CN101748151B

CN101748151B - 一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体及其应用

Info

Publication number: CN101748151B
Application number: CN200810241637A
Authority: CN
Inventors: 邬冬云; 王战会; 侯金林; 李进; 刘俊云; 唐云霞; 秦华; 周向军
Original assignee: SHENZHEN YUANXING BIO-PHARM Co Ltd
Current assignee: Heng Ruiyuan Zheng (Guangzhou) Biotechnology Co.,Ltd.; Henry is the source of biological science and Technology Co.,Ltd. (Shanghai)
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2028-12-19
Also published as: CN101748151A

Abstract

本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，该载体包括病毒载体和丙型肝炎病毒的至少两个抗原序列，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。同时注射本发明所述重组腺病毒载体具有高度安全性。

Description

一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术，尤其是涉及一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，该重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体由缺失性的腺病毒和丙型肝炎病毒的至少两个抗原序列构成。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是导致慢性肝炎的主要致病因子之一。在我国，HCV人群感染率为3.2％，估计受感染者在4000万以上，高于亚洲地区平均水平，在世界上属高发地区。当健康人群感染HCV后约75-85％会发展成为慢性丙型肝炎，其中20％病人会进一步发展为肝硬化和肝细胞性肝癌等导致最终死亡的严重疾病。目前除干扰素外尚无理想的预防和治疗手段，且干扰素治疗率不到50％，尤其对于基因型1型，这种占全球所有HCV感染者70％以上，占我国HCV感染者约80％的型别，治疗效果尤差；除此之外干扰素还引起一系列的副作用。因此，目前亟需发展一种有效的疫苗来预防或用以治疗HCV感染。

研究证明，HCV感染人体后，体内针对HCV的特异性细胞免疫是控制HCV病毒复制的关键，正是因为患者体内特异性T细胞的存在，特别是特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的存在，使感染者在感染HCV后的一个相当长的时间内，病毒被控制在一个较低的水平。诱导特异性细胞免疫反应的HCV疫苗通常是依靠疫苗载体系统将HCV病毒抗原基因带入人体细胞表达，然后通过抗原递呈细胞将HCV的抗原蛋白加工成能与MHC分子结合的短肽，从而经MHC通路激活特异性细胞免疫。因此研究开发诱导特异性细胞免疫反应的疫苗就变得非常有必要。

目前HCV基因型主要分为6种(以1到6表示)，其中六个基因型又可分为100多种亚型(以a，b，c等表示)。HCV包括3种结构蛋白C、E1、E2和6种非结构蛋白NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b，其中结构蛋白参与病毒颗粒装配，非结构蛋白参与基因的复制。目前全球进入临床实验的诱导特异性细胞免疫反应的HCV疫苗涉及到HCV的各种基因，如merck公司的以E1和E3缺失的5或6型腺病毒为载体，目的基因为Met-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B，或者优化的上述基因序列，能达到预防和治疗HCV感染的作用。Transgene公司的以E1和E3缺失的腺病毒为载体，其中目的基因CMV-NS3-NS4位于E1区，SV40-NS5B位于E3区。1996年8月16日韩国KOREA公司申请的KR19960033924专利申请公开了E1区缺失的Ad5载体，缺失区插入了core，E1和E2区。

HCV具有显著异源性和高度可变性，在HCV的编码基因中，C区最保守、非结构(NS)区次之，E1和E2区可变性最高称为高可变区。由于HCV型别众多，而且会在免疫压力下不断地发生变异，如果T细胞反应针对的T细胞表位过于狭窄，病毒就可能很容易地通过变异来逃避细胞免疫的攻击；此外，人群中HLA分子多样性的存在，使不同HLA类型的人体内T细胞识别的抗原表位千差万别，所以选择较为保守的基因作为诱导特异性细胞免疫反应疫苗的目的基因是较为理想的选择。

06年12月31日美国globeImmune申请的美国专利US20080069831，保护了NS3和core的融合蛋白在酵母中表达；03年11月13日英国葛兰素集团申请的中国专利200380108869.8保护的是core和NS3的融合蛋白，均不是在腺病毒载体中表达。

腺病毒在自然界分布广泛，在许多哺乳动物和畜类中都发现其存在。至今已分离到100种以上不同血清型的各种腺病毒。腺病毒是二十面体病毒壳体结构，其基因组为线性的双链DNA。由于腺病毒做为载体具有高的感染效率和高的外源基因表达水平、同时高滴度重组病毒的制备较简单、容量适合装载大多数外源基因、不整合入靶细胞基因组等等的优点，故腺病毒被广泛用于基因治疗的载体。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，该载体包括病毒载体和丙型肝炎病毒的至少两条抗原序列，所述抗原含有B细胞表位和T细胞表位，该重组载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应。

所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、SV40病毒载体、反转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。

所述腺病毒载体是缺失性腺病毒载体。

所述核苷酸序列插入至腺病毒的E1、E2、E3或E4区域。

所述腺病毒载体是人5型腺病毒载体、35型腺病毒载体、2型腺病毒载体或6型腺病毒载体。

所述抗原序列可通过内部核糖体进入位点序列连接，从启动子双顺反子地表达。

所述抗原序列可融合表达于载体。

所述丙型肝炎病毒的抗原选自选自核心、NS3、NS4A、NS4B、NS5和其它含T细胞表位的抗原。

所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS3抗原，其序列如SEQ ID NO：1所示。

所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS4A抗原，其序列如SEQ ID NO：2所示。

所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS4B抗原，其序列如SEQ ID NO：3所示。

所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS5A抗原，其序列如SEQ ID NO：4所示。

所述丙型肝炎病毒抗原是核心和NS5B抗原，其序列如SEQ ID NO：5所示。

所述重组载体还含有至少一个免疫刺激物基因序列。

所述免疫刺激物是白细胞介素、干扰素、粒细胞集落刺激因子或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

上述新型重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体在制备用于预防和治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的药物中的应用。

一种用上述重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体制备的疫苗。

本发明的新型重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体是通过如下方法获得的，是将两个或两个以上的目的基因通过基因工程方法进行融合或者通过内部核糖体进入位点IRES序列连接，然后以酶切方式插入到经改良过的腺病毒载体中形成重组体，在大肠杆菌中进行扩增，经分离、提取、纯化后，转染293细胞(人胚肾细胞)，在293细胞内包装成的类病毒颗粒。

根据上述方案，首先通过PCR扩增得到所需目的基因，将两个目的基因如核心抗原序列和NS3序列通过PCR扩增方法进行连接，得到带有核心抗原序列和NS3基因序列的新的片段。将该新得到的目的基因片段克隆入穿梭质粒载体pDC315(io)，通过FLP-frt重组酶系统在293细胞中获得重组腺病毒。

上述目的基因还可以是核心抗原和NS4A，核心抗原和NS4B、核心抗原和NS5A、核心抗原和NS5B。

丙型肝炎核心抗原和NS3抗原具有引起CTL反应和体液免疫应答的作用。用丙型肝炎核心抗原序列和NS3抗原序列做为目的基因的重组体作用于动物能引起动物体内CTL反应及体液免疫应答。本申请所述重组腺病毒载体作用于动物后能引起较强的CTL反应。由于腺病毒做为载体具有高的感染效率和高的外源基因表达水平、不整合入靶细胞基因组等等的优点，因此注射本发明所述重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体具有高度安全性。另外，用丙型肝炎核心抗原序列、NS3序列做为目的基因的重组腺病毒载体也能引起很强的体液免疫反应。因此，注射本发明的重组病毒载体后，能使动物体内引起体液免疫反应和细胞免疫反应，从而达到预防和治疗疾病的目的。

附图说明

图1A、图1B是重组人丙肝病毒抗原腺病毒疫苗构建流程图。

图2是PDC315(io)质粒图谱。

图3是pBHGlox(delta)E1，3Cre质粒图谱。

图4是重组腺病毒RAd-CNS3的PCR鉴定。

图5是RT-PCR检测感染细胞HepG2中的HCV-CNS3的转录。

图6是重组腺病毒RAd-CNS3免疫Balb/c小鼠2周细胞免疫反应。

图7是重组腺病毒RAd-CNS3免疫Balb/c小鼠4周细胞免疫反应。

具体实施方式

实施例1、重组人丙肝病毒抗原腺病毒疫苗的构建

下面结合图1对Ad/CNS3重组人丙肝病毒抗原腺病毒疫苗的构建做进一步详细描述。

以下所述5型腺病毒还可以是2型腺病毒、6型腺病毒、35型腺病毒或者动物腺病毒。

以下所述目的基因还可以是核心抗原和NS4A，核心抗原和NS4B、核心抗原和NS5A、核心抗原和NS5B。

1、编码丙型肝炎病毒核心抗原的核苷酸序列core的获得：从丙肝患者血清提取总RNA，通过逆转录的方法获得cDNA，以获得的cDNA为模板，设计引物：

Core-S-out：5’-TTGTGGTACTGCCTGATAGGG-3’

Core-A：5’-AGCGGAAGCTGGG(A/G)TGGTCA(A/G)(A/G)C-3’(上海英俊生物科技有限公司合成)，

进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性2分钟，以后各循环：94℃变性25秒，55℃退火25秒，72℃延伸1分，共35个循环，之后72℃延伸10分钟，得到PCR片段。

再以该获得的PCR产物为模版，设计PCR引物：

Core-S：5’-ATGAGCAC(A/G)AATCCTAAACC-3’

Core-A：5’-AGCGGAAGCTGGG(A/G)TGGTCA(A/G)(A/G)C-3’(上海英俊生物科技有限公司合成)

进行PCR扩增，扩增条件为：第一循环94℃变性1分钟，以后各循环：94℃变性25秒，55℃退火25秒，72℃延伸40秒，共35个循环，之后72℃延伸10分钟，之后得到core片段，其具体序列如SEQ ID NO：6所示。将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后得到T/core载体。

2、编码丙型肝炎病毒NS3抗原的核苷酸序列NS3的获得：抽取丙肝病人血清，从病人血清中提取丙肝病毒RNA，通过逆转录的方法获得cDNA，以获得的cDNA为模板，设计引物：

NS3-S-out：5’-GAGACCAAGATCATCACCTGGG-3’

NS3-S：5’-GCGCC(C/T)ATCACGGCCTG(C/T)(G/T)C-3’

NS3-A：5’-(A/C)GTGACGACCTCCAGGTCAGCCGAC-3’

NS3-in-S1：5’-GCAGCCCAAGGGTACAAGGT-3’

NS3-in-A1：5’-ACCTTGTACCCTTGGGCTGC-3’

NS3-in-S2：5’-CT(C/T)GATGTGTCCGTCATACC-3’

NS3-in-A2：5’-GGTATGACGGACACATC(A/G)AG-3’

(上述引物均由上海英俊生物科技有限公司合成)，

首先以NS3-S-out和NS3-in-A1为引物，cDNA为模版，进行PCR扩增。扩增条件为：第一循环94℃变性1分钟，以后循环：94℃变性25秒，50℃退火25秒，72℃延伸1分钟，共35个循环，之后72℃延伸10分钟，得到A片段，将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后命名为T/A载体。

同时以NS3-in-S1和NS3-A为引物，cDNA为模版，Taq酶进行PCR扩增。扩增条件为：第一循环94℃变性1分钟，以后5循环：94℃变性25秒，45℃退火25秒，72℃延伸1分30秒，以后循环：94℃变性20秒，50℃退火25秒，72℃延伸1分30秒，共30个循环，之后72℃延伸10分钟，得到B片段，将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后得到T/B载体。

再以NS3-S和NS3-in-A1为引物，提取T/A质粒为模版，Taq酶进行PCR扩增。扩增条件为：第一循环94℃变性1分钟，以后5循环：94℃变性25秒，45℃退火25秒，72℃延伸50秒，以后循环：94℃变性25秒，50℃退火25秒，72℃延伸45秒，共30个循环，之后72℃延伸10分钟，得到NS3-1片段，将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后得到T/NS3-1载体。

再以NS3-in-S1和NS3-in-A2为引物，提取T/B质粒为模版，Taq酶进行PCR扩增。扩增条件为：第一循环94℃变性1分钟，以后5循环：94℃变性25秒，45℃退火25秒，72℃延伸50秒，以后循环：94℃变性25秒，50℃退火25秒，72℃延伸50秒共30个循环，之后72℃延伸10分钟，得到NS3-2片段，将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后得到T/NS3-2载体。

再以NS3-in-S2和NS3-A为引物，提取T/B质粒为模版，Taq酶进行PCR扩增。扩增条件为：第一循环94℃变性1分钟，以后5循环：94℃变性25秒，45℃退火25秒，72℃延伸50秒，以后循环：94℃变性25秒，50℃退火25秒，72℃延伸50秒共30个循环，之后72℃延伸10分钟，得到NS3-3片段，将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后得到T/NS3-3载体。

提取T/NS3-2和T/NS3-3质粒为模版，NS3-in-S1+NS3-in-A2和NS3-in-S2+NS3-A为引物，分别扩增出NS3-2和NS3-3片段，再以NS3-in-S1和NS3-A为引物，以NS3-2和NS3-3为模版，进行PCR扩增。扩增条件为：第一循环94℃变性2分钟，以后各循环：94℃变性25秒，55℃退火25秒，72℃延伸1分30秒，共30个循环，之后72℃延伸10分钟，得到NS3-2+3片段，将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后得到T/NS3-2+3载体。

提取T/NS3-1和T/NS3-2+3质粒为模版，NS3-S+NS3-in-A1和NS3-in-S1+NS3-A为引物，分别扩增出NS3-1和NS3-2+3片段，再以NS3-S和NS3-A为引物，以NS3-1和NS3-2+3为模版，Taq酶进行PCR扩增。扩增条件为：第一循环94℃变性2分钟，以后各循环：94℃变性25秒，49℃退火25秒，72℃延伸2分钟，共30个循环，之后72℃延伸10分钟，得到NS3片段，其具体序列如SEQ ID NO：7所示。将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，经PCR鉴定和测序鉴定后得到T/NS3载体。

3、CNS3融合基因片段的获得：设计引物：Core基因上游引物HCV-C-F：CGGCTAGCACCATGAGCACAAATCCTAAACC(含NHe I位点)；C基因下游重叠引物HCV-CN3-R：GAGCAGGCCGTGATAGGCGCAGCGGAAGCTGGGGTGGTCAG，T/core为模板扩增出带重叠序列的core片段；NS3基因上游引物HCV-N3C-F：CTGACCACCCCAGCTTCCGCTGCGCCTATCACGGCCTGCTC；NS3基因下游引物HCV-N3-R：GCGTCGACTCAAGTGACGACCTCCAGGTCAGCC(含SalI位点)，T/NS3为模板，扩增出带重叠序列的NS3片段。

再以该所得core和NS3为模版，以上述HCV-C-F和HCV-N3-R为引物，进行PCR扩增，先不加引物，扩增条件为：94℃变性3分30秒，45℃退火30秒，72℃延伸2分钟40秒；再向管中加入引物后，94℃预变性3分钟，之后各循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2分钟40秒，25个循环后，72℃延伸10分钟，得到CNS3融合基因片段，其具体序列如SEQ ID NO：1所示。将其得到的PCR片段插入到T载体(Takara公司)中，得到T/CNS3载体。

4、腺病毒穿梭载体PDC315/CNS3的获得：用NHe I和Sal I酶切质粒T/CNS3得到CNS3/NHe I+SalI片段；用NHe I和SalI酶切载体PDC315(io)(加拿大MICRO公司)，其质粒图谱如图2所示，得到PDC315/NHe I+SalI片段，用T4DNA连接酶连接上述两个片段，得到携带丙肝核心抗原基因core和非结构基因NS3的穿梭质粒pDC315/CNS3，命名为腺病毒穿梭载体pDC315/CNS3。

5、同源重组：与骨架载体pBHGlox(delta)E1，3Cre((Microbix Biosystems公司，其质粒图谱如图3所示，利用Lipofectamine^TM2000(invitrogen)共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病毒。转染第10-14天出现病毒空斑，经过3次有限稀释法纯化病毒空斑，得到表达丙肝核心抗原和非结构抗原NS3的重组腺病毒，命名为RAd-CNS3重组腺病毒疫苗。提取重组腺病毒DNA，PCR法检测插入的CNS3序列和腺病毒E2区，目的基因检测引物为：引物HCV-C-F，HCV-N3-R(同前)和穿梭质粒引物pDC315F，pDC315R，腺病毒载体E2区检测引物为E2BF和E2BR，其序列为：

E2BF：5’-TCG TTT CTC AGC AGC TGT TG 3′，

E2BR：5’-CAT CTG AAC TCA AAG CGT GG 3′；(华大基因上海鼎安)，

检测结果见图4：泳道M为500bp DNA Marker，泳道1-3以双引物E2BF+E2BR与HCV-C-F+HCV-N3-R进行PCR所得产物：1为样品(重组腺病毒RAd-CNS3)，2为腺病毒阳性对照(空载腺病毒)3为阴性对照。

同时对腺病毒DNA进行测序(华大基因上海鼎安)，测序结果正确的腺病毒命名为腺病毒疫苗RAd-CNS3。

实施例2：重组腺病毒载体的检测

RT-PCR检测感染细胞HepG2中的HCV-CNS3的转录：

用重组腺病毒RAd-CNS3感染HepG2细胞，之后从感染的HepG2细胞中提取总RNA，以上述配对引物HCV-C-F+HCV-N3-R(同前)为引物，用RT/Platinum Taq Mixkit(Invitogen)进行RT-PCR扩增目的条带。结果见图5：泳道M为DL15000bp DNAMarker，泳道1为样品，泳道2为阴性对照。

实施例3重组腺病毒生产实验

重组腺病毒扩增

培养293细胞(人胚肾细胞)，接种重组腺病毒于293细胞中进行扩增。扩增方法为本技术领域已知的，可以参考《组织培养和分子细胞学技术》(鄂征北京出版社)

重组腺病毒纯化

采用离子交换柱HPLC纯化系统对重组腺病毒进行纯化。

重组腺病毒活性测定

TCID50方法测得重组腺病毒RAd-CNS3的比滴度为3.82％。

实施例4、重组腺病毒疫苗免疫小鼠实验

整合了丙肝核心抗原基因与非结构抗原NS3基因的腺病毒疫苗RAd-CNS3在感染动物后会模拟正常腺病毒感染模式，诱导免疫系统产生针对丙肝核心抗原基因与非结构抗原NS3基因的特异性细胞免疫和体液免疫，当机体再次接触病原体时，通过多信号途径刺激特异性免疫记忆细胞分泌细胞因子γ-IFN，γ-IFN已经证实具有抗病毒效果。ELISPOT实验即通过检测γ-IFN的分泌从而间接检测特异性CTL反应。重组腺病毒RAd-CNS3免疫Balb/c小鼠，以空载腺病毒作为对照，于免疫后第2周、4周取其脾脏制备单个脾细胞悬液，分别以丙肝核心抗原多肽和非结构抗原NS3多肽为体外刺激物，进行ELISPOT试验，检测试验组分泌γ-IFN的鼠脾细胞即形成斑点的细胞(spot forming cell，SFC)。

实验共分2组，分别注射RAd-CNS3，空载腺病毒RAd，每组注射6只Balb/c小鼠(雌性，4-6周龄，中山大学试验动物中心)。后腿肌肉注射200ul，100ul/侧，RAd-CNS3组：10¹¹vp/小鼠，RAd组：¹¹vp/小鼠。注射后2周、4周时，每组取3只动物处死。

ELISPOT实验：动物处死后无菌取脾脏研磨制成单个细胞悬液，进行稀释，将之加于预先包被并封闭好的ELISPOT板96孔内，每孔5×10⁵个脾细胞。加入丙肝核心抗原多肽和非结构抗原NS3多肽(华大基因上海天源合成)作为刺激物。进行ELISPOT实验，具体步骤参见U-Cytech试剂盒说明书。

试验组同时携带丙肝核心抗原表位和非结构抗原NS3表位，在诱导CTL反应上具有优势。由图6、图7结果可知试验组产生了很强的针对丙肝核心抗原和非结构抗原NS3特异性的CTL反应。

由上可知：小鼠注射重组腺病毒RAd-CNS3后在体外经特异性多肽刺激后能释放γ-IFN，从而证明重组腺病毒RAd-CNS3可以诱导机体产生特异性细胞免疫反应，当激活的细胞再次遇到相同病原体时，就会释放γ-IFN等细胞因子发挥抗病毒作用。

所以说本发明的重组腺病毒RAd-CNS3可以诱导小鼠产生针对HCV核心抗原特异性CTL反应和HCV非结构抗原NS3的特异性CTL反应，从而提示重组腺病毒RAd-CNS3对丙肝具有更好的治疗作用。

SEQUENCE LISTING

<110>深圳市源兴生物医药科技有限公司

<120>一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体及其应用

<160>7

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2469

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>1

atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gtcggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccga cccgagggca ggacctgggc ccagcccggg 240

tacccttggc ccctctacgg taacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgtggctccc ggcctagttg gggccccacg gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360

aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420

ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ttggcacatg gtgtccgggt tctggaggac 480

ggcgtgaact acgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540

ctgctgtcct gcctgaccac cccagcttcc gctgcgccta tcacggcctg ctcccaacag 600

acacggggcc tacttggttg catcatcact agcctcacag gccgggacaa gaaccaggtc 660

gagggggagg ttcaggtggt ctccaccgca acacaatctt tcctggcgac ctgtgtcaac 720

ggcgtgtgtt ggactgtcta ccatggcgcc ggctctaaga ccttagccgg cccaaaaggt 780

ccgatcaccc aaatgtacac caatgtggac caagacctcg ttggctggca ggcgcccccc 840

ggggcgcgat ccatgacacc atgcacctgc ggcagttcgg acctctactt ggtcacgaga 900

catgctgatg tcattccggt gcgccggcgg ggcgacagca gggggagtct actctccccc 960

aggcccatct cctacttgaa gggctcttcg ggtggcccac tgctctgccc tttggggcat 1020

gttgtgggca tctttcgagc tgccgtgtgc acccgggggg ttgcgaaggc ggtggacttc 1080

gtacccgttg agtctatgga aaccaccatg cggtctccgg tcttcacaga caactcatcc 1140

cccccggccg taccgcagac atttcaagtg gcccatctac acgctcctac tggcagcggc 1200

aagagcacca aagtgccggc tgcatatgca gcccaagggt acaaggtgct cgtcctgaac 1260

ccatccgttg ctgccacctt aagttttgga gcgtatatgt ctaaggcaca tggtaccgac 1320

cctaatatca gaaccggggt aaggaccatc accacgggcg cccccatcac atactccacc 1380

tacggcaagt tccttgccga cggtggatgc tccgggggcg cctatgacat cataatatgt 1440

gatgagtgcc actcaaccga ctcgactacc atcttgggca tcggcacagt cctggaccaa 1500

gcggagacag ctggagcgcg gcttgtcgtg ctcgctaccg ccacgcctcc gggatcagtc 1560

accgtgccac accccaatat cgaggaggtg gccttgtcca atactggaga gattcccttc 1620

tatggcaaag ccatccccat cgagaccatc aaggggggaa ggcatctcat tttctgccat 1680

tccaagaaga agtgtgacga gctcgccgca aagctatcag gcctcggact caacgctgta 1740

gcgtattacc ggggtctcga tgtgtccgtc ataccgacta gtggagacgt cgttgtcgtg 1800

gcaacagacg ctctaatgac tggctttacc ggtgactttg actcagtgat cgactgtaac 1860

acatgtgtca cccaaacagt cgattttagc ttggatccta ccttcaccat tgagacgacc 1920

accgtacccc aagatgcggt gtcgcgctcg cagcggcgag gtaggactgg caggggtagg 1980

aggggcatct acaggtttgt gactccagga gaacgaccct cgggcatgtt cgattcctca 2040

gtcctgtgtg agtgctatga cgcgggttgt gcttggtacg agctcacgcc cgccgagacc 2100

tcagttaggc tgcgggctta cctaaataca ccagggttgc ccgtttgcca ggaccatctg 2160

gagttttggg agagcgtctt tacaggcctc acccacatag atgcccattt cctatcccag 2220

actaaacagg caggcgacaa cttcccctac ctagtagcat atcaagctac agtgtgcgcc 2280

agggcccagg ctccacctcc atcgtgggac caaatgtgga agtgtctcat acggctaaag 2340

cctacgctgc acgggccaac acccctgctg tataggctag gagccgtaca aaatgaggtc 2400

gccctcacac accccataac caaatacatc atggcatgca tgtcggctga cctggaggtc 2460

gtcacttga 2469

<210>2

<211>738

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>2

atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gtcggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccga cccgagggca ggacctgggc ccagcccggg 240

tacccttggc ccctctacgg taacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgtggctccc ggcctagttg gggccccacg gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360

aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420

ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ttggcacatg gtgtccgggt tctggaggac 480

ggcgtgaact acgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540

ctgctgtcct gcctgaccac cccagcttcc gctagcacct gggtgctggt gggcggggtc 600

cttgcagctt tggccgcata ttgcctgaca acgggcagtg tggtcatcgt gggcaggatc 660

gtcttgtccg ggaaaccggc cgtcataccc gacagggaag tcctctatca ggagttcgat 720

gagatggagg agtgttga 738

<210>3

<211>1359

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>3

atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gtcggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccga cccgagggca ggacctgggc ccagcccggg 240

tacccttggc ccctctacgg taacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgtggctccc ggcctagttg gggccccacg gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360

aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420

ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ttggcacatg gtgtccgggt tctggaggac 480

ggcgtgaact acgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540

ctgctgtcct gcctgaccac cccagcttcc gctgcctcac atctccccta catcgaacag 600

ggaatgcagc tcgccgagca attcaagcag aaagcactcg ggttgctgca gacagccagc 660

aagcaagcgg aggctgctgc tcccgtggtg gagtccaaat ggcgagccct tgaggccttc 720

tgggcaaagc acatgtggaa cttcatcagc ggggtacagt acttagcagg cttatccact 780

ctgcctggga atcccgcaat agcttctctg atggcattca cagcttctat cattagcccg 840

ctcaccaccc aatctaccct cctgtttaac atcttgggag gatgggtagc cgcccaactc 900

gctcccccca gcgctgcttc ggctttcgtg ggcgccggca ttgccggtgc ggctgttggc 960

ggcataggtc ttgggaaggt gcttgtgggc atcctagcgg gctatggggc gggggtggct 1020

ggcgcactcg tggcctttaa ggtcatgagc ggcgaaacgc cctctgccga ggacctgctc 1080

aatctactcc ctgccatcct ctctcctggt gccctggtcg tcggggtcgt gtgcgcggca 1140

atactgcgtc gacacgtggg cccgggagag ggggctgtgc agtggatgaa ccggctgata 1200

gcgttcgctt cgcggggtaa tcacgtttcc cccacgcact atgtgcctga gagcgacgct 1260

gcagcgcgtg ttacccagat cctctccagc cttaccatca ctcagctact gaagaggctc 1320

caccagtgga tcaatgagga ctgctccaca ccatgctga 1359

<210>4

<211>1917

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>4

atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gtcggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccga cccgagggca ggacctgggc ccagcccggg 240

tacccttggc ccctctacgg taacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgtggctccc ggcctagttg gggccccacg gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360

aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420

ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ttggcacatg gtgtccgggt tctggaggac 480

ggcgtgaact acgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540

ctgctgtcct gcctgaccac cccagcttcc gcttccggtt cgtggctaag ggatatttgg 600

gactggatat gcacggtgtt gactgacttc aagacctggc tccagtccaa actcctgccg 660

cggttgccgg gagtcccctt cctctcctgc caacgagggt acaagggagt ctggcggggg 720

gacggcatca tgcaaaccac ctgcccatgt ggaggacaga tcactggaca tgtcaaaaat 780

ggttccatga ggatcgtcgg gcctagaacc tgtagcaaca cgtggtgcgg aacattcccc 840

atcaacgcat acaccacggg cccttgcaca ccctccccgg cgccaaacta ttctaaggcg 900

ctgtggcggg tggctgctga ggagtacgtg gaggttacgc gggtggggga tttccactac 960

gtgacgggta tgaccactga caacgtaaag tgcccatacc aggttccggc ccccgaattc 1020

ttcacagaag tggatggggt gcgattgcac aggtacgctc cggcatgcag acccctccta 1080

cgggacgagg tcgtgttcca ggttgggctc aaccaatacc tggtcgggtc acagctccca 1140

tgcgagcccg agccggatgt agcagtgctt acttccatgc ttaccgaccc ctcccatatc 1200

acagcagaga cggctaagcg taggttggcc agggggtccc ccccctctct ggccagctcc 1260

tcagctagcc agttgtcagc gccttccctg aaggcgacat gcactaccca tcatgactcc 1320

ccggacgctg acctcatcga ggccaacctc ctgtggcggc aggagatggg cgggaacatc 1380

acccgtgtgg agtcagagaa taaggtagta attctggact ctttcgaccc gcttcgagcg 1440

gaggaggatg atagggaggt atctgttcca gcggaaatcc tgcggaaaac caggaagtac 1500

cccccagcga tgcccatatg ggcacgcccg gactacaacc ctccattact agagtcctgg 1560

aaggacccgg actatgtccc tccggtggta catgggtgcc ccctgccgcc tactaaggcc 1620

cctccaatac cacctccacg gaggaagagg acggttgtcc tgacagagtc caccgtatct 1680

tctgttttgg cggagctcgc taccaagacc ttcggcagct ccgaatcatc ggccgtcgac 1740

agcggcacgg cgaccgcccc tcctgatcaa gcctccgatg acagcgacaa gggatccgac 1800

gttgagtcgt actcctccat gccccccctt gagggagaac cgggggaccc cgatctcagc 1860

aacgggtcct ggtctactgc gagcgaggag gccagtgagg acgtcgtctg ctgctga 1917

<210>5

<211>2349

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>5

atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gtcggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccga cccgagggca ggacctgggc ccagcccggg 240

tacccttggc ccctctacgg taacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgtggctccc ggcctagttg gggccccacg gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360

aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420

ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ttggcacatg gtgtccgggt tctggaggac 480

ggcgtgaact acgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540

ctgctgtcct gcctgaccac cccagcttcc gcttcgatgt cctacacgtg gacaggcgcc 600

ctgatcacgc cgtgcgctgc tgaggagagc aagttgccta tcaacccatt gagcaactcc 660

ttactgcgtc accacaacat ggtctacgcc acaacatccc gcagcgcgag cttgcggcag 720

aagaaggtca cctttgacag actgcaggtc ctggacgacc actaccggga cgtgctcaag 780

gagatgaagg cgagggcgtc cacagtcagg gccaaacttc tatctgtaga agaagcctgc 840

aagctgacgc ccccacattc ggccaaatcc aaatttggct atggggcaaa ggacgtccgg 900

aacctatcca gcagggccgt aaaccacatc cgctccgtgt ggaaggacct gctggaagac 960

actgagacac caattgacac taccatcatg gcaaaaaatg aggttttctg cgtccaacca 1020

gagaaaggag gccgcaagcc agctcgcctt atcgtattcc cagacttggg ggttcgtgtg 1080

tgcgagaaga tggctcttta cgacgtggtc tccactcttc ctcaggccgt gatgggttcc 1140

tcatacgggt tccagtactc tcctggacag cgggtcgagt tcctggtgaa tgcctggaaa 1200

tcgaagaagt gccctatggg cttctcgtac gacactcgct gttttgactc aacagttact 1260

gagaatgata tccgtgttga ggagtcaatc taccaatgtt gtgacttggc ccctgaagcc 1320

aaacaggcca taaggtcgct cactgagcgg ctttatatcg ggggtcccct gactaattca 1380

aaagggcaaa actgcggcta tcgccggtgc cgcgcgagcg gcgtactgac gactagctgc 1440

ggtaacaccc ttacatgcta cttgaaggct gctgcggcct gtcgagctgc aaagctccag 1500

gactgcacag tgctcgtgaa cggagacgac cttgtcatta tctgtgagag cgcgggaacc 1560

ctagaggatg cggcaagcct acgagccttc acggaggcta tgactaggta ctctgctccc 1620

cccggggacc cgccccaacc agcatatgac ttggagctga taacatcatg ctcctccaac 1680

gtgtcggtcg cgcacgatgc atccggcaag agggtgtatt acctcacccg tgaccccacc 1740

acccccctcg cgcgggctgc gtgggagaca gctaggcaca ctccagtcaa ctcctggcta 1800

ggcaacatca ttatgtatgc gcccacctta tgggcaagga tgattttgat gactcacttc 1860

ttctccatcc ttctagctca ggaacaactt gaaaaagccc tggattgtca gatctatggg 1920

gcctgttact ccattgagcc acttgaccta cctcagatca ttgaacgact ccatggtctt 1980

agcgcatttt cactccatag ttactctcca ggtgagatca atagggtggc ttcatgcctc 2040

aggaagcttg gggtgccacc cttgcgagtc tggagacatc gggccagaag tgtccgcgct 2100

aagctactgt cccagggggg gagggctgcc acttgcggca agtacctctt cgactgggca 2160

gtaaggacca agctcaaact cactccaatt ccaggtgcgt cccggttgga cttgtccggc 2220

tggttcgttg ctggttacag cgggggagac atatatcaca gcctgtctcg tgcccgaccc 2280

cgctggttca tgttgtgcct actcctactt tccgtagggg taggcatcta cctgctcccc 2340

aaccggtga 2349

<210>6

<211>573

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>6

atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60

gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gtcggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120

ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcaca acctcgtgga 180

aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccga cccgagggca ggacctgggc ccagcccggg 240

tacccttggc ccctctacgg taacgagggc atggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300

cgtggctccc ggcctagttg gggccccacg gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360

aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420

ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ttggcacatg gtgtccgggt tctggaggac 480

ggcgtgaact acgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540

ctgctgtcct gcctgaccac cccagcttcc gct 573

<210>7

<211>1893

<212>DNA

<213>丙型肝炎病毒

<400>7

gcgcctatca cggcctgctc ccaacagaca cggggcctac ttggttgcat catcactagc 60

ctcacaggcc gggacaagaa ccaggtcgag ggggaggttc aggtggtctc caccgcaaca 120

caatctttcc tggcgacctg tgtcaacggc gtgtgttgga ctgtctacca tggcgccggc 180

tctaagacct tagccggccc aaaaggtccg atcacccaaa tgtacaccaa tgtggaccaa 240

gacctcgttg gctggcaggc gccccccggg gcgcgatcca tgacaccatg cacctgcggc 300

agttcggacc tctacttggt cacgagacat gctgatgtca ttccggtgcg ccggcggggc 360

gacagcaggg ggagtctact ctcccccagg cccatctcct acttgaaggg ctcttcgggt 420

ggcccactgc tctgcccttt ggggcatgtt gtgggcatct ttcgagctgc cgtgtgcacc 480

cggggggttg cgaaggcggt ggacttcgta cccgttgagt ctatggaaac caccatgcgg 540

tctccggtct tcacagacaa ctcatccccc ccggccgtac cgcagacatt tcaagtggcc 600

catctacacg ctcctactgg cagcggcaag agcaccaaag tgccggctgc atatgcagcc 660

caagggtaca aggtgctcgt cctgaaccca tccgttgctg ccaccttaag ttttggagcg 720

tatatgtcta aggcacatgg taccgaccct aatatcagaa ccggggtaag gaccatcacc 780

acgggcgccc ccatcacata ctccacctac ggcaagttcc ttgccgacgg tggatgctcc 840

gggggcgcct atgacatcat aatatgtgat gagtgccact caaccgactc gactaccatc 900

ttgggcatcg gcacagtcct ggaccaagcg gagacagctg gagcgcggct tgtcgtgctc 960

gctaccgcca cgcctccggg atcagtcacc gtgccacacc ccaatatcga ggaggtggcc 1020

ttgtccaata ctggagagat tcccttctat ggcaaagcca tccccatcga gaccatcaag 1080

gggggaaggc atctcatttt ctgccattcc aagaagaagt gtgacgagct cgccgcaaag 1140

ctatcaggcc tcggactcaa cgctgtagcg tattaccggg gtctcgatgt gtccgtcata 1200

ccgactagtg gagacgtcgt tgtcgtggca acagacgctc taatgactgg ctttaccggt 1260

gactttgact cagtgatcga ctgtaacaca tgtgtcaccc aaacagtcga ttttagcttg 1320

gatcctacct tcaccattga gacgaccacc gtaccccaag atgcggtgtc gcgctcgcag 1380

cggcgaggta ggactggcag gggtaggagg ggcatctaca ggtttgtgac tccaggagaa 1440

cgaccctcgg gcatgttcga ttcctcagtc ctgtgtgagt gctatgacgc gggttgtgct 1500

tggtacgagc tcacgcccgc cgagacctca gttaggctgc gggcttacct aaatacacca 1560

gggttgcccg tttgccagga ccatctggag ttttgggaga gcgtctttac aggcctcacc 1620

cacatagatg cccatttcct atcccagact aaacaggcag gcgacaactt cccctaccta 1680

gtagcatatc aagctacagt gtgcgccagg gcccaggctc cacctccatc gtgggaccaa 1740

atgtggaagt gtctcatacg gctaaagcct acgctgcacg ggccaacacc cctgctgtat 1800

aggctaggag ccgtacaaaa tgaggtcgcc ctcacacacc ccataaccaa atacatcatg 1860

gcatgcatgt cggctgacct ggaggtcgtc act 1893

Claims

1.一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，其特征在于：该载体包括重组病毒载体和编码来自丙型肝炎病毒的两个抗原序列，含B细胞和T细胞表位，该重组载体能使免疫动物产生体液免疫和细胞免疫反应，所述两个丙型肝炎病毒抗原为核心和NS3抗原，所述核心和NS3抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组病毒载体是腺病毒。

2.根据权利要求1所述的一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，其特征在于：所述腺病毒是缺失性腺病毒。

3.根据权利要求2所述的一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，其特征在于：所述核心和NS3抗原的核苷酸序列被定位于腺病毒的E1区域。

4.根据权利要求3所述的一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，其特征在于：所述腺病毒是人5型腺病毒。

5.根据权利要求1所述的一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，其特征在于：所述核心和NS3抗原的核苷酸序列通过内部核糖体进入位点序列连接，从启动子双顺反子地表达。

6.根据权利要求1所述的一种重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体，其特征在于：所述两个抗原序列融合表达于载体。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组人丙肝病毒抗原腺病毒载体在制备用于预防和治疗由丙型肝炎病毒引起的疾病的药物中的应用。