CN1086421C - 丙型肝炎病毒复合多价疫苗基因的合成与克隆 - Google Patents

Abstract

本发明是一种丙型肝炎病毒(HCV)复合多价疫苗基因。丙型肝炎是国际上研究的热点之一，但由于HCV的高度变异性，目前尚无有效的HCV候选疫苗。本发明从HCV表达产物中优选了5个高度保守的T/B细胞表位，与一个破伤风类毒素(TT)外源刺激T细胞表位及一个原核翻译增强子组合成一段270bp的复合多价抗原基因，为高效表达该疫苗基因并诱发有效的免疫应答建立了基础。

Description

丙型肝炎病毒复合多价疫苗基因的合成与克隆

本研究属于分子生物学领域。

丙型肝炎是目前国际上研究的热点之一。自1988年非甲非乙型肝炎病毒被命名为丙型肝炎病毒，有关丙肝的病理、诊断、治疗、预防以及丙肝病毒的分子生物学方面的研究迅速开展起来，并取得了一系列突飞猛进的进展。在一些国家，目前丙型肝炎的感染率较高，但却无确实可行的治疗手段，因此丙肝疫苗的研究为丙型肝炎的防治带来了希望。

约80％的非甲非乙型肝炎为丙型肝炎病毒(HCV)所致，其中又有60％丙型肝炎呈慢性化，且容易发生肝硬化，并与肝细胞癌关系密切，可见HCV危害很大。丙型肝炎病毒为单股正链RNA病毒，由约9400个核苷酸组成，外披包膜，脂质含量高。分类学上HCV属披膜病毒科中的黄病毒属，基因结构与黄病毒、瘟疫病毒相似。从进化上分析，HCV可能为一类重组病毒，其C′端氨基酸源于披膜病毒甲科，N端来自小核糖核酸病毒科。HCV整个基因组只有一个ORF，编码一条3010、3011或3033个氨基酸残基的蛋白前体，病毒多肽就起始于它的第一个蛋氨酸。ORF内从5′端起依次为C区(核心)、E1区(衣壳)、非结构蛋白区(NS)按5′-3′并列者NS1-NS5五个基因。NS1又称E2区或E2/NS1区，该区N端存在由25或30个氨基酸组成的超变区(HVR)。长期以来，对HCV的治疗一直没有理想的办法，因此丙型肝炎疫苗的研制就显得十分重要，但由于多种因素的制约，HCV疫苗的研制现还没有突性的进展。

自1988年Houghton等首次分离并克隆了HCV的部分序列后，人们对HCV才有了更深入的了解。1991年， Farci等希望通过完整的HCV病毒免疫来获得特异性保护，但结果提示该方法不能提供对HCV有效的保护力(Farci P et al。Hepatitis，1991；14：90A)。Spaete等在CHO细胞中表达了E2/NS1蛋白，并与一种佐剂免疫7只大猩猩，再用HCV株攻击，其中有2只获得保护，而对照组则全部感染了HCV，提示该蛋白可能是免疫应答的一种靶部位，可作为HCV疫苗的候选抗原(Richard RS et al。Virology，1992；188：819)。随后，Choo等用重组痘苗病毒表达了HCV的E1及E2蛋白，并把这两种蛋白分别免疫7只黑猩猩，结果其中5只产生了抗HCV-E抗体的滴度超过1∶15000，且对同株HCV的攻击具有良好的保护性，另两只滴度较低，短暂感染上HCV，提示所产生的抗HCV-E抗体可能为中和抗体，但是否具有交叉保护性或长期免疫力等还需继续观察(Choo QL et al。Proc Natl Acad Sci USA，1994；91：1294)。

在中国，HCV疫苗的研究则主要采用PCR技术，获得目的基因后进行表达及免疫原性的研究。中国已先后有人进行了HCV重组蛋白的初步尝试。北京中国药品生物制品检定所的张庶民等用融合蛋白表达质粒pGex，在大肠杆菌中表达了HCV核心区不同基因片段，用免疫印染和ELISA证明了HCV核心蛋白的抗原性。同所的祁自柏等也在大肠杆菌中表达了HCV的部分非结构NS4基因，并在国内首次用DNA重组法表达了HCV部分NS4-NS5基因，经分子杂交分析，表达产物可特异地与抗HCV非结构区抗体反应。第三军医大学附属西南医院传染病专科中心沈定霞等将HCV外膜E2/NS1基因克隆至融合型表达载体，在大肠杆菌中进行表达，表达的重组蛋白经Western Blot和ELISA鉴定具有HCV外膜蛋白的抗原性，能与丙肝病毒感染血清发生特异性结合反应，为研究外膜蛋白抗体的意义创造了条件。由于HCV包膜糖蛋白的基因结构及疏水图谱与黄病毒、瘟病毒的包膜蛋白非常相似，而黄病毒NS1蛋白和瘟病毒gp53/gp55已证实可刺激机体产生中和抗体，保护机体不受病毒致死性攻击的作用。

但采用PCR技术获得目的表达产物的手段，对迅速变异的HCV则可能无法提供有效的保护，其主要问题在于：

(1)HCV高度变异：与HBV不同的是，HCV病毒株极易变异，现已在世界各地测定了数十株HCV全基因序列和更多的HCV RNA克隆片段。HCV核酸和氨基酸高度易变，核酸序列的同源性仅60％-92％，因此HCV存在有许多不同的型和亚型。一般认为一种病毒不同病毒体之间核酸序列的同源性如小于80％则分属不同的基因型。依此原则，目前世界各地克隆的HCV毒株大致分为4个主要基因型(HCV I，II，III，IV)，各型间的氨基酸及核苷酸组成相似性小于80％，且几乎很难见到两个完全相同的克隆。

不同型HCV有一定的地区分布特征，欧美国家流行HCVI，日本HCVI-IV型均有但以HCVII型为主，中国以及南朝鲜的毒株亦属于II型。HCV RNA的突变率是原核和真核DNA复制突变率的1 000 000倍，使得各地分离的HCV毒株，甚至从同一患者体内分离的HCV克隆间核酸同源性都有一定甚至很大的差异，表现为HCV的高度异质性。其基因组中5′非编码区、C、NS3和NS5基因变异较小，而E2/NS1基因尤其是E2的HV区变异非常大。这提示有某种特殊的机理维持HCV重要功能基因的相对稳定，同时又保持某些基因区的高度突变率，以满足生存和进化的需要。RNA病毒为适应环境和逃脱宿主的免疫清除而易发生突变，逐渐形成了新的HCV突变株并各自独立演化。HCV重要功能基因的相对稳定和某些基因的相对易变，使HCV表现为高度易变，但又能区分为一定型和许多亚型，这也是HCV分型的机理。各型HCV毒株间核酸和病毒蛋白变异性很大，尤其是E2/NS1基因区及其编码产物变异更大。Weiner发现E2HV区有类似于HIV-1gp120蛋白中的线性中和抗原决定簇，而且不同型或亚型甚至不同的HCV克隆的中和抗原决定簇也不完全相同。HCV的高度易变性是丙型肝炎慢性化和病情反复发作的重要原因，不同型HCV的毒力以及对抗病毒治疗的反应有所差别。因此，这就要求构建的丙型肝炎疫苗应包括各种不同型和亚型的HCV毒株。此外，由于HCV型和亚型很多也意味着很可能没有一种丙型肝炎疫苗可以在全世界通用，根据各地流行的HCV毒株来构建HCV疫苗也许更为可行些。HCV的高变性可能是导致HCV逃避宿主的免疫应答，使机体不能产生有效的保护性抗体，继而清除HCV的主要原因。

(2)非中和抗体产生：大部分抗HCV阳性的患者血清中仍然可以检测到HCVRNA的转录，显然提示这些抗体的保护性较差或根本无保护性，并非中和抗体。因此目前所研制的HCV基因工程疫苗免疫后所制备的抗血清常常无明显的抗HCV作用。

(3)HCV免疫主要为细胞免疫，但细胞毒T细胞作用在HCV疫苗中的作用未受到充分重视。

本发明的目的是设计一种HCV复合多价疫苗基因，为制备高效、安全、价廉、方便、多价的HCV复合疫苗打下基础。

本发明根据HCV疫苗及HCV表位、决定簇的有关报道，充分考虑了HCV疫苗研究所存在的问题，特别是HCV的多变性，在HCV基因组中优选了编码5个高度保守的保护性表位多肽的核苷酸序列，分别来自核心蛋白(1-16，132-141)，E1(126-135)，NS3(139-147)及NS5(768-775)，由于这些表位在四型HCV中均高度保守，而且大都已被证实为具有良好免疫原性，因此该复合基因所表达的抗原可望对不同型、不同株的HCV提供保护作用，并加入了一个破伤风类毒素(TT)外源刺激表位。我们设计了一段长为270bp的复合多价抗原基因，基因编码的表位之间通过甘氨酸及脯氨酸来连接，经计算机分析，保证了各个表位基本相互独立，并在不影响氨基酸密码及大肠杆菌可识别密码子的情况下，对个别碱基进行调换，以删除一些有害的二级结构。在基因的5′端，同时设计了一个9bp的原核翻译增强子(TTAACTTTA)，能高效表达目的抗原基因。

整个基因的设计还充分考虑到T细胞特别是CTL作用对HCV疫苗的免疫应答的影响。CTL是HCV感染的一种主要的防御机制，在HCV慢性感染过程中可识别肝细胞内表达的HCV抗原，有助于机体清除HCV感染的肝细胞，CTL通过HCV感染肝细胞表面的HLA-I类分子与T细胞受体结合而起作用。这些HLA-I类分子主要有A2。1、Aw68、B7等，特别是HLA-A2。1在人群中出现的频率相当高，中国人、日本人、高加索人等分别为55％、43％、46％。因此本发明在HCV基因组中优选了编码4个T细胞表位的核苷酸序列(其中1个表位同时含有B细胞表位，另一个T细胞表位含有一个B细胞表位的部分序列)及一个破伤风类毒素(TT)外源刺激表位，可被HLA-A2等限制的CTL所识别，为复合疫苗产生有效免疫应答打下良好的基础。各表位的来源、序列及性质如下。

表位来源      表位氨基酸序列             表位性质

C             MTSTNPKPQRKTKRNTN(1-16)       B

C             DLMGYIPLVG(132-141)           T

E1            RMAWDMMMW(317-326)            T

NS3           TGDFDSVID(1445-1453)          B/T

NS5           ELITSCSS(2781-2788)           T(B)

TT            IYSYFPSVD                     T

本发明通过人工合成HCV复合多价抗原基因，重组、表达并研究目的蛋白的抗原性。构建HCV复合多价原核及真核表达载体，转化多种大肠杆菌宿，构建HCV疫苗候选株。

本发明的制备方法主要通过以下步骤实现：

1.基因的拼接：利用化学方法合成小片段，经分步退火将这些基因片段拼接成270bp的HCV复合多价基因。

2.通过转化、质粒抽提、酶切等方法筛选阳性重组克隆，并对基因进行序列分析鉴定。

3.表达载体的构建：将此基因分别克隆到原核系统游离蛋白表达载体pKK223-3、融合蛋白表达载体pWR450-1和真核系统表达载体pSV2和pREP9上。

4.外源基因在大肠杆菌中的表达及硫酸铵分级沉淀初步纯化产物。

上述方法均为现有技术中的方法，实施例中已详细描述。

本发明的创新之处在于：

(1).针对HCV的高度变异性，在HCV基因组中优选了编码5个具有良好免疫原性的高度保守表位的核苷酸序列(见表1)，分别来自核心蛋白(1-16，132-141)，E1(126-135)，NS3(139-147)及NS5(768-775)，由于这些表位在四型HCV中均高度保守，而且大都已被证实为具有良好免疫原性，因此该复合基因所表达的抗原可望对不同型、不同株的HCV提供保护作用，而目前已获得的HCV候选疫苗基因则多是通过PCR方法扩增得到，由于HCV的高度变异性，因此这些片段对某一型HCV可能有效，但对其它型HCV则可能无保护作用，因此利用化学合成基因技术，把编码HCV的高度保守表位的核苷酸序列经严格设计杂合起来获得的多价基因，理论上优于目前采用PCR技术扩增HCV基因法。这种设计方法在HCV疫苗研究中尚未见报道。

(2).整个基因的设计充分考虑到HCV本身免疫的特点，特别强调HLA限制的CTL作用对HCV疫苗免疫应答的影响，选择4个可被HLA或MHC分子识别的T细胞表位(见表1)，另外，还加入了一个为破伤风类毒素的T细胞表位(IYSYFPSVD)，该表位已被证实是一种较强的外源T细胞表位。在该疫苗的设计上更强调细胞免疫在HCV疫苗研究中的作用，符合HCV病毒株本身的免疫特点，因此该疫苗将可能诱发良好的免疫应答，特别是细胞免疫应答，这也有别于现阶段HCV疫苗比较注重体液免疫。

(3).原核翻译增强子可在很大程度上增强外源基因的表达(数十倍到数百倍)，本发明在该复合基因的5′端设计了一个9bp的原核翻译增强子，可高效表达目的抗原基因，这种原核翻译增强子在HCV疫苗中的应用也未见报道，该设计已经在该研究的表达中得到体现，本发明已经获得高效表达HCV融合蛋白的重组菌株。

本发明人工合成的复合多价抗原基因，与单价多肽疫苗相比，可能具有更强的免疫原性，更易激起机体的免疫反应。人工合成疫苗因有着传统疫苗无法比拟的极好靶位点攻击特异性，而且安全、价廉、多价及易于储存，被认为是将来疫苗市场上的生力军。

图1是HCV复合多价抗原基因表位的来源及氨基酸序列及性质。

图2是HCV抗原基因分步退火连接方案。

图3是pUCHC的酶切鉴定图。

图4是HCV抗原基因的序列分析结果。

图5是HCV复合多价抗原基因的结构及氨基酸序列。

图6是多种重组载体的构建。

本发明更详细的实施方法可参见实施例。

实施例

1.基因的拼接：合成的DNA片段每管4OD，分别溶于100μl 0.5mol/L NaCl中，浓度为90μmol/L，按图1方案进行分步退火连接。

除片段F1和片段F8外，其余各片段各取1μl，分别将F2与F13、F3与F12、F4与F11、F5与F10、F6与F9混在一管中，在各管中分别加入14μlddH₂O，2μl 10×PNKbuffer，2μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4 PNKinase； F7、F14各在一管，分别加入7μlddH₂O，1μl10×PNK buffer，1μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4 PNKinase，所有管都在37℃反应30分钟。在F7和F14中分别加入1μl F8和F1，再各加9μlddH₂O，所有7管都沸水浴20分钟，而后自然冷却退火至室温(约15小时)。分别混合F1/F14与F2/F13、F3/F12与F4/F11、F5/F10与F6/F9与F7/F8，各加1μl 10mmol/L ATP，1μl T4 ligase，20℃连接过夜；再混合F1/F14与F2/F13与F3/F12与F4/F11，再补充1μl 10mmol/LATP，0.5μl T4ligase，20℃连接过夜；再混合全部片段，补充1μl 10mmol/L ATP，0.5μl T4 ligase，20℃连接过夜。按以下方法走胶回收270bp的最终目的片段后再用T4 PNKinase磷酸化两端5′末端，与经HindIII、BamI双酶切的pUC119连接，转化E.coli DH5α筛选重组克隆。

按材料与方法部分中的分步退火连接方案将14条单链DNA片段拼接成270bp的丙肝复合多价抗原基因，通过2％琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与经HindIII/BamHI双酶切的质粒载体pUC119连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，在含IPTG和X-gal的氨苄LB平板上挑取白色菌落抽提质粒进行鉴定。经HindIII/BamHI双酶切后走1％琼脂糖凝胶电泳，阳性克隆都切出了270bp的条带(图2)，说明已成功地克隆到丙肝复合多价抗原基因，该重组质粒命名为pUCHC。

2.插膜法回收DNA片段：需回收纯化的样品在2％的琼脂糖凝胶中电泳分离后，在紫外灯下于目的片段之前约1mm处，切开一条与电泳条带同宽的缺口，在缺口两端沿电泳方向将前方胶切开，插入一片大小合适的事先经沸水煮过10分钟的透析膜，膜略高于凝胶面，继续电泳5-10分钟至目的DNA全部转移至膜上。取出透析膜放于一装有0.2ml TAE的Eppendorf管中，Vortex振荡，重复洗1次，收集总体积为0.4ml的TAE浸出液，加入45μl(约1/10体积)3mol/L NaAc，加等体积氯仿抽提一次，吸出上清液并加入2倍体积的冷无水乙醇，-20℃沉淀30分钟。12000rpm离心5分钟，沉淀烘干，溶于10μlddH₂O中，即为回收的目的DNA片段。

3.质粒抽提、酶切、连接及转化均按常规碱变性方法抽提质粒。

4.阳性重组克隆的筛选：以pUC119为载体的转化子先在含IPTG和X-gal的平板上进行初步筛选，再挑取白色菌落进行抽提质粒酶切鉴定。以其他质粒为载体的直接抽提质粒酶切鉴定转化子。

5.插入片段的序列分析：精抽带有插入片段的阳性克隆质粒(以pUC119为载体，图3)，用pUC119上的荧光标记通用引物进行DNA自动测序，结果表明克隆到的复合基因核苷酸序列完全符合原始设计(图4，5)。

6.表达载体的构建：为了研究此丙肝复合多价抗原在多种免疫途径中作为疫苗的可能性，需使之能在多种表达系统得到表达。按图5方案将此基因分别克隆到原核系统游离蛋白表达载体pKK223-3、融合蛋白表达载体pWR450-1和真核系统表达载体pSV2和pREP9上，各自的酶切鉴定证明各重组表达载体均已构建成功。

由pUCHC上用EcoR I和Pst I双酶切回收得到246bp的丙肝复合抗原基因，与同样经EcoR I和Pst I双酶切的pKK223-3或pWR450-1质粒连接，转化DH5α菌株，挑取转化了抽提质粒进行鉴定。经EcoR I和Pst I双酶切，阳性克隆都切出了246bp的目的片段，分别命名为pKKHC及pWRHC。

由pUCHC上用Hind III和BamH I双酶切回收得到270bp的丙肝复合抗原基因，与经Hind III和Bgl II双酶切(BamH I与Bgl II为同裂酶)的pSV2质粒连接，转化DH5α菌株，挑取转化子抽提质粒进行鉴定。质粒pSV2经EcoR I酶切将只产生5.7kb一条条带，阳性克隆经EcoR I酶切则切出了2.6kb和3.1kb两条条带，证明克隆正确。因为pSV2上丢失的Hind III-Bgl II片段正好也约为270bp，因此从质粒大小上看，阳性克隆与载体质粒是一样的。命名该质粒为pSVHC。

由pUCHC上用Hind III和BamH I双酶切回收得到270bp的丙肝复合抗原基因，与同样经Hind III和BamH I双酶切的pREP9质粒连接，转化DH5α菌株，挑取转化子抽提质粒进行鉴定。经Hind III和BamH I双酶切，阳性克隆都切出了270bp的目的片段。质粒pREP9经Xba I和BamH I双酶切将产生0.7kb和9.8kb两条条带，阳性克隆经Xba I和BamH I双酶切切出了0.97kb和9.8kb两条条带，进一步证明克隆正确。命名该质粒为pREPHC。

7.外源基因在大肠杆菌中的发酵表达与产物分析：接种于2ml TB+Amp液体培养基37℃活化过夜，次日取50pl转接5ml TB+Amp液体培养基，37℃振摇2小时，加入5μl 2％IPTG，继续培养3小时，分装Eppendorf管，离心取菌体，加入75μlddH₂O，振开，再加入100μl 2×Sample Buffer，沸水浴10min，离心20秒，上清用于SDS-PAGE电泳检测，分离胶12％。

8.硫酸铵分级沉淀初步纯化丙肝抗原与LacZ的融合蛋白：将发酵好的菌液离心收菌，菌体用超声波缓冲液(50mmol/L Tris·Cl pH8.0，10mmol/L EDTA)洗涤三次，最终悬浮于20倍体积的超声波缓冲液中，冰浴状态下用最大功率超声破碎30次，每次30秒并间歇30秒。处理好的样品于4℃ 6000rpm离心10分钟取上清。在Eppendorf管中按事先计算好的要分别由上一饱和度达到10％、20％、30％、40％、50％饱和度所需的硫酸铵量称取硫酸铵，在第一管中加入1.5ml的超声上清液，待硫酸铵完全溶解后再振荡30分钟，12000rpm离心5分钟，上清倒入第二管，同样处理直至第五管。所有五管沉淀均用20μl ddH₂O溶解，加入20μl 2×Sample Buffer，煮沸5分钟，冷却后SDS-PAGE电泳检测。

将pWRHC质粒转入大肠杆菌不同菌株TG1、JM109、DE3等中进行表达，发现只有在TG1中表达较好，而且在转接过夜种子菌2小时后用IPTG进行诱导，诱导3小时后收菌，表达量最高，融合蛋白约占菌体蛋白的10％-20％。

pWR450-1质粒为带有强Lac启动子的蛋白表达载体，其上表达的β-半乳糖苷酶(LacZ)为55KD，丙肝抗原在LacZ的49KD(447个氨基酸)处开始与之融合，产生出约60KD的LacZ-HC融合蛋白。

为了今后获取该融合蛋白用于免疫方面的实验，我们初步摸索了对LacZ-HC蛋白进行分离纯化的条件。运用硫酸铵分级沉淀，我们通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别检测了TG1/pWRHC菌体经超声波破碎后可溶性蛋白在10％，20％，30％，40％，50％硫酸铵饱和度下的沉淀产物，发现60KD的发酵产物LacZ-HC主要出现在50％饱和度的沉淀物中。因此，可将菌体蛋白先用40％饱和度的硫酸铵沉淀一次，再在50％饱和度沉淀后取沉淀进一步纯化用这样可去除约70％杂蛋白。

Claims (2)

1.一种丙型肝炎病毒(HCV)复合多价疫苗基因，其特征是从HCV基因组中优选了编码5个高度保守的保护性表位的核苷酸序列，这些表位包括4个T细胞表位及一个B细胞表位，其中一个T细胞表位同时含有B细胞表位，另一个T细胞表位含存一个B细胞表位的部分序列，另外加入了一段编码破伤风类毒素(TT)外源刺激表位的核苷酸序列及一个9bp的原核翻译增强子，这些编码表位的序列组合成了一段长为270bp的复合多价抗原基因(见图5)，各表位间用甘氨酸及脯氨酸来连接。其表位选择如下：

表位来源      表位氨基酸序列            表位性质

   C          MTSTNPKPQRKTKRNTN(1-16)       B

   C          DLMGYIPLVG(132-141)           T

   E1         RMAWDMMMW(317-326)            T

   NS3        TGDFDSVID(1445-1453)          B/T

   NS5        ELITSCSS(2781-2788)           T(B)

   TT         IYSYFPSVD                     T

2.权利要求1所述的HCV疫苗基因的克隆与表达方法法，包括基因的拼接，转化及阳性重组子的筛选，其特征在于：

(1)通过分步退火连接，把所合成的14段基因小片段拼接成所设计的270bp的目的片段。

(2)通过转化、质粒抽提、酶切等方法筛选阳性重组克隆，并对基因进行鉴定。

(3)构建多种真核及原核表达载体。

(4)该基因在大肠杆菌获得初步表达产物并对表达产物进行初步纯化分析。

Images