CN104911152A - 一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株及其构建方法和应用，属于生物技术领域。所述病毒rIHNV HLJ-09株的微生物保藏号为CGMCC No.8606，通过感染重组病毒的细胞传代实验证明此病毒能够稳定传代。重组病毒rIHNV HLJ-09腹腔接种虹鳟幼鱼，结果导致幼鱼发病死亡，致死率可达90％，表明此病毒具有与亲代HLJ-09株病毒相似的致病特性。进一步，本发明中利用rIHNV HLJ-09反向遗传系统，将rIHNV HLJ-09的NV ORF用报告基因EGFP(绿色荧光蛋白)编码基因替换，成功拯救病毒，拯救病毒命名为rIHNV-EGFP。激光共聚焦显微镜观察rIHNV-EGFP病毒侵染的细胞可观察到明显的绿色荧光，说明该rIHNV HLJ-09病毒株可应用于表达外源蛋白。

Description

一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株及其构建方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

传染性造血器官坏死(Infectious haematopoietic necrosis，IHN)是由弹状病毒科诺拉弹状病毒属的传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosisvirus，IHNV)感染鲑科鱼类以造血器官出血、坏死为主要病理特征的一种高度传染性和急性病毒性疾病。IHNV是鱼类弹状病毒的典型代表，危害鱼种类范围很广，有能力感染鲑鱼科的所有品种。IHNV高致病力毒株对鲑鳟稚鱼的致死率高达100％，感染后幸存的鱼终生带毒，成为潜在的传染源，并通过粪便和精卵排出病原。目前此病广泛流行于北美、欧洲、亚洲的各国，已成为世界性鲑鳟鱼病，随着水生动物及其产品进出口贸易的急剧增加，IHN已经传入我国，并在我国局部地区流行。给鲑鳟养殖业带来重大经济损失。IHNV只有一个血清型。现今已确定IHNV有4个基因型：U基因型，M基因型，L基因型，JRt基因型。前三种基因型主要在北美和欧洲流行，JRt基因型在亚洲日本和韩国爆发。IHNV是OIE公布要求上报的7种鲑鳟病毒性疾病之一，也是口岸鱼类的第一类检疫对象。

反向遗传学是针对遗传物质为RNA的生物体而言，在获得生物体基因组全部cDNA序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，再按基因组组成顺序构建含有生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究基因组结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状的影响等方面的内容。RNA病毒的反向遗传操作，即构建RNA病毒的DNA副本，并在DNA水平对病毒基因组进行定向修饰，模拟真实病毒粒子的生命周期，用以研究病毒基因结构与功能、病毒与宿主之间相互作用的关系等。RNA病毒突变率较高，直接对其进行定向操作比较困难。基于DNA水平的反向遗传操作为研究RNA病毒的复制及调控机理、病毒毒力、病毒-宿主相互作用和研制新型基因工程疫苗等提供了重要的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株的获得：

亲本病毒HLJ-09毒株为2009年本实验室从黑龙江省某虹鳟养殖场爆发急性疾病的死亡的虹鳟组织分离的IHNV。HLJ-09株基因组共包含6种基因，分别编码核衣壳蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，糖蛋白(G)，非病毒结构蛋白(NV)和病毒聚合酶(L)。基因组的顺序为3’-N-P-M-G-NV-L-5’。根据测定的传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基因序列(Genbank accession no.JX649101)，设计特异性引物，构建两端分别带有锤头状核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)全长基因组cDNA重组真核表达质粒，以及核蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)、非结构蛋白(NV)四个参与病毒转录和复制的辅助质粒，将上述5个质粒共转染EPC细胞，在细胞RNA聚合酶II的作用下启动真核表达载体pCI的CMV启动子起始转录各个目的基因，拯救HLJ-09株重组传染性造血器官坏死病毒(rIHNV)，即为重组病毒rIHNV HLJ-09株。

获得的重组传染性造血器官坏死病毒株，命名为rIHNV HLJ-09，分类命名为传染性造血器官坏死病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，微生物保藏号为CGMCC No.8606，保藏日期为2013年12月11日。

进一步的，本发明提供了一种构建所述的病毒rIHNV HLJ-09株的方法，其特征在于，采用反向遗传操作系统拯救重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株。

在本发明中，优选的，包括以下步骤：

(1)根据传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基因序列，设计特异性引物，构建包括受控于真核启动子的传染性造血器官坏死病毒株HLJ-09的全基因组cDNA序列的转录质粒；

(2)根据传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基因序列，设计特异性引物，构建分别包括编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白(N)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白(P)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)的cDNA序列以及编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白(NV)的cDNA序列的四个转录辅助质粒，四个辅助质粒均受控于真核启动子；

(3)将上述的转录质粒和转录辅助质粒共转染用于病毒拯救的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，从转染细胞的上清液中拯救重组传染性造血器官坏死病毒株rIHNV HLJ-09。

在本发明中，优选的，所述真核启动子为CMV启动子。

在本发明中，优选的，步骤(1)中所述转录质粒还包括编码锤头状核酶(HamRz)的序列、编码丁型肝炎核酶(HdvRz)的序列以及位于全基因组cDNA序列内部的分子标识，所述全基因组cDNA序列位于真核启动子和编码锤头状核酶(HamRz)的序列之后，编码丁型肝炎核酶(HdvRz)之前，共同构成转录模板。

在本发明中，优选的，所述分子标识是位于全基因组cDNA序列内部的SnaB I酶切位点以及Spe I酶切位点。

在本发明中，优选的，步骤(1)中所述转录质粒为pIHNV-HLJ-09；所述传染性造血器官坏死病毒株HLJ-09的全基因组cDNA序列从5’至3’方向依次分成F1片段、F2片段、F3片段、F4片段、F5片段和F6片段6个片段进行扩增，扩增F1片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，扩增F2片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，扩增F3片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，扩增F4片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，扩增F5片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，扩增F6片段的引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示。

在本发明中，优选的，步骤(2)中所述四个转录辅助质粒是通过将编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白(N)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白(P)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)的cDNA序列以及编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白(NV)的cDNA序列分别克隆于载体pCI中得到的，分别命名为pCI-N，pCI-P，pCI-L以及pCI-NV；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白(N)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白(P)的的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQID NO:21和SEQ ID NO:22所示；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:23-26所示；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白(NV)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示。

在本发明中，优选的，步骤(3)中所述转录质粒和四个转录辅助质粒的浓度均为1μg/mL，转录质粒和四个转录辅助质粒的质量比为：pIHNV-HLJ-09：pCI-N：pCI-P：pCI-L：pCI-NV＝10:5:5:2:1；所述宿主细胞为EPC细胞。

本发明中应用rIHNV HLJ-09反向遗传系统，将rIHNV HLJ-09的NV ORF用报告基因EGFP(绿色荧光蛋白)编码基因替换，成功拯救病毒，重组病毒命名为rIHNV-EGFP。激光共聚焦显微镜观察该病毒侵染细胞可观察到明显的绿色荧光。说明该rIHNV HLJ-09可应用于表达外源蛋白。

因此，进一步的，本发明还提供了所述的病毒rIHNV HLJ-09株在作为表达外源蛋白病毒载体中的应用。

在本发明中，优选的，利用反向遗传技术在rIHNV HLJ-09病毒基因组内插入外源基因，表达外源基因蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明利用采用反向遗传操作系统拯救重组传染性造血器官坏死病毒rIHNVHLJ-09株。拯救的病毒具有特征性的分子标识，通过感染重组病毒的细胞传代实验证明此病毒能够稳定传代。重组病毒rIHNV HLJ-09腹腔接种虹鳟幼鱼，结果导致幼鱼发病死亡，致死率可达90％，表明此病毒具有与亲代HLJ-09株病毒相似的致病特性。进一步，本发明中利用rIHNV HLJ-09反向遗传系统，将rIHNV HLJ-09的NV ORF用报告基因EGFP(绿色荧光蛋白)编码基因替换，成功拯救病毒，拯救病毒命名为rIHNV-EGFP。激光共聚焦显微镜观察rIHNV-EGFP病毒侵染的细胞可观察到明显的绿色荧光，说明该rIHNV HLJ-09病毒株可应用于表达外源蛋白。

附图说明

图1为全长cDNA的F1段-F6段PCR产物图，其中，M为DL DNA 2000Marker，F1-F6为F1-F6段PCR产物；

图2为pCI-IHNV-HLJ-09酶切鉴定结果图，其中，M为DL15000DNA Marker，1为Nhe I单酶切；，2为Nhe I和Kpn I双酶切；

图3为全长cDNA重组质粒的构建策略图；

图4为N、P、L、NV辅助质粒的酶切鉴定结果图，其中，1、2为pCI-L单双酶切，3、4为pCI-N单双酶切，5、6为pCI-P单双酶切，7、8为pCI-NV单双酶切；

图5为重组病毒株rIHNV HLJ-09在EPC上引起的细胞病变效应结果图(250×)，其中，A为拯救毒感染细胞后的细胞病变效应，B为正常EPC细胞；

图6为重组病毒株rIHNV HLJ-09的分子标识的酶切结果图，其中，M为DL2000DNA Marker，1为重组病毒株A片段SnaB I酶切，2为重组病毒株B片段SpeI酶切；3为亲本病毒A片段SnaB I酶切，4为亲本病毒B片段Spe I酶切；且重组病毒株基因组A段PCR产物SnaB I单酶切得到221bp和472bp两段预期的片段；B段PCR产物Spe I单酶切得到292bp和454bp两段预期的片段；亲本病毒基因组A段和B段则不能被SnaB I和Spe I切开；

图7为重组病毒株rIHNV HLJ-09的分子标识序列图，其中，A为SnaB I分子标识序列，B为Spe I分子标识序列；

图8为重组病毒株rIHNV HLJ-09的间接免疫荧光检测图，其中，A为拯救病毒感染EPC细胞，B为亲本病毒感染EPC细胞，C为正常EPC细胞；

图9为电镜观察重组病毒株rIHNV HLJ-09的形态图；

图10为重组病毒株rIHNV HLJ-09病毒生长曲线图；

图11为重组病毒的细胞嗜性图；

图12为重组病毒接种虹鳟累计死亡率的测定图；

图13为重组病毒rIHNV-EGFP中EGFP蛋白的直接荧光检测图；其中，A：rIHNV-EGFP重组病毒感染EPC细胞24h，B：rIHNV-EGFP重组病毒感染EPC细胞24h，C：rIHNV-EGFP重组病毒感染EPC细胞24h，D：EPC细胞对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 重组传染性造血器官坏死病毒株rIHNV HLJ-09的获得

具体步骤如下：

1、全长cDNA重组质粒的构建

用primer5.0进行HLJ-09株病毒全基因(Genbank accession no.JX649101)限制性酶切位点分析，选择5个单一的限制性酶切位点，全长cDNA从5’至3’方向被基因组内在的和引入的酶切位点SnaB I、Nde I、Spe I、Nhe I、Mlu I、Nco I依次分成长度分别为1696bp(F1)、1734bp(F2)、1852bp(F3)、1707bp(F4)、2140bp(F5)1997bp(F6)的6个片段进行RT-PCR扩增，其中SnaB I和Spe I两个酶切位点为无义突变，作为重组病毒区别与亲本病毒的分子标识。基因组分段扩增所需的引物及扩增区段如表1所示。通过RT-PCR的方法，利用高保真PrimerSTAR^TM HSDNA聚合酶(购自大连宝生物)扩增F1段～F6段，结果如图1所示。将各段PCR产物连接到pMD18-T simple克隆载体，分别命名为pT-F1，pT-F2，pT-F3，pT-F4，pT-F5，pT-F6。

为方便基因组各个片段的连接，最终构建成含全长基因组cDNA的重组真核表达质粒，本研究选择pBlueScript ⅡSK(+)作为中间克隆载体，根据研究目的将其进行一系列的改造。设计一个含8个单一的限制性酶切位点的linker克隆入pBlueScript ⅡSK(+)的MCS中。改造后载体的MCS处的序列为GCTAGCatcacGGCGCCacttaTACGTAtcatcCATATGcatgcACTAGTgacacACGCGTcattcCTGCAGgacacCCATGGtcatgCTCGAGatccaGTGCACtcagaAGATCTgacacGGATCCtcactGGTACCtcactTCTAGA，下划线表示的酶切位的的顺序依次为Nhe I、Kas I、SnaB I、Nde I、Spe I、Mlu I、Nco I、Kpn I。

为了转录后产生基因组精确的5’末端和3’末端，通过融合PCR的方法将锤头状核酶(Hammerhead ribozyme，HamRz)和丁肝病毒核酶(Hepatitis delta ribozyme，HdvRz)添加在病毒基因组cDNA的5’末端和3’末端，同时通过引物设计分别引入Nde I和Kpn I酶切位点，所用引物见表1。将锤头状核酶结构和丁肝病毒核酶结构分两步和三步融合在F1段和F6段上。HamRz的cDNA：5’CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTC3’；HdvRz的cDNA：5’GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG。多重PCR的步骤如下：第一步PCR以pT-F1质粒为模板，以HamRz F1/IHN KasR为引物，得到的PCR产物命名为HHF1-1(920bp)。第二步pCR以经胶回收的第一步pcR产物为模板，以HamRz F2/IHN KasR为引物，得到的PCR产物命名为HHF1(942bp)。用同样方法在F6段的末端引入HdvRz结构。第一步以pT-F6质粒为模板。第一、二、三步所用的引物分别是IHN NcoF/HdvRz R1、IHN NcoF/HdvRz R2、IHN NcoF/HdvRz R3，得到的pCR产物分别命名为HDVF6-1(2029bp)、HDVF6-2(2045bp)、HDVF6(2085bp)。胶回收HHF1和HDVF6PCR产物，克隆到pMD18-T simple载体，命名为pT-HHF1，pT-HDVF6。用NheI和Kas I双酶切鉴定正确的pT-HHF1质粒和改造后的pBlueScript ⅡSK质粒，胶回收基因片段HHF1和线性化载体，将HHF1亚克隆入pBlueScript ⅡSK中。用Kas I和SnaB I双酶切pT-F1质粒和pBlueScript ⅡSK-HHF1，得到新的融合了HamRz的F1，命名为pBlueScript ⅡSK-HF1重组质粒。

表1 扩增构建反向遗传HLJ-09株全长cDNA分子克隆的引物序列

注：以上引物参照毒株为IHNV HLJ-09株GenBank登录号为JX649101)，＊为无义突变的酶切位点，斜体为酶切位点，下划线部分为突变体碱基

将融合了核酶的HF1及HDVF6和F2、F3、F4、F5目的基因片段依次克隆入改造后的pBlueScript ⅡSK(+)中间克隆载体的MCS的NheI/SnaBI、SnaBI/NdeI、NdeI/SpeI、SpeI/MluI、MluI/NcoI、NcoI/KpnI位置，构建成pBlueScript Ⅱ-F123456重组质粒。从pBlueScript Ⅱ-F123456重组质粒中酶切获得F123456目的片段克隆入真核表达载体pCI(中国农科院哈尔滨兽医研究所田志军研究员惠赠)的NheI/KpnI位置，构建病毒全长cDNA重组真核表达质粒pIHNV-HLJ-09，如图2所示。

全长cDNA重组质粒的构建策略如图3所示。

2、N、P、L、NV蛋白重组质粒的构建

用primer5.0设计针对N、P、NV、L蛋白开放阅读框(ORF)的特异性引物(表2)，其中，L基因的长度比较长，分成2段进行扩增，再将其拼接起来。通过特定的酶切位点Kpn I和NotR I将N、P、NV、L基因克隆到真核表达载体pCI中，构建pCI-N，pCI-P，pCI-L，pCI-NV重组质粒，如图4所示。

表2 扩增反向遗传系统中辅助质粒序列的引物

注：斜体加粗为酶切位点，下划线部分为Kozak序列。

3、病毒拯救

用去内毒素试剂盒(美国OMEGA公司生产)提取纯化序列正确的5种重组质粒(病毒全长基因cDNA重组质粒pIHNV-HLJ-09和pCI-N，pCI-P，pCI-L，pCI-NV重组质粒)。调整各个转染质粒的浓度为1μg/mL。采用Lipofectamine LTX andPLUS^TM Reagents(Invitrogen,Carlsbad,CA)介导的转染方法进行共转染EPC细胞(本实验室保存)，各个质粒浓度比为：pIHNV-HLJ-09：pCI-N：pCI-P：pCI-L：pCI-NV的比例为10:5：5:2:1，具体操作见转染试剂说明书。然后将转染板置于16℃培养箱继续培养5～7天，转染细胞及上清混合物反复冻融3次收获重组病毒，常规方法接种EPC细胞(本实验室保存)，16℃继续培养3天，对重组病毒传代，直到出现明显的细胞病变效应(CPE)。

4、重组病毒的特性

细胞病变效应：重组病毒从第5代开始出现典型的细胞病变效应，如图5所示，拯救出的病毒命名为rIHNV HLJ-09。

分子标识：提取重组病毒rIHNV HLJ-09基因组RNA，通过RT-PCR的方法，利用特异的引物(表3)扩增含有分子标识SnaB I和Spe I的片段，分子标识SnaBI酶切位点位于全基因的P基因内部，扩增引物为扩增P基因的上下游引物IHNV PKpnF和IHNV P NotR，扩增片段命名为A(SnaB)，大小692bp。分子标识Spe I酶切位点扩增上下游引物为新合成的rIHNV SpeF和rIHNV SpeR，扩增片段命名为B(Spe)，大小740bp。通过酶切鉴定可知重组病毒基因组中含有以上两个特异的分子标识，与PCR产物的测序结果一致，如图6和图7所示。

表3 扩增拯救病毒的分子标识的引物

注：斜体加粗为酶切位点。

病毒粒子形态：将重组病毒rIHNV HLJ-09和亲本病毒HLJ-09分别感染EPC细胞后用抗IHNV全病毒的兔血清为抗体进行间接免疫荧光检测，荧光显微镜下均可观察到特异性黄绿色荧光，而阴性血清和正常EPC细胞对照无荧光产生，如图8所示。EPC细胞接种拯救毒60h后，制备感染细胞的超薄切片，透射电镜观察，也可看到与IHNV一致的弹状病毒粒子，大小约为160nm×80nm左右，如图9所示。

生长曲线：将重组病毒rIHNV HLJ-09和亲本病毒HLJ-09接种EPC细胞，每隔12h测定病毒滴度，绘制生长曲线。结果显示，两者具有相似的复制特点和增殖特性。接毒后24～60h为病毒的对数生长期，72h进入平台期，平台期病毒的滴度均为10⁷TCID₅₀/mL，如图10所示。

细胞嗜性与稳定性：将重组病毒rIHNV HLJ-09和亲本病毒HLJ-09分别接种EPC细胞、CHSE-214细胞和RTG-2细胞。用Reed-Muench法测定两种病毒对这三种细胞的TCID₅₀。结果显示，重组病毒同亲本病毒一样在三种细胞上均生长良好。拯救毒在EPC和CHSE-214上的TCID₅₀高于RTG-2，此结果与亲本毒一致。培养结果如图11所示。将拯救毒在EPC细胞上连续传代20代，病毒可以正常复制，稳定传代。

毒力：将重组病毒rIHNV HLJ-09和亲本病毒HLJ-09腹腔注射接种健康的虹鳟稚鱼，连续20d观察虹鳟的发病情况。虹鳟稚鱼接种重组病毒rIHNV HLJ-09和亲本病毒HLJ-09后均在第3d开始出现死亡，第4～6d出现死亡高峰。统计拯救病毒rIHNV HLJ-09和亲本病毒HLJ-09累计死亡率均为90％，两种病毒都属于IHNV强毒，如图12所示。

获得的重组传染性造血器官坏死病毒株，命名为rIHNV HLJ-09，分类命名为传染性造血器官坏死病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏号为CGMCC No.8606，保藏日期为2013年12月11日。

实施例2 rIHNV HLJ-09株在病毒载体中的应用

具体步骤如下：

1、重组病毒rIHNV-EGFP的拯救

利用rIHNV HLJ-09反向遗传系统，将rIHNV HLJ-09的NV ORF报告基因用EGFP(绿色荧光蛋白)编码基因替换，构建重组质粒pIHNV-EGFP；将CHSE-214细胞用无双抗的含10％FBS的L15饲养于24孔板内，细胞密度约为80％～90％。在200μL的无血清L15培养液中分别加入1μg pIHNV-EGFP及0.5μg pCI-N，0.5μgpCI-P，0.2μg pCI-L，0.1μg pCI-NV，0.1μg pCI-G质粒，轻轻混匀。向DNA混合液添加0.6μL PLUSTM Reagents，轻轻混匀，室温孵育5min。将上述200μL转染液加入CHSE-214细胞中，前后轻轻晃动24孔板。将转染板置于25℃培养箱内作用6h，弃液，补加新鲜配制的含10％FBS的L15培养液。然后将转染板置于16℃培养箱培养5～7天，观察CPE。转染细胞及上清混合物反复冻融3次收获重组病毒。拯救出的重组病毒命名为rIHNV-EGFP。

2、重组病毒rIHNV-EGFP表达外源蛋白的检测

将重组病毒rIHNV-EGFP感染CHSE-214细胞(大马哈鱼胚胎细胞，本实验保存)，72h后用激光共聚焦显微镜检测EGFP的表达情况，可见细胞上有特异性的黄绿色荧光。结果显示重组病毒rIHNV-EGFP可表达绿色荧光蛋白，如图13所示。

Claims (10)

1.一株重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株，其特征在于，所述病毒rIHNV HLJ-09株的微生物保藏号为CGMCC No.8606，保藏日期：2013年12月11日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种构建权利要求1所述的病毒rIHNV HLJ-09株的方法，其特征在于，采用反向遗传操作系统拯救重组传染性造血器官坏死病毒rIHNV HLJ-09株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基因序列，设计特异性引物，构建包括受控于真核启动子的传染性造血器官坏死病毒株HLJ-09的全基因组cDNA序列的转录质粒；

(2)根据传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的全基因序列，设计特异性引物，构建分别包括编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白(N)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白(P)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)的cDNA序列以及编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白(NV)的cDNA序列的四个转录辅助质粒，四个辅助质粒均受控于真核启动子；

(3)将上述的转录质粒和转录辅助质粒共转染用于病毒拯救的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞，从转染细胞的上清液中拯救重组传染性造血器官坏死病毒株rIHNV HLJ-09。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述真核启动子为CMV启动子。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述转录质粒还包括编码锤头状核酶(HamRz)的序列、编码丁型肝炎核酶(HdvRz)的序列以及位于全基因组cDNA序列内部的分子标识，所述全基因组cDNA序列位于真核启动子和编码锤头状核酶(HamRz)的序列之后，编码丁型肝炎核酶(HdvRz)之前，共同构成转录模板。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分子标识是位于全基因组cDNA序列内部的SnaB I酶切位点以及Spe I酶切位点。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述转录质粒为pIHNV-HLJ-09；所述传染性造血器官坏死病毒株HLJ-09的全基因组cDNA序列从5’至3’方向依次分成F1片段、F2片段、F3片段、F4片段、F5片段和F6片段6个片段进行扩增，扩增F1片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，扩增F2片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，扩增F3片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，扩增F4片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，扩增F5片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，扩增F6片段的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述四个转录辅助质粒是通过将编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白(N)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白(P)的cDNA序列、编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)的cDNA序列以及编码所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白(NV)的cDNA序列分别克隆于载体pCI中得到的，分别命名为pCI-N，pCI-P，pCI-L以及pCI-NV；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的核蛋白(N)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的磷酸化蛋白(P)的的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:23-26所示；扩增所述传染性造血器官坏死病毒HLJ-09株的非结构蛋白(NV)的cDNA序列的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:27和SEQID NO:28所示。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述转录质粒和四个转录辅助质粒的浓度均为1μg/mL，转录质粒和四个转录辅助质粒的质量比为：pIHNV-HLJ-09：pCI-N：pCI-P：pCI-L：pCI-NV＝10:5:5:2:1；所述宿主细胞为EPC细胞。

10.权利要求1所述的病毒rIHNV HLJ-09株在作为表达外源蛋白病毒载体中的应用，其特征在于，利用反向遗传技术在rIHNV HLJ-09株病毒基因组内插入外源基因，表达外源基因蛋白。