CN113862287B - 一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体及其应用 - Google Patents

一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种基因3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆及其应用。本发明提取感染HCV的血清RNA，最终获得CH3a毒株的全长基因组序列，通过构建CH3a‑Core‑NS2/JFH1和5’UTR‑NS5A/JFH1，并在DBN毒株5’UTR‑NS5A的帮助下获得功能性的CH3NS5B‑3’UTR。从上述具感染性的嵌合病毒中鉴定到多个新突变，特别是NS5B和3’UTR内的新突变和小片段缺失。最后，综合运用突变点组合，成功构建了可感染Huh7.5系列细胞的CH3a感染性克隆。CH3a感染性克隆对不同抗病毒药物呈浓度依赖性反应，展示CH3a病毒克隆在抗病毒药物研究等方面的潜在应用。

Description

一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆 突变体及其应用。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的 一个重要病原体。HCV属于单链正义RNA病毒，反向遗传系统是RNA病毒研 究的一个重要技术体系，然而代表不同基因型毒株的HCV细胞感染性克隆体系 的缺乏制约了对HCV生活周期、发病机制、疫苗等方面的研究。
近年来针对HCV非结构蛋白NS3、NS5A、NS5B的直接作用抗病毒药物 (direct-acting antiviral agents,DAAs)对持续病毒学应答(sustained virological responseat 12weeks post treatment,SVR12)取得重大成果，SVR12高达99％。 随着DAAs陆续获批上市，这一公共卫生问题带来了突破性的进展，有望实现 HCV治愈。
HCV在体内长期的慢性感染过程中，由于高突变率和高复制率，导致其在 感染者体内同时呈现多种变异株，又与不同器官组织的宿主细胞和免疫系统长 期相互适应和作用，形成庞大的准种库。HCV以准种的形式分布在感染者的体 内，也使其容易逃离机体免疫的监控，因而影响其被有效地清除，导致机体很 难彻底摆脱其感染的发展，故易形成慢性肝炎。HCV准种变异在宿主体内的持 续存在对病毒感染的控制、抗病毒药物和疫苗的发展都是巨大的挑战，也是目 前DAAs药物面临的最大威胁。
HCV主要分为8种主要基因型(genotype，GT)和67种亚型基因。主要基 因型之间序列差异约为30％，多数主要基因型又可分为多种亚型(用a、b、c 等表示)，各亚型之间的序列差异为20-25％。不同基因型HCV具有一定的地区 和人群分布，治疗反应和致病机制的差异性。除了遗传生物学差异外，基因型 还是影响药物治疗效果的一个重要因素。其中，3a和6a型HCV越来越受到更 多关注。基因3a型HCV感染与脂肪病变和纤维化高度相关，且特殊表现出对 现行的DAAs敏感性低，导致治愈率相对较低；临床上还发现感染3a型HCV 的病人的脂肪肝发病率高于其它基因型病毒感染的病人。HCV基因组具有很强 的异质性，目前还没有代表我国区域的3a型HCV毒株的感染模型，因此，建 立我国本土3a型HCV毒株的感染模型对开展我国HCV的基础研究和临床试验 非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种3a型丙型肝炎 病毒全长感染性克隆突变体及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体， 所述突变体包括在3a型HCV毒株的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白及JFH1毒株 的NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白中 至少一种的适应性变异；核心蛋白中适应性变异的位点包括第10位或第72位， E1蛋白中适应性变异的位点包括第372位、374位或375位，E2蛋白中适应性 变异的位点包括第533位或715位，NS2蛋白中适应性变异的位点包括第877 位、933位或946位，NS3蛋白中适应性变异的位点包括第1118位、第1470位 或第1618位，NS4A蛋白中适应性变异的位点包括第1678位，NS4B蛋白中适 应性变异的位点包括第1775位、1825位、第1840位或第1848位，NS5A蛋白 中适应性变异的位点包括第2218位、第2256位、第2271位、第2350位、第 2426位或第2761位，NS5B蛋白中适应性变异的位点包括第2880位、第3004 位或第3005位；所述适应性变异为在突变位点上发生取代、插入或删除一个或 多个氨基酸残基。
本发明从中国丙肝患者的血清中提取病毒的血清RNA，反转得到病毒的 cDNA，测序PCR产物，获得CH3a毒株的全长基因组序列。构建全长cDNA 克隆质粒，野生型克隆以及加入突变点后的CH3a均不能在转染后的Huh7.5及 其衍生细胞株中复制；将CH3a的NS5B换成基因2a型JFH1毒株序列后的嵌合 体也不能在Huh7.5系列细胞中建立感染。通过构建CH3a-Core-NS2/JFH1和5’ UTR-NS5A/JFH1，并在DBN毒株5’UTR-NS5A的帮助下获得功能性的CH3aNS5B-3’UTR，从上述具感染性的嵌合病毒中鉴定到多个新突变，特别是NS5B 和3’UTR内的新突变和小片段缺失。最后，综合运用突变点组合，成功构建了 可感染Huh7.5系列细胞的CH3a感染性克隆。CH3a感染性克隆对不同抗病毒药 物呈浓度依赖性反应，展示CH3a病毒克隆在抗病毒药物研究等方面的潜在应 用。
作为本发明所述3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体的优选实施方 式，所述适应性变异为取代突变，至少包含以下一个或多个氨基酸残基的取代：
1)在核心蛋白上的第10位的赖氨酸突变为谷氨酰胺；
2)在核心蛋白上的第72位的谷氨酸突变为甘氨酸；
3)在E1蛋白上的第372位的苯丙氨酸突变为亮氨酸；
4)在E1蛋白上的第374位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
5)在E1蛋白上的第375位的蛋氨酸突变为苏氨酸；
5)在E2蛋白上的第533位的天冬酰胺突变为丝氨酸；
6)在E2蛋白上的第715位的蛋氨酸突变为缬氨酸；
6)在NS2蛋白上第877位的天冬氨酸突变为甘氨酸；
7)在NS2蛋白上第933位的丝氨酸突变为脯氨酸；
8)在NS2蛋白上第946位的天冬酰胺突变为丝氨酸；
9)在NS3蛋白上第1118位的脯氨酸突变为亮氨酸；
10)在NS3蛋白上第1470位的苯丙氨酸突变为亮氨酸；
11)在NS3蛋白上第1618位的缬氨酸突变为谷氨酸；
12)在NS4A蛋白上第1678位的丙氨酸突变为丝氨酸；
13)在NS4B蛋白上第1775位的缬氨酸突变为丙氨酸；
14)在NS4B蛋白上第1825位的组氨酸突变为精氨酸或半胱氨酸；
15)在NS4B蛋白上第1840位的亮氨酸突变为蛋氨酸；
16)在NS4B蛋白上第1848位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
17)在NS5A蛋白上第2218位的赖氨酸突变为谷氨酸；
18)在NS5A蛋白上第2256位的缬氨酸突变为甘氨酸；
19)在NS5A蛋白上第2271位的缬氨酸突变为天冬酰胺；
20)在NS5A蛋白上第2350位的亮氨酸突变为脯氨酸；
21)在NS5A蛋白上第2426位的丝氨酸突变为精氨酸；
22)在NS5A蛋白上第2761位的谷氨酸突变为甘氨酸；
23)在NS5B蛋白上第2880位的丙氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；
24)在NS5B蛋白上第3004位的亮氨酸突变为蛋氨酸或脯氨酸；
25)在NS5B蛋白上第3005位的半胱氨酸突变为酪氨酸。
作为本发明所述3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体的优选实施方 式，所述适应性变异选自A组合或B组合：
A组合：适应性变异为1)～13)、14)中组氨酸突变为精氨酸、15)～21)、 23)中丙氨酸突变为天冬氨酸、24)亮氨酸突变为蛋氨酸及25)；
B组合：适应性变异为1)～13)、14)中组氨酸突变为半胱氨酸、15)～ 22)、23)中丙氨酸突变为谷氨酸、24)中亮氨酸突变为脯氨酸及25)。
上述克隆突变体分别引入了适应性突变，提高了3a型丙型肝炎病毒的感染 传播速度和病毒滴度。
作为本发明所述3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体的优选实施方 式，所述B组合中，适应性变异还包括CH3a毒株3’非翻译区的Δ11nt等突变。
作为本发明所述3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体的优选实施方 式，所述突变体的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
第二方面，本发明提供了上述的3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体 的构建方法，包括以下步骤：
在CH3a_Core-NS2上适应性突变K10Q、M375T、M715V、D877G、S933P， 将CH3a_Core-NS2驯化5代获得的完全氨基酸突变M375T、D877G、S933P和 K10Q、M375T、M715V、D877G、S933P分别引入基因组CH3a_Core-NS2后 得到CH3a_C-NS2_3m和CH3a_C-NS2_5m克隆；
用JFH1 NS5B替换掉CH3a NS5B并保留LS突变的克隆CH3a_5-5A，将 S52_5-5A病毒的适应性突变D877G、P1118L、F1470L、V1618E、A1678S、H1825R 引入了CH3a_5-5A构建了CH3a_5-5A_6m；将CH3a_5-5A_6m和 CH3a_C-NS2_3m拼接获得CH3a_5-5A_9m；在CH3a_5-5A_9m基础上继续引入 CH3a_5-5A_6m感染传代获得的的Core-NS2基因区段的适应性突变E72G、 F372L、I374V、N533S、N946S和来自CH3a_Core-NS2的适应性突变K10Q得 到CH3a_5-5A_15m克隆；
在CH3a_5-5A_15m基础上引入适应性突变K2218E、V2256G、D2271N、L2350P及来自DBN3acc的突变V1775A、L1840M、I1848V、S2426R、A2880D 和C3005Y，构建得到CH3aFL-25m，在CH3aFL-25m基础上引入C3004M，构 建得到CH3aFL-26m，在CH3aFL-25m基础上引入C3004P和Δ11nt等突变，构 建得到CH3aFLΔ11nt-26m，在CH3aFLΔ11nt-26m基础上引入适应性突变E2761G及 H1825C，获得CH3aFLΔ11nt-27m。
第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述的3a型丙 型肝炎病毒全长感染性克隆突变体。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述的多核苷 酸。
第五方面，本发明提供了一种基因工程化的细胞，所述细胞包括上述的表 达载体或多核苷酸，更优选地，细胞包括Huh7.5细胞和Huh7.5.1细胞。
第六方面，本发明提供了上述3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体在 制备抗病毒药物中的应用。
第七方面，本发明提供了上述3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体在 体外感染细胞中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
本发明建立了高效复制的CH3a_C-NS2_5m和CH3a_5-5A_15m与JFH1的 嵌合感染性克隆，病毒滴度分别104.4FFU/mL和104.5FFU/mL；克隆突变体分别 引入了适应性突变，提高了病毒的感染传播速度和滴度。这些嵌合病毒可以用 于HCV GT3a结构基因功能和GT3a特别的致病机制的研究。
附图说明
图1为第一段PCR(CH3a-PCR1)氨基酸序列的差异分析图I；
图2为第一段PCR(CH3a-PCR1)氨基酸序列的差异分析图II；
图3为第二段PCR(CH3a-PCR2)氨基酸序列的差异分析图；
图4为CH3a各TA克隆片段序列的拼接方法示意图；
图5为CH3a_C-NS2嵌合克隆基因组结构、CH3a_5-5A基因组结构和氨基 酸突变位点示意图以及CH3a_C-NS2嵌合病毒、CH3a_5-5A嵌合病毒的传播速 度和滴度的结果图(图5B和图5C的左Y轴表示细胞感染的百分比；右Y轴显 示感染率高于80％时，检测上清HCV感染滴度FFU，平均值±SD)；
图6为DBN3a_5’UTR-NS5A与CH3a_NS5B-3’UTR嵌合基因组和突变位点 示意图；
图7为DBN_5’UTR-NS5A与CH3a_NS5B-3’UTR嵌合病毒的感染培养图；
图8为CH3a全长基因组及突变位点示意图及利用CH3a转染细胞的结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实 施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用 的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体的构建
选用的HCV GT3a感染者血清用COBAS Ampiprep/COBAS TaqMan滴度 3.93×106IU/mL，毒株命名为CH3a毒株(3a型HCV毒株)。
1、CH 3a毒株基因组的扩增及拼接
1.1 CH 3a毒株基因组的扩增：Trizol和氯仿法提取病毒RNA，采用常用技 术手段扩增CH 3a毒株3’UTR、NS5B段；为了来自一整条病毒RNA的序列， 本发明运用巢式引物对CH3a毒株进行两轮PCR，各段PCR产物加A尾后连接 pGEM-T easy载体(TA克隆)，转化TOP10感受态细胞，蓝白斑筛选，每个片 段选取10个单克隆菌落扩大摇菌，抽提质粒，设计测序引物，Sanger法测序每 个反应600～800个碱基，精确测得每个核苷酸序列，比对分析。
将克隆测序的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，以S52毒株为参照比对差 异。本发明将测序克隆的每个位点上出现频次最高的核苷酸定义为共有序列。
第一段PCR(CH3a-PCR1)氨基酸序列的差异分析(只列出差异氨基酸)， 参考图1和图2。
第一段选取了灰度标记最少的克隆18号克隆(P1-18)，进行下一步实验； 第二段PCR克隆选取了7627-22(P2-22)和7990-3-4，二者拼接去掉了7990-3-4 少见1460位点的N氨基酸；NS5B段因为实验室其他同学课题的需要根据PCR 测序结果合成了共有序列，本发明目前阶段采用了该序列；3’UTR扩增选取 了序列polyU/UC数目适中，且跟NS5B序列一致性好VR-2克隆序列，比对分 析数据此处不做展示；PCR未及部分5’UTR的200bp使用了S52毒株的序列。
第二段PCR(CH3a-PCR2)氨基酸序列的差异分析(只列出差异氨基酸)， 参考图3。
1.2 CH 3a毒株基因组的拼接：选取P1-18、P2-22/7990-3-4、NS5B(FSJ) 和VR-2克隆，用Not I-Afl II-BsiW I和BsrGⅠ-Xba I 5个酶，分三大段拼接全 场基因组。
1)融合CH3a_5’UTR-AflⅡ的基因片段，NotⅠ和AflⅡ酶切该片段后插 入到pS52_5’UTR-NS5A/JFH1；
2)设计点突变去掉7990-3-4克隆内的XbaⅠ突变；
3)限制性内切酶AflⅡ和BsiWⅠ酶切7627-22，拼接到7990-3-4，去掉位 点N1460；
4)限制性内切酶BsiW I和BbvCⅠ酶切pJ6_5’ UTR-NS2/JFH1_NS3-NS5A/CH3a_NS5B/JFH1-3’UTR作为载体，BsiW I和BsrG I切去除Xba I和N1460位点的7990-3-4，(BsrGI和BbvCⅠ酶切后产生相同的 DNA黏性末端)连接两个片段；
5)AflⅡ和Xba I酶切上一部克隆插入第1步的质粒，获得除3’UTR为 JFH1的CH3a克隆；
6)选取CH3a-3’UTR的克隆VR-2，用Hpa I和Xba I换JFH1-3’UTR为 CH3a序列，获得全基因组为3a的质粒克隆CH3a_FL。CH 3a各TA克隆片段序 列的拼接方法示意图如图4所示。
2、CH 3a毒株感染性克隆的构建
2.1 CH3a_Core-NS2病毒的培养
本发明构建了CH3a_Core-NS3、CH3a_Core-NS2与J6/JFH1_NS5AΔ 40-EGFP的嵌合克隆(参考图5A)。前者转染Huh7.5.1后检测到了低水平复制 但没有获得强感染性病毒；后者转染获得了传播较快的病毒，病毒转染在第23 天达到高峰，滴度为103.8FFU/mL(参考图5B)。
将CH3a_Core-NS2(C-NS2)转染后高峰期病毒感染新Huh7.5.1细胞，然后 细胞传代驯化病毒。病毒感染第5代时传播明显变快，取上清RT-PCR扩增病毒 的Core-NS2区域，测序鉴定获得了5个适应性的氨基酸突变K10Q(在核心蛋 白上的第10位的赖氨酸突变为谷氨酰胺)、M375T(在E1蛋白上的第375位的 蛋氨酸突变为苏氨酸)、M715V(在E2蛋白上的第715位的蛋氨酸突变为缬氨 酸)、D877G(在NS2蛋白上第877位的天冬氨酸突变为甘氨酸)、S933P(在 NS2蛋白上第933位的丝氨酸突变为脯氨酸)，将CH3a_C-NS2驯化5代获得的 完全氨基酸突变M375T、D877G、S933P和K10Q、M375T、M715V、D877G、 S933P分别引入基因组CH3a_C-NS2后得到CH3a_C-NS2_3m和 CH3a_C-NS2_5m克隆(参考图5A)，转染Huh7.5.1细胞后传代培养。引入适应 性突变的基因组病毒传播变快，均在第9天达到感染高峰，上清滴度也分别达 到104.3FFU/mL和104.4FFU/mL(参考图5B)。表明培养获得的适应性突变对提 高病毒传播速度和滴度有重要作用。
2.2 CH3a_5’UTR-NS5A病毒的培养
本发明将S52毒株(S52_5-5A病毒)的适应性突变D877G(在NS2蛋白上 第877位的天冬氨酸突变为甘氨酸)、P1118L(在NS3蛋白上第1118位的脯氨 酸突变为亮氨酸)、F1470L(在NS3蛋白上第1470位的苯丙氨酸突变为亮氨酸)、 V1618E(在NS3蛋白上第1618位的缬氨酸突变为谷氨酸)、A1678S(在NS4A 蛋白上第1678位的丙氨酸突变为丝氨酸)、H1825R(在NS4B蛋白上第1825 位的组氨酸突变为精氨酸)引入了CH3a_5-5A(用JFH1 NS5B替换掉CH3aNS5B 并保留LS突变的克隆CH3a_5-5A)构建了CH3a_5-5A_6m，转染后检测到 CH3a_5-5A_6m有持续性的复制感染(参考图5A)，并在细胞传代培养第39天 时达到感染高峰，滴度为103.3FFU/mL(参考图5C)。本申请人取CH3a_5-5A_6m 病毒高峰期的细胞上清感染新的Huh7.5.1和Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞，经过 细胞长期传代培养驯化病毒，可获得适应性突变增加病毒的复制效率和滴度。
2.3高效CH3a_5-5A病毒的培养
在CH3a_5-5A_6m的基础上引入了CH3a_C-NS2_3m病毒传代培养获得的 适应性突变M375T(在E1蛋白上的第375位的蛋氨酸突变为苏氨酸)、M715V (在E2蛋白上的第715位的蛋氨酸突变为缬氨酸)、S933P(在NS2蛋白上第 933位的丝氨酸突变为脯氨酸)构建了CH3a_5-5A_9m克隆(参考图5A)。两个 克隆一起转染Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞，CH3a_5-5A_9m传播比 CH3a_5-5A_6m增快，第19天可以达到高峰，上清滴度增高至103.6FFU/mL(参 考图5C)。为了获得复制效率更高的病毒，申请人在CH3a_5-5A_9m基础上继 续引入CH3a_5-5A_6m感染传代获得的的Core-NS2基因区段的适应性突变 E72G(在核心蛋白上的第72位的谷氨酸突变为甘氨酸)、F372L(在E1蛋白上 的第372位的苯丙氨酸突变为亮氨酸)、I374V(在E1蛋白上的第374位的异亮 氨酸突变为缬氨酸)、N533S(在E2蛋白上的第533位的天冬酰胺突变为丝氨酸)、 N946S(在NS2蛋白上第946位的天冬酰胺突变为丝氨酸)和来自CH3a_C-NS2 的适应性突变K10Q(在核心蛋白上的第10位的赖氨酸突变为谷氨酰胺)构建 新克隆CH3a_5-5A_15m(参考图5A)。该克隆转染Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞 后第5天即可以达到感染高峰，上清滴度达到105.1FFU/mL。
2.4 CH3a_FL感染克隆的构建
在获得CH3a_5-5A的高效病毒后，申请人设计了全长CH3a基因组的克隆。首 先合成了Xho I(5189)-BbvC I(7677)区段，引入来自多个克隆培养的适应性突变： 包含CH3a_5-5A_6m独立感染1的3个突变K2218E、V2256G和L2350P； CH3a_5-5A_9m的1个突变D2271N；文献报道的DBN3acc的4个突变V1755A、 L1840M、I1848V、S2426R。将合成的区段拼接进CH3a_5-5A_15m质粒，然后 用BbvC I-Xba I拼接CH3a_NS5B和3’UTR(VR2)构建新的全长基因组克隆。 参考DBN基因组，在DBN毒株引入上适应性突变，包括Y81H、R317Q、S449A、D474A、T529N、V636A、F941L、Y1680C、V1776A、L1841M、I1849V、S2427R、 A2881D、C3006Y构建得到(DBN/CH3a-NS5B-3’UTR)，在 DBN/CH3a-NS5B-3’UTR基础上引入C3004M构建得到 DBN/CH3a-NS5B-3’UTR+C3004M，在DBN/CH3a-NS5B-3’UTR+C3004M基础 上引入Δ11nt等突变构建DBN/CH3a-NS5B-3’UTR+C3004M/Δ11nt，其嵌合基因 组和突变位点(突变位点来自DBN3acc或嵌合病毒培养鉴定)参考图6，将上 述病毒转染Huh7.5.1-VISI-mCherry细胞，培养结果图参考图7。
2.5 CH3a毒株感染性克隆CH3acc
CH3a全长基因组及突变位点参考图8A，在CH3a_5-5A_15m基础上引入适 应性突变K2218E、V2256G、D2271N、L2350P及来自DBN3acc的突变V1775A、 L1840M、I1848V、S2426R、A2880D和C3005Y，构建得到CH3aFL-25m(参 考CH3a基因组)，在CH3aFL-25m基础上引入C3004M，构建得到CH3aFL-26m (命名为CH3acc1，序列如SEQ ID NO:1)，在CH3aFL-25m基础上引入C3004P 和Δ11nt等突变，构建得到CH3aFLΔ11nt-26m，在CH3aFLΔ11nt-26m基础上引入适应性突变E2761G及H1825C，获得CH3aFLΔ11nt-27m(CH3acc2，序列如SEQ ID NO:2)。
将上述带有不同突变组合的全长基因组转染Huh7.5.1细胞和Huh7.5细胞， J6/JFH1-NS5AΔ40-EGFP(2a型)病毒作对照(参考图8B-图8C)。
本发明提取感染HCV的血清RNA，RT-PCR，测序PCR产物，获得CH3a 毒株的全长基因组序列。构建全长cDNA克隆质粒，野生型克隆以及加入突变 点后的CH3a均不能在转染后的Huh7.5及其衍生细胞株中复制；将CH3a的 NS5B换成基因2a型JFH1毒株序列后的嵌合体也不能在Huh7.5系列细胞中建 立感染。通过构建CH3a-Core-NS2/JFH1和5’UTR-NS5A/JFH1，并在DBN毒 株5’UTR-NS5A的帮助下获得功能性的CH3 NS5B-3’UTR。从上述具感染性 的嵌合病毒中鉴定到多个新突变，特别是NS5B和3’UTR内的新突变和小片段 缺失。最后，综合运用突变点组合，成功构建了可感染Huh7.5系列细胞的CH3a 感染性克隆。CH3a感染性克隆对不同抗病毒药物呈浓度依赖性反应，展示CH3a 病毒克隆在抗病毒药物研究等方面的潜在应用。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体及其应用
<130> 2021.09.29
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9605
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcctgcctct tacgaggcga cactccacca tggatcactc ccctgtgagg aacttctgtc 60
ttcacgcgga aagcgcctag ccatggcgtt agtacgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc 120
cccctcccgg gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gtacaccgga atcgctgggg 180
tgaccgggtc ctttcttgga gcaacccgct caatacccag aaatttgggc gtgcccccgc 240
gagatcacta gccgagtagt gttgggtcgc gaaaggcctt gtggtactgc ctgatagggt 300
gcttgcgagt gccccgggag gtctcgtaga ccgtgcaaca tgagcacact tcctaaaccc 360
caaagacaaa ccaaaagaaa caccatccgt cgcccacagg acgtcaagtt cccgggtggc 420
ggacagatcg ttggtggagt atacgtgttg ccgcgcaggg gcccacgatt gggtgtgcgc 480
gcgacgcgta agacttctga acggtcacag cctcgcggac gacgacagcc tatccccaag 540
gcgcgtcgga gcggaggccg gtcctgggcc cagcctgggt acccttggcc cctctatggt 600
aacgagggtt gcgggtgggc agggtggctc ctgtccccac gcggctctcg tccgtcttgg 660
ggcccaaatg acccccggcg aagatcccgc aatttgggta aagtcatcga tacccttaca 720
tgcggatttg ccgacctcat ggggtacatc ccgcttgttg gcgctcccgt aggaggcgtc 780
gcaagagccc ttgcgcatgg cgtgagggcc cttgaagacg ggataaattt cgcaacaggg 840
aatttgcccg gttgctcctt ttctgtcttt cttctcgctc tgttctcttg cttaattcat 900
ccagcagcta gttttgagtg gcggaatacg tctggcctct atgtccttac caacgactgt 960
cccaatagca gtattgtgta tgaggccgat gacgttattc tgcacacgcc cggctgcata 1020
ccttgtgttc aagaaggcaa tgcatctgag tgctggaccc cagtgacacc tacagtggca 1080
gtcaggtaca tcggggcaac caccgcttcg atacgcagtc atgtggacct attagtgggg 1140
gcggccacga tgtgttctgc gctctacgtg ggtgatatgt gtggggccgt cttcctcgtg 1200
ggacaagcct tcacgtttag accccgccgc catcaaacgg tccagacctg taactgctcg 1260
ctgtacccag gccacctttc aggacatcga atggcttggg atatgatgat gaactggtcc 1320
cccgctgtag gtatggtggt ggcgcacgtc ctgcgtttgc cccagacctt gttcgacata 1380
gtagccgggg cccattgggg cattttggcg ggcctagcct attactctat gcagggtaac 1440
tgggccaagg tccttatcgt cacggtcatg ttttcaggag tcgatgccta tacacacatc 1500
atcggtggca gtgcagctca tggagcccgt ggtcttgcta gcctcttcca tccaggcgcc 1560
aggcagaacc tgcagctggt caacaccaat ggctcgtggc acatcaacag tactgctctg 1620
aactgcaatg actccataaa caccgggttc atagctgggt tgctttatta tcataagttc 1680
aactctactg gatgtcctca aaagctcagc agctgcaagc tcatcacttc cttcaagcag 1740
ggatggggcc ccttgtcaga tgctaacatc accggtcctt ctgatgacaa accctactgc 1800
tggcactacg cacctagacc ttgtaacacc gtcccggcat cgagtgtctg cggtcctgtg 1860
tactgcttca caccatcgcc agtggtcgtg ggcactactg atgctaaagg caagccgacc 1920
tacaactggg gtgagagtga gacagatgtg tttctgttgc agtccctgcg gccccccggt 1980
ggtcggtggt ttgggtgtgt atggatgaac tctacggggt ttgtcaagac gtgcggagct 2040
cccccttgcg acatctacgg gggtggaggg aatcccaaag atccgtcaga cctcttctgc 2100
cccaccgact gcttcaggaa gcatcctgag gccacataca gccggtgtgg tgcggggccc 2160
tggttgacac ctcgatgctt ggtcgactat ccataccggc tttggcatta cccatgtaca 2220
gtcaacttca cactgttcaa ggtgaggatg tttgtgggcg ggtttgagca ccggttctcc 2280
gccgcctgca actggaccag gggggagcgc tgcgacatcg aggatcgtga ccgtagcgag 2340
caacatccgc tgctgcattc aacaactgag cttgccatac tgccttgctc gttcacgccc 2400
atgcctgcgc tgtcaacagg tctaatacac cttcaccaaa acatcgtgga tgtccagtac 2460
ctttatggcg ttggatctgg tgtggtggga tgggcgttga aatgggagtt cgtcatcctc 2520
gttttccttc tcctagcaga cgcacgcgtg tgcgttgccc tctggctgat gctgatgata 2580
acacaagcag aagcagcctt ggagaacctt gtcacgctga acgccgtcgc tgctgccggg 2640
acacacggta tcggctggta cctggtagcc ttttgcgcgg cgtggtacgt gcggggtaaa 2700
ctagtcccgt tggtgaccta cggcctaacg ggtctttggt ccctagcatt gctcgtcctc 2760
ctgctccccc aacgggcgta tgcttggtcg ggtgaagaca gcgctactct tggcgctggg 2820
gtcttggtcc tctttggctt ctttacctta tcaccttggt ataagcattg gatcggccgc 2880
ctcatatggt ggaaccagta caccatatgc agatgcgagt ccgcccttca agtgtgggtt 2940
cccccccttc ttgcgcgtgg gagtaggggc ggtgtcatcc tgctgacaag cctgctttat 3000
ccatctttaa tttttgacat caccaaactg ctgatagcag tattgggccc attatacttg 3060
atacaggctg ccatcactca taccccctac ttcgtgcgtg cgcatgtact ggtccgcctt 3120
tgcatgctcg tgcgccccgt gatgggggga aaatacttcc agatggtcat actgagcatt 3180
ggcagatggt tcaacaccta cctatatgac cacctagcgc caatgcaaca ttgggctgcg 3240
gctggtctta gagacctagc agtggccacc gaacctgtaa tatttagtcc catggagatc 3300
aaggtcatca cctggggcgc agatacggca gcttgcggag atattctttg cgggctgccc 3360
gtctctgcgc ggttgggcca tgaggtgttg ttgggacctg ccgatgacta tcgggagatg 3420
ggttggcggt tgttggctcc gatcacagca tacacccagc aaactagggg ccttcttggg 3480
actatcgtta ccagcttgac tggcagggat aagaatgtgg tgaccggtga agtgcaggta 3540
ctttctacag ccacccagac cttcctaggt acaacagtgg ggggggttat gtggactgtt 3600
taccatggtg caggttcgag aacactcgcg ggcgctaaac atccagcgct ccagatgtac 3660
acaaatgtgg atcaggacct cgtcgggtgg ctagcccctc caggggccaa gtctcttgaa 3720
ccgtgcgcct gcggatccgc agacttatac ttggttaccc gcgaagctga tgtcatccct 3780
gcacggcgca ggggggactc cacagcgagc ttgctcagtc ctagacctct cgcctgcctt 3840
aagggttcct ctggaggtcc tgttatgtgc ccttcggggc atgtcgcggg gatctttaga 3900
gctgctgtgt gcaccagagg tgtagcaaaa gctttacagt tcataccagt ggaaaccctt 3960
agcacacagg ctaggtctcc atctttctct gacaattcaa ctcctcccgc tgttccacag 4020
agctaccaag tggggtacct tcatgccccg accggcagcg gtaagagcac aaaggtcccg 4080
gccgcttatg tagcacaagg atataacgtt ctcgtgctga atccatcagt ggcggccaca 4140
ctgggcttcg gctctttcat gtcacgtgct tatgggatcg accctaacat ccgcactggg 4200
aaccgcacca ttacaactgg cgccaagctg acctattcca cctatggtaa gttccttgcg 4260
gacgggggtt gctccggagg agcatatgat gtgattattt gtgatgaatg ccatgcccaa 4320
gacgctacta gcatattggg tataggcacg gtcctagatc aggctgagac agccggggtg 4380
aggctgacgg ttctagcgac agcaactccc ccaggcagca tcactgtgcc acattctaac 4440
atcgaagaag tggccctggg ctccgaaggt gagatccctt tctacggcaa ggctataccg 4500
atagacctgc tcaagggggg gaggcacctt atgttttgcc attccaagaa aaagtgtgat 4560
gagttagcat ccaaactcag aggcatgggg ctcaacgctg tagcgtacta taggggtctc 4620
gatgtgtccg tcataccaac aacaggagac gtcgtagttt gcgctactga cgctctcatg 4680
actggattca ccggagactt cgattctgtc atagactgca acgtggctgt tgagcagtac 4740
gttgacctca gtttggaccc tactttctcc atcgagactc gcactgctcc ccaagacgca 4800
gtctcccgca gccaacgtcg tggccgtacg ggccgaggta gactcggtac gtaccggtat 4860
gttacccccg gtgaaagacc gtctggaatg tttgactcgg ttgttctctg tgagtgttat 4920
gacgcgggct gttcgtggta cgatctgcag cccgccgaga ccacagtcag actgagagct 4980
tacttgtcca cgccggggtt acctgtctgc caagaccatt tagacttttg ggagagcgtc 5040
ttcactggac taactcacat agatgcccac tttttgtcac agactaagca gcagggactc 5100
aatttctcgt acctgactgc ctaccaagcc acagtgtgcg cccgcgcgca ggctcccccc 5160
ccaagttggg acgagacgtg gaagtgcctc gagcggctta aaccaacact acatggaccc 5220
acgccccttc tatatcggtt ggggcctgtc caaaatgaag tctgcttgac acaccccgtc 5280
acaaagtaca tcatggcatg catgtcagct gatttggaag taaccaccag tacctgggtg 5340
ttgcttggag gggtcctcgc ggccctagcg tcctactgct tgtcggtcgg ctgcgttgtg 5400
attgtgggtc atatcgagct ggggggcaag ccggcactcg tgccagacag agaggtgttg 5460
tatcaacaat acgatgagat ggaggagtgc tcacgagctg ccccatacgt cgaacaagct 5520
caggtaatag cccaccagtt caaagaaaag gtccttggat tgctgcagcg agccacccaa 5580
caacaagctg tcattgagcc tatagtagct accaactggc aaaaacttga ggccttctgg 5640
cacaagtaca tgtggaattt tgcgagtggg atccagtacc tagcaggcct ctccactttg 5700
cccggcaacc ctgctgtggc gtctcttatg gcgttcactg cttcagtcac cagtcccctg 5760
acgaccaacc aaactatttt ttttaacata ctcggggggt gggttgcaac ccgtttggca 5820
gggccccaga gctcttccgc atttgtggta agcggcatgg ctggcgctgc catagggggc 5880
gtaggcctgg gcaaggtctt gcttgacatc ctggcaggat acggggctgg cgtctcaggc 5940
gccctggtag cttttaagat catgggagga gaactcccca ctactgagga catggtcaac 6000
ctgttacccg ccatactatc tccaggcgcc ctcgtcgttg gtgtaatatg cgctgccata 6060
ctgcgtcgcc acgtaggacc tggggaggga gcggttcagt ggatgaacag gcttattgca 6120
ttcgcatccc ggggtaacca cgtctcacca acacactatg tccccgagag cgatgctgca 6180
gcgagggtca ccgcgttgct gagttctcta actatcacaa gcctgctccg gcggttgcac 6240
cagtggatca atgaggacta cccaagtccc tgcagcggcg attggctgcg tgacatctgg 6300
gactgggttt gcacagtgtt gtccgacttc aaaacatggc tctctgctaa gattatacca 6360
gcgctccctg gactgccctt catttcatgt cagaggggat acaagggcgt gtggcgggga 6420
gacggtgtga tgtcgacacg ctgtccttgc gggtcatcaa taactggcca tgtgaagaat 6480
gggtccatgc ggcttgcagg gccgcgtaca tgtgctaaca tgtggtacgg tacctttccc 6540
atcaatgagt acaccaccgg acccagcaca ccttgcccat cacccaacta cactcgcgca 6600
ctgtggcgcg tggctgccaa cagctacgtt gaggtgcgcc gggtgggaga cttccattac 6660
attacagggg ccacagaaga tgaactcaag tgtccgtgcc aagtgccggc tgccgagttt 6720
ttcactgaag tggatggggt gagactccac cgttacgccc ctccatgtaa gcccttgttg 6780
agagatgaca tcactttcat ggtggggttg aattcctacg tgataggatc tcaactcccc 6840
tgtgagcctg aaccagatgt ttctgtgctg acctcgatgc taagagaccc ttcccatatc 6900
accgccgaga cggcggcgcg ccgtctcgcg cgcgggtctc ctccatcgga ggcaagctca 6960
tccgccagcc aactatcggc tccgtcgttg gaagccacct gccagacgca taggcctcat 7020
ccagacgctg agctagtaga cgccaacttg ttgtggcggc aagagatggg cagcaacatc 7080
acgcgggtag agtctgagac gaagggtgtg attcttgatt cgttcgaacc tctgagagcc 7140
gaacctgata acggcgagct ctcggtggct gcagagtgtt tcaagaaacc tcccaagtac 7200
cctccggctc ttcctatatg ggctaggcca gattacaacc ctccactgtt agaccgctgg 7260
aaagcaccgg attatgaacc accgactgtc catgggtgcg ccttaccacc acgaggcgct 7320
ccaccggtgc ctcctcctcg gaggaaaaga acaatccagc tggatggctc caacgtgtcc 7380
gcggcgccag ccgcgctagc ggaaaaatca tttccatcct cgaaaccaca ggaggagaat 7440
agctcgtcct ctggggtcga cacacagtcc agcactactt ccaaggcgct cccttctccg 7500
ggaggggagt ctgactcaga gtcatgttcg tccatgcctc ctcttgaggg agagccgggc 7560
gatccagact tgagttgcga ctcttggtcc accgttagcg acagcgagga gcagagagtg 7620
gtctgctgct ctatgtcgta ctcttggacc ggcgccctga taacaccatg tagtgctgag 7680
gaggagaaac tgcctatcag cccactcagc aactccttgt tgagacatca taacatggtc 7740
tattcaacgt cgtcaagaag cgcttctcag cgccagaaga aggttacctt cgataggctg 7800
caagtgctcg acgaccatta cagggttgta ttaaaggagg taaaggagcg agcgtccaag 7860
gtgaaggctc gcatgcttac catcgaggaa gcgtgcgcgc tcgtccctcc tcactctgcc 7920
cgatcgaagt tcgggtatag tgcgaaggac gttcgctcct tgtccagcaa ggccattaac 7980
cagatccgct ccgtctggga ggacttgctg gaagacacca caactccaat tccaactacc 8040
ataatggcga agaacgaggt attttgtgtg gaccctgtca aagggggccg caaacccgct 8100
cgcctcattg tgtaccctga cctgggggtg cgtgtctgtg agaaacgcgc cctatatgac 8160
gtgatacaga agttgtcaat tgagacgatg ggttccgcct atggattcca atattcgcct 8220
caacagcggg tcgaacgtct actgaagatg tgggcctcaa agaaaacccc tctggggttc 8280
tcgtatgaca cccgctgctt tgactcaact gtcactgaac aggacatcag ggtggaagag 8340
gagatatacc aatgctgtga tcttgaaccg gaggccagga aagtgatctc ctccctcacg 8400
gagcggcttt actgcggggg tcctatgttc aacagcaagg ggacccagtg tggttatcgc 8460
cgttgccgtg ccagtggagt tctgcccacc agcttcggca atacgatcac ttgttacatc 8520
aaggccacag cggctgcaaa ggccgcaggc ctccaaaacc cggactttct tgtttgcggg 8580
gacgacctgg tcgtggtggc tgagagtgtt ggcgtcgaag aggatagagc agccctgaga 8640
gctttcacgg aggctatgac caggtattct gctccacctg gggatgctcc gcagcccacc 8700
tacgaccttg agctcattac atcttgctcc tccaatgtct ccgtggcacg ggacgaaaag 8760
gggaagaggt attattacct cacccgtgat gccaccactc ccctaagccg tgcggcttgg 8820
gagacagctc gtcacactcc agttaactcc tggctgggta atatcatcat gtacgcgcct 8880
accatctggg tgcgcatggt aatgatgaca cacttcttct ccatactcca atcccaggag 8940
atacttgatc ggcccctcga ctttgaaatg tacggggaca cttactctgt cactccgctg 9000
gatttaccag caatcattga aagactccat ggtctgagcg cgttcacgct ccacagttac 9060
tctccagtag aactcaatag ggtcgcgggg acactcagga aacttgggtg ccccccccta 9120
cgagcgtgga gacatcgggc acgagcagtg cgcgccaagc ttatcgccca gggggggaag 9180
gccaaaatat gtggtcttta cctctttaat tgggcggtac gcaccaagac caaactcact 9240
ccactaccgg ccgctggcca gctggactta tccagctggt ttacggttgg tgtcggcggg 9300
aacgacattt atcacagcgt gtcgcgtgcc cgaacccgcc atttgctgct ttacctactc 9360
ctactagccg taggggtagg catctttctc ctgccagcac ggtaagctgg taggataaca 9420
ctccattttt ttttttttct tgtttttttt tttttttttc tttcctttcc ctttcccttc 9480
ttttctgatc tataattttc cttcttaggt ggctccatct tagccctagt cacggctagc 9540
tgtgaaaggt ccgtgagccg catgactgca gagagtgctg atactggcct ctctgcagat 9600
catgt 9605
<210> 2
<211> 9594
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcctgcctct tacgaggcga cactccacca tggatcactc ccctgtgagg aacttctgtc 60
ttcacgcgga aagcgcctag ccatggcgtt agtacgagtg tcgtgcagcc tccaggaccc 120
cccctcccgg gagagccata gtggtctgcg gaaccggtga gtacaccgga atcgctgggg 180
tgaccgggtc ctttcttgga gcaacccgct caatacccag aaatttgggc gtgcccccgc 240
gagatcacta gccgagtagt gttgggtcgc gaaaggcctt gtggtactgc ctgatagggt 300
gcttgcgagt gccccgggag gtctcgtaga ccgtgcaaca tgagcacact tcctaaaccc 360
caaagacaaa ccaaaagaaa caccatccgt cgcccacagg acgtcaagtt cccgggtggc 420
ggacagatcg ttggtggagt atacgtgttg ccgcgcaggg gcccacgatt gggtgtgcgc 480
gcgacgcgta agacttctga acggtcacag cctcgcggac gacgacagcc tatccccaag 540
gcgcgtcgga gcggaggccg gtcctgggcc cagcctgggt acccttggcc cctctatggt 600
aacgagggtt gcgggtgggc agggtggctc ctgtccccac gcggctctcg tccgtcttgg 660
ggcccaaatg acccccggcg aagatcccgc aatttgggta aagtcatcga tacccttaca 720
tgcggatttg ccgacctcat ggggtacatc ccgcttgttg gcgctcccgt aggaggcgtc 780
gcaagagccc ttgcgcatgg cgtgagggcc cttgaagacg ggataaattt cgcaacaggg 840
aatttgcccg gttgctcctt ttctgtcttt cttctcgctc tgttctcttg cttaattcat 900
ccagcagcta gttttgagtg gcggaatacg tctggcctct atgtccttac caacgactgt 960
cccaatagca gtattgtgta tgaggccgat gacgttattc tgcacacgcc cggctgcata 1020
ccttgtgttc aagaaggcaa tgcatctgag tgctggaccc cagtgacacc tacagtggca 1080
gtcaggtaca tcggggcaac caccgcttcg atacgcagtc atgtggacct attagtgggg 1140
gcggccacga tgtgttctgc gctctacgtg ggtgatatgt gtggggccgt cttcctcgtg 1200
ggacaagcct tcacgtttag accccgccgc catcaaacgg tccagacctg taactgctcg 1260
ctgtacccag gccacctttc aggacatcga atggcttggg atatgatgat gaactggtcc 1320
cccgctgtag gtatggtggt ggcgcacgtc ctgcgtttgc cccagacctt gttcgacata 1380
gtagccgggg cccattgggg cattttggcg ggcctagcct attactctat gcagggtaac 1440
tgggccaagg tccttatcgt cacggtcatg ttttcaggag tcgatgccta tacacacatc 1500
atcggtggca gtgcagctca tggagcccgt ggtcttgcta gcctcttcca tccaggcgcc 1560
aggcagaacc tgcagctggt caacaccaat ggctcgtggc acatcaacag tactgctctg 1620
aactgcaatg actccataaa caccgggttc atagctgggt tgctttatta tcataagttc 1680
aactctactg gatgtcctca aaagctcagc agctgcaagc tcatcacttc cttcaagcag 1740
ggatggggcc ccttgtcaga tgctaacatc accggtcctt ctgatgacaa accctactgc 1800
tggcactacg cacctagacc ttgtaacacc gtcccggcat cgagtgtctg cggtcctgtg 1860
tactgcttca caccatcgcc agtggtcgtg ggcactactg atgctaaagg caagccgacc 1920
tacaactggg gtgagagtga gacagatgtg tttctgttgc agtccctgcg gccccccggt 1980
ggtcggtggt ttgggtgtgt atggatgaac tctacggggt ttgtcaagac gtgcggagct 2040
cccccttgcg acatctacgg gggtggaggg aatcccaaag atccgtcaga cctcttctgc 2100
cccaccgact gcttcaggaa gcatcctgag gccacataca gccggtgtgg tgcggggccc 2160
tggttgacac ctcgatgctt ggtcgactat ccataccggc tttggcatta cccatgtaca 2220
gtcaacttca cactgttcaa ggtgaggatg tttgtgggcg ggtttgagca ccggttctcc 2280
gccgcctgca actggaccag gggggagcgc tgcgacatcg aggatcgtga ccgtagcgag 2340
caacatccgc tgctgcattc aacaactgag cttgccatac tgccttgctc gttcacgccc 2400
atgcctgcgc tgtcaacagg tctaatacac cttcaccaaa acatcgtgga tgtccagtac 2460
ctttatggcg ttggatctgg tgtggtggga tgggcgttga aatgggagtt cgtcatcctc 2520
gttttccttc tcctagcaga cgcacgcgtg tgcgttgccc tctggctgat gctgatgata 2580
acacaagcag aagcagcctt ggagaacctt gtcacgctga acgccgtcgc tgctgccggg 2640
acacacggta tcggctggta cctggtagcc ttttgcgcgg cgtggtacgt gcggggtaaa 2700
ctagtcccgt tggtgaccta cggcctaacg ggtctttggt ccctagcatt gctcgtcctc 2760
ctgctccccc aacgggcgta tgcttggtcg ggtgaagaca gcgctactct tggcgctggg 2820
gtcttggtcc tctttggctt ctttacctta tcaccttggt ataagcattg gatcggccgc 2880
ctcatatggt ggaaccagta caccatatgc agatgcgagt ccgcccttca agtgtgggtt 2940
cccccccttc ttgcgcgtgg gagtaggggc ggtgtcatcc tgctgacaag cctgctttat 3000
ccatctttaa tttttgacat caccaaactg ctgatagcag tattgggccc attatacttg 3060
atacaggctg ccatcactca taccccctac ttcgtgcgtg cgcatgtact ggtccgcctt 3120
tgcatgctcg tgcgccccgt gatgggggga aaatacttcc agatggtcat actgagcatt 3180
ggcagatggt tcaacaccta cctatatgac cacctagcgc caatgcaaca ttgggctgcg 3240
gctggtctta gagacctagc agtggccacc gaacctgtaa tatttagtcc catggagatc 3300
aaggtcatca cctggggcgc agatacggca gcttgcggag atattctttg cgggctgccc 3360
gtctctgcgc ggttgggcca tgaggtgttg ttgggacctg ccgatgacta tcgggagatg 3420
ggttggcggt tgttggctcc gatcacagca tacacccagc aaactagggg ccttcttggg 3480
actatcgtta ccagcttgac tggcagggat aagaatgtgg tgaccggtga agtgcaggta 3540
ctttctacag ccacccagac cttcctaggt acaacagtgg ggggggttat gtggactgtt 3600
taccatggtg caggttcgag aacactcgcg ggcgctaaac atccagcgct ccagatgtac 3660
acaaatgtgg atcaggacct cgtcgggtgg ctagcccctc caggggccaa gtctcttgaa 3720
ccgtgcgcct gcggatccgc agacttatac ttggttaccc gcgaagctga tgtcatccct 3780
gcacggcgca ggggggactc cacagcgagc ttgctcagtc ctagacctct cgcctgcctt 3840
aagggttcct ctggaggtcc tgttatgtgc ccttcggggc atgtcgcggg gatctttaga 3900
gctgctgtgt gcaccagagg tgtagcaaaa gctttacagt tcataccagt ggaaaccctt 3960
agcacacagg ctaggtctcc atctttctct gacaattcaa ctcctcccgc tgttccacag 4020
agctaccaag tggggtacct tcatgccccg accggcagcg gtaagagcac aaaggtcccg 4080
gccgcttatg tagcacaagg atataacgtt ctcgtgctga atccatcagt ggcggccaca 4140
ctgggcttcg gctctttcat gtcacgtgct tatgggatcg accctaacat ccgcactggg 4200
aaccgcacca ttacaactgg cgccaagctg acctattcca cctatggtaa gttccttgcg 4260
gacgggggtt gctccggagg agcatatgat gtgattattt gtgatgaatg ccatgcccaa 4320
gacgctacta gcatattggg tataggcacg gtcctagatc aggctgagac agccggggtg 4380
aggctgacgg ttctagcgac agcaactccc ccaggcagca tcactgtgcc acattctaac 4440
atcgaagaag tggccctggg ctccgaaggt gagatccctt tctacggcaa ggctataccg 4500
atagacctgc tcaagggggg gaggcacctt atgttttgcc attccaagaa aaagtgtgat 4560
gagttagcat ccaaactcag aggcatgggg ctcaacgctg tagcgtacta taggggtctc 4620
gatgtgtccg tcataccaac aacaggagac gtcgtagttt gcgctactga cgctctcatg 4680
actggattca ccggagactt cgattctgtc atagactgca acgtggctgt tgagcagtac 4740
gttgacctca gtttggaccc tactttctcc atcgagactc gcactgctcc ccaagacgca 4800
gtctcccgca gccaacgtcg tggccgtacg ggccgaggta gactcggtac gtaccggtat 4860
gttacccccg gtgaaagacc gtctggaatg tttgactcgg ttgttctctg tgagtgttat 4920
gacgcgggct gttcgtggta cgatctgcag cccgccgaga ccacagtcag actgagagct 4980
tacttgtcca cgccggggtt acctgtctgc caagaccatt tagacttttg ggagagcgtc 5040
ttcactggac taactcacat agatgcccac tttttgtcac agactaagca gcagggactc 5100
aatttctcgt acctgactgc ctaccaagcc acagtgtgcg cccgcgcgca ggctcccccc 5160
ccaagttggg acgagacgtg gaagtgcctc gagcggctta aaccaacact acatggaccc 5220
acgccccttc tatatcggtt ggggcctgtc caaaatgaag tctgcttgac acaccccgtc 5280
acaaagtaca tcatggcatg catgtcagct gatttggaag taaccaccag tacctgggtg 5340
ttgcttggag gggtcctcgc ggccctagcg tcctactgct tgtcggtcgg ctgcgttgtg 5400
attgtgggtc atatcgagct ggggggcaag ccggcactcg tgccagacag agaggtgttg 5460
tatcaacaat acgatgagat ggaggagtgc tcacgagctg ccccatacgt cgaacaagct 5520
caggtaatag cccaccagtt caaagaaaag gtccttggat tgctgcagcg agccacccaa 5580
caacaagctg tcattgagcc tatagtagct accaactggc aaaaacttga ggccttctgg 5640
cacaagtaca tgtggaattt tgcgagtggg atccagtacc tagcaggcct ctccactttg 5700
cccggcaacc ctgctgtggc gtctcttatg gcgttcactg cttcagtcac cagtcccctg 5760
acgaccaacc aaactatttt ttttaacata ctcggggggt gggttgcaac ccgtttggca 5820
gggccccaga gctcttccgc atttgtggta agcggcatgg ctggcgctgc catagggggc 5880
gtaggcctgg gcaaggtctt gcttgacatc ctggcaggat acggggctgg cgtctcaggc 5940
gccctggtag cttttaagat catgggagga gaactcccca ctactgagga catggtcaac 6000
ctgttacccg ccatactatc tccaggcgcc ctcgtcgttg gtgtaatatg cgctgccata 6060
ctgcgtcgcc acgtaggacc tggggaggga gcggttcagt ggatgaacag gcttattgca 6120
ttcgcatccc ggggtaacca cgtctcacca acacactatg tccccgagag cgatgctgca 6180
gcgagggtca ccgcgttgct gagttctcta actatcacaa gcctgctccg gcggttgcac 6240
cagtggatca atgaggacta cccaagtccc tgcagcggcg attggctgcg tgacatctgg 6300
gactgggttt gcacagtgtt gtccgacttc aaaacatggc tctctgctaa gattatacca 6360
gcgctccctg gactgccctt catttcatgt cagaggggat acaagggcgt gtggcgggga 6420
gacggtgtga tgtcgacacg ctgtccttgc gggtcatcaa taactggcca tgtgaagaat 6480
gggtccatgc ggcttgcagg gccgcgtaca tgtgctaaca tgtggtacgg tacctttccc 6540
atcaatgagt acaccaccgg acccagcaca ccttgcccat cacccaacta cactcgcgca 6600
ctgtggcgcg tggctgccaa cagctacgtt gaggtgcgcc gggtgggaga cttccattac 6660
attacagggg ccacagaaga tgaactcaag tgtccgtgcc aagtgccggc tgccgagttt 6720
ttcactgaag tggatggggt gagactccac cgttacgccc ctccatgtaa gcccttgttg 6780
agagatgaca tcactttcat ggtggggttg aattcctacg tgataggatc tcaactcccc 6840
tgtgagcctg aaccagatgt ttctgtgctg acctcgatgc taagagaccc ttcccatatc 6900
accgccgaga cggcggcgcg ccgtctcgcg cgcgggtctc ctccatcgga ggcaagctca 6960
tccgccagcc aactatcggc tccgtcgttg gaagccacct gccagacgca taggcctcat 7020
ccagacgctg agctagtaga cgccaacttg ttgtggcggc aagagatggg cagcaacatc 7080
acgcgggtag agtctgagac gaagggtgtg attcttgatt cgttcgaacc tctgagagcc 7140
gaacctgata acggcgagct ctcggtggct gcagagtgtt tcaagaaacc tcccaagtac 7200
cctccggctc ttcctatatg ggctaggcca gattacaacc ctccactgtt agaccgctgg 7260
aaagcaccgg attatgaacc accgactgtc catgggtgcg ccttaccacc acgaggcgct 7320
ccaccggtgc ctcctcctcg gaggaaaaga acaatccagc tggatggctc caacgtgtcc 7380
gcggcgccag ccgcgctagc ggaaaaatca tttccatcct cgaaaccaca ggaggagaat 7440
agctcgtcct ctggggtcga cacacagtcc agcactactt ccaaggcgct cccttctccg 7500
ggaggggagt ctgactcaga gtcatgttcg tccatgcctc ctcttgaggg agagccgggc 7560
gatccagact tgagttgcga ctcttggtcc accgttagcg acagcgagga gcagagagtg 7620
gtctgctgct ctatgtcgta ctcttggacc ggcgccctga taacaccatg tagtgctgag 7680
gaggagaaac tgcctatcag cccactcagc aactccttgt tgagacatca taacatggtc 7740
tattcaacgt cgtcaagaag cgcttctcag cgccagaaga aggttacctt cgataggctg 7800
caagtgctcg acgaccatta cagggttgta ttaaaggagg taaaggagcg agcgtccaag 7860
gtgaaggctc gcatgcttac catcgaggaa gcgtgcgcgc tcgtccctcc tcactctgcc 7920
cgatcgaagt tcgggtatag tgcgaaggac gttcgctcct tgtccagcaa ggccattaac 7980
cagatccgct ccgtctggga ggacttgctg gaagacacca caactccaat tccaactacc 8040
ataatggcga agaacgaggt attttgtgtg gaccctgtca aagggggccg caaacccgct 8100
cgcctcattg tgtaccctga cctgggggtg cgtgtctgtg agaaacgcgc cctatatgac 8160
gtgatacaga agttgtcaat tgagacgatg ggttccgcct atggattcca atattcgcct 8220
caacagcggg tcgaacgtct actgaagatg tgggcctcaa agaaaacccc tctggggttc 8280
tcgtatgaca cccgctgctt tgactcaact gtcactgaac aggacatcag ggtggaagag 8340
gagatatacc aatgctgtga tcttgaaccg gaggccagga aagtgatctc ctccctcacg 8400
gagcggcttt actgcggggg tcctatgttc aacagcaagg ggacccagtg tggttatcgc 8460
cgttgccgtg ccagtggagt tctgcccacc agcttcggca atacgatcac ttgttacatc 8520
aaggccacag cggctgcaaa ggccgcaggc ctccaaaacc cggactttct tgtttgcggg 8580
gacgacctgg tcgtggtggc tgagagtgtt ggcgtcgaag aggatagagc agccctgaga 8640
gctttcacgg aggctatgac caggtattct gctccacctg gggatgctcc gcagcccacc 8700
tacgaccttg agctcattac atcttgctcc tccaatgtct ccgtggcacg ggacgaaaag 8760
gggaagaggt attattacct cacccgtgat gccaccactc ccctaagccg tgcggcttgg 8820
gagacagctc gtcacactcc agttaactcc tggctgggta atatcatcat gtacgcgcct 8880
accatctggg tgcgcatggt aatgatgaca cacttcttct ccatactcca atcccaggag 8940
atacttgatc ggcccctcga ctttgaaatg tacggggaca cttactctgt cactccgctg 9000
gatttaccag caatcattga aagactccat ggtctgagcg cgttcacgct ccacagttac 9060
tctccagtag aactcaatag ggtcgcgggg acactcagga aacttgggtg ccccccccta 9120
cgagcgtgga gacatcgggc acgagcagtg cgcgccaagc ttatcgccca gggggggaag 9180
gccaaaatat gtggtcttta cctctttaat tgggcggtac gcaccaagac caaactcact 9240
ccactaccgg ccgctggcca gctggactta tccagctggt ttacggttgg tgtcggcggg 9300
aacgacattt atcacagcgt gtcgcgtgcc cgaacccgcc atttgctgct ttacctactc 9360
ctactagccg taggggtagg catctttctc ctgccagcac ggtaagctgg taggataaca 9420
ctccattttt ttttttttct tgtttttttt tttttttttc tttcctttcc ctttcccttc 9480
ttttttttcc ttcttaggtg gctccatctt agccctagtc acggctagct gtgaaaggtc 9540
cgtgagccgc atgactgcag agagtgctga tactggcctc tctgcagatc atgt 9594

Claims (5)

1.一种3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体，其特征在于，所述突变体的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述细胞包括如权利要求1所述的3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体。
3.如权利要求2所述的细胞，其特征在于，细胞为Huh7.5细胞或Huh7.5.1细胞。
4.如权利要求1所述的3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体在制备抗病毒药物中的应用。
5.如权利要求1所述的3a型丙型肝炎病毒全长感染性克隆突变体在体外感染细胞中的应用。
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