CN101220373B

CN101220373B - 一种重组病毒载体及其应用

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Publication number: CN101220373B
Application number: CN2008100021799A
Authority: CN
Inventors: 李进; 唐云霞; 秦华; 蒋英丽; 周向军
Original assignee: SHENZHEN YUANXING BIO-PHARM Co Ltd
Current assignee: Henry is the source of biological science and Technology Co Ltd (Shanghai); Henry is the source of biological science and Technology Co Ltd (Shenzhen)
Priority date: 2007-01-10
Filing date: 2008-01-09
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2028-01-09
Also published as: CN101220373A

Abstract

本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种重组病毒载体，该载体包括病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码致病病毒的抗原，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组病毒载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。同时注射本发明所述重组腺病毒载体具有高度安全性。

Description

一种重组病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种用编码致病病毒抗原的核苷酸序列和病毒载体序列构建的重组体。

背景技术

乙型肝炎是由人乙型肝炎病毒(Human Hepatitis Bvirus，HBV)引起的，HBV为DNA双链病毒，主要经血液、密切接触和母婴垂直传播。不同地区，HBV的感染几率及传播方式也不尽相同。感染HBV后，部分患者将发展成为慢性持续性感染状态，有的可能演变为肝硬化或原发性肝细胞癌。目前，据估计，全世界乙肝带毒者约3.5亿人，亚洲地区约2.2亿。我国约有1.3亿人是乙肝病毒携带者，每年用于治疗肝炎的医疗费用约300-500亿元，并且多数感染发生在新生儿或儿童期，由于这一阶段发生的感染早期多无症状，急性期极难被发现，因此90％以上将发展为慢性乙肝患者。目前，对于慢性乙肝患者和乙肝抗原表面携带者来说目前尚无有效的治疗方法。有限的化学疗法虽然能在一定程度上抑制HBV复制，但却不能彻底清除体内的感染病毒。研究发现，乙肝患者的急性和慢性肝病的不同结局很大程度上是由于机体对HBV感染的免疫反应不同所致。在急性乙肝患者体内，针对HBV的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)反应是很活跃的、是多位点和高度特异性的，可迅速清除感染病毒；而慢性乙肝患者和乙肝病毒健康携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，致使病毒持续存在，因此目前学术界认为纠正和克服患者体内的CTL低反应状态可能是机体清除HBV，使患者得到彻底恢复的关键。

CTL是通过什么机理来达到清除HBV的目的的呢？由于HBV cccDNA结构特殊，又具有长期的稳定性，最初一直认为CTL只有通过破坏和杀伤感染的肝细胞才能达到清除病毒的作用。但近年来的研究发现事实并非如此。在HBV转基因鼠模型中，病毒特异性的CTL主要是通过非细胞致病性过程来清除病毒的，只有极小一部分残存病毒的清除是通过CTL介导的细胞凋亡和细胞毒性反应来实现的，整个病毒清除过程中受损肝细胞不足1％。Guidotti在HBV急性感染黑猩猩动物模型中也发现，在急性期，HBV DNA绝大部分被清除，而这个期间并没有肝损害、细胞凋亡及ALT升高。由此可见在HBV急性感染过程中，HBV主要是通过这种非细胞致病性机理清除的。其具体过程为：HBV特异性的CTL识别感染肝细胞表面的病毒靶抗原，随即释放细胞因子，主要是IFN-γ和TNF-α，通过旁分泌机制直接作用于HBV感染肝细胞，激活肝细胞内的抗病毒分子机制。同时，这些细胞因子激活Kupffer细胞，并通过正反馈机制进一步产生更多的TNF-α。这种细胞因子的环境导致细胞内病毒颗粒和病毒RNA的降解。

目前市面上应用的乙肝疫苗是酵母重组乙肝疫苗，主要用于乙肝的预防，不能起到治疗乙肝的作用。周陶友等将HBcAg和HBsAg同时插入到pcDNA3.1载体中，构建成pcDNA3.1-SC。动物实验表明：新构建成的载体能诱导针对HBsAg/HBcAg的特异性CTL和体液免疫应答。Jens Wild等构建了载体：将HBcAg和HBsAg分别导入载体pCMV构建得到pCMV/C和pCMV/S，两者同时导入载体构建得到pCMV/CS，动物实验表明：pCMV/C和pCMV/CS对小鼠引起的CTL反应强度相似。国外进入临床I期和国内外处于实验室阶段的治疗性乙肝疫苗都属于DNA疫苗，DNA疫苗目前存在的问题是外源核酸是否会整合到染色体中引起癌变，能否引起免疫病理作用等问题尚未有确切结论，且疫苗诱发的免疫反应强度较弱。所以应用具宿主范围广、高效转导、稳定、安全、易操作等优点的腺病毒做为载体，则能避免上述缺点。

腺病毒在自然界分布广泛，在许多哺乳动物和畜类中都发现其存在。至今已分离到100种以上不同血清型的各种腺病毒。腺病毒是二十面体病毒壳体结构，其基因组为线性的双链DNA。由于腺病毒做为载体具有高的感染效率和高的外源基因表达水平、同时高滴度重组病毒的制备较简单、容量适合装载大多数外源基因、不整合入靶细胞基因组等等的优点，故腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种重组病毒载体。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种重组病毒载体，该载体包括病毒载体和至少两条核苷酸序列，所述核苷酸序列分别编码致病病毒的抗原，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组病毒载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应。

所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。

所述腺病毒载体是缺失性腺病毒载体。

所述腺病毒载体是人腺病毒载体。

所述腺病毒载体是动物腺病毒载体。

所述人腺病毒载体是人5型腺病毒载体、35型腺病毒载体、2型腺病毒载体或6型腺病毒载体。

所述两个核苷酸序列插入至腺病毒载体的E1、E2、E3或E4区域。

所述致病病毒是甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或者戊型肝炎病毒。

所述致病病毒的抗原是乙型肝炎病毒的表面抗原、核心抗原、pol抗原或含B、T细胞表位的抗原。

所述两个核苷酸序列分别编码两个乙型肝炎病毒抗原。

所述一个核苷酸序列为编码乙型肝炎病毒表面抗原的核苷酸序列，如SEQ IDNO：1所示，另一个核苷酸序列为编码乙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列，如SEQID NO：2所示。

所述致病病毒为人乳头瘤病毒或者禽流感病毒。

所述重组病毒载体还含有至少一个免疫刺激物的基因序列。

所述免疫刺激物是白细胞介素、干扰素、粒细胞集落刺激因子或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

所述两个核苷酸序列通过内部核糖体进入位点序列连接，从启动子双顺反子表达。

所述内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：3所示。

所述内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：4所示。

上述重组病毒载体在制备用于预防和治疗由致病病毒引起的疾病的药物中的应用。

一种用上述重组病毒载体制备的疫苗。

本发明的重组腺病毒是通过如下方法获得的，是将多个目的基因通过IRES(Internal Ribosome Entry Site，内部核糖体进入位点)机制连接，然后以酶切方式插入到经改良过的腺病毒载体中形成重组体，然后在大肠杆菌中进行扩增，经分离、提取、纯化后，与辅助载体(PJM17)共同转染293细胞(人胚肾细胞)，在293细胞内包装成的类病毒颗粒。

根据上述方案，首先通过PCR扩增得到所需目的基因，将两个目的基因HBc和HBs与有两个多克隆位点的序列IRES连接，得到带有HBc、IRES和HBs基因的新的片段(顺序可不同，同时IRES序列也有差异)。将该新得到的目的基因片段克隆入穿梭质粒载体pDC515(io)，通过FLP-frt重组酶系统在293细胞中获得重组腺病毒。

乙肝核心抗原和乙肝表面抗原具有引起CTL反应和体液免疫应答的作用。用乙肝核心抗原和表面抗原做为目的基因的重组体作用于动物能引起动物体内CTL反应及体液免疫应答。本申请所述重组腺病毒载体作用于动物后引起的CTL反应强度远远大于乙肝核心抗原和表面抗原的其它重组体，也强于单独乙肝核心抗原的重组体，由于腺病毒做为载体具有高的感染效率和高的外源基因表达水平、不整合入靶细胞基因组等等的优点，因此注射本发明所述重组腺病毒载体具有高度安全性。另外，用乙肝核心抗原、表面抗原和其它抗原做为目的基因的重组腺病毒载体也能引起很强的CTL反应。因此，注射本发明的重组病毒载体后，能使动物体内引起体液免疫反应和细胞免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。

附图说明

图1是pIRES质粒图谱。

图2是pDC515(io)质粒图谱。

图3(A)(B)是CHB4重组腺病毒载体构建流程图。

图4是PCR方法检测重组腺病毒CHB4的电泳图片。

图5是pDC515/CIS2载体构建流程图。

图6是PCR方法检测重组腺病毒CHB5的电泳图片。

图7是pDC515/S’IC’载体构建流程图。

图8是PCR方法检测重组腺病毒CHB6的电泳图片。

图9是pDC515/S’IC’2载体构建流程图。

图10是PCR方法检测重组腺病毒CHB7的电泳图片。

图11是各组小鼠注射重组腺病毒后4、6周CTL反应强度表(n＝3)。

图12是各组转基因鼠注射重组腺病毒后4、6周CTL反应强度表(n＝3)。

具体实施方式

实施例1、CHB4重组腺病毒疫苗的构建

1、内部核糖体进入位点(IRES，Internal Ribosome Entry Site)片段的获得：以pIRES载体(购自BD公司，其质粒图谱如图1所示)为模板，设计引物：IRES(F)5’ACG ACT CAC TAT AGG CTA 3’，IRES(R)5’TCG ACT CTA GAG GAT CC，(华大基因上海鼎安合成)，进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性5分钟，以后各循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分，共30个循环，之后72℃延伸5分钟。得到IRES片段，其具体序列参见SEQ ID NO：3。将扩增得到的PCR片段插入到T载体(Promega公司)中，得到T/I载体，请参阅图3A。

2、编码乙型肝炎病毒表面抗原的核苷酸序列HBs的获得：抽取乙肝病人血清，从病人血清中提取乙肝病毒DNA，以提取的DNA为模板，设计引物：HBS-BamHI F：5′GGATCCATGGAGAGCACAACATCA 3′，HBS-SalI R：5′GTCGACTCAAATGTATACCCAAAG 3’，(华大基因上海鼎安合成)，进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性5分钟，以后各循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分，共30个循环，之后72℃延伸5分钟。得到HBs片段，其具体序列如SEQ ID NO：1所示。将扩增得到的PCR片段插入到T载体中，得到T/S载体，请参阅图3A。

3、编码乙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列HBc的获得：抽取乙肝病人血清，从病人血清中提取乙肝病毒DNA，以提取的DNA为模版，设计引物：HBc-NHeI F：5′GCT AGC ATG GAC ATT GAC CCG 3′，HBc-XhoI R：5′CTC GAG CTA ACA TTG AGATTC 3’，(华大基因上海鼎安合成)，进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性5分钟，以后各循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分，共30个循环，之后72℃延伸5分钟。得到HBc片段，其具体序列如SEQ ID NO：2所示。将其PCR片段插入到T载体中，得到T/C载体，请参阅图3A。

4、T/CIS重组质粒的获得：用限制性内切酶NheI和XhoI将HBc从质粒T/C上切下插入质粒T/I，得到质粒T/CI；用限制性内切酶BamHI和SalI将HBs从质粒T/S上切下插入质粒T/CI，得到重组质粒T/CIS。

5、腺病毒穿梭载体PDC515/CIS的获得：请参阅图3A，用限制性内切酶NheI和SalI将HBc-IRES-HBs(简称CIS)从质粒T/CIS上切下插入穿梭质粒pDC515(Microbix Biosystems公司)，其质粒图谱如图2所示，得到携带乙肝核心抗原基因HBc和表面抗原基因HBs的穿梭质粒pDC515/CIS，命名为腺病毒穿梭载体PDC515/CIS。

6、同源重组：请参阅图3B，腺病毒穿梭载体PDC515/CIS与5型人腺病毒载体骨架PBHGΔE1.3flp(Microbix Biosystems公司)利用Lipofectamine2000(购自invitrogen公司)共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病毒。共转染9-13天出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，得到表达乙肝核心抗原和乙肝表面抗原的重组腺病毒，命名为HB-CIS1重组腺病毒载体(简称为CHB4)。提取重组腺病毒DNA，PCR方法检测插入的CIS序列，检测引物为：5’GCTAGCATGGACATTGACCG-3’和5’-GTCGACTCAAATGTATACCCAAAG-3’华大基因上海鼎安)对重组腺病毒进行鉴定，鉴定结果见图4，其中第一泳道为DL2,000 NA标准分子量(购自Takara公司)，第二泳道为PCR检测重组腺病毒载体的结果，其中有一条1850bp的条带，与预期的大小一致，表明为正确的插入CIS基因的重组腺病毒载体，第三泳道为阴性对照；同时进行测序(华大基因上海鼎安)，测序结果正确的腺病毒命名为重组腺病毒HB-CIS(简称为CHB4)。

实施例2、CHB5重组腺病毒载体的构建

1、IRES2片段的获得：人工合成IRES2序列，如SEQ ID NO：4所示，以其为模板，设计引物：IRES-MluI(F)：5’ACGCGTTATCCCTTGCGG 3’IRES-SmaI(R)：5’CCCGGGTGTGGCAGGAGT 3’(华大基因上海鼎安合成)，进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性2分钟，以后各循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，共30个循环，之后72℃延伸7分钟。得到IRES2片段。将扩增得到的PCR片段插入到T载体(Promega公司)中，得到T/IRES2载体。

2、腺病毒穿梭载体PDC515/CIS2的获得：请参阅图5，用限制性内切酶M1uI和SmaI酶切质粒T/IRES2得到IRES2片段；用限制性内切酶MluI和SmaI酶切质粒PDC515/CIS得到PDC515/CS片段，用T4DNA连接酶连接上述两个片段，得到携带乙肝核心抗原基因HBc和表面抗原基因HBs的穿梭质粒pDC515/CIS2，命名为腺病毒穿梭载体PDC515/CIS2。

3、同源重组：腺病毒穿梭载体PDC515/CIS2与5型人腺病毒载体骨架PBHGΔE1.3flp利用Lipofectamine2000共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病毒。共转染9-13天出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，得到表达乙肝核心抗原和乙肝表面抗原的重组腺病毒，命名为HB-CIS2重组腺病毒疫苗(简称为CHB5)。提取重组腺病毒DNA，PCR方法检测插入的CIS序列，检测引物为：5’GCTAGCATGGACATTGACCG-3’和5’-GTCGACTCAAATGTATACCCAAAG-3’华大基因上海鼎安)对重组腺病毒进行鉴定，鉴定结果请参阅图6，其中第一泳道为DL2,000 NA标准分子量(Takara)，第二泳道为PCR检测重组腺病毒载体的结果，其中有一条1610bp的条带，与预期的大小一致，表明为正确的插入CIS2基因的重组腺病毒载体，第三泳道为阴性对照。同时进行测序(华大基因上海鼎安)，测序结果正确的腺病毒命名为重组腺病毒HB-CIS2(简称为CHB5)。

实施例3、HB-S’IC’重组腺病毒疫苗的构建(CHB6)

1、IRES片段的获得：同实施例1步骤得到T/I载体。

2、HBs’片段的获得：抽取乙肝病人的血清，从病人血清中提取乙肝病毒DNA，以提取的DNA为模板，设计引物：HBs-NheI(IF)：5′GCTAGCCAACCATGGAGAGCACA3′(下划线为增强子)，HBs-XhoI(R)：5′CTCGAGTCAAATGTATACCCA3′(华大基因上海鼎安合成)，进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性5分钟，以后各循环：94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1分，共30个循环，之后72℃延伸7分钟。得到HBs’片段。将其PCR片段插入到T载体中，得到T/S’载体。

3、HBc’片段的获得：抽取乙肝病人的血清，从病人血清中提取乙肝病毒DNA，以提取的DNA为模板，设计引物：Bc-BamHI(HF)：5′GGATCCCCGCCATGGACATTGAC3′(下划线为增强子)，HBc-XhoI(R)：5’CTCGAGCTAACATTGAGATTC 3’(华大基因上海鼎安合成)，进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性5分钟，以后各循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分，共30个循环，之后72℃延伸7分钟。得到HBc’片段。将其PCR片段插入到T载体中，得到T/C’载体。

4、T/S’IC’重组质粒的获得：用限制性内切酶NheI和XhoI将HBs’从质粒T/S’上切下插入质粒T/I，得到质粒T/S’I；用限制性内切酶BamHI和SalI将HBc’从质粒T/C’上切下插入质粒T/S’I，得到重组质粒T/S’IC’。

5、腺病毒穿梭载体PDC515/S’IC’的获得：请参阅图7，用限制性内切酶NheI和SalI将HBs’-IRES-HBc’(简称S’IC’)从质粒T/S’IC’上切下插入穿梭质粒pDC515，得到携带乙肝核心抗原基因HBc’和表面抗原基因HBs’的穿梭质粒pDC515/S’IC’，命名为腺病毒穿梭载体PDC515/S’IC’。

6、同源重组：腺病毒穿梭载体PDC515/S’IC’与5型人腺病毒载体骨架PBHGΔE1.3flp利用Lipofectamine2000共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病毒。共转染9-13天出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，得到表达乙肝核心抗原和乙肝表面抗原的重组腺病毒，命名为HB-S’IC’重组腺病毒载体(简称为CHB6)。提取重组腺病毒DNA，检测引物为：5’GCTAGCCAACCATGGAGAGCACA-3’和5’-CTCGAGCTAACATTGAGATTC-3’华大基因上海鼎安)对重组腺病毒进行鉴定，鉴定结果见图8，其中第一泳道为DL2，000 NA标准分子量(Takara)，第二泳道为PCR检测重组腺病毒载体的结果，其中有一条1850bp的条带，与预期的大小一致，表明为正确的插入SIC基因的重组腺病毒载体。第三泳道为阴性对照。同时进行测序(华大基因上海鼎安)，测序结果正确的腺病毒命名为重组腺病毒HB-S’IC’(简称为CHB6)

实施例4、HB-S’IC’2重组腺病毒载体的构建(CHB7)

1、IRES片段的获得：同实施例2步骤得到T/IRES2载体。

2、腺病毒穿梭载体PDC515/S’IC’2的获得：请参阅图9用限制性内切酶MluI和SmaI酶切质粒T/IRES2得到IRES2片段；用限制性内切酶MluI和SmaI酶切质粒PDC515/S’IC’得到PDC515/S’C’片段，用T4DNA连接酶连接上述两个片段，得到携带乙肝表面抗原基因HBs’和核心抗原基因HBc’的穿梭质粒pDC515/S’IC’2，命名为腺病毒穿梭载体PDC515/S’IC’2。

3、同源重组：与5型人腺病毒载体骨架PBHGΔE1.3flp利用Lipofectamine2000共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病毒。共转染9-13天出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，得到表达乙肝核心抗原和乙肝表面抗原的重组腺病毒，命名为HB-S’IC’2重组腺病毒载体(简称为CHB7)。提取重组腺病毒DNA，PCR方法检测插入的S’IC’2序列，检测引物为：5’GCTAGCCAACCATGGAGAGCACA-3’和5’-CTCGAGCTAACATTG AGATTC-3’华大基因上海鼎安)，对重组腺病毒进行鉴定，鉴定结果见图10，其中第一泳道为DL2,000 NA标准分子量(Takara)，第二泳道为PCR检测重组腺病毒载体的结果，其中有一条1610bp的条带，与预期的大小一致，表明为正确的插入S’IC’2基因的重组腺病毒载体。第三泳道为阴性对照。同时进行测序(华大基因上海鼎安)，测序结果正确的腺病毒命名为重组腺病毒HB-S’IC’2(简称为CHB7)。

实施例5、重组腺病毒表达实验

1、重组腺病毒表达检测

1)乙肝表面抗原的表达检测：将接种重组腺病毒后发生病变的293细胞离心后收集上清，取十分之一体积(100ul)进行elisa实验。所用试剂盒为乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(上海实业科华生物技术有限公司)，测得构建的腺病毒CHB4、CHB5、CHB6、CHB7表达了乙肝表面抗原(表1)。

表1：乙肝表面抗原elisa实验结果

孔号	CHB4	CHB5	CHB6	CHB7	阳性对照	阳性对照	阴性对照	阴性对照	空白对照
										吸光值	0.203	0.320	1.888	1.801	3.297	3.273	0.047	0.059	0.053

2)乙肝核心抗原的表达检测：将接种重组腺病毒后发生病变的293细胞离心后收集上清，取十分之一体积(100ul)进行elisa实验。所用试剂盒为乙肝病毒核心抗原酶联免疫测定试剂盒(西安华广生物工程有限公司)，测得构建的腺病毒CHB4、CHB5、CHB6、CHB7表达了乙肝核心抗原(表2)。

表2：乙肝核心抗原elisa实验结果

孔号	CHB4	CHB5	CHB6	CHB7	阳性对照	阳性对照	阴性对照	阴性对照	空白对照
										吸光值	0.732	0.748	0.402	0.506	1.209	0.977	0.101	0.087	0.069

2、重组腺病毒纯化

采用离子交换柱HPLC纯化系统对重组腺病毒进行纯化。

3、重组腺病毒活性测定

TCID50方法测得重组腺病毒CHB4、CHB5、CHB6、CHB7的比滴度分别为8.21％，7.13％，5.11％，4.52％。

实施例6、重组腺病毒疫苗免疫小鼠实验

整合了乙肝核心抗原基因与乙肝表面抗原基因的重组腺病毒CHB4、CHB5、CHB6、CHB7在感染动物后会模拟正常腺病毒感染模式，诱导免疫系统产生针对乙肝核心抗原的特异性细胞免疫和体液免疫，当机体再次接触病原体时，通过多信号途径刺激特异性免疫记忆细胞分泌细胞因子γ-IFN，γ-IFN已经证实具有抗病毒效果。ELISPOT实验即通过检测γ-IFN的分泌从而间接检测特异性CTL反应。不同构建的重组腺病毒免疫C57/BL小鼠，同时用单独含HBc基因的重组腺病毒Ad-core(参见申请号为CN200510080238.0的专利申请文件)、单独含HBs基因的腺病毒载体AMB4(E1和E3区缺失的Ad5与乙肝表面抗原基因重组得到的重组载体)做为对照，于第4、6周取其脾脏制备单个脾细胞悬液，分别以乙肝核心抗原多肽和乙肝表面抗原多肽为体外刺激物，进行ELISPOT试验。相同条件下，看试验组分泌γ-IFN的鼠脾细胞即形成斑点的细胞(spot forming cell，SFC)是否比对照组显著增多。单位脾细胞产生的SFC数目的多少反映了CTL反应的强弱，数目越多，则CTL反应越强，反之亦然。

实验共分七组，分别注射CHB4、CHB5，CHB6，CHB7，Ad-core，AMB4和病毒保存液，每组动物注射6只C57/BL小鼠(雄性，6-8周龄，中山大学试验动物中心)。左右后腿肌肉分别注射0.5×10¹⁰VP/只，共10¹⁰VP/只。注射后4、6周时，每组取3只动物处死。

体液免疫实验：摘眼球取全血，5000rpm离心10分钟后吸出上层血清，1∶2稀释后进行ELISA实验(按上海实业科华生物技术有限公司说明书进行)，测HBV表面抗体。结果显示，4、6周实验组小鼠和注射AMB4组小鼠血清抗HBV表面抗体均为阳性，注射Ad-core和病毒保存液组均为阴性。即注射腺病毒疫苗CHB4、CHB5，CHB6，CHB7后诱导了体液免疫反应，说明本发明的腺病毒疫苗具有预防乙肝的作用。

ELISPOT实验：动物处死后无菌取脾脏研磨制成单个细胞悬液，进行稀释，将之加于预先包被并封闭好的ELISPOT板上96孔内，每孔5×10⁵个脾细胞。加入乙肝核心抗原多肽和乙肝表面抗原多肽(华大基因上海天源合成)作为刺激物。进行ELISPOT实验(见U-Cytech试剂盒说明书)，结果请参阅图11。

试验组同时携带乙肝核心抗原表位和表面抗原表位，在诱导CTL反应上具有优势。由图11结果可知试验组的CTL反应强度远远高于对照组。

由上可知：小鼠注射腺病毒疫苗CHB4、CHB5，CHB6，CHB7后在体外经特异性多肽刺激后能释放γ-IFN，从而证明腺病毒疫苗CHB4、CHB5，CHB6，CHB7可以诱导机体产生特异性细胞免疫反应，当激活的细胞再次遇到相同病原体时，就会释放γ-IFN等细胞因子发挥抗病毒作用。4、6周的实验结果比较发现，CHB4、CHB5，CHB6，CHB7在体内表达并诱导机体产生特异性免疫反应需要时间，6周CTL反应强度显著高于4周。

所以说本发明的腺病毒疫苗CHB4、CHB5，CHB6，CHB7可以诱导小鼠产生HBV核心抗原特异性CTL反应和HBV表面抗原特异性CTL反应，从而提示CHB4、CHB5，CHB6，CHB7对乙肝具有更好的治疗作用。

实施例7、重组腺病毒免疫转基因鼠实验

原理同实施例6。

实验共分五组，分别注射CHB4、CHB5，CHB6，CHB7，保存液，每组注射六只转基因鼠(应用精原千细胞转染法建立HBV转基因鼠，其中含有HBV(adr型)全基因，4-6周龄，雌性，购自第四五八医院全军传染病中心)，左右后腿肌肉分别注射0.5×10¹⁰VP/只，共10¹⁰VP/只。注射后4、6周时，每组取3只动物处死。

ELISPOT实验：动物处死后无菌取脾脏研磨制成单个细胞悬液，进行稀释，将之加于预先包被并封闭好的ELISPOT板上96孔内，每孔5×10⁵个脾细胞。加入乙肝核心抗原多肽和乙肝表面抗原多肽(华大基因上海天源合成)作为刺激物。进行ELISPOT实验(见U-Cytech试剂盒说明书)，结果请参阅见图12。

试验组同时携带乙肝核心抗原表位和表面抗原表位，在诱导CTL反应上具有优势。由图12结果可知试验组的CTL反应强度远远高于对照组。

由上可知：转基因鼠注射腺病毒疫苗CHB4、CHB5，CHB6，CHB7后在体外经特异性多肽刺激后能释放γ-IFN，从而证明腺病毒疫苗CHB4、CHB5，CHB6，CHB7可以诱导机体产生特异性细胞免疫反应，当激活的细胞再次遇到相同病原体时，就会释放γ-IFN等细胞因子发挥抗病毒作用。

所以说本发明的腺病毒疫苗CHB4、CHB5，CHB6，CHB7可以诱导转基因鼠产生HBV核心抗原特异性CTL反应和HBV表面抗原特异性CTL反应，从而提示CHB4、CHB5，CHB6，CHB7对乙肝具有更好的治疗作用。

SEQUENCE LISTING

<110>深圳市源兴生物医药科技有限公司

<120>一种重组病毒载体及其应用

<130>2008-1-9

<150>200710072954.3

<151>2007-01-10

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>681

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>1

atggagagca caacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc 60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat 120

tttctagggg gagcacccac gtgtcctggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac 180

tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt 240

atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactac 300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaggaacaa caactaccag tacgggacca 360

tgcaagacct gcacgattcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcttg ttgctgtaca 420

aaaccttcgg acggaaactg cacttgtatt cccatcccat catcctgggc tttcgcaaga 480

ttcctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcctggctca gtttactagc gccatttgtt 540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat 600

tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttttac ctctattacc aattttcttt 660

tgtctttggg tatacatttg a 681

<210>2

<211>552

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒

<400>2

atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60

tctgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120

gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactcaggca agctattctg 180

tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca 240

tccagggaat tagtagtcag ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta 300

ttgtggtttc acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg 360

tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta 420

tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480

ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540

tctcaatgtt ag 552

<210>3

<211>620

<212>DNA

<213>encephalomyocarditis virus

<400>3

ctcgagaatt cacgcgtcga gcatgcatct agggcggcca attccgcccc tctccctccc 60

ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccgtgtgcgt ttgtctatat 120

gtgattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt 180

cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt 240

gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 300

gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc 360

acgtgtataa gtatcacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat 420

agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc acacaggggc tgaaggatgc 480

ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg 540

tgtttagtcg aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct 600

ttgaaaaaca cgatgataag 620

<210>4

<211>381

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tatcccttgc ggccgcagat cttatatggg gcacccccgc cccttgtaaa cttccctgac 60

cctgacatga caagagttac taacagcccc tctctccaag ctcacttaca ggctctctac 120

ttagtccagc acgaagtctg gagacctctg gcggcagcct accaagaaca actggaccga 180

ccggtggtac ctcaccctta ccgagtcggc gacacagtgt gggtccgccg acaccagact 240

aagaacctag aacctcgctg gaaaggacct tacacagtcc tgctgaccac ccccaccgcc 300

ctcaaagtcg atcgaattga tcctcttgtc tgctgcagca tcgttctccc atttctgcag 360

atgggctcaa ctcctgccac a 381

Claims

1.一种重组病毒载体，其特征在于：该载体包括腺病毒载体和两条核苷酸序列，其中一条核苷酸序列为编码乙型肝炎病毒表面抗原的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示，另一条核苷酸序列为编码乙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示，该重组病毒载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应。

2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于：重组病毒载体还含有至少一个免疫刺激物的基因序列。

3.根据权利要求2所述的重组病毒载体，其特征在于：所述免疫刺激物是白细胞介素、干扰素、粒细胞集落刺激因子或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组病毒载体，其特征在于：所述两个核苷酸序列通过内部核糖体进入位点序列连接，从启动子进行所述两个核苷酸序列的表达。

5.根据权利要求4所述的重组病毒载体，其特征在于：所述内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：3所示。

6.根据权利要求4所述的重组病毒载体，其特征在于：所述内部核糖体进入位点序列如SEQ ID NO：4所示。

7.权利要求1-6任一项所述的重组病毒载体在制备用于预防和治疗由乙型肝炎病毒引起的乙型肝炎的药物中的应用。

8.用权利要求1-6中任一项所述的重组病毒载体制备的疫苗。