KR20010012543A - 렌티바이러스-기원 유전자 전달 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EIAV 게놈의 적어도 일부 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 벡터를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 발현 시스템에 관한 것이다. 상기 벡터는 EIAV 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 결손을 포함하지만, 바람직하게는 gag/pol 발현 벡터이다. 또한 발현 시스템은 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하고, 부가적으로 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다중 클로닝 사이트를 포함하는 두 번째 벡터를 더 포함한다. 또한 벡터 발현 시스템은 바이러스 외피 단백질을 발현하는 세 번째 벡터를 포함한다. 첫 번째 벡터와 세 번째 벡터는 패키징-신호 결손이다. 발현 시스템이 렌티바이러스-허용 세포로 형질감염되면, 복제-결손 EIAV 입자가 생산되고 이 때 입자는 이종 유전자를 분열세포와 비분열 세포 양자의 넓은 범위로 운반하는 데 유용하다.

Description

렌티바이러스-기원 유전자 전달 벡터{Lentivirus-based gene transfer vectors}
특정의 외래 유전자 혹은 고유 유전자 서열을 포유동물 세포로 도입하고, 그 유전자의 발현을 조절하는 능력은 의료 및 생물학적 연구 분야에서 중요한 가치를 가진다. 상기 능력은 유전자 조절을 연구하고, 질병의 치료를 위한 치료학적 원리를 제안하는 수단을 제공한다.
특정 외래 유전자나 고유 유전자를 포유동물 숙주세포로 도입하는 것은 적절한 핵산 벡터내로 유전자 서열을 도입하는 것에 의하여 용이해진다. 그러한 재조합 벡터를 원하는 숙주세포로 도입할 수 있는 다양한 방법이 개발되어 왔다. DNA 형질전환 또는 DNA 형질도입이 관여하는 방법과는 대조적으로, 바이러스 벡터를 이용하는 것은 재조합 분자를 넓은 범위의 숙주세포에 빠르게 도입하게 한다. 구체적으로, 바이러스 벡터는 재조합 핵산 벡터를 숙주세포로 도입하는 효율을 증가시키기 위하여 이용되어 왔다. 포유동물 세포로 외래 유전자를 도입하고 발현시키기 위한 벡터로서 이용되어온 바이러스는 SV40(H. Okayama et al., Molec. Cell. Biol. 5, 1136-1142(1985)의 예를 참조); 소 파필로마 바이러스(D. DiMaio et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 79, 4030-4034(1982)의 예를 참조); 아데노바이러스(J.E. Morin et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 84, 4626(1987)의 예를 참조); 아데노-관련 바이러스(AAV; N. Muzyczka et al., J. Clin. Invest. 94, 1351(1994)의 예를 참조); 헤르페스 심플렉스 바이러스(A.I. Geller, et al., Science 241, 1667(1988)의 예를 참조) 등을 포함한다.
레트로바이러스-기원 벡터는 특히 포유동물 세포로 외래 유전자를 안정적이고, 통합되게 전달하기 위한 도구로서 선호된다. 외래 유전자를 포유동물 세포로 도입하여 발현시키기 위한 벡터로서 이용되어온 레트로바이러스는 모로니(Moloney) 쥐 육종 바이러스(T. Curran et al., J. Virol. 44, 674-682(1982); A. Gazit et al., J. Virol. 60, 19-28(1986))와 쥐 백혈병 바이러스(MuLV; A.D. Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 1-24(1992))를 포함한다.
재조합 분자를 포유동물 세포로 도입하려는 노력은 많은 세포가 상술된 바이러스 벡터 혹은 레트로바이러스 벡터에 의하여 감염되지 못하는 것에 의하여 방해를 받았다. 예를 들어 상대적으로 제한된 숙주 범위를 가지는 레트로바이러스 벡터에 대한 제한은, 부분적으로 바이러스 수용체로 제공되는 막 단백질의 발현의 수준에 의한 것이다(M.P. Kavanaugh et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91, 7071-7075(1994)). 다른 제한은 비-분열 세포(예를 들어, 신경, 간세포, 근섬유, 조혈구 스템 세포)로 삽입될 수 없음과 현 패키징 시스템을 이용하기에는 낮은 벡터 타이터 및 정제와 농축 이전에 벡터 입자가 깨지는 것을 포함한다.
렌티바이러스는 비-분열 세포에 감염가능한 레트로바이러스의 서브그룹이다. 날디니 등은 이종 유전자 서열을 인간 초기 대식세포와 최종적으로 분화된 신경으로뿐 아니라 비-증식 헬라 세포와 래트 섬유아세포로 도입 가능한 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 근간한 렌티바이러스 벡터 시스템을 보고하였다(L. Naldini et al., Science 272, 263-267(1996)). 그러나 그러한 시스템을 인간에 이용하는 것은 벡터가 전염성 혹은 질병-야기 형태로 재조합될 가능성 때문에 심각한 안정성 문제를 야기한다.
따라서, 광범한 분열 및 비-분열 세포로 유전자 전달을 매개할 수 있는 안전하고 효율적인 렌티바이러스 벡터 시스템이 요구된다.
본 발명은 유전자 운반에 유용한 벡터로서 이용되는 바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비-분열세포 및 분열세포에 유전자를 운반하는데 유용한 렌티바이러스 벡터에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 EIAV-유래 벡터를 제조하는 데 이용된 플라스미드 구조물을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2a는 플라스미드 pEV53의 개략도이다.
도 2b는 플라스미드 pEV53A의 개략도이다.
도 3은 플라스미드 pEC-lacZ의 개략도이다.
도 4는 플라스미드 pEC-puro의 개략도이다.
도 5는 플라스미드 pGI-VSV-G의 개략도이다.
도 6a은 하기 실시예 3에 기술된 바와 같이 MuLV(위 줄)과 EIAV 벡터(아래 줄)에 의하여 분열세포(왼쪽 칼럼) 및 비-분열세포(오른쪽 칼럼)로 유전자를 전달하는 것을 도시한 4개의 사진을 포함한다.
도 6b는 MuLV-기원 벡터(막대 그래프의 왼쪽쌍)과 EIAV-기초 벡터(막대 그래프의 오른쪽쌍)에 의하여 분열세포 및 비-분열세포로 유전자를 전달하는 효율을 비교하여 나타낸 것이다. 후술하는 바와 같이, 성공적인 유전자 전달을 파란색으로 염색된 감염 세포(즉, X-gal 양성)의 퍼센트로 그래프의 y-축에 나타내었다.
도 6c는 MuLV-기원 유전자 전달 벡터로 감염된 세포에서 DNA로 브로모데옥시우리딘(BrdU)이 삽입되는 것을 차단하는 아피디콜린의 능력을 나타낸 것이다. 하기 실시예 3에 기술된 바와 같이, 성공적인 유전자 전달을 BrdU에 양성인 감염세포의 퍼센트로 그래프의 y-축에 나타내었다.
도 7은 EIAV-기원 벡터 EC-lacZ가 분열 및 비-분열 세포에 감염되어 유전자를 전달하는 능력을 도시한 두 개의 그래프를 포함한다. 도 7의 왼쪽 그래프에서, 개방원은 아피디콜린이 처리되지 않은 인간 CFT1 세포를 나타내고, 폐쇄원은 아피디콜린으로 처리된 인간 CFT1 세포를 나타낸다. 도 7의 오른쪽 그래프에서, 개방 삼각형은 아피디콜린으로 처리되지 않은 말 피부 세포를 나타내고, 폐쇄 삼각형은 아피디콜린으로 처리된 말 피부 세포를 나타낸다. 양 그래프에서, 유전자 전달을 X-gal 양성 감염 세포의 퍼센트로 y-축에 나타내었다. 양 그래프에서, EC-lacZ 벡터의 용량을 ㎕ 바이러스/㎖ 접종의 단위로 x-축에 나타내었다.
도 8은 농축하지 않은(원심하지 않은) 혹은 농축한(원심한) EC-lacZ/VSV-G 의사타입 바이러스 입자의 감염력의 용량-반응 곡선이다. 도 8에서, 개방원은 농축된 바이러스 입자를 나타내고, 폐쇄원은 농축되지 않은 바이러스 입자를 나타낸다. EC-lacZ 벡터의 용량은 ㎕ 바이러스/㎖ 접종의 단위로 x-축에 나타내고, 감염력은 X-gal 양성인 세포의 퍼센트로 y-축에 나타내었다.
본 발명은 유전자 전달을 위하여 말 병원성 빈혈 바이러스(Equine Infectious Anemia Virus, EIAV)-유래 벡터를 이용하여 이종 유전자 서열을 세포로 전달하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 첫 번째 면은 EIAV 게놈의 적어도 일부 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 벡터를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 발현 시스템에 관한 것이고, 이 때 벡터는 ⅰ) EIAV 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 결손을 포함하고, ⅱ)결손된 패키징 신호를 포함한다. 또한 발현 시스템은 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 두 번째 벡터를 포함하고, 이 때 벡터는 ⅰ) 기능적(competent) 패키징 신호를 포함하고, ⅱ) 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다중 클로닝 사이트를 포함한다. 또한 벡터 발현 시스템은 바이러스의 핵산 서열을 포함하는 세 번째 벡터를 포함하고, 이 때 벡터는 ⅰ) 바이러스 외피 단백질을 발현하고, ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함한다.
본 발명의 두 번째 면은 상술한 본 발명의 벡터 발현 시스템으로 세포를 감염시키는 것을 포함하는 복제-결손 렌티바이러스 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 세 번째 면은 상술한 본 발명의 벡터 발현 시스템으로 표적 세포를 감염시키는 것을 포함하는 이종 유전자를 표적 세포에 운반하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 네 번째 면은 a) 생산자 세포를 상술한 본 발명의 벡터 발현 시스템으로 감염시키고; b) 세포내에서 복제-결손 렌티바이러스 입자를 생산하기에 충분한 세포 배양 조건하에서 생산자 세포를 성장시키고; c) 생산자 세포로부터 복제-결손 렌티바이러스 입자를 회수하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 스톡의 제조방법에 관한 것이다.
상기한 그리고 또다른 본 발명의 면은 도면과 하기 상세한 설명에 자세하게 설명되어 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 보여주는 상응하는 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명한다. 하지만, 본 발명은 상이한 많은 형태로 구체화될 수 있고, 여기에 기재된 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 더욱이, 이 실시예는 당업자에게 발명의 범주를 상세히 알리기 위하여 제공된다.
Ⅰ. 말 병원성 빈혈 바이러스(EIAV) 게놈
EIAV는 레트로바이러스 과의 렌티바이러스 속의 구성원이다. 야생형 EIAV는 구형 외피를 가지고 핵단백질 코아를 포함하는 비리언에 패키징되는 2분자체 RNA 게놈(한가닥, 극성 양성)을 가진다. 야생형 EIAV 게놈의 복제는 역전사 및 숙주세포 게놈으로의 삽입을 통하여 일어난다. 게놈은 구조 단백질 gag, pol 및 env을 코딩하는 세 개의 유전자와 삽입된 바이러스 게놈의 양 말단에 긴 말단 반복(LTR)을 포함한다. 모든 레트로바이러스에 공통적인 gag, pol 및 env 서열에 더하여, EIAV 게놈은 예닐곱개의 짧은 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. 짧은 세 개의 ORF은 다회 스플라이싱된 mRNA로부터 해독된다. ORF S1은 전사 트랜스엑티베이터 tat를 암호한다. ORF S2는 기능이 알려지지 않은 단백질을 암호하고, ORF S3는 rev 단백질을 암호하는 것으로 보인다. rev 는 gag, pol 및 env의 효과적인 발현을 위하여 필요한 것으로 생각되어 진다. Rev 는 전사후에 EIAV의 env 유전자 내에 위치한 rev-반응 요소(RRE)로 알려진 RNA 서열과 상호작용한다.
또한 EIAV의 야생형 게놈은 R 서열(게놈의 각 말단의 짧은 반복서열); U5 서열(R 서열 바로 뒤의 특이 서열 요소); U3 서열(구조 단백질의 하류에 위치한 특이 서열 요소); 삽입된 프로바이러스의 전사 개시를 조절하는 프로모터 요소; 패키징 서열(이하 패키징 사이트 혹은 패캐징 신호로 가변적으로 칭함); 및 5'-스플라이스 도너 사이트를 포함하는 몇몇의 시스-활동 서열을 포함한다.
Ⅱ. 본 발명의 EIVA 벡터
본 발명의 벡터는 넓은 계통발생적 범위의 숙주 세포내에서 숙주 세포 핵과는 독립적으로 이종 핵산을 복제하고 발현하는 수단을 제공한다. 이러한 숙주 세포로의 벡터-매개 이종 핵산의 삽입은 숙주 세포의 감염 혹은 형질감염이라 불리고, 여기에서 감염은 바이러스 입자가 이용됨을 의미하고 형질감염은 핵산의 누드(naked) 분자가 이용됨을 의미한다.
또한 본 발명의 벡터는 이종 핵산이 바이러스 입자에 삽입될 수 있게 하고, 그에 의하여 이종 핵산을 포함하는 감염된 숙주 세포의 수를 증폭시키키는 수단을 제공한다. 이종 핵산의 삽입은 바이러스 입자내에서 이종 핵산의 복제와 그안에서의 이종 단백질의 계속적인 생산을 용이하게 한다. 본 명세서에 이종 단백질은 단백질의 전부 혹은 일부가 숙주 세포에 의하여는 발현되지 않는 단백질 혹은 그의 절편으로 정의된다. 핵산 혹은 유전자 서열은 그것이 유전자를 세포로 운반하는 데 사용되는 바이러스 벡터의 야생형(예를 들어, 야생형 EIVA 게놈)에 자연적으로 존재하지 않는 경우 이종이라고 부른다. 본 명세서에서 사용되는 핵산 서열 혹은 유전자 서열이라는 용어는 핵산 분자(바람직하게는 DNA)를 칭하는 것이다. 그러한 유전자 서열은 DNA, cDNA, 합성 DNA, RNA 혹은 그들의 조합을 포함하는 다양한 원(源)으로부터 유래될 수 있다. 그러한 유전자 서열은 자연적으로 존재하는 인트론을 포함하거나 포함하지 않는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 더욱이, 그러한 게놈 DNA는 프로모터 서열 혹은 폴리-아데닐레이트 서열과 결합되어 얻어질 수 있다. 본 발명의 유전자 서열은 바람직하게는 cDNA이다. 게놈 DNA 혹은 cDNA는 다양한 방법으로 얻어질 수 있다. 게놈 DNA는 적합한 세포로부터 공지의 방법으로 추출되고 정제될 수 있다. 다른 방법으로, mRNA가 세포로부터 분리되어 역전사나 다른 방법으로 cDNA를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 목적하는 유전자를 표적 세포에 운반하는 방법에서 단회 라운드의 복제를 수행할 수 있는 벡터를 생산하는 것이다. 이러한 기술의 한 면은 바이러스 유전자를 표적 조직에 전달하는 것을 배제하는 유전자 전달 시스템이다. 이는 바이러스 유전자를 코딩하는 발현 벡터를 목적하는 유전자를 코딩하는 벡터로부터 물리적으로 분리시킴에 의하여 달성된다. 분리된 발현 벡터는 허용 세포(예를 들어, "생산 세포")로 형질감염된다. 바이러스 유전자 산물은 바이러스 입자의 생산에 필수적이다. 그러나 본 발명에서는 이러한 유전자를 코딩하는 유전자는 결손 패키징 신호를 포함하는 발현 벡터에 위치하고; 따라서 구조 단백질을 코딩하는 유전자는 패키징되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "구조 단백질" 혹은 "EIVA 구조 단백질"은 EIAV 게놈의 캡시데이션(즉, 패키징)에 요구되는 코딩 단백질과 gag, pol 및 env 를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "결손"이라는 용어는 그의 유전자 산물을 코딩하거나 신호서열로 제공되는 것에 있어서 기능적이지 않은 핵산서열을 말한다. 예를 들어, 결손 env 유전자 서열은 env 단백질을 코딩하지 않으며, 결손 패키징 신호는 결손 신호가 위치하는 핵산 분자의 패키징을 용이하게 하지 않는다. 서열의 일부 혹은 전부의 결실, 서열의 프레임을 어긋나게 하는 것(out-of-frame), 서열을 블라킹하는 것을 포함하는 당분야에 공지된 어떠한 수단에 의하여도 핵산 서열은 결손될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "결실된" 혹은 "결실"이라는 용어는 특정 절편의 전부의 결실 혹은 절편이 비작동적 혹은 비기능적으로 되게 하기에 충분한 특정 서열의 일부의 결실을 의미한다. 본 명세서에서 "복제 결손"이라는 용어는 EIAV 구조 단백질을 코딩하는 벡터가 형질감염 후에 표적 세포에서 캡슐화되지 않는 것을 의미한다. 패키징된 벡터가 캡슐화에 필요한 모든 바이러스 구조 단백질을 포함하지 않거나, 하나 이상의 필요 구조 단백질이 그로부터 결여되어서 그 결과 패키징 된 벡터가 전체 바이러스 게놈을 복제할 수 없을 때 결과적으로 렌티바이러스 입자는 복제 결손이다.
본 발명의 바람직한 벡터는 EIAV로부터 유래한다. 원래의 EIAV 핵산은 바이러스로 감염된 세포와 그로부터 제조된 벡터로부터 분리될 수 있다. EIAV 벡터를 제조하는 방법의 일 예는 페리의 논문에 제공되어 있다(S.T. Perry, et al., J. Virol. 66, 4085-4097). 예를 들어, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 cDNA가 역 전사효소에 의하여 EIAV RNA로부터 제조될 수 있다. 그리고나서 이중-가닥 EIAV cDNA가 생성되어 박테리아 클로닝 벡터와 같은 클로닝 벡터에 클로닝될 수 있다. 박테리아, 효모 혹은 진핵세포 벡터와 같이 당업자에게 알려져 있고 사용되고 있는 어떠한 클로닝 벡터도 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 바람직하게 EIAV RNA 게놈의 적어도 일부와 상보적인 cDNA를 포함한다. 이형 분자의 전사와 발현을 달성하기 위하여, 벡터는 인간 혹은 동물 세포로 도입될 수 있는 이형 cDNA 분자를 포함할 수 있다. cDNA 분자는 EIAV 게놈의 적어도 일부와 게놈의 복제에 필요한 RNA 게놈에 상보적인 cDNA를 포함할 수 있으며, cDNA 분자는 세포내에서 기능적인 프로모터 서열의 전사 조절하에 놓여진다.
본 발명의 프로모터 서열은 진핵 혹은 원핵 세포 유래의 프로모터를 포함할 수 있으며, 세포에서 멀리 위치한 서열(즉, 프로모터 서열의 5' 말단에 연결된 서열)의 전사를 유도하기에 충분하다. 프로모터 부위는 또한 전사의 증가과 억제를 위한 조절 요소를 포함한다. 적합한 프로모터에는 사이토메갈로바이러스 급 초기 프로모터(pCMV), 마우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터(pRSV)와 SP6, T3 혹은 T7 프로모터가 포함된다. 프로모터의 상류에 있는 인핸서 혹은 코딩 부위의 하류에 있는 종결자 서열은 발현을 용이하게 하기 위하여 본 발명의 벡터에 선택적으로 포함될 수 있다. 또한 본 발명의 벡터는 세포가 효율적이고 효과적으로 벡터의 핵산에 의하여 발현된 단백질을 가공하기에 충분한 폴리아데닐레이트 서열, 국지화 서열 혹은 신호 서열과 같은 부가적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 폴리아데닐레이트 서열의 예는 SV40 초기 부위 폴리아데닐레이트 사이트(C.V. Hall et al., J. Molec. App. Genet. 2, 101(1983))와 SV40 후기 부위 폴리아데닐레이트 사이트(S. Carswell and J.C. Alwine, Mol. Cell Biol. 9, 4248(1989))이다. 그러한 부가적 서열은 벡터내로 삽입되어 전사가 요망되면 작동적으로 프로모터 서열과 연결되고, 혹은 부가적으로 해독과 프로세싱이 요망되면 개시 및 프로세싱 서열과 작동적으로 연결된다. 삽입 서열은 벡터의 어떠한 위치에도 놓여질 수 있다. "작동적으로 연결된다"는 용어는 유전자 서열과 프로모터 혹은 다른 조절 또는 프로세싱 서열 사이의 연결을 기술하는 데 사용된다. 그결과 유전자 서열의 전사는 프로모터 서열과 작동적으로 연결됨으로써 관련되고, 유전자 서열의 해독은 해독 조절 서열과 작동적으로 연결됨으로써 관련되고, 유전자 서열의 후-전사 프로세싱은 프로세싱 서열과 작동적으로 연결됨으로써 관련된다.
본 발명의 벡터의 구축을 위한 표준 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 샘브룩의 논문(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.(Cold Spring Harbor, NY, 1989))에서 찾을 수 있다. 다양한 전략이 DNA의 절편을 연결하는 데 유용하고, 그것의 선택은 DNA 절편의 말단의 성질에 달려있고 숙련된 기술자에 의하여 쉽게 이루어진다.
본 발명의 일 실시예에서, 재조합 렌티바이러스 발현 시스템은 세 가지 벡터를 포함한다. 첫 번째 벡터는 EIAV 게놈의 적어도 일부 핵산 서열을 포함하고, 이 때 벡터는 (ⅰ)는 EIVA 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 결손을 포함하고, (ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함한다.
두 번째 벡터는 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하고, 이 때 벡터는 (ⅰ) 기능적 패키징 신호를 포함하고, (ⅱ) 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다중 클로닝 사이트를 포함한다. 세 번째 벡터는 바이러스의 핵산 서열을 포함하고, 이 때 벡터는 (ⅰ) 바이러스 외피 단백질을 발현하고, (ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 첫 번째 벡터는 gag/pol 발현 벡터이다. Gag/pol 발현 벡터는 바이러스 입자를 조합하고 세포로부터 방출하는 데 필요한 EIAV 단백질을 발현하고, 단백질 gag와 pol을 코딩하는 유전자를 포함한다. 첫 번째 벡터는 또한 보조 단백질 rev 와 tet을 코딩하는 유전자를 포함한다. 그 기능이 알려지지 않은 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 S2는 부가적으로 포함된다. 첫 번째 벡터는 레트로바이러스-매개 바이러스 유전자의 전달을 배제하는 돌연변이를 포함하도록 구축된다. 그러한 돌연변이는 바이러스 env 유전자 서열이 결여되어 따라서 복제-가능 EIAV의 생산의 가능성을 배제하거나, 바이러스 역전사와 삽입에 필요한 게놈의 3' 말단의 어떠한 시스-액팅 서열 요소가 결여된 것이다. 따라서 이러한 구조체로부터 바이러스 유전자가 바이러스 입자내로 패키징되어도 그들은 복제되지 않을 것이고 복제-가능 야생형 바이러스는 생성되지 않을 것이다.
발명의 바람직한 실시예에서, 발현 시스템의 첫 번째 벡터는 도 2a에 도시된 플라스미드 pEV53이다. pEV53은 12170bp 플라스미드이고, EIAV tat 코딩부위(bp 1124-1210과 5886-6026), gag 코딩부위(bp 1216-2676), pol 코딩부위(bp 2433-5874) 및 ORF S2 코딩부위(bp 6037-6234)로부터 상류에 위치한 bp 209-1072의 키메라 CMV/EIAV 인핸서 프로모터 부위를 포함하는 cDNA 클론이다.
또한 상기 벡터는 env 코딩부위 일부(bp 6063-7733) 및 rev 코딩부위(bp 6188-6288과 7250-7654)를 포함한다. 파지 f1 부위(bp 8037-8450), SV 40 초기 프로모터 부위 및 복제 오리진(bp 8514-8839), 네오마이신 저항 코딩 부위(bp 9685-9924), SV40 폴리아데닐레이트 신호 (bp 9685-9924), Col E1 복제 오리진(bp 10356-11029) 및 β-락타메이즈(암피실린 저항) 코딩 부위(bp 11174-12035)처럼, 소성장호르몬(BGH) 폴리아데닐레이트 신호가 제공된다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시예에서, 발현 시스템의 첫 번째 벡터는 플라스도 2b에 도시한 pEV53A 플라스미드이다. 플라스미드 pEV53A는 pEV53에서 유래한 것이고, 이때 EIAV 단백질의 발현정도에 영향을 미치지 않으면서 바이러스 유전자의 레드로바이러스-매개 전달의 기회를 더 감소시키는 변형이 이루어진 것이다. 플라스미드 pEV53A는, pEV53에서 프로모터/인핸서 요소와 삽입에 중요한 시스-액팅 요소를 포함하는 모든 EIAV 긴말단 반복서열과 역전사의 개시를 위한 tRNA 프라이머 결합 사이트 서열이 결여되었다. pEV53A는 pEV53의 902-1077의 뉴클레오타이드가 결여된 것이다.
본 발명의 발현 시스템의 두 번째 벡터는 유전자 전달을 위한 벡터로서 제공되고, 목적하는 이종 유전자를 코딩하는 cDNAs의 삽입을 위한 다중 클로닝 사이트뿐 아니라 벡터 게놈의 역전사(복제)를 지지하는데 필요한 모든 시스-액팅 서열 요소를 포함한다. 본 발명에서, 목적하는 유전자를 코딩하는 벡터는 표적 세포로 전달될 유전적 정보를 바이러스 게놈의 패키징과 삽입에 필요한 시스-액팅 서열 요소와 함께 운반하는 재조합 EIAV-유래 벡터이다. 두 번째 벡터는 gag 서열의 어떤 일부가 EIAV 게놈의 패키징에 작용한다고 믿어지기 때문에 gag 코딩 부위의 어떤 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 탄이 개시한 바와 같이, LTR에 포함된 5' 스플라이스 도너 사이트는 생산된 바이러스의 타이터를 증가시키는 돌연변이를 포함하는 것이 바람직하다(W. Tan et al., J. Virol. 70, 3645-3658(1996)).
바람직한 두 번째 벡터의 두가지 예는 도 3과 도 4에 제공된다. 도 3은 플라스미드와 cDNA 클론 pEC-lacZ, 즉 대장균 lacZ 리포터 유전자를 발현하는 EIAV로부터 유래한 8749bp 플라스미드를 도시한다. 플라스미드는 두 개의 CMV 급-초기 인핸서 프로모터 부위(bp 1-734 와 1609-2224에 위치), EIAV 긴말단 반복의 R-U5 서열 도메인(bp 735-849), 일부 EIAV gag 서열(bp 993-1570), lacZ 코딩 서열(bp 2297-5437), EIAV LTR 서열(bp 5752-6073), 파아지 f1 부위(bp 6163-6618), 암피실린 저항 코딩 부위(bp 7057-7917) 및 ColE1 복제 오리진(bp 8062-8736)을 포함한다.
도 4는 플라스미드와 cDNA 클론 pEC-puro, 즉 퓨로마이신 저항 유전자를 발현하는 EIAV로부터 유래한 6099bp 플라스미드를 도시한다. 이 벡터는 또한 두 개의 CMV 급-초기 인핸서 프로모터 부위(bp 1-734 와 1609-2224에 위치), EIAV 긴말단 반복의 R-U5 서열 도메인(bp 735-849), 일부 gag 서열(bp 993-1570), 퓨로마이신 저항 유전자 코딩 서열(bp 2234-2933), EIAV LTR 서열(bp 3102-3423), 파아지 f1 부위(bp 3513-3968), 암피실린 저항 코딩 부위(bp 4407-5267) 및 ColE1 복제 오리진(bp 5412-6086)을 포함한다.
당업자에게 명백하듯이, 삽입된 이종 유전자 서열(들)의 뉴클레오타이드 서열은 어떠한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 예를 들어, 삽입된 이종 유전자 서열은 리포터 유전자 서열 혹은 선별적 마커 유전자 서열일 수 있다. 본 발명에서 사용된 리포터 유전자 서열은 발현되었을 때 그의 존재 혹은 활성이 모니터 될 수 있는 단백질을 생산하는 어떠한 유전자 서열일 수 있다. 적합한 리포터 유전자의 예는 갈락토키나제, 베타갈라토시다제, 글로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, 베타-락타마제 등의 유전자를 포함한다. 대체하여, 리포터 유전자 서열은 그의 발현이 세포 생리에 영향을 주는 유전자 산물을 생산하는 어떠한 유전자 서열일 수 있다. 본 발명의 이종 유전자 서열음 이미 하나 이상의 프로모터, 개시 서열 혹은 프로세싱 서열을 소유하는 하나 이상의 유전자 서열을 포함할 수 있다.
선별적 마커 유전자 서열은 그의 존재가 그것을 포함하는 세포를 선별적으로 증식할 수 있게 하는 단백질을 발현할 수 있는 어떠한 유전자 서열이다. 선별적 마커 유전자의 예는 숙주에서 항생제(예를 들어, 퓨로마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 등)에 대한 저항성을 부여할 수 있는 혹은 숙주에게 아미노산 유사체에 대한 저항성을 부여할 수 있는, 혹은 부가적 탄소원 또는 다른 허용되지 않는 배양 조건에서 박테리아의 성장을 가능하게 하는 유전자 서열을 포함한다. 유전자 서열은 리포터 유전자와 선별적 마커 유전자 서열을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 가장 바람직한 리포터 유전자는 대장균의 베타-갈락토시다제 활성을 코딩하는 lacZ 유전자와 퓨로마이신 저항을 코딩하는 유전자이다.
바람직한 리포터 혹은 선별적 마커 유전자 서열은 정상세포에서 벡터의 인지와 선택을 가능하게 하기에 충분한 것이다. 발명의 일 실시예에서, 리포터 유전자 서열은 정상적으로는 포유동물 세포에는 없고 따라서 그의 존재가 그러한 세포에서 벡터의 존재를 단정적으로 결정할 수 있는 효소 혹은 다른 단백질을 코딩할 수 있다.
이종 유전자 서열은 또한 적합한 생물학적 활성 단백질 혹은 폴리펩티드, 면역원성 또는 항원성 단백질 혹은 플리펩티드 또는 약학적으로 활성있는 단백질 혹은 폴리펩티드와 같은 원하는 산물의 코딩 서열을 포함한다. 다른 것으로, 이종 유전자 서열은 안티센스 RNA 서열과 같은 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하여, 이때 안티센스 서열은 개체에 도입되어 개체의 세포내에서 상보적 폴리뉴클레오타이드의 발현을 저해할 수 있다.
이종 유전자의 발현은 항체 반응을 일으키는 면역원성 혹은 항원성 단백질 혹은 폴리펩티드를 제공하고, 이때 항원은 혈액, 혈장 혹은 복수와 같은 동물의 체액으로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 재조합 렌티바이러스 발현 시스템의 세 번째 벡터는 바이러스 외피 단백질을 발현한다. 상기 벡터는 따라서 적합한 프로모터의 조절하에서 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 밀접히 관련된 바이러스의 외피 유전자를 이용함으로써 본 발명의 바이러스 벡터가 감염될 수 있는 숙주세포의 범위를 변경시킬 수 있다. 다른말로 하면, 어떤 바이러스의 외피 단백질을 다른 바이러스의 캡슐화에 참여하게 할 수 있는 이점을 이용함으로써 본 발명의 EIAV 벡터의 숙주 범위를 확장시킬 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 베시큘라-스토마티티스 바이러스의 G-단백질(VSV-G; Rose and Gillione, J. Virol. 39, 519-528(1981); Rose and Bergmann, Cell 30, 753-762 (1982) 참조) 혹은 그것의 절편 또는 유도체가 세 번째 벡터에서 발현되는 외피 단백질이다. VSV-G는 다른 벡터의 게놈과 매트릭스 성분을 이용하여 의사타입의 비리온을 효과적으로 형성한다. 본 명세서에서 사용하는 "유의사타입"이란 용어는 하나의 바이러스의 핵산을 포함하지만 다른 바이러스의 외피 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 말한다. 일반적으로, VSV-G 의사타입 벡터는 매우 넓은 숙주 범위를 가지고, 높은 감염력을 여전히 보유하면서 한외원심분리(예를 들어, J.C. Burns, et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 90, 8033-8037(1993)에 따른 방법)에 의하여 고농도의 타이터로 침전될 수 있다.
본 발명의 세 번째 벡터의 예시적이고 바람직한 실시예를 도 5에 도시하였다. 상기 도면은 플라스미드와 cDNA 클론 pCI-VSV-G, 즉 외피 당단백질 VSV-G의 바람직한 발현 벡터를 도시한다. 이 플라스미드는 5679개의 염기쌍을 포함하고, CMV 급-초기 인핸서 프로모터 부위(bp 1-795), 키메라 인트론 부위(bp 857-989), VSV-G 코딩 부위(bp 1088-2633), 파아지 f1 부위(bp 3093-3548), SV40 후기 폴리아데닐레이트 신호(bp 2783-3003), ColE1 DNA 복제 오리진(bp 4992-5666) 및 암피실린 저항 코딩 부위(bp 3987-4847)을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 병원성 복제-결손 EIAV 입자는 본 명세서에 기술된 방법과 당업자에게 알려진 기술을 조합한 방법에 따라서 제조될 수 있다. 그 방법은 본 발명의 벡터 발현 시스템으로 렌티바이러스-허용 세포를 감염시키는 단계; 감염된 세포에서 EIAV-유래 입자를 생성하는 단계; 및 세포로부터 바이러스 입자를 회수하는 단계를 포함한다. 렌티바이러스-허용 세포를 감염시키는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 적합한 수단에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, 여기에 기술된 3-플라스미드 발현 시스템이 일시적 형질감염에 의하여 EIAV-유래 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는데 이용된다. 또다른 실시예에서와 같이, 벡터를 세포내로 도입시키는 것은 예를 들어 세포를 DEAE-덱스트란으로 처리하거나, RNA를 세포에 첨가하기전에 "리포펙틴"으로 처리하거나 엘렉트로포레이션에 의한 것과 같은 어떠한 적합한 수단에 의하여도 성취될 수 있다.
세포에서 감염성 바이러스 입자의 생산을 용이하게 하는 단계는 표준 세포 배양 성장 기술에 의한 것과 같은 전통적인 기술에 의하여 수행될 수 있다.
감염성 바이러스 입자를 회수하는 단계는 또한 전통적인 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 감염성 입자는 당업계에 알려진 바와 같이 세포 파쇄 혹은 세포 배양물의 상등액의 획수에 의하여 회수될 수 있다. 선택적으로 회수된 바이러스 입자는 원한다면 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
원한다면 당업자에 의하여, 본 발명의 벡터와 방법을 이용하여 렌티바이러스 스톡 용액이 제조될 수 있다. 바이러스 스톡 용액을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있으며 소네오카 등에 의하여 예시된다(Y. Sonedka et al., Nucl. Acids Res. 23, 628-633(1995); N.R. Landau et al., J. Virol. 66, 5110-5113(1992)). 본 발명에서 스톡용액을 제조하는 방법에서, 렌티바이러스-허용세포(이하 '생산자세포'라 칭함)는 본 발명의 벡터 시스템으로 형질감염된다. 그리고나서 세포는 적합한 세포배양 조건하에서 성장하고, 렌티바이러스 입자가 세포 자체나 상기 기술된 세포배지로부터 회수된다. 적합한 생산자 세포주는 인간 배 신장 세포주 293, 말피부 세포주 NBL-6와 개 태아 흉선세포주 Cf2TH를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 벡터는 또한 안정한 패키징 세포(즉, 세포가 안정적으로 EIAV 바이러스 단백질을 발현하고 그 지체로서는 병원성 바이러스 입자를 생성하지 못함)를 제조하는 데 유용하다. 레트로바이러스 단백질을 발현하는 패키징 세포를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 테민(Temin) 등의 미국 특허 제 4,650,764 호에 개시된 방법에 의하여 증폭된다. 상기 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 범주내에서, 패키징 세포는 하나 이상의 EIAV 구조 단백질을 코딩하는 EIAV 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스-허용 숙주세포를 포함할 것이며, 이때 핵산 서열은 패키징-신호가 결손되고, 따라서 세포 자체가 하나 이상의 EIAV 구조 단백질을 생산할 수는 있지만, 복제-가능 병원성 바이러스를 생산하지는 못한다. 일 실시예로, EIAV 핵산 서열은 예를 들어 pEV53 과 같은 EIAV gag-pol 발현벡터이다. 패키징 세포는 적합한 EIAV 핵산 서열로 상기에 제공된 것과 같이 알려진 과정에 따라 EIAV-허용 숙주 세포(예를 들어, 인간 배 신장 293 세포)에 형질감염시킴으로써 만들어진다. 결과적 패키징 세포는 하나 이상의 EIAV 구조 단백질을 발현하고 생성할 수 있다. 그러나, EIAV 핵산 서열에서 패키징 신호가 결여되어 있으므로 그 자체로는 복제-가능 EIAV 바이러스를 생성하지 못한다. 그리고 나서 패키징 세포는 목적하는 이종 유전자와 적합한 패키징 신호를 포함할 수 있는 다른 핵산 서열(예를 들어 pEC-puro, pEC-lacZ 혹은 pCI-VSV-G)로 형질감염될 수 있다. 일단 부가적 서열(들)로 형질감염되면, 패키징 세포는 이종 유전자를 포함하지만 스스로 복제-불능인 EIAV 바이러스의 스톡을 제공하는데 이용될 수 있다.
백신과 같은 본 발명의 약학적 제형은 본 명세서에 개시된 바와 같은 병원성, 복제 결손 바이러스 입자의 면역원적 양과 약학적으로 허용되는 담체를 조합하여 포함한다. "면역원성 양"은 약학적 제형이 투여된 개체에서 면역 반응을 유발하기에 충분한 병원성 바이러스 입자의 양이다. 용량당 약 103에서 약 107바이러스 입자, 바람직하게는 약 104-106바이러스 입자의 양이 적합한 것으로 믿어지고, 처치되는 객체의 나이와 종 그리고 면역 반응이 나타나기 원하는 면역원에 의존한다. 약학적으로 허용되는 담체의 예는 멸균된 피로젠-제거 순수한 물과 멸균된 피로젠-제거 생리 식염수를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 병원성 복제-결손 바이러스 입자의 면역원성 양이 투여될 수 있는 대상은 인간과 동물(예를 들어 돼지, 소, 개, 말, 당나귀, 쥐, 햄스터, 원숭이)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 제형은 비경구(예를 들어, 피부내, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내), 경구 혹은 흡입 투여에 적합한 것을 포함한다. 다른 방법으로, 본 발명의 약학적 제형은 대상의 점막내 투여(예를 들어, 비강투여)에 적합할 수 있다. 제형은 일회용량 형태로 간단하게 제조될 수 있고 당업계에 알려진 어떠한 방법으로도 제조될 수 있다.
본 발명의 벡터와 방법은 시험관내 발현 시스템에 유용하고, 이때 두 번째 벡터에 삽입된 이종 유전자는 시험관내에서 생산되기 요망하는 단백질 혹은 펩티드를 코딩한다.
또한 본 발명의 벡터, 방법 및 약학적 제형은 치료방법 혹은 다른 목적으로 원하는 단백질 혹은 펩티드를 요구하는 대상에게 단백질 혹은 펩티드를 투여하는 방법에 유용하다. 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 두 번째 벡터에 위치하는 이종 유전자가 원하는 단백질 혹은 펩티드를 코딩하고, 헬퍼 세포나 본 발명의 헬퍼 세포를 포함하는 약학적 제형이 원하는 단백질 혹은 펩티드를 필요로 하는 대상에 투여된다. 이러한 방법에서, 단백질 혹은 펩티드는 대상의 생체내에서 생산될 수 있다. 하기에서 설명되는 것 처럼, 대상은 단백질 혹은 펩티드가 결손되어서, 혹은 대상에서 단백질 혹은 펩티드의 생산이 치료방법으로서 어떠한 치료적 효과를 발휘할 수 있어서, 단백질 혹은 펩티드를 필요로 할 수도 있다.
Ⅲ. 유전자 전달 기술
본 발명의 유전자 전달 기술은 몇가지 적용을 가진다. 가장 즉시의 적용은 아마 단백질의 기능적 도메인과 펩티드의 프로세싱을 밝히는 것이다. 단백질의 클론된 cDNA 혹은 게놈 서열은 프로세싱과 세포 운명에서 세포-특이 차이점을 연구하기 위하여, 배양중의 상이한 세포 타입으로 혹은 생체내로 도입될 수 있다. 코딩 서열은 강력한 프로모터의 조절하에 둠으로써, 원하는 단백질의 실질적인 양이 얻어질 수 있다. 나아가 단백질 프로세싱, 세포간 분류 혹은 생물학적 활성에 관여하는 특이 잔기가 코딩 서열의 분리된 잔기에서 돌연변이적 변화에 의하여 결정될 수 있다.
또한 본 발명의 유전자 전달 기술은 단백질의 발현을 조절하는 그리고 세포의 활동을 조절하는 그의 능력을 측정하는 수단을 제공하는데 적용될 수 있다. 분화에 대한 기능과 같이, 단백질의 어떠한 기능은 조직 배양으로 연구될 수 있지만, 반면 다른 것들은 관여하는 성질의 변화를 모니터하기 위하여 발생중의 상이한 시간에 생체내 시스템으로 재도입하는 것을 필요로 한다. 유전자 전달은 핵산 서열과 특정 유전자의 발현을 조절하는 세포 인자를 연구하는 수단을 제공한다. 그러한 연구로 접근하는 한 방법은 연구될 조절 요소를 리포터 유전자에 융합하여 리포터 유전자의 발현을 계속적으로 분석하는 것이다.
유전자 전달은 또한 질병 상태의 치료법을 이해하고 제공하는데 중요한 잠재적 이용을 가진다. 결손 유전자가 밝혀지고 클로닝된 많은 수의 유전병이 있다. 어떠한 경우에는, 이러한 클론된 유전자의 기능이 알려져 있다. 일반적으로, 상기 질병 상태는 일반적으로 열성 유전되는 흔히 효소의 결손 상태 및 우성 유전되는 적어도 가끔씩 조절 혹은 구조 단백질이 관여하는 불균형 상태의 두가지 분류로 나뉜다. 결손상태의 질병을 위하여, 유전자 전달은 안티센스 돌연변이를 이용한 질병의 동물 모델을 제조하는 것뿐 아니라 보충 치료법으로 정상 유전자를 영향을 받는 조직에 전달하는 데 이용될 수 있다. 불균형 질병의 상태를 위하여, 유전자 전달은 모델 시스템에서 질병 상태를 제조하는 데 이용될 수 있고, 그리고 나서 질병 상태를 극복하려는 노력에 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 유전적 질병의 치료를 가능하게 한다. 본 발명에서와 같이, 질병 상태는 질병을 일으키고 이를 더욱 심각하게 하는 결손이나 불균형을 부분적으로 혹은 전체적으로 치료함으로써 개선된다. 핵산 서열을 부위-특이적으로 삽입하여 돌연변이를 발생시키거나 결손을 정정하는 데도 이용가능하다.
조혈구 스템 세포, 림프구, 관내피 세포, 호흡기 상피 세포, 각질세포, 골격 및 근육 심장 세포, 신경과 암 세포는 시험관 내 혹은 생체내 방법으로 치료적 유전자 전달의 제안된 표적들이고, 이와 관련하여 밀러의 논문을 참조하라(A.D. Miller, Nature 357, 455-460(1992); R.C. Mulligan, Science 260, 926-932(1993)). 이러한 세포와 다른 것들이 본 발명의 벡터와 방법의 표적 세포로 적합하다.
요약하여, 본 발명의 바이러스 벡터는 분열 세포나 비분열 세포를 안정적으로 형질감염시키는데 이용될 수 있고, 안정적으로 이종 유전자를 발현하는데 이용할 수 있다. 이러한 벡터 시스템을 사용하여, 지금은 세포의 생리에 영향을 줄 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 분열 혹은 비분열 세포로 도입하는 것이 가능하다.
지금까지 본 발명을 기술하였고, 동일한 것을 특정 실시예를 참조로 하여 예시할 것이다. 본 명세서에 포함된 실시예는 예시하는 것을 목적으로 하는 것이며 본 발명을 한정하는 것이 아니다.
실시예 1. 플라스미드의 구축
본 명세서에 기술된 EIAV 벡터의 모 플라스미드는 플라스미드 pER2.1이고 미국 노스캐롤라이나 주립대의 프레드 풀러 박사(Fred Fuller)에 의하여 제공되었다. 클론 pER2.1의 구축은 페리 등의 논문에 기술되어 있다(S.T. Perry et al., J. Virol. 66, 4085-4097 (1992)). pER2.1은 EIAV의 말름퀴스트 와이밍 균주의 병원성 DNA 클론을 클로닝한다. 이 클론의 하나의 안정한 면은 생성된 바이러스가 그의 원래의 말 숙주에서는 질병을 유발하지 않는다는 것이다. 또한 유전자 전달을 위한 사용에서 고려되는 다른 레트로바이러스(예를 들어 쥐 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스)로부터 유래한 벡터와는 달리, 야생형 EIAV는 인간 세포에 활성적으로 감염되지 않는다.
EIAV gag/pol (첫 번째) 발현벡터. pEV53 플라스미드(도 2a 참조)는 바이러스 입자를 조립하고 세포로부터 방출하는데 필요한 EIAV 단백질을 발현하고, gag와 pol 유전자와 보조 단백질 rev 와 tat를 코딩하는 유전자를 포함한다. 그 기능이 알려지지 않은 당백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임 S2가 또한 포함되어 있다. pEV53 은 레트로바이러스-매개 바이러스 유전자의 전달을 배제하는 돌연변이를 포함하도록 구축되었다. 그러한 돌연변이는 바이러스 env 유전자 서열이 결실되고(따라서 복제-가능 EIAV의 생산의 가능성을 배제함), 바이러스 역전사와 삽입에 필요한 게놈의 3' 말단의 시스-액팅 서열 요소가 결실된 것이다. 결실이 포함되어 그 결과 바이러스 유전자가 병원성 입자로 패키징되지 않을 것이며, 그들은 복제되지 않을 것이다(예를 들어, 복제-가능 야생형 바이러스는 생성되지 않을 것이다). 도 2b에 도시된 플라스미드 pEV53A는 pEV53에서 유래한 것이지만, 역전사의 개시를 위한 tRNA 프라이며 결합 사이트 서열 뿐 아니라 프로모터/인핸서 요소와 삽입에 중요한 시스-액팅 요소를 포함하는 모든 EIAV 긴말단 반복서열이 결실된 점에서 pEV53과 상이하고, pEV53에서 902-1077번의 뉴클레오타이드가 결실된 것이다. 플라스미드 pEV53A는 EIAV 단백질의 발현정도에 영향을 미치지 않으면서 바이러스 유전자의 레드로바이러스-매개 전달의 기회를 더 감소시키는 변형이 이루어진 것이다.
유전자 전달 (두 번째) 벡터. pEC-lacZ(도 3 참조)와 pEC-puro(도 4 참조) 플라스미드는 유전자 전달을 위한 벡터로 제공하기 위하여 고안되었고, 목적하는 이종 유전자를 코딩하는 cDNAs의 삽입을 위한 다중 클로닝 사이트뿐 아니라, 벡터 게놈의 역전사(예를 들어 복제)를 지지하는데 필요한 모든 시스-액팅 서열 요소를 포함한다. pEC-lacZ 플라스미드는 베타-갈락토시다제 리포터 유전자 lacZ를 코딩하고, pEC-puro는 퓨로마이신-N-아세틸 트랜스퍼라제 선별적 마커 유전자 puro를 코당힌다.
바이러스 외피 유전자 발현 (세 번째) 벡터. 본 명세서에 기술된 발현 시스템의 세 번째 벡터는 도 5에 도시된 플라스미드 pCI-VSV-G이다. 이 플라스미드는 바이러스 외피 유전자, 특히 베시큘라 스토마티티스 바이러스 G 당단백질 유전자를 발현한다.
실시예 2. 바이러스 벡터의 제조와 시험
EIAV 벡터는 pEV53A gag-pol 발현 플라스미드, pCI-VSV-G env 발현 플라스미드와 pEC-lacZ 혹은 pEC-puro 발현 벡터 플라스미드를 인간 293 세포(미국 타입 컬쳐 콜렉션, 록빌, MD)의 배양물에 표준 칼슘 인산염-매개를 이용하여 공형질감염 시켜 제조하였다. 형질감염 48시간 후에, 배양 배지를 세포로부터 회수하여 EIAV 벡터 생성을 테스트하였다. pEC-puro 벡터의 유전자 전달 효율은 벡터의 순차적인 희석액이 퓨로마이신에 대한 저항성을 보이는 능력에 의하여 측정되었다. 이러한 분석에서 감염된 세포는 세포의 약물-저항 콜로니를 생성하였고, 그리고나서 이를 카운트하였다. 인간 293 세포는 표적 세포로 사용되었다. 6개의 개별적 실험으로부터, pEC-puro 벡터의 평균 타이터를 결정하였으며 ㎖ 당 2±1×105콜로니 형성 단위(cfu)였다.
pEC-lacZ 벡터의 유전자 전달 효율은 갈락토스의 유사체인 X-gal(Molecular Probes, Inc., 유진, 오레곤)로 감염된 인간 CFT1 인간 기도 상피 세포를 염색하여 측정하였다. 이러한 분석에서 베타-갈락토시다제 유전자를 발현하는 세포는 파란색으로 변하고, 파란색 세포의 퍼센트를 조사하였다. 최초에 감염된 세포수를 염색된 세포의 분수에 곱하여 바이러스의 타이터를 결정하였다. pEC-lacZ 벡터의 타이터는 ㎖ 당 5±1×104콜로니 형성 단위(cfu)였다.
몇 개의 대조 실험을 puro 및 lacZ 유전자의 발현이 바이러스 요소에 의하여 매개되는지 확인하기 위하여 수행되었다. 첫 번째 실험에서, pEV53 혹은 pEV53A와 pCI-VSV-G 벡터 양자가 EC-puro 및 EC-lacZ 벡터의 유전자 전달에 중요하다고 밝혀졌다. 상기 결과는 유전저 전달이 바이러스(유리 DNA가 아님)에 의하여 매개되는 발현과 상응하는 것이다. lacZ를 사용한 두 번째 대조 실험에서, 두 시간 감염 직후에 세포를 X-gal로 염색하였더니 파란색이 나타나지 않았다. 결과는 역전사, 삽입과 유전자 발현의 동시적 면과 일치되는 것으로 다른 레트로바이러스에서는 완성되기에 약 10시간의 최소 시간이 요구되는 것으로 알려져 있다.
실시예 3. 비-분열 세포로의 유전자 전달
EIAV는 대식세포와 기도 상피와 같은 비-분열, 종국적으로 분화한 세포에 감염될 수 있다. 이러한 성질을 본 발명에서 시험하기 위하여, 인간 CFT1 기도 상피 세포(노스 캐롤라이나 대학의 얀카스카 (J.R. Yankaskas) 박사가 제공함)를 아피디콜린으로 세포주기를 정지시키고 그리고 나서 pEC-lacZ 벡터로 감염시켰다. 대조구로서, 쥐 백혈병 바이러스(MuLV)로부터 유래한 lacZ-포함 레트로바이러스인 LZ 벡터로 동일하게 세포를 감염시켰다. 감염후 48시간후에, 배지를 X-gal로 베타-갈락토시다제 활성을 분석하기 위하여 염색하였다. 아피디콜린으로 처리한 배양물에서 아피디콜린은 감염중에나 감염후에도 존재하였다.
염색된 세포의 현미경적 사진을 도 6a에 도시하였다. LZ 벡터는 아피디콜린으로 처리되지 않은 세포(좌측 상부 패널)에 효과적으로 감염되었다. 그러나 세포가 아피디콜린의 처리에 의하여 세포주기가 멈췄을 때, 유전자 전달은 급격하게 감소되었다(우측 상부 패널). 이는 파란색을 거의 나타내지 않는 세포수를 세어서 분열세포에 대한 비분열 세포의 상대적 유전자 전달 효율을 LZ 벡터에 대하여 약 100에서 1 까지 나타냄으로서 측정되었다(도 6b 참조, 막대 그래프의 왼쪽쌍). 결과는 다른 실험자에 의한 실험결과와 일치하였다(D.C. Miller et al., Mol. Cell. Biol. 10, 4329-4242(1990); P.E. Lewis and M. Emerman, J. Viol., 68, 510-516(1994)를 참조하라). 감염시에, 아피디콜린 저해 효율을 시험하기 위하여 브로모데옥시우리딘(BrdU)으로 두시간 동안 양 배양물에 펄스를 주었고, BrdU이 DNA 에 삽입된 것을 분석하여 도 6c에 나타내었다. 그 결과 아피디콜린이 BrdU가 DNA로 삽입되는 것을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.
LZ 벡터에서 얻은 결과와는 상반되게, 아피디콜린 처리는 EC-lacZ 벡터에 의하여 감염된 인간 CFT1 세포의 퍼센트에 중요한 영향을 주지 않았다(도 6a의 하부 패널과 6B의 막대 그래프의 오른쪽 쌍을 참조). 이러한 결과들은 EIAV가 효과적으로 비분열세포에 감염될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어 도 7에서 나타난 실험에서, 말 피부 섬유아세포 세포주 NBL-6는 세포가 아피디콜린으로 처리되었을 때 세포가 아피디콜린으로 처리되지 않았을 때에 비교하여, 10배 잘 감염되었다(주어진 바이러스 양에서).
실시예 4. VSV-G 의사타입 EIAV 벡터의 한외원심분리
VSV-G 의사타입 EIAV 벡터의 하나의 이점은 VSV-G가 제공하는 증가하는 안정성이 한외원심분리로 침전됨에 의하여 감염력의 농축이 가능한 것이다(J.C. Burn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8033-8037(1993)). VSV-G 의사타입 EIAV 벡터의 감염력은 또한 원심분리 기술을 사용하여 침전함에 의하여 회복될 수 있다. 이 실험에서, 2-플라스미드(pEC-lacZ/pCI-VSV-G)가 공형질감염된 293 세포(pEV53 플라스미드를 안정적으로 발현하도록 변형됨)의 720㎖ EC-lacZ 포함 상등액을 고속 원심분리에서 바이러스를 침전시킴으로써 농축하였다. 침전물은 0.36㎖의 1X 행크의 평형 염 용액(HBSS, 카테고리 번호 14175, Life Technologies, Inc., 케테르브루그, MD)에 현탁하여 바이러스 입자를 2000배 농축하였다. 감염력이 결정되었고(도 8의 감염력에 대한 용량-반응 곡선을 참조), 타이터는 5×105에서 6×108으로 약 1200배 증가하였다. 따라서 감염력의 수득은 약 60% 였다. 이러한 결과는 EIAV 벡터가 침전에 의하여 고 타이터로 농축될 수 있음을 예시한다.
실시예 5. 세포주의 패키징
안전한 패키징 세포를 위하여 인간 배 신장 세포주 293이 pEV53으로 표준 칼슘 형질감염 과정을 사용하여 감염되었다. 세포는 G418(geneticin)(Life Technologies, Inc., 케테르브루그, MD)을 사용한 네오마이신의 발현으로 선별되었다. 개별적 콜로니가 선별되어, 확정되고 pECpuro와 pCI-VSV-G의 형질감염후의 바이러스 생산이 시험되었다. 가장 많은 벡터 생산을 나타낸 클론 패키징 세포주가 장기 보존을 위하여 동결되거나 패키징 기능의 유지 분석을 위하여 계속 배양되었다. 패키징 기능은 적어도 한달 이상 안정한 것으로 나타나. 본 발명이 안정하고 EIAV-기원 패키징 세포주의 생산에 유용하고 성공적임을 나타내었다.
발명이 그의 특정한 실시예와 연관되어 기술되었지만, 본 발명이 더 변형될 수 있음은 명백하고, 이러한 적용은 일반적으로 발명의 원리를 따르고 발명이 속하는 분야에서 알려진 혹은 전통적으로 실시되는 범위내이고 하기의 청구항의 범주내의 중요한 성질에 적용할 수 있는 범위내에서 본 명세서의 기재로부터 달성할 수 있는 본 발명의 어떠한 변형과 용도 혹은 적용을 포함하기 위하여 제공된 것이다.

Claims (36)

  1. (a) (ⅰ) 말 병원성 빈혈 바이러스(EIVA) 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 결손을 포함하고, (ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는, EIVA 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 벡터;
    (b) (ⅰ) 기능적(competent) 패키징 신호를 포함하고, (ⅱ) 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다중 클로닝 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 두 번째 벡터; 및
    (c) (ⅰ) 바이러스 외피 단백질을 발현하고, ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스의 핵산 서열을 포함하는 세 번째 벡터를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터 발현 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 두 번째 벡터는 하나 이상의 EIAV 구조 단백질의 발현이 결손된 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 첫 번째 벡터, 상기 두 번째 벡터 및 상기 세 번째 벡터는 적어도 EIAV 게놈의 일부의 cDNA 클론인 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 첫 번째 벡터는 gag-pol 발현 벡터이고 이때 상기 벡터는 env 유전자에서 결손을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 env 유전자에서 결손은 결실 돌연변이인 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 첫 번째 벡터와 상기 두 번째 벡터는 각각 env 유전자에서 결손을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 세 번째 벡터는 EIAV 외피 단백질이 아닌 외피 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 세 번째 벡터는 베지큘라 스토마티티스 바이러스 G 당단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 두 번째 벡터는 이종 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 이종 유전자는 항원성 단백질 혹은 펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 첫 번째 벡터는 플라스미드 pEV53와 플라스미드 pEV53A 로 이루어지는 군에서 선택되고; 상기 두 번째 벡터는 플라스미드 pEC-lacZ와 플라스미드 pEC-puro로 이루어지는 군에서 선택되고; 상기 세 번째 벡터는 플라스미드 pCI-VSV-G인 것을 특징으로 하는 벡터 시스템.
  12. 도 2a에 도시된 플라스미드 pEV53.
  13. 도 2b에 도시된 플라스미드 pEV53A.
  14. 도 2에 도시된 플라스미드 pEC-lacZ.
  15. 도 3에 도시된 플라스미드 pEC-puro.
  16. 도 4에 도시된 플라스미드 pCI-VSV-G.
  17. (a) (ⅰ) EIVA 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 결손을 포함하고, (ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는, EIVA 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 벡터;
    (b) (ⅰ) 기능적(competent) 패키징 신호를 포함하고, (ⅱ) 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다중 클로닝 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 두 번째 벡터; 및
    (c) (ⅰ) 바이러스 외피 단백질을 발현하고, ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스의 핵산 서열을 포함하는 세 번째 벡터로 세포를 감염시키는 것을 포함하는 복제-결손 렌티바이러스 입자의 제조방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 세포는 비-분열 세포인것을 특징으로 하는 제조방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 두 번째 벡터는 이종 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제 17 항의 방법에 따라서 제조된 복제-결손 렌티바이러스 입자.
  21. 프로모터와 이종 유전자 서열을 포함하는 EIAV 핵산 서열을 포함하고, 이때 상기 핵산 서열은 하나 이상의 EIAV 구조 단백질을 코딩하는 것이 결손되어 바이러스 입자가 복제 결손인 것을 특징으로 하는 병원성 EIAV 입자.
  22. 제 17 항의 방법에 따라서 제조된 렌티바이러스 입자인 복제-결손 렌티바이러스 입자를 포함하는 세포.
  23. (a) (ⅰ) EIVA 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 결손을 포함하고, (ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는, EIVA 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 벡터;
    (b) (ⅰ) 기능적(competent) 패키징 신호를 포함하고, (ⅱ) 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다중 클로닝 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 두 번째 벡터; 및
    (c) (ⅰ) 바이러스 외피 단백질을 발현하고, ⅱ) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스의 핵산 서열을 포함하는 세 번째 벡터로 표적 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 세포로 이종 유전자를 운반하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 표적 세포는 비-분열 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. (a) (ⅰ) (1) EIVA 구조 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에서 하나 이상의 결손을 포함하고, (2) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는, EIVA 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 벡터;
    (ⅱ) (1) 기능적(competent) 패키징 신호를 포함하고, (2) 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다중 클로닝 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하는 두 번째 벡터; 및
    (ⅲ) (1) 바이러스 외피 단백질을 발현하고, (2) 결손 패키징 신호를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스의 핵산 서열을 포함하는 세 번째 벡터로 렌티바이러스-허용 생산자 세포를 형질감염시키는 단계;
    (b) 상기 생산자 세포를 복제-결손 렌티바이러스 입자를 생산하기에 충분한 세포 배양 조건하에서 생장시키는 단계; 및
    (c) 상기 복제-결손 렌티바이러스 입자를 상기 생산자 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는 렌티바이러스 스톡의 제조방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 생산자 세포는 세포 배양 배지에서 생장하고, 이때 상기 복제-결손 렌티바이러스 입자는 상기 배지로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  27. 제 25 항의 (c) 단계에 따라 회수된 복제-결손 렌티바이러스 입자를 표적 세포에 감염시키는 것을 포함하는 표적 세포로 이종 유전자를 운반하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 표적 세포가 비-분열 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 상기 표적 세포는 인간 기도 상피세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 복제-결손 렌티바이러스 입자로 표적 세포를 감염시키는 것을 포함하는 표적 세포로 이종 유전자를 운반하는 방법.
  31. 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 복제-결손 렌티바이러스 입자와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  32. 렌티바이러스-허용 세포를 EIAV 게놈의 적어도 일부의 핵산 서열을 포함하고 결손 패키징 신호를 포함하는 벡터로 형질감염시키는 단계를 포함하는 패키징 세포의 제조방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 벡터는 gag-pol 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 32 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 pEV53과 플라스미드 pEV53A로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 32 항에 있어서, 상기 렌티바이러스-허용 세포는 인간 293 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 하나 이상의 EIAV 구조 단백질을 코딩하는 EIAV 핵산 서열을 포함하고, 이때 상기 핵산 서열은 패키징 신호가 결손되어 세포 자체로는 하나 이상의 EIAV 구조 단백질을 생산할 수는 있지만 복제-감응 병원성 바이러스는 생산할 수 없는 것을 특징으로 하는 패키징 세포.
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