KR20180066229A - 안구 신경변성 장애(예, 녹내장)의 치료 및 예방에 사용되는 니코틴아미드 - Google Patents

안구 신경변성 장애(예, 녹내장)의 치료 및 예방에 사용되는 니코틴아미드 Download PDF

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사이먼 더블유. 엠. 존
피터 알렉산더 윌리엄스
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더 잭슨 래보라토리
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Abstract

본 발명은 신경변성 장애의 치료에서 니코틴아미드(NAM) 및/또는 피루베이트를 신경보호 약물로서 포함하는 약학적 조성물, 또는 신경변성 장애, 특히, 녹내장을 포함하는 안구-관련 신경변성 질환에서 신경 조직의 축삭 변성의 치료에서의 유전자 요법의 이용에 관한 것이다.

Description

안구 신경변성 장애(예, 녹내장)의 치료 및 예방에 사용되는 니코틴아미드
연방 후원 연구에 관한 진술(STATEMENT REGARDING FEDERALLY SPONSORED RESEARCH)
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institute of Health, NIH)이 지원한 허가번호 제 R01 EY011721호에 따라 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 이 발명에 소정의 권리를 가진다.
관련 출원의 참조(REFERENCE TO RELATED APPLICATION)
본 출원은 2015년 10월 23일에 제출된 미국 예비 출원 번호 제 62/245,467호 및 2016년 7월 25일에 제출된 미국 예비 출원 번호 제 62/366,211호에 대하여 35 U.S.C.§119(e)의 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 내용은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 삽입된다.
축삭 손상은 신경변성 질환의 초기에 발생한다. 신경변성 질환은 말단 또는 중추 신경계로부터 생존 신경세포의 기능장애 또는 손실을 특징으로 한다. 많은 경우, 축삭 변성은 신경 손상에 선행하는 것으로 나타나는데, 신경 손상은 축삭 돌기의 가까이에 있는 말단 보다는 멀리 있는 말단에서 필연적으로 더욱 분명해진다. 신경세포에서 신경변성 캐스케이드(cascases)를 일으키는 업스트림 분자 신호는 아직 밝혀지지 않았다.
축삭 변성을 줄이기 위해 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 이와 관련된 화합물을 사용할 것을 시사하는 보고들이 있다. 예를 들어, US 2006-0211744 A1('744 출원)은 만성 신경변성을 감소시키기 위해, NAD, NADH, 및 니코틴아미드(NAM)를 포함하는 약제의 사용을 기술하고 있다. '744 출원은 NAD가 축삭 변성에 대하여 신경세포들을 보호하는 효과를 제공하고 있음을 가로절단 후근 신경절(DRG)의 세포 배양 모델을 이용하여 개시하고 있다. 또한 '744 출원은 NAM이 실험적 자가면역 뇌수막염(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 및 재발 경감 다발성 경화증(Relapsing Remitting Multiple Sclerosis, RRMS)의 마우스 모델에서 신경변성을 감소시킨다는 것을 개시하고 있다. 미국 특허 제 7,776,326 호('326 특허)는 손상된 신경에서 NAD 활성을 증가시키는 제제를 투여함으로써 포유동물의 신경병증 질환에서 축삭 변성을 치료하는 방법을 개시하고 있다. '326 특허권자는 니코틴산과 NAM이 축삭 변성을 감소시키지 않는다는 것을, 세포체에 가까운 위치에 있는(척수 신경으로부터) 가로절단 후근 신경절 및 측삭 절단(기계적 절단)을 이용하여 분명하게 결론을 내렸다. 안구 주사 연구에서, '326 특허권자는 NAM은, 유리체강내 주사시, 대조군 동물과 차이를 보이지 않는다고 다시 밝혔다.
녹내장은 가장 흔한 신경변성 질환 중 하나이며 비가역성 실명의 주요 원인인데, 전 세계적으로 7천만 명이 넘는 사람들, 특히 노인에게서 발생한다(Quigley 및 Broman, Br J Ophthalmol 90, 262-267, 2006). 녹내장은 진행성 기능장애와, 시력 상실에 이르는 망막 신경절 세포(retinal ganglion cells, RGCs)의 손실을 특징으로 하는 복합적 다요인성 질환이다. 높은 안압(intraocular pressure, IOP)과 연령 증가는 녹내장의 신경변성에 대한 감수성 요인이다. 최근의 연구는 질환의 초기 단계에 녹내장 조직에서 일어나는 다양한 분자 변화를 암시하고 있다(Howell et al., Journal of Clinical Investigation 121, 1429-1444, 2011; Nickells et al., Annu Rev Neurosci 35, 153-179, 2012). RGC 내에서 녹내장성 손상을 일으키는 초기 세포 및 분자 기전은 잘 알려져 있지 않다. RGC는 망막 내의 세포체, 수상돌기, 및 시냅스뿐만 아니라 시신경 내의 축삭에 영향을 주는 변화를 포함하여, 초기 녹내장에 여러 부위에서 손상을 받는 것으로 생각된다. 얼마나 높은 IOP와 노화가 신경세포의 취약성을 유발하고 인간의 녹내장을 유발하는지에 대한 기작은 여전히 불분명하다.
IOP 상승을 완화시킬 수 있는 이용 가능한 전략이 있지만, 안구 신경변성을 목표로 하는 효과적인 치료법이나 예방책은 없다. 따라서, 망막 및 축삭 변성에서 RGC 손상을 감소시키기 위한, 특히 녹내장의 치료에서 치료적 개입을 위하여, 계속적으로 초기 신경변성 과정을 촉발시키는 업스트림 분자 신호를 판독하고 새로운 분자 타겟을 정의할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 안구 신경변성 장애(예, 녹내장)의 치료 및 예방에 사용되는 니코틴아미드를 제공하는 것이다.
본 발명은 니코틴아미드(NAM) 또는 피루베이트, 또는 이들의 조합물이 신경 세포체, 축삭, 및 관련 세포 유형을 보호함으로서, 신경변성(예를 들어, 축삭 변성) 및 안구 신경변성 질환(예를 들어, 녹내장)의 치료에 유익하다는 본 출원자의 발견에 주로 근거한다.
본 발명의 목적은 치료적 유효량의 NAM 및/또는 피루베이트를 포함하는 약학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장의 치료 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 치료적 유효량의 NAM 및/또는 피루베이트를 포함하는 약학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 예컨대 녹내장에서의 안압 강하 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 치료적 유효량의 NAM 및/또는 피루베이트를 포함하는 약학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장이 있거나 앓고 있는 환자의 시각 기능 향상 방법을 제공하는 것이다.
본 요법 치료(약물 및/또는 유전자 요법)는, 특정 이론에 구애되지 않고, 다음 두 가지 주요 기작에 의해 안압을 낮추어 작용하는 것으로 믿어진다: 1) 수양액 생성 감소 및/또는 2) 수양액 유출 증가. 본 요법은 높은 안압을 낮추어, 시신경과 같은 축삭을 보존하고 이후의 시각 기능 상실을 예방함으로써 효과적인 치료법으로 기능할 수 있다.
본 요법 치료는 녹내장에서의 신경변성을 치료하고 예방하는데 유용하다.
본 녹내장 치료는 망막 수준(예를 들어, RGC)에서 신경 기능이상 및 신경변성을 치료 또는 예방하는데 효과적이다. 녹내장은 임의의 안압 수준(고 IOP 또는 정상 IOP)에서 존재할 수 있다. 본 요법 치료는 망막 신경절 세포(retinal ganglionic cells, RGC)와 같은, 망막 세포의 신경보호 효과에 대한 IOP-독립적인 효과를 제공한다.
소정 구체예에서, 본 치료는 안압을 감소시킴으로써 녹내장의 진행(예를 들어, 일차 개방각 녹내장 또는 POAG)을 방지 및/또는 지연시킨다. 녹내장 치료를 위한 거의 모든 현재의 전략은 IOP 상승을 낮추거나 방지하는 것을 목표로 한다.
소정 구체예에서, 본 치료는 직접 신경보호를 제공하는 동시에 안압을 감소시킴으로써 녹내장(예를 들어, 일차 개방각 녹내장 또는 POAG)의 진행을 방지 및/또는 지연시킨다. 본 요법은 녹내장의 치료에 예상치 못한 이중 잇점을 제공한다.
소정 구체예에서, 본 치료는 안압을 감소시키지 않고서 녹내장의 진행을 방지 및/또는 지연시킨다. 따라서, 본 요법 방법은 약물 및/또는 유전자 요법이 IOP-의존적 신경보호 효과를 제공한다는 예상치 못한 이점을 제공한다.
본 요법 방법은 시신경 변화와 시야 손실의 특징적인 패턴을 방지하여 일차 개방각 녹내장과 같은 녹내장을 치료한다. AAO의 바람직한 실용 패턴에 따르면, 일차 개방각 녹내장의 진단을 위해 세 가지 소견(IOP 상승, 시신경 손상, 또는 시야 손실) 중 두 개가 있어야 한다.
본 발명의 목적은 신경변성 장애(예를 들어, 녹내장과 같은, 안구 신경변성 질환)의 치료가 필요한 대상체의 신경 변성 장애의 치료 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 세포내 NADt 수준을 증가시키거나 세포내 NAD+, NADH, GSH, GSSG, PQQ, 또는 피루베이트 수준을 증가시키는 하나 이상의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
소정 구현예에서, 신경변성 장애(예를 들어, 녹내장과 같은 안구 신경변성 질환)는 축삭 변성, 신경 기능장애, 세포체 수축, 시냅스 상실, 수상 돌기 위축 및/또는 정상적인 신경 노화를 수반한다. 소정 구체예에서, 신경변성 장애(예를 들어, 녹내장과 같은 안구 신경변성 질환)는 축삭 변성을 수반한다.
소정 구체예에서, 신경변성 장애(예를 들어, 녹내장과 같은 안구 신경변성 질환)는 웰러 변성(Wallerian degeneration), 웰러-유사 변성(Wallerian-like degeneration), 또는 축삭 변성을 수반한다. 예를 들면, 웰러 변성은 신경 손상에 기인한다. 신경 손상은 질환, 외상, 화학 요법제, 또는 신경 세포 노화로 유발될 수 있다.
소정 구체예에서, 신경손상 질환은 알츠하이머 병, 다발성 경화증, 당뇨병성 신경병증, 외상성 뇌 손상, 허혈, 말초 신경병증, 또는 녹내장 또는 연령-관련 안구 질환(예를 들어, 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration, AMD), 레버 신경병증(Leber's optic neuropathy), 우성 시신경 위축, 백내장, 당뇨병성 안질/당뇨병성 망막병증, 망막 변성, 안구 건조증, 시력 저하)과 같은 안과 장애 중 하나 이상이다.
소정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 전구체(예: 니코틴산(Na), 니코틴아미드(NAM), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN), 니코틴아미드 리보시드(NR), 또는 이들의 조합)를 포함한다.
소정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 니코틴아미드, 피루베이트, 또는 피롤로퀴놀린 퀴논(pyrroloquinoline quinone, PQQ)을 포함한다. 본 발명의 화합물은 세포내 NAD+을 보충하거나 미토콘드리아 전자 전달계를 개선시키는 것으로 여겨진다.
소정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 다음을 포함한다:(a) NAM;(b) 피루베이트;(c) PQQ;(d) NAM 및 피루베이트;(d) NAM 및 PQQ.
본 발명의 목적은 신경변성 장애(예를 들어, 녹내장과 같은 안구 신경변성 질환)의 치료가 필요한 대상체의 신경변성 장애의 치료 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 대상체에 유전자 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 유전자 조성물은 Nmnat(예를 들어, Nmnat-1, Nmnat-2, 또는 Nmnat-3)의 발현을 증가시키는 유전자를 함유한다.
소정 구체예에서, 상기 유전자는 NMNAT1이다.
소정 구체예에서, 상기 유전자는 Wld S 이다.
소정 구체예에서, 상기 방법은 대상체의 안구에 Nmnat(예를 들어, Nmnat-1, Nmnat-2, 또는 Nmnat-3) 및/또는 Wld S 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함한다.
소정 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 대상체에 국부적으로 투여된다.
소정 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 대상체에 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터 등)로 투여된다.
소정 구체예에서, 신경변성 장애는 녹내장 또는 연령-관련 안구 질환이며, 상기 대상체는 인간이다.
본 발명의 목적은 신경변성 장애의 치료가 필요한 대상체의 신경변성 장애의 치료 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 세포내 NAD+ 수준을 증가시키는 하나 이상의 화합물을 치료적 유효량으로 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, Nampt, Nmnat(예를 들어, Nmnat-1), 및/또는 Wld S 를 코딩하고 발현하는 폴리뉴클레오티드를 상기 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 목적은 녹내장의 치료가 필요한 대상체의 녹내장 치료 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 치료적 유효량의 니코틴아미드(NAM)를 함유하는 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여, 녹내장을 치료하는 단계를 포함한다.
또한, 특징적인 본 발명의 목적은 녹내장의 예방이 필요한 대상체의 녹내장 예방 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 치료적 유효량의 니코틴아미드(NAM)를 함유하는 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여, 녹내장을 예방하는 단계를 포함한다.
소정 구체예에서, 상기 NAM은 망막 신경절 세포에서 신경변성을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재한다. 예를 들어, 소정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 일일 섭취를 위하여, 약 0.5 내지 10 그램의 NAM, 약 1 내지 5 그램의 NAM, 또는 약 2.5 그램의 NAM을 함유한다.
소정 구체예에서, 상기 NAM은 안압을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재한다. 예를 들어, 소정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 일일 섭취를 위하여 약 2 내지 25 그램의 NAM, 약 10 내지 20 그램의 NAM, 또는 약 10 그램의 NAM을 함유한다.
소정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 피루베이트를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 NAM 및 피루베이트는 망막 신경절 세포에서 신경변성을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재한다. 예를 들어, 소정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은(1) 일일 섭취를 위하여 약 0.5 내지 10 그램의 NAM, 약 1 내지 5 그램의 NAM, 또는 약 2.5 그램의 NAM; 및(2) 일일 섭취를 위하여 약 0.5 내지 10 그램의 피루베이트, 약 1 내지 5 그램의 피루베이트, 또는 약 2.5 그램의 피루베이트를 독립적으로 함유한다. 바람직하게는, 상기 NAM 및 피루베이트는 안압을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재한다. 예를 들어, 소정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은(1) 일일 섭취를 위하여 약 2 내지 25 그램의 NAM, 약 10 내지 20 그램의 NAM, 또는 약 10 그램의 NAM; 및(2) 약 2 내지 25 그램의 피루베이트, 약 10 내지 20 그램의 피루베이트, 또는 약 10 그램의 피루베이트를 독립적으로 함유한다.
소정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 니코틴아미드 모노뉴클레오타이드(NMN), 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 니코틴아미드 리보스(NR)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함한다. 소정 구체예에서, PQQ가 존재하는 경우, 상기 약학적 조성물은 일일 섭취를 위하여 약 10mg 내지 10g, 약 50mg 내지 1g, 또는 약 500mg의 PQQ를 포함한다.
소정 구체예에서, 본 방법(피루베이트가 있거나 없거나)은 NMNAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 소정 구체예에서, 폴리 뉴클레오티드는, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터, 또는 레트로 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에 있다.
소정 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 AAV이다. 소정 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 AAV2.2이다. 소정 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티 바이러스 벡터이다.
소정 구체예에서, 상기 유전자 조성물은 유리체내로 또는 안구내로 투여된다. 바람직하게는, 상기 유전자 조성물은 유리체내로 투여된다.
소정 구체예에서, 상기 대상체는 인간 대상체이다.
소정 구체예에서, 상기 대상체는 약 12 내지 21 mmHg의 안압을 갖는다. 소정 구체예에서, 상기 대상체는 21 mmHg 초과하는 안압을 갖는다.
소정 구체예에서, 상기 대상체는 녹내장의 신경변성 증상을 발생시키지 않는다. 소정 구체예에서, 상기 대상체는 녹내장의 신경변성 증상을 발생시킨다.
소정 구체예에서, 상기 대상체는 시각 기능장애를 발생시킨다.
소정 구체예에서, 상기 방법은 추가 치료제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 예시적인 추가 치료제는 안압 강하제를 포함한다. 소정 구체예에서, 상기 추가 치료제는 베타 차단제, 비선택적 아드레날린 작용제, 선택적 α-2 아드레날린 작용제, 탄산 탈수효소 저해제(carbonic anhydrase inhibitor), 프로스타글란딘 유사체, 부교감신경흥분 작용제, 카르바콜(carbachol) 또는 이들의 조합이다. 소정 구체예에서, 상기 추가 치료제는 티몰, 레보부놀롤, 메티프라놀롤 카테올롤, 베탁솔롤, 에피네페린, 아프라클로니딘, 브리모니딘, 아세타졸아미드, 도르졸아미드, 브린졸아미드, 라타노프로스트, 트라바프로스트, 비마타프로스트, 필로카르핀, 요오드화 에코디오페이트, 카바콜, 또는 이들의 조합을 포함한다.
또한 본 발명의 목적은 시각 기능의 개선을 필요로 하는 대상체의 시각 기능 개선 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 치료적 유효량의 니코틴아미드(NAM)를 함유하는 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 시각 기능을 개선시키는 단계를 포함한다.
소정 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 피루베이트를 추가로 포함한다.
소정 구체예에서, 상기 방법은 NMNAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 모든 구체예는 명시적으로 부인하지 않는 한 임의의 다른 구체예와 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명에 따르면 안구 신경변성 장애(예, 녹내장)의 치료 및 예방에 사용되는 니코틴아미드가 제공된다.
도 1은 질환의 초기 단계에서 DBA/2J(D2) 마우스의 분자적으로 결정된 녹내장 단계를 정의하고 연령-매칭된 D2-Gpnmb+ 또는 어린 대조군과 형태학적으로 구별할 수 없는 계층적 클러스터링(HC)의 결과를 도시한다. HC는 D2 마우스 및 대조군에서 분리된 망막 신경절 세포(RGC)에서의 RNA-시퀀싱에 기초하였다. HC는 분자적으로 유사한 대조군과 어린 샘플과 구별되는 그룹으로 RGC 샘플을 클러스터링하게 한다(Spearman 's rho). 원 = D2 RGC의 샘플, 삼각형 = D2-Gpnmb+ RGCS의 샘플. Inset: D2-Gpnmb+와 각 그룹 사이의 차등적으로 발현되는(DE) 유전자(q<0.05)의 수.
도 2A는 4개의 D2 마우스 그룹(그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 그룹 4) 및 D2-Gpnmb+ 대조군 중 차별적으로 발현된(DE) 유전자의 수를 보여준다.
도 2B는 모든 샘플의 히트맵(heatmap) 상관 관계를 보여준다(Spearman's rho, 파란색 = 가장 높은 상관, 붉은색 = 가장 낮은 상관). 도 1에서의 계통수는 회색으로 표시되어 있다.
도 3A는 대조군(9월령 생쥐)으로부터의 HC 거리가 증가함에 따라 미토콘드리아:핵 리드(read) 총 비율이 증가함을 보여 준다. 결과는 미토콘드리아 기능장애가 녹내장의 RGC 손상의 조기 원인이라는 개념과 일치한다.
도 3B는 질환 전의 D2 마우스(9월령 D2 마우스의 세 개의 클러스터 - 그룹 2, 그룹 3, 그룹 4)와 연령- 및 성-매칭된 야생형 대조군(D2-Gpnmb+)의 RGC로부터 수득된 RNA-seq 데이타를 이용하여, Ingenuity Pathway Analysis(IPA)에 기초한 몇 가지 상위의 크게 농축된 경로를 보여 준다. -log p 값이 클수록 더 크게 농축된다. 상위 3개 농축 경로 중 2개는 미토콘드리아 기능장애 및 산화적 인산화이다. 또한, 추가적으로 크게 농축된 경로에 대하여 표 3 참조. D2 그룹 1에는 차등적으로 발현되는 경로가 없음을 주의한다.
도 3C는 대조군으로부터 D2 그룹의 HC 거리가 증가함에 따라 핵이 코딩된 미토콘드리아 단백질에 대한 전사 발현이 주로 증가함을 보여준다(모두 9월령 마우스). 결과는 미토콘드리아 기능장애가 녹내장의 RGC 손상의 조기 원인이라는 개념과 다시 일치한다. 점들은 개별 유전자를 나타내며, 회색 또는 밝은 점 = 차등적으로 발현되지 않음, 빨간색 또는 어두운 점 = q<0.05에서 차등적으로 발현됨. 유전자는 마우스 MitoCarta2.0에서 채취하였다(Calvo et al., Nucleic Acids Res 44, D1251-1257, 2016).
도 3D는 RNA 시퀀싱이 녹내장에서의 미토콘드리아 분열 유전자 전사체를 조기에 확인한다는 것을 보여 준다(9월령 마우스). 결과는 미토콘드리아 기능장애가 녹내장의 RGC 손상의 조기 원인이라는 개념과 일치한다.
도 3E는 대조군과 비교하여 초기 미토콘드이라 언폴드(unfolded) 단백질 반응을 보여 준다. 보이는 데이터는 D2 그룹 4(9월령 마우스)에 대한 것이다. 결과는 미토콘드리아 기능장애가 녹내장의 RGC 손상의 조기 원인이라는 개념과 일치한다.
도 3F는 초기 녹내장(9월령 마우스)에서 대사적 및 산화적 현상을 나타내는 개별 유전자 발현 플롯의 결과를 나타낸다. 점들은 개별 유전자를 나타내며, 회색 또는 밝은 점 = 차등적으로 발현되지 않음, 빨간색 또는 어두운 점 = q<0.05에서 차등적으로 발현됨. 다시, 산화적 인산화 유전자는 최고 수준의 차등적 발현을 보이는 것들 중에 있으며, 차등 발현은 대조군과의 HC 거리가 증가하는 D2 그룹에서 계속해서 더 높게 나타나는 것처럼 보인다(그룹 4> 그룹 3 및 2).
도 3G 및 3H는 차등적으로 발현된 유전자(n = 4/연령 그룹)의 웨스턴 블랏 단백질 검증(각각 도 3I 및 3J)으로부터의 데이터를 요약하는 막대 그래프이다. RNA-시퀀싱에 의해 평가된 전사체 존재도(abundance)와 상관관계가 있는 시토크롬 c(도 3G) 및 eIF2α(도 3H) 모두에서 일반적인 단백질 증가가 있었다. 두 막대 그래프의 세로축은 β-액틴에 대한 상대 밀도이다. * = P<0.05, ** = P<0.01.2
도 3K는 산화적 인산화 유전자가 모든 그룹에 걸쳐서 차등적으로 발현되는 것을 보여 주는데, 대조군과의 HC 거리가 증가한 D2 그룹에서 점차적으로 더 높은 발현을 나타낸다(그룹 4> 그룹 3> 그룹 2> 그룹 1). 적색 = 최고 발현, 청색 = 최저 발현, IV = 미토콘드리아 착화합물 I-V(표 1에 표시), G = D2-Gpnmb+, 1-4 = D2 그룹 1-4.
도 4A 및 도 4B는 9월령 D2 마우스에서 RGC 세포체 및 수지상 미토콘드리아의 크리스타의 부피가 줄어든다는 것을 보여 준다. 그러나, 총 미토콘드리아 크기/부피에는 큰 차이가 없다. 스케일 바 = 350 nm. ** = P<0.01, * = P<0.001.
도 5A는 NAMLO 처리된(550 ㎎/㎏/일) D2 마우스(N = 22/그룹)에서 NAD(t) 수준이 증가되는 것을 보여준다. * = P<0.05, *** = P<0.001.
도 5B는 연령에 따라 GSH/GSSG 수준이 감소함을 보여 준다(n = 22/그룹). * = P<0.05, ** = P<0.001.
도 5C는 D2-Gpnmb+ 대조군 마우스(n = 22/그룹)의 나이에 따라 NAD(t) 수준이 또한 감소함을 보여 준다. *** = P <0.001.
도 5D는 피루베이트 처리에 의해 회복되는, 연령에 따른 피루베이트 수준의 감소를 보여준다. 6월령부터 D2 마우스를 생쥐는 정상 음용수 중 500 mg/kg/d 피루베이트로 처리하였다.
도 5E는 NAM 처리(550 ㎎/㎏/일) 또는 Wld S 의 대립 유전자의 첨가에 의해 회복되는, 연령에 따른 D2 망막 내의 총 NAD(NAD(t))(즉, NAD+ + NADH) 감소를 보여 준다. Wld S 와 NAM의 병용은 추가적인 장점을 제공한다.
도 6A 및 6B는 NAM 처리(550 mg/kg/일)가 면역염색에 의해 평가된 초기 녹내장에서 HIF-1α 상향조절을 감소 시킨다는 것을 보여준다(n = 6/그룹). * = P<0.05, *** = P<0.001. 이 결과는 NAM 치료가 D2 녹내장의 조기 손상 변화를 예방함을 입증한다.
도 7A는 RNA 시퀀싱이 D2 녹내장에서 세포 대사에 대한 변화, 특히 지방산 대사 유전자 변화를 확인함으로 보여 준다. 점들은 개별 유전자를 나타내며, 회색 또는 밝은 점 = 차등적으로 발현되지 않음, 빨간색 또는 어두운 점 = q<0.05에서 차등적으로 발현됨.
도 7B는 오일 레드 O를 사용하여 염색된, IOP-손상, 노화된 D2 눈 내의 안쪽-망막 세포외 지질 액적 형성을 보여준다. 무(NOE) 또는 중증(SEV) 시신경변성 둘 다를 보인 D2 눈에서 염색이 존재하였다. 외안구 지방은 양성 대조군으로 사용되었다(n = 6/그룹). 스케일 바 = 25 μm.
도 8A 및 8B는 γH2AX 염색에 의해 평가된 DNA 손상 수준의 증가를 보여준다(n = 6/그룹). 결과는 γH2AX 염색 최대 세기(AU)의 막대 그래프로서 표시된다. *** = P<0.001.
도 9A 및 9B는 녹내장에서 NAM이 PARP 활성화를 방지한다는 것을 보여준다. PARP는 NAD+의 주요 소비자이며, 연령에 따라 RGC의 NAD(t)의 감소에 기여할 수 있다. NAM(550 mg/kg/일) 투여 후, PARP 발현(pan-PARP 면역염색)은 NAM-처리된 망막에서 감소한다(n = 6/그룹). *** = P<0.001. 스케일 바 = 15 μm.
도 10A 및 10C(IOP 프로파일), 및 도 10B 및 10D(IOP 상승 홍채 질환의 임상 증상)는 보호 전략이 치료된 눈에서 임상 질환 진행/증상을 변화시키지 않는다는 것을 보여준다. 홍채 질환은 비슷한 속도로 진행되었고, 같은 기간 내에 모든 그룹에서 심각한 상태에 이르렀다. NAMLo = 550 mg/kg/일. NAMHi = 2000 mg/kg/일. Nmnat1 = 외인성 Nmnat1 발현에 의한 유전자 요법(바이러스 벡터에서).
도 11A는 NAM이 시신경변성을 방지한다는 것을 나타낸다. 바의 녹색 또는 하위 섹션 = 무- 또는 초기 녹내장(no or early glaucoma, NOE)(신경 손상이 없는 단계), 바의 노란색 또는 중간 섹션 = 중도의 손상(moderate damage, MOD), 바의 빨간색 또는 위쪽 섹션 = 심각한(severe, SEV) 손상. Fisher's exact test: ** = P<0.01, *** = P<0.001. NAMLo = 550 mg/kg/일. NAMHi = 2000 mg/kg/일. 초반 시작 = 치료가 6월령에서 시작된다(거의 모든 눈에서 IOP 상승 전). 후반 시작 - 치료가 9월령에서 시작된다(IOP 상승 시작 후; 대부분의 눈에서 IOP가 상승하거나 했던 시점).
도 11B는 12개월째에 D2 녹내장에서 니코틴아미드가 시신경변성을 방지하는 것을 보여준다. 차트는 녹내장이 발견되지 않는 신경(NOE; 바의 아래 부분), 중등도 녹내장성 손상(MOD; 바의 중간 부분), 또는 심각한 녹내장성 손상(바의 상단 부분)의 백분율을 보여준다. 좌측부터, DBA/2J 대조군 - 표준 음용수에서 D2 마우스; 니코틴아미드(NAMLo) 초반 시작 - 6월령(질환 전)부터 550 mg/kg/일 NAM을 보충한 표준 음용수에서 D2 마우스; 니코틴아미드(NAMLo) 후반 시작 - 9월령(질환 동안)부터 550 mg/kg/일 NAM을 보충한 표준 음용수에서 D2 마우스; 니코틴아미드(NAMHi) 초반 시작 - 6월령(질환 전)부터 2,000 mg/kg/일 NAM을 보충한 표준 음용수에서 D2 마우스; 피루베이트 - 6월령(IOP 상승 전)부터 500 mg/kg/일 피루베이트를 보충한 표준 음용수에서 D2 마우스; NAMLo + 피루베이트 - 6월령(질환 전)부터 500 mg/kg/일 NAM + 500 mg/kg/일 피루베이트를 보충한 표준 음용수에서 D2 마우스; D2.Wlds - 표준 음용수에서 Wld s 형질유전자(효소 활성을 증가시키도록 NMNAT 효소를 변형)을 지닌 D2 마우스; D2.Wld s + 니코틴아미드(NAMLo) - 6월령(IOP 상승 전)부터 500 mg/kg/일 NAM으로 보충한 표준 음용수에서 Wld s 형질유전자(NMNAT 효소를 변형)을 지닌 D2 마우스. 녹내장성 신경변성의 유리체내 치료에 더하여, NAM도 예방적으로 녹내장성 신경변성을 예방한다.
도 12A는 NAM 및 피루베이트가 RGC 세포체 손실(n = 8/그룹), 망막 NFL 및 IPL 박화(n =8/그룹), 시신경변성(n > 50/그룹), 및 선행 축삭원행질 수송(n = 20/그룹)을 방지하는 것을 보여준다. 해당 마커와 색상 키(color keys)는 각 컬럼 아래에 있다. 스케일 바: RBPMS = 20 μm, Nissl = 20 μm, PPD = 20 μm, CT-
Figure pct00001
= 100 μm(망막), 200 μm(LGN, Sup. Col.). ONH = 시신경 머리, LGN = 외측무릎핵(lateral geniculate nucleus), Sup. Col. = 상층 둔덕. 흰색 별표는 ONH 부위에서의 축삭 수송의 손실을 나타낸다.
도 12B는 NAM 및 피루베이트 처리된 D2 마우스에서의 축삭 수송의 회복을 보여준다. 축삭 수송의 손실은 녹내장에서 두드러진 특징이며 신경세포 건강의 척도로 이용될 수 있다. 형광 표지된 콜레라 독소(Ct-B; 녹색)를 이용하여, 망막 신경절 세포의 눈 부분에서부터 세포의 종점(뇌) 끝으로의 축삭 수송을 이용하여 시각화하였다. 상단줄: D2.Gpnmb (wt) 마우스는 망막에서 뇌의 시각 중심까지의 정상적이고 완전한 축삭 수송을 가진다(LGN; lateral geniculate nucleus(외측무릎핵), Sup. col.; superior colliculus(상층 둔덕)). 두 번째 줄: D2 마우스는 시신경 내에서 불완전한 축삭 수송 정지를 가진다(흰색 별표). 뇌의 시각 중심에는 라벨링이 없다. 세 번째와 네 번째 줄: NAM 처리(세 번째 줄) 또는 피루베이트 처리(네 번째 줄)는 축삭 수송 손실을 방지한다.
도 13A는 NAM가 RGC 세포체 손실을 방지하는 것을 보여준다(N = 8/그룹, D2와 D2-Gpnmb+ 사이의 밀도 저하는 압력 유도 스트레칭에 기인함). *** = P<0.001.
도 13B는 NAMLo(550 mg/kg/일)와 피루베이트(500 mg/kg/일)가 RGC 세포체 손실을 방지하는 것을 보여준다(RGC의 특정 마커를 이용; RBMPS).
도 14는 NAM(NAMLo 및 NAMHI), 피루베이트(500 ㎎/㎏/일), Wld S 및 이들의 조합 모두가 패턴 전위도(PERG)의 진폭을 이용하는 시각 기능 테스트에 기초하여 D2 마우스의 초기 시각 기능 상실을 예방하는 것을 보여준다(n>20/그룹). PERG는 매우 민감하고 조기에 녹내장을 측정하기 때문에 NAM 또는 피루베이트 치료는 녹내장 초기 단계조차도 예방한다. NAMLo+피루베이트의 조합과 NAMLO+Wld S의 조합 모두는 PERG 진폭의 추가적 회복을 보여준다. NAMLo = 550 mg/kg/일. NAMHi = 2,000 mg/kg/일.
도 15는 NAMLo(550 mg/kg/일) 및 피루베이트(500 mg/kg/일)가 노화된 마우스에서도 PERG를 예방한다는 보여준다. 6월령 및 12월령 D2 및 12월령 NAMLo 처리 마우스(550 mg/kg/일)의 예시적인 추적이 나타나 있다. 12월령 피루베이트-처리 마우스와 NAMLo 처리 Wld s 마우스에 대한 결과도 나타나있다.
도 16A 및 도 16B는 NAMLo 처리(550 mg/kg/일)가 SNAP-25 염색에 의해 평가 된 초기 녹내장에서 시냅스 손실을 방지한다는 것을 보여준다(n = 6/그룹). ** = P<0.01, *** = P<0.001. 스케일 바 = 25 μm.
도 17A 및 도 17B는 NAM(NAMLo = 550 mg/kg/일)이 도 4A 및 4B에 보인 바와 같이 수지상 미토콘드리아에서 초기 미토콘드리아 기능장애를 예방한다. 이들 데이터는 PERG의 초기 변화 및 9 개월째 D2 망막에서 이전에 보고된 시냅스 손실에 해당한다. 따라서, IOP 증가가 유도한 미토콘드리아 기능장애는 초기의 신경변성 변화를 유발할 수 있다. ** = P<0.01, *** = P<0.001. ns = 통계적으로 유의하지 않음. 바 스케일 = 350 nm.
도 18은 NAM 처리(550 mg/kg/일)가 내부 망막에서 지질 액적 형성을 방지한다는 것을 보여준다(12 개월; 도 7B에 보임). 스케일 바 = 25 μm.
도 19A 및 도 19B는 NAM 처리(NAMLo = 550 mg/kg/일)가 γH2AX 염색에 의해 평가된 바와 같이 초기 녹내장에서 DNA 손상을 방지한다는 것을 보여준다(n = 6/그룹). *** = P<0.001. 스케일 바 = 25 μm.
도 20A는 NAM-처리된 RGCS에서 대사 및 DNA 손상 경로가 정상으로 돌아가는 것을 보여주는 개별 유전자 발현 플롯을 나타낸다. 점들은 개별 유전자를 나타내며, 회색 또는 밝은 점 = 차등적으로 발현됨, 적색 또는 어두운 점 = D2-Gpnmb+ 대조군과 비교하여 q<0.05에서 차등적으로 발현됨.
도 20B는 NAM-처리된 RCG가 대조군과 분자적으로 유사하다는 것을 보여주는 유전자 발현(모두 발현된 유전자)의 히트맵이다.
도 21A는 NAM-처리된 RCG가 어린 및 연령-일치된 녹내장 대조군 RCG 모두에 분자적으로 유사하다는 것을 보여준다(Spearman's rho). 원 = D2 RGC의 샘플, 삼각형 = D2-Gpnmb+ RGC의 샘플, 사각형 = NAM-처리된 샘플(NAMLo = 550 mg/kg/일) RGC. 따라서 NAM 치료는 질환 및 연령-관련 분자 변화를 방지한다.
도 21B는 대조군 D2-Gpnmb+ 그룹과 비교하여 D2 그룹(그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 그룹 4) 중에서 차등적으로 발현된 유전자의 수를 요약한다.
도 21C 및 21F는 NAM-처리(NAMLo = 550 mg/kg/일)가 9월령 D2 RGC에서 보여지는 전사체 불균형과 OXPHOS 불균형(미토콘드리아:핵 라이브러리 크기 비)을 방지한다는 것을 보여준다. 도 21F에서, 빨간색 = 가장 높은 발현, 파란색 = 가장 낮은 표현. IV = 미토콘드리아 복합체 IV(표 1에 표시), G = D2-Gpnmb + , 1-4 = D2 그룹 1-4, N = NAM.
도 21D에서, D2 마우스를 6개월때부터 정상적인 음용수 중 550 mg/kg/일의 니코틴아미드로 처리하였다(노화된 NAM). NAM-처리 마우스로부터의 망막 신경절 세포의 RNA- seq는 NAM이 연령- 및 질환-관련 유전자 발현 변화를 예방한다는 것을 보여준다. NAM-처리 망막 신경절 세포는 연령-매칭된 대조군(노화 대조군)보다는 어린 대조군(어린 대조군)에 가장 유사하다. 이것은 NAM이 연령-종속 분자 변화를 방지한다는 것을 나타낸다.
도 21E는 모든 샘플의 히트 맵 상관 관계를 보여준다(Spearman's rho, 파란색 = 가장 높은 상관, 빨간색 = 가장 낮은 상관). 도 21A의 계통수는 회색으로 나타나있다.
도 22A 및 22B는 NAM이 녹내장성 손상을 모델링한 신경변성 치료에 대한 방어성이 있다는 것을 보여준다. NAM은 신경절 세포층 세포(GCL 세포)를 사멸(도 22A) 및 세포사멸 전 핵 수축(도 22B)으로부터 보호하는데 양호한 용량-반응 효과를 보여 주었다. 망막 신경절 세포 손상 의 축삭절단 배양 모델에서, 니코틴아미드(NAM)의 첨가는 세포 수축(세포 사멸 및 기능장애의 징후)을 용량 의존적으로(축삭 절단 후 5일) 보호한다. 5일 동안 상이한 농도의 NAM에 노출된, D2 마우스 망막으로부터의 DAPI-표지 핵의 평균 핵 직경을 측정하였다(0일 대조군(정상 망막), 무처리군(축삭절단 후 5일), 100 mM 및 500 mM NAM(축삭절단 후 5일)). NAM으로 처리한 망막은 손상되지 않은, 기준 대조군(0 일)과는 구별될 수 있다. β-NAD 및 β-NMN을 망막을 처리하는 데 있어서 상당한 보호효과를 가진다( n = 8 망막/그룹). *** = P<0.001. 스케일 바 = 20 μm.
도 23A 내지 23C는 TNFα 투여 후 12 주째에 TNFα 주입된 눈에서 NAM(NAMLo = 550 ㎎/㎏/일)은 PERG(도 23A) 및 세포체 손실(도 23B 및 23C)을 방지한다는 것을 보여준다(n = 20/그룹). * = P <0.05. ns = 통계적으로 유의하지 않음. 스케일 바 = 20 μm.
도 24A 및 24B는 유전자 요법이 녹내장성 신경변성을 견고하게 방지한다는 것을 보여준다. CMV 프로모터 하에서 뮤린 Nmnat1을 과발현하기 위한 플라스미드를 가진 AAV2.2 바이러스 벡터를 5.5 개월째에 D2 눈에 유리체내로 주사하였다. 도 24A는, 도 12A에 입증된 바와 같이, Nmnat1 과발현이 RGC 세포체 손실 및 선행 축삭원형질 수송을 방지한다는 것을 보여준다(n = 10/그룹). 스케일 바는 도 24A에서 50 μm이고, 도 24B에서 100㎛이다.
도 24C 및 24D는 Nmnat1 유전자 요법 또한 시신경변성(n> 40/그룹)(도 24C), 세포체 손실(n = 8/그룹)(도 24D, 상부 패널), 및 PERG 진폭(n> 20/그룹)(도 24D, 하부 패널)에 대하여 D2 눈의 IOP가 상승하는 것을 방지하고 있다. 음용수에 NAM(NAMLo = 550 ㎎/㎏/일)를 추가하면 시신경변성(Nmnat1 + NAMLo = P<0.001에 대비하여 Nmnat1, Fisher's exact test)을 추가적으로 방지할 수 있다(도 24C). ** = P <0.01, *** = P <0.001.
도 25는 NAM 및 NMNAT1/Wld S를 갖는 NAD 재순환 경로를 보여준다.
도 26A 및 26B는 PQQ로 처리된 축삭절단 망막에서, PQQ 투여가 핵 직경 수축(도 26A)과 세포 밀도 감소(도 26B)를 방지한다는 것을 보여준다.
도 27A 내지 도 27H는 FACS sorting RGC를 보여준다. 망막 샘플을 항체 칵테일로 염색하였다(재료 및 방법 참조). 도 27A는 생존 세포를 확인하기 위해 게이팅된(도 27D) 전방 및 측방 산란(도 27B 및 27C)을 보여준다. RGC는 게이팅된 Thy1.2+로 확인되었다(Cd11b-, Cd11c-, Cd31-, Cd34-, Cd45.2-, GFAP-, DAPI-). Cd11b, Cd45 및 Thy1.2 플롯 만이 나타나있다(도 27E-27G). 도 27H에서, FACS 양성 RCG를 도말하고, SNAP-25 및 β-튜불린으로 염색하여, RGC 상태를 확인하였다. 스케일 바 = 25 μm.
정의
본원에서 사용된 용어는 다음과 같은 의미를 가진다.
본원에서 사용된 용어 "녹내장"은 망막 및 시신경 손상 및 시각 기능장애 또는 시력 상실을 초래하는 안질환을 의미한다. 녹내장은 노년층에게 더욱 흔하게 발생한다. 녹내장으로 인한 시력 상실은 영구적이며 되돌릴 수 없다.
본원에서 사용된 용어 "치료가 필요한 대상체/환자"는 소정 신경변성 질환 또는 상태, 특히 녹내장을 포함한 안구 신경변성을 앓고 있거나 그러한 치료가 필요한 사람으로 일반적으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "녹내장"은 일차 개방각 녹내장, 이차 개방각 녹내장, 정상 안압 녹내장, 과분비 녹내장, 일차 폐쇄각 녹내장, 이차 폐쇄각 녹내장, 고원 홍채 녹내장, 색소 녹내장, 복합-기작 녹내장, 발달 녹내장, 스테로이드-유발 녹내장, 비늘 녹내장, 아밀로이드 녹내장, 신생 혈관 녹내장, 악성 녹내장, 캡슐 녹내장, 고원 홍채 증후군 등을 포괄한다.
본원에서 사용되는 용어 인간의 "정상 안압(정상 "IOP")"은 10 ㎜Hg 내지 21 ㎜Hg의 IOP 값을 갖는 인간 대상체를 의미한다. 그러나 일부 사람들은 정상 IOP(정상 안압 녹내장으로 알려져 있음)에도 불구하고 시신경 손상을 일으킬 수 있다.
본원에서 사용된 용어 인간의 "높은 안압"(높은 IOP)은 21 mmHg(또는 2.8 kPa) 이상의 IOP 값을 갖는 인간 대상체를 의미한다. 높은 IOP는 녹내장의 위험 인자로 알려져 있다. 그러나 일부 사람들은 수년간 높은 안압을 보이며 시신경 손상을 일으키지 않을 수도 있다..
본원에 사용 된 용어 "신경보호하는" 또는 "신경보호"는 손상 또는 죽음으로 인한 안구 신경(예를 들어, 시신경) 또는 중추 또는 말초 신경계에서 뉴런, 시냅스, 수상 돌기, 세포체, 또는 축삭을 보호하거나, 신경세포 손상 또는 사멸의 발병을 지연시키거나, 신경세포 집합체에서 신경세포 손상의 정도/신경세포 사멸의 정도를 감소시키는 능력을 의미한다.
본원에서 사용된, 예를 들어, 일반적 또는 안구적 신경변성 질환(예를 들어, 녹내장)에서의 신경세포 손상 및 사멸에 관한 용어 "예방하는" 또는 "예방"은, 본 발명의 화합물 또는 제제의, 바람직하게는 그러한 손상, 사멸, 질환이 발생하기 전의 신경보호를 부여하는 능력을 말한다. 따라서 녹내장 예방은, 녹내장의 발생을 회피, 최종적으로 녹내장 발생의 위험 또는 기회 감소, 녹내장의 발생 또는 진전을 지연, 또는 최종적으로 녹내장을 발생시키는 녹내장 손상/ 신경세포 사멸의 정도/ 신경세포 집합체 중의 손상을 감소시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 녹내장과 같은, 신경변성과 관련된 증상 또는 상태의 발생을 완화, 중지, 또는 억제하기 위하여 본 발명의 화합물 또는 제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용용어 "시력 또는 시각 기능을 개선하는"은 본 발명의 화합물 또는 제제가 투여된 대조군 대상체에 비교하여, 본 발명의 화합물 또는 제제가 투여된 대상체에서 시각 또는 시각 기능(시야 검사 또는 망막전위도 검사의 패턴 망막전위도 검사(pattern electroretinography, PERG) 진폭과 같은)을 향상시키는 데 있어서, 본 발명의 화합물 또는 제제의 효과를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 대상체에 투여될 때 투여 효과를 발생하는 양을 의미한다. 예를 들어, 신경변성을 억제하기 위하여 대상체에 투여될 때 "치료적 유효량"은 IOP 상승을 감소 및/또는 RGC 기능을 향상시킨다(예를 들어, RGC 기능의 저하를 방지).
본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 상호교환 가능하게 사용되며, 설치류, 개, 및 인간과 같은 포유류를 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 발명의 화합물이 투여될 수 있는 임의의 포유류 환자 또는 대상체(예를 들어, 인간)을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약제" 또는 "약학적 조성물"은 질환의 치료, 치유 또는 개선에 사용되거나 질환의 증상을 치료, 완화, 또는 경감시키는 데 사용되는 약학 제형을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 그러한 서열과 양립가능한 세포에서 그것이 함유하는 유전자/핵산 분자의 발현을 수행할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적합한 프로모터 서열 및 선택적으로 전사 종결 신호를 포함한다.
다음과 같은 약어가 사용됩니다.
NAM - 니코틴아미드
NAMPT - 니코틴아미드 포스포리보실 트랜스퍼라아제
NMN 또는 β-NMN - 니코틴아미드 모노뉴클레오티드
NMNAT - 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐일 트랜스퍼라아제
NAD - 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드
NaMN- 니코틴산 모노뉴클레오티드
NR- 니코틴아미드 리보시드
개요
본 발명은 망막 신경절 세포(retinal ganglion cells, RGCs)에 대한 최첨단 분자 기술(RNA sequencing; RNA-seq)의 사용에 기초하며, 이에 기초하여 비정상적인 미토콘드리아가 검출 가능한 신경변성 전에 발생하는 신경 세포의 기능장애를 초기 유발한다는 것을 발견하게 되었다. 본 발명자들은 DBA/2J(D2) 마우스 모델(만성 연령-관련, 유전된 녹내장)을 사용하여, 대부분의 녹내장의 주요 위험 인자인 나이 증가와 RGC에서 신경세포 변성을 일으키는 높은 IOP 사이의 관계를 더욱 밝혀냈다.
본 발명자들은 NAD+ 수준의 감소를 보충하기 위해 치료 수준의 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+)를 망막에 전달하는 방법을 개발하였다. 본 발명의 특정 약학적 조성물(예를 들어, NAM 및/또는 피루베이트)의 투여는 안구 신경변성 및 녹내장의 치료에 있어서 신규한 접근법을 나타낸다. 본 치료 방법은 노화 신경세포가 질환-관련 손상에 취약한 경우의 감소를 포함하는 다른 신경변성의 치료에 유용할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 목적의 약학적 조성물의 연령-의존적 신경변성을 치료하거나 예방하는, 예건대 녹내장을 치료하거나 예방하기 위한 치료적 용도를 제공한다.
소정 구체예에서, 본 약학적 조성물은 녹내장, 바람직하게는 일차 개방각 녹내장, 정상 압력 녹내장, 및 일차 폐쇄각 녹내장의 치료 또는 예방에 효과적이다. 소정 구체예에서, 본 발명의 약제학적 제제는 일차 개방각 녹내장을 치료 또는 예방에 특히 효과적이다.
소정 구체예에서, 상기 방법은 신경변성 장애(예를 들어, 녹내장)의 치료/예방을 필요로하는 대상체에게 치료적 유효량의 니코틴아미드(NAM)를 투여하는 것을 포함한다.
소정 구체예에서, 상기 대상체에 피루베이트와 함께 NAM가 함께 투여된다. NAM 및/또는 피루베이트가 세포내 NAD+ 수준(NAD+ 및 NADH 총 수준)을 증가시켜 상기 대상체의 신경변성 장애를 치료 또는 예방하는 것으로 여겨진다.
한 양태에서, 본 발명은 세포내 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 증가시켜 신경변성을 예방함으로써 녹내장을 치료하는 유전자 전달의 치료적 이용을 제공한다.
소정 구체예에서, 본 발명은 유전자 요법 방법(예를 들어, 니코틴아미드 뉴클레오티드 아데닐트랜스퍼라제 1(Nmnat1)의 발현을 유도함)을 제공한다. Nmnat1 단백질의 발현은 완전히 예방적이며 NAM과 함께 상승적으로 작용(즉, 84%의 눈은 녹내장성 신경변성을 갖지 않음)한다.
본 발명의 이점은 진행하고 있는 녹내장의 위험 인자를 감소시킨다는 것이다. 본 연구는, NAM 단독으로 또는 다른 약제(예를 들어, 피루베이트)와 함께 녹내장의 위험 인자를 감소시킨다는 것을 명확하게 보여준다. 12월령 대조군 D2 마우스의 경우, 약 60%의 신경이 심각한 녹내장을 가지고 있다. 이것은 진행 중인 녹내장 발생의 위험 인자가 0.6임을 나타낸다. 저용량 NAM 투여(마우스에서 550 mg/kg/일) 후, 이 위험 인자는 0.36으로 감소하거나(위험 인자 2배 이하 감소), 고용량 NAM(마우스에서 2,000 mg/kg/일)이 투여되는 경우, 0.06으로 감소된다(위험 인자 10배 감소).
본 발명의 이점은 NAM과 유전자 요법(예를 들어, NMNAT1 유전자 요법)의 투여 사이의 상승적 효과이다. 위험 인자를 0.29(위험 인자 ~2배 감소)로 단독으로 감소시키는 유전자 요법과 비교하여, NAM과 유전자 요법의 병용은 위험 인자를 0.16으로 감소(위험 인자 ~4배 감소)시킨다. 따라서 NAM과 유전자 요법을 병용하면 IOP 상승 후 녹내장의 발생 위험 인자를 상승적으로 감소시킨다.
NAM(단독으로 또는 피루베이트와 같은 다른 약제와 함께)의 보호 효과에 대한 본 발견은 예상치 못한 것이다. 본 발견은 NAM은 보호 효과가 없다는 '326 특허에 보고된 것과는 상당한 대조를 이룬다.
상이한 발견의 근거를 제공하는 적어도 다음과 같은 이유가 있다. 첫 번째 이유는 '326 특허권자들은, 특히 녹내장과 같은 안구-관련 질환에서 생체내 효과와 관련이 없는 실험 시스템을 이용했다는 것이다. 그 실험에서, '326 특허권자들은 후근 신경절(DRG) 신경을 분리하고 신경염을 절단하여 신경 손상을 유발하였다. 기계적 절단이 DRG 신경 세포체에 매우 가깝게 일어나는 곳에서의 이러한 인공적 배양-유도성 신경 손상은 신경변성을 생체내에서 전혀 유사하지 않다. 녹내장에서 초기 축삭 손상은 DRG 신경염보다 세포체에서 훨씬 더 먼 거리에서 일어나는 것으로 여겨진다. 두 번째 이유는 '326 특허권자 배양 시스템이, 녹내장성 신경변성에서 매우 관련성이 높은 신경 세포인, 망막 신경절 세포(RGCs)를 사용하지 않았다는 것이다. 세 번째 이유는 326' 특허권자들이 손상되지 않은 신경 조직(서로 연락하고 지원하는 다양한 세포 유형으로 구성됨) 대신에, 인공 세포 시스템을 사용했다는 것이다.
마지막으로, '326 특허권자들은, 신경(주변 수초(sheathe)를 포함)이 기계적으로 절단되는 생체내 완전한 시신경 횡단절개 모델을 언급했다는 것이다. 이는 갑자기 신경을 손상시키고 실질적으로 축삭이 있는 국소 환경을 변경시키며, 14일 이내에 망막 신경절 세포의 90% 이상을 사멸시킨다(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21610673 참조). 손상이 신경 상에서 정확한 위치에 있다 하더라도, 녹내장은 없다. 전반적으로, '326 특허권자들이 채택한 접근법은 인간의 녹내장을 되풀이하지 않는 망막 신경절 세포를 파괴하는 매우 인공적이고 빠른 방법이다. 시신경 횡단절개 실험에서, 326' 특허권자들이 화합물(NAM 포함)을 유리체내로 주입하여 안구에 NAD 생성을 일으킨 것은 흥미로우며, '326 특허권자들은 이 모델의 RGC에서 NAM이 축삭 변성에 대해 예방적이지 않다고 명백히 결론을 내렸다.
이들 모두는 특히 관련이 있다. 본 발명자들의 배양 실험은, 다른 망막 세포 유형과의 정상적인 관계에 있는 망막 신경절 세포를 포함하는 손상되지 않은 망막 조직을 사용하고, 망막 신경절 세포 축삭은 녹내장에서 손상이 일어나는 동일한 위치에서 절단하였기에, 녹내장과 더욱 관련이 있다. RGC 축삭이 눈에서 나와 시신경이 되는 시신경 머리 내의 실제 축삭에서 녹내장의 손상이 일어난다고 믿어진다.
대조적으로, 이러한 응용에 제시된 데이터는 녹내장에서의 NAM의 신경 보호 효과를 명백하게 보여준다. NAM의 단독 사용 또는 다른 제제(예를 들어, 피루베이트)와 함께 사용하는 것은 녹내장과 같은 안구-관련 질환에서 신경 보호 효과를 제공한다. 본 출원에서, 신경보호 효과는 다음 파라미터 중 적어도 하나에 의해 입증된다:(i) 세포체 손실의 방지(RBPMS 염색);(ii) 망막 박화(retinal thinning) 및 신경 섬유층 손실의 방지(Nissl 염색);(iii) 시신경변성 및 축삭 손실 방지(PPD 염색);(iv) 선행 축색 원형질 수송(anterograde axoplasmic transport) 손실 방지(Ct-B 염색);(v) 시각 기능 상실 방지(PERG);(vi) 비정상적인 미토콘드리아 크리스타(mitochondrial cristae, EM)의 방지;(vii) 지방 액적 감소(오일 레드 O 염색); 및(viii) PARP 활성화 감소(PARP 염색).
본 발명자는, NAM의 단독 사용 또는 다른 제제(예를 들어, 피루베이트)와 함께 사용하는 것이 세포내 사건에 영향을 주어 신경 보호 효과를 제공한다는 것을 추가로 밝혀 내었으며, 상기 신경 보호 효과는(i) HIF-1α 활성화 감소(HIF-1α 염색);(ii) 시냅스 손실 감소(SNAP-25 염색);(iii) 핵의 미토콘드리아 전사 과다로의 복원(RNA-seq); 및(iv) 연령-관련 분자/유전자 변화의 예방(RNA-seq)에 의하여 입증된다.
본 발명의 또 다른 이점은 NAD 전달에 있어서 NAM과 유전자 요법을 병용하는 것이다. 유전자 요법 접근법은 많은 임상 연구에 의해 입증된 바와 같이 적어도 3-5 년간 지속되는 것으로 여겨진다. 유전자 요법은 녹내장에서 NAM 및/또는 피루베이트와 함께 사용하여 상승적인 신경 보호 효과를 제공 할 뿐만 아니라 IOP를 낮춘다.
상기에서 일반적으로 기술된 발명과 함께, 다음 섹션은 본 발명의 추가 태양에 대한 보다 상세한 설명을 제공한다.
DBA/2J 마우스 모델
본 발명자들은 DBA/2J(D2) 마우스 모델의 사용을 선택했는데, 이는 이 마우스 종이 인간 녹내장을 잘 흉내내는 유전된 연령-관련 녹내장을 유발하기 때문이다. D2 마우스는, 동일한 질환을 매개하는 분자(예를 들어, 보체 성분 분자)의 유도, 시신경 머리에서 주요한 녹내장 손상의 동일한 위치, 및 인간 녹내장에서 발생하는 RGC 사멸의 동일한 지형학 패턴을 포함하여, 인간 녹내장에 대하여 많은 확립된 유사성을 갖는. 가장 많이 연구된 녹내장 모델 중 하나이다. D2 마우스는 홍채 질환과 약 6~8월령에 시작되는 높은 안압을 가진다. 9월령까지 대다수의 D2 마우스의 눈에는 높은 안압이 계속 발생하고 있다. 계속해서 D2 마우스는 진행성 시력 상실, 시신경 손상 및 내부 망막 기능장애를 가진다. 설계된 실험이 일반적으로 끝나는 12월령에, ~70%의 D2 마우스 눈은 망막과 시신경의 조직 검사를 기반으로 하는 심한 질환을 가진다. 화합물(예를 들어, 메만틴, 티몰롤, 또는 라타노프로스트)의 국소적 투여는 D2 마우스에서 IOP를 낮추고, 인간 녹내장에서 그러한 것과 같이 신경변성의 발생 위험성을 감소시킨다. 대조군 D2-Gpnmb +는 녹내장을 일으키지 않는 연령- 및 스트레인-정합 마우스이다.
녹내장에서의 안압
안압(IOP)은, 예를 들어, 골드만 압평 안압계(Goldmann applanation tonometry, Haag Streit, Bern, Switzerland)를 이용하여 측정할 수 있다. 인간의 경우, 정상 IOP는 12~21 mmHg이다. 21 mmHg를 초과하는 안압은 높은 것으로 간주된다. IOP의 증가는 녹내장의 주요 위험 요소이다. 일차 개방각 녹내장(primary open angle glaucoma, POAG, 90% 이상을 차지하는 가장 흔한 녹내장)을 갖는 환자들 중에서, 25 mmHg는 비치료 기준선 IOP의 중앙값이다.
볼티모어(Baltimore) 안과 연구(www.ncbi.nlm.nih.gov/pub/12049574)는 높은 위험도 = IOP > 25.75 mmHg, 중도 위험도 = IOP 23.75 내지 25.75 mmHg, 낮은 위험도 = IOP < 23.75 mmHg임을 보고하였다. IOP를 24 mmHg 이하로 20%만큼 감소시키면 진행 위험도가 5년후에는 9.5%에서 4.4%로 감소한다. 한 개의 눈이 실명될 확률은 진단 후 10 년이 지나면 27%, 20년 후에는 38.1%이다. 두 눈 전부가 실명이 될 확률은 각각 6%와 13.5%이다.
일차 개방각 녹내장(POAG) 환자와 같은 인간 녹내장 환자의 경우, 녹내장은 비동기적이며 연령과 관련이 있다(40세 이상에서 가장 흔하게 발생). 비치료 녹내장은 안압이 21~25 mmHg일 때 초기에서 말기로 진행하는 데 평균 14년이 걸린다. 이 진행 속도는 IOP가 증가함에 따라 급격히 증가한다(IOP>30 mmHg인 경우, 초기 단계에서 말기 단계로 진행하는 시간이 ~3년).
인간 환자에서, IOP를 낮추는 치료(외과적 또는 약리학적)는 신경변성의 발생 위험을 감소시킨다. 질환진행률과 실명이 될 확률은 진단받지 않은 환자들 때문에 잘못 표현될 수 있다. 높은 IOP가 항상 녹내장을 나타내는 것(10 년후 30% 이하의 실명, 20년 후 40%이하의 실명)은 아니라고 일반적으로 믿어진다. IOP 강하가 녹내장을 치유하지 않으나, 위험 인자를 58% 정도 감소시킨다. 종래의 IOP 강하 예방에도 불구하고, 여전히 시력 손실, 심지어는 실명의 위험이 있다. 녹내장에서 가능한 신경 보호 전략은 제한되어 있다. 녹내장에서 시력 손실은 비가역적이다. 사실, 녹내장은 세계에서 비가역적 실명의 주 요인이다.
망막 신경절 세포(Retinal Ganglion Cells, RGCs)
망막 신경절 세포(RGC)는 망막의 출력 신경세포이다. 이 세포들은 중간 신경세포(즉, 양극성 세포 및 무축삭 세포)를 통해 광수용체(즉, 간상체와 추상체)로부터 시각 정보를 수신한다. 이 시각 정보는 빛의 광자로 시작하여 망막 신경절 세포 시냅스에서 전기 전위로 끝을 낸다. RGC는 세포체를 떠나 망막을 가로질러, 눈(시신경 머리) 밖으로 나오는 시신경 유두(즉, 맹점)에 이르는 긴 축삭을 가진다. 시신경 머리(미엘린 전이 구역(myelin transition zone))를 지나면, 망막 신경절 세포의 축삭은 수초가 되어 시신경을 형성(즉, 시신경은 망막 신경절 세포 축삭 묶음이며, 종마다 다르지만 마우스에서는 50,000개 이하임)한다. 시신경의 축삭은 결국 뇌의 말단 시각 중추에 도달하여 이들 신호를 중계하거나 이들 정보를 자체적으로 처리한다. 망막 신경절 세포의 축삭이 끝나는 두 개의 중요한 시각 중추는 외측슬상체(lateral geniculate nucleus, LGN) 및 사구체 상층 둔덕(sup. col./SC)이다.
망막 신경절 세포는 녹내장에서 특히 영향(예를 들어, 세포 손실)을 받는다. RGC의 손상은 시신경 머리의 부위의 축삭에서 일어날 것 같다. 비정상적으로 높은 IOP에 의하여 눈에 유도되는 스트레스로 인해, 시신경 머리는 망막 신경절 세포 축삭에 기계적 손상이 발생할 수 있는 눈의 "약점"이라고 추측된다. 또한, 눈 전체에 압력이 세포체 및 수상 돌기에 영향을 주어야 하기 때문에 축삭은 망막 신경절 세포의 손상의 유일한 지점이 아니다. RGC가 어떻게 손상되는지에 대한 정확한 기본 기작은 명확하지 않다.
DBA/2J(D2) 마우스에서, 본 발명자들은 IOP가 높은 시점에서, 시신경 내에 검출가능한 축삭 손실 시신경이 없다(즉, 안구 신경변성이 없음)는 것을 보여 주었다. 놀랍게도, 본 발명자들은 초기 미토콘드리아 및 분자 변화, 수상 돌기 위축, 및 시냅스 손실이 있음을 발견했다. 이러한 발견은 IOP의 영향이 시신경의 축삭뿐만 아니라 망막 신경절 세포의 다른 구획에서 분명히 나타남을 시사한다.
신경변성 치료
소정 구체예에서, 상기 제제는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 전구체(예를 들어, 니코틴산, 니코틴아미드(NAM), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN), 니코틴아미드 리보시드(NR), 또는 이들의 조합), 크렙 사이클(Krebs cycle) 중간체 또는 이의 전구체(예를 들어, 피루베이트), 또는 이들의 조합을 포함한다.
소정 구체예에서, 상기 제제는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD+) 전구체, 예컨대, 니코틴산, 니코틴아미드(NAM), 니코틴아미드 모노뉴클레오티드, 니코틴아미드 리보시드, 또는 이들의 조합을 포함한다. 소정 구체예에서, NAD+ 전구체는 니코틴아미드 또는 니코틴아미드 리보시드이다.
니코틴산(니아신, 니코티네이트, 비타민 B3, 및 비타민 PP라고도 알려짐)은 비타민이다. 그의 해당 아미드는 니코틴아미드 또는 니아신아미드로 불린다. 이들 비타민은 직접 상호 전환가능하지 않다. 그러나 니코티네이트와 니코틴아미드 둘 다는 산화환원 쌍 NAD+/NADH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드) 및 NADP+/NADPH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트)의 합성에서 전구체이다. 니코티네이트와 니코틴아미드 대사 경로는 본원에서 NAD+ 합성 경로로 지칭될 수 있다.
NAD+는 회수 경로(salvage pathway)와 신생 경로라는 두개의 대사 경로를 통해 합성된다. 회수 경로에서, NAD+는 전구체 화합물(예를 들어, 니코틴산, 니코틴아미드, 니코틴아미드 리보시드, 등.)의 외부 소스로부터 합성될 수 있다. 신생 경로에서, NAD+는 아미노산(예를 들어, 트립토판, 아스파라긴산, 등)의 대사 중에 생성된 퀴놀리네이트로부터 합성될 수 있다.
본 발명의 NAD+ 전구체는 니코틴산, 니코틴아미드, 니코틴아미드 리보시드 등 뿐만 아니라 이들의 염 및 유사체를 포함한다. 소정 구체예에서, 본 발명의 NAD+ 전구체를 투여하는 것은 세포내 NAD+의 수증(intracellular level)을 증가시킨다.
소정 구체예에서, 상기 제제는 크렙 사이클 중간체 또는 이의 전구체, 또는 이의 조합을 포함한다. 예를 들어, 크렙 사이클 중간체 또는 전구체는 옥살로아세테이트, 아세틸 CoA, 시트레이트, CoA-SH, cis -아코니테이트, D-이소시트레이트, NAD+, 옥살로숙시네이트, NADH, α-케토글루타레이트, 숙시닐-CoA, GDP, 유비퀴논, 숙시네이트, 푸마레이트, L-말레이트, 피루베이트, 단당류(예를 들어, 글루코스, 갈락토스, 프럭토스 등), 이당류(예를 들어, 수크로스, 말토스, 락토스), 또는 이의 조합을 포함한다.
따라서, 본 발명은 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 리보시드 및/또는 니코틴아미드 및/또는 니코틴산 대사산물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 리보시드 및/또는 니코틴아미드 및/또는 니코틴산 대사산물은 유리 형태(free form)로 이용될 수 있다. 본 원에서 성분과 관련하여 사용된 용어 "유리(free)"는 상기 성분이 보다 큰 분자 복합체내로 혼입되지 않음을 나타낸다. 일부 구체예에서, 니코틴산은 니아신에 포함될 수 있다. 니코틴산 및/또는 니코틴아미드 리보시드 및/또는 니코틴아미드 및/또는 니코틴산 대사산물은 염 형태 일 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 임의의 조성물은 이의 염, 유도체, 대사산물, 이화산물, 동화산물, 전구체 및 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 대사산물은 니코티닐 CoA, 니코틴누르산, 니코티네이트, 모노뉴클레오티드, 니코티네이트 아데닌 디뉴클레오티드 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 니코틴아미드를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 조성물은 본질적으로 니코틴산 대사산물이 없을 수 있다.
소정 구체예에서, 염은 불화물, 염화물, 브롬화물, 요오드화물, 포르메이트, 아세테이트, 아스코르베이트, 벤조에이트, 카르보네이트, 시트레이트, 카바메이트, 포르메이트, 글루코네이트, 락테이트, 메틸 브로마이드, 메틸 설페이트, 포스페이트, 숙시네이트, 설페이트, 및 트리플로로아세테이트 염으로 구성된 군에서 선택된다.
또한 NAM/니코틴산 유사체가 본 발명에 사용될 수 있다. 니코틴산의 적합한 유사체는 예를 들어 이소니코틴아미드 및 N-메틸-니코틴아미드를 포함한다.
또한 소정 구체예에서, NAM의 케토-, 에틸-, 벤질-. 또는 기타 비-염 형태가 본 발명에서 사용될 수 있다.
NAM/니코틴아미드/NAD/NR/피루베이트의 독성은 낮으며, 상대적으로 많은 양을 독성 효과 없이 투여할 수 있다.
마우스에서, 본 화합물(예를 들어, NAM/니코틴아미드/NAD/NR/피루베이트)은 신경 보호 효과를 제공하기 위해 약 200 내지 1000 mg/kg/일의 1일 투여량으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 1일 투여량은 약 400 내지 600 mg/kg/일이다. 보다 바람직하게는, 1일 투여량은 약 550 mg/kg/일이다. 이러한 투여량에서, 본 화합물은 신경 보호 효과를 제공한다.
마우스에서, 본 화합물(예를 들어, NAM/니코틴아미드/NAD/NR/피루베이트)은 안압 강하 효과를 제공하기 위하여 약 1,000 내지 5,000 mg/kg/일의 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 1일 투여량은 약 1,500 내지 3,000 mg/kg/일이다. 보다 바람직하게는, 1일 투여량은 약 2,000 mg/kg/일이다. 이러한 투여량에서, 본 화합물은 안압 강하 효과를 제공한다.
PQQ와 관련하여, 생쥐에서 적어도 2000 mg/kg/일이 허용된다. PQQ에 의해 제공되는 신경 보호 효과는 마우스에서 약 20 내지 2,000 mg/kg/일, 약 100 내지 1,000 mg/kg/일, 또는 약 500 ㎎/㎏/일이다.
하나의 종(예를 들어, 마우스)에서 mg/kg으로 표시되는 약학적 조성물의 투여량을 또 다른 종(예를 들어, 사람)에서 mg/kg으로 표시되는 등가 표면적 투여량으로 환산하기 위하여, 다음 표에 Freireich et al., Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, dog, monkey and man, Cancer Chemother Rep. 50(4):219-244, 1966(본원에 참조로서 병합됨)에서의 가정과 상수에 기초하여, 환산에 대한 대략적인 인자를 제공한다.
등가의 표면적 용량 환산 인자
로(To)
에서(From) 마우스(20 그램) 래트(150 그램) 원숭이(3 kg) 개(8 kg) 인간(60kg)
마우스 1 1/2 1/4 1/6 1/12
래트 2 1 1/2 1/4 1/7
원숭이 4 2 1 3/5 1/3
개 6 4 1 2/3 1 1/2
인간 12 7 3 2 1
따라서, 마우스에서 550 ㎎/㎏의 투여량은 원숭이에서는 550 ㎎/㎏ Х 1/4 = 137.5 ㎎/㎏, 60 kg의 인간에서는 550㎎/㎏ Х 1/12 = 45.8 ㎎/㎏(또는 2.85 g)에 등가(mg/m2에 기초하여 등가를 가정)이다.
위의 표에서 다소 단순화된 환산 인자는 각각의 종의 체중 대 표면적 비율[km]에 기초한다. 더 정확한 환산을 원한다면, 용량 환산도 하기에 열거된 각각의 종의 km 인자에 기초할 수 있다.
다양한 종에 대한 대표적인 표면적/무게 비율[km]
종 체중(kg) 표면적(m 2 ) km 인자
마우스 0.02 0.0066 3.0
래트 0.15 0.025 5.9
원숭이 3.0 0.24 12
개* 8.0 0.40 20
인간(어린이) 20 0.8 25 명
인간(성인) 60 1.6 37 세
* 특정 개의 유형에 따라, km 인자가 다를수 있다. 예를 들어, 녹내장에 걸리기 쉬운 일부 테리어개 및 기타 품종은 약 10개의 km 인자를 이용할 수 있다.
따라서, 마우스에서 550 mg/kg의 투여량은 60 kg 성인에서 550 mg/kg × 3.0/37 = 44.6 mg/kg(즉, 2.68 g), 그리고 20 kg 아이에서 550 mg/kg × 3.0/25 = 66 mg/kg(즉 1.32g)에 등가이다.
또한 위의 표는 투여량에 적절한 km 인자를 곱하여 계산함으로써 mg/sq.m 투여량의 등가로서 임의의 주어진 종에서 mg/kg의 투여량을 표현하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 성인의 경우, 100 mg/kg은 100 mg/kg × 37 kg/sq.m = 3700 mg/sq.m에 등가이다.
인간(약 60kg 개체)에 있어서, 본 화합물(예를 들어, NAM/니코틴아미드/NAD/NR/피루베이트)은 신경 보호 효과를 제공하기 위해 0.5 내지 10 그램의 일일 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 1일 투여량은 약 1 내지 5 g/일이다. 바람직하게는, 1일 투여량은 약 2 내지 4 g/일이다. 보다 바람직하게, 1일 투여량은 약 2.5 g/일이다. 이러한 투여량에서, 본 화합물은 신경 보호 효과를 제공한다.
인간(60kg 미만 개체)에 있어서, 본 화합물(예를 들어, NAM/니코틴아미드/NAD/NR/피루베이트)은 안압강하효과를 제공하기 위하여 약 5 내지 25 g/일의 1일 투여량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 1일 투여량은 약 10 내지 20 g/일이다. 바람직하게는, 1일 투여량은 약 8 내지 15 g/일이다. 보다 바람직하게는, 1일 투여량은 약 10 g/일이다. 이러한 투여량에서, 본 화합물은 안압 강하 효과를 제공한다.
사람(60kg 미만 개체)에 있어서 PQQ는 신경 보호 효과를 제공하기 위하여, 약 2 내지 160 mg/kg/일, 약 10 내지 100 mg/kg/일, 또는 약 50 mg/kg/일의 1일 투여량으로 투여될 수 있다. 소정 구체예에서, PQQ는 하루에 약 10 mg 내지 100 mg, 하루에 약 50 mg 내지 1 g, 또는 하루에 약 500 mg의 1일 투여량으로 투여될 수 있다.
이상적으로, 전형적인 투여는 1일 1 회, 2 회, 또는 3회일 수 있다. 1일 총 투여량은 1 회 투여되거나, 2 또는 3 개의 별도의 투여량으로 투여될 수 있다(예를 들어, 각 투여량은 1일 총량의 1/2 또는 1/3). 다중 투여의 경우, 각 투여량은 동일한 양 또는 상이한 양일 수 있다. 약학적 조성물은 아침 또는 저녁에 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 식사 유무와 관계없이 섭취할 수 있다.
신경변성 장애를 치료하는 치료제
한 양태에서, 본 발명은 세포내 NADt 수준을 증가시키거나 세포내 NAD+, NADH, GSH, GSSG, 피루베이트 또는 PQQ 수준을 증가시키는, 치료적 유효량의 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애의 치료 또는 예방이 필요한 대상체의 신경변성 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 NAM, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN 또는 β-NMN), NAD, 피루베이트, PQQ, 또는 글루타티온을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
약학적 조성물에 사용되는 약제는, 녹내장과 같은 그러한 신경변성 장애를 치료 또는 예방 하는 신경 보호제이다.
많은 상이한 유형의 손상 또는 신경변성 질환 또는 상태는 신경세포 손상 또는 사멸, 예를 들면, 저산소증, 저혈당, 당뇨병, 이온 항상성의 손실, 신경세포의 신체 손상, 독성 물질에 노출, 및 유전성 또는 비 유전성 신경변성 장애를 포함한 신경계에 영향을 주는 많은 질환을 초래한다. 소정 구체예에서, 신경변성 장애는 축사 변성을 포함한다. 소정 구체예에서, 신경변성 장애는 월러 변성(Wallerian degeneration) 또는 월러-유사 변성(Wallerian-like degeneration)을 포함한다. 예를 들어, 월러 변성은 신경세포 상처, 질환, 외상, 또는 화학요법제로 인한 상처와 같은, 신경세포 상처를 유발할 수 있다.
이것은 단지 예시적인 목록일 뿐이라는 것을 이해할 것이다. 신경보호성 제제가 존재하면 비보호 신경세포에서 기능적 무결성의 손실을 초래할 수 있는 손상 또는 질환 상태에 노출시 신경 세포가 생존할 수 있다. 또한 그러한 제제는 신경세포를 더욱 탄력적으로 만들어서, 손상에 대응하여 신경세포가 손상되는 것을 방지할 수 있다.
약학적 조성물
약학적 제형은 투여되는 대상에게 해롭지 않은 형태로 약리학적 유효 성분 및 상기 유효 성분을 안정화시키고 순환 또는 표적 조직으로의 흡수에 영향을 미치도록 설계된 추가 성분을 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 보조제 및 부형제와 함께, 문헌 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995에 개시된 것과 같은 종래의 기술에 따라 제형화할 수 있다.
적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 불활성 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수용액 및 다양한 유기 용매를 포함한다. 고체 담체의 예는 락토오스, 테라 알바, 수크로스, 사이클로덱스트린, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 및 셀룰로즈의 저급 알킬 에테르가 있다. 액체 담체의 예는 시럽, 땅콩유, 올리브유, 인지질, 지방산, 지방산 아민, 폴리옥시에틸렌, 및 물이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여는 다양한 경로, 예를 들어 경구, 비경구(피하, 근육내, 피부내 포함), 유리체내, 안구내(예를 들어, 점안약의 형태) 등일 수 있다. 하나의 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 경구 투여용이다(음료의 일부로서 약학적 조성물의 투여를 포함). 하나의 바람직한 구체예에서, 약학적 조성물은 안구내 투여용이다.
비경구 투여는 주사기, 선택적으로는 펜-유사 주사기에 의해 피하, 근육내, 복강내, 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 추가의 선택사항으로서, 본 발명의 제형도, 예를 들어, 무침(needle-free) 주사에 의해 또는 패치, 선택적으로 이온삼투압 패치 또는 점막 투여, 예컨대, 협측 투여로부터 경피 투여에 적용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어 용액, 현탁액, 유제, 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 경질 젤라틴 캡슐, 및 연질 젤라틴 캡슐, 점안제, 안약, 안과용 연고제, 안과용 린스, 주사액 등과 같은 적합한 제형으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 조성물의 안정성을 더욱 향상시키거나, 생체이용률을 증가시키거나, 용해도를 증가시키거나, 부작용을 감소시키거나, 당업자에게 잘 알려진 시간요법(chronotherpy)을 성취하거나, 환자 순응도를 증가시키거나, 이들의 조합을 위하여, 예를 들면 공유, 소수성, 및 정전기적 상호작용, 약물 전달체, 약물 전달 시스템, 및 향상된 약물 전달 시스템을 통해, 추가적으로 혼합되거나 부착될 수 있다.
담체, 약물 전달 시스템, 및 향상된 약물 전달 시스템의 예는, 셀룰로오스 및 유도체와 같은 중합체, 덱스트란 및 유도체, 전분 및 유도체와 같은 다당류, 폴리(비닐 알콜), 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 중합체, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 이들의 블록 공중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민과 같은 담체 단백질, 당업자에게 잘 알려진 블록 공-중합체 시스템과 같은 열겔화 시스템과 같은 겔, 미셀, 리포좀, 미세구, 나노입자, 액정 및 이의 분산액, 지질-물 시스템의 상 거동의 당업자에게 잘 알려진 L2 상 및 이의 분산액, 중합체 미셸, 다중 유화액, 자기-유화, 자기-미세유화, 시클로덱스트린 및 이의 유도체, 및 덴드리머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 제어, 지속, 연장, 지연, 및 완화 방출형 약물 전달 시스템의 조성물에 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, 이에 한정되지 않지만, 약학적 조성물은 당업자에게 잘 알려진 비경구 제어 방출 및 지속 방출 시스템(두 시스템 모두 투여의 횟수를 수 배로 감소시킴)의 조성물에 유용할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 약학적 조성물은 피하 투여된 제어 방출 및 지속 방출 시스템이다. 본 발명의 범위를 제한하지 않는 한, 유용한 제어 방출 시스템 및 조성물의 예는 하이드로겔, 유성겔, 액정, 중합체 미셀, 미세구, 및 나노입자이다.
신경변성 질환
본 발명의 약학적 조성물은 월러 변성(Wallerian degeneration)과 같은 축삭 변성을 수반하는 신경변성 장애의 치료에 유용할 것으로 예측된다. 그러한 변성이 중요할 수 있는 장애의 예는 당뇨병성 신경병증, 운동 신경 병증, 다발성 경화증, 말초 신경병증, 뇌졸중 및 기타 허혈 장애, 외상성 뇌 손상 등을 포함한다. 이 목록은 단지 설명의 목적으로만 제공되며, 제한적이거나 배타적이지 않다.
소정 구체예에서, 신경변성 장애는 당뇨병성 신경병증, 외상성 뇌 손상, 허혈, 말초 신경병증, 또는 녹내장과 같은 안과 장애 중 하나 이상이다. 소정 구체예에서, 상기 신경변성 장애는 녹내장이다.
하나의 구체예에서, 약학적 조성물은 신경세포 손상으로 인한 신경변성 장애의 치료 또는 예방에 있어서 신경보호 약물로서 사용하기 위한 것이다. 추가 구체예에서, 조절자는 신경세포 손상으로 인한 축삭 변성(예를 들어, 월러 변성)을 수반하는 신경변성 장애의 치료에 있어서 신경보호 약물로서 사용하기 위한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "손상"는 세포체에서 또는 축삭 또는 수지 돌기 과정에서 뉴런에 가해지는 손상을 의미한다. 이것은 종래의 의미에서 물리적 외상, 즉 대상체에 가해지는 외력에 의하여 발생하는 뇌, 척수 또는 말초 신경에 대한 외상일 수 있다. 기타 유해한 외부 요소는 예를 들어 수은 및 기타 중금속, 비소, 살충제, 및 용제와 같은 환경 독소이다. 대안적으로, 손상은, 대상체내에서, 예를 들면, 허혈성 뇌졸중 및 당뇨병성 신경병증에서와 같이 산소 및 에너지 공급 감소, 다발성 경화증 또는 산화 스트레스에서와 같은 자가면역 공격, 및 근 위축성 측삭 경화증에 중요하다고 밀더이는 자유-라디칼 생성으로부터 기인하는 신경세포의 손상으로 인하여 발생할 수 있다. 또한 손상은 본 명세서에서 축삭 수성의 기작에서의 임의의 결점을 지칭하는 것으로 사용된다.
다른 구체예에서, 본 약학적 조성물은 질환으로 인한 신경세포 손상으로 발생되는 신경변성 장애에서 신경보호 약물로서 사용하기 위한 것이다.
한 구체예에서, 상기 신경세포 손상은 노화에 기인한다.
한 구체예에서, 상기 신경세포 손상은 외상에 기인한다. 한 구체예에서, 상기 장애는 화학요법제에 의해 유도되는 신경세포 손상이다. 탁솔(Taxol), 벨캐이드(Velcade) 및 빈크리스틴(vincristine)과 같은 암 화학요법에서 사용되는 소정 약물은 사용가능한 최대 용량을 제한하는 말초 신경병증을 유발한다. 최근의 연구에 따르면, 탁솔 또는 빈크리스틴 독성을 앓고 있는 신경세포는 형태학과 기저 분자 현상에서 월러-유사 변화(Wallerian-like change)를 겪는다고 한다. 월러 변성 저해는 특히 이 조건에서 효과적일 수 있었는데, 이는 신경세포가 신경 독성제에 일시적으로만 노출되기 때문이다. 따라서 월러 변성을 억제하는 약제와 함께 탁솔 또는 빈크리스틴을 동시에 투여하면 현재 가능한 것보다 실질적으로 더 높은 용량으로 약물을 사용할 수 있게 되어 암을 더욱 효과적으로 방지할 수 있다.
노화는 대부분의 녹내장에서 일반적인 위험 인자이며, 본 치료 방법은 연령-관련 NAD 감소를 예방하고 환자에 녹내장이 발생하는 것을 예방한다(즉, 신경변성을 예방함). 본 발명은 NAM 및/또는 피루베이트(NAD 수준을 보충)의 투여와 NMNAT1 유전자의 유전자 전달의 병용 요법을 제공한다. NAM 및/또는 피루베이트 및 유전자 요법의 놀라운 효능을 감안할 때, 상기 병용 요법은 녹내장 치료 및 예방을 위한 매력적인 접근법이다.
신경변성을 치료하기 위한 유전자 요법
유전자 요법은 순응성 문제를 극복하고 효능을 향상시키는 매력적인 방법이다. 본 발명은 신경변성을 치료하기 위한 유전자 요법의 방법을 제공한다. 축삭 변성은 미충족 치료 의료의 영역이다. 신경변성은 운동 신경 질환, 녹내장, 알츠하이머 질환 및 다발성 경화증의 증상을 일으킨다. 당뇨병에서는 사지 절단의 주요 원인인 신경병성 통증 및 원위 감각 상실을 유발한다. 또한 암 화학요법에서 용량을 제한하는 부작용이다. 뻗침 손상으로 인한 진행성 축삭 변성은 외상성 뇌 손상의 주요 병리학이며, 백질을 보호하지 않으면 뇌졸중 치료가 제한된다. 인간 인구의 약 절반이 결국 이러한 장애들 중 하나 이상을 앓게 되고, 삶의 질을 크게 떨어뜨린다.
소정 구체예에서, 본 발명은 눈의 신경변성을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 눈에 대한 기능장애 유전자의 복제본을 교체하는 방법을 제공한다. 유전자는 바이러스 유전자 전달을 이용하여 도입된다. 소정 구체예에서, 상기 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 AAV는 AAV2.2이다. 본 출원의 목적상, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 등을 포함하는 기타 AAV 혈청형을 포괄하기 위한 것이다. 기타 구체예에서, 상기 벡터는 렌티바이러스(Lentivirus), 전형적으로는 위사형 HIV-기반 벡터(pseudotype HIV-based vector)이다.
RGC를 표적화하는 유전자를 전달하기 위해, 바이러스 벡터를 유리체 챔버에 도입한다. 바람직한 구체예에서, 유전자 전달은 내측 망막에 직접 인접하여 표적화된다. 유리체내 주사는 안과 수술에서 일상적으로 시행되며 병원/임상 위치에서 안전하게 수행될 수 있다.
본 발명은 매력적인 전망으로서 바이러스 유전자 전달을 눈에 제공하는 데 이는 수많은 세포가 평생 동안 형질감염되어 표적화된 유전자 산물을 전달할 수 있기 때문이다. 발명가가 아는 한, 눈에서의 유전자 요법은 녹내장 치료의 새로운 접근법을 나타낸다. 녹내장과 같이, 인간의 복합 질환에 적용되는 NAD+를 증가시키는 유전자 요법은 치료의 새로운 접근법을 나타낸다.
일 양태에서, 본 발명은 앓는 눈에 유전자를 전달하여 NAD의 발현을 증진시키는 방법을 제공한다. 소정 구체예에서, 본 발명에 따른 유전자 요법 조성물(예를 들어, 바이러스 벡터 상의 폴리뉴클레오티드)은 유리체내로 또는 안구내로 투여된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 유전자 요법은 유리체내 투여를 위한 것이다. 바람직한 경로는 치료될 대상체의 일반적인 상태 및 나이, 치료될 상태의 성질, 및 선택된 유효 성분에 좌우될 것이라는 것을 이해할 것이다.
일 태양에서, 본 발명은 Nmnat의 발현을 증가시키기 위해 눈에 유전자를 전달하는 유전자 요법을 제공한다.
소정 구체예에서, Nmnat의 단백질 발현을 증가시키는 유전자는 Nmnat-1, Nmnat-2 또는 Nmnat-3을 포함한다. 소정 구체예에서, 유전자는 Nmnat-1(예를 들어, 인간 NMNAT1)이다.
NMNAT
니코틴아미드 뉴클레오티드 아데닐일트랜스터라제 1(Nmnat1 [마우스], NMNAT1 [인간])은 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)의 생합성에서 중요한 단계를 촉매하는 효소를 암호화한다. 코딩된 효소는 여러 니코틴아미드 뉴클레오티드 아데닐일 트랜스퍼라제 중 하나이며, 세포핵에 특히 국한되어 있다. 이 유전자의 대안적인 스플라이싱은 다중(적어도 3개)의 전사 변이체를 초래한다.
인간 NMNAT1, 아형(1)에 대한 NCBI 참조 서열(RefSeq)은 NM_022787.3(뉴클레오타이드) 및 뉴클레오티드 서열이 더 긴 NMNAT1 아형(1)을 코딩하는 전사 변이체(1)로서 알려진 NP_073624.2(단백질); 및 NM_001297778.1(뉴클레오타이드) 및 뉴클레오티드 서열이 변이체(1)과 비교하여 5' UTR 영역에서 상이한 전사 변이체(2)로서 알려진 NP_001284707.1(단백질)을 포함한다. 전사체 1 및 2는 동일한 아형(1)을 코딩하고, 본 발명의 방법에 모두 이용될 수 있다. 모든 서열은 참조로서 본원에 병합된다.
핵에 국한되고 도처에 발현된 기타 인간 패밀리 구성원과는 달리, 관련 니코틴아미드 뉴클레오타이드 아데닐일트랜스퍼라제 2(nmnat2)인 이러한 효소는 세포질적이며, 뇌에서 우세하게 발현된다. 이 유전자의 대안적 스플라이싱은 2개의 전사 변이체를 생성한다.
인간 NMNAT2 아형(1)에 대한 NCBI 참조 서열(RefSeq)은, NM_015039.3(뉴클레오타이드) 및 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 NP_055854.1(단백질)을 포함한다. 모든 서열은 참조로서 본원에 병합된다.
관련 니코틴아미드 뉴클레오티드 아데닐일트랜스퍼라제 3(nmnat3)은 미토콘드리아에 국한된 단백질을 코딩하며, 또한 분자 샤페론으로서 신경보호 역할을 할 수 있다. 다종 아형(적어도 5개)를 암호화하는 대안적으로 스플라이싱된 전사 변이체(적어도 6개)는 이 유전자에서 관찰되었다.
인간 NMNAT3 아형(3)에 대한 NCBI 참조 서열(RefSeq)은 NM_001320510.1(뉴클레오티드) 및 뉴클레오티드 서열은 가장 긴 아형(3)을 코딩하는 전사 변이체 3이며, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 NP_001307439.1(단백질)을 포함한다. 모든 서열은 참조로서 본원에 병합된다.
NMNAT2는 축삭에서 중요한 NAD 생산 효소로 출현하고 있으며, 축삭 변성을 방지한다. 지속적인 스트레스는 RGCs에서 Nmnat2 발현에 부정적으로 영향을 미친다(D2 녹내장 그룹 4, q<0.05, 녹내장 변성 전에 검출 된 최종 단계). 이 감소는 녹내장에서 축삭 변성으로의 전환에서 중요 할 수 있다. NMNAT2 발현은 알츠하이머 질환이 있는 뇌에서 감소하고, 노화된 사후 인간 뇌에서 매우 다양한 우울증을 가지며, 이는 이러한 조건에 대한 다양한 취약성을 야기할 수 있다.
상이한 종의 동물에서 수 많은 관련 nmnat 서열(예를 들어, 하우스 마우스 Mus musculus)은 NCBI RefSeq 및 GenBank 등등과 같은, 공공 데이터베이스에서 쉽게 사용할 수 있다. 모든 서열은 본원에 참조로서 병합된다.
NAMPT를 사용하는 유전자 요법은 세포의 NAD+ 수준을 상승시키지만 축삭 세포 독성을 유발할 수 있다고 믿어진다. NAMPT는 NAM을 NMN으로 변환한 다음 NAD+로 변환하는 기능을 한다. 세포내 NAD+는 축삭 변성과 관련된 주요 분자이다. NAD+ 수치가 낮으면 축삭은 빠르게 변성된다. 좌골 신경 축삭에서 축색 손상 후에 NMN이 빠르게 축적된다는 것도 입증되었다. 이 모델 축삭 변성에서, NMN 수준은 12 시간 이내에 상승하고, 이어서 손상 후 36 시간에 신경 손상이 발생한다. FK866을 사용하여 NMN 생산 효소 NAMPT를 차단하면 잠재적으로 이 축삭 변성을 억제하여 NMN이 신경세포에 유독하다는 것을 암시한다. 축삭 변성은 NMN 의존성인 것으로 보이며, FK866을 이용한 NMN의 증가를 억제하는 것은 축삭 변성을 방지한다. 축삭 변성(이-광자 레이저 절단술(two-photon-laser axotomy))의 제브라피쉬 모델에서, FK866은 축삭 변성을 강력하게 지연시켰다. 신경염 변성(자궁 경부 신경절, superia cervical ganglion(SCG))의 세포 배양 모델에서 NMN(NMN을 NAMN으로 전환시키는 박테리아 효소 NMN 디아미다제의 과발현에 의함)을 신속하게 제거함으로써 축삭 변성을 강력하게 방지한다.
따라서, 본 발명은 NAMPT와는 달리 NMNAT를 이용한 유전자 요법이 안구 신경변성을 방지하는데 효과적이라는 예기치 않은 발견을 나타낸다.
따라서, 본발명자는 Nampt에 대하여 Nmnat1를 선택하였으며, Nampt 과발현은 NMN의 생산을 유도하는데, 이는, 적절히 제거하지 않으면, 신경세포에 유독하다.
Wld S
축삭 변성은 신경변성 질환의 일반적인 구성요소이다. 이러한 더 큰 정도의 원위 축삭 변성을 설명하려고 시도하는 두 가지 모델이 있다. 첫 번째는 변성이 신경 말단에서 역으로 퍼지는 "다잉백(dying back)"이다. 두 번째는 월러 변성인데, 병변 유형에 따라 어느 방향으로나 병변 부위에서부터 변성이 진행되어, 궁극적으로 병변 부위에서 먼 위치에서의 축삭이 손실되고 근위부분은 그대로 남게 된다. 엄밀히 말하더라도, 월러 변성은 축삭의 물리적 손상에 반응하여만 발생 하지만, 유사한 메커니즘이 그러한 손상이 발생하지 않은 질환에서 작동한다. 후자는 "월러-유사(Wallerian-like)" 변성이라고도 한다. 이후에 두 유형의 변성을 합쳐서 "월러 변성"이라고 한다.
최근에 발견된 WldS 마우스는 이러한 두 과정에 대한 이해를 향상시켰다. 이 동물들에서, 월러 변성은 야생형 동물들에서보다 대략 10배 느리다. 이 돌연변이도 축삭 말단의 "다잉 백(dyeing back)"을 수반하는 것으로 믿어지는 병리학을 지연시킨다는 것을 연구들이 보여 주었다. 그러므로 WldS 유전자는 축삭 변성의 두 모델 사이의 기계적 연결을 제공한다.
Wld S 유전자의 동정과 특성 규명에도 불구하고, 월러 변성의 분자 방아쇠(molecular trigger)에 대한 이해는 제한적이었다. 이 방아쇠에 대한 지식은 "다잉 백(dyeing back)" 신경변성 질환의 초기 단계에 대한 이해에 중대한 영향을 줄 수 있었다.
Wld S 와 함께 사용하는 마우스는 월러 변성을 지연시켰다. WldS 돌연변이는 마우스 염색체 4에서 발생하는 상염색체-우성 돌연변이이다. 이 유전자 돌연변이는 자연적으로 발생하는 85-kb 탠덤 삼중화(tandem triplication)로서, 두 관련된 유전자, 즉 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 아데닐일 트랜스퍼라제 1(Nmnat-1) 및 유비퀴틴화 인자 e4b(Ube4b)와, 18개의 아미노산을 코딩하는 링커 영역을 함유하는 돌연변이된 영역을 만든다. 생성된 단백질은 핵 내에 국지적이며(localized), 축삭에서는 검출될 수 없다.
돌연변이는 마우스에 해를 끼치지 않는 것처럼 보인다. 유일하게 알려진 효과는 월러 변성이 신경 손상 후 평균 3주까지는 지연된다는 것이다. 최근의 연구는, 돌연변이가 제대로 이해되지 않는 기작에 의해 축삭을 보호한다고 한다. 특정 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, WldS 돌연변이는 Nmnat(예를 들어, Nmnat-1) 단백질을 과발현 및/또는 국지화(localization)를 개선 및 NAD 합성을 증가시킬 것 같다.
소정 구체예에서, 상기 방법은 대상체에게 Nmnat(예를 들어, Nmnat-1, -2, 또는 -3) 또는 WldS을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함한다.
소정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 WldS 또는 이의 동등한 인간 서열을 코딩한다.
소정 구체예에서, 상기 방법은 대상체에게 NAM 또는 전구체, 및 WldS을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
소정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 대상체에 국소 투여된다. 예를 들어, 녹내장 치료를 위해, 제제를 환부의 눈에 국소적으로 전달할 수 있다.
벡터
소정 구체예에서, 폴리뉴클레오티는 바이러스 벡터 상에서 대상체에게 투여 된다. 예시적인 적합한 바이러스 벡터는 AAV 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 AAV 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 관심의 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 외인성 유전 물질로서 대상체에 도입될 수 있다. 그러한 종류의 유전자 요법은, 예를 들어, 신경세포 조직과 같은, 손상되거나 병이 있는 조직을 복구하는 것에 관한 방법에 사용될 수 있다. 요컨대, 아데노바이러스, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 유전자 전달 비히클(하기 참조)을 포함하는 임의의 적합한 벡터가 DNA 및/또는 RNA와 같은 유전 정보를 대상체에게 전달하는데 사용될 수 있다. 숙련된 사람은 유전자 요법에서 표적화되는 특정 유전자를 대체하거나 복구할 수 있다. 예를 들어, 질환 세포의 게놈 내의 비특이적인 위치에 정상 유전자를 삽입하여 비기능적 유전자를 대체할 수 있다. 다른 예에서, 비정상적인 유전자 서열은 상동성 재조합을 통해 정상 유전자 서열로 대체될 수있다. 대안적으로, 선택적인 역돌연변이는 정상 기능으로 유전자를 복귀시킬 수 있다. 추가적인 예는 특정 유전자의 조절을 변경(유전자가 온 또는 오프되는 정도)하는 것이다. 소정 구체예에서, 표적 세포(신경세포 줄기 세포)는 유전자 요법 접근법에 의해 생체외 처리되고, 이어서 포유동물, 바람직하게는 치료를 필요로 하는 인간에게 전달된다.
다양한 유형의 핵산 구조체에 의한 형질 감염 및 감염(예를 들어, 바이러스 벡터에 의함)을 포함하여, 유전자 조작 방법을 인식하는 어떠한 기술도 이용될 수 있다.
예를 들어, 화학적 물질 또는 생물학적 베터(바이러스)를 이용하여, 물리적 처리(예를 들어, 전기영동, 음파천공(sonoporation), 광학 형질감염, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 유체역학 전달, 나노입자, 마그네토펙션(magnetofection))에 의하여 대상체에 이종 핵산(예를 들어, DNA)을 도입할 수 있다. 화학적-기반 형질감염은 칼슘 포스페이트, 사이클로덱스트린, 중합체(예를 들어, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 중합체). 덴드리머와 같은 고도로 가지친 유기 화합물, 리포좀(양이온성 리포좀, 리포펙타민을 이용한 리포펙션과 같은 리포펙션, 등), 또는 나노입자(화학적 또는 바이러스성 기능화 유무에 관계없음)에 기반할 수 있다.
핵산 구조체는 관심의 핵산 분자를 포함하고, 일반적으로 그 핵산 분자가 도입된 세포 내에서 관심의 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있다.
소정 구체예에서, 핵산 구조물은, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 발현을 길항하는 핵산(예를 들어, siRNA, miRNA, shRNA , 안티센스 서열, 앱타머, 리보자임,안타고미르(antagomir), RNA 스폰지 등)과 같은, 유전자 산물을 코딩하는 핵산 분자가 표적화된 세포에서 핵산 분자의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 작동적으로 연결되는 발현 벡터이다.
특정 세포로 도입하기 위해 제조된 DNA 구조물은 전형적으로 세포에 의해 인식되는 복제 시스템, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 의도된 DNA 단편, 및 폴리펩티드-코딩하는 분절에 작동적으로 연결된 전사 및 번역 개시 및 종결 조절 서열을 포함한다. DNA 분절은 또 다른 DNA 분절과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사를 자극하면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 신호 서열을 위한 DNA는, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비-단백질로서 발현되는 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하여 있으며, 신호 서열의 경우에는 인접하여 있으며 판독 단계에 있다. 그러나, 전사가 인핸서에 의해 조절되는 코딩 서열을 갖는 인핸서를 인접할 필요가 없다. 편리한 제한효소 부위에서의 결찰에 의해 또는 이를 대신하여 삽입된 어댑터 또는 링커에 의해 연결을 수행한다.
적절한 프로모터 서열의 선택은 일반적으로 DNA 분절의 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 좌우된다. 적절한 프로모터 서열의 예는 당해 분야에 공지된 진핵세포 프로모터(예를 들어, Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, 2001을 참조)를 포함한다. 전사 조절 서열은 전형적으로 세포에 의해 인식되는 이종 인핸서 또는 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 CMV 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 복제 시스템을 포함하고, 전사 및 번역 조절 서열은 폴리펩티드 코딩 분절을 위한 삽입 부위와 함께 사용될 수 있다. 세포주 및 발현 벡터의 실시가능한 조합의 예는 Sambrook and Russell(2001, 상기 문헌) 및 Metzger et al.(1988) Nature, 334: 31-36에 기재되어 있다.
본 발명의 일부 양태는 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구조물 또는 발현 벡터의 사용에 관한 것인데, 상기 벡터는 유전자 요법에 적합한 벡터이다. 유전자 요법에 적합한 벡터는, Anderson(Nature, 392: 25-30, 1998); Walther 및 Stein(Drugs, 60: 249-71, 2000); Kay et al.(Nat. Med., 7: 33-40, 2001); Russell(J. Gen. Virol., 81:2573-604, 2000); Amado and Chen(Science 285:674-6, 1999); Federico(Curr. Opin. Biotechnol., 10:448-53, 1999); Vigna and Naldini(J. Gene Med., 2:308-16, 2000); Marin et al.(Mol. Med. Today, 3:396-403, 1997); Peng and Russell(Curr. Opin. Biotechnol., 10:454-7, 1999); Sommerfelt(J. Gen. Virol., 80:3049-64, 1999); Reiser(Gene Ther., 7: 910-3, 2000); 및 인용된 참고 문헌(모든 참조로서 병합됨)에 개시된 바와 같다. 예로서 레트로바이러스, 아데노바이러스(AdV), 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 수두 바이러스, 알파바이러스, 및 헤르페스 바이러스에 기초한 것과 같은, 통합 및 비통합 벡터를 포함한다.
특히 적합한 유전자 요법 벡터는 아데노바이러스(Ad) 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 이 벡터들은 많은 수의 분열 및 비분열 세포 유형을 감염시킨다. 또한, 아데노바이러스 벡터는 고도의 형질전환 유전자 발현이 가능하다. 그러나, 세포 진입후 아데노 바이러스 및 AAV 벡터의 에피솜 성질(episomal nature) 때문에, 이들 바이러스 벡터는 상기에 지시된 바와 같이 형질전환 유전자의 일시적인 발현만을 필요로 하는 치료 용도에 가장 적합하다(Russell, J. Gen. Virol., 81:2573-2604, 2000; Goncalves, VirolJ., 2(1):43, 2005). 바람직한 아데노바이러스 벡터는 Russell(2000, 상기 문헌 )에 의해 검토된 바와 같이 숙주 반응을 감소 시키도록 변형된다. AAV 유전자 전달의 안전성과 효능은 사람에서 광범위하게 연구되어 간, 근육, CNS, 및 망막에서 고무적인 결과를 얻었다(Manno et al., Nat. Medicine, 2006; Stroes et al., ATVB, 2008; Kaplitt, Feigin, Lancet, 2009; Maguire, Simonelli et al. NEJM, 2008; Bainbridge et al., NEJM, 2008).
AAV2는 인간과 실험 모델 모두에서 유전자 전달 연구를 위해 가장 잘 특성화된 혈청형 이다. AAV2는 골격근, 신경세포, 혈관 평활근 세포, 및 간세포에 대한 자연적 향성을 나타낸다. 아데노-관련 바이러스-기반 비통합 벡터의 다른 예는 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 유사형(pseudotyped) AAV를 포함한다. AAV8 및 AAV9와 같은, 비인간 혈청형의 사용은 대상체에서 이러한 면역학적 반응을 극복하는 데 유용할 수 있으며, 임상시험이 막 시작되었다(ClinicalTrials dot gov Identifier: NCT00979238). 간세포로의 유전자 전달을 위해, 아데노바이러스 혈청형 5 또는 AAV 혈청형 2, 7 또는 8은 효과적인 벡터이고, 따라서 바람직한 Ad 또는 AAV 혈청형인 것으로 보여진다(Gao, Molecular Therapy, 13:77-87, 2006).
본 발명에 적용하기 위한 예시적인 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 기반 발현 구조물이다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시키는 독특한 능력을 가지고 있다(Amado and Chen, Science 285:674-676, 1999). 렌티바이러스계 발현 구조물의 구성 및 사용 방법은 미국 특허 번호 제 6,165,782호, 제 6,207,455호, 제 6,218,181호, 제 6,277,633호, 제 6,323,031호 및 Curr. Opin. Biotechnol. 10:448-53, 1999) 및 Vigna et al.(J. Gene Med. 2:308-16, 2000)에 기재되어 있다.
일반적으로, 유전자 요법 벡터는, 뉴클레오티드 서열이 상술한 바와 같은 적절한 조절 서열에 작동적으로 연결되는, 발현될 본 발명의 유전자 산물(예를 들어, 폴리펩티드)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 점에 있어서 핵산 서열을 포함한다는 점에서 전술한 발현 벡터와 같을 것이다. 그러한 조절 서열은 적어도 프로모터 서열을 포함할 것이다. 유전자 요법 벡터로부터 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 프로모터는, 예를 들어 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 중간 조기 프로모터, 뮤린 모로니 백혈병 바이러스(murine Moloney leukaemia virus, MMLV) 루스 육종 바이러스로부터의 것들, 즉 또는 HTLV-1과 같은 바이러스 긴 말단 반복 프로모터(viral long terminal repeat promoter, LTRs), 원숭이 바이러스 40(simian virus 40, SV 40) 초기 프로모터, 및 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 추가적인 적합한 프로모터는 하기에 기재되어 있다.
작은 유기 또는 무기 화합물의 투여에 의해 유도될 수 있는 몇몇 유도성 프로모터 시스템이 기재되어 있다. 이런 유도성 프로모터는 중금속에 의해 제어되는 것들, 예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터(Brinster et al., Nature, 296:39-42, 1982; Mayo et al., Cell, 29:99-108, 1982), RU-486(프로게스테론 길항제)(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8180-8184, 1994), 스테로이드(Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5603-5607, 1993), 테트라사이클린(Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; U.S. Pat. No. 5,464,758; Furth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:9302-9306, 1994; Howe et al., J. Biol. Chem., 270:14168-14174, 1995; Resnitzky et al., Mol. Cell. Biol., 14:1669-1679, 1994; Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526, 1995) 및 VP 16의 활성화 도메인으로서의 tetR 폴리펩티드 및 에스트로겐 수용체의 리간드 결합 도메인으로 구성되는 키메릭 전사활성자(transactivator)를 기반으로 tTAER 시스템(Yee et al., 2002, US 6,432,705)을 포함한다.
RNA 간섭(하기 참조)에 의해 특정 유전자를 넉-다운(knock down)시키기 위한 소형 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적합한 프로모터는, 전술한 폴리머라제 Ⅱ 프로모터 이외에도, 폴리모라제 III 프로모터를 포함한다. RNA 폴리머라제 III(pol III)는 5S, U6, 아데노바이러스 VA1, Vault, 텔로머라제 RNA, 및 tRNA를 포함한 다양한 종류의 소형 핵 및 세포질 비-코딩 RNA의 합성을 담당한다. 이들 RNA를 코딩하는 많은 유전자의 프로모터 구조가 결정되었는데, RNA pol III 프로모터는 3 가지 유형의 구조에 속하는 것으로 밝혀졌다(검토를 위해 Geiduschek and Tocchini-Valentini, Annu. Rev. Biochem., 57: 873-914, 1988; Willis, Eur. J. Biochem., 212:1-11, 1993; Hernandez, J. Biol. Chem., 276:26733-36, 2001를 참조). siRNA의 발현에 특히 적합한 것은, 전사가 5'-측면 영역, 즉 전사 개시 부위의 상류에서만 발견되는 시스-작용 요소에 의해 유도되는 유형 3의 RNA pol Ⅲ 프로모터이다. 상향 서열 요소는 전형적인 TATA 상자(Mattaj et al., Cell, 55:435-442, 1988), 근위 서열 요소 및 원위 서열 요소(distal sequence element(DSE), Gupta and Reddy, Nucleic Acids Res., 19:2073-2075, 1991)을 포함한다. 유형 3 pol III 프로모터의 제어 하에 있는 유전자의 예는 U6 소형 핵 RNA(U6 snRNA), 7SK, Y, MRP, HI, 및 텔로머라제 RNA 유전자이다(예를 들어, Myslinski et al., Nucl. Acids Res., 21:2502-09, 2001).
유전자 요법 벡터는 선택적으로 제 2 또는 추가 폴리펩티드를 코딩하기 위한 제 2 또는 하나 이상의 추가 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 제 2 또는 추가 폴리펩티드는 발현 구조체를 함유하는 세포의 동정, 선별 및/또는 스크리닝을 허용하는(선택가능한) 마커 폴리펩티드일 수 있다. 이 목적에 적합한 마커 단백질는, 예를 들어, 형광 단백질 GFP, 및 선택 마커 유전자 HSV 티미딘 키나제(HAT 배지에서의 선택용), 세균성 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(하이그로마이신 B 상에서 선택용), Tn5 아미노글리코시드(G418 상에서의 선택용), 및 디하이드로폴레이트 환원 효소(dihydrofolate reductase(DHFR), 메토트렉세이트 상에서의 선택용), CD20, 저-친화성 신경 성장 인자 유전자이다. 이들 마커 유전자를 얻기 위한 원천 및 그 사용 방법은 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001에 제공되어있다.
대안적으로, 제 2 또는 추가 뉴클레오티드 서열은, 필요한 것으로 간주되는 경우, 형질 전환 세포로부터의 대상체를 치료할 수 있게 하는 비상 안전 기작(fail-safe mechanism)을 제공하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 자살 유전자로 종종 지칭되는 이러한 뉴클레오티드 서열은 전구약물을, 폴리펩티드가 발현되는 형질전환 세포를 사멸시킬 수 있는 독성 물질로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 코딩한다. 이러한 자살 유전자의 적합한 예는, 예를 들어, E. coli 시토신 디아미나제 유전자 또는 단순 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 및 베리셀라-조스터(Varicella-Zoster) 바이러스로부터의 티미딘 키나제 유전자들 중 하나인데, 그 경우 간사이클로비르(ganciclovir)가 대상체에서 IL-10 형질전환 세포를 사멸하는 전구약물로서 이용될 수 있다(예컨데, Clair et al., Antimicrob. Agents Chemother., 31:844-849, 1987을 참조).
눈의 유전자 요법에서 투여 경로
한 양태에서, 본 발명은 안구 변성 질환을 치료하기 위한 유전자 요법 방법을 제공한다. 당업자는 유리체내 투여 또는 안구내 투여를 수반하는 눈의 유전자 요법에 대한 경로를 인식할 것이다.
안구내 투여는 안구 내의 어디에서나 유전자 조성물을 전달하는 것이다.
바람직한 구체예에서, 유전자 조성물은 유리체내로 주사된다. 유리체내 투여는 눈의 유리체 구역, 즉 망막과 직접 인접한, 눈의 후방 부분을 구성하는 액체에 유전자 조성물을 직접 전달한다는 것이다. 소정 구체예에서, 주사 중에 유리체는 제거되어 약물을 위한 공간을 만든다.
유리체내 주사는 일반적으로 의사의 진료실에서 이루어지지만, 병원의 수술실에서도 행해질 수 있다. 환자는 일반적으로 프로파라카인, 리도카인, 등등과 같은 흔한 약물로(보통 점안액 또는 적신 스폰지/면봉) 국소 마취된다.
소정 구체예에서, 유전자 조성물은 망막하에(즉, 망막 밑에) 주입된다.
주사의 경우, 27-32 게이지의 바늘 크기가 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 바늘 크기는 30게이지이다. 바늘 주입은 눈에 제제를 주입하나 위험은 없는 대중적인 기술이다. 주사는 깊거나 표면적일 수 있다. 주사는 직선(즉, 눈의 표면에서 90도), 비스듬한(45-60도), 또는 이중-창(비스듬한, 직선)일 수 있다.
눈에서 유전자 요법
본 발명은 RGC 내 NAD+를 증가시키는 유전자 조성물을 이용한 유전자 요법을 제공한다. 눈은 소형이고(즉, 형질감염되는 세포가 적다), 쉽게 접근할 수 있으며, 부분적으로/거의 면역 특정화되고(즉, 면역 반응을 일으킬 기회가 적거나 없음), 다른 눈은 반대쪽 대조군 및 백업으로 기능한다.
눈이 안보이는 장애에 대한 몇 가지 눈-기반 유전자 요법 임상 시험이 진행되었다. 예를 들어, 레버 선천성 흑내장(Leber's Congenital Amaurosis)을 치료하기 위한 AAV2 벡터에 통한 RPE65 유전자의 유전자 요법은 III 상 임상 시험(Phase III clinical trial)에 있으며(NCT00481546, NCT00516477, NCT00643747 및 NCT00999609); 색소성 망막염 치료를 위한 AAV2 벡터를 이용한 MERTK 유전자의 유전자 요법은 I 상(NCT014822195)에 있으며; 스타가르트(Stargardt's disease)를 치료하기 위한 EIAV 렌티바이러스 벡터를 사용하는 ABCA4 유전자의 유전자 요법은 현재 II 상에 있으며(NCT01367444); 범맥락막위축을 치료하기 위한 AAV2 벡터를 이용한 유전자 REP-1의 유전자 요법은 현재 II 상에 있다(NCT02553135). 여러 클리닉의 임상 연구는 눈에의 유전자 전달이 안전하게 허용되는 것으로 나타났습니다.
병용 요법 - 추가 치료체
소정 구체예에서, 본 발명은 신경변성의 병용 요법 치료가 필요한 인간에게 신경 세포(예를 들어, RGC)에서 세포내 NAD+ 수준을 향상시키는 화합물 및 추가 치료제를 투여함으로써 신경변성의 병용 요법 치료 방법을 제공한다.
소정 구체예에서, 본 발명의 녹내장 치료를 위한 추가 치료제는 IOP를 강하하는 제제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 추가 치료제는 베타 차단제(티몰롤 말레이트, 티몰롤 반수화물, 레보부놀롤(Levobunolol) HCL, 메티프라놀롤 칼르테오롤롤(Metipranolol Carteolol), 베탁솔롤(Betaxolol), 등등), 비-선택적 아르레날린 작용제(예를 들어, 에피네페린, 디피베프린 HCL), 선택적 α-2 아드레날린 작용제(예를 들어, 아프라틀로니딘 HLC, 브리모니딘 타르트레이트, 및 브리모니딘 타르트레이트 인 프라이트(Brimonidine tartrate in Purite)), 또는 탄산 탈수효소 억제제(아세타졸아미드(경구), 아세타졸아미드(비경구), 메타졸아미드(경구), 도르졸아미드(국소), 및 브린졸아미드(국소)와 같은 CAI))를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
소정 구체예에서, 추가 치료제는 프로스타글란딘 유사체(예를 들어, 라타노프로스트, 트라바프로스트, 및 비마타프로스트(프로스타미드)), 부교감신경흥분 작용제(필로카르핀 HCL과 같은 직접 콜린성 작용제; 및 에코티오페이트 아이오다이드, 데메르카리움 아이오다이드, 및 파이소스티그민 이소플루오로페이트와 같은 간접 콜린성 제제를 포함함), 및 카르바콜(혼합 직접 작용제/아세틸콜린 이형제)를 포함한다.
소정 구체예에서, 추가 치료제는 편리성 증가, 순응도, 효능 및 비용의 잠재적 이점을 제공하는 고정 병용 약물을 포함한다. 고정 병용은 프로스타글란딘 유사체, 알파-아드레날린 수용체 작용제, 또는 국소 탄산 탈수효소 억제제와 병용되는 국소적 베타 차단제를 포함할 수 있다. 예시적인 고정 병용은(1) 도르졸라미드 하이드로클로라이드 2% 및 티몰롤 말레이트 안과용 용액 0.5%(예를 들어, 코솝(Cosopt), 현재 일반 의약품으로 사용가능)와 같은 드로졸라이드 및 티몰롤,(2) 브리모니딘 타르트레이트 0.2%, 티몰롤 말레이트 안과용 용액 0.5%(예를 들어, 콤비간(Combigan))과 및 브리모니딘 타르트레이트 0.2% 및 브린졸라미드 1%(예를 들어, 심브린자(Simbrinza))와 같은, 브리모니딘과 티몰롤 또는 브린졸라미드, 또는(3) 라타노프로스트 및 티몰롤을 포함한다.
소정 구체예에서, 추가 치료제는 경구 글리세린과 같은 고삼투압제, 이소소르비드, 및 유리체 부피를 감소시킴으로써 IOP를 신속하게 낮추는 유리체내 만닌톨을 포함한다. 그것들은 혈액 안구 장벽을 넘지 않으므로, 유리체를 탈수하는 삼투압을 발휘한다. 고삼투압 제제는 일반적으로 더 확실한 치료가 제공될 때까지 일시적으로 높은 안압을 감소시키기 위한 심각한 상황에서 사용된다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명된다.
실시예
실시예 1: 녹내장 감수성 유전자/경로의 확인
(A) 인간의 신경변성을 모방한 마우스 모델 선택
DBA/2J D2(D2) 마우스 모델을 선택하여 인간의 신경변성의 병인을 조사했다. D2 마우스는 널리 사용되는 녹내장 모델로, 인간 녹내장의 특징을 개략적으로 가지고 있다. D2 마우스에서 두 유전자(Gpnmb R250X , Tyrp1 b )의 돌연변이 대립 유전자는 진행형 홍채 질환을 일으킨다. 이 홍채 질환은 홍채 간질 위축(인간의 본질적인 홍채 위축과 매우 유사 함)과 홍채 색소 분산 표현형(인간의 색소 분산 증후군과 매우 유사함)이라는 두 가지 주요 구성원을 가진다. 본질적인 홍채 위축과 색소 분산 증후군은 모두 인간에게 안압 상승과 녹내장을 유발한다. D2 눈의 홍채 질환은 8-9월령까지 대부분의 눈에서 연령-관련된 안압(IOP) 상승을 일으킨다. 시신경 변성은 12월령까지 거의 완료한다(일반적으로 70% 이상의 신경이 심한 손상을 입음).
본 연구에서, D2 마우스는 연령-관련된 IOP 증가 후에 안구 신경변성을 겪는다는 것이 확인되었다. 특히, 3개 연령 즉, 4, 9, 12월령의 D2 마우스를 이용했다.
(i) 4월령 D2 마우스는 정상 안압(IOP)(즉, 10-13 mmHg)을 나타내고 녹내장이 없는 것으로 확인되었다(즉, 이들 마우스는 IOP 발달 이전 및 녹내장 전의 시기이며, 신경변성을 검출되지 않음). 이 연령에서, D2 마우스는 대조군 마우스와 구별할 수 없다.
(ii) 9월령 D2 마우스는 높은 안압(즉, 21 mmHg 이상)을 나타내지만 신경변성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 이 발달 단계에서 기존의 녹내장은 부존재 하지만, 9월령 D2 마우스의 눈은 "초기 녹내장"을 가진 것으로 정의된 분자 변화를 겪는다.
(iii) 12월령 D2 마우스는 가변적인 높은 IOP(즉, 14 에서 21 mmHg 이하)를 나타내고 신경변성이 명백한 것으로 확인되었다(즉, 녹내장, 60% 이상의 눈이 심각한 신경변성을 가짐).
(iv) 대조군 D2-Gpnmb + 마우스를 이 연구에서 사용하였는데, 이는 이들 마우스가 높은 안압 또는 노화에 따른 신경변성을 나타내지 않기 때문이다. 이들 마우스는 Gpnmb R250X 돌연변이를 일으키는 홍채 질환의 교정을 제외하고는 D2 마우스와 동일하다.
(B) D2 마우스의 망막에서 망막 신경절 세포(RGC)의 분리
(i) 4월령 DBA/2J D2 마우스,(ii) 9월령 DBA/2J D2 마우스,(iii) 나이, 성별, 종이 매치된 D2-Gpnmb + 야생형 대조군의 눈에서 망막을 수확하였다.
우선 망막 샘플을 항체 칵테일로 염색하였다. 망막 신경절 세포(RGCs)는 Thy1.2+ 세포로 정의하였다(Cd11b-, Cd11c-, Cd31-, Cd34-, Cd45.2-, GFAP-, DAPI-에서 음성). FACS 양성 RCG를 도말하고, RGC 상태를 확인하기 위해 SNAP-25 및 β-튜불린(RGC의 특정 마커)으로 염색하였다.
형광 활성 세포 분리 분석(fluorescence-activated cell sorting, FAC sorting)를 이용하여, 이들 세 그룹의 마우스에서 새롭게 수확된 망막에서 RGC를 분리하였다. 도 27A-27H 참조.
(C) RNA 시퀀싱
녹내장에 이르는 감수성 유전자/경로를 확인하기 위하여, 상기(B)에서 얻은 RGC의 RNA로부터 RNA-시퀀싱(RNA-seq)을 실시하여 신경변성에 선행하는 RGC 내 매우 초기의 분자 변화를 밝혔다. RNA로부터 증폭 dscDNA 라이브러리(이중-가닥 카피 DNA)를 생성하고 샘플 당 3500만 리드(read)의 깊이에서 판독하였다. 데이터 분석은 q<0.05의 오류 발견률(false discovery rate(FDR), q)로 수행하였다. 모든 그룹(B)의 샘플을 성공적으로 증폭하고 시퀀싱하였다.
4, 9 및 12월령 D2 및 D2-Gpnmb +의 눈에서 신경 망막의 추가 대사 프로파일링을 수행하였다. 대사 프로파일링은 제조업자의 권고에 따라 표적화 분석을 사용하여 수행하였다. 다음의 대사산물을 프로파일링하였다: NAD+/NADH(즉, 총 NAD, NAD(t)), GSH/GSSG(즉, 총 글루타치온, 글루타치온(t)), 피루베이트.
(D) 계층적 클러스터링(HC)
본 연구에서, 표본 당 3천 5백만 리드의 깊이에서, 분리된 RGC로부터 RNA를 시퀀싱하였다. 미감식(unsupervised) 계층적 클러스터링(HC)은 질환의 초기 단계에 있고 연령이 일치하는 D2-Gpnmb + 또는 어린 대조군과 형태학적으로 구별할 수 없는 샘플들에서 분자적으로 결정된 녹내장 단계를 정의하는데 사용되었다.
HC는 9월령 D2 샘플의 4개의 구별된 그룹(즉, 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 그룹 4)을 정의하였다. 그룹 1은 모든 대조군 샘플과 클러스터링하였으며, 분자 수준에서 녹내장이 검출되지 않는 D2 RGC를 나타낸다. 그룹 2 내지 그룹 4의 모든 샘플은 질환의 초기 단계에 있었고, 대조군(전사체 수준에서의 질환 진행이 더 크다)과의 거리가 멀어짐에 따라 그룹 수가 증가하는 것이 관찰되었다(도 1, 2A 및 2B).
질환이 진행됨에 따라, 미토콘드리아 리드에서 가장 두드러졌던 전사체 존재도가 증가하였다(도 3A). 핵 및 미토콘드리아 게놈에 의해 코딩되는 미토콘드리아 분자의 상대적 비율에 있어서의 불균형은 미토콘드리아 기능에 부정적 영향을 미친다. D2 그룹 2 내지 4에서, 미토콘드리아 단백질을 코딩하는 유전자의 차등 발현, 및 미토콘드리아 기능장애 및 산화적 인산화 경로에서 차등적으로 발현된 유전자(연령 및 성별-매치된 D2-Gpnmb + 대조군에 비교됨)의 상당한 농축은 RGC 내의 미토콘드리아 비정상을 추가로 지시한다(도 3A -3J 및 3K 및 하기 표 1-3).
전사체(예를 들어, 모든 전사된 유전자)에 대한 총 리드(read) 존재도는 핵 전사체(즉, 핵 내에서 코딩됨) 또는 미토콘드리아 전사체(즉, 미토콘드리아에서 코딩됨)으로부터 유래되는 리드들로 분열된다. 리드 존재도는 D2 RGC의 양 전사체에서 증가하였으나, 미토콘드리아-유래 리드가 가장 풍부하였는데, 이는 미토콘드리아 기능장애를 선호하는 불균형을 나타낸다(도 3A).
상위 농축 경로(IPA)는 D2 그룹 2, 3 및 4에서 나타난다. 차등적으로 발현된(differentially expressed, DE) 유전자가 하나만 있기 때문에, D2 그룹 1에는 농축 경로가 없다. 이러한 D2 그룹 1은 녹내장 손상을 겪지 않은 눈을 나타낸다(도 3B).
핵(미토콘드리아는 아님) 유전자에 의해 코딩된 모든 미토콘드리아 단백질의 플롯을 준비하였다. DE 유전자는 적색으로 표시되어 있다. 비-DE 유전자는 회색으로 표시되어 있다. 미토콘드리아 단백질을 코딩하는 핵 유래 전사체의 존재도가 증가하는 것은 미토콘드리아 전환(turnover) 또는 기능에서의 불균형을 나타낸다(도 3C).
미토콘드리아 분열 유전자(Dnm1 및 Fis1)의 발현이 증가한다는 것은 녹내장 초기에서 미토콘드리아 내에서의 분열 전의 사건을 가리킨다. 분열 증가는 미토콘드리아 반전 및 질환의 증가와 관련이 있다. 미토콘드리아 융합/분열 역학에 영향을 미치는 돌연변이는 일반적으로 치명적이거나 신경계 상태를 일으킨다(우성 시신경 위축, Charcot-Marie-Tooth병을 포함하나 이에 제한되지 않음)(도 3D).
미토콘드리아의 언폴드(unfolded)_단백질 반응과 관련 있는 유전자의 발현이 증가했다. 이는 일반적으로 종종 세포사멸(프로그램된 세포 사멸)에 선행하는 세포 내에서의 스트레스 반응이다(도 3E).
미토콘드리아-관련 경로 내 유전자의 개별적 플롯을 준비하였다. DE 유전자는 빨간색으로 표시되어 있고, 비-DE 유전자는 회색으로 표시되어 있다. 특히 세포 내의 에너지 위기를 가리키는 산화적 인산화 및 활성 산소종 대사에서의 경로를 거친 미토콘드리아 유전자의 상향조절을 주목한다(도 3F) .
망막으로부터의 미토콘드리아 사멸 전의 분자 시토크롬 C의 단백질 분석(Western blot)은 시토크롬 C가 초기 녹내장 동안 유전자와 단백질 양쪽 수준에서 상향조절되어, 12개월까지 상당히 상향조절되었다는 것을 나타낸다(도 3G 및 3I).
또한 단백질 분석은 망막 내에서 eIF2의 상향 조절이 있음을 확인해준다(도 3H 및 3J) .
도 1, 3A-3E, 3K 4A 및 4B에서의 미토콘드리아 복합체 유전자 리스트
복합체 유전자 복합체 유전자
I ENSMUSG00000064341 I ENSMUSG00000064345
I ENSMUSG00000064360 I ENSMUSG00000064363
I ENSMUSG00000064367 I ENSMUSG00000064368
I ENSMUSG00000065947 I Ndufa1
I Ndufa10 I Ndufa11
I Ndufa12 I Ndufa13
I Ndufa2 I Ndufa3
I Ndufa4 I Ndufa4l2
I Ndufa5 I Ndufa6
I Ndufa7 I Ndufa8
I Ndufa9 I Ndufab1
I Ndufaf1 I Ndufaf2
I Ndufaf3 I Ndufaf4
I Ndufaf5 I Ndufaf6
I Ndufaf7 I Ndufb10
I Ndufb11 I Ndufb2
I Ndufb3 I Ndufb4
I Ndufb5 I Ndufb6
I Ndufb7 I Ndufb8
I Ndufb9 I Ndufc1
I Ndufc2 I Ndufs1
I Ndufs2 I Ndufs3
I Ndufs4 I Ndufs6
I Ndufs7 I Ndufs8
I Ndufv1 I Ndufv2
I Ndufv3
II Sdha II Sdhb
II Sdhc II Sdhd
III Cyc1 III ENSMUSG00000064370
III Uqcr10 III Uqcr11
III Uqcrb III Uqcrc1
III Uqcrc2 III Uqcrfs1
III Uqcrh III Uqcrq
IV Cox4i1 IV Cox4i2
IV Cox5a IV Cox5b
IV Cox6a1 IV Cox6b1
IV Cox6b2 IV Cox6c
IV Cox7a2 IV Cox7a2l
IV Cox7b IV Cox7c
IV Cox8a IV ENSMUSG00000064351
IV ENSMUSG00000064354 IV ENSMUSG00000064358
V Atp5a1 V Atp5b
V Atp5c1 V Atp5d
V Atp5e V Atp5f1
V Atp5g1 V Atp5g2
V Atp5g3 V Atp5h
V Atp5j V Atp5j2
V Atp5k V Atp5l
V Atp5o V Atp5s
V Atp5sl V ENSMUSG00000064356
V ENSMUSG00000064357
도 1, 3A-3E, 3K, 4A, 4B, 5A, 11-14, 20A, 20B에서 경로 구간에 포함된 유전자
경로 유전자 목록
지방산 대사 Abcd2, Pex2, Cyp4f18, Slc27a2, Acot5, Slc27a5, Acox1, Acaa1a,Acot2, Acot4, Slc27a4, Elov12, Acsbg1, Acot3, Pex5, Hsd17b4,
Pla2g4f, Edn1, Edn2, Mif, Ptgis, Cd74, Ptgds, Pnpla8, Ptges2,
Tbxas1, Ptges3, Ptges, Ptgs1, Hpgds, Fam213b, Ptgs2, Phyh,
Pex13, Hacl1, Hao1, Acs15, Cpt1a, Slc27a6, Slc27a1, Slc27a3,
Acot1, Acsl4, Acsbg2, Acs16, Acsl1, Acs13, Acsm5, Fa2h, Ppara,
Ghr, Prkar2b, Acaa2, Pla2g15, Agpat6, Acsf2, Snca, Them4,
Amacr, Cry1, Acsf3, Alkbh7, Cyb5a, Stat5b, Lypla1, Acnat2,
Acox2, Aacs, Ankrd23, Cpt2, Baat, Abhd5, Cyp4a10, Crot, Acnat1,
Angptl3, Mecr, Acsm4, Lypla2, Acot11, C3, Gpam, Sgpl1, Tnxb, Th,
Apoa2, Crat, Aasdh, Cyp4a12a, Echdc2, Acsm2, Acaa1b, Stat5a,
Crem, Ucp3, Ndufs6, Them5, Acot12, Scd1, Scd4, Ch25h, Lipc,
Prkag1, Fads3, Prkag3, Acaca, Brca1, Ndufab1, Mlycd, Mcat,
Prkaa2, Hnf1a, Acsm1, Sc5d, H2-Ke6, Agmo, Hsd17b12, Lp1,
Mg1m, Acsm3, Prkab2, Abcd3, Msmo1, Prkaa1, Fasn, Pla2g1b,
Olah, Cbr4, Prkag2, Pccb, Acly, Nr1h3, Fads6, Acacb, Degs1,
Prkab1, Abcd1, Hadhb, Slc25a17, Cpt1c, Eci1, Lep, Acox3, Bdh2,
Cpt1b, Adipoq, Decr1, Ppard, Eci3, Echs1, Ech1, Acadm, Pex7,
Hadha, Ehhadh, Hadh, Sesn2, Fads1, 4833423E24Rik, Fads2,
Elov15, Elov13, Decr2, Lta4h, Ltc4s, Cyp4f13, Alox5, Ncf1, Hpgd,
Pdpn, Ptgr1, Ptgr2, Tnfrsf1a, Pdpn, Lpin1, Lpin2, Eci2, Faah,
Acot7, Lpin3, Dld, Lias, Lipt2, Cyp4v3, Adh7, Elov17, Elov14,
Elovl1, Elov16, Alox15, Sstr4, Cyp1b1, Cyp2j5, Cyp4f14, Cyp2c54,
Cyp2d12, Cyp2d11, Cyp2d34, Cyp2d22, Cyp2d9, Cyp2d40,
Cyp2d10, Mapk3, Cyp2j13, Aloxe3, Alox8, Cyp2j9, Cyp2j11,
Alox12b, Alox12e, Cyp2j8, Cyp2ab1, Alox12, Cyp2j6, Cyp2j12,
Daglb, Dagla, Cyp2c55, Cyp2c50, Rnpepl1, Prg3, Cotl1, Ggt5,
Fcer1a, Syk, 2010111I01Rik, Ggt1, Mgst2, Pla2g5, Rnpep,
Alox5ap, Pla2g3, Cyp2c69, Cyp2g1, Cyp2c44, Cyp2b23, Cyp2f2,
Cyp2c70, Cyp2c66, Cyp2a22, Cyp2b19, Cyp2a12, Cyp2b13,
Cyp2e1, Cyp2c38, Cyp2b10, Cyp2c40, Cyp2c39, Cyp2t4, Cyp2b9,
Cyp2c67, Cyp2c29, Cyp2c37, Cyp2c68, Cyp2s1, Cyp2c65, Gcdh,
Hao2, Mapk14, Adipor2, Cygb, Pparg, Adipor1, Por, Acss1, Acss2,
Ces1f, Ces1d, Tecr, Hacd3, Hacd2, Pecr, Hacd1, Hacd4, Acad10,
Acads, Acad9, Acadvl, Etfdh, Acad8, Acad12, Ivd, Acoxl, Etfa,
Acadl, Acadb, Acad11, Cyp4a31, Cyp4a32, Lipe, Asah2, Myo5a,
Plp1, Qk, Tyrp1, Thns12, Aldh5a1, Oxsm, Scd3, Scd2
포도당대사 Akt1, Ppp1r3b, Mtor, Ppp1r3e, Ppp1ca, Ppp1r3d, Ppp1r3f,
Ppp1cb, Inpp5k, Gnmt, Nr3c1, Nln, Lep, Pdk2, Fbp1, Slc35b4,
Acadm, Rora, Mlycd, Lcmt1, Igfbp3, Fam132a, Igfbp5, Adipoq,
Pdk1, Sirt1, Ncoa2, C1qtnf1, Pdk3, Pdk4, Igfbp4, Tff3, Nkx1-1,
Adipor1, Rorc, Irs2, Irs1, Mup4, Pmaip1, Rgn, Mup9, Akt2,
Mup20, Mup12, Mup19, Mup16, Foxa2, Ranbp2, Park2, Cox11,
Gckr, Midn, Bad, Dusp12, Pfkfb1, Nr1d1, Foxo1, Tcf7l2, Supt20,
Kat2b, Gcg, Wdr5, Kat2a, Pgam1, Tigar, Enpp1, Grb10, Pask,
Clk2, Sik1, Serpina12, C1qtnf3, Lepr, Il6, Gck, Smek1, Ppara,
Arp19, Stk11, Smek2, Ptpn2, Pth, C1qtnf2, Dyrk2, Insr, Igf2, Ins2,
Ppp1r3g, Igf1, Epm2aip1, Adra1b, Pomc, Khk, Gcgr, Phlda2, Ogt,
Sesn2, Trp53, Actn3
산화성인산화 Ndufb11, Atp6v1h, Cox6b1, Atp6v1b1, Atp6v0b, Atp4a, Atp4b,
Atp5a1, Atp5b, Atp5c1, Atp5f1, Atp5g1, Atp5j, Atp5k, Atp6v1a,
Atp6v1b2, Atp6v0d1, Atp6v1e1, Atp6v0e, Atp6v0a1, Atp6v0c,
Cox17, Cox4i1, Cox5a, Cox5b, Cox6a1, Cox6a2, Cox6c, Cox7a1,
Cox7a2, Cox7c, Cox8a, Cox8b, Atp6v0a4, Atp6, Atp8, Cox1, Cox2,
Cox3, Cytb, Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd41, Nd5, Nd6, Ndufa2,
Ndufa4, Ndufs4, Ndufv1, Atp12a, Cox7a2l, Atp6v0a2, Uqcrq,
Uqcrc1, Ndufs8, Cox15, Ndufs2, Ndufs1, Atp5g3, Ndufb6,
Gm4943, Atp6v0d2, Tcirg1, Atp5l, Atp5o, Cox6b2, Atp6v1g3,
Ndufs6, Ndufa412, Ndufa1, Atp6ap1, Atp5j2, Ndufs5, Atp5d,
Ndufb5, Sdhc, Ndufa3, Ndufa9, Cox7b, Atp6v1f, Uqcr10, Ndufb9,
Atp6v1g2, Atp6v1g1, Atp6v1c1, Ndufc1, Ndufa12, Ndufa7, Cyc1,
Ndufb3, Uqcrh, Uqcr11, Uqcrfs1, Ndufb7, Sdhd, Sdha, Uqcrc2,
Atp5e, Ndufa6, Ndufa13, Ndufb8, Ndufa10, Uqcrb, Sdhb, Ppa1,
Atp5g2, Ndufb4, Ndufc2, Ndufb2, Ndufa5, Ndufb10, Ndufs3,
Ndufa8, Atp6v1c2, Cox11, Ndufa11, Ndufab1, Cox10, Atp5h,
Ndufv2, Atp6v1d, Ppa2, Atp6v1e2, Ndufs7, Cox8c, Atp6v0e2, Lhpp,
Cox7b2, Ndufv3, Cox4i2, ENSMUSG00000064341,
ENSMUSG00000064345, ENSMUSG00000064360,
ENSMUSG00000064363, ENSMUSG00000065947,
ENSMUSG00000064367, ENSMUSG00000064368,
ENSMUSG00000064370, ENSMUSG00000064351,
ENSMUSG00000064354, ENSMUSG00000064358,
ENSMUSG00000064357, ENSMUSG00000064356
산화 방지제대사 Gpx1, Gpx2, Gpx3, Gpx4, Gpx5, Gpx6, Gpx7, Gstk1, Gstp1, Ehd2,
Prdx1, Prdx2, Prdx3, Prdx4, Prdx5, Prdx6, Apc, Cat, Ctsb, Duox1,
Epx, Lpo, Mpo, Ptgs1, Ptgs2, Rag2, Serpinb1b, Tpo, Alb, Gsr,
Sod1, Sod3, Srxn1, Txnrd1, Txnrd2, Txnrd3
ROS 신진 대사 Sod1, Sod2, Sod3, Ccs, Cyba, Ncf1, Ncf2, Nos2, Nox1, Nox4,Noxa1, Noxo1, Recql4, Scd1, Ucp2, Aox1, Fmo2, Il19, Il22, Als2,
Apoe, Cat, Ccl5, Ctsb, Duox1, Epx, Ercc2, Ercc6, Fth1, Gclc, Gclx, Gpx1, Gpx2, Gpx3, Gpx4, Gpx5, Gpx6, Gpx7, Gsr, Gss,
Hmox1, Hspa1a, Idh1, Krt1, Mpo, Nqo1, Park7, Prdx1, Prdx2,
Prdx6, Prnp, Psmb5, Sod1, Sqstm1, Tpo, Txn1, Txnip, Txnrd1,
Txnrd2, Ucp3, Xpa
DNA 손상수리 Brca2, Ddb2, Dclre1a, Ercc1, Ercc2, Fancc, Lig1, Nthl1, Ogg1,
Pcna, Pole, Rpa1, Trp53, Xpa, Xpc, Apex1, Fen1, Lig1, Mbd4,
Mpg, Nthl1, Ogg1, Parp1, Parp2, Pcna, Pole, Trp53, Ung, Xrcc1,
Wrn, Abl1, Exo1, Mlh1, Mlh3, Msh2, Msh3, Pcna, Pms2, Atm, Blm,
Brca1, Brca2, Chek1, H2afx, Hus1, Lig1, Mdc1, Mlh1, Mre11a,
Nbn, Prkdc, Rad50, Rad51, Rad52, Rpa1, Trp53bp1, Xrcc2, Xrcc6,
Atrx, Brip1, Chek2, Fanca, Fancd2, Fancg, Gadd45a, Gadd45g,
Mgmt, Polh, Poli, Pttg1, Rad1, Rad17, Rad18, Rad21, Rad51c,
Rad51b, Rad9a, Rev1, Rnf8, Smc1a, Smc3, Sumo1, Topbp1, Xrcc3
미토콘드리아수송 Aip, Bak1, Bcl2, Bcl2l1, Bnip3, Cpt1b, Cpt2, Dnajc19, Timm10b,
Grpel1, Hsp90aa1, Hspd1, Immp2l, Mfn2, Mipep, Mtx2, Stard3,
Trp53, Tspo, Ucp1, Ucp2, Ucp3
(E) IPA 분석에 근거한 상위 농축 경로
표 5는 IPA 분석에 근거한 10개의 가장 농축된 경로를 나열한다. 2016년 7월 25일에 출원한 U.S.S.N. 62/366,211의 도 1은 D2 마우스와 D2-Gpnmb + 대조군 사이의 상위 농축 경로에 대한 예비적인 분석 결과를 제공한다(이의 개시 내용은 참조로서 본원에 병합됨).
가장 농축된 10개의 경로(IPA 분석)
랭킹 경로 비교 -log p 값
1 EIF2의 신호전달 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 47.6
2 산화적 인산화 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 26.6
3 미토콘드리아 기능장애 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 23.5
4 eIF4 및 p70S6K의 신호전달의 조절 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 19.7
5 mTOR 신호 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 18.3
6 광전도 경로 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 8.8
7 대식세포 및 단핵 세포에서의 Fcγ 수용체-매개 식균 작용 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 6.3
8 IL-8 신호전달 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 5.1
9 GABA 수용체 신호전달 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 4.9
10 헌팅톤 질환 신호전달 D2 Group 2 vs. D2-Gpnmb + 4.7
랭킹 경로 비교 -log p value
1 EIF2 신호전달 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 30.4
2 산화적 인산화 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 21.4
3 미토콘드리아 기능장애 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 17.4
4 mTOR 신호 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 13.5
5 광전도 경로 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 11.8
6 eIF4 및 p70S6K 시그널링 조절 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 11.6
7 글루타메이트 수용체 신호 전달 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 5.6
8 단백질 키나아제 A 신호전달 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 5.5
9 시냅스 장기간 강화 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 5.5
10 심장 β- 아드레날린 신호전달 D2 Group 3 vs. D2-Gpnmb + 5.3
랭킹 경로 비교 -log p 값
1 EIF2 신호전달 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 24.9
2 미토콘드리아 기능장애 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 23.7
3 산화적 인산화 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 20.9
4 축삭 가이드 신호전달 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 14.0
5 eIF4 및 p70S6K 신호전달의 조절 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 13.2
6 mTOR 신호전달 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 12.3
7 신경세포에서의 CREB 신호전달 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 11.0
8 Rho 패밀리 GTPases에 의한 신호전달 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 9.35
9 헌팅톤병 신호전달 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 9.1
10 Stathmin1에 의한 유방암 조절 D2 Group 4 vs. D2-Gpnmb + 9.0
경로 분석은 eIF2 및 mTOR 신호전달 전사체의 풍부화를 확인하였는데(도 3B 및 3F), 여기서 eIF2 신호전달이 그룹 2에서 가장 농축된 경로(대조군에 대하여 첫 번째로 구별가능한 단계)인 것을 확인하였다.
미토콘드리아 분열 유전자(Dnm1 및 Fis1)의 상당한 상향조절(도 3D) 및 미토콘드리아의 언폴드(unfolded) 단백질 반응(UPRmt)의 유의한 변화가(도 3E)가 있었으며, 이는 미토콘드리아 기능장애를 추가적으로 나타낸다.
(F) 형태는 미토콘드리아 비정상을 보여준다
이 연구에서, 이러한 마우스의 망막에 전자 현미경(electron microscopy, EM)을 수행하여 형태학적인 변화를 평가하였다. EM은 현재 세포내 소기관(미토콘드리아 등)의 형태를 연구할 수 있게 하는 최고의 해상도를 제공한다. EM은 대조군 RGC가 아닌, D2 RGC의 덴드라이트의 미토콘드리아 크리스타 부피가 감소된 기능장애 미토콘드리아를 밝혔다(도 4A 및 4B). 이러한 미토콘드리아 EM 발견은 9월령 D2 망막에서 시냅스 손실과 일치하는데, 패턴 망막전위도 진폭(pattern electroretinogram amplitude(PERG), 인간 환자와 동물 모두에서 RGC 활성의 민감한 측정치)을 초기에 감소시키고(도 14), 망막 시토크롬 C 수준을 증가시킨다(도 3G).
이러한 데이터는 미토콘드리아 교란이 유전된 연령-관련 녹내장에서 생체내 RGC 내에서 발생하는 최초의 변화 중 하나임을 분명히 보여준다. 현재 발견은, 배양된 세포가 압력을 받으면 미토콘드리아의 비정상을 겪는다는 보고된 시험관내 연구와 일치한다. 그러나 체외 연구는 미토콘드리아 비정상이 녹내장에서 생체 내에서 어떻게 빨리 발생하는지를(본 발견이 설정하는 동안) 설정하지 못한다.
요약하면, 현재의 RNA-seq 연구는 검출불가능한 신경변성 표현형을 가진 녹내장이 있기 쉬운 눈의 RGC에서 전사과정과 미토콘드리아 기능장애를 나타냈다. 미토콘드리아 기능장애는 표적 대사 분석 및 EM을 통해 확인되었으며, 초기 에너지 위기와 함께 녹내장 초기에 비정상적인 미토콘드리아를 보여 주었다.
실시예 2: 대사 프로파일링
질환의 전 및 질환의 초기 단계(즉, 4월령(녹내장 전), 신경변성 없이 높은 IOP가 존재하는 9월령, 및 대다수의 눈에서 신경변성이 존재하고 심각한 12월령) 동안에, D2 마우스(대조군 D2-Gpnmb + 마우스에 비교)에 존재하는지를 판단하기 위해, 신경 망막의 대사 프로파일링을 실시하였다.
4월령, 9월령, 12월령 D2 및 D2-Gpnmb + 눈에서 추가적인 신경 망막의 대사 프로파일링을 실시하였다. 제조업자의 권고에 따라 표적 분석을 이용하여 대사 프로파일링을 실시하였다. 다음의 대사산물을 프로파일링하였다: NAD+/NADH(즉 총 NAD, NAD(t)), GSH/GSSG(즉, 총 글루타티온, 글루타티온(t)), 및 피루베이트. 모든 프로파일링된 대사산물에서 연령과 관련된 유의한 감소가 있었다. 이러한 대사 프로파일 변화는, 임의의 검출가능한 신경변성 표현형 전에 일어나고 연령-매치된, 녹내장이 없는, 대조군 D2-Gpnmb + 망막에서도 발생한다(도 5A-D).
이들은 세포 대사 및 세포 스트레스로부터의 보호에서 중요한 분자이기 때문에, 이러한 연령에 따른 감소는 망막 신경을 스트레스 및 미토콘드리아 기능장애와 관련된 질환으로 감작화하리라 예상된다.
우리의 데이타는 HIF-1α(교란된 산화환원 상태 동안에 중요한 대사 조절자)가 녹내장에서 신경절 세포층에서 일찍 유도되었음을 보여준다(RNA-seq 및 면역염색에 의하여, 도 6A 및 도 6B). 이것은 RGC가 녹내장에서 교란된 대사(및 후속적으로 활성 산소종의 과도한 생성)를 일찍 겪는다는 것을 제안한다.
안압 상승, 미토콘드리아 기능장애, 대사산물 고갈(특히 NAD), 및 세포 스트레스 사이의 연관성을 연구하기 위해, 초기 녹내장에서 DNA 손상과 PARP(폴리-ADP-리보스 중합 효소)의 역할을 조사하였다. PARP는 DNA 손상에 반응하며 세포 내에서 NAD의 주요한 소비자이다.
RNA-seq 데이터세트는, RGC가 미토콘드리아 스트레스 및 대사산물 고갈의 기간을 거쳐, 잠재적으로 지방산 대사(초기 녹내장 동안 망막에서 지질 침착물의 증가에 해당함, 도 7A 및 도 7B)로 진행됨을 시사한다.
지방산 β-산화의 한 결과는 자유 라디칼/활성 산소종(ROS)의 생성이 증가한다는 것이다. 따라서 ROS가 유도한 DNA 손상의 징후를 위하여 망막을 평가하였다(RNA-seq, 그림 3F; 및dsDNA 절단의 민감한 마커인 γ-H2AX 면역염색에 의해). γ-H2AX+ 핵이 대조군이 아닌 D2 망막의 신경절 세포 층에 전체에 걸쳐 존재하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 녹내장에서 DNA 손상이 매우 일찍 증가함을 나타낸다(도 8A 및 도 8B).
PARP 활성은 연령에 따라 RGC에서 유도되는 것으로 밝혀졌으며(도 9A 및 9B), DNA 손상과 RGC내에서 증가된 대사 스트레스 사이의 연관성을 제공한다. 우리의 발견은 PARP가 DNA 손상에 의해 유도되고, PARP는 주요한 NAD+ 효소이며, 헥소키나제의 PAR 저해를 통한 해당작용을 저해한다는 가설과 일치한다.
D2 마우스 모델은 나이가 녹내장 및 다양한 여러 신경변성 질환의 주요 위험 인자라는 패러다임을 분명히 뒷받침한다. 우리의 대사 프로파일 데이터는, 연령 증가가 필수 신경세포 대사물질의 고갈을 통하여 어떻게 손상에 대한 신경세포 취약성을 증가시킬 수 있는지를 제시한다.
전체적으로, 본원에 제시된 데이터는, 망막에서 NAD 및 글루타티온의 연령-의존성 감소가 RGC를 녹내장 및 가능한 기타 연령 관련 질환으로 감작화하는 새로운 모델을 뒷받침한다. RGC는 높은 IOP과 녹내장에 특히 취약하다. 따라서, 연령-의존성 대사산물 감소뿐만 아니라 RGC 내 PARP 활성화가 세포 대사를 방해하고, 진행중인 IOP-유발성 스트레스에 대한 감수성을 증가시켜, RGC에 치명적인 손상을 주고자 한다.
D2 마우스에서, 녹내장성 신경변성은 연령과 관련되어 있고, 만성적이고, 비동기적이다. D2 녹내장의 발달 동안, RGC는 연결성의 초기 손실, 총 세포체 손실, 축삭 손실, 및 시신경변성에 앞서 발생하는 신진대사적 및 분자적 변화를 겪는다. 이러한 초기 변화는, RGC가 진행되는 IOP 유발 스트레스 하에 있을 때, 세포 대사의 신뢰성을 감소시키고 연령에 따라 세포 기능장애의 가능성을 증가시킬 것으로 예상된다.
요약하면, RNA-시퀀싱 및 대사 분석에 근거하여, 망막의 신경세포가 변성 전 대사 위기를 거친다는 것을 발견하였다. 이것은 미토콘드리아가 기능하는 방식을 변경거나 보충할 수 있는 대사성 분자에서 중요한 역할을 제안한다. 이러한 기능장애를 수정하면, 녹내장 이상의 잇점이 있으며, 나이와 관련된 보다 일반적인 변화와 관련이 있다는 것을 제안하다.
지금까지의 데이터는 NAD 감소가 녹내장에 대한 나이-관련 신경세포 취약성의 중심에 있음을 보여줍니다.
실시예 3: NAM은 축삭절단 배양에서 신경세포 손실을 방지한다
이러한 일련의 연구에서, NAD 수준을 높이면 손상된 눈을 신경변성적 변화로부터 손상된 눈을 보호하는지를 조사하였다. 축삭 절단술(즉, 축삭의 절단)은 일부 녹내장에서 보이는 급격히 심각한 손상(insult)을 모방하고, 이러한 더 심각한 손상에 대하여 중요한 모델이다.
본 연구는 대사적/활력 장애의 가능성을 줄임으로써 RGC가 외부 스트레스에 더 탄력적으로 될 것이라는 가설에 기반하고 있다.
D2 마우스에서 관찰된 미토콘드리아 기능장애/에너지 위기에 잠재적으로 길항하는 약물 후보 물질을 확인하기 위해, 미토콘드리아에서의 거동을 가지는 과잉 약물을 축삭 절단 배양에서 테스트하였다. 이 스크린은 니코틴아미드(NAM)가, 세포사멸 전을 핵 리모델링의 보충마크의 특성인, 핵 수축에 대한 가장 강력한 보호를 하는 것으로 확인했다. 도 22A 및 도 22B.
상기 시험관내 발견은 실시예 3의 생체내 결과와 일치한다.
실시예 4: NAM은 D2 마우스의 녹내장을 완화한다.
D2 마우스의 대규모 코호트를 이용하여 생체내 실험을 수행하였다.
이 실험에서 시신경을 NO(녹내장 없음), MOD(중도 손상) 및 SEV(중증도 손상)의 세 가지 손상 수준으로 분류하였다.
실험 D2 마우스를 하기 그룹들로 나누었으며 주어진 조건은 다음과 같다:
W = 물(기준 마우스 물)
NAM 또는 NAMLo = 음용수 중 550 mg/kg/d의 NAM
Early = 초반 시작 = 녹내장 전 = 6월령(즉, 예방적)
Late = 후반 시작 = 녹내장 중 = 9월령(마우스가 이미 높은 안압을 가지고 있을 때, 즉 중재적(interventional), 인간 녹내장과 매우 관련이 있을 때)
니코틴아미드(NAM: NAD의 전구체)를 D2 생쥐에 투여하여 NAD 수준을 증가시켰다(도 5A, 11-14, 20A, 20B 참조). 이어서, 시신경 손상, 세포체 손실, 시각 기능 및 축삭 운반에 대해 12월령 때에 마우스를 평가하였다.
음용수 중 NAM 투여(550 mg/kg/d, NAMLo)는 12개월(이 녹내장 모델에서 신경변성을 평가하기 위한 표준 최종 단계)동안 NAD 수준의 감소를 방지하였다(도5A 및 5E ).
(A) NAM은 녹내장의 모든 검출 가능한 징후로부터 마우스를 보호한다
신경세포 취약성 가설을 뒷받침하면, NAM은 IOP를 변경시키지 않았지만(도 10A-10D), 녹내장을 강력히 예방하는데, 즉, NAM은 신경보호제이다. 중요한 것은, NAM이 예방적((6 개월에 시작, 초반 시작; 군집 대다수의 눈에서 IOP 상승 이전)이면서 및 중재적(9개월에 시작, 후반 시작, 대다수의 눈에서 지속적인 IOP 상승이 있을 때). 이것은 NAM이 신경 손상 발생을 방지할 뿐만 아니라 신경세포 손상을 이미 손상된 신경으로 제한할 수 있음을 의미한다(도 11A 및 11B). 이는 일단 질환이 증상이 나타나서 검출이 가능하면 치료를 시작해야만 하는 인간 질환에 있어서 중요하다.
이 데이터는, 예를 들어, 가족력, 안과적 외상, 알려진 유전자 돌연변이로 인해 녹내장의 위험이 있는 대상체에서 있어서나 IOP가 높은 것처럼 보이지만 녹내장 손상이 없는 경우, NAM이 예방적으로 사용되어 인체 녹내장을 치료할 수 있음을 뒷받침한다.
(B) NAM은 망막 신경절 세포의 기능장애 및 변성을 강력히 예방한다
NAM은 시신경변성(도 11A 및 12A)의 발병을 현저하게 감소시키고, RGC 세포체 손실 및 망막 박화(보통의 방법, 예컨대, OCT, 검사경 검사를 통해 인간 클리닉에서 검출가능함)를 방지하고(도 12A 및 도 13A), 전방 축삭 수송(Ct-
Figure pct00002
추적에 의해 평가; 축삭 기능장애 및 변성의 중요한 초기 마커)(도 12A) 및 패턴 전자 망막 검사(PERG)에 의해 평가되는 시각 기능(도 14 및 도 15)을 회복시켰다. PERG는 사람과 동물 모델 모두에서 녹내장성 시각장애의 매우 세심한 초기 측정수단인 것으로 여겨졌으며(Saleh et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 4564-4572, 2007); 따라서 NAM은 녹내장의 초기 징후를 예방한다.
(C) NAM은 망막에서 초기 시냅스 손실과 지질 액적 형성을 방지한다
또한 NAM의 투여는 본 모델에서 발생하는 초기 시냅스 손실(SNAP-25 면역염색)(도 16A 및 16B)에 대한 예방하고 및 EM(도 17A 및 17B)에 의해 평가되는 비정상적 크리스타를 갖는 기능장애 미토콘드리아의 형성을 억제하기에 충분하였다.
또한 지질 액적의 형성이 고령의 D2 망막에서 방지되었다(도 18).
(D) NAM은 PARP 활성화를 감소시키고 및 녹내장의 분자 징후를 예방한다
또한 NAM은 PARP 활성화를 감소시키고, DNA 손상 수준 및 덜 교란된 세포 대사를 반영하는 HIF-1α의 전사 유도를 제한하였다(도 9A, 9B, 19A, 및 19B). 상향 작용자, 즉 미토콘드리아내 대사산물 고갈 및 산화환원 버퍼링을 수정함으로써 이러한 손상 메커니즘을 방지하는 것 같다.
NAM은 RNA-seq로 평가된 바와 같이, 처리된 대다수의 눈에서 녹내장의 최초 분자 징후도 예방하였다. NAM으로 처리된 샘플은 대조군과 분자적으로 유사하고, 나이를 매치시킨 샘플과 어린 대조군 샘플 둘 다에서 클러스터링되었다(도 20A, 20B, 21A-21F).
(E) NAM은 RGC에서 연령-관련 유전자 발현을 방지한다
NAM도 RGC 내에서 연령-관련 유전자 발현 변화의 대부분을 방지하였다(N = DE 유전자의 수; 4월령 D2-Gpnmb + 대 9월령 D2-Gpnmb + = 4699, 9월령 D2-Gpnmb + 대 NAM = 4437, 4월령 D2-Gpnmb + 대 NAM = 83). 이 놀라운 수준의 분자 보호는 높은 IOP를 가진 눈에서 대사 붕괴 및 녹내장의 확률을 줄이는데 있어서 예상외의 NAM의 효능을 강조한다. 나이가 녹내장의 병인의 주요 위험 요인이기 때문에, 연령-관련 변화를 막는 것은 인간의 녹내장뿐만 아니라 천천히 변성되는 신경변성 질환의 많은 경우에서 신경변성을 예방할 잠재력을 가진다.
치료된 눈의 대부분에서, NAM 투여는 PERG와 같은 초기 질환의 매우 섬세한 측정을 기반으로 한 결과를 포함하여, 녹내장을 완전히 예방한다. 또한, 많은 안구 및 신경변성 질환이 손상을 입기 쉬운 연령-종속 분자의 가능성으로 인하여 노인에게 발생한다. NAM 치료는 유전자 발현에 의해 평가된 연령-관련 분자 변화를 방지한다(이러한 변화를 매우 민감하게 측정함).
또한, 축삭 변성 및 세포체 수축은 일부 신경변성 질환에서 일반적인 구성요소를 나타낼 수 있다. NAM은 적어도 녹내장 치료에서 상기 데이터를 기반으로 이러한 변화를 방지한다. 또한, 상기 데이터는 NAM이 녹내장에서 축삭 변성 및 세포체 수축을 방지한다는 것을 보여준다.
실시예 5: 식이 NAM를 증가시키면 D2 마우스의 IOP 증가 정도를 더욱 감소시킨다
NAM은 과다 용량에서도 안전하게 견딜수 있다고 믿어진다. 일부 연구는 인간에서 하루에 4g 미만의 용량에서 간독성의 발생을 알려주었다. 그러나, 이것들은 오래된 제제물 내에 있는 불순물에 기인한다. 고용량의 니코틴아미드 또는 니아신에 대한 6000명의 환자에 대한 설문 조사에서, 단지 3건의 황달이 보고되었다. 이들 중 하나(6 g/일 니아신)에서, 상이하나 동시에 투여된 약물(니아신이 아님)을 중단한 후에 황달을 해결하였으며, 다른 하나에서는 니아신 치료를 지속하여 활달을 해결하였다. 더 높은 니코틴아미드 용량과 관련하여, 비정상적인 간 효소 검사가 간세포 손상을 가리키지 않고, 오히려, 약물 중단시 신속하게 가역적이 되는, 간 효소 발현의 변화를 나타내는 것을 시사한다. 간 독성의 드문 사례는 개별 유전 감수성 또는 다른 개별 요인을 반영할 수 있다. 매우 높은 용량의 장기간 효과는 추가 평가가 필요하지만, 경험에 의하여, 장기간 니코틴아미드 치료의 위험 대 이득의 비율은 매우 유리할 것이다.
녹내장의 확률을 더 낮추고 IOP-유래 손상으로부터 더 많은 눈을 보호하기 위해, D2에 투여된 NAM의 용량(2000 mg/kg/d에서의 원래의 더 낮은 용량의 4배를 나타냄, NAMHi)을 증가시켰다.
놀랍게도, NAM(이 용량에서)은 녹내장성 시신경 손상이 없는 치료된 눈의 93%에서 극히 보호적인 것으로 밝혀졌다(도 11A). 이것은 녹내장 발생의 위험 인자가 10배 이하로 감소한 것을 의미한다. 이러한 단일 분자를 투여함으로써 얻을 수 있는 보호의 정도는 전례가 없으며 전혀 예상하지 못하였다.
마우스에서의 550mg/kg/d의 NAM은 더 명확한 신경보호 효과(IOP가 변경되지 않음)을 입증하여, 2000 mg/kg/d의 용량을 증가시키면 IOP 상승의 정도를 감소시킨다(도 10A 및 도 10B). 이것은 NAM이 RGC에 대한 추가 세포 유형에서 연령-관련 병인 과정을 방지한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 데이터는, NAM이 IOP 상승과 신경 취약성을 모두 방지하므로, 인체 녹내장의 치료에서 이중 잇점과 임상 잠재력을 가진다. IOP가 변경되지 않는 550 mg/kg/d의 낮은 용량에서, IOP 강하 치료(예를 들어, 수술이나 점안)는 NAM 보충물과 병용하여 신경변성을 더 강력하게 예방한다.
실시예 6: NAM은 녹내장성 손상에 대한 RGC 사멸의 두 모델에 효과적이다
녹내장은 다중 손상을 수반하는 복합 질환이다. RGC 구획들(예를 들어, 세포체, 축삭, 수상돌기)이 상이하게 영향을 받을 수 있는 광범위한 병인학이 있다. 기계적 축삭 손상과 국소 염증은 녹내장 중 RGC 변성에 두 가지 중요한 원인이다.
상이한 문맥에서 NAM 치료의 효과를 평가하기 위해, RGC 사멸의 두 가지 모델에서 NAM 효능을 테스트하였다. 첫 번째 녹내장성 손상 모델은 축삭 절제술의 조직 배양 모델의 사용을 포함하고, 두 번째 녹내장성 손상 모델은, 국소 염증을 일으키고 녹내장에 연루된 용해성 뮤린 TNFα의 유리체내 주사의 사용과 관련이 있다.
NAM은 RGC 세포체 변성으로부터 배양된 망막을 강력하게 보호했다(도 22A 및 22B). 또한 NAM은 TNFα 주입된 안구에서 PERG 진폭의 손실 및 세포 손실로부터 보호했다(도 23A-23C).
심각한 급성 손상에 대한 이러한 보호와 녹내장과 기타 신경변성 질환의 공통점을 고려하면, NAM은 녹내장 및 기타 연령-관련 신경변성 질환의 치료에 광범위한 영향을 줄 수 있다.
실시예 7: Nmnat1 유전자 요법은 D2 마우스의 녹내장을 완화한다
이 연구에서, NAD+ 생산에서 핵심 효소인 Nmnat1의 과발현(도 25)이 NAD+ 생성 세포 기관을 지지한다는 것을 입증하였다.
단일 전사체로서 발현된 CMV 프로모터 하에서 5.5월령 D2 마우스의 눈에 Nmnat1 유전자 및 GFP 리포터를 포함하는 AAV2.2 벡터를 한 번 주입했다. 마우스를 마취하고, 1.5 μL의 바이러스 벡터(3Х108 U/㎖)를 유리체내(즉, 윤곽선 뒤에서, 렌즈와 중심 망막을 피하면서, 유리체실 내에 45-60도의 각도로) 주사하였다. 두 눈에 주사하였다. 주사 직후에, 수화 점안제를 국소 투여하고, 마우스를 가열 램프 하에서 깨우도록 하였다. 눈에 손상이 없음을 확인하기 위해 주사 후 중복 시점에서 눈을 임상적으로 검사하였다. 시각 기능 평가(PERG에 의한)를 주사 이전 및 이후에 수행하여, 초기 주사 및 바이러스 형질감염의 악영향을 확인하지 않았다.
Nmnat1 발현(GFP 발현에 의해 평가됨)은 AAV2.2 주사 후 적어도 첫 주에 검출 가능하였고, 주사 후 2 주에 RGC에서 강하게 나타났으며(RGC의 >83%에서 나타남), 마지막 단계 시점(12개월)까지 견고하게 유지되었다. 대다수의 RGC를 형질도입하고 바이러스로 전달된 유전자 산물을 발현시키며, 이 유전자 산물은 외측무릎핵(lateral geniculate nucleus, LGN) 및 상층 둔덕(Sup Col.)를 포함하는, 망막의 RGC 세포의 세포체 및 뇌 내의 RNC의 종말점에서 GFP 형광에 의해 입증된다.
Nmnat1의 과발현은 축삭 및 세포체 손실을 방지하고(도 24A-24C 및 도 24D, 상부 패널), RGC에서의 세포질 수송 및 전기적 활성을 보존하기에 충분하였다(PERG)(도 24B 및 도 24D - 하부 패널). 치료된 눈의 >70%에서 녹내장성 신경손상이 없다. 이러한 강력한 보호는 인간 녹내장을 예방하기 위한 유사한 유전자 요법 전략의 사용을 조장한다.
실시예 8: Nmnat1 유전자 요법 및 NAM을 이용한 병용 요법
이 연구에서, 실시예 4 및 실시예 7에 상술된 실험을 조합하여, Nmnat1 및 NAM(NAMLo) 의 병용 요법의 효과를 조사하였다. 간략히, 마우스를 보통 콜로니로 회복하고 정상적인 음용수 중 NAM 550 mg/kg/d를 투여한 1 주일의 바이러스 쉐딩(shedding) 기간 후에, 마우스는 상기와 같이 유전자 요법을 겪었다.
이러한 병용은 12월령에 녹내장성 손상이 검출되지 않은 84%의 눈에 상당한 추가적인 보호를 제공하였다. 이는 비치료된 D2 대조군에 비해 IOP 유발 녹내장성 신경변성의 발생 위험이 ~4 배 감소함을 나타낸다.
유전자 요법과 병용하여 NAM의 투여량을 늘리면 훨씬 보호성이 있다.
실시예 9: Wld s 는 D2 마우스의 녹내장을 완화한다
월러 변성은 D2 느린 대립유전자(Wld S )는 D2 녹내장을 부분적으로 예방하는 것으로 보여졌다. Wld S 단백질은 변성 NMNAT1 단백질(NMN을 NAD으로 전환하는 효소)이다. 돌연변이 단백질 Wld S를 포함하는 세포는 효소 활성을 증가시켜, NMN을 NAD으로 더 빠르게 또는 더 효율적으로 전환한다.
본 실험에서, Wld S 돌연변이를 함유하는 D2 마우스에서 Wld S 단독보다는 NAM과 Wld S 의 병용이 녹내장을 더 잘 예방한다. NAM가 투여되며 Wld S 돌연변이를 지니는 마우스는 녹내장성 손상을 상당히 예방한다(~95% 녹내장 없음).
월러 변성 완속 대립유전자(Wallerian degeneration slow allele, Wld s )를 가진 D2 마우스가 사용되었다는 것을 제외하고, 실시예 4에서와 실질적으로 동일하게 실험을 수행하였다. 또한, 결과를 도 11B에 보였다. Wld s 단독으로 또는 NAM 단독으로 D2 녹내장을 예방하는 것이 분명하지만, Wld s 와 NAM의 병용은 Wld s 단독보다는 훨씬 좋다.
특히, NAM 단독은 녹내장에서 약 70%의 방지 효과를 가진다. 한편, NAM+Wld s 는 녹내장에서 ~95% 예방한다. NAM과 NAM+Wld s 모두는 세포 및 시신경의 모든 부분을 보호하였다(데이터 미도시). NAM 및 Wld s 각각이 부분적으로 보호성이 있지만, 이의 병용은 현저한 상승효과(즉, ~ 70% 예방부터 ~ 95%)를 나타냈다.
특정 이론에 구속되는 것은 아니지만, Wld s 돌연변이를 사용함으로써 Nmnat 발현을 증가시키면 더 많은 NAM이 NADt로 전환할 수 있으며, 이의 병용은 녹내장에서 신경변성을 상승적으로 예방한다고 믿어진다.
이 이론과 일치하여, DBA/2J 마우스에서, NADt 및 기타 TCA/크렙 사이클 성분들(예를 들어, 피루베이트, 도 5D)의 세포내 수준의 연령 및 질환 관련 감소가 있다. 따라서, NADt(NAD+/NADH)의 세포 수준을 처리 동물에서 측정하였다.
NADt(NAD+/NADH)의 수준이 NAM 처리 마우스뿐만 아니라 Wld s 마우스에서도 회복된다는 것을 발견했다. Wld s 마우스가 NAM으로 더 추가 처리될 때, NADt 수준의 복원은 NAM+Wld s 처리된 마우스에서 상승적이다(도 5E 참조).
이 실시예의 결과는 실시예 8의 결과와 일치한다.
NADt(NAD+/NADH) 수준은 노화와 신경변성 질환에서 변화한다고 생각된다. 본원에 제공된 데이터는 NAM, NAM 유도체, 및/또는 NMNAT 효소의 투여/보충은 광범위한 노화 및 질환 표현형에서 보호성이 있다는 것을 입증한다.
실시예 10: 피루베이트는 D2 마우스의 녹내장을 완화/예방한다
이 실시예는 니코틴아미드(비타민 B3) 및/또는 피루베이트(포도당의 간단한 대사산물)와 병용하여, 시각 손실, 축삭 수송 손실, 망막 및 시신경 손상으로부터 DBA/2J 마우스를 강력히 보호한다는 것을 입증한다. 유전자 발현 실험은, 니코틴아미드로 처리된 마우스가 연령이-일치하는 비녹내장 마우스가 아닌, 젊은 대조군 마우스와 보다 밀접하게 분자적으로 일치함을 입증한다. 이 자료는, 니코틴아미드는 연령-의존적 대사를 통해 부분적으로 작용하여, 녹내장에 대한 감수성의 연령 종속적 증가를 지연시킬 수 있음을 시사한다. NAM이 제공하는 방어의 수준은 전혀 예상치 못하고 놀랍다.
피루베이트는 포도당에서 생산되는 대사에 관여하는 중요한 단순 알파-케토산이다. 피루베이트는 크렙 사이클(시트르산 사이클)의 주된 입력인, 아세틸-조효소 A로 전환된다. 산소 정상 상태(normoxia)(정상 상태) 중, 피루베이트는 NADH 수준을 증가시킨다.
피루베이트 수준은 연령에 따라 망막에서 감소하여, 망막 신경세포를 높은 안압으로 인한 녹내장 손상으로 감작화한다(도 5D). 정상적인 음용수 중 피루베이트를 투여한 마우스는 망막 중 피루베이트의 수준을 증가시켰다(도 5D). 정상적인 음용수 중 피루베이트를 투여한 마우스는 녹내장에서의 시신경 축삭 변성, 세포 손실, 및 시각 기능장애(PERG에 의해 평가됨)에 내성이 있다(도 11B, 12B, 13B, 및 14).
상기 결과는 NAM 및 피루베이트 둘 다 투여된 마우스에서의 효능을 증가하여, 신경세포 변성을 방지하는, NAM- 및 피루베이트- 처리 사이의 상승 효과를 입증하였다.
실시예 11: PPQ는 핵가공 수축과 세포 밀도 감소를 방지한다
또한, 추가적인 신경보호제를 시험하여 신경변성 질환에서 이의 역할을 측정하였다.
한 실험에서, 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)의 신경보호 기능을 측정하기 위해 유사한 실험을 설정하였다. PQQ는 니코틴아미드와 마찬가지로, 중요한 산화환원 보조인자이다. PQQ는 미토콘드리아 생합성을 촉진하며, 이의 신경보호 기능은 이의 항산화제로서의 기능에 의존한다고 생각된다. 도 26은 PQQ가 망막 조직 배양에서 보호성이 있음을 보여준다.
실시예 12: 망막의 글루타티온 수준은 연령에 따라 감소한다
N-아세틸시스테인(N-acetyl-L-cysteine 또는 NAC)은 신경세포 내 L-시스테인의 전구체, 글루타티온의 전구체, 강력한 생물학적 항산화제, 및 주요한 산화 환원 버퍼이다. 도 5B의 데이터는 망막의 글루타티온 수준이 연령에 따라 감소함을 보여준다.
NADPH(NAD로부터 생산됨)는 GSSG로부터의 GSH 합성에 필요하다. 따라서 NAD와 GSH 수준은 본질적으로 연관되어있다.
재료 및 방법
1. 마우스 종, 사육, 및 축산
이전에 보고된 바와 같이, 14시간 명/10시간 암 사이클에서 식이와 물은 자유롭게 이용할 수 있는 상태에서 마우스를 사육하였다(Howell et al., Journal of Clinical Investigation 121, 1429-1444, 2011). 모든 육종 및 실험 절차를 "안과 연구에서 동물의 사용을 위한 시력 및 안과 정책 연구 협회(Association for research for Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic Research)에 따라 착수하였다. 생물 안정 위원회(Institutional Biosafety Committee)와 잭슨 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)는 이 연구를 승인하였다.
C57BL/6J(B6), DBA/2J(D2), 및 DBA/2J-Gpnmb R150X(D2- Gpnmb + ) 균주를 이용하고, 다른 곳에 자세히 기재되어 있다(Anderson et al., Nature Genetics 30, 81-85, 2002). D2-Gpnmb + 마우스는 높은 IOP를 발생시키지 않아서 녹내장성 신경변성을 발생시키지 않는다(Libby et al., Vis Neurosci 22, 637-648, 2005). 이 마우스는 DBA/2J 마우스에 대한 유전자으로 매칭된 대조군이다.
오래된 녹내장의 실험에서, 마우스에 6 개월째(예방적, 거의 모든 눈에서 안압 상승 이전) 또는 9 개월째(대부분의 안구가 높은 IOP 및 분자 변화를 가지나 신경변성을 검출할 수 없음)부터 식이 및/또는 물 중 NAM을 투여했다(Howell et al., Journal of Clinical Investigation 121, 1429-1444, 2011). 이러한 분자적 변화는 PERG 결손 및 전방향 축삭원형질 수송의 손실 이전에 일어난다. 저용량 NAM(NAMLo, 550 mg/kg/d, PanReac AppliChem)을 일반 산성 음용수(350 mL)에 용해시키고 주당 1 회 교체하였다. 고용량 NAM(NAMHi, 2000 mg/kg/d)의 경우, NAM은 물(550 mg/kg/d)과 식이(1450 mg/kg/d)에서 모두 사용할 수 있고, 일주일에 한 번씩 바뀌었다. NAM의 식이는 이미 출판된, custom Western diet for palatability(LabDiet)(Graham et al., Sci Rep 6, 21568, 2016)에서 준비하였다. 대조군 마우스는 NAM이 첨가되지 않은 동일한 식이를 받았다. 이 식이는 쥐의 안구 건강에 영향을 주지 않는다.
2. RGC의 FAC sorting
세포를 수집하기 전에, 모든 표면과 부피를 70% 에탄올 및 RNaseZap(ThermoFisher Scientific) 용액으로 세척 한 후 dH2O으로 세척하였다. 마우스를 안락사시키고, 눈을 적출하여, 즉시 얼음처럼 찬 HBSS에 넣었다. 얼음 위의 HBSS 중에 있는 눈(4 또는 9월령, PPD 염색으로 확인되는 축산 변성이 없음, 데이터 미도시)에서 망막을 분리하고, 100μL의 맞춤형 HBSS(Gibco), 디스파제(5 U/mL)(Stemcell Technologies), DNase I(2000 U/mL)(Worthington Biochemical) 및 SUPERase(1 U/μL)(ThermoFisher Scientific) 용액에 직접 넣었다. 모든 망막은, PPD 염색 및 분석에 의하여 녹내장 축삭 변성이 없는 것으로 된 눈에서 얻었다(아래의 시 신경 평가 참조). 망막을 37℃에서 20분 동안 배양하고, Eppendorf Thermomixer R에서 350 RPM으로 진탕시킨 다음, 200 μL 피펫을 사용하여 부드럽게 마쇄시켰다. 샘플을 HBSS 중 2% BSA, SUPERase(1 U/μL)에서 차단하고, DAPI뿐만 아니라 Cd11b, Cd11c, Cd34, Cd45.2, GFAP, Thy1.2에 대한 접합 항체로 염색하였다. 이 칵테일로 인하여, FACS 동안, 다른 망막 세포 유형을 정확하게 제거하게 할 수 있었다.
FACS는 FACSAria(BD Biosciences)에서 수행하였다. Thy1.2+(다른 모든 마커에서 음성) RGC를 300 μL의 버퍼 RLT + 1%
Figure pct00003
-ME에 쇼팅하고, 교반하고, 추가의 공정때까지 -80℃에서 동결하였다.
3. RNA 시퀀싱
FAC 소팅된 RGC 샘플을 얼음 위에서 해동시키고, RLT 버퍼(총 부피 300 μL)에서 주사기로 균질화시켰다. 선택적인 DNase 처리 단계를 포함한 제조사의 프로토콜(Qiagen)에 따라 RNeasy 마이크로 키트를 사용하여 총 RNA를 분리하고, Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 품질을 평가하였다. Ribogreen Assay(Invitrogen)를 사용하여 농도를 측정하였다. Nugen Ovation RNA-seq System V를 이용하여 증폭된 dscDNA 라이브러리를 생성하였다. Diogenode Disruptor를 사용하여 SPIA dscDNA를 300 bp 길이로 전단시켰다. 품질 관리는 Agilent 2100 Bioanalyzer 및 DNA 1000 칩 분석을 사용하여 품질 관리를 수행하였다.
Library Quantitation kit/Illumina GA/ABI Prism(Kapa Biosystems)를 이용하여 제조된 라이브러리 크기를 qPCR에 의하여 분석하였다. 라이브러리는 샘플 당 30-35 리드(reads)의 깊이를 제공하는 HiSeq 2500 시퀀서(Illumina) 상에서 바코딩, 풀링, 및 레인별로 6개의 샘플을 시퀀싱했다.
4. 차등 유전자 발현 및 경로 분석
사용자 정의 품질 관리 파이썬 스크립트(custom quality control python script)에 의해 샘플의 품질 관리를 분석하였다. 추가 분석을 위해 =30%의 기본 품질 점수를 가진 70%의 염기를 갖는 리드를 유지하였다. TopHat v 2.0.7(Kim et al., Genome Biol 14, R36, 2013)을 이용하여 리드 정렬을 실시하고, DBA/2J 마우스 게놈(build-mm10)에 대한 주석과 디폴트 매개변수가 제공된 HTSeq(Anders et al., Bioinformatics 31, 166-169, 2015)을 이용하여 발현 측정을 실시하였다. Bamtools v 1.0.2(Barnett et al., Bioinformatics 27, 1691-1692, 2011)를 이용하여 매핑 통계를 계산하였다.
그룹 간의 차등 유전자 발현 분석을 edgeR v 3.10.5(Robinson et al., Bioinformatics 26, 139-140, 2010)을 이용하여 실시하고, 이어서 RUVSeq를 이용하여 배치를 수정하고, 둘 이상의 샘플에서 다섯개 미만의 리드를 갖는 유전자를 제거하여 아웃라이어(outlier) 샘플 및 낮게 발현되는 유전자를 제거하였다. 정규화는 정리된 평균 M 값(trimmed mean of M, TMM)을 이용하여 실시하였다.
무감독 HC를 R(1-cor, Spearman 's rho)에서 실시하였다. 모든 그룹에 걸쳐 총 72 개의 샘플을 성공적으로 증폭 및 시퀀싱하였으며, HC 파이프 라인을 따라 9 개의 샘플을 아웃라이어(outliers)로서 제거하였다. 오류 발견률(FDR)을 이용하여 중복 테스트를 조정하였다. 유전자는 FDR<0.05에서 상당히 차등적으로 발현된 것으로 간주되었다.
연령-관련 변화를 연구하기 위해, 4월령 및 9월령 D2-Gpmnb + 샘플과 NAMLo 샘플을 비교하였다. 경로 분석을 위해, QIAGEN의 Ingenuity Pathway Analysis(IPA, Qiagen)를, 특히 차등적으로 발현되는 유전자를 통한 네트워크 생성에 사용하였다. 상당히 차등적으로 발현된 유전자의 목록을 IPA에 업로드하고, IPA 지식 기반dmf 이용하여 Mus musculus Entrez 유전자 기호에 매핑하였다. 이어서 이러한 객체를 IPA 지식 기반에 포함된 정보로부터 개발된 표준 경로에 중첩될 것이다. IPA의 내장 네트워크 점수화 알고리즘은 생성된 네트워크의 순위를 매기는데 사용될 것이다.
5. 대사적 표현형 분석
GSH/GSSG 및 NAD+/NADH 정량화를 위해, 망막을 해리시키고(상기와 같이), 제조사의 지침(GSH/GSSG, Cayman Chemical, NAD+/NADH, Biovision)에 따라 화합물을 측정하였다. 키트로부터 나온 표준을 이용하여 생성된 표준 곡선에 따라 결과를 계산하였다. 각 샘플의 최종 대사산물 농도를 Bradford 분석으로 측정된 총 단백질 농도로 표준화하였다.
6. 전체 망막 이식 배양
마우스를 안락사시키고, 눈을 적출하여, 즉시 얼음처럼 찬 HBSS에 넣었다. 망막을 얼음 위의 HBSS 내의 눈에서 해부하고, 세포 배양 삽입물(Millipore) 상에 신경절 세포층으로 평평하게 올리고, Neurobasal-A, 1% 페니실린-스트렙토마이신(10000 U/mL), 1% 글루타민(100x), 1% N-2(100x) 및 1% B-27(50x)(모두 ThermoFisher Scientific)을 함유하는 조직 배양 배지에 담그었다.
약물 처리된 망막 조직 배양을 위하여, 배지를 상기와 같이 만들고, 다음 화합물(달리 언급하지 않는, 모두 Sigma): β-NAD, NAM(PanReacAppliChem), β-NMN. 37℃ 4% CO2에서 6-웰 플레이트에서 망막을 5시간 동안 배양하고, 4% PFA로 고정하고 DAPI 염색하였다(무처리 "Day 0" 대조군의 경우, 망막을 해부하고 4% PFA에 곧바로 두었음). 망막을 Zeiss AxioObserver로 영상화 하였다.
7. 용해성 뮤린 TNF-α 주사
지연된 망막 신경절 세포 변성을 유도하기 위해, 용해성 뮤린 TNFα(1 ng/μL)을 전술한 바와 같이 유리체내로 주사하였다(Nakazawa et al., J Neurosci 26, 12633-12641, 2006). 10 주령의 B6 마우스를, TNFα 주사 전에, 2 주 동안 NAM으로 전처리하고, PERG를 8, 10 및 12 주령에 실시하였다. 마우스를 12 주령에 희생시키고, RGC 카운팅을 실시하였다.
8. 임상적 표현형 분석
D2 마우스의 안압 상승은 색소 분산 홍채 질환에 후속하는 것이다. 모든 실험에서, 돌연변이 또는 약물 처리된 마우스에서의 홍채 질환 및 안압의 진행을 대조군 D2 마우스와 비교하였다(John et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 39, 951-962, 1998). 각 실험에서 홍채 질환과 안압을 평가하였다.
홍채 질환을 6개월째에 시작하여 실험이 완료될 때까지 2 개월 간격으로 평가하였다.
실험 완료까지 8.5-9 개월째에 시작하여 45일 간격으로 안압을 측정하였다.
9. 패턴 망막전위도 검사(Pattern Electroretinography, PERG)
PERG는 이전에 보고 된 바와 같이 주둥이에서 피하로 기록되었다. 간략하게는, LED 패널에서 생성된 패턴 자극(0.05 사이클/도의 격자, 100% 대비)이 각각의 눈에서 약 1Hz의 약간 상이한 주파수로 개별적으로 나타난다. 비동기 평균법(asynchronous averaging method, Chou et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 55, 2469-2475, 2014)을 사용하여 파형을 회수하였다.
마우스를 ketamine/xylazine을 이용하여 마취하고(Savinova et al., BMC Genet 2, 12, 2001), 직장 온도계로 모니터링된 피드백 제어 가열된 단계에서 체온은 37℃에서 유지하였다.
10. 시신경 평가 및 녹내장 손상 측정
시신경의 처리와 파라페닐렌디아민(PPD) 염색은 발표된 바와 같다(Smith et al., Systematic evaluation of the mouse eye. Anatomy, pathology and biomethods. CRC Press, Boca Raton, 2002). PPD는 모든 축삭의 미엘린 시드(myelin sheath)를 얼룩지게 하지만, 손상된 축삭만 축삭형질(axoplasm)을 어둡게 염색한다. 시신경 손상의 매우 민감한 측정법을 제공하는 것은 잘 확립되어있다(Smith et al., Systematic evaluation of the mouse eye. Anatomy, pathology and biomethods. CRC Press, Boca Raton, 2002).
간략히 설명하면, 시신경의 두개내 부분을 4% PFA에서 실온에서 48시간 동안 고정시키고, 가공하여, 플라스틱에 매장되었다. 공막의 후방 표면으로부터 1 mm까지의 영역 내에서 시신경 분절이 단면화되었으며(1 μm 두께 절편), PPD로 염색하였다. 일반적으로, 각 신경에서 30-50 절편을 취하였다.
손상 수준을 결정할 때 각 신경의 여러 절편을 고려하였다. 시신경을 분석하여 3 가지 손상 수준 중 하나로 결정하였다.
(1) 무-녹내장 또는 초기 손상(No or early damage, NOE) - 손상된 축삭이 5% 미만이고 신경아교증이 없다. 이 수준의 손상은 연령 및 성별이 매치되는 비-녹내장 마우스에서 나타나며, 녹내장으로 인한 것은 아니다. 이들 눈의 어느 것도 녹내장성 신경 손상을 나타내지는 않지만, 이러한 눈의 일부에 신경변성을 선행하는 초기 분자 변화가 있으므로, 이 손상 수준은 녹내장 또는 무 녹내장 또는 초기 녹내장이라고 불린다. 이러한 분자적 변화는 유전자 발현 연구(Howell et al., Journal of Clinical Investigation 121, 1429-1444, 2011)에 의해 검출될 수 있다. 초기 분자 변화는 있지만 변성이 없는 눈은 대사적, 미토콘드리아 및 유전자 발현 변화가 검토될 때, 초기 녹내장으로 간주된다.
(2) 중도 손상(moderate damage, MOD) - 평균 30%의 축삭 손상과 초기 신경교종
(3) 중증도(severe, SEV) → 50% 축삭 손실 및 손상과 눈에 띄는 신경 교종
11. 선행 축삭 수송
마우스를 ketamine/xylazine을 사용하여 마취하고, 2 μL AF488 또는 AF594 콜레라 독소 B 서브 유닛(PBS 중 1 mg/mL)(ThermoFisher, Scientific)를 수정체내로 주사하였다. 72 시간 후, 마우스를 마취시키고 4% PFA 심장 관류를 통해 안락사시켰다. 뇌와 눈은 추가 24 시간 동안 4% PFA에서 사후 고정하고, PBS 중 30% 수크로오스에서 밤새 동결보존하고(ON), OCT 동결매장하고 20 μm에서 절단하였다. Zeiss AxioObserver 또는 Zeiss AxioImager를 사용하여 AF488을 시각화하였다.
12. 조직학
면역 형광 염색을 위해, 마우스를 자궁 경부 탈구로 안락사시키고, 눈을 적출하여, 4% PFA ON에 두었다. 망막을 해부하고, 슬라이드에 평평하게 올려 놓고, 0.1% Triton-X로 15 분간 투과시키고, PBS 중 2% BSA로 차단하고, 일차 항체로 RT에서 염색하였다(항체 목록은 아래 참조).
일차 항체 배양 후, 망막을 PBS로 5회 세척하고, 2차 항체로 RT에서 4시간 동안 염색하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS로 5 회 더 세척하고, DAPI로 15분 동안 염색하고, 플루오로마운트로 장착하고, 덮개를 벗기고 매니큐어로 밀봉하였다.
망막 절편에서 눈은 30% sucrose ON에서 동결보존하였고, OCT에서 동결시키고, 18 μm에서 동결절편을 만들었다. 슬라이드를 실온으로 가온하고, 상기 절차를 따랐다. 저해상도의 경우, Zeiss AxioObserver 에서 망막을 이미지화하였다. 망막 절편은 더 높은 해상도의 이미지를 위해 Leica SP8 상에서 이미지하였다.
Nissl 염색을 위해, 동결 절편을 실온으로 가온시키고, 1:1 알코올:클로로포름을 넣고, 연속 희석 계열 알코올 구배를 통해 재수화시켰다. 슬라이드를 증류수로 1회 세척하고, 증류수 중 0.1% 크레실 바이올렛에 15 분 동안 염색한 후, 95% 알콜에서 분화시키고, 100% 알콜에서 탈수시킨 다음, 크실렌에서 제거하였다. 상기와 같이 슬라이드를 준비하였다. Nissl 염색된 망막 절편을 Nikon Eclipse E200을 사용하여 이미지화하였다.
오일 레드 O 염색을 위하여, 슬라이드를 실온으로 가온하고, 60% 이소프로판올에서 신속하게 세척하고, 오일 레드 O 및 헤마톡실린에서 15분 동안 실온에서 항온 처리하고, 60% 이소프로판올로 다시 세척하고, 장착 및 커버를 제거하였다. Nikon Eclipse E200을 사용하여 Oil Red O로 염색된 망막 절편을 이미지화하였다.
13. 웨스턴 블랏팅
마우스를 자궁 경부 탈구로 안락사시키고, 안구를 적출하여, 즉시 얼음처럼 찬 HBSS에 넣었다. 망막을 HBSS 중 눈에서 해부하고, RIPA 버퍼에 직접 넣고, 균질화시켰다. 단백질 추출물을 프리캐스트 겔(precast gels, Bio-Rad)에서 SDS-PAGE로 분리하고, iBlot 2(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 PVDF 멤브레인으로 전사하였다. 멤브레인을 0.1% PBS-Tween 중 5% 우유 또는 5% BSA에서 차단하고, 항체 배양을 블로킹 용액에서 수행하였다. ECL을 사용하여 항체 염색을 검출하였다. 단백질 농도는 Bradford 분석법으로 평가하고, 밀도 측정법을 사용하여 하우스키핑 단백질로 정규화하였다.
14. 전자 현미경
마우스를 안락사시키고, 눈을 적출한 다음, Smith-Rudt(0.1M 포스페이트 버퍼 중 0.8% PFA 및 1.2% 글루테알데히드)로 고정시켰다. 각막 및 렌즈를 해부하고, 남아있는 후부 안구-컵(망막 및 ONH 함유)을 2% 수성 오스뮴 테트라옥사이드에 후-고정시키고, 에틸 알콜 중에서 탈수시켰다. 이어서, 시료를 침투시키고, Embed 812/Araldite 수지(Electron Microscopy Sciences)에 평평하게 올려놓고 표면 절편을 맞추었다. 블록을 60℃에서 48 시간 동안 중합시켰고, 90 nm의 마이크로톰 절편을 300 메쉬 구리 격자로 잘랐다(Leica UC6, Leica). 그리드를 1% 수성 우라닐 아세테이트/레이놀드 납 시트레이트로 염색하고, JEOL JEM 1230 TEM 상에서 관찰하였다. 이미지는 AMT 2K 카메라에서 수집하였다.
15. 유전자 요법
바이러스성 전달 유전자 요법을 위해, 마우스를 마취시키고(위와 같이), GFP 리포터가 있는 CMV 프로모터(본문에서 Nmnat1 이라 칭함; Vector Biolabs #ADV-265880) 하에, 1.5 μL(3.1 Х 1010 gc/mL) AAV2.2 뮤린 Nmnat1을 유리체내로 주사하였다. 마우스를 BSL2 실험실 에서 5.5월령째에 주사하였고, 2주 후에 우리의 정규 마우스 콜로니로 옮겼다.
추가적인 NAM 치료를 받는 Nmnat1 마우스의 경우, 6월령부터 일반 음용수 중 550 mg/kg/d NAM을 투여 받았다. 마우스를 12개월째에 안락사 시켰다.
16. 항체
위의 실시예에서 사용된 항체는 다음과 같다. IF: 면역형광성 WB: Western Blot
Figure pct00004
17. 통계 분석
샘플 크기(눈의 개수, n)는 각 도면에 표시되어 있다. 그래프 그리기와 통계 분석을 R에서 수행하였다. Stendent's t 검정은 양적 플롯에서 쌍별 분석(pairwise analysis)에 사용되었고, 오차 막대는 달리 명시되지 않는 한 평균의 표준 오차를 나타낸다.
모든 인용된 참고 문헌은 참조로서 병합된다. 본 발명의 특정 구체예들이 상기에서 기술되어 있지만, 본 기술 분야의 당업자는, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 많은 균등물, 수정물, 대체물, 및 변형물이 만들어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (38)

  1. 치료적 유효량의 니코틴아미드(NAM)를 함유하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하여, 녹내장을 치료하는 단계를 포함하는, 녹내장의 치료가 필요한 대상체의 녹내장의 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피루베이트를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NAM), 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 및 니코틴아미드 리보스(NR)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 NAM은 망막 신경절 세포에서 신경변성을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 NAM은 안압을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 NAM 및 피루베이트는 망막 신경절 세포에서 신경변성을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 NAM 및 피루베이트는 안압을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 방법은 NMNAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 내에 있는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV2.2인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 유전자 조성물은 유리체내로 또는 안구내로 투여하는 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 유전자 조성물은 유리체내로 투여하는 방법.
  17. 제2항에 있어서, 상기 방법은 NMNAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 추가 치료제는 베타 차단제, 비선택적 아드레날린 작용제, 선택적 α-2 아드레날린 작용제, 탄산 탈수효소 저해제(carbonic anhydrase inhibitor), 프로스타글란딘 유사체, 부교감신경흥분 작용제, 카르바콜(carbachol), 또는 이들의 조합인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 추가 치료제는 티몰, 레보부놀롤, 메티프라놀롤 카테올롤, 베탁솔롤, 에피네페린, 아프라클로니딘, 브리모니딘, 아세타졸아미드, 도르졸아미드, 브린졸아미드, 라타노프로스트, 트라바프로스트, 비마타프로스트, 필로카르핀, 에코디오페이트 요오다이드, 카바콜, 또는 이들의 조합인 방법.
  21. 치료적 유효량의 니코틴아미드(NAM)를 함유하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하여, 녹내장을 예방하는 단계를 포함하는, 녹내장 예방이 필요한 대상체의 녹내장의 예방 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피루베이트를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NAM), 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD) 및 니코틴아미드 리보스(NR)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 NAM은 안압을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 NAM 및 피루베이트는 안압을 감소시키는 치료적 유효량으로 존재하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 상기 방법은 NMNAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 유전자 조성물은 유리체내로 또는 안구내로 투여하는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 유전자 조성물은 유리체내로 투여하는 방법.
  32. 제22항에 있어서, 상기 방법은 NMNAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 추가 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 추가 치료제는 베타 차단제, 비선택적 아드레날린 작용제, 선택적 α-2 아드레날린 작용제, 탄산 탈수효소 저해제(carbonic anhydrase inhibitor), 프로스타글란딘 유사체, 부교감신경흥분 작용제, 카르바콜(carbachol), 또는 이들의 조합인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 추가 치료제는 티몰, 레보부놀롤, 메티프라놀롤 카테올롤, 베탁솔롤, 에피네페린, 아프라클로니딘, 브리모니딘, 아세타졸아미드, 도르졸아미드, 브린졸아미드, 라타노프로스트, 트라바프로스트, 비마타프로스트, 필로카르핀, 에코디오페이트 요오다이드, 카바콜, 또는 이들의 조합인 방법.
  36. 치료적 유효량의 니코틴아미드(NAM)를 함유하는 약학적 조성물을 대상체에 투여하여, 시각 기능을 향상시키는 단계를 포함하는, 시각 기능의 향상이 필요한 대상체의 시각 기능 향상 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피루베이트를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제36항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, NMNAT1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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