CN106148404B - 一种人乙型肝炎病毒重组载体及其应用 - Google Patents
一种人乙型肝炎病毒重组载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药及基因工程领域,涉及一种基于人乙型肝炎病毒的重组载体,所涉及得病毒基因组相对于野生型人乙型肝炎病毒缺失了乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的部分或者全部及核心蛋白的部分,并在聚合酶起始密码子前插入有核糖体进入位点。本发明还提供了该重组载体的制备方法及其在靶向肝脏或者肝细胞的基因治疗方面的应用。本发明的人乙型肝炎病毒重组载体支持多种外源序列的插入和基因表达;重组乙肝病毒自身无基因组复制能力,但在提供核心蛋白的情况下重组乙肝病毒基因组可高效复制,并在同时提供核心蛋白和表面蛋白的情况下包装、分泌具有感染性的完整重组乙肝病毒颗粒,表明本发明的重组人乙肝病毒载体作为肝脏特异性的基因导入载体具有良好应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程、基因治疗和生物医药领域,具体涉及一种重组人乙型肝炎病毒载体及其在特异性地靶向肝脏或肝细胞导入外源基因中的应用。
背景技术
文献报道了肝脏疾病如慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、代谢障碍引起的肝病、药物及其它原因引起的中毒性肝病、自身免疫性肝病等是临床常见病,对机体健康危害极大,其中许多疾病尚没有很有效的治疗手段,迫切需要新型治疗方法或药物,而肝脏或肝细胞特异的基因治疗方法在该方面具有潜在的应用价值。
研究显示,先天性或后天性功能基因缺陷,可导致血友病、胰岛素依赖的I型糖尿病等由于血液中特定蛋白质的缺乏而产生的严重疾病。肝脏由于其巨大的肝细胞数量以及与循环血液的密切接触,是通过基因治疗方法治疗此类疾病的理想靶器官,从而使得肝脏或肝细胞特异的基因治疗方法在此类疾病治疗中亦具有广泛的应用前景。
基因治疗最关键、同时也是最困难的问题在于如何将外源基因特异并高效地导入特定组织器官内特定类型的靶细胞,并使其在靶细胞内表达。对肝脏的特异性基因导入尤为困难:由于肝内kupffer(枯否氏)细胞的吞噬作用,用脂质体方法很难有效地将外源基因导入肝实质细胞;而使用常见的重组病毒载体如腺病毒载体、慢病毒载体等将外源基因导入到肝实质细胞的效果也不理想,原因至少可部分归结于这些病毒的感染并不是肝特异性的。人乙型肝炎病毒(HBV)(以下简称乙肝病毒)具有高度的组织和细胞特异性,感染人时仅感染肝脏中的肝实质细胞,因而以HBV为基础、用于肝脏基因治疗的重组病毒载体一直受到关注。
现有技术公开了乙肝病毒具有部分环状双链的DNA基因组,长度约为3.2kb,含有四个不同程度相互重叠开放阅读框架,它们分别是C基因,编码核心蛋白(核心抗原)和分泌的e蛋白(e抗原);S基因,编码大、中和小表面蛋白(表面抗原),大蛋白和中蛋白相比小蛋白,在氨基端分别多preS(由preS1+preS2组成)和preS2;P基因,编码聚合酶;X基因,编码X蛋白。
研究显示,乙肝病毒的感染始于病毒附着在肝细胞上,通过特异性受体的识别,病毒外膜与细胞膜发生融合,病毒核衣壳释放到细胞质中并解聚,病毒基因组转移到细胞核内,在细胞修复酶的作用下形成共价闭合环状DNA(cccDNA),随后,病毒以cccDNA为模板转录产生四种mRNA,分别是3.5kb前基因组RNA(pgRNA)、2.4kb mRNA、2.1kb mRNA和0.8kbmRNA。2.4kb和2.1kb的mRNA指导表面蛋白的翻译,0.8kb mRNA指导X蛋白的翻译,而3.5kbpgRNA除了指导核心蛋白和聚合酶的翻译外,还作为病毒的前基因组RNA在其翻译产生的聚合酶顺式作用下起始反转录;进而前基因组RNA、聚合酶以及新生负链DNA被新产生的核心蛋白包裹形成新的核衣壳,该步骤为基因组复制后续步骤发生的必要前提,在核衣壳中,病毒聚合酶以pgRNA为模板完成反转录并进而以负链DNA为模板合成正链DNA组成子代病毒基因组;最终,核衣壳被表面蛋白包裹,形成成熟的病毒粒子,分泌出细胞,开始新的感染周期。
研究显示,乙肝病毒的聚合酶在病毒DNA的复制中占有核心地位。聚合酶可分为四个结构域,分别为末端蛋白(TP)、间隔区(Spacer或SP)、反转录酶(RT)和核酸酶H(RNaseH)。TP、RT和RNaseH活性在乙肝病毒DNA的复制中都不可缺少,而SP的功能尚不清楚,可能主要起连接TP和RT的作用;不同基因型的乙肝病毒的聚合酶大小稍有差异,差异主要来自SP区的长度。
乙肝病毒的嗜肝性主要体现在感染进入靶细胞和细胞内病毒基因转录调控两个层面上。首先,乙肝病毒高度选择性地感染人肝细胞;其次,乙肝病毒基因的转录受到病毒携带的四个启动子和两个增强子的调控,许多肝细胞特异或富集的转录调控因子参与调节这些元件的活性〔Seeger C and Mason W,2000.Microbiol.Mol.Biol.Rev.64:51-68〕。
乙肝病毒的嗜肝性使其在理论上有可能成为肝脏基因治疗的理想病毒载体。但是,由于乙肝病毒的基因组很小,仅为3.2kb,病毒基因及转录调控区之间高度相互重叠,病毒核衣壳的容量又极为有限(实验证明基因组DNA若大于3.5kb就无法检测到病毒的复制),因此,对乙肝病毒基因组进行人工改造使其能够容纳一定长度的外源基因,且不影响病毒的高效复制就显得非常困难,国际上早期的一些尝试均未能获得成功(Chaisomchit S,Tyrrell D,Chang L,1997.Gene Therapy.4:1330-1340)。中国发明专利《一种高效复制的人乙型肝炎病毒重组载体及其应用》(CN 102643858B,2014.04.02)公开了一种人乙型肝炎病毒重组载体(下文简称5c3c)的设计、构建及应用,该重组基因组特点在于相对于野生型人乙型肝炎病毒基因组,缺失了聚合酶的部分间隔区(A、B、C、F、H基因型的人乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的SP15-SP143的部分或者全部);5c3c的聚合酶间隔区缺失位点处可插入特定的外源序列并仍保持高效的基因组复制能力,以及实现外源基因的表达。但由于5c3c中外源序列的插入位点位于乙型肝炎病毒聚合酶中的间隔区,为不破坏前基因组RNA顺式翻译有功能聚合酶的能力从而保持重组病毒载体的高效复制能力,外源序列的插入不可导致在聚合酶编码序列中引入终止密码子,为此外源序列可能需要进行人工突变。而即使外源序列插入5c3c不导致聚合酶翻译提前终止,由于外源序列插入必然导致聚合酶间隔区出现无关序列,仍有可能影响聚合酶活性并进而导致重组病毒载体复制能力低下。由于上述原因,已公开的5c3c人乙型肝炎病毒重组载体对可插入的外源序列存在一定限制,一定程度上影响了实施应用。另一方面,5c3c载体编码完整的病毒核心蛋白和有功能的病毒聚合酶,无需其它协助即可独立完成从病毒前基因组RNA开始的病毒基因组复制过程,仅在形成完整感染性病毒粒子时需要提供野生型病毒被膜蛋白辅助。对于体内基因治疗应用而言,具备独立复制能力的病毒载体发生不可预见后果的可能性更高,长期安全性较不具备独立复制能力的病毒载体更易受到质疑。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的缺陷,提供一种易用性和安全性得到显著改善的、在肝脏细胞中特异性表达外源基因的重组乙肝病毒载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体在基因治疗中的应用。
本发明基于,利用乙肝病毒的嗜肝性可以将其开发为肝脏特异的重组病毒载体,关键技术是如何在乙肝病毒基因组中寻找合适的外源基因插入位点,同时维持病毒的高效复制。中国发明专利《一种高效复制的人乙型肝炎病毒重组载体及其应用》(CN 102643858B,2014.04.02)公开的5c3c重组病毒载体中外源序列的插入位点位于乙型肝炎病毒聚合酶间隔区,对可插入的外源序列存在特定限制;此外由于5c3c载体编码完整的病毒核心蛋白和有功能的病毒聚合酶,可独立进行病毒基因组复制,长期安全性存疑。在本发明中,以5c3c为基础,对病毒核心蛋白做最大缺失以造成重组病毒载体无法独立进行基因组复制,缺失位点并可用于外源序列插入;同时,为减少上游序列变化对病毒聚合酶翻译的影响,在病毒聚合酶起始密码子前插入核糖体进入位点(IRES)序列。本发明对在5c3c载体核心蛋白编码序列中引入缺失、进而在缺失部位插入外源序列后病毒基因组的复制能力、复制条件以及外源基因的表达进行了详尽研究,研究结果显示,删除5c3c载体核心蛋白编码序列中第109-406位核苷酸导致重组病毒载体基因组完全失去独立复制能力,但在反式提供以野生型病毒核心蛋白时,重组病毒载体基因组能够高效复制,而在病毒聚合酶起始密码子之前引入IRES序列可进一步提高复制效率;在核心蛋白缺失部位处直接插入多种序列未经修改的外源基因,所获得的重组病毒载体仍具有在反式提供有野生型病毒核心蛋白时高效复制的能力,并且插入的外源基因也能有效表达,显示该重组病毒基因组具有作为重组乙肝病毒载体的良好性质。
本发明一方面提供了一种基于人乙型肝炎病毒的重组载体,所述病毒基因组相对于已公开的5c3c载体,缺失核心蛋白的部分并在聚合酶起始密码子之前插入IRES序列。
具体而言,所述病毒基因组含有以下的结构之一:
附图1和图2中所示的结构及所示部位的缺失,缺失范围位于人乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区(SP区域)和核心蛋白区,同时在病毒聚合酶起始密码子ATG前插有IRES序列;
含有附图1和图2中所示的结构及所示部位的缺失,缺失范围包括所示缺失部位全部或者部分的任意缺失,同时在病毒聚合酶起始密码子ATG前插有IRES序列;
在(a)(b)所述结构中的所示缺失部位插入了任意外源序列的结构。
目前已知人乙肝病毒有8个基因型(A-H);各基因型聚合酶的RT和RNaseH区大小完全相同,而TP和SP区大小稍有区别,国际标准将各结构域分别计数。具体就SP而言:A、B、C、F、H基因型为169个残基,E、G基因型为168个残基,D基因型为158个残基。按照国际标准计数规则,以A、B、C、F、H基因型的169残基大小为基准,所述的聚合酶缺失是A、B、C、F、H基因型的乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的SP15-SP143的部分或者全部。对于核心蛋白,B、C、D、E、F、H基因型有552bp(184aa),A基因型有558bp(186aa),G基因型有585bp(195aa)。按照国际标准计数规则,所述的核心蛋白缺失相当于基因型A、B、C、F、H的第109至406位核苷酸的部分或者全部。
本发明的重组载体的制备方法包括:去除乙型肝炎病毒聚合酶间隔区和核心蛋白上述区段的部分或者全部;例如,扩增获得不含有乙型肝炎病毒聚合酶间隔区和核心蛋白上述区段的部分或者全部的乙肝病毒载体序列,然后依次拼接。
本发明还提供了一种构建物,所述构建物可转录出上述重组人乙肝病毒载体的前基因组RNA。
另一方面,本发明提供了一种细胞,该细胞含有上述的重组人乙肝病毒载体或上述的构建物。
利用本发明提供的重组人乙肝病毒载体、构建物或细胞可以制备得到不具备自主复制能力,但在反式提供野生型乙肝病毒核心蛋白的条件下高效复制其基因组,在进一步反式提供野生型乙肝病毒被膜蛋白时包装形成完整感染性病毒粒子,并可在感染细胞中表达外源基因的重组乙肝病毒。
由于反式提供的乙肝病毒核心蛋白和被膜蛋白均为野生型乙肝病毒蛋白,上述重组乙肝病毒粒子与天然乙肝病毒结构成分完全相同,仅内含的基因组缺失了乙肝病毒聚合酶间隔区的SP15-SP143和核心蛋白第109-406位核苷酸的部分或者全部序列。所述缺失序列均位于乙肝病毒调控区(启动子、增强子)以及前基因组RNA包装信号等重要元件之外,相应区段的缺失对乙肝病毒感染肝细胞和在肝细胞内特异地基因转录都没有影响〔Seeger Cand Mason W,2000.Microbiol.Mol.Biol.Rev.64:51-68〕。此外由于缺少核心蛋白,该重组乙肝病毒在不表达野生型乙肝病毒核心蛋白或被膜蛋白的肝细胞内,不能自主进行病毒基因组的复制。因此,该重组乙肝病毒颗粒在具备此前公开的5c3c载体的肝脏或肝细胞特异性的基因导入能力的基础上,提高了安全性。
例如,将外源基因与本发明的重组乙肝病毒载体或者所述的构建物连接,并转入肝细胞。本发明的重组乙肝病毒载体可以在核心蛋白缺失区、即IRES序列上游插入外源序列,除乙肝病毒基因组长度限制外,对插入外源序列的其它性质没有特殊限制。而此前公开的5c3c载体由于外源序列插入位点位于病毒聚合酶间隔区,除乙肝病毒基因组长度限制外,插入序列还不可在聚合酶编码序列中引入终止密码子导致聚合酶编码序列提前终止,从而对外源基因的选择造成了限制。因此,本发明的重组乙肝病毒载体在具备此前公开的5c3c载体的基础上,还提高了易用性。
同时,本发明提供了一种用于肝脏靶向的基因治疗药物,所述药物包含上述的重组载体或构建物。所述药物可以是外源基因编码序列与本发明的重组载体或构建物连接构成。
本发明中,术语“缺失”指的是本发明所述的重组人乙肝病毒载体,其基因组与野生型乙肝病毒基因组相比较,缺少特定序列,而缺少序列的具体位置,如附图1和图2所示。
本发明另一方面还涉及含有上述重组人乙肝病毒载体基因组的构建物,所述构建物可以是DNA形式或RNA形式。
本发明的重组人乙肝病毒载体基因组通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的重组乙肝病毒载体基因组结构以及公共数据库中的野生型或突变株乙肝病毒基因组序列设计引物,扩增而得有关序列。当序列较长时,通常可通过重叠扩增,例如进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其插入克隆载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
上述的“克隆载体”指本领域熟知的原核或真核表达质粒。“克隆载体”包含一个或多个选择性标记基因,以用于选择转化或转染的宿主细胞的表型,如真核细胞使用的新霉素抗性,大肠杆菌使用的四环素或氨苄青霉素抗性等。
在本发明中,使用本领域的技术人员熟知的方法将包含本发明的重组人乙肝病毒载体基因组插入到克隆载体中。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、体内重组技术等(Sambrook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory.New York,1989)。
本文所指的“构建物”是指包含本发明的重组人乙肝病毒载体基因组以及指导其转录起始、翻译起始、转录终止和翻译终止的调控序列的表达质粒。
上述表达质粒可用于转染适当的真核细胞,以使其能够转录出本发明的重组人乙肝病毒载体基因组中含有的病毒基因特别是前基因组RNA。宿主细胞如哺乳动物HuH7、HepG2细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于:磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体介导等。
本发明的重组人乙肝病毒载体可在细胞内表达并分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种方法分离和纯化表达产物。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:密度梯度离心、PEG沉淀等。
本发明还涉及上述重组人乙肝病毒载体、构建物或细胞在制备基因治疗药物中的用途,包括但不限于将其与药学上可接受的物质混合包括糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;磷酸盐缓冲液等。
附图说明
图1和图2显示重组乙肝病毒载体基因组中相对于野生型乙肝病毒基因组的缺失部位,
图1中,上图为野生型乙肝病毒基因组的示意图,本发明重组乙肝病毒载体相对于野生型乙肝病毒基因组在聚合酶间隔区(中图)以及核心蛋白编码区(下图)的缺失部位分别以扇形框标示;
图2显示缺失部位的具体位置;目前已知人乙肝病毒有8个基因型(A-H),各基因型聚合酶的RT和RNaseH区大小完全相同,而TP和SP区大小稍有区别,国际标准将各结构域分别计数,具体就SP而言:A、B、C、F、H基因型为169个残基,E、G基因型为168个残基,D基因型为158个残基;按照国际标准计数规则,以A、B、C、F、H基因型的169残基大小为基准,所述的聚合酶缺失是A、B、C、F、H基因型的乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的SP15-SP143的部分或者全部(上图);对于核心蛋白,B、C、D、E、F、H基因型有552bp(184aa),A基因型有558bp(186aa),G基因型有585bp(195aa);按照国际标准计数规则,所述的核心蛋白缺失相当于基因型A、B、C、F、H的第109至406位核苷酸的部分或者全部(下图)。
图3为实施例中使用的各种构建物的结构示意图,其中,WT:约1.1拷贝的野生型HBV基因组装配到CMV启动子下游,由后者驱动病毒前基因组RNA转录并进而作为复制模板进行子代病毒基因组复制;5c3c:中国发明专利《一种高效复制的人乙型肝炎病毒重组载体及其应用》(CN 102643858B,2014.04.02)公开的重组人乙肝病毒载体的基因组结构,病毒聚合酶间隔区缺失部位(SP15-SP143)采用折线标出;5c3c-ΔC:在5c3c基础上,在核心蛋白中引入第109至406位核苷酸缺失,缺失部位用空白缺口表示;5c3c-ΔC-Gtx IRES(5dCG):在5c3c-ΔC基础上,在核心蛋白缺失部位、聚合酶起始密码子上游插入Gtx IRES序列(Chappell,S.A.,et al.2000.Proc Natl Acad Sci U S A 97:1536-1541),得到本发明的重组人乙肝病毒载体的基因组结构,IRES以斜线填充方框表示;5dCG-ZeoR:5dCG中插入博来霉素抗性蛋白基因ZeoR;5dCG-NLuc:5dCG中插入荧光素酶NanoLuc(Promega)蛋白基因NLuc;5dCG-sNLuc:5dCG中插入分泌型NanoLuc蛋白基因sNLuc;5dCG-DsRed:5dCG中插入红色荧光蛋白基因DsRed;5dCG-EGFP:5dCG中插入插入绿色荧光蛋白基因EGFP;pC:用于反式提供野生型乙肝病毒核心蛋白的质粒示意图;pLMS:用于反式提供野生型乙肝病毒表面蛋白的质粒示意图。
图4为本发明重组人乙肝病毒载体的复制条件及复制效率研究结果,其中,5c3c、5c3c-ΔC与5dCG分别单独转染或者与表达野生型乙肝病毒核心蛋白的辅助质粒pC共同转染培养肝癌细胞株Huh7,以核酸杂交方法检测胞内病毒复制中间体。
图5为本发明重组人乙肝病毒载体插入外源序列后的复制情况,其中,
Patient serum:由病人血清抽提得到的人乙肝病毒的基因组核酸,用作marker;WT:用CMV启动子启动的1.1拷贝野生型人乙肝病毒的复制情况;5c3c:中国发明专利《一种高效复制的人乙型肝炎病毒重组载体及其应用》(CN 102643858B,2014.04.02)公开的重组人乙肝病毒载体的复制情况;5dCG:本发明重组人乙肝病毒载体的复制情况;5dCG-ZeoR:5dCG插入外源基因ZeoR后重组乙肝病毒的复制情况;5dCG-NLuc:5dCG插入外源基因NLuc后重组乙肝病毒的复制情况;5dCG-sNLuc:5dCG插入外源基因sNLuc后重组乙肝病毒的复制情况;5dCG-DsRed:5dCG插入外源基因DsRed后重组乙肝病毒的复制情况;5dCG-EGFP:5dCG插入外源基因EGFP后重组乙肝病毒的复制情况;除病人血清样品外,所有复制实验均在培养肝癌细胞株Huh7中实施,其中除WT和5c3c外,5dCG及5dCG插入外源基因的构建物均同时共转染表达野生型乙肝病毒核心蛋白的辅助质粒pC。
图6和图7为外源基因的表达情况,其中,
图6显示了本发明重组人乙肝病毒载体5dCG载体中插有有外源基因NLuc和sNLuc的重组乙肝病毒基因组的构建物转染Huh7细胞后,无论是否有表达野生型乙肝病毒核心蛋白的辅助质粒pC共同转染,细胞裂解液(Intracellular)和细胞培养液(Supernatant)里均可检测到显著的荧光素酶表达(以Promega公司NanoLuc检测试剂盒检测);pNL-blank:阴性对照质粒pNL-blank与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;pNL-sNLuc:分泌型NanoLuc阳性对照质粒(Promega)pNL-sNLuc与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;5dCG:5dCG转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;5dCG+pC:5dCG与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;5dCG-NLuc:5dCG-NLuc转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;5dCG-NLuc+pC:5dCG-NLuc与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;5dCG-sNLuc:5dCG-sNLuc转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;5dCG-sNLuc+pC:5dCG-sNLuc与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞裂解液和细胞培养液里的荧光素酶表达情况;
图7显示了携带有外源基因Ds-Red或EGFP的重组乙肝病毒载体5dCG构建物转染Huh7细胞后红色(Ds-Red)或绿色(EGFP)荧光蛋白的表达情况,明场视野(Bright Field)为对照;5dCG:5dCG转染Huh7细胞后,细胞红、绿荧光蛋白的表达情况;5dCG+pC:5dCG与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞红、绿荧光蛋白的表达情况;5dCG-EGFP:5dCG-EGFP转染Huh7细胞后,细胞红、绿荧光蛋白的表达情况;5dCG-EGFP+pC:5dCG-EGFP与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞红、绿荧光蛋白的表达情况;5dCG-DsRed:5dCG-DsRed转染Huh7细胞后,细胞红、绿荧光蛋白的表达情况;5dCG-DsRed+pC:5dCG-DsRed与pC质粒共同转染Huh7细胞后,细胞红、绿荧光蛋白的表达情况。
图8:为细胞内及培养基中的重组乙肝病毒,其中,通过用PreS1的抗体做pull-down实验,证明本发明的重组乙肝病毒载体5dCG以及5dCG插入外源基因NLuc和sNLuc的重组乙肝病毒构建物5dCG-NLuc和5dCG-sNLuc,不仅均能在反式提供野生型乙肝病毒核心蛋白(pC质粒共转)的情况下,完成基因组复制,而且均能在反式提供野生型乙肝病毒表面蛋白(pLMS质粒共转)的情况下,包装出完整病毒颗粒并分泌至转染细胞上清中;野生型人乙肝病毒质粒(WT)、5c3c载体质粒单独或与pLMS共转分别作为对照。Intracellular capsid-associated HBV DNA:转染细胞内核心颗粒包裹的乙肝病毒基因组复制中间体;Supernatant HBV DNA:转染细胞培养上清中总病毒核酸;Supernatant HBV DNA anti-PreS1pulldown:利用PreS1抗体pulldown上清中的成熟病毒粒子抽提其中病毒基因组。
具体实施方式
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述,本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述:例如,Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989);《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑,1985);《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑,1984);《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,1984);《蛋白质纯化:原理和实践》第2版(Springer-Verlag,N.Y.),以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑,1986)。或者,可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1:重组人乙肝病毒载体的复制条件与复制能力
下面以含1.1拷贝的重组人乙肝病毒载体基因组的表达质粒5dCG(图3)为例说明本发明中重组病毒载体的构建方法。首先以中国发明专利《一种高效复制的人乙型肝炎病毒重组载体及其应用》(CN 102643858B,2014.04.02)公开的重组人乙肝病毒载体构建物,含有1.1拷贝的、聚合酶间隔区有384bp缺失的乙肝病毒基因组的质粒5c3c(图3)为模板,通过反向PCR扩增得到缺失核心蛋白基因第109-406位核苷酸的含1.1拷贝的重组人乙肝病毒载体基因组质粒5c3c-ΔC,接着通过PCR的方法扩增出Gtx IRES核糖体进入位点序列(Chappell,S.A.,et al.2000.Proc Natl Acad Sci U S A 97:1536-1541)插入5c3c-ΔC中聚合酶起始密码子上游位置,得到含1.1拷贝的本发明重组人乙肝病毒载体基因组质粒5c3c-ΔC-Gtx IRES(5dCG)。
5c3c、5c3c-ΔC及5dCG分别与空质粒对照或表达野生型乙肝病毒核心蛋白的辅助质粒pC共转染肝癌细胞株Huh7细胞,转染96小时后,收获并破碎细胞,经DNA酶消化,蛋白酶K消化,酚氯仿抽提,乙醇沉淀后,southern blot方法检测胞内病毒复制中间体以研究不同载体的复制条件与复制水平。如附图4所示,5c3c载体由于自身表达野生型乙肝病毒核心蛋白,无论是否共转pC辅助质粒,均能有效复制其基因组;而5c3c-ΔC及5dCG由于自身缺失表达野生型乙肝病毒核心蛋白的能力,在无pC辅助质粒共转时,没有基因组复制能力,仅当有pC质粒共转提供核心蛋白时可以进行基因组复制;然而考察三个构建物的复制效率可知,5c3c-ΔC及5dCG在共转pC辅助质粒条件下复制强于5c3c,而其中5dCG又强于5c3c-ΔC。
实施例2:重组人乙肝病毒的复制能力
含1.1拷贝的重组人乙肝病毒载体基因组的质粒5dCG,在病毒核心蛋白缺失部位插入了未经修改的ZeoR、NLuc、sNLuc、DsRed及EGFP蛋白编码序列后得到重组病毒质粒5dCG-ZeoR、5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc、5dCG-DsRed及5dCG-EGFP,上述质粒与载体质粒5dCG分别与表达野生型乙肝病毒核心蛋白的辅助质粒pC共同转染肝癌细胞株Huh7细胞,转染96小时后,收获并破碎细胞,经DNA酶消化,蛋白酶K消化,酚氯仿抽提,乙醇沉淀后,southernblot方法检测胞内病毒复制中间体。作为对照,CMV启动子驱动的1.1拷贝野生型人乙肝病毒质粒WT及CMV启动子驱动的1.1拷贝5c3c重组病毒质粒亦分别转染Huh7细胞后同样抽提胞内复制中间体检测。同时以人乙肝病毒感染病人血清中抽提得到的病毒基因组为分子量对照。如附图5所示,本发明的重组人乙肝病毒载体5dCG插入从375bp(ZeoR)到747bp的(Ds-Red)的外源基因编码序列后得到的重组乙肝病毒,在反式提供野生型病毒核心蛋白时都能高效复制,复制效率虽略有差异,但均接近或高于野生型病毒基因组(WT)的复制水平。
实施例3:重组人乙肝病毒有效表达外源基因
以本发明的重组人乙肝病毒载体质粒5dCG和在其基础上携带有NLuc、sNLuc基因的重组乙肝病毒质粒5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc分别转染肝癌细胞株Huh7细胞,或者与表达野生型病毒核心蛋白的辅助质粒pC共同转染肝癌细胞株Huh7细胞,转染后48h分别收集细胞上清和细胞,检测荧光素酶的表达情况,并用生产厂商提供的阳性对照质粒pNL-sNLuc和相应去除sNLuc编码序列的隐形对照质粒pNL-blank分别转染肝癌细胞株Huh7细胞,作为阴性对照和阳性对照。结果如附图5所示,无论有无共同转染辅助质粒pC,5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc中的NLuc和sNLuc蛋白均可以有效的表达。此外,以本发明的重组人乙肝病毒载体质粒5dCG和在其基础上携带有红色和绿色荧光蛋白基因的重组乙肝病毒质粒5dCG-DsRed及5dCG-EGFP分别转染肝癌细胞株Huh7细胞,或者与表达野生型病毒核心蛋白的辅助质粒pC共同转染肝癌细胞株Huh7细胞,转染后48h用荧光显微镜观察,并用5dCG做阴性对照。结果如如附图6所示,无论有无共同转染辅助质粒pC,本发明的重组乙肝病毒载体5dCG携带的外源基因编码的红色和绿色荧光蛋白均可以有效表达。
实施例4:检测重组病毒颗粒的完整性
本发明的重组人乙肝病毒载体5dCG质粒及5dCG中插入NLuc和sNLuc编码序列的重组乙肝病毒质粒5dCG-NLuc、5dCG-sNLuc与乙肝病毒表面蛋白表达质粒pLMS及核心蛋白表达质粒pC共同转染肝癌细胞株Huh7细胞,转染后72h收集细胞上清,用抗PreS1(位于大表面蛋白的氨基端)的抗体做pulldown实验,并利用核酸杂交的方法检测是否有包含病毒基因组DNA的成熟病毒粒子被pulldown。5dCG、5dCG-NLuc和5dCG-sNLuc单独转染的细胞上清作为对照,用转染野生型乙肝病毒质粒WT、以及5c3c载体单独或与pLMS共转的细胞上清作为另一组对照。如附图8所示,在有pC质粒共转条件下,5dCG及其携带外源序列的衍生构建物不论是否与pLMS共转,重组病毒基因组均能复制,但只有在反式提供表面蛋白的情况下,才能形成并分泌可以被PreS1抗体pulldown的完整病毒颗粒。5c3c载体基因组复制不需要共转pC质粒,但完整病毒粒子形成与分泌同样依赖于pLMS质粒反式提供表面蛋白。野生型病毒质粒则可以独立完成基因组复制和完整病毒粒子形成与分泌。
实验结果表明,本发明的重组人乙肝病毒载体能使插入的外源基因表达,对插入序列特征无特殊要求,重组乙肝病毒基因组当且仅当存在野生型核心蛋白辅助时可高效复制,并当且仅当同时还存在野生型表面蛋白辅助的情况下,有效形成并分泌完整的重组乙肝病毒颗粒,相对于已公开的重组人乙肝病毒载体5c3c显著提高了易用性和安全性,表明本发明的重组人乙肝病毒载体作为肝脏特异性的基因导入载体具有良好应用前景。
Claims (7)
1.一种基于人乙型肝炎病毒的重组载体,包含人乙型肝炎病毒的重组基因组,所述重组基因组相对于野生型人乙型肝炎病毒基因组,缺失聚合酶的部分间隔区,所述缺失是A、B、C、F、H基因型聚合酶的间隔区的SP15-SP143的部分或者全部,其特征在于:所述人乙型肝炎病毒的重组基因组同时还缺失核心蛋白,所述缺失是基因型A、B、C、F、H核心蛋白基因的第109至406位核苷酸的部分或全部;此外,所述人乙型肝炎病毒的重组基因组在上述病毒核心蛋白缺失部位下游、聚合酶起始密码子上游位置,插入有核糖体进入位点序列。
2.一种构建物,所述的构建物是DNA,其包含权利要求1所述的重组载体和与之可操作连接的转录控制元件,其特征在于,所述的构建物转录后获得权利要求1所述的重组载体的前基因组RNA。
3.一种细胞,其特征在于,所述细胞含有权利要求1所述的重组载体或权利要求2所述的构建物。
4.权利要求1所述的重组载体的制备方法,其特征在于,其包括,去除权利要求1所述的人乙型肝炎病毒核心蛋白区段的部分或者全部,扩增或者化学合成核糖体进入位点序列,去除权利要求1所述的人乙型肝炎病毒聚合酶的间隔区的部分或全部,然后依次拼接获得权利要求1所述的重组载体。
5.权利要求1所述的重组载体或权利要求2所述的构建物在制备肝脏及肝细胞特异性的基因导入载体中的应用。
6.一种肝脏靶向的基因治疗药物,其特征在于,所述药物包含权利要求1所述的重组载体或权利要求2所述的构建物。
7.如权利要求6所述的基因治疗药物,其特征在于,所述药物是外源序列与权利要求1所述的载体或权利要求2所述的构建物连接构成。
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