CN105816871B - 一种中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗及其应用，所述中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗的制备方法包括以下步骤：(1)设计扩增J基因型传染性造血器官坏死病毒表面糖蛋白(Glycoprotein，G)基因的特异性引物；(2)利用病毒敏感细胞系培养IHN病毒分离株，然后提取病毒基因组RNA；(3)采用步骤(1)所得引物对步骤(2)所得的病毒基因组RNA进行一步法RT‑PCR扩增；(4)将步骤(3)所得的回收产物与pMD19‑T simple载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落，扩大培养后提取质粒进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒进行测序；(5)将步骤(4)鉴定正确的IHNV病毒分离株糖蛋白基因利用BamH I和Xho I酶切位点克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，构建核酸疫苗。

Description

一种中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗、制备方法及其应用。
背景技术
传染性造血器官坏死病(infectious haematopoietic necrosis，IHN)是由传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV)引起的一种常见的危害鲑鳟鱼类的急性病毒性传染病。自从上世纪50年代在美国首次暴发以来，IHNV已经扩散至欧洲、澳洲、亚洲等十余个国家。根据致病毒株、环境因素、鱼龄的不同，IHNV可造成鲑鳟鱼高达100％的死亡率，对世界的鲑鳟鱼养殖业造成了巨大的经济损失。
IHNV属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，诺拉弹状病毒属(Novirhabdovirus)的单股、负链、RNA病毒，全基因组长度约为11kb，包含六个基因，分别编码病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、非结构蛋白(NV)和聚合酶蛋白(L)。糖蛋白是该病毒的表面蛋白，含有丰富的抗原表位，是该病毒的保护性抗原，在病毒的免疫反应过程中具有重要的作用。目前根据G蛋白基因序列将世界范围内的IHNV分为U、M、L、E和J五种基因型。其中，U、M、L基因型主要流行于北美，E基因型流行于欧洲，J基因型流行于亚洲，并分化为JNagano和J Shizuoka两个基因亚型。尽管世界IHNV分离株含有5个基因型，但是各基因型病毒株糖蛋白具有较高的核苷酸及氨基酸同源性，其中核酸同源性在95％以上，氨基酸同源性在94％以上(Jia,Zheng,Shi,Kan,Wang,He,Zheng,Yu,Lan,Hua,Liu,Jin,2014)。虽然各基因型的IHNV之间糖蛋白同源性很高，但是已有研究表明，不同基因型的IHNV核酸疫苗存在不同程度的交叉保护，如免疫M基因型IHNV核酸疫苗的虹鳟鱼在免疫28天后仍然能够很好的阻挡其它基因型的IHNV毒株的攻击，而免疫U基因型的虹鳟鱼在免疫后第28天后不能很好抵抗M基因型的IHNV毒株的攻击，该结果说明尽管具有较高的核苷酸及氨基酸同源性，针对不同基因型IHNV毒株构建的核酸疫苗对其它基因型的病毒可能不具有同一的保护性(Penaranda,Lapatra,Kurath,2011)。遗传进化分析结果显示我国IHNV分离株与同一基因型(J基因型)的日本及韩国IHNV毒株的糖蛋白核苷酸及氨基酸同源性可高达99％。尽管同属于J基因型的不同毒株之间具有如此高的同源性，但是J基因型已经进化分为两个亚基因型(J Nagano和J Shizuoka)，这两个亚基因型目前主要由日本及韩国的IHNV分离株组成，而中国毒株正在逐步演化出第三个亚基因型；已有研究结果表明糖蛋白某些位点氨基酸的改变对病毒的毒力具有很大的影响，甚至能够改变中和抗原表位使变异病毒株能够逃避中和抗体的阻断作用而侵染敏感细胞系及敏感鱼类造成疫苗免疫失败(Kim,Winton,Leong,1994)；另外，大量数据表明：IHNV的进化与宿主无关而与毒株所处的地域相关(Enzmann,Kurath,Fichtner,Bergmann,2005)，因此，本研究针对我国不同虹鳟主养区IHNV分离株进行了遗传进化分析，结果表明不同地区的IHNV分离株存在一定变异情况，并且表现为以地域甚至是养殖场为单位进行独立进化(Jia,Zheng,Shi,Kan,Wang,He,Zheng,Yu,Lan,Hua,Liu,Jin,2014)。目前已经有关于IHNV核酸疫苗的系列报道，主要以M基因型IHNV毒株糖蛋白构建的系列核酸疫苗(Corbeil,LaPatra,Anderson,Kurath,2000)。
发明内容
由于上述原因，本发明利用我国现行的J基因型的、分离于不同虹鳟主养区(黑龙江省、辽宁省、甘肃、新疆、云南)的IHNV分离株，分别命名为HLJ-15、LN-15、GS-15、XJ-15及YN-15，进行核酸疫苗的构建，通过交叉保护试验，筛选出稳定的、具有全面保护作用的高效核酸疫苗株。
将我国IHNV分离株糖蛋白G基因分别克隆连接到真核表达载体pcDNA3.1，构建成核酸疫苗。按2μg/尾的计量分别免疫虹鳟(1.7±0.5g)，同时设pcDNA3.1为阴性对照组及空白对照组(50μL/尾磷酸盐溶液)。于免疫后第7、14、21及28天进行攻毒试验评估核酸疫苗的免疫保护效果，并分别交叉感染不同的IHNV分离株，检测来自不同地区的IHNV分离株构建的核酸疫苗对其他地区的IHNV分离株的交叉保护效果。
本发明的一个方面提供了一种中国传染性造血器官坏死病核酸疫苗的制备方法，其包括以下步骤：(1)设计扩增J基因型传染性造血器官坏死病毒(IHNV)表面糖蛋白G基因的特异性引物F1和F2；
其中
(2)扩增IHNV病毒分离株HLJ-15、LN-15、GS-15、XJ-15、YN-15，然后提取病毒基因组RNA；
(3)采用步骤(1)所得引物对步骤(2)所得的病毒基因组RNA进行RT-PCR扩增，将RT-PCR扩增产物经电泳后回收产物；
(4)将步骤(3)所得的回收产物与pMD19-T simple载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落扩大培养后提取质粒并进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒进行测序；
(5)将步骤(4)鉴定正确的IHNV病毒分离株糖蛋白G基因利用BamH I和Xho I酶切位点克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，构建核酸疫苗pHLJ-15、pLN-15、pGS-12、pXJ-15和pYN-15。
其中，IHNV病毒分离株HLJ-15保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCV201622，保藏日为2016年4月15日。进一步地，其中步骤(2)中扩增步骤为将IHNV病毒分离株(HLJ-15、LN-15、GS-15、XJ-15、YN-15)悬液用细胞维持液(所述细胞维持液为含有2％FBS的MEM培养基)稀释成10-5，取1ml接种于汇合的单层EPC细胞，于15℃孵育1h，弃去病毒悬液，加入5ml细胞维持液于细胞培养瓶内，于15℃培养；当80％左右的细胞出现细胞病变时，收集病毒悬液保存于-80℃冰箱。
本发明的再一个方面提供了一种前述制备方法获得的中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗。
本发明的再一个方面提供了一种中国虹鳟传染性造血器官坏死病保护性抗原基因，其序列为SEQ ID No.3。
本发明的再一个方面提供了一种权利要求1所述基因的扩增引物组合物，其序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
本发明的再一个方面提供了中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗在预防水产动物的中国虹鳟传染性造血器官坏死病的药物中的用途。
其中所述的中国虹鳟传染性造血器官坏死病是指由J基因型虹鳟传染性造血器官坏死病毒株HLJ-15、LN-15、GS-15、XJ-15、YN-15中的一项或多项病毒引起的中国传染性造血器官坏死病。
附图说明
图1为IHNV分离株G蛋白基因的PCR扩增，其中1：HLJ-15，2：LN-15，3：GS-15，4：XJ-15，5：YN-15，M：DL2000DNA marker。
图2为含有G蛋白基因片段的T载体的PCR鉴定，其中1：HLJ-15，2：LN-15，3：GS-15，4：XJ-15，5：YN-15，NC：阴性对照，M：DL2000DNA marker。
图3为含有G蛋白基因片段的pcDNA3.1阳性重组载体的PCR鉴定，其中1：HLJ-15，2：LN-15，3：GS-15，4：XJ-15，5：YN-15，M：DL2000DNA marker，NC：阴性对照。
具体实施方式
实验材料与试剂
SV Total RNA Isolation System购自Promega；PrimeScriptTMOne Step RT-PCRKit Ver2.0试剂盒、pMD19-T simple载体、DNA Marker、One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit II(Perfect Real Time)试剂盒、限制性内切酶购自大连宝生物公司；IHNV分离株保藏于中国典型培养物保藏中心：HLJ-15(CCTCC no.V201622)、LN-15(CCTCC no.GDV127)、GS-15(CCTCC no.GDV 128)、XJ-15(CCTCC no.GDV129)、YN-15(CCTCCno.GDV130)、真核表达载体pcDNA3.1为市售产品。EPC细胞(购自美国典型培养物保藏中心， Number：CRL-2872)。
实施例1引物设计与合成
根据GenBank收录的IHNV糖蛋白(glycoprotein,G)的多条基因序列进行比对，选取表面糖蛋白G基因特异性保守区段，利用Prime primer 5.0软件设计用于扩增J基因型IHNV的糖蛋白G基因，序列见表1，引物由哈尔滨博仕生物公司合成。
表1用于扩增J基因型的IHNV糖蛋白G基因的引物序列
扩增获得的序列为中国虹鳟传染性造血器官坏死病保护性抗原基因，如SEQ IDNo.3所示：
TTGAGACCGAACGCAACTCGCAGAGACCCACCGAAACA
ATGGACGCCATGATCACCACTCCGCTCATTCTCATTCTAATCACCTGTGGAGCAAACAGCCAAACAGTCCCCCCCGACACCGCAAGCGAATCAGACCAACCCACCTGGTCAAACCCGCTCTTCACCTACCCCGAGGGATGCACTCTGGACAAACTCTCCAAGGTCAATGCTTCTCAACTGAGATGCCCAAGGATCTTCGATGATGAGAACAGGGGGCTAATTTCTTATCCCGCCTCCATCCGGTCCCTGATGGTCGGAAACGACCTCGGGGCGATTCACACCCAAGGGAACTACATCCACAAAGTCCTGTACCGCACCATCTGCTCAACAGGGTTCTTCGGGGGTCAGACGATAGAGAAGGTGCTTGTAGAAATGAAACTCTCAACGAGAGAAGCAGGGTCATATGACACCACAACCGCGGCCGCTCTGTACTTCCCAGCTCCCCGATGCCAATGGTACACCGACAACGTACAAAATGATCTCATCTTCTACTACACAACCCAAAAGAGTGTTCTGAGAGATCCCTACACCAGAGACTTTCTGGACTCAGATTTTGTTGGAGGAAAATGCACTAAATCACCCTGTCAGACTCATTGGTCCAACGTAGTTTGGATTGGTGATGCAGAGATACCAGCCTGTGACGCCAGCCCAGAAATAAACGGTCACCTCTTTGTTGATAGAATCTCCAGTCGAGCCGTGAAGGCAACGAGCTACGGACACCACCCCTGGGGACTGCATCGGGCCTGTATGATTGAATTCTGTGGGGGGCAGTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTGGTATCTGTAGGATACAATTCTGGAGCAAAAACCCTCTCTTTCCCGAAGTGTGAGGACAAGACGGTGGGGATGAGGGGAAACTTGGATGACTTTGCCTATCTAGACGACCTGGTGAAGGCCTCAGAGAGCAGAGAGGAATGTCTTGAGGCGCATGCCGAGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCATACCTCCTATCCAAGTTCCGATCTCCACATCCCGGAATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCTATCTATCATGGGATGTGCATGACGGTCGCTGTGGACGAGGTATCCAAGGACAGGACGACGTACAGGGCCCATCACGCCACCAACTTCACTAAATGGGAACGACCCTTTGGAGATGAGTGGGAAGGCTTTCACGGATTGCACGGAAACAACATCACCATTATTCCAGACCTGGAGAAATACGTCGCCCAGTACAAGATGAGCATGATGGAACCGATGAGCATCAAATCCGTACCCCATCCAAGCATCCTGGCCCTCTACAATGAGACAGAAGTATCGGGGATCTCCATCAGGAAATTGGACTCTTTCGACCTTCAATCACTCCACTGGAGTTTCTGGCCCACAATCTCCACACTGGGTGGGATTCCCCTGGTTCTCCTCCTTGCTGTTGCCGCGTGCTGCTGCTGGTCAGGGAGACCTCCCACTCCCTCCGCGCCGCAGAGTATCCCCATGTATCACCTGGCAAACAGGTCCTAA
AGGACCTCAATCTTCACTTCCTCACCACCAGACAG
实施例2病毒的扩增及RNA制备
将病毒分离株IHNV(HLJ-15、LN-15、GS-15、XJ-15、YN-15)病毒悬液用细胞维持液(含有2％FBS的MEM培养基)稀释成10-5病毒悬液，取1ml接种于单层汇合的EPC细胞，于15℃孵育1h，弃去病毒悬液，加入5mL细胞维持液于细胞培养瓶内，于15℃培养。当80％以上细胞出现细胞病变(cytopathic effect，CPE)时，收集细胞培养液(即病毒悬液)。取150μL病毒悬液于无RNA酶的离心管中。12000g离心5min，去除沉淀。按照SV Total RNA IsolationSystem说明书提取病毒基因组RNA。提取后的RNA分装于-80℃备用。
实施例3糖蛋白基因的扩增
按照一步法RT-PCR试剂盒说明书，以G flank F1/F2为引物分别对不同分离株G基因进行扩增。RT-PCR扩增程序：50℃预反应30分钟，94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸90s，循环数30，72℃终延伸10min。RT-PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，回收产物与pMD19-T simple载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落扩大培养后提取质粒并进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒进行测序。
实施例4核酸疫苗的构建及制备
分别将测序获得的各分离株糖蛋白G基因利用BamH I和Xho I酶切位点克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，构建核酸疫苗pHLJ-15、pLN-15、pSD-15、pGS-15、pXJ-15、pYN-15。利用质粒大量提取试剂盒制备上述核酸疫苗。
实施例5核酸疫苗保护效果测定
将1.7±0.5g虹鳟随机分组，每组50尾，暂养水温维持在(14±1)℃的循环水池(60cm×60cm×50cm)中，7d后进行核酸疫苗的注射免疫(注射位置为背鳍基部)，试验前禁食2d。核酸疫苗的免疫剂量按2μg/尾，同时设pcDNA3.1(2μg/尾)阴性对照组及空白对照组(50μL/尾磷酸盐溶液)。于免疫后7、14、21、28天进行攻毒试验。利用养鱼的水将各病毒分离株浓度调整为104PFU/ml，然后将虹鳟分别置于不同病毒株溶液中2h，其间利用氧气泵不间断的充氧，同时控制水温为14±1℃。攻毒试验结束后将各组虹鳟重新置于循环水池内暂养。连续4周内记录各实验组虹鳟发病及死亡情况。该疫苗保护率评价试验为三次独立重复研究的综合结果。
实验结果
本发明利用分离自我国虹鳟主养区的东北、华北、西北及西南地区的IHNV分离株的表面糖蛋白基因构建了核酸疫苗。通过背鳍基部肌肉注射的方式对虹鳟进行免疫。于免疫后的第7、14、21、28天进行保护率检测实验。各疫苗组分别利用前述的所有IHNV分离株进行攻毒试验，通过保护率分析结果确定保护效果最稳定、具有最佳保护率的核酸疫苗株。研究结果表明，在免疫早期(7天)，各组疫苗无论是同源攻毒还是异源攻毒，均具有很好的保护效果，保护率均可达80％以上，而此时同一疫苗的同源攻毒与异源攻毒保护率没有显著差异。该结果说明本研究所构建的核酸疫苗均能够刺激虹鳟产生强烈的非特异性免疫从而保护其免受强毒的攻击；免疫后14天及21天进行攻毒的实验组也观察到相似的结果；在免疫后第28天攻毒，结果显示所有的核酸疫苗对同源病毒的攻击均具有很强大抵抗力，保护率可高达88％以上，而对异源病毒的攻击各核酸疫苗表现出不同程度的交叉保护，其中pHLJ-15疫苗株表现出最优的稳定的交叉保护效果，保护率均在86％以上。其它疫苗株的异源保护率明显低于同源保护率，最低的异源保护率仅为72％。本研究的阴性对照组在不同时间攻毒后，保护率极低(最高为6％)；而空白对照虹鳟一直健康存活，存活率为100％。综上所述，pHLJ-15疫苗株具有高效稳定的保护率，在我国IHN的全面防控方面将会具有巨大的应用价值。
表2核酸疫苗保护率分析结果
备注：本结果为重复、独立的三次试验的综合分析结果
参考文献
Corbeil,S.,LaPatra,S.E.,Anderson,E.D.,Kurath,G.,2000.Nanogramquantities of a DNA vaccine protect rainbow trout fry against heterologousstrains of infectious hematopoietic necrosis virus.Vaccine.18,2817-2824.
Enzmann,P.J.,Kurath,G.,Fichtner,D.,Bergmann,S.M.,2005.Infectioushematopoietic necrosis virus:monophyletic origin of European isolates fromNorth American genogroup M.Diseases of aquatic organisms.66,187-195.
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Penaranda,M.M.,Lapatra,S.E.,Kurath,G.,2011.Specificity of DNAvaccines against the U and M genogroups of infectious hematopoietic necrosisvirus(IHNV)in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss).Fish&shellfishimmunology.31,43-51.

Claims (7)

1.一种中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
(1)设计扩增J基因型传染性造血器官坏死病毒(IHNV)表面糖蛋白G基因的特异性引物F1和F2；
其中
F1 5'TTGAGACCGAACGCAACTCGCAGAG 3'SEQ ID No.1
F2 5'CTGTCTGGTGGTGAGGAAGTGAAGA 3'SEQ ID No.2
(2)扩增IHNV病毒分离株HLJ-15，然后提取病毒基因组RNA；
(3)采用步骤(1)所得引物对步骤(2)所得的病毒基因组RNA利用TAKARA生物公司的onestep RT-PCR kit进行一步法RT-PCR扩增，将RT-PCR扩增产物经电泳后进行产物回收；
(4)将步骤(3)所得的回收产物与pMD19-T simple载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落扩大培养后提取质粒并进行PCR鉴定，将鉴定正确的质粒进行测序；
(5)将步骤(4)鉴定正确的IHNV病毒分离株糖蛋白G基因SEQ ID No.3利用BamH I和XhoI酶切位点克隆到真核表达载体pcDNA3.1上，构建核酸疫苗pHLJ-15；
其中，IHNV病毒分离株HLJ-15的保藏编号为CCTCC No.V201622。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤(2)中扩增步骤为将IHN病毒分离株HLJ-15悬液用细胞维持液稀释成10-5，取1ml该病毒悬液接种于单层汇合的EPC细胞，于15℃孵育1h，弃去病毒悬液，加入5ml上述细胞维持液于细胞培养瓶内，于15℃培养；当80％左右的细胞出现细胞病变时，收集病毒悬液保存于-80℃冰箱，
所述细胞维持液为含有2％FBS的MEM培养基。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法获得的中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗。
4.一种中国虹鳟传染性造血器官坏死病保护性抗原基因在制备中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗中的用途，中国虹鳟传染性造血器官坏死病保护性抗原基因的序列为SEQ ID No.3。
5.一种扩增权利要求1步骤1)中所述的G基因的引物组合物，其序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
6.权利要求3所述的中国虹鳟传染性造血器官坏死病核酸疫苗在制备预防中国虹鳟传染性造血器官坏死病的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述的中国虹鳟传染性造血器官坏死病是指由J基因型传染性造血器官坏死病毒引起的中国虹鳟传染性造血器官坏死病。
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