JP7089469B2 - 眼神経変性障害(例えば緑内障)の処置及び予防における使用のためのニコチンアミド - Google Patents
眼神経変性障害(例えば緑内障)の処置及び予防における使用のためのニコチンアミド Download PDFInfo
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Description
本発明は、国立衛生研究所(NIH)によって与えられた助成番号R01 EY011721で米国政府支援のもと行われた。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。
本出願は、2015年10月23日に出願の米国仮出願番号第62/245,467号及び2016年7月25日に出願の62/366,211号に対し35U.S.C.§119(e)に基づいて利益を主張し、その全ての内容を、全体において参照により本明細書に組み込む。
本緑内障処置は、網膜(例えば、RGC)のレベルで神経性機能不全及び神経変性を処置又は予防するのに有効である。緑内障は、どんなレベルの眼内圧でも(高IOP又は正常眼圧)存在し得る。本治療処置は、網膜神経節細胞(RGC)などの網膜細胞に対する神経保護的効果のIOP非依存的効果を提供する。
本発明の目的は、処置を必要とする対象において神経変性障害(眼神経変性疾患、例えば緑内障など)を処置する方法を提供することであり、方法が、対象に遺伝子組成物を投与する工程を含む。遺伝子組成物は、Nmnat(例えば、Nmnat-1、Nmnat-2又はNmnat-3)の発現を増加させる遺伝子を含有する。
特定の実施形態において、遺伝子はWldSである。
特定の実施形態において、方法は、対象の眼にNmnat(例えば、Nmnat-1、Nmnat-2又はNmnat-3)及び/又はWldSをコードするポリヌクレオチドを投与する工程を含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターで対象に投与される(例えば、AAVベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなど)。
本発明の目的は、処置を必要とする対象において神経変性障害を処置する方法を提供することであり、方法が、対象にNADtの細胞内レベルを増加させる1つ又はそれ以上の化合物の治療有効量を投与する工程を含み、対象にNampt、Nmnat(例えば、Nmnat-1)、及び/又はWldSをコード並びに発現するポリヌクレオチドを投与する工程を更に含む。
特定の実施形態において、前記対象は、ヒト対象である。
特定の実施形態において、前記対象は、緑内障の神経変性症状を発症していない。特定の実施形態において、前記対象は、緑内障の神経変性症状を発症している。
特定の実施形態において、方法は対象に追加の治療的薬剤を投与する工程を更に含む。典型的な追加の治療的薬剤には、眼内圧を低減する薬剤がある。特定の実施形態において、前記追加の治療的薬剤は、β受容体遮断薬、非選択的アドレナリン作動薬、選択的α-2アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、プロスタグランジン類似体、副交感神経刺激様アゴニスト、カルバコール又はそれらの組合せである。特定の実施形態において、前記追加の治療的薬剤は、チモロール、レボブノロール、メチプラノロールカルテオロール、ベタキソロール、エピネフリン(epinepherine)、アプラクロニジン、ブリモニジン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾールアミド、ラタノプロスト、トラボプロスト(travaprost)、ビマトプロスト(bimataprost)、ピロカルピン、ヨウ化エコチオフェート、カルバコール又はそれらの組合せである。
特定の実施形態において、方法は、遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、前記遺伝子組成物は、NMNAT1をコードするポリヌクレオチドを含む。
この出願に使用される用語は、以下の意味を持つものとする。
本明細書では、用語「緑内障」とは、網膜及び視神経に対する損傷及び視覚機能不全又は視力喪失をもたらす眼疾患のことを指す。緑内障は、老人の間で広く一般に起こる。緑内障による視力喪失は、恒久的であり、不可逆的である。
NAM-ニコチンアミド
NAMPT-ニコチンアミドホスホリボシル転移酵素
NMN又はβNMN-ニコチンアミドモノヌクレオチド
NMNAT-ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリル転移酵素
NAD-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
NaMN-ニコチン酸モノヌクレオチド
NR-ニコチンアミドリボース配糖体
概要
本発明は、網膜神経節細胞(RGC)に対する最高水準の分子技術(RNA配列決定;RNA-seq)の使用に主に基づき、これは、検出可能な神経変性の前に起こるミトコンドリア異常が、ニューロン機能不全の初期の駆動体であるという発見につながった。DBA/2J(D2)マウスモデル(慢性老人性、遺伝性緑内障)を使用して、本発明者らは、大部分の緑内障にとって鍵となる危険因子である加齢とRGCにおけるニューロン変性の駆動における高IOPとの関係を更に明らかにした。
特定の実施形態において、医薬組成物は、緑内障、好ましくは原発性開放隅角緑内障、正常眼圧緑内障及び原発性閉寒隅角緑内障を処置又は予防するのに有効である。特定の実施形態において、本発明の医薬製剤は、原発性開放隅角緑内障を処置又は予防するのに特に有効である。
特定の実施形態において、対象はピルビン酸と組み合わせてNAMを投与される。NAM及び/又はピルビン酸が、NADt(NAD+及びNADHの総レベル)の細胞内レベルを増加させ、従って対象において神経変性障害を処置又は予防すると考えられる。
DBA/2Jマウスモデル
本発明者らは、DBA/2J(D2)マウスモデルがヒト緑内障をよく模倣する遺伝性老人性緑内障を発症するので、このマウス系統の使用を選択した。D2マウスは、ヒト緑内障に起こるのと同じ疾患媒介分子(例えば補体成分分子)、視神経頭において鍵となる緑内障侵襲の同じ部位、及びRGC死の同じ局所解剖学的パターンの誘導を含め、ヒト緑内障との類似点が多く確立されている最も研究されている緑内障モデルの1つである。D2マウスは、約6~8ヵ月齢で開始する虹彩疾患及び高い眼内圧を有する。9ヵ月齢まで、高い眼圧は、大部分のD2マウスの眼において持続中であった。D2マウスは、進行性の視力喪失、視神経損傷及び網膜内層機能不全をその後有する。12ヵ月齢で、設計された実験が通常どおりに終わったとき、D2マウス眼のおよそ70%が、網膜及び視神経の組織学検査に基づく重度疾患を有する。緑内障。化合物(例えば、メマンチン、チモロール又はラタノプロスト)の局所投与は、ヒト緑内障においてするのと同様に、D2マウスにおいてIOPを低減し、神経変性を発症する危険性を減少させる。対照D2-Gpnmb+は、緑内障を発症しない月齢及び系統が同じマウスである。
眼内圧(IOP)は、例えば、ゴールドマン圧平眼圧測定(Haag Streit、Bern、Switzerland)を使用して決定することができる。ヒトにおいて、正常IOPは、12~21mmHgである。21mmHgを超えるIOPは、高いと見なされる。IOPの上昇は、緑内障における主要な危険因子である。POAG(原発性開放隅角緑内障、事例の90%超を占める最も一般的な緑内障)である緑内障では、25mmHgが、無処置のベースラインIOP中央値である。
網膜神経節細胞(RGC)は、網膜の出力ニューロンである。それらは、介在ニューロン(即ち、双極細胞及びアマクリン細胞)を経て光受容器(即ち、桿体視細胞及び錐体視細胞)から視覚情報を受ける。この視覚情報は、光中の光子として開始し、網膜神経節細胞シナプスで電位になる。RGCは、細胞体を残す長い軸索を有し、軸索が眼から出る(視神経頭)視神経円板(即ち、盲点)へと網膜を超えて横断する。視神経頭(ミエリン移行帯)を越えたところで、網膜神経節細胞軸索はミエリン化し、視神経を形成する(即ち、視神経は網膜神経節細胞軸索の束であり、マウスにおいてこれは、系統によりおよそ50000本である)。視神経中の軸索は、脳内の末端視覚中枢に最終的に到達し、脳は、次いでこれらのシグナルを中継する又はこの情報をそれ自体で処理する。網膜神経節細胞軸索が終わる2つの重要な視覚中枢は、外側膝状核(LGN)及び上丘(sup.col./SC)である。
特定の実施形態において、薬剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)前駆体(例えば、ニコチン酸、ニコチンアミド[NAM]、ニコチンアミドモノヌクレオチド[NMN]、ニコチンアミドリボース配糖体[NR]又はそれらの組合せ)、クレブス回路中間体若しくはその前駆体(例えば、ピルビン酸)、又はそれらの組合せを含む。
特定の実施形態において、NAMのケト、エチル、ベンジル又は他の非塩実施形態を、本発明に使用することもできる。
マウスにおいて、本化合物(例えば、NAM/ニコチンアミド/NAD/NR/ピルビン酸)は、1日の投与量約200~1000のmg/kg/日で投与して、神経保護的効果を得ることができる。好ましくは、1日の投与量は約400~600mg/kg/日である。より好ましくは、1日の投与量は約550mg/kg/日である。これらの投与量において、本化合物は、神経保護的効果をもたらす。
神経変性障害を処置するための治療的薬剤
一態様において、本発明は、処置又は予防を必要とする対象において神経変性障害を処置又は予防する方法を提供し、方法が、対象にNADtの細胞内レベルを増加させる又はNAD+、NADH、GSH、GSSG、ピルビン酸若しくはPQQの細胞内レベルを増加させる薬剤の治療有効量を投与する工程を含む。
多くの異なる型の侵襲又は神経変性疾患又は病態、例えば:低酸素、低血糖症、糖尿病、イオンホメオスタシスの喪失が原因の代謝的ストレス、ニューロンの物理的傷害、毒物への曝露及び遺伝又は非遺伝性神経変性障害を含む神経系に影響を及ぼす多数の疾患は、ニューロンの損傷又は死をもたらし得る。特定の実施形態において、神経変性障害は、軸索変性を含む。特定の実施形態において、神経変性障害は、ワーラー変性又はワーラー様変性を含む。例えば、ワーラー変性は、疾患、外傷又は化学療法薬に起因する傷害などのニューロン傷害に起因する場合がある。
医薬製剤は、投与される対象に対して有害でない形態の薬理学的活性成分、及び活性成分を安定化するように設計され、血液循環又は標的組織へのその吸収に影響を及ぼす追加の構成要素を含む。
本発明の医薬組成物は、ワーラー変性などの軸索変性を含む神経変性障害の処置に有用性があると予測される。これらの変性が重要なものになり得る障害の例には、糖尿病性神経障害、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、末梢神経障害、脳卒中及び他の虚血性障害、外傷性脳傷害、等がある。このリストは単なる例示目的であり、制限的又は包括的でない。
一実施形態において、ニューロン傷害は、老化に起因する。
遺伝子治療は、服薬順守問題を克服し、有効性を改善するのに魅力的な方法である。本発明は、神経変性を処置するための遺伝子治療の方法を提供する。軸索変性は、治療必要性が満たされていない領域である。神経変性は、運動ニューロン疾患、緑内障、アルツハイマー病及び多発性硬化症における症状の原因になる。糖尿病において、それは神経障害性疼痛及び遠位感覚消失の原因になり、それは肢切断の主原因である。それは、がん化学療法において用量を制限する副作用でもある。伸張傷害による進行性軸索変性は、外傷性脳傷害における主要な病理であり、白質を保護できないことが、脳卒中の処置を制限する。ヒト集団のおよそ半分は、これらの障害の1つ又は複数を最終的に患うことになり、これは生活の質を有意に減少させる。
NMNAT
ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ1(Nmnat1[マウス]、NMNAT1[ヒト])は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)の生合成において鍵となる工程を触媒する酵素をコードする。コードされている酵素は、いくつかのニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼの1つであり、細胞核に特異的に限局する。この遺伝子の選択的スプライシングは、複数の(少なくとも3つ)転写産物バリアントをもたらす。
Nampt過剰発現は、NMNの産生を駆動することになり、NMNは、適切に除去しないとニューロンに有毒なので、従って、NamptよりもNmnat1を選択した。
軸索変性は、神経変性疾患の一般的な要素である。遠位軸索変性のこのより大きな程度を説明しようと試みる2つのモデルがある。第1は、変性が神経末端から逆行的に広がる「遠位性」である。第2は、ワーラー変性であり、この場合変性が、病変型に従って病変の部位からいずれの方向にも広がり、遠位から病変部位への軸索の喪失を最終的にもたらし、近位部分が完全に残る。厳密に言えば、ワーラー変性は、軸索の物理的傷害に応じてしか起こらず、そのような傷害が起こらなかった疾患においては類似の機序が作動する。後者は、「ワーラー様」変性と称される。両方の型の変性は、「ワーラー変性」として以下で一緒に称されることになる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、WldS又はそのヒト配列相当物をコードする。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象に局所的に投与される。
例えば、緑内障を処置するために、薬剤は、冒された眼に局所的に送達されてもよい。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターで対象に投与される。典型的な適切なウイルスベクターには、それだけには限らないが、AAVベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、等がある。好ましくは、ウイルスベクターは、AAVベクター又はレンチウイルスベクターである。
特定の実施形態において、核酸構築物は、ポリペプチドなどの遺伝子産物又はポリペプチドの発現をアンタゴナイズする核酸(例えば、siRNA、miRNA、shRNA、アンチセンス配列、アプタマー、リボザイム、アンタゴmir、RNAスポンジ、等)をコードする核酸分子が、標的細胞における核酸分子の発現を指令可能なプロモーターに作動的に連結されている発現ベクターである。
遺伝子治療に適切なベクターは、Anderson(Nature、392:25~30頁、1998年);Walther及びStein(Drugs、60:249~71頁、2000年);Kayら(Nat.Med.、7:33~40頁、2001年);Russell(J.Gen.Virol.、81:2573~604頁、2000年);
Amado及びChen(Science 285:674~6頁、1999年);Federico(Curr.Opin.Biotechnol.、10:448~53頁、1999年);Vigna及びNaldini(J.Gene Med.、2:308~16頁、2000年);Marinら(Mol.Med.Today、3:396~403頁、1997年);Peng及びRussell(Curr.Opin.Biotechnol.、10:454~7頁、1999年);Sommerfelt(J.Gen.Virol.、80:3049~64頁、1999年);Reiser(Gene Ther.、7:910~3頁、2000年);及びその中に引用される文献(参照により全て組み込む)に記述されるものなど当業者に公知である。例には、レトロウイルス、アデノウイルス(AdV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス並びにヘルペスウイルスに基づくものなど組み込み型及び非組み込み型ベクターがある。
一態様において、本発明は、眼変性疾患を処置するための遺伝子治療の方法を提供する。当業者は、硝子体内投与又は眼内投与を含む眼における遺伝子治療の経路を認識するだろう。
好ましい実施形態において、遺伝子組成物は、硝子体内に注射される。硝子体内投与は、遺伝子組成物を眼の硝子体区画、即ち、網膜に直ぐ近接する眼の後部を構成する液体に直接送達する。特定の実施形態において、注射の間硝子体は、薬物のための空間を作るために除去される。
注射の場合、27~32ゲージの注射針サイズを使用することができる。好ましい実施形態において、注射針サイズは、30ゲージである。注射針注射は、眼に薬剤を注射するための普及している技術であり、全く危険性はない。注射は、深部又は表面であり得る。注射は、垂直(即ち眼の表面に対して90°で)、斜め(45~60°)又はダブルペイン(double-pane)(斜めに、外へ垂直に)とすることができる。
本発明は、遺伝子組成物を使用して、RGCにおいてNAD+を上昇させる遺伝子治療を提供する。眼は、サイズが小さく(即ち、トランスフェクトする細胞が少ない)、容易に接近でき、部分的に/ほとんど免疫特権化されており(即ち、免疫応答を引き起こす可能性が低い/ほとんどない)、他眼が対側性対照及び予備として役立つので、遺伝子治療を利用するには理想的な器官である。
特定の実施形態において、本発明は、それを必要とするヒトに神経細胞(例えば、RGC)におけるNAD+細胞内レベルを増強させる化合物及び更なる治療的薬剤を投与することによる神経変性の併用療法処置の方法を提供する。
(A)ヒトにおける神経変性を模倣するマウスモデルの選択
DBA/2J D2(D2)マウスモデルを選択してヒトにおける神経変性の病因を調べた。D2マウスは、緑内障の広く使用されているモデルであり、ヒト緑内障の顕著な特徴を概括する。D2マウスにおいて、2つの遺伝子(GpnmbR250X、Tyrp1b)の変異対立遺伝子は、進行性虹彩疾患の原因になる。この虹彩疾患には、2つの主要な要素:虹彩間質性萎縮(ヒトの本態性虹彩萎縮に非常に似ている)及び虹彩色素脱出表現型(ヒトの色素脱出症候群に非常に似ている)がある。本態性虹彩萎縮及び色素脱出症候群は、ヒトにおいてIOP上昇及び緑内障を誘導する。D2眼における虹彩疾患は、8~9ヵ月齢までの大多数の眼に老人性の眼内圧(IOP)上昇をもたらす。視神経変性は、12ヵ月齢までにほぼ完了する(一般に、70%超の神経が、重度の損傷を有する)。
(i)4ヵ月齢D2マウスが、正常眼内圧(IOP)(即ち、10~13mmHg)であり、緑内障を呈しないことを検証した(即ち、これらのマウスは、IOP及び前緑内障の発症前の月齢である;検出可能な神経変性はない)。この月齢において、D2マウスは、対照マウスと区別がつかない。
(i)4ヵ月齢DBA/2J D2マウス、(ii)9ヵ月齢DBA/2J D2マウス、及び(iii)月齢、性別及び系統が同じD2-Gpnmb+野生型対照から得た眼から網膜を採取した。
緑内障をもたらす感受性遺伝子/経路を同定するために、(B)において上で得られたRGCのRNAからRNA-配列決定(RNA-seq)を実施して、神経変性に先行するRGC内の非常に初期の分子変化を説明した。増幅させたdscDNAライブラリ(二本鎖コピーDNA)をRNAから生成し、サンプル当たり35000000個のリード深度で読んだ。データ分析を、偽発見率q<0.05の(FDR、q)で実施した。全ての群のサンプル(B)は、成功裏に増幅され、配列決定された。
本研究において、サンプル当たり35000000個のリード深度で、単離されたRGC由来のRNAを配列決定した。教師なし階層的クラスタリング(HC)を使用して、疾患の初期段階にあり、同月齢のD2-Gpnmb+又は若齢対照と形態学的に区別がつかないサンプル間で分子的に決定される緑内障の段階を定義した。
表3は、IPA分析に基づく最も濃縮された10個の経路を挙げる。2016年7月25日に出願されたU.S.S.N.62/366,211の図1は、D2マウスとD2-Gpnmb+対照の間の濃縮された上位の経路の予備分析の結果を提供する(その開示を、参照により組み込む)。
本研究において、これらマウスの網膜に対して電子顕微鏡検査(EM)を実施することによって形態学的な交替を評価した。EMは、細胞内オルガネラ(ミトコンドリアなど)の形態を研究するのに利用可能な最大の分解能を現在与える。EMにより、D2 RGCの樹状突起においてミトコンドリアクリステ容積が減少した機能不全のミトコンドリアが明らかになったが、対照RGCにはなかった(図4A及び図4B)。これらのミトコンドリアEM所見は、9ヵ月齢D2網膜におけるシナプス喪失、パターン網膜電図振幅(PERG、ヒト患者及び動物両方におけるRGC活性の高感度の評価基準)の初期の減少(図14)、及び網膜チトクロムcレベルの増加(図3G)と一致する。
疾患の前及び最初期段階(即ち、4ヵ月[前緑内障]、どんな神経変性もなしに高IOPが存在する場合には9ヵ月齢、及び大多数の眼において神経変性が存在する/重度である場合12ヵ月)の間に、ミトコンドリア機能不全/エネルギー危機が、(対照D2-Gpnmb+マウスと比較して)D2マウスに存在するかどうか決定するために、神経網膜の代謝プロファイリングを実施した。
[実施例3]NAMは、軸索切断培養において神経細胞喪失を保護する
この一連の研究において、NADレベルを増加させることにより、侵襲された眼を神経変性変化から保護できるかどうか調べた。軸索切断(即ち軸索を分断すること)は、いくつかの緑内障に見られる急性の重度の侵襲を模倣し、これらのより重度の侵襲を試験するための重要なモデルである。
ミトコンドリアで作用がある多量の薬物を、軸索切断培養において試験して、D2マウスにおいて観察されるミトコンドリア機能不全/エネルギー危機を潜在的にアンタゴナイズする候補薬物を同定した。スクリーニングにより、ニコチンアミド(NAM)が、核リモデリングプレアポトーシスの顕著な特徴である核収縮に対して最も強力な保護を与えると同定された。図22A及び図22B。
[実施例4]NAMは、D2マウスにおいて緑内障を軽減する
D2マウスの大きなコホートを使用してin vivo実験を行った。
実験的なD2マウスを以下の群に分割し、与えた:
W=水(標準マウス水)
NAM又はNAMLo=飲料水中の550mg/kg/日のNAM
初期=初期開始==プレ緑内障=6ヵ月齢(即ち予防的)
後期=後期開始=緑内障中=9ヵ月齢(マウスがすでに高IOPである場合、即ち介入的、ヒト緑内障により関係する)
NADレベルは、D2マウスにニコチンアミド(NAM;NADの前駆体)を投与することによって増加した(図5A、図11~図14、図20A及び図20Bを参照のこと)。マウスを、12ヵ月目に視神経損傷、神経細胞体喪失、視覚機能及び軸索輸送について次いで評価した。
ニューロン脆弱性仮説を支持することには、NAMは、IOPを改変しなかった(図10A~図10D)が、緑内障から強力に保護し、即ち、NAMは神経保護的薬剤である。重要なことに、NAMは、予防的(6ヵ月目に開始する、初期開始;コロニー内の大多数の眼においてIOP上昇の前)及び介入として(9ヵ月目に開始する、後期開始;大多数の眼が継続的なIOP上昇を有した場合)両方で保護的であった。これは、NAMが、ニューロン傷害が起こること及びニューロン傷害を、すでに侵襲されたニューロンに制限することの両方から予防できることを意味する(図11A及び図11B)。これは、疾患が症状を示す、従って検出可能になったときだけ処置が開始されることになるヒト疾患で重要である。
NAMは有意に、視神経変性の発病率を減少させ(図11A及び図12A)、RGC神経細胞体喪失及び網膜薄層化を予防し(通常の方法 、例えばOCT、眼底検査によってヒトクリニックにおいて検出可能)(図12A及び図13A)、順行性軸索輸送(Ct-β追跡によって評価され;軸索機能不全及び変性の重要な初期マーカー)(図12A)及びパターン網膜電図によって評価される視覚機能(PERG)(図14及び図15)を回復した。PERGは、非常に高感度であり、ヒト及び動物モデル両方において緑内障の視覚機能不全の初期の評価基準であることが示され(Salehら、Invest Ophthalmol Vis Sci 48、4564~4572頁、2007年);従って、NAMは緑内障の最初期の徴候を予防する。
NAM投与はまた、このモデルにおいて起こる初期のシナプス喪失(SNAP-25免疫染色)から保護し(図16A及び図16B)、EMによって評価される異常なクリステを持つ機能不全ミトコンドリアの形成を阻害するのに充分であった(図17A及び図17B)。
(D)NAMはPARP活性化を低下させ、緑内障の分子徴候を予防する
NAMは、乱れが少ない細胞代謝を反映するPARP活性化、限られたレベルのDNA損傷及びHIF-1αの転写誘導も低下させる(図9A、図9B、図19A及び図19B)。NAMは、上流のエフェクターを修正すること、即ちミトコンドリア内の代謝物質除去及び酸化還元緩衝作用によってこれらの損傷機序をおそらく予防する。
NAMは、RGC内の老人性遺伝子発現変化の大多数も予防した(n=DE遺伝子数;4ヵ月のD2-Gpnmb+対9ヵ月のD2-Gpnmb+=4699、9ヵ月のD2-Gpnmb+対NAM=4437、4ヵ月のD2-Gpnmb+対NAM=83)。分子保護のこの驚くべき程度は、高IOPの眼における代謝の混乱及び緑内障の確率を低下させる際のNAMの予想外の効力を強調する。年齢は、緑内障の病因における主要な危険因子であり、老人性変化に損傷を与えることを阻害することは、ヒト緑内障及び徐々に変性する他の神経変性疾患の多くの例において神経変性を予防する潜在性を有する。
NAMは、高用量でも安全に寛容されると考えられる。いくつかの研究は、ヒトにおいて1日当たり4g超のNAMの用量で肝毒性の発病率を示唆した。しかしながら、これらは古くなった調製品の不純物に起因した。高用量のニコチンアミド又はナイアシンに対する患者6000名の最近の調査において、黄疸の事例が3つしか報告されていない。これらの1例において(6g/日ナイアシン)黄疸は、異なるが、同時に投与された薬物(ナイアシンではない)を止めた後に消散し、もう一方において黄疸は継続的なナイアシン処置でも消散した。高用量のニコチンアミドについて、異常肝臓酵素試験は、肝臓細胞損傷を示さないが、むしろ肝臓酵素発現の変化を示し、薬物を中止するとそれは急速に元に戻ることを示唆した。肝臓毒性の希な事例は、個々の遺伝的感受性又は他の個々の因子を反映する場合がある。非常に高い用量の長期の効果は、更なる評価を必要とするが、経験は、長期のニコチンアミド処置の利益に対する危険性の比が非常に有利になることを示唆する。
緑内障は、複数の侵襲に関係する複合疾患である。それには、RGC区画(例えば、神経細胞体、軸索、樹状突起)が異なる影響を受け得る幅広い発病因子がある。機械的軸索損傷及び局所炎症は、緑内障の間のRGC変性の2つの重要な要因を示す。
本研究において、Nmnat1、NAD+産生において鍵となる酵素、の過剰発現(図25)が、NAD+産生細胞機構を支持することを実証する。
本研究において、実施例4及び実施例7に詳述される実験を組み合わせることによって、Nmnat1及びNAM(NAMLo)の組み合わせの治療による効果を調べた。簡潔には、マウスは、上記の通り遺伝子治療を受け、1週間のウイルス排出期間後に、マウスを通常のコロニーに戻し、正常飲料水中のNAM 550mg/kg/日を投与した。
[実施例9]WldSは、D2マウスにおいて緑内障を軽減する
ワーラー変性が遅い対立遺伝子(WldS)は、D2緑内障において部分的な保護を示した。WLDSタンパク質は、修飾されたNMNAT1タンパク質(NMNをNADに変換する酵素)である。変異体タンパク質WLDSを含有する細胞は、酵素活性の増加を示し、より速く又はより効率的にNMNをNADに変換する。
NADt(NAD+/NADH)レベルは、老化及び神経変性疾患において変化すると考えられる。本明細書において得られるデータは、NAM、NAM誘導体及び/又はNMNAT酵素の投与/補充が、老化及び疾患表現型の大きな範囲で保護的になり得ることを実証する。
この実施例は、ニコチンアミド(ビタミンB3)及び/又はピルビン酸(グルコースの単純な代謝物質)との組み合わせが、DBA/2Jマウスを視力喪失、軸索輸送の喪失、網膜及び視神経損傷から強力に保護することを実証する。遺伝子発現実験は、ニコチンアミドで処置したマウスが、同年齢の非緑内障のマウスよりも若齢対照マウスに対して分子的により近く一致していることを実証する。データは、ニコチンアミドが、年齢依存的な機序によってある程度働いており、緑内障に対する感受性の年齢依存的増加を遅延させ得ることを示唆する。NAMが提供する保護の規模は、完全に予想外であり、驚く程である。
[実施例11]PQQは、核直径収縮及び細胞密度の低下を予防する
更なる神経保護的薬剤を試験して、神経変性疾患におけるそれらの役割も決定した。
N-アセチルシステイン(N-アセチル-L-システイン又はNAC)は、L-システインの前駆体、グルタチオンの前駆体、強い生物学的酸化防止剤及びニューロンにおける主要な酸化還元緩衝剤である。図5Bのデータは、網膜中のグルタチオンレベルが、年齢に伴って低下することを示す。
材料及び方法
1.マウス系統、育種及び管理
マウスを、これまでに報告されているように、飼料及び水を不断給餌で14時間明/10時間暗周期で飼育した(Howellら、Journal of Clinical Investigation 121、1429~1444頁、2011年)。全ての育種及び実験手順は、Use of Animals in Ophthalmic ResearchのためのAssociation for research for Vision and Ophthalmology Statementに従って行われた。ジャクソン研究所の機関内安全委員会及び動物実験委員会が、本研究を承認した。
細胞採集の前に、全ての表面及び容積を、70%エタノール及びRNaseZap(ThermoFisher Scientific)溶液、続けてdH2Oで清浄にした。マウスを安楽死させ、眼を摘出し、氷冷HBSSに直ちに入れた。網膜を、眼から氷上のHBSS中に解剖し(4又は9ヵ月齢、PPD染色によって軸索変性がないことを確認した、データ不掲載)、特別注文のHBSS(Gibco)、ディスパーゼ(5U/mL)(Stemcell Technologies)、DNase I(2000U/mL)(Worthington Biochemical)及びSUPERase(1U/μL)(ThermoFisher Scientific)溶液100μL中に直接置いた。全ての網膜は、PPD染色及び分析によって緑内障の軸索変性がない眼に由来した(下記の視神経判定を参照のこと)。網膜を、37℃で20分間インキュベートし、Eppendorf Thermomixer R中で350RPMで振盪し、その後200μLピペットを使用して穏やかに粉砕した。サンプルを、HBSS中の2%BSA、SUPERase(1U/μL)でブロッキングし、Cd11b、Cd11c、Cd34、Cd45.2、GFAP、Thy1.2並びにDAPIに対するコンジュゲート抗体で染色した。このカクテルにより、FACSの間に他の網膜細胞型を正確に除去できた。
FACソートされたRGCサンプルを氷上で解凍し、RLT緩衝液中で注射器でホモジナイズした(総容積300μL)。トータルRNAを、製造業者の手順に従ってRNeasyマイクロキット(Qiagen)を使用して、任意でDNase処理工程を含めて単離し、品質をAgilent 2100 Bioanalyzerを使用して評価した。濃度を、Ribogreen Assay(Invitrogen)を使用して決定した。増幅したdscDNAライブラリを、Nugen Ovation RNA-seq System Vを使用して作製した。SPIA dscDNAを、Diogenode Disruptorを使用して長さ300bpに剪断した。品質管理を、Agilent 2100 Bioanalyzer及びDNA 1000チップアッセイを使用して実施した。
サンプルを、特別注文の品質管理Python Scriptによって品質管理分析に供した。塩基の70%が塩基クオリティスコア≧30を有するリードを、更なる分析のために保持した。リード整列化を、TopHat v2.0.7(Kimら、Genome Biol 14、R36頁、2013年)を使用して実施し、発現評価を、DBA/2Jマウスゲノム(build-mm10)に対して与えられた注釈及び初期設定パラメータを用いてHTSeq(Andersら、Bioinformatics 31、166~169頁、2015年)を使用して実施した。Bamtools v 1.0.2(Barnettら、Bioinformatics 27、1691~1692頁、2011年を使用して、マッピング統計を算出した。
GSH/GSSG及びNAD+/NADH定量化のために、網膜を分離し(上記のように)、化合物を製造業者の指示に従って測定した(GSH/GSSG、Cayman Chemical;NAD+/NADH、Biovision)。結果を、キットの標準を使用することによって生成した標準曲線により算出した。各サンプルに対する最終的な代謝物質濃度を、ブラッドフォードアッセイによって測定した総タンパク質濃度に対して標準化した。
マウスを安楽死させ、眼を摘出し、氷冷HBSSに直ちに入れた。網膜を、眼から氷上のHBSS中に解剖し、神経節細胞層を上にして細胞カルチャーインサート(Millipore)上に平らに載せ、Neurobasal-A、1%ペニシリンストレプトマイシン(10000U/mL)、1%グルタミン(100×)、1% N-2(100×)及び1% B-27(50×)(全てThermoFisher Scientific)を含有する組織培養培地中に浸漬した。
遅延性網膜神経節細胞変性を誘導するために、可溶性マウスTNFα(1ng/μL)を、前述の通り硝子体内に(intravitrally)注射した(Nakazawaら、J Neurosci 26、12633~12641頁、2006年)。10週齢のB6マウスを、TNFα注射の前に2週間NAMで前処置し、PERGを、8、10及び12週齢で実施した。12週目にマウスを屠殺し、RGC計数を実施した。
D2マウスにおけるIOP上昇は、色素分散虹彩疾患の後に続く。全ての実験において、変異体又は薬物処置マウスにおける虹彩疾患及び眼内圧の進行を、前述のとおり対照D2マウスと比較した(Johnら、Invest Ophthalmol Vis Sci 39、951~962頁、1998年)。各実験において、虹彩疾患及び眼内圧を評価した。
眼内圧を、8.5~9ヵ月で開始して実験完了まで45日間隔で測定した。
9.パターン網膜電図(PERG)
これまでに報告されているように、PERGを、鼻口部から皮下記録した。簡潔には:LEDパネルで生成されるパターン刺激(格子0.05周期/度、コントラスト100%)を、およそ1Hzわずかに異なる周波数で別々に各眼に見せた。波形を、非同期加算平均方法を使用して読み取った(Chouら、Invest Ophthalmol Vis Sci 55、2469~2475頁、2014年)。
視神経の加工及びパラフェニレンジアミン(PPD)による染色は、公開されている(Smithら、Systematic evaluation of the mouse eye.、Anatomy、pathology and biomethods.CRC Press、Boca Raton、2002年)。PPDは、全ての軸索のミエリン鞘を染色するが、損傷を受けた軸索だけの軸索原形質を暗く染色する。視神経損傷の非常に高感度の評価基準を提供することが、確立されている(Smithら、Systematic evaluation of the mouse eye.、Anatomy、pathology and biomethods.CRC Press、Boca Raton、2002年)。
(1)損傷なし又は初期の損傷(NOE)-5%未満の軸索が損傷を受けている及びグリオーシスでない。このレベルの損傷は、同じ年齢及び性別の非緑内障のマウスに見られ、緑内障によるものではない。これらの眼のいずれも緑内障の神経損傷を呈しないが、これらの眼のいくつかは、神経変性に先行する初期の分子変化を有するので、この損傷レベルは、緑内障でない又は初期の緑内障と呼ばれる。これらの分子変化は、遺伝子発現研究によって検出することができる(Howellら、Journal of Clinical Investigation 121、1429~1444頁、2011年)。本明細書において代謝的、ミトコンドリア、遺伝子発現変化について論ずる場合、これらの初期の分子変化があるが、変性がない眼を、初期の緑内障であると見なす。
(3)重度(SEV)→50%の軸索喪失及び顕著なグリオーシスがある損傷。
11.順行性軸索輸送
マウスを、ケタミン/キシラジンを使用して麻酔し、AF488又はAF594コレラ毒素サブユニットB(PBS中に1mg/mL)(ThermoFisher Scientific)2μLで硝子体内に注射した。72時間後、マウスを麻酔し、4%PFA心灌流によって安楽死させた。脳及び眼を、4%PFA中で更に24時間後固定し、PBS中の30%ショ糖で終夜(ON)凍結防止し、OCT凍結包埋(cryoembedded)し、20μmで切片化した。AF488を、Zeiss AxioObserver又はZeiss AxioImagerを使用して可視化した。
免疫蛍光染色の場合、マウスを、頚椎脱臼によって安楽死させ、その眼を摘出し、4%PFA中にON置いた。網膜を解剖し、スライド上へ平らに載せ、0.1% Triton-Xで15分間透過処理し、PBS中の2% BSAでブロッキングし、一次抗体中でRTでON染色した(抗体のリストについては下記参照)。
マウスを、頚椎脱臼によって安楽死させ、眼を摘出し、氷冷HBSSに直ちに入れた。網膜を、眼からHBSS中に解剖し、RIPA緩衝液に直接入れ、ホモジナイズした。タンパク質抽出物を、成型ゲル(Bio-Rad)でSDS-PAGEによって分離し、iBlot 2(ThermoFisher Scientific)を使用してPVDF膜へ移した。膜を、0.1%PBS-Tween中の5%ミルク又は5% BSA中でブロッキングし、抗体インキュベーションを、ブロッキング溶液中で実施した。抗体染色を、ECLを使用して検出した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイによって評価し、デンシトメトリーを使用してハウスキーピングタンパク質に対して標準化した。
マウスを安楽死させ、眼を摘出し、次いでSmith-Rudt(0.1Mリン酸緩衝液中の0.8%PFA及び1.2%グルタルアルデヒド(gluteraldehyde))中でON固定した。角膜及びレンズを、解剖し、残りの後部アイカップ(eye-cup)(網膜及びONHを含有する)を、2%水性四酸化オスミウムで後固定し、エチルアルコールで脱水した。サンプルを、次いで浸潤させ、Embed 812/Araldite樹脂(Electron Microscopy Sciences)に平らに載せ、正面切片にさせた。ブロックを、60℃で48時間重合させ、90nmミクロトーム切片を、300メッシュ銅グリッド上に切断(Leica UC6、Leica)した。グリッドを、1%水性の酢酸ウラニル/レイノルドのクエン酸鉛で染色し、JEOL JEM 1230 TEMで視た。画像を、AMT 2Kカメラで採取した。
ウイルスで送達される遺伝子治療の場合、マウスを麻酔し(上記の通り)、GFPレポータと共にCMVプロモーター下にあるAAV2.2マウスNmnat1 1.5μL(3.1×1010gc/mL)で硝子体内に注射した(主文においてNmnat1と称する;Vector Biolabs#ADV-265880)。マウスを、BSL2研究室において5.5ヵ月齢で注射し、2週間後に通常のマウスコロニーへ移動させた。
16.抗体
上の実施例で使用した抗体を、以下に記載する。IF:免疫蛍光。Wb:ウェスタンブロット
サンプルサイズ(眼の数、n)を、各図の凡例に示す。グラフ化及び統計分析を、Rで実施した。スチューデントt検定を、定量的プロットにおけるペアワイズ分析に使用し、エラーバーは、特に明記しない限り平均値の標準誤差のことを指す。
Claims (32)
- 対象において網膜神経節細胞の軸索変性を減少させて、該対象において緑内障を処置するための医薬組成物であって、該対象において網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させて緑内障を処置するために有効な量でニコチンアミド(NAM)を含有する、前記医薬組成物。
- ピルビン酸を更に含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が、ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)、ピロロキノリンキノン(PQQ)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)及びニコチンアミドリボース(NR)からなる群から選択される1つ又はそれ以上の化合物を更に含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- NAM及びピルビン酸が、網膜神経節細胞の軸索変性を減少させるための治療有効量で存在する、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記対象がヒト対象である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させること、そして緑内障を処置することが、遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、該遺伝子組成物が、NMNAT1をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスベクター内にある、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、AAVベクターである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、AAV2.2である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記遺伝子組成物が、硝子体内又は眼内に投与される、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記遺伝子組成物が、硝子体内に投与される、請求項6に記載の医薬組成物。
- 網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させること、そして緑内障を処置することが、遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、該遺伝子組成物が、NMNAT1をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- 網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させること、そして緑内障を処置することが、対象に追加の治療的薬剤を投与する工程を更に含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記追加の治療的薬剤が、β受容体遮断薬、非選択的アドレナリン作動薬、選択的α-2アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、プロスタグランジン類似体、副交感神経刺激様アゴニスト、カルバコール又はそれらの組合せである、請求項15に記載の医薬組成物。
- 前記追加の治療的薬剤が、チモロール、レボブノロール、メチプラノロールカルテオロール、ベタキソロール、エピネフリン、アプラクロニジン、ブリモニジン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾールアミド、ラタノプロスト、トラボプロスト、ビマトプロスト、ピロカルピン、ヨウ化エコチオフェート、カルバコール又はそれらの組合せである請求項15に記載の医薬組成物。
- 対象において緑内障を予防するための医薬組成物であって、該対象において網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させて該対象において緑内障を予防するために有効な量でニコチンアミド(NAM)を含有する、前記医薬組成物。
- 医薬組成物がピルビン酸を更に含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が、ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)、ピロロキノリンキノン(PQQ)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)及びニコチンアミドリボース(NR)からなる群から選択される1つ又はそれ以上の化合物を更に含む、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記対象がヒト対象である、請求項18に記載の医薬組成物。
- 網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させること、そして緑内障を予防することが、遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、該遺伝子組成物が、NMNAT1をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記ポリヌクレオチドがウイルスベクター内にある、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである、請求項23に記載の医薬組成物。
- 前記遺伝子組成物が、硝子体内又は眼内に投与される、請求項22に記載の医薬組成物。
- 前記遺伝子組成物が、硝子体内に投与される、請求項22に記載の医薬組成物。
- 網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させること、そして緑内障を予防することが、遺伝子組成物を投与する工程を更に含み、該遺伝子組成物が、NMNAT1をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項19に記載の医薬組成物。
- 網膜神経節細胞中で軸索変性を減少させること、そして緑内障を予防することが、対象に追加の治療的薬剤を投与することを更に含む、請求項18から27のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記追加の治療的薬剤が、β受容体遮断薬、非選択的アドレナリン作動薬、選択的α-2アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害薬、プロスタグランジン類似体、副交感神経刺激様アゴニスト、カルバコール又はそれらの組合せである、請求項28に記載の医薬組成物。
- 前記追加の治療的薬剤が、チモロール、レボブノロール、メチプラノロールカルテオロール、ベタキソロール、エピネフリン、アプラクロニジン、ブリモニジン、アセタゾラミド、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾールアミド、ラタノプロスト、トラボプロスト、ビマトプロスト、ピロカルピン、ヨウ化エコチオフェート、カルバコール又はそれらの組合せである、請求項28に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が経口投与される、請求項1、2、18、および19のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項1、2、18、および19のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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