KR20210113606A - 신경 질환을 검출, 예방, 회복 및 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 개시내용의 다양한 양상 중에서 신경학적 질환(예를 들어, 성인 발병 신경학적 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 전측두엽 치매)의 발병을 검출, 예방, 역전, 치료 또는 지연시키는 방법이 제공된다.

Description

신경 질환을 검출, 예방, 회복 및 치료하는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 12월 5일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/775,626의 우선권을 주장하며, 이 가출원은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

연방정부 지원 연구 또는 개발에 관한 진술

해당 사항 없음

참조 포함 자료

해당 사항 없음

발명의 분야

본 개시내용은 일반적으로 신경학적 질환(예를 들어, 성인 발병 신경학적 질환, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매(FTD) 등)의 치료 및 검출에 관한 것이다.

본 개시내용의 다양한 양상 중에는 신경학적 질환(예를 들어, 성인 발병 신경학적 질환, AD, PD 또는 FTD)의 발병을 검출, 예방, 치료, 역전 또는 지연시키는 방법의 제공이 있다.

본 발명의 일 양상은 기능상실 변이체(loss-of-function variant)를 포함하는 리소좀 유전자가 이형접합성인 대상체에서 자가포식-리소좀 경로를 조절하는 방법으로서, 자가포식-리소좀 경로 조절제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 리소좀 기능장애와 관련된 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 발병을 예방, 치료, 역전 또는 지연시키는 방법으로서, 대상체의 생물학적 샘플에서 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자를 검출하거나, 또는 그 유전자가 검출되어 있는 단계; 및 자가포식-리소좀 경로 조절제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 대상체는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 이형접합성이거나, 또는 대상체는 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease: LSD)의 보인자(carrier)인 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 적어도 하나의 리소좀 유전자 기능상실 변이체를 검출하는 방법으로서, 대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자의 존재를 검출하는 단계를 포함하고, 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자가 검출되는 경우, 대상체는 APP 프로세싱 기능장애(dysfunction)와 관련된 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 있거나 이에 걸릴 위험이 있는 것으로 결정되는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 자가포식-리소좀 경로 조절제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 자가포식-리소좀 경로 조절제는 검출된 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련된 치료이다.

일부 실시형태에서, 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자는 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있다.

일부 실시형태에서, 대상체는 리소좀 기능장애와 관련된 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있는 것으로 의심되거나, 또는 가질 위험이 있는 것으로 의심된다.

일부 실시형태에서, 대상체는 리소좀 유전자 기능상실 변이체가 이형접합성이거나 이형접합성인 것으로 의심되거나, 또는 리소좀 축적 질환(LSD)에 대한 보인자이거나, 또는 보인자인 것으로 의심된다.

일부 실시형태에서, 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자는 CTNS, MAN2B1, MFSD8, GLB1, GALNS, NAGLU, CLN3, GNPTAB, SGSH, CLN8, NPC1, TPP1, DNAJC5, MANBA, PPT1, SMPD1, GAA, HGSNAT, GNS, CTSA, HEXB 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자는 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자는 NEU1, NAGLU, GBA, GLB1, MANBA, MAN2B1, HGSNAT, IDS, PPT1, GNS, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자는 GALC, ACD 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 자가포식-리소좀 경로 조절제는 유전자 요법(gene therapy, GT)을 포함하며, 여기서 GT는 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 효소 활성을 증가 또는 향상시킨다.

일부 실시형태에서, 대상체는 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합의 발현을 조절하는 자가포식-리소좀 경로 조절제에 의해 치료된다.

일부 실시형태에서, 대상체는 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 반수체기능부전이거나 그 유전자에 이형접합성 변이체를 갖는다.

일부 실시형태에서, 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자는 SGSH, NAGLU, HGSNAT, GNS, 및 이들의 조합으로 이루어진 군의 헤파란 설페이트(HS) 대사를 담당하는 유전자에 있는 희귀 기능 변이체로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 기능상실 변이체는 리소좀 유전자의 결실, 치환 또는 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이체이다.

일부 실시형태에서, 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태는 리소좀 기능장애와 관련이 있다.

일부 실시형태에서, 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태는 변경된 APP 프로세싱(예를 들어, 뇌 간질 Aβ의 변경된 수준 및 증가된 Aβ 플라크 부담) 또는 α-Syn 응집과 관련이 있다.

일부 실시형태에서, 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태는 Aβ 축적과 관련이 있다.

일부 실시형태에서, 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태는 알츠하이머병(AD)이다.

일부 실시형태에서, 자가포식-리소좀 경로 조절제는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 작용제(agent)로서, 화학적 샤페론 요법(CCT), 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 유전자 편집, 조혈 줄기 세포 이식(HSCT), 화학적 샤페론 요법(CCT), 정지 코돈 판독 약물, 기질 감소 요법(SRT), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 방법은 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 또는 줄기 세포 요법에 의한 외인성 리소좀 단백질에 의한 보완을 포함한다.

일부 실시형태에서, 자가포식-리소좀 경로 조절제는 시스테아민(Cysteamine), 사이클로덱스트린 또는 미글루스타트(Miglustat)를 포함하는, 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 치료이다.

일부 실시형태에서, Aβ, apoE, 타우(tau), 또는 α-Syn 응집이 대상체에서 감소되거나, 또는 치료되지 않은 대상체에 비해 Aβ, apoE, tau 또는 α-Syn 제거가 향상된다.

일부 실시형태에서, 대상체는 치매, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매(FTD), 크로이츠펠트-야콥 질환, 운동 뉴런 질환, 폴리글루타민 장애, 헌팅턴병, 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 루이소체 치매 또는 다계통 위축(multiple system atrophy)이 있거나, 걸릴 위험이 있는 것으로 의심된다.

다른 목적 및 특징은 부분적으로는 명백할 것이고 부분적으로는 이하에서 지적될 것이다.

본 기술분야의 기술자는 아래에 설명된 도면이 단지 예시 목적을 위한 것임을 이해할 것이다. 도면은 어떤 식으로든 본 교시의 범위를 제한하도록 의도된 것이 아니다.
도 1a 내지 도 1c는 (a) 연령, (b) 알츠하이머병(AD) 상태 및 (c) AD 마우스 모델에 의한 NAGLU 전사체 수준의 변화를 도시한 일련의 플롯이다.
도 2는 건강한 대조군과 비교하여 파킨슨병(PD) 사례의 흑색질로부터의 뉴런에서 NAGLU 전사체 수준을 보여주는 점 플롯이다.
도 3a 및 도 3b는 사전-형성된(pre-formed) α-Syn 원섬유(PFF)로 처리된 뉴런에서 알파-시누클레인(α-Syn)의 축적을 도시한 일련의 이미지 및 웨스턴 블롯이다. (a) 1차 뉴런에서 α-Syn PFF에 의해 유도된 인산화된 α-Syn 응집체의 면역형광 검출. 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리된 뉴런 배양물은 대조군으로 도시된다. (b) PFF 처리된 1차 뉴런으로부터 1% Triton X-100 및 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS)로 연속 추출 후 수득되는 용해물에서 α-Syn의 축적을 보여주는 웨스턴 블롯 분석(SDS 가용성 분획만 표시됨).
도 4a 내지 도 4c는 상이한 유전형의 마우스의 뇌 절편에서 인산화된 α-Syn(pSyn) 염색을 보여주는 일련의 이미지이다. (A) 인산염 완충 식염수(PBS)를 접종하고 30일 후(days post inoculation, dpi)의 어린 야생형(WT) C57BL/6 마우스의 pSyn 염색(갈색) 및 크레실 바이올렛으로 대비염색된 관상 뇌 절편. (b) α-Syn PFF에 의한 30 dpi에 어린 WT C57BL/6 마우스의 pSyn 염색. (c) α-Syn PFF에 의한 30 dpi에 어린 NAGLU-결손 마우스 pSyn 염색. 검은 색 화살표는 주사 부위의 수준을 나타낸다. 삽입된 그림은 피질에 항-pSyn 항체 및 루이소체(Lewy body, LB)/LN(루이소체 신경돌기, Lewy neurite) 유사 병리가 있는 염색을 보여준다. 청색 박스는 바깥후각 피질에 위치한다. 응집체가 더 널리 퍼져 있으며(청색 박스) NAGLU 결손 마우스의 동측 및 대측 반구 모두에 존재한다. 막대: 100㎛.
도 5는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 분해 능력의 연령 의존적 저하 및 신경퇴행에서의 역할에 대한 개략도이다. 검은 선은 ALP 기능의 연령 의존적 저하를 나타낸다. 청색 선은 알츠하이머병(AD)의 신경퇴행성 변화를 나타낸다. 파선은 95% 신뢰 구간(CI)을 나타낸다.
도 6은 AD 코호트 대 엑솜 응집 컨소시엄(Exome Aggregation Consortium: ExAC)에서 리소좀 축적 질환(LSD) 유발 유전자의 예측된 기능적 희귀 변이체에 대한 누적 대립유전자 빈도(cumulative allele frequency: cMAF)를 비교한 산점도이다. 유럽 혈통의 AD 코호트에서 얻은 LSD 유발 유전자별 누적 대립유전자 빈도는 x축에, ExAC 데이터세트의 누적 대립유전자 빈도는 y축에 도시된다.
도 7a 내지 도 7e는 리소좀 기능에서 리소좀 단백질, CSPα의 역할을 나타낸 일련의 이미지 및 막대 차트이다. (a) N2A 세포(불멸화 뉴런세포주)의 면역염색의 대표도. (b) N2A 세포의 세포질 및 리소좀 농축 분획의 LAMP-1 및 CSPα의 대표적인 웨스턴 블롯. (c) 비어 있음(empty), hCSPα-WT(야생형), 또는 CSPα-p.L115R(p.L115R, 성인 발병 뉴런 세로이드 지질갈색소증(adult-onset neuronal ceroid lipofuscinosis: ANCL)에 있는 질환 유발 돌연변이)을 안정적으로 발현하는 N2A 세포 중의 Lysotracker 신호. (d) 그래프는 비어 있음, hCSPα-WT(WT) 또는 hCSPα-p.L115R(p.L115R)을 안정적으로 발현하는 세포의 세포 균질액에서 측정된 리소좀 효소, PPT-1, β-gluc 및 β-Hexa의 활성을 보여준다. (E) 그래프는 배양 배지(분비됨)에서 측정된 PPT-1, β-gluc 및 β-Hexa의 리소좀 효소 활성을 보여준다.
도 8a 내지 도 8c는 마우스 모델에서 연령, AD 상태 및 AD에 따른 DNAJC5 전사체 수준의 변화를 보여주는 일련의 점 및 선 플롯이다(주: DNAJC5는 리소좀 단백질, CSPα를 암호화하는 유전자 지칭임). (a) 상이한 연령의 신경병리학적으로 정상인 인간 뇌 샘플의 DNAJC5 전사체 수준. (b) 2가지 상이한 연구에서 대조군과 비교되는, AD 사례의 뉴런에 있는 DNAJC5 전사체 수준. (c) 2개월 내지 18개월 사이에 AD 마우스 모델(TAU, p.P301L; 청색 선); (APP, p.K670N/p.M671L; 적색 선) 및 야생형 마우스(검은 선)의 피질에 있는 DNAJC5 전사체 수준. 오른쪽 그래프는 2개월 내지 18개월 사이에 상대적 플라크 밀도(APP 마우스)와 엉킴(tangle) 밀도(Tau 마우스)를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9d는 CSPα가 생체내 및 시험관내 APP 프로세싱에 영향을 미친다는 것을 보여주는 일련의 이미지 및 막대 차트이다. (a) 성인 발병 LSD 환자(ANCL)의 대뇌 피질에 대한 APP/Aβ(4G8) 염색의 대표적인 이미지. (b) 빈 벡터(empty vector), 특정 shRNA 및 ANCL 유발 돌연변이 p.L115R(p.L115R)에 의해 형질도입된 N2A 세포에서 나타나는 LAMP1(녹색)과 APP/Aβ(4G8, 빨간 색)의 대표적인 중첩 공초점 이미지. (c) (b)에서와 같이 형질도입된 N2A 세포로부터의 합성 배지(배지) 및 세포 균질액(세포) 중의 Aβ40 및 Aβ42 수준. (d) (b)에서와 같이 형질도입된 N2A 세포로부터의 오버라잉(overlying) 배지, 전장 APP 및 이의 α- 및 β-CTF, 및 CSPα에 있는 가용성 APPα 단편의 면역블롯(좌측) 및 정량(우측).
도 10a 및 도 10b는 (a) 연령 및 (b) AD 상태에 따른 리소좀 단백질, NPC1 전사체 수준의 변화를 보여주는 일련의 점 플롯이다.
도 12a 내지 도 12d는 내인성 CSPα가 리소좀에 있고 돌연변이 CSPα가 ALP 기능에 영향을 미친다는 것을 보여주는 일련의 이미지, 점 플롯 및 막대 차트이다. (a) 1차 피질 뉴런의 체세포 및 신경돌기, 및 뉴런 유사 세포 유형(N2A)에 있는 리소좀 마커와 공동국재화하는 내인성 CSPα의 대표적인 이미지 및 정량. (b) 리소좀 마커 LAMP1과 CSPα의 공동 침전을 보여주는 웨스턴 블롯. (c) 성인 발병 세로이드 지질갈색소증(ANCL) 유발 돌연변이 p.L115R을 발현하는 뉴런의 리소좀 마커에 대한 웨스턴 블롯. (d) 야생형 및 p.L115R 세포 중의 Lysotracker 신호의 정량.
도 13a 및 도 13b는 CSPα가 생체내 Aβ 생성에 영향을 미친다는 것을 보여주는 일련의 이미지 및 막대 차트이다. (a) ANCL, 대조군 및 AD 환자의 뇌 절편 이미지. (b) ANCL, AD 및 건강한 대조군 샘플로부터의 뇌 샘플의 세제(detergent) 가용성 및 불용성(구아니딘) 분획 중 Aβ의 정량.
도 14a 및 도 14b는 PPT 및 NAGLU가 반접합성인 마우스에서 β-아밀로이드 축적이 악화됨을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 도 14a. 반접합성 미경험(naive) NAGLU 마우스는 뇌 간질액(ISF)에서 더 낮은 Aβ 수준을 나타낸다. 한배 새끼 WT 및 반접합성 마우스에서 Aβ의 ISF 수준의 미세투석 정량화는 Aβ의 기준선 ISF 수준이 상당히 감소하였음을 보여주었다. ^*p<0.05, 독립표본(unpaired) t 시험 시. 10개월령 야생형(n=8) 및 NAGLU 반접합체(n=5). 도 14b. 반접합성 미경험 PPT1 마우스는 뇌 간질액(ISF)에서 더 낮은 Aβ 수준을 나타낸다. 한배 새끼 WT 및 반접합성 마우스에서 Aβ의 ISF 수준의 미세투석 정량화는 Aβ의 기준선 ISF 수준이 상당히 감소하였음을 보여주었다. ^**p<0.01, 독립표본 t 시험 시. 7개월령 야생형(n=5) 및 NAGLU 반접합체(n=6).
도 15는 α-Syn 사전-형성된 원섬유(PFF)의 주사 후 α-Syn 병리의 확산을 보여주는 일련의 이미지이다. α-Syn PFF의 단일 접종물을 3개월된 야생형 마우스(적색 화살표)의 선조체에 주사하고, 주사 후 90일에 뇌를 제거하고 포스포-특이적 α-Syn 항체로 염색했다. 삽입된 도면은 갈색 침전물로 보이는 여러 뇌 영역에서의 α-Syn 병리를 보여준다(크레실 바이올렛 대비염색은 청색으로 나타남).
도 16a 및 도 16b는 NAGLU 결손 마우스에서 pSyn 응집체가 증가함을 보여주는 일련의 이미지이다. (a) 해마(상단) 및 흑색질(하단)에 α-Syn PFF의 주사 90일 후(dpi) 어린 야생형 C57BL/6 마우스의 pSyn 염색(갈색) 및 크레실 바이올렛으로 대비염색된 관상 뇌 절편. (B) 해마(상단) 및 흑색질(하단)에 α-Syn PFF의 90 dpi 후 어린 NAGLU 결손 마우스의 pSyn 염색. 검은색 화살표는 NAGLU 결손 마우스의 동측 및 대측 반구 모두에서 응집체가 더 널리 퍼져 있는 뇌 영역을 나타낸다.
도 17a 내지 도 17c는 (A) 선조체에 α-Syn PFF의 90 dpi 후에 나타나는 어린 야생형 C57BL/6 마우스의 pSyn 염색(갈색) 및 크레실 바이올렛으로 대비염색된 흑색질(SN)의 관상 뇌 절편을 보여주는 일련의 이미지이다. (b) 선조체에 α-Syn PFF의 90 dpi 후에 나타나는 어린 NAGLU 결손 마우스의 SN의 pSyn 염색. (c) 선조체에 α-Syn PFF의 90 dpi 후에 나타나는 어린 야생형 마우스의 SN에서의 티로신 하이드록실라제(TH, 녹색) 및 pSyn(적색) 공동 염색.
도 18은 리소좀 효소 유전자에 이형접합성 돌연변이(5XFAD+/-, NAGLU+/- 또는 5XFAD+/-, PPT1+/-)를 보유하는 AD(5XFAD+/-)의 마우스 모델에서 각각의 리소좀 효소 cDNA를 발현하는 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 이용하여 AD 병리를 치료하기 위한 생체내 접근법의 개략도이다.
도 19는 리소좀 효소 유전자에 이형접합성 돌연변이(NAGLU+/- 또는 PPT1+/-)를 보유하는 PD의 마우스 모델(α-syn 사전형성된 원섬유가 주사됨)에서 각각의 리소좀 효소 cDNA를 발현하는 재조합 AAV 벡터를 이용하여 PD 병리를 치료하기 위한 생체내 접근법의 개략도이다.
도 20은 NAGLU 전사체 수준에 대해 도 2와 유사하게, 대조군과 비교하여 파킨슨병 사례의 흑색질로부터의 뉴런에 존재하는 PPT1 전사체 수준을 나타낸다.
도 21a 내지 도 21f는 AD 모델(5XFAD+/-)에서 NAGLU, PPT1 및 DNAJC5 반접합체가 β-아밀로이드 축적을 악화시킨다는 것을 보여주는 일련의 이미지 및 플롯이다. 7개월령에 (A) 5XFAD+/-, (B) 5XFAD+/-/Naglu+/-, (C) 5XFAD+/-/PPT+/- 및 (D) 5XFAD+/-/DNAJC5+/- 해마 영역에서 β-아밀로이드 염색한 대표 사진. 도 21e는 PPT1 유전자의 반접합체가 β-아밀로이드 축적을 악화시키는 것을 보여주는 점 플롯이다. 플라크로 덮인 표면적은 5XFAD 마우스에 비해 PPT1 반접합성/5XFAD 마우스에서 증가했다. 해마에 존재하는 플라크 부하의 정량화는 맹검으로 수행했다. ^**p<0.01, 독립표본 t 시험 시. 7개월령 5XFAD(n=4) 및 PPT1 반접합성/5XFAD(n=8). 도 21f는 NAGLU 유전자의 반접합체가 β-아밀로이드 축적을 악화시키는 것을 보여주는 점 플롯이다. 플라크로 덮인 표면적은 5XFAD 마우스에 비해 NAGLU 반접합성/5XFAD 마우스에서 증가했다. 해마에서 플라크 부하의 정량화는 맹검으로 수행했다. ^*p<0.05 독립표본 t 시험 시. 7개월령 5XFAD(n=4) 및 NAGLU 반접합성/5XFAD(n=4).
도 22는 리소좀 유전자의 기능상실(LoF)이 α-시누클레인 응집을 조절함을 보여주는 일련의 이미지이다. NAGLU 결손은 내인성 마우스 α-Syn의 병리학적 응집을 악화시킨다. PPT1 결손은 α-Syn 사전-형성된 원섬유의 선조체내 접종 주사 90일 후에 내인성 마우스 α-Syn의 병리학적 응집을 "감소"시킨다.
도 23은 표적화된 AAV2/9-PPT1 유전자 요법이 PPT1 반접합성/5XFAD 마우스에서 질환 진행을 지연시킴을 보여주는 생존 곡선이다. 캐플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선은 PPT1 반접합성/5XFAD 미처리군(적색, n=8)의 수명 중간값(median life span)이 AAV9-PPT1(녹색, n=5)로 두개내 처리된 반접합성/5XFAD보다 현저히 짧다는 것을 보여준다. 경향에 대한 로그 순위 시험(log-rank test for trend)에 의한 분석은 전체 생존율에 대해 유의미했다(P<0.0001). AAV2/9-PPT1로 처리된 마우스는 조직학적 분석을 위해 7.8개월에 의도적으로 죽였다.
도 24는 영아 뉴런 세로이드 지질갈색소증, CLN1 질환을 가진 아동의 보인자인 모계 및 부계의 족보를 설명하는 다이어그램이다.

본 개시내용은 적어도 부분적으로, 리소좀 축적 질환(LSD)을 유발하는 리소좀 단백질 유전자의 유해한 돌연변이가 이형접합성(보인자)인 대상체(LSD 증상이 없는 LSD에 대한 보인자)가 알츠하이머병(AD) 발병의 증가된 위험을 갖고 있다는 발견을 기반으로 한다. 현재의 도그마는 LSD 유발 유전자, 및 많은 다른 유전 질환 중 LOF 변이체에 대한 이형접합성 보인자는 정상이며 임의의 질환에 대한 소인이 없는 것으로 간주된다.

LSD가 있는 환자는 LSD를 유발하는 유전자 결함이 동형접합성(두 대립유전자가 완전하거나 거의 완전한 기능상실 리소좀 유전자 변이를 가짐)이며 LSD에 따라 유아기 내지 20세 사이의 임의의 시기까지 산다. 이러한 LSD 환자는 AD가 발병할 만큼 오래 살지 못할 것이다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 AD를 갖는 대상체에서 LSD-유발 유전자의 하나 이상의 변이체(유해한 돌연변이)가 검출되고 농축되었으며, 하나의 대립유전자(이형접합성)에서만 검출되었음을 발견하였다. 본 발명자들은 이들 변이체가 이형접합성 대상체에서 기능상실 변이체인 것을 발견하였다.

현재 리소좀 축적 질환(LSD)의 치료는 많은 치료 전략이 시행되고 있으며(예를 들어, 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 줄기 세포 요법(SCT)(예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식), 경구 소분자 기질 감소 요법, 소분자 샤페론 또는 자가포식-리소좀 경로의 약리학적 치료), 리소좀 단백질에 유해한 이형접합성 돌연변이가 있는 AD 환자의 치료에 사용될 수 있다.

리소좀 유전자의 이형접합 기능상실 변이체

LSD와 관련이 있는 유전자에서 기능상실 변이체(예를 들어, 일명 유해한 변이체 또는 돌연변이)에 대해 동형접합성인 대상체는 심각한 리소좀 기능장애를 초래한다는 것은 잘 알려져 있다. 그러나, 본 명세서에서는 놀랍게도 인간 AD 환자의 게놈이 리소좀 유전자가 이형접합성의 완전 또는 거의 완전한 기능상실 변이체가 풍부한 것(예를 들어, LDS 보인자)으로 발견되었다. 또한, 본 명세서에서는 완전히 정상으로 보이는 마우스의 리소좀 유전자에서 유해한 돌연변이의 이형접합체가 미묘한 리소좀 기능장애를 유발하고 정상적인 APP 프로세싱에 직접적으로 영향을 미치는 것으로 밝혀진다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 기능상실 변이체는 완전한 기능상실 변이체, 거의 완전한 기능상실 변이체, 또는 부분적인 기능상실 변이체일 수 있다. 이와 같이, 기능상실 변이체는 리소좀 효소 또는 다른 필수 리소좀 단백질의 생산 또는 정상 기능을 방해하는 리소좀 유전자 또는 LSD 관련 유전자의 변이체이다. 변이체는 결실, 치환, 삽입, 스플라이스 돌연변이, 프로모터 돌연변이, 변경된 안정성을 초래하는 돌연변이, 프레임이동 또는 정지 변이체, 넌센스 돌연변이, 및/또는 리소좀 유전자 또는 이의 생성된 단백질의 정상 기능에 부정적인 영향을 미치는 임의의 다른 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 완전한, 거의 완전한 또는 부분적인 기능상실 변이체는 효소의 생산 또는 활성의 붕괴 또는 감소를 초래할 수 있다.

완전한 기능상실(LOF) 변이체는 하류 조기 정지 코돈 또는 영향을 받은 전사체의 단백질 암호 서열의 제1 엑손 또는 50% 초과를 제거하는 더 큰 결실을 초래하는 변이체(반수체기능부전)와 같이 영향을 받는 전사체의 완전한 LOF와 상관관계가 있을 것으로 예상되는 변이체 또는 변이체들로서 정의될 수 있다(MacArthur et al., 2012 Science 335, 823-828). 거의 완전한 또는 부분적인 LOF 변이체는 유전자 활성을 감소시키지만 완전히 제거하지는 않는다.

본 명세서에 나타낸 바와 같이, 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있는 변이체를 포함하는 다수의 유전자는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)과 강하게 관련이 있는 것으로 발견되었다. 이는 대상체가 LSD를 발생시키기 위해서는 이러한 돌연변이에 대해 동형접합성일 필요가 있지만, APP 프로세싱 또는 미묘한 리소좀 기능장애 관련 질환, 예컨대 AD 또는 PD를 발생시키기 위해 대상체는 오로지 이형접합성일 필요가 있기 때문에 새로운 발견이다.

이 발견은 또한 이전에는 이러한 유전자가 반수체기능부전(haploinsufficient)이며 이러한 LSD 단백질의 감소된 발현을 갖는 것이 임의의 다른 질환 상태와 관련이 있을 수 있다는 점을 인식하지 못하였기 때문에 중요하다. 위에서 언급한 바와 같이, LSD를 유발할 수 있는 이형접합 돌연변이를 보유한 사람(보인자)들은 임의의 질환에 대한 소인이 있지 않다는 것이 오랜 믿음이었다.

본 명세서에 나타낸 바와 같이, 리소좀 유전자(예를 들어, LSD 또는 정상 ALP 기능과 관련이 있는 유전자)의 이형접합성의 유해한 돌연변이는 AD와 관련이 있다. 이 유전자는 현재 부족하고 새로운 치료 표적을 산출할 수 있는 지식인, AD 발병에서 리소좀 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있다. 개시된 결과는 AD의 잠재적인 치료를 위해 LSD용으로 현재 시행되고 있는 치료 전략을 용도변경하기 위한 기반을 수립할 수 있다. 놀랍게도, AD에서 식별된 유해한 변이체를 갖는 유전자가 심지어 가장 현저하게 풍부한 것이 아닌 NAGU 및 PPT1 모델(예를 들어, 표 13 참조)이 LSD 요법에 반응하는 것으로 나타났다. 이와 같이, AD에서 현저하게 풍부한 다른 식별된 LSD 유발 유전자가 유해한 이형접합 변이체(또는 완전하거나 거의 완전한 기능상실 변이체)를 갖는 대상체에게 제공되는 LSD 치료는 적어도 잘 반응하거나 우수하게 반응할 것으로 예상될 것이다.

본 명세서에서는 완전한 또는 거의 완전한 기능상실 이형접합 변이체를 갖는 45개의 리소좀 효소 유전자가 AD 및 PD 환자에서 풍부하다는 것이 발견되었다. 다음은 알려진 LSD 관련 유전자이다: AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5 또는 GRN. 이들 유전자와 관련된 효소 결손 및 이들 유전자의 변이체에 대한 유전형을 측정하기 위한 검정은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

ALP 관련 유전자에 결손이 있는 대상체의 집단은 또한 리소좀 기능장애를 가질 수 있다. 현재 453개의 리소좀 유전자가 알려져 있다. 이와 같이, 다음 유전자의 LOF 변이체는 리소좀 기능장애를 일으킬 수 있으며, 본 명세서에 기재된 치료법으로 치료 가능할 수 있다: ABCA2, ABCA3, ABCA5, ABCB9, ABCC10, ACP2, ACP5, ACPP, ADA, ADAM8, ADRB2, AGA, AHNAK, ALDOB, ANKFY1, ANKRD27, ANPEP, ANXA11, AP1B1, AP1G1, AP1M1, AP1M2, AP1S1, AP1S2, AP1S3, AP3B1, AP3B2, AP3D1, AP3M1, AP3M2, AP3S1, AP3S2, AP4B1, AP4E1, AP4M1, AP4S1, AQP2, ARF1, ARL8A, ARL8B, ARRB1, ARSA, ARSB, ARSD, ARSG, ASAH1, ASS1, ATP11A, ATP11C, ATP13A2, ATP6AP1, ATP6V0A1, ATP6V0A2, ATP6V0A4, ATP6V0B, ATP6V0C, ATP6V0D1, ATP6V0D2, ATP6V1A, ATP6V1B1, ATP6V1B2, ATP6V1C1, ATP6V1C2, ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1F, ATP6V1G1, ATP6V1H, AZU1, BCL10, BLOC1S1, BTD, C18orf8, C19orf28, C1orf85, C2orf18, C7orf28B, CAT, CCDC115, CCKAR, CCZ1, CD164, CD1B, CD1D, CD1E, CD63, CD68, CD74, CECR1, CHID1, CHIT1, CLCN5, CLCN6, CLCN7, CLN3, CLN5, CLTA, CLTB, CLTC, CLTCL1, CLU, COL6A1, CP, CPVL, CREG1, CST3, CST7, CTBS, CTNS, CTSA, CTSB, CTSC, CTSD, CTSE, CTSF, CTSG, CTSH, CTSK, CTSL1, CTSL2, CTSO, CTSS, CTSW, CTSZ, CUBN, CXCR2, CYBASC3, DAGLB, DEPDC5, DKFZp761E198, DNAJC13, DNAJC5, DNAJC6, DNASE1, DNASE2, DNASE2B, DNM2, DOC2A, DPP4, DPP7, DRAM1, DRAM2, ECE1, EGF, ELANE, ENPEP, ENPP1, ENTPD4, EPDR1, FAM176A, FGFR3, FLOT1, FLOT2, FNBP1, FUCA1, FUCA2, GAA, GABARAP, GALC, GALNS, GBA, GC, GDAP2, GGA1, GGA2, GGA3, GGH, GJA1, GLA, GLB1, GM2A, GNA11, GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAQ, GNB1, GNB2, GNB4, GNPTAB, GNPTG, GNS, GOT1, GPC3, GPLD1, GPR137, GPR137B, GPR143, GRN, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HPS1, HPS4, HPSE, HSPA8, HYAL1, HYAL2, HYAL3, IDS, IDUA, IFI30, IGF2R, IL4I1, ITM2C, KCNE1, KCNE2, KIAA0226, KIAA0415, KIAA1609, LAMP1, LAMP2, LAMP3, LAMTOR1, LAMTOR2, LAPTM4A, LAPTM4B, LAPTM5, LDLR, LGMN, LHCGR, LIPA, LITAF, LMBRD1, LNPEP, LOC653653, LRBA, LRP1, LRP2, M6PR, MAN2B1, MAN2B2, MANBA, 1-Mar, 2-Mar, 3-Mar, 8-Mar, 9-Mar, MCOLN1, MCOLN2, MCOLN3, MFSD1, MFSD8, MIOS, MMD, MON1B, MPO, MTOR, MYLPF, MYO7A, NAAA, NAGA, NAGLU, NAGPA, NAPA, NAPG, NAPSA, NBR1, NCSTN, NEU1, NEU4, NPC1, NPC2, NPPA, NSF, OCA2, OSTM1, P2RX4, P2RY2, PCSK9, PCYOX1, PEBP4, PGCP, PI4K2A, PLA2G15, PLA2G4E, PLA2G4F, PLBD1, PLBD2, PLD1, PLD3, PLEKHF1, PLOD1, PNPLA7, PON2, PPT1, PPT2, PRCP, PRDX6, PRF1, PRTN3, PSAP, PSAPL1, PSEN1, PSEN2, PTGDS, RAB14, RAB27A, RAB2A, RAB5C, RAB7A, RAB7B, RAB9A, RAMP2, RAMP3, RDH14, RILP, RNASE1, RNASE2, RNASE6, RNASET2, RNF13, RNF152, RPTOR, RRAGA, RRAGB, RRAGC, RRAGD, SCARB1, SCARB2, SCPEP1, SELRC1, SERINC2, SFTPB, SFTPD, SGSH, SH3GL2, SIAE, SIDT2, SLC11A1, SLC11A2, SLC12A4, SLC15A3, SLC15A4, SLC17A5, SLC26A11, SLC29A3, SLC2A13, SLC2A8, SLC30A2, SLC36A1, SLC37A3, SLC44A2, SLC48A1, SMCR8, SMPD1, SMPD4, SMPDL3A, SNAP23, SNX16, SORT1, SPACA3, SPG11, SPHK2, SPNS1, SPPL2A, SRGN, STARD3, STARD3NL, STS, STX3, STX7, STXBP2, SUMF1, TCIRG1, TIAL1, TLR3, TLR7, TLR9, TM9SF1, TMBIM1, TMEM127, TMEM175, TMEM192, TMEM55A, TMEM55B, TMEM63A, TMEM74, TMEM8A, TMEM9, TMEM92, TMEM97, TOM1L1, TPCN1, TPCN2, TPP1, TRIM23, TRIP10, TSPAN1, TSPAN8, TXNDC5, TYR, UBA52, UNC13D, UNC93B1, USP4, USP5, USP6, UVRAG, VAMP4, VAMP7, VASN, VMA21, VPS11, VPS16, VPS18, VPS33A, VPS33B, VPS35, VPS36, VPS39, VPS41, VPS4B, WDR11, WDR41, WDR48, ZFYVE26, ZNRF1, 또는 ZNRF2.

자가포식-리소좀 경로(ALP) 기능장애와 관련이 있는 신경학적 질환, 장애 및 상태

전형적으로 리소좀 축적 질환(LSD)(대상체가 하기 유전자 변이체에 대해 동형접합성인 경우)과 관련이 있는 완전하거나 거의 완전한 기능상실 변이체에 대해 이형접합성인 대상체(보인자)는 ALP 기능장애 또는 APP 프로세싱 결함을 유발할 수 있는 것으로 발견되었다. 리소좀 유전자의 유해한 변이체는 무증상 리소좀 기능장애를 유발할 수 있고, 이는 변경된 APP 프로세싱(예를 들어, 뇌 간질 Aβ의 변경된 수준 및 증가된 Aβ 플라크 부담) 또는 α-Syn 응집을, 특히 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)이 있는 대상체에서 초래할 수 있다. 이것은 리소좀 유전자(NAGLU, PPT1 또는 Csp-α)에서 이형접합성의 완전한 또는 거의 완전한 기능상실 돌연변이가 AD 또는 PD의 마우스 모델에 야기되는 경우 두드러지게 드러난다. 이 경우, 이형접합성의 완전한 또는 거의 완전한 기능상실 돌연변이는 Aβ 플라크 형성 또는 α-시누클레인의 응집을 크게 악화시킨다. 이와 같이, 무증상 리소좀 기능장애가 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 초래할 수 있음이 여기에서 발견되었다. 리소좀 기능장애와 관련이 있는 기타 신경학적 질환, 장애 및 상태는 유전성 뇌 아밀로이드 혈관병증, 뇌졸중 및 지적 기능의 저하(치매)를 특징으로 하는 상태인, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 병, 운동 뉴런 질환, 폴리글루타민 장애, 예컨대, 헌팅턴병뿐만 아니라, 가족성 아밀로이드 다발신경병증(FAP), 루이소체 치매, 다계통 위축 또는 전두측두엽 치매와 같은 말초 조직 질환일 수 있다.

본 개시내용은 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있는 유전자 변이체가 이형접합성인 대상체(예를 들어, 보인자)를 치료하고, 자가포식-리소좀 경로(ALP)-관련 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다.

예를 들어, 표 13은 AD가 있는 대상체에서 LSD 유발 유전자에서 발견되는 변이체를 갖는 유전자를 설명한다. 대상체는 이 유전자가 동형접합성이었다면, LSD가 발생했을 것이다. 그러나, 본 명세서에서 놀랍게 발견된 바와 같이, 이형접합체는 AD 또는 PD와 같은 자가포식-리소좀 경로-관련성 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태로 미래에 진단될 위험이 있음을 예측하는 것으로서 본 명세서에서 연관된 것이다.

이와 같이, 이러한 이형접합성의 완전 또는 거의 완전한 기능상실 유전자 변이체를 갖는 대상체를 진단 및 치료하는 개시된 방법은 자가포식-리소좀 경로-관련 신경학적 질환 상태를 검출하거나 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 리소좀 또는 자가포식 기능장애(예를 들어, AD, PD, FTD 등)와 관련이 있는 임의의 신경학적 또는 신경퇴행성 질환과 같은 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 사용될 수 있다.

리소좀 축적 질환 관련 유전자 또는 완전하거나 거의 완전한 기능상실 변이체를 갖는 유해한 리소좀 유전자가 이형접합성인 대상체의 다른 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있다.

리소좀 축적 질환(LSD)

리소좀 축적 질환(LSD) 또는 장애는 자가포식-리소좀 경로 유전자에 있는 동형접합성의 완전한 또는 거의 완전한 기능상실 유전자 변이체를 특징으로 하며, 그 결과 리소좀에서 거대분자의 분해 경로에 필수적인 리소좀 단백질 또는 리소좀 단백질 기능의 감소 또는 전체 손실을 초래한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 완전하거나 거의 완전한 기능상실 리소좀 유전자 변이체가 이형접합성인 대상체는 APP 프로세싱 기능장애(AD) 또는 α-시누클레인 응집(PD)과 관련된 신경학적 질환이 발병할 위험에 있는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, 새롭게 발견된 신경학적 리소좀 관련 질환에서 이형접합성 기능상실 변이체에 의해 유발된 질환에 대한 치료가 구현될 수 있다.

LSD는 리소좀에서 거대분자의 분해 경로에 관여하는 하나의 특정 리소좀 단백질의 전체 또는 부분적 결손을 특징으로 하는 적어도 50가지의 유전 질환의 그룹이다. 이들은 단일유전자성이고 이들 대부분에 대해 다수의 돌연변이가 기술되어 있다. 일부 돌연변이는 단백질 기능의 완전한 손실을 유발하는 반면, 다른 돌연변이는 정상 기능을 단지 감소시킨다. 일반적으로 결함이 있는 리소좀 효소의 기질인 분해되지 않거나 부분적으로 분해된 물질의 축적은 리소좀에서 일어난다. 통상적으로, LSD는 점액다당류증, 지질증, 글리코겐증, 올리고당증 등을 포함하여, 축적되는 비분해 기질의 화학적 본성에 따라 분류된다.

증상의 큰 이질성에도 불구하고, 이러한 질환의 대부분은 상이한 질환 간에, 그리고 동일 질환을 가진 환자 간에도 유의적인 변이가 있을 지라도, 높은 이병률 및 증가된 사망률을 가진 그의 진행성 과정을 특징으로 한다. 일반적으로, 이러한 질환은 다발성이며, 임상적 특징은 기관비대, 중추신경계 기능장애, 거친 모발 및 얼굴을 포함한다. 대부분의 환자는 출생 시 무증상이며, 어린 시절에 발병한다. 빈도는 지역과 집단에 따라 다르지만, 개별적으로는 드물지만 합산된 추정 유병률은 정상 출생아 중 1:4000 내지 1:9000 범위이다. 흥미롭게도, 대부분의 소아 LSD에는 유의미한 신경학적 구성요소가 있다.

이러한 질병 중 일부는 지금까지 특정 치료법이 없지만, 일부 LSD의 경우 조혈모세포이식(HSCT), 효소대체요법(ERT), 유전자 요법(GT) 및 소분자 약물이 이용 가능하거나 임상 시험 중에 있다.

자가포식-리소좀 경로 기능 향상제: 리소좀 축적 질환 치료 및 요법

본 개시내용은 LSD 질환, 장애 또는 병태와 관련된 완전한 또는 거의 완전한 기능상실 리소좀 유전자가 이형접합성인 대상체의 식별 및 치료를 제공한다. 이러한 이형접합성 대상체는 자가포식-리소좀 경로(ALP) 관련 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 발병할 위험이 더 높다. 본 발명의 LSD 요법 및 치료는 자가포식-리소좀 경로(ALP) 기능을 구제하거나 강화함으로써 동물 모델에서 ALP-관련 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하는 것으로 본 명세서에서 나타났다.

유전자 요법 및 효소 대체 요법과 같은 LSD 치료는 질환의 동형접합성 동물 모델 및 인간 환자에서 LSD를 치료하는 것으로 나타났다. 이와 같이, 이 치료법은 동형접합성 집단에 비해 이형접합성 집단에서 질환을 치료하기에 더 쉽고 훨씬 더 효과적일 것으로 예상된다. 다시 말해, 이형접합성 집단과 관련이 있는 기능장애(예를 들어, AD 및 PD)가 LSD 환자에 비해 경미하기 때문에, 치료 효능에 대한 임계값은 동형접합성 집단에 비해 이형접합성 집단에서 더 낮을 것이다.

LSD의 치료(LSD 치료제) 및 치료 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ohashi 2018 Gene therapy for lysosomal storage diseases and peroxisomal diseases Journal of Human Genetics (2019) 64:139-143; Beck 2017 Treatment strategies for lysosomal storage disorders, Dev Med & Child Neuro, 13-18; Ferreira and Gahl 2017 Lysosomal storage diseases, Translational Science of Rare Diseases 2(1-2) 1-71; Platt 2017 Emptying the stores: lysosomal diseases and therapeutic strategies, Nature Reviews Drug Discovery 17 133-150; Marques and Saftig 2019 Lysosomal storage disorders - challenges, concepts and avenues for therapy: beyond rare diseases J Cell Sci 132 jcs221739를 참조한다. 따라서, 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용의 치료제 및 치료 방법은 이러한 공정들에 따라 수행될 수 있다.

LSD에 대한 이러한 요법 및 다른 요법은 이미 동형접합성 대상체에서 효과적인 것으로 밝혀져 있기 때문에 이형접합성 대상체에서도 효과적일 것으로 예상될 것이다.

기질 감소 요법(SRT)

대사 또는 유전자 경로에서 효소는 일련의 반응을 촉매한다. 각 효소는 유전자에 의해 이의 RNA 및 단백질 산물을 통해 조절되거나 매개된다. 경로의 각 단계에서 효소 활성은 전구체 분자(기질)가 이의 다음 중간체 상태로 변형되는 반응을 촉매한다. 대사 경로의 기능부전은 기질의 축적을 야기하여 유해한 영향을 미칠 수 있다. 기질 감소 요법은 잔류 분해 활성이 기질 축적을 방지하기에 충분한 지점까지 기질의 수준을 감소시킴으로써 이 기능부전을 해결한다.

기질 감소 요법의 이론적 근거는 잔류 효소 활성이 저장되고 유입되는 리소좀 물질을 이화작용할 수 있는 비율까지 리소좀 물질의 형성을 감소시키는 것이다. SRT의 예는 미글루스타트(Miglustat)(Zavesca) 또는 엘리글루스타트(Eliglustat)(Cerdelga)를 포함할 수 있다.

조혈줄기세포 이식(HSCT)

HSCT에서는, 건강한 공여자의 골수 또는 제대혈로부터 줄기세포가 이식된다. 증거에 따르면, 이의 효능은 공여자 세포가 골수로 이동하여 혈액 계통이 재구성되는 것에 의존할 뿐만 아니라 이식된 세포가 뇌를 포함한 많은 질환 표적 기관으로 후속적으로 이동하여, 여기서 상주하는 효소 결손 집단을 대체하여; 기능적 효소의 국소적이고 꾸준한 공급원이 되는 것에 의존하는 것으로 나타난다. 이것은 일반적으로 '상호 보정(cross-correction)'이라고 하는 과정에 의해 더욱 향상된다. 상호 보정은 리소좀 효소가 하나의 세포(이 경우에는 공여자 조혈 세포)로부터 분비되어 수용체 매개 과정을 통해 인접 세포(또는 조혈 또는 비조혈 세포 기원)로 흡수될 수 있는 과정이다. 많은 경우에, 동형접합성의 완전한 또는 거의 완전한 기능상실 돌연변이와 관련이 있는 생화학적 결함을 완전하게 보정하기 위해 충분한 효소가 공유된다. 성공적인 경우, HSCT는 환자의 수명을 연장시키고 신경인지를 보존하며 체세포 변화를 향상시킬 수 있다. HSCT의 단점은 이 절차와 관련된 상당한 위험, 예컨대, 이식편대숙주 질환의 발병 가능성, HLA 호환성 공여자 발견의 어려움 및 키메라현상의 발달을 포함한다. 따라서, 많은 국가에서 이의 사용은 이용가능하다면 ERT을 위해 연기되었다.

효소 대체 요법(ERT)

ERT의 경우, 결손된 재조합 효소는 반복적인 정맥 주사를 통해 환자에게 투여된다. 이 경우 재조합 효소는 '상호 보정'에 연루된 동일한 수용체 매개 과정을 통해 세포에 흡수된다. 다양한 LSD에 대해 효과적이고 안전한 치료 옵션임에도 불구하고 ERT는 또한 중요한 한계를 갖고 있다. 그 중에는 일부 환자에서 나타난 이상반응, 높은 치료 비용, 매주 4 내지 5시간 길이의 주입에 대한 평생 의존성, 신경학적 및 골격 병리를 보정하는 능력의 제한이 있다.

유전자 요법 및 게놈 편집

유전자 요법은 바이러스 벡터에 의해 기능적 유전자를 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 리소좀 축적 질환(LSD)에 대한 유전자 요법이 빠르게 발전하고 있다. 대부분의 LSD는 뇌 연루를 특징으로 하여, 뇌를 표적으로 하는 치료법의 개발을 촉진한다. LSD의 뇌 연루에 대한 유전자 요법에는 두 가지 유형, 즉, 뇌 세포로 치료 유전자의 직접 전달 및 생체외 조혈 줄기 세포 표적화된 유전자 요법이 있다. 후자의 접근법에 대한 이론적 근거는 뇌 미세아교 세포가 조혈 세포에서 유래한다는 것이다. 따라서, 유전자-보정된 조혈 세포는 뇌로 이동하여 미세아교 세포로 분화한다. 이러한 유전자-보정된 미세아교 세포는 LSD와 관련된 대사 결함을 상호 보정하고 LSD의 염증을 감소시켜 임상적 이점을 야기한다. 유전자 편집 기술도 이 분야에 적용되었으며 LSD에 초점을 맞춘 실험이 현재 진행 중이다(예를 들어, de Carvalho et al. 2015 Genome Editing: Potential Treatment for Lysosomal Storage Diseases Current Stem Cell Reports 1(1) 9-15 참조). 이러한 접근법은 아직 조사 중이지만 매우 고무적인 결과가 수득되었다. 현재, LPL 결손증에 대한 것: AAV/LPL(Glyvera); ADA 결손: 레트로바이러스/ADA(Strimvelis); 및 레버의 선천적 흑암증: AAV/RPE65(Luxturna)를 포함하여, 시장에서 승인된 여러 유전자 요법이 있다.

최근에 유전자 요법에 대한 상황이 개선되었다. 예를 들어, 2019년 1분기에 진행 중인 유전자 요법의 임상 시험은 372건이었다(Alliance for Regenerative Medicine, 5/9/19).

본 기술분야에 공지된 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 광견병, 에볼라, 렌티바이러스 또는 이의 혼성체로부터 선택되는 바이러스 벡터일 수 있다.

유전자 요법은 효소를 표적 기관으로 직접 지속적으로 전달할 수 있게 하여 매주 주입할 필요를 없앤다. 또한, 몇몇 세포의 보정으로, 효소가 순환계로 분비되어 이웃 세포에 흡수될 수 있게 하여(상호 보정), 생화학적 결함의 광범위한 보정을 초래할 수 있다. 이처럼, 유전자 전달 벡터에 의해 변형되어야 하는 세포의 수는 비교적 적다. 더욱이, 리소좀 효소의 과발현이 유해한 것으로 보이지 않고, 효소의 5 내지 10% 정상 수준만큼 소량이 여러 LSD에 치료적일 수 있으므로, 정확한 전사 조절이 아마도 필요하지 않을 수 있다.

유전자 변형(modification)은 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 생체외 전략은 배양물 중의 세포의 변형과 변형된 세포를 환자에게 이식하는 것을 기반으로 한다. 단일유전자 질환에 가장 일반적으로 간주되는 치료 표적인 세포는 줄기 세포이다. 다양한 공급원에서 이러한 세포를 수집 및 분리하는 기술의 진보는 LSD에 대한 실행가능한 옵션으로서 자가 유전자 요법을 촉진시켰다. LSD의 마우스 모델에서, 효소 유전자를 암호화하는 유전자 변형된 신경 줄기 세포는 리소좀 축적을 효과적으로 감소시키고, 병리를 감소시키며, 동물의 수명을 연장했다. 중간엽 줄기 세포와 유도 만능 줄기 세포(iPSC)도 이러한 목적으로 사용되고 있다. 그러나, 기존의 유전자 요법 프로토콜에는 한계가 있을 수 있다; 그 중 바이러스 벡터의 경우 면역 반응 및 삽입 돌연변이유발 가능성과 관련된 안전성 문제, 및 비바이러스 벡터에 의한 낮은 효율성이 있다.

표적 게놈 편집을 위한 엔도뉴클레아제의 사용은 일반적인 유전자 요법 프로토콜에 의해 제공되는 한계를 해결할 수 있다. 이 효소는 맞춤형 분자 가위로서, 거의 모든 세포 유형에서 DNA를 잘 정의되고 완벽하게 특정된 조각으로 절단할 수 있다. 또한, 일시적으로 뉴클레아제를 발현하는 플라스미드에 의해, 또는 전사된 RNA에 의해 세포로 전달될 수 있어, 바이러스의 사용을 피할 수 있다.

조합 요법

치료적 접근의 조합은 LSD에서 효과적인 것으로 나타났다. 예를 들어, 본 발명자들은 유전자 요법, HST 이식 및 소분자 기질 감소의 조합이 크라베(Krabbe) 질환의 치료에 가장 효과적이었음을 이전에 보여주었다. 이와 같이, 유사한 조합 접근법은 또한 AD 또는 PD와 같은 리소좀 기능장애 관련 신경학적 질환이 있는 대상체에게 가장 효과적일 것으로 예상될 것이다. 그러나, 본 명세서에서 앞서 개시한 바와 같이, 이형접합성 집단과 관련된 기능장애는 이형접합성 LSD 집단보다 훨씬 적을 것으로 예상되기 때문에 이형접합성 집단은 치료가 더욱 쉬울 것이고 치료 효능에 대해 더 낮은 임계값을 가질 것으로 예상된다.

또 다른 예로서, 유전자 요법은 HSCT와 조합될 수 있다. 환자로부터 추출된 조혈 줄기 세포는 특정 돌연변이 근처의 부위에서 절단하도록 설계된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 벡터 및 공여자 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 공여자 벡터는 돌연변이된 영역과 상동성이지만 정확한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 영역을 함유하고, 이중 가닥 파손 후 DNA 손상 복구를 위한 주형 역할을 할 것이다. 그 다음, 절단과 상동성 재조합이 일어나는 두 벡터를 내재화하는 세포가 정확한 유전자 서열을 가질 것이며 선택되어 환자에게 다시 이식될 수 있다. 자가 HSCT와 뉴클레아제 매개 게놈 편집의 조합은 면역 기능의 회복이 빠르므로, 환자의 치료 중 감염 위험이 더 낮다는 이점이 있을 것이다. 또한, 공여자와 수혜자가 동일한 개체이기 때문에 거부 반응(이식편대숙주 질환)의 발병을 피할 수 있다. 보정된 조혈 줄기 세포(HSC) 치료는 환자로부터 추출된 조혈 줄기 세포가 맞춤형 엔도뉴클레아제를 암호화하는 벡터와 상동성 재조합을 유도하는 공여자 벡터에 의해 형질감염될 수 있는 단계를 포함할 수 있다. 그 다음, 보정된 세포는 생체외에서 선택되어, 환자에게 다시 이식될 수 있다.

개별맞춤/정밀 의학

리소좀 유전자 결함에 대한 이형접합체가 APP 프로세싱을 변경하고 Aβ 플라크 침착을 증가시킨다는 발견은 개별맞춤된(personalized) 치료 접근을 허용한다. 리소좀 관련 유전자에서 완전한 또는 거의 완전한 기능상실 변이체를 검출하는 방법은 해당 정보에 기초하여 이를 처리하기 위한 기반으로서 사용될 수 있다(예를 들어, 표 1, 표 2 및 표 3 참조).

이제 검출된 리소좀 유전자 변이체를 기반으로 하여 리소좀 기능장애와 관련된 신경학적 질환의 위험이 있는 대상체를 식별하여 치료하는 것이 가능하다. 리소좀 유전자 결함 및 LSD에 대한 치료는 잘 알려져 있으며 리소좀 기능장애(예를 들어, AD)와 관련된 신경학적 질환의 효과를 구제하는데 효과적인 것으로 나타났다.

본 명세서에 제공된 증거와 함께, LSD를 가진 동형접합성 아동에게 현재 사용되는 LSD에 대한 치료는 위험이 있는 보인자(이형접합성)에서도 작용할 것으로 예상되는데, 그 이유는 둘 다 자가포식-리소좀 경로를 포함하기 때문이며, 이형접합성 대상체의 경우 효능에 대한 임계값이 훨씬 낮을 수 있다.

자가포식-리소좀 경로(ALP)

신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 및 상태의 치료를 위해 자가포식-리소좀 경로(ALP)를 조절하는 방법이 본 명세서에 기술된다.

자가포식-리소좀 경로(ALP)는 세포내 소기관 및 응집-경향이 있는(aggregate-prone) 단백질의 분해를 위한 주요 경로이다. 자가포식('자가섭취')은 리소좀을 통한 영양소의 분해 및 재순환을 담당하는 세포내 분해 경로이다. 리소좀 기능장애가 여러 신경퇴행성 질환, 가장 특히 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)에서 역할을 할 수 있다는 증거가 증가하고 있다. 리소좀 유전자 기능상실 변이체는 또한 병인을 알 수 없는 치매의 사례와 관련이 있을 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 인간 게놈에는 ALP와 관련된 적어도 430개의 유전자가 존재한다(38개의 자가포식 유전자, 161개의 자가포식 조절 유전자, 64개의 리소좀 유전자 및 167개의 리소좀 조절 유전자). 자가포식-리소좀 경로 관련 유전자에 유해한 이형접합 변이체를 운반하는 개체는 일반적인 성인 발병 신경학적 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 전두측두엽 치매 등)의 발병 위험에 있다. 또한, 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 줄기 세포 요법 등을 통한 외인성 리소좀 단백질의 보충은 이러한 질병의 진행을 늦출 수 있다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, PD 및 AD에서 ALP 유전자의 특정 결함을 식별함으로써, 유전자 요법, 효소 대체, 경구 소분자 기질 감소 요법, 소분자 샤페론 및 PD 및 AD뿐만 아니라, 기타 신경학적 및 신경퇴행성 질환 및 장애의 잠재적 치료를 위한 자가포식 경로의 약리학적 교정(remediation)을 포함한 복수의 치료 전략을 이용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, ALP와 관련된 유전자의 발현은 신경학적 또는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 치료를 위해 조절될 수 있다. ALP와 관련된 유전자의 단백질 산물은 또한 효소 대체 요법(ERT)으로 보충될 수도 있다.

LSD 관련 유전자는 다음을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다: AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, 또는 GRN. 예를 들어, 성인 발병 신경퇴행성 질환과 상관있는 LSD-관련 유전자는 ASAH1, CLN3, CLN8, CSTD, CTNS, CTSA CTSF, DNAJC5, GAA, GALC, GALNS, GBA, GLA, GLB1, GNPTAB, GNS, GRN, HEXB, HGSNAT, IDS, IDUA, MAN2B1, MANBA, MFSD8, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PLD3, PPT1, SGSH, SMPD1, SORL1, 및 TPP1일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

ALP와 관련이 있는 유전자는 ABCA2, ABCA3, ABCA5, ABCB9, ABCC10, ACP2, ACP5, ACPP, ADA, ADAM8, ADRB2, AGA, AHNAK, ALDOB, ANKFY1, ANKRD27, ANPEP, ANXA11, AP1B1, AP1G1, AP1M1, AP1M2, AP1S1, AP1S2, AP1S3, AP3B1, AP3B2, AP3D1, AP3M1, AP3M2, AP3S1, AP3S2, AP4B1, AP4E1, AP4M1, AP4S1, AQP2, ARF1, ARL8A, ARL8B, ARRB1, ARSA, ARSB, ARSD, ARSG, ASAH1, ASS1, ATP11A, ATP11C, ATP13A2, ATP6AP1, ATP6V0A1, ATP6V0A2, ATP6V0A4, ATP6V0B, ATP6V0C, ATP6V0D1, ATP6V0D2, ATP6V1A, ATP6V1B1, ATP6V1B2, ATP6V1C1, ATP6V1C2, ATP6V1D, ATP6V1E1, ATP6V1F, ATP6V1G1, ATP6V1H, AZU1, BCL10, BLOC1S1, BTD, C18orf8, C19orf28, C1orf85, C2orf18, C7orf28B, CAT, CCDC115, CCKAR, CCZ1, CD164, CD1B, CD1D, CD1E, CD63, CD68, CD74, CECR1, CHID1, CHIT1, CLCN5, CLCN6, CLCN7, CLN3, CLN5, CLTA, CLTB, CLTC, CLTCL1, CLU, COL6A1, CP, CPVL, CREG1, CST3, CST7, CTBS, CTNS, CTSA, CTSB, CTSC, CTSD, CTSE, CTSF, CTSG, CTSH, CTSK, CTSL1, CTSL2, CTSO, CTSS, CTSW, CTSZ, CUBN, CXCR2, CYBASC3, DAGLB, DEPDC5, DKFZp761E198, DNAJC13, DNAJC5, DNAJC6, DNASE1, DNASE2, DNASE2B, DNM2, DOC2A, DPP4, DPP7, DRAM1, DRAM2, ECE1, EGF, ELANE, ENPEP, ENPP1, ENTPD4, EPDR1, FAM176A, FGFR3, FLOT1, FLOT2, FNBP1, FUCA1, FUCA2, GAA, GABARAP, GALC, GALNS, GBA, GC, GDAP2, GGA1, GGA2, GGA3, GGH, GJA1, GLA, GLB1, GM2A, GNA11, GNAI1, GNAI2, GNAI3, GNAQ, GNB1, GNB2, GNB4, GNPTAB, GNPTG, GNS, GOT1, GPC3, GPLD1, GPR137, GPR137B, GPR143, GRN, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQA2, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HPS1, HPS4, HPSE, HSPA8, HYAL1, HYAL2, HYAL3, IDS, IDUA, IFI30, IGF2R, IL4I1, ITM2C, KCNE1, KCNE2, KIAA0226, KIAA0415, KIAA1609, LAMP1, LAMP2, LAMP3, LAMTOR1, LAMTOR2, LAPTM4A, LAPTM4B, LAPTM5, LDLR, LGMN, LHCGR, LIPA, LITAF, LMBRD1, LNPEP, LOC653653, LRBA, LRP1, LRP2, M6PR, MAN2B1, MAN2B2, MANBA, 1-Mar, 2-Mar, 3-Mar, 8-Mar, 9-Mar, MCOLN1, MCOLN2, MCOLN3, MFSD1, MFSD8, MIOS, MMD, MON1B, MPO, MTOR, MYLPF, MYO7A, NAAA, NAGA, NAGLU, NAGPA, NAPA, NAPG, NAPSA, NBR1, NCSTN, NEU1, NEU4, NPC1, NPC2, NPPA, NSF, OCA2, OSTM1, P2RX4, P2RY2, PCSK9, PCYOX1, PEBP4, PGCP, PI4K2A, PLA2G15, PLA2G4E, PLA2G4F, PLBD1, PLBD2, PLD1, PLD3, PLEKHF1, PLOD1, PNPLA7, PON2, PPT1, PPT2, PRCP, PRDX6, PRF1, PRTN3, PSAP, PSAPL1, PSEN1, PSEN2, PTGDS, RAB14, RAB27A, RAB2A, RAB5C, RAB7A, RAB7B, RAB9A, RAMP2, RAMP3, RDH14, RILP, RNASE1, RNASE2, RNASE6, RNASET2, RNF13, RNF152, RPTOR, RRAGA, RRAGB, RRAGC, RRAGD, SCARB1, SCARB2, SCPEP1, SELRC1, SERINC2, SFTPB, SFTPD, SGSH, SH3GL2, SIAE, SIDT2, SLC11A1, SLC11A2, SLC12A4, SLC15A3, SLC15A4, SLC17A5, SLC26A11, SLC29A3, SLC2A13, SLC2A8, SLC30A2, SLC36A1, SLC37A3, SLC44A2, SLC48A1, SMCR8, SMPD1, SMPD4, SMPDL3A, SNAP23, SNX16, SORT1, SPACA3, SPG11, SPHK2, SPNS1, SPPL2A, SRGN, STARD3, STARD3NL, STS, STX3, STX7, STXBP2, SUMF1, TCIRG1, TIAL1, TLR3, TLR7, TLR9, TM9SF1, TMBIM1, TMEM127, TMEM175, TMEM192, TMEM55A, TMEM55B, TMEM63A, TMEM74, TMEM8A, TMEM9, TMEM92, TMEM97, TOM1L1, TPCN1, TPCN2, TPP1, TRIM23, TRIP10, TSPAN1, TSPAN8, TXNDC5, TYR, UBA52, UNC13D, UNC93B1, USP4, USP5, USP6, UVRAG, VAMP4, VAMP7, VASN, VMA21, VPS11, VPS16, VPS18, VPS33A, VPS33B, VPS35, VPS36, VPS39, VPS41, VPS4B, WDR11, WDR41, WDR48, ZFYVE26, ZNRF1, 또는 ZNRF2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

분자공학

하기 정의 및 방법은 본 발명을 보다 잘 정의하고 본 발명을 실행하는데 있어서 본 기술분야의 기술자를 안내하기 위해 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어는 관련 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.

본 명세서에 사용된 용어 "이종 DNA 서열", "외인성 DNA 절편" 또는 "이종 핵산"은 각각 특정 숙주 세포에 대해 외래인 공급원으로부터 기원하거나, 동일한 공급원으로부터 기원하는 경우에는 그 원래의 형태로부터 변형된 서열을 지칭한다. 따라서, 숙주 세포의 이종 유전자는 특정 숙주 세포에 대해 내인성이지만, 예를 들어 DNA 셔플링의 사용을 통해 변형된 유전자를 포함한다. 이 용어는 또한 자연 발생 DNA 서열의 비자연 발생의 다중 카피를 포함한다. 따라서, 이 용어는 세포에 대해 외래 또는 이종성인 DNA 분절, 또는 세포는 동종이지만, 그 요소가 일반적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있는 DNA 분절을 지칭한다. 외인성 DNA 분절은 발현되어 외인성 폴리펩타이드를 생성한다. "상동성" DNA 서열은 그것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 관련이 있는 DNA 서열이다.

발현 벡터, 발현 작제물, 플라스미드 또는 재조합 DNA 작제물은 일반적으로 특정 핵산을, 예를 들어 숙주 세포에서, 전사 또는 해독시키는 일련의 특정 핵산 인자에 의해, 재조합체 수단 또는 직접 화학적 합성을 포함하는 인간 개입을 통해 생성된 핵산을 지칭한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전사될 핵산을 포함할 수 있다.

"프로모터"는 일반적으로 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열로서 이해된다. 유도성 프로모터는 일반적으로 특정 자극에 반응하여 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 매개하는 프로모터로서 이해된다. 프로모터는 중합효소 II 유형 프로모터의 경우, TATA 요소와 같이 전사 시작 부위 근처에 필요한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 전사 시작 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼 떨어져 위치할 수 있는 원위 인핸서(enhancer) 또는 리프레서(repressor) 요소를 선택적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "전사 가능한 핵산 분자"는 RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 전사 가능한 핵산 분자가 기능적 mRNA 분자로 전사되고 이것이 해독되어 단백질 산물로서 발현되는 방식으로 작제물을 세포 내로 도입시키는 방법은 알려져 있다. 작제물은 또한 관심 있는 특정 RNA 분자의 해독을 저해하도록 안티센스 RNA 분자를 발현할 수 있도록 작제될 수 있다. 본 개시내용의 실시를 위해, 작제물 및 숙주 세포를 제조하고 사용하기 위한 통상적인 조성물 및 방법은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717, Ausubel et al.(2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook and Russel(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773, Elhai, J. and Wolk, C.P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754] 참조).

"전사 시작 부위" 또는 "개시 부위"는 위치 +1로도 정의되는, 전사된 서열의 부분인 첫 번째 뉴클레오타이드 주위의 위치이다. 이 부위와 관련하여, 이 유전자의 다른 모든 서열과 이의 조절 영역에는 번호가 매겨질 수 있다. 하류 서열(즉, 3' 방향에 있는 후속 단백질 암호화 서열)는 포지티브로 표시될 수 있는 반면, 상류 서열(5' 방향에 있는 대부분의 제어 영역)은 네거티브로 표시된다.

"작동 가능하게 연결된" 또는 "기능적으로 연결된"은 바람직하게는 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 하는 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 결합(association)을 지칭한다. 예를 들어, 조절 DNA 서열이 암호 DNA 서열의 발현에 영향을 미치도록 두 서열이 위치한다면(즉, 암호 서열 또는 기능적 RNA가 프로모터의 전사 조절 하에 있다면), 조절 DNA 서열은 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 "작동 가능하게 연결된" 또는 "결합된" 것이라고 한다. 암호 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 두 핵산 분자는 단일 근접 핵산 분자의 부분일 수 있고 인접할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 세포에서 관심 유전자의 전사를 조절하거나 매개한다면, 프로모터는 관심 유전자에 작동 가능하게 연결된 것이다.

"작제물"은 일반적으로 임의의 공급원에서 유래되고, 게놈 통합 또는 자가 복제를 할 수 있고, 하나 이상의 핵산 분자가 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 포함하는, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자가 복제 핵산 분자, 파지 또는 선형 또는 원형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자와 같은 임의의 재조합 핵산 분자로서 이해한다.

본 개시내용의 작제물은 3' 전사 종결 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 전사 가능한 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 함유할 수 있다. 또한, 작제물은 예를 들어 3'-비해독 영역(3' UTR)으로부터의 추가 조절 핵산 분자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 작제물은 해독 개시에서 중요한 역할을 할 수 있고 또한 발현 작제물의 유전자 성분일 수 있는 mRNA 핵산 분자의 5' 비해독 영역(5' UTR)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 추가 상류 및 하류 조절 핵산 분자는 프로모터 작제물에 존재하는 다른 요소와 관련하여 선천적이거나 또는 이종성인 공급원으로부터 유래될 수 있다.

"형질전환"이라는 용어는 핵산 단편이 숙주 세포의 게놈으로 전달되어 유전자적으로 안정적인 유전을 초래하는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 세포는 "트랜스제닉(transgenic)" 세포로 지칭되고, 트랜스제닉 세포를 포함하는 유기체는 "트랜스제닉 유기체"로 지칭된다.

"형질전환된", "트랜스제닉" 및 "재조합"은 이종 핵산 분자가 도입된 숙주 세포 또는 유기체, 예를 들어 박테리아, 시아노박테리움, 동물 또는 식물을 지칭한다. 핵산 분자는 본 기술분야에 일반적으로 알려져 있고 개시되어 있는 바와 같이 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다(Sambrook 1989; Innis 1995; Gelfand 1995; Innis & Gelfand 1999). PCR의 공지된 방법은 짝을 이룬 프라이머, 네스트형(nested) 프라이머, 단일 특이적 프라이머, 축퇴성 프라이머, 유전자 특이적 프라이머, 벡터 특이적 프라이머, 부분적으로 불일치하는 프라이머 등을 사용하는 방법이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. "형질전환되지 않은"이라는 용어는 형질전환 과정을 거치지 않은 정상 세포를 지칭한다.

"야생형"은 임의의 알려진 돌연변이 없이 자연에서 발견되는 바이러스 또는 유기체를 지칭한다.

상기에서 필요로 한 동일성 퍼센트를 보유하고 발현된 단백질의 필요한 활성을 유지하는 변이체 뉴클레오타이드, 및 이의 암호화된 폴리펩타이드의 설계, 생성 및 시험은 본 기술분야의 기술 내에 있다. 예를 들어, 돌연변이체의 유도 진화 및 신속한 단리는 문헌[Link et al. (2007) Nature Reviews 5(9), 680-688; Sanger et al. (1991) Gene 97(1), 119-123; Ghadessy et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8) 4552-4557]을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 참고문헌에 기술된 방법을 따를 수 있다. 따라서, 본 기술분야의 기술자는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 참조 서열에 대해 적어도 95 내지 99% 동일성을 갖는 다수의 뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 변이체를 생성하고, 본 기술분야의 통상적인 방법에 따라 원하는 표현형에 대해 이를 선별할 수 있다.

뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)는 2개의 서열이 정렬될 때 참조 서열과 비교하여 후보 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기와 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 백분율로 이해한다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 정렬하고 필요한 경우 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 갭(gap)을 도입한다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 서열 정렬 절차는 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 종종 BLAST, BLAST2, ALIGN2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어가 서열을 정렬하는데 사용된다. 본 기술분야의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 서열이 정렬될 때, 주어진 서열 B에 대해, 서열 B와, 또는 서열 B에 대항하여, 주어진 서열 A의 서열 동일성 퍼센트(대안적으로, 주어진 서열 B에 대해, 서열 B와, 또는 서열 B에 대항하여 특정 서열 동일성 퍼센트를 갖거나 포함하는 주어진 서열 A로서 표현될 수 있다)는 다음과 같이 계산될 수 있다: 서열 동일성 퍼센트 = X/Y100, 여기서 X는 A와 B의 서열 정렬 프로그램 또는 알고리즘의 정렬에 의해 동일한 일치(match)로서 채점된 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 잔기의 총 수이다. 서열 A의 길이가 서열 B의 길이와 같지 않다면, B에 대한 A의 서열 동일성 퍼센트는 A에 대한 B의 서열 동일성 퍼센트와 같지 않을 것이다.

일반적으로, 필요한 활성이 유지되는 한, 보존적 치환은 임의의 위치에서 이루어질 수 있다. 대체된 아미노산이 원래 아미노산과 유사한 특성을 갖는 소위 보존적 교환, 예를 들어 Asp에 의한 Glu, Asn에 의한 Gln, Ile에 의한 Val, Ile에 의한 Leu, 및 Thr에 의한 Ser의 교환이 수행될 수 있다. 예를 들어, 유사한 특성을 갖는 아미노산은 지방족 아미노산(예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신); 하이드록실 또는 황/셀레늄 함유 아미노산(예를 들어, 세린, 시스테인, 셀레노시스테인, 트레오닌, 메티오닌); 환형 아미노산(예를 들어, 프롤린); 방향족 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판); 염기성 아미노산(예를 들어, 히스티딘, 라이신, 아르기닌); 또는 산성 및 이들의 아미드(예를 들어, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민)일 수 있다. 결실은 아미노산이 직접 결합으로 대체되는 것이다. 결실 위치로는 폴리펩타이드의 말단 및 개별 단백질 도메인 사이의 연결을 포함한다. 삽입은 폴리펩타이드 사슬에 아미노산을 도입하는 것으로, 직접 결합이 하나 이상의 아미노산으로 공식적으로 대체된다. 아미노산 서열은, 예를 들어, 개선된 활성 또는 변경된 조절을 갖는 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 본 기술분야에 공지된 컴퓨터 시뮬레이션 프로그램의 도움으로 조절될 수 있다. 이러한 인공적으로 생성된 폴리펩타이드 서열에 기초하여, 그러한 조절된 폴리펩타이드를 암호화하는 상응하는 핵산 분자는 원하는 숙주 세포의 특이적 코돈 용법을 사용하여 시험관내에서 합성할 수 있다.

"매우 엄격한 혼성화 조건"은 6×SSC 완충액(즉, 0.9M 염화나트륨 및 0.09M 시트르산나트륨) 중에서 65℃에서의 혼성화로서 정의된다. 이러한 조건을 감안하여, 주어진 서열 세트가 혼성화할 것인지의 여부에 관해, 두 서열 사이의 DNA 이본쇄의 용융 온도(T_m)를 계산하여 결정이 이루어질 수 있다. 특정 이본쇄의 용융 온도가 6 X SSC의 염 조건에서 65℃보다 낮다면 두 서열은 혼성화하지 않을 것이다. 반면에, 동일한 염 조건에서 용융 온도가 65℃ 초과라면, 그 서열들은 혼성화될 것이다. 일반적으로, 임의의 혼성화된 DNA:DNA 서열의 용융 온도는 다음 식을 사용하여 결정할 수 있다: T_m = 81.5℃ + 16.6(log₁₀[Na⁺]) + 0.41(G/C 함량 분율) - 0.63(폼아마이드 %) - (600/l). 또한, DNA:DNA 혼성체의 T_m은 뉴클레오타이드 동일성이 1% 감소할 때마다 1 내지 1.5℃씩 감소한다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russel, 2006] 참조).

숙주 세포는 본 기술분야에 공지된 다양한 표준 기술을 사용하여 형질전환될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et al.(2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929, Sambrook and Russel(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. and Wolk, C.P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754] 참조). 이러한 기술로는 바이러스 감염, 인산칼슘 형질감염, 리포좀 매개 형질감염, 미세발사체(microprojectile) 매개 전달, 수용체 매개 흡수, 세포 융합, 전기천공 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 형질감염된 세포는 선택 및 전파되어, 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공할 수 있다.

숙주 세포에 도입될 수 있는 예시적인 핵산은, 예를 들어, 다른 종의 DNA 서열 또는 유전자, 또는 심지어 동일한 종에서 유래하거나 동일한 종에 존재하지만 유전 공학 방법에 의해 수혜자 세포에 통합되는 유전자 또는 서열을 포함한다. "외인성"이라는 용어는 또한 형질전환되는 세포에는 정상적으로 존재하지 않거나, 또는 아마도 형질전환 DNA 분절 또는 유전자에서 발견되는 형태, 구조 등으로 단순히 존재하지 않는 유전자, 또는 정상적으로 존재하고 천연 발현 패턴과 상이한 방식으로 발현시키고자 하는, 예를 들어 과발현시키고자 하는 유전자를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "외인성" 유전자 또는 DNA는 유사한 유전자가 이미 그러한 세포에 존재할 수 있는지 여부에 관계없이 수혜자 세포 내로 도입되는 임의의 유전자 또는 DNA 분절을 지칭하는 것으로 의도된다. 외인성 DNA에 포함된 DNA의 유형은 세포에 이미 존재하는 DNA, 동일한 유형의 유기체의 다른 개체로부터의 DNA, 다른 유기체의 DNA, 또는 외부에서 생성된 DNA, 예컨대 유전자의 안티센스 메시지를 함유하는 DNA 서열, 또는 합성 또는 변형된 버전의 유전자를 암호화하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기술된 접근법에 따라 개발된 숙주 균주는 본 기술분야에 공지된 다수의 수단에 의해 평가될 수 있다(예를 들어, 문헌[Studier (2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234; Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363; Baneyx(2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253] 참조).

유전자를 하향 조절하거나 침묵시키는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 발현된 단백질 활성은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 단백질 앱타머, 뉴클레오타이드 앱타머 및 간섭 RNA(RNAi)(예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 마이크로 RNA(miRNA))를 사용하여 하향조절하거나 또는 제거할 수 있다(예를 들어, 망치머리 리보자임 및 작은 헤어핀 RNA를 기술하는 문헌[Fanning and Symonds (2006) Handb Exp Pharmacol. 173, 289-303G]; 표적화 데옥시리보뉴클레오타이드 서열을 기술하는 문헌[Helene, C., et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36; Maher (1992) Bioassays 14(12): 807-15]; 압타머를 기술하는 문헌[Lee et al. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 1-8; RNAi를 기술하는 Reynolds et al. (2004) Nature Biotechnology 22(3), 326-330]; RNAi를 기술하는 문헌[Pushparaj and Melendez (2006) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 33(5-6), 504-510]; RNAi를 기술하는 문헌[Dillon et al. (2005) Annual Review of Physiology 67, 147-173]; RNAi를 기술하는 문헌[Dykxhoorn and Lieberman (2005) Annual Review of Medicine 56, 401-423] 참조). RNAi 분자는 다양한 공급원(예를 들어, Ambion, 텍사스; Sigma Aldrich, 미주리; Invitrogen)에서 구입할 수 있다. 다양한 알고리즘을 사용하는 여러 siRNA 분자 설계 프로그램은 본 기술분야에 알려져 있다(예를 들어, Cenix 알고리즘, Ambion; BLOCK-iT™ RNAi Designer, Invitrogen; siRNA Whitehead Institute Design Tools, Bioinofrmatics & Research Computing 참조). 최적의 siRNA 서열을 정의하는 데 영향을 미치는 형질로는 siRNA 말단의 G/C 함량, siRNA의 특정 내부 도메인의 Tm, siRNA 길이, CDS(암호 영역) 내의 표적 서열의 위치 및 3' 오버행(overhang)의 뉴클레오타이드 함량을 포함한다.

게놈 편집

유전자조작된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 그리고 보다 최근에는 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문(palindromic) 반복-CRISPR-관련 단백질 9(CRISPR-Cas9) 시스템을 사용하는 게놈 편집 기술의 최근 발전은 게놈에서 표적 부위를 정확하게 변형시킬 수 있는 가능성을 가능하게 했다. 이 기술은 많은 유전자 질환에 대한 치유 희망을 갖게 한다. 여기에서, 표적화된 게놈 편집은 조혈 줄기 세포 이식, 및 기능상실 리소좀 유전자 변이체가 이형접합성인 대상체의 치료에 사용되는 다른 접근법과 함께 사용되거나 또는 조합될 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 효소 활성은 게놈 편집을 사용하여 향상되거나 증가될 수 있다. 게놈 편집 공정은 잘 알려져 있다; 예를 들어, Aldi 2018 Nature Communications 9(1911) 참조. 따라서, 본 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 본 개시내용의 공정은 이러한 공정에 따라 수행될 수 있다.

예를 들어, 게놈 편집은 CRISPR/Cas9, CRISPR-Cpf1, TALEN 또는 ZNF를 포함할 수 있다. 게놈 편집에 의한 효소 활성의 적절한 향상은 LSD에 대한 보호를 초래할 수 있다.

일례로서, 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복체(CRISPR)/CRISPR 관련(Cas) 시스템은 포유류 세포에서 원하는 게놈 부위를 표적으로 하는 새로운 부류의 게놈 편집 도구이다. 최근에 공개된 II형 CRISPR/Cas 시스템은 Cas9가 인식하는 NGG 모티프 바로 앞에 있는 20개의 뉴클레오타이드 DNA 서열(따라서, (N)₂₀NGG 표적 DNA 서열)에 혼성화하는 합성 가이드 RNA와 복합체를 형성함으로써 게놈 부위에 표적화되는 Cas9 뉴클레아제를 사용한다. 이것은 NGG 모티프의 상류에 있는 3개의 뉴클레오타이드에서 이중 가닥을 파손시킨다. 이중 가닥 파손은, 오류-발생이 쉽고 유전자 대립유전자를 넉아웃(knock out)시키는 프레임이동 돌연변이에 도움이 되는 비-상동성 말단 결합, 또는 상동성 유도 수선을 유발시키며, 이는 외인성으로 도입된 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 수선 주형을 사용하여 게놈의 돌연변이를 넉인(knock-in)하거나 보정하는데 이용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템을 사용하는, 게놈 편집은 효소 생산 또는 활성을 향상 또는 증가시킴으로써 기능상실 리소좀 유전자 변이체에 대해 이형접합성인 대상체를 치료하는 치료 응용예의 유용한 도구일 수 있다.

예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법은 클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복체-관련(Cas) 단백질과 폴리뉴클레오타이드 서열을 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열을 변경시키는 방법을 포함할 수 있다.

제형

본 명세서에 기재된 작용제(agent) 및 조성물은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736 (2005)에 기술된 바와 같은 하나 이상의 약제학적 허용성 담체 또는 부형제를 사용하여 임의의 통상적인 방식에 의해 제형화될 수 있고, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다. 이러한 제형은 대상체에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 담체와 함께, 정제된 형태일 수 있는 본 명세서에 기재된 생물학적 활성제의 치료적 유효량을 함유할 것이다.

"제형"이라는 용어는 인간과 같은 대상체에게 투여하기에 적합한 형태로 약물을 제조하는 것을 지칭한다. 따라서, "제형"은 캡시드 단백질과 같은 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "약제학적 허용성"은 약리학적 활성의 허용될 수 없는 손실 또는 허용될 수 없는 이상 부작용을 일으키지 않는 물질 또는 성분을 나타낼 수 있다. 약제학적 허용성 성분의 예는 미국 약전(USP 29) 및 국립 처방집(NF 24), United States Pharmacopeial Convention, Inc, 매릴랜드 록빌, 2005("USP/NF") 또는 더 최신판의 모노그래프에 실린 것, 및 지속적으로 업데이트되는 FDA의 Inactive Ingredient Search 온라인 데이터베이스에 나열된 구성 요소일 수 있다. USP/NF 등에 기술되지 않은 다른 유용한 구성 요소도 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 또는 흡수 지연제를 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 본 기술분야에 잘 알려져 있다(일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(A.R. Gennaro, Ed.), 21st edition, ISBN: 0781746736(2005)] 참조). 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 불화합성인 경우를 제외하고, 치료 조성물에 이의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다.

"안정한" 제형 또는 조성물은 약 0℃ 내지 약 60℃와 같은 편리한 온도에서 상업적으로 합당한 기간, 예를 들어 적어도 약 1일, 적어도 약 1주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 1년, 또는 적어도 약 2년 동안 저장을 허용하기에 충분한 안정성을 갖는 조성물을 지칭할 수 있다.

제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 본 개시내용과 함께 사용되는 작용제는 경막내(예를 들어, 유전자 요법), 두개내(예를 들어, 유전자 요법), 비경구, 폐, 경구, 국소, 피내, 종양내, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸), 이식, 근육내, 복강내, 정맥내(예를 들어, 효소 대체 요법), 뇌실내, 피하, 비강내, 경막외, 안과, 경피, 협측 및 직장을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 여러 경로를 사용하여 대상체에게 투여하는 공지된 방법에 의해 제형화될 수 있다. 개별 작용제(agent)는 또한 하나 이상의 추가 작용제와 조합으로 또는 다른 생물학적 활성 또는 생물학적 불활성 작용제와 함께 투여될 수 있다. 이와 같은 생물학적 활성 또는 불활성 작용제는 작용제(들)와 유체 또는 역학적 소통 상태에 있거나, 또는 이온, 공유, 반데르발스, 소수성, 친수성 또는 다른 물리적 힘에 의해 작용제(들)에 부착될 수 있다.

제어 방출(또는 지속 방출) 제제는 작용제(들)의 활성을 연장하고 투여 빈도를 줄이도록 제형화될 수 있다. 제어 방출 제제는 작용 개시 시간, 또는 제제의 혈중 농도와 같은 기타 특성에 영향을 미치고 결과적으로 부작용 발생에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있다. 제어 방출 제제는 초기에 원하는 치료 효과를 생산하는 제제(들)의 양을 방출하고 연장된 기간에 걸쳐 치료 효과 수준을 유지하기 위해 다른 양의 작용제를 점진적 및 지속적으로 방출하도록 설계될 수 있다. 체내에서 작용제의 수준을 거의 일정하게 유지하기 위해, 작용제는 신체에서 대사되거나 배출되는 작용제의 양을 대체하는 속도로 투여 형태에서 방출될 수 있다. 작용제의 제어 방출은, 예를 들어, pH 변화, 온도 변화, 효소, 물 또는 기타 생리학적 조건이나 분자와 같은 다양한 유도인자에 의해 자극될 수 있다.

본 명세서에 기재된 작용제 또는 조성물은 또한 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 다른 치료 양식과 조합되어 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 요법 외에도, 질환, 장애 또는 병태의 치료에 효과적인 것으로 알려진 다른 요법을 대상체에게 제공할 수도 있다.

치료 방법

또한, 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 실질적으로 저해하거나, 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 진행을 늦추거나, 또는 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 발달을 제한하기 위해, 치료적 유효량의 ALP 기능 향상제(예, LSD 치료제)의 투여를 필요로 하는 대상체에서 증가된 Aβ 또는 APP 프로세싱 기능장애와 관련이 있는 신경학적 질환, 장애 또는 병태가 있거나, 있을 것으로 의심되거나, 또는 발병할 위험이 있는, 리소좀 기능장애와 관련이 있는 기능상실 유전자 변이체가 이형접합성인 대상체의 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 치료, 예방, 또는 역전시키는 방법이 제공된다.

본 명세서에 기재된 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 대상체에 대해 수행된다. 본 명세서에 기재된 치료 방법을 필요로 하는 대상체는 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 갖거나, 진단되거나, 가질 것으로 의심되거나, 또는 발병할 위험이 있는 대상체일 수 있다. 치료의 필요성에 대한 결정은 전형적으로 문제가 되는 질환이나 상태에 일관되는 병력 및 신체 검사에 의해 평가될 것이다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 치료할 수 있는 다양한 상태의 진단은 본 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 대상체는 말, 소, 개, 고양이, 양, 돼지, 마우스, 래트, 원숭이, 햄스터, 기니피그 및 인간과 같은 포유동물을 포함하는 동물 대상체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 인간 대상체일 수 있다.

일반적으로, ALP 기능 향상제의 안전하고 유효한 양은, 예를 들어 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 대상체에서 원하는 치료 효과를 일으키는 양이다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 ALP 기능 향상제의 유효량은 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 실질적으로 저해하거나, 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 진행을 늦추거나, 또는 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 발달을 제한할 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 따르면, 투여는 비경구, 폐, 경구, 국소, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 경막내, 두개내, 뇌실내, 피하, 비강내, 경막외, 안과, 협측 또는 직장 투여일 수 있다.

본 명세서에 기재된 치료에 사용되는 경우, 치료적 유효량의 ALP 기능 향상제는 순수한 형태로, 또는 이러한 형태가 존재하는 경우 약제학적 허용성 염 형태로, 약제학적 허용성 부형제와 함께 또는 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 화합물은 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 실질적으로 저해하거나, 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 진행을 늦추거나, 또는 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 발달을 제한하기에 충분한 양으로, 임의의 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 유익/유해 비율로 투여될 수 있다.

단일 투여 형태를 생성하기 위해 약제학적 허용성 담체와 조합될 수 있는 본 명세서에 기재된 조성물의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 필요한 치료적 유효량은 다수의 개별 용량의 투여에 의해 도달될 수 있기 때문에, 각 투여 형태의 개별 용량에 함유된 작용제의 단위 함량은 그 자체가 치료적 유효량을 구성할 필요는 없다는 것을 본 기술분야의 기술자라면 이해할 것이다.

본 명세서에 기술된 조성물의 독성 및 치료 효능은 LD₅₀(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED₅₀(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 따라 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 LD₅₀/ED₅₀ 비율로 표현될 수 있는 치료 지수이며, 여기서 더 큰 치료 지수가 최적인 것으로 본 기술분야에서 일반적으로 이해되고 있다.

임의의 특정 대상체에 대한 특정 치료 유효 용량 수준은 치료 중인 장애 및 장애의 중증도; 사용된 특정 화합물의 활성; 사용된 특정 조성물; 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 투여 시간; 투여 경로; 사용된 조성물의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 화합물과 조합으로 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 요인에 따라 달라질 것이다(예를 들어, 문헌[Koda-Kimble et al.(2004) Applied Therapeutics: The Clinical Use of Drugs, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453; Winter(2003) Basic Clinical Pharmacokinetics, 4^th ed., Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475; Sharqel(2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503] 참조). 예를 들어, 조성물의 시작 용량은 원하는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 수준보다 낮은 수준이고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 본 기술분야의 기술 범위 내에 있다. 원하는 경우, 유효 1일 용량은 투여 목적에 따라 다중 용량으로 분할될 수 있다. 결과적으로, 단일 용량 조성물은 1일 용량을 구성하는 양 또는 이의 부분다중 용량을 함유할 수 있다. 그러나, 본 개시내용의 화합물 및 조성물의 총 1일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다.

다시 말하지만, 본 명세서에 기술된 상태(state), 질환, 장애 및 상태(condition) 각각은 물론 다른 것들도 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법으로부터 이익을 얻을 수 있다. 일반적으로, 상태, 질병, 장애 또는 상태를 치료하는 것은 그 상태, 질병, 장애 또는 상태에 걸리거나 걸릴 소인이 있을 수 있으나, 아직 이의 임상적 또는 무증상적 증상을 경험하지 않거나 나타내지 않는 포유류에서 임상 증상의 출현을 예방, 역전 또는 지연시키는 것을 포함한다. 또한, 치료는, 상태, 질환, 장애 또는 병태를 저해하는 것, 예를 들어, 질환 또는 이의 적어도 하나의 임상적 또는 무증상적 증상의 발달을 저지하거나 감소시키는 것을 포함할 수도 있다. 또한, 치료는 질병의 완화, 예를 들어 상태, 질환, 장애 또는 병태 또는 이의 임상적 또는 무증상적 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 유발하는 것을 포함할 수 있다. 치료될 대상체에 대한 이점은 통계적으로 유의미할 수 있거나, 또는 대상체 또는 의사가 적어도 인지할 수 있는 것일 수 있다.

ALP 기능 향상제의 투여는 단일 이벤트(event)로 또는 치료의 시간 경과 동안 발생할 수 있다. 예를 들어, ALP 기능 향상제는 매일, 매주, 격주로 또는 매월 투여될 수 있다. 유전자 요법의 경우, 치료 시간 경과는 일반적으로 적어도 1일 내지 수 일일 것이다. ERT와 같은 특정 치료법은 수 일에서 수 주까지 치료를 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 치료는 1주, 2주 또는 3주에 걸쳐 연장될 수 있다. 더 만성적인 상태와 장기 치료 방법의 경우, 치료는 수 주에서 수 개월 또는 심지어 1년 이상까지 연장될 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 따른 치료는 리소좀 유전자의 기능상실 변이체와 관련이 있는 신경학적 질환, 장애 또는 병태에 대한 통상적인 치료 양식 이전에, 그와 동시에, 또는 그 이후에 수행될 수 있다.

투여

본 명세서에 기재된 작용제 및 조성물은 본 기술분야에 공지된 다양한 수단으로 본 명세서에 기재된 방법에 따라 투여할 수 있다. 작용제 및 조성물은 외인성 물질 또는 내인성 물질로서 치료적으로 사용될 수 있다. 외인성 작용제는 신체 외부에서 생산 또는 제조되어 신체에 투여되는 것이다. 내인성 작용제는 신체의 다른 기관 내에서 또는 신체의 다른 기관으로 전달하기 위해 일부 유형의 장치(생물학적 또는 기타 장치)에 의해 신체 내부에서 생산 또는 제조되는 것이다.

상기 논의된 바와 같이, 투여는 두개내, 경막내, 비경구, 폐, 경구, 국소, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 뇌실내, 피하, 비강내, 경막외, 안과, 협측 또는 직장 투여일 수 있다.

본 명세서에 기재된 작용제 및 조성물은 본 기술분야에 잘 알려진 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여는, 예를 들어, 경구 섭취, 직접 주사(예를 들어, 전신 또는 정위), 관심 인자를 분비하도록 조작된 세포 이식, 약물 방출 생체재료, 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템, 다층 코팅, 마이크로입자, 이식가능한 매트릭스 장치, 미니삼투 펌프, 이식가능한 펌프, 주사가능한 겔 및 하이드로겔, 리포좀, 미셀(예를 들어, 최대 30㎛), 나노스피어(예를 들어, 1㎛ 미만), 마이크로스피어(예를 들어, 1 내지 100㎛), 저장 장치, 상기한 것 중 임의의 조합, 또는 다양한 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위한 기타 적절한 전달 비히클을 수반하는 방법을 포함할 수 있다. 작용제 또는 조성물을 제어 방출 전달하는 다른 방법은 본 기술분야의 기술자에게 공지되어 있을 것이며 본 개시내용의 범위 내에 있다.

전달 시스템은, 예를 들어, 인슐린 또는 화학요법을 특정 기관 또는 종양에 전달하는 데 사용되는 것과 유사한 방식으로 작용제 또는 조성물을 투여하는 데 사용할 수 있는 주입 펌프를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 시스템을 사용하여, 작용제 또는 조성물은 선택된 부위에서 제어된 기간에 걸쳐 작용제를 방출하는 생분해성, 생체적합성 중합체 임플란트와 조합으로 투여될 수 있다. 중합체 물질의 예는 폴리안하이드라이드, 폴리오쏘에스터, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 및 이의 공중합체 및 조합을 포함한다. 또한, 제어 방출 시스템은 치료 표적 근처에 배치될 수 있어, 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다.

작용제는 다양한 담체 전달 시스템에 캡슐화되고 투여될 수 있다. 담체 전달 시스템의 예에는 마이크로스피어, 하이드로겔, 중합체성 임플란트, 스마트 중합체성 담체 및 리포좀이 포함된다(일반적으로, 문헌[Uchegbu and Schatzlein, eds. (2006) Polymers in Drug Delivery, CRC, ISBN-10: 0849325331] 참조). 분자 또는 생체분자 작용제 전달을 위한 담체 기반 시스템은 다음을 수행할 수 있다: 세포내 전달 제공; 생체분자/작용제 방출 속도 조정; 작용 부위에 도달하는 생체 분자의 비율 증가; 작용 부위로 약물 수송 개선; 다른 작용제 또는 부형제와 함께 공동국재화된 침착 허용; 생체내에서 작용제의 안정성 개선; 제거율을 감소시킴으로써 작용 부위에서 작용제의 체류 시간 연장; 비표적 조직으로 작용제의 비특이적 전달 감소; 작용제로 인한 자극 감소; 작용제의 높은 초기 투여량으로 인한 독성 감소; 작용제의 면역원성 변경; 투여 빈도 감소, 제품의 맛 개선; 또는 제품 저장 수명 개선.

분자 생물학 프로토콜을 사용하는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 본 기술분야에 공지된 다양한 표준 기술을 따를 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879697717; Ausubel et al.(2002) Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed., Current Protocols, ISBN-10: 0471250929; Sambrook and Russel(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10: 0879695773; Elhai, J. and Wolk, C.P. 1988. Methods in Enzymology 167, 747-754, Studier(2005) Protein Expr Purif. 41(1), 207-234; Gellissen, ed. (2005) Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10: 3527310363; Baneyx(2004) Protein Expression Technologies, Taylor & Francis, ISBN-10: 0954523253] 참조).

본 명세서에 기재된 정의 및 방법은 본 개시내용을 보다 잘 정의하고 본 개시내용의 실시에서 본 기술분야의 기술자를 안내하기 위해 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어는 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용의 특정 실시형태를 설명하고 청구하는 데 사용되는 성분의 양, 특성, 예컨대 분자량, 반응 조건 등을 나타내는 숫자는 일부 경우에 "약"이라는 용어가 수식하고 있는 것으로서 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 값이 이 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 수단의 표준 편차를 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 서면 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 매개변수는 특정 실시형태에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 일부 실시형태에서, 수치 매개변수는 기록된 유효 숫자의 수에 비추어 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 본 개시내용의 일부 실시형태의 넓은 범위를 나타내는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 기록된다. 본 개시내용의 일부 실시형태에 제시된 수치 값은 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 특정 오류를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 범위 내에 속하는 각각 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약기 방법으로서 역할을 하도록 의도된 것이다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, 각각의 개별 값은 본 명세서에 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다.

일부 실시형태에서, 특정 실시형태를 기술하는 맥락에서(특히 이하 청구범위 중 특정 맥락에서) 사용되는 단수적 표현의 용어 및 유사한 언급은 특별히 달리 명시되지 않는 한, 단수 및 복수를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시형태에서, 청구범위를 포함한 본 명세서에 사용된 용어 "또는"은 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 나타내지 않거나 대안이 상호 배타적이지 않은 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.

용어 "포함한다(comprise)", "갖는다(have)" 및 "포함한다(include)"라는 용어는 개방형 연결 동사이다. "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", "갖는다(has)", "갖는(haing)", "포함한다(includes)" 및 "포함하는(including)"과 같은 이러한 동사 중 하나 이상의 모든 형태 또는 시제도 역시 개방형이다. 예를 들어, 하나 이상의 단계를 "포함하는", "갖는" 또는 "포함하는" 임의의 방법은 그러한 하나 이상의 단계만을 보유하는 것으로 제한되지 않으며, 다른 목록에 없는 단계도 포함할 수 있다. 유사하게, 하나 이상의 특징을 "포함하는", "갖는" 또는 "포함하는" 임의의 조성물 또는 장치는 하나 이상의 특징만을 보유하는 것으로 제한되지 않고 다른 목록에 없는 특징을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서의 특정 실시예와 관련하여 제공된 임의의 예 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 개시내용을 더 잘 밝히기 위한 것이며, 달리 청구된 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 언어는 본 개시내용의 실행에 필수적인 임의의 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서에 개시된 본 개시내용의 대안적인 요소 또는 실시형태의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각 그룹의 구성원은 개별적으로 지칭되고 청구될 수 있거나, 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본 명세서에서 발견되는 다른 요소와 임의의 조합으로 지칭되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹에서 결실될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 결실이 나타나는 경우, 본 명세서는 변형되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마커쉬(Markush) 그룹의 서면 설명을 만족시키는 경우, 그룹을 함유하는 것으로 본 명세서에서 간주된다.

본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 참고 문헌은 마치 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 참고 문헌이 모든 목적을 위해 전체가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼, 모든 목적에 동일한 정도로 그 전체가 참조로 포함된다. 본 명세서에서 참고문헌의 인용은 그것이 본 개시내용에 대한 선행 기술임을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.

본 개시내용은 상세히 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 기재된 본 개시내용의 범위를 벗어남이 없이 변형, 변이 및 균등한 실시형태가 가능하다는 것은 명백할 것이다. 또한, 본 개시내용의 모든 실시예는 비제한적인 예로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예

이하 비제한적 실시예는 본 개시내용을 추가로 예시하기 위해 제공된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명자들이 본 개시내용의 실시에서 잘 기능하는 것으로 발견한 접근법을 나타내고, 따라서 본 실시 방식의 예를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 본 기술분야의 기술자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 본 기술분야의 기술자는 본 개시내용에 비추어, 개시되는 특정 실시형태에 많은 변화가 이루어질 수 있고 본 개시내용의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 같거나 유사한 결과가 수득된다는 것을 인식해야 한다.

실시예 1: 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 병리에 대한 NAGLU 변이체의 역할 조사

본 실시예는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 발병에서 헤파란 설페이트의 리소좀 분해에 관여하는 유전자의 유전자 변이의 역할을 시험관내 및 생체내에서 검증하는 것을 기술한다.

리소좀 기능장애가 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD) 및 전두측두엽 치매(FTD)와 같은 여러 성인 발병 신경퇴행성 질환에 대한 일반적인 병원성 메커니즘임을 시사하는 강력한 유전자적 및 생화학적 증거가 있다. 그러나, 리소좀 기능의 연령 의존적 및 AD 및 PD 관련 감소를 뒷받침하는 유전자 변이는 잘 이해되어 있지 않다. 또한, 각 리소좀 유전자의 일반 집단 내에서 유전자 변이가 AD 또는 PD의 발병 위험 및 질병 발병에서의 역할에 대한 기여는 체계적이고 포괄적인 평가가 완료되지 않았다. 현재 지식에서 이 격차를 해결하기 위해 45개의 리소좀 유전자에 대한 단일 변이체 및 유전자 기반 분석을 AD 및 PD의 사례-대조 코호트(case-controlled cohort)에서 수행하였다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, AD 및 PD 둘 모두와 관련이 있는 몇몇 리소좀 효소 유전자의 변이체가 발견되었다. 이 데이터는 PD와 GBA의 관련성을 확인시켜준다. 특히 관심의 대상은 AD 및 PD 환자에서 헤파란 설페이트(HS) 대사를 담당하는 유전자(GNS, NAGLU, SGSH 및 HGSNAT)에 희귀 기능 변이체의 풍부함(enrichment)이다. 또한, PD 환자의 흑색질로부터의 도파민성 뉴런에는 감소된 NAGLU 전사체 수준이 있다.

흥미롭게도, NAGLU 전사체 수준은 또한 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 사례에서 현저히 더 높고, AD의 마우스 모델에서 병리의 발달에 비례하는 연령 의존적 증가를 나타낸다. 특정 단백질 코어에 공유 부착된 HS 사슬로 이루어진 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan: HSPG)은 폭넓은 리간드와 상호작용하는 풍부한 세포 표면 및 세포외 분자이다. HSPG는 아밀로이드(Aβ), 아포지단백질 E(apoE), 타우(tau), 및 알파-시누클레인(α-Syn)을 비롯한 다양한 병원성 단백질의 올리고머화, 제거, 세포내이입 및 트래피킹(trafficking)을 조절한다. 병원성 단백질의 HSPG 결합의 약리학적 저해 및 HSPG 합성의 유전자적 감소는 병원성 단백질의 제거를 촉진하고 이들의 응집을 감소시킨다. 현재까지 NAGLU 활성의 감소와 그에 따른 HSPG 축적이 APP 대사, Aβ 플라크 부담 또는 α-Syn 응집 및 확산에 영향을 미치는지의 여부는 명확하지 않다.

본 명세서에 기술된 바와 같이, NAGLU 활성에 선택된 유전자 변이체의 기능적 영향을 완전히 특성화하는 데에는 생화학 및 세포 기반의 검정을 사용할 수 있다. 전체 길이의 APP 수준, APP 트래피킹, 뉴런의 Aβ 생성 및 신경교 세포에 의한 Aβ 분해에 대한 돌연변이 NAGLU의 효과가 조사된다. NAGLU의 반수체기능부전이 AD의 잘 특성화된 마우스 모델에 존재하는 AD 병리를 가속화하는지 여부를 결정할 수 있다. α-Syn PFF의 결합, 내재화 및 응집이, 선택된 변이체를 안정적으로 발현하는 NAGLU 결손 및 반접합성 마우스의 1차 뉴런에서 영향을 받는지 여부가 결정될 수 있다. 마지막으로, α-Syn PFF의 선조체내 접종은 반접합성 또는 넉아웃(KO) NAGLU 마우스에서 수행되고, pSyn의 응집체 형성, 연결도 의존성(connectivity dependent) 확산, 및 질환 진행 및 수명에 대한 이들의 영향이 정량화된다.

프로젝트 설명

본 연구의 목표는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 발병에서 헤파란 설페이트의 리소좀 분해에 관여하는 유전자의 유전자 변이의 역할을 시험관내 및 생체내에서 검증하는 것이다. 본 명세서에 기술된 연구는 시험관내 및 생체내 모두에서 선택된 NAGLU 변이체의 기능적 효과를 검증하기 위해 전산 방법과 실험 데이터를 연결시킨 혁신적인 통합 프레임워크를 포함한다. 여기에 개략된 실험은 AD 및 PD와 관련이 있는 새로운 리소좀 유전자를 밝혀내고 AD 및 PD 발병에 리소좀 기능장애의 메커니즘에 대해 더 잘 통찰력을 제공한다.

리소좀 유전자의 동형접합성 돌연변이로 인한 심각한 리소좀 기능장애가 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD) 및 전두측두엽성 치매(FTD)와 같은 여러 성인 발병 신경퇴행성 질환의 일반적인 병원성 메커니즘임을 시사하는 강력한 유전자적 및 생화학적 증거가 있다. 45개 리소좀 유전자에 대한 단일 변이체 및 유전자 기반 분석을 AD(5712개 사례/5011개 대조군) 및 PD(821개 사례/750개 대조군)의 사례-대조 코호트에서 수행하였다. 변이체는 AD 및 PD 둘 다와 관련된 다수의 리소좀 효소 유전자에서 식별되었다. 중요하게도, 이 데이터는 PD와 GBA의 관련성을 확인시켜준다. 특히, 관심의 대상은 AD 및 PD 환자에서 헤파란 설페이트(HS) 대사를 담당하는 유전자(SGSH, NAGLU, HGSNAT 및 GNS)에서 희귀 이형접합성 기능 변이체의 풍부함이었다. PD 환자의 흑색질(SN)로부터 도파민성 뉴런에는 N-아세틸-알파-글루코사미니다제(NAGLU)의 전사체 수준이 감소되어 있다. NAGLU 및 SGSH에서 예측된 희귀 이형접합성 기능 변이체의 풍부함은 AD 환자에서 발견되었다.

흥미롭게도, NAGLU 전사체 수준은 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 사례에서 또한 현저히 더 높고, AD의 마우스 모델에서 병리의 동시 발달과 함께 비례하는 연령 의존적 증가를 나타낸다. 분석 결과 다수의 리소좀 효소 유전자에서 반수체기능부전이 AD 및 PD의 위험 인자로서 확인되었지만, 변경된 리소좀 HS 대사의 효과가 연구되고 잘 특성화된 동형접합성 NAGLU-결손 마우스에서 원리 증명 실험이 수행되었다. 따라서, 지금까지 NAGLU의 반수체기능부전이 임의의 신경학적 질환과 관련이 있다는 직접적인 생물학적 증거는 없었다. 특정 단백질 코어에 공유 부착된 HS 사슬로 이루어진 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)은 폭넓은 리간드와 상호작용하는 풍부한 세포 표면 및 세포외 분자이다. HSPG는 아밀로이드(Aβ), 아포지단백질 E(apoE), 타우 및 알파-시누클레인(α-Syn)을 비롯한 다양한 병원성 단백질의 올리고머화, 제거, 세포내이입 및 트래피킹을 조절한다.

병원성 단백질의 HSPG 결합의 약리학적 저해 및 HSPG 합성의 유전자적 감소는 병원성 단백질의 제거를 촉진하고 이들의 응집을 감소시킨다. 대부분의 HSPG 및 결합된 리간드는 리소좀 프로테아제, 엑소글리코시다제 및 설파타제에 의해 분해된다. SGSH, NAGLU, HGSNAT 및 GNS 효소는 리소좀에서 HS의 단계적 분해에 관여한다. 이러한 유전자의 기능상실(LoF) 돌연변이는 리소좀 내부에 부분적으로 분해된 HS의 축적을 초래하고 점액다당류증(MPS) III A, B, C 및 D형을 유발한다. 여러 성인 발병 신경퇴행성 질환의 병인에서 HSPG의 변경된 리소좀 분해의 역할이 덜 명확할지라도, 동형접합성 NAGLU-결손 마우스는 중앙 내후각피질에서 과인산화된 타우, Aβ 및 HSPG의 세포내 축적을 나타낸다. 또한, MPS IIIB 환자는 심각한 SN 뉴런 손실 및 측두엽 피질, 해마 및 SN의 뉴런에 인산화된 α-Syn(pSyn)의 축적을 나타낸다. 이러한 데이터와 다른 데이터는 AD와 PD 사이의 일반적인 병원성 메커니즘으로서 심각한 리소좀 기능장애를 강력하게 시사한다. 그러나, 위에서 언급한 바와 같이, 성인 발병 신경학적 질환에서 리소좀 단백질의 반수체기능부전을 시사하는 직접적인 생물학적 데이터는 없다(글루코세레브로시다제(GBA) 및 파킨슨병의 한 가지 주목할만한 예외는 있음).

(I) NAGLU 유전자에서 희귀 변이체의 기능적 효과의 결정

기능적 효과를 검증하기 위해, NAGLU-결손 마우스의 세포를 가장 유해한 것으로 예상되는 3가지 변이체를 운반하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 효소 활성 및 HSPG 수준에 대한 효과를 측정한다.

(II) NAGLU 유전자의 변이체가 시험관내에서 APP 대사, Aβ 생성 및 Aβ 분해에 대해, 그리고 NAGLU 반수체기능부전이 생체내에서 AD 병리에 대해 미치는 효과 결정

검증된 변이체(섹션 (I)에 기재된 것)를 안정적으로 발현하는 NAGLU-결손성 및 반접합성 마우스로부터의 1차 뉴런이 APP 트래피킹, APP 반감기, APP 프로세싱 기구 및 Aβ 생성에 미치는 효과에 대해 시험한다. 선택된 변이체를 안정적으로 발현하는 NAGLU-결손성 또는 반접합성 마우스의 신경교 세포는 Aβ 흡수 및 분해에 대해 시험한다.

NAGLU 반수체기능부전이 5XFAD 마우스에서 초기(4개월) 및 후기(8개월령)에 Aβ 생성, Aβ 제거, 플라크 침착, 시냅스 손실 및 신경염증에 영향을 미치는지의 여부를 결정할 수 있다. 가장 유해한 변이체(섹션 (I) 유래)는 AAV2/9-PHP.B 위형 벡터를 사용하여 신생 반접합성 마우스의 뇌에서 발현되고, FAD 돌연변이가 없는 24개월 마우스에서 AD 관련 표현형에 대한 NAGLU 반수체기능부전 효과의 정량적인 병리학적 조사가 수행된다.

(III) 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 대한 NAGLU의 효과 결정

NAGLU 유전자의 PD-관련 기능적 변이체가 α-Syn 응집 및 세포간 전파에 영향을 미치는 것으로 가정된다. 선택된 변이체를 안정적으로 발현하는 NAGLU-결손성 및 반접합성 마우스 유래의 1차 뉴런에서 α-Syn PFF의 결합, 내재화 및 응집이 영향을 받는지 여부가 결정될 수 있다. 마지막으로, 재조합 효소 대체 또는 유전자 요법이 α-Syn PFF의 내재화 및 응집에 대한 효과를 구제하는지 여부가 결정될 수 있다.

α-Syn PFF의 선조체내 주사는 돌연변이 A53T 인간 α-Syn을 발현하는 야생형 마우스 및 트랜스제닉 마우스에서 세포내 루이소체(LB) 병리의 축적, SN 뉴런의 선택적 손실 및 손상된 운동 조화를 발생 반복한다. α-Syn PFF의 선조체내 접종은 출생 시 가장 유해한 NAGLU 변이체를 발현하는 AAV2/9-PHP.B 위형 벡터가 주사된 반접합성 또는 NAGLU-결손 마우스에게 수행된다. pSyn의 응집체 형성, 연결도-의존적 확산 및 이들의 질병 진행 및 수명에 대한 영향이 정량화된다.

의의

AD의 ALP 기능장애

가족형 AD는 증가된 아밀로이드-β(Aβ)를 생산하고 후속적으로 세포외 공간(ISF, 간질액)에서 Aβ가 가용성 올리고머 또는 불용성 Aβ 플라크로 응집함으로써 병원성으로 유도되지만, 후기 발병 산발성 AD 환자에서의 최근 연구는 Aβ1의 제거 장애를 입증한다. 따라서, 생산과 제거 사이의 균형은 Aβ 수준 및 Aβ 플라크를 발생시키는 경향을 결정한다. 자가포식-리소좀 경로(ALP)는 세포내 소기관 및 응집체-경향이 있는(aggregate-prone) 단백질을 분해하는 주요 경로이다. 자가포식('자가 섭취')은 리소좀을 통한 영양소의 소화 및 재순환을 담당하는 세포내 분해 경로이다. ALP "코어(core)" 유전자는 인간 뇌에서 정상적인 노화 동안 전사적으로 하향조절된다. 이에 반해, AD 환자의 뇌에서는 ALP가 전사적으로 상향조절된다. 산발성 AD 뇌에서는 beclin 1(ALP에서 자가포식소체 형성에 필수적인 다기능 단백질) 수준 감소, rab5 및 rab7(엔도솜-리소좀 경로를 따라 소포의 트래피킹을 조절하는 작은 ras 관련 GTPase(rab) 단백질) 수준 증가, 거대자가포식(높은 LC3-II 수준) 및 mTOR 신호전달(인산화된 p70 S6 키나제)의 비정상적인 활성화 및 이영양증 신경돌기에서 자가포식성 액포(AV) 및 리소좀 조밀체의 대량 뉴런 축적이 있다.

또한, 신경병리학적 연구에 따르면, AD 뇌의 자가포식-리소좀 병리가 AD 발병에 기여하는 것으로 발견되었지만, 기본 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다. ALP의 변화는 또한 복수의 트랜스제닉 마우스 AD 모델에서도 발견되었다. 두 AD 마우스 모델에서 beclin 1의 반수체기능부전은 이들의 리소좀을 더욱 파괴시켰고 세포내 및 세포외 Aβ 축적을 촉진하였으며 신경퇴행을 악화시켰다. 리소좀 뉴라미니다제 1(NEU1)의 동형접합 손실은 AD 모델에서 Aβ 병리를 악화시켰다. 이에 반해, NEU1의 과발현은 AD 병리를 감소시켰다. 이러한 결과는 모두 ALP "코어" 유전자 또는 리소좀 단백질의 변화가 AD 병리를 가속시킨다는 것을 시사한다. 세포 연구에 따르면, 엔도솜-리소좀 시스템이 Aβ 생산의 주요 부위임을 시사한다. 그러나, 정확히 어디에서 Aβ가 생성되는지에 대해서는 의견일치된 것이 없다. Aβ는 시험관내 및 생체내 모두에서 거대자가포식을 유도한 후 생성된다. Aβ의 축적은 mTOR 신호전달을 증가시키는 반면, mTOR 신호전달의 감소는 Aβ 수준을 감소시키는데, 이는 ALP 활성화와 Aβ 수준 사이의 네거티브 피드백 루프를 시사한다. 자가포식 활성화 하에, 자가포식성 액포는 γ-세크레타제 활성이 가장 높은 세포 부위가 된다. 프레세닐린(Presenilin) 2(PSEN2) 및 니카스트린(Nicastrin)(촉매적으로 필수적인 γ-세크레타제 성분)은 리소좀에 위치한다. 사실, PSEN1은 리소좀 pH를 조절한다.

시험관내에서 리소좀 기능의 약리학적 손상은 Aβ 생산의 변화를 초래한다. 리소좀 pH의 변화는 Aβ 분비를 감소시킨다. 리소좀 프로테아제 저해제는 아밀로이드생성 APP 단편의 생산을 감소시킨다. 이러한 모든 연구는 전반적인 리소좀 기능이 정상 및 비정상 Aβ 전구체 단백질(APP) 프로세싱 및 후속 아밀로이드생성에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 인간 병리학, 마우스 및 세포 모델로부터의 모든 증거는 자가포식 유도의 결손이 질병 초기에 발생하지만, 리소좀 제거 결손은 질병의 더 진행된 단계에서 발생함을 강력하게 시사한다.

PD의 리소좀 기능장애

세포내이입 트래피킹, 리소좀 완전성(integrity) 및 리소좀 가수분해효소 활성의 심각한 유전자 결함이 시누클레인병증의 위험 인자임이 인간의 사후 연구 및 모델 시스템에서 잘 확립되어 있다. 파킨슨병(PD)의 병원성 메커니즘으로서 리소좀 기능장애는 가족성 PD에서 ATP13A2(리소좀 ATPase) 및 VPS35 유전자(엔도솜-리소좀 트래피킹)의 돌연변이에 의해 뒷받침된다. 또한, GBA 유전자(리소좀 가수분해효소 글루코세레브로시다제) 및 SMPD1 유전자(리소좀산 스핑고미엘리나제)의 저-빈도 변이체는 산발성 PD의 위험을 증가시킨다. 최근 메타 분석에 따르면 SCARB2(리소좀 통합 막 단백질 2형), TMEM175(막횡단 단백질 175), CTSB(리소좀 시스테인 프로테아제 카텝신 B), ATP6V0A1(ATPase H+를 수송하는 V0 서브유닛 a1) 및 GALC(리소좀 갈락토실세라미다제) 유전자는 또한 PD 위험과 관련이 있는 것으로 발견되었다. 리소좀 마커(LAMP-1, LAMP-2a, 카텝신-D, GBA 및 ATP13A2)는 산발성 PD 환자에서 LB의 구성요소로서 식별되었다. 따라서, LB 및 루이소체 신경돌기(LN)는 손상된 리소좀 주위에 파종되어 질환이 진행됨에 따라 리소좀 유래의 미분해 물질의 지속적인 침착에 의해 크기가 커질 수 있는 것으로 암시되었다.

복수의 세포 기반 모델은 최근 기계론적인 의문이 남아 있지만, 시누클레인병증의 진행에서 단백질증성(proteopathic) 종자의 세포간 전달의 가능한 중심적 역할에 대해 집중되고 있다. 또한, 특정 α-Syn 계통(strain)이 별개의 수용체 또는 세포내이입 메커니즘을 통해 내재화되는지 여부는 여전히 불분명하다. 불멸화 세포와 1차 뉴런에 의한 α-Syn의 거대음세포(macropinocytotic) 흡수는 HSPG에 의해 매개되는 것으로 보인다. 그러나, 생체내 α-Syn 확산에서 HS의 역할은 평가되지 않았다. 리소좀 프로세싱은 1차 뉴런에서 내재화된 α-Syn 원섬유의 주된 운명이다. 간단히 말해서, 리소좀 기능의 심각한 약리학적 교란은 α-Syn 원섬유의 세포내 프로세싱에 이상을 유발하며, 동시에 내인성 α-Syn의 모집을 통한 봉입체 형성 속도의 증가를 동반한다. 이 모집을 통제하는 과정은 아직 제대로 이해되지 않았고 병원성 종은 엔도-리소좀 트래피킹을 피해야 한다는 것을 시사한다. 따라서, 외인성 α-Syn 종은 세포내이입 소포 및 리소좀 막 파열을 초래하여, 세포내이입 트래피킹 및 리소좀 분해를 피하는 것으로 보고되었다. 일단 세포기질(cytosol)에 들어가면, 이러한 α-Syn 원섬유 또는 올리고머는 가용성 종과 상호작용하고 내인성 α-Syn의 모집을 개시할 수 있다. 이러한 결과는 리소좀 활성 및 완전성의 결함이 병리학적 α-Syn 응집 및 전달을 가속화할 수 있다는 발상을 추가로 뒷받침한다.

리소좀 결함은 α-Syn의 새로운 응집 및 성숙한 세포기질 응집체의 손상된 자가포식 분해에 기여하는 것으로 생각된다. 흥미롭게도, 여러 시험관내 및 생체내 α-Syn 과발현 모델에서 신경보호는 라파마이신(mTOR) 의존성 또는 mTOR 독립성 자가포식 향상제의 포유류 표적을 사용하여 보고되었다. 유사하게, beclin-1의 바이러스 벡터 매개 발현은 α-Syn 트랜스제닉 마우스에서 α-Syn 응집체 및 시냅스 병리를 감소시킨다. ALP의 마스터 활성제인 전사 인자 EB(TFEB)의 과발현은 또한 α-Syn 응집을 방지한다. 종합하면, 이러한 연구들은 PD에서 리소좀 기능을 회복시키는 것을 목표로 하는 새로운 치료법이 매우 필요한 질환 수정 치료 전략을 제공할 수 있음을 나타낸다.

AD 및 PD에서의 헤파란 설페이트

특정 단백질 코어에 공유 부착된 HS 사슬로 이루어진 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)은 폭넓은 리간드와 상호작용하는 풍부한 세포 표면 및 세포외 분자이다. 막 HSPG는 세포내이입 수용체로서 작용하고 구성적 및 리간드 유도적 세포내이입을 겪는다. 대부분의 HSPG 및 결합된 리간드는 리소좀 프로테아제, 엑소글리코시다제 및 설파타제에 의해 분해된다. HSPG는 Aβ, apoE, 타우 및 α-Syn을 포함한 다양한 병원성 단백질의 올리고머화, 제거, 세포내이입 및 트래피킹을 조절한다. HSPG는 Aβ 플라크와 LB 및 LN에 존재한다. HSPG는 Aβ에 결합하여 이의 올리고머화 및 응집을 가속화하는 것으로 나타났다. HS는 시험관내에서 α-Syn 원섬유의 형성을 상당히 자극한다. HS는 또한 세포 Aβ 흡수를 매개한다. HSPG는 α-Syn의 거대음세포성 흡수를 매개한다. 병원성 단백질의 HSPG 결합의 약리학적 저해 및 HSPG 합성의 유전자적 감소는 병원성 단백질의 제거를 촉진하고 이들의 응집을 감소시킨다. 이러한 발견은 HS 및 HSPG가 Aβ 및 α-Syn 대사와 AD 및 PD의 발병에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. NAGLU는 헤파란 설페이트(HS)의 리소좀 분해에 참여하는 N-아세틸-알파-글루코사미니다제를 암호화한다. NAGLU의 LoF 돌연변이는 산필리포(Sanfilippo) 증후군 B로도 알려진 점액다당류증 IIIB형(MPS-IIIB)을 유발한다. Aβ 플라크 부재하에 NAGLU-결손 환자와 인간 MPS-IIIB 환자 모두의 뇌에서는 세포내 전체 길이-APP의 정성적으로 증가된 수준이 보고되었다. MPS-IIIB 환자는 정상 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ40 수준에서 현저한 3배 증가를 나타낸다. MPS IIIB 환자는 심각한 SN 뉴런 손실 및 측두피질, 해마 및 SN의 뉴런에서 인산화된 α-Syn 축적을 나타낸다. 현재까지 NAGLU 활성의 감소와 그로 인한 HSPG 축적이 APP 대사, Aβ 생성 또는 제거 또는 α-Syn 응집 및 확산에 영향을 미치는지의 여부는 명확하지 않다.

혁신

본 명세서에 기술된 연구의 목표는 AD 및 PD의 리소좀 기능장애에 대한 유전자적 발견을 검증하고 더욱 통찰하는 것이다. 또한, 이 연구는 유전자적으로 결정된 리소좀 기능장애를 가진 PD 및 AD 환자의 식별을 용이하게 할 수 있으며, 이러한 기능장애의 회복은 효과적인 치료법을 제공할 수 있다. 본 명세서에 개략된 연구는 AD 및 PD에 의한 NAGLU 유전자에 관련이 있는 유전자 변이의 기능적 결과를 체계적이고 종합적으로 평가하는 데 있어 개념적으로 혁신적이다(섹션(I)). 이 연구는 Aβ 생성 및 제거(섹션 (II))뿐만 아니라 시험관내 및 생체내 α-Syn 응집 및 확산(섹션 (III))에 대한 노화 및 NAGLU 반수체기능부전이 미치는 효과에 대한 더 나은 이해를 제공할 것이다. 또한, 이 연구는 NAGLU를 유전자적으로 변경한 결과 및 임상적으로 관련된 평가변수(endpoint)에서 Aβ 및 α-Syn 병리에 미치는 그의 효과를 결정하기 위해 뉴런 병리를 신중하게 조사한다. 본 명세서에 기술된 연구는 시험관내 및 생체내 모두에서 NAGLU 유전자의 기능적 효과를 검증하기 위해 전산 방법과 실험 데이터를 결합시킨 혁신적인 통합 프레임워크를 포함한다. 세포 기반 검정은 생화학적 데이터, 마우스 뇌의 특정 세포 유형에서 얻은 RNAseq 데이터, 인간 AD 및 PD 사례 및 대조군에서의 게놈-전체(genome-wide) 유전자 발현 데이터, 및 Aβ 플라크와 상관성이 있는 AD 마우스 모델의 게놈-전체 유전자 발현 데이터에 의해 보완된다. 섹션 (II) 및 (III)에 기술된 연구는 취약한 뇌 영역에서 연령 및 NAGLU의 반수체기능부전이 APP 프로세싱 및 트래피킹, Aβ 플라크 부담 및 Aβ40/42 수준 및 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 영향을 미치는지의 여부에 대한 질문을 다룬다. 이러한 연구는 신경유전학, 리소좀 생물학, LSD 동물 모델, 세포 및 마우스 모델에서의 AD 및 PD 병태생리학에 걸친 전문 지식을 갖춘 조사자가 참여한 공동 혁신에 의해 가능하다.

접근법

여기서는 AD 및 PD 위험과 관련된 NAGLU 유전자 변이의 시험관내 및 생체내 모두에서의 기능적 결과를 평가하기 위해 최신 게놈 도구를 사용할 수 있다.

데이터 및 결과

리소좀 HS 분해 유전자의 이형접합성 변이체는 AD 발병 위험에 영향을 미침

45개 리소좀 유전자에 대한 단일 변이체 및 유전자 기반 분석이 AD의 2가지 사례-대조된 코호트에서 수행되었다. 발견 샘플은 667개의 관련 없는 AD 사례와 511개 대조군의 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 데이터로 이루어졌다. 예상한 바와 같이, ExAC 데이터세트(유럽, 비-핀란드 혈통)로부터의 유전자 특이적인 누적 대립유전자 빈도(cumulative allele frequency, cMAF)는 사내 AD 데이터베이스의 cMAF와 매우 일치했다(r²=0.96). 희귀 단백질 변경 변이체(cMAF)의 부담을 대조군 및 ExAC에서 관찰되는 부담과 비교했다. 대부분의 유전자의 경우, 대조군과 비교하여 사례에는 과도한 변이가 있었지만, SGSH 유전자에서는 명목상의 연관성만이 발견되었다(p = 4.2×10^-3; 승산비(OR) = 3.7, 95% 신뢰 구간(CI) 1.4 내지 9.6). ExAc 샘플의 cMAF와 비교한 경우, SGSH 유전자(p = 7.9×10^-5; OR = 3.0, 95% CI 1.8 내지 4.9) 및 NAGLU 유전자(p = 4.8×10^-4; OR = 3.7, 95% CI 1.4 내지 9.6)는 다중 시험 보정 임계값 p<1.0×10^-3(0.05/50)을 통과했다. 다음으로, 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP) 코호트(AD 사례 5045명 및 대조군 4500명)를 사용하여 이러한 결과를 반복했다. NAGLU는 이 독립적인 샘플에서 반복되었다(p = 3×10^-3; OR = 2.3, 95% CI 1.2 내지 5.2). 반복 샘플에서 발견된 연관성이 동일한 방향과 유사한 효과 크기라는 사실에 주목해야 한다.

연령, AD 상태 및 AD 마우스 모델에 따른 NAGLU 전사체 수준

마우스의 뇌 세포 유형에서 얻은 RNAseq 데이터는 NAGLU 전사체가 뉴런에서보다 신경교세포에서 더 높은 수준(약 20배)의 발현을 나타낸다는 것을 보여준다. 신경병리학적으로 정상적인 인간 뇌 샘플에서, 연령에 따라 NAGLU 전사체 수준이 유의미하게 증가했다(p=0.02)(예를 들어, 도 1a 참조). NAGLU 전사체 수준은 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 사례에서 유의적으로 더 높았다(p=0.007)(예를 들어, 도 1b 참조). NAGLU 전사체 수준은 또한 야생형 마우스(예를 들어, 도 1c의 검은 선 참조)에서의 수준에 비해, AD 마우스 모델(APP, p.K670N/p.M671L/PSEN1,p.M146V; 반접합성[HET] 또는 동형접합성[HO]; 예를 들어, 도 1c 참조)의 피질에서 AD 병리의 발달과 함께 비례하는 연령 의존적 증가를 나타냈다(예를 들어, 도 1c, 오른쪽 패널).

리소좀 HS 분해 유전자의 이형접합성 변이체가 PD 발병 위험에 영향을 미침

발견 샘플은 PPMI 코호트로부터의 331개 관련 없는 PD 사례의 WES 데이터로 이루어졌다. NFE ExAC 데이터세트로부터의 유전자 특이적 cMAF는 사내 PD 데이터베이스로부터의 cMAF와 매우 일치했다(PPMI r²=0.92, 사내 r²=0.96). 희귀 단백질 변경 변이체(cMAF)의 부담을 대조군 및 ExAC에서 관찰된 부담과 비교했다. ExAc 샘플의 cMAF와 비교했을 때, GBA(p = 6.1×10^-6; OR = 2.1; CI = 1.3 내지 3.3), GNS(p = 2.5×10^-5; OR = 2.4; CI = 1.4 내지 4.6) 및 NAGLU(p = 1.0×10^-4; OR = 4.7; CI = 1.5 내지 8.3)를 비롯한 7개의 유전자가 다중 시험 보정 임계값 p<1.0×10^-3를 통과했다. 또한, HGSNAT에서도 경향이 있었다(p = 8.1×10^-3; OR = 1.8; CI = 1.1 내지 2.8). 다음으로, Human-Exome 칩을 사용하여 데이터를 얻은 490개의 PD 사례를 포함하여 추가 PD 코호트(WUSTL)를 사용하여 이러한 결과를 반복했다. 특히, 반복 샘플에서 발견된 연관성은 동일한 방향이고 효과 크기는 유사하다; NAGLU(p = 3.6×10^-7; OR = 3.6; CI = 2.8 내지 8.3) 및 HGSNAT(p = 9.7×10^-4; OR = 1.9; CI = 1.4 내지 3.2).

PD 상태와 NAGLU 전사체 수준

NAGLU 유전자에 돌연변이가 있는 MPS IIIB 환자에서 SN 병리 및 LB 축적이 보고되었다. 또한, 대조군과 비교하여 PD 환자의 흑색질로부터의 도파민성(DA) 뉴런에서 NAGLU 유전자의 전사체 수준이 감소하는 것으로 발견되었다(예를 들어, 도 2 참조). 뉴런 배양물에서 α-Syn PFF의 제조 및 사용은 이전에 최적화되었다. α-Syn PFF는 야생형 마우스의 1차 피질 뉴런에 시험관내 7일(day in vitro; DIV)째에 첨가되었다. 치료 후 7일째; 뉴런을 고정시키고 pSyn-특이적 항체로 염색하였다. PFF는 내인적으로 발현된 α-Syn을 비정상적인, 인산화된, 불용성 응집체로 모집을 유도했다(예를 들어, 도 3a 및 도 3b 참조). α-Syn 응집체는 초기에 시냅스전 말단 및 축삭에서 작은 점상 봉입체로서 나타났다(예를 들어, 도 3a 하단 우측 패널 참조). 응집체는 성장하여 루이소체 신경돌기를 닮은 더욱 길고 구불구불한 모양이 되었다(예를 들어, 도 3a 하단 왼쪽 패널 참조). 도 3b는 PBS 처리된 대조군 뉴런이 단량체성 α-Syn에 상응하는 15kDa를 약간 초과하는 밴드를 보여주었음을 나타낸다. PFF로 처리된 뉴런에서는 더 높은 분자량을 가진 여러 밴드가 나타났다. 이러한 추가 밴드는 아마도 α-Syn 올리고머에 상응하는 것 같다. 이것은 α-Syn 응집에 미치는 리소좀 기능장애의 효과를 연구하기 위한 다루기 쉬운 시험관내 시스템이다.

NAGLU 결손 마우스에서 pSyn 병리의 확산

α-Syn PFF 또는 PBS(대조군)의 선조체내 접종은 6 마리의 NAGLU 결손 마우스 및 6 마리의 야생형 한배 새끼에서 수행되었다. 모든 마우스는 주사에서 살아남았고 현재 노화 중이다. 공개된 데이터와 일치하는 것으로서, 주사 후 30일(dpi)째 PBS 처리된 동물은 pSyn 병리를 나타내지 않았다(예를 들어, 도 4a 참조). 이와 반대로, PFF-주사된 야생형 마우스는 풍부한 동측 pSyn 병리를 나타냈고 대측 pSyn 병리는 매우 적었다(예를 들어, 도 4b 참조). 90 dpi에서는 PFF가 주입된 야생형 마우스에서 대측 강도보다 동측에 더 많은 pSyn 병리 구배가 있었다. 이 구배는 운동 피질 및 SN에서 매우 현저했다. 편도체 및와 체성감각 피질에서는 더욱 대칭적인 병리가 있었다. 놀랍게도, α-Syn PFF로 처리된 NAGLU-결손 마우스는 30dpi에서 주사 부위의 동측 및 대측 모두에 전전두엽(prefrontal) 및 후각 피질에서 α-Syn 병리를 나타냈다(예를 들어, 도 4c 참조). NAGLU-결손 마우스는 더욱 대칭적인 pSyn 병리를 갖는 것으로 나타났으며, 이는 WT 마우스에서 관찰된 것보다 대측 측면으로 더욱 확산적임을 나타낼 수 있다. 더 많은 α-Syn PFF 처리된 마우스가 현재 pSyn 병리의 지역 및 시간적 확산에 미치는 NAGLU 결손의 영향을 추가로 특성화하고 NAGLU-결손 마우스에서 pSyn 병리의 확산 증가를 시사하는 이러한 초기 결과를 확대하기 위해 분석되고 있다.

연구 설계 및 방법

(I) NAGLU 유전자 변이체의 기능적 효과 결정

단백질 산물에 미치는 효과 평가

식별된 AD 또는 PD와 관련된 NAGLU 유전자의 모든 변이체를 평가하는 것은 본 명세서에 기술된 연구의 범위를 벗어나는 것이다. 따라서, 본 연구는 NAGLU 유전자에서 식별된 상위 3 내지 5개의 변이체에 초점을 맞춘다. 상위 변이체는 AD/PD 환자에서의 빈도, SIFT 및 Polyphen2가 그 단백질에 미치는 예측된 영향, 및 GERP 보존 점수를 기반으로 정의된다. 이러한 유전자는 발견 샘플 및 반복 샘플 모두에서 얻은 데이터의 강도를 기반으로 하여 선택된다. NAGLU 유전자에서 선택된 변이체가 효소 활성, 단백질 수준 및 리소좀 기능에 미치는 영향이 결정될 수 있으며, 표 4에 나열된 3개의 변이체가 초점 영역이다. NAGLU(병원성 변이체로서 이전에 식별된 것)에서 잠재적인 기능적 변이체를 선택하기 위해 매우 엄격한 기준이 사용되었다. 그러나, 단백질 수준과 효소 활성에 대한 그들의 영향을 특성화하는 것이 중요하다. 세포는 NAGLU 결손 마우스에서 이미 불멸화되었다. 표 4에 요약된 변이체를 형질도입하고 효소 활성 및 단백질 수준에 대한 그들의 영향을 결정할 수 있다. 리소좀 기능 및 HSPG 축적에 대한 효과도 결정될 수 있다. 선택된 변이체는 부위 지정 돌연변이유발을 사용하여 조작되고, 이전에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 벡터 내로 서브클로닝된다. 렌티바이러스 벡터는 재조합 또는 합성 핵산 분자를 수반하는 연구에 대한 NIH 가이드라인의 섹션 III-E-1에 따라 BSL2 시설에서 생산, 처리 및 폐기한다. 효소 활성에 대한 변이체의 효과를 결정하기 위해 NAGLU 활성에 대해 이전에 설명한 바와 같이 형광 검정을 사용한다. 변이체는 이전에 설명한 바와 같이 리소좀 기능에 영향을 미치는 것으로 결정된다. HSPG의 수준은 ELISA에 의해 정량화된다. 엄격함과 재현성을 보장하기 위해 이중 맹검 관찰자가 삼반복으로 최소 3번의 독립적인 실험으로 정량화를 수행한다.

예상 결과

NAGLU 변이체는 부분적인 기능상실을 유발하고, 리소좀에서 부분적으로 분해된 HS를 증가시키며, ALP 기능을 변경시킬 것으로 예상된다. 5 내지 20%의 잔류 NAGLU 활성이 검출될 것으로 예상된다. 선택된 변이체가 야생형 수준에 비해 활성을 감소시키지 못한 경우, 아세포 국재화 및 미스폴딩(misfolding)에 대한 그들의 효과를 평가한다. 추가 AD 또는 PD 관련 변이체를 선택하여 효소 활성에 대한 효과를 시험할 수 있다.

(II) (a) 시험관내에서 APP 대사, Aβ 생성 및 Aβ 분해에 대한 NAGLU의 기능적 효과 결정

APP 트래피킹, 세포내이입 및 아세포 국재화에 대한 효과 평가

여러 연구에서 APP의 세포내이입은 APP 아밀로이드생성 경로에서 엔도솜 및 다소포체 내의 β- 및 γ-세크레타제와의 공동국재화에 필수적임을 입증했다. 리소좀 기능장애에 이차적으로 발생하는 엔도솜 흐름의 손상은 이 소기관 내에서 증가된 통과 시간을 초래하여 β 및 γ 절단에 대한 경향을 증가시키고, 따라서 Aβ 생성을 증가시킨다. Aβ 플라크가 없는 NAGLU 결손 환자 및 산필리포 B 환자 모두의 뇌에서는 세포내 전체 길이의 APP 수준의 증가가 보고되었다. NAGLU 유전자에서 선택된 변이체가 APP의 정상 상태 수준, APP 세포내이입 또는 분해를 위해 리소좀 내로 APP의 향상된 흐름에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, 세포내 APP 출현의 동역학 및 세포 표면에서 APP 수준을 이전에 공개된 세포 표면 비오틴화 검정을 사용하여 결정할 수 있다. 전체 길이의 APP 반감기에 대한 효과는 단백질 합성 저해제인 사이클로헥시미드로 처리 하에 0, 5, 10, 30분째에 웨스턴 블롯으로 측정한다. 공동국재화 기술은 APP 및 SorL1 아세포 국재화에 대한 효과를 연구하는 데 사용한다. α-세크레타제(ADAM10 및 ADAM17), β-세크레타제 1(BACE1) 및 γ-세크레타제 복합체(PSEN1 및 Nicastrin)를 포함한 APP 프로세싱 기구의 단백질 및 전사체 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 RT-qPCR에 의해 측정한다.

Aβ 생성에 대한 효과 평가

상당한 비율의 APP가 리소좀을 표적으로 하고 리소좀 산성화 저해제의 존재 하에 APP 수준이 세포에서 빠르게 축적되는데, 이는 리소좀 분해가 Aβ 펩타이드의 형성을 방지하기 위해 APP 단백분해를 유도함을 시사한다. 산필리포 B 환자는 정상 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ 수준의 상당한 증가(3배)를 나타낸다. Aβ 올리고머 수준의 상당한 증가는 NAGLU 결손 마우스의 뇌에서 보고되었다. 이러한 발견은 NAGLU 결손이 있는 마우스와 인간 모두에서 HS 축적 및 리소좀 기능장애가 γ-세크레타제 의존성의 비정상적인 APP 프로세싱을 초래함을 시사한다. 따라서, 선택된 변이체는 세포 배양물에서 Aβ 생성에 영향을 미치는지의 여부에 대해 평가될 수 있다. 1차 뉴런 배양은 이전에 설명한 바와 같이 수행한다. 뉴런 특이적 프로모터(시냅신) 하에 선택된 변이체 및 야생형을 운반하는 렌티바이러스 벡터는 NAGLU 결손 및 반접합성 마우스 둘 모두의 1차 뉴런을 형질도입시키는 데 사용된다. 상이한 부피의 농축된 렌티바이러스는 뉴런의 적절한 발현 수준을 결정하는데 사용된다. NAGLU 수준은 RT-qPCR 및 형광검정에 의해 측정된다. 세포 용해물 및 세포의 배지에 존재하는 Aβ 종은 이전에 공개된 샌드위치 ELISA에 의해 검출한다. 간략히 설명하면, Aβx-40 및 Aβx-42 펩타이드를 마우스 단클론 코팅 항체 HJ2(항-Aβ35-40) 및 HJ7.4(항-Aβ37-42)로 포획한다. 중심 도메인을 표적으로 하는 비오틴화 항체인 HJ5.1(항-Aβ13-28) 또는 N-말단 아미노산을 표적으로 하는 HJ3.5를 검출 항체로서 사용하고, 이어서 스트렙타비딘-폴리-HRP-40을 사용한다. α- 및 β-CTF, sAPPα 및 sAPPβ와 같은 APP 유래 단백분해 단편을 웨스턴 블롯으로 측정한다. 전체 길이 APP의 수준은 이전에 설명한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 모니터링한다.

Aβ 분해에 대한 효과 평가

미세아교세포는 Aβ 플라크 주위에서 증식하고, Aβ 물질을 포식작용하지만, 후속 분해가 손상되어 AD에서 점진적인 Aβ 축적에 기여한다. 미세아교세포가 원섬유 Aβ를 흡수할 수 있지만, 이를 분해할 수 없는 이유는 명확하지 않다. 그러나, AD 환자의 미세아교세포는 beclin-1의 감소 및 후속적인 ALP 기능장애를 나타낸다. 또한, 불용성 원섬유 Aβ는 염화물 채널 CIC-7이 일차 미세아교세포의 리소좀으로 트래피킹하는 데 영향을 미치며, 이는 리소좀 분해를 손상시킨다. 그러나, 리소좀 산성화를 복원하면 Aβ 분해가 향상된다. 종합하면, 이 증거는 미세아교 세포의 ALP 부족이 AD 발병에 기여할 수 있음을 시사한다. 여기에 제시된 데이터 마이닝 노력은 NAGLU가 뉴런에서보다 미세아교세포에서 더 높은 수준의 발현을 나타냄을 밝혀냈다. 따라서, 선택된 변이체로 형질도입된 NAGLU 결손 및 반접합성 마우스의 1차 미세아교 세포는 외인성 Aβ를 흡수하고 분해할 수 있는지 여부에 대해 평가할 수 있다. Aβ 흡수 및 분해 평가는 이전에 공개된 바와 같이 수행한다.

ALP 기능에 대한 효과 평가

NAGLU 결손 마우스의 심장 및 뇌 조직에서 증가된 Beclin1, p62 및 LC3-II 수준은 자가포식소체의 축적에 의한 리소좀 자가포식 시스템의 비정상적인 활성을 시사한다. 반접합성 NAGLU 마우스의 뉴런은 ALP 기능장애를 나타내는지 여부와 이러한 변화가 선택된 변이체에 의해 증가되는지 여부에 대해 평가될 수 있다. LC3 및 p62의 웨스턴 블롯은 거대자가포식 활성화의 간접 지표로서 사용된다. 자가포식 흐름은 이전에 공개된 바와 같은 자가포식 시스템의 활성화제(라파마이신 및 토린1), 자가포식 저해제(바필로마이신 A1), 리소좀향성 작용제(클로로퀸, 염화암모늄), 및 E64/류펩틴의 부재 또는 존재하에 세포에 존재하는 LC3-II의 양에 의해 평가된다. 이것은 mCherry-GFP-LC3 마커를 사용한 생세포 이미지화에 의해 보완된다. 자가포식소체-리소좀 융합은 LC3 및 LAMP1의 공동국재화에 의해 추가로 평가될 수 있다. Lysotracker를 이용하여 세포당 산성 구획의 수를 정량한다. TFEB의 활성화는 이의 핵 국재화로 평가된다. RT-qPCR은 TFEB 조절 mRNA 전사체(SQSTM1/p62, MAP1LC3B 및 LAMP2)의 전사체 수준의 변화를 측정하는 데 사용된다. 엄격함과 재현성을 보장하기 위해, 조사자는 정량화 및 분석 단계 동안 유전형에 대해 알지 못한다. 각 실험에 대해 얻은 데이터는 기술된 각 그룹 내에서 평균을 낸다. 실험은 유전형당 적어도 2개의 독립적으로 생성된 제조물을 사용하여 3반복으로 수행한다. 통계적으로 유의미한 차이는 이원 ANOVA 및 적절한 사후 시험을 사용하여 각 마커 또는 기능 분석이 대조군 대비 NAGLU와 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해 시험한다.

AAV2/9-PHP.B 벡터의 생성

NAGLU 야생형 및 가장 유해한 변이체를 AAV2/9-PHP.B 벡터에 서브클로닝한다. AAV2/9-PHP.B는 AAV9보다 최소 40배 더 큰 효율로 중추신경계(CNS) 전체에 유전자를 전달하고 다수의 CNS 영역에 걸쳐 대부분의 성상세포 및 뉴런을 형질도입시킨다. 고역가 AAV2/9 벡터 스톡은 UNC 바이러스 벡터 코어 시설에서 얻었다. AAV 벡터 스톡은 이 프로젝트에 개략된 모든 실험에 대해 젖산 링거액에 1012 vg/ml로 희석한다.

예상 결과

APP 트래피킹, APP 대사, Aβ 생성 또는 Aβ 분해에 대한 NAGLU의 유전자 투여량 효과가 있을 것으로 예상된다. 또한, 본 명세서에 개략된 실험은 NAGLU 유전자에서 선택된 변이체가 뉴런 및 미세아교세포 생존에 미치는 효과를 평가할 수 있도록 할 것으로 예상된다. 대안적으로, 5XFAD 트랜스제닉 마우스 또는 N2A695 세포의 1차 뉴런을 사용하여 NAGLU 유전자의 선택된 변이체로 형질도입시킬 수 있으며, Aβ 생성에 대한 효과를 평가할 수 있다. 시험관내에서 AD의 위험 및 발병 모두에 영향을 미치는 NAGLU 유전자의 변이체를 식별한 후의 다음 단계는 인간 섬유아세포로부터 직접 유도 만능 줄기 세포(iPScs) 생성 및 게놈 편집 방법에서 진행(progress)을 활용하는 것이다. NAGLU 유전자에 변이체를 운반하는 AD 환자의 iPSc 유래 뉴런 또는 신경교 세포를 사용하여, 동종동계의 CRISPr 보정 세포와 비교하여 APP 대사에 미치는 그러한 변이체의 효과를 비교할 수 있었다. 이 실시예의 결과와 NAGLU 활성에 대한 형광 검정의 유용성을 조합한 결과, AD의 생물마커로서 사용될 수 있는 특정 결함을 검출하기 위해 AD 사례 및 대조군의 뇌척수액(CSF), 혈장, 혈청 또는 뇌 조직을 선별할 수 있었다.

(II) (b) 나이 든 마우스에서 AD 병리의 발달에 대한 NAGLU 반수체기능부전의 기능적 효과 결정

마우스 및 인간에서 NAGLU의 완전한 기능상실의 신경퇴행성 결과는 특성화되었지만 이 유전자의 단일 카피의 장기적인 결과(반수체기능부전)에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 반접합성 마우스 및 인간은 항상 정상이라고 추정되었다. 그러나, 최근에는 리소좀 유전자의 반수체기능부전이 인간과 마우스에서 유의적인 대사 이상을 초래한다는 것이 입증되었다. 여기서는, AD 병리가 더 경미한 형태의 유전된 ALP 기능장애에서 발달하고, 이들의 출현은 추가적인 연령 관련 ALP 손상을 필요로 할 수 있다고 가정한다. 1차 평가변수는 4개월(플라크 침착 전)에 측정된 Aβ 수준 및 마우스에 FAD 유발 돌연변이의 존재하에 8개월째에 측정된 플라크 부하이다. Aβ 수준에 대한 효과는 AD와 관련된 가장 유해한 NAGLU 변이체를 발현하는 24개월된 NAGLU 반접합성 마우스에서 1차 평가변수이다.

AD 병리의 마우스 모델에 대한 효과

산필리포 B 질환이 있는 인간 환자에서 NAGLU 단백질의 완전한 기능상실은 정상 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ40 수준에 있어 현저한 3배 증가를 초래한다. NAGLU 전사체 수준은 AD 마우스 모델의 피질에서 AD 병리의 발달과 함께 비례하는 연령-의존적 증가를 나타냈다(예를 들어, 도 1c 참조). AD 트랜스제닉 마우스에서와 같이, 인간에서의 인지 저하는 Aβ 플라크 부하에 비례하지 않지만, 가용성 Aβ 종과 상관성이 있다. 세포 내 Aβ 생성에서 이러한 유전자의 역할을 뒷받침하는 인간 산필리포 B 환자 및 NAGLU 결손 마우스의 데이터를 감안할 때, 경미한 리소좀 손상(NAGLU의 반접합체)이 Aβ 생성을 선호하는 가족성 알츠하이머병(FAD) 돌연변이를 운반하는 잘 특성화된 AD 마우스 모델에서 Aβ 생성을 가속화하는지 여부를 결정할 수 있다. NAGLU-결손 마우스는 고도로 설페이트화된 HS 뇌 축적, 신경염증, 뉴런과 미세아교세포 모두에서 리소좀 확대, 및 약 4mo에서 시냅스 단백질 감소, 및 이어서 변경된 일주기 리듬(altered circadian rhythm), 청력 및 시력 결손을 나타내며, 나이 든 마우스(>8mo)에서는 푸르키네(Purkinje) 세포의 손실 및 손상된 운동 조화를 나타낸다. NAGLU-결손된 마우스의 수명 중간값은 약 12mo 연령이다. 5XFAD 모델은 생후 1.5개월에 뉴런내 Aβ42, 2개월에 플라크, 4개월에 시냅스 마커의 손실 및 기억 결손, 및 9개월에 뉴런 손실을 발생시키는 매우 공격적인 Aβ 침착 모델이다. 플라크의 발달은 반응성 신경교증을 동반한다. NAGLU 반수체기능부전이 기존의 아밀로이드생성 과정을 악화시키는지 여부를 추가로 확인하기 위해, NAGLU 마우스를 5XFAD 트랜스제닉 마우스와 교배한다. NAGLU 및 5XFAD 마우스는 C57Bl/6 배경에서 유사유전형이다. Aβ 플라크 부하에 대한 가장 유해한 NAGLU 변이체(섹션 (I)에 설명됨) 및 NAGLU의 유전자 투여량의 효과는 이전에 설명된 바와 같이 4개월 및 8개월에 샌드위치 ELISA에 의한 Aβ40/Aβ42 수준 및 조직학에 의해 결정한다. APP 대사는 웨스턴 블롯에 의해 APP-CTF를 측정함으로써 평가한다. 4개월은 Aβ 축적이 더 일찍 시작되는지 검출하기 위한, 5XFAD 마우스에 Aβ 플라크가 침착되는 초기 시점인 반면, 8개월은 Aβ 플라크가 풍부한 후기 단계를 나타낸다.

무작위화, 생물학적 변수 및 샘플 크기

샘플 크기 계산은 플라크 부하(SD=20%, α=5%)의 40% 증가와 세제 용해성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42를 80% 검정력(power)로 검출하기 위해 적어도 n=10마리의 마우스/그룹이 필요함을 나타낸다. 이십(20)마리의 NAGLU-결손 마우스 및 5XFAD와 교배된 20마리의 NAGLU 반접합성 마우스에게 출생 시 AAV2/9-PHP.B를 사용하여 가장 유해한 NAGLU 변이체를 주사한다. 또한, 20마리의 NAGLU 결손 마우스, 5XFAD와 교배된 20마리의 NAGLU 반접합성 마우스 및 4개월 및 8개월령의 20마리 추가 5XFAD 마우스(유전자적 배경에 대해 대조하기 위해)를 조직학적 및 생화학적 연구를 위해 수집한다. 암컷은 일반적으로 수컷보다 Aβ 축적이 더 크기 때문에, 각 그룹은 10명의 수컷과 10명의 한배새끼 암컷(n=20)으로 구성된다. 각 실험에 대해 실험 동물이 생성되면 실험실의 독립적인 구성원이 각 동물에게 무작위로 번호를 할당한다. 따라서, 연구와 가장 밀접하게 관련된 연구원은 유전형 및 치료 요법에 대해 알지 못하여 편견없는 실험을 보장한다. 생화학적 및 조직학적 분석을 위한 샘플은 무작위로 할당된 동일한 번호를 보유한다. 생물학적 변수는 하나의 실험 내에서 유사유전형 동물과 동일한 배취의 시약을 사용하여 최소로 유지한다.

NAGLU 반수체기능부전이 나이 든 마우스에 미치는 영향

AD 병리(예를 들어, Aβ 플라크)는 전형적으로 연령-의존적이다. 그러나, 공개된 연구에서는 연령과 ALP 기능장애 간의 상호작용을 해결하지 못했다. 생체내 AD에서 ALP의 역할을 평가하는 대부분의 연구는 약리학적 접근법 또는 ALP 유전자의 완전한 부재 및 단기 평가변수를 사용했다. 10개월령 NAGLU 결손 마우스의 뇌에서 Aβ 올리고머의 증가가 보고되었다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 유전자적 접근법은 NAGLU의 내인성 수준의 감소에 대해 사용될 수 있고, Aβ를 수반하는 AD-관련 표현형에 대한 유전된 만성 리소좀 손상의 효과에 대한 정량적인 병리학적 조사가 수행될 수 있다. 결과는 정상적인 인간 뇌 샘플에서 나이가 들수록 NAGLU 전사체 수준이 매우 현저히 증가한다는 것을 보여주었다(예를 들어, 도 1a 참조). 또한, NAGLU 전사체 수준은 연령 일치 대조군에 비해 AD 사례에서 현저히 더 높았다(예를 들어, 도 1b 참조). 이러한 결과는 NAGLU로부터 응집된 단백질에 대한 보상 반응이 정상적인 노화 과정의 일부일 수 있음을 시사한다. AD 모델에서 발견된 비정상적인 상승은 그들이 Aβ의 비정상적 수준을 제어하려고 시도하고 있음을 시사한다. 따라서, NAGLU의 반수체기능부전은 나이 든 마우스에서 AD 관련 표현형을 악화시킬 수 있다.

샘플 크기

샘플 크기 계산은 세제 가용성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42의 20% 증가를 80% 검정력으로 검출하기 위해 적어도 n=15 마우스/그룹이 필요함을 나타낸다. NAGLU 결손 마우스 십오(15)마리, NAGLU 반접합성 마우스 15마리 및 야생형 마우스 15마리에게 출생 후 1 내지 2일에 AAV2/9-PHP.B를 사용하여 가장 유해한 NAGLU 변이체를 주사한다. 마우스를 회복시켜 적어도 12개월령까지 살게한다. 빈사 상태의 마우스를 마취 및 희생시켜 세제 가용성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42 수준과 같은 뇌 생화학적 연구를 수집한다.

Aβ 플라크 정량 및 Aβ 생성

마우스의 하위 코호트에서 고정된 동결 뇌 절편(50㎛)을 X-34로 염색하고 HJ3.4(항-Aβ) 항체로 면역염색하여 플라크 부하(면적%로 표시)를 정량한다. 대측 반구의 뇌 조직 균질액에서 Aβ 수준은 가용성(PBS) 및 불용성(5M 구아니딘) 분획으로 분별하고 ELISA를 사용하여 정량한다. APP 프로세싱 기구에 대한 영향이 평가된다.

시냅스 마커

시냅스 손실은 인간 및 AD 마우스 모델에서 공통적인 결과이다. NAGLU 반수체기능부전이 5XFAD 마우스에서 시냅스 손실을 가속시키는지 여부는, 이전에 공개된 바와 같이 SNAP-25, 소포 관련 막 단백질 2, 신택신(Syntaxin) 1 및 시냅토피신(Synaptophysin)과 같은 시냅스전 마커에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가할 수 있다.

생체내 Aβ 미세투석

Aβ는 뇌에서 비교적 짧은 반감기를 가지며, 마우스 간질액(ISF)에서 약 1 내지 2시간, 인간 뇌척수액(CSF)에서 약 8시간이다. Aβ 생성 및 제거에 대한 NAGLU의 효과를 조사하기 위해 생체내 미세투석을 사용하여 3 내지 4개월령에 AAV2/9 또는 PBS가 주사된 5XFAD/NAGLU(+/-); 5XFAD/NAGLU(-/-) 마우스 및 5XFAD 한배 새끼의 해마에서 ISF Aβ 대사를 동역학적으로 평가한다. 깨어있어 자유롭게 이동하는 마우스의 해마에서 시간 경과에 따라 ISF Aβ 수준을 평가하기 위해, 생체내 미세투석을 이전에 설명한 바와 같이 수행한다. 간단히 말해서, 이소플루란 마취하에 가이드 캐뉼러가 해마 위에 정위적으로 이식된다(정수리점 3.1㎜ 뒤, 정중선에서 2.5㎜ 측면, 12°각도로 경막 1.2㎜ 아래). 미세투석 프로브는 가이드 캐뉼라를 통해 뇌로 삽입된다. 인공 CSF는 미세투석 관류 완충액으로 사용된다. 미세투석 샘플을 60 내지 90분마다 수집하고 ELISA에 의해 Aβ40 또는 Aβ42에 대해 평가한다. 6시간 동안 Aβ의 평균 농도는 ISF Aβ의 기본 농도로서 정의한다. 각 동물에 대해 모든 Aβ 농도는 해당 마우스의 기본 Aβ 농도에 대해 정규화된다. 기본 농도가 결정된 후, Aβ의 생성을 신속하게 차단하기 위해 마우스에게 혈액-뇌 투과성 γ-세크레타제 저해제(LY411575, 3㎎/㎏ 피하)를 투여한다. 미세투석 샘플을 6시간 동안 60분마다 수집한 다음 ELISA로 Aβ40에 대해 검정한다. ISF Aβ의 반감기는 시간에 대한 Aβ 변화 %의 세미 로그 플롯의 기울기를 기반으로 하여 계산한다. 지속적으로 감소하는 Aβ 값만이 반감기 분석에 포함된다. 검정력 분석에 기초하여, n=10마리 마우스/그룹은 ISF Aβ 수준 및 제거율의 30% 감소를 검출한다(5개 그룹×10 = 50마리 마우스, 동일한 수의 수컷 및 암컷).

ALP 기능장애

NAGLU 결손, NAGLU 반접합성 및 5XFAD 마우스와 교배된 NAGLU 반접합성 마우스의 뇌 절편을, 앞서 설명한 바와 같이 항-LAMP1, LC3 및 p62 항체로 면역염색한다.

신경돌기 이영양증 및 반응성 신경교증에 대한 효과

발명자의 이전 연구들은 NAGLU 결손 마우스가 증가된 성상교세포증을 나타낸다는 것을 입증하였다. 따라서, 병렬 연구로, 뇌 절편을 항-CD11b 및 항-GFAP 항체로 염색하여 반응성 신경교증에 대한 선택된 유전자의 하나의 단일 카피의 영향을 조사한다. 고정 동결된 뇌 절편은 이전에 수행된 바와 같이 이영양성 신경돌기를 정량하기 위해 레티큘론-3(reticulon-3)(RTN-3) 항체(RTN-3은 이영양성 신경돌기에서 선택적으로 축적됨)로 면역염색한다.

예상 결과

NAGLU 유전자에 대한 반접합성 마우스는 5XFAD 마우스에서 Aβ 플라크 부담을 가속시키고 악화시킬 것으로 예상된다. NAGLU 반수체기능부전은 나이 든 마우스에서 APP 대사 및 Aβ 생성에 영향을 미치고, 결과적으로 Aβ 플라크의 생성 없이 시냅스 손실 및 반응성 신경교증을 증가시킬 것으로 예상된다. 반접합성 마우스의 뇌에서 APP 대사 및 Aβ 생성의 변화가 발견되지 않는 경우, NAGLU의 전사체는 이에 대한 검증된 shRNA/RNAi를 운반하는 AAV2/9 벡터를 주입함으로써 신생 5XFAD 트랜스제닉 마우스에서 녹다운될 수 있다. CRISPr 기술은 시험관내 검정에 가장 강한 효과가 있는 선택된 유전자의 변이체들에 대한 넉인(knock-in) 마우스를 생성하는 데 사용될 수 있다. NAGLU 마우스에서 결과를 확대하기 위해, 사용가능한 마우스 모델이 있는 경우, HS를 분해하는 다른 리소좀 효소(예를 들어, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제[SGSH(Jax 003780)])에 동일한 접근법을 적용할 수 있다.

(III) 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 대한 NAGLU의 효과 결정

시험관내에서 α-시누클레인의 흡수, 트래피킹, 응집 및 제거에 대한 NAGLU의 기능적 효과 결정

불멸화 세포와 1차 뉴런에 의한 α-Syn의 거대음세포 흡수는 HSPG에 의해 매개되는 것으로 보인다. 또한, HS는 시험관내에서 α-Syn 원섬유의 형성을 현저히 자극한다. 잘 특성화된 α-Syn 응집 모델은 배양된 뉴런에서 발생되었다. 이 모델에서 재조합 α-Syn에서 생성된 PFF는 1차 뉴런에 직접 첨가되고 이 뉴런에 의해 세포내이입된다. 이러한 PFF는 내인적으로 발현된 α-Syn을 비정상적인, 인산화된 불용성 및 유비퀴틴화된 응집체로 모집되도록 유도한다. 시험관내에서 야생형, 비-트랜스제닉 마우스에서 유래한 1차 뉴런에서 내인성 α-Syn으로부터 이러한 응집체의 형성은 2 내지 3일의 지연 단계를 따르고, 4 내지 7일까지 축삭에서 형성되어 체세포수지상 구획으로 7 내지 10일까지 확산하고, PFF 첨가 후 약 14일에 뉴런이 사멸한다. α-Syn 원섬유의 흡수, 트래피킹, 응집 및 제거에 대한 NAGLU의 효과는 이러한 잘 특성화된 모델을 사용하여 결정할 수 있다. 가장 유해한 NAGLU 변이체로 형질도입된 NAGLU-결손 및 반접합성 마우스로부터의 1차 해마 뉴런에서 내인성 α-Syn의 제거에 임의의 변화가 있는지 여부도 결정할 수 있다. NAGLU-결손 마우스의 1차 뉴런에서 α-Syn 응집체(봉입체)의 비율 및 수준은 α-Syn PFF에 의한 치료(예를 들어, 도 2 참조) 후에 결정될 수 있다. 마지막으로, 재조합 효소 대체가 NAGLU-결손 마우스의 뉴런에서 α-Syn PFF를 구제할 수 있는지 여부를 결정할 수 있다.

α-Syn PFF의 생성

재조합 단량체 α-Syn은 이전에 확립된 프로토콜에 따라 박테리아로부터 제조하고, 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 순차적으로 정제한다. α-Syn의 원섬유 형태는 37℃에서 약 72 내지 120시간 동안 재조합 단량체를 교반한 다음, 지정된 분자량 컷오프 매개변수를 갖는 원심분리 필터 장치를 사용하여 크기를 선택하여 제조한다. PFF 생성 조건은 이미 최적화되어 있다. PFF를 트리스 완충 NaCl에 희석하고 5 내지 10 DIV 후 배양된 1차 뉴런에 첨가한다. PFF 형질도입 및 파종은 노출 후 4 내지 7일에 면역형광 또는 순차적 추출 및 면역블롯팅에 의해 확인한다. 내인성 α-Syn에서 유래한 비정상적인 α-Syn 응집체는 항 pSyn(Ser129) 항체, 클론 81A(Biolegend, MMS-5091)를 사용한 면역형광 및 웨스턴 블롯을 통해 검출한다. α-Syn PFF는 BSL2 시설에서 생산, 처리 및 폐기한다.

α-Syn PFF 트래피킹, 세포내이입 및 아세포 국재화

리소좀 프로세싱은 1차 뉴런에서 세포내이입된 α-Syn 원섬유의 주된 운명이다. PFF 처리된 뉴런은 시냅스전(CSPα), 세포내이입(EEA1), 자가포식소체(Rab7) 및 리소좀(LAMP1) 마커와 함께 염색되어 엔도-리소좀 경로에서 α-Syn 응집체의 트래피킹에 변화가 있는지 여부를 결정한다.

ALP 기능에 대한 효과 평가

α-Syn 응집체는 자가포식소체 제거를 감소시켜 전반적인 거대자가포식을 손상시킨다. 따라서, 자가포식 경로의 약리학적 조절이 α-Syn 제거를 개선하는지 여부를 결정할 수 있다.

샤페론 매개 자가포식(CMA)에 대한 효과 평가

α-Syn은 샤페론 매개 자가포식(CMA)에 의해 분해되고 응집-경향성 α-Syn 돌연변이체는 CMA를 차단한다. 따라서, LAMP2A 및 HSP70 단백질 수준을 점검하여 이들이 PFF 처리된 세포에서 영향을 받는지 관찰한다. PFF 처리된 뉴런은 CMA 활성제; AR7(레틴산 수용체 알파 특이적 길항제)로 처리하고, α-Syn 수준을 세포 용해물 및 합성 배지에서 결정한다.

세포내이입 및 리소좀 막 완전성에 대한 영향

α-Syn PFF는 세포내이입 후 소포 및 리소좀 파열을 유도한다. 이러한 파열된 소포는 EEA1, LC3 및 갈락틴-3 양성이다. α-Syn PFF가 리소좀 막 완전성에 영향을 미치는지의 여부는 Gal-3 및 LC3 염색에 의해 결정할 수 있다.

효소 대체를 이용한 구제 실험

재조합 NAGLU는 흡수/결합 저해제(만노스-6-포스페이트: M3655, Sigma)의 존재 또는 부재 하에 αSyn PFF에 노출 전, 노출 중 및 후에 첨가하고 α-Syn PFF 응집에 대한 효과를 시험한다. 시험관내 결손 뉴런에 첨가하기 위한 충분한 재조합 NAGLU는 이미 있다.

예상 결과

시험관내 α-Syn PFF의 흡수, 트래피킹 및 응집에 대한 NAGLU의 유전자 투여량 효과가 예상되고, 재조합 효소는 이러한 효과를 구제할 수 있다. NAGLU 결손 세포는 세포막과 엔도리소좀 시스템에 HS 및 HSPG를 축적한다. 따라서, α-Syn PFF의 흡수 증가는 세포내 소포 및 리소좀 막의 파괴로 이어질 것으로 예상되며, 이는 내인성 α-Syn의 세포기질 수준 및 모집을 증가시킬 것이다. 렌티바이러스 벡터가 생성될 수 있고, 응집 경향성 α-Syn 돌연변이체가 NAGLU-결손 및 반접합성 마우스로부터의 1차 뉴런에서 과발현될 수 있고 응집 및 분해 속도가 평가될 수 있다. 대안적으로, 과발현성 인간 A53T α-Syn 트랜스제닉 마우스로부터의 1차 뉴런이 사용될 수 있으며, NAGLU 유전자에서의 선택된 변이체로 형질도입될 수 있고 α-Syn에 대한 효과가 후속적으로 시험될 수 있다. NAGLU 유전자에서의 변이체를 운반하는 PD 환자로부터 iPSc 유래된 뉴런은 동종 CRISPr 보정 세포와 비교하여 α-Syn 프로세싱에 대한 이러한 변이체의 효과를 비교하는 데에도 사용될 수 있다.

생체내 α-Syn 확산에 대한 NAGLU의 효과 결정

축적된 실험 데이터는 α-Syn의 세포간 전달이 프리온 단백질에서 관찰된 것과 유사한 파종 원리를 따른다는 것을 나타낸다. 인간 A53T α-Syn을 과발현하는 어린 마우스(약 3 내지 4개월령)에게 응집된 α-Syn을 함유하는 뇌 추출물(루이소체 질환의 사례에서 부검에서 유래한 뇌 추출물)의 뇌내 주사는 주사 후 30일(dpi)에 빠르게 관찰되는 숙주에 pSyn 병변의 형성을 자극하고; 약 90dpi에는 pSyn이 뇌의 해부학적으로 연결된 영역에 폭넓고 풍부하게 분포하며, 이는 인간 PD 사례에서 관찰되는 α-Syn 침착물의 명백한 확산과 아주 유사함을 시사한다. 약 100dpi에서 마우스는 주사되지 않은 마우스에 비해 운동 기능장애 및 조기 사망(약 126dpi)을 발생시킨다. 합성(인간 또는 마우스) α-Syn PFF의 뇌내 주사는 또한 비트랜스제닉(야생형) 숙주 마우스에서 LB-유사 병리 및 신경 퇴행을 유도하였다(예를 들어, 도 4b 참조). 대략적으로, LB와 함께 치매 뇌에 불용성 pSyn을 주사한 야생형 마우스의 50%는 pSyn 병리를 발생시켰다. 이와 대조적으로, 인간 및 마우스 α-Syn PFF에 의한 pSyn 병리 유도의 효율은 각각 90% 및 100%이다. 30 dpi에서, pSyn-양성 LB-유사 축적은 주사 부위에 대해 동측에만 독점적으로 존재했다(예를 들어, 도 4b 및 도 4c 참조). 영향을 받은 동측 영역 내에서뿐만 아니라 대측 신피질에서도 LB/LN 병리는 90 및 180dpi에 조사된 마우스에서 현저하게 증가된 pSyn 면역반응성을 보여주었다. SN 치밀부(SNpc) α-Syn 병리는 PFF 주사 후 점진적으로 발달하여, 특히 복내측 SNpc 집단에서, 30dpi에 옅은 세포질 축적에서부터 90 및 180dpi에 조밀한 핵주위 LB 유사 봉입체로 진화하였다. 90 및 180dpi에 각각 15% 및 35%씩 SNpc 도파민성(DA) 뉴런이 동시 감소하였고, 이는 LB/LN이 SNpc DA 뉴런 손실 전에 형성됨을 시사한다. 따라서, LB/LN의 전파는 연결도 의존적이며 병리학적 α-Syn의 축적은 SNpc DA 뉴런 손실의 상류이고, 여기에 직접적으로 연결된 것으로 보인다. α-Syn PFF의 선조체내 주사의 이러한 생체내 모델은 세포내 LB/LN 병리의 축적, SNpc DA 뉴런의 선택적 손실 및 손상된 운동 조화를 발생 반복한다. LB와 LN은 둘 모두 HSPG를 함유한다. 그러나, 생체내 α-Syn 확산 중 HS의 역할은 평가되지 않았다. 현재까지 NAGLU 활성의 감소와 결과적인 HSPG 축적이 α-Syn 응집 및 확산에 영향을 미치는지의 여부는 명확하지 않다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, PD와 관련된 가장 유해한 NAGLU 변이체를 발현하는 NAGLU-결손 및 반접합성 마우스는 HS 및 HSPG 축적이 α-Syn 응집, 확산에 영향을 미치고 생체내 질병을 가속화하는지 시험하는 데 사용될 수 있다.

α-Syn PFF의 선조체내 접종

α-Syn PFF는 전술한 바와 같이 제조한다. α-Syn PFF의 선조체내 접종은 출생시 AAV2/9-PHP.B를 사용하여 가장 유해한 NAGLU 변이체가 주사된 NAGLU-결손 및 반접합성 마우스 및 NAGLU-결손 마우스, 반접합성 마우스 및 12마리의 야생형 마우스에게 수행된다. pSyn 응집체의 확산을 정량화하고 α-Syn PFF가 NAGLU 마우스의 수명에 영향을 미치는지의 여부를 평가한다. 3 내지 4개월령의 야생형, NAGLU-결손 또는 반접합성 마우스에게 등쪽 선조체(0.2㎜ A/P, 정수리점에 비해 2.0㎜ M/L, 두개골 표면 3.2㎜ 아래)의 일측에 마우스 αSyn PFF(또는 대조군으로서 PBS 또는 αSyn 단량체)를 단회 접종 주사했다. 마우스는 주사 후 30일, 90일 또는 180일까지 회복 및 경과시키고, 각 시점에서 뇌를 수확하여, 항-pSyn(Ser129) 항체를 이용한 면역조직화학을 위해 처리한다. pSyn 공동국재화 염색은 항-유비퀴틴 및 HSP90을 사용하여 수행한다. 검정력 분석을 기반으로 하여, n=12 마우스/그룹은 pSyn 수준의 30% 증가를 검출한다. (5 그룹×12=60 마리 마우스)

αSyn 및 pSyn 정량

피질, 해마, 선조체 및 뇌간은 각 동물의 반뇌에서 절제하고 불용성 αSyn은 연속 세제 추출 후, 항-시누클레인-1/클론 42(BD Biosciences) 및 항-pSyn 81A(biolegend)를 포획 항체로서 사용하여, 이전에 공개된 바와 같이 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 단리한다.

PFF- 및 PBS-처리된 동물로부터의 동측 및 대측 선조체의 면역블롯 분석은 이전에 공개된 바와 같이 티로신 하이드록실라제(TH) 및 도파민 수송체(DAT)에 대한 항체를 사용하여 수행한다. SN에서 뇌 위축 및 뉴런 손실이 평가되고, 손상 및 염증 마커(예를 들어, GFAP, Iba-1)에 대한 면역조직화학은 위에서 설명한 대로 수행한다.

수명은 PFF-처리 및 PBS-처리된 NAGLU-결손 동물 간에 비교된다. 로타로드(rotarod) 및 와이어 매달림 시험(wire hang test)은 α-Syn PFF 주사 6개월 후 야생형 마우스에서 운동 장애를 검출하는 데 가장 민감한 것으로 알려져 있다. 로타로드 및 와이어 매달림 행동 시험의 사용은 마우스 모델에서 이전에 공개되어 있고 적절한 실험 설계 및 통계 도구(다중 그룹 비교를 위한 사후 분석이 포함된 ANOVA 및 쌍별 비교를 위한 스튜던트 t-시험)가 알려져 있다. 보행 분석은 PFF 및 PBS 처리된 동물에서 수행된다. 이전에 보행 분석은 LSD의 마우스 모델에서 "파킨슨병 유사" 징후를 포착하는 데 매우 민감한 것으로 밝혀져 있다.

로타로드 및 와이어 매달림 검정의 성능과 관련하여, 한 번에 5개 그룹을 비교하기 위해 정상 동물은 60초, NAGLU-결손 동물은 0초(40주)에 수행하고, 표준 편차가 30초인 경우, 효과 크기는 0.89이다. 효과 크기가 0.89, α=0.05 및 검정력=0.95인 경우, 그룹 간의 유의적인 차이를 검출할 수 있기 위해서는 6마리의 동물이 필요하다. 수명과 관련하여 평균 수명이 대략 730일이고 NAGLU-결손의 경우 약 322일이며 표준 편차가 20일인 반접합 동물과 정상 동물이 있는 5개 그룹 간의 비교 시에, 효과 크기는 5.51이다. 효과 크기가 5.51, α=0.05, 검정력=0.95인 경우, 그룹 간의 유의적인 차이를 감지할 수 있기 위해서는 2 내지 3마리의 동물만 필요하다. 행동 및 수명 연구에는 10 내지 12마리의 마우스/그룹이 사용되기 때문에 충분히 검정력이 있다.

예상 결과

α-Syn PFF 주사는 NAGLU 결손 마우스의 표현형을 가속화하여 신경교증, 신경퇴행을 증가시키고 운동 장애를 악화시키고 수명을 단축시킬 것으로 예상된다. 반접합성 NAGLU 마우스는 pSyn 병리의 전파를 악화시킨다. 대안적으로, α-Syn 돌연변이를 운반하는 AAV2/9 벡터가 생성되어 어린 NAGLU-결손 마우스의 선조체에 정위적으로 주사될 수 있거나, 과발현성 인간 A53T α-Syn 마우스가 NAGLU-결손 마우스에 교배될 수 있고 pSyn 병리, 질병 진행 및 수명의 변화가 평가되었다. 동일한 접근법이 SGSH-결손 마우스에 적용될 수 있다.

실시예 2: 연령-의존적이며 알츠하이머병(AD)-관련이 있는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 저하에 기초가 되는 유전자 변이 조사

이 실시예는 알츠하이머병(AD) 발병에 관여하는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 기능장애에 기초가 되는 유전자 변이의 식별을 설명한다.

여러 시험관내 및 생체내 연구에서 자가포식 리소좀 경로(ALP) 기능장애가 AD의 발병에 기여한다고 시사하지만, ALP 기능의 연령 의존적 및 AD 관련 저하에 기초가 되는 유전자 변이는 잘 이해되어 있지 않다. AD 유발 유전자 및 여러 AD 위험 유전자에서 희귀 기능 변이체는 ALP 기능장애를 유발한다. 고립된 집단에서 단일 ALP 유전자에 대한 연구는 AD와 리소좀 축적 장애(LSD) 사이에 유전자 중첩을 뒷받침한다. 그러나, ALP의 각 유전자의 일반 집단 내에서의 유전자 변이가 AD 발병 위험 및 AD 발병에서의 역할에 기여하는지에 대한 체계적이고 포괄적인 평가는 완료되지 않았다. 현재 지식의 이러한 격차를 해결하기 위해 여기에 기술된 연구는 AD 발병 위험과 관련이 있는 ALP 유전자에서 효과 크기가 큰 희귀 기능 변이체를 식별하고 우선 순위를 지정할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 전산 방법과 실험 데이터를 연결시킨 통합 프레임워크는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하는데 사용될 수 있다. 첫째, 33,350명의 비-핀란드 유럽인 대조군으로부터의 ALP의 각 유전자에 있는 희귀 기능 변이체의 부담을 2,000명의 AD 사례 및 3,000명의 대조군과 비교한다. 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)에서 공개적으로 이용가능한 10,000개의 샘플과 함께 2,000개의 AD 사례 및 2,000개의 대조군을 포함하는 추가 독립 샘플의 결과를 반복한다. 둘째, 세포 기반 검정을 사용하여 AD 위험과 관련된 후보 ALP 유전자에서 선택된 변이체가 효소 활성, 단백질 안정성 및/또는 mRNA 수준에 미치는 효과 및 리소좀 기능에 미치는 그의 영향을 조사한다. 아밀로이드생성 및 Aβ 분해에 대한 검증된 기능 변이체의 효과를 조사한다. 마지막으로, AD 위험과 관련된 후보 ALP 유전자의 반접합성 또는 넉아웃 모델에서 AD 병리의 자발적 발달에 대한 정량적 및 정성적 병리학적 조사를 수행한다. Aβ 플라크 부담에 대한 후보 ALP 유전자의 유전자 투여량의 효과는 또한 잘 특성화된 AD 마우스 모델에서 측정된다. 여기에 개략된 연구는 AD와 관련된 새로운 ALP 유전자를 밝혀낼 수 있다. 실험은 AD 발병에서 ALP 기능장애의 메커니즘을 더 잘 통찰할 수 있게 하고 AD의 잠재적인 치료를 위해 리소좀 축적 장애에 대해 현재 시행되고 있는 치료 전략을 용도변경하기 위한 기초를 확립할 수 있다.

여기에 설명된 연구의 목표는 알츠하이머병(AD) 발병에 관여하는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 기능장애에 기초가 되는 유전자 변이를 식별하는 것이다. 이 연구는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하기 위해 전산 방법과 실험 데이터를 결합시키는 혁신적인 통합 프레임워크를 포함한다. 여기에 개략된 실험은 AD와 관련된 새로운 ALP 유전자를 밝혀낼 수 있다. 실험은 AD 발병에서 ALP 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공하고 AD의 잠재적인 치료를 위해 리소좀 축적 장애에 대해 현재 시행되고 있는 치료 전략을 용도변경하기 위한 기초를 확립할 수 있다.

연령은 알츠하이머병(AD)의 발병 및 진행에 가장 큰 위험 요소이다. 세포 수준에서 노화는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 분해 능력을 감소시킨다. 여러 시험관내 및 생체내 연구는 ALP 기능장애로 인해 응집된 단백질의 제거 결함이 AD 발병에 기여한다고 암시하지만, ALP 기능의 연령 의존적 및 AD 관련된 저하에 기초가 되는 유전자 변이는 잘 알려져 있지 않다. AD 유발 유전자의 희귀 기능 변이체 및 여러 AD 위험 유전자는 ALP 기능장애를 유발한다. 고립된 집단에서 단일 ALP 유전자에 대한 연구는 AD와 리소좀 축적 장애(LSD) 사이의 유전자 중첩을 뒷받침한다. 그러나, ALP의 각 유전자의 일반 집단 내에서의 유전자 변이가 AD 발병 위험 및 AD 발병에서의 그의 역할에 기여하는지는 체계적이고 포괄적인 평가가 완료되지 않았다.

현재 지식의 이러한 격차를 해결하기 위해 여기에 기술된 연구는 AD 발병 위험과 관련이 있는 ALP 유전자에서 효과 크기가 큰 희귀 기능 변이체를 식별하고 우선 순위를 지정한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 전산 방법과 실험 데이터를 연결시킨 통합 프레임워크는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하는데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 연구의 실행가능성은 가족성 및 산발성 AD 모두에서 과다표현되는 제한된 수의 ALP 유전자(PLD3, GRN, CTSF 및 SORL1)에서 이전에 밝혀지지 않은 희귀 변이체를 편견 없는 접근법에 의해 뒷받침된다. 따라서, 모든 ALP 유전자의 분석은 일반적인 집단에서 발견되는 변이에 비해 AD 환자의 희귀 기능 변이체의 풍부함을 밝혀낼 것으로 예상된다. 본 명세서에 기술된 연구는 고립된 집단에서의 연구에 존재하는 계층 집단으로부터 초래되는 현재의 거짓 연관성을 극복하고, 시험관내 및 생체내에서 변이체 및 유전자 수준 모두에서 보완적인 기능적 특성화를 제공한다.

(I) AD에서 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자 식별

ALP 유전자에서 미시험된 희귀 기능 변이체가 AD 발병 위험에 영향을 미치는 것으로 가정한다. 이러한 위험 변이체를 식별하기 위해, 33,350개 대조군의 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 데이터[Exome Aggregation Consortium(ExAC) 데이터베이스, 비-핀란드 유럽인]를 분석하여 유럽 혈통의 개체로부터 얻은 ALP의 각 유전자에서 기준 유전자 변이를 결정한다. 다음으로, 엑솜칩과 WES 데이터를 조합하여 사내의 2,000건의 AD 사례와 3,000건의 대조군에 대한 ALP 유전자의 유전자 기반 분석을 수행한다. 결과는 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)로부터 WES 데이터에서 공개적으로 사용가능한 샘플 10,000개와 함께 2,000개의 AD 사례 및 2,000개의 대조군을 포함하는 독립적인 샘플에서 반복한다. 희귀 변이체를 축소한 후, 적어도 12개의 리소좀 유전자에서 효과 크기가 큰(OR>2.5) 예측된 기능 변이체의 풍부함이 식별되었다(결과 참조).

(II) 시험관내 AD 발병에 미치는 ALP의 선택된 후보 유전자의 기능적 효과의 결정

AD 위험과 관련된 새로운 ALP 유전자가 시험관내에서 AD 발병에 역할을 하는 것으로 가정한다. 세포 기반 검정을 사용하여, AD 위험과 관련된 후보 ALP 유전자에서 선택된 변이체가 효소 활성, 단백질 안정성 및/또는 mRNA 수준에 미치는 효과 및 리소좀 기능에 미치는 그의 영향을 조사한다. 아밀로이드생성 및 Aβ 분해에 대한 검증된 기능 변이체의 효과를 조사한다. 기능적 리소좀 관련 단백질로서 DNAJC5 유전자에 의해 암호화된 단백질인 CSPα의 새로운 역할은 이전에 발견된 바 있다. 또한, CSPα가 APP 프로세싱 및 아밀로이드생성에 역할을 한다는 것을 보여주는 강력한 데이터가 수집된 바 있다(결과 참조).

(III) 생체내 AD 병리에 대한 ALP의 선택된 후보 유전자의 기능적 효과 결정

AD 위험과 관련된 새로운 ALP 유전자가 생체내 AD 발병에 역할을 하는 것으로 가정한다. AD 병리의 자발적 발달에 대한 정량적 및 정성적인 병리학적 조사는 반접합성 또는 넉아웃(KO) NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 마우스에서 내인성 병리의 발생 시간으로 정의되는 3개의 시점에서 수행한다. Aβ 플라크 부담에 대한 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 유전자-투여량 효과는 잘 특성화된 AD 마우스 모델에서 측정한다.

여기에 기술된 실험은 AD와 관련된 새로운 ALP 유전자를 밝혀낼 수 있다. 이들은 현재 부족하고 새로운 치료 표적을 얻을 수 있는 지식인, AD 발병에서 ALP 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있다. 여기에 기술된 연구는 AD의 잠재적인 치료를 위해 LSD에 대해 현재 시행되고 있는 치료 전략의 용도변경에 대한 기초를 확립할 수 있다.

의의

인간 게놈에는 자가포식-리소좀 경로(ALP)와 관련된 적어도 430개의 유전자가 있다(자가포식 유전자 38개, 자가포식 조절 유전자 161개, 리소좀 유전자 64개, 리소좀 조절 유전자 167개). 모든 ALP 유전자 중 38%(157개 유전자)에서의 돌연변이가 멘델병(OMIM)을 유발하며, 그 중 가장 많이 연구된 것은 고전적인 리소좀 축적 장애(LSD)이다. 7,700명의 생존 출생아 중 약 1명의 빈도로 그룹으로서 발생하는 적어도 50개의 별개의 LSD가 있다. LSD는 일반적으로 소아 장애로 간주되며 일반적으로 완전한 기능상실(LoF) 돌연변이로 인해 발생한다. 그러나, 정상이하(hypomorphic) 변이체를 운반하는 LSD의 성인 발병 형태가 보고되었다. LSD는 단일유전자 장애이지만 복잡한 임상 특징을 나타낼 수 있다. 사실, LSD의 약 75%는 임상적으로 중요한 신경학적 구성요소를 가지고 있다.

멘델 장애에서 교란된 유전자 및 경로가 상응하는 복합 질환의 병인에서 역할을 한다는 것을 나타내는 복합 질환과 멘델 질환의 공존 비율은 상당히 높다. 종합적으로, 멘델식 표현형에 연루된 유전자의 거의 20%는 복합 형질의 게놈 전체 상관분석 연구(genome-wide association study: GWAS) 신호를 담당하는 변이체를 함유하거나 이에 가장 가깝다. 이와 대조적으로, 모든 유전자의 약 15%는 전반적으로 멘델 표현형의 기초가 되며, 이는 멘델 표현형에 연루된 유전자가 GWAS 신호에 풍부하다는 것을 시사한다. ALP 게놈 영역의 거의 35%는 GWAS 형질(GWAS 카탈로그)과 연관되어 있다. 사실, ALP 경로에 있는 유전자의 18.5%는 멘델 질환과 일반 질환 모두에서 역할을 한다. 약 22%는 LSD를 유발하는 유전자이다. 여러 증거 라인(시험관내 및 생체내)에서 AD가 LSD와 분자 메커니즘을 공유한다는 것을 암시하지만, ALP에서 AD 관련 기능장애에 기초가 되는 유전자 변이는 잘 이해되어 있지 않다.

AD의 원인에 관한 주요 가설은 연령 관련 및 조기 발병 질환의 유전자 연구에서 유래되며, 이 둘 모두 아밀로이드-베타(Aβ) 펩타이드의 생산 및 응집의 증가와 연루되어 있다. 보완적인 가설은 Aβ를 포함한 병원성 단백질의 제거 결함이 멘델형 AD 유전자에 돌연변이가 없는 환자에서 AD의 원인이 될 수 있음을 시사한다. 엔도솜-리소좀 및 자가포식 조절장애는 AD 환자 및 AD 마우스 모델에서 발생한다. 자가포식 액포(AV)의 대규모 뉴런 축적은 AD 환자의 뇌 및 리소좀 저해제로 처리된 마우스 또는 카뎁신 결손 마우스에서 발견되었다. 리소좀 가수분해효소는 또한 AD 환자의 뉴런에서 강하게 상향조절된다. 또한, 리소좀은 정상 및 비정상적인 APP 프로세싱 및 후속적인 아밀로이드생성에도 중요한 역할을 한다. 시험관내 리소좀 기능의 손상은 Aβ 생산의 변화를 초래한다. 염화암모늄 또는 바필로마이신 A1에 노출되면 Aβ 분비가 감소한다. 리소좀 프로테아제 저해제로의 치료는 리소좀 내에서 아밀로이드생성 APP 단편의 생산을 감소시킨다. 리소좀 효소 및 리소좀 관련 단백질 수준은 AD 환자의 뇌척수액(CSF)에서 변경된다. 이러한 모든 결과는 AD에서 ALP 내의 여러 부위에 대한 누적 "적중(hit)"이 병원성 단백질의 제거를 손상시키는 선택적 부전을 유발한다는 가설을 뒷받침한다.

CSTD, NPC1 및 NPC2와 같은 LSD 유발 유전자의 희귀 변이체는 선택된 집단에서 AD의 위험을 증가시킨다. 또한, LSD 유발 유전자가 결손된 마우스에 대한 연구는 APP 프로세싱 및 아밀로이드생성에서 각 유전자의 독특한 역할을 밝혀냈다. NPC1, CLN3 및 HEXB 유전자가 결손된 마우스는 α-CTF/β-CTF 및 Aβ40/42 수준을 모두 증가시킨다. IDUA, SGSH, GBA 및 TPP1 유전자가 결손된 마우스는 Aβ 플라크 없이 세포내 APP/Aβ 수준을 증가시킨다. IDUA 및 SGSH 유전자가 결손된 마우스는 Aβ42 수준이 검출되지 않는 대조군에 비해 Aβ40의 3배 증가를 초래한다. ASAH1 및 PPT1 유전자가 결손된 마우스는 플라크 없이 세포내 APP/Aβ를 감소시킨다. 그러나, ALP의 각 유전자에서 일반 집단 내에서의 유전자 변이가 AD 발병 위험에 기여하는지, 그리고 AD 발병에서의 그의 역할에 대한 체계적이고 포괄적인 평가는 완료되지 않았다(예를 들어, 도 5 참조).

신생아 선별 연구에 따르면 건강한 사람에서 보고된 리소좀 효소 활성 수준에 10배 범위의 차이가 있는 것으로 나타났다. GBA, NPC1, GALC, GAA, GLA 및 IDUA 유전자의 질병 유발 변이체의 이형접합성 보인자(carrier)는 대조군보다 훨씬 낮은 수준의 효소 활성을 나타낸다. 또한, NPC1에 질환 유발 변이체의 이형접합성 보인자는 니만-픽(Niemann-Pick) 환자에 영향을 미치는 1차 경로의 하류에서 유의적인 대사 이상을 나타낸다. 현재까지, 이러한 대사 변경 및 ALP 기능장애의 장기적인 결과에 초점을 맞춘 체계적인 연구는 없는 것으로 보인다. 그러나, 질환 유발 변이체의 이형접합성 보인자가 신경퇴행성 질환의 더 높은 위험을 갖는다는 것을 암시하는 연구는 거의 없다.

본 명세서에 기술된 연구는 현재 지식의 여러 격차를 해결할 수 있다. 첫째, 대규모 데이터베이스의 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 데이터를 사용하여 유럽 혈통(EA)의 개체에 대한 ALP의 각 유전자에서 실제 기준 유전자 변이를 결정한다. 둘째, ALP의 각 유전자에서 희귀 기능 변이체의 누적 대립유전자 빈도를 AD 사례에서 분석하여 AD 발병 위험에 영향을 미치는 후보 유전자를 식별한다. 마지막으로, 시험관내 및 생체내 AD의 발병에서 상기 후보 유전자의 역할을 검증한다. AD에서 ALP 유전자의 특정 결함을 식별함으로써, 유전자 요법, 효소 대체, 경구 소분자 기질 감소 요법, 소분자 샤페론 및 자가포식 경로의 약리학적 치료를 포함하는 LSD 치료용으로 현재 사용되고 있는 여러 치료 전략은 AD의 잠재적인 치료에 이용될 수 있다.

혁신

본 명세서에 개략된 실험은 AD와 관련된 ALP에서 잘 알려진 기능장애와 관련된 유전자 변이를 정의하고, 뿐만 아니라 시험관내 및 생체내에서 AD와 관련된 ALP 유전자의 희귀 기능 변이체의 효과를 이해하기 위한 설계인 점에서 혁신적이다.

데이터는 여기에 설명된 연구의 타당성을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공한다. NAGLU, NPC1, PPT1, GLB1 및 DNAJC5 유전자(아래에 기술됨)를 포함한 여러 후보 유전자에서 예측된 희귀 기능 변이체의 풍부함이 식별되었다. 이러한 결과는 AD 위험과 관련된 새로운 ALP 유전자를 포함하고 AD 발병에서 ALP 기능장애의 메커니즘에 대한 새로운 길을 열어준다. 예를 들어, 이 유전자 분석을 기반으로, DNAJC5 유전자에 의해 암호화된 단백질인 CSPα가 기능적 리소좀 관련 단백질로서의 새로운 역할이 발견되었다. 또한, CSPα가 APP 프로세싱 및 아밀로이드생성에 역할을 한다는 것을 보여주는 강력한 증거가 제공된다.

AD에서 ALP 유전자의 유전자 변이에 대한 현재의 지식 상태는 반복율이 매우 낮은 고립된 집단에서 거짓 연관성을 보고하는 제한된 연구가 지배적이다. 본 명세서에 기술된 연구는 일반적인 집단을 나타내는 매우 큰 샘플에서 AD 발병의 위험에 대한 ALP의 각 유전자의 유전자 변이의 기여를 체계적이고 포괄적으로 평가하는 설계이기 때문에 상기 제한을 극복할 수 있다. 따라서, 데이터는 총 AD 사례(n = 약 4000) 및 대조군(n = 약 5000)에 대한 사내 WES 및 엑솜 칩 데이터 외에도, 엑솜 응집 콘소시엄[Exome Aggregation Consortium(ExAC)(n = 약 61,000)] 및 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)(n = 약 10,000)의 공개적으로 사용가능한 두 대형 데이터베이스의 WES 데이터가 사용된다. 이러한 다중 데이터세트를 사용하여 AD와 관련된 ALP에서 잘 알려진 기능장애의 유전자 구조를 해결할 분석 세트가 설계되었다.

ALP의 기능장애는 AD와 관련이 있다는 것이 일반적인 가정이다. 그러나, AD 발병에서 ALP 유전자의 역할에 대한 의견 일치는 없다. 이것은 부분적으로 대부분의 연구가 적절한 세포 유형이 아닐 수 있는 고전적 발현 시스템(뉴런 유사 세포주)을 사용하여 소수의 유전자(예를 들어, 카텝신 D)에 초점을 맞추고 있다는 사실 때문이다. 또한, 이 연구는 적절한 AD 경로(APP 프로세싱 대 타우 응집)를 평가하지 않는다. 본 명세서에 기술된 연구는 시험관내 및 생체내 모두에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하기 위해 전산 방법과 실험 데이터를 결합시킨 혁신적인 통합 프레임워크를 포함한다. 세포 기반 검정은 생화학적 데이터, 생세포 검정, 마우스의 특정 뇌 세포 유형으로부터의 RNAseq 데이터, 인간 AD 사례 및 대조군에서의 게놈 전체 유전자 발현 데이터, 상이한 단계에서의 인간 AD 사례로부터의 게놈 전체 유전자 발현 데이터, 상이한 연령대의 인간으로부터의 게놈 전체 유전자 발현 데이터, Aβ 플라크와 상관성이 있는 AD 마우스 모델로부터의 게놈 전체 유전자 발현 데이터 및 신경섬유 엉킴 부담을 보완한다.

ALP 유전자의 넉아웃 마우스를 사용한 대부분의 연구는 AD 병리에 초점을 맞추어 AD 발병에서 그들의 역할을 이해하려고 시도했다. 그러나, 결손된 유전자에 기인하는 병리는 빠르고 LSD와 더 관련이 있다. 이것은 그 결과의 해석을 복잡하게 만들고 대부분의 시간이 명확한 근거가 없다. 여기에 설명된 연구는 세포 기반 검정에 의해 지원되는 유전자 분석의 결과를 기반으로 선택된 ALP 유전자로부터 반접합성 마우스의 상이한 시점에서의 Aβ 플라크 부담을 포함하여 AD 병리에 취약한 뇌 영역을 평가할 수 있다.

실험 접근법

프로젝트 개요

다수의 시험관내 및 생체내 연구는 ALP 기능장애가 AD의 발병에 기여함을 시사한다. 그러나, AD 관련된 ALP 기능의 저하에 기초가 되는 유전자 구조는 잘 이해되어 있지 않다. 이 문제를 해결하기 위해 대규모 데이터세트(사내 데이터베이스 및 공개적으로 사용가능한 것 모두)에서 ALP 유전자에 예측된 희귀 기능 변이체의 분석을 조합한 통합 접근법을 사용하여 AD 위험에 관여하는 증거가 있는 ALP의 후보 유전자들에 우선 순위를 지정한다(예를 들어, 섹션 (I) 참조). 섹션 (I)의 분석에서 예상되는 주요 결과는 AD와 관련된 단일 변이체보다는 유전자의 식별이다. 다음으로, 선택된 변이체의 기능적 효과는 각각의 암호화된 단백질에서 검증된다. 섹션 (II)에서, AD 위험과 관련된 선택된 유전자의 부분적인 기능상실의 효과는 세포 기반 검정에서 결정될 수 있다. 이 과정은 AD 발병에서 선택된 후보 ALP 유전자의 역할을 뒷받침하는 생화학적, 병리학적 및 세포 기능적 증거를 수집하는 인간 질환 및 마우스 모델 둘 모두에서의 광범위한 데이터 마이닝 과정과 통합된다. 이 상호연결된 과정에서 전산 데이터가 정의되고 실험 데이터를 개선하며, 그 반대일 수도 있다(예를 들어, 섹션 (II) 참조). 마지막으로, 선택된 ALP 유전자가 생체내 AD 병리와 연관되어 있는지 여부를 결정할 수 있다(예를 들어, 섹션 (III) 참조). 여기에 개략된 실험은 유전자 및 세포 기반 결과뿐만 아니라, 마우스 모델의 이용가능성을 기반으로 한다. 또한, AD와 관련된 선택된 ALP 유전자의 부분적인 기능상실이 AD 병리(취약한 뇌 영역의 Aβ 플라크)를 변형시키는지 여부를 결정할 수 있다. 선택된 유전자에 대해 전체 부재(-/-) 및 반접합성(+/-)인 마우스는 이러한 마우스 모델에서 AD 병리가 내인적인 병리의 결과인지 구별하기 위해 검사한다. 또한, 선택된 유전자에 대해 나이 든 반접합성(+/-) 마우스에서 AD 병리의 발달을 조사한다. Aβ 플라크 부담에 대한 선택된 ALP 유전자의 유전자 투여량의 효과도 잘 특성화된 AD 마우스 모델에서 측정된다. 이러한 실험에서 예상되는 결과는 생체내 AD 병리에 대한 단일 ALP 유전자 기여의 확인이다.

데이터

자가포식-리소좀 유전자 세트(약 430개 유전자) 목록은 공개 데이터베이스(예를 들어, 생물정보학 분석 참조) 및 문헌에 있는 기존 주석을 마이닝하여 수동으로 편집 및 각색하였다. ALP 기능장애의 가장 잘 연구된 모델은 LSD이다. LSD는 LoF 동형접합성, 복합 이형접합성 돌연변이 또는 카피 수 변이(CNV)에 의해 유발되는 유전자적으로 이질적인 멘델 질환 그룹이다. 다른 집단(대부분 고립된 집단)에서 LSD의 발생률은 매우 낮다. 따라서, 일반 집단에서 LSD 유발 변이체의 예상 빈도는 극히 낮다. 60,000개 초과의 시퀀싱된 엑솜을 함유하는 ExAC 데이터베이스를 사용하여 광범위한 인종 표본에서 LSD를 유발하는 변이체의 빈도를 추정했다. 3개의 X-연관 LSD 유발 유전자(GLA, IDS 및 LAMP2)만이 기능상실(LoF) 불내성(pLI ≥ 0.9)이다. 43개의 추가 LSD 유발 유전자에서 관찰된 LoF 돌연변이의 수는 중립 모델에서 예상되는 것보다 낮다. LSD 유발 유전자는 NPC2 유전자의 32개에서부터 GAA 유전자의 423개까지 광범위한 단백질 변경 변이체를 나타낸다. 많은 이러한 변이체는 이형접합성 상태에서 정상이하 변이체로서 작용할 가능성이 있는 예측된 LoF이다. 이렇게 많은 수의 단백질 변경 변이체는 인간에서 보고된 리소좀 효소 활성 수준의 광범위성을 설명할 수 있다. 흥미롭게도, GAA 유전자는 ExAc에서 가장 많은 수의 단백질 변경 변이체와 효소 활성의 더 넓은 가변성을 나타낸다.

대부분의 AD 샘플은 유럽 혈통에서 유래된 것이다. 따라서, 분석은 비-핀란드계 샘플(약 33,000명 개체)에 있는 LSD 유발 유전자(n=46)에 초점을 맞추었다. NCBI ClinVAr 데이터베이스에 보고된 LSD 유발 변이체는 약 2740개이다. ExAc 샘플에 주석이 달린 LSD 유발 변이체는 288개이다: 76%는 미스센스 변이체이고, 10%는 대체 스플라이싱에 영향을 미치고, 12%는 넌센스 돌연변이이다. 대부분의 LSD 유발 변이체는 SIFT에 의해 유해성이고(87%), 폴리펜2에 의해 손상성(84%)인 것으로 예상된다. LSD 유발 변이체의 대부분(73%)은 고도로 보존된 뉴클레오타이드에 위치한다(GREP 점수>4). 이것은 CNV가 포함되지 않았기 때문에 EA 집단에서 LSD 질환을 유발하는 변이체 빈도를 과소평가한 것이다. CNV는 LSD의 일반적인 원인이다. 또한, ExAc에서 보고된 여러 LoF 변이체는 NCBI ClinVAr 데이터베이스에서 LSD 유발 변이체로서 분류되지 않은 것으로 발견되었다. LSD 유발 변이체는 각 LSD 유발 유전자에서 발견되었지만 LSD 유발 변이체의 수는 HYAL1 유전자에서 발견된 1개에서부터 ARSA 유전자에서 발견된 20개까지 다양하다. 유전자당 이러한 변이체의 누적 대립유전자 빈도(cMAF)(이형접합성 보인자의 수)는 CSTD 유전자에서 1.50E^-05에서부터 NPC2 유전자에서 0.003까지 다양하다. 따라서, 1×10^-3의 cMAF 임계값은 보존적 상한으로서 적용했는데, 그 이유는 일반 집단에서 이보다 더 빈번한 변이체가 침투성이 높은 LSD 유발 변이체라고 예측할 수 없기 때문이다.

발견 샘플은 523개의 관련 없는 AD 사례와 386개의 대조군에서 얻은 WES 데이터로 구성되었다. 표 5는 AD와 관련된 상위 LSD 유발 유전자를 보여준다.

이들은 ExAc 샘플에서 LSD 유발 변이체를 정의하는 특징을 기반으로 하여 정의된 포함 및 제외 기준을 사용하여 분석되었다. 예상한 바와 같이, ExAC 데이터세트(유럽인, 비-핀란드 혈통)의 유전자 특이적 cMAF는 사내 AD 데이터베이스(유럽 혈통)의 cMAF와 매우 일치했다(예를 들어, 도 6 참조). 포함 기준을 충족하는 각 LSD 유발 유전자의 변이체(n=46)는 유전자별로 대조되었다: 82%는 미스센스 변이체이고 15%는 대체 스플라이싱에 영향을 미치며 3%는 넌센스 돌연변이이다. 분석에 포함된 변이체의 수는 ARSB 유전자에서 5개에서부터 NPC1 유전자에서 21개까지 유전자마다 다양하다. 희귀 단백질 변경 변이체(cMAF)의 부담을 대조군 및 ExAC에서 관찰된 부담과 비교했다. 이러한 유전자의 대부분에서, 대조군에 비해 사례에서 과도한 변이가 있지만, SGSH 유전자(p = 4.2×10^-3; OR = 3.7, 95% CI 1.4 내지 9.6) 및 CLN8 유전자(p = 1.0×10^-2; OR = 8.9, 95% CI 1.1 내지 68.1)에 의해 명목상의 연관성만이 발견되었다(예를 들어, 표 5 참조). ExAc 샘플의 cMAF와 비교한 경우에는, 14개의 유전자가 매우 엄격한 다중 시험 보정 임계값 p<1.0×10^-4(0.05/450)를 통과했고, 13개의 LSD 유발 유전자가 유전자 수준의 유의적인 임계값 p<2.4×10^-6(0.05/20,000)을 통과했다(예를 들어, 표 5 참조). 다음으로, 인간 엑솜 칩을 사용하여 데이터를 얻은 1722개의 AD 사례 및 1394개의 가족성 AD(FAD) 사례의 WES 데이터를 포함하여, 표 5에 나열된 결과를 반복하기 위해 2개의 추가 AD 코호트를 사용했다(예를 들어, 표 6 참조).

예상한 바와 같이, Exome-chip 데이터가 있는 샘플에서는 6개의 유전자만이 반복되었지만, FAD 샘플에서는 대부분의 연관성이 반복되었다(예를 들어, 표 6 참조). 이 불일치에 대한 가장 가능성 있는 설명은 데이터의 적용범위 깊이(coverage depth)이다. 가장 좋은 예는 NAGLU 유전자의 결과로서, 이의 변이체 중 엑솜 칩의 데이터에 의한 포함 기준을 충족하는 변이체는 없었다(예를 들어, 표 6 참조). 주목할 만한 것은, 반복 샘플에서 발견된 연관성이 동일 방향이고 효과 크기가 같다는 사실이다.

3개의 샘플에서 반복된 ALP 유전자 중 하나는 시스테인 스트링 단백질 알파(CSPα)를 암호화하는 DNAJC5 유전자이며, 이 유전자의 돌연변이는 성인 발병 LSD를 유발한다. CSPα는 신경돌기의 원형질막에 국재화된다. 이것은 뉴런-유사 세포 유형(N2A)에서 확산된 세포질 국재화를 가졌으나, 또한 내인성 CSPα의 일부는체세포에 LAMP2와 함께 공동국재화되었다(예를 들어, 도 7a 참조). 아세포 분획화는 상당한 비율의 CSPα가 또 다른 리소좀 마커(LAMP1)와 공동침전한다는 것을 보여주었다(예를 들어, 도 7b 참조). 이러한 결과는 내인성 CSPα가 리소좀 관련 단백질임을 시사한다. 예상대로, LSD를 유발하는 돌연변이(p.L115R)를 발현하는 세포에서는 빈 벡터에 비해 훨씬 더 높은 수준의 LysoTracker 신호가 있었다. 이와 대조적으로, CSPα-WT-형질도입된 세포는 CSPα-p.L115R을 발현하는 세포 또는 빈 벡터에 비해 훨씬 적은 LysoTracker 신호를 가졌으며(예를 들어, 도 7c 참조), 이는 CSPα가 리소좀 pH의 조절에 관여할 수 있음을 시사한다. LSD-유발 돌연변이(p.L115R)의 발현은 빈 벡터에 비해 세포내 및 분비된 리소좀 효소의 상당한 상승을 초래하였다(예를 들어, 도 7d 및 도 7e 참조). 이와 대조적으로, CSPα-WT의 과발현은 빈 벡터 또는 CSPα-p.L115R로 형질도입된 세포에 비해 세포내 및 분비된 리소좀 효소의 상당한 감소를 초래했으며(예를 들어, 도 7d 및 도 7e 참조), 이는 리소좀 트래피킹 및 세포외배출이 CSPα에 의해 영향을 받는다는 것을 시사한다.

DNAJC5 전사체는 AD 병리에 가장 민감한 뇌 영역 및 뉴런에서 고도로 발현된다. 연령에 따른 DNAJC5 전사체 수준의 감소는 청년(<40세), 중년(40 내지 70세) 및 정상 노인(70 내지 94세)의 전두엽 피질 영역으로부터의 신경병리학적으로 정상인 뇌 샘플에서 발견되었다(p=0.0003; GEO 데이터베이스; 시리즈 GDS5204)(예를 들어, 도 8a 참조). DNAJC5 전사체 수준은 AD의 레이저 포획 미세 절개된 엉킴 없는 뉴런 및 대조군에서 연령 일치 대조군에 비해 AD 사례에서 상당히 더 낮았다(p=<0.0001, 예를 들어, 도 8b, 왼쪽 그래프 참조)(GEO 데이터베이스; 시리즈 GSE5281). 이 결과는 다른 연구(GEO 데이터베이스; 시리즈 GSE15222)에서 반복되었다(예를 들어, 도 8b 우측 그래프 참조). 또한, DNAJC5 전사체 수준은 연령 의존적 감소를 나타내고 야생형 마우스(도 8c의 검은 선)에서의 수준에 비해, 두 AD 마우스 모델(TAU, p. P301L; 도 8c의 청색 선) 및 (APP, p.K670N/p.M671L; 도 8c의 적색 선)의 피질에서 AD 병리의 발달에 반비례하는 것(우측 그래프, 예컨대, 도 8c 참조)으로 발견되었다. 이러한 모든 결과는 CSPα가 AD 발병에 관여할 가능성이 있음을 시사한다.

CSPα에 LSD 유발 변이체(p.L115R)가 있는 환자의 뇌는 Aβ 플라크 또는 신경섬유 엉킴을 나타내지 않는다. 그러나, 조직학적 분석은 피질 뉴런(인간 LSD, 예를 들어, 도 9a 참조)에서 APP/Aβ(항체 4G8)의 현저한 세포내 축적을 나타내었다. 따라서, 아밀로이드생성에서 CSPα의 역할을 시험관내에서 시험하였다. APP/Aβ 면역반응성은 N2A695 세포(빈 벡터, 예를 들어, 도 9b 참조)에서 리소좀 마커와 공동국재화했다. N2A695 세포에서 CSPα 발현의 녹다운은 Aβ/APP 수준을 감소시키고 Lamp-1과의 공동국재화를 감소시켰다(ShRNA, 예를 들어, 도 9b 참조). CSPα에서 LSD 유발 변이체를 안정적으로 발현하는 N2A695 세포는 APP/Aβ의 세포내 축적을 나타냈다(p.L115R, 예를 들어, 도 9b 참조). hCSPα-p.L115R을 발현하는 N2A695 세포는 빈 벡터로 형질도입된 세포보다 훨씬 높은 Aβ40 및 Aβ42 수준을 배지로 방출시켰다(예를 들어, 도 9c, 왼쪽 그래프 참조). 이와 반대로, 특정 shRNA-CSPα를 발현하는 N2A695 세포는 세포외 Aβ40 및 Aβ42 수준을 훨씬 적게 분비한다(예를 들어, 도 9c, 왼쪽 그래프 참조). hCSPα-p.L115R을 발현하는 N2A695 세포는 빈 벡터로 형질도입된 경우보다 더 많은 Aβ40을 세포내에 축적하였다(예를 들어, 도 9c, 오른쪽 그래프 참조). Aβ42의 수준은 상이한 그룹을 따라 차이가 없었다(예를 들어, 도 9c, 오른쪽 그래프 참조). shRNA-CSPα로 형질도입된 세포는 전체 길이 APP, α-CTF/β-CTF, CSPα 및 sAPPα 수준의 감소를 나타냈다(예를 들어, 도 9d, 그래프 참조). hCSPα-p.L115R에서는 sAPPα 수준의 변화 없이 전체 길이의 APP 및 α-CTF/β-CTF의 증가를 나타내었다(예를 들어, 도 9d, 그래프 참조). 이러한 결과는 아밀로이드생성 및 아마도 AD 발병에서 CSPα의 새롭고 예상치 못한 역할이 밝혀졌음을 시사한다.

연구 설계 및 방법

(I) AD에서 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자 확인

ALP 유전자의 시험되지 않은 희귀 기능 변이체가 AD 발병 위험에 영향을 미친다고 가정한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 대규모 데이터세트(자체 데이터베이스 및 공개적으로 이용가능한 것)에 있는 ALP 유전자의 예측된 희귀 기능 변이체의 분석을 조합한 통합 접근법을 사용하여 AD 위험에 관여하는 증거를 가지고 ALP의 후보 유전자의 우선 순위를 지정할 수 있다.

희귀 변이에 대한 대립유전자 빈도 임계값 정의

LSD 유발 변이체의 가장 높은 MAF, SIFT, Polyphen2 또는 GERP 점수를 포함하는 LSD 유발 변이체의 분석에서 얻은 정보를 사용하여 다음 포함 기준을 정의했다: 1) AD 사례에서 98% 초과의 호출률(call rate), 2) 변이체당 Maf<0.01%, 3) ExAc 또는 Ensemble에 의해 미스센스(missense)로 주석이 달린 지정된 표준 전사체에서 유일하게 가능성이 있는 단백질 변경 변이체, 4) 프레임이동, 5) 넌센스, 6) 스플라이스 공여자 및 수용자 영역에 영향을 미치는 변이체, 7) NCBI ClinVar 데이터베이스에서 병원성의 증거가 있고 3' 또는 5' UTR 영역에 위치하는지 여부. ExAC에서 찾을 수 없는 변이체, 또는 NCBI ClinVar 데이터베이스에 존재하지 않거나, 또는 ExAC 및 ClinVar에서 잘못호출(miscalling)한 Maf>0.01%인 동일한 인트론성, 또는 3' 또는 5' URT 변이체는 제외했다. 집단별 변이체가 이 분석에 교란 효과가 없도록 하기 위해 주성분 결과를 기반으로 하여 개체를 선택했다.

연구 집단

WES는 2,000명의 개체로부터 수득했다. Knight-ADRC로부터 총 3,000명 개체의 엑솜 칩 데이터에 대한 엑세스가 이용가능하다. 또한, ADNI 및 Knight-ADRC 샘플에 대해 청소 및 대치된(imputed) GWAS 데이터에 대한 액세스도 이용가능하다. Alzheimer's disease Neuroimageing Initiative(ADNI; 600건의 사례 및 200건의 대조군), NIA-LOAD(867건의 관련 없는 사례 및 645건의 관련 없는 대조군), Knight Alzheimer's Disease Research Center(Knight-ADRC; 779건의 사례, 555건의 대조군) 및 스페인사람 데이터세트(167건의 사례 및 534건의 대조군)에서 이용할 수 있는 DNA가 있다. 이러한 데이터세트에 대한 설명은 이전에 공개되었다. 각각의 사례는 유력 AD에 대한 NINCDS-ADRDA(National Institute of Neurological and Communication Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related Disorders Association)와 동등한 기준을 사용하여 알츠하이머 유형의 치매 진단을 받았다. 대조군은 사례와 동일한 평가를 받았지만 인지적으로 정상이었다. 모든 개체는 유럽 혈통이었고 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었다. 데이터는 ExAC(버전 0.3.1, 2015년 3월)에서 다운로드되었다. 오로지 30배 초과의 중간 서열 깊이에 커버되는 높은 비율의 암호 영역을 갖는 유전자 및 고품질(PASS 필터) 변이체만이 분석에 포함되었다. 데이터는 ADSP에서 다운로드했다. 발견 단계 데이터세트에는 113 가족에서 584명 대상체에 대한 WGS 데이터와, 가계 데이터 추가 853명(682건 사례[비히스패닉계 510명, 히스패닉 172명]), 및 AD에 여러 번 영향을 받은 가족의 히스패닉 대조군 171명이 포함되었다.

전체 엑솜 시퀀싱 데이터

개체 2,000명으로부터의 WES가 있다. 엑솜 농축은 SureSelect 52Mb Target Enrichment System(Agilent)을 사용하여 수행한다. DNA는 페어드 엔드 판독(paired-end read)(Illumina HiSeq2000)에 의해 시퀀싱했다. 정렬 및 변이체 호출(call)은 Novoalign 및 SAM 도구를 사용하여 수행한다. 이러한 방법은 유전형 호출에 대한 양호한 특이성 및 민감도에 의해 이전에 사용되었다. GWAS 데이터는 서열 호출의 품질 관리에 사용된다. 이 연구에서 엑솜 시퀀싱 호출과 GWAS 데이터 간에는 98% 초과의 일치율이 발견되었다.

인간 엑솜 칩 데이터

Knight-ADRC에서는 총 3,000명의 개체 유래의 엑솜 칩 데이터에 액세스할 수 있다. 일루미나(Illumina)와 아피메트릭스(Affymetrix)는 "엑솜 칩"이라고 하는 저렴한 기성 유전형분석 칩을 개발했으며, 이 칩에는 엑솜 변이체 서버 데이터베이스에서 적어도 2회 보고되어 있는 엑손 내의 변이체가 함유되어 있다. 엑솜 칩에 포함된 대부분의 암호 변이체는 MAF<0.01로 매우 희귀한 변이체이다. 이 어레이는 저 빈도의 변이체를 분석하는 빠르고 간단한 방법을 제공한다. 그러나, 이러한 어레이는 모든 암호 변이체를 포함하지 않는다.

엑솜 칩 품질 관리(QC)

유전형 호출(genotyping call)은 다른 곳에 기술된 일루미나 엑솜-칩 데이터를 호출하기 위한 최상의 관행을 사용하여 이루어졌다. 엑솜 칩에 대한 QC는 GWAS에 사용되는 QC 단계와 유사하지만, MAF가 낮기 때문에 변이체가 제거되지 않았다. 이 엑솜 칩에는 원 데이터가 존재하며, 단일 변이체 또는 유전자 수준에서 임의의 유의적인 연관성에 대해 클러스터가 점검된다.

부담 시험

중간 정도의 효과 크기를 갖는 희귀 변이체의 효과를 수용하기 위해, 희귀 변이체와의 연관성을 분석하도록 개발된 검증된 통계 방법이 사용된다. 간단히 설명하면, 유전자 기반 방법은 영역 내의 희귀 변이체를 단일 값으로 축소한 다음, 영역 내의 희귀 변이체와 관심 형질 간의 연관성을 시험한다. 서열 커널 연관 시험(sequence kernel association test, SKAT)은 유전자 영역 내의 희귀 변이체와 상태 간의 연관성을 시험하는 데 사용된다. 다른 유전자 기반 방법에 비해 SKAT의 장점은 SKAT가 동일한 유전자 내에서 다른 방향으로 효과를 갖는 변이체를 확인하고 교란성 공변량에 대해 조정할 수 있다는 것이다. 95% 신뢰 구간을 갖는 승산비는 가장 일반적인 대립유전자와 비교하여 대안적 대립유전자에 대해 계산한다. 대립유전자 시험에서 연관성이 감지되면 추가 분석을 통해 부가 또는 우성 모델이 더 나은 적합성(fit)을 제공하는지 여부를 결정한다. 독립적인 사례 대조 샘플은 발견 데이터세트의 결과를 반복하기 위해 사용한다. 각각의 다른 데이터세트에 대한 분석은 별도로 수행된다. p-값과 OR을 조합하기 위해 공동 분석이 수행된다. 이 방법은 이전 연구에서 AD에 대한 새로운 유전자를 식별하는 데 성공적으로 사용되었다.

GWAS 데이터

게놈 전체 유전형분석(genome-wide genotyping)은 샘플의 대부분(>90%)에 대해 이미 생성되어 있다. 유전형분석은 NeuroX 칩(WU 및 PPMI)을 포함한 다양한 어레이로 수행했다. 연관 분석 또는 대치(imputation) 전에 모든 샘플과 유전형은 엄격한 품질 관리(QC)를 받는다. 유전형 데이터는 SNP 및 개체에 대한 최소 호출률(98%) 및 최소 소수 대립유전자 빈도(MAF= 0.02)를 적용하여 청소(clean)한다. 하디-베인베르크(Hardy-Weinberg) 평형이 아닌 SNP(P<1×10^-6)는 제외한다. 예상치 못한 중복 및 불가사의한 관련성에 대한 시험은 혈통별 동일성 비율의 쌍별 게놈 전체 추정치를 사용하여 수행한다.

대치

1,000개 게놈 프로젝트 데이터(3단계, 2014년 11월 출시) 및 Impute2 소프트웨어를 사용하여 최대 6백만 개의 SNP를 대치한다. R²<0.5, 소수 대립유전자 빈도(MAF)<0.02, 비-하디-바인베르크 평형(out of Hardy-Weinberg equilibrium)(p<1x10^-6), 호출률 <95% 또는 Gprobs 점수 <0.90인 SNP는 제거한다. 이전의 GWAS 및 대치 과정에서 총 6,815,690개의 SNP가 QC 과정을 통과했다.

집단 구조

GWAS 데이터의 유용성을 감안하여, 자체 보고된 인종/민족성을 확인하기 위해 앵커로서 HapMap 샘플과 함께 샘플에 Eigenstrat를 사용한다. 집단 계층화 분석의 세 가지 제1 주성분 인자(PC)가 공변량으로서 분석에 포함된다.

데이터 저장 및 관리

각 엑솜에 대해 최대 150GB의 처리된 데이터가 생성되며, 서열을 정렬하고 SNP 호출을 수행하는 데 3일이 필요하다. 따라서, 크고 안전한 데이터 저장 시스템을 갖는 것이 필요하다. 생성된 모든 데이터는 3 테라바이트(TB)의 공간이 있는 리눅스(Rinux) 서버에 저장된다. 데이터가 처리되고 엑솜 시퀀싱에 의해 검출된 서열 변이체가 유전형에 의해 확인되면, 다른 엑솜 시퀀싱 프로젝트를 위해 개발되어 사용되었던 데이터 관리, 품질 관리, 클리닝, 주석달기 및 분석을 위한 효율적이고 효과적인 방법이 적용된다.

생물정보학 분석

보완 분석을 위해 다음의 공개적으로 이용가능한 데이터베이스가 사용된다: OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man), Exome Variant Server ExAC, GWAS 카탈로그, GERP4, ClinVar 데이터베이스, 및 인간 자가포식 데이터베이스(Human Autophagy Database).

검정력 분석

발병 시 연령과 관련된 유전자 변이체를 감지하는 검정력을 결정하기 위해 SAS에서 Proc Power를 사용하여 분석을 실행했다. 분석은 0.05 내지 0.50 범위의 소수 대립유전자 빈도, OR 1.2 내지 3.6, 및 4,000 내지 7,000개 사이의 샘플 크기를 사용하여 실행했다. 알파는 단일 변이체 분석의 경우 5x10^-8, 유전자 기반 분석의 경우 5×10^-6으로 조정했다. 이러한 결과를 기반으로 할 때, OR>1.19(또는 <0.84)의 효과를 검출하는 약 80%의 검정력이 있다.

예상 결과

본 명세서에 기술된 연구의 실현가능성은 가족성 및 산발성 AD 모두에서 과표현되는, 제한된 수의 ALP 유전자(PLD3, GRN, CTSF 및 SORL1)에서 희귀 변이체를 밝혀낸 이전의 편견 없는 접근법에 의해 뒷받침된다. (I)의 목적은 ALP에 속하는 인간 게놈에 있는 약 430개 유전자 중에서 AD 위험과 관련된 유전자를 식별하는 것이다. LSD 유발 유전자(n=46)에 초점을 맞춘 연구는 효과 크기가 큰 AD 위험과 관련된, ALP의 최소 12개의 추가 신규 유전자가 식별될 수 있고(예를 들어, 표 5 참조), 이러한 유전자가 적절한 깊이의 적용범위를 갖는 추가 샘플에서 반복될 수 있음(예를 들어, 표 6 참조)을 입증한다. 이러한 결과는 일반 집단에서 발견되는 변이보다 AD 환자에서 ALP 유전자의 변이가 더 높다는 가설을 뒷받침한다. 따라서, 이 분석에 포함된 나머지 약 384개 ALP 유전자의 수와 AD 위험의 새로운 연관성이 밝혀질 것으로 예상된다.

결과 및 검정력 계산은 유전자 기반 분석에서 2.7 초과의 평균 승산비를 감지하기에 충분한 검정력이 있음을 시사한다. ALP 유전자의 연관성이 사례 대조 설계에 의해 반복되지 못한다면 내적표현형(endophenotype) 설계가 사용될 수 있다. 따라서, AD에 대한 CSF 생물마커 수준에 미치는 ALP 유전자의 변이체의 효과는 LSD 유전자 및 다음 CSF 생물마커, t-타우, p-타우 및 Aβ42 각각에 대한 단일 변이체 및 유전자 기반 분석을 수행하여 결정할 수 있다. ALP 유전자의 조절 게놈 영역이 AD 발병 위험에 관여할 수 있는지를 평가하기 위해, 총 25,580개의 AD 사례와 48,466개의 대조군으로 이루어진 I-GAP(International Genomics of Alzheimer's Project)에 의해 이전에 공개된 GWAS의 데이터에 있는 ALP 유전자의 연관성이 분석될 수 있다. ALP 유전자가 발병 시의 연령(age at onset, AAO)에 영향을 미치는지 점검하기 위해 보완 접근법이 있을 수 있으며, 즉, AD 발병 시의 연령과 관련된 유전자 변이체를 조사하는 이전에 공개된 GWAS의 데이터가 점검될 수 있다.

전체 엑솜 시퀀싱을 사용하여 대부분의 단백질 변경 변이체가 식별될 수 있을 것으로 예상된다. 그러나 WES 데이터를 RNAseq 데이터로 보완하면, 스플라이스 공여자 및 수용자 영역에 영향을 미치는 특정 변이체에서 더욱 잠재적인 기능 변이체를 식별할 수 있다는 것이 분명해졌다. RNAseq 데이터는 WES 데이터가 이미 수득되어 있는 대조군 및 AD 사례의 500개 뇌 조직 샘플로부터 현재 생성되고 있으며, 이것은 AD 발병에서 ALP 유전자의 스플라이스에 영향을 미치는 변이체의 영향을 분석할 수 있도록 한다. 게놈의 비암호 게놈 영역의 역할에 대한 보다 자세한 분석을 수행하기 위해 100명의 개체의 전체 게놈 시퀀싱도 생성되고 있다.

(II) 생체내 AD 발병에 대한 ALP의 선택된 후보 유전자의 기능적 효과의 결정

AD 위험과 관련된 새로운 ALP 유전자가 시험관내 AD 발병에 역할을 하는 것으로 가정한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포 기반 검정은 AD 위험과 관련된 후보 ALP 유전자 중에서 선택된 변이체가 효소 활성, 단백질 안정성 및/또는 mRNA 수준에 미치는 효과 및 이의 리소좀 기능에 대한 영향을 조사하는데 사용될 수 있다. 아밀로이드생성, APP 프로세싱 및 Aβ 분해에 대한 검증된 기능적 변이체의 효과는 아래에 기술된 바와 같이 조사할 수 있다.

방법론 및 분석

(I)에서 식별된 AD와 관련된 각 ALP 유전자의 모든 변이체를 평가하는 것은 본 명세서에 기술된 연구 범위를 벗어나는 것이다. 따라서, 다음 기준에 일치하는 유전자 중에서 (I)에서 식별된 상위 3 내지 5개의 변이체가 우선된다. 1) 1차 뉴런/미세아교세포를 획득하고 (III)에 요약된 생체내 실험을 수행하는 데 사용할 수 있는 이용가능한(상업적으로 또는 협력자를 통해) 마우스 모델이 있는 경우. 2) 기능의 변화를 감지하는데 이용할 수 있는 생화학적 및/또는 세포 기반 검정이 있는 경우. 3) 데이터 분석을 지원하기에 충분한 전문 지식을 갖춘 공동 작업자가 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학에 있는 경우. 따라서, 발견 샘플 및 반복 샘플 모두의 데이터 강도와 상기 기준 전부를 고려하여, 3개의 유전자 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5가 선택되었다. 본 명세서에 기술된 모든 실험을 수행하기 위해서는 전문 지식과 적절한 협력을 이용할 수 있다.

선택된 ALP 유전자 클로닝

단백질 발현 및 정상 기능에 대한 야생형 및 돌연변이 후보 유전자의 효과를 특성화하는 것이 중요하다. cDNA 클론은 Origene 또는 Invitrogen의 후보 유전자로부터 구입한다. 선택된 변이체는 부위 지시성 돌연변이유발 키트(QuikChange II(Agilent Technology, 미국 캘리포니아 산타클라라 소재))를 사용하여 조작한다.

렌티바이러스 생성

야생형 및 돌연변이 cDNA는 퓨로마이신 내성 유전자를 운반하는 pLenti-III-PGK 벡터(Applied Biological Materials Inc, 캐나다 리치몬드 소재)에 서브클로닝한다. VSV-G, Gag-Pol 및 Rev를 암호화하는 플라스미드와 함께 최종 렌티 벡터를 이전에 설명한 바와 같이 HEK-293T 패키징 세포 내로 공동 형질감염시킨다. 바이러스 상청액은 이전에 공개된 프로토콜에 따라 수집한다. N2A695 세포는 24시간 동안 농축되지 않은 바이러스 상청액과 함께 배양되며, 세포는 4주 동안 5 ㎍/㎖의 퓨로마이신에 의해 선택된다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자에 대한 특정 shRNA를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 녹다운 모델도 N2A695 세포에서 생성된다.

세포 기반 검정

하기 세포주가 사용된다: 인간 배아 신장(HEK293-T), N2A, 및 N2A695(APP 프로세싱을 연구하는데 일상적으로 사용되는, 인간 APP695 WT(N2A695로 명명됨)를 안정적으로 발현하는 마우스 신경모세포종 세포)(예를 들어, 도 7a 참조). NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 반접합성 또는 넉아웃 마우스 모델의 1차 뉴런 또는 미세아교세포도 (I)에서 식별된 변이체에 의해 형질도입된다. 1차 뉴런 배양은 이전에 설명한 대로 수행한다.

mRNA 및 단백질 수준의 효과

특정 프라이머를 사용한 정량적 실시간 PCR은 mRNA 수준 및 스플라이싱에 미치는 선택된 변이체의 효과를 시험하는 데 사용된다. 웨스턴 블롯은 다음 항체 항-CSPα(ADI-VAP-SV003-E, ENZO Life Sciences) 항-NAGLU(ab137685, Abcam) 및 항-NPC1에 의해 수행된다. 형광 검정은 NAGLU 활성에 대해 이전에 설명된 바와 같이 수행한다(예를 들어, 도 7d 및 도 7e 참조). 간략하게 설명하면, 4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-α-글루코사미나이드 절단은 0.02 내지 5mM 범위의 4-메틸움벨리페론(Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재)에 대한 표준 곡선을 사용하여 Hitachi F-2000 형광 분광광도계(Hitachi, 캘리포니아주 플레젠턴 소재)에서 448nm 방출 및 365nm 여기 하에 측정한다. NPC-1 특이적 검정은 이전에 공개된 바와 같이 수행한다.

리소좀 기능

Lysotracker는 유세포 분석을 사용하여 세포당 산성 구획의 수를 정량화하는 데 사용된다(예를 들어, 도 7c 참조). 리소좀 pH는 LysoSensor Yellow/Blue dextran(DND-160)에 의해 측정된다. 리소좀 막 완전성은 아크리딘 오렌지(Acridine orange)에 의해 모니터링된다. 아세포 분획화는 조직 및 배양 세포용 리소좀 농축 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 수행하며, LAMP1, Rab7 및 EEA1은 리소좀, 후기 및 초기 엔도솜 마커에 대한 대조군으로서 사용한다(예를 들어, 도 7b 참조). 이 검정은 리소좀 내의 선택된 단백질(LAMP-1 또는 -2), 초기 엔도솜(EEA1), 후기 엔도솜(Rab7), 원형질막(플로틸린) 마커를 공동국재화하기 위한 면역형광의 공초점 이미지화에 의해 보완된다(예를 들어, 도 7a 참조).

세포 용해물 기반 리소좀 효소 활성

리소좀 효소 활성의 세포내 및 세포외 2차 상승은 PPT-1, β-gluc 및 β-Hexa에 대한 형광 검정에 의해 수행된다(예를 들어, 도 7d 및 도 7e 참조).

거대자가포식의 약리학적 조절

형질도입된 세포는 자가포식 시스템(라파마이신, 토린1, 토린 2, 메틸아민, 브레펠딘(brefeldin) A 및 스파우틴(Spautin)-1) 및 샤페론 매개 자가포식(AR7)의 활성화제 및 저해제로 처리한다. LC3 및 p62의 웨스턴 블롯은 거대자가포식 활성화의 간접 지표인자로서 사용한다. 클로로퀸, 염화암모늄(NH₄Cl) 및 류펩틴과 같은 리소좀향성 작용제(lysosomotropic agent)는 양성 대조군으로서 사용한다.

APP 프로세싱 및 회전율(turnover)에 미치는 영향

N2A695 세포는 APP 반감기를 정량하기 위해 단백질 합성 저해제 사이클로헥시미드로 처리한다. APP 프로세싱 기구의 단백질 및 전사체 수준(PSEN1, Nicastrin, ADAM10, ADAM17 및 BACE1)은 각각 웨스턴 블롯 및 RT-qPCR에 의해 측정한다. 세포 표면 APP에 대한 선택된 ALP 유전자의 동적 효과를 측정하기 위해, 원형질막의 APP는 4℃에서 비-막투과성 절단 비오틴 유도체(설포-NHS-SS-비오틴)를 사용하여 표지화한다. 세포 표면 APP는 이전에 공개된 바와 같이 스트렙타비딘 IP 및 APP 면역블롯팅에 의해 측정한다.

Aβ40/Aβ42 수준

형질도입된 N2A695 세포로부터의 세포 용해물 및 배지 내의 Aβ 종은 이전에 공개된 바와 같이 샌드위치 ELISA에 의해 검출한다(예를 들어, 도 9c 참조). Aβx-40 및 Aβx-42 펩타이드는 마우스 단클론 코팅 항체 HJ2(항-Aβ35-40) 및 HJ7.4(항-Aβ37-42)로 포획한다. 중심 도메인을 표적으로 하는 비오틴화 항체인 HJ5.1(항-Aβ13-28), 또는 N-말단 아미노산을 표적으로 하는 HJ3.5(항-Aβ1-13)를 검출 항체로 사용한 다음, 스트렙타비딘-폴리-HRP-40(Fitzgerald Industries)을 사용한다.

APP의 α/β-세크레타제 프로세싱

세포 상청액의 APP 절단 산물(sAPPβ 및 sAPPα) 및 세포내 단편(α- 및 β-CTF)은 웨스턴 블롯으로 측정한다. 다음 항체 22C11 및 CT695를 사용하여 전체 길이 및 α- 및 β-CTF 단편을 특성화한다(예를 들어, 도 9d 참조).

Aβ 흡수/분해

선택된 변이체 또는 특정 shRNA에 의해 형질도입된 1차 미세아교세포를 2시간 동안 250nM 합성 Aβ42로 처리한다. Aβ 흡수를 측정하기 위해 Aβ42 처리된 세포를 세척하고 트립신 처리하여 표면 결합된 Aβ를 제거하고, 용해하고, 세포내 Aβ42를 샌드위치 ELISA에 의해 측정한다(예를 들어, 도 9c 참조). Aβ 흡수율은 세포가 Aβ42에 노출되는 시간을 0, 5, 10, 30분, 및 1, 2, 4, 8, 12, 24시간으로 변화시켜 측정한다. Aβ 분해를 측정하기 위해, 세포를 250nM 합성 Aβ42로 2시간 동안 처리하고, 완전히 세척하고, 새로운 배지에서 항온처리한다. 그 다음, 세포를 세척하고, 트립신처리하고, 용해하고, 0, 2, 4, 8, 12, 24시간 후에 세포내 Aβ42를 측정한다. 세포내 Aβ 반감기는 이전에 공개된 1차 동역학을 가정하여 계산한다.

생물정보학 분석

다음 공개적으로 이용가능한 데이터베이스가 보완 분석에 사용된다: Gene Expression Omnibus, Brain RNA-seq2, Mouse Dementia Network(Mouse DemNet)의 유전자 발현 데이터, PolyPhen2, SIFT, Human Splicing Finder 및 Mouse Genome Informatics.

예상 결과

DNAJC5에 대한 예측된 희귀 기능 변이체 및 확인 결과를 검출하기 위한 여기에 설명된 특정 설계를 기반으로 하여, (I)에서 식별된 ALP 유전자 위험 변이체가 부분적인 기능상실을 유발하고 리소좀 기능을 변경할 것으로 예상된다. 이들 단백질의 기능에서 5 내지 20%의 잔류 활성이 검출될 것으로 예상된다. 또한, ALP 유전자의 과발현, 하향 조절 또는 스플라이싱 변화 변이체가 APP 대사 및 아밀로이드생성에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 문헌의 마이닝 데이터 및 전산 자료를 사용하여 각 ALP 유전자에 대한 Aβ 또는 타우 대사 검정을 포함한 세포 유형 및 기능 검정을 신중하게 선택할 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 실험을 통해 ALP 유전자에서 선택된 변이체가 뉴런 및 미세아교세포 생존에 미치는 효과를 평가할 수 있을 것으로 예상된다.

NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자에서 WT와 위험 변이체 간의 강력한 차이가 관찰되지 않는다면, 이것은 기능의 미묘한 변화를 은폐하는 과발현 때문일 수 있다. 따라서, 작은 변화를 유발하는 AD 위험 변이체는 평생 동안 질환에서 나타날 수 있지만, 세포 배양물 시기에는 효과를 관찰하는데 어려움이 있을 수 있다. 따라서, APP 돌연변이는 과발현될 수 있거나, ALP 기능이 약리학적으로 변경될 수 있다. 5XFAD 트랜스제닉 마우스(34840-JAX)와 같은 AD 마우스 모델의 1차 뉴런이 사용되어, NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 선택된 변이체에 의해 형질도입되고, APP 프로세싱 및 타우 응집에 대한 효과가 시험될 수 있다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자에 변이체를 운반하는 AD 환자의 iPSc 유래 뉴런이 사용될 수 있으며, APP 대사에 대한 이러한 변이체의 효과가 대조군과 비교될 수 있다. CRISPr 기술과 같은 게놈 편집 방법을 사용하여 ALP 유전자에 선택된 변이체를 도입시키고 위에서 설명한 기능 검정을 수행할 수 있다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자에서 선택된 변이체를 안정적으로 발현하는 N2A695 세포 또는 1차 뉴런 또는 신경교 세포를 자가포식 저해제의 리소좀향성 작용제의 치사량이하의 용량으로 처리할 수 있고, APP 프로세싱에 대한 효과를 측정할 수 있다.

시험관내에서 AD의 위험 및 발병 모두에 영향을 미치는 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5의 변이체를 식별한 후의 다음 단계는 LSD 치료법의 진행을 활용하는 것이다. 효소 대체, 기질 감소, 분자 샤페론 또는 ALP의 약리학적 조절과 같은 치료 전략을 활용하고 AD 발병 검정에 대한 효과를 시험관내에서 시험한다.

(III) 생체내 AD 병리에 대한 ALP의 선택된 후보 유전자의 기능적 효과 결정

AD 위험과 관련된 새로운 ALP 유전자가 생체내 AD 발병에 역할을 하는 것으로 가정한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, AD 병리의 자발적 발달에 대한 정량적이고 정성적인 병리 조사를 반접합성 또는 넉아웃(KO) NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 마우스에서, 내인성 병리의 발생 시간에 의해 정의된 3개의 시점에서 수행할 수 있다. Aβ 플라크 부담에 대한 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 유전자 투여량 효과는 초기 발병 가족성 AD의 잘 특성화된 모델, 5XFAD 트랜스제닉 마우스(34840-JAX)에서도 측정할 수 있다.

방법론 및 분석

(I)에서 식별된 AD와 관련된 각 ALP 유전자를 평가하는 것은 본 명세서에 기술된 실험 범위를 벗어나는 것이다. 따라서, 후속 생체내 연구를 위해 선택되는 마우스 모델의 선택을 위해 포함 기준이 정의되었다: 이용가능해야 하고(상업적 또는 협력자를 통해), 기능적 검정, 강력한 뇌 병리, 강력한 행동 변화, 이상적으로는 짧은 수명 및 아밀로이드생성에 대한 효과의 시험관내 검증이 있어야 한다.

마우스 그룹

이 실험을 위해 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 마우스의 3 그룹(18마리 마우스/그룹): 1) 정상적인 한배 새끼, 2) 반접합성(+/-) 마우스, 및 3) 결손성(-/-) 마우스가 3회의 다른 시점에서 생성된다. NAGLU KO 마우스의 수명 중앙값은 12개월이다. 그러나, 뇌 병리는 빠르면 3개월에 분명해진다. 따라서, AD 병리는 NAGLU 마우스에서 2개월, 4개월 및 8개월에 조사한다. DNAJC5 KO 마우스의 수명 중앙값은 60일이며 뇌 병리는 빠르면 30일에 분명해진다. 따라서, AD 병리는 21일, 30일 및 40일에 조사한다. NPC1 KO 마우스의 수명 중앙값은 75일이므로, 30, 50 및 70일에 NPC1 KO 마우스에서 AD 병리를 조사한다.

AD 마우스 모델 5XFAD도 사용된다. 5XFAD 마우스는 6주령에 뉴런내 Aβ-42를 축적한다. 해마에서 아밀로이드 침착은 2개월에 나타나며 나이 든 마우스의 뇌 전체로 전파된다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 결손이 기존의 아밀로이드생성 과정을 악화시킬 수 있는지 여부를 추가로 확인하기 위해, NAGLU, NPC1 및 Cspα 마우스를 5XFAD 트랜스제닉 마우스와 교배한다. 이 실험을 위해 3개의 그룹(27마리 마우스/그룹)을 생성한다. Aβ 플라크 부담에 대한 유전자 투여량의 효과는 5XFAD/NAGLU(+/-), 5XFAD/NPC-1(+/- ) 및 5XFAD/DNAJC5(+/-) 마우스에서 3주마다 Aβ-42 뇌 수준, 1개월 및 2개월에 아밀로이드 침착을 측정하여 결정한다. 이 실험을 위해 3개의 그룹(27마리 마우스/그룹)을 생성한다. 5XFAD 병리에서 선택된 유전자의 완전한 부재의 효과는 각 KO 마우스에서 내인성 병리를 평가하기 위해 기술한 동일한 시점에서 5XFAD/NAGLU(-/-), 5XFAD/NPC-1(-/-) 및 5XFAD/DNAJC5(-/-) 마우스를 분석하여 평가한다. 실험자는 조직학적 분석 동안 동물의 유전형과 연령에 대해 알지 못한다. 각 마우스에는 ID 번호가 무작위로 할당된다.

아밀로이드 플라크 정량

50 마이크로미터 두께의 비브라톰(vibratome) 뇌 절편을 앞쪽 전교련에서부터 꼬리 해마까지 300μM마다 수집한다. 플라크 이미지화를 위해, 절편은 ThioS로 염색하거나, HJ3.4 항-Aβ 항체로 면역염색한다. 염색된 뇌 슬라이스의 고해상도 디지털 이미지는 NanoZoomer 디지털 스캐너(Hamamatsu Photonics)로 수득한다. 플라크 적용범위의 총 면적은 해마 또는 조롱박 피질 영역에서 NIH ImageJ를 사용하여 측정하며 각 슬라이스에 대한 총 면적의 백분율로서 표시된다. n = 4 절편으로부터의 결과는 각 동물을 대표하기 위해 평균을 낸다.

Aβ40/Aβ42 수준

어린 마우스의 해마에서 총 Aβ를 검출하기 위해, 절제된 조직을 PBS 및 그 다음 RIPA 완충액에서 순차적으로 균질화하여 플라크가 관찰되지 않는 연령에서 세제 가용성 Aβ를 수득하고, 샘플을 분석을 위해 저장한다. 나이 든 마우스(플라크가 풍부할 때)에서 해마 조직은 PBS 및 그 다음 TBS 중 5M 구아니딘, pH 8.0(원섬유 및 막-결합된 Aβ를 추출하기 위해)에서 순차적으로 균질화했다. Aβ40/Aβ42 수준은 (II)에 기술된 바와 같이 ELISA로 정량한다.

예상 결과

유전자 분석이 보고하는 큰 효과 크기를 기반으로 하여, 반접합성이며 AD 위험과 관련이 있는 것으로 발견되고 시험관내 검정에서 검증된 후보 ALP 유전자가 결손된 마우스에서는 각각의 연령 일치된 대조군에서보다 더 많은 AD 병리가 발견될 것으로 예상된다. 또한, AD 병리에 대해 유전자 용량 효과를 볼 수 있을 것으로 예상되며; 반접합성 및 KO 마우스의 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자는 5XFAD 마우스에서 Aβ 플라크 부담의 부하를 가속 및 악화시켜야 한다.

반접합성 및 결손 마우스의 뇌에서 AD 병리가 발견되지 않는 경우, (II)에서 검증된 가장 중요한 변이체를 운반하는 AAV2/9 벡터를 만들어 반접합성 마우스의 해마에 정위적으로 주입하고 AD 병리의 존재를 재평가한다. AD 병리가 발견되면, 결손 유전자의 야생형 카피를 운반하는 AAV2/9 벡터를 주입하고 AD 병리를 재검사하여 구제 실험을 시도할 수도 있다. AD 병리에서 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 역할을 시험하는 또 다른 방식은 검증된 shRNA/RNAi를 운반하는 AAV2/9 벡터를 주사하여, 5XFAD 트랜스제닉 마우스에서 AD 병리를 녹다운시키고 AD 병리에 효과가 있는지 시험하는 것이다.

효소 대체, 기질 감소, 분자 샤페론 및 ALP의 약리학적 조절과 같은 LSD에 대한 요법은 생체내 AD 발병 검정에 대한 효과에 대해 시험될 수 있다. 여기에 기술된 연구의 결과와 NAGLU 활성에 대한 형광 검정 및 NPC1 생물마커에 대한 질량분석 검정의 이용가능성을 조합하면, AD 사례 및 대조군의 대규모 코호트의 CSF, 혈장, 혈청 또는 건혈 반점을 선별하여 AD의 생물마커로서 사용될 수 있는 특정 결함을 검출할 수 있다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 결손이 타우 병리를 악화시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 마우스를 타우 발현 마우스, p.P301L(015815-JAX)와 교배한다. 타우, p. P301L 마우스는 생후 4개월이 되면 피질에 엉킴을 발생시킨다. 따라서, 타우 수준은 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 마우스와 교배된 마우스에서 1개월령에 측정한다. 마우스 뇌에서 과인산화된 타우의 부담을 측정하기 위한 조건이 최적화되었다. ELISA에 의한 타우 뇌 수준의 정량화는 또한 이전에 최적화되어 있다. CRISPr 기술과 같은 게놈 편집 방법은 시험관내 검정에서 가장 강력한 효과가 있는 ALP 유전자 변이체의 넉인(knock-in) 마우스를 생성하는 데 사용된다. 이러한 넉인(knock-in) 마우스는 또한 5XFAD를 포함한 AD 마우스 모델 및 타우, p. P301L을 발현하는 마우스와 교배된다.

실시예 3: 알츠하이머병(AD)에서 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 기능장애의 기초가 되는 유전자 변이 식별

이 실시예는 알츠하이머병에서 자가포식-리소좀 경로의 유전자에 있는 희귀 기능 변이체의 역할을 기술한다.

여러 시험관내 및 생체내 연구에서 자가포식 리소좀 경로(ALP) 기능장애가 AD의 발병에 기여한다는 것을 시사하지만, 연령 의존적이고 AD 관련된 ALP 기능의 저하의 기초가 되는 유전자 변이는 잘 이해되어 있지 않다. AD 유발 유전자의 희귀 기능 변이체 및 여러 AD 위험 유전자는 ALP 기능장애를 유발한다. 그러나, ALP의 각 유전자의 일반 집단 내에서의 유전자 변이가 AD 발병 위험 및 AD 발병에서의 역할에 기여하는지에 대한 체계적이고 포괄적인 평가는 완료되지 않았다. 현재 지식의 이러한 격차를 해결하기 위해, AD 발병 위험과 관련된 ALP의 유전자의 희귀 기능 이형접합성 변이체를 식별하고 우선순위를 지정하는 강력한 접근법이 본 명세서에 기술된다. 전산 방법과 실험 데이터를 결합시킨 혁신적인 통합 프레임워크가 시험관내 및 생체내 모두에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하는데 사용될 수 있다. 첫째, 33,350명의 비-핀란드계 유럽인 대조군으로부터의 ALP의 각 유전자에 있는 희귀 기능 변이체의 부담을 2,000명의 AD 사례 및 3,000명의 대조군과 비교한다. 그 결과를 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)에서 공개적으로 이용가능한 10,000개의 샘플과 함께 2,000개의 AD 사례 및 2,000개의 대조군을 포함하는 추가 독립 샘플에서 반복한다. 둘째, 생화학적 및 세포 기반 검정을 사용하여 AD와 관련된 후보 ALP 단백질에서 선택된 유전자 변이체의 기능적 영향을 완전히 특성화한다. ALP 기능에 대한 돌연변이 단백질의 효과 및 전체 길이의 APP 수준, APP 트래피킹, 뉴런에서의 Aβ 생성 및 신경교 세포에 의한 Aβ 분해에 대한 결과를 조사한다. 마지막으로, NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 반수체기능부전이 AD의 잘 특성화된 마우스 모델에 존재하는 AD 병리를 가속화하는지 여부를 결정할 수 있다. Aβ를 수반하는 AD 관련 표현형에 대한 유전된 경미한 만성 리소좀 손상의 효과에 대한 정량적인 병리학적 조사가 수행된다. 본 명세서에 기술된 실험은 AD와 관련된 새로운 ALP 유전자를 밝혀낼 수 있다. 그들은 AD 병인에서 ALP 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있다.

본 명세서에 기술된 연구의 목표는 알츠하이머병(AD) 발병에 관여하는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 기능장애의 기초가 되는 유전자 변이를 식별하는 것이다. 본 명세서에 기술된 연구는 시험관내 및 생체내 모두에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하기 위해 전산 방법과 실험 데이터를 결합시킨 혁신적인 통합 프레임워크를 포함한다. 본 명세서에 기술된 실험은 AD와 관련된 새로운 ALP 유전자를 밝혀낼 수 있다. 그들은 AD 발병에서 ALP 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있다.

알츠하이머병에서 자가포식-리소좀 경로의 유전자에서의 희귀 기능 변이체의 역할

연령은 알츠하이머병(AD)의 발병 및 진행에 가장 큰 위험 인자이다. 노화는 또한 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 분해 능력을 감소시킨다. 여러 시험관내 및 생체내 연구는 ALP 기능장애가 AD의 발병에 기여한다는 것을 암시하지만, ALP 기능의 연령 의존적 및 AD 관련 저하의 기초가 되는 유전자 변이는 잘 이해되어 있지 않다. 주요 가설은 추가적인 연령 관련 ALP 손상에 의해 악화되는 경미한 형태의 유전성 ALP 기능장애가 AD 병리의 발달에 기여한다는 것이다. 따라서, 뉴런의 유전된 ALP 손상은 아밀로이드 생성을 증가시킬 수 있는 반면, 신경교 세포의 ALP 손상은 아밀로이드 플라크를 분해하는 능력을 감소시킬 수 있다. 즉, 생산과 제거 사이의 균형은 Aβ 수준과 아밀로이드 플라크를 발생시키는 경향을 결정한다.

고립된 집단에서 소수의 ALP 유전자(예를 들어, 카텝신 D)의 단일 암호 변이체 및 대규모 게놈 전체 상관분석 연구(GWAS)로부터의 인트론 "적중"(예를 들어, SQSTM1)에 초점을 맞춘 소규모 샘플 크기 연구는 AD 위험에서 ALP의 유전자 변이체의 역할을 뒷받침한다. 또한, AD 유발 유전자(예를 들어, Presenilins)의 희귀 돌연변이와 AD 위험 유전자(예를 들어, SORL1)의 기능적 암호 변이체는 ALP 기능장애를 유발한다. 인간 게놈은 ALP와 관련된 적어도 430개의 유전자를 암호화한다. 그러나, AD 발병 위험에 대한 ALP의 각 유전자에서의 암호 변이체의 기여에 대한 체계적이고 포괄적인 평가는 완료되지 않았다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 섹션 (I)은 이 격차를 해결할 수 있다.

전체 엑솜 시퀀싱(WES) 데이터를 AD 사례 및 대조군의 대규모 데이터베이스와 조합하여, 추정상의 ALP 유전자(포스포리파제 D 계열, 구성원 3, PLD3)의 희귀 변이체가 AD 위험과 관련이 있음은 이전에 밝혀냈다. PLD3는 전사 인자 EB(TFEB)-반응성 유전자이며, 리소좀 매개 메커니즘을 통해 아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid Precursor Protein, APP) 프로세싱에 영향을 미치는 것으로 보인다. 후기 발병 산발성 AD에서는 또 다른 여러 리소좀 유전자의 예측된 기능 이형접합성 변이체가 풍부함을 입증하는 데이터가 있다. 이러한 연관성을 검증하기 위한 노력으로, 시냅스 샤페론인 시스테인 스트링 단백질(CSPα)의 보완적 역할이 기능적 리소좀 관련 단백질로서 발견되었다. 또한, AD 환자 및 마우스 모델의 뇌에서 CSPα 전사체 수준이 감소함을 보여주는 데이터가 수집되었다. 또한, CSPα의 돌연변이는 시험관내 자가포식소체/리소좀 융합에 영향을 미치고 생체내 Aβ 생성에 영향을 미친다. 세포내 콜레스테롤 수송체 1(NPC1) 및 N-아세틸-알파-글루코사미니다제(NAGLU)를 암호화하는 유전자도 이러한 분석에서 AD 위험과 관련이 있다. 또한, 정상적인 인간 뇌 샘플에서 NPC1 및 NAGLU 전사체 수준은 나이가 들수록 상당한 증가가 발견되었다. 흥미롭게도, NPC1 및 NAGLU 전사체 수준은 연령이 일치하는 대조군에 비해 AD 사례에서도 상당히 더 높다. 이러한 결과는 본 명세서에 기술된 연구의 실행가능성을 뒷받침하며, ALP 유전자의 기능적 이형접합성 변이체에 의해 야기된 반수체기능부전이 시험관내 및 생체내에서 APP 대사, Aβ 생성 및 Aβ 분해에 영향을 미칠 수 있는 AD 발병 위험에 영향을 미친다는 것을 시사한다.

(I) AD에서 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자 식별

모든 ALP 유전자(n=430)의 단일 변이체 및 유전자 기반 분석은 사내에서 4,000건의 AD 사례와 5,000건의 대조군에서 수행한다. 결과는 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)의 독립적인 샘플(5,000건의 AD 사례 및 4,500건의 대조군)에서 반복한다. 모든 ALP 유전자는 Exome Aggregation Consortium(ExAC) 데이터베이스의 비핀란드계 유럽인(n=33,350)의 WES 데이터를 사용하여 분석하여 유럽 혈통의 개체에서 얻은 ALP의 각 유전자의 기준 유전자 변이를 결정한다.

(II) 시험관내에서 APP 대사, Aβ 생성 및 Aβ 분해에 대한 ALP의 선택된 후보 유전자의 기능적 효과 결정

단백질 기능, 단백질 안정성에 대한 선택된 변이체의 효과 및 ALP 기능에 미치는 영향을 검증하기 위해 생화학적 및 세포 기반 검정을 사용한다. APP 트래피킹, APP 반감기, APP 프로세싱 기구 및 Aβ 생성에 대한 검증된 기능 변이체의 효과를 1차 뉴런에서 검사한다. Aβ 흡수 및 분해는 결손성 또는 반접합성 마우스(NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자)의 신경교 세포에서 시험한다.

(III) 나이 든 마우스에서 AD 병리의 발달에 대한 선택된 후보 ALP 유전자의 반수체기능부전 의 기능적 효과 결정

경미한 리소좀 손상이 AD 발병의 초기(4개월) 및 후기(8개월령)에 5XFAD 마우스에서 Aβ 생성, 플라크 침착, 시냅스 손실 및 신경교증을 가속화하는지 여부를 결정할 수 있다. AD 관련 표현형에 대한 유전된 만성 유전 리소좀 손상의 효과에 대한 정량적인 병리학적 조사가 FAD 돌연변이가 없는 24개월된 마우스에서 수행된다.

이러한 연구는 AD와 관련된 ALP 기능장애에 대한 유전자 기여의 원리 증명 기반을 형성한다. 이 지식은 현재 부족하고 새로운 치료 표적을 산출할 수 있다.

연구 전략

의의

자가포식-리소좀 경로(ALP)는 세포내 소기관 및 응집-경향성 단백질의 분해를 위한 주요 경로이다. 문자 그대로 '자가 섭취'를 의미하는 자가포식은 리소좀을 통한 영양소의 소화 및 재순환을 담당하는 세포내 분해 경로이다. 선의의 기능적 자가포식 반응은 내인성 또는 외인성 기원의 세포질 물질을 리소좀 내에서의 분해로 유도한다. 리소좀은 영양소 감지, 및 세포 제거와 에너지 대사를 제어하는 리소좀-핵 신호전달 메커니즘을 통해, 라파마이신 복합체 1(mTORC1) 키나제 복합체 및 전사 인자 EB(TFEB)의 포유류 표적을 수반하는 신호전달 경로에서 중요한 역할을 한다. ALP는, 특히 임의의 질병 관련 돌연변이 단백질의 발현이 없는 경우에도, 신경퇴행에 대한 보호 역할을 하는 세포내 품질 관리 시스템이다. "코어" 자가포식 유전자(ATG5 및 ATG7)의 뉴런 특이적 결실은 비정상적인 단백질 축적, 진행성 신경퇴행 및 조기 사망을 유발한다.

AD에서 ALP 기능장애

가족성 형태의 AD는 증가된 아밀로이드-β(Aβ) 생산에 의해 병원성으로 유도되지만, 후기 발병 산발성 AD 환자에 대한 최근 연구에서는 Aβ 제거 손상을 입증한다. 따라서, 생산과 제거 사이의 균형은 Aβ 수준과 아밀로이드 플라크를 발생시키는 경향을 결정한다. ALP "코어" 유전자는 인간 뇌의 정상적인 노화 동안 전사적으로 하향조절된다. 놀랍게도, 정상적인 노화와 달리 AD 환자의 뇌에서는 ALP가 전사적으로 상향조절되며, 이는 비정상적인 단백질의 축적을 대응하는 시스템의 보상적 시도임을 나타낼 수 있다. 산발성 AD 뇌에서 beclin 1(ALP에서 자가포식소체 형성에 필수적인 다기능성 단백질)의 수준 감소, rab5 및 rab7(엔도솜-리소좀 경로를 따라 소포의 트래피킹을 조절하는 작은 ras 관련 GTPase(rab) 단백질)의 수준 증가, 및 거대자가포식(높은 LC3-II 수준) 및 mTOR 신호전달(인산화된 p70 S6 키나제)의 비정상적인 활성화뿐만 아니라, 이영양증 신경돌기에서 리소좀 조밀체 및 자가포식 액포(AV)의 대규모 신경 축적이 있다. 또한, 신경병리학적 연구에 따르면, AD 뇌의 자가포식-리소좀 병리가 AD 발병에 기여하는 것으로 발견되었지만, 기본 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다.

유전된 ALP 기능장애는 AD 병리를 악화시킴

ALP의 변화는 여러 트랜스제닉 마우스 AD 모델에서도 발견되었다. 2가지 AD 마우스 모델(J20 및 T41; hAPP751V171I, KM670/671NL)에서 beclin 1의 반수체기능부전은 리소좀을 추가로 파괴하고 세포내 및 세포외 Aβ 축적을 촉진하고 신경퇴행을 악화시켰다. 리소좀의 뉴라미니다제 1(NEU1)의 부재는 AD 모델(5XFAD, APP KM670/671,I716V,V717I/PSEN1M146L/L286V)에서 Aβ 병리를 악화시켰다. 이와 대조적으로, NEU1의 과발현은 AD 병리를 감소시켰다. 이러한 결과는 모두 ALP "코어" 유전자 또는 리소좀 단백질의 변화가 AD 병리를 악화시킨다는 것을 암시한다.

ALP 기능 개선은 아밀로이드 AD 관련 표현형을 감소시킴

APP/PS1(APPK670M/N671L/PS1M146L) 마우스는, 특히 Aβ의 세포외 침착 이전에도, 취약한 뉴런 집단에서 비정상적인 거대자가포식 활성화를 나타낸다. 그러나, 뉴런과 성상세포 모두에서 TFEB의 표적 발현은 APP/PS1 마우스 모델에서 Aβ 플라크를 감소시켰다. TFEB 발현은 여러 리소좀 및 트래피킹 유전자의 전사 상향조절을 유도하고 리소좀 산성화 및 기능을 증가시킨다. AD 마우스 모델(TgCRND8; hAPPK670N/M671L/V717F)에서 리소좀 시스테인 프로테아제 활성화(시스타틴 B를 결실시킴에 의해)는 자가포식-리소좀 병리를 구제하고, 비정상적인 Aβ 및 유비퀴틴화된 단백질 축적을 감소시키고, 세포외 아밀로이드 침착 및 뇌의 총 Aβ40/42 수준을 감소시켰으며, 학습 및 기억력 시험에서 결손의 발달을 방지했다. 리소좀 프로테아제의 약리학적 활성화는 두 AD 마우스 모델(J20 및 APP/PS1)에서 Aβ42 수준을 감소시키고 인지 시험 및 시냅스 결손에 대한 성능을 개선했다. ALP(mTOR-저해)의 약리학적 활성화는 여러 AD 모델(J20; hAPP695,751,770V171F,KM670/671NL), (3xTg-AD; APPSwe/TauP301L), (APP-PS1, APPswe/PSEN1dE9)에서 인지 결손을 개선하고 β-아밀로이드 축적을 경감시킨다. 이러한 결과는 ALP의 전반적인 활성화 또는 리소좀 단백질분해의 선택적 향상이 모두 여러 AD 마우스 모델에서 아밀로이드 제거를 촉진한다는 것을 보여준다.

Aβ는 엔도솜-자가포식-리소좀 구획에서 생성됨

세포 연구는 엔도솜-리소좀 시스템이 Aβ 생산의 주요 부위임을 암시한다. 그러나, 정확히 Aβ가 생성되는 위치에 대한 일치된 의견은 없다. Aβ는 시험관내 및 생체내 모두에서 거대자가포식을 유도한 후 생성된다. Aβ의 축적은 mTOR 신호전달을 증가시키는 반면, mTOR 신호전달의 감소는 Aβ 수준을 감소시키며, 이는 ALP 활성화와 Aβ 수준 사이의 네거티브 피드백을 암시한다. 자가포식 활성화 하에, 자가포식성 액포는 γ-세크레타제 활성이 가장 높은 세포 부위가 된다. PSEN2 및 니카스트린(Nicastrin)(촉매적으로 필수적인 γ-세크레타제 성분)은 리소좀에 위치한다. 사실, PSEN1은 리소좀 pH를 조절한다. 시험관내 리소좀 기능의 약리학적 손상은 Aβ 생산의 변화를 초래한다. 리소좀 pH의 변화는 Aβ 분비를 감소시킨다. 리소좀 프로테아제 저해제는 아밀로이드생성 APP 단편의 생산을 감소시킨다. 이러한 모든 연구는 전체 리소좀 기능이 정상 및 비정상적인 APP 프로세싱 및 후속적인 아밀로이드생성에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다. 한편, 특정 리소좀 유전자가 결손된 마우스에 대한 연구는 APP 프로세싱 및 Aβ 생산에서 각 유전자의 독특한 역할을 밝혀냈다. 인간 병리, 마우스 및 세포 모델로부터의 모든 증거는 자가포식 유도의 결손이 질병 초기에 발생하지만, 리소좀 제거 결손은 질병의 더 진행된 단계에서 발생함을 강력하게 암시한다. 그러나, ALP의 변화가 AD 병리의 원인, 결과 또는 변형 요인인지는 분명하지 않다.

인간 리소좀 유전자의 완전 기능상실 및 AD

리소좀 유전자와 AD 사이의 관계에 대한 현재의 이해는 리소좀 축적 질환(LSD)에서 AD 병리를 조사한 소수의 연구에 의해 형성된다. 이 연구는 점액다당류증(MPS), 니만 픽병 C형(NPC) 또는 뉴런 세로이드 지질갈색소증(NCL) 뇌에서 Aβ 플라크를 발견하지 못했다. 그러나, MPS, NPC 및 NCL 환자는 뇌 전반의 세포의 세포질에서 강렬하고 확산된 Aβ 신호를 나타낸다(예를 들어, 도 13a 및 도 13b 참조). MPS 환자는 정상 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ 수준의 상당한 증가를 나타낸다. Aβ38, Aβ40 및 Aβ42의 CSF 수준 증가는 NPC 환자의 뇌에서 증가된 γ-세크레타제 의존성 Aβ 방출을 암시한다. NCL을 갖는 인간 환자는 대조군과 비교하여 Aβ40 및 Aβ42 수준의 상당한 감소를 나타냈다(예를 들어, 도 13a 및 도 13b 참조). 또한, FAD 돌연변이의 과발현 없이, NPC1(Niemann-Pick 질병), CLN3(Batten 질병) 및 HEXB(Sandhoff 질병) 유전자가 결손된 마우스는 세포내 APP 단편(α-CTF/β-CTF) 및 Aβ40/42 수준 모두의 증가를 나타낸다. Aβ 플라크 없이 세포내 APP/Aβ 수준의 증가는 IDUA(MPS-I), SGSH(산필리포 A), GBA(고셔병) 및 TPP1(후기 영아 배튼병) 유전자가 결손된 마우스에서 보고되었다. IDUA(MPS-I), SGSH(산필리포병 A형) 유전자가 결손된 마우스에서는 검출가능한 Aβ42 없이 대조군에 비해 Aβ40 수준의 3배 증가가 발견되었다. 이와 대조적으로, 세포내 APP/Aβ 수준의 현저한 감소는 ASAH1(파버병) 또는 PPT1(영아 배튼병) 유전자가 결손된 마우스에서 발견되었다. 이러한 연구는, 특히 Aβ 플라크가 없는 경우에도, APP 트래피킹 또는 프로세싱이 리소좀 유전자의 완전 기능상실을 갖는 인간 환자 및 마우스 모델 모두에서 영향을 받는다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, 인간 및 AD 트랜스제닉 마우스 모두에서 인지 저하는 Aβ 플라크 부하에 비례하지 않지만, 가용성 Aβ 종과 상관관계가 있다. 트랜스제닉 AD 마우스의 데이터는 뉴런내 Aβ가 세포외 Aβ보다 신경독성이 더 크다는 것을 나타낸다. 세포내 Aβ의 축적은 인간 및 마우스 AD 모델 모두에서 세포외 침착에 선행하는 것으로 나타났다. 따라서, 리소좀 유전자가 없는 인간 및 마우스 둘 모두의 짧은 수명은 연구자들이 Aβ40 또는 Aβ42의 비정상적인 생성 외에 Aβ 플라크를 발견하지 못하게 했을 가능성이 있다.

인간 ALP 유전자의 유전자 변이

인간 게놈에는 ALP와 관련된 최소 430개의 유전자가 있다(38개의 자가포식 유전자, 161개의 자가포식 조절 유전자, 64개의 리소좀 유전자 및 167개의 리소좀 조절 유전자). 모든 ALP 유전자의 38%(157개 유전자)에서 돌연변이는 인간 멘델병(OMIM)을 유발한다. 60,000명의 사람에 존재하는 돌연변이의 빈도와 유형에 대한 최근 분석에 따르면 대부분의 ALP 유전자가 "기능상실에 불내성인" 돌연변이이며 중립 진화 모델에서 예측한 것보다 잠재적으로 덜 유해한 변이체를 운반한다는 것을 발견했다. 이것은 넉아웃 마우스에서 대부분의 "코어" ALP 유전자의 배아발생 또는 신생아 기간 동안의 치사율 및 세포 유지와 생존에 대한 이들의 중요성과 일치한다. 가장 많이 연구되고 잘 알려진 ALP 유전자는 돌연변이되면 LSD를 유발하는 리소좀 유전자이다. 흥미롭게도, 이러한 LSD 유발 유전자의 대부분(약 50개)은 LoF 돌연변이에 불내성이 아니며 인간에서 상당한 유전자 암호 변이를 나타낸다. 따라서, 역학 연구에 따르면 건강한 사람의 리소좀 효소 활성 수준에는 10배 범위의 차이가 있는 것으로 밝혀졌다. GBA, NPC1, GALC, GAA, GLA 및 IDUA 유전자를 포함한 여러 리소좀 유전자에서 반수체기능부전을 유발하는 유전자 변이체를 보유한 개체는 대조군보다 상당히 낮은 수준의 효소 활성을 나타낸다. 또한, NPC1 유전자의 반수체기능부전은 인간 보인자에서 상당한 또 다른 대사 이상을 초래한다. ALP 유전자의 하나의 단일 정상 카피의 운반은 건강에 영향을 미치지 않는다고 오랫동안 추정되어 왔다. 그러나, 상당한 유전자 증거는 GBA 유전자의 기능 변이체가 파킨슨병 및 루이소체 질환의 발병에 주요 유전자 위험 인자로서 역할을 함을 뒷받침한다. 동형접합성 상태에서 소아에 LSD(고셔병)를 유발하는 동일한 변이체가 이형접합성 방식으로 존재할 경우, 성인 발병 신경퇴행성 질환의 위험에 영향을 미친다. 이러한 연구는 리소좀 유전자의 반수체기능부전이 성인 인간의 일반적인 신경퇴행성 질환의 소인임을 암시한다. AD의 위험에 영향을 미치는 ALP 유전자의 기능적 이형접합 변이체의 기여에 대한 체계적인 평가는 부족하다.

혁신

본 명세서에 기술된 연구는 AD와 관련된 ALP의 잘 알려진 기능장애와 관련이 있는 유전자 변이를 체계적이고 포괄적으로 평가하고(예를 들어, 섹션 (I) 참조), 뿐만 아니라 시험관내(예를 들어, 섹션 (II) 참조) 및 생체내(예를 들어, 섹션 (III) 참조)에서 AD와 관련된 ALP 유전자의 희귀 기능적 이형접합성 변이체의 효과를 이해하는데 있어서 개념적으로 혁신적이다. 또한, 이러한 연구는 ALP를 유전자적으로 변경한 결과 및 임상적으로 관련된 평가변수에서 아밀로이드 병리에 미치는 효과를 결정하기 위해 뉴런 병리를 신중하게 검사한다. 현재 AD에서 ALP 유전자의 유전자 변이에 대한 이해는 반복율이 매우 낮은 고립된 집단에서 거짓 연관성을 보고하는 제한된 연구에 의해 좌우된다. 본 명세서에 기술된 연구는 설계가 일반 집단을 나타내는 매우 큰 샘플에서 AD 발병 위험에 대한 ALP의 각 유전자의 유전자 변이의 기여도를 포괄적으로 평가하기 때문에, 그러한 제한을 극복할 수 있다. 따라서, WES 데이터의 공개적으로 이용가능한 2개의 대규모 데이터베이스인 ExAC(Exome Aggregation Consortium)(n = 약 61,000)와 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)(n = 약 10,000)의 데이터가 AD 사례(n = 약 4000) 및 대조군(n = 약 5000) 전체에 대한 사내 WES 및 엑솜 칩 데이터 외에도 사용된다. 이러한 다중 데이터세트를 사용하여, AD와 관련된 ALP의 잘 알려진 기능장애의 유전자 구조를 해결할 수 있는 분석 세트가 설계되었다. 여기에 설명된 연구는 시험관내 및 생체내 모두에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하기 위해 전산 방법과 실험 데이터를 결합시킨 혁신적인 통합 프레임워크를 포함한다. 세포 기반 검정은 생화학적 데이터, 생세포 검정, 마우스의 뇌 세포 유형 특이적 샘플의 RNAseq 데이터, 인간 AD 사례 및 대조군의 게놈 전체 유전자 발현 데이터, 다른 단계에서 인간 AD 사례의 게놈 전체 유전자 발현 데이터, 다른 연령에서 인간의 게놈 전체 유전자 발현 데이터, 및 Aβ 플라크와 상관관계가 있는 AD 마우스 모델의 게놈 전체 유전자 발현 데이터에 의해 보완된다. 따라서, 이러한 데이터 마이닝 노력의 결과로서 섹션 (II)에 기술된 실험은 1차 뉴런뿐만 아니라 미세아교 세포에서도 수행된다. 세포 유형 특이적 RNAseq 데이터는 대부분의 ALP 유전자가 뉴런보다 미세아교 세포에서 더 높은 수준의 발현을 나타낸다는 것을 보여준다. 본 명세서에 기술된 접근법은 AD에서 ALP 유전자의 역할에 대한 결정되지 않은 이전 연구를 극복한다. 섹션 (III)에 기술된 연구는 연령 및 취약한 뇌 영역에서 ALP 유전자의 반수체기능부전이 APP 프로세싱 및 트래피킹, Aβ 플라크 부담 및 Aβ40/42 수준에 영향을 미치는지의 여부에 대한 질문을 해결할 수 있다. 이러한 연구는 AD에 대한 결손 유전자의 효과의 해석을 복잡하게 하는 짧은 수명 및 급속한 신경퇴행을 나타내는 ALP 유전자의 넉아웃 마우스를 사용한 이전 연구의 한계를 극복할 수 있다. 이러한 연구는 신경유전학, 리소좀 생물학, LSD 동물 모델, 세포 및 마우스 모델의 AD 병리 전반에 걸쳐 전문 지식을 가진 조사자가 참여하는 공동 혁신에 의해 가능하다.

접근법

여기서, 최신 게놈 도구와 대규모 데이터세트는 ALP 기능의 AD 관련 저하에 기초가 되는 유전자 구조를 밝히는데 사용된다. 또한, APP 대사, Aβ 생성 및 Aβ 분해에 대한 선택된 변이체 및 유전자의 효과는 시험관내 및 생체내에서 검증될 수 있다.

데이터 및 결과

리소좀 유전자의 이형접합 변이체는 알츠하이머 발병 위험에 영향을 미침.

공개 데이터베이스 및 문헌에 있는 기존 주석을 마이닝하여 각색한 자가포식-리소좀 유전자 세트(약 430개 유전자) 목록은 이전에 수작업으로 편집하였다. AD 코호트의 모든 ALP 유전자가 분석될 수 있다. 그러나, 전체 기능상실(LoF) 돌연변이가 LSD를 유발하는 리소좀 유전자는 인간 및 마우스 모델에서 신경퇴행을 초래하는 ALP 기능장애에 대해 가장 잘 연구된 모델이다. 또한, 고립된(지리학적 및 유전자적으로) 집단에서 단일 리소좀 유전자에 대한 작은 샘플 크기 연구는 AD 위험에 대한 리소좀 유전자에서 유전자 변이체의 역할을 뒷받침한다. 그러나, 이러한 연구는 반복되지 않았다. 따라서, AD에 대한 ALP 유전자의 유전자 기여 분석은 유럽 혈통인 집단을 잘 대표하는 대규모 데이터세트를 사용하여 46개의 리소좀 유전자에 초점을 맞춤으로써 시작되었다. 현재 이용가능한 생물정보학 도구 종합시험의 단점은 알려지지 않은 기능의 암호 변이체가 기능적(생물학적) 결과를 갖는지를 예측하는 완벽한 알고리즘이 없다는 것이다. 따라서, 잠재적 기능 변이체의 포함 및 제외 기준은 기능이 알려지지 않은 암호 변이체와 동형접합성이거나 또는 복합 이형접합성인 경우 LSD를 유발하는 공지된 완전한 또는 거의 완전한 LoF 변이체 간의 공통 특징을 기반으로 하여 정의되었다.

발견 샘플은 523개의 관련 없는 AD 사례와 386개의 대조군에서 얻은 WES 데이터로 구성되었다. 표 5는 AD와 관련이 있는 상위 리소좀 유전자를 보여준다. 예상한 바와 같이, ExAC 데이터세트(유럽인, 비핀란드 혈통)의 유전자 특이적 누적 대립유전자 빈도(cMAF)는 사내 AD 데이터베이스(유럽 혈통)의 cMAF와 매우 일치했다(r²=0.97). AD 코호트에서 포함 기준을 충족하는 각 리소좀 유전자의 암호 변이체는 유전자별로 대조되었다. 82%는 미스센스 변이체이고 15%는 대체 스플라이싱에 영향을 미치며 3%는 넌센스 돌연변이이다. 희귀 단백질 변경 변이체(cMAF)의 부담을 대조군 및 ExAC에서 관찰된 부담과 비교했다. 대부분의 유전자에서, 대조군에 비해 사례에서 과도한 변이가 있었지만, SGSH 유전자(p= 4.2×10^-3; OR = 3.7, 95% CI 1.4-9.6) 및 CLN8 유전자(p = 1.0×10^-2; OR = 8.9, 95% CI 1.1-68.1)에서 명목상의 연관성만이 발견되었다(예를 들어, 표 5 참조).

ExAc 샘플의 cMAF와 비교했을 때, 14개의 유전자가 매우 엄격한 다중 시험 보정 임계값 p<1.0×10^-4(0.05/450)를 통과했으며, 13개의 LSD 유발 유전자가 유전자-수준의 유의적인 임계값 p<2.4×10^-6(0.05/20,000)을 통과했다(예를 들어, 표 5 참조). 다음으로, ADSP 코호트를 사용하여 5045명의 AD 사례 및 4500명의 대조군을 포함하는 표 5에 나열된 결과를 반복했다(예를 들어, 표 7 참조).

9개의 유전자는 이 독립적인 샘플에서 AD와의 연관성을 반복했다(예를 들어, 표 7 참조). 주목할 점은 반복 샘플에서 발견된 연관성이 동일한 방향이고 효과 크기가 동일하다는 사실이다.

연령 및 AD 상태와 NPC1 전사체 수준

위에서 정의한 기준에 따라, 2개의 샘플에서 반복된 3개의 리소좀 유전자를 기능 분석을 위해 선택했다: 세포내 콜레스테롤 수송체 1(NPC1)을 암호화하는 유전자, N-아세틸-알파-글루코사미니다제(NAGLU)를 암호화하는 유전자, 및 시스테인 스트링 단백질 알파(CSPα)를 암호화하는 DNAJC5 유전자. NPC1은 저밀도 지단백질을 후기 엔도솜/리소좀 구획으로 수송하고, 여기서 가수분해하여 유리 콜레스테롤로서 방출시킨다. 이 유전자의 LoF는 니만 픽 C형 질환을 유발한다. NPC1 전사체는 뉴런보다 미세아교세포와 성상세포에서 더 높은 수준의 발현(~4.5배)을 나타낸다. 신경병리학적으로 정상인 인간 뇌 샘플에서, NPC1 전사체 수준은 나이가 들수록 매우 유의적으로 증가하였다(p<0.0001)(예를 들어, 도 10a 참조). NPC1 전사체 수준은 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 사례에서 유의적으로 더 높았다(p=0.01, 예를 들어, 도 10b 참조).

연령, AD 상태 및 AD 마우스 모델에 따른 NAGLU 전사체 수준

NAGLU는 헤파란 설페이트를 분해하고 이 유전자의 총 LoF는 산필리포 증후군 B로도 알려진 점액다당류증 IIIB형(MPS-IIIB)을 유발한다. 마우스의 뇌 세포 유형에서 얻은 RNAseq 데이터는 NAGLU 전사체가 뉴런에서보다 미세아교세포에서 더 높은 수준(약 20배)의 발현을 나타낸다는 것을 보여준다. 신경병리학적으로 정상인 인간 뇌 샘플에서, NAGLU 전사체 수준은 나이가 들수록 유의적으로 증가하였다(p=0.02)(예를 들어, 도 1a 참조). NAGLU 전사체 수준은 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 사례에서 상당히 더 높았다(p=0.007, 예를 들어, 도 1b 참조). NAGLU 전사체 수준은 또한 야생형 마우스(검은 선, 예를 들어, 도 1c 참조)에서의 수준과 비교하여 AD 마우스 모델(APP, p.K670N/p.M671L/PSEN1,pM146V; 반접합성[HET] 또는 동형접합성[HO]; 예를 들어, 도 1c 참조)의 피질에서 AD 병리(오른쪽 그래프, 예를 들어, 도 1c 참조)의 발달에 따라 비례하는 연령 의존적 증가를 나타냈다.

연령, AD 상태 및 AD 마우스 모델에 따른 DNAJC5 전사체 수준

CSPα는 시냅스에서 세포외유출 및 단백질항상성 유지에 관여하는 시냅스 샤페론이다. CSPα의 이형접합성 돌연변이는 상염색체 우성 성인 발병 뉴런 세로이드 지질갈색소증(ANCL)을 유발한다. DNAJC5 전사체는 AD 병리에 가장 민감한 뇌 영역 및 뉴런에서 고도로 발현된다. 연령에 따른 DNAJC5 전사체 수준의 감소는 신경병리학적으로 정상인 뇌 샘플에서 전두엽 피질 영역으로부터 발견되었다(예를 들어, 도 8a 참조). DNAJC5 전사체 수준은 AD의 레이저 포획 미세절제된 엉킴이 없는 뉴런 및 대조군(p=<0.0001, 예를 들어, 도 8b, 왼쪽 그래프 참조)에서 연령 일치 대조군과 비교 시, AD 사례에서 상당히 더 낮았다(GEO 데이터베이스; 시리즈 GSE5281). 이 결과는 다른 연구(GEO 데이터베이스; 시리즈 GSE15222)에서 반복되었다(예를 들어, 도 8b, 오른쪽 그래프 참조). 또한, DNAJC5 전사체 수준은 연령 의존적 감소를 나타냈고, 야생형 마우스에서의 수준(예를 들어, 도 8 참조)과 비교하여 AD 마우스 모델(APP, p.K670N/p.M671L; 도 8)의 피질에서 AD 병리의 발달에 반비례했다(예를 들어, 도 8 참조), 이러한 모든 결과는 NPC1, NAGLU 및 CSPα가 AD 발병에 관여함을 암시한다.

내인성 CSPα는 리소좀에 국재화하고 돌연변이된 CSPα는 자가포식 단백질 수준(LC3-II 및 p62)에 영향을 미침

내인성 CSPα는 1차 피질 뉴런 및 뉴런-유사 세포 유형(N2A) 모두에서 체세포, 신경돌기 및 시냅스 부톤(bouton)에서 리소좀 마커와 함께 공동국재화했다(예를 들어, 도 12a 참조). 아세포 분획화는 유의적인 비율의 CSPα가 또 다른 리소좀 마커(LAMP1)와 함께 공동침전한다는 것을 보여주었다(예를 들어, 도 12b 참조). 이러한 결과는 내인성 CSPα가 리소좀 관련 단백질임을 시사한다. ANCL 유발 돌연변이(p.L115R)의 발현은 고분자량 CSPα 응집체를 초래했고, 리소좀 단백질 LAMP1 및 SNAP23의 수준을 증가시켰다. p62의 감소 및 LC3-I에서 LC3-II로의 지속적인 전환이 있었으며, 이는 자가포식의 활성화 및 자가포식소체와 리소좀의 융합 차단을 시사한다(예를 들어, 도 12c 참조). 이 ANCL 유발 돌연변이는 빈 벡터에 비해 LysoTracker 신호 수준을 상당히 증가시켰다. 대조적으로, CSPα-WT의 과발현은 LysoTracker 신호를 상당히 감소시켰다(예를 들어, 도 12d 참조).

CSPα는 생체내 APP 프로세싱에 영향을 미침

ANCL 환자의 뇌는 Aβ 플라크 또는 신경섬유 엉킴을 나타내지 않았다. 그러나, ANCL 환자의 피질 뉴런에서 APP/Aβ의 현저한 세포내 축적이 있었다(ANCL, 예를 들어, 도 13a 참조). ANCL, AD 및 건강한 대조군 샘플로부터의 뇌 샘플의 세제-가용성 및 불용성(구아니딘) 분획에 존재하는 Aβ의 정량화는 대조군 및 AD 샘플 둘 모두에 비해, ANCL 환자에서 Aβ40 및 Aβ42 수준의 상당한 감소를 나타내 보였다(예를 들어, 도 13b 참조). 이러한 결과는 CSPα가 Aβ 생성과 AD 발병에 역할을 한다는 것을 시사한다.

연구 설계 및 방법

(I) AD에서 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자 식별

ALP 유전자의 기능적 이형접합 변이체에 의해 유발된 반수체기능부전이 AD 발병 위험에 영향을 미친다는 가설을 시험할 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 대규모 데이터세트(사내 데이터베이스 및 공개적으로 이용가능한 것 모두)에서 ALP 유전자의 예측된 희귀 기능 변이체의 분석을 조합한 통합 접근법은 AD 위험에 관여하는 증거에 의해 ALP의 후보 유전자의 우선순위를 지정하는 데 사용된다.

섹션 (I)에 대한 방법론 및 분석: 희귀 변이에 대한 대립유전자 빈도 임계값 정의

초기 분석은 리소좀 유전자에 초점을 맞춘다. 동일한 방법론이 모든 ALP 유전자에 적용된다. 그러나, 나머지 ALP 유전자에서 LoF 돌연변이로 유발된 인간 질환이 없는 경우, 포함 기준은 리소좀 유전자에 대한 경험을 기반으로 조정된다. NCBI ClinVAr 데이터베이스에는 약 2740개의 LSD 유발 변이체가 보고되어 있다. 대부분의 AD 샘플은 유럽 혈통인 것이다. 따라서, 유사한 유전자 배경을 가진 집단에서 리소좀 유전자의 유전자 변이의 기준을 확립하기 위해 비핀란드계 샘플(약 33,000명의 개체)을 ExAc에서 선택했다. ExAc 샘플에서 이형접합성으로 주석이 달린 시험된 리소좀 유전자에서 288개의 LoF 변이체가 발견되었다: 76%는 미스센스 변이체이고, 10%는 대체 스플라이싱에 영향을 미치며, 12%는 넌센스 돌연변이이다. 대부분의 LoF 변이체는 SIFT에 의해 유해성(87%), polyphen2에 의해 손상성(84%)인 것으로 예측된다. 대부분(73%)의 LoF 변이체는 고도로 보존된 뉴클레오타이드에 위치한다(GREP 점수>4). ExAc에서 보고된 여러 LoF 변이체는 NCBI ClinVAr 데이터베이스에서 LSD 유발 변이체로 분류되지 않은 것이다. 이형접합성 LoF 변이체는 각각 시험된 리소좀 유전자에서 발견되었지만, 이형접합성 LoF 변이체의 수는 HYAL1 유전자에서 발견된 1개에서부터 ARSA 유전자에서 발견된 20개까지 다양하다. 유전자당 이러한 이형접합성 LoF 변이체의 cMAF는 CSTD 유전자의 경우 1.5-05에서부터 NPC2 유전자의 경우 0.003까지의 범위이다. 따라서, 1×10^-3의 cMAF 임계값을 보존적 상한으로서 적용했다. LoF 변이체의 가장 높은 MAF, SIFT, Polyphen2 또는 GERP 점수를 포함한 LoF 변이체의 분석에서 얻은 정보를 사용하여 다음 포함 기준을 정의했다: 1) AD 사례에서 호출률>98%, 2) 변이체당 Maf<0.01%, 3) ExAc 또는 Ensemble에 의해 미스센스로서 주석이 달린 지정된 표준 전사체의 유일하게 가능성이 있는 단백질 변경 변이체, 4) 프레임이동, 5) 넌센스, 6) 스플라이스 공여자 및 수용자 영역에 영향을 미치는 변이체, 7) NCBI ClinVar 데이터베이스에서 병원성의 증거가 있고 3' 또는 5' UTR 영역에 있는 경우. ExAC에서 찾지 못한 변이체, 또는 NCBI ClinVar 데이터베이스에 존재하지 않거나, 또는 ExAC 및 ClinVar에서 잘못호출한 Maf>0.01%인 동일한 인트론성, 3' 또는 5' URT 변이체는 제외되었다. 집단별 변이체가 이 분석에 교란 효과가 없도록 하기 위해 주요 성분의 결과를 기반으로 하여 개체를 선택했다.

표 8은 유전자 분석을 수행하기 위해 이용가능한 샘플의 요약을 보여준다.

Knight ADRC(Knight Alzheimer's Disease Research Center), ADNI(Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative), NIA-LOAD 연구, 스페인사람 데이터세트 및 ADSP(Alzheimer's Disease Sequenching Project)에서 17,000명 초과의 개체에 대한 표현형 데이터, DNA 및/또는 유전자 데이터에 접근된다. 또한, ADSP의 10,000개 샘플이 현재 시퀀싱되고 있다(WGS). 사내 데이터베이스의 모든 ALP 유전자는 분석될 수 있다. 이러한 데이터세트에 대한 설명은 이전에 공개되었다. 각각의 사례는 유력 AD에 대한 NINCDS-ADRDA(National Institute of Neurological and Communication Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related Disorders Association)와 동등한 기준을 사용하여 알츠하이머 유형의 치매 진단을 받았다. 대조군은 사례와 동일한 평가를 받았지만 인지적으로 정상이었다. 모든 개체는 유럽 혈통이었고 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었다.

알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)

AD 사례 및 대조군의 WES 데이터는 ALP 유전자에 대해 본 명세서에 기재된 모든 유전자 분석을 수행하는 데 사용된다. 데이터는 2015년 12월 ADSP에서 다운로드되었다. 발견 단계 데이터세트는 113개 가족으로부터 584명 대상체에 대한 WGS 데이터와 4000명 초과의 대상체에 대한 혈통 데이터; 5096건의 사례와 4965건의 대조군에 대한 WES 데이터, 및 AD에 다중 영향을 받는 가족으로부터 추가 853명(682건 사례[510건 비-히스패닉계, 172건 히스패닉]) 및 171명의 히스패닉 대조군 대상의 전체 엑솜 서열 데이터를 함유한다. ADSP 반복 단계는 이미 진행 중이며 추가 10,000명의 개체에 대한 WGS 데이터를 포함한다.

공개적으로 이용가능한 WES 데이터

ExAc에 포함된 비핀란드계 유럽인 샘플의 대립유전자 빈도는 모든 ALP 유전자 분석을 위한 대립유전자 빈도 기준으로서 사용한다. 데이터는 ExAC(버전 0.3.1, 2015년 3월)에서 다운로드되었다. 30배 초과의 중앙 서열 깊이에 커버되는 암호 영역의 높은 비율 및 오로지 고품질(PASS 필터) 변이체를 갖는 ALP 유전자의 데이터만을 이 분석에 포함시켰다.

전체 엑솜 시퀀싱 데이터 수집에 대한 기술 참고사항

2,000명 개체의 WES가 있다. 엑솜 농축은 SureSelect 52Mb Target Enrichment System(Agilent)을 사용하여 수행한다. DNA는 페어드 엔드 리드(paired-end read)(Illumina HiSeq2000)에 의해 시퀀싱했다. 정렬 및 변이체 호출은 Novoalign 및 SAM 도구를 사용하여 수행한다. 데이터가 처리되고 엑솜 시퀀싱에 의해 검출된 서열 변이체가 유전형에 의해 확인되면, 다른 엑솜 시퀀싱 프로젝트에 개발되어 사용되는 데이터 관리, 품질 관리, 클리닝, 주석 및 분석에 대한 효율적이고 효과적인 방법을 적용한다.

통계 시험

중간 정도의 효과 크기를 갖는 희귀 변이체의 효과를 수용하기 위해, 희귀 변이체와의 연관성을 분석하도록 개발된 검증된 통계 방법을 사용한다. 간단히 말하면, 유전자 기반 방법은 영역 내의 희귀 변이체를 단일 값으로 축소한 다음, 영역 내의 희귀 변이체와 관심 형질 간의 연관성을 시험한다. 서열 커널 연관 시험(SKAT)은 유전자 영역 내의 희귀 변이체와 상태 간에 연관성을 시험하는데 사용된다. SKAT는 동일한 유전자 내에서 서로 다른 방향으로 영향을 갖는 변이체를 설명할 수 있고 집단 마커를 포함한 교란성 공변량에 대해 조정할 수 있다. 그 다음, 독립적인 사례 대조 샘플을 사용하여 발견 데이터세트의 결과를 반복한다. 각각 다른 데이터세트에 대한 분석은 별도로 수행한다. p-값과 OR을 조합하기 위해 공동 분석을 수행한다. 이 방법은 AD에 대한 새로운 유전자를 식별하기 위해 이전 연구에서 성공적으로 사용되었다.

집단 구조

이 분석은 분석에 포함된 사내 샘플의 유럽 혈통을 정의한다. 자체 보고된 인종/민족성을 확인하기 위해 앵커로서 HapMap 샘플과 함께 샘플에 Eigenstrat가 사용된다.

생물정보학 분석

보완 분석을 위해 공개적으로 이용가능한 다음 데이터베이스가 사용된다: OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man); ExAC; GWAS 카탈로그; ClinVar 데이터베이스; 인간 자가포식 데이터베이스.

검정력 분석

AD와 관련된 유전자 변이체를 감지하는 검정력을 결정하기 위해 SAS에서 Proc Power를 사용하여 분석을 실행했다. 분석은 0.01 내지 0.50 범위의 소수 대립유전자 빈도, OR 1.2 내지 3.6, 및 4,000 내지 7,000 사이의 샘플 크기를 사용하여 진행했다. 알파는 단일 변이체 분석의 경우 5x10^-8, 유전자 기반 분석의 경우 5x10^-6으로 조정되었다. OR>1.19(또는 <0.84)의 경우, 효과를 감지하는 검정력은 약 80%이다.

예상 결과

ALP 유전자와 AD 위험의 새로운 연관성이 본 명세서에 기술된 연구에 의해 밝혀질 것으로 예상된다. 본 연구는 AD 위험과 관련된 ALP의 신규 유전자가 식별될 수 있고(예를 들어, 표 5 참조), 이들이 적절한 적용범위의 깊이를 가진 독립적인 샘플에서 반복될 수 있음을 입증했다(예를 들어, 표 7 참조). 관련된 인간 질환의 부재 외에도, 대규모 데이터세트(ExAC)의 대부분의 "코어" ALP 유전자에서 발견되는 최소한의 유전자 변이와 일치하는 것으로서, AD 환자의 "코어" ALP 유전자에서 기능적 변이체의 풍부함은 예상되지 않는다.

대안적 접근법

결과 및 검정력 계산은 유전자 기반 분석에서 2.7 초과의 평균 승산비를 감지하기에 충분한 검정력이 있음을 시사한다. ALP 유전자의 연관성이 사례 대조 설계에 의해 반복되지 못한다면, 내적표현형 설계를 사용할 수 있다. 따라서, AD의 CSF 생물마커 수준에 대한 ALP 유전자의 변이체의 영향은 ALP 유전자 및 다음 CSF 생물마커: t-타우, p-타우 및 Aβ42 각각에 대한 단일 변이체 및 유전자 기반 분석을 수행하여 결정할 수 있다. ALP 유전자의 조절 게놈 영역이 AD 발병 위험에 관여할 수 있는지 평가하기 위해, 총 25,580건의 AD 사례와 48,466건의 대조군으로 이루어진 I-GAP(International Genomics of Alzheimer's Project)에 의해 이전에 공개된 GWAS 데이터에서 ALP 유전자의 연관성을 분석할 수 있다. 보완 접근법은 ALP 유전자가 발병 연령(AAO)에 영향을 미치는지 점검하기 위해 이루어질 수 있다.

나머지 약 384개 ALP 유전자의 유전자 변이체 및 이의 AD 위험과의 잠재적 연관성에 대한 분석이 완료되었다. 샘플 크기는 추가 10,000명의 개체(AD 사례 및 대조군 모두)에 대한 WGS 데이터를 포함하는 ADSP 반복 단계를 사용하여 증가시킬 수 있다. 게놈 집계 데이터베이스(gnomAD)의 조직자와 적절한 협력이 수립된다. gnomAD는 123,136명의 개체로부터의 엑솜 서열 데이터와 더 큰 데이터세트의 결과를 반복하기 위한 15,496명의 개체로부터의 전체 게놈 시퀀싱을 함유하는 ExAc의 확장판이다. ADSP 데이터는 gnomAD에 포함되어 있고, 이는 현재 분석에 공개 버전의 gnomAD의 사용을 배제한다.

(II) (a) 시험관내에서 APP 대사, Aβ 생성 및 Aβ 분해에 미치는 ALP의 선택된 후보 유전자의 기능적 효과 결정

섹션 (I)에서 식별된 AD와 관련된 각 ALP 유전자의 모든 변이체를 평가하는 것은 본 명세서에 기술된 연구의 범위를 벗어나는 것이다. 따라서, NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자에 있어서 섹션 (I)에서 식별된 상위 3 내지 5개의 변이체가 우선된다. 상위 변이체는 AD 환자의 빈도, 그 단백질에 대한 SIFT 및 Polyphen2에 의한 예측 효과, 및 GERP 보존 점수를 기반으로 하여 정의된다. 이러한 유전자는 발견 및 반복 샘플 모두에서 얻은 데이터의 강도를 기반으로 하여 선택된다. AD 위험과 관련된 새로운 ALP 유전자는 시험관내에서 APP 대사, Aβ 생성 및 Aβ 분해에 영향을 미치는 것으로 가정된다.

단백질 산물에 대한 효과 평가

LoF 변이체의 많은 가상환경에서의(in silico) 특징을 공유하는 변이체가 선택되었다. 본 명세서에 개략된 실험은 각각의 단백질에 대한 기능적 영향을 검증하기 위해 실험 데이터를 만들 수 있다. 선택된 변이체는 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 cDNA의 부위 지시성 돌연변이유발을 사용하여 조작한다. 야생형 및 돌연변이 cDNA는 이전에 설명한 바와 같이 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝한다. 렌티바이러스 벡터는 재조합 또는 합성 핵산 분자를 수반하는 연구에 대한 NIH 가이드라인의 섹션 III-E-1에 따라 BSL2 시설에서 생산, 처리 및 폐기한다. 1차 뉴런 배양물은 이전에 설명한 바와 같이 수행한다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자는 결손 마우스의 1차 뉴런에서 발현되고 단백질 안정성에 대한 영향은 웨스턴 블롯으로 정량한다. 돌연변이 단백질의 아세포 국재화는 리소좀(LAMP-1 또는 -2), 초기 엔도솜(EEA1), 후기 엔도솜(Rab7), ER(KDel) 및 골지체(Giantin) 마커 내에 선택된 단백질을 공동국재화시키기 위해 면역형광의 공초점 이미지로 평가한다. NAGLU 변이체의 효소 활성에 대한 효과는 이전에 설명한 바와 같이 형광 검정을 사용하여 시험한다. NPC1에 대한 선택된 변이체의 효과는 이전에 공개된 바와 같이 수행한다. DNAJC5에 대한 선택된 변이체의 기능적 효과는 SNAP-25의 분해를 방지하는 능력에 의해 시험된다.

APP 트래피킹, 세포내이입 및 아세포 국재화에 대한 효과 평가

여러 연구에서 APP의 세포내이입은 APP 아밀로이드생성 경로에서 엔도솜 및 다소포체 내의 β- 및 γ-세크레타제와의 공동국재화에 필수적임을 입증했다. 리소좀 기능장애에 이차적인 엔도솜 흐름의 손상은 이 소기관 내에서의 통과 시간을 증가시키며, 이는 β 및 γ 절단 경향을 증가시키고, 따라서 Aβ 생성을 증가시킨다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자에서 선택된 변이체가 APP의 정상 상태 수준, APP 세포내이입, 또는 분해를 위해 리소좀 내로 APP의 향상된 흐름에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, 세포내 APP 출현의 동역학 및 세포 표면의 APP 수준을 이전에 공개된 바와 같은 세포 표면 비오틴화 검정을 사용하여 결정할 수 있다. 전체 길이 APP 반감기에 대한 효과는 단백질 합성 저해제 사이클로헥시미드로 처리 하에 0, 5, 10, 30분에 웨스턴 블롯에 의해 측정된다. APP 및 SorL1 아세포 국재화에 대한 효과를 연구하기 위해 면역조직화학 공동국재화 현미경 기술을 수행한다. α-세크레타제(ADAM10 및 ADAM17), β-세크레타제 1(BACE1) 및 γ-세크레타제 복합체(PSEN1 및 Nicastrin)를 포함한 APP 프로세싱 기구의 단백질 및 전사체 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 RT-qPCR에 의해 측정한다.

Aβ 생성에 대한 효과 평가

APP의 상당 비율은 리소좀을 표적으로 하고 APP 수준은 리소좀 산성화 저해제의 존재 하에 세포에 빠르게 축적되며, 이는 리소좀 분해가 Aβ 펩타이드의 형성을 방해하기 위해 APP 단백질분해를 유도한다는 것을 시사한다. 또한, 인간 산필리포병 환자(NAGLU 결손)는 정상 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ 수준의 상당한 증가를 나타낸다. Aβ40 및 Aβ42의 증가된 CSF 수준 및 β-절단된 가용성 APP 수준의 무변화는 NPC 환자(NPC1 결손)의 뇌에서 보고되었다. DNAJC5에 돌연변이가 있는 인간 환자는 대조군에 비해 Aβ40 및 Aβ42 수준의 상당한 감소를 나타낸다. 따라서, 선택된 변이체가 세포 배양물에서 Aβ 생성에 영향을 미치는지의 여부를 평가할 수 있다. 세포 용해물 및 세포 배지의 Aβ 종은 이전에 공개된 샌드위치 ELISA에 의해 검출된다. 간략하게 설명하면, Aβx-40 및 Aβx-42 펩타이드는 마우스 단클론 코팅 항체 HJ2(항-Aβ35-40) 및 HJ7.4(항-Aβ37-42)에 의해 포획된다. 중심 도메인을 표적으로 하는 비오틴화 항체인 HJ5.1(항-Aβ13-28) 또는 N-말단 아미노산을 표적으로 하는 HJ3.5(항-Aβ1-13)를 검출 항체로서 사용하고, 이어서 스트렙타비딘-폴리-HRP-40(Fitzgerald Industries)을 사용한다. APP 유래 단백질분해 단편, 예컨대, α- 및 β-CTF, sAPPα 및 sAPPβ는 웨스턴 블롯으로 측정한다. 전체 길이 APP의 수준도 웨스턴 블롯으로 모니터링한다.

Aβ 분해에 대한 효과 평가

미세아교세포는 아밀로이드 플라크 주위에서 증식하고 아밀로이드 물질을 포식작용하지만, 후속 분해가 손상되어 AD에서 진행성 아밀로이드 축적에 기여한다. 미세아교세포가 원섬유 Aβ를 흡수할 수 있지만, 분해할 수 없는 이유는 명확하지 않다. 그러나, AD 환자의 미세아교세포는 beclin-1의 감소 및 후속적인 ALP 기능장애를 나타낸다. 또한, 불용성 원섬유 Aβ는 염화물 채널 CIC-7을 1차 미세아교세포의 리소좀으로 트래피킹하는 데 영향을 미치며, 이는 리소좀 분해를 손상시킨다. 그러나, 리소좀 산성화를 복원시키면 Aβ 분해가 향상된다. 종합하면, 이 증거는 미세아교세포에서 ALP 부족이 AD 발병에 기여할 수 있음을 시사한다. 여기에 제시된 데이터 마이닝 노력은 NAGLU 및 NPC1 유전자가 뉴런보다 미세아교세포에서 더 높은 수준의 발현을 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 선택된 변이체로 형질도입된 NAGLU 및 NPC1 결손성 및 반접합성 마우스로부터의 1차 미세아교 세포가 외인성 Aβ를 흡수하고 분해할 수 있는지 여부를 평가할 수 있다. Aβ 흡수 및 Aβ 분해는 이전에 공개된 대로 수행한다.

ALP 기능에 대한 효과 평가

반접합성 마우스의 뉴런이 ALP 기능장애를 나타내는지 여부와 이러한 변화가 선택된 변이체에 의해 증가되는지 여부를 시험할 수 있다. LC3 및 p62의 웨스턴 블롯은 거대자가포식 활성화의 간접 지표인자로서 사용된다. 자가포식 흐름은 자가포식 시스템의 활성제(라파마이신 및 토린1), 자가포식 저해제(바필로마이신 A1), 리소좀향성 작용제(클로로퀸, 염화암모늄), 및 E64/류펩틴의 부재 또는 존재하에 세포에 존재하는 LC3-II의 양에 의해 평가된다. 이것은 mCherry-GFP-LC3 마커를 사용한 생세포 이미지화에 의해 보완된다. 자가포식소체-리소좀 융합은 LC3 및 LAMP1의 공동국재화에 의해 추가로 평가된다. Lysotracker는 세포당 산성 구획의 수를 정량화하는 데 사용된다.

생물정보학 분석

보완 분석을 위해 공개적으로 이용가능한 다음 데이터베이스가 사용된다: Gene Expression Omnibus; Brain RNA-seq2; 마우스 치매 네트워크(Mouse DemNet)로부터의 유전자 발현 데이터; Polyphen2; SIFT; Mouse Genome Informatics.

예상 결과

섹션 (I)에서 식별된 ALP 유전자 위험 변이체는 부분 기능상실을 유발하고 ALP 기능을 변경할 것으로 예상된다. 이 단백질의 기능에서 5-20%의 잔류 활성이 검출될 것으로 예상된다. 또한, 선택된 유전자의 과발현 또는 하향 조절이 APP 트래피킹, APP 대사, Aβ 생성 또는 Aβ 분해에 영향을 미칠 것으로도 예상된다. 또한, 본 명세서에 기재된 실험은 또한 뉴런 및 미세아교세포 생존에 대한 ALP 유전자의 선택된 변이체의 효과를 평가할 수 있게 할 것으로 예상된다.

NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 발생에서 WT와 위험 변이체 간의 강력한 차이가 관찰되지 않는다면, 이것은 기능의 미묘한 변화를 은폐하는 과발현 때문일 수 있다. 일생 동안 질병에 나타날 수 있는 작은 변화를 일으키는 AD 위험 변이체를 세포 배양물 시기에 효과를 확인하는 것은 어려울 수 있다. 대안적으로, 5XFAD 트랜스제닉 마우스 또는 N2A695 세포로부터의 1차 뉴런을 사용하여 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 선택된 변이체로 형질도입시킬 수 있으며, Aβ 생성에 대한 효과를 시험할 수 있다.

시험관내에서 AD의 위험 및 발병에 영향을 미치는 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 변이체를 식별한 후 다음 단계는 인간의 섬유아세포에서 직접 iPSc의 생성 및 게놈 편집 방법의 진행을 이용하는 것이다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 변이체를 운반하는 AD 환자의 iPSc 유래 뉴런 또는 신경교 세포는 동종 CRISPr 보정된 세포와 비교하여 APP 대사에 대한 그러한 변이체의 효과를 비교하는데 사용될 수 있다. 이러한 도구가 준비되면, 효소 대체(NAGLU), 사이클로덱스트린(NPC1) 또는 ALP의 약리학적 조절과 같은 치료 전략이 활용될 수 있고 Aβ 생성 또는 Aβ 분해에 대한 효과가 시험관내에서 시험될 수 있다.

(II)(b) 나이 든 마우스에서 AD 병리의 발달에 대한 선택된 후보 ALP 유전자의 반수체기능부전의 기능적 효과 결정

마우스와 인간에서 NAGLU 및 NPC1 유전자의 완전한 기능상실의 신경퇴행성 결과는 특성화되었지만, 이러한 유전자의 단일 카피의 장기적인 결과에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 반접합성 마우스와 인간은 정상이라고 항상 가정되어 왔다. 그러나, 최근 NPC1 유전자의 반수체기능부전은 인간 및 마우스에서 상당한 대사 이상을 초래한다는 것이 입증되었다. AD 병리는 더 경미한 형태의 유전성 ALP 기능장애로부터 발생하며 이들의 출현은 추가적인 연령 관련 ALP 손상을 필요로 할 수 있는 것으로 가정한다. 1차 평가변수는 생후 4개월(플라크 침착 전)에 측정된 가용성 Aβ 수준 및 마우스에 FAD 유발 돌연변이가 있는 8개월령에 플라크 부하이다. 가용성 Aβ 수준에 대한 효과는 24개월된 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 반접합성 마우스의 주요 평가변수이다. 반접합성 마우스는 상업적으로 이용가능한 결손 마우스로부터 생성된다.

AD 병리의 마우스 모델에 대한 효과

산필리포병이 있는 인간 환자에서 NAGLU 단백질의 완전 기능상실은 정상 대조군 뇌에 비해 가용성 Aβ 수준의 현저한 3배 증가를 초래한다. NPC1 기능이 완전히 상실된 환자에서는 Aβ40 및 Aβ42의 CSF 수준 증가 및 β-절단된 가용성 APP 수준의 무변화가 보고되었다. NAGLU 전사체 수준은 AD 마우스 모델의 피질에서 AD 병리의 발달과 함께 비례하는 연령-의존적 증가를 나타냈다(예를 들어, 도 1c 참조). DNAJC5 전사체 수준은 연령 의존적 감소를 나타내었고 AD 마우스 모델의 피질에서 AD 병리의 발달에 반비례했다(예를 들어, 도 8a 참조). DNAJC5에 이형접합 돌연변이를 갖는 인간 환자는 대조군과 비교하여 Aβ40 및 Aβ42 수준의 상당한 감소를 나타내었다(예를 들어, 도 13 참조). AD 트랜스제닉 마우스에서와 같이, 인간의 인지 저하는 Aβ 플라크 부하에 비례하지 않지만, 가용성 Aβ 종과 상관관계가 있다. 세포내 Aβ 생성에 이러한 유전자들의 역할을 뒷받침하는 인간 LSD 환자 및 LoF 마우스 모델로부터의 데이터를 감안하여, 경미한 리소좀 손상(NAGLU, NPC1 및 DNAJC5에서 반접합체)이 Aβ 생성에 유리한 FAD 돌연변이를 운반하는 AD의 잘 특성화된 마우스 모델에서 Aβ 생성을 가속화하는지 여부를 결정할 수 있다. 5XFAD 모델은 1.5개월에 뉴런내 Aβ42, 2개월에 플라크, 4개월에 시냅스 마커의 상실 및 기억 결손, 및 9개월에 뉴런 손실을 발생시키는 매우 공격적인 아밀로이드 침착 모델이다. 플라크의 발달은 반응성 신경교증을 동반한다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 반수체기능부전이 기존의 아밀로이드생성 과정을 악화시키는지 여부를 추가로 확인하기 위해, NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 마우스를 5XFAD 트랜스제닉 마우스와 교배한다. 이 실험을 위해 4개의 그룹(30마리의 마우스/그룹)을 만든다. 4개월 및 8개월에 APP 대사, Aβ 플라크 부하 및 Aβ40/Aβ42 수준에 대한 유전자 투여량의 효과는 5XFAD/NAGLU(+/-), 5XFAD/NPC-1(+/-) 및 5XFAD/DNAJC5(+/-) 마우스에서 결정한다. 4개월은 5XFAD 마우스에서 아밀로이드 플라크를 침착시키는 초기 시점이다. 8개월은 아밀로이드 플라크가 풍부한 연령을 나타낸다.

샘플 크기

샘플 크기 계산에 따르면, 동일한 수의 수컷과 암컷 마우스를 연구하면서 80% 검정력으로 플라크 부하(SD=30%, α=5%) 및 세제-용해성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42와 같은 평가변수의 20% 증가를 감지하는 데에는 그룹당 최소 n=15마리의 마우스가 필요하다는 것을 시사한다. 조직학적 및 생화학적 연구를 위한 뇌를 수집하기 위해, 5XFAD[5XFAD/NAGLU(-/+); 15의 5XFAD/NPC1(-/+) 및 5XFAD/DNAJC5(-/+)]와 교배된 각 유전자의 15마리(15)의 이형접합성 마우스 및 15마리의 추가 5XFAD 마우스를 4개월 및 8개월령에 마취하여 희생시킨다.

나이 든 마우스에 대한 리소좀 유전자의 반수체기능부전 효과

AD 병리(예를 들어, Aβ 플라크)는 전형적으로 연령-의존적이다. 그러나, 공개된 연구에서는 연령과 ALP 기능장애 간의 상호 작용을 해결하지 못했다. 생체내에서 AD 중 ALP의 역할을 평가하는 대부분의 연구는 약리학적 접근 또는 ALP 유전자의 완전한 부재 및 단기적인 평가변수를 사용했다. NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 내인성 수준의 감소를 위해 유전자적 접근법이 사용되며, Aβ를 포함하는 AD 관련 표현형에 있어서 유전된 만성 유전성 리소좀 손상의 효과에 대한 정량적인 병리학적 조사가 수행된다. 결과는 정상적인 인간 뇌 샘플에서 나이와 함께 NPC1 및 NAGLU 전사체 수준이 매우 현저히 증가하는 것을 보여주었다(예를 들어, 도 10a 및 도 1a 참조). 또한, NPC1 및 NAGLU 전사체 수준은 연령 일치 대조군에 비해 AD 사례에서 현저하게 더 높았다(예를 들어, 도 10b 및 도 1b 참조). 이러한 결과는 리소좀 유전자 NPC1 및 NAGLU로부터 응집 단백질에 대한 보상 반응이 정상적인 노화 과정의 일부임을 암시한다. AD 모델에서 발견된 비정상적 상승은 그들이 Aβ의 비정상적 수준을 제어하려고 시도하고 있음을 암시한다. 이와 대조적으로, 신경병리학적으로 정상인 뇌 샘플에서 나이가 들수록 DNAJC5 전사체 수준의 감소가 있었고(예를 들어, 도 8a 참조), DNAJC5 전사체 수준은 연령 일치 대조군에 비해 AD 사례에서 상당히 더 낮았다(예를 들어, 도 8b 참조). DNAJC5는 이의 돌연변이가 ALP 기능을 손상시키는 신경보호 시냅스 샤페론을 암호화한다(예를 들어, 도 13b 참조). 따라서, 해당 유전자의 반수체기능부전은 나이 든 마우스의 AD 관련 표현형을 악화시킬 수 있다.

샘플 크기

각 유전자의 반접합성 마우스[NAGLU(-/+); NPC1(-/+) 및 DNAJC5(-/+)] 십오(15)마리 및 야생형 마우스 15마리를 24개월령에 마취하고 희생시켜 조직학적 및 생화학적 연구를 위한 뇌를 수집한다.

아밀로이드 플라크 정량 및 Aβ 생성

마우스의 하위코호트(sub-cohort)에서 고정된 동결 뇌 절편(50㎛)을 X-34로 염색하고 HJ3.4(항-Aβ) 항체로 면역염색하여 플라크 부하(면적%로 표시됨)를 정량한다. 대측 반구로부터의 뇌 조직 균질액의 Aβ 수준은 가용성(PBS) 및 불용성(5M 구아니딘) 분획으로 분획화하고 ELISA를 사용하여 정량한다. 선택된 유전자의 반수체기능부전이 APP 프로세싱 기구에 영향을 미치는지의 여부를 평가한다.

시냅스 마커

시냅스 손실은 인간 및 AD 마우스 모델에서 일반적인 결과이다. 선택된 유전자의 단일 카피가 5XFAD 마우스에서 시냅스 손실을 가속화하는지 여부는 이전에 공개된 바와 같은 시냅스전 마커인 SNAP-25, 소포 관련 막 단백질 2, 신탁신(Syntaxin) 1 및 시냅토피신(Synaptophysin)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 평가한다.

ALP 기능장애

전술한 바와 같은 뇌 절편을 사용하여, 절편을 항-LAMP1, LC3 및 p62 항체로 면역염색한다.

신경돌기 이영양증 및 반응성 신경교증에 대한 효과

위의 코호트로부터의 고정된 동결 뇌 절편을 레티큘론-3(RTN-3) 항체(RTN-3은 이영양성 신경돌기에 선택적으로 축적됨)로 면역염색하여 이전에 공개된 바와 같이 이영양성 신경돌기를 정량한다. 이전 연구는 NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 결손 마우스가 증가된 성상교세포증을 나타낸다는 것을 입증했다. 따라서, 병렬 연구로 뇌 절편을 항-CD11b 및 항-GFAP 항체로 염색하여 반응성 신경교증에 대한 선택된 유전자의 하나의 단일 카피의 영향을 조사한다.

예상 결과

NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 반접합성 마우스는 5XFAD 마우스에서 Aβ 플라크 부담의 가속화하고 악화시킬 것으로 예상된다. 선택된 유전자의 반수체기능부전은 Aβ 플라크의 생성 없이 시냅스 손실 및 반응성 신경교증을 증가시키는 나이 든 마우스에서 APP 대사 및 Aβ 생성에 영향을 미칠 것으로 예상된다.

반접합성 마우스의 뇌에서 APP 대사 및 Aβ 생성의 변화가 발견되지 않는다면, 섹션 (II)에 설명된 실험에서 검증된 가장 유의미한 변이체를 운반하는 AAV2/9 벡터를 만들어 반접합성 신생 마우스의 해마에 정위적으로 주사하고, AD 병리의 존재를 평가한다. 대안적으로, NAGLU, NPC1 및 DNAJC5 유전자의 전사체는 이에 대한 검증된 shRNA/RNAi를 운반하는 AAV2/9 벡터를 주사하여 신생 5XFAD 트랜스제닉 마우스에서 녹다운시킨다. CRISPr 기술은 시험관내 검정에 가장 강력한 영향을 미치는 것으로 선택된 유전자의 변이체의 넉인(knock-in) 마우스를 만드는 데 사용될 수 있다.

여기에 기술된 연구의 결과와 NAGLU 활성에 대한 형광 검정 및 NPC1 생물마커에 대한 질량 분석 검정의 이용가능성을 조합하면, AD 사례 및 대조군의 대규모 코호트의 CSF, 혈장, 혈청 또는 건혈 반점을 선별하여 AD 생물마커로서 사용될 수 있는 특정 결함을 검출할 수 있다.

실시예 4: 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 발병에 대한 NAGLU의 유전자 변이의 효과 결정

본 실시예는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 발병에서 NAGLU 유전자의 유전자 변이의 시험관내 및 생체내 효과를 기술한다.

증가하는 증거는 알츠하이머병(AD), 루이소체 치매, 파킨슨병(PD)을 동반한 전측두엽 치매(FTD) 사이에 임상적, 병리학적, 유전자적 중복이 있음을 암시한다. 비정상적인 헤파란 설페이트(HS) 대사는 다양한 생화학적 및 세포 연구에서 AD 및 PD의 일반적인 병원성 메커니즘으로서 부상하고 있지만 기본 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다. AD 또는 PD의 발병에 역할을 하는 HS의 리소좀 분해에 관여하는 효소의 유전자 변이체의 역할은 체계적으로 평가되어 있지 않다. 여기서, 유전자 분석은 대규모 사례-대조군 AD 및 PD 코호트에서 수행되었으며, 헤파란 설페이트(HS) 분해를 담당하는 리소좀 효소 유전자에서 희귀 기능 변이체의 상당한 풍부함이 농축이 상당한 효과 크기에 의해 발견되었다. 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)은 아밀로이드(Aβ) 및 알파-시누클레인(α-Syn)을 포함한 다양한 병원성 단백질의 올리고머화, 제거, 세포내이입 및 트래피킹을 조절한다. 병원성 단백질의 HSPG 결합의 약리학적 저해 및 HSPG 합성의 유전자 감소는 병원성 단백질의 제거를 촉진하고 이들의 응집을 감소시킨다. 현재까지 N-아세틸-알파-글루코사미니다제(NAGLU) 활성의 감소와 결과적인 HSPG 축적이 APP 대사, Aβ 플라크 부담 또는 α-Syn 응집 및 확산에 영향을 미치는지의 여부는 명확하지 않다. 여기에 설명된 연구는 Aβ 전구체 단백질(APP) 트래피킹, 뉴런에서의 Aβ 생성 및 신경교 세포에 의한 Aβ 분해에 대한 NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스(hypomorphic missense) 변이체의 효과를 결정할 수 있다. 마우스에서 인간 신경퇴행성 질환과 관련된 유전자 변이체를 모델링하기 위해 혁신적인 접근법이 설명된다. NAGLU 반접합성 마우스에서 장기 추적 관찰을 통해, 생애 초기에 주사된 정상이하 NAGLU 변이체의 비침습적이고 광범위하게 분포하고 장기 지속되는 전반적인 신경 발현을 가능하게 하는 향신경성 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터가 사용된다. 따라서, NAGLU 변이체의 세포 효과뿐만 아니라 AD 및 PD 환자에서 발견되는 노화 및 이형접합성의 효과도 연구될 수 있다. 또한, NAGLU의 감소 또는 과발현이 잘 특성화된 AD 마우스 모델에 존재하는 AD 병리에 영향을 미치는지의 여부도 결정될 수 있다. NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체가 1차 뉴런에서 α-Syn의 결합, 내재화 및 응집에 영향을 미치는지의 여부 및 이러한 변화가 기질 감소, 재조합 효소 대체 또는 유전자 요법에 의해 구제되는지 여부가 결정될 수 있다. 마지막으로, 신뢰성이 있고 잘 확립된 병리학적 α-Syn 확산 방법을 사용하여 정상이하 NAGLU 변이체가 인산화된 α-Syn의 응집체 형성, 연결도-의존적 확산 및 질병 진행 및 수명에 미치는 효과를 결정할 수 있다. 본 명세서에 설명된 연구의 결과는 유전자적으로 결정된 리소좀 기능장애가 있는 PD 및 AD 환자의 식별에 중요한 의미를 가지며, 여기서 이러한 기능장애의 회복은 효과적인 치료법을 제공할 수 있다.

본 명세서에 설명된 연구의 목표는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 발병에서 NAGLU 유전자의 유전자 변이의 효과를 시험관내 및 생체내에서 결정하는 것이다. 이 연구는 마우스에서 인간 신경퇴행성 질환과 관련된 유전자 변이체를 모델링하는 혁신적인 접근법을 포함한다. 본 명세서에 설명된 연구는 AD 및 PD와 관련된 새로운 리소좀 유전자를 밝혀내어 AD 및 PD 발병에서 리소좀 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있다.

알츠하이머병(AD), 루이소체 치매, 파킨슨병(PD)을 동반한 전측두엽 치매(FTD) 사이에 임상적, 병리학적, 및 유전자적 중복이 있음을 암시하는 증거가 증가하고 있다. 비정상적인 헤파란 설페이트(HS) 대사는 다양한 생화학적 및 세포 연구에서 AD 및 PD의 일반적인 병원성 메커니즘으로서 부상하고 있지만, 기본 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다. 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)은 세포 배양물에서 아밀로이드(Aβ) 및 알파-시누클레인(α-Syn)의 올리고머화, 제거, 세포내이입 및 트래피킹을 조절한다. HSPG는 Aβ에 결합하여 이의 올리고머화 및 응집을 가속화한다. HS는 시험관내에서 α-Syn 원섬유의 형성을 독립적으로 자극하고 세포의 Aβ 흡수를 매개한다. HSPG는 또한 α-Syn의 거대음세포 흡수를 매개한다. 병원성 단백질에 대한 HSPG 결합의 약리학적 저해 및 HSPG 합성의 유전자적 감소는 병원성 단백질의 제거를 촉진하고 이들의 응집을 감소시킨다. 또한, HSPG는 Aβ 플라크와 루이소체(LB)에 존재한다. 이러한 발견은 HS 및 HSPG가 Aβ 및 α-Syn 대사 및 후속적으로 AD 및 PD의 발병에서 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다. 그러나, AD 또는 PD의 발병에서 HS의 리소좀 분해에 관여하는 효소의 유전자 변이체가 하는 역할에 대한 체계적인 평가는 없었다. 따라서, 대규모 사례-대조군 AD 및 PD 코호트에서 유전자 분석을 수행하였고, 헤파란 설페이트(HS) 분해를 담당하는 리소좀 효소 유전자에서 상당한 ƒO기를 갖는 희귀 기능 변이체의 상당한 풍부함이 확인되었다. HS 분해에 관여하는 가장 광범위하게 연구된 리소좀 효소는 N-아세틸-알파-글루코사미니다제(NAGLU)이며, 인간에서 이의 결손은 점액다당류증 IIIB(MPS-IIIB)를 유발한다. 인간 질병의 특징을 발생 반복한 NAGLU 결손의 잘 특성화된 마우스 모델이 있다. 여기에 설명된 연구의 목표는 AD(승산비=3.7) 및 PD(승산비=4.7) 환자에서 발견된 NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체가 APP 대사, Aβ 생성 및 시험관내 Aβ 분해, 및 생체내 AD 병리뿐만 아니라 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 영향을 미치는지의 여부를 결정하는 것이다.

(I) 뉴런 APP 대사 및 Aβ 생성, 시험관내 Aβ 신경교 분해 및 생체내 AD 병리에 대한 NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체의 효과 결정

인간 MPS-IIIB 환자 및 NAGLU-결손 마우스는 둘 모두 세포내 전체 길이의 APP의 증가된 피질 수준을 나타낸다. MPS-IIIB 환자는 또한 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ40 수준의 유의적인 3배 증가를 나타낸다. NAGLU 활성의 변화가 뉴런에서 APP 대사 및 Aβ 생성에 영향을 미치는 것으로 가정된다. NAGLU 변이체를 운반하는 AD 환자의 이형접합 상태는 시험관내에서 모델링된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, APP 트래피킹, APP 반감기, APP 프로세싱 기구 및 Aβ 생성에 대한 정상이하 NAGLU 변이체의 효과는 1차 뉴런에서 결정될 수 있다.

미세아교세포가 AD 발병에 기여함을 암시하는 증거는 증가하고 있다. 데이터 마이닝 노력은 NAGLU가 미세아교세포에서 높은 수준의 발현을 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 신경교 세포에서 NAGLU의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 정상이하 NAGLU 변이체를 안정적으로 발현하는 1차 미세아교세포가 외인성 Aβ를 흡수하고 분해할 수 있는지 여부를 결정할 수 있다.

가족성 AD 돌연변이가 없는 경우, NAGLU 결손 마우스는 중심 내후각피질에 Aβ 및 HSPG의 세포내 축적을 나타낸다. AD 병리에 대한 NAGLU 이형접합성 및 노화의 효과는 생체내에서 모델링된다. 가장 유해한 NAGLU 변이체가 AAV2/9-PHP.B 벡터를 사용하여 출생 시 이를 주사한 24개월된 NAGLU 반접합성 마우스에서 AD 관련 표현형에 영향을 미치는지의 여부가 결정될 수 있다.

NAGLU 감소 또는 과발현이 4개월 및 8개월에 5XFAD 마우스에서 Aβ 생성, Aβ 제거, 플라크 침착, 시냅스 손실 및 신경염증에 영향을 미치는지의 여부가 결정될 수 있다.

(II) 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 대한 NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체의 효과 결정

MPS-IIIB 환자는 흑색질(SN)에서 심각한 뉴런 손실 및 측두엽, 해마 및 SN의 뉴런에서 병리학적 인산화된 α-Syn(pSyn)의 축적을 나타낸다. NAGLU 활성의 감소는 시험관내에서 α-Syn 흡수, 제거 및 응집, 및 생체내 확산에 영향을 미치는 것으로 가정된다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, α-Syn 사전-형성된 원섬유(PFF)의 결합, 내재화 및 응집이 정상이하 NAGLU 변이체를 안정적으로 발현하는 1차 뉴런에서 영향을 받는지 여부를 결정할 수 있다.

또한, 기질 감소(Genistein), 재조합 효소 대체 또는 유전자 요법이 α-Syn PFF의 내재화 및 응집에 미치는 효과를 구제하는지 여부도 결정할 수 있다.

α-Syn PFF의 선조체내 주사는 야생형 및 돌연변이 A53T 인간 α-Syn을 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 세포내 LB 병리의 축적, SN 뉴런의 선택적 손실 및 손상된 운동 조화를 발생 반복한다. α-Syn PFF의 선조체내 접종은 출생시 가장 유해한 NAGLU 변이체를 발현하는 AAV2/9-PHP.B 벡터가 주사된 반접합성 또는 NAGLU 결손 마우스에서 수행된다. 인산화된 α-Syn의 응집체 형성, 연결도-의존적 확산 및 이들이 질병 진행 및 수명에 미치는 영향을 정량화한다.

의의

AD 및 PD의 헤파란 설페이트

비정상적인 헤파란 설페이트(HS) 대사는 다양한 생화학적 및 세포 연구에서 AD 및 PD의 일반적인 병원성 메커니즘으로서 부상하고 있지만, 기본적인 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다. 특정 단백질 코어에 공유 부착된 HS 사슬로 이루어진 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)은 폭넓은 리간드와 상호작용하는 풍부한 세포 표면 및 세포외 분자이다. 막 HSPG는 세포내이입 수용체로서 작용하고 구성적일 뿐만 아니라 리간드 유도된 세포내이입을 겪는다. 대부분의 HSPG 및 결합된 리간드는 리소좀 프로테아제, 엑소글리코시다제 및 설파타제에 의해 분해된다. HSPG는 Aβ 및 α-Syn을 포함한 다양한 병원성 단백질의 올리고머화, 제거, 세포내이입 및 트래피킹을 조절한다. HSPG는 Aβ 플라크와 LB 및 LN에 존재한다. HSPG는 Aβ에 결합하여 이의 올리고머화 및 응집을 가속화하는 것으로 나타났다. HS는 시험관내에서 α-Syn 원섬유의 형성을 유의적으로 자극한다. HS는 또한 세포 Aβ 흡수를 매개한다. HSPG는 α-Syn의 거대음세포성 흡수를 매개한다. 병원성 단백질의 HSPG 결합의 약리학적 저해 및 HSPG 합성의 유전자 감소는 병원성 단백질의 제거를 촉진하고 이들의 응집을 감소시킨다. 이러한 결과는 HS 및 HSPG가 Aβ 및 α-Syn 대사, 및 AD와 PD의 발병에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.

AD의 리소좀 기능장애

가족형 AD는 아밀로이드-β(Aβ) 생산이 증가되고 후속적으로 세포외 공간(ISF, 간질액)에서 가용성 올리고머 또는 불용성 Aβ 플라크로 Aβ가 응집됨에 의해 병원성으로 유도되지만, 후기 발병 산발성 AD 환자에서의 최근 연구는 Aβ의 손상된 제거를 입증한다. 따라서, 생산과 제거 사이의 균형은 Aβ 수준과 Aβ 플라크를 발생시키는 경향을 결정한다. 리소좀은 세포내 소기관과 응집-경향성 단백질의 분해에 주요 역할을 한다. 신경병리학적 연구는 또한 AD 뇌의 리소좀 병리가 AD 발병에 기여한다는 것을 발견했지만, 기본 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다. 여러 트랜스제닉 마우스 AD 모델에서 리소좀의 변화가 발견되었다. 이러한 결과는 모두 리소좀 단백질의 변화가 AD 병리를 가속화한다는 것을 암시한다. 세포 연구는 엔도솜-리소좀 시스템이 Aβ 생산의 주요 부위임을 암시한다. 프레세닐린(Presenilin) 2(PSEN2)와 니카스트린(Nicastrin)(촉매적으로 필수적인 γ-세크레타제 성분)은 리소좀 내에 위치한다. 사실, PSEN1은 리소좀 pH를 조절한다. 시험관내 리소좀 기능의 약리학적 손상은 Aβ 생산의 변화를 초래한다. 리소좀 pH의 변화는 Aβ 분비를 감소시킨다. 리소좀 프로테아제 저해제는 아밀로이드생성 APP 단편의 생성을 감소시킨다. 이러한 모든 연구는 전반적인 리소좀 기능이 정상 및 비정상적인 Aβ 전구체 단백질(APP) 프로세싱 및 후속적인 아밀로이드생성에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.

HS 대사 유전자가 결손된 인간 및 마우스에서의 APP 대사

리소좀에는 HS의 단계적 분해에 관여하는 적어도 4개의 효소가 있다. 이들 유전자의 기능상실(LoF) 돌연변이는 리소좀 내부에 부분적으로 분해된 HS의 축적을 초래하고 점액다당류증(MPS) III A, B, C 및 D형(산필리포 증후군)을 유발한다. MPS 환자는 뇌 전체에 걸친 세포의 세포질에서 집중적하고 확산성인 Aβ 신호를 나타낸다. MPS 환자는 정상 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ 수준의 상당한 증가를 나타낸다. 또한, 가족성 AD(FAD) 돌연변이의 과발현이 없는 경우, MPS 마우스 모델에서는 세포내 APP/Aβ 수준의 증가가 보고되었다. MPS III 마우스 모델에서는 대조군에 비해 Aβ40 수준의 3배 증가가 발견되었다. 인간 및 AD 트랜스제닉 마우스 둘 모두에서 인지 저하는 가용성 Aβ 종과 상관관계가 있다. 트랜스제닉 AD 마우스의 데이터는 뉴런내 Aβ가 세포외 Aβ보다 신경독성이 더 크다는 것을 나타낸다. 세포내 Aβ의 축적은 인간 및 마우스 AD 모델 모두에서 세포외 침착보다 선행하는 것으로 나타났다. 이러한 연구는 APP 트래피킹 또는 프로세싱이 HS 대사에 관여하는 리소좀 유전자가 완전 기능상실된 인간 환자 및 마우스 모델 둘 모두에서 영향을 받는다는 것을 암시한다.

PD의 리소좀 기능장애

인간의 사후 연구 및 모델 시스템은 세포내이입 트래피킹, 리소좀 완전성 및 리소좀 가수분해효소 활성의 결함이 시누클레인병증에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 리소좀 마커는 산발성 PD 환자에서 LB의 구성 요소이다. 따라서, LB 및 루이소체 신경돌기(LN)는 손상된 리소좀 주위에 파종되어 질병이 진행됨에 따라 리소좀 유래의 미분해 물질의 지속적인 침착에 의해 크기가 성장할 수 있는 것으로 시사되었다. 여러 세포 기반 모델은 기계론적인 문제가 남아 있지만, 시누클레인병증의 진행에서 단백질병성 종자의 세포간 전달의 중심성에 집중한다. 특정 α-Syn 계통이 별개의 수용체 또는 세포내이입 메커니즘을 통해 내재화되는지 여부는 여전히 불분명하다. 불멸화 세포 및 1차 뉴런에 의한 α-Syn의 거대음세포 흡수는 HSPG에 의해 매개된다. 그러나, 생체내에서 α-Syn 확산에 대한 HS의 역할은 평가되지 않았다. 리소좀 프로세싱은 1차 뉴런에서 내재화된 α-Syn 원섬유의 주된 운명이다. 리소좀 기능의 약리학적 교란은 α-Syn 원섬유의 세포내 프로세싱에 이상을 유발하며, 동시에 내인성 α-Syn의 모집을 통해 봉입체 형성 속도를 증가시킨다. 이 모집을 지배하는 과정은 아직 제대로 이해되어 있지 않으며, 이는 병원성 종이 엔도-리소좀 트래피킹을 피해야 한다는 것을 시사한다. 따라서, 외인성 α-Syn 종은 세포내이입 소포 및 리소좀 막 파열을 초래하여, 세포내이입 트래피킹 및 리소좀 분해를 피하는 것으로 보고되었다. 일단 세포기질에 들어가면, 이러한 α-Syn 원섬유 또는 올리고머는 가용성 종과 상호작용하고 내인성 α-Syn의 모집을 시작할 수 있다. 이러한 결과는 리소좀 활성 및 완전성의 결함이 병리학적 α-Syn 응집 및 전달을 가속화할 수 있다는 발상을 추가로 뒷받침한다. HSPG는 LB 및 LN에 존재한다. HS는 시험관내에서 α-Syn 원섬유의 형성을 상당히 자극한다. 그러나, α-Syn 응집 및 확산에서 HS의 리소좀 축적의 역할은 아직 완전히 확립되지 않았다.

인간 리소좀 유전자의 유전자 변이에 대한 대규모 분석

60,000명의 사람들의 엑솜에 존재하는 돌연변이의 빈도와 유형에 대한 최근 분석에 따르면, 리소좀 유전자는 "기능상실에 불내성(intolerant)"인 돌연변이이며 진화의 중립 모델에서 예측한 것보다 잠재성이 적은 유해성 변이체를 운반하는 것으로 발견되었다. 이것은 넉아웃 마우스에서 대부분의 "코어" 리소좀 유전자의 배아발생 또는 신생아 기간 동안의 치사율과 일치한다. 가장 많이 연구되고 잘 알려진 리소좀 유전자는 돌연변이되면 리소좀 축적 질환(LSD)을 유발하는 유전자이다. 흥미롭게도, 이러한 LSD 유발 유전자의 대부분은 LoF 돌연변이에 불내성이 아니며 인간에서 상당한 유전자 암호 변이를 나타낸다. 따라서, 건강한 사람의 리소좀 효소 활성 수준에는 10배 범위의 차이가 있다. 리소좀 유전자의 하나의 단일 정상 카피의 운반은 건강에 어떠한 영향도 미치지 않는다고 오랫동안 가정되어 왔다. 그러나, NPC1 유전자에 이형접합성 미스센스 병원성 돌연변이의 보인자에 대한 최근 연구에서는 상당한 전신 대사 이상이 밝혀졌다. 또한, 실질적인 유전자적 증거는 GBA 유전자에서 이형접합 미스센스 변이체가 시누클레인병증 발병의 주요 유전자적 위험 인자로서의 역할을 뒷받침한다. 동형접합 상태에서 소아에서 LSD를 유발하는 동일한 병원성 변이체(고셔병)가 이형접합 방식으로 존재할 경우 PD 및 루이소체 치매를 비롯한 성인 발병 신경퇴행성 질환의 위험에 영향을 미친다. 이러한 연구는 노화 및 리소좀 유전자의 반수체기능부전의 조합이 성인 인간의 일반적인 신경퇴행성 장애의 소인임을 암시한다. AD 또는 PD의 위험에 영향을 미치는 리소좀 유전자에서 기능적 이형접합성 변이체의 기여에 대한 체계적인 평가는 부족하다.

NAGLU 유전자에 반수체기능부전을 유발하는 유전자 변이체를 운반하는 개체는 대조군보다 현저히 낮은 수준의 효소 활성을 나타낸다. 최근 연구에 따르면 ExAC 데이터세트에서 164개의 NAGLU 미스센스 "미지 유의성의 변이체(variants of unknown significance, VUS)"의 효소 활성이 보고되었고, HGMD에서 35개 병원성 미스센스 돌연변이가 보고되었으며, 이중 17개는 ExAC에서도 발견되었다. 이것은 병원성 변이체의 약 90%가 야생형 수준에 비해 15% 미만의 효소 활성을 나타냈음을 입증했다. 이 데이터는 일반 집단의 개체가 NAGLU 유전자에 정상이하 이형접합성 변이체를 운반한다는 것을 암시한다. 그러나, NAGLU 반수체기능부전의 장기적인 결과는 완전히 연구되지 않았다. 유전자 분석은 대규모 사례-대조군 AD 및 PD 코호트에서 수행되었으며 리소좀 헤파란 설페이트(HS) 대사 효소의 유전자에 희귀 기능 변이체의 상당한 풍부함이 상당한 효과 크기에 의해 식별되었다. NAGLU의 정상이하 미스센스 변이체는 AD(p = 3×10^-3; OR = 2.3, 95% CI 1.2 내지 5.2) 및 PD(p = 3.6×10^-7; OR = 3.6; CI = 2.8 내지 8.3)와 관련이 있는 것으로 발견되었다.

AD 또는 PD 환자에서 발견되는 NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체는 APP 대사, Aβ 생성 및 시험관내 Aβ 분해 및 생체내 AD 병리뿐만 아니라 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 영향을 미친다.

혁신

본 명세서에 기술된 연구는 AD 및 PD 위험과 관련된 NAGLU 유전자의 정상이하, 이형접합성 변이체의 기능적 결과를 체계적이고 포괄적으로 평가하여 개념상 혁신적이다. 이러한 연구의 결과는 유전자적으로 결정된 리소좀 기능장애를 가진 PD 및 AD 환자의 식별에 중요한 의미를 가지며, 이러한 기능장애의 회복은 효과적인 치료법을 제공할 수 있다. 기질 감소, 재조합 효소 대체 또는 유전자 요법을 활용하는 구제 실험도 본 명세서에 기술되어 있고, 이는 해독 상의 의미를 가질 수 있다.

전산 방법과 실험 데이터를 결합시킨 혁신적인 통합 프레임워크는 시험관내 및 생체내 모두에서 NAGLU 유전자의 기능적 효과를 검증하는 데 사용된다. 본 명세서에 기술된 이 연구는 최신 기술과 대규모 데이터세트의 유전자 분석, 세포 기반 검정, 생화학적 데이터, 마우스와 인간 뇌에서 특정 세포 유형에서 얻은 RNAseq 데이터, 인간 AD 및 PD 사례, 및 대조군의 RNA-seq 데이터, 및 유전자 요법, 기질 감소 및 재조합 효소 대체와 같은 개입을 갖는 마우스 모델에서 Aβ 플라크, 생화학적, 조직병리학적 및 행동 데이터와 상관관계를 입증한 AD 마우스 모델로부터의 게놈 전체 유전자 발현 데이터의 결과를 조합시킨다.

섹션 (I) 및 (II)에 설명된 연구는 취약한 뇌 영역에 대한 NAGLU의 반수체기능부전 및 연령이 APP 프로세싱 및 트래피킹, Aβ 플라크 부담, Aβ 수준 및 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 영향을 미치는지에 대한 문제를 해결한다. NAGLU 및 세포 자율성(뉴런 대 신경교 세포)의 역할도 AD 및 PD 메커니즘에서 평가된다.

마우스에서 인간 신경퇴행성 질환과 관련된 유전자 변이체를 모델링하는 혁신적인 접근법이 본 명세서에 기술된다. 정상이하 변이체를 운반하는 관심 유전자를 비침습성(뇌 혈액 장벽 통과)의 광범위한 분포 및 장기지속적인 전반적 신경 발현을 할 수 있도록 하는 향신경성 AAV 벡터는 반접합성 마우스의 생애 초기(생후 2 내지 4일)에 주사되고, 최대 20 내지 24개월 동안 장기간 추적조사된다. 따라서, 식별된 유전자 변이체의 세포 효과뿐 아니라 AD 및 PD 환자에서 발견되는 것과 같은 노화 및 이형접합성의 효과도 연구된다.

이 프로젝트를 실행하기 위해 매우 생산적이고 학제간 연구 팀이 구성되었다. 이러한 연구는 신경유전학, 리소좀 생물학, LSD 동물 모델, 세포 및 마우스 모델에서의 AD 및 PD 병태생리에 걸쳐 전문 지식을 갖춘 조사자가 참여하는 공동 혁신에 의해서만 가능하다.

접근법

여기서, 최신의 기능적 게놈 도구는 AD 및 PD 위험과 관련된 NAGLU 유전자 변이의 시험관내 및 생체내 모두에서의 효과를 결정하기 위해 사용된다.

연구

리소좀 HS 분해 유전자의 이형접합 변이체는 AD 발병 위험에 영향을 미침

45개 리소좀 유전자에 대한 단일 변이체 및 유전자 기반 분석을 AD의 2개 사례-대조군 코호트에서 수행하였다. 발견 샘플은 667개의 무관련 AD 사례와 511개의 대조군에서 얻은 WES 데이터로 구성되었다. 예상대로, ExAC 데이터세트(유럽인, 비핀란드 혈통)에서의 유전자 특이적 누적 대립유전자 빈도(cMAF)는 사내 AD 데이터베이스에서의 cMAF와 매우 일치했다(r²=0.96). 희귀 단백질 변경 변이체(cMAF)의 부담을 대조군 및 ExAC에서 관찰된 부담과 비교했다. 대부분의 유전자에서는, 대조군에 비해 사례에서 과도한 변이가 있었지만, SGSH 유전자에서는 명목상의 연관성만이 발견되었다(p = 4.2×10^-3; OR = 3.7, 95% CI 1.4 내지 9.6). ExAc 샘플의 cMAF와 비교했을 때, SGSH 유전자(p = 7.9×10^-5, OR = 3.0, 95% CI 1.8 내지 4.9) 및 NAGLU 유전자(p = 4.8×10^-4; OR = 3.7, 95% CI 1.4 내지 9.6)는 다중 시험 보정 임계값 p<1.0×10^-3을 통과했다. 다음으로, 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP) 코호트(AD 사례 5045명 및 대조군 4500명)를 사용하여 이러한 결과를 반복했다. NAGLU는 이 독립적인 샘플에서 반복되었다(p = 3×10^-3; OR = 2.3, 95% CI 1.2 내지 5.2). 특히, 주목할 것은 이 반복 샘플에서 발견된 연관성이 동일한 방향에서 유사한 효과 크기라는 점이다.

연령, AD 상태 및 AD 마우스 모델에 따른 NAGLU 전사체 수준

신경병리학적으로 정상인 인간 뇌 샘플에서, NAGLU 전사체 수준은 연령에 따라 유의적으로 증가하였다(p=0.02)(예를 들어, 도 1a 참조). NAGLU 전사체 수준은 연령 일치 대조군과 비교하여 AD 사례에서 유의적으로 더 높았다(p=0.007, 예를 들어, 도 1b 참조). AD 환자에서 NAGLU 전사체 수준의 통계적으로 유의미한(p = 3.2×10^-8) 증가(0.46 log₂ 배수)는 2개의 대규모 독립적인 AD 데이터베이스(Mayo Clinic Brain Bank RNA-seq 및 Mount Sinai Brain Bank)에서 반복되었다. NAGLU 전사체 수준은 또한 야생형 마우스에서의 수준(상단 그래프의 검은 선, 예를 들어, 도 1c 참조)에 비해, AD 마우스 모델의 피질(청색 선 상단 그래프; 예를 들어, 도 1c 참조)에서 AD 병리(하단 그래프, 예를 들어, 도 1c 참조)의 발달과 함께 비례하는 연령 의존적 증가를 나타내었다. ANOVA 분석은 연령 및 유전형의 유의적인 상호작용(p=0.0042)을 입증했다. 연령은 변이의 11.4%(p=0.0003)를 설명하는 반면, 유전형은 42.3%(p<0.0001)를 설명한다. 이러한 결과는 NAGLU로부터 응집된 단백질에 대한 보상 반응이 정상적인 노화 과정의 일부일 수 있음을 암시한다. AD 모델에서 발견된 비정상적 상승은 이들이 Aβ의 비정상적 수준을 제어하려고 시도하고 있음을 암시한다.

따라서, NAGLU의 반수체기능부전은 나이 든 마우스에서 AD 관련 표현형을 악화시킬 수 있다.

Aβ 수준의 간질액(ISF) 수준에 대한 NAGLU의 유전자 투여량 효과.

한배 새끼 WT, 반접합성 및 NAGLU 결손 마우스에서 Aβ의 ISF 수준에 대한 미세투석 정량(예를 들어, 도 14a 참조)은 Aβ의 기준선 ISF 수준에 대한 NAGLU의 유전자-투여량 효과를 나타냈다(예를 들어, 도 14b 참조). 또한, 반접합성 및 NAGLU 결손 마우스에서 ISF Aβ 수준은 60% 증가가 발견되었지만, 200μM 클로로퀸에 반응시킨 야생형 마우스에서는 발견되지 않았다(예를 들어, 도 14c 참조). 이 용량의 클로로퀸은 젊은(3개월) 또는 늙은(18개월) APP/PS1 마우스 모델에서 Aβ의 ISF 수준을 변화시키지 않았다(데이터는 미제시됨). 이러한 결과는 NAGLU 활성 수준의 변화가 비정상적인 APP 대사 및 Aβ 생성과 관련이 있다는 가설을 뒷받침한다.

리소좀 HS 분해 유전자의 이형접합 변이체는 PD 발병 위험에 영향을 미침

발견 샘플은 PPMI 코호트에서 얻은 331개의 무관련 PD 사례의 WES 데이터로 이루어졌다. NFE ExAC 데이터세트의 유전자 특이적 cMAF는 사내 PD 데이터베이스의 cMAF와 매우 일치했다(PPMI r²=0.92; WUSTL r2=0.96). 희귀 단백질 변경 변이체(cMAF)의 부담을 대조군 및 ExAC에서 관찰된 부담과 비교했다. ExAc 샘플의 cMAF와 비교했을 때, GBA(p = 6.1×10^-6; OR = 2.1; CI = 1.3-3.3), GNS(p = 2.5×10^-5; OR = 2.4; CI = 1.4-4.6) 및 NAGLU(p = 1.0×10^-4; OR = 4.7; CI = 1.5-8.3)을 포함한 7개의 유전자가 다중 시험 보정 임계값 p<1.0×10^-3을 통과했다. HGSNAT에서도 경향이 있었다(p = 8.1×10^-3; OR = 1.8; CI = 1.1 내지 2.8). 다음으로, 이러한 결과를 반복하기 위하여, Human-Exome 칩을 사용하여 데이터를 얻은 490개의 PD 사례를 포함한 추가 PD 코호트(WUSTL)를 사용하였다. 특히, 반복 샘플에서 발견된 연관성은 동일한 방향에서이며 효과 크기는 유사하다: NAGLU(p = 3.6×10^-7; OR = 3.6; CI = 2.8 내지 8.3) 및 HGSNAT(p = 9.7×10^-4; OR = 1.9; CI = 1.4 내지 3.2). NAGLU 유전자에 돌연변이가 있는 MPS IIIB 환자에서는 SN 병리 및 LB 축적이 보고되었다. 또한, 대조군과 비교하여 PD 환자의 흑색질로부터의 도파민성 뉴런에서 NAGLU 유전자의 전사체 수준은 감소하는 것으로 발견되었다(예를 들어, 도 2 참조).

α-Syn의 결합, 내재화 및 응집의 시험관내 모델

α-Syn PFF의 제조 및 사용은 뉴런 배양물에서 최적화되었다. α-Syn PFF는 시험관내 7일(DIV)째에 야생형 마우스의 1차 피질 뉴런에 첨가되었다. 치료 후 7일째; 뉴런을 고정하고 pSyn-특이적 항체로 염색하였다. PFF는 내인적으로 발현된 α-Syn을 비정상적인 인산화된 불용성 응집체로 모집되도록 유도하였다(예를 들어, 도 3a 및 도 3b 참조). α-Syn 응집체는 초기에 시냅스전 말단 및 축삭에서 작은 점상 봉입체로서 나타났다(예를 들어, 도 3a 참조). 응집체는 성장하여, 루이소체 신경돌기와 유사한, 더 길고 구불구불한 외관이 된다(예를 들어, 도 3a 참조). 도 3b는 PBS 처리된 대조군 뉴런이 단량체성 α-Syn에 상응하는 15kDa를 약간 초과하는 밴드를 보여주었다는 것을 나타낸다. PFF로 처리된 뉴런에서는 더 높은 분자량을 가진 여러 밴드가 나타났다. 이러한 추가 밴드는 α-Syn 올리고머에 해당할 가능성이 있다. 이것은 α-Syn 응집에 대한 리소좀 기능장애의 영향을 연구하기 위한 다루기 쉬운 시험관내 시스템이다.

생체내 pSyn 병리의 확산

α-Syn PFF의 선조체내 접종은 6마리의 NAGLU 결손 마우스와 6마리의 야생형 한배 새끼에서 수행되었다. 모든 마우스는 주사 후 생존했다. 공개된 데이터와 일치하는 것으로, 주사 후 90일(dpi)째 PFF 주사된 야생형 마우스는 선조체, 전두엽 및 내후각 피질, 기저측 편도체 및 SN을 포함한 여러 뇌 영역에서 풍부한 동측 pSyn 병리를 나타냈다. WT-처리된 마우스는 내후각피질에서 대측성 pSyn 병리를 거의 나타내지 않았다(예를 들어, 도 15 참조). α-Syn PFF로 처리된 NAGLU-결손 마우스는 주사 부위의 동측 및 대측 모두의 전두엽 및 내후각 피질에서 더 많은 α-Syn 병리를 나타냈다(예를 들어, 도 16b 참조). NAGLU 결손 마우스는 더 많은 병리학적 pSyn 병리를 나타냈으며, 이는 WT 마우스에서 관찰되는 것보다 동측 및 대측 모두에 더 많이 확산되었음을 나타낼 수 있다. 더 많은 α-Syn PFF 처리된 마우스는 특히 SN에서 pSyn 병리의 영역적 및 시간적 확산에 대한 NAGLU 결손의 영향을 추가로 특성화하기 위해 현재 분석 중이고(예를 들어, 도 17a 내지 도 17c 참조), NAGLU-결손 마우스에 pSyn 병리의 확산 증가를 암시하는 초기 결과를 확대한다.

연구 설계 및 방법

(I)(a) NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체가 뉴런 APP 대사 및 Aβ 생성, 시험관내 Aβ 신경교 분해에 미치는 효과 결정

NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체

선택된 변이체는 부위 지시성 돌연변이유발을 사용하여 조작하고 이전에 설명된 바와 같이 렌티바이러스 벡터내로 서브클로닝한다. 렌티바이러스 벡터는 재조합 또는 합성 핵산 분자를 수반하는 연구에 대한 NIH 가이드라인(NIH Guidelines for Research Involving Recombinant or Synthetic Nucleic Acid Molecules)의 섹션 III-E-1에 따라 BSL2 시설에서 생산, 처리 및 폐기한다. 효소 활성에 대한 변이체의 효과를 결정하기 위해, NAGLU 활성에 대해 이전에 기술된 바와 같이 형광 검정을 사용한다. HSPG의 수준은 ELISA에 의해 정량한다.

APP 트래피킹, 세포내이입 및 세포내 국재화에 대한 효과 평가

여러 연구에서 APP의 세포내이입은 APP 아밀로이드생성 경로에서 엔도솜 및 다소포체 내에 β- 및 γ-세크레타제와 공동국재화하는 데 필수적임을 입증했다. 리소좀 기능장애에 이차적인 엔도솜 흐름의 손상은 이 소기관 내에서 증가된 통과 시간을 초래하여, β 및 γ 절단 경향을 증가시키고, 따라서 Aβ 생성을 증가시킨다. Aβ 플라크 없이 NAGLU-결손 환자 및 산필리포 B 환자 모두의 뇌에서는 세포내 전체 길이-APP의 증가된 수준이 보고되었다. NAGLU 유전자에서 선택된 변이체가 APP의 정상 상태 수준, APP 세포내이입 또는 분해를 위해 리소좀 내로 APP의 흐름 향상에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 세포내 APP 출현의 동역학 및 세포 표면의 APP 수준은 이전에 공개된 세포 표면 비오틴화 검정을 사용하여 결정할 수 있다. 전체 길이 APP 반감기에 대한 효과는 단백질 합성 저해제인 사이클로헥시미드로의 처리 0, 5, 10, 30분째에 웨스턴 블롯으로 측정한다. 또한, 공동국재화 기술을 사용하여 APP 및 SorL1 아세포 국재화에 대한 효과를 연구한다. α-세크레타제(ADAM10 및 ADAM17), β-세크레타제 1(BACE1) 및 γ-세크레타제 복합체(PSEN1 및 니카스트린)를 포함한 APP 프로세싱 기구의 단백질 및 전사체 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 RT-qPCR로 측정한다. 엄격함과 재현성을 보장하기 위해, 정량은 이중 맹검 관찰자가 삼반복으로 최소 3회의 독립적인 실험으로 수행한다.

Aβ 생성에 대한 효과 평가

상당한 비율의 APP는 리소좀을 표적으로 하고 리소좀 산성화 저해제의 존재 하에 APP 수준은 세포 내에 빠르게 축적되는데, 이는 리소좀 분해가 APP 단백분해작용을 유도하여 Aβ 펩타이드의 형성을 방지한다는 것을 암시한다. 산필리포 B 환자는 정상 대조군 뇌에 비해 가용성 Aβ40 수준의 유의적인 증가(3배)를 나타낸다. Aβ 올리고머 수준의 유의적인 증가는 NAGLU-결손 마우스의 뇌에서 보고되었다. 이러한 결과는 NAGLU 결손이 있는 마우스 및 인간 모두에서 리소좀 기능장애 및 HS의 축적이 γ-세크레타제 의존성 비정상 APP 프로세싱을 초래함을 암시한다. 따라서, 선택된 변이체가 세포 배양물에서 Aβ 생성에 영향을 미치는지 여부를 평가할 수 있다. 1차 뉴런 배양은 이전에 설명한 바와 같이 수행한다. 뉴런 특이적 프로모터(시냅신) 하에 선택된 변이체 및 야생형을 운반하는 렌티바이러스 벡터는 NAGLU 결손 및 반접합성 마우스 둘 모두의 1차 뉴런을 형질도입시키는 데 사용된다. 다른 양의 농축된 렌티바이러스를 사용하여 뉴런에서의 적절한 발현 수준을 결정한다. NAGLU 수준은 RT-qPCR 및 형광 검정에 의해 측정한다. 세포 용해물 및 세포 배지 중의 Aβ 종은 이전에 공개된 샌드위치 ELISA에 의해 검출한다. 간략하게 설명하면, Aβx-40 및 Aβx-42 펩타이드는 마우스 단클론 코팅 항체 HJ2(항-Aβ35-40) 및 HJ7.4(항-Aβ37-42)에 의해 포획된다. 중심 도메인을 표적으로 하는 비오틴화된 항체인 HJ5.1(항-Aβ13-28), 또는 N-말단 아미노산을 표적으로 하는 HJ3.5는 검출 항체로서 사용하고, 이어서 스트렙타비딘-폴리-HRP-40을 사용한다. APP 유래 단백질분해 단편, 예컨대, α- 및 β-CTF, 및 sAPPα 및 sAPPβ는 웨스턴 블롯으로 측정한다. 전체 길이 APP의 수준은 또한 이전에 설명한 바와 같이 웨스턴 블롯으로 모니터링한다.

Aβ 분해에 대한 효과 평가

미세아교세포는 Aβ 플라크 주위에 증식하여 Aβ 물질을 포식작용을 하지만, 후속 분해가 손상되어 AD에서 점진적인 Aβ 축적에 기여한다. 미세아교세포가 원섬유 Aβ를 흡수할 수 있지만, 이를 분해할 수 없는 이유는 명확하지 않다. 그러나, AD 환자의 미세아교세포는 beclin-1의 감소, 및 후속적인 리소좀 기능장애를 나타낸다. 또한, 불용성 원섬유 Aβ는 1차 미세아교세포에서 염화물 채널 CIC-7을 리소좀으로 트래피킹하는 데 영향을 미치며, 이는 리소좀 분해를 손상시킨다. 그러나, 리소좀 산성화를 복원시키면 Aβ 분해가 향상된다. 종합하면, 이러한 증거는 미세아교세포에서 리소좀 기능부전이 AD 발병에 기여할 수 있음을 암시한다. 여기에 설명된 데이터 마이닝 노력은 NAGLU가 미세아교세포에서 높은 발현 수준을 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 선택된 정상이하 NAGLU 변이체로 형질도입된 NAGLU 결손 및 반접합성 마우스의 1차 미세아교세포가 외인성 Aβ를 흡수하고 분해할 수 있는지 여부를 평가할 수 있다. Aβ 흡수 및 분해 평가는 이전에 공개된 바와 같이 수행한다.

ALP 기능에 대한 효과 평가

NAGLU 결손 마우스의 심장 및 뇌 조직에서 Beclin1, p62 및 LC3-II 수준의 증가는 자가포식소체가 축적되는 리소좀 자가포식 시스템의 비정상적인 활성을 암시한다. 반접합성 NAGLU 마우스의 뉴런이 ALP 기능장애를 나타내는지 여부와 이러한 변화가 선택된 변이체에 의해 증가되는지 여부를 시험할 수 있다. LC3 및 p62의 웨스턴 블롯은 거대자가포식 활성화의 간접 지표로 사용된다. 자가포식 흐름은 자가포식 시스템의 활성화제(라파마이신 및 토린1), 자가포식 저해제(바필로마이신 A1), 리소좀향성 작용제(클로로퀸, 염화암모늄) 및 이전에 공개된 바와 같은 E64/류펩틴의 부재 또는 존재하에 세포에 존재하는 LC3-II의 양에 의해 평가된다. 이것은 mCherry-GFP-LC3 마커를 사용한 생세포 이미지화에 의해 보완된다. 자가포식소체-리소좀 융합은 LC3 및 LAMP1의 공동국재화에 의해 추가로 평가된다. Lysotracker는 세포당 산성 구획의 수를 정량하는 데 사용된다. TFEB의 활성화는 핵 국재화에 의해 평가된다. RT-qPCR은 TFEB-조절된 mRNA 전사체(SQSTM1/p62, MAP1LC3B 및 LAMP2)의 전사체 수준의 변화를 측정하는 데 사용한다.

엄격함과 재현성을 보장하기 위해, 조사자는 정량 및 분석 단계 동안 유전형에 대해 알지 못한다. 각 실험에 대해 수득된 데이터는 설명된 각 그룹 내에서 평균을 낸다. 실험은 유전형당 최소 2개의 독립적으로 생성된 제조물을 사용하여 3반복으로 수행한다. 통계적으로 유의미한 차이는 이원 ANOVA 및 적절한 사후 시험을 사용하여 각 마커 또는 기능 분석이 대조군 대비 NAGLU와 연관이 있는지 여부를 결정하기 위해 시험된다.

예상 결과

APP 트래피킹, APP 대사, Aβ 생성 또는 Aβ 분해에 대한 NAGLU의 유전자 투여량 효과가 예상된다. 또한, 본 명세서에 설명된 실험에 따르면 NAGLU 유전자에서 선택된 변이체가 뉴런 및 미세아교세포 생존에 미치는 효과를 평가할 수 있을 것으로 예상된다. 대안적으로, 5XFAD 트랜스제닉 마우스 또는 N2A695 세포의 1차 뉴런을 NAGLU 유전자의 선택된 변이체로 형질도입시킬 수 있고 Aβ 생성에 대한 효과를 시험할 수 있다. 시험관내에서 AD의 위험 및 발병 모두에 영향을 미치는 NAGLU 유전자의 변이체를 식별한 후 다음 단계는 iPSc 생성 및 게놈 편집 방법의 진행을 활용하는 것이다. NAGLU 유전자에 변이체를 보유한 AD 환자의 iPSc 유래 뉴런 또는 신경교 세포는 동종 CRISPr 보정된 세포에 비해 상기 변이체가 APP 대사에 미치는 효과를 비교하는 데 사용할 수 있다. 여기에 설명된 실험의 결과와 NAGLU 활성에 대한 형광 검정의 이용가능성을 조합하면 AD 사례 및 대조군의 CSF, 혈장, 혈청 또는 뇌 조직을 선별하여 AD의 생물마커로서 사용될 수 있는 특정 결함을 검출할 수 있다.

(I)(b) 생체내 AD 병리에 대한 NAGLU 유전자의 효과 결정

마우스와 인간에서 NAGLU의 완전 기능상실인 신경퇴행성 결과는 특성화되었지만, 이 유전자의 단일 카피(반수체기능부전)의 장기적인 결과 또는 과발현에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 반접합성 마우스 및 인간은 정상이라고 항상 가정되어 왔다. 그러나, 최근에 리소좀 유전자의 반수체기능부전이 인간 및 마우스의 유의적인 대사 이상을 초래한다는 것이 입증되었다. 한 가지 가설은 AD 병리가 더 경미한 형태의 유전성 리소좀 기능장애로부터 발생하고 이들의 출현은 추가적인 연령 관련 리소좀 손상을 필요로 할 수 있다는 것이다. 1차 평가변수는 4개월(플라크 침착 전)에 측정되는 Aβ 수준 및 마우스에 FAD 유발 돌연변이의 존재 하에 8개월령에 측정되는 플라크 부하이다. Aβ 수준에 대한 효과는 AD 관련된 가장 유해한 NAGLU 변이체를 발현하는 24개월 NAGLU 반접합성 마우스에서의 1차 평가변수이다.

나이 든 마우스의 AD 표현형에 대한 정상이하 미스센스 NAGLU 변이체의 효과

한배 새끼 WT, 반접합성 및 NAGLU-결손 마우스에서 Aβ의 ISF 수준에 대한 미세투석 정량(예를 들어, 도 14a 참조)은 Aβ의 기준선 ISF 수준에 대한 NAGLU의 유전자-투여량 효과를 밝혀냈다(예를 들어, 도 14b 참조). 또한, ISF Aβ 수준의 60% 증가는 반접합성 및 NAGLU-결손 마우스에서 발견되었지만, 클로로퀸에 반응시킨 야생형 마우스에서는 발견되지 않았다(예를 들어, 도 14c 참조). AD 병리(예를 들어, Aβ 플라크)는 전형적으로 연령-의존적이다. 그러나, 공개된 연구에서는 연령과 리소좀 기능장애 간의 상호작용을 해결하지 못했다. 생체내 역할을 평가하는 대부분의 연구는 약리학적 접근 또는 리소좀 유전자의 완전 부재 및 단기 평가변수를 사용했다. Aβ 올리고머의 증가는 10개월령의 NAGLU-결손 마우스의 뇌에서 이전에 보고되었다. 여기서, 반접합성 NAGLU 마우스에게는 가장 유해한 NAGLU 변이체를 운반하는 AAV2/9-PHP.B를 생후 1 내지 2일째에 I.V를 통해 주사한다. AAV2/9-PHP.B 벡터는 혈액 뇌 장벽을 통과하고 AAV9보다 적어도 40배 더 큰 효율로 CNS 전체에 유전자를 전달하고 다수의 CNS 영역에 걸쳐 대부분의 뉴런을 형질도입시킨다. 마우스는 회복되어 적어도 20개월령까지 살게 한다. 빈사 상태의 마우스를 마취 및 희생시켜 세제 가용성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42 수준과 같은 뇌 생화학적 연구를 수집한다. Aβ를 수반하는 AD-관련 표현형에 대한 정량적인 병리학적 조사가 또한 수행된다(예를 들어, 도 18 참조).

샘플 크기 계산은 세제 가용성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42의 20% 증가를 80% 검정력으로 검출하기 위해 적어도 n=15 마우스/그룹이 필요하다는 것을 나타낸다. 십오(15)마리의 NAGLU 반접합성 마우스 및 15마리의 야생형 마우스에게 생후 1 내지 2일째에 AAV2/9-PHP.B를 사용하여 가장 유해한 NAGLU 변이체를 주사한다.

AD 병리의 마우스 모델에 대한 NAGLU 감소 또는 과발현의 효과

산필리포 B 질환이 있는 인간 환자에서 NAGLU 단백질의 완전 기능상실은 정상 대조군 뇌와 비교하여 가용성 Aβ40 수준의 유의적인 3배 증가를 초래한다. 그러나, NAGLU 전사체 수준은 대조군에서보다 인간 AD 사례 및 AD 마우스 모델에서 유의적으로 더 높았다(예를 들어, 도 1b 및 도 1c 참조). 세포내 Aβ 생성에서 이러한 유전자의 역할을 뒷받침하는 인간 산필리포 B 환자와 NAGLU 결손 마우스로부터의 데이터를 감안하여, NAGLU 감소 또는 과발현이 세포내 Aβ 생성을 선호하는 FAD 돌연변이를 운반하는 AD의 잘 특성화된 마우스 모델에서 Aβ 생성에 영향을 미치는지 여부를 결정할 수 있다. 5XFAD 모델은 1.5개월째에 뉴런내 Aβ42, 2개월째에 플라크, 4개월째에 시냅스 마커 손실 및 기억 결손, 및 9개월령에 뉴런 손실을 발생시키는 Aβ 침착 모델이다. 플라크의 발생은 반응성 신경교증을 동반한다. NAGLU 결손 마우스는 고도로 설페이트화된 HS 뇌 축적, 신경염증, 뉴런 및 미세아교세포 모두에서 확장된 리소좀, 및 약 4mo에서 시냅스 단백질의 감소 후 변경된 일주기 리듬, 청력 및 시력 결손, 및 나이 든 마우스(>8개월)에서는 푸르키네(Purkinje) 세포의 손실 및 손상된 운동 조화를 동반한다. NAGLU-결손 마우스의 수명 중앙값은 약 12개월이다. NAGLU 및 5XFAD 마우스는 C57Bl/6 배경과 동계유전형이다. NAGLU 반수체기능부전이 기존의 아밀로이드생성 과정을 악화시키는지 여부를 추가로 확인하기 위해, NAGLU 마우스를 5XFAD 트랜스제닉 마우스와 교배한다. NAGLU의 과발현이 5XFAD 마우스에서 AD 병리에 영향을 미치는지 여부를 결정할 수 있다. 출생 시 5XFAD 마우스에서 야생형 NAGLU를 운반하는 AAV2/9를 가지고 일측 단회 두개내 주사를 수행한다. 그 다음, 5XFAD 마우스의 각각 AAV2/9-WT-NAGLU 주사된 반뇌 및 주사되지 않은 반뇌에서, 이전에 설명한 바와 같이 조직학에 의해 Aβ 플라크 부하, 및 샌드위치 ELISA에 의해 Aβ40/Aβ42 수준을 4개월 및 8개월에 측정하여 Aβ 플라크 부하를 비교한다. APP 대사는 웨스턴 블롯에 의해 APP-CTF를 측정함으로써 평가한다. 4개월은 Aβ 축적이 더 일찍 시작되는지를 검출하기 위한, 5XFAD 마우스에서 Aβ 플라크가 침착하기에는 초기 시점인 반면, 8개월은 Aβ 플라크가 풍부한 후기 단계를 나타낸다.

AAV2/9 벡터의 생성

NAGLU 야생형 및 가장 유해한 변이체는 AAV2/9-PHP.B 또는 AAV2/9 벡터로 서브클로닝한다. UNC Viral Vector Core 시설에서 고역가 AAV2/9 벡터 스톡을 얻었다. AAV 벡터 스톡은 이 연구에 설명된 모든 실험을 위해 젖산 링거 용액에 10¹² vg/ml로 희석한다.

Aβ 플라크 정량 및 Aβ 생성

고정된 동결 뇌 절편(50㎛)은 마우스의 하위코호트에서 X-34로 염색하고 HJ3.4(항-Aβ) 항체로 면역염색하여 플라크 부하(면적%로 표시됨)를 정량한다. 대측 반구의 뇌 조직 균질액의 Aβ 수준은 가용성(PBS) 및 불용성(5M 구아니딘) 분획으로 분획화하고 ELISA를 사용하여 정량한다. APP 프로세싱 기구에 대한 효과를 평가한다.

시냅스 마커

시냅스 손실은 인간 및 AD 마우스 모델에서 일반적인 결과이다. NAGLU 감소 또는 과발현이 5XFAD 마우스의 시냅스 손실에 영향을 미치는지 여부는 이전에 공개된 시냅스전 마커인 SNAP-25, 소포 관련 막 단백질 2, 신탁신(Syntaxin) 1 및 시냅토피신(Synaptophysin)에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 평가할 수 있다.

생체내 Aβ 미세투석

Aβ는 뇌에서 반감기가 비교적 짧아서, 마우스 간질액(ISF)에서는 약 1 내지 2시간이고 인간 뇌척수액(CSF)에서는 약 8시간이다. Aβ 생성 및 제거에 대한 NAGLU의 효과를 조사하기 위해 생체내 미세투석을 사용하여, 3 내지 4개월째에 AVV2/9 또는 PBS가 주사된 5XFAD/NAGLU(+/-); 5XFAD/NAGLU(-/-) 마우스 및 5XFAD 한배 새끼의 해마에서 ISF Aβ 대사를 동역학적으로 평가한다. 깨어나서 자유롭게 움직이는 마우스의 해마에서 시간 경과에 따른 ISF Aβ 수준을 평가하기 위해, 생체내 미세투석은 이전에 기술된 바와 같이 수행한다(예를 들어, 도 14a 내지 도 14c 참조). 간단히 말해서, 이소플루란 마취하에 가이드 캐뉼러가 해마 위에 정위적으로 이식된다(정수리점 3.1㎜ 뒤, 정중선에서 2.5㎜ 측면, 12°각도로 경막 1.2㎜ 아래). 미세투석 프로브는 가이드 캐뉼라를 통해 뇌로 삽입한다. 인공 CSF는 미세투석 관류 완충액으로 사용한다. 미세투석 샘플을 60 내지 90분마다 수집하고 ELISA로 Aβ40 또는 Aβ42에 대해 평가한다. 6시간 동안 Aβ의 평균 농도는 ISF Aβ의 기본 농도로서 정의한다. 각 동물에 대해 모든 Aβ 농도는 해당 마우스의 기본 Aβ 농도에 대해 정규화된다.

Aβ 제거 반감기

기본 농도가 결정된 후, Aβ의 생성을 신속하게 차단하기 위해 마우스에게 혈액-뇌 투과성 γ-세크레타제 저해제(LY411575, 3㎎/㎏ 피하)를 투여한다. 미세투석 샘플을 6시간 동안 60분마다 수집한 다음 ELISA로 Aβ40에 대해 검정한다. ISF Aβ의 반감기는 시간에 대한 Aβ 변화 %의 세미 로그 플롯의 기울기를 기반으로 하여 계산한다. 지속적으로 감소하는 Aβ 값만이 반감기 분석에 포함된다.

샘플 크기

검정력 분석을 기반으로 할 때, 제거율 및 ISF Aβ 수준의 30% 감소를 검출하는 데에는 n=10마리 마우스/그룹이 필요하다(5개 그룹×10 = 50마리 마우스, 동일한 수의 수컷 및 암컷).

ALP 기능장애

시험된 모든 유전형의 뇌 절편은 위에서 설명한 바와 같이 항-LAMP1, LC3 및 p62 항체로 면역염색한다.

신경돌기 이영양증 및 반응성 신경교증에 대한 효과

이전 연구에서는 NAGLU 결손 마우스가 증가된 성상교세포증을 나타내는 것으로 입증되었다. 따라서, 병행 연구로서, 반응성 신경교증에 대한 선택된 유전자의 하나의 단일 카피의 영향을 조사하기 위해 항-CD11b 및 항-GFAP 항체를 이용하여 염색을 수행한다. 고정 동결된 뇌 절편은 이전에 수행된 것과 같은 이영양성 신경돌기를 정량하기 위한 레티큘론-3(RTN-3) 항체(RTN-3은 이영양성 신경돌기에 선택적으로 축적됨)로 면역염색한다.

관련 생물학적 변수의 고려

여기에 기술된 연구의 변수로서 성별이 고려된다. 암컷 마우스는 일반적으로 수컷보다 더 큰 Aβ 축적을 가지므로 연구의 각 그룹은 10명의 수컷과 10명의 한배새끼 암컷(n=20)으로 구성한다. 샘플 크기 계산은 80% 검정력으로 세제 용해성 및 불용성 Aβ40 및 Aβ42 및 플라크 부하의 40% 증가(SD=20%, α=5%)를 검출하기 위해 적어도 n=10마리의 마우스/그룹이 필요함을 나타낸다. 이십(20)마리의 NAGLU-결손 마우스 및 5XFAD와 교배된 20마리의 NAGLU 반접합성 마우스에게 출생 시 AAV2/9-PHP.B를 사용하여 가장 유해한 NAGLU 변이체를 주사한다. 또한, 20마리의 NAGLU-결손 마우스, 5XFAD와 교배된 20마리의 NAGLU 반접합성 마우스 및 4개월 및 8개월령인 20마리의 추가 5XFAD 마우스(유전자적 배경을 대조하기 위해)를 조직학적 및 생화학적 연구를 위해 수집한다. 각 실험에 대해 실험 동물이 생성되면 실험실의 독립적인 구성원이 각 동물에 무작위로 숫자를 지정한다. 따라서, 연구와 가장 밀접하게 관련된 연구원은 유전형 및 치료 요법에 대해 알지 못하여 편견없는 실험을 보장한다. 생화학적 및 조직학적 분석을 위한 샘플은 무작위로 지정된 동일한 숫자를 유지한다. 생물학적 변수는 한 실험 내에서 동일한 배취의 시약과 동계유전자형 동물을 사용함으로써 최소화한다.

예상 결과

NAGLU 유전자에 대한 반접합성 마우스는 5XFAD 마우스에서 Aβ 플라크 부담을 가속화하고 악화시킬 것으로 예상된다. NAGLU 반수체기능부전은 나이 든 마우스에서 APP 대사 및 Aβ 생성에 영향을 미치고, 결과적으로 Aβ 플라크의 생성 없이 시냅스 손실 및 반응성 신경교증을 증가시킬 것으로 예상된다. 반접합성 마우스의 뇌에서 APP 대사 및 Aβ 생성의 변화가 발견되지 않는 경우, NAGLU의 전사체는 이에 대한 검증된 shRNA/RNAi를 운반하는 AAV2/9 벡터를 주사하여 신생 5XFAD 트랜스제닉 마우스에서 녹다운시킬 수 있다. CRISPr 기술은 시험관내 검정에서 가장 강력한 효과가 있는 선택된 유전자의 변이체에 대한 넉인(knock-in) 마우스를 생성하는 데 사용할 수 있다. NAGLU 마우스에서의 결과를 연장하기 위해, 이용 가능한 마우스 모델이 있는 HS를 분해하는 다른 리소좀 효소(예를 들어, N-설포글루코사민설포하이드롤라제, [SGSH(Jax 003780)])에 대해 동일한 접근법을 적용할 수 있다.

(II) 시험관내 α-Syn 응집 및 생체내 α-Syn 확산에 대한 NAGLU 유전자의 정상이하 미스센스 변이체의 효과 결정

여기에 기술된 바와 같이, α-시누클레인의 흡수, 트래피킹, 응집 및 제거에 대한 NAGLU의 기능적 효과는 시험관내에서 결정할 수 있다. 불멸화 세포와 1차 뉴런에 의한 α-Syn의 거대음세포 흡수는 HSPG에 의해 매개되는 것으로 보인다. 또한, HS는 시험관내에서 α-Syn 원섬유의 형성을 유의적으로 자극한다. α-Syn 응집의 잘 특성화된 모델은 배양된 뉴런에서 이전에 개발되었다. 이 모델에서 재조합 α-Syn으로부터 생성된 PFF는 1차 뉴런에 직접 첨가되고 이 뉴런에 의해 세포내이입된다. 이러한 PFF는 내인적으로 발현된 α-Syn이 비정상적인 인산화된 불용성 및 유비퀴틴화된 응집체 내로 모집되도록 유도한다. 시험관내 야생형, 비트랜스제닉 마우스 유래의 1차 뉴런에서 내인성 α-Syn으로부터 이러한 응집체의 형성은 2 내지 3일의 지연 단계를 따르고, 그 다음 4 내지 7일경에 축삭에서 형성되고, 7일 내지 10일경에 체세포수지상 구획으로 전파하고, PFF 첨가 후 약 14일 경에 뉴런 사멸에 이른다(예를 들어, 도 3a 및 도 3b 참조). 여기에 기술된 바와 같이, α-Syn 원섬유의 흡수, 트래피킹, 응집 및 제거에 대한 NAGLU의 효과는 이러한 잘 특성화된 모델을 사용하여 결정할 수 있다. 또한, 가장 유해한 NAGLU 변이체에 의해 형질도입된 NAGLU-결손 및 반접합성 마우스 유래의 1차 해마 뉴런에서 내인성 α-Syn의 제거에 변화가 있는지 여부를 결정할 수도 있다. NAGLU-결손 마우스로부터의 1차 뉴런에서 α-Syn 응집체(봉입체)의 속도 및 수준은 α-Syn PFF로 처리한 후 결정할 수 있다(예를 들어, 도 3a 및 도 3b 참조). 또한, 기질 감소(제니스타인), 재조합 효소 대체 또는 유전자 요법 대체가 NAGLU 결손 마우스의 뉴런에서 α-Syn PFF를 구제할 수 있는지 여부도 결정할 수 있다.

α-Syn PFF의 생성

재조합 단량체 α-Syn은 박테리아로부터 제조되고 확립된 프로토콜에 따라 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 순차적으로 정제된다. α-Syn의 원섬유 형태는 재조합 단량체를 37℃에서 약 72 내지 120시간 동안 교반한 다음, 특정한 분자량 컷오프 매개변수를 갖는 원심분리 필터 장치를 사용하여 크기를 선택하여 제조한다. PFF 생성 조건은 이전에 최적화되었다. PFF를 트리스 완충 NaCl에 희석하고 5 내지 10 DIV 후 배양된 1차 뉴런에 첨가한다. PFF 형질도입 및 파종은 노출 후 4 내지 7일째에 면역형광 또는 순차적 추출 및 면역블롯팅에 의해 확인한다. 내인성 α-Syn에서 유래된 비정상적인 α-Syn 응집체는 항 pSyn(Ser129) 항체, 클론 81A(Biolegend, MMS-5091)를 사용한 면역형광 및 웨스턴 블롯을 통해 검출한다. α-Syn PFF는 BSL2 시설에서 생산, 처리 및 폐기한다.

α-Syn PFF 트래피킹, 세포내이입 및 아세포 국재화

리소좀 프로세싱은 1차 뉴런에서 세포내이입된 α-Syn 원섬유의 주된 운명이다. PFF 처리된 뉴런은 시냅스전(CSPα), 세포내이입(EEA1), 자가포식소체(Rab7) 및 리소좀(LAMP1) 마커와 함께 염색되어 엔도-리소좀 경로에서 α-Syn 응집체의 트래피킹에 변화가 있는지 결정한다.

ALP 기능에 대한 효과 평가

α-Syn 응집체는 자가포식소체 제거를 감소시킴에 의해 전반적인 거대자가포식을 손상시킨다. 따라서, 자가포식 경로의 약리학적 조절(위에서 설명한 바와 같이)이 α-Syn 제거를 개선하는지 여부를 결정할 수 있다.

샤페론 매개 자가포식(CMA)에 대한 효과 평가

α-Syn은 샤페론 매개 자가포식(CMA)에 의해 분해되고 응집-경향성 α-Syn 돌연변이체는 CMA를 차단한다. 따라서, PFF-처리된 세포에서 LAMP2A 및 HSP70 단백질 수준이 영향을 받는지 여부를 결정할 수 있다. PFF 처리된 뉴런은 CMA 활성제로 처리하고; AR7(레틴산 수용체 알파 특이적 길항제) 및 α-Syn 수준은 세포 용해물 및 합성 배지에서 결정한다.

세포내이입 및 리소좀 막 완전성에 대한 영향

α-Syn PFF는 세포내이입 후 소포 및 리소좀 파열을 유도한다. 이러한 파열된 소포는 EEA1, LC3 및 갈락틴-3에 대해 양성이다. α-Syn PFF가 리소좀 막 완전성에 영향을 미치는지 여부는 Gal-3 및 LC3 염색에 의해 결정한다.

구제 실험

재조합 NAGLU는 흡수/결합 저해제(만노스-6-포스페이트: M3655, Sigma)의 존재 또는 부재 하에 αSyn에 노출시키기 전, 노출 중 및 후에 첨가하고, α-Syn PFF 응집에 대한 효과를 시험한다. 재조합 NAGLU는 시험관내에서 결손된 뉴런에 첨가하기에 이미 충분히 이용 가능하다. 제니스타인(4',5,7-트라이하이드록시이소플라본 또는 5,7-다이하이드록시-3-(4-하이드록시페닐)-4H-1-벤조피란-4-온)은 MPS 환자의 배양된 섬유아세포에서 글리코사미노글리칸(GAG) 합성을 저해하고 NAGLU-결손 마우스의 리소좀 저장 물질을 감소시킨다. 제니스타인은 시험관내 실험에서 기질 감소 작용제로서 사용된다.

예상 결과

시험관내에서 α-Syn PFF의 흡수, 트래피킹 및 응집에 대한 NAGLU의 유전자 투여량 효과가 있고, 이러한 효과를 재조합 효소가 구제할 것으로 예상된다. NAGLU-결손 세포는 세포막과 엔도-리소좀 시스템에 HS와 HSPG를 축적한다. 따라서, α-Syn PFF의 흡수 증가에 이어 세포내 소포 및 리소좀 막의 파괴가 예상되며, 이는 내인성 α-Syn의 세포기질 수준 및 모집을 증가시킬 것이다. 렌티바이러스 벡터가 생성될 수 있고 응집-경향성 α-Syn 돌연변이체는 NAGLU-결손 및 반접합성 마우스의 1차 뉴런에서 과발현될 수 있다. 그 다음, 응집 및 분해 속도가 평가될 수 있다. 대안적으로, 과발현성의 인간 A53T α-Syn 트랜스제닉 마우스로부터의 1차 뉴런을 사용할 수 있고, 이는 NAGLU 유전자의 선택된 변이체에 의해 형질도입될 수 있고 α-Syn에 대한 효과가 시험될 수 있다. NAGLU 유전자에 변이체를 운반하는 PD 환자로부터의 iPSc 유래 뉴런은 동종의 CRISPr 보정 세포와 비교하여 α-Syn 프로세싱에 미치는 상기 변이체의 효과를 비교하는 데 사용될 수 있다.

생체내 α-Syn 확산에 대한 NAGLU의 효과 결정

축적된 실험 데이터는 α-Syn의 세포간 전달이 프리온 단백질에서 관찰되는 것과 유사한 파종 원리를 따른다는 것을 나타낸다. 인간 A53T α-Syn을 과발현하는 어린 마우스(약 3 내지 4개월령)에게 응집된 α-Syn을 함유하는 뇌 추출물(루이소체 질환의 사례로부터 얻은 부검 유래 뇌 추출물)의 뇌내 주사는 주사 후 30일(dpi) 정도로 조기에 관찰되는, 숙주에 pSyn 병변 형성을 자극하고; 약 90 dpi 경에, pSyn은 뇌의 해부학적으로 연결된 영역에 널리 퍼지고 풍부하며, 이는 인간 PD 사례에서 관찰된 α-Syn 침착물의 명백한 확산과 매우 유사함을 시사한다(예를 들어, 도 15, 도 16a 및 도 16b, 및 도 17a 내지 도 17c 참조). 약 100dpi 경에, 마우스는 주사되지 않은 마우스에 비해 운동 기능장애 및 조기 사망(약 126dpi)을 발생시킨다. 합성(인간 또는 마우스) α-Syn PFF의 뇌내 주사는 또한 비-트랜스제닉(야생형) 숙주 마우스에서 LB-유사 병리 및 뉴런 변성을 유도했다(예를 들어, 도 15, 도 16a 및 도 16b, 및 도 17a 내지 도 17c 참조). LB를 동반한 치매 뇌의 불용성 pSyn을 주사한 야생형 마우스의 대략 50%에서 pSyn 병리가 발생했다. 대조적으로, 인간 및 마우스 α-Syn PFF에 의한 pSyn 병리의 유도 효율은 각각 90% 및 100%이다. 30 dpi에서, pSyn-양성 LB-유사 축적은 전적으로 주사 부위에 대해 동측성이었다(예를 들어, 도 15, 도 16a 및 도 16b, 및 도 17a 내지 도 17c 참조). 영향을 받은 동측 영역내뿐만 아니라 대측 신피질내의 LB/LN 병리는 90 및 180dpi에 조사된 마우스에서 현저하게 증가된 pSyn 면역반응성을 보여주었다. SN 치밀부(SNpc) α-Syn 병리는 PFF 주사 후 점진적으로 발달하여, 특히 복내측 SNpc 집단 중에서, 30dpi에 희미한 세포질 축적부터 90 및 180 dpi에 조밀한 핵주위 LB 유사 봉입체로 진화했다. 이와 동시에 SNpc 도파민성(DA) 뉴런은 90 및 180 dpi에 각각 15% 및 35%씩 감소했고, 이는 SNpc DA 뉴런 손실 전에 LB/LN이 형성됨을 암시한다. 따라서, LB/LN의 전파는 연결도-의존성이며, 병리학적 α-Syn의 축적은 SNpc DA 뉴런 손실의 상류이며 직접 연결된 것으로 나타난다. α-Syn PFF의 선조체내 주사의 이러한 생체내 모델은 세포내 LB/LN 병리의 축적, SNpc DA 뉴런의 선택적인 손실 및 손상된 운동 조화를 발생반복한다. LB와 LN은 둘 모두 HSPG를 함유한다. 그러나, 생체내 α-Syn 확산에 있어서 HS의 역할은 평가되지 않았다. 현재까지, NAGLU 활성의 감소와 결과적인 HSPG 축적이 α-Syn 응집 및 확산에 영향을 미치는지 여부는 명확하지 않다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, PD와 관련된 가장 유해한 NAGLU 변이체를 발현하는 NAGLU 결손 및 반접합성 마우스는 HS 및 HSPG 축적이 α-Syn 응집, 확산에 영향을 미치고 생체내 질환을 가속시키는지 여부를 시험하는 데 사용할 수 있다.

α-Syn PFF의 선조체내 접종

α-Syn PFF는 위에서 설명한 바와 같이 제조한다. α-Syn PFF의 선조체내 접종은 출생 시 AAV2/9-PHP.B를 사용하여 가장 유해한 NAGLU 변이체가 주사된 NAGLU-결손 및 반접합성 마우스(예를 들어, 도 19 참조) 및 NAGLU-결손 마우스, 반접합성 마우스 및 12마리의 야생형 마우스에서 수행된다. pSyn 응집체의 확산을 정량하여 α-Syn PFF가 NAGLU 마우스의 수명에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 3 내지 4개월령의 야생형, NAGLU-결손 또는 반접합성 마우스에게 마우스 αSyn PFF(또는 대조군으로서 PBS 또는 αSyn 단량체)를 등쪽 선조체(0.2㎜ A/P, 정수리점 대비 2.0㎜ M/L, 두개골 표면 3.2㎜ 아래)의 일측에 단회 접종으로 주사한다. 마우스를 회복시키고 주사 후 30일, 90일 또는 180일까지 노화되도록 하고, 각 시점에 뇌를 수확하고 항-pSyn(Ser129) 항체를 사용한 면역조직화학을 위해 처리한다. pSyn 공동국재화 염색은 항-유비퀴틴 및 HSP90을 사용하여 수행한다. 검정력 분석을 기반으로 할 때, pSyn 수준의 30% 증가를 검출하는 데에는 n=12마리의 마우스/그룹이 필요하다. (5개 그룹×12=60마리 마우스).

αSyn 및 pSyn 정량

피질, 해마, 선조체 및 뇌간은 각 동물의 반뇌에서 절제하고, 불용성 αSyn은 순차적인 세제 추출에 이어, 포획 항체로서 항-시누클레인-1/클론 42(BD Biosciences) 및 항-pSyn 81A(biolegend)를 사용하여, 이전에 공개된 바와 같이 ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 분리한다.

PFF- 및 PBS-처리 동물로부터 동측 및 대측 선조체의 면역블롯 분석은 이전에 공개된 바와 같이 티로신 하이드록실라제(TH) 및 도파민 수송체(DAT)에 대한 항체를 사용하여 수행한다(예를 들어, 도 17c 참조). SN의 뇌 위축 및 뉴런 손실도 평가하고, 손상 및 염증 마커(예를 들어, GFAP, Iba-1)에 대한 면역조직화학을 전술한 바와 같이 수행한다.

수명은 PFF 처리 동물과 PBS 처리 동물 간에 비교한다. 로타로드 및 와이어 매달림 시험은 α-Syn PFF 주사 후 6개월이 지난 야생형 마우스에서 운동 손상을 검출하는 데 가장 민감한 것으로 알려져 있다. LSD 마우스 모델에서 로타로드 및 와이어 매달림 행동 시험의 사용은 이전에 공개되어 있고 적절한 실험 설계 및 통계 도구(다중 그룹 비교를 위한 사후 분석을 사용한 ANOVA 및 쌍별 비교를 위한 스튜던트 t-시험)가 알려져 있다. PFF 및 PBS 처리 동물에서 보행 분석이 수행된다. 보행 분석은 LSD의 마우스 모델에서 "파킨슨병 유사" 징후를 포착하는 데 매우 민감하다는 것은 이전에 밝혀져 있다.

샘플 크기

로타로드 및 와이어 매달림 검정의 성능과 관련하여 한 번에 5개 그룹을 비교하기 위해, 정상 동물은 60초, NAGLU-결손 동물은 0초(40주)에서 수행하고, 표준 편차가 30초일 때, 효과 크기는 0.89이다. 효과 크기가 0.89, α= 0.05 및 검정력= 0.95인 경우, 그룹 간의 유의미한 차이를 검출할 수 있기 위해서는 6마리의 동물이 필요하다. 수명과 관련하여 수명 중앙값이 약 730일인 반접합성 동물 및 정상 동물과 약 322일인 NAGLU-결손 동물을 갖고 표준 편차가 20d인 5개 그룹간의 비교 시, 효과 크기는 5.51이다. 효과 크기가 5.51, α= 0.05, 검정력= 0.95인 경우, 그룹 간의 유의미한 차이를 검출할 수 있기 위해서는 2 내지 3마리의 동물만이 필요하다. 행동 및 수명 연구는 10 내지 12마리의 마우스/그룹이 사용되기 때문에 충분히 검정력이 있을 것이다.

예상 결과

α-Syn PFF 주사는 NAGLU-결손 마우스의 표현형을 가속화하여 신경교증, 신경퇴행을 증가시키고 운동 손상을 악화시키고 수명을 단축시킬 것으로 예상된다. 반접합성 NAGLU 마우스는 pSyn 병리의 전파를 악화시킬 것이다. 대안적으로, α-Syn 돌연변이를 운반하는 AAV2/9 벡터가 생성될 수 있고, 어린 NAGLU-결손 마우스의 선조체에 정위적으로 주사될 수 있거나, 과발현성 인간 A53T α-Syn 마우스를 NAGLU-결손 마우스에 교배시켜 pSyn 병리, 질병 진행 및 수명의 변화에 대해 관찰할 수 있다. 동일한 접근법을 SGSH-결손 마우스에게 적용할 수 있다.

실시예 5: 파킨슨병 발병에 관여하는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 기능장애에 기초가 되는 유전자 변이 식별

이 실시예는 PD에서 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자를 식별하고 시험관내에서 α-시누클레인 응집체 및 미토파지에 대한 특정 ALP 유전자의 기능적 효과를 결정하는 것을 설명한다.

파킨슨병(PD)과 특정 리소좀 축적 장애(LSD) 사이에 중복되는 임상, 병리학 및 유전자적 특징을 강조하는 증거가 부각되고 있고, 이는 공통적인 병원성 메커니즘을 시사한다. GBA, SMPD1 및 NPC1 유전자의 동형접합 기능상실 돌연변이는 LSD를 유발한다. GBA, SMPD1 및 NPC1의 이형접합성 저 빈도 암호 변이체는 PD 위험을 증가시킨다. 이러한 결과는 ALP 유전자의 완전 기능상실 변이체가 LSD를 유발하고 부분 기능상실 저 빈도 변이체가 PD의 위험을 증가시킨다는 것을 암시한다. 그러나, PD 발병 위험에 대한 ALP의 각 유전자의 유전자 변이의 기여 및 PD 발병에서의 그의 역할에 대한 체계적이고 포괄적인 평가는 수행되지 않았다. 현재 지식의 이러한 격차를 해결하기 위해, PD 발병 위험과 관련된 ALP 유전자(GBA 제외)의 희귀 기능 변이체를 식별하고 우선 순위를 정하는 강력한 접근법이 여기에 설명된다. 첫째, 33,350명의 비핀란드 유럽인 유래의 ALP의 각 유전자에 있는 희귀 기능 변이체의 부담을 2,700명의 PD 사례 및 2,000명의 대조군과 비교한다. 여기에 제시된 결과는 GBA, NAGLU 및 PPT1을 포함한 PD 환자의 적어도 6개의 LSD 유발 유전자에서 예측된 기능 변이체의 풍부함을 암시한다. 둘째, 세포 기반 분석을 사용하여 PD 위험과 관련된 NAGLU 및 PPT1 유전자의 선택된 변이체가 효소 활성, 단백질 안정성 및/또는 mRNA 수준에 미치는 효과 및 전반적인 리소좀 기능에 미치는 영향을 조사한다. α-시누클레인(α-Syn) 응집체 제거 및 미토파지에 대한 검증된 기능 변이체의 효과는 시험관내에서 평가한다. 또한, 내인성 α-Syn 응집체에 대한 NAGLU 및 PPT1 유전자의 유전자 투여량 효과는 α-Syn 사전-형성된 원섬유(PFF)에 노출 후 측정한다. 그 다음, 재조합 효소 대체가 NAGLU 및 PPT1-결손 마우스의 뉴런에서 α-Syn 사전-형성된 원섬유의 PFF 유도 독성을 약화시킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. 마지막으로, NAGLU 및 PPT1-결손 마우스의 1차 도파민성 뉴런에서 미토파지에 변화가 있는지 여부를 결정할 수 있다. 여기서, 설명된 연구는 PD 발병에서 ALP 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있으며, PD의 잠재적 치료를 위해 LSD에 대해 현재 시행되고 있는 치료 전략의 용도변경을 위한 기초를 수립할 수 있다.

여기에 설명된 연구의 목표는 파킨슨병(PD) 발병에 관여하는 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 기능장애의 기초가 되는 유전자 변이를 식별하는 것이다. 여기에 제시된 연구는 시험관내에서 α-시누클레인 응집체 및 미토파지에 대한 선택된 ALP 유전자의 기능적 검증과 인간 유전자 연구를 결합시키는 통합 프레임워크를 포함한다. 여기에 설명된 실험은 PD와 관련된 새로운 ALP 유전자를 밝혀낼 수 있다. 그들은 PD 발병에서 ALP 기능장애의 메커니즘에 대한 더 큰 통찰력을 제공할 수 있고 PD의 잠재적 치료를 위해 현재 리소좀 축적 장애에 대해 시행 중인 치료 전략의 용도변경을 위한 기초를 수립할 수 있다.

PD와 특정 리소좀 축적 장애(LSD) 간에 중복되는 임상적 및 유전자적 특징을 강조하는 증거가 부각되고 있고, 이는 가능한 일반적인 병원성 메커니즘을 시사한다. GBA, LRRK2, VPS35, SNCA, GAK, ATP13A2 및 RAB7L1을 포함한 여러 멘델성 및 PD 위험 관련 유전자는 자가포식-리소좀 경로(ALP)에 관여하고 그 변이체는 ALP 기능장애를 촉진한다. GBA, SMPD1 및 NPC1 유전자의 동형접합성 기능상실 돌연변이는 LSD를 유발한다. 흥미롭게도, GBA, SMPD1 및 NPC1의 이형접합성 저 빈도 암호 변이체는 PD의 위험을 증가시킨다. 이러한 결과는 ALP 유전자의 완전 기능상실 변이체가 LSD를 유발하고 부분 기능상실 저 빈도 변이체가 PD의 위험을 증가시킨다는 것을 암시한다. 고립된 집단에서 단일 ALP 유전자에 대한 연구는 PD와 LSD 사이의 유전자 중첩을 뒷받침한다. 그러나, PD 발병 위험에 대한 ALP의 각 유전자에 있는 유전자 변이의 기여 및 일반 집단 내에서 PD 발병에서의 그의 역할에 대한 체계적이고 포괄적인 평가는 수행되지 않았다.

(I) PD에서 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자 식별

ALP 유전자(GBA 제외)에서 시험되지 않은 희귀 기능 변이체가 PD의 위험을 증가시키는 것으로 가정한다. 여기에 설명된 바와 같이, 33,350개 대조군의 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 데이터(ExAc 데이터베이스, 비핀란드계 유럽인)를 분석하여 유럽 혈통(EA)의 개체에 대한 ALP의 각 유전자(약 430개)의 기준 유전자 변이를 수립한다. 다음으로, ALP 유전자의 유전자 기반 분석을 엑솜 칩, 게놈 전체(GWA) 및 WES 데이터를 조합한 PD의 사례 대조군 코호트(2,700개의 사례/2,000개의 대조군)에서 수행한다. 6개의 LSD 유발 유전자에서 예측된 희귀 기능 변이체의 풍부함은 이러한 PD 코호트에서 이전에 식별된 바 있다.

(II) 시험관내에서 α-시누클레인 응집체 및 미토파지에 대한 특정 ALP 유전자의 기능적 효과 결정

영아 뉴런 세로이드 지질갈색소증 또는 점액다당류증 IIIB 환자는 파킨슨병, 흑색질 퇴행 또는 루이소체 축적을 보인다. 또한, PD 환자의 DA 뉴런에서 N-아세틸-알파-글루코사미니다제(NAGLU) 및 팔미토일-단백질 티오에스터라제 1(PPT1) 유전자의 전사체 수준도 감소한다. (I)에 제시된 데이터와 함께 종합하면, NAGLU 및 PPT1 유전자를 선택하여 시험관내 PD 발병에 대한 관련성을 추가로 검증했다.

여러 엄격한 기준은 (I)에서 식별된 희귀 변이체가 잠재적으로 기능적임을 암시한다. 기능적 효과를 검증하기 위해 NAGLU 및 PPT1-결손 마우스의 1차 뉴런을 이전에 병원성으로 식별된 2개의 변이체를 포함하여 (I)에서 식별된 유전자당 가장 유해한 변이체로 예측되는 3개의 변이체를 운반하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨다. NAGLU 및 PPT1 유전자에서 선택된 변이체가 효소 활성, 단백질 및 RNA 수준에 미치는 효과를 측정한다. 전체 리소좀 기능에 대한 영향도 결정한다.

여러 약리학적 시험관내 및 생체내 연구는 ALP 기능장애가 응집된 α-시누클레인(α-Syn)의 제거 결함을 유발한다는 것을 암시한다. 그러나, 특정 ALP 유전자(GBA 제외)의 부재가 응집된 α-Syn의 리소좀 제거에 영향을 미치고 독성을 증가시키는지는 불분명하다. 여기서, NAGLU 및 PPT1 유전자의 부재가 내인성 α-Syn의 제거에 영향을 미치는지의 여부를 결정할 수 있는 연구가 설명된다. α-Syn은 NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 1차 뉴런에서 과발현되며 리소좀 제거 및 신경 독성에 대한 효과가 시험된다. 또한, NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 1차 뉴런에 첨가된 외인성 α-Syn 사전-형성된 원섬유(PFF)가 PFF 유도 신경독성을 악화시키는지 여부도 결정할 수 있다. 마지막으로, 재조합 효소 대체가 NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 뉴런에서 사전-형성된 α-Syn 원섬유의 독성을 약화시킬 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. α-Syn PFF의 생성 및 정제 조건은 이전에 최적화되었다. 야생형 해마 뉴런도 α-Syn으로 형질도입되었으며, 포스포-α-Syn 봉입체가 형광 및 웨스턴 블롯팅 방법에 의해 검출되었다.

기능장애 미토콘드리아는 PD의 발병에 기여한다. LSD의 리소좀 기능장애는 미토콘드리아 품질 관리 경로의 조절장애, 및 손상된 미토콘드리아의 축적과 관련이 있다. 미토파지는 PD 유발 유전자인 Parkin과 Pink1에 의해 매개된다. 그러나, 미토파지가 NAGLU 또는 PPT1 유전자의 부재에 의해 영향을 받는지, 그리고 Parkin/Pink1 경로와 관련이 있는지는 불분명하다. 여기에는 NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 1차 도파민성 뉴런에서 미토파지에 변화가 있는지 여부를 결정할 수 있는 연구가 설명된다.

의의

인간 게놈에는 자가포식-리소좀 경로(ALP)와 관련된 적어도 430개의 유전자가 있다(자가포식 유전자 38개, 자가포식 조절 유전자 161개, 리소좀 유전자 64개 및 리소좀 조절 유전자 167개). 모든 ALP 유전자의 38%(157개 유전자)의 돌연변이는 멘델병(OMIM)을 유발하며, 그 중 가장 많이 연구된 것은 고전적인 리소좀 축적 장애(LSD)이다. 신생아 5,000명 중 약 1명의 빈도로 그룹으로서 발생하는 적어도 50개의 별개의 LSD가 있다. LSD는 일반적으로 소아 장애로 간주되며 전형적으로 완전 기능상실(LoF) 돌연변이로 인해 발생한다. 그러나, 정상이하 변이체를 운반하는 LSD의 성인 발병 형태가 보고되었다. LSD는 단일유전자 장애이지만 복잡한 임상 특징을 나타낸다. 사실, LSD의 약 75%는 임상적으로 중요한 신경학적 구성요소를 가지고 있다.

PD와 특정 리소좀 축적 장애(LSD) 사이에 중복되는 임상적 및 유전자적 특징을 보여주는 증거가 부각되고 있으며, 이는 공통적인 병원성 메커니즘을 시사한다. GBA, SMPD1 및 NPC1 유전자의 동형접합 기능상실 돌연변이는 LSD를 유발한다. 흥미롭게도, GBA, SMPD1 및 NPC1의 이형접합성 저 빈도 암호 변이체는 PD의 위험을 증가시킨다. 이러한 결과는 ALP 유전자의 전체 기능상실 변이체가 LSD를 유발하고 부분 기능상실 저 빈도 변이체가 PD의 위험을 증가시킨다는 것을 암시한다. 고립된 집단에서 단일 ALP 유전자에 대한 연구는 PD와 LSD 사이의 유전자적 중첩을 뒷받침한다. 그러나, ALP의 각 유전자에서 유전자 변이가 PD 발병 위험에 미치는 기여 및 일반 집단 내 PD 발병에서의 그의 역할에 대한 체계적이고 포괄적인 평가는 수행되지 않았다.

신생아 선별 연구에 따르면, 리소좀 효소 활성 수준은 건강한 인간의 10배가 넘는 것으로 나타났다. GBA, NPC1, GALC, GAA, GLA 및 IDUA 유전자의 질병 유발 변이체의 이형접합 보인자는 대조군보다 상당히 낮은 수준의 효소 활성을 나타낸다. 또한, NPC1의 질병 유발 변이체의 이형접합 보인자는 니만 픽에서 영향을 받는 1차 경로의 하류에 유의적인 대사 이상을 나타낸다. 현재까지 이러한 대사 변경 및 ALP 기능장애의 장기적인 결과에 대한 체계적인 연구는 없다. 그러나, 여러 연구에 따르면 질병 유발 변이체의 이형접합 보인자는 신경퇴행성 질환의 위험이 더 높다는 것을 암시한다. 여기에 설명된 연구는 현재 지식의 여러 격차를 해결한다. 첫째, 대규모 데이터베이스로부터의 전체 엑솜 시퀀싱(WES) 데이터를 사용하여 유럽 혈통(EA)의 개체에 대한 ALP의 각 유전자의 기준 유전자 변이를 결정한다. 둘째, PD 사례에서 ALP의 각 유전자에 대해 희귀 기능 변이체의 누적 대립유전자 빈도를 분석하여 PD 발병 위험에 영향을 미치는 신규 유전자를 식별한다. 마지막으로, PD의 발병에서 이러한 후보 유전자의 역할을 시험관내에서 검증한다. PD에서 ALP 유전자의 특정 결함을 식별함으로써, 유전자 요법, 효소 대체, 경구 소분자 기질 감소 요법, 소분자 샤페론 및 PD의 잠재적 치료를 위한 자가포식 경로의 약리학적 치료를 포함하여 LSD 치료를 위해 현재 시행 중인 여러 치료 전략을 활용할 수 있다. 이러한 데이터는 생체내에서 이러한 ALP 유전자의 역할을 결정하기 위해 설계된 보다 철저한 실험의 기초를 형성할 것이다.

혁신

PD에서 ALP 유전자의 유전자 변이에 대한 현재의 지식 상태는 GBA 유전자 연구에 의해 좌우된다. 여기에 설명된 연구는 ExAC(Exome Aggregation Consortium)(n = 약 61,000)의 WES 데이터에 대한 대규모 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 및 PD 사례(n = 약 2700) 및 대조군(n = 약 2000)에 대한 사내 WES 및 엑솜 칩 데이터에서 PD 발병 위험에 대한 ALP의 각 유전자의 유전자 변이의 기여를 체계적이고 종합적으로 평가한다. 이러한 여러 데이터세트를 사용하여 PD와 관련된 ALP 기능장애의 유전자 구조를 밝혀낼 수 있는 분석 세트가 설계되었다.

PD 발병에서 특정 ALP 유전자의 역할에 대한 일치된 의견은 없다. 이는 부분적으로 대부분의 유전자 연구가 소수의 유전자(예를 들어, GBA, SMPD1 및 NPC1)에 초점을 맞추고 있고 세포 기반 연구는 고전적인 발현 시스템과 약리학적 접근법을 사용한다는 사실 때문이다. 또한, 이들 연구 중 다수는 적절한 PD 경로(α-Syn 응집 대 미토파지)를 평가하지 않는다. 여기에 설명된 연구는 시험관내에서 선택된 ALP 유전자의 기능적 효과를 검증하기 위해 전산 방법과 실험 데이터를 결합시킨 통합 프레임워크를 포함한다. 세포 기반 검정은 생화학적 데이터, 생세포 검정, 인간 PD 사례 및 대조군에서 게놈 전체 유전자 발현 데이터, 상이한 단계에서 인간 PD 사례로부터 얻은 게놈 전체 유전자 발현 데이터, PD 마우스 모델로부터의 게놈 전체 유전자 발현 데이터에 의해 보완된다. 이 연구의 목표를 달성하기 위해 LSD 및 PD에서 입증된 생산성 기록과 함께 공동 팀이 모집되었다.

실험적 접근

PD의 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자

자가포식-리소좀 유전자 세트(약 430개 유전자) 목록은 공개 데이터베이스(생물정보학 분석 참조) 및 문헌의 기존 주석을 마이닝하여 수동으로 편집되었다. ALP 기능장애의 가장 잘 연구된 모델은 LSD이다. LSD는 동형접합 LoF, 복합 이형접합 돌연변이 또는 카피 수 변이(CNV)에 의해 유발되는 멘델 질환의 유전자적으로 불균일한 그룹이다. 60,000개 초과의 시퀀싱된 엑솜이 함유된 ExAC 데이터베이스를 사용하여 폭넓은 민족성 표본에서 LSD를 유발하는 변이체의 빈도를 추정했다. LSD 유발 유전자는 NPC2 유전자에서의 32개에서부터 GAA 유전자에서의 423개까지 광범위한 단백질 변경 변이체를 나타낸다. 이러한 변이체의 대부분은 이형접합 상태에서 정상이하 변이체로서 작용할 가능성이 있는 LoF로 예측된다. PD 샘플의 대부분은 유럽 혈통인 것이다. 따라서, 여기에 제시된 분석은 비핀란드계 샘플(NFE, 약 33,000명의 개체)에 있는 LSD 유발 유전자(n=46)에 초점을 맞춘다. NCBI ClinVAr 데이터베이스에는 약 2740개의 LSD 유발 변이체가 보고되어 있다. ExAc 샘플에서 주석이 달린 LSD 유발 변이체는 288개이다: 76%는 미스센스 변이체이고, 10%는 대체 스플라이싱에 영향을 미치며 및 12%는 넌센스 돌연변이이다. 대부분의 LSD 유발 변이체는 SIFT에 의해 유해성(87%)이며, polyphen2에 의해 손상성(84%)인 것으로 예상된다. LSD 유발 변이체의 대부분(73%)은 고도로 보존된 뉴클레오타이드(GREP 점수>4)에 위치한다. 유전자당 이러한 변이체의 누적 소수 대립유전자 빈도(cMAF)(이형접합체 보인자 수)는 CSTD 유전자의 경우 1.50E-⁰⁵에서부터 NPC2 유전자의 경우 0.003까지이다. 따라서, 1×10^-3의 cMAF 임계값은 일반 집단에서 이보다 더 빈번한 변이체가 침투상이 높은 변이체라고 예측할 수 없기 때문에 보존적인 상한으로서 적용했다.

발견 샘플은 PPMI 코호트에서 331개의 관련 없는 PD 사례의 WES 데이터로 구성되었다. 표 9는 PD와 관련된 상위 LSD 유발 유전자를 보여준다.

이들은 ExAc 샘플에서 LSD 유발 변이체를 정의하는 특징을 기반으로 하는 포함 및 제외 기준을 사용하여 분석하였다. 예상된 바와 같이, NFE ExAC 데이터세트의 유전자 특이적 cMAF는 사내 PD 데이터베이스의 cMAF와 매우 일치했다(PPMI r²=0.92; WUSTL r²=0.96). 포함 기준을 충족하는 각 LSD 유발 유전자의 변이체(n=46)는 유전자별로 대조되었다: 82%는 미스센스 변이체이고 15%는 대체 스플라이싱에 영향을 미치고 3%는 넌센스 돌연변이이다. 희귀 단백질 변경 변이체의 부담(cMAF)은 대조군 및 ExAC에서 관찰된 부담과 비교했다. 이러한 유전자의 대부분은 대조군에 비해 사례에서 변이가 과도하지만, 사내 대조군과의 연관성은 발견되지 않았다. ExAc 샘플의 cMAF와 비교할 때 7개의 유전자가 엄격한 다중 시험 보정 임계값 p<1.0×10^-3(0.05/50)을 통과했으며, 3개의 LSD 유발 유전자가 유전자 수준 유의적인 임계값 p<2.4×10^-6(0.05/20,000)을 통과했다(예를 들어, 표 9 참조). 다음으로, 인간-엑솜 칩을 사용하여 데이터를 얻은 490개의 PD 사례를 포함하는 추가 코호트(WUSTL)를 사용하여 표 9에 나열된 결과를 반복했다(예를 들어, 표 10 참조).

예상한 바와 같이, 7개의 유전자는 엑솜-칩 데이터가 있는 샘플에서 반복되었다(예를 들어, 표 10 참조). 특히, 반복 샘플에서 발견된 연관성은 동일한 방향이고 효과 크기도 동일하다. 이러한 유전자적 발견을 뒷받침하는 것으로서, PD 및 흑색질(SN)의 탈색소화가 PPT1에 돌연변이가 있는 환자에서 보고되었다. NAGLU 유전자에 돌연변이가 있는 MPS IIIB 환자에서는 SN 병리 및 루이소체 축적이 보고되었다. 또한, NAGLU 및 PPT1 유전자의 전사체 수준의 감소는 대조군에 비해 PD 환자의 흑색질로부터의 DA 뉴런에서 발견되었다(예를 들어, 도 2, 도 20 참조)(GEO 데이터베이스; 시리즈 GDS2821). 따라서, 변이체의 병원성(ClinVar 데이터베이스), 일반 집단(ExAc) 및 PD 사례에서의 빈도 및 단백질에 대한 효과의 인 실리코(in silico) 예측에 대한 이전에 공개된 데이터를 기반으로 하여, NAGLU 및 PPT1 유전자 각각에 있는 3개의 변이체를 선택하여 기능 분석을 수행하였다(예를 들어, 표 11 참조).

αSyn PFF의 제조 및 사용은 이전에 뉴런 배양물에서 최적화되었다. αSyn PFF는 시험관내에서 7일(DIV) 째에 야생형 마우스의 1차 피질 뉴런에 첨가했다. 처리 7일 후, 뉴런을 고정시키고 p-α-syn 특이 항체로 염색하였다. PFF는 내인적으로 발현된 α-syn을 비정상적인 인산화된 불용성 응집체 내로 모집시켰다(예를 들어, 도 3a 및 도 3b 참조). α-syn 응집체는 초기에 시냅스전 말단 및 축삭에서 작은 점상 봉입체로서 나타났다(예를 들어, 하단 우측 패널, 도 3a 참조). 응집체는 성장하여 루이소체 신경돌기와 유사하게 더 길고 구불구불한 외관이 되었다(예를 들어, 하단 왼쪽 패널, 도 3a 참조). 도 3b는 PBS-처리된 대조군 뉴런이 단량체성 α-syn에 상응하는 15kDa를 약간 초과하는 밴드를 나타내었음을 보여준다. PFF로 처리된 뉴런에서 더 높은 분자량을 가진 여러 밴드가 나타났다. 이러한 추가 밴드는 α-syn 올리고머에 해당할 가능성이 있다. 이것은 α-syn 응집에 대한 리소좀 기능장애의 효과를 연구하기에 다루기 쉬운 시험관내 시스템이다.

연구 설계 및 방법

(I) PD에서 희귀 기능 변이체가 풍부한 ALP 유전자 식별

ALP 유전자에서 시험되지 않은 희귀 기능 변이체가 PD 발병 위험에 영향을 미치는 것으로 가정한다. 여기서, 통합 접근법은 ALP의 후보 유전자의 우선순위를 정하기 위해 대규모 데이터세트(사내 및 공개적으로 이용가능한 데이터베이스 모두)에 있는 ALP 유전자에서 예측된 희귀 기능 변이체의 분석을 PD 위험에 연루 증거와 조합하여 설명한다. (I)에 대한 방법론 및 실험 설계가 이하에 설명된다.

샘플 및 데이터 수집

여기에 제시된 바와 같이, LSD 유발 유전자는 PD에서 분석되었다. 다음 데이터세트는 또한 PD에서 380개의 추가 ALP 유전자의 역할을 결정하는 데 사용된다.

PPMI(Parkinson's Progression Markers Initiative): PPMI 데이터세트에 대한 유전자적, 표현형 및 역학적 데이터는 PPMI 웹사이트에서 이용가능하다. 모든 PPMI 샘플에 대해 GWAS, 엑솜-칩 및 WES 데이터가 수득되었다(예를 들어, 표 12 참조).

이 데이터세트는 이전에 여러 연구에서 사용되었다. CSF Aβ, 타우 및 α-시누클레인 수준은 모든 참가자에 대해 이용가능하다.

워싱턴 대학의 운동 장애 클리닉(MDC): 3000개 초과 샘플에서 얻은 임상, 유전자 및 DNA 데이터를 포함하는 샘플은 MDC에서 액세스할 수 있다. 이러한 샘플에 대해 GWAS 및 엑솜 칩 데이터는 이미 수득되어 있다(WES는 아님)(예를 들어, 표 12 참조). CSF Aβ, 타우 및 α-시누클레인 수준은 현재 300명의 참가자에 대해 이용가능하다. 추가 PD 사례 및 대조군은 MDC 클리닉을 통해 모집할 수 있다. MDC 클리닉은 매주 평균 10명의 새로 진단된 PD 환자를 평가한다. 연간 약 500명의 새로운 PD 사례 및 대조군이 모집될 수 있는 것으로 추정된다. 새로 모집된 모든 개체에 대해 DNA 및 GWAS 및 엑솜 칩 데이터가 수득된다.

나바라 대학(UN)의 운동 장애 유닛: PD에 대한 총 654건의 사례와 550건의 대조군에 대한 임상 데이터 및 유전자 물질이 액세스될 수 있고, 이는 그 다음 여기에 제시된 미국계 유럽인 코호트에서 결과를 반복하는 데 사용된다. 이 모든 샘플에 대해 GWAS 및 엑솜 칩 데이터가 생성된다. WES/WGS는 유전형을 기반으로 하여 선택된 참가자에 대해 생성된다. PD 임상 진단은 UK Brain Bank 기준을 기반으로 한다. 모든 참가자에게 등록 전에 사전 서면 동의서를 받다. 이 세 인구의 인구 통계학적 특성은 이전에 공개되었다.

희귀 변이에 대한 대립유전자 빈도 임계값 정의

LSD 유발 변이체의 가장 높은 MAF, SIFT, Polyphen2 또는 GERP 점수를 포함한, LSD 유발 변이체의 분석에서 얻은 정보를 사용하여 다음 포함 기준을 정의했다: 1) PD 사례에서 호출률>98%, 2) 변이체당 MAF<0.01%, 3) ExAc 또는 Ensemble에 의해 미스센스로서 주석이 달린 지정된 표준 전사체에서 오로지 가능한 단백질 변경 변이체, 4) 프레임이동, 5) 넌센스, 6) 스플라이스 공여자 및 수용자 영역에 영향을 미치는 변이체, 및 7) NCBI ClinVar 데이터베이스에서 병원성의 증거가 있고 3' 또는 5' UTR 영역에 위치하는지 여부. ExAC에서 찾을 수 없는 변이체, 또는 NCBI ClinVar 데이터베이스에 없거나 MAF가 0.01% 초과이거나, 또는 ExAC 및 ClinVar에서 잘못호출한 동일한(synonymous) 인트론성 3' 또는 5' UTR 변이체는 제외했다. 집단별 변이체가 이 분석에 교란 효과가 없도록 하기 위해 주요 성분 결과를 기반으로 하여 개체를 선택했다(집단 구조 분석 참조).

데이터는 ExAC(버전 0.3.1, 2016년 6월)에서 다운로드함.

30배 초과의 서열 깊이 중앙값까지 커버되는 높은 비율의 암호 영역을 갖는 유전자만 및 오로지 고품질(PASS 필터) 변이체만이 이 분석에 포함되었다.

GWAS, QC 및 대치

WUSTL 및 PPMI 샘플은 Illumina 610, Omniexpress 칩 또는 HumanCoreExome으로 유전형에 대해 분석되었다. 엄격한 QC가 유전형 데이터에 적용되었다. (1) 유전형분석 성공률이 SNP당 또는 개체당 98% 미만인 경우, (2) 하디-바인베르크 평형(HWE)(p<1×10^-6) 또는 (3) MAF 또는 결측값 <0.05인 경우에는 SNP를 떨어뜨렸다. QC는 유전형 칩을 기반으로 하여 별도로 수행했다. 낮은 품질의 SNP 및 개체를 제거한 후, 1,000개의 게놈 프로젝트(3단계 출시)의 참조 반수체형과 함께 SHAPEIT-Impute2 정보루트를 사용하여 유전형 대치(genotype imputation)를 수행했다. 유전형 대치는 사용된 유전형 플랫폼을 기반으로 별도로 수행되었다. 정보-점수 품질이 0.3 미만이고 Impute2에서 보고된 사후 확률<0.9 또는 HWE 이상치인 SNP는 제거되었다. 추가 샘플은 Illumina NeuroX2 어레이에 의해 유전형이 분석된다. 이것은 맞춤형 Illumina HumanCore Exome 어레이이다. Illumina HumanCore Exome은 대치용으로 선택된 약 226,000개의 공통 SNP와 또 다른 225,000개의 암호 마커를 함유한다. NeuroX2 어레이는 또한 PD에 대해 알려진 보고된 병원성 변이체와 PD에 대한 GWAS에서 p 값이 10^-3미만인 모든 신호에 대한 태그화된 SNP를 모두 포함하는 또 다른 사용자 지정 콘텐츠를 함유한다. 또 다른 유전형 샘플에 대한 QC 및 대치는 동일한 정보루트를 따른다. 또한, 모든 샘플은 HRC 정보루트를 사용하여 재-대치될 수 있다.

엑솜 칩 QC

앞서 설명한 Illumina Exome 칩 데이터 호출에 대한 모범 사례를 사용하여 유전형 호출이 이루어졌다. 엑솜 칩에 대한 QC는 GWAS에서 사용되는 QC 단계와 유사하지만, 낮은 MAF로 인해 변이체는 제거하지 않았다. 엑솜 칩에 대한 원시 데이터는 수득되어 있으므로, 단일 변이체 또는 유전자 수준에서 임의의 유의적인 연관성에 대해 클러스터를 점검할 수 있다.

전체 엑솜 시퀀싱 데이터

QC 및 변이체 호출에 사용된 방법은 여기에 설명된 연구에 사용될 수 있다. 간단히 말해서, Agilent의 SureSelect를 사용하여 엑솜 라이브러리를 제조한다. 서열 데이터는 150x2 페어드 엔드 리드로 HiSeq4000에서 생성되는데, 적용범위의 평균 깊이는 최소 30x이다. 정렬은 GRCh37.p13 게놈 기준에 대해 수행되며, 이는 이 버전의 게놈에 대한 GATK 지원에 따라 GRCh38로 변경될 수도 있다. 변이체 호출은 GATK의 3.6 Best Practices에 따라 수행된다. WES 서열은 GATK의 권장 사항에 따라 정렬되고 개별적으로 변이체 호출된다. 99.9 초과 부분에 속하는 변이체 및 삽입-결실만이 분석을 위해 고려된다: 대립유전자 균형(AB=0.3-0.7), 품질(QUAL ≥30), 리드 깊이(DP≥10) 및 결측값(유전자=0.02)에 대해 변이체 임계값이 설정된다. 하디 바인베르크 평형에서 벗어난 변이체(P<1×10^-6) 또는 사례와 대조군 사이에 차등 결측값이 있는 변이체는 분석에서 제거한다. 또한, 누락 변이체가 2% 초과이고, 유전형 데이터가 임상 데이터베이스에서 성별 불일치를 나타내는 개체는 데이터세트에서 제거된다. 마지막으로, 개체 및 가족 관련도는 PLINK1.9 및 이러한 개체에 대한 기존 GWAS 데이터세트를 사용하여 확인한다. 변이체의 기능적 영향 및 집단 빈도는 SnpEff로 주석을 단다.

집단 계층화

Eigenstrat와 HapMap 샘플을 앵커로 사용하여 주요 구성 요소 분석을 수행하여 자체 보고된 인종/민족성을 확인했다. 집단 계층화로 인한 거짓 연관성을 피하기 위해 유럽 혈통의 개체만이 포함되었다.

주석

SNP 주석은 SeattleSeq, Exome Variant Server, SNP Function Annotation Portal 및 PharmGKB를 사용하여 단다.

부담 시험

희귀 변이체와 연관성을 분석하기 위해 이전에 개발된 검증된 통계 방법을 사용한다. 간단히 말해서, 유전자 기반 방법은 영역 내의 희귀 변이체를 단일 값으로 축소한 다음, 영역 내의 희귀 변이체와 관심 형질 간의 연관성을 시험한다. 서열 커널 연관 시험(SKAT)을 사용하여 유전자 영역 내의 희귀 변이체와 상태 간의 연관성을 시험한다. 이 방법은 이전 연구에서 성공적으로 사용되었다.

여기에 제시된 결과와 검정력 계산은 유전자 기반 분석에서 2.7 초과의 평균 승산비를 감지하기에 충분한 검정력이 있음을 시사한다. ALP 유전자의 연관성이 사례 대조군 설계에 의해 반복되지 않는다면, 내적표현형 설계가 사용될 수 있다. 따라서, ALP 유전자의 공통 또는 희귀 변이체가 α-시누클레인의 뇌척수액(CSF) 수준에 영향을 미치는지의 여부를 시험할 수 있다(800명의 개체). 게놈 통계응집 데이터베이스(Genome Aggregation Database)(126K 엑솜)는 일반 집단에서 ALP 유전자 선별을 보완하는 데 사용된다.

(II) 시험관내 α-시누클레인 응집체 및 미토파지에서 특정 ALP 유전자의 기능적 효과 결정

여러 ALP 유전자의 특정 결함이 PD 발병에 기여하는 것으로 가정한다.

(II)(a)에 대한 방법론 및 실험 설계는 아래에 설명된다. 이 방법론을 사용하여 NAGLU 및 PPT1 유전자에서 선택된 변이체가 효소 활성, 단백질 및 RNA 수준, 리소좀 기능에 미치는 효과를 결정할 수 있다.

(II)(a) 개요

(I)에서 식별된 PD와 관련된 각 ALP 유전자의 모든 변이체를 평가하는 것은 여기에 설명된 연구의 범위를 벗어나는 것이다. 따라서, 목표 1에서 식별된 3개의 변이체에 초점을 맞춘다(예를 들어, 표 11 참조). NAGLU 및 PPT1 유전자(2개는 이전에 병원성 변이체로서 식별됨)에서 잠재적인 기능적 변이체를 선택하기 위해 엄격한 기준이 사용되었다. 그러나, mRNA 안정성, 단백질 수준 및 효소 활성에 미치는 그들의 영향을 특성화하는 것이 중요하다. 그렇게 하기 위해, NAGLU 및 PPT1 넉아웃 마우스로부터의 1차 세포를 생성하고 표 11의 변이체로 형질도입시키고 효소 활성, 단백질 및 RNA 수준에 대한 그들의 효과를 결정한다. 리소좀 기능에 대한 효과도 결정한다. NAGLU 및 PPT1 유전자의 cDNA는 박테리아 및 포유동물 세포 모두에서 발현시키기 위한 플라스미드에서 이미 수득되었다. 선택된 변이체는 부위 지시성 돌연변이유발 키트(QuikChange II(Agilent Technology, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)를 사용하여 조작된다.

렌티바이러스 생성

야생형 및 돌연변이 cDNA는 퓨로마이신 내성 유전자를 운반하는 pLenti-III-PGK 벡터(Applied Biological Materials Inc, 캘리포니아 리치몬드 소재)에 서브클로닝한다. 결과적으로 수득되는 벡터를 VSV-G, Gag-Pol 및 Rev를 암호하는 플라스미드와 함께 이전에 설명한 바와 같이 HEK-293T 포장 세포에 공동 형질감염시킨다. 바이러스 상청액은 이전에 공개된 프로토콜에 따라 수집한다. 세포를 농축되지 않은 바이러스 상청액에 24시간 동안 노출시키고 세포를 4주 동안 5 ㎍/㎖의 퓨로마이신으로 선택한다. 1차 뉴런 배양물은 이전에 설명한 바와 같이 수행한다.

mRNA 및 단백질 수준의 효과

정량적 실시간 PCR은 mRNA 수준 및 스플라이싱에 대한 선택된 변이체의 효과를 시험하기 위해 특정 프라이머를 사용하여 수행한다. 웨스턴 블롯은 항-PPT1(GeneTex) 및 항-NAGLU(ab137685, Abcam) 항체로 수행한다.

세포 용해물 기반 리소좀 효소 활성

효소 활성에서 변이체의 효과를 결정하기 위해, NAGLU 및 PPT1 활성에 대해 이전에 설명한 바와 같이 형광 검정을 수행한다. 간단히 말해서, 4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-α-글루코사미니드(NAGLU) 및 4-메틸움벨리페릴-6-티오팔미토일-β-d-글루코시드(PPT1) 절단은 Hitachi F-2000 형광 분광분석기(Hitachi, 캘리포니아주 플레즌튼)에서 448㎚ 방출 및 365㎚ 여기에서, 0.02 내지 5mM의 4-메틸움벨리페론(Sigma, 미주리 세인트루이스) 범위의 표준 곡선을 사용하여 측정한다.

리소좀 기능

유세포 분석을 사용하여 세포당 산성 구획의 수를 정량하기 위해 Lysotracker를 사용하여 변이체가 전체 리소좀 기능에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 리소좀 막 완전성은 LLOMe 1mM에 이어 갈락테인-3 염색(sc-23938)에 의해 모니터링한다.

(II)(b)에 대한 방법론 및 실험 설계는 아래에 설명된다. 이 방법을 사용하여 α-Syn 응집에 대한 NAGLU 및 PPT1 유전자의 효과를 결정할 수 있다.

(II)(b) 개요

NAGLU 및 PPT1 결손 및 반접합성 마우스의 1차 피질 및 해마 뉴런에서 내인성 α-Syn의 제거에 변화가 있는지 여부를 결정할 수 있다. 렌티바이러스 벡터를 사용하여 NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 1차 뉴런에서 α-Syn을 과발현시키고 제거 및 신경독성에 대한 효과를 시험한다. 1차 뉴런에서 α-Syn 응집체(봉입체)의 비율 및 수준은 외인성 α-Syn 사전-형성된 원섬유(PFF)로 처리한 후 NAGLU 및 PPT1-결손 마우스로부터 결정한다(예를 들어, 도 3a 및 도 3b 참조). 마지막으로, 재조합 효소 대체가 NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 뉴런에서 α-Syn 사전-형성된 원섬유의 독성을 약화시킬 수 있는지 여부를 결정한다.

알파-시누클레인(αSyn) 사전-형성된 원섬유(PFF) 생성

PFF 생성 조건은 이전에 최적화되었다. 마우스 및 인간 야생형 αSyn 단량체 단백질은 이전에 설명한 바와 같이 에세리치아 콜라이에서 생산한다. 간단히 말해서, BL21 DE3 RIL 컴피턴트 E. 콜라이를 pRK172 박테리아 발현 벡터에 클로닝된 αSyn으로 형질전환시킨다. 박테리아 펠릿을 고염 완충액에 재현탁시키고 Kontes 균질화기를 사용하여 균질화하고 초음파처리하고 비등시켜 원하지 않는 단백질을 침전시킨다. 생성된 용해물을 원심분리하고 상청액을 투석하고 크기 배제 및 음이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. αSyn PFF를 생성하기 위해 단량체 단백질을 37℃에서 72시간 동안 1000rpm으로 진탕하는 Thermomixer에서 Tris-완충 NaCl에서 5mg/mL 농도로 항온처리한다. 최종 PFF 농도를 결정하기 위해, 생성된 PFF 현탁액의 소량의 분취물을 15분 동안 17,000×g에서 원심분리하고, 상청액의 총 단백질 농도를 BCA 분석에 의해 결정하고, 진탕하기 전에 취한 분취물의 농도에서 공제한다. PFF를 트리스 완충 NaCl에 희석하고 5 내지 10 DIV 후 배양된 1차 뉴런에 첨가한다. PFF 형질도입 및 파종은 노출 후 4 내지 7일에 면역형광 또는 순차적 추출 및 면역블롯팅에 의해 확인한다. 내인성 α-syn에서 유래된 비정상적인 α-syn 응집체는 항-포스포-α-시누클레인(Ser129) 항체, 클론 81A(Biolegend, MMS-5091)를 사용한 면역형광을 통해 검출한다. PFF 처리된 뉴런은 시냅스전(CSPα 또는 SNAP-25), 세포내이입(EEA1), 자가포식소체(Rab7) 및 리소좀(LAMP1) 마커로 공동염색한다. 리소좀에 αSyn 응집체의 풍부함이 있는지 여부를 결정한다. 아세포 분획화는 조직 및 배양된 세포를 위한 리소좀 농축 키트(Lysosome Enrichment Kit for Tissue and Cultured Cells, Thermo Scientific)를 사용하여 수행하고, LAMP1, Rab7 및 EEA1을 리소좀, 후기 및 초기 엔도솜 마커에 대한 대조군으로서 사용한다.

거대자가포식의 약리학적 조절

여기에 설명된 바와 같이, 자가포식 경로의 약리학적 조절이 α-Syn 제거를 개선하는지 여부를 결정할 수 있다. 형질도입 및 PFF 처리된 세포는 자가포식 시스템(토린1, 3-메틸아민, 브레펠딘 A 및 스파우틴-1) 및 샤페론 매개 자가포식(AR7)의 활성제 및 저해제로 처리한다. LC3 및 p62의 웨스턴 블롯은 거대자가포식 활성화의 간접 지표로서 사용된다. 클로로퀸, 염화암모늄(NH₄Cl) 및 류펩틴과 같은 리소좀향성 작용제는 양성 대조군으로서 사용한다.

재조합 효소

시험관내에서 결손 뉴런에 첨가하기 위한 충분한 재조합 NAGLU 및 PPT1은 이미 수득되어 있다. 효소는 흡수/결합 저해제(만노스-6-포스페이트: M3655, Sigma)의 존재 여부에 관계없이 αSyn PFF에 노출 전, 노출 중 및 노출 후에 첨가한다.

(II)(c)의 방법론 및 실험 설계는 아래에 설명된다. 여기에 설명된 바와 같이, 이 방법론은 미토파지에 대한 NAGLU 및 PPT1 유전자의 효과를 결정할 수 있다.

(II)(c) 개요

여기에 설명된 바와 같이, NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 1차 도파민성 뉴런에서 미토파지에 변화가 있는지 여부를 결정할 수 있다. 1차 도파민성 뉴런 배양은 이전에 설명한 바와 같이 수행한다.

미토파지 검정

세포는 20μM 카보닐 시안화물 m-클로로페닐하이드라존(CCCP)(SIGMA, C2759) 및/또는 바필로마이신 A1(Sigma, B1793)의 존재 또는 부재하에 12 내지 24시간 동안 항온처리한다. MitoTracker 및 JC-1 염료 및 LC-3, SQSTM1 및 LAMP-1 단백질과의 공동국재화는 미토파지를 평가하는 데 사용된다. 미토콘드리아 단백질(TOM20, 사이토크롬 c, 복합체 III(C-III) 코어 1, TIM44) 분해는 웨스턴 블롯팅에 의해 검출한다. Parkin 및 Pink1 수준은 NAGLU 및 PPT1 결손 마우스의 1차 도파민성 뉴런에서 qPCR 및 웨스턴 블롯팅에 의해 확인한다.

대안적으로, CRISPr 기술과 같은 게놈 편집 방법을 사용하여 NAGLU 및 PPT1 유전자에서 선택된 변이체를 도입시키고 위에서 설명한 기능 검정을 수행할 수 있다. 전체 리소좀 활성은 α-Syn PFF의 존재 하에 TFEB를 과발현함으로써 증가할 수 있다. 전자 현미경을 사용하여 미토파지에 대한 효과를 측정할 수 있다. 이 프로젝트에서 생성된 데이터는 생체내 PD 발병에서 NAGLU 및 PPT1 유전자의 역할을 결정하기 위해 설계된 것보다 철저한 실험의 기초를 형성할 것이다.

실시예 6: 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)에 대한 신규 치료 분자 표적의 식별

이 실시예는 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD) 치료를 위한 새로운 치료 표적의 식별을 설명한다.

본 명세서에 개시된 바와 같이, 알츠하이머병 환자의 샘플에서 적어도 12개의 리소좀 유전자에 효과 크기가 큰(OR>2.5) 예측된 기능적 변이체의 풍부함이 식별되었다.

대략 10명 중 1명은 일생의 어느 시점에서 치매를 앓게 된다. 현재 일부 형태의 치매를 앓고 있는 미국인은 800만 명이 넘다. 이 숫자는 인구가 노령화됨에 따라 급격히 증가할 것으로 예상된다. 치매 환자의 60 내지 80%(약 5백만)는 알츠하이머병(AD)의 임상 진단을 받을 것이다. 그러나, AD로 진단된 환자의 절반만이 실제로 AD 유사 병리를 가질 것이다. 따라서, 약 250만 명의 미국인은 임의의 알려진 분류에 맞지 않는 치매 형태를 가지고 있다. 파킨슨병(PD)은 AD에 이어 두 번째로 가장 흔한 신경퇴행성 질환으로서, 현재 100만 명의 미국인이 PD를 갖고 산다.

심각한 리소좀 기능장애가 여러 신경 퇴행성 질환, 특히 AD 및 PD에서 역할을 할 수 있다는 증거가 증가하고 있다. 현재 리소좀 유전자의 완전 또는 거의 완전한 기능상실 변이체가 병인을 알 수 없는 치매의 사례와 연관이 있을 것으로 여겨지고 있다. 이 시점에서 몇 개의 단일 리소좀 유전자는 고립된 집단에서 AD 또는 PD와 연관이 있었다. 리소좀 유전자 유해한 변이체의 빈도는 AD(n=1,394) 및 PD 환자(n=821)와 유럽 태생의 대조군 개체(n>33,000)의 대표적인 샘플과 서로 직접 비교되었다. 매우 엄격한 통계 방법을 사용하여, 각각 AD 및 PD 사례에서 상당히 과발현되는 20개 및 8개의 리소좀 유전자에서의 희귀 기능 변이체가 확인되었다(예를 들어, 표 13 및 표 14 참조). 유전자 분석에서 식별된 희귀 변이체만의 계산된 보인자 빈도를 감안할 때, 540만 명의 AD 환자 중 최소 3%와 100만 명의 PD 환자 중 2%가 해당 유전자에 결함이 있을 수 있는 것으로 추정된다. 리소좀 유전자에 결함이 있는 AD 및 PD 환자의 실제 수는 훨씬 더 많을 수 있다.

리소좀 축적 질환(LSD)은 적어도 50개의 별개의 질병을 포함하는 유전성 대사 질환의 비교적 큰 부류이다. 이 질환은 단일 리소좀 유전자에 완전하거나 거의 완전한 기능상실 돌연변이로 인해 발생하며 전형적으로 상염색체 열성 방식으로 유전된다. LSD에 대한 효과적인 치료법에 대해 상당한 진전이 있었다. 치료적 접근법에는 소분자 샤페론, 종결 코돈 판독 약물, 기질 감소, 유전자 요법, 효소 대체, 줄기 세포 매개 요법 등이 포함된다. LSD는 전형적으로 신경퇴행성 소아 질환으로 간주되지만, 데이터는 리소좀 유전자 결함이 성인 발병 신경 퇴행성 질환의 사례에 관련되어 있음을 암시한다.

LSD 치료법의 개발과 함께 상당한 비율의 치매 사례에서 리소좀 유전자 결함과 관련되어 있는 여기에 제시된 데이터는 다음과 같은 의미를 갖는다:

1) 유전자 데이터는 AD 또는 PD 환자에 대한 진단 선별 도구의 기초를 형성할 수 있다.

2) AD 및 PD와 관련된 리소좀 유전자의 변이체를 갖는 환자는 질병을 중지 또는 역전시키기 위해 위에 나열된 치료법 중 하나로 잠재적으로 치료될 수 있다.

3) 리소좀 유전자에 신경퇴행성 관련 변이체를 보유한 증상전 가족 구성원은 질병 발병 이전 또는 질병의 초기 단계에서 치료될 수 있다.

4) LSD 효과적인 치료법의 용도변경은 성인 발병 신경퇴행성 장애에 대한 질병 조절로 간주될 수 있다.

실시예 7: 성인 발병 신경학적 질환과 관련된 리소좀/자가포식 유전자 변이체

이 실시예는 성인 발병 신경학적 질환과 관련된 리소좀/자가포식 유전자의 유전자 변이체, 및 이들 변이체의 효과를 생체내에서 시험하기 위한 실험 및 전략에 대해 설명한다.

배경

연령은 알츠하이머병(AD) 및 파킨슨병(PD)의 발병 및 진행에 가장 큰 위험 요소이다. 노화는 또한 자가포식-리소좀 경로(ALP)의 분해 능력을 감소시킨다. 여러 시험관내 및 생체내 연구에서 ALP 기능장애가 AD 및 PD의 발병에 기여함을 암시하지만, ALP 기능의 연령 의존적 및 AD 관련 저하의 기초가 되는 유전자 변이는 잘 이해되어 있지 않다.

가설

주요 가설은 리소좀/자가포식 유전자에 이형접합성 유전자 변이체를 운반하는 개체가 일반적인 성인 발병 신경학적 질환(예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 전두측두엽 치매 등)의 발병 위험이 있다는 것이다. 또한, 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 줄기 세포 요법 등을 통한 외인성 리소좀 단백질의 보충은 이러한 질병의 진행을 늦출 것이다.

유전자적 연관성

알츠하이머병

모든 ALP 유전자(n=430)의 단일 변이체 및 유전자 기반 분석이 사내에서 4,000건의 AD 사례와 5,000명의 대조군에서 수행되었다. 결과는 알츠하이머병 시퀀싱 프로젝트(ADSP)의 독립적인 샘플(5,000건의 AD 사례 및 4,500건의 대조군)에서 반복되었다. 모든 ALP 유전자는 ExAC(Exome Aggregation Consortium) 데이터베이스의 비핀란드계 유럽인(n=33,350)으로부터의 WES 데이터를 사용하여 분석하여 유럽 혈통의 개체로부터의 ALP의 각 유전자의 기준 유전자 변이를 결정했다.

파킨슨병

모든 ALP 유전자(n=430)의 단일 변이체 및 유전자 기반 분석은 사내에서 1,000명의 PD 사례와 1,000명의 대조군에서 수행되었다. 결과는 IPGDC(International Parkinson's Disease Genetics Consortium)의 독립적인 샘플(PD 사례 5,500건 및 대조군 6,000건)에서 반복되었다.

결과

대부분의 유전자의 경우에 사내 대조군에 비해 사례에는 과도한 변이가 있었지만, 몇 개의 유전자에서는 명목상의 연관성만이 발견되었다. AD 또는 PD 사례의 cMAF를 ExAc 샘플과 비교했을 때, 여러 독립 유전자가 다중 시험 보정 임계값을 통과했다. 다음으로, ADSP 또는 IPGDC 코호트를 사용하여 이러한 결과를 반복했다. 이 두 개의 독립적인 샘플에서 여러 유전자가 반복되었다.

지원 데이터

A) mRNA 수준

1. 인간

2. 마우스 모델

B) 간질액

생체내 개념 증명

A) 알츠하이머병:

1. NAGLU +/-; 5XFAD

2. PPT1 +/-; 5XFAD

3. DNAJC5 +/-; 5XFAD

B) 파킨슨병:

1. 알파-시누클레인의 사전형성된 원섬유(PFF-αSyn)가 주사된 NAGLU -/-

2. PFF-αSyn가 주사된 PPT1 -/-

3. PFF-αSyn가 주사된 GALC -/- 및 +/-

4. PFF-αSyn가 주사된 ACD -/- 및 +/-

구제 실험

유전자 요법은 리소좀 효소 유전자의 이형접합성 돌연변이로 인한 리소좀 기능장애를 구제할 수 있다. 단일 개입은 CNS에 지속적이고 광범위한 효과를 미칠 것이다.

A) 알츠하이머병:

1. NAGLU +/-; 5XFAD

a) + GT

2. PPT1 +/-; 5XFAD

a) + ERT

b) + GT

3. DNAJC5 +/-; 5XFAD

a) + GT

B) 파킨슨병:

1. 알파-시누클레인의 사전형성된 원섬유(PFF-αSyn)가 주사된 NAGLU -/-

a) + GT

2. PFF-αSyn가 주사된 PPT1 -/-

a) + ERT

b) + GT

3. PFF-αSyn가 주사된 GALC -/- 및 +/-

a) + ERT

b) + GT

아밀로이드 축적 결과

본 명세서에서는 β-아밀로이드 축적은 PPT 및 NAGLU가 반접합성인 마우스에서 악화되는 것으로 나타났다(예를 들어, 도 14a, 도 14b 참조).

반접합성 미경험(naive) NAGLU 마우스는 뇌 간질액(ISF)에서 더 낮은 Aβ 수준을 나타낸다. 한배 새끼 WT 및 반접합성 마우스에서 Aβ의 ISF 수준의 미세투석 정량은 Aβ의 기준 ISF 수준이 상당히 감소함을 보여주었다. 반접합성 미경험 PPT1 마우스는 뇌 간질액(ISF)에서 더 낮은 Aβ 수준을 나타낸다. 한배 새끼 WT 및 반접합성 마우스에서 Aβ의 ISF 수준의 미세투석 정량은 Aβ의 기준선 ISF 수준이 상당히 감소함을 나타내었다.

Aβ 플라크 부하 결과

AD(5XFAD+/-) 모델에서 NAGLU, PPT1 및 DNAJC5 반접합성은 β-아밀로이드 축적을 악화시키는 것으로 나타났다. 7개월째에 (A) 5XFAD+/-, (B) 5XFAD+/-/Naglu+/-, (C) 5XFAD+/-/PPT+/- 및 (D) 5XFAD+/-/DNAJC5+/- 해마 영역에서 β-아밀로이드를 염색한 대표적인 사진(예를 들어, 도 21a 내지 도 21d 참조).

또한, PPT1 및 NAGLU 유전자의 반접합성은 β-아밀로이드 축적을 악화시키는 것으로 나타났다(예를 들어, 도 21e 참조). 플라크로 덮인 표면적은 5XFAD 마우스에 비해 PPT1 반접합성/5XFAD 마우스에서 증가했다. 해마에서 플라크 부하의 정량은 맹검으로 수행되었다. 독립표본(unpaired) t 시험 시, ^**p<0.01. 7개월령 5XFAD(n=4) 및 PPT1 반접합성/5XFAD(n=8). 플라크로 덮인 표면적은 5XFAD 마우스에 비해 NAGLU 반접합성/5XFAD 마우스에서 증가했다. 해마에서 플라크 부하의 정량은 맹검으로 수행했다. 독립표본 t 시험 시, ^*p<0.05. 7개월령 5XFAD(n=4) 및 NAGLU 반접합성/5XFAD(n=4).

생존 결과

표적화된 AAV2/9-PPT1 유전자 요법이 PPT1 반접합성/5XFAD 마우스에서 질병 진행을 지연시킨다는 것이 본 명세서에서 입증되었다. 캐플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선은 PPT1 반접합성/5XFAD 미처리군(적색, n=8)의 중간 수명이 AAV9-PPT1이 두개내 처리된 반접합성/5XFAD(녹색, n=5)보다 현저히 짧다는 것을 보여준다. 경향에 대한 로그 순위 검정에 의한 분석은 전체 생존에서 유의미하였다(P<0.0001). AAV2/9-PPT1로 처리된 마우스는 누가 보아도 건강했지만, 조직학적 분석을 위해 7.8개월에 의도적으로 희생시켰다.

실시예 6: LSD 유전자 보인자의 가족 사례 연구

이 실시예는 LSD(영아 뉴런 세로이드 지질갈색소증, CLN1 질환) 자녀가 있는 가족에 대한 연구를 설명한다. CLN1 질환은 리소좀 효소 PPT1(팔미토일 단백질 티오에스테라제 1)의 동형접합 결손으로 인해 유발된다. 정의에 따르면, 부모는 PPT1 유전자의 완전하거나 거의 완전한 기능상실 돌연변이가 이형접합성(보인자)이다. 따라서, 우리는 모계 및 부계 가족의 족보(예를 들어, 도 24 참조)를 작성하는 것에 대한 서면 동의를 얻었다. 가족력은 AD 및 기타 관련 형태의 성인 신경학적 질환 및/또는 치매의 증가를 보여주었다. AD의 공식적인 진단은 부검 후에만 이루어질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 임상적으로, AD는 다른 형태의 성인 발병 신경학적 질환과 유사한 증상을 나타낼 수 있다. 이 족보에서 영향을 받은 많은 가족 구성원은 정식 진단을 받지는 않았다(즉, 부검 없음). 그러나, PPT1 유전자의 이형접합성인 완전 또는 거의 완전한 기능상실 돌연변이는 여러 세대를 통해 이 가족을 통해 유전되었다. 이 가족에서 신경학적 질환 및/또는 치매의 현저한 증가는 위에 제시된 유전자적 및 생물학적 데이터와 완벽하게 일치한다.

Claims (67)

1. 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 이형접합성인 대상체에서 자가포식-리소좀 경로를 조절하는 방법으로서,
   자가포식-리소좀 경로 조절제의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계
   를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD)과 관련이 있는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 대상체가 리소좀 기능장애와 관련이 있는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있는 것으로 의심되거나 또는 가질 위험이 있는 것으로 의심되는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 대상체가 리소좀 유전자 기능상실 변이체에 대해 이형접합성이거나 이형접합성인 것으로 의심되거나, 또는 리소좀 축적 질환(LSD)에 대한 보인자(carrier)이거나 또는 보인자인 것으로 의심되는, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 CTNS, MAN2B1, MFSD8, GLB1, GALNS, NAGLU, CLN3, GNPTAB, SGSH, CLN8, NPC1, TPP1, DNAJC5, MANBA, PPT1, SMPD1, GAA, HGSNAT, GNS, CTSA, HEXB 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
6. 제2항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있는, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 NEU1, NAGLU, GBA, GLB1, MANBA, MAN2B1, HGSNAT, IDS, PPT1, GNS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 GALC, ACD 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제가 유전자 요법(GT)을 포함하되, 상기 GT는 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련된 효소 활성을 증가 또는 향상시키는, 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN 및 이들의 조합의 발현을 조절하는 자가포식-리소좀 경로 조절제로 치료되는, 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 반수체기능부전이거나 또는 상기 유전자에 이형접합성 변이체를 갖는 것인, 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 SGSH, NAGLU, HGSNAT, GNS 및 이들의 조합으로 이루어진 군의 헤파란 설페이트(HS) 대사를 담당하는 유전자에 있는 희귀 기능 변이체로부터 선택되는, 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 기능상실 변이체는 리소좀 유전자의 결실, 치환 또는 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이체인, 방법.
14. 제3항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 리소좀 기능장애와 관련이 있는, 방법.
15. 제3항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 변경된 APP 프로세싱(예를 들어, 뇌 간질 Aβ의 변경된 수준 및 증가된 Aβ 플라크 부담) 또는 α-Syn 응집과 관련이 있는, 방법.
16. 제3항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 Aβ 축적과 관련이 있는, 방법.
17. 제3항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 알츠하이머병(AD)인, 방법.
18. 제3항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 작용제로서,
    화학적 샤페론 요법(CCT),
    효소 대체 요법(ERT),
    유전자 요법(GT),
    유전자 편집,
    조혈 줄기 세포 이식(HSCT),
    화학적 샤페론 요법(CCT),
    정지 코돈 판독 약물,
    기질 감소 요법(SRT), 및 이들의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는, 방법.
19. 제1항 또는 제18항에 있어서, 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 또는 줄기 세포 요법에 의한 외인성 리소좀 단백질 보충을 추가로 포함하는, 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제는 시스테아민(Cysteamine), 사이클로덱스트린 또는 미글루스타트(Miglustat)를 포함하는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 치료인, 방법.
21. 제1항에 있어서, Aβ, apoE, 타우(tau), 또는 α-Syn 응집이 상기 대상체에서 감소되거나, 또는 처리되지 않은 대상체에 비해 Aβ, apoE, 타우 또는 α-Syn 제거가 향상되는, 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 치매, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매(FTD), 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병, 운동 뉴런 질환, 폴리글루타민 장애, 헌팅턴병, 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 루이소체 치매 또는 다계통 위축(multiple system atrophy)이 있거나, 또는 있는 것으로 의심되는, 방법.
23. 대상체의 리소좀 기능장애와 관련된 신경학적 질환, 장애 또는 병태의 발병을 예방, 치료, 역전 또는 지연시키는 방법으로서,
    상기 대상체의 생물학적 샘플에서 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자를 검출하거나, 또는 그 유전자가 검출되어 있는 것인 단계; 및
    자가포식-리소좀 경로 조절제의 치료적 유효량을 투여하는 단계
    를 포함하되, 상기 대상체는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 이형접합성이거나, 또는 상기 대상체가 리소좀 축적 질환(LSD)에 대한 보인자인, 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자가 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있는, 방법.
25. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 리소좀 기능장애와 관련이 있는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있는 것으로 의심되거나, 또는 가질 위험이 있는 것으로 의심되는, 방법.
26. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 리소좀 유전자 기능상실 변이체가 이형접합성이거나 이형접합성인 것으로 의심되거나, 또는 리소좀 축적 질환(LSD)에 대한 보인자(carrier)이거나 또는 보인자인 것으로 의심되는, 방법.
27. 제23항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 CTNS, MAN2B1, MFSD8, GLB1, GALNS, NAGLU, CLN3, GNPTAB, SGSH, CLN8, NPC1, TPP1, DNAJC5, MANBA, PPT1, SMPD1, GAA, HGSNAT, GNS, CTSA, HEXB 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
28. 제23항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있는, 방법.
29. 제23항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 NEU1, NAGLU, GBA, GLB1, MANBA, MAN2B1, HGSNAT, IDS, PPT1, GNS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
30. 제23항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 GALC, ACD 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
31. 제23항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제가 유전자 요법(GT)을 포함하고, 여기서, 상기 GT는 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련된 효소 활성을 증가 또는 향상시키는, 방법.
32. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN 및 이들의 조합의 발현을 조절하는 자가포식-리소좀 경로 조절제로 치료되는, 방법.
33. 제23항에 있어서, 상기 대상체가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 반수체기능부전이거나 또는 상기 유전자에 이형접합성 변이체를 갖는 것인, 방법.
34. 제23항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 SGSH, NAGLU, HGSNAT, GNS 및 이들의 조합으로 이루어진 군의 헤파란 설페이트(HS) 대사를 담당하는 유전자에 있는 희귀 기능 변이체로부터 선택되는, 방법.
35. 제23항에 있어서, 상기 기능상실 변이체는 리소좀 유전자의 결실, 치환 또는 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이체인, 방법.
36. 제25항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 리소좀 기능장애와 관련이 있는, 방법.
37. 제25항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 변경된 APP 프로세싱(예를 들어, 뇌 간질 Aβ의 변경된 수준 및 증가된 Aβ 플라크 부담) 또는 α-Syn 응집과 관련이 있는, 방법.
38. 제23항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 Aβ 축적과 관련이 있는, 방법.
39. 제23항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 알츠하이머병(AD)인, 방법.
40. 제23항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 치료로서,
    화학적 샤페론 요법(CCT),
    효소 대체 요법(ERT),
    유전자 요법(GT),
    유전자 편집,
    조혈 줄기 세포 이식(HSCT),
    화학적 샤페론 요법(CCT),
    정지 코돈 판독 약물,
    기질 감소 요법(SRT), 및 이들의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는, 방법.
41. 제1항 또는 제40항에 있어서, 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 또는 줄기 세포 요법에 의한 외인성 리소좀 단백질 보충을 추가로 포함하는, 방법.
42. 제23항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제는 시스테아민(Cysteamine), 사이클로덱스트린 또는 미글루스타트(Miglustat)를 포함하는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 치료인, 방법.
43. 제23항에 있어서, Aβ, apoE, 타우(tau), 또는 α-Syn 응집이 상기 대상체에서 감소되거나, 또는 처리되지 않은 대상체에 비해 Aβ, apoE, 타우 또는 α-Syn 제거가 향상되는, 방법.
44. 제23항에 있어서, 상기 대상체는 치매, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매(FTD), 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병, 운동 뉴런 질환, 폴리글루타민 장애, 헌팅턴병, 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 루이소체 치매 또는 다계통 위축(multiple system atrophy)이 있거나, 또는 있는 것으로 의심되는, 방법.
45. 대상체에서 적어도 하나의 리소좀 유전자 기능상실 변이체를 검출하는 방법으로서,
    대상체로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계; 및
    기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하되, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자가 검출되는 경우, 상기 대상체는 APP 프로세싱 기능장애와 관련이 있는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 결정되는, 방법.
46. 제45항에 있어서, 자가포식-리소좀 경로 조절제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제는 검출된 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 치료인, 방법.
47. 제45항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자가 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있는, 방법.
48. 제45항에 있어서, 상기 대상체가 리소좀 기능장애와 관련이 있는 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태를 갖고 있는 것으로 의심되거나, 또는 가질 위험이 있는 것으로 의심되는, 방법.
49. 제45항에 있어서, 상기 대상체가 리소좀 유전자 기능상실 변이체가 이형접합성이거나 이형접합성인 것으로 의심되거나, 또는 리소좀 축적 질환(LSD)에 대한 보인자(carrier)이거나 또는 보인자인 것으로 의심되는, 방법.
50. 제45항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 CTNS, MAN2B1, MFSD8, GLB1, GALNS, NAGLU, CLN3, GNPTAB, SGSH, CLN8, NPC1, TPP1, DNAJC5, MANBA, PPT1, SMPD1, GAA, HGSNAT, GNS, CTSA, HEXB 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
51. 제45항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 적어도 하나의 리소좀 유전자가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, 또는 GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리소좀 축적 질환(LSD)과 관련이 있는, 방법.
52. 제45항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 NEU1, NAGLU, GBA, GLB1, MANBA, MAN2B1, HGSNAT, IDS, PPT1, GNS 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
53. 제45항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 GALC, ACD 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
54. 제46항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제가 유전자 요법(GT)을 포함하고, 여기서, 상기 GT는 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련된 효소 활성을 증가 또는 향상시키는, 방법.
55. 제45항에 있어서, 상기 대상체가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN 및 이들의 조합의 발현을 조절하는 자가포식-리소좀 경로 조절제로 처리되는, 방법.
56. 제45항에 있어서, 상기 대상체가 AGA, ARSA, ARSB, ASAH1, CLN2(TPP1), CLN3, CLN5, CLN6, CLN8, CTNS, CTSA, CTSD, CTSK, FUCA1, GAA, GALC, GALNS, GLA, GLB1, GM2A, GNPTAB, GNPTG, GNS, GUSB, HEXA, HEXB, HGSNAT, HYAL1, IDS, IDUA, KCTD7, LAMP2, LIPA, MAN2B1, MANBA, MCOLN1, MFSD8, NAGA, NAGLU, NEU1, NPC1, NPC2, PPT1, PSAP, SGSH, SLC17A5, SMPD1, SUMF1, CHIT1, ATP13A2, CTSF, DNAJC5, GRN, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 반수체기능부전이거나 또는 상기 유전자에 이형접합성 변이체를 갖는 것인, 방법.
57. 제45항에 있어서, 상기 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자가 SGSH, NAGLU, HGSNAT, GNS 및 이들의 조합으로 이루어진 군의 헤파란 설페이트(HS) 대사를 담당하는 유전자에 있는 희귀 기능 변이체로부터 선택되는, 방법.
58. 제45항에 있어서, 상기 기능상실 변이체는 리소좀 유전자의 결실, 치환 또는 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이체인, 방법.
59. 제45항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 리소좀 기능장애와 관련이 있는, 방법.
60. 제45항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 변경된 APP 프로세싱(예를 들어, 뇌 간질 Aβ의 변경된 수준 및 증가된 Aβ 플라크 부담) 또는 α-Syn 응집과 관련이 있는, 방법.
61. 제45항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 Aβ 축적과 관련이 있는, 방법.
62. 제45항에 있어서, 상기 신경학적 또는 신경퇴행성 질환, 장애 또는 병태가 알츠하이머병(AD)인, 방법.
63. 제46항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제는 기능상실 변이체를 포함하는 상기 리소좀 유전자와 관련이 있는 작용제로서,
    화학적 샤페론 요법(CCT),
    효소 대체 요법(ERT),
    유전자 요법(GT),
    유전자 편집,
    조혈 줄기 세포 이식(HSCT),
    화학적 샤페론 요법(CCT),
    정지 코돈 판독 약물,
    기질 감소 요법(SRT), 및 이들의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는, 방법.
64. 제45항 또는 제62항에 있어서, 효소 대체 요법(ERT), 유전자 요법(GT), 또는 줄기 세포 요법에 의한 외인성 리소좀 단백질 보충을 추가로 포함하는, 방법.
65. 제46항에 있어서, 상기 자가포식-리소좀 경로 조절제는 시스테아민(Cysteamine), 사이클로덱스트린, 미글루스타트(Miglustat), 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기능상실 변이체를 포함하는 리소좀 유전자와 관련이 있는 작용제인, 방법.
66. 제45항에 있어서, Aβ, apoE, 타우(tau), 또는 α-Syn 응집이 상기 대상체에서 감소되거나, 또는 처리되지 않은 대상체에 비해 Aβ, apoE, 타우 또는 α-Syn 제거가 향상되는, 방법.
67. 제45항에 있어서, 상기 대상체는 치매, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 전두측두엽 치매(FTD), 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병, 운동 뉴런 질환, 폴리글루타민 장애, 헌팅턴병, 가족성 아밀로이드 다발성신경병증(FAP), 루이소체 치매 또는 다계통 위축(multiple system atrophy)이 있거나, 또는 있는 것으로 의심되는, 방법.

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