DE60038567T2 - Modifiziertes gp100 und dessen verwendung - Google Patents

Modifiziertes gp100 und dessen verwendung

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    • C12N2710/24071Demonstrated in vivo effect

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Fachgebiet der Immuntherapie und betrifft die Konstruktion neuer Formen von gp100, welche für die Erzeugung von Immunantworten in vivo geeignet sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Auftreten von kutanem bösartigen Melanom und die Sterblichkeit hieran haben über die letzten Jahrzehnte dramatisch zugenommen (Liu, T., et al. (1996) Surg Clin North Am 76: 1205; Gloster, H. M., et al. (1996) Dermatol Surg 22: 217). Derzeitig beträgt das geschätzte Lebenszeit-Risiko für einen Amerikaner, ein Melanom zu entwickeln, ungefähr 1 zu 90 (Rigel, D. S., et al. (1979) Mayo Clin Proc 72: 367). Während die meisten Melanome im Frühstadium erfolgreich durch einfaches chirurgisches Herausschneiden behandelt werden können (Greenstein, D. S., et al. (1995) Dermatol Surg 21: 927; Whooley, B. P., et al. (1995) Dermatol Surg 4: 187; Urist, M. M., et al. (1996) Ann Rev Med 47: 211), werden Patienten mit einer fortgeschrittenen Krankheit selten geheilt, selbst bei aggressiver Chemotherapie und/oder Immuntherapie (Falkson, C. I., et al. (1995) Anticancer Drugs 6: 709).
  • Obwohl Melanom als ein aggressiver Primärschaden vorhanden sein kann, welcher innerhalb von Wochen metastasiert, findet seine Entwicklung typischerweise über eine Zeitperiode von mehreren Monaten bis Jahren statt und nimmt seinen Fortgang über eine Reihe von getrennten pathologischen Stadien. Das früheste Stadium ist das Melanom der radialen Wachstumsphase (RGP), welches als ein intradermales Neoplasma (Melanom in situ) beginnt. RGP-Melanome können Monate oder sogar Jahre lang in relativer Ruhe verbleiben und werden im Allgemeinen durch einfaches Herausschneiden geheilt. Schließlich entwickeln die meisten RGP-Melanome eine Komponente des vertikalen Wachstums (Melanom der vertikalen Wachstumsphase, VGP), welche einen aggressiveren Tumor kennzeichnet, der mit geringerer Wahrscheinlichkeit durch einfaches Herausschneiden geheilt werden kann. Die metastatische Ausbreitung ist das Endstadium in der Tumorprogression und deutet auf ein sehr schlechtes Endergebnis hin (Reintgen, D. (1997) Ann Surg 225: 1).
  • Der wichtigste prognostische Faktor in der Bestimmung des Überlebens bei einem Patienten mit primärem Melanom ist die Tiefe der Läsion. Während das Fünf-Jahre-Überleben für Patienten mit Tumoren von ≤ 0,75 mm Dicke ungefähr 96% beträgt, weisen Individuen mit Tumoren > 4,5 mm Tiefe ein Fünf-Jahre-Überleben von nur ungefähr 38% auf (Whooley, B. P., et al. (1995) Dermatol Surg 4: 187; Urist, M. M., et al. (1996) Ann Rev Med 47: 211). Da die Entwicklung eines VGP-Melanoms aus seinem RGP-Vorläufer im Allgemeinen wenigstens einige Monate beansprucht, existiert ein "Zeitfenster", innerhalb dessen das chirurgische Herausschneiden einen dramatischen Effekt auf das Patientenergebnis aufweisen kann. Geht man noch weiter, ist es vernünftig, vorzuschlagen, dass neue Herangehensweisen zum Umgang mit der Restkrankheit zu dieser Zeit am erfolgreichsten sind.
  • Mehrere Beweislinien legen nahe, dass eine Manipulation von Immunantworten gegen Melanom therapeutisch sein kann: 1. Klinische Beobachtungen einer spontanen Regression von metastatischem Melanom können durch eine Anti-Melanom-Immunantwort verursacht werden (Nelson, C. A., et al. (1976) Natl Cancer Inst Monogr 44: 145). 2. Eine Regression von metastatischem Melanom ist auch in einigen Patienten beobachtet worden, denen man hohe Dosen an IL-2 mit oder ohne Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK) oder tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL's) verabreichte (Rosenberg, S. A., et al. (1998) J Natl. Cancer Inst 90: 1894). 3. Noch kürzlicher ist eine Anzahl von Melanom-spezifischen und -assoziierten Tumorantigenen kloniert worden (Van den Eynde, B., et al. (1997) Curr Opin Immunol 9: 684). Die Verfügbarkeit dieser Reagenzien hat zur Hoffnung geführt, dass spezifische Impfstoffe entwickelt werden können, um die Fähigkeit von tumorspezifischen T-Zellen zu steigern, Melanomzellen zu eliminieren. Diese Antigene können in einer Vielzahl von Zuführungsvehikeln verabreicht werden, und das effektivste Dosierungsschema für ein Optimierung einer Anti-Tumor-Antwort ist derzeitig nicht eindeutig.
  • Herkömmliche Impfstoffe für viele Infektionskrankheiten haben gezeigt, dass eine primäre infektiöse Herausforderung eine effektive schutzgebende Gedächtnis-Immunantwort induzieren kann. Ein kritisches Ereignis, das zum Initiieren einer Immunantwort erforderlich ist, selbst in Gegenwart von zirkulierenden Tumor-reaktiven T-Zellen, besteht darin, dass Tumorantigene Zugang in die sekundären Lymphoidstrukturen der Milz und der Lymphknoten erlangen (Zinkernagel, R. M., et al. (1997) Immunol Rev 156: 199). Ein Melanom, welches sich lokal in der Haut entwickelt, ist vor dem Immunsystem verborgen, solange die Tumorantigene die sekundären Lymphoidorgane nicht erreichen. Der Tumor kann dann zu einer so großen Masse heranwachsen, dass zu der Zeit, an welcher eine Immunantwort ausgelöst wird, selbige rasch von dem Tumor überlastet wird (Moskophiis, D., et al. (1993) Nature 362: 758). Alternativ dazu können Melanomzellen, welche ausbrechen und zu dem örtlichen Lymphknoten gelangen, nicht in der Lage sein, eine Immunantwort auszulösen, weil sie schlechte Antigen-präsentierende Zellen sind, d. h. keine hohen Spiegel an HLA-Klasse I-Molekülen (Ferrone, S. (1995) Immunology Today 61: 487) oder costimulatorischen Molekülen, wie Mitglieder der B7-Familie (Bluestone, J. A., et al. (1995) Immunity 2: 555), exprimieren. Erneut kann der Tumor eine Tolerierungs-Größe erreichen, bevor eine Immunantwort initiiert wird. Eine erfolgreiche Impfungsstrategie in Patienten mit tiefem, aber nicht-metastatischen, Melanom sollte sowohl die Zahl an Tumor-reaktiven T-Zellen erhöhen als auch diese aktivieren, sodass sie in die Peripherie wandern und ihre zytotoxische Effektorfunktion ausüben können.
  • gp100 wird normalerweise in Melanosomen vorgefunden und in Melanozyten, retinalen Zellen und anderen Abkömmlingen der Neuralrinne exprimiert (Kawakami, Y., et al. (1997) Int Rev Immunol 14: 173). Die Funktion von gp100 ist derzeit unbekannt (Rosenberg, S. A., et al. (1998) Nature Med 4: 321). Durch Massenspektrometrie sind drei immundominante HLA-A2-bindende gp100-Peptide identifiziert worden: g9-154 (Aminosäuren 154-162), g9-209 (Aminosäuren 209-217) und g9-280 (Aminosäure 280-288) (Kawakami, Y., et al. (1995) J Immunol 154: 3961). Insbesondere sind zwei dieser Peptide synthetisch verändert worden, sodass eine stärkere Immunantwort im ursprünglichen T-Zellklon induziert wird: das Threonin an der Position 2 in g9-209 wurde zu einem Methionin verändert, und der Alaninrest an der Position 9 in g9-280 wurde zu einem Valin verändert (Parkhurst, qqM. R., et al. (1996) J Immunol 157: 2539). Diese Änderungen erhöhen die Bindungsaffinität der Peptide an das HLA-A2-Molekül ohne Änderung der vom T-Zell-Rezeptor (TCR) erkannten Epitope. Rosenberg et al. haben bereits erfolgreich Melanompatienten mit einem dieser modifizierten Peptide immunisiert und objektive klinische Antworten in einigen Patienten erzielt (Rosenberg, S. A., et al. (1998) Nature Med 4: 321).
  • Es wurde gezeigt, dass ein Pocken- bzw. Poxvirusvektor, der eine Nukleinsäure umfasst, die gp100 codiert, welches an den Codons 210 (T210M) und 288 (A288V) modifiziert ist, eine gp100-spezifische Immunantwort in Mäusen induziert (Irvine, K., et al. (1999) Cancer Research 59: 2536).
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine pharmazeutische Zusammensetzung entwickelt, umfassend ein Poxvirus, das darin inseriert eine gp100M codierende, in 1 gezeigte, Nukleinsäuresequenz, definiert durch SEQ. ID. Nr.: 1, aufweist, zum Primen, und die Peptide, die aus Aminosäuresequenzen gemäß SEQ. ID. Nr.: 124 und SEQ. ID. Nr.: 125 bestehen, zum Boosten, wobei die Zusammensetzung für die getrennte Verabreichung des Vektors und der Peptide hergerichtet ist. Diese Zusammensetzung kann für die Erzeugung einer Immunantwort gegen humanes Melanom durch sequentielle Verabreichung verwendet werden.
  • Die Nukleinsäuresequenz von gp100M ist in 1 gezeigt, und ist hierin ebenfalls als SEQ. ID. Nr.: 1 bekannt. Die von der Nukleinsäuresequenz von gp100M codierte, entsprechende Aminosäuresequenz ist in der 2 gezeigt, welche hierin als SEQ. ID. Nr.: 2 bezeichnet wird.
  • Es wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül beschrieben, welches bereitgestellt wird, wobei es eine Sequenz, wie in der 1 gezeigt (SEQ. ID. Nr.: 1), aufweist.
  • Vorzugsweise umfasst das gereinigte und isolierte Nukleinsäuremolekül:
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, wie gezeigt in SEQ. ID. Nr.: 1, worin T ebenfalls U sein kann;
    • (b) Nukleinsäuresequenzen, die zu (a) komplementär sind;
    • (c) Nukleinsäuresequenzen, die zu (a) oder (b) homolog sind;
    • (d) ein Fragment von (a) bis (c), das mindestens 15 Basen, vorzugsweise 20 bis 30 Basen lang ist und das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an (a) bis (d) hybridisiert; oder
    • (e) ein Nukleinsäuremolekül, das sich von jeder der Nukleinsäuren von (a) bis (c) hinsichtlich der Codonsequenzen auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet.
  • Es werden ein isoliertes gp100M-Protein und/oder immunogene Fragmente davon, codiert von einem Nukleinsäuremolekül der Erfindung, beschrieben. Das gp100M besitzt die Aminosäure[sequenz], wie in der 2 gezeigt (SEQ. ID. Nr.: 2).
  • Bevorzugte Fragmente schließen ein Fragment ein, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr.: 124 oder gemäß SEQ. ID. Nr.: 125 aufweist.
  • Auch wird ein Verfahren zum Modulieren des Immunsystems eines Tiers beschrieben, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge eines gp100 oder gp100, welches modifiziert worden ist, um ein Molekül bereitzustellen, welches das Immunsystem moduliert, an ein hierfür bedürftiges Tier. Vorzugsweise handelt es sich bei dem modifizierten gp100 oder gp100 um gp100M bzw. gp100M, am stärksten bevorzugt weisen das modifizierte gp100 oder gp100 die Sequenzen von SEQ. ID. Nr.: 1 bzw. 2 auf.
  • Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zum Modulieren des Immunsystems eines Tiers, umfassend das Verabreichen, an ein hierfür bedürftiges Tier, einer wirksamen Menge eines Vektors, in welchen ein gp100 inseriert worden ist, das modifiziert worden ist, um ein Molekül vorzusehen, welches das Immunsystem moduliert, wobei der Vektor vorzugsweise viral ist, [und] das Virus vorzugsweise ein Adenovirus, Alphavirus oder Poxvirus ist. Stärker bevorzugt handelt es sich bei dem Virus, falls es ein Poxvirus ist, um Vaccinia, Fowlpox bzw. Geflügelpocken, Avipox bzw. Vogelpocken, TROVAC, ALVAC, NYVAC oder MVA, vorzugsweise ALVAC.
  • Das modifizierte gp100 oder gp100 können mit einem zweiten Mittel, vorzugsweise einem Lymphokin, Cytokin oder costimulatorischen Molekül, wie einem Mitglied der B7-Molekülfamilie, verabreicht werden, wobei das Cytokin vorzugsweise GM-CSF, IL-2, IL-12, TNF oder IFNγ1 ist.
  • Es wird ein Verfahren zum Stimulieren des Immunsystems eines Tiers beschrieben, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines gp100 oder gp100, welches modifiziert worden ist, um ein Molekül vorzusehen, welches das Immunsystem stimuliert, vorzugsweise gp100M bzw. gp100M, an ein hierfür bedürftiges Tier, wobei das modifizierte gp100 oder gp100 am stärksten bevorzugt die Sequenzen von SEQ. ID. Nr.: 1 bzw. 2 aufweisen.
  • Es wird ein Verfahren zum Steigern der Effizienz eines Gen-Impfstoffs bei der Behandlung eines Tiers beschrieben, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines gp100, welches modifiziert worden ist, um ein Molekül vorzusehen, welches das Immunsystem stimuliert, vorzugsweise gp100M; zum Beispiel in bevorzugter Weise, wenn das Tier Krebs hat.
  • Es wird eine Zusammensetzung zum Modulieren des Immunsystems eines Tiers beschrieben, umfassend eine effektive Menge eines gp100, das modifiziert worden ist, um ein Molekül vorzusehen, welches das Immunsystem stimuliert, vorzugsweise gp100M, in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger, wobei das modifizierte gp100 am stärksten bevorzugt die Sequenz von SEQ. ID. Nr.: 1 aufweist.
  • Es werden Verfahren für prophylaktische oder therapeutische Anwendungen beschrieben, welche eine Nukleinsäuresequenz beteiligen, die ein modifiziertes gp100, vorzugsweise gp100M, weiter bevorzugt ein gp100M mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr.: 2, codiert.
  • Es wird ebenfalls ein Melanomimpfstoff beschrieben, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, codierend ein modifiziertes gp100, zum Verhindern oder Behandeln von Krebs, vorzugsweise gp100M, weiter bevorzugt ein gp100M mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr.: 2.
  • Ebenfalls beschrieben wird ein Melanomimpfstoff, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, codierend ein modifiziertes gp100, zum Verhindern oder Behandeln von Melanom, vorzugsweise gp100M, weiter bevorzugt ein gp100M mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr.: 2.
  • Es wird eine modifizierte gp100-Proteinsequenz, welche modifiziert ist, um ihre Immunogenizität zu erhöhen oder ihre Induktion einer Anti-Melanom-Immunantwort durch Verbesserung der Bindung an MHC-Moleküle zu steigern, zur Verwendung in hierin beschriebenen prophylaktischen oder therapeutischen Verfahren beschrieben.
  • Es wird ein Impfstoff beschrieben, umfassend eine modifizierte gp100-Nukleinsäuresequenz oder ihr entsprechendes Protein, fähig zum Hervorrufen der Produktion von Antikörpern in einem Säugetier gegen entsprechende Antigene, vorzugsweise gp100M bzw. gp100M, weiter bevorzugt ein gp100M mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr.: 1 und ein gp100M mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. Nr.: 2.
  • Es wird eine antigene, immunologische oder Impfstoff-Zusammensetzung oder eine therapeutische Zusammensetzung zur Induzierung einer antigenen oder immunologischen Antwort in einem mit der Zusammensetzung inokulierten Wirtstier beschrieben, wobei der Impfstoff ein modifiziertes rekombinantes Virus einschließt, bei welchem nicht-essenzielle Virus-codierte genetische Funktionen inaktiviert sind, sodass das rekombinante Virus eine abgeschwächte Virulenz und eine verbesserte Sicherheit aufweist.
  • Es wird eine immunogene Zusammensetzung beschrieben, enthaltend ein modifiziertes rekombinantes Virus, bei welchem nicht-essenzielle Virus-codierte genetische Funktionen inaktiviert sind, sodass das rekombinante Virus eine abgeschwächte Virulenz und eine verbesserte Sicherheit aufweist.
  • Es wird ein modifiziertes rekombinantes Virus beschrieben, bei welchem nicht-essenzielle Virus-codierte genetische Funktionen darin inaktiviert sind, sodass das Virus eine abgeschwächte Virulenz aufweist, und wobei das modifizierte rekombinante Virus ferner DNA aus einer heterologen Quelle in einer nicht-essenziellen Region des Virusgenoms enthält.
  • Es wird ein rekombinantes Virus beschrieben, umfassend ein Virus, in welches eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung inseriert ist, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid codiert, wobei das rekombinante Virus die Expression des Polypeptids in einer infizierten Zelle verursacht.
  • Es wird ein rekombinantes Virus beschrieben, in welches eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung inseriert ist, wobei die Nukleinsäure ein modifiziertes gp100-Polypeptid codiert, wobei mit dem rekombinanten Virus infizierte Zellen zur Hervorrufung einer Immunantwort direkt gegen ein Mitglied in der Lage sind, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
    • (1) dem Polypeptid;
    • (2) einem Fragment des Polypeptids;
    • (3) einer Zelle, welche das Polypeptid oder ein Fragment davon exprimiert; oder
    • (4) Zellen, welche das Protein oder Fragment davon binden, wobei das Virus vorzugsweise Adenovirus, Alphavirus oder Poxvirus ist, wobei das Virus, falls es Poxvirus ist, vorzugsweise Vaccinia, Fowlpox, Avipox, TROVAC, ALVAC, NYVAC oder MVA ist, wobei das Virus bevorzugt ALVAC ist.
  • Ein derartiges rekombinantes Virus kann Teil einer Zusammensetzung sein, welche das jeweilige rekombinante Virus und ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
  • Gleichfalls werden das Produkt der Expression eines rekombinanten Virus, das eine Nukleinsäure einschließt, codierend ein modifiziertes gp100, wobei das Virus vorzugsweise ein Adenovirus, Alphavirus oder Poxvirus ist, wobei das Virus, sofern es Poxvirus ist, weiter bevorzugt Vaccinia, Fowlpox, Avipox, TROVAC, ALVAC, NYVAC oder MVA, vorzugsweise ALVAC, ist, und Anwendungen dafür, wie etwa zur Bildung antigener, immunologischer oder Impfstoff-Zusammensetzungen zur Behandlung, Prävention, Diagnose oder zum Testen; sowie DNA aus dem rekombinanten Poxvirus, welche beim Konstruieren von DNA-Sonden und PCR-Primern brauchbar ist, beschrieben.
  • Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung offensichtlich. Es versteht sich jedoch, dass die ausführliche Beschreibung und die spezifischen Beispiele lediglich zur Veranschaulichung angegeben sind, obgleich sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben.
  • BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Zeichnung(en) besser verständlich, worin:
  • 1 die Nukleinsäuresequenz von gp100M-cDNA zeigt.
  • 2 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz für das gp100M-Protein.
  • 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz von C5H6gp100M, der H6-Protomor-gesteuerten humanen gp100M-Insertionskassette.
  • 4 zeigt eine schematische Wiedergabe des ALVAC(2)-gp100M(vCP1584)-Genoms.
  • 5 zeigt die Nukleotidsequenz der Oligonukleotidprimer, die zum Sequenzieren von pBS/1584 verwendet werden.
  • 6 zeigt Immunopräzipitat-Ergebnisse aus nicht-infizierten HeLa-Zellen oder Zellen, welche entweder mit parentalem ALVAC-Virus, ALVAC-gp100 oder ALVAC(2)-gp100M infiziert waren.
  • 7 zeigt einen Western-Blot von HeLa-Zellen, welche mit einem von parentalem ALVAC-Virus, ALVAC-gp100 oder ALVAC(2)-gp100M infiziert waren, wobei die Expression von Volllängen-gpl00 in ALVAC-gp100- oder ALVAC(2)-gp100M-infizierten Zellen veranschaulicht ist.
  • 8 ist eine Säulengrafik, welche die Ergebnisse einer IFN-γ-ELISPOT-Analyse eines Tiers zeigt, das eine intranodale Injektion des Tumorantigens empfängt.
  • 9 ist eine Säulengrafik, welche die Ergebnisse einer IFN-γ-ELISPOT-Analyse eines Tiers zeigt, das eine intranodale Injektion des Tumorantigens empfängt.
  • 10 ist eine Säulengrafik, welche die Ergebnisse einer IFN-γ-ELISPOT-Analyse eines Tiers zeigt, das eine subkutane Injektion des Tumorantigens empfängt.
  • 11 ist eine Säulengrafik, welche die Ergebnisse einer IFN-γ-ELISPOT-Analyse eines Tiers zeigt, das eine subkutane Injektion des Tumorantigens empfängt.
  • 12 ist eine Grafik, welche die Antikörperantwort nach einem Dosierungsschema von intranodaler (Gruppe 2) und subkutaner (Gruppe 3) Verabreichung von ALVAC-modifiziertesgp100/modifiziertes-gp100-Peptid-Immunogenen zeigt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Wie bereits erwähnt, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung entwickelt, die ein Poxvirus, das darin inseriert eine Nukleinsäuresequenz, die gp100M codiert, wie gezeigt in der 1, definiert durch SEQ. ID. Nr.: 1, aufweist, zum Primen, und die Peptide, bestehend aus den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ. ID. Nr.: 124 und SEQ. ID. Nr.: 125, zum Boosten, umfasst, wobei die Zusammensetzung für die getrennte Verabreichung des Vektors und der Peptide hergerichtet ist. Diese Zusammensetzung ist zur Erzeugung einer Immunantwort gegen humanes Melanom durch sequentielle Verabreichung brauchbar.
  • I. IN DER ERFINDUNG VERWENDETE NUKLEINSÄUREMOLEKÜLE
  • Wie oben erwähnt, haben die Erfinder das Gen (gp100M) und sein Genprodukt (gp100M) beschrieben und charakterisiert.
  • Allgemein ausgedrückt, wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül beschrieben, umfassend eine Sequenz, die ein Protein mit der Aktivität eines gp100 codiert, das modifiziert worden ist, um ein Molekül vorzusehen, welches das Immunsystem stimuliert. Wie hierin verwendet, schließt ein gp100, das modifiziert worden ist, um ein Molekül vorzusehen, welches das Immunsystem stimuliert, diejenigen gp100-Sequenzen mit modifizierten Sequenzen bei etwa den Aminosäuren 209 und/oder bei etwa 280 (wie dargestellt in Parkhurst, M. R., et al., J. Immunol. 157: 2539–2548 (1996)) und/oder immunogene Fragmente davon ein.
  • Es wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül beschrieben, das ein modifiziertes gp100 codiert, welches zum Modulieren des Immunsystems in der Lage ist. Der Begriff "isoliert" bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die von zellulärem Material oder Kulturmedium, falls sie durch rekombi nante DNA-Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, falls sie chemisch synthetisiert wird, im Wesentlichen frei ist. Der Begriff "Nukleinsäure" schließt beabsichtigtermaßen DNA und RNA ein, und diese kann entweder doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül wird beschrieben, wobei es eine Sequenz, wie in der 1 gezeigt, aufweist.
  • Vorzugsweise umfasst das gereinigte und isolierte Nukleinsäuremolekül:
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, wie in 1 gezeigt, worin T ebenfalls U sein kann;
    • (b) Nukleinsäuresequenzen, die komplementär zu (a) sind;
    • (c) Nukleinsäuresequenzen, die homolog zu (a) oder (b) sind;
    • (d) ein Fragment von (a) bis (c), das wenigstens 15 Basen, vorzugsweise 20 bis 30 Basen lang ist und das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an (a) bis (c) hybridisiert; oder
    • (e) ein Nukleinsäuremolekül, das sich von jeder der Nukleinsäuren von (a) bis (c) hinsichtlich Codonsequenzen auf Grund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet.
  • Es werden Nukleinsäuremoleküle beschrieben, welche Verkürzungen der Proteine der Erfindung sowie Analoge und Homologe der Proteine der Erfindung und Verkürzungen davon, wie nachstehend beschrieben, codieren.
  • Es werden ebenfalls Nukleinsäuremoleküle beschrieben, welche Nukleinsäuresequenzen mit einer wesentlichen Sequenzhomologie zu der Nukleinsäuresequenz, wie in der 1 gezeigt, und Fragmenten davon, aufweisen. Der Begriff "Sequenzen mit wesentlicher Sequenzhomologie" bezeichnet diejenigen Nukleinsäuresequenzen, welche geringfügige oder folgenlose Sequenzabweichungen von diesen Sequenzen aufweisen, d. h. die Sequenzen funktionieren auf im Wesentlichen die gleiche Weise, um funktionell äquivalente Proteine herzustellen. Die Abweichungen können auf lokale Mutationen oder strukturelle Modifikationen zurückzuführen sein.
  • Im Allgemeinen schließen Nukleinsäuresequenzen mit einer wesentlichen Homologie Nukleinsäuresequenzen mit wenigstens 70%, vorzugsweise 80–90% Identität zu der Nukleinsäuresequenz, wie in der 1 gezeigt, ein.
  • Ebenfalls beschrieben sind ein Nukleinsäuremolekül und Fragmente davon mit wenigstens 15 Basen, welche an die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung unter Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise stringenten Hybridisierungsbedingungen, hybridisieren. Geeignete Stringenzbedingungen, welche die DNA-Hybridisierung fördern, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt (zum Beispiel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6). Hybridisierungsvorgehen sind dem Fachmann ebenfalls durchaus bekannt (wie zum Beispiel beschrieben in Ausubel et. al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. (1994), Silhavy et al., Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1984); Davis et al., Methods in Enzymol. 65: 404 (1980)). Bedeutende Parameter, welche für die Optimierung von Hybridisierungsbedingungen in Betracht gezogen werden können, werden in einer Formel widergespiegelt, welche die Berechnung eines kritischen Werts, der Schmelztemperatur, über welcher zwei komplementäre DNA-Stränge sich voneinander trennen, gestattet (Davis et al., Methods in Enzymol. 65: 404 (1980)). Diese Formel ist wie folgend: Tm = 81,5 + 0,41 × (% G + C) + 16,6 log (tatsächliche Ionenkonzentration) – 0,63 × (% Formamid) – 600/Basenzahl. Unter geeigneten Stringenzbedingungen ist die Hybridisierungstemperatur (Th) ungefähr 20 bis 40°C, 20 bis 25°C oder vorzugsweise 30 bis 40°C unter der berechneten Tm. Der Fachmann auf dem Gebiet wird verstehen, dass optimale Temperatur- und Salzbedingungen ohne Weiteres empirisch in Vorbereitungsexperimenten unter Anwendung herkömmlicher Verfahrensweisen bestimmt werden können.
  • Zum Beispiel können stringente Bedingungen sowohl für Vorhybridisierungs- als auch Hybridisierungsinkubationen (i) innerhalb von 4 bis 16 Stunden bei 42°C, in 6 × SSC mit 50% Formamid, oder (ii) innerhalb von 4–16 Stunden bei 65°C in einer wässrigen 6 × SSC-Lösung (1 M NaCl, 0,1 M Natriumcitrat (pH 7,0)) erzielt werden. Typischerweise werden Hybridisierungsexperimente bei einer Temperatur von 60 bis 68°C, z. B. 65°C, durchgeführt. Bei einer solchen Temperatur können stringente Hybridisierungsbedingungen in 6 × SSC, vorzugsweise in 2 × SSC oder 1 × SSC, weiter bevorzugt in 0,5 × SSC, 0,3 × SSC oder 0,1 × SSC (in Abwesenheit von Formamid) erreicht werden. 1 × SSC enthält 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat.
  • Für Polynukleotide mit 30 bis 600 Nukleotiden wird die oben genannte Formel verwendet und dann durch Subtrahieren von (600/Polynukleotidgröße in Basenpaaren) korrigiert. Stringenzbedingungen sind durch eine Th definiert, welche 5 bis 10°C unter der Tm liegt.
  • Hybridisierungsbedingungen mit kürzeren Oligonukleotiden als 20 bis 30 Basen folgen nicht exakt den oben dargestellten Regeln. In solchen Fällen ist die Formel zur Berechnung der Tm wie folgend: Tm = 4 × (G + C) + 2 (A + T). Zum Beispiel wird ein 18-Nukleotid-Fragment von 50% G + C eine ungefähre Tm von 54°C aufweisen.
  • Nukleinsäuremoleküle aus einem modifizierten gp100-Gen, wie dem gp100M-Gen, können durch Herstellen einer markierten Nukleinsäuresonde, basierend auf der Gesamtheit oder einem Teil der Nukleinsäuresequenz, wie in 1 gezeigt, und Verwenden dieser markierten Nukleinsäuresonde zum Screenen einer geeigneten DNA-Bibliothek (z. B. einer cDNA- oder einer genomischen DNA-Bibliothek) isoliert werden. Durch Screenen einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek isolierte Nukleinsäuren können durch Standardtechniken sequenziert werden.
  • Nukleinsäuremoleküle, wie beschrieben, können ebenfalls durch selektives Amplifizieren einer Nukleinsäure unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion(PCR)-Methode und von cDNA, genomischer DNA oder einer anderen Quelle von DNA isoliert werden. Es ist möglich, synthetische Oligonukleotidprimer aus dem Nukleinsäuremolekül, wie in der 1 gezeigt, zur Ver wendung in einer PCR zu entwerfen. Diese synthetischen Oligonukleotidprimer können ebenfalls weiter modifiziert werden, um spezifische Abänderungen von der normalen Nukleinsäuresequenz einzubinden, sodass sie für eine ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden können. Eine Nukleinsäure kann aus cDNA oder genomischer DNA unter Verwendung dieser Oligonukleotidprimer und von standardmäßigen PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Es ist davon auszugehen, dass cDNA aus mRNA durch Isolieren von zellulärer Gesamt-mRNA durch eine Vielzahl von Techniken, zum Beispiel durch Anwendung des Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsvorgehens von Chirgwin et al. (Biochemistry, 18, 5294–5299 (1979)), hergestellt werden kann. cDNA wird dann unter Anwendung von reverser Transkriptase aus der mRNA synthetisiert (zum Beispiel Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL).
  • Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie beschrieben, welches eine RNA ist, kann durch Klonierung einer cDNA, codierend ein neues Protein der Erfindung, in einen geeigneten Vektor, der die Transkription der cDNA gestattet, isoliert werden, um ein RNA-Molekül herzustellen, welches das gp100M-Protein codiert. Zum Beispiel kann eine cDNA stromabwärts eines Bakteriophagen-Promotors (z. B. eines T7-Promotors) in einen Vektor kloniert werden, cDNA kann in vitro mit T7-Polymerase transkribiert werden, und die resultierende RNA kann durch Standardtechniken isoliert werden.
  • Ein Nukleinsäuremolekül, wie beschrieben, kann auch chemisch unter Anwendung von Standardtechniken synthetisiert werden. Verschiedene Verfahren zum chemischen Synthetisieren von Polydesoxynukleotiden sind bekannt, einschließlich Festphasensynthese, welche, wie Peptidsynthese, in kommerziell verfügbaren DNA-Synthesizer vollständig automatisiert worden ist (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4 598 049 ; U.S.-Patent Nr. 4 458 066 und U.S.-Patent Nr. 4 401 796 und 4 373 071 ).
  • Das Initiationscodon und untranslatierte Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle, wie beschrieben, können unter Verwendung derzeitig verfügbarer Computersoftware bestimmt werden, welche für diesen Zweck entworfen wurde, wie PC/Gene (IntelliGenetics Inc., Calif.). Regulatorische Elemente können unter Anwendung herkömmlicher Techniken identifiziert werden. Die Funktion der Elemente kann durch Verwendung dieser Elemente zum Exprimieren eines Reportergens bestätigt werden, das funktionsfähig mit den Elementen verbunden ist. Diese Konstrukte können unter Anwendung von Standardvorgehen in kultivierte Zellen eingebracht werden. Zusätzlich zum Identifizieren regulatorischer Elemente in DNA können solche Konstrukte auch verwendet werden, um mit den Elementen wechselwirkende Proteine zu identifizieren, wobei im Fachgebiet bekannte Techniken angewandt werden.
  • Es werden ebenfalls Nukleinsäuren beschrieben, welche Fusionsproteine codieren, die ein Protein, wie beschrieben, und ein ausgewähltes Protein oder ein selektierbares Markerprotein (siehe nachstehend) umfassen.
  • II. VERFAHREN ZUM EXPRIMIEREN VON NUKLEINSÄURESEQUENZEN ZUR VERWENDUNG IN DER ERFINDUNG
  • Ein Polynukleotidmolekül, wie beschrieben, welches RNA, DNA oder Modifikationen oder Kombinationen davon enthält, kann verschiedene Anwendungen haben. Zum Beispiel kann ein Polynukle[ot]idmolekül verwendet werden in (i) einem Verfahren zur Herstellung des codierten Polypeptids in einem rekombinanten Wirtsystem, (ii) in der Konstruktion von Impfstoffvektoren (wie Poxviren), welche zum Modulieren von Immunsystemen verwendet werden; (iii) als Impfstoffvektoren, welche ferner in Verfahren und Zusammensetzungen zum Verhindern und/oder Behandeln von Melanom verwendet werden, (iv) als ein Impfstoffagens (sowie als ein RNA-Molekül) in einer nackten Form oder formuliert mit einem Zuführungsvehikel, und (v) als Nachweisreagenzien/Hybridisierungssonden in molekularen und/oder therapeutischen Assays.
  • Es werden ebenfalls beschrieben (i) eine Expressionskassette, enthaltend ein DNA-Molekül, wie beschrieben, das unter die Steuerung der zur Expression erforderlichen Elemente gebracht wurde, im Besonderen unter die Steuerung eines geeigneten Promotors; (ii) ein Expressionsvektor, der eine Expressionskassette, wie beschrieben, enthält; (iii) eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle, welche mit einer Expressionskassette und/oder einem Vektor, wie beschrieben, transformiert oder transfiziert ist, sowie (iv) ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder Polypeptidderivats, das von einem Polynukleotid, wie beschrieben, codiert ist, welches das Kultivieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, die mit einer Expressionskassette und/oder einem Vektor, wie beschrieben, transformiert oder transfiziert ist, unter Bedingungen, welche die Expression des DNA-Moleküls, wie beschrieben, gestatten, und das Aufreinigen des codierten Polypeptids oder Polypeptidderivats aus der Zellkultur beinhaltet.
  • Ein rekombinantes Expressionssystem kann aus prokaryotischen und eukaryotischen Wirten ausgewählt werden. Eukaryotische Wirte schließen Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris), Säugerzellen (z. B. COS1-, NIH3T3- oder JEG3-Zellen), Arthropodenzellen (z. B. Spodoptera frugiperda (SF9)-Zellen) und Pflanzenzellen ein. Vorzugsweise wird ein prokaryotischer Wirt, wie E. coli, verwendet. Bakterielle und eukaryotische Zellen sind aus einer Anzahl unterschiedlicher Quellen, welche dem Fachmann bekannt sind, z. B. der Amerikanischen Kultur-Typ-Sammlung (American Type Culture Collection, ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA), erhältlich.
  • Die Wahl des Expressionssystems hängt von den für das exprimierte Polypeptid gewünschten Merkmalen ab. Zum Beispiel kann es nützlich sein, ein Polypeptid, wie beschrieben, in einer besonderen lipidierten Form oder irgendeiner anderen Form herzustellen.
  • Die Auswahl der Expressionskassette hängt von dem gewählten Wirtsystem sowie den für das exprimierte Polypeptid gewünschten Merkmalen ab. Typischerweise schließt eine Expressionskassette einen Promotor, der im gewählten Wirtsystem funktionell ist und konstitutiv oder induzierbar sein kann; eine Ribosomenbindungsstelle; ein Startcodon (ATG), falls notwendig; eine Region, welche ein Signalpeptid codiert (z. B. ein Lipidierungs-Signalpeptid); ein DNA-Molekül, wie beschrieben; ein Stopcodon; und gegebenenfalls eine 3'-terminale Region (Translations- und/oder Transkriptionsterminator) ein. Die Signalpeptid-codierende Region ist angrenzend an das Polynukleotid, wie beschrieben, und im richtigen Leseraster platziert. Die Signalpeptidcodierende Region kann homolog oder heterolog hinsichtlich des DNA-Moleküls, das das reife Polypeptid codiert, sein und kann spezifisch für den Sekretionsapparat des für die Expression verwendeten Wirts sein. Das offene Leseraster, aufgebaut von dem DNA-Molekül, wie beschrieben, allein oder zusammen mit dem Signalpeptid, ist unter die Steuerung des Promotors gestellt, sodass Transkription und Translation im Wirtsystem stattfinden. Promotoren (und Signalpeptid codierende Regionen) sind für den Fachmann auf dem Gebiet weithin bekannt und erhältlich und schließen zum Beispiel den Promotor von Salmonella typhimurium (und Derivate), der durch Arabinose induzierbar (Promotor araB) und in gramnegativen Bakterien, wie E. coli, funktionsfähig ist (wie im U.S.-Patent Nr. 5 028 530 und in Cagnon et al., Protein Eng. 4: 843 (1991), beschrieben), den Promotor des RNA-Polymerase codierenden Gens von Bakteriophage T7, der in einer Anzahl von E. coli-Stämmen funktionsfähig ist, die T7-Polymerase (beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4 952 496 ), OspA-Lipidierungs-Signalpeptid und das R1pB-Lipidierungs-Signalpeptid (Cagnon et al., Protein Eng. 4: 843 (1991)) exprimieren, ein.
  • Die Expressionskassette ist typischerweise Teil eines Expressionsvektors, welcher im Hinblick auf seine Fähigkeit, im gewählten Expressionssystem zu replizieren, ausgewählt wird. Expressionsvektoren (z. B. Plasmide oder virale Vektoren) können aus denjenigen ausgewählt werden, welche in Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual 1985, Ergänzungsband 1987) beschrieben sind. Sie können von verschiedenen kommerziellen Quellen erworben werden.
  • Verfahren zum Transformieren/Transfizieren von Wirtszellen mit Expressionsvektoren hängen von dem gewählten Wirtsystem ab, wie in Ausubel et. al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. (1994), beschrieben.
  • Nach der Expression wird ein rekombinantes Polypeptid, wie beschrieben, (oder ein Polypeptidderivat) hergestellt und verbleibt im intrazellulären Kompartiment, wird in das extrazelluläre Medium oder in den periplasmatischen Raum sezerniert/ausgeschieden, oder wird in die zelluläre Membran eingebettet. Das Polypeptid kann dann in einer im Wesentlichen gereinigten Form aus dem Zellextrakt oder aus dem Überstand nach einer Zentrifugation der rekombinanten Zellkultur gewonnen werden. Typischerweise kann das rekombinante Polypeptid durch Antikörperbasierende Affinitätsreinigung oder durch jedwedes andere Verfahren, welches vom Fachmann auf dem Gebiet leicht angepasst werden kann, wie etwa durch genetische Fusion an eine kleine Affinitätsbindungsdomäne, gereinigt werden. Auch Antikörper-basierte Affinitätsreinigungsverfahren sind für die Reinigung eines Polypeptids, wie beschrieben, verfügbar. Antikörper, die für die Reinigung der Polypeptide, wie beschrieben, durch Immunaffinität verwendbar sind, können wie unten beschrieben erhalten werden.
  • Hierin werden beschrieben (i) eine Expressionskassette, enthaltend ein DNA-Molekül, wie beschrieben, das unter die Steuerung der für die Expression erforderlichen Elemente, insbesondere unter die Steuerung eines geeigneten Promotors, gebracht wurde; (ii) ein Expressionsvektor, der eine Expressionskassette, wie beschrieben, enthält; (iii) eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die mit einer Expressionskassette und/oder einem Vektor, wie beschrieben, transformiert oder transfiziert ist, sowie (iv) ein Verfahren zur Herstellung eines durch ein Polynukleotid, wie beschrieben, codierten Polypeptids oder Polypeptidderivats, welches das Kultivieren einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, die mit einer Expressionskassette und/oder einem Vektor, wie beschrieben, transformiert oder transfiziert ist, unter Bedingungen, welche die Expression des DNA-Moleküls, wie beschrieben, gestatten, und das Gewinnen des codierten Polypeptids oder Polypeptidderivats aus der Zellkultur beinhaltet.
  • III. PROTEINE ZUR VERWENDUNG IN DER ERFINDUNG
  • Es wird ein isoliertes Protein beschrieben, das von Nukleinsäuremolekülen, wie beschrieben, codiert ist. Innerhalb dieses Zusammenhangs kann ein Protein, wie beschrieben, verschiedene strukturelle Formen des Primärproteins einschließen, welche biologische Aktivität beibehalten. Wie hierin verwendet, bedeutet "modifiziertes gp100" oder "modifiziertes gp100-Protein", "gp100M" oder "gp100M-Protein" ein gp100, das modifiziert worden ist, um ein Molekül vorzusehen, welches das Immunsystem moduliert.
  • Mit "Polypeptid" oder "Protein" ist jede Kette von Aminosäuren gemeint, ungeachtet der Länge oder posttranslationalen Modifikation (z. B. Glykosylierung oder Phosphorylierung). Beide Begriffe werden in der vorliegenden Anmeldung austauschbar verwendet.
  • Die Begriffe "modifiziertes gp100", modifiziertes gp100-Protein", "gp100M" oder "gp100M-Protein", wie hierin verwendet, schließen beabsichtigtermaßen Analoge eines modifizierten gp100 oder gp100M, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen enthalten, ein. Aminosäuresubstitutionen können eine konservative bzw. konservierte oder nicht-konservierte Natur aufweisen. Konservierte Aminosäuresubstitutionen beinhalten das Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren mit Aminosäuren von ähnlichen Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobizitäts-Merkmalen. Wenn lediglich konservative Substitutionen vorgenommen werden, sollte das resultierende Analog zu einem modifizierten gp100M funktionell äquivalent sein. Nicht-konservative Substitutionen beinhalten das Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren mit einer oder mehreren Aminosäuren, welche unähnliche bzw. andersartige Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobizitäts-Merkmale besitzen.
  • Eine oder mehrere Aminosäureinsertionen können in die Aminosäuresequenz von modifiziertem gp100, vorzugsweise gp100M, eingeführt werden. Aminosäureinsertionen können aus einzelnen Aminosäureresten oder sequentiellen Aminosäuren bestehen.
  • Deletionen können aus der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren oder diskreter Bereiche (d. h. Aminosäuren) aus der gp100M-Aminosäuresequenz bestehen. Dabei können die deletierten Aminosäuren zusammenhängend sein, oder nicht.
  • Ebenfalls im Ausdruck "gp100M", "modifiziertes gp100", "modifiziertes gp100-Protein" oder "gp100M-Protein", wie hierin verwendet, eingeschlossen sind Homologe von gp100M. Solche Homologe sind Proteine, deren Aminosäuresequenzen aus den Aminosäuresequenzen von gp100M-Regionen aus anderen Quellen aufgebaut sind, deren codierende Nukleinsäuresequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (wobei diese Bedingungen dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind) mit einer Nukleinsäuresonde, die zum Erhalten von gp100M verwendet wird, hybridisieren. Es lässt sich vorhersagen, dass ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens zu 72%, vorzugsweise 75 bis 90% ähnlich zu der Aminosäuresequenz von gp100M ist, eine gp100M-Aktivität aufzeigt.
  • Wie hierin verwendet, betreffen die Begriffe "modifiziertes gp100", "modifiziertes gp100-Protein", "gp100M" oder "gp100M-Protein" ebenfalls Isoformen des modifizierten gp100- oder gp100M-Proteins. Eine Isoform enthält die gleiche Anzahl und Arten an Aminosäuren, wie das modifizierte gp100 oder gp100M, aber die Isoform weist eine andere Molekularstruktur auf. Die betrachteten Isoformen sind diejenigen, welche die gleichen Eigenschaften wie das hierin beschriebene Protein aufweisen. In dem Begriff sind ebenfalls andere Proteine eingeschlossen, die Ähnlichkeiten mit einem modifizierten gp100 oder gp100M gemeinsam haben.
  • Allgemein gesprochen, wird ein isoliertes Protein mit einer äquivalenten Aktivität zu derjenigen eines modifizierten gp100-, vorzugsweise eines gp100M-Proteins beschrieben. Vorzugsweise weist das Protein die Aminosäuresequenz, wie in der 2 gezeigt, auf.
  • Zusätzlich zu Volllängen-Aminosäuresequenzen schließen die Proteine, wie beschrieben, ebenfalls Verkürzungen des Proteins und Analoge und Homologe des Proteins und Verkürzungen davon, wie hierin beschrieben, ein. Verkürzte Proteine können Peptide von wenigstens fünfzehn Aminosäureresten umfassen. Analoge des Proteins mit der in 2 gezeigten Aminosäurese quenz und/oder Verkürzungen davon, wie hierin beschrieben, können, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, eine Aminosäuresequenz einschließen, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen enthält. Aminosäuresubstitutionen können von konservativer oder nicht-konservativer Natur sein. Konservative Aminosäuresubstitutionen beinhalten das Austauschen von einer oder mehreren Aminosäuren der Proteine der Erfindung mit Aminosäuren von ähnlichen Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobizitäts-Merkmalen. Wenn lediglich konservative Substitutionen vorgenommen werden, sollte das resultierende Analog funktionell äquivalent sein. Nicht-konservative Substitutionen beinhalten das Austauschen von einer oder mehreren Aminosäuren der Aminosäuresequenz mit einer oder mehreren Aminosäuren, welche unähnliche Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobizitäts-Merkmale besitzen.
  • Eine oder mehrere Aminosäureinsertionen können in die in der 2 gezeigten Aminosäuresequenzen eingebracht werden. Aminosäureinsertionen können aus einzelnen Aminosäureresten oder einem Bereich sequentieller Aminosäuren bestehen.
  • Deletionen können aus der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren oder einzelner Bereiche aus der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz bestehen. Die deletierten Aminosäuren können zusammenhängend sein, oder nicht. Die Untergrenze der Länge des resultierenden Analogs mit einer Deletionsmutation beläuft sich auf etwa 10 Aminosäuren, vorzugsweise 100 Aminosäuren.
  • Analoge eines Proteins, wie beschrieben, können hergestellt werden durch Einbringen von Mutationen in die Nukleotidsequenz, welche das Protein codiert. Mutationen in Nukleotidsequenzen, welche für die Expression von Analogen eines Proteins, wie beschrieben, konstruiert sind, müssen das Leseraster der codierenden Sequenzen beibehalten. Darüber hinaus wird es bevorzugt, dass die Mutationen keine komplementären Regionen erzeugen, welche hybridisieren könnten, wodurch sekundäre mRNA-Strukturen produziert werden, wie Schleifen oder Haarnadeln, welche die Translation der Rezeptor-mRNA nachteilig beeinflussen könnten.
  • Man kann Mutationen an bestimmten Loci einbringen, indem Oligonukleotide synthetisiert werden, welche eine mutierte Sequenz, flankiert von Restriktionsstellen zur Ermöglichung der Ligation an Fragmente der nativen Sequenz, enthalten. Im Anschluss an die Ligation codiert die resultierende rekonstituierte Sequenz ein Analog, das die gewünschte Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion aufweist.
  • Alternativ dazu können Verfahren zur Oligonukleotid-gerichteten ortsspezifischen Mutagenese angewandt werden, um ein verändertes Gen vorzusehen, bei welchem jeweilige Codons gemäß der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion verändert sind. Die Deletion oder Verkürzung eines Proteins, wie beschrieben, kann auch durch Nutzen zweckmäßiger Restriktionsendonuklease-Stellen, welche benachbart zur gewünschten Deletion sind, konstruiert werden. Anschließend an die Restriktion können Überhänge aufgefüllt und die DNA wieder ligiert werden.
  • Beispielhafte Verfahren zur Herstellung der oben dargestellten Änderungen werden von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989) offenbart.
  • Die Proteine, wie beschrieben, schließen ebenfalls Homologe der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz und/oder Verkürzungen davon ein, wie hierin beschrieben. Solche Homologe sind Proteine, deren Aminosäuresequenzen aus Aminosäuresequenzen aufgebaut sind, deren codierende Nukleinsäuresequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe Erörterung von stringenten Hybridisierungsbedingungen hierin) mit einer Nukleinsäuresonde hybridisieren, die zum Erhalten eines Proteins, wie beschrieben, verwendet wird.
  • Ein homologes Protein schließt ein Protein mit einer Aminosäuresequenz ein, welche wenigstens 70%, vorzugsweise 80–90% Identität mit der Aminosäuresequenz, wie gezeigt in 2, aufweist. Die Homologie wird typischerweise unter Verwendung von Sequenzanalysesoftware gemessen (z. B. "Sequence Analysis Software Package" der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Ähnliche Aminosäuresequenzen werden aligniert bzw. parallel zugeordnet, um den maximalen Grad an Homologie (d. h. Identität) zu erhalten. Zu diesem Zweck kann es notwendig sein, künstlich Lücken in die Sequenz einzuführen. Sobald die optimale Alignierung aufgestellt worden ist, wird der Grad an Homologie (d. h. Identität) durch Aufzeichnen aller Positionen, an welchen die Aminosäuren beider Sequenzen identisch sind, relativ zur Gesamtzahl an Positionen, bestimmt. Beispielsweise können Sequenz-Alignierungen unter Verwendung der Computerprogramme ALIGN (Handelsbezeichnung) oder GENALIGN (Handelsbezeichnung) (Inteligenetics Suite 5.4, Oxford Molecular) durchgeführt werden. ALIGN verwendet den Needleman-Wunsch-Algorithmus (Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)) und seine späteren Modifikationen, um Regionen mit Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu lokalisieren. Das Auffinden von Regionen maximaler Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen kann in rigoroser Weise unter Verwendung der iterativen Matrix-Berechnung des Algorithmus von Needleman und Wunsch von 1997 bewältigt werden. Die Analyse ist auf Regionen ohne interne Deletionen oder Insertionen beschränkt, die durch eine minimale Zahl von Ausschlaufungen (Loop-outs) oder Deletionen verknüpft sind. Sellers (J. Appl. Math (Siam) 26: 787 (1974)) entwickelte ein echtes metrisches Maß der "Distanz" zwischen Sequenzen, und Waterman et al. (Advan. Math 20: 367 (1976)) erweiterte diesen Algorithmus, um Insertionen und Deletionen willkürlicher Länge einzuschließen. Smith (J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)) verbesserte die frühen Algorithmen, um Teilsequenzen maximaler Ähnlichkeit aufzufinden. Der Algorithmus ist verwendet worden, um so lange Sequenzen wie 5000 Basen durch Unterteilen dieser Sequenzen in Segmente von 200 bis 400 Basen und danach erneutes Zusammenfügen davon zu einer endgültigen besten Übereinstimmung zu analysieren. Dieses Verfahren zur Unterteilung der Sequenz und nachfolgenden erneuten Zusammenfügung derselben hat sich als ziemlich zuverlässig erwiesen. Der Algorithmus gestattet die Festlegung der Größe des Segments, das von dem Programm nach Ähnlichkeiten durchsucht wird. Danach fügt das Programm die Segmente, nach Überprüfen der Überlappungen benachbarter Teilsequenzen, zusammen. Die Gewichtung von Deletionen und die relative Größe von Überlappungen kann reguliert werden. Das Programm gibt die Ergebnisse aus, um die Unterschiede in nah verwandten Sequenzen zu zeigen. GENALIGN ist ein Mehrfach-Alignierungs-Programm. Unter Anwendung der Verfahren von Martinez/Regions (Sobel und Martinez, Nucleic Acid Res 14: 363 (1985)) oder Needleman-Wunsch (Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)) können bis zu 99 Sequenzen hinsichtlich der Alignierung analysiert werden. GENALIGN bringt die Sequenzen in eine Reihenfolge, welche die am nähesten bzw. genauesten alignierten Sequenzpaare in Nachbarschaft zueinander setzt. Eine Konsensussequenz wird unter den Mehrfach-Sequenzalignierungen angezeigt. Die bei der Entwicklung der Konsensussequenz verwendeten Sequenzen werden zur Verwendung in anderen Programmen abgespeichert. GENALIGN gestattet eine derartige Änderung der Suchparameter, dass alternative Alignierungen der Sequenzen gebildet werden können.
  • Diese Programme werden unter Anwendung ihrer Standardeinstellungen verwendet. Die Standardeinstellungen sind wie folgend: FastDB AMINO-Rest-Länge = 2 Deletions-Gewichtung = 5,00 Längen-Faktor = 0 Übereinstimmungs-Gewichtung = 1,00 NUKLEIN-Rest-Länge = 4 Ausweitungsfaktor = 50 Findseq
    Suchparameter: Ähnlichkeitsmatrix Unitär K-Tupel 4 Fehlpaarungs-Strafwert 1 Verbindungs-Strafwert 30 Randomisierungs-Gruppenlänge 0 Ausschluss-Wert 5
    Alignierungs-Parameter: Fenstergröße 32 Lücken-Strafwert 1,00 Lückengrößen-Strafwert 0,33
  • Auch Isoformen der Proteine, wie beschrieben, werden berücksichtigt. Eine Isoform enthält dieselbe Anzahl und dieselben Arten von Aminosäuren, wie ein Protein, wie beschrieben, aber die Isoform besitzt eine andere Molekularstruktur. Die hierin berücksichtigen Isoformen sind dieje nigen, welche die gleichen Eigenschaften wie ein Protein, wie es hierin beschrieben wird, aufweisen.
  • Polypeptide, welche eine Sequenz aufweisen, die homolog zu der Sequenz eines modifizierten gp100 ist, wie diejenige, welche in der 2 gezeigt ist, schließen natürlich vorkommende allelische Varianten sowie Mutanten oder jedwede anderen nicht-natürlich vorkommenden Varianten ein, welche in Hinsicht auf die Antigenizität zu einem Polypeptid mit einer Sequenz, wie in 2 gezeigt, analog sind.
  • Wie es im Fachgebiet bekannt ist, ist eine allelische Variante eine alternative Form eines Polypeptids, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Substitution, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren aufweist, welche die biologische Funktion des Polypeptids nicht verändert/verändern. Mit "biologischer Funktion" ist die Funktion des Polypeptids in den Zellen gemeint, in denen es natürlicherweise vorkommt, selbst wenn die Funktion nicht für das Wachstum oder Überleben der Zellen notwendig ist. Zum Beispiel besteht die biologische Funktion eines Porins darin, den Eintritt von im extrazellulären Medium vorliegenden Verbindungen in Zellen zu ermöglichen. Die biologische Funktion ist von der antigenischen Funktion unterschieden. Ein Polypeptid kann mehr als eine biologische Funktion besitzen.
  • Allelische Varianten sind in der Natur sehr häufig. Zum Beispiel wird eine Bakterienspezies (d. h. C. pneumoniae) üblicherweise durch eine Vielzahl von Stämmen repräsentiert, die sich voneinander durch kleinere allelische Variationen unterscheiden. Tatsächlich kann ein Polypeptid, welches dieselbe biologische Funktion erfüllt, in verschiedenen Stämmen eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche nicht in jedem der Stämme identisch ist. Eine derartige allelische Variation kann gleichermaßen auf der Polynukleotid-Ebene widergespiegelt werden.
  • Es wird ebenfalls ein Protein, wie beschrieben, welches mit einem ausgewählten Protein oder einem selektierbaren Markerprotein (siehe nachstehend) konjugiert ist, um Fusionsproteine herzustellen, beschrieben. Darüber hinaus werden immunogene Bereiche und/oder Fragmente eines modifizierten gp100 beschrieben.
  • Ein Beispiel für Fusionspolypeptide, wie beschrieben, schließt ein Polypeptid oder Polypeptidderivat, wie beschrieben, fusioniert an ein Polypeptid, welches eine Adjuvans-Aktivität aufweist, ein (wie zum Beispiel die Untereinheit B von entweder Choleratoxin oder hitzelabilem Toxin von E. coli). Zum Erreichen einer Fusion bestehen mehrere Möglichkeiten. Zum Ersten kann das Polypeptid, wie beschrieben, an das N- oder, vorzugsweise, an das C-terminale Ende des Polypeptids mit Adjuvans-Aktivität fusioniert werden. Zum Zweiten kann ein Polypeptidfragment, wie beschrieben, innerhalb der Aminosäuresequenz des Polypeptids mit Adjuvans-Aktivität fusioniert werden.
  • Die Proteine, wie beschrieben (einschließlich Verkürzungen, Analogen etc.) können unter Anwendung von rekombinanten DNA-Methoden hergestellt werden. Demgemäß können die Nukleinsäuremoleküle, wie beschrieben, welche eine Sequenz aufweisen, die ein Protein, wie beschrieben, codiert, in einer bekannten Art in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden, der eine gute Expression des Proteins gewährleistet. Mögliche Expressionsvektoren schließen, ohne aber darauf eingeschränkt zu sein, Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren (z. B. Replikations-defekte Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren) ein, solange der Vektor mit der verwendeten Wirtszelle verträglich ist. Der Begriff "Vektoren sind für die Transformation einer Wirtszelle geeignet" bedeutet definitionsgemäß, dass die Expressionsvektoren ein Nukleinsäuremolekül, wie beschrieben, und begleitende regulatorische Sequenzen enthalten, die auf der Grundlage der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt sind, wobei die regulatorische Sequenz funktionsfähig mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden ist. "Funktionsfähig verbunden" bedeutet beabsichtigtermaßen, dass die Nukleinsäure auf eine Weise mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, welche die Expression der Nukleinsäure gestattet.
  • Ebenfalls in Betracht gezogen wird ein rekombinanter Expressionsvektor, wie beschrieben, der ein Nukleinsäuremolekül, wie beschrieben, oder ein Fragment davon, sowie die notwendigen regulatorischen Sequenzen für die Transkription und Translation der inserierten Nukleotidsequenz enthält. Geeignete regulatorische Sequenzen können aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich bakteriellen, pilzlichen oder viralen Genen, abgeleitet sein (siehe zum Beispiel die regulatorischen Sequenzen, welche in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben sind). Die Auswahl von geeigneten regulatorischen Sequenzen hängt von der gewählten Wirtszelle ab und kann vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres bewerkstelligt werden. Beispiele derartiger regulatorischer Sequenzen schließen die Folgenden ein: einen transkriptionellen Promotor und Enhancer, oder eine RNA-Polymerase-Bindungssequenz, oder eine Ribosomenbindungssequenz (einschließlich eines Translationsinitiationssignals). Abhängig von der gewählten Wirtszelle und dem verwendeten Vektor können außerdem andere Sequenzen (wie ein Replikationsursprung, zusätzliche DNA-Restriktionsstellen, Enhancer, und Sequenzen, die eine Induzierbarkeit der Transkription vermitteln) in den Expressionsvektor eingebaut werden. Es ist ebenfalls davon auszugehen, dass die notwendigen regulatorischen Sequenzen auch von dem gp100/gp100M-Gen und/oder dessen flankierenden Regionen, zusätzlich zu den oben erwähnten regulatorischen Gensequenz(en), bereitgestellt werden können.
  • Ebenfalls beschrieben wird ein rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Nukleinsäuremolekül, wie beschrieben, welches in den Expressionsvektor in einer Antisinn-Orientierung kloniert ist. D. h., das DNA-Molekül ist in einer Weise funktionsfähig mit einer regulatorischen Sequenz verbunden, welche, mittels Transkription des DNA-Moleküls, die Expression eines RNA-Moleküls gestattet, das den Antisinn zu einer Nukleotidsequenz darstellt, welche die Nukleotide, wie in 1 gezeigt, umfasst. Man kann mit der Antisinn-Nukleinsäure funktionsfähig verknüpfte regulatorische Sequenzen auswählen, welche die kontinuierliche Expression des Antisinn-RNA-Moleküls veranlassen.
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren, wie beschrieben, können ebenfalls ein selektierbares Markergen enthalten, welches die Selektion von Wirtszellen erleichtert, die mit einem rekombinanten Molekül, wie beschrieben, transformiert oder transfiziert sind. Beispiele für selektierbare Markergene sind Gene, welche ein Protein, wie G418 und Hygromycin (die eine Resistenz gegenüber bestimmten Arzneistoffen verleihen), β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase oder Leuchtkäfer-Luciferase, codieren. Die Transkription des selektierbaren Markergens wird durch Änderungen in der Konzentration des selektierbaren Markerproteins, wie β-Galactosidase, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase oder Leuchtkäfer-Luciferase, verfolgt. Falls das selektierbare Markergen ein Protein codiert, das Antibiotikum-Resistenz, wie etwa Neomycin-Resistenz, verleiht, können Transformantenzellen mit G418 selektiert werden. Wie es dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, werden Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben, überleben, wohingegen Zellen, die keinen derartigen aufgenommenen nachweisbaren Marker aufweisen, sterben. Dies macht es möglich, die Expression von rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung sichtbar zu machen und zu testen. Es wird ebenfalls erkannt, dass selektierbare Marker auf einem von der Nukleinsäure von Interesse getrennten Vektor eingebracht werden können.
  • Die rekombinanten Expressionsvektoren können auch Gene enthalten, welche eine Fusionseinheit codieren, die eine erhöhte Expression des rekombinanten Proteins; erhöhte Löslichkeit des rekombinanten Proteins bereitstellt und/oder bei der Reinigung eines rekombinanten Zielproteins durch Wirken als ein Ligand bei Affinitätsreinigung hilft. Zum Beispiel kann eine proteolytische Spaltungsstelle an dem rekombinanten Zielprotein hinzugefügt werden, um eine Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit anschließend an die Reinigung des Fusionsproteins zu gestatten.
  • Rekombinante Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um eine transformierte Wirtszelle herzustellen. Der Begriff "transformierte Wirtszelle" beinhaltet beabsichtigtermaßen prokaryotische und eukaryotische Zellen, welche mit einem rekombinanten Expressionsvektor der Erfindung transformiert oder transfiziert worden sind. Die Begriffe "transformiert mit", "transfiziert mit", "Transformation" und "Transfektion" umfassen beabsichtigtermaßen das Einbringen von Nukleinsäure (z. B. eines Vektors) in eine Zelle durch eine von vielen möglichen, auf dem Fachgebiet bekannten, Techniken. Prokaryotische Zellen können mit Nukleinsäure zum Beispiel durch Elektroporation oder Calciumchlorid-vermittelte Transformation transformiert werden. Nukleinsäure kann mittels herkömmlicher Techniken, wie Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofectin, Elektroporation oder Mikroinjektion, in Säugerzellen eingebracht werden. Geeignete Verfahren zum Transformieren und Transfizieren von Wirtszellen kann man in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press (1989)) und anderen Laboratoriums-Lehrbüchern nachschlagen.
  • Geeignete Wirtszellen schließen eine große Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen ein. Zum Beispiel können die Proteine, wie beschrieben, in bakteriellen Zellen, wie E. coli, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus), Hefezellen oder Säugerzellen exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen können in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991), gefunden werden.
  • Die Proteine, wie beschrieben, können ebenfalls durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei in der Chemie von Proteinen allgemein bekannte Techniken angewandt werden, wie etwa eine Festphasensynthese (Merrifield, J., Am. Chem. Assoc. 85: 2149–2154 (1964)) oder die Synthese in homogener Lösung (Houbenweyl, Methods of Organic Chemistry (1987), (Hrsg.: E. Wansch), Band 15, Punkte I und II, Thieme, Stuttgart).
  • IV. IMPFSTOFFE
  • Es wird ein Impfstoff zum Modulieren des Immunsystems eines Tiers beschrieben, wobei es sich bei dem Immunogen um eine effektive Menge eines gp100 oder modifizierten gp100 und/oder immunogene Fragmente davon, vorzugsweise in Vermischung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger, handelt.
  • Demgemäß wird ein Verfahren zum Modulieren der Immunantwort eines Tiers beschrieben, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge eines gp100 oder modifizierten gp100 und/oder immunogener Fragmente davon, vorzugsweise in Vermischung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel oder Träger, an ein hierfür bedürftiges Tier umfasst.
  • Die Impfstoffe, wie beschrieben, können zusätzlich geeignete Verdünnungsmittel, Adjuvantien und/oder Träger enthalten. Die Impfstoffe enthalten vorzugsweise ein oder mehrere andere Adjuvantien, welche die Immunogenität des Impfstoffs in vivo weiter erhöhen können. Diese anderen ein oder mehreren Adjuvantien können aus vielen auf dem Fachgebiet bekannten Adjuvantien ausgewählt werden, einschließlich zum Beispiel dem Lipid-A-Anteil des LPS aus gramnegativen Bakterien (Endotoxin), Trehalosedimycolat von Mykobakterien, dem Phospholipid Lysolecithin, Dimethyldictadecylammoniumbromid (DDA), bestimmten linearen Polyoxypropylen-Polyoxyethylen (POP-POE)-Blockpolymeren, Aluminiumhydroxid (und anderen Aluminiumverbindungen) und Liposomen (siehe nachstehend).
  • Ein anderes bevorzugtes Adjuvans/Immunstimulans ist ein immunstimulatorisches Oligonukleotid, das nicht-methylierte CpG-Dinukleotide enthält ("CpG"). CpG ist eine Abkürzung für Cytosin-Guanosin-Dinukleotidmotive, welche in DNA vorhanden sind. Auf dem Fachgebiet ist CpG als ein Adjuvans bekannt, wenn es sowohl auf systemischen als auch mukosalen Wegen verabreicht wird ( WO 9602555 ; Europäisches Patent EP 468520 ; Davies et al. (1998) J. Immunol. 160: 87; McCluskie und Davis (1998) J. Immunol. 161: 4463). In einer Anzahl von Untersuchungen ist ebenfalls gezeigt worden, dass aus BCG-Gensequenzen abgeleitete synthetische Oligonukleotide zum Induzieren immunstimulierender Effekte in der Lage sind (sowohl in vitro als auch auch in vivo; Krieg, (1995) Nature 374: 546). Ausführliche Analysen von immunstimulatorischen Oligonukleotidsequenzen haben gezeigt, dass das CG-Motiv in einem bestimmten Sequenzzusammenhang vorliegen muss, und dass derartige Sequenzen in bakterieller DNA häufig, aber in Wirbeltier-DNA selten sind (zum Beispiel handelt es sich bei der immunstimulatorischen Sequenz oft um: Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin, wobei das CG-Motiv nicht methyliert ist; allerdings sind andere nicht-methylierte CpG-Sequenzen bekanntermaßen immunstimulatorisch und können als solche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden).
  • Die Impfstoffe können auch Cytokine, von welchen bekannt ist, Immunantworten zu verstärken (einschließlich GM-CSF, IL-2, IL-12, TNF und IFNγ), costimulatorische Moleküle (wie diejenigen der B7-Familie) und/oder andere Lymphokine als Adjuvantien einschließen. Der Impfstoff kann ebenfalls Konservierungsstoffe wie Natriumazid, Thimerosol, Beta-Propiolacton und binäres Ethylenimin enthalten.
  • Die Impfstoffzusammensetzungen, wie beschrieben, sind zur Verabreichung an Subjekte in einer biologisch verträglichen Form in vivo geeignet. Der Ausdruck "biologisch verträgliche Form, die zur Verabreichung in vivo geeignet ist", wie hierin verwendet, bedeutet eine Form der zu verabreichenden Substanz, in welcher jedwede toxischen Effekte von den therapeutischen Effekten aufgewogen werden.
  • Die Dosis des Impfstoffs kann gemäß Faktoren, wie dem Krankheitszustand, Alter, Geschlecht und Gewicht des [Subjekts] und der Fähigkeit des Impfstoffs, eine gewünschte Antwort in dem Tier hervorzurufen, variieren. Ein Dosierungsschema kann hergerichtet sein, um die optimale therapeutische Antwort bereitzustellen. Zum Beispiel können mehrere unterteilte Dosen täglich verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional reduziert werden, wie durch die Anforderungen der therapeutischen Situation vorgegeben. Die Dosis des Impfstoffs kann auch variiert werden, um eine optimale vorbeugende Dosis-Antwort, abhängig von den Umständen, bereitzustellen.
  • Die Impfstoffe können in einer zweckdienlichen Weise verabreicht werden, wie etwa durch Injektion (subkutan, intravenös, intermuskulär, intranodal etc.), orale Verabreichung, Inhalation, transdermale Verabreichung (wie topische Creme oder Salbe etc.) oder Suppositorien-Anwendungen.
  • Daher werden beschrieben (i) ein Impfstoff, der ein modifiziertes gp100 (oder immunogenes Fragment davon), wie beschrieben, enthält; (ii) eine Stoffzusammensetzung, welche ein gp100 (oder immunogenes Fragment davon), wie beschrieben, zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger enthält; (iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines modifizierten gp100 (oder immunogenen Fragments davon), wie beschrieben, enthält; (iv) ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen ein modifiziertes gp100 (oder immunogenes Fragment davon) in einem Säugetier (zum Beispiel einem Menschen; alternativ dazu kann das Verfahren in tiermedizinischen Anwendungen eingesetzt werden), welches das Verabreichen einer immunogenisch wirksamen Menge eines modifizierten gp100 (oder immunogenen Fragments davon), wie beschrieben, an den Säuger zum Hervorrufen einer Immunantwort (zum Beispiel einer schutzgebenden oder therapeutischen Immunantwort gegen modifiziertes gp100) beinhaltet; (v) ein Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln von Melanom, welches das Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines modifizierten gp100 (oder immunogenen Fragments davon), wie beschrieben, an ein bedürftiges Individuum beinhaltet. Außerdem umfasst die Erfindung die Verwendung eines modifizierten gp100 (oder modifizierten Fragments davon), wie beschrieben, in der Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung und/oder Behandlung von Melanom.
  • Ein Impfstoff der Erfindung kann ein Nukleinsäuremolekül enthalten, das ein modifiziertes gp100-Protein, wie beschrieben, codiert. Derartige Impfstoffe werden als Nukleinsäureimpfstoffe bezeichnet, werden jedoch ebenfalls genetische Impfstoffe, Polynukleotidimpfstoffe oder DNA-Impfstoffe genannt, welche sämtlich beschrieben werden. In einem solchen Fall wird das modifizierte gp100-Protein in vivo im Wirtstier hergestellt. Die Nukleinsäuren enthaltenden Impfstoffe können unter Verwendung eines geeigneten Vektors (d. h. "Impfstoffvektor"), einschließlich zum Beispiel retroviraler Vektoren, alphaviraler, adenoviraler Vektoren, poxviraler Vektoren, anderer viraler Vektoren, bakterieller DNA, Plasmiden oder freier/nackter DNA, zugeführt werden.
  • Folglich werden beschrieben (i) ein Impfstoffvektor, der ein DNA-Molekül, wie beschrieben, enthält, das unter die Steuerung von für die Expression benötigten Elementen platziert ist; (ii) eine Stoffzusammensetzung, enthaltend einen Impfstoffvektor, wie beschrieben, zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger; (iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines Impfstoffvektors, wie beschrieben; (iv) ein Verfahren zum Induzieren einer Immunantwort gegen modifiziertes gp100 in einem Säugetier (zum Beispiel einem Menschen; alternativ dazu kann das Verfahren in Anwendungen der Tiermedizin eingesetzt werden), welches das Verabreichen einer immunogenisch wirksamen Menge eines Impfstoffvektors, wie beschrieben, an den Säuger zum Hervorrufen einer Immunantwort (zum Beispiel einer schutzgebenden oder therapeutischen Immunantwort gegen modifiziertes gp100) beinhaltet; (v) ein Verfahren zur Vorbeugung gegen und/oder Behandlung von Melanom, welches das Verabreichen einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge eines Impfstoffvektors, wie beschrieben, an ein bedürftiges Individuum beinhaltet. Außerdem umfasst die Erfindung die Verwendung eines Impfstoffvektors, wie beschrieben, in der Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung gegen und/oder Behandlung von Melanom.
  • i Impfstoffvektor
  • Der Impfstoffvektor kann ein Poxvirus- oder anderer viraler Vektor, bakterielle DNA, Plasmid- oder eine freie/nackte DNA sein. Vorzugsweise ist der Impfstoffvektor zur Integration in Empfängertierzellen nicht in der Lage. Die Elemente zur Expression von dem Impfstoffvektor aus können einen für die Expression in Empfängertierzellen geeigneten Promotor einschließen.
  • Lebend-Impfstoffvektoren, welche auf dem Fachgebiet verfügbar sind, schließen virale Vektoren, wie Alphaviren, Adenoviren und Poxviren, sowie bakterielle Vektoren (zum Beispiel Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille Calmette Guérin (BCG) und Streptococcus) ein.
  • Ein Beispiel eines Adenovirusvektors sowie eines Verfahrens zum Konstruieren eines Adenovirusvektors, der fähig zum Exprimieren eines DNA-Moleküls der Erfindung ist, wird im U.S.-Patent Nr. 4 920 209 (das hierin als Bezugsstelle einbezogen ist) beschrieben. Poxvirusvektoren, welche verwendet werden können, schließen zum Beispiel Fowlpox-, Vaccina- und Canarypox-Virus (wie beschrieben in U.S.-Patent Nr. 5 766 599 und U.S.-Patent Nr. 5 364 773 , U.S.-Patent Nr. 5 756 103 , (ALVAC(2), U.S.-Patent Nr. 5 990 091 , U.S.-Patent Nr. 6 004 777 ) ein; Poxvirusvektoren, welche fähig zum Exprimieren einer Nukleinsäure, wie beschrieben, sind, können durch homologe Rekombination erhalten werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, sodass das Polynukleotid, wie beschrieben, unter zur Expression in Säugerzellen geeigneten Bedingungen (siehe nachstehend) in das virale Genom inseriert wird.
  • In einem bevorzugten Aspekt ist der manipulierte Poxvirusvektor ALVAC (welcher aus Canarypox-Virus abgeleitet worden ist). ALVAC repliziert nicht produktiv in Nicht-Vogel-Wirten, weshalb von diesem Merkmal angenommen wird, dass es sein Sicherheitsprofil verbessert.
  • ALVAC ist ein abgeschwächter Canarypox-Virus-basierender Vektor, der ein Plaque-kloniertes Derivat des zugelassenen bzw. lizenzierten Canarypox-Impfstoffs Kanapox (Tartaglia et al., Virol. 188: 217 (1992)) ( U.S.-Patent Nr. 5 756 103 ) war. ALVAC besitzt einige allgemeine Eigenschaften, welche die gleichen wie einige allgemeine Eigenschaften von Kanapox sind. Von ALVAC-basierten rekombinanten Viren, die extrinsische Immungene exprimieren, hat man ebenfalls gezeigt, als Impfstoffvektoren wirksam zu sein (Tartaglia, J., et al., in AIDS Research Reviews (Band 3), Koff, W., Wong-Staol, F., Kenedy, R. C. (Hrsg.), Marcel Dekker NY, S. 361–378 (1993); Tartaglia, J., et al., J. Virol. 67: 2370 (1993)). Zum Beispiel waren Mäuse, die mit einer ALVAC-Rekombinante immunisiert wurden, welche das Rabies-Virus-Glykoprotein exprimiert, vor einer letalen Herausforderung mit Rabies-Virus geschützt (Tartaglia, J., et al. (1992), Virology 188: 217), was das Potenzial für ALVAC als Impfstoffvektor verdeutlicht. ALVAC-basierende Rekombinanten haben sich auch in Hunden, welche mit dem kaninen Distemper-Virus (Taylor, J., et al., (1992), Virology 187: 321) und Rabies-Virus (Perkus, M. E., et al., in Combined Vaccines and Simultaneous Administration: Current Issues and Perspective, Annals of New York Academy of Sciences (1994)) herausgefordert wurden, in Katzen, welche mit felinem Leukämievirus herausgefordert wurden (Tartaglia, J., et al., J. Virol. 67: 2370 (1993)), und in Pferden, welche mit equinem Influenza-Virus herausgefordert wurden (Taylor, J., et al., in Proceedings of the Third International Symposium an Avian Influenza, Univ. of Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin, S. 331–335 (1993)), als wirksam erwiesen.
  • ALVAC(2) ist ein ALVAC-Vektor der zweiten Generation in welchem Vaccinia-Transkriptionselemente E3L und K3L innerhalb des C6-Locus inseriert worden sind ( U.S. 5 990 091 ; U.S. 6 004 777 ). Das E3L codiert ein Protein, welches fähig zum spezifischen Binden an dsRNA ist. Der K3L-ORF besitzt signifikante Homologie zu E1F-2. Innerhalb von ALVAC(2) steht das E3L-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle seines natürlichen Promotors, wohingegen K3L unter die Kontrolle des frühen/späten Vaccina-H6-Promotors gebracht worden ist. Die E3L- und K3L-Gene wirken zum Inhibieren der PKR-Aktivität in mit ALVAC(II) infizierten Zellen, was die Steigerung des Spiegels und der Persistenz von Fremdgenexpression gestattet.
  • Weitere Impfstoffvektorsysteme beinhalten die Verwendung von natürlich wirts-beschränkten Poxviren. Fowlpoxvirus (FPV) ist das prototypische Virus der Avipox-Gattung der Poxvirusfamilie. Aus Fowlpox abgeleitete Vektoren sind erzeugt worden (d. h. TROVAC, siehe U.S.-Patent Nr. 5 766 599 ). Die Replikation der Avipoxviren ist auf Vogelarten beschränkt (Matthews, Inter Virol. 17: 42 (1982)), und es gibt in der Literatur keine Berichte von Avipoxvirus, welches eine produktive Infektion in irgendeiner Nicht-Vogel-Spezies, einschließlich Mensch, verursacht. Diese Wirts-Einschränkung liefert eine inhärente Sicherheitsbarriere hinsichtlich der Übertragung des Virus auf andere Arten und macht den Einsatz von Avipoxvirus-basierenden Impfstoffvektoren in tiermedizinischen und humanen Anwendungen zu einem attraktiven Vorschlag.
  • FPV ist in vorteilhafter Weise als ein Vektor, welcher Antigene aus Geflügelpathogenen exprimiert, verwendet worden. Das Hämagglutinin-Protein eines virulenten Vogel-Influenza-Virus wurde in einer FPV-Rekombinante exprimiert. Nach Inokulierung der Rekombinante in Hühner und Truthähne wurde eine Immunantwort induziert, welche schutzgebend gegen entweder eine homologe oder eine heterologe virulente Influenzavirus-Herausforderung war (Taylor, J., et al., (1988) Vaccine 6: 504). FPV-Rekombinanten, welche die Oberflächenglykoproteine von "Newcastle Disease"-Virus exprimieren, sind ebenfalls entwickelt worden (Taylor, J., et al., (1990) J. Virol. 64: 1441; Edbauer, C., et al., (1990) Virology 179: 901).
  • Ein stark abgeschwächter Stamm von Impfstoffen, bezeichnet als MVA, ist ebenfalls als Vektor für Poxvirus-basierte Impfstoffe verwendet worden. Die Verwendung von MVA ist im U.S.-Patent Nr. 5 185 146 beschrieben.
  • Andere abgeschwächte Poxvirusvektoren sind durch genetische Modifikationen von Wildtypstämmen des Virus hergestellt worden. Zum Beispiel wird der NYVAC-Vektor durch Deletion von spezifischen Virulenz- und Wirtsbereichgenen aus dem Copenhagen-Stamm von Vaccinia abgeleitet (Tartaglia, J., et al. (1992) Virology 188: 217) und hat sich als ein rekombinanter Vektor bei der Hervorrufung einer schutzgebenden Immunantwort gegen ein exprimiertes Fremdantigen als nützlich erwiesen ( U.S. 5 364 773 ). Der TROVAC-Vektor liefert noch ein weiteres Beispiel eines abgeschwächten Poxvirus, das verwendet werden kann ( U.S. 5 766 599 ).
  • Rekombinante Poxviren können in zwei Schritten konstruiert werden, welche im Fachgebiet bekannt sind und analog zu den Verfahren zum Erzeugen synthetischer Rekombinanten von Poxviren, wie dem Vaccinia-Virus und Avipox-Virus, sind (beschrieben in den U.S.-Patenten Nr. 4 769 330 ; 4 744 848 ; 4 603 112 ; 5 100 587 und 5 179 993 ). In deutlicher Weise, basierend auf den Abschwächungsprofilen der NYVAC-, ALVAC- und TROVAC-Vektoren und ihrer nachgewiesenen Fähigkeit, sowohl humorale als auch zelluläre immunologische Antwortreaktionen gegen extrinsische Immunogene hervorzurufen (Tartaglia, J., et al., in AIDS Research Reviews (Band 3), Koff, W., Wong-Staol, F., Kenedy, R. C. (Hrsg.), Marcel Dekker NY, S. 361–378 (1993); Tartaglia, J., et al. (1993), J. Virol. 67: 2370; Taylor, J., et al., (1992) Virology 187: 321), bieten solche rekombinanten Viren einen klaren Vorteil gegenüber früher beschriebenen rekombinanten Viren auf Vaccinia-Basis. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das Bereitstellen eines modifizierten gp100-Rekombinanten-Poxvirus sowie von Zusammensetzungen und Produkten davon (insbesondere ALVAC-modifiziertes-gp100-Rekombinanten und Zusammensetzungen und Produkten davon) einen in hohem Maße wünschenswerten Fortschritt gegenüber dem gegenwärtigen Stand der Technik darstellt.
  • Plasmide und/oder freie/nackte Nukleinsäuren (d. h. Polynukleotide (DNA oder RNA)), wie beschrieben, können ebenfalls als Impfstoffvektoren an ein Tier zu Zwecken einer (z. B. therapeutischen oder prophylaktischen) Impfung verabreicht werden ( U.S.-Patent Nr. 5589466 ; McDonnell und Askari, NEJM 334: 42–45 (1996); Kowalczyk und Ertl, Cell Mol. Life Sci. 55: 751–770 (1999)). Wenn ein DNA-Molekül, wie beschrieben, verwendet wird, kann es in einer freien/nackten oder Plasmid-Form vorliegen. Typischerweise handelt es sich hierbei um eine Form, welche unfähig ist, in einer Säugerzelle zu replizieren, und unfähig ist, in das Säugergenom zu integrieren. Das DNA-Molekül wird außerdem typischerweise unter die Kontrolle eines zur Expression in einer Säugerzelle geeigneten Promotors gebracht. Der Promotor kann ubiquitär oder gewebespezifisch funktionieren. Beispiele für nicht-gewebespezifische Promotoren schließen den frühen Cytomegalovirus(CMV)-Promotor (beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4 168 062 ) und den Rous-Sarcom-Virus-Promotor ein. Der Desmin-Promotor ist gewebespezifisch und steuert die Expression in Muskelzellen. Nützliche Vektoren sind allgemeiner beschrieben worden (d. h. WO 94/21797 ).
  • Für DNA/RNA-Impfung kann das Polypeptid, wie beschrieben, eine Vorläufer- oder reife Form des modifizierten gp100 oder immunogenen Fragments davon codieren. Wenn es eine Vorläuferform codiert, kann die Vorläuferform homolog oder heterolog sein. Im letztgenannten Fall kann eine eukaryotische Leadersequenz verwendet werden, wie etwa die Leadersequenz des Gewebe-Typ-Plasminogenfaktors (tPA).
  • Bei der Herstellung der Polynukleotid-Aspekte, wie beschrieben, können Standardtechniken der Molekularbiologie zur Herstellung und Reinigung von Polynukleotiden angewandt werden. Zur Verwendung als Impfstoff kann ein Polynukleotid, wie beschrieben, gemäß verschiedenen Verfahren formuliert werden, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind.
  • Zunächst kann ein Polynukleotid in einer nackten/freien Form, frei von irgendwelchen Zuführungsvehikeln (wie anionischen Liposomen, kationischen Lipiden, Mikropartikeln (z. B. Gold-Mikropartikeln), Fällungsmitteln (z. B. Calciumphosphat)) oder jedwedem anderen Transfektions-erleichternden Mittel, verwendet werden. In diesem Fall kann das Polynukleotid einfach in einer physiologisch annehmbaren Lösung (wie steriler Kochsalzlösung oder steriler gepufferter Kochsalzlösung) mit oder ohne Träger verdünnt werden. Falls vorhanden, ist der Träger vorzugsweise isotonisch, hypotonisch, oder schwach hypertonisch, und weist eine verhältnismäßig geringe Ionenstärke auf (wie von einer Saccharoselösung (z. B. einer Lösung mit 20% Saccharose) vorgesehen).
  • Alternativ dazu kann ein Polynukleotid mit Mitteln assoziiert sein, welche bei der zellulären Aufnahme helfen. Es kann u. a. (i) mit einem chemischen Agens ergänzt werden, das die zelluläre Permeabilität modifiziert (wie Bupivacain; siehe zum Beispiel die WO 94/16737 ), (ii) in Liposomen verkapselt sein, oder (iii) mit kationischen Lipiden oder Siliziumdioxid-, Gold- oder Wolfram-Mikropartikeln assoziiert sein.
  • Kationische Lipide sind im Fachgebiet allgemein bekannt und werden üblicherweise für Genzuführung verwendet. Derartige Lipide schließen Lipofectin (ebenfalls bekannt als DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid), DOTAP (1,2-Bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propan), DDAB (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), DOGS (Dioctadecylamidologlycylspermin) und Cholesterinderivate, wie DC-Chol (3-beta-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)carbamoyh)cholesterol), ein. Eine Beschreibung dieser kationischen Lipide kann man in EP 187 702 , WO 90/11092 , U.S.-Patent Nr. 5 283 185 , WO 91/15501 , WO 95/26356 und U.S.-Patent Nr. 5 527 928 finden. Kationische Lipide für die Genzuführung werden bevorzugt in Assoziation mit einem neutralen Lipid, wie DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) verwendet, wie es zum Beispiel in WO 90/11092 beschrieben ist.
  • Andere transfektionserleichternde Verbindungen können zu einer Formulierung, die kationiosche Liposomen enthält, hinzugefügt werden. Einige von ihnen sind zum Beispiel in WO 93/18759 , WO 93/19768 , WO 94/25608 und WO 95/2397 beschrieben. Sie schließen z. B. Sperminderivate, die zur Erleichterung des Transports von DNA durch die Kernmembran brauchbar sind (siehe zum Beispiel WO 93/18759 ), und membranpermeabilisierende Verbindungen, wie GALA, Gramicidin S und kationische Gallensalze (siehe zum Beispiel WO 93/19768 ), ein.
  • Gold- oder Wolfram-Mikropartikel können ebenfalls für die Genzuführung verwendet werden (wie es in WO 91/359 und WO 93/17706 beschrieben ist). In diesem Fall können die Mikropartikelbeschichteten Polynukleotide über intradermale oder intraepidermale Routen injiziert werden, wobei eine nadellose Injektionsvorrichtung ("Genkanone") verwendet wird, wie etwa diejenigen, die zum Beispiel in U.S.-Patent Nr. 4 945 050 , U.S.-Patent Nr. 5 015 580 und in der WO 94/24263 beschrieben sind.
  • Anionische und neutrale Liposomen sind ebenfalls allgemein im Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel, Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL Press (1990), für eine ausführliche Beschreibung von Verfahren zur Herstellung von Liposomen) und sind für die Zuführung eines großen Bereichs von Produkten, einschließlich Polynukleotiden, verwendbar.
  • Ein Impfstoffvektor, wie beschrieben, kann auch ein Cytokin (wie zum Beispiel Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-12 (IL-12), Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF)) und/oder costimulatorische Moleküle (wie zum Beispiel die B7-Molekülfamilie) und/oder andere Lymphokine, welche die Immunantwort verstärken, exprimieren. Daher kann ein Impfstoffvektor eine zusätzliche, zum Beispiel ein Cytokin und/oder Lymphokin und/oder ein costimulatorisches Molekül codierende, DNA-Sequenz einschließen, welche unter die Kontrolle von geeigneten Elementen gebracht wurde, die für die Expression in einer Tierzelle erforderlich sind.
  • Alternativ dazu kann eine Zusammensetzung, wie beschrieben, mehrere Impfstoffvektoren einschließen, die jeweils zum Exprimieren eines Polypeptidderivats, wie beschrieben, eines Cytokins und/oder Lymphokins und/oder von costimulatorischen Molekülen in der Lage sind.
  • ii Art der Verabreichung
  • In Impfverfahren zum Behandeln oder Verhindern von Krebs in einem Tier kann ein Impfstoffvektor, wie beschrieben, durch jedweden herkömmlichen Weg, der auf dem Impfstoff-Fachgebiet in Gebrauch ist, verabreicht werden, wie es dem Fachmann bekannt ist. Dies kann zum Beispiel die Verabreichung an eine (z. B. okulare, intranasale, orale, gastrische, pulmonäre, intestinale, rektale, vaginale oder Harnwegs-)Schleimhautoberfläche einschließen, über den parenteralen (z. B. subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen oder intraperitonealen) Weg oder intranodal erfolgen. Bevorzugte Routen hängen von der Auswahl des Impfstoffvektors ab. Die Verabreichung kann in einer Einzeldosis oder wiederholt in Intervallen erreicht werden. Die geeignete Dosierung hängt von verschiedenen Parametern ab, welche der Fachmann kennt, wie etwa dem Impfstoffvektor selbst, dem Weg der Verabreichung und dem Zustand des zu impfenden Tiers (Gewicht, Alter und dergleichen).
  • Die Verabreichung des Impfstoffs oder Immunogens, wie beschrieben, kann entweder für einen prophylaktischen oder therapeutischen Zweck erfolgen. Bei prophylaktischer Bereitstellung wird das Immungen im Voraus vor jedem Anzeichen oder im Voraus vor jedem Symptom auf Grund von Melanom, oder bei Patienten, welche durch herkömmliche Therapien krankheitsfrei gemacht wurden, aber bezüglich eines erneuten Auftretens erheblich gefährdet sind, bereitgestellt. Die prophylaktische Verabreichung des Immungens dient zum Verhindern oder Abschwächen von Melanom in einem Säuger. Bei therapeutischer Bereitstellung wird das Immungen bei (oder nach) nach dem Ausbruch der Krankheit oder beim Ausbruch irgendeines Symptoms der Krankheit bereitgestellt. Die therapeutische Verabreichung des Immungens dient der Abschwächung der Krankheit.
  • Ein besonders bevorzugtes Impfverfahren umfasst ein Prime/Boost-Protokoll. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass dieses Protokoll, worin auf eine Immunisierung mit einer Poxvirus-Rekombinante, die ein Fremdgen-Produkt exprimiert (oder einer anderen Nukleinsäure, die ein Genprodukt codiert), ein Auffrischen bzw. Boost unter Verwendung einer gereinigten Untereinheit-Präparations-Form dieses Genprodukts (oder der dafür codierenden Nukleinsäure) folgt, eine gesteigerte Immunantwort im Verhältnis zu der Antwortreaktion hervorruft, welche mit jedem Produkt allein hervorgerufen wird. Folglich wird hierin die Verwendung eines modifizierten gp100 in einem Prime/Boost-Protokoll beschrieben. Beispiele für Methodiken, welche das Prime/Boost-Protokoll lehren, sind in WO 98/58956 , WO 00/00216 , WO 98/56919 , WO 97/39771 und WO 98/58956 beschrieben.
  • Die Menge an nackter/freier DNA, welche in einem Impfstoffempfänger zu verwenden ist, hängt im Allgemeinen von der Stärke des im DNA-Konstrukt verwendeten Promotors, der Immunogenität des exprimierten Genprodukts, dem Zustand des für eine Verabreichung beabsichtigten Tiers (d. h. dem Gewicht, Alter und allgemeinen Gesundheitszustand des Tiers), der Art der Verabreichung und dem Typ der Formulierung ab. Im Allgemeinen kann menschlichen Erwachsenen eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Dosis von etwa 1 μg bis etwa 1 mg, bevorzugt von etwa 10 μg bis etwa 800 μg und weiter bevorzugt von etwa 25 μg bis etwa 250 μg verabreicht werden. Die Verabreichung kann in einer einzelnen Dosis, wiederholt in Intervallen, oder eingebunden in Prime/Boost-Protokollen (wie vorangehend beschrieben) erzielt werden.
  • iii. Orale Impfstoffe
  • Nicht-toxikogene Vibrio-cholerae-Mutantenstämme, welche als ein oraler Lebendimpfstoff nützlich sind, werden zum Beispiel in U.S.-Patent Nr. 4 882 278 (welches einen Stamm offenbart, in dem ein wesentlicher Anteil der codierenden Sequenz jedes der zwei ctxA-Allele deletiert worden ist, sodass kein funktionelles Choleratoxin hergestellt wird); WO 92/11354 (ein Stamm, in dem der irgA-Locus durch Mutation inaktiviert ist; diese Mutation kann in einem einzigen Stamm mit ctxA-Mutationen kombiniert werden); und WO 94/1533 (Deletionsmutante, der funktionelle ctxA- und attRS1-DNA-Sequenzen fehlen) beschrieben. Diese Stämme können gentechnisch manipuliert werden, um heterologe Antigene zu exprimieren, wie in WO 94/19482 beschrieben. Eine effektive Impfstoffdosis eines Vibrio-cholerae-Stamms, der zum Exprimieren eines von einem DNA-Molekül, wie beschrieben, codierten Polypeptids oder Polypeptidderivats in der Lage ist, kann zum Beispiel etwa 1 × 105 bis etwa 1 × 109, bevorzugt etwa 1 × 106 bis etwa 1 × 108 lebensfähige Bakterien in einem geeigneten Volumen für den gewählten Verabreichungsweg enthalten. Bevorzugte Verabreichungswege schließen alle mukosalen Wege ein; am stärksten bevorzugt werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
  • Abgeschwächte Salmonella-typhimurium-Stämme, welche für die rekombinante Expression von heterologen Antigenen gentechnisch manipuliert wurden, oder nicht, und ihre Verwendung als orale Impfstoffe sind zum Beispiel in der WO 92/11361 beschrieben. Bevorzugte Verabreichungswege schließen alle mukosalen Wege ein; am stärksten bevorzugt werden diese Vektoren intranasal oder oral verabreicht.
  • Wie der Fachmann auf dem Gebiet leicht erkennt, können andere, als Impfstoffvektoren verwendbare, bakterielle Stämme ebenfalls Shigella flexneri, Streptococcus gordonii und Bacille Calmette Guerin (wie in WO 88/6626 , WO 90/0594 , WO 91/13157 , WO 92/1796 und WO 92/21376 beschrieben) einschließen.
  • In bakteriellen Vektoren kann ein Polynukleotid, wie beschrieben, in das bakterielle Genom inseriert werden, kann in einem freien Zustand verbleiben oder kann auf einem Plasmid getragen werden. Außerdem kann einer Zusammensetzung, die einen bakteriellen Impfstoffvektor enthält, ein Adjuvans zugesetzt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt eine Reihe von Adjuvantien. Geeignete Adjuvantien können vom Fachmann auf dem Gebiet ohne Weiteres ausgewählt werden.
  • V. ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Ein modifiziertes gp100-Protein und -Gen, einschließlich des gp100M-Gens (gp100M) und gp100M-Proteins, sowie die unter Anwendung der hier beschriebenen Verfahren identifizierten Substanzen, einschließlich Impfstoffen, können in pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verabreichung an Subjekte in einer biologisch verträglichen Form, die zur Verabreichung in vivo geeignet ist, formuliert werden. Mit "biologisch verträgliche Form, geeignet zur Verabreichung in vivo" ist eine Form der zu verabreichenden Substanz gemeint, in welcher jedwede toxischen Effekte von den therapeutischen Effekten aufgewogen werden. Die Substanzen können an hierfür bedürftige Tiere verabreicht werden. Die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie beschrieben, oder einer "effektiven Menge", sind als eine Menge definiert, welche, bei den nötigen Dosierungen und Zeitdauern, wirksam ist, um das gewünschte Ergebnis des "Modulierens des Immunsystems eines Tiers" zu erreichen. Eine therapeutisch wirksame Menge einer Substanz kann gemäß Faktoren, wie dem Krankheitszustand, dem Alter, Geschlecht und Gewicht des Tiers, und der Fähigkeit des Immunogens, eine gewünschte Antwortreaktion in dem Tier hervorzurufen, variieren. Dosierungsschemen können angepasst sein, um die optimale therapeutische Antwort vorzusehen. Zum Beispiel können mehrere unterteilte Dosen täglich verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional reduziert werden, wie es durch die Erfordernisse der therapeutischen Situation angezeigt ist. "Modulieren des Immunsystems eines Tiers" wird als die Fähigkeit definiert, eine Immunantwort in einem Zieltier zu erzeugen. Diese Antwort umfasst sowohl zelluläre als auch humorale Immunantworten.
  • Die aktive Substanz kann in einer zweckdienlichen Weise verabreicht werden, wie etwa durch Injektion (intradermal, intramuskulär, subkutan, intravenös, intranodal usw.) oder durch orale Verabreichung, Inhalation, transdermale Aufbringung oder rektale Verabreichung oder jedwede andere Route der Verabreichung, welche die Modulation des Immunsystems eines Tiers ermöglicht. Abhängig vom Weg der Verabreichung kann die aktive Substanz mit einem Material überzogen sein, um die Verbindung vor der Wirkung von Enzymen, Säuren und anderen natürlichen Bedingungen, welche die Verbindung inaktivieren können, zu schützen.
  • Ein Verabreichungsweg, der vorzugsweise verwendet wird, ist derjenige der intranodalen Injektion eines modifizierten gp100-Proteins/immunogenen Fragments oder einer das Protein/Fragment codierenden Nukleinsäure oder einer beliebigen der Zusammensetzungen, wie beschrieben.
  • Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen können durch per se bekannte Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen, die Subjekten verabreicht werden können, hergestellt werden, sodass eine wirksame Menge der aktiven Substanz in einer Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel vereinigt wird. Geeignete Vehikel sind zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences (1985), Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA) oder im Handbook of Pharmaceutical Additives (zusammengestellt von Michael und Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot, England (1995)) beschrieben. Auf dieser Grundlage umfassen die Zusammensetzungen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Lösungen der Substanzen in Assoziation mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Vehikeln oder Verdünnungsmitteln und können in gepufferten Lösungen mit einem geeigneten pH-Wert enthalten sein und/oder zu physiologischen Flüssigkeiten iso-osmotisch sein. Diesbezüglich kann man auf das U.S.-Patent Nr. 5 843 456 Bezug nehmen.
  • Die Nützlichkeit der Substanzen, Antikörper und Zusammensetzungen der Erfindung kann in experimentellen Modellsystemen bestätigt werden.
  • Die nachfolgenden, nicht-einschränkenden Beispiele sind veranschaulichend für die vorliegende Erfindung:
  • BEISPIELE
  • ALVAC(2)-gp100M (vCP1584) ist eine Präparation eines rekombinanten Canarypoxvirus, das eine modifizierte Version von humanem Melanomantigen gp100 exprimiert.
  • A. MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN (IDENTITÄT)
  • 1. Charakterisierung des Empfängers:
  • a. Parentaler Organismus:
  • Canarypoxvirus: Familie – Poxviridae, Subfamilie – Chordopoxviridae, Gattung – Avipoxvirus. Canarypoxvirus ist ein hüllentragendes Virus, das ein lineares dsDNA-Genom von ungefähr 325 kbp enthält. Dieses Virus repliziert sich ausschließlich in Vogelarten produktiv ((Tripathy D. Avian pox. In: Diseases of Poultry (9. Auflage: B. W. Calnek et al., Hrsg.) S. 583–596).
  • b. Beschreibung des Vektors:
  • ALVAC(2) ist ein modifiziertes abgeschwächtes Canarypoxvirus ( U.S. 5 990 091 ). Der Ursprungsstamm von Canarypoxvirus (Rentschler-Stamm) wurde durch 200 serielle Passagierungen auf primären Kükenembryo-Fibroblasten (CEFs) abgeschwächt. Das abgeschwächte Virus wurde Plaque-isoliert und als ALVAC bezeichnet. Zur Erzeugung von ALVAC(2) wurde der ALVAC-Vektor durch die Insertion von zwei codierenden Vacciniavirus-Sequenzen (E3L und K3L) modifiziert, um die Gesamteffizienz der viralen mRNA-Translation zu steigern. Das von E3L spezifizierte Genprodukt ist ein dsRNA-Bindungsprotein, und der offene Leserahmen (ORF) von K3L hat eine signifikante Sequenzähnlichkeit zum aminoterminalen Bereich von eIF-2 ((; Beattie et al., Virology 183: 419 (1991); Beattie et al., Virology 210: 254 (1995)). Sowohl K3L als auch E3L sind in der Lage zum Hemmen der Aktivität einer zellulären Proteinkinase (PKR), welche, sofern durch dsRNA aktiviert, den Translationsinitiationsfaktor eIF-2a phosphoryliert, was zu einer Inhibition der Initiation der mRNA-Translation führt. Ergebnisse aus mehreren Untersuchungen haben diesen vorgeschlagenen Mechanismus bewiesen, durch welchen die K3L- und E3L-Genprodukte von Vaccinia zur Herabregulierung der PKR-Aktivität und zu einer verstärkten virusspezifischen Genexpression (ihren (Tartaglia, J., et al., 11th Colloque des Cent Gardes, Elsevier Press (1997)).
  • c. Ableitung von Vektor aus dem Parental-Organismus:
  • Der parentale Stamm von Canarypoxvirus (Rentschler-Stamm) wurde 1970 in Deutschland isoliert und 1973 vom Institut Merieux erhalten. Das Virus wurde durch 200 serielle Passagierungen auf primären Kükenembryo-Fibroblasten (CEFs) abgeschwächt. Das abgeschwächte Virus wurde 1975 in Frankreich unter dem Namen KANAPDX (ND) als Impfstoff registriert. Das Virus wurde vier aufeinander folgenden Plaque-Reinigungen unter Agarose unterzogen, und ein einzelnes Plaque-Isolat wurde selektiert und als ALVAC bezeichnet.
  • Die K3L codierende Sequenz wurde durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines das Copenhagen-Vaccinia-HindIII-K-Fragment enthaltenden Plasmids als Matrize synthetisiert und unter die Kontrolle des Vaccinia-H6-Promotors gebracht. Die codierende Sequenz und das stromaufwärts gelegene regulatorische Element von E3L wurden aus einem Plasmid erhalten, welches einen Klon des HindIII-E-Fragments aus Copenhagen-Vaccinia enthält. Die vom H6-Promotor gesteuerten K3L- und die E3L-Sequenzen wurden in ein Donorplasmid inseriert, welches zum Lenken von deren Insertion in die C6-Stelle des Parental-Vektors in der Lage ist, und zwar gemäß den Einzelheiten, die im Beispiel 1 dargestellt sind. Zwischen dem Donorplasmid und ALVAC-Rettungsvirus wurde eine Rekombination durch In-vitro-Rekombination, wie früher beschrieben (Piccini et al., Methods of Enzymol. 153: 545 (1987)), durchgeführt. Die Expression von E3L und K3L im resultierenden rekombinanten Virus, vCP1468, wurde bestätigt, und vCP1468 wurde als ALVAC(2) bezeichnet.
  • d. Klonierungsstelle:
  • Der als C5 bezeichnete Locus wurde für die Insertion der modifiziertes gp100 codierenden Sequenzen in den ALVAC(2)-Vektor verwendet. Dank des C5-Locus, der innerhalb der umfangreichen Invertierten-Terminalen-Repetitionen (ITRs) des Virusgenoms existiert, führt die Insertion in diesen Locus hinein zum Auftreten von zwei Kopien der inserierten Sequenz. Eine schematische Darstellung der Insertionsstelle ist in der 4 gezeigt. Derzeitig ist dem von C5 codierten Polypeptid keinerlei Funktion zugeschrieben worden, noch hat der abgeleitete offene Aminosäure-Leserahmen, der in dieser Region codiert ist, eine signifikante Homologie mit irgendeinem Eintrag in den bestehenden Proteindatenbanken gemeinsam.
  • 2. Charakterisierung des Donors
  • a. Donororganismus:
  • Es wurden die Plasmide pCDNA3-gp100 und PCRII-gp100 verwendet, welche jeweils das Gen enthalten, das humanes gp100 (Melanom-Abstoßungsantigen) codiert.
  • b. Donorgene:
    • (i) Exprimierte Donorgene: humanes gp100-Melanomantigen.
    • (ii) Promotor: Vacciniavirus-früh/spät-H6-Promotor (Perkus, M. E., et al., J. Virol. 63: 3829 (1989)).
  • c. Donorgene im rekombinanten Organismus:
  • Die codierenden Sequenzen für ein modifiziertes humanes gp100 sind in das ALVAC(2)-Genom inseriert worden, um das modifizierte gp100-Antigen zu exprimieren, welches bezüglich der Wechselwirkung von zwei CTL-Epitopen mit HLA-Klasse I verbessert war.
  • BEISPIEL 1
  • Insertion der Vaccinia-E3L/K3L codierenden Sequenzen in die C6-Stelle von ALVAC Die K3L-codierenden Sequenzen wurden durch PCR-Amplifikation synthetisiert, wobei pSD407 (enthaltend das Copenhagen-Vaccinia-HindIII-K-Fragment) als Matrize verwendet wurde. Die Oligonukleotide MPSYN 763 (5'-CCCTCT AGATCG CGATAT CCGTTA AGTTTG TATCGT AATGCT TGCATT TTGTTA TTCGT-3') (SEQ. ID. Nr.: 109) und MPSYN 764 (5'-CCCGAA TTCATA AAAATT ATTGAT GTCTACA-3') (SEQ. ID. Nr.: 110) wurden als Primer für die PCR-Reaktion verwendet. Das ungefähr 325 bp große PCR-Fragment wurde mit XbaI und EcoRI verdaut, was ein 315 bp großes Fragment ergab. Dieses 315 bp große Fragment wurde durch Isolierung aus einem Agarosegel gereinigt und mit XbaI- und EcoRI-verdautem Vektor pBSSK+ von Stratagene (La Jolla, CA.) ligiert. Die Nukleinsäuresequenz wurde bestätigt. Dieses Plasmid wurde als pBS 763\764 bezeichnet. Ein Verdau von pBS 763/764 mit NruI und XhoI lieferte ein 340 bp großes Fragment, welches zur Klonierung in den Plasmidvektor pMM154 isoliert wurde. PMM154 enthält eine Kassette mit dem Vaccinia-H6-Promotor, der ein irrelevantes Gen im NYVAC-tk-Insertionsvektor-Hintergrund steuert. PMM154 wurde durch Verdau mit NruI (partiell) und XhoI vorbereitet, sodass das 340 bp große Fragment aus pBS 763/764, welches das K3L-Gen enthielt, benachbart zum H6-Promotor direktional orientiert werden konnte, wodurch man pMPTKH6K3L erzeugte. Das Plasmid pMP42GPT, welches das dominante selektierbare Eco-gpt-Markergen unter der Steuerung des Entomopox-42k-Promotors enthält, wurde mit SmaI und BamHI verdaut, wodurch man eine 0,7 Kbp große 42k-Ecogpt-Expressionskassette erhielt. Dieses 0,7 Kbp große Fragment wurde gereinigt und in SmaI- und BamHI-geschnittenen pMPTKH6K3L ligiert, wodurch das Plasmid pMPTKH6K3Lgpt erzeugt wurde. Dieses Plasmid wurde mit XhoI verdaut, wodurch ein 1,2 Kbp großes Fragment erzeugt wurde, das die H6/K3L- und die 42k/Ecogpt-Expressionskassette enthielt, welches dann über ein Gel gereinigt wurde. Das 1,2 Kbp große XhoI-Fragment wurde in die XhoI-Stelle des ALVAC-C6-Insertionsplasmids pC6L inseriert, wodurch man pMPC6H6K3Lgpt erzeugte.
  • Das gesamte E3L-Gen ist innerhalb eines 2,3 Kbp großen EcoRI-Fragments enthalten, welches aus pSD401VC isoliert wurde, das einen Klon des HindIII-E-Fragments aus Copenhagen- Vaccinia enthielt. Das 2,3 Kbp große EcoRI-Fragment wurde dann in pMPC6H6K3Lgpt inseriert, der mit EcoRI partiell verdaut worden war, wodurch das Plasmid pMPC6H6K3E3gpt erzeugt wurde. Das Plasmid pMPC6H6K3E3gpt wurde mit XhoI verdaut. Das resultierende 6,8 Kbp große Vektorfragment wurde gereinigt und mit sich selbst ligiert, was zum Plasmid pMPC6E3 führt. Das Plasmid pMPTKH6K3L wurde mit PspAI verdaut, und das resultierende 560 bp große Fragment, enthaltend die H6/K3L-Expressionskassette, wurde in PspAI-verdautes pMPC6E3 ligiert, was zu dem Plasmidkonstrukt pMPC6H6K3E3 führt. Das Plasmid pMPC6H6K3E3 enthält die Vaccinia-H6/K3L-Expressionskassette und das Vaccinia-E3L-Gen mit dem endogenen Promotor, flankiert von den ALVAC-C6-Insertionsstellen-Sequenzen.
  • BEISPIEL 2
  • Genetische Modifikationen der Donorgene:
  • Das Plasmid pCDNA3-gp100 wurde in MN522 transformiert, wodurch man das Plasmid pMEL gp100 #1 erhielt. Ein generisches C5-Donorplasmid NVQH6C5LSP-18 wurde innerhalb der Polylinker-Region mit BamHI verdaut, mit alkalischer Phosphatase behandelt und an die kinasierten und annealten Oligonukleotide SPC5PL1 (5'-GAT-CGT-CGA-CGA-GCT-CGA-ATT-CG-3') (SEQ. ID. Nr.: 111) und SPC5PL2 (5'-GAT-CCG-AAT-TCG-AGC-TCG-TCG-AC-3') (SEQ. ID. Nr.: 112) ligiert, wodurch das Plasmid NVQH6MC5 #10 erzeugt wurde. Die Oligonukleotide MELgp01 (5'-CCC-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GGA-TCT-GGT-GCT-AAA-AAG-3) (SEQ. ID. Nr.: 113) und MELgp02 (5'-CCC-CTC-GAG-ATA-AAA-ATC-AGA-CCT-GCT-GCC-CAC-TGA-3') (SEQ. ID. Nr.: 114) wurden in einer PCR mit dem Plasmid pMEL gp100 #1 verwendet, um ein 2 kb großes Fragment zu erzeugen, welches einen Teil des H6-Promotors, verknüpft an das 5'-Ende des gp100-Gens, enthält. Dieses Fragment wurde mit EcoRV und XhoI verdaut und in EcoRV/XhoI-verdautes NVQH6MC5 #10 kloniert, wodurch das Plasmid C5H6MELgp100 #5 erzeugt wurde, welches das gp100-Gen, verknüpft an den H6-Promotor, enthält.
  • Das gp100-Gen im Plasmid C5H6MELgp100 #5 wurde unter Verwendung von maßgeschneiderten Primern sequenziert. Eine 65bp große Deletion wurde in diesem Klon gefunden und ist gezeigtermaßen in pCDNA3-gp100 vorhanden. Das Plasmid PCRII-gp100 wurde in einer PCR mit den Oligonukleotiden MELgp05 (5'-CCC-ATC-TGG-CTC-TTG-GTC-3') (SEQ. ID. Nr.: 115) und MELgp13 (5'-TGA-CAT-CTC-TGC-CAG-TGT-GGT-3') (SEQ. ID. Nr.: 116) verwendet, um ein 0,6 kb großes Fragment zu erzeugen. Dieses Fragment wurde mit BamHI und Asp718 verdaut und an ein 6,5 kb großes Asp718/BamHI(partiell)-Fragment aus C5H6MELgp100 #5 ligiert, wodurch man das Plasmid C5H6MELgp100 erzeugte, das das gesamte gp100-Gen unter der Steuerung des H6-Promotors enthält.
  • Das im Voraus bestehende Plasmid pC5H6MELgp100 wurde als Matrize für eine ortsgerichtete Mutagenese der zwei CTL-Epitope verwendet, beginnend an den Aminosäuren 209 bzw. 280. Die verwendeten Primer waren:
    Figure 00370001
  • Ein Abschnitt, der die modifizierten Epitope enthält, wurde sequenziert und als ein 440 bp großes Nco1/MluN1-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in mit Nco1 und MluN1 verdauten pC5H6MELgp100 ligiert, wodurch ein Plasmid mit dem vollständigen gp100 mit den modifizierten Epitopen 209-2M und 280-9V erzeugt wurde.
  • Sequenzdaten enthüllten eine G-nach-C-Substitution an bp #10, welche die Aminosäure #4 von einem Valin zu einem Leucin ändert. Dies wurde durch PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaars korrigiert;
    Figure 00370002
  • MEL25 ändert bp #549 von einem C zu einem G, wobei die einmalige Nco1-Stelle für ein leichteres Screening zerstört wird. Es verändert nicht die Aminosäure.
  • Das resultierende PCR-Fragment wurde mit BamH1 und EcoR5 verdaut und ersetzte das äquivalente Fragment, wobei der Fehler korrigiert wurde. Das resultierende Plasmid ist pC5gp100-M, welches in 3 (SEQ. ID. Nr.: 123) gezeigt ist.
  • Genetische Modifikation des Empfängers:
  • Eine Rekombination zwischen dem Donorplasmid pC5gp100M und ALVAC(2)-Rettungs-Virus erzeugte das rekombinante Virus vCP1584, welches das Vaccinia-H6-Promotor-gesteuerte modifizierte humane gp100 im C5-Locus enthält.
  • BEISPIEL 3
  • Screening zur Identifizierung und Reinigung von rekombinanten Organismen:
  • Die Aspekte des Screenings für die Identifizierung und Reinigung eines rekombinanten Organismus der vorliegenden Erfindung sind nachstehend dargestellt.
    • (1) Plaque-Aufreinigung erfolgte unter Anwendung von In-situ-Plaque-Hybridisierung (Piccini et al., Methods of Enzymol. 153: 545 (1987)), [und] wurde angewandt, um rekombinante Viren zu identifizieren und die Reinheit von letztendlichen Viruspräparationen aufzuzeigen. Die In-situ-Plaque-Hybridisierungs-Analyse wurde mit radioaktiv markierten Sonden durchgeführt, die spezifisch für das gp100-Konstrukt (ein 580 bp großes Fragment) und den C5-Insertionslocus waren.
    • (2) Restriktionsanalyse: Virale genomische DNA wurde aus Zellen isoliert, die mit ALVAC-Stammform oder ALVAC(2)-gp100M (vCP1584) infiziert sind. Die genomische DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen (HindIII, PstI oder BamHI) verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese durch ein Agarosegel fraktioniert und mittels Ethidiumbromidfarbung sichtbar gemacht. Die Insertion der mod bzw. modifizierten gp100-Expressionskassette am C5-Locus wurde bestätigt.
    • (3) Immunpräzipitationsanalysen: Diese wurden unter Verwendung von radioaktiv markierten Lysaten durchgeführt, die aus nicht-infizierten HeLa-Zellen oder Zellen, welche entweder mit parentalem ALVAC-Virus, ALVAC-gp100 (vCP1465) oder ALVAC(2)-gp100M (vCP1584) infiziert waren, abgeleitet wurden, wie früher beschrieben (Taylor et al., J. Virol. 64: 1441 (1990)). Kurz gesagt, wurden HeLa-Zellkulturen bei einer m. o. i. bzw. Multiplizität der Infektion von 10 pfu/Zelle in Methionin-freien Medien, welche mit [35S]-Methionin (35 μCi/ml) ergänzt waren, infiziert. 18 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen lysiert. Eine Immunpräzipitation wurde unter Verwendung eines Kaninchen-Anti-gp100-Serums (AZN-LAM, erhalten von M. Schreurs University of Nijmegen, Niederlande) durchgeführt. Die Immunpräzipitate wurden auf einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel fraktioniert. Das Gel wurde fixiert und für die Fluorographie mit 1M Na-Salicylat während 1/2 Stunde behandelt. Das getrocknete Gel wurde an Kodak XAR-2-Film exponiert, um die Proteinspezies sichtbar zu machen. Ergebnisse mit Anti- gp100 zeigen die Expression von gp100 in ALVAC-gp100-infizierten HeLa-Zellen, aber nicht für parental infizierte Zellen (Siehe 6).
    • (4) Western-Blot. HeLa-Zellen wurden 18 Stunden lang bei einer Multiplizität von 10 pfu/Zelle mit ALVAC(2)-gp100M (vCP1584), ALVC-gp100 (vCP1465) oder ALVAC infiziert. Zelllysate wurden durch SDS-Page getrennt und auf Nitrozellulose überführt. Der Blot wurde mit AZN-LAM (Verdünnung 1/5000), gefolgt von HRP-konjugiertem Schwein-Anti-Kaninchen, unter Anwendung des verstärkten Chemolumineszenz(ECL)-Nachweisverfahrens (Amersham) inkubiert. Die Ergebnisse zeigen die Expression von Volllängen-gp100 in ALVAC-gp100- und ALVAC(2)-gp100M-infizierten Zellen (Siehe 7).
    • (5) Plaque-Immunoscreen-Analyse. Diese wurde an vCP1584-Material durchgeführt, um die phänotypische Stabilität des Virus nach Passagierung zu bestimmen. Die phänotypische Stabilität von Produktionschargen-Material von ALVAC-gp100M (vCP1584) wurde durch einen immunologischen Plaque-Assay analysiert, welcher die Expression der inserierten Gene auf Plaque-Ebene misst. Der Assay unter Verwendung von permeabilisierten Zellen zum Nachweis von intrazellulärer sowie Oberflächen-Expression von Hgp100mod wurde für diesen Test gewählt.
  • Test- und Kontrollreagenzien (ALVAC(2)-gp100M (vCP1584) und ALVAC-Standard bzw. ALVAC-gp100M) wurden auf CEF-Monoschichten unter Agarose bei Verdünnungen ausplattiert, welche zu 40–200 Plaques pro 60-mm-Schale führten. 120 Stunden nach Inkubation bei 37°C wurden die infizierten Monoschichten durch Plaque-Immunoassay für den Nachweis der internen Expression von gp100M bearbeitet. Positive und negative Plaques wurden für Test- und Kontrollproben ausgezählt. Der verwendete Primärantikörper war monoklonaler Anti-HMB50 bei einer Verdünnung von 1:800. Ein verwendeter Sekundärantikörper war Meerrettichperoxidase(HRP)-konjugiertes Kaninchen-Anti-Maus-Antiserum, welches 1:500 verdünnt war.
  • Das Ergebnis der Analyse der internen Expression von humanem modifizierten gp100 durch individuelle Plaques, erzeugt durch (vCP1584), ist in der Tabelle 1 wiedergegeben.
  • Das Ergebnis zeigt, dass 98,7% der Plaque-Population von ALVAC-gp100M gp100M exprimiert, was darauf hinweist, dass ALVAC-gp100M phänotypisch stabil ist.
  • Die Ergebnisse der Plaque-Immunoscreen-Analyse zeigen, dass ALVAC(2)-gp100M phänotypisch in Hinblick auf die Expression von gp100 stabil ist.
    • (6) Nukleotidsequenz-Analyse. Diese wurde an vCP1584 durchgeführt, um die Nukleotidsequenz der H6-Promotor-gesteuerten Melanom-gp100M-Kassette zu bestätigen. Die Sequenzanalyse enthüllte keine Nukleotidunterschiede im Verhältnis zur erwarteten Sequenz, und daher sind keine Mutationen während der Herstellung von vCP1584 eingeführt worden. Um diese Analyse durchzuführen, wurde ein Pool von Plasmidklonen, enthaltend ein 2,2 kb großes PCR-abgeleitetes Fragment (umfassend die H6-Promotor-gesteuerte Melanom-gp100M-Kassette), das aus genomischer vCP1584-DNA erzeugt war, verwendet.
  • pBS/1584 wurde durch Vereinigen von 9 positiven Klonen erzeugt, welche durch die Ligation eines 2,2 kb großen PRC-Fragments (enthaltend die H6-Promotor-gesteuerte Melanom-gp100M-Kassette aus vCP1584) in pBS-sk-(Stratogene) erhalten wurden. Das 2,2 kb große PCR-Fragment wurde aus genomischer vCP1584-DNA mit den Oligonukleotidprimern IDC5-1 und IDC5-2 (5) abgeleitet. Die Nukleotidsequenzen der zum Sequenzieren von pBS/1584 verwendeten Oligonukleotidprimer sind in der 5 aufgeführt.
  • BEISPIEL 4 Dieses Beispiel stellt Ergebnisse aus der Injektion von modifizierten gp100-Molekülen in Cynomolgus-Affen bereit.
  • Verfahren und Experiment-Auslegung
  • Testsystem
  • Cynomolgus-Affen (Macaca fascicularis), für Versuchszwecke gezüchtete Tiere. Hersteller: Siconbrec "Simian Conservation Breeding & Research Center Inc.", Fema Building, 44 Gil Puyat Avenue Makati, Metro Manila, Philippinen.
  • Anzahl an Tieren in der Untersuchung: 12 (6 Männchen und 6 Weibchen).
  • Alter beim Beginn der Behandlung: 26 bis 38 Monate.
    • – Körpergewichtsbereich am Beginn der Behandlung (Tag-1):
    • – Männchen: 1,73 bis 2,34 kg
    • – Weibchen: 1,71 bis 2,65 kg.
  • Tierhaltung
    • – Unterbringung: ein Raum mit Air-Condition;
    • – Temperatur: 19 bis 25°C (Zielbereich),
    • – relative Luftfeuchtigkeit: > 40%
    • – Luftänderungen: Minimum von 8 Luftwechsel je Stunde,
    • – Lichtzyklus: 12 Stunden Licht (künstlich)/12 Stunden Dunkelheit.
    • – Käfig: die Tiere wurden einzeln in Käfigen aus nichtrostendem Stahl-Maschenwerk untergebracht (ungefähr 540 × 810 × 760 mm).
    • – Nahrung: erweiterte vollständige kommerzielle Primatennahrung (Mazuri-Diet, Special Diet Services Ltd., Witham, Essex, CM8, 3AD, Großbritannien), analysiert hinsichtlich chemischer und bakterieller Kontaminanten.
  • Abgegebene Menge: 100g Nahrung/Tier/Tag.
  • Darüber hinaus erhielten die Tiere täglich Früchte (Äpfel oder Bananen).
  • Die Tiere wurden mindestens 16 Stunden lang vor der Blutentnahme für klinische Laboratoriumsuntersuchungen und vor der Nekropsie fasten gelassen.
    • – Wasser: Trinkwasser nach Belieben (mittels Flaschen).
    • – Kontaminanten: in der Nahrung oder dem Wasser waren keine bekannten Kontaminanten bei Spiegeln vorhanden, welche die Erreichung des Ziels der Untersuchung beeinträchtigt haben könnten.
  • Vorbehandlungsprozeduren
    • – Tiergesundheits-Prozedur: alle Tiere erhielten eine klinische Untersuchung hinsichtlich Gesundheitsmängeln beim Eintreffen und eine veterinärmedizinische klinische Untersuchung während der Eingewöhnungsperiode.
    • – Eingewöhnungsperiode: mindestens 3 Wochen zwischen Ankunft der Tiere und Beginn der Behandlung.
  • Experimentelle Auslegung
    • – Die Zuordnung in Behandlungsgruppen wurde während der Eingewöhnungsperiode unter Anwendung einer statistischen Zuordnungsprozedur, basierend auf Körpergewichtsklassen, vorgenommen.
    • – Die Tiere wurden den in der Tabelle 2 gezeigten Behandlungsgruppen zugeordnet. Die verabreichten Dosis-Spiegel wurden in der Tabelle 3 gezeigt.
  • Verabreichung der Test/Kontroll-Artikel
  • Tiere der Gruppe 1 und 2
    • – Verabreichungsverfahren: Injektion in den linken inguinalen Lymphknoten. Die Tiere wurden vor jeder Verabreichung durch eine intramuskuläre Injektion von Ketaminhydrochlorid (Imalgene® 500 – Merial, Lyon, Frankreich) leicht betäubt. Die Injektion wurde bei jeder Gelegenheit am selben Lymphknoten (linke Seite) vorgenommen. An jede Injektion schloss sich eine lokale Desinfektion mit Iod (Vétédine®-Vétoquinol, Lure, Frankreich) an.
  • Gruppe 3
    • – Route: subkutan.
    • – Verfahren zur Verabreichung: Bolusinjektion unter Verwendung einer sterilen Spritze und Nadel, welche subkutan eingeführt werden. Es wurden vier Injektionsstellen verwendet, woran sich eine lokale Desinfektion mit Iod (Vétédine®-Vétoquinol, Lure, Frankreich) anschloss. Außerdem wurden die Tiere vor jeder Verabreichung durch eine intramuskuläre Injektion von Keta minhydrochlorid (Imalgene® 500 – Merial, Lyon, Frankreich) leicht betäubt, um unter denselben Bedingungen wie die Tiere der Gruppen 1 und 2 vorzuliegen.
  • Es wurden vier Injektionsstellen in den dorsalen Zervikal/Interskapular-Regionen verwendet, wie es in der Tabelle 4 gezeigt ist.
  • ELISPOT-Analyse
  • Ein ELISPOT-Assay wurde angewandt, um die zellvermittelte Immunantwort zu untersuchen, welche in den Affen in den verschiedenen Behandlungsgruppen erzeugt wurde. Insbesondere wurde ein ELISPOT-IFNγ-Assay angewandt, um die IFNγ Produktion aus T-Lymphozyten, die aus den Affen erhalten wurden, in Antwort auf gp100-Antigene zu messen.
  • Materialien und Methoden
    • Platten: MILLIPORE-Multiscreen-HA-Platte/MAHR S45.10 (96 Vertiefungen).
    • Einfangantikörper: monoklonale MABTECH-Anti-IFNγAntikörper/G-Z4, 1 mg/ml.
    • Nachweisantikörper: monoklonale MABTECH-Anti-IFNγ-Antikörper/7-B6-1-Biotin, 1 mg/ml.
    • Enzym: SIGMA, Extravidin-PA-Konjugat/E2636
    • Substrat: BIORAD, NBT/BCIP – Alkalische-Phosphatase-Konjugatsubstrat, Kit/Ref: 170-64 32.
  • Aufbeschichten
  • Man bringt pro Vertiefung 100 μl Einfangantikörper bei 1 μg/ml, verdünnt zu 1/1000 in Carbonat/Bicarbonat-Puffer 0,1 M, pH 9,6, in die Mehrfachvertiefungsplatte ein. Es wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Es wird viermal in 1X PBS gewaschen.
  • Sättigung
  • Man bringt pro Vertiefung 200 μl RPMI, supplementiert mit 10% FCS, nicht-essenziellen Aminosäuren, Pyruvat, Hepes-Puffer und Peni-Strepto, ein. Es wird 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
  • Test
  • Zellen aus den immunisierten Tieren werden gegen (a) Medium allein; (b) vereinigte bzw. gepoolte Peptide bei einer Konzentration von 1 mg/ml; und (c) einen nicht-spezifischen Stimulus (PMA-Iono) getestet. Die in diesem Beispiel zum Stimulieren der IFN-γ-Produktion verwendeten vereinigten Peptide waren aus gp100 abgeleitet und sind in den Tabellen 5 bis 8 veranschaulicht. Das Endvolumen jeder Probe beträgt 200 μl. Man inkubiert 20 Stunden lang bei 37°C. Es wird viermal in 1X PBS und 0,05% Tween 20 gewaschen.
  • Nachweis
  • 100 μl Nachweisantikörper bei 1 μg/ml, welche 1/1000 in 1X PBS, 1% BSA und 0,05% Tween 20 verdünnt sind, werden pro Vertiefung eingebracht. Es wird 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird viermal in 1X PBS und 0,05% Tween 20 gewaschen.
  • Reaktion
  • Pro Vertiefung werden 100 μl Extravidin-PA-Konjugat eingebracht, das 1/6000 in 1X PBS, 1% BSA und 0,05% Tween 20 verdünnt ist. Es wird 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird viermal in 1X PBS und 0,05% Tween 20 gewaschen.
  • Substratzugabe
  • Pro Vertiefung werden 100 μl im Voraus hergestelltes Substrat eingebracht. Zum Beispiel werden für 1 Platte vorbereitet: 9,6 ml destilliertes Wasser, 0,4 ml 25X-Puffer, 0,1 ml Lösung A (NBT) und 0,1 ml Lösung B (BCIP). Es wird 30–45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Waschen erfolgt in destilliertem Wasser. Es erfolgt eine Trocknung und Überführung auf eine Kunststofffolie. Die Anzahl an Spots wird unter Verwendung eines Zeiss-Bildanalysators ausgezählt. Jeder Spot entspricht einer individuellen IFN-γ-sezernierenden T-Zelle.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse der ELISPOT-Analyse sind in den 811 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass von den getesteten Tieren 2 von 2 (d. h. 100%) der Tiere, welche die intranodale Verabreichung des gp100-Antigens erhielten, und 2 von 4 (d. h. 50%) der Tiere, welche die subkutane Verabreichung des gp100-Antigens erhielten, eine positive zellvermittelte Immunantwort aufwiesen.
  • ELISA-Analyse
  • Der ELISA wurde unter Anwendung der auf dem Fachgebiet bekannten Standardmethodik durchgeführt. Kurz gesagt, wurde das humane gp100 ("hgp100"; hergestellt im Baculovirus) in Beschichtungspuffer bzw. Auftragspuffer (Carbonat-Bicarbonat, pH 9,6) verdünnt und bei 0,5 μg/Vertiefung zu 96 Vertiefungen zugesetzt. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C gelassen. Die Platten wurden dann gewaschen, und Blocking-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung/0,5% Tween 20/1,0% BSA, pH 7,2) wurde 2 Stunden lang bei 37°C zugegeben. Die Platten wurden dann gewaschen, und die Seren wurden in Verdünnungspuffer verdünnt (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung/0,5% Tween 20/0,1 BSA, pH 7,2). Für diese Untersuchung wurden Affenseren 1:800 verdünnt, und "7" serielle 3-fach-Verdünnungen wurden für jede getestete Probe durchgeführt. Die humanen Serumkontrollen wurden 1:50 in Verdünnungspuffer verdünnt, und "7" serielle 2-fach-Verdünnungen wurden durchgeführt. Jede Verdünnung erfolgte in zweifacher Ausfertigung. Die Platten wurden weitere 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und der Meerrettichperoxidase(HRP)-konjugierte Anti-Mensch-Sekundärantikörper (Anti-Human-Ig-Gesamtantikörper aus Schaf (Amersham Life Science, NA933)), der 1:100 in Verdünnungspuffer verdünnt war, wurde zu den Vertiefungen zugesetzt und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und OPD (o-Phenylendiamindihydrochlorid)-Substrat mit H2O2 in Substratpuffer (50 mM Phosphat/25 mM Citrat, pH 7,2) wurde den Vertiefungen zugesetzt. Für einen kinetischen ELISA wurde die Platte wiederholt (2-Minuten-Intervalle während 15 Minuten) ungestoppt (ohne "Stop"-Puffer) abgelesen. Die Platten wurden bei 450 mm abgelesen.
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse des oben genannten Experiments sind in der Tabelle 9 und in der 12 präsentiert. Die Tiere von Gruppe 2 erhielten intranodale Injektionen von ALVAC(2)-gp100(mod), gefolgt von Boosts mit den modifizierten gp100-Peptiden 209(2M) und 290(9V); die Tiere in Gruppe 3 erhielten eine subkutane Injektion des ALVAC(2)-Konstrukts, gefolgt von Peptid-Boosts; die Tiere in der Gruppe 1 erhielten intranodale Injektionen mit Kochsalzlösung als Kontrolle.
  • Wie aus der 12 ersehen werden kann, induzierten beide Typen von Injektion der Antigene eine signifikante humorale Antwort auf das Antigen.
  • Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieses Beispiels, dass die Injektion eines Tumorantigens gemäß der Erfindung sowohl eine signifikante humorale als auch zellvermittelte Antwortreaktion induziert.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel präsentiert Daten, welche aus humanen Melanompatienten erhalten wurden, bei denen ein Primen mit ALVAC(2)-gp100M und ein Boosten mit modifizierten gp100-Peptiden (g209-2M und g280-9V) vorgenommen wurde.
  • Immunisierungsprotokoll
  • 5 Patienten wurden subkutan in einem Prime-Boost-Schema mit ALVAC(2)-gp100M ("prime"; lyophilisiertes ALVAC(2)-gp100M, das in 1 ml 0,4% NaCl resuspendiert war; 0,5-ml-Injektionen (ungefähr 0,5 × 107,09 CCID50 pro Injektion)) und den Peptiden g209-2M und g280-9V ("boost"; 1000 μg/Peptid in 1 ml Gesamtvolumen pro Woche (0,2 ml/Injektion täglich × 5 Tage lang)) immunisiert. Alle Patienten: 1) waren HLA-A0201-positiv; 2) wiesen ein Alter zwischen 18 und 70 Jahren auf; 3) zeigten ein pathologisch bestätigtes bösartiges Melanom; 4) zeigten Immunkompetenz durch Reaktivität gegenüber mindestens 2 oder mehr von 7 Hauttests auf zellvermittelte Immunität (CMI); 5) besaßen Werte der Bluthämatologie und -chemie innerhalb der folgenden Bereiche: I) Hämatologie: Hämoglobin > 100 g/l Granulozyten > 2,0 × 109/l Lymphozyten > 1,5 × 109/l Blutplättchen > 100 × 109/l
    II) Chemie: Serum-Kreatinin < 150_mol/l Serum-Gesamt-Bilrubin <30_mol/l AST, ALT und ALP müssen < 2x der normalen Obergrenze sein, oder < 5x der normalen Obergrenze, falls auf Leber-Metastasen beruhend.
  • Die Patienten wurden in den Wochen 1, 4 und 7 mit ALVAC(2)-gp100M "geprimt"; und in den Wochen 10 und 13 mit Peptiden "geboostert".
  • ELISPOT-Analyse: Diese Ergebnisse sind in den Tabellen 10 und 11 wiedergegeben. Mononukleare Zellen des peripheren Bluts ("PBMNC") wurden mittels Dichtezentrifugation über Ficoll-Gradienten isoliert. Die Zellen wurden bei 3 × 106/ml in AIM-V-Medien zusammen mit einer Mischung von g209-2M und g280-9V oder dem HLA-A*0201-Eindungs-Flu-Peptid (alle bei 50 μg/ml) 8 Tage lang in Massenkultur gehalten. An den Tagen 3 und 5 der Kultur wurde IL-2 zugegeben. Am Tag 9 wurden die Zellen geerntet, gezählt und 2 × 105 Zellen/Vertiefung plus 50 U/ml IL-2, mit und ohne die jeweiligen Peptide, wurden in Nitrozellulosemembran enthaltende ELISPOT-Platten ausplattiert, welche mit Anti-INF-γ-Antikörpern vorbeschichtet worden waren.
  • Die Platten wurden nach 48 Stunden Kultur entwickelt. Die aufgeführten Zahlen sind die Unterschiede zwischen dem Mittelwert von zwei Vertiefungen, welche mit Peptid und IL-2 restimuliert wurden, und zwei Vertiefungen, welche lediglich mit IL-2 behandelt wurden.
  • Bei den Antworten handelt es sich um die Anzahl der Spots (gezählt mit dem elektronischen ELISPOT-Lesegerät, jedoch in den meisten Fällen mit Bestätigung durch manuelles Auszählen) pro 2 × 105 PBMNC. Die Anzahl an CD8+-T-Zellen wurde nicht routinemäßig bestimmt, ist jedoch typischerweise um das 2-5-Fache niedriger als diese Zahl. TABELLE 1 Analyse der Expression von gp100-Antigen durch ALVAC-gp100M Humanes gp100 Positive Plaques Negative Plaques Gesamtzahl der Plaques % positiv ALVAC-Std. 0 571 571 0 vCP1584 387 0 387 100 ALVAC gp100mod L 875 11 886 98,7
    TABELLE 2 Gruppen-Nummer Weg der Verabreichung Behandlungstage und verabreichte Verbindung Anzahl an Tieren 1 Intranodal Kochsalzlösung (NaCl 0,9%): Tage 28, 42, 56 dann 70, 71, 72, 73, 74 dann 84, 85, 86, 87 und 88 4 2 Intranodal ALVAC(2)-gp100mod: Tage 28, 42, 56 *mgp100-Peptide: Tage 70, 71, 72, 73, 74 dann 84, 85, 86, 87 und 88 4 3 Subkutan Kochsalzlösung (NaCl 0,9%): Tag 1 ALVAC(2)-gp100mod: Tage 28, 42, 56 *mgp100-Peptide: Tage 70 und 84 4
    • *209(2M)-IMDQVPFSY (SEQ. ID. Nr.: 124); 290(9V) YLEPGPVTV (SEQ. ID. Nr.: 125)
    • – Tiere der Gruppe 1 (Kontrolle) erhielten den Kontrollartikel (Kochsalzlösung zur Injektion (NaCl 0,9%)).
    • – Tiere der Gruppe 3 erhielten nur am Tag 1 den Kontrollartikel (Kochsalzlösung zur Injektion (NaCl 0,9%)).
    TABELLE 3 Gruppen-Nummer Dosishöhe Dosisvolumen (ml/Verabreichung) 1 Kochsalzlösung (NaCl 0,9%): 0 0,250 2 Dosis: 0,25 × 107,4 CCID 50 ALVAC(2)-gp100mod: 0,25 107,4 CCID 50 0,250 Dosis: 200 μg (gesamt) der Peptide IMDQVPFSY (209(2M)) und YLEPGPVTV (290(9V)) (je 100 μg) 0,2 3 Kochsalzlösung (NaCl 0,9%) 0,250 ALVAC(2)-gp100mod: 0,25 107,4 CCID 50 0,250 Dosis: 200 μg (gesamt) der Peptide IMDQVPFSY (209(2M)) und YLEPGPVTV (290(9V)) (je 100 μg) 0,2
    TABELLE 4 Tage verwendete Stellen 1 und 28 unten links 42 oben links 56 oben rechts 70 unten links 84 unten rechts
    TABELLE 5 Peptid-Pool #1
    Figure 00480001
    TABELLE 6 Peptid-Pool #2
    Figure 00490001
    TABELLE 7 Peptid-Pool #3
    Figure 00500001
    TABELLE 8 Peptid-Pool #4
    Figure 00510001
    TABELLE 9 TAG (mOD/min) Affe# 0 57 68 96 1 3 5 2 2 2 4 6 12 10 3 7 6 10 8 4 7 6 8 8 5 5 9 20 15 6 11 8 10 12 7 11 23 51 30 8 7 30 70 22 9 1 7 5 3 10 2 6 6 4 11 3 7 14 8 12 6 9 15 6
    TABELLE 10 gp100-spezifische Antworten auf g209-2M und g280-9V* Patient vor 1. Injektion vor 2. Injektion vor 3. Injektion vor 4. Injektion vor 5. Injektion 4 Wochen nach Impfung #1 0 0 0 ND ND 2 ± 1,4 #2 0 14 ± 2,8 54 ± 6,4 16 ± 7,8 ND ND #3 0 0 ND ND ND ND #4 0 0 24 ± 13,4 1 ± 2,1 ND ND #5 ND 6 ± 6,4 ND ND ND ND
    TABELLE 11 Flu-Peptid-spezifische Antworten* Patient vor 1. Injektion vor 2. Injektion vor 3. Injektion vor 4. Injektion vor 5. Injektion 4 Wochen nach Impfung #1 > 150 ND > 70 ND ND 12,5 #2 ND 0 24 0 ND ND #3 23,5 7 ND ND ND ND #4 0 29 13,5 11,5 ND ND #5 ND > 200 ND ND ND ND
    • * ND gibt an, dass die Werte für die Probe nicht bestimmt wurden.
    SEQUENZAUFLISTUNG
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    Figure 01010001

Claims (6)

  1. Verwendung (i) eines Poxvirusvektors, der darin inseriert eine in 1 (SEQ ID NR: 1) gezeigte Nukleinsäuresequenz aufweist, und (ii) Peptide, bestehend aus den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NR: 124 und SEQ ID NR: 125, zur Herstellung eines Medikaments für die Erzeugung einer Immunantwort gegen humanes Melanom durch sequentielle Verabreichung.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Poxvirusvektor ALVAC ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Poxvirusvektor ALVAC-2 ist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Poxvirusvektor, der darin inseriert eine in 1 (SEQ ID NR: 1) gezeigte Nukleinsäuresequenz zum Primen aufweist, und das Peptid der SEQ ID NR: 124 und das Peptid der SEQ ID NR: 125 zum Boosten, wobei die Zusammensetzung für die getrennte Verabreichung des Vektors und der Peptide hergerichtet ist.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Poxvirusvektor ALVAC ist.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Poxvirusvektor ALVAC-2 ist.
DE60038567T 1999-10-22 2000-10-20 Modifiziertes gp100 und dessen verwendung Active DE60038567T2 (de)

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