de suero sin inyección de vapor y en el matraz T
complementado con suero fue de 2,5E+4 vps/célula y de 3,5E+4
vps/célula, respectiva-
mente.
mente.
\newpage
Tras la infección viral, la viabilidad de las
células disminuyó desde el 100% hasta el 13% en el día 6 de la
recogida. Durante esos 6 días tras la infección, la concentración de
glucosa disminuyó desde 5,0 g/L hasta 2,1 g/L y la de lactato
aumentó desde 0,3 g/L hasta 2,9 g/L. Durante todo el periodo de
operación, se consumieron aproximadamente 20 mL de disolución de
Na_{2}CO_{3} (106 g/L).
Los resultados experimentales demuestran que es
técnica y económicamente factible producir Ad-p53 en
el
biorreactor con agitación y con inyección de vapor. Está bien establecida la operación unitaria de ampliación a escala y a gran escala del biorreactor con agitación y con inyección de vapor.
biorreactor con agitación y con inyección de vapor. Está bien establecida la operación unitaria de ampliación a escala y a gran escala del biorreactor con agitación y con inyección de vapor.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente ejemplo es un texto extraído de
Blanche et al. en el documento WO 98/00524. Este texto es
descriptivo de los métodos usados por Blanche et al. en la
producción de adenovirus recombinante.
Los adenovirus recombinantes se producen
usualmente mediante la introducción de ADN viral en la línea de
encapsulación, seguido de lisis de células tras aproximadamente 2 ó
3 días (siendo la cinética del ciclo adenoviral de 24 a 36 horas).
Tras la lisis de las células, se aíslan las partículas virales
recombinantes mediante centrifugación en un gradiente de cloruro de
cesio.
Para la implementación del procedimiento, el ADN
viral introducido puede ser el genoma viral recombinante completo,
posiblemente construido en una bacteria (ST 95010) o en una levadura
(documento WO95/03400) transfectado en las células. También puede
ser un virus recombinante usado para infectar la línea de
encapsulación. Además, es posible introducir el ADN viral en forma
de fragmentos, llevando cada uno una parte del genoma viral
recombinante y una zona de homología que permite que el genoma
viral recombinante se reorganice mediante recombinación homóloga
entre los diferentes fragmentos, tras la introducción en la célula
de encapsulación. Por tanto, un procedimiento clásico de producción
de adenovirus incluye las siguientes etapas: se infectan las células
(por ejemplo, células 293) en una placa de cultivo con una
disolución madre viral previa a la tasa de 3 a 5 partículas virales
por célula (multiplicidad de infección (MOI) = de 3 a 5), o se
transfectan con ADN viral. Entonces, la incubación dura de 40 a 72
horas. Posteriormente, el virus se libera del núcleo mediante la
lisis de las células, generalmente mediante varios ciclos sucesivos
de descongelación. Entonces, se centrifuga el lisado celular
obtenido a baja velocidad (de 2000 a 4000 rpm), después de lo cual
se purifica el sobrenadante (lisado celular clarificado) mediante
centrifugación en la presencia de cloruro de cesio en dos
etapas:
- -
- Una primera centrifugación rápida de 1,5 horas en dos capas de cloruro de cesio de densidades de 1,25 y 1,40 que está entorno a la densidad del virus (1,34) de tal modo que se separa el virus de las proteínas del medio;
- -
- Una segunda centrifugación más larga en un gradiente (desde 10 hasta 40 horas según el rotor usado), que constituye una sola y verdadera etapa de purificación del virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Generalmente, tras la segunda etapa de
centrifugación, la banda del virus se intensifica. Sin embargo, se
observan dos bandas más finas, menos densas. La observación en el
microscopio electrónico ha demostrado que estas bandas están
constituidas de partículas virales vacías o rotas para la banda más
densa y de subunidades virales (pentones, hexones) para la banda
menos densa. Tras esta etapa, el virus se recoge mediante la punción
con aguja en el tubo de centrifugación y se elimina el cesio
mediante diálisis o desionización.
Aunque los niveles de pureza obtenidos son
satisfactorios, este tipo de procedimiento presenta ciertas
desventajas. En particular, se basa en el uso del cloruro de cesio,
que es un reactivo incompatible con el uso terapéutico en el
hombre. Por tanto, es imperativo eliminar el cloruro de cesio al
final de la purificación. También este procedimiento tiene algunas
otras desventajas mencionadas más adelante, limitando su uso a una
escala industrial.
Para remediar estos problemas, se ha propuesto
purificar el virus obtenido después de la lisis, no por gradiente
de cloruro de cesio, sino por cromatografía. Por tanto, el artículo
de Huyghe et al. (Hum. Gen. Ther. 6(1996)
1403) describe un estudio de diferentes tipos de cromatografías
aplicadas a la purificación de adenovirus recombinantes. Este
artículo describe en particular un estudio de purificación de
adenovirus recombinante usando cromatografía de intercambio
aniónico débil (DEAE). Estudios anteriores ya habían descrito el uso
de este tipo de cromatografía dirigido a ese objetivo (Klemperer
et al. Virology 9 (1959) 536; Philipson L., Virology
10 (1960) 459; Haruna et al., Virology 13 (1961) 264). Los
resultados presentados en el artículo de Huyghe et al.
mostraron una eficacia bastante escasa del protocolo de
cromatografía de intercambio iónico recomendado. Por tanto, la
resolución obtenida es promedio, indicando los autores que las
partículas virales están presentes en varios picos cromatográficos;
la producción es baja (producción de partícula viral: 67%,
producción de partícula infecciosa: 49%); y la preparación viral
obtenida tras esta etapa cromatográfica es impura. Además, es
necesario el tratamiento previo del virus con diferentes
enzimas/proteínas. También, el mismo artículo describe un estudio
del uso de cromatografía de permeación en gel, mostrando una
resolución muy mala y producciones muy bajas
(15-20%).
El documento WO 98/00524 describe un nuevo
procedimiento para la producción de adenovirus recombinantes. El
procedimiento según el documento WO 98/00524 resulta de cambios en
los procedimientos anteriores en la fase de producción y/o en la
fase de purificación. El procedimiento según el documento WO
98/00524 posibilita ahora de una manera muy rápida y de tipo
industrial, obtener disoluciones madre de virus de muy alta cantidad
y cali-
dad.
dad.
Una de las primeras características se refiere
más particularmente a un procedimiento para la preparación de
adenovirus recombinantes en el que se recogen los virus del
sobrenadante del cultivo. Otro aspecto, se refiere a un
procedimiento para la preparación de adenovirus incluyendo una etapa
de ultrafiltración. Según aún otro aspecto, el documento WO
98/00524 refiere a un procedimiento para la purificación de
adenovirus recombinantes incluyendo una etapa de cromatografía de
intercambio aniónico. El documento WO 98/00524 también describe un
procedimiento de purificación mejorado, usando cromatografía de
permeación en gel, posiblemente acoplada con cromatografía de
intercambio aniónico. El procedimiento según el documento WO
98/00524 posibilita obtener virus de alta calidad en lo que se
refiere a la pureza, estabilidad, morfología e infectividad, con
producciones muy altas y en condiciones de producción completamente
compatibles con los requisitos industriales y con las regulaciones
que se refieren a la producción de moléculas terapéuticas.
En particular, en lo que se refiere a la
industrialización, el procedimiento según el documento WO 98/00524
usa métodos del tratamiento de sobrenadantes de cultivos sometidos a
prueba en una gran escala para proteínas recombinantes, tales como
microfiltración y filtración profunda, y ultrafiltración tangencial.
Además, debido a la estabilidad del virus a 37ºC, este
procedimiento permite una mejor organización en la fase industrial
puesto que, al contrario del método intracelular, no es necesario
que el tiempo de recogida sea preciso en el plazo de medio día.
Además, esto garantiza la recogida máxima del virus, que es
particularmente importante en el caso de virus deficientes en
varias regiones. Además, el procedimiento según el documento WO
98/00524 permite un seguimiento más fácil y más preciso de las
cinéticas de producción, directamente en muestras homogéneas del
sobrenadante, sin tratamiento previo, lo que permite la mejor
reproducibilidad de las producciones. El procedimiento según el
documento WO 98/00524 posibilita eliminar la etapa de lisis celular.
La lisis de las células presenta varias desventajas. Por tanto,
puede ser difícil considerar la ruptura de las células mediante
ciclos de congelación/descongelación al nivel industrial. Además,
los métodos de lisis alternativos (de Dounce,
X-press, sonicación, cizallamiento mecánica, etc.)
también presentan desventajas: son potenciales generadores de
pulverizados que son difíciles de confinar para los virus L2 ó L3
(nivel de confinamiento de los virus, dependiendo de su
patogenicidad o de su modo de diseminación), con estos virus que
tienen una tendencia a ser infecciosos a través de medios aéreos;
generan esfuerzos cortantes y/o una liberación de calor que es
difícil de controlar, disminuyendo la actividad de las
preparaciones. La solución de usar detergentes para lisar las
células demandaría la validación y también requeriría que se
validara la eliminación del detergente. Finalmente, la lisis
celular conduce a la presencia en el medio de una gran cantidad de
residuos celulares, lo que hace más difícil la purificación. En lo
que se refiere a calidad de virus, el procedimiento según el
documento WO 98/00524 permite potencialmente la mejor maduración del
virus, lo que conduce a una población más homogénea. En particular,
siempre que el empaquetamiento del ADN viral sea la última etapa en
el ciclo viral, la lisis prematura de las células libera
potencialmente partículas vacías que, aunque no son replicativas,
son a priori infecciosas y pueden participar en el efecto
tóxico distintivo del virus y aumentar el ratio de la actividad
específica de las preparaciones obtenidas. El ratio de infectividad
específica de una preparación se define como el ratio del número
total de partículas virales, medido mediante métodos bioquímicos (DO
a 260 nm, HPLC, CRP, métodos inmuno-enzimáticos,
etc.) para varias partículas virales que generan un efecto
biológico (formación de placas de lisis en las células en cultivo y
en medio sólido, traslado de células). En la práctica, para una
preparación purificada, el ratio se determina mediante la división
de la concentración de las partículas medidas a DO de 260 nm, por
la concentración de unidades formadoras de placas en la preparación.
Este ratio debe ser inferior a 100.
Los resultados obtenidos muestran que el
procedimiento según el documento WO 98/00524 posibilita obtener un
virus de una pureza comparable con la del homólogo purificado
mediante centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, en una
única etapa y sin tratamiento preliminar, partiendo de un
sobrenadante viral concentrado.
Por tanto, el documento WO 98/00524 se refiere a
un procedimiento para la producción de adenovirus recombinantes
caracterizado por el hecho que se introduce el ADN viral en un
cultivo de células de encapsulación, y se recogen los virus
producidos tras la liberación en el sobrenadante del cultivo. Al
contrario de los procedimientos anteriores en los que los virus se
recogen tras la lisis celular prematura realizada mecánica o
químicamente, en el procedimiento según el documento WO 98/00254
las células no se lisan por medio de un factor externo. Se sigue
con el cultivo durante un periodo de tiempo más largo y se recogen
los virus directamente en el sobrenadante, tras la liberación
espontánea por las células de encapsulación. De esta manera, se
recupera el virus en el sobrenadante celular, mientras que en los
procedimientos anteriores está implicado un virus intracelular y
más particularmente un virus intra-
nuclear.
nuclear.
El solicitante ha demostrado ahora que a pesar
de que la prolongación de la duración del cultivo y a pesar del uso
de volúmenes más grandes, el procedimiento según la invención
posibilita generar partículas virales en gran cantidad y de mejor
calidad.
Además, como se indicó anteriormente, este
procedimiento posibilita evitar las etapas de lisis, que son
problemáticas desde un punto de vista industrial y generan
numerosas impurezas.
Por tanto, el principio del procedimiento radica
en la recogida de los virus liberados en el sobrenadante. Este
procedimiento puede implicar un tiempo de cultivo más largo que el
usado en las técnicas anteriores basado en la lisis de las células.
Tal como se indicó anteriormente, el tiempo de recogida no tiene que
ser preciso en el plazo de medio día. Esto se determina
esencialmente mediante las cinéticas de liberación de los virus en
el sobrenadante del
cultivo.
cultivo.
Las cinéticas de liberación de los virus pueden
seguirse de diferentes formas. En particular, es posible usar
métodos de análisis tales como HPLC en fase inversa, cromatografía
analítica de intercambio iónico, PCR semicuantitativa (ejemplo
4.3), tinción de células muertas con azul de tripano, medición de la
liberación de enzimas intracelulares de tipo LDH, medición de
partículas en el sobrenadante mediante equipos de tipo Coulter o
mediante difracción de la luz, métodos inmunológicos (ELISA, RIA,
etc.) o nefelométricos, titulación mediante la agregación en la
presencia de anticuerpos, etc.
La recogida se realiza preferiblemente cuando se
ha liberado al menos el 50% de los virus en el sobrenadante. El
punto en el tiempo en el que se ha liberado el 50% de los virus
puede determinarse fácilmente haciendo un estudio cinético según
los métodos descritos anteriormente. Incluso más preferiblemente, la
recogida se realiza cuando se ha liberado al menos el 70% de los
virus en el sobrenadante. Se prefiere particularmente realizar la
recogida cuando al menos se ha liberado el 90% de los virus en el
sobrenadante, es decir, cuando la cinética alcanza una meseta. Las
cinéticas de liberación del virus se basan esencialmente en el ciclo
de replicación del adenovirus y pueden resultar influidas por
ciertos factores. En particular, pueden variar según el tipo de
virus usado, y especialmente según el tipo de deleción realizada en
el genoma viral recombinante. En particular, la deleción de la
región E3 parece retardar la liberación del virus. Por tanto, en
presencia de la región E3, puede recogerse el virus entre 24 y 48
tras la infección. Por el contrario, en ausencia de la región E3,
parecen ser necesarios tiempos de cultivo más prolongados. Con
respecto a esto, el solicitante ha tenido la experiencia con las
cinéticas de liberación de un adenovirus deficiente en regiones E1 y
E3 en el sobrenadante de las células, y ha demostrado que la
liberación comienza aproximadamente de 4 a 5 días tras la infección
y dura hasta aproximadamente el día 14. Generalmente, la liberación
alcanza una meseta entre el día 8 y el día 14, y el título
permanece estable durante al menos 20 días tras la infección.
Preferiblemente, en el procedimiento según el
documento WO 98/00254, las células se cultivan durante un periodo
que oscila entre 2 y 14 días. Además, la liberación del virus puede
inducirse mediante la expresión de una proteína en la célula de
encapsulación, por ejemplo, una viral, implicada en la liberación
del virus. Por tanto, en el caso del adenovirus, la liberación
puede modularse mediante la expresión de la proteína Death
codificada por la región E3 del adenovirus (proteína
E3-11.6K), expresada posiblemente bajo el control de
un promotor inducible. En consecuencia, es posible reducir el
tiempo de liberación del virus y recoger en el sobrenadante del
cultivo más del 50% de los virus 24-48 horas tras la
infección.
Para recuperar las partículas virales,
ventajosamente se filtra primero el sobrenadante del cultivo. Dado
que el adenovirus tiene un tamaño de aproximadamente 0,1 \mum (120
nm), la filtración se realiza con membranas cuyos poros son
suficientemente grandes como para dejar pasar el virus a través,
pero suficientemente finos como para retener los contaminantes.
Preferiblemente, la filtración se realiza con membranas que tienen
una porosidad superior a 0,2 \mum. Según una realización a modo
de ejemplo particularmente ventajosa, la filtración se realiza
mediante filtraciones sucesivas en membranas de porosidad
decreciente. Particularmente, se han obtenido buenos resultados
haciendo filtración en filtros con un intervalo de porosidad
decreciente - 10 \mum, 1,0 \mum, luego 0,8 - 0,2 \mum. Según
otra variante preferida, la filtración se realiza mediante
microfiltración tangencial en membranas planas o fibras huecas. Más
particularmente, es posible usar membranas Millipore planas o
fibras huecas cuya porosidad oscila entre 0,2 y 0,6 \mum. Los
resultados presentados en los ejemplos muestran que esta etapa de
filtración tiene una producción del 100% (no se observó pérdida de
virus por retención en el filtro que tenía la menor porosidad).
Según otro aspecto del documento WO 98/00524, el
solicitante ha desarrollado ahora un procedimiento que posibilita
recoger y purificar el virus del sobrenadante. Hacia este objetivo,
un sobrenadante así filtrado (o clarificado) se somete a
ultrafiltración. Esta ultrafiltración posibilita (i) concentrar el
sobrenadante, siendo importantes los volúmenes usados; (ii)
realizar una primera purificación del virus y (iii) ajustar el
tampón de la preparación en las etapas de preparación posteriores.
Según una realización preferida a modo de ejemplo, el sobrenadante
se somete a ultrafiltración tangencial. La ultrafiltración
tangencial consiste en concentrar y fraccionar una disolución entre
dos compartimentos, retener y filtrar, separar mediante membranas de
umbrales de punto de corte especificado, mediante la producción de
un flujo en el compartimiento de material retenido del aparato y
mediante la aplicación de una presión transmembrana entre este
compartimento y el compartimento de material filtrado.
Generalmente, el flujo se produce con una bomba en el compartimiento
de material retenido del aparato, y la presión transmembrana se
controla mediante una válvula en el canal de líquido del circuito de
material retenido o mediante una bomba de velocidad variable en el
canal de líquido del circuito de material filtrado. Se eligen la
velocidad del flujo y la presión transmembrana de modo que se
generen bajos esfuerzos cortantes (número de Reynolds inferior a
5000 s^{-1}, preferiblemente menor de 3000 s^{-1}, presión menor
de 1,0 bar) mientras que se previene el taponamiento de las
membranas. Pueden usarse diferentes sistemas para llevar a cabo la
ultrafiltración, por ejemplo, membranas en espiral (Millipore,
Amicon) así como membranas planas o fibras huecas (Amicon,
Millipore, Sartorius, Pall, GF, y Sepracor). Dado que el adenovirus
tiene una masa de aproximadamente 1000 kDa, es ventajoso dentro del
alcance de la invención usar membranas que tengan un umbral de
punto de corte menor de 1000 kDa y preferiblemente que oscile entre
100 kDa y 1000 kDa. El uso de membranas que tiene un umbral de
punto de corte de 1000 kDa o superior, provoca en efecto una gran
pérdida de virus en esta fase. Es preferible usar membranas que
tengan un umbral de punto de corte que oscile entre 200 y 600 kDa,
e incluso más preferible, entre 300 y 500 kDa. Las experiencias
presentadas en los ejemplos muestran que el uso de una membrana que
tiene un umbral de punto de corte en 300 kDa permite que se retenga
más del 90% de las partículas virales, mientras que se eliminan los
contaminantes del medio (ADN, proteínas en el medio, proteínas
celulares, etc.). El uso de un umbral de punto de corte de 500 kDa
ofrece las mismas ventajas.
Los resultados presentados en el documento WO
98/00524 muestran que esta etapa posibilita concentrar grandes
volúmenes de sobrenadante sin pérdida de virus (redimiendo del 90%),
con generación de mejor calidad de virus. En particular, pueden
obtenerse fácilmente factores de concentración de 20- a 100-
veces.
Por tanto, esta etapa de ultrafiltración incluye
una purificación adicional en comparación con el modelo clásico
puesto que se eliminan los contaminantes de masa por debajo del
umbral de punto de corte (300 ó 500 kDa) al menos en parte. Puede
observarse una mejora clara en la calidad de la preparación viral,
tras comparar el aspecto de la separación después de la primera
etapa de ultracentrifugación según los dos procedimientos. En el
procedimiento clásico que implica lisis, el tubo de preparación
viral presenta un aspecto turbio con un coágulo (lípidos,
proteínas) que algunas veces toca la banda de virus, mientras que en
el procedimiento según la invención, tras la liberación y la
ultrafiltración, la preparación presenta una banda que previamente
se ha resuelto bien de los contaminantes del medio que persisten en
la fase superior.
También se demuestra una mejora en la calidad
tras comparar los perfiles sobre la cromatografía de intercambio
iónico de un virus obtenido mediante lisis celular con un virus
obtenido mediante ultrafiltración, tal como se describe en el
documento WO 98/000524. Además, es posible mejorar adicionalmente la
calidad mediante la aplicación de ultrafiltración con diafiltración
del concentrado. Esta diafiltración se realiza basándose en al
mismo principio que la ultrafiltración tangencial, y posibilita
eliminar más completamente los contaminantes de gran tamaño en el
umbral de punto de corte de la membrana, mientras que se logra el
equilibrio del concentrado en el tampón de
purifica-
ción.
ción.
Además, el solicitante también ha mostrado que
esta ultrafiltración posibilita purificar el virus directamente
mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante
cromatografía de permeación en gel, permitiendo la excelente
resolución del pico de la partícula viral sin que requiera de
antemano tratamiento de la preparación con cromatografía. Esto es
particularmente inesperado y ventajoso. De hecho, tal como se indica
en el artículo de Huyghe et al. mencionado anteriormente, la
purificación por cromatografía de preparaciones virales da pobres
resultados y requiere también tratamiento previo de la suspensión
viral con Benzonase y ciclodextrinas.
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Para llegar a un procedimiento optimizado que
pueda usarse para la producción de adenovirus para la producción
terapéutica clínica, se han modificado algunas etapas en el
procedimiento anterior así como en de Blanche et al. en la
publicación PCT n.º WO 98/00524, para mejorar la producción a gran
escala. Estas etapas implican la modificación de la etapa de
recogida del virus, la etapa de tratamiento con nucleasa y la resina
usada para la purificación. El procedimiento optimizado se
representa en el diagrama de flujo en la figura 28.
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En el procedimiento descrito anteriormente, los
virus se recogían mediante la lisis de células 293 usando una
disolución de lisis de Tween-20 al 1%, 2 días tras
la infección viral. Este método de recogida requería la
introducción de una etapa de lisis en el procedimiento y la adición
de una sustancia (Tween-20) en la recogida viral
sin procesar. Considerando la naturaleza lítica del ciclo de vida
del adenovirus, se usó una estrategia alternativa para recoger el
sobrenadante que contenía virus tras la lisis completa de células
293 mediada por virus. Se determinó la cinética de liberación viral
mediante el análisis de muestras diarias de sobrenadante del
sistema Cellcube^{TM} tras la infección. La liberación viral en el
sobrenadante alcanzó una meseta en el día 5 tras la infección. Se
encontró que las cinéticas de la liberación viral son constantes. La
figura 24 muestra la cinética de liberación viral típica para
Ad5CMV-p53. Se obtuvo una producción viral
equivalente mediante el uso de o bien lisis con
Tween-20 ó bien métodos de recogida de sobrenadante
por autolisis. Sin embargo, el método de recogida de sobrenadante
simplificó el procedimiento de producción mediante la eliminación
de la etapa de lisis en el procedimiento y el agente de lisis
añadido (Tween-20) en la recogida viral sin
procesar. Como resultado, se usará preferiblemente el método de
recogida del sobrenadante para el procedimiento optimizado.
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En el procedimiento anterior y en el de Blanche
et al en la publicación PCT n.º WO 98/00524, se incluyó NaCl
1 M en el tampón de tratamiento con Benzonase^{TM} para prevenir
la precipitación viral durante el tratamiento con enzimas.
Desgraciadamente, se encontró que la presencia de NaCl 1 M en el
tampón, inhibe significativamente la actividad enzimática de
Benzonase^{TM}. Como resultado, se examinaron otros tampones que
podrían prevenir la precipitación viral sin retardar la actividad
enzimática de Benzonase^{TM}. Se encontró que un tampón Tris 0,5
M/HCl + MgCl_{2} 1 mM, pH = 8,0, reunía ambos criterios. Además,
este tampón tiene una conductividad de 19 mS/cm lo que posibilita
cargar la disolución viral tratada con Benzonase^{TM},
directamente en la columna cromatográfica para la purificación.
Como resultado, el cambio del tampón Tris 0,5 M/HCl + MgCl_{2} 1
mM, pH = 8,0, no solo mejorará la eficacia del tratamiento con
Benzonase^{TM}, sino que también simplificará el procedimiento
posterior.
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La resina Fractogel TMAE(s) y la resina
Toyopearl SuperQ 650M empleadas en el procedimiento anterior y la
de Blanche et al. funcionaron bien de manera sistemática. Sin
embargo, debido a problemas de suministro y soporte técnico, se
eligieron resinas alternativas para su uso en la purificación de
virus. Se encontró que la resina Source 15Q fabricada por Pharmacia
Biotech funciona tan bien como las resinas Fractogel y Toyopearl.
La figura 25 muestra un cromatograma típico de la resina Source 15Q.
Sorprendentemente, se encontró que el material viral interacciona
ligeramente más fuerte con la resina Source 15Q que con la resina
Fractogel y Toyopearl. Como resultado, se observó un gran pico de
proteína viral al inicio del gradiente de elución. También se eluyó
la fracción de virus purificada relativamente más tarde en el
gradiente. Sin embargo, el perfil de purificación global no fue
significativamente diferente del de la resina Fractogel o Toyopearl.
El análisis por HPLC de la fracción viral purificada de la resina
Source 15Q mostró un perfil equivalente al de la resina Fractogel.
La figura 26 muestra el perfil por HPLC.
También se evaluó Ad5CMV-p53
preparado mediante el procedimiento optimizado para determinar su
actividad biológica en comparación con el material preparado
mediante el procedimiento anterior y el de Blanche et al. Las
dos líneas celulares, H1299 y SAOS-LM, que no
expresaron p53 endógeno, se transdujeron con materiales preparados
mediante los dos procedimientos a iguales multiplicidades de
infección (partículas virales/célula). Se monitorizó la expresión
de p53 a las 6 horas tras la transducción en H1299 y a las 24 horas
tras la transducción en SAOS-2. El nivel de
expresión de p53 mediando por los dos materiales fue equivalente y
dependiente de la dosis en ambas líneas celulares receptoras
(figura 27).
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Se evaluó la estabilidad de la congelación y
descongelación de la fracción viral purificada eluida de una
columna de cromatografía (masa purificada). La fracción viral
purificada eluida de la columna se congeló en masa a \leq -60ºC
tras complementar con glicerol hasta una concentración final del 10%
(v/v). La masa congelada se descongeló satisfactoriamente sin
efectos nocivos para el título. Los datos de congelación y
descongelación se facilitan en la
tabla 16.
tabla 16.
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\vskip1.000000\baselineskip
Además, no se observaron cambios en los perfiles
de HPLC antes y tras la congelación y descongelación. Por tanto, el
material viral en la etapa tras la cromatografía puede mantenerse a
< -60ºC para su procesamiento adicional, y puede introducirse un
control del procedimiento en la etapa tras la cromatografía (masa
purificada).
Se observó una estabilidad de congelación y
descongelación similar para el producto en masa estéril formulado.
La tabla 17 muestra los datos de congelación y descongelación.
\vskip1.000000\baselineskip
Como resultado, el producto en masa estéril
formulado puede mantenerse a < -60ºC antes de su llenado aséptico
sin efectos dañinos en el título viral y puede introducirse un
punto de control del procedimiento en la etapa tras la formulación
(masa estéril).
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Durante la ampliación a escala y la optimización
del procedimiento a gran escala (16-meros), los
inventores encontraron varios parámetros que son deseables para
series de producción satisfactorias y alta producción del virus.
Estos parámetros deseables se centran entorno al sistema de cultivo
celular, la parte más anterior del procedimiento de producción de
adenovirus, y se cree que es aplicable a otros tipos de sistemas de
cultivo celular y a escalas más grandes. En particular, puede
preverse fácilmente que los cambios descritos a continuación que
dan como resultado cambios funcionales en el sistema, serán útiles
para permitir la modificación y la optimización de otros sistemas
de cultivo celular.
Para el presente ejemplo, los parámetros de
control del cultivo son tal como sigue. Las células se cultivan a
37ºC con CO_{2} al 10%. El medio de cultivo es DMEM + FBS al 10%,
y la densidad celular de inoculación para la expansión celular es
< 4 x 10^{4} células/cm^{2}. Los parámetros que están
implicados en la configuración y ejecución del sistema
Cellcube^{TM} y se enumeran a continuación.
Configuración de Cellcube^{TM}: En una
configuración a escala completa (4 x 100 ó
"16-meros"), es deseable usar un circuito
separado de recirculación del medio de cultivo para cada módulo de
cubo (4-mero) para lograr incluso la perfusión del
medio. Por ejemplo, en la presente configuración de
16-meros, los 16-meros se componen
de cuatro de 4-meros unidos entre sí en una serie,
teniendo cada 4-meros su propio circuito de
recirculación de medio. Los 16-meros se consideran
una unidad y se controlan mediante un único módulo de control que
modula la tasa de perfusión del medio, y mide los parámetros de
control del cultivo. Otras configuraciones tales como el uso de un
circuito de recirculación del medio para cada dos módulos de
4-meros dan como resultado desigual perfusión del
medio debido al descenso de la presión en el sistema, y es nocivo
para la salud de las células en el segundo cubo con menores niveles
de nutrientes y medio recientemente oxigenado. Por tanto, en un
sistema de cultivo celular usado para la producción de adenovirus,
es preferible que la perfusión del medio de cultivo celular se
mantenga a una presión y velocidad constante, garantizando la salud
sistemática y óptima de las células productoras. La tasa de
perfusión se determina mediante la monitorización de uno o más de
los parámetros de control del cultivo celular, tales como la
concentración de glucosa.
Densidad de siembra: Con el fin de lograr
expansión y crecimiento celular máximos, es más preferible inocular
el Cellcube^{TM} con 1-2 x 10^{4}
células/cm^{2}. Números superiores de células usadas en la etapa
de inoculación celular dan como resultado una densidad celular que
es demasiado alta y el resultado es un exceso de confluencia de
células en el momento de la infección viral, disminuyendo por tanto
las producciones. Un experto en la técnica podrá perfectamente
determinar que en otros tipos de sistemas de cultivo celular, podría
determinarse fácilmente una optimización similar de la densidad de
siembra para un sistema particular.
Método de siembra: Se ha encontrado que para la
producción a escala completa es ventajoso usar un conjunto
homogéneo de células para la siembra de todos los módulos de
Cellcube^{TM}. Antes de sembrar en el aparato de cultivo celular,
se expanden las células productoras del banco de células de trabajo
a partir de los cultivos de disolución madre. Esta expansión
celular se lleva a cabo mediante el crecimiento de células en
matraces de cultivo celular u otros dispositivos similares de
cultivo celular, y la división continua de las células en
dispositivos de cultivo celular más grandes. Tras alcanzar el número
total de células necesarias para la inoculación del aparato de
cultivo celular a gran escala, se reúnen todas las células de cada
uno de los dispositivos de cultivo celular usados para la expansión
celular. Este conjunto homogéneo de células se usa para inocular
cada uno de los módulos del Cellcube^{TM} de los
16-meros. La siembra de cada uno de los módulos
usando poblaciones celulares separadas, por ejemplo a partir de
dispositivos de cultivo celular individuales en la fase de
expansión celular, puede dar como resultado desigual densidad
celular, y por tanto, desiguales niveles de confluencia. Se cree
que el uso de un conjunto homogéneo de células para la siembra
supera estos problemas.
Duración de la inoculación celular: Durante la
inoculación de cada uno de los módulos de Cellcube^{TM}, se
añaden células al módulo y se permite un periodo de algunas horas
para adherirse a la superficie del módulo. Durante este tiempo, no
hay perfusión o recirculación del medio. Los inventores han
encontrado que es ventajoso completar esta siembra de células en un
día (24 horas). Por tanto por ejemplo, se inocula un lado del módulo
y se deja durante un periodo de tiempo de 6-8 horas
para permitir la adhesión celular, y por tanto el otro lado del
módulo se inocula y se deja durante la noche para permitir que las
células se adhieran a la superficie del módulo. Durante este
procedimiento de siembra, se conserva separado el medio del cultivo
celular de cada lada del módulo, y no se permite que fluya al otro
lado del módulo. Se ha observado que si se realiza el procedimiento
de inoculación celular durante un periodo de tiempo de más de un
día, y/o con intercambio de medio entre los lados del módulo, hay
una mayor probabilidad de desprendimiento celular de la superficie
de cultivo celular debido a una débil adhesión. Las posibles
razones para esta adhesión débil pueden incluir: 1) el intercambio
del medio entre los lados del módulo que puede producir esfuerzos
cortantes con el potencial para desprender las células que se
someten al proceso de adhesión, y 2) mayor periodo de tiempo antes
de que se inicie la perfusión del medio puede dar como resultado
bajos niveles de nutrientes en los medios, y por tanto que se
deteriore la salud de las células, lo que conduce a una adhesión
menos eficaz.
Parámetros de control del cultivo: Los
inventores han encontrado han encontrado que la concentración de
glucosa del medio de cultivo celular debe preferiblemente
mantenerse a 1-2 g/L. Estudios anteriores usando
concentraciones de glucosa a niveles más altos, han demostrado la
reducción de la producción del producto.
Método de infección: Ocho días tras la siembra
de las células, se infectaron las células con adenovirus. Durante
el proceso de infección, se detuvo la perfusión del medio durante
una hora, sin embargo se mantuvo la recirculación del medio,
conservando por tanto niveles altos de oxígeno fresco en el medio.
Los inventores han encontrado que si también se detiene la
recirculación del medio durante la etapa de infección, existe una
creciente posibilidad de muerte celular debido a la falta de
oxígeno.
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El ejemplo descrito a continuación es
descriptivo de los métodos y materiales usados en el procedimiento
de producción y purificación a gran escala para el adenovirus
Ad5CMV-p53 recombinante. Este procedimiento usa un
aparato biorreactor Cellcube^{TM} como el sistema de cultivo
celular, y gran escala en este ejemplo se refiere a una
configuración de Cellcube de 4 x 100 o múltiplos del mismo. Las
producciones de virus máximos totales que pueden obtenerse a partir
de un sistema Cellcube de 4 x 100 son aproximadamente
1-5 x 101^{5} partículas virales en la
recogida.
El Cellcube^{TM} de 4 x 100 se configuró como
se describió anteriormente, con 4 módulos de Cellcube^{TM} de 100
en paralelo, todo en un circuito de recirculación de medio, y siendo
controlado todo el sistema mediante una sola unidad de control. Las
células productoras, células 293 del banco de células de trabajo
(BCT), se descongelaron y expandieron en matraces T y factorías
celulares (Nunc) que se siembran a densidades de desde
1-8 x 10e4 células/cm^{2}. Generalmente, las
células se dividieron en una confluencia de aproximadamente el
85-90% y se expandieron continuamente hasta que se
obtuvieron suficientes células para la inoculación del
Cellcube^{TM}. Al final de la fase de expansión celular, todas las
células de cada una de las factorías celulares se agruparon para
preparar una mezcla homogénea de células 293. Se usó esta fuente de
células para inocular el Cellcube^{TM} con un número de células
total en el intervalo de 1-3 x 10e9 células viables
por lado. Durante la inoculación celular, se suspendió la perfusión
y la recirculación del medio durante un periodo de tiempo para
permitir que las células se adhirieran al sustrato. Se permiten que
las células adhieran a un lado durante 4-6 horas;
entonces se inocula el lado dos y se permite que las células se
adhieran durante no más de 18 horas antes de reiniciar la
recirculación. Tras la adhesión celular, se reinició la perfusión y
la recirculación del medio y se permitió que las células crecieran
durante 7 días a 37ºC en condiciones de cultivo de pH =
6,90-7,45, DO = 40-50% de saturación
de aire. Se reguló la tasa de perfusión del medio según la
concentración de glucosa en el Cellcube^{TM}, y se mantuvo a entre
1-2 g/L. Un día después de la infección viral, se
cambió el medio para la perfusión de DMEM + FBS al 10% a DMEM basal
(sin FBS). En el día 8, se infectaron las células con virus
AdCMVp53 a una multiplicidad de infección (MOI) de
5-50 partículas virales por células basándose en un
total de 8 x 10^{10} células. Se detuvo la perfusión del medio
durante 1 hora en el momento de la infección y luego se reanudó
durante aproximadamente dos días. Se mantuvo la recirculación del
medio a través del periodo de infección del virus.
Estudios anteriores que analizaron las cinéticas
de liberación del virus tras la infección por
Ad5CMV-p53 de células 293 determinaron que se
obtuvo la liberación de virus máxima de las células productoras
debido a la naturaleza lítica del adenovirus, cuatro a seis días
tras la infección. Por tanto, cuatro a seis días tras la infección,
se eliminó el sobrenadante de los módulos de Cellcube^{TM} como
conjunto. Entonces, se clarificó el sobrenadante con virus mediante
filtración a través de dos filtros Polyguard de 5,0 micras, seguido
por un filtro Polysep de 5,0 micras (Millipore). Entonces se
concentró el sobrenadante aproximadamente 10 veces usando
filtración de flujo tangencial a través de un casete Pellicon
(Millipore) de punto de corte de peso molecular nominal (NMWC) de
300 K. Entonces, se intercambió el tampón mediante diafiltración
frente a Tris 0,5 M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 8. Entonces se trató el
sobrenadante a temperatura ambiente con Benzonase^{TM} 100 U/ml
en un tampón Tris 0,5 M/HCl + MgCl_{2} 1 mM, pH = 8,0, filtrado en
0,2 micras, y se incubó durante la noche a temperatura ambiente
para eliminar ácidos nucleicos celulares contaminantes. Entonces, se
filtró la preparación de virus sin procesar en 0,2 micras y se
cargó directamente en una columna de intercambio iónico (BPG
200/500, Pharmacia) que contenía resina Source 15Q en equilibrio con
Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, NaCl 250 mM, pH = 8. Se eluyó el
virus con un gradiente lineal de 40 volúmenes de columna que usa un
tampón de elución compuesto de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, + NaCl
2M, pH = 8. Entonces se sometió el virus purificado a otra etapa de
concentración y diafiltración para colocar el virus en la
formulación viral final para el producto de virus. La etapa de
concentración usó una membrana de TFF Pellicon de NMWC de 300, y
para la diafiltración se intercambió el tampón usando
8-10 volúmenes de columna de solución salina
tamponada con fosfato de Dulbecco + glicerol al 10%. Entonces, se
filtró hasta esterilidad el virus purificado a través de un filtro
Milipak (Millipore) de 0,2 micras. Entonces, el producto formulado
se llenó en los viales estériles de vidrio con tapones. Se
aplicaron tapas onduladas con cierre de fácil apertura antes de la
inspección y el etiquetado del producto final.
En el procedimiento pueden introducirse dos
puntos de control del procedimiento tal como se describe en el
ejemplo 10. El primer control del procedimiento puede introducirse
tras la etapa de IEC, momento en el que puede añadirse glicerol al
10% al eluato y congelarse para el procesamiento posterior. La
segunda etapa de control del procedimiento puede introducirse
después que obtener el producto final pero antes de la filtración
hasta esterilidad y la dispensación en viales. En este punto, el
producto en masa final puede congelarse y mantenerse para la
filtración y dispensación en viales final.
Se midió la siguiente lista de parámetros a lo
largo de toda la producción y el procedimiento de purificación. La
especificación es la medida deseada que el artículo sometido a
prueba debe cumplir. El resultado de cada prueba se muestra a la
derecha de la tabla.
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\vskip1.000000\baselineskip
En la actualidad, el producto Adp53 clínico se
almacena congelado a \leq 60ºC. Esta condición de almacenamiento
de ultracongelación no sólo es cara, sino que también crea problemas
para el transporte e inconvenientes para su uso clínico. El
objetivo del esfuerzo para desarrollo de una formulación es
desarrollar una formulación o bien líquida o bien liofilizada para
Asp53 que pueda almacenarse a condición de refrigeración y que sea
estable durante un periodo de tiempo prolongado. El desarrollo de la
formulación para Adp53 se centra tanto en formulaciones de
liofilización como líquidas. Desde el punto de vista de la economía
de fabricación y de comercialización, se prefiere la formulación
líquida a la formulación liofilizada. En este caso se resumen
resultados preliminares de ambos frentes de desarrollo de
formulación.
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Se usó un liofilizador de \mup
Dura-stop (FTSsystems) con un dispositivo de
recuperación de muestras en proceso. Se equipó el liofilizador
tanto con un manómetro de termopar como con un manómetro de
capacitancia para la medición a vacío. Se programó la temperatura
del condensador para alcanzar -80ºC. Los viales se detuvieron al
final de cada serie con un dispositivo de parada mecánica
incorporado.
Se analizó la humedad residual en el producto
liofilizado mediante un voltámetro de tipo
Karl-Fischer (Mettler DL37, voltámetro KF).
Se realizó el análisis por HPLC de las muestra
en un sistema de HPLC Beckman Gold.
Se usaron viales de liofilización de
borosilicato de 3 ml con 13 mm de apertura y sus correspondientes
tapones de caucho de butilo (ambos de Wheaton) tanto para la
liofilización como para el desarrollo de la formulación líquida.
Los viales taponados se cubrieron con tapas de fácil apertura de
aluminio usando un dispositivo de colocación de tapones (LW 312
Westcapper, The West company).
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Existen tres variables del procedimiento
principales que pueden programarse para lograr la liofilización
óptima. Éstas son la temperatura de la bandeja, la presión de la
cámara y el tiempo de duración de la etapa de liofilización. Para
evitar el colapso por aglutinación, es necesario que se establezca
la temperatura de la bandeja a temperaturas 2-3ºC
por debajo de la temperatura eutéctica o de transición vítrea de la
formulación congelada. Tanto las temperaturas de transición vítrea
como las temperaturas eutécticas de una formulación pueden
determinarse mediante el análisis calorimetría diferencial de
barrido (DSC). Generalmente, la presión de la cámara se establece
por debajo de la presión de vapor del hielo de la formulación
congelada. La presión de vapor del hielo es dependiente de la
temperatura de la bandeja y de la presión de la cámara. Una presión
demasiado alta de la cámara reducirá la velocidad de secado
mediante la reducción de la presión diferencial entre el hielo y los
alrededores, mientras que una presión demasiado baja también
retardará la velocidad de secado mediante la reducción de la tasa
de transferencia de calor de las bandejas a los viales. El
desarrollo del un ciclo de liofilización está estrechamente
relacionado con la formulación y los viales elegidos para la
liofilización. La selección de los excipientes de la formulación se
basa en los excipientes clásicos encontrados en la mayoría de
productos farmacéuticos liofilizados. Los excipientes en una
formulación de liofilización deben proporcionar las funciones de
carga, crioprotección, y lioprotección. Los excipientes elegidos
fueron manitol (M, agente de carga), sacarosa (S, crioprotector y
lioprotector), y albúmina sérica humana (HSA, lioprotector). Estos
excipientes se formularon en Tris 10 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50
a distintos porcentajes y se llenaron en viales de 3 ml a un
volumen de llenado de 1 mL. Para comenzar, se programó un ciclo
preliminar para cribar una variedad de formulaciones basándose en
los criterios de humedad residual y en el aspecto físico tras el
secado. El ciclo usado se representa gráficamente en la figura 29.
Se llevó a cabo una amplia selección mediante la variación de los
porcentajes de los excipientes individuales. La tabla 18 muestra
brevemente algunos de los resultados.
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Los resultados sugieren que se requiere una
cantidad mínima del 3% de manitol en la formulación con el fin de
lograr una aglutinación farmacéuticamente elegante. También se
examinaron los porcentajes de sacarosa en la formulación. No se
observó efecto significativo en la liofilización a concentraciones
de sacarosa \leq al 10%. La concentración de HSA se mantuvo
constante al 0,5% durante la fase de selección inicial.
Tras la evaluación de las formulaciones, se
optimizó el ciclo de liofilización mediante el cambio de la
temperatura de la bandeja, el vacío de la cámara y la duración de
cada etapa del ciclo. Basándose en la amplia optimización del
ciclo, se usó el siguiente ciclo (ciclo n.º 14) para el desarrollo
adicional de la liofilización de virus.
Cargar la muestra a temperatura ambiente en la
bandeja
Establecer la temperatura de la bandeja a -45ºC
y congelar la muestra. Tiempo de la etapa 2 h.
Establecer la temperatura de la bandeja a -45ºC,
girar la bomba de vacío y establecer el vacío a 400 mT. Tiempo de la
etapa 5 h.
Establecer la temperatura de la bandeja a -35ºC,
establecer el vacío a 200 mT. Tiempo de la etapa 13 h.
Establecer la temperatura de la bandeja a -22ºC,
establecer el vacío a 100 mT. Tiempo de la etapa 15 h.
Establecer la temperatura de la bandeja a -10ºC,
establecer el vacío a 100 mT. Tiempo de la etapa 5 h
Establecer la temperatura de la bandeja a 10ºC,
establecer el vacío a 100 mT, tiempo de la etapa 4 h
Taponar los viales a vacío.
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Se optimizaron adicionalmente el ciclo y la
formulación según la recuperación de virus tras la liofilización
analizada tanto por HPLC como por ensayos de unidades formadoras de
placas (UFP). La tabla 19 muestra las recuperaciones de virus
inmediatas tras el secado de diferentes formulaciones usando el
ciclo de secado anterior. La variación del porcentaje de sacarosa
en la formulación tuvo efecto significativo en las recuperaciones
de virus.
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\newpage
La humedad residual en el producto liofilizado
aumentó a medida que aumentaba el porcentaje de sacarosa. Se
requiere una concentración mínima de sacarosa del 5% en la
formulación para mantener una buena recuperación de virus tras la
liofilización. Se observaron efectos similares de la sacarosa en la
formulación que tenía el 5% en vez del 6% de manitol. Sin embargo,
la buena recuperación de virus inmediatamente después del secado no
apoya necesariamente una estabilidad en almacenamiento a largo
plazo. Como resultado, se incorporaron formulaciones que tenían 4
concentraciones de sacarosa diferentes del 6, 7, 8 y 9%, para su
evaluación adicional.
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Se examinó la contribución de las
concentraciones de HSA en la formulación sobre la recuperación de
virus tras el secado, usando el mismo ciclo de liofilización. La
tabla 20 muestra los resultados.
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Los resultados indican que la inclusión de HSA
en la formulación tuvo un efecto positivo en la recuperación de
virus tras el secado. Concentraciones superiores al 0,5% no
mejoraron adicionalmente la recuperación de virus tras el secado.
Como resultado, se formuló HSA al 0,5% en todas las formulaciones de
liofilización.
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Tal como se indica en la tabla 19, humedades
residuales relativamente altas estuvieron presentes en el producto
seco. Aunque, no ha habido una humedad residual óptima conocida para
los virus liofilizados, podría ser beneficioso para la estabilidad
en almacenamiento a largo plazo, reducir adicionalmente la humedad
residual en el producto seco. Tras revisar el ciclo de secado, se
decidió aumentar la temperatura de secado secundario desde 10ºC
hasta 30ºC sin aumentar el tiempo total del ciclo. Tal como se
indica en la tabla 21, se había logrado una reducción significativa
en la humedad residual en todas las formulaciones, sin efectos
negativos en las recuperaciones de virus. Con el ciclo de secado
mejorado, la humedad residual fue inferior al 2% en todas las
formulaciones inmediatamente tras el secado. Se espera que la
humedad residual reducida mejorará la estabilidad en almacenamiento
a largo plazo del producto seco.
Se realizó la liofilización de manera similar a
la anterior, excepto que se usó N_{2} seco para la extracción de
gas para el control de la presión durante el secado y relleno al
final del ciclo. Al final de la serie de secado, la cámara se llenó
con N_{2} seco hasta aproximadamente un 80% de presión
atmosférica. Posteriormente, se taponaron los viales. No se observó
diferencia entre las series de inertización con N_{2} y con aire
inmediatas tras el secado. Sin embargo, si el oxígeno presente en el
vial durante la relleno con aire provoca efectos dañinos
(oxidación) en el virus o en los excipientes usados durante el
almacenamiento a largo plazo, el relleno con N_{2} seco es
probable que mejore los efectos dañinos y mejore la estabilidad en
almacenamiento a largo plazo del virus.
Durante la preparación de formulaciones que
contienen virus, se añade la disolución madre de virus a las
formulaciones previamente formuladas a un factor de dilución de 10.
Debido a la presencia de glicerol al 10% en la disolución madre de
virus, se introdujo glicerol al 1% en las formulaciones. Para
examinar cualquier posible efecto de la presencia de glicerol al 1%
en la liofilización, se realizó una serie de liofilización usando
virus diafiltrados en la formulación de 5%(M)/7%(S)/0,5%(HSA). Se
realizó dialfiltración con 5 volúmenes de intercambio de tampón
usando un modo de intercambio de tapón de volumen constante para
garantizar la eliminación adecuada del glicerol residual (99% de
eliminación). Tras la diafiltración, se llenó la disolución de virus
en viales y luego se liofilizaron de manera similar. La tabla 22
muestra los resultados de la liofilización.
No se observó diferencia significativa tras la
liofilización, entre las formulaciones con y sin glicerol al 1%. Se
evaluarán las posibles implicaciones de este cambio en el
almacenamiento a largo plazo.
Durante la evaluación de la estabilidad en
almacenamiento a largo plazo, se colocó el virus Adp53 liofilizado
en diferentes formulaciones y diferentes ciclos, a -20ºC, 4ºC y
temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Los parámetros medidos
durante el estudio de estabilidad fueron UFP, HPLC, partículas
virales, humedad residual y vacío dentro del vial (integridad). La
figura 30A y la figura 30B muestran los datos tras almacenar durante
12 meses con el secado secundario a 10ºC sin inertización con
N_{2}. El virus liofilizado es estable tanto a -20ºC como a 4ºC
de almacenamiento durante hasta 12 meses. Sin embargo, el virus no
fue estable en almacenamiento a temperatura ambiente. Se observó
más del 50% de pérdida e infectividad a TA tras un almacenamiento de
1 mes. El ratio para esta rápida pérdida de infectividad a TA no
está claro. Sin embargo, es probable que la TA esté por encima de
la temperatura de transición vítrea de la formulación seca y dé como
resultado en la degradación acelerada del virus. Un análisis de
calorimetría diferencial de barrido (DSC) de la formulación podría
proporcionar información muy útil. No se detectó cambio de la
presión dentro de los viales durante el almacenamiento, lo que
indica que los viales mantuvieron su integridad. El ligero aumento
en la humedad residual durante el almacenamiento puede atribuirse a
la liberación de la humedad desde la tapa de caucho al interior del
producto seco.
La figura 31 y figura 32 muestran los datos de
la estabilidad en almacenamiento con secado secundario a 30ºC sin y
con relleno con N_{2}, respectivamente. Debido a la estabilidad
casi idéntica observada a las condiciones de almacenamiento de
-20ºC y 4ºC, y para reducir el consumo de virus, no se incluyó -20ºC
en el estudio de estabilidad en almacenamiento a largo plazo. De
manera similar a las muestras secas con secado secundario a 10ºC,
el virus es estable a 4ºC pero no es estable a TA. Sin embargo, se
observó relativamente mejor estabilidad en el almacenamiento a TA
que los secados en secado secundario a 10ºC. Es probable que eso sea
el resultado de la menor humedad residual lograda en el secado
secundario a 30ºC. Este resultado sugiere que la humedad residual
es un parámetro importante que afecta la estabilidad en
almacenamiento durante el almacenamiento a largo plazo. Es
necesario el almacenamiento durante un plazo mayor para revelar
cualquier efecto beneficioso de realizar la inertización con
N_{2} durante la liofilización, dado que no se observó ningún
efecto significativo durante hasta 3 meses de almacenamiento.
Durante el almacenamiento, el análisis por HPLC indica que el virus
es estable tanto a -20ºC como a 4ºC de almacenamiento y que no es
estable a TA, lo que está de acuerdo con los resultados del ensayo
de UFP.
La presencia de HSA en las formulaciones puede
ser una potencial preocupación reguladora. Como resultados, se ha
evaluado una variedad de excipientes para sustituir a la HSA en la
formulación.
Los sustitutos examinados incluyeron PEG,
aminoácidos (glicina, arginina), polímeros (polivinilpirrolidona) y
tensoactivos (Tween-20 y
Tween-80).
Junto al desarrollo de la liofilización del
producto Adp53, se llevó a cabo experimentación para examinar la
posibilidad de desarrollar una formulación para el producto Adp53.
El objetivo fue desarrollar una formulación que pueda proporcionar
suficiente estabilidad al virus cuando se almacene a temperaturas
por encima de la de congelación. Se han evaluado cuatro conjuntos
de formulaciones líquidas. En el primer conjunto de formulación, la
formulación actual de glicerol al 10% se comparó con formulaciones
que contenían HSA y PEG. En el segundo grupo de formulación, se
examinaron diversos aminoácidos para la formulación de Adp53. En el
tercer conjunto de formulación, se uso la formulación óptima
desarrollada para la liofilización para formular Adp53 en una forma
líquida. En la cuarta formulación, se evaluaron detergentes para la
formulación de Adp53. Los virus formulados con todas esas
diferentes formulaciones se sometieron a prueba para determinar la
estabilidad en almacenamiento a largo plazo a -20ºC,
4ºC y TA.
4ºC y TA.
Se comparó la formulación que contenía HSA
(sacarosa al 5% + HSA al 5% en tampón Tris 10 mM, NaCl 150 mM, y
MgCl_{2} 1 mM, tampón de pH = 8,20), con glicerol al 10% en tampón
de DPBS y formulaciones de sacarosa/PEG y trealosa/PEG. Se ha
recomendado PEG como un buen agente de exclusión preferencial en las
formulaciones (Wong y Parasrampurita, Pharmaceutical excipients
for the stabilization of proteins. BioPharm, 10(11)
52-61, 1997). Se incluye en este conjunto de
formulación examinar si puede proporcionar el efecto de
estabilización en Adp53. Las formulaciones se llenaron en viales de
liofilización de 3 ml a un volumen de llenado de 0,5 ml. Se taparon
los viales o bien en condiciones atmosféricas o bien en inertización
con N_{2}, para examinar cualquier efecto positivo que pueda
tener la inertización con N_{2} en la estabilidad en
almacenamiento a largo plazo de Adp53. Para garantizar la
desgasificación adecuada de la formulación y la posterior
inertización con N_{2}, se taponaron parcialmente los viales
llenos con tapones de liofilización y se cargaron en la bandeja del
liofilizador a TA. La cámara del liofilizador se cerró y se
estableció el vacío mediante el encendido de la bomba de vacío. Se
evacuó la cámara a 25 en.Hg. Entonces, se purgó la cámara
completamente con N_{2} seco. La evacuación y la gasificación se
repitieron dos veces para garantizar la inertización con N_{2}
completa. Los viales inertizados con N_{2} se colocaron con los
viales no inertizados con N_{2} a diversas condiciones de
almacenamiento para la evaluación de la estabilidad en
almacenamiento. La figura 33 muestra el análisis de datos durante
hasta 9 meses de almacenamiento a 4ºC y TA.
Se observaron descensos estadísticamente
significativos en las UFP de virus y partículas virales por HPLC
para la formulación de glicerol al 10% tras 3 meses de
almacenamiento tanto a 4º como a TA. No se observó degradación de
virus estadísticamente significativa para el resto de las
formulaciones en almacenamiento a 4ºC. Sin embargo, se observó
disminución de la infectividad del virus cuando se almacenó a TA. Se
necesita un mayor tiempo de almacenamiento para evaluar la eficacia
de las diferentes formulaciones.
Se evaluaron diversas combinaciones de
aminoácidos, azucares, PEG y urea para la estabilización de Adp53
durante el almacenamiento prolongado. La figura 34 muestra los
datos de estabilidad de 6 meses. Los resultados indican que la
combinación de manitol al 5% y sacarosa al 5% con otros excipientes
dieron mejor estabilidad en almacenamiento a TA. En este grupo de
formulación, no se incluyeron excipientes derivados de humanos o
animales.
Se evaluó el desarrollo de formulaciones óptimas
para liofilización, para la formulación de Adp53 en forma líquida.
Este enfoque sería una buena conexión entre la formulación líquida y
la liofilización si puede lograrse una estabilidad de Adp53
satisfactoria usando la formulación de liofilización para el llenado
líquido. Se almacenaron las muestras llenas a -20ºC y 4ºC para el
estudio de estabilidad. La figura 35 muestra los datos de
estabilidad de 3 meses. El virus es estable tanto a -20ºC como a 4ºC
para las cuatro diferentes formulaciones. Esto está de acuerdo con
los resultados del conjunto de formulación n.º 2 que sugiere que se
espera mejor estabilidad del virus con la presencia tanto de
manitol como de sacarosa en la formulación. Se obtuvieron datos de
estabilidad en almacenamiento a mayores tiempos.
Se han usado detergentes en las formulaciones
para una variedad de proteínas recombinantes. En este conjunto de
formulaciones, se examinaron diversas concentraciones de detergentes
para la formulación de Adp53. Los detergentes usados fueron
no-iónicos (Tween-80) y
zwitteriónicos (Chaps). La figura 36 muestra los datos de
estabilidad de 6 meses. El virus es estable en almacenamiento a 4ºC.
Se observó mejor estabilidad del virus en formulaciones que
contenían Tween-80. La adicional acumulación de
datos de estabilidad ayudará a optimizar la concentración de
detergente. De manera similar al conjunto de formulación n.º 2, en
este conjunto de formulaciones no se incluye una proteína
exógena.
Tanto la liofilización como la formulación
líquida han producido datos e información muy interesantes y
prometedores. Se ha desarrollado un ciclo de liofilización y las
formulaciones correspondientes para producir Adp53 liofilizado que
es estable a 4ºC durante al menos 12 meses. Se está recogiendo
estabilidad en almacenamiento a tiempos más prolongados. Debido al
enfoque conservativo tomado en el desarrollo inicial del ciclo de
liofilización, además se está investigando la reducción
significativa del tiempo del ciclo de liofilización y la mejora de
la eficacia del proceso de liofilización. Sorprendentemente, se
generaron datos de estabilidad muy prometedores para la formulación
líquida en el almacenamiento a 4ºC. Sin embargo, se necesitan datos
de almacenamiento a tiempos más prolongados para evaluar la
factibilidad del desarrollo de una formulación liquida para
Adp53.
Todas las composiciones y/o los métodos dados a
conocer y reivindicados en el presente documento pueden prepararse
y ejecutarse sin excesiva experimentación a la luz de la presente
descripción. Aunque se han descrito las composiciones y los métodos
de esta invención en lo que se refiere a realizaciones preferidas,
será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse
variaciones a las composiciones y/o los métodos y en las etapas o
en la secuencia de etapas del método descrito en el presente
documento sin apartarse del concepto de la invención. Más
específicamente, será evidente que ciertos agentes que están
relacionados tanto química como biológicamente, pueden sustituirse
por los agentes descritos en el presente documento mientras que se
lograrían los mismos o similares resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
La siguiente bibliografía, en la medida que
proporcionan un procedimiento a modo de ejemplo u otros detalles
complementarios a los expuestos en el presente documento, se cita
específicamente en el presente documento como referencia.
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Claims (18)
1. Procedimiento para preparar adenovirus
recombinante, comprendiendo el procedimiento:
- (a)
- preparar un cultivo de células productoras en un medio seleccionado;
- (b)
- infectar las células productoras en el cultivo con adenovirus recombinante, en el que las células productoras se infectan entre la fase semilogarítmica de crecimiento y fase estacionaria de crecimiento; y
- (c)
- recoger adenovirus recombinantes del cultivo celular.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se infectan las células productoras con el adenovirus entre
la fase logarítmica tardía de crecimiento y la fase estacionaria de
crecimiento.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se siembran las células productoras usando un conjunto
esencialmente homogéneo de células.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el cultivo de las células productoras incluye perfusión.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que las células productoras se perfunden a una tasa que mantendrá
un nivel de glucosa de entre 0,5 y 3,0 g de glucosa/litro, en
particular entre 0,7 y 2,0 g de glucosa/litro, y más en particular
entre 1 a 1,5 g de glucosa/litro.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las células productoras se siembran en el medio de cultivo y
se permite que se adhieran a una superficie de cultivo durante entre
3 horas y 24 horas antes de iniciar la recirculación de los
medios.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de infección adenoviral incluye la recirculación
del medio de cultivo.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se siembra el cultivo con entre 0,5 x 10^{4} y 3 x
10^{4} células/cm^{2}, en particular entre 7,5 x 10^{3} y 2,0
x 10^{4} células/cm^{2}, y más en particular entre 9 x 10^{3}
y 1,5 x 10^{4} células/cm^{2}.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se somete el adenovirus recogido a purificación y se coloca
en una composición farmacéuticamente aceptable.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el adenovirus se purifica mediante etapas que incluyen
cromatografía.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que la etapa de cromatografía implica someter el adenovirus a
más de una separación cromatográfica, o en el que la etapa de
cromatografía implica someter el adenovirus a sólo una separación
cromatográfica, en particular en el que la separación cromatográfica
incluye cromatografía de intercambio iónico.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicho adenovirus recombinante es un adenovirus de replicación
deficiente que codifica para un gen terapéutico ligado
operativamente a un promotor
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que dicho adenovirus de replicación deficiente carece de al
menos una parte de la región E1, en particular en el que dichas
células productoras complementan la parte de la región E1 que
falta.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichas células productoras se seleccionan del grupo que
consiste en células 293, PER.C6, 911 e IT293SF, en particular en el
que dichas células productoras son células
293.
293.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que dicho gen terapéutico se selecciona del grupo que consiste
en ras antisentido, myc antisentido, raf
antisentido, erb antisentido, src antisentido,
fms antisentido, jun antisentido, trk
antisentido, ret antisentido, gsp antisentido,
hst antisentido, bcl antisentido, abl
antisentido, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73,
C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV
ras, DCC, NF-1, NF-2,
WT-1, MEN-I, MEN-II,
BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12,
GM-CSF, G-CSF,
mda-7, timidina quinasa o p53, en particular en el
que dicho gen terapéutico es un gen p53.
16. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que dicho promotor es un promotor SV40-IE,
VRS-LTR, de \beta-actina,
CMV-IE, tardío principal de adenovirus, de polioma
F9-1 o de tirosinasa.
17. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el adenovirus se recoge mediante etapas que incluyen lisar
las células productoras por medios distintos de
congelación-descongelación, en particular en el que
las células productoras se lisan por medio de una lisis con
detergente, o en el que las células productoras se lisan por medio
de lisis de adenovirus.
18. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende además purificar el adenovirus recogido para obtener una
composición de adenovirus recombinante purificado que tiene uno o
más de las siguientes propiedades:
- (a)
- un título de virus de entre 1 x 10^{9} y 1 x 10^{13} ufp/ml;
- (b)
- una concentración de partículas de virus de entre 1 x 10^{10} y 2 x 10^{13} partículas/ml;
- (c)
- un ratio partícula:ufp de entre 10 y 60;
- (d)
- tener menos de 50 ng de BSA por 1 x 10^{12} partículas virales;
- (e)
- entre 50 pg y 1 ng de ADN humano contaminante por 1 x 10^{12} partículas virales,
- (f)
- un solo pico de elución de HPLC.
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