KR20150098675A - 넌센스 돌연변이로부터 생긴 유전적 질환을 치료하기 위한 물질 및 이를 확인하는 방법 - Google Patents

넌센스 돌연변이로부터 생긴 유전적 질환을 치료하기 위한 물질 및 이를 확인하는 방법 Download PDF

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Abstract

마크롤라이드를 사용하여 넌센스 돌연변이 또는 조기 종결 코돈에 의해 야기되거나 이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료가 개시된다. 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루 및 조기 종결 코돈을 유도하는 물질을 확인하는 방법 및 이의 용도가 추가로 개시되어 있다.

Description

넌센스 돌연변이로부터 생긴 유전적 질환을 치료하기 위한 물질 및 이를 확인하는 방법{AGENTS FOR TREATING GENETIC DISEASES RESULTING FROM NONSENSE MUTATIONS, AND METHODS FOR IDENTIFYING THE SAME}
본 개시내용은 마크롤라이드(macrolide)를 사용한 넌센스 돌연변이에 의해 생긴 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루(read-through)를 유도하는 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다.
선행 기술
현재 개시된 대상에 대한 배경으로서 관련된 것으로 생각되는 참조문헌은 하기 기재되어 있다:
[1] Mendell et al., 2001 Cell, 107(4): 411-4.
[2] Burke et al., 1985 Nucleic Acids Res, 13(17): 6265-72.
[3] Lai et al., 2004 PNAS, 101(44): 15676-15681.
[4] Zingman et al., 2007 Clin Pharmacol Ther, 81(1): 99-103.
[5] Malik et al., 2010 Ther Adv Neurol Disord, 3(6): 379-389.
[6] Mattis et al., 2009 Human Molecular Genetics, 18(20): 3906-3913.
[7] Hainrichson et al., 2008, Org Biomol Chem, 6(2): 227-39.
[8] Floquet et al., 2012, PLoS Genet, 8(3): e1002608.
[9] Thompson et al., 2004, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 48(12): 4889-4891.
[10] Zilberberg et a., 2010, Gut, 59: 496-507
[11] WO2007/144876.
[12] Auld et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A, 107(11): 4878-83.
[13] Du et al., 2009 J. Exp. Med., 206(10): 2285-2297.
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[15] WO 2004/001010.
[16] WO 2007/027106.
[17] US 2009/0311695.
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[20] Hua, Y. et al., 2011 Nature, 478(7367):123-6.
[21] Jaruratanasirikul, S., et al., 1996, Antimicrob. Agents Chemother. 40:825-826.
본 명세서의 상기 참조문헌의 인식은 이들이 임의의 방식으로 현재 개시된 대상의 특허가능성에 관련된다는 것을 의미하는 것으로서 추론되지 않는다.
현대의 인간 유전학의 도래는 많은 희귀한 장기 질환이 기원상 유전적이라는 것을 나타냈다(1). 특히, 레트 증후군, 뒤시엔느 근위축증, 어셔 증후군 및 많은 다른 질환과 같은 질환은 조기 종결 코돈을 발생시키는 유전자의 코딩 서열 내에 단일 뉴클레오타이드 변이인 넌센스 돌연변이로부터 생긴 것으로 대부분의 경우에 나타났다. 이러한 돌연변이의 존재는 절두된 비기능성 단백질을 합성시킨다.
지난 10년에 걸쳐, 유전자의 코딩 서열 내의 넌센스 돌연변이로부터 생긴 유전적 질환의 치료 전략은 아미노글리코사이드 항생제의 사용에 기초하여 생겼다. 이 분자는 조기 종결 코돈의 리드-쓰루를 촉진하여, 전장 단백질의 합성을 회복시킨다. 이러한 전략은 뒤시엔느 근위축증 및 낭성 섬유증을 포함하는 다양한 유전적 질환에 대해 시험되었다(2-6). 불행하게도, 아미노글리코사이드, 예컨대 겐타마이신은 심각한 용량 제한 독성을 가져, 임의의 만성 질병에 대해 매력적이지 않은 장기간 치료로 만든다(7).
소정의 분자에 의한 소정의 돌연변이된 유전자의 리드-쓰루 수준은 중지 코돈의 성질 및 둘러싼 뉴클레오타이드 환경에 따라 달라진다(8). 따라서, 리드-쓰루제를 사용한 소정의 치료에 대한 반응은 매우 가변적이고 리드-쓰루 수준, 즉 전장 단백질의 합성의 수준을 지배하는 규칙에 대해 거의 알려지지 않았다.
원핵 시스템(에스체리치아 콜라이)에서의 단백질 합성 동안의 중지 코돈 리드-쓰루에 대한 다수의 항생제의 효과가 시험되었다(9). 또한, 조기 종결 코돈의 아미노글리코사이드- 및 마크롤라이드-유도 리드-쓰루에 의한 대장암 세포에서의 선종성 용종증(APC: adenomatous polyposis coli) 유전자의 복원은 또한 Zilberberg 등의 문헌 및 특허 출원 WO 2007/144876에 보고되어 있다(10, 11). 특히, WO 2007/144876은 다양한 암, 구체적으로 돌연변이된 APC 유전자를 발현하는 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 마크롤라이드 항생제의 사용을 개시한다.
전통적으로, 조기 종결 코돈의 리드-쓰루를 시험하기 위해 설계된 벡터는 루시퍼라제에 기초한다. 그러나, 이러한 검정은 표적을 벗어난 효과를 갖는 것으로 밝혀져서, 이러한 검정에 의해 확인된 주요 화합물이 리드-쓰루를 실제로 유도하지 않을 수 있다는 것을 제시한다(12). 리드쓰루제를 확인하기 위한 스크리닝 검정에 대한 다양한 접근법이 예를 들어 듀(Du) 등 및 카르드노(Cardno) 등의 문헌에 기재되어 있다(13, 14).
특히, 특허 출원 WO 2004/001010(15)은 조기 번역 중지 코돈을 갖는 임의의 유전자의 전사후 발현을 조절하는 화합물을 스크리닝하고 확인함으로써 조기 번역 종결 및/또는 넌센스 매개 메신저 리보핵산("mRNA") 붕괴를 조절하는 화합물을 스크리닝하고 확인하기 위한 방법을 개시한다. 특허 출원 WO 2007/027106(16)은 이중 리포터 코딩 작제물 및 방법을 개시한다. 이러한 작제물 및 방법은 리코딩의 조절을 통해 작용하는 약물을 스크리닝하는 데 유용하다.
또한, 특허 출원 US 2009/0311695(17)는 RNA 전사체의 통합성 및/또는 RNA 대사에 미치는 유전적 변이의 효과를 확인하는 방법을 개시한다. US 2009/0311695는 또한 RNA 전사체의 통합성을 조절하고/하거나, RNA 대사를 조절하는 데 관여하는 물질을 확인하기 위한 고속 검정을 개시한다.
주로 현재의 가능한 치료가 전장 단백질의 독성 및 비교적 낮은 수준의 합성과 갖은 단점을 겪으므로 유전적 질환, 특히 넌센스 돌연변이 또는 조기 중지 코돈에 의해 발생하는 유전적 질환을 치료하는 데 유용한 치료제에 대한 수요가 여전히 존재한다. 현재까지, 제안된 리드-쓰루 치료는 임상 연구에서 효과적인 것으로 밝혀지지 않았다. 또한, 넌센스 돌연변이에 의해 발생한 유전적 질환에 대한 치료제로서 사용될 수 있는 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 물질을 확인하기 위한 효과적이지만, 단순한 조성물 및 방법에 대한 추가의 수요가 존재한다.
이의 양상 중 하나에서, 본 개시내용은 조기 중지 코돈 또는 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 조기 중지 코돈 또는 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
이의 양상 중 다른 하나에서, 본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 비전신으로 투여된다.
이의 양상 중 또 다른 하나에서, 본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하고 상기 업스트림 핵산 서열과 상기다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 치료학적 유효 용량으로 CNS에 직접 투여된다.
이의 양상 중 또 다른 하나에서, 본 개시내용은 세포내(inter-culluar) 또는 세포이하(subcellular) 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하여, 적어도 하나의 넌센스 돌연변이로부터 생긴 비기능성 형태의 상기 세포내 또는 세포이하 단백질의 생성과 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 적어도 하나의 증상 또는 병증을 치료하는 데 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물이 있고, 여기서 상기 세포내 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 적어도 7%의 기능성 단백질의 생성이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물이 있고, 여기서 상기 세포내 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 약 7% 내지 약 25%의 기능성 단백질의 생성이다.
추가의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 적어도 1종의 마크롤라이드는 에리쓰로마이신, 아지쓰로마이신 및 크랄리쓰로마이신 또는 이들의 적어도 2종의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 추가의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 및 두개내로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로로 투여된다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 척추강내로 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy), 모세혈관확장 운동실조(Ataxia-telangiectasia), 레트 증후군(Rett syndrome), 어셔 증후군(Usher syndrome), 페록시좀 생물발생 장애(peroxisome biogenesis disorder), 활성화 결핍증(Activator Deficiency)/GM2 갱글리오사이드 축적증(GM2 Gangliosidosis), 알파 만노스 축적증(Alpha-mannosidosis), 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 콜레스테릴 에스터 저장 질환(Cholesteryl ester storage disease), 만성 헥소사미니디아제 A 결핍증(Chronic Hexosaminidase A Deficiency), 시스틴증(Cystinosis), 다논 질병(Danon disease), 파브리병(Fabry disease), 파버병(Farber disease), 푸코시드축적증(Fucosidosis), 갈락토시알리도시스(Galactosialidosis), 고쉐병(Gaucher Disease), GM1 갱글리오사이드 축적증, I-세포 질환(I-Cell disease)/뮤코리피드증(Mucolipidosis) II, 소아 유리 시알산 저장 질환/ISSD(Infantile Free Sialic Acid Storage Disease), 연소기 헥소사미니디아제 A 결핍증(Juvenile Hexosaminidase A Deficiency), 크라베병(Krabbe disease), 리소솜 산 리파제 결핍증(Lysosomal acid lipase deficiency), 이염성 백질이영양증(Metachromatic Leukodystrophy), 뮤코다당증 질병(Mucopolysaccharidoses disorder), 다종 술파타제 결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 니만 픽병(Niemann-Pick Disease), 신경성 지방갈색소증(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses), 폼피병(Pompe disease)/글리코겐 저장 질환 II형(Glycogen storage disease type II), 농축 이골증(Pycnodysostosis), 샌드호프병(Sandhoff disease)/성인 발병/GM2 갱글리오사이드 축적증, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 유아, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 연소기, 쉰들러병(Schindler disease), 살라병(Salla disease)/시알산 저장 질환, 테이 삭스(Tay-Sachs)/GM2 갱글리오사이드 축적증, 여성 질환, 척수소뇌변성증(Spinocerebellar ataxia), 샤를부아-사기네이(Charlevoix-Saguenay)의 보통염색체 열성 경직성 운동실조(Autosomal recessive spastic ataxia), 간헐성 운동실조(Episodic ataxia: Ea), 보통염색체 열성 소뇌성 운동실조(autosomal recessive cerebellar ataxia: ARCA), 파킨슨병(Parkinson's disease), 타우병증(taupathy), 프로그로이드 증후군(Progroid syndrome), 베르너 증후군(Werner syndrome), 말초신경병증(Polyneuropathy), 청력 손실(hearing loss), 운동실조(ataxia), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa) 및 백내장(cataract)(PHARC), 샤리코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth: CMT), 프리온병(Prion disease), 유아 신경원성 세로이드 리포푸신증(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis), 뉴로세르핀 봉입체(neuroserpin inclusion body)에 의한 가족성 뇌증(familial encephalopathy), 대리어병 질환(Darier's disease), 판상증(Laminopathy), 에머리-드레이퓨즈 근위축증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 지대형근 근위축증 1B형(limb girdle muscular dystrophy type 1B), 듀니건형 가족성 부분 지방영양이상증(Dunnigan-type familial partial lipodystrophy), 바라퀘-시몬스 증후군(Barraquer-Simons syndrome), 부쉬케-올렌도프 증후군(Buschke-Ollendorff syndrome), 듀니건형의 가족성 부분 지방영양이상증(FPLD), 백질이영양증(Leukodystrophy), 탈수초, 성인 발병, 상염색체 우성(ADLD), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이의 양상 중 또 다른 하나에서, 본 개시내용은 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 전장 SMN2의 생성을 증가시킨다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 비전신으로 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 SMN2 유전자에 존재하는 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도한다.
추가의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된, 상기 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈을 포함하는 SMN2 유전자의 단편에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
다른 추가의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 CNS로 직접 투여된다.
이의 양상 중 다른 하나에서, 본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
이의 양상 중 또 다른 하나에서, 본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 비전신으로 투여된다.
본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도한다.
이의 양상 중 다른 하나에서, 본 개시내용은 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질의 적어도 부분 생성을 적어도 부분적으로 복원하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하여, 적어도 하나의 넌센스 돌연변이로부터 생긴 비기능성 형태의 상기 세포내 또는 세포이하 단백질의 생성과 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 적어도 하나의 증상 또는 병증을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법이 있고, 상기 세포내 기능성 단백질의 적어도 부분 생성을 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 적어도 7%의 기능성 단백질의 생성이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법이 있고, 상기 세포내 기능성 단백질의 적어도 부분 생성을 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 약 7% 내지 약 25%의 기능성 단백질의 생성이다.
이의 양상 중 다른 하나에서, 본 개시내용은 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
이의 양상 중 또 다른 하나에서, 본 개시내용은,
a. 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 제1 핵산 서열;
b. 청색 형광 단백질(BFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열; 및
c. 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 개재된 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 제3 핵산 서열로서, 상기 제3 핵산 서열은 넌센스 돌연변이를 포함하는 것인 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 제공하고;
상기 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에서 인프레임으로 연결된다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 핵산 작제물이 있고, 여기서 GFP는 BFP에 업스트림이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 핵산 작제물은 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열 사이에 개재된 하나 이상의 링커 핵산 서열을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 본 명세서에 정의된 핵산 작제물을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.
이의 양상 중 다른 하나에서, 본 개시내용은 본 명세서에 정의된 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
이의 양상 중 또 다른 하나에서, 본 개시내용은 본 명세서에 정의된 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 세포는 진핵 세포이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 세포는 포유동물 세포이다.
본 개시내용은 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은
a. 후보 마크롤라이드를 (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재되고, 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단와 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계를 포함하고;
c. 상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 후보 마크롤라이드가 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따르면 업스트림 형광 단백질은 GFP이고, 다운스트림 형광 단백질은 BFP이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 넌센스 돌연변이를 포함하는 개재된 핵산 서열은 적어도 45개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
추가의 실시형태에서, 다운스트림 형광 단백질의 형광은 업스트림 및 다운스트림 형광 단백질 둘 다를 발현하는 세포에서만 측정된다.
다른 추가의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법은 업스트림 및 다운스트림 형광 단백질 둘 다를 발현하는 세포를 검출하거나 분류하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 적어도 약 7 내지 25%의 증가는, 후보 마크롤라이드가 임상 용도를 위한 적합한 리드-쓰루라는 것을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 다운스트림 형광 단백질의 형광의 측정은 형광 활성화 세포 분류기(FACS)에 의해 수행된다.
추가의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법은 작제물을 포함하고 후보 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 넌센스 돌연변이를 갖지 않는 대조군 작제물을 포함하는 세포 사이의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 마크롤라이드는 항생제 마크롤라이드이다.
이의 양상 중 또 다른 하나에서, 본 개시내용은 하기 단계 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 포함하는 넌센스 돌연변이로부터 생기거나 이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법을 제공한다:
(ⅰ) 하기 a. 내지 f.를 포함하는 방법에 의해 상기 질환의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드를 선택하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드를 상기 대상체에게 투여하는 단계:
a. 상기 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 유전자에서 적어도 하나의 넌센스 돌연변이를 확인하는 단계;
b. (a)의 상기 확인된 돌연변이에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 단편 및 GFP 및 BFP로부터 선택된 2개의 명확한 형광 단백질을 코딩하는 2개의 핵산 서열에 의해 플랭킹된(flanked) 이의 둘러싼 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물을 제공하는 단계로서, 단편 및 2개의 명확한 형광 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 제공하는 단계;
c. (b)의 작제물을 숙주 세포로 도입하는 단계; 및
d. (b)의 작제물을 포함하는 숙주 세포를 후보 리드-쓰루 마크롤라이드와 접촉시키는 단계; 및
e. 형광 단백질 둘 다를 포함하는 리드-쓰루 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계;
f. 형광 단백질 둘 다를 함유하는 리드-쓰루 폴리펩타이드의 존재는 상기 후보 리드-쓰루 마크롤라이드가 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드라는 것을 나타낸다.
본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 하나의 추가적인 치료학적으로 효과적인 물질과 조합된 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
본 명세서에 개시된 대상을 더 잘 이해하고, 어떻게 이것이 실행될 수 있는지를 예시하기 위해, 첨부된 도면을 참조하여 단지 비제한적인 예의 방식으로 실시형태가 이제 기재될 것이다:
도 1 GFP-BFP 플라스미드 작제
도 1a는 "GFP-C2-BFP" 작제물이라 칭하는 스크리닝 플라스미드의 도식적 예시이다.
도 1b는 왼쪽 패널에서의 청색 형광 단백질(BFP) 형광 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 형광 또는 BFP 및 GFP 단백질 둘 다를 발현하는 융합 단백질(오른쪽 패널)에 기원하는 일련의 청색 및 녹색 형광을 나타내는 GFP-C2-BFP 작제물의 면역형광 사진을 제시한다.
도 1c는 GFP 및 BFP 방출에 따라 FACS 분석에 의해 얻은 스크리닝 플라스미드 및 상응하는 세포 분포 다이아그램의 도식적 예시를 제시한다.
도 1c-1은 GFP 및 BFP 둘 다를 발현하는 "WT" GFP-C2-BFP 플라스미드 작제물이다.
도 1c-2는 넌센스 돌연변이를 포함하는 GFP-C2-BFP 플라스미드 작제물이고 오직 GFP를 발현한다.
도 1c-3은 에리쓰로마이신의 존재 하에 리드-쓰루인 넌센스 돌연변이를 포함하는 GFP-C2-BFP 플라스미드 작제물이다.
도 1d는 상이한 농도의 항생제 마크롤라이드 처리의 존재에서 얻은 FACS 데이터의 오버레이 예시를 제시하고, 평균 값의 이동은 리드-쓰루의 정도를 나타낸다.
약어: WT, 야생형; mut, 돌연변이; GFP, 녹색 형광 단백질; BFP, 청색 형광 단백질; Ery, 에리쓰로마이신.
도 2 ATM 돌연변이의 리드-쓰루에 미치는 상이한 에리쓰로마이신 용량의 영향 ATM 넌센스 돌연변이(즉, TGA 중지 코돈)를 포함하는 GFP-C2-BFP 플라스미드로 형질감염된 HEK293T 세포에 대해 얻어지고 24, 36 또는 48시간 동안 0, 300, 500 또는 700㎍/㎖의 에리쓰로마이신의 존재 하에 항온처리된 정규화 형광 판독(MFI)을 나타내는 막대 그래프.
도 3 ATM 단백질 복원
도 3A는 WT B 림프구와 비교하여 7일 동안 (300㎍/㎖에서의) 표시된 항생제의 존재 하에 항온처리된 이형접합 넌센스 돌연변이 C5515->T를 보유한 운동실조 모세혈관확장증(A-T) 환자로부터 얻은 B 림프구의 웨스턴 블롯 분석이다. 세포를 수확하고 특이적 항-ATM 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 처리하였다.
도 3B는 7일 동안 (100 또는 300㎍/㎖에서의) 표시된 항생제의 존재 하에 배양된 이형접합 넌센스 돌연변이 C5515->T를 보유하는 운동실조 모세혈관확장증(A-T) 환자로부터 얻은 B 림프구의 웨스턴 블롯 분석이다. 세포를 수확하고 특이적 항-ATM 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 처리하였다.
도 3C는 티나(TINA) 소프트웨어에 의해 분석된 도 3B에 도시된 밴드 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3D는 7일 동안 표시된 항생제로 처리된 동형접합 A-T 돌연변이체 C103->T 및 WT 세포의 웨스턴 블롯 분석이다. 이후, 세포를 수확하고 특이적 항-ATM 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석으로 처리하였다.
약어: 0, 무 치료; E, 에리쓰로마이신; AZ, 아지쓰로마이신; G, 황산겐타마이신, WT, 야생형.
도 4 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루에 미치는 상이한 에리쓰로마이신 용량의 영향 상응하는 넌센스 돌연변이를 포함하는 GFP-C2-BFP 플라스미드로 형질감염되고 24시간(도 4a) 또는 48시간(도 4b) 동안 표시된 에리쓰로마이신 농도의 존재 하에 항온처리된 HEK293T 세포의 배양 시 어셔 증후군("Ush"/"U"), 레트 증후군("RT"/"R") 및 운동실조 모세혈관확장증("ATM"/"A")과 관련된 유전자의 핵산 단편에서 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루에 미치는 0, 300, 500 또는 700㎍/㎖에서의 에리쓰로마이신의 영향을 나타내는 막대 그래프.
도 5 전장 단백질의 발현 운동실조 모세혈관확장증("ATM mut.") 및 어셔 증후군("Usher mut.")과 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루에 미치는 0, 500 또는 700㎍/㎖에서의 에리쓰로마이신 영향의 웨스턴 블롯 분석.
도 6 RTT-R294X 환자의 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석
상부 패널은 항-MeCP2 항체를 사용하여 겐타마이신(300㎍/㎖), 에리쓰로마이신(100㎍/㎖), 아지쓰로마이신(10, 100 또는 300㎍/㎖)의 존재 하에 또는 이의 부재(-) 하에 7일 동안 항온처리된 RTT-R294X 환자의 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. WT 섬유아세포에서의 MeCP2의 발현 수준은 비교를 위해 제시된다(WT, 왼쪽 레인). 하부 패널은 티나 소프트웨어에 의해 분석된 블롯 분석의 밴드 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7 MeCp2의 핵 국재화
도 7a는 MeCP2(상부 패널) 또는 dapi(하부 패널)에 지향된 항체에 의한 야생형(WT) 섬유아세포의 염색을 나타낸다.
도 7b는 표시된 바대로 겐타마이신(300㎍/㎖) 또는 에리쓰로마이신(100㎍/㎖)의 존재, 또는 부재("약물 무", 왼쪽 패널) 하에 7일 동안 항온처리된 섬유아세포의 MeCp2(상부 패널) 또는 dapi(하부 패널)의 염색이다. 화살표는 핵에 대한 MeCp2 단백질의 국재화를 나타낸다.
도 7c는 표시된 바대로 아지쓰로마이신(10, 100 또는 300㎍/㎖)의 존재 하에 7일 동안 항온처리된 섬유아세포의 MeCp2(상부 패널) 또는 dapi(하부 패널) 염색이다. 화살표는 핵에 대한 MeCp2 단백질의 국재화를 나타낸다.
도 7d는 도 7b 및 도 7c에 제시된 세포의 각각의 40-50개의 세포에서의 핵 염색 백분율을 나타내는 막대 그래프이다.
약어: WT, 야생형; RTT, 레트 증후군; conc, 농도.
도 8 마크롤라이드를 사용한 SMN2 발현의 복원
도 8a(상부 패널)는 표시된 바대로 겐타마이신(300㎍/㎖), 에리쓰로마이신(100㎍/㎖), 아지쓰로마이신(10, 100 또는 300㎍/㎖)의 존재 또는 이의 부재(-) 하에 7일 동안 항온처리된 SMA 환자의 섬유아세포(SMN1-/-; SMN2+/-)의 항-SMN 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석이다. 하부 패널은 상부 패널에 도시된 결과의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8b(상부 패널)는 표시된 바대로 겐타마이신(300 vg/㎖), 에리쓰로마이신(100㎍/㎖), 아지쓰로마이신(10, 100 또는 300㎍/㎖)의 존재 또는 이의 부재(-) 하에 7일 동안 항온처리된 환자의 섬유아세포(SMN1-/-; SMN2+/+)의 SMA의 항-SMN 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석이다. 하부 패널은 상부 패널에 도시된 결과의 정량화를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8c는 임의의 치료의 부재 하의 환자의 섬유아세포 SMN1-/-; SMN2+/- 또는 SMN1-/-; SMN2+/+의 SMA의 항-SMN 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석이다.
도 8d는 대조군 검정으로서 (각각 500㎍/㎖에서의) 겐타마이신 또는 에리쓰로마이신 또는 이의 부재 하에 7일 동안 항온처리된 환자의 섬유아세포 SMN1-/-; SMN2+/- 또는 SMN1-/-; SMN2+/+의 SMA의 비연관 단백질에 지향된 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석이다.
도 8e는 알마르(Alamar) 청색 검정을 사용하여 SMA 섬유아세포(SMN1-/-; SMN2+/+)의 (표시된 바대로) 약물 치료 후 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.
약어: SMN1, 생존 운동 뉴런 1; SMN2, 생존 운동 뉴런 2; conc, 농도.
본 개시내용은 조기 종결 코돈 및 결과적으로 절두된 비기능성 단백질을 형성시키는 넌센스 돌연변이로부터 생긴 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 데 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법은 하기 본 명세서에 예시된 바대로 놀랍게도 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 돌연변이된 핵산 서열의 리드-쓰루를 성공적으로 유도하는 것으로 밝혀진 항생제 마크롤라이드 패밀리의 분자를 이용한다.
유리하게는, 심지어 낮은 수준의 리드-쓰루, 즉 전장 기능성 단백질의 낮은 수준의 번역은 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 겪는 환자에게 임상적 유의성을 갖는 것으로 예상된다. 즉, 리드-쓰루 번역에 의한 전장 기능성 단백질의 심지어 적절한 양의 생성의 복원은 생리학적으로 관련될 수 있고, 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 증상 또는 병증은 대부분 개선될 수 있다.
본 개시내용은 넌센스 돌연변이 리드-쓰루를 유도할 수 있는 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드와 같은 물질을 확인하기 위한 매우 효과적인 조성물 및 민감한 방법을 추가로 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 확인된 리드-쓰루 물질은 넌센스 돌연변이로부터 생긴 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환, 예컨대 하기 본 명세서에 기재된 질환의 치료에 이용될 수 있다.
따라서, 이의 양상 중 하나에서 본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서 정의된 용어 " 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 질환 또는 신경발달성 질환 "은 소정의 유전자에서의 넌센스 돌연변이로부터 생기거나 이와 관련된 임의의 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환, 즉 특정한 유전자의 핵산 서열에서 조기 중지 코돈(또한 조기 종결 코돈이라 칭함)을 도입하는 돌연변이를 포괄한다.
많은 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환은 절두된(또는 불완전한) 및 일반적으로 비기능성인 단백질 생성물을 생성시키는 특이적 단백질을 코딩하는 유전자에서의 특이적 위치에서 적어도 부분적으로 넌센스 돌연변이 또는 조기 중지 코돈과 관련되는 것으로 공지되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바대로, " 조기 종결 코돈으로부터 생긴 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환 " 또는 " 넌센스 돌연변이로부터 생긴 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환 "은 상호호환적으로 사용되고, 절두된 단백질을 형성시키는 넌센스 돌연변이가 질환을 일으키는 기초하는 인자 중 하나로서 확인된 질환을 의미한다. 용어 " 생긴 "은 넌센스 돌연변이가 질환을 일으키는 유일한 인자라는 것을 나타내지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 정의된 용어 " 넌센스 돌연변이 "는 전사된 mRNA에서 조기 중지 코돈, 또는 넌센스 코돈, 및 결과적으로 절두된, 또는 불완전한 및 일반적으로 비기능성인 단백질 생성물을 발생시키는 돌연변이이다. 즉, "넌센스 돌연변이"는 아미노산에 상응하는 코돈을 중지 코돈으로 변경하는 돌연변이이다.
용어 " 중지 코돈 "(또한 종결 코돈이라 칭함)은 성장하는 폴리펩타이드 사슬에 대한 아미노산 잔기의 첨가에 상응하는 메신저 RNA에서의 대부분의 코돈에 반대인, 번역의 종결을 신호전달하는 메신저 RNA 내의 뉴클레오타이드 트리플렛이다.
따라서, 당해 분야에 공지된 용어 " 조기 종결 코돈 " 또는 " 조기 중지 코돈 "은 아미노산 잔기에 상응하는 코돈 대신에 중지 코돈의 발생을 의미한다. 조기 중지 코돈은 특정한 유전자의 코딩 핵산 서열의 말단에 규칙적으로 위치한 정상 중지 코돈에 업스트림의 어디든 위치할 수 있다.
조기 종결 코돈은 TAG(UAG로서 전사), TAA(UAA로서 전사) 및 TGA(UGA로서 전사)를 포함하는 공지된 중지 코돈 중 임의의 하나일 수 있다. 각각의 가능성은 본 발명의 명확한 실시형태를 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 조기 종결 코돈은 TGA(UGA로서 전사)이다.
하기 기재된 바대로, 단백질의 효과적인 리드-쓰루는 예를 들어 10 내지 100㎍/㎖의 아지쓰로마이신의 존재 하에 항온처리된 R294X 섬유아세포에 대해 도 6에 입증된 바대로 10 내지 100㎍/㎖의 용량 범위에서 항생제 마크롤라이드로 처리된 세포에 대해 얻어진다.
뇌 조직, CSF 및 눈물에서의 마크롤라이드 아지쓰로마이신의 수준의 측정(Jaruratanasirikul et al.(21))은 500㎎ 경구 투여 후, 비감염된 인간에서의 아지쓰로마이신의 농도가 혈청에서 0.008 내지 0.031㎍/㎖의 범위이고 CSF에서 검출되지 않거나 0.015㎍/㎖이라는 것을 보고하였다. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 효과적인 치료를 위해, CSF에서의 약 10㎍/㎖ 마크롤라이드의 농도가 목표가 되어야 한다. 이 농도는 i.v. 또는 경구 경로 투여를 통해 성취될 수 없는데, 왜냐하면 이것은 (예를 들어, 아지쓰로마이신의) 10㎎/㎏ i.v.의 현재 승인된 용량보다 666배 높은 용량을 필요로 할 수 있기 때문이다. 아지쓰로마이신이 신체에서의 이의 분포에 따라 항생제로서 가장 높은 승인된 용량인 10㎎/㎏ 정맥내(i.v.)로 투여될 때, CSF에서의 아지쓰로마이신의 효과적인 농도는 오직 약 0.3㎍/㎖일 것이고, 이것은 명확히 상기 언급된 효과적인 리드-쓰루의 범위의 밖이다. 따라서, CSF에서 치료학적으로 효과적인 용량을 성취하기 위해 오직 효과적이고 비독성인 투여 경로는 항생제 마크롤라이드의 비전신 투여, 예를 들어 중추 신경계(CNS)로의 직접 주사(그러나, 이에 제한되지는 않음)일 것이다.
또한, 일반적으로 항생제 및 항생제 마크롤라이드의 전신 투여는 특히 다양한 부작용, 예를 들어 돌연변이된 박테리아 균주(몇몇 열거하자면)의 소화 및 형성에 유리한 신체에서의 세균총의 파괴를 갖는다.
따라서, 이의 양상 중 다른 것에 의해 본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하기 위한 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 비전신으로 투여된다.
본 명세서에 정의된 용어 " 비전신으로 "는 국소 투여 경로, 즉 소화관을 통하지 않거나 비경구가 아닌 투여 경로를 의미한다.
투여는 필요로 하는 환자에 대한 만성 반복 투여일 수 있다. 본 명세서에 사용된 " 만성 반복 투여 "는 환자에 대한 규칙적 기준으로 마크롤라이드 항생제의 측정 분량을 제공하는 것을 의미한다. 규칙적 기준은 예를 들어 1일 1회, 격일 1회, 1주 2회, 격주 1회, 연속 2주 중 1회, 1달 1회 또는 연속 2달 중 1회일 수 있다. 투여 및 용량은 주치의의 우수 의학 실행(good medical practice)에 의해 결정되고, 환자의 연령, 성별, 체중 및 일반 상태에 따라 달라질 수 있다.
본 개시내용은 항생제 마크롤라이드가 예를 들어 운동실조 모세혈관확장증 질환에 대해 하기 실시예 2 및 3에서와 같은 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 다양한 유전자에서 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도할 수 있다는 놀라운 발견에 기초하고, 항생제 마크롤라이드 에리쓰로마이신은 운동실조 모세혈관확장증 돌연변이된(ATM) 단백질을 코딩하는 유전자에서 발견된 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 리드-쓰루 "는, 번역의 과정을 언급할 때, "센스" 코돈(즉, 아미노산을 코딩하는 코돈)으로서 중지 코돈("넌센스" 코돈)을 판독하거나 상기 중지 코돈을 우회하여, 전장 단백질의 합성을 적어도 부분적으로 복원하는 것을 의미한다.
따라서, 리드-쓰루를 유도할 수 있는 물질을 확인하는 것이 중요하다.
따라서, 또 다른 양상에서 본 개시내용은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도한다 "는 넌센스 돌연변이(또한 본 명세서에서 조기 중지 코돈이라 칭함)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 전장 단백질의 적어도 부분 증가, 생성, 증분 또는 상승을 의미한다. 상기 전장 단백질의 번역의 증가는 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100%일 수 있다.
하기 예시된 바대로, 본 개시내용은 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드와 같은 물질의 확인 및 선택을 가능하게 하는 핵산 작제물 및 스크리닝 방법에 기초한다.
본 명세서에 개시된 핵산 작제물은 넌센스 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 분리된, 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 핵산 서열 및 청색 형광 단백질(BFP)을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 넌센스 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 소정의 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환에 기초하는 것으로 공지된 유전자의 돌연변이된 단편에 상응한다. 본 개시내용에 따른 핵산 작제물은 도식적으로 예를 들어 도 1a에 제시되어 있고, 넌센스 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 점선으로 제시된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 상응하는 "은, 넌센스 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오타이드의 서열이 상기 유전자에서 넌센스 돌연변이로 인해 결함이 있는 것으로 공지되고 소정의 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환에 기초하는 단백질을 코딩하는 유전자의 단편에 상동성이라는 것을 의미하고, 단편은 넌센스 돌연변이를 유도하는 유전자의 구역에 이르고, 즉 이것은 조기 중지 코돈을 포함한다.
넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 서열에 대해 다운스트림에 위치한 형광 단백질을 코딩하는 구역의 번역은 예를 들어 하기 본 명세서에 기재된 항생제 마크롤라이드의 존재 하에 리드-쓰루 물질에 의해서만 유도될 수 있다.
도 4a 및 도 4b에서 하기 예시된 바대로, 넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 서열에 다운스트림에 위치한 형광 단백질인 BFP의 형광 강도는 에리쓰로마이신의 존재 하에 증가하여, 어셔 증후군 및 레트 증후군과 관련된 유전자에 대해 예를 들어 실시예 5에 입증된 바대로 핵산 서열의 가변 상황에서 GFP 및 BFP를 포함하는 완전한 융합 단백질의 리드-쓰루를 촉진하는 에리쓰로마이신의 능력을 나타낸다.
리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드 화합물과 같은 물질의 능력은 본 명세서에 기재된 검정을 이용하여 시험되고 하기 본 명세서에서 실시예 부분에 예시될 수 있다.
따라서, 현재 개시된 대상의 실시형태에서, 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하고,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하고 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
이렇게 확인된 리드-쓰루 물질은 조성물에서 활성 성분을 구성한다.
상기 표시된 바대로, CSF에서 치료학적으로 효과적인 용량을 성취하기 위해 오직 효과적이고 비독성인 투여 경로는 항생제 마크롤라이드의 비전신 투여, 예를 들어 중추 신경계(CNS)로의 직접 주사(그러나, 이에 제한되지는 않음)일 것이다.
따라서, 현재 개시된 대상의 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 조성물은 치료학적 유효 용량으로 CNS에 직접 투여된다.
즉, 현재 개시된 대상의 실시형태에서, 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 CNS에 직접 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하고,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하고 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
상기 기재된 바대로, 전장 기능성 단백질의 심지어 낮은 수준의 번역은 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 겪는 환자에게 임상적 유의성을 갖는 것으로 예상된다.
따라서, 이의 양상 중 다른 하나에서, 본 개시내용은 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하여, 적어도 하나의 넌센스 돌연변이로부터 생긴 비기능성 형태의 상기 세포내 또는 세포이하 단백질의 생성과 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 적어도 하나의 증상 또는 병증을 치료하기 위해 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
용어 " 생성을 적어도 부분적으로 복원 " 또는 " 적어도 부분 생성을 복원 "은 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질의 생성(번역)의 적어도 부분 증가, 생성, 증분 또는 상승, 즉 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 전장 단백질의 번역을 의미한다. 세포내 기능성 단백질의 생성의 상기 증가, 증분 또는 상승은 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100%일 수 있다.
용어 " 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질 "은 생물학적 기능을 갖고 세포 내에서 또는 이의 보체에서 생성된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 전장 단백질을 의미한다.
용어 " 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 적어도 하나의 증상 또는 병증 "은 걸음걸이, 이동 및 조정력, 근육 약화, 감각 질병 인지 손상 및 지적 능력의 질병을 의미한다.
따라서, 현재 개시된 대상의 실시형태에서, 본 개시내용은 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하여, 적어도 하나의 넌센스 돌연변이로부터 생긴 비기능성 형태의 상기 세포내 또는 세포이하 단백질의 생성과 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 적어도 하나의 증상 또는 병증을 치료하기 위해 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 CNS에 직접 투여된다.
현재 개시된 대상의 몇몇 실시형태에서, 상기 세포내 기능성 단백질의 생성을 상기 적어도 부분적으로 복원하는 것은 생성된 전체 단백질의 기능성 단백질의 적어도 7% 생성이다.
현재 개시된 대상의 다른 실시형태에서, 상기 세포내 기능성 단백질의 생성을 상기 적어도 부분적으로 복원하는 것은 생성된 전체 단백질의 기능성 단백질의 약 7% 내지 약 25% 생성이다.
즉, 항생제 마크롤라이드를 포함하는 현재 개시된 조성물은 적어도 부분적으로, 즉 전장 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질의 번역의 약 7% 내지 약 25% 범위를 복원하는 데 효과적일 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 " 마크롤라이드 "는 하나 이상의 데옥시 당, 보통 클라디노스 및 데소사민이 부착될 수 있는 마크롤라이드 고리, 대형 대환식 락톤 고리의 존재로부터 활성이 기원하는 약물(통상적으로 항생제)의 그룹을 의미한다. 락톤 고리는 보통 14원, 15원, 또는 16원이다. 마크롤라이드는 폴리케타이드 유형의 천연 생성물에 속한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 마크롤라이드는 또한 이의 염, 유도체 및 유사체를 포괄한다.
본 개시내용에 따른 마크롤라이드는 아잘라이드, 아지쓰로마이신, 보로마이신, 브레펠딘, 카디시딘, 크랄리쓰로마이신, 다이리쓰로마이신, 에리쓰로마이신, 피닥소마이신, 필리핀, 플로프리스틴, 플루리쓰로마이신, 요사마이신, 키타사마이신, 마크로신, 메파르트리신, 미데카마이신, 미오카마이신, 나르게니신, 올렌도마이신, 올리고마이신, 펜타마이신, 피크로마이신, 프리스티나마이신 iia, 프리스티나마이신 iib, 로키타마이신, 록시쓰로마이신, 솔리쓰로마이신, 스피라마이신, 스트렙토그라민 a, 스트렙토바리신, 틸미코신, 트롤렌도마이신, 툴라쓰로마이신, 틸로신 및 비르기니아마이신을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 유도체 "는, 마크롤라이드 화합물을 언급할 때, 유도체가 본 명세서에서 정의된 바와 같은 모 화합물과 동일한 또는 유사한 생물학적 특성/활성을 갖도록 하나 이상의 구성성분, 치환기 및/또는 기능성 그룹으로 모 화합물과 다른 모 화합물로부터 유래한 화학 변형된 화합물을 의미한다.
하기 예시된 바대로, 본 발명자들은 마크롤라이드 에리쓰로마이신, 및 아지쓰로마이신이 전장 단백질의 번역을 복구하는 데 효과적인, 즉 리드-쓰루 물질로서 효과적이라는 것을 밝혀냈다.
본 명세서에서 정의된 용어 " 항생제 마크롤라이드 "는 따라서 항생제 활성을 갖는 마크롤라이드, 예를 들어 아지쓰로마이신, 크랄리쓰로마이신, 다이리쓰로마이신, 에리쓰로마이신, 록시쓰로마이신, 텔리쓰로마이신, 카보마이신 A, 요사마이신, 키타사마이신, 미데카마이신/미데카마이신 아세테이트, 올렌도마이신, 솔리쓰로마이신, 스피라마이신, 트롤렌도마이신 및 틸로신/틸로신(이들로 제한되지는 않음)을 의미한다.
따라서, 현재 개시된 대상의 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 에리쓰로마이신, 아지쓰로마이신 및 크랄리쓰로마이신 또는 이들의 적어도 2종의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 마크롤라이드를 포함한다.
본 발명의 실시형태에 따라 사용되는 마크롤라이드 화합물 또는 이의 염은 상업적으로 이용 가능하고, 또한 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 마크롤라이드는 에리쓰로마이신이다. 에리쓰로마이신은 CAS 등록 번호 114-07-8로 확인될 수 있다. 에리쓰로마이신 염 및 유도체의 예는, 제한 없이, 에리쓰로마이신 락토비오네이트, 에리쓰로마이신 에틸숙시네이트, 에리쓰로마이신 스테아레이트, 에리쓰로마이신 에스톨레이트, 에리쓰로마이신 에스토레이트, 에리쓰로마이신 이시스트레이트, 에리쓰로마이신 글루셉테이트, 에리쓰로마이신 프로피오네이트, 에리쓰로마이신 살나세딘, 에리쓰로마이신 A, B, C, D, 또는 E, 록시쓰로마이신, 크랄리쓰로마이신, 아지쓰로마이신, 디리씨오마이신, 플루리쓰로마이신, 및 미국 특허 6777543호, 6825171호 및 5,602,106호 및 WO2002/050093호에 기재된 것과 같은 유도체를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 마크롤라이드는 아지쓰로마이신이다. 아지쓰로마이신은 CAS 등록 번호 83905-01-5로 확인될 수 있다. 이의 구조 및 항생제 활성은 예를 들어 미국 특허 4,474,768호 및 4,517,359호에 개시되어 있다.
몇몇 실시형태에서, 마크롤라이드는 크랄리쓰로마이신이다. 크랄리쓰로마이신은 CAS 등록 번호 81103-11-9로 확인될 수 있다. 이의 구조 및 항생제 활성은 예를 들어 미국 특허 4331803호에 개시되어 있다.
상기 표시된 바대로, 본 개시내용에 따른 조성물은 CNS에 직접 투여될 수 있다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 용어 " 중추 신경계 "(CNS)는 감각 자극이 전달되고 운동 자극이 통과하고, 전체 신경계의 활성을 조정하는 척추동물에서 뇌 및 척수로 이루어진 신경계의 부분으로서 정의된다.
CNS로의 직접 투여의 예는 척추강내 투여(이것이 뇌척수액에 도달하도록 척수의 거미막밑 공간으로의 치료학적 물질의 도입), 및 뇌로의 직접 투여, 예컨대 대뇌내, 뇌실내, 두개내 투여 경로를 포함한다. 이러한 투여 경로는 중추 신경계에 영향을 미치는 질환에 특히 유리할 수 있다.
따라서, 상기 및 다른 실시형태에서 본 개시내용에 따른 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 및 두개내로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로로 투여된다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 척추강내로 투여된다.
즉, 현재 개시된 대상의 실시형태에서, 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 척추강내로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하고,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를 (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 서열을 포함하고 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
하기 예에 예시된 바대로, 본 발명자들은 질환 레트 증후군과 관련된 전장 단백질 MeCP2 및 질환 모세혈관확장 운동실조와 관련된 전장 단백질 ATM의 번역이 에리쓰로마이신 또는 아지쓰로마이신(각각 예를 들어 도 6 및 도 3 참조)의 존재 하에 이 단백질을 코딩하는 유전자에서 중지 코돈을 보유한 세포의 배양 시 얻어진다는 것을 밝혀냈다.
따라서, 현재 개시된 대상의 모든 실시형태 및 양상에서, 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환은 척수성 근위축증, 모세혈관확장 운동실조, 레트 증후군, 어셔 증후군, 페록시좀 생물발생 장애, 헐러 증후군, 리소좀 저장 질환, 활성화 결핍증/GM2 갱글리오사이드 축적증, 알파 만노스 축적증, 아스파르틸글루코사민뇨증, 콜레스테릴 에스터 저장 질환, 만성 헥소사미니디아제 A 결핍증, 시스틴증, 다논 질병, 파브리병, 파버병, 푸코시드축적증, 갈락토시알리도시스, 고쉐병, GM1 갱글리오사이드 축적증, I-세포 질환/뮤코리피드증 II, 소아 유리 시알산 저장 질환/ISSD, 연소기 헥소사미니디아제 A 결핍증, 크라베병, 리소솜 산 리파제 결핍증, 이염성 백질이영양증, 뮤코다당증 질병, 다종 술파타제 결핍증, 니만 픽병, 신경성 지방갈색소증, 폼피병/글리코겐 저장 질환 II형, 농축 이골증, 샌드호프병/성인 발병/GM2 갱글리오사이드 축적증, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 유아, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 연소기, 쉰들러병, 살라병/시알산 저장 질환, 테이 삭스/GM2 갱글리오사이드 축적증, 여성 질환, 척수소뇌변성증, 샤를부아-사기네이의 보통염색체 열성 경직성 운동실조, 간헐성 운동실조(Ea), 보통염색체 열성 소뇌성 운동실조(ARCA), 척수성 근위축증, 파킨슨병, 타우병증, 프로그로이드 증후군, 베르너 증후군, 말초신경병증, 청력 손실, 운동실조, 망막색소변성증 및 백내장(PHARC), 샤리코-마리-투스(CMT), 프리온병, 유아 신경원성 세로이드 리포푸신증, 뉴로세르핀 봉입체에 의한 가족성 뇌증, 대리어병 질환, 판상증, 에머리-드레이퓨즈 근위축증, 지대형근 근위축증 1B형, 듀니건형 가족성 부분 지방영양이상증, 바라퀘-시몬스 증후군, 부쉬케-올렌도프 증후군, 듀니건형의 가족성 부분 지방영양이상증(FPLD), 백질이영양증, 탈수초, 성인 발병, 상염색체 우성(ADLD), 펠리제우스-메르츠바하병, 및 이들의 임의의 조합일 수 있다.
현재 개시된 대상의 몇몇 실시형태 및 양상에서, 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환은 레트 증후군이다.
본 명세서에 정의된 용어 "레트 증후군", 또는 " RTT "(원래 대뇌위축성 고암모니아혈증이라 칭함)는 거의 배타적으로 여성에 영향을 미치는(레트 증후군은 12살 이상의 매 12,500명의 여성에 영향을 미친다) 뇌의 회백질의 신경진행성 질병을 의미한다. 임상 특징은 작은 손 및 다리 및 머리 성장 속도의 감속(몇몇에서는 소두증 포함)을 포함한다. 레트 증후군을 앓는 사람은 위장관 질병에 노출되기 쉽고, 이들은 통상적으로 구술 능력을 갖지 않고, 이환된 개체 중 약 50%는 걷지 않는다. 척추측만증, 성장 부전 및 변비는 매우 흔하고 문제가 될 수 있다.
유전적으로, 레트 증후군은 X 염색체에 기초한 유전자 MECP2에서 돌연변이에 의해 야기되고, 산발적으로 또는 생식선 돌연변이로부터 생길 수 있다. 레트 증후군은 초기에 임상 관찰로 진단되지만, MECP2 유전자에서 유전적 결합이 있는 경우 진단은 확정적이다. 레트 증후군 사례의 약 95%에서, 원인은 어린이에서의 신생 돌연변이이다.
이환된 유전자 메틸-CpG 결합 단백질-2(MeCP2)의 적어도 200개의 상이한 돌연변이는 미스센스, 넌센스(여기서, 번역된 단백질의 조기 말단이 발생함), 프레임 이동 및 결실을 포함하는 레트 증후군과 관련된 것으로 밝혀졌다.
따라서, 현재 개시된 대상의 실시형태에서, 넌센스 돌연변이와 관련된 레트 증후군의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 레트 증후군을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 척추강내로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하고,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를 (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재되고, 레트 증후군과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
현재 개시된 대상의 다른 실시형태 및 양상에서, 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환은 운동실조 모세혈관확장증(A-T)이다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 용어 "운동실조 모세혈관확장증"(A-T)(또한 루이-바 증후군(Louis-Bar syndrome)이라 칭함)는 심각한 장애를 발생시키는 희귀, 신경퇴행성, 유전 질환이다. 운동실조는 작은 확장된 혈관에 대한 모세혈관확장증 및 협동 저하를 의미하고, 이들 둘 다 질환의 특징이다. A-T는 소뇌를 포함하는 뇌의 특정 구역을 손상시켜, 이동 및 협동이 어렵게 하고, 면역계를 약화시켜 감염에 대한 소인을 야기하고 파괴된 DNA의 보수를 방지하여, 암의 위험을 증가시킨다. A-T는 특히 조기 종결 코돈일 수 있는 운동실조 모세혈관확장증 돌연변이된(ATM) 유전자에서의 결함에 의해 야기된다. ATM은 DNA 이중 말단 파괴에 의해 동원되고 활성화된 세린/트레오닌 단백질 키나제이다.
따라서, 현재 개시된 대상의 또 다른 실시형태에서, 넌센스 돌연변이와 관련된 운동실조 모세혈관확장증의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 운동실조 모세혈관확장증을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 척추강내로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하고,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 운동실조 모세혈관확장증과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하고 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
하기 예시된 바대로, 에리쓰로마이신의 상이한 용량의 효과가 도 4a 및 도 4b(실시예 5)에 입증된 바대로 장기 질환, 예를 들어 어셔 증후군과 관련된 유전자에서 2개의 추가적인 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루에서 시험된다.
현재 개시된 대상의 다른 실시형태에서, 어셔 증후군의 치료를 필요로 하는 환자에서 어셔 증후군을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 척추강내로 투여된다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 " 어셔 증후군 "은 청력 손실 또는 난청 및 진행성 시력 저하를 특징으로 하는 병증을 의미한다. 시력 저하는 눈의 뒤쪽(망막)에서 광 민감 조직의 층에 영향을 미치는 망막색소변성증(RP)이라 불리는 눈 질환에 의해 야기된다. 시력 저하는 점차 악화하는 망막의 광 민감 세포로서 생긴다. 야간 시력 저하가 처음에 발생하고, 측면(말초) 시야에서 전개되는 맹점이 생긴다. 시간이 지남에 따라, 이 맹점은 확대되고 합쳐져서 터널 시야를 생성한다. 어셔 증후군의 몇몇 경우에, 시야는 눈의 렌즈의 혼탁화(백내장)에 의해 추가로 손상된다. I형, II형 및 III형이라 칭하는 어셔 증후군의 3가지 주요 형태가 확인되었다. 이러한 유형은 징후 및 증상이 나타날 때 이의 중증도 및 연령에 의해 구별된다.
하기 실시예 9에 예시된 바대로, 본 개시내용에 따른 조성물은 척수성 근위축증 환자로부터 얻은 섬유아세포에서 하기 본 명세서에 정의된 SMN1 단백질과 동일한 전장 SMN2 단백질의 번역을 유도하는 데 있어서 또한 효과적이다.
따라서, 현재 개시된 대상의 이의 양상 중 다른 하나에서, 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 " 척수성 근위축증 "(SMA)은 생존 운동 뉴런 1(SMN1) 유전자의 손실에 의해 발생한 유전 보통염색체 열성 신경퇴행성 질환이다. SMA는 대략 1:6000-1:10,000의 질환 유병률로 전세계에서 유아 사망률의 주요한 유전적 원인이다. SMA는 골격근 약화 및 위축증을 발생시키는 척수의 전각 내의 운동 뉴런의 퇴화를 특징으로 한다. 근육 약화 및 위축증은 대칭적이고 진행성이어서, 대개는 팔보다 다리에 더 많이 영향을 미쳐서, 결국 늑간 활성을 감소시킨다. 호흡 부전 및 합병증은 SMA 환자에서 대부분의 조기 사망의 원인이다(18).
모든 SMA 환자는 엑손 7 내의 침묵, 단일-뉴클레오타이드 이행에 의해서만 분화된, SMN1 유전자와 거의 동일한 SMN2 유전자의 하나 이상의 카피를 보유한다. 단일 비중합성 뉴클레오타이드는 SMN2의 엑손 7(840C>T)의 5' 말단에서 달라서 대부분의 SMN2 유래 전사체가 대안적으로 스플라이싱되게 하여, 통상적인 최종 코딩 엑손(엑손 7)이 결여된 아이소폼을 생성한다. 따라서, SMN2는 낮은 수준의 전장 SMN 및 높은 수준의 절두된 SMNΔ7 아이소폼을 생성한다. SMN2에 의해 생성된 전장 단백질은 SMN1(전장, 비결함 또는 비절두 단백질 SMN1 및 SMN2 둘 다는 본 명세서에서 SMN 단백질이라 칭해질 수 있음)에 의해 생성된 기능성, 비결함 단백질과 동일하다. 따라서, SMA는 SMN2 유전자에서 조기 중지 코돈과 또한 관련된다.
절두된 SMNΔ7 단백질 생성물은 기능장애성이고 불안정하다. SMN2 유전자로부터 생성된 소량의 기능성 단백질은 SMN1의 손실을 완전히 보상할 수 없다. SMN2 유전자는 조기 중지 코돈을 포함한다.
따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 조성물이 있고, 여기서 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 전장 SMN2의 생성을 증가시킨다.
용어 " 전장 SMN의 생성을 증가시킨다 "는 전장 SMN의 번역의 적어도 부분 증가, 증분 또는 상승을 의미한다. 전장 SMN의 번역의 상기 증가, 증분 또는 상승은 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100%일 수 있다.
현재 개시된 대상의 실시형태에서, 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 비전신으로 투여된다.
현재 개시된 대상의 다른 실시형태에서, 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 SMN2 유전자에 존재하는 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하여, SMN2 전장 단백질의 수준을 증가시킨다. 현재 개시된 대상의 또 다른 실시형태에서, 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 SMN2 유전자에서 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된, 상기 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈을 포함하는 SMN2 유전자의 단편에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈을 포함하는 SMN2 유전자(SMN2 유전자는 본 명세서에서 서열 번호 11로 표시됨)의 단편에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물은 CNS로 직접 투여된다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 및 두개내로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로로 투여된다.
추가의 실시형태에서, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물은 척추강내로 투여된다.
즉, 현재 개시된 대상의 또 다른 실시형태에서, 척수성 근위축증(SMA)의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 척추강내로 투여되며, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된, 상기 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈을 포함하는 SMN2 유전자의 단편에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
현재 개시된 대상의 모든 양상 및 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 " 조성물 "은 또한 "약제학적 조성물" 또는 "의학 조성물"일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 약제학적 조성물 "은 다른 불활성 화학 성분, 예컨대 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 명세서에 기재된 1종 이상의 화합물(마크롤라이드)의 제형을 의미한다. 약제학적 조성물의 목적은 대상체에게 활성 성분(마크롤라이드 항생제)의 투여를 촉진하는 것이다.
약물의 제법 및 투여에 대한 기법은 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences', Mack Publishing Co., Easton, PA, (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 20th ed, 2000)에서 확인될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 분야에 널리 공지된 공정에 의해, 예를 들어 종래의 혼합, 용해, 과립화, 드라제 제조, 가루화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 따라서 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로의 활성 성분의 공정처리를 수월하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 1종 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 종래의 방식으로 제제화될 수 있다. 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다.
담체의 예는, 제한 없이, 락토스, 수크로스, 물, 유기 용매 및 폴리에틸렌글라이콜이다.
담체는 추가적인 부형제, 예컨대 결합제, 붕해제, 활택제, 표면 활성제(계면활성제), 유화제, 보존제 및 향료를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분이 하기 본 명세서에 추가로 기재된 바대로 의도하는 목적을 성취하기에 효과적인 양으로 포함된 조성물을 포함한다.
현재 개시된 대상은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환 또는 이러한 질환의 증상 또는 특징의 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 " 치료하는 " 또는 " 치료 "는 하기 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: (1) 질환을 예방하는 것, 즉 질환의 증상 또는 징후를 표현하거나 나타내지 않지만 질환(예를 들어, 돌연변이된 유전자를 발현하는 포유동물)에 노출되거나 이에 소인이 있을 수 있는 포유동물에서 질환의 임상 증상 또는 징후가 발생하지 않게 하는 것; (2) 질환을 저해하는 것, 즉 질환 또는 이의 임상 증상 또는 징후의 발생 속도를 정지시키거나 감소시키는 것; (3) 질환을 경감시키거나 완화시키는 것, 즉 질환 또는 이의 임상 증상 또는 징후의 부분 또는 완전 회귀를 발생시키는 것. 용어 " 치료하는 "은 기능성 단백질의 형성/생성을 촉진하는 것을 포괄한다.
또한 추가로, 현재 개시된 대상은 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
현재 개시된 대상은,
a. 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 제1 핵산 서열;
b. 청색 형광 단백질(BFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열; 및
c. 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 개재된 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 제3 핵산 서열(여기서, 제3 핵산 서열은 넌센스 돌연변이를 포함함)
을 포함하는 핵산 작제물을 추가로 제공하고;
제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에서 인프레임으로 연결된다.
일반적으로, 본 개시내용의 핵산 작제물의 구조는 5'에서 3' 방향으로 (1) 프로모터; (2) 제1 형광 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; (3) 넌센스 돌연변이(또한 본 명세서에서 "조기 중지 코돈"이라 칭함)를 포함하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 서열; (4) 제2 형광 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (6) 일반 종결 신호를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 작제물은 따라서 넌센스 돌연변이를 포함하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 서열, 즉 공지된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 유전자에서 돌연변이된 서열에 상응하거나 이에 상동성인 돌연변이된 서열을 포함하고, "돌연변이"는 조기 말단 또는 중지 코돈이다.
조기 종결 코돈은 임의의 공지된 중지 코돈(UAG, UAA 및 UGA)일 수 있다. 통상적으로, 돌연변이 또는 조기 중지 코돈을 함유하는 서열의 길이는 적어도 45개의 뉴클레오타이드, 예를 들어 적어도 46개, 적어도 47개, 적어도 48개, 적어도 49개, 적어도 50개의 뉴클레오타이드이다. 돌연변이 또는 조기 중지 코돈은 일반적으로 서열의 중간에 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 핵산 " 또는 " 폴리뉴클레오타이드(들) "는 단일 또는 이중 가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 작제물 "은 하나 이상의 핵산 서열로 이루어질 수 있는 인공 조립되거나 단리된 핵산 분자를 의미하고, 핵산 서열은 코딩 서열(즉, 최종 생성물을 코딩하는 서열), 조절 서열, 비코딩 서열, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 바대로 용어 " 오픈 리딩 프레임 "("ORF")은 하나의 시작 코돈 및 하나의 중지 코돈을 함유하는 코딩 구역에 관한 것이다. 본 발명에 따른 오픈 리딩 프레임은 상기 기재된 "일반" 시작 코돈과 중지 코돈 사이에 위치한 돌연변이된, 조기 중지 코돈을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 리드-쓰루가 발생하지 않는 경우, 생성된 단백질은 조기 종결 코돈에서 종료할 것이다. 리드-쓰루가 발생하는 경우, 전체 ORF는 완전 번역될 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 인 프레임 "은, 하나 이상의 핵산 서열을 언급할 때, 이의 정확한 판독 프레임이 보존되도록 이 서열이 연결된다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 정의된 바와 같은 용어 " 연결된 "은 다양한 핵산 서열이 포스포다이에스터 결합에서 공유 결합된다는 것을 의미한다.
용어 " 사이에 개재된 "은 핵산 서열 또는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열이 다른 핵산 서열, 구체적으로 형광 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 의해 말단 둘 다(업스트림 및 다운스트림)에서 플랭킹된다는 것을 의미한다. 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 구체적인 개재된 핵산 서열은 본 명세서에 기재된 바대로 넌센스 돌연변이 또는 중지 코돈을 보유하는 돌연변이된 단백질의 단편에 상동성이거나 이에 상응하는 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 " 업스트림 " 및 " 다운스트림 "은 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 DNA 서열 또는 RNA 서열에서 상대 위치를 의미한다. 널리 공지된 바대로, 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 골격의 당(데옥시리보스 또는 리보스) 고리에서 탄소에 칭해지는 5' 말단 및 3' 말단을 갖는다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열에서의 위치에 비해, 용어 다운스트림은 서열의 3' 말단을 향한 구역에 관한 것이다. 용어 업스트림은 가닥의 5' 말단을 향한 구역에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 작제물은 녹색 및 청색 형광 단백질을 포함한다.
적합한 청색 형광 단백질은 애드젠(Addgene)사의 EBFP(380-440), EBFP2(383-448) 및 에브로젠(Evrogene)사의 TagBFP(402-457)를 포함한다. 적합한 녹색 형광 단백질은 애드젠사의 EGFP(488-507), 에브로젠사의 TurboGFP(482-502), TagGFP(482-505), ACGFP1(484-510), TagGFP2(483-506) 및 인비트로겐(Invitrogene)사의 Emerald(487-509)를 포함한다. 숫자는 특정한 FACS 기계 레이저 및 필터에 따라 선택된 각각의 형광 단백질의 여기(㎚) 및 방출(㎚)을 의미한다. 상기 단백질의 서열 및 이를 코딩하는 서열은 당해 분야에 공지되어 있다.
구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 사용되는 GFP는 서열 번호 9로 칭하는 핵산 서열을 갖고, 본 명세서에 사용되는 BFP는 서열 번호 10으로 칭하는 핵산 서열을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 핵산 작제물이 있고, 여기서 GFP는 BFP에 업스트림이다.
상기 예시된 바대로, 본 발명자들은 GFP를 코딩하는 제1 핵산 서열, BFP를 코딩하는 제2 핵산 서열 및 GFP와 BFP 사이에 개재된 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 제3 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 이용하고, 제3 핵산 서열은 넌센스 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 제3 핵산 서열은 운동실조 모세혈관확장증 돌연변이된(ATM) 단백질을 코딩하는 유전자에 보유된 넌센스 돌연변이(중지 코돈)를 포함하고, 중지 코돈을 포함하는 핵산 서열은 서열 번호 3으로 칭해진다. 이러한 핵산 작제물은 운동실조 모세혈관확장증과 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 물질(예를 들어, 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드)을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 확인된 물질은 이 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 제3 핵산 서열은 유전자 카데린-23 유전자(CDH23)에 보유된 넌센스 돌연변이(중지 코돈)를 포함하고, 중지 코돈을 포함하는 핵산 서열은 서열 번호 6으로 칭해진다. 이러한 핵산 작제물은 어셔 증후군과 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 물질(예를 들어, 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드)을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 확인된 물질은 이 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 제3 핵산 서열은 MECP2 유전자에 보유된 넌센스 돌연변이(중지 코돈)를 포함하고, 중지 코돈을 포함하는 핵산 서열은 서열 번호 8로 칭해진다. 이러한 핵산 작제물은 레트 증후군과 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 물질(예를 들어, 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드)을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 확인된 물질은 이 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 제3 핵산 서열은 SMN2 단백질(SMN2 유전자는 서열 번호 11로 칭해짐)을 코딩하는 SMN2 유전자에 천연 보유된 중지 코돈을 포함한다. 이러한 핵산 작제물은 척수성 근위축증(SMA)과 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 물질(예를 들어, 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드)을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 확인된 물질은 이 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 작제물은 제1 서열, 제2 서열과 제3 서열 사이에 개재된 하나 이상의 링커 서열을 포함한다. 이러한 링커 서열은 예를 들어 오픈 리딩 프레임을 유지하기 위해 삽입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 작제물은 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 사이에 개재된 하나 이상의 링커 핵산 서열을 추가로 포함한다.
임의의 유형의 플라스미드, 코스미드, YAC 또는 바이러스 벡터는 표적 세포/세포 집단으로 직접 도입될 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 재조합 DNA 작제물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 원하는 표적 세포를 선택적으로 감염시키는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 현재 개시된 대상은 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 벡터를 제공한다.
용어 " 벡터 "는 숙주 세포로 작제물을 수송하고/하거나 숙주 세포에서 작제물 내에 포함된 핵산 서열을 발현시키기 위해 사용된 폴리뉴클레오타이드 분자, 보통 이중 가닥 DNA를 의미한다. 벡터는 적어도 하나의 추가적인 숙주 시스템, 예컨대 이. 콜라이에서 복제할 수 있다. 벡터는 벡터를 함유하는 세포의 선택에 허용하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 많은 바이러스, 원핵 및 진핵 발현 벡터는 공지되어 있고/있거나 상업적으로 구입 가능하다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당해 분야의 당업자의 지식 내에 있다.
바이러스 벡터는 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 폭시이리다에(Poxyiridae), 아데노비리다에(Adenoviridae), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 파필로마비리다에(Papillomaviridae), 파르보비리다에(Parvoviridae), 헤파드노비리다에(Hepadnoviridae), 레트로비리다에(Retroviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 뉴모비리다에(Pneumoviridae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 오르토믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 부니아비리다에(Bunyaviridae), 한타비리다에(Hantaviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae), 칼리시비리다에(Caliciviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae) 또는 헤파시비리다에(Hepaciviridae)로부터 선택될 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다.
당해 분야에 공지된 바대로, 벡터는 이의 조작에 필요한 다양한 다른 폴리뉴클레오타이드 서열(예컨대, 예를 들어, 조절 서열, 비코딩 서열, 구조 서열 등)을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 숙주 세포를 핵산 작제물로 형질감염시키는 단계를 포함한다. 형질감염된 세포를 이후 시험된 물질과 접촉시킨다.
따라서, 현재 개시된 대상은 본 명세서에 정의된 바와 같은 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포 또는 현재 개시된 대상의 핵산 작제물을 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 임의의 종의 임의의 세포 또는 세포주는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 진핵 세포이다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 포유동물 세포이다.
핵산 분자는 핵산 분자의 합성에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이들은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 상업적으로 구입 가능한 시약 및 합성장치를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
조립 작제물 및 벡터를 생성하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 문헌[Sambrook et ah, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987; Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing, 1987]에 일반적으로 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 " 프로모터 구성요소 ", " 프로모터 " 또는 " 프로모터 서열 "은 코딩 서열의 5' 말단(즉, 업스트림에 위치하여 진행함)에 일반적으로 위치하고 스위치로서 작용하여, 코딩 서열의 발현을 활성화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 코딩 서열이 활성화되면, 이것은 전사된다고 말해진다. 전사는 일반적으로 코딩 서열로부터 RNA 분자(예를 들어, mRNA 등)의 합성을 포함한다. 따라서, 프로모터는 전사 조절 구성요소로서 작용하고 또한 mRNA로의 코딩 서열의 전사의 개시를 위한 자리를 제공한다. 프로모터는 네이티브 공급원으로부터 이의 전체가 유래하거나, 자연에 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래한 상이한 구성요소로 구성되거나, 심지어 합성 뉴클레오타이드 분절을 포함할 수 있다.
당해 분야의 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 발생의 상이한 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여, 또는 다양한 발현 수준에서 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대부분의 시기에 대부분의 세포 유형에서 발현시키고자 하는 유전자를 발생시키는 프로모터는 흔히 " 구성적 프로모터 "라 칭한다. 특정한 조직에서 유전자 발현을 유도하는 프로모터는 " 조직 특이적 프로모터 "라 칭한다.
사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 SV40 초기 프로모터 구역, 티미딘 키나제, 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터, 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터, 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열, 바이러스 CMV 프로모터, 인간 융모성 고나도트로핀-베타 프로모터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 " 도입하는 " 및 " 형질감염 " 또는 " 형질감염시키는 "은 상호호환적으로 사용될 수 있고, 표적 세포(들), 및 더 구체적으로 표적 세포(들)의 막 밀폐 공간의 내부로의 분자, 예를 들어 핵산, 폴리뉴클레오타이드 분자, 벡터의 수송을 의미한다. 분자는 예를 들어 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)]에 교시된 바대로 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 표적 세포(들)로 "도입"될 수 있다. 세포로 분자를 "도입시키는" 수단은 예를 들어 열 쇼크, 인산칼슘 형질감염, PEI 형질감염, 전기영동, 리포펙션, 형질감염 시약(들), 바이러스 매개 전달 및 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 세포의 형질감염은 임의의 기원의 임의의 유형의 세포, 예를 들어 인간 세포, 동물 세포, 식물 세포 등에서 수행될 수 있다.
본 발명의, 또는 본 발명의 스크리닝 방법에서 사용하기 위한 숙주 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵세포이다. 몇몇 실시형태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 예시적인 포유동물 세포 유형은 HEK293T 및 HCT116을 포함한다.
숙주 세포는 작제물 또는 벡터로 일시적으로 형질전환될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 작제물로 안정하게 형질전환된 숙주 세포주가 개발될 수 있다. 일시적인 또는 안정한 형질전환을 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 양상에 따르면, 조기 종결 코돈의 리드-쓰루를 유도할 수 있는 물질을 확인하기 위한 방법이 제공된다.
현재 개시된 대상은 하기 기재된 바대로 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 물질을 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 리드-쓰루를 유도하는 후보물질은 특히 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드일 수 있다.
따라서, 현재 개시된 대상의 추가의 양상에 의해 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 유도하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은,
a. 후보 마크롤라이드를 (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하고 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단을 접촉시키는 단계로서; 업스트림, 다운스트림 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
b. 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계를 포함하고;
상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타낸다.
상기 방법은 본 발명의 핵산 작제물을 함유하는 세포를 시험된 물질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 핵산 작제물은 제1의, 업스트림 형광 단백질을 코딩하는 서열, 및 제2의, 다운스트림 형광 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 이 2개의 서열은 넌센스 돌연변이를 포함하는 서열에 의해 분리된다. 바람직하게는, 이 서열은 적어도 45개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
" 접촉시키는 "은 작제물 내에 함유된 핵산 서열의 전사 및 번역(발현)을 허용하는 조건 하에 수행되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 작제물이 유도성 프로모터를 함유하는 경우, 적합한 유도 분자는 시험 샘플에 첨가되어야 한다. 또한, 접촉은 바람직하게는 완충제 및 염(예컨대, KC1, NaCl 및 또는 MgCl2)의 조합을 포함하는 수용액 중에 수행된다.
본 발명의 방법은 상이한 배양 시간을 이용하여 수행될 수 있다. 배양 시간은 형광이 측정되기 전에 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간일 수 있다.
상기 방법은 상기 물질의 존재 하에 작제물을 발현하는 세포에서 및 상기 물질의 부재 하에 작제물을 발현하는 세포에서 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 물질(예를 들어, 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드)과 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 물질과 접촉한 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 물질이 리드-쓰루 물질(예를 들어, 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드)이라는 것을 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 약 2 내지 15%의 증가는 상기 물질이 임상 용도를 위한 적합한 리드-쓰루 물질이라는 것을 나타낸다.
다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계를 형광 활성화 세포 분류기(FACS)에 의해 수행할 수 있다. 현재 바람직한 실시형태에서, 업스트림 및 다운스트림 형광 단백질 둘 다를 발현하는 세포는 FACS에 의해 분류되고, 다운스트림 형광 단백질의 형광 강도는 분류된 세포에서만 측정된다.
통상적으로, 평균 형광 강도(MFI)는 상기 물질에 노출된 세포 집단 및 상기 물질에 노출되지 않은 세포 집단에 대해 계산되고, MFI 값이 비교된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 2개의 형광 단백질은 리드-쓰루에 대한 필요 없이 융합 단백질로서 항상 동시 발현되도록 대조군 작제물에서 넌센스 돌연변이가 없다는 것을 제외하고는(즉, 대조군 작제물은 조기 종결 코돈을 포함하지 않음) 본 발명의 작제물과 유사한 대조군 작제물의 사용을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 바람직하게는 작제물을 발현하기 위해 온전한 세포, 및 검출을 위해 유세포 분석기를 사용하여 실행될 수 있지만, 상기 방법은 실험실내 번역을 이용하여 수행되고/되거나, 형광을 검출하거나 측정하기 위한 다른 기법을 이용하도록 변형될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 스크리닝 방법은 후보 리드-쓰루 물질을 세포 비함유 추출물과 접촉시킴으로써 수행된다. 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 임의의 기법은 번역에 대해 세포 비함유 추출물을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 세포 비함유 추출물은 세포를 원심분리하고 상청액을 청명하게 함으로써 생성될 수 있다. 세포를 예를 들어 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 2일, 적어도 5일, 적어도 1주일 동안 세포 비함유 추출물의 제조 동안 얼음에서 항온처리할 수 있다. 바람직하게는, 세포를 얼음에서 항온처리되지 않은 세포 추출물과 비교하여 세포 추출물의 번역 활성을 개선하는데 충분히 길게 얼음에서 항온처리한다. 대안적으로, 세포를 약 0℃ 내지 10℃, 예를 들어 약 4℃의 온도에서 항온처리할 수 있다.
원심분리를 실험실내 번역 반응에 대해 세포 비함유 추출물을 단리시키기 위해 저속으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 세포 추출물은 약 2 x g 내지 20,000 x g, 약 5 x g 내지 15,000 x g, 약 10,000 x g에서 원심분리된 세포로부터의 상청액일 수 있다. 대안적으로, 세포 비함유 추출물은 약 SI 내지 S50 추출물, 예를 들어 약 S5 내지 S25 추출물, 약 S10 추출물일 수 있다.
세포 비함유 번역 추출물은 임의의 종 기원의 세포로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 세포 비함유 번역 추출물은 효모, 배양된 마우스 또는 랫트 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 제노푸스 난소세포, 망상적혈구, 밀 배아, 또는 호밀 배아로부터 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Krieg & Melton, 1984, Nature 308:203 and Dignam et al, 1990 Methods Enzymol. 182:194-203] 참조). 대안적으로, 세포 비함유 번역 추출물, 예를 들어 래빗 망상적혈구 용해물 및 밀 배아 추출물은 예를 들어 프로메가(Promega)(위스콘신주 매디슨)로부터 구입될 수 있다. 다른 대안으로서, 세포 비함유 번역 추출물은 국제 특허 공보 WO 01/44516호 및 미국 특허 4,668,625호에 기재된 바대로 제조된다. 몇몇 실시형태에서, 세포 비함유 추출물은 인간 세포, 예를 들어, HeLa 세포로부터 단리된 추출물이다.
몇몇 실시형태에서, 시험된 물질은 풀에서 스크리닝된다. 양성 풀이 확인되면, 이 풀의 개별 화합물이 별도로 시험될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 여기서 예를 들어 하기 예시된 바대로 업스트림 형광 단백질은 GFP이고, 다운스트림 형광 단백질은 BFP이다.
다른 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 여기서 넌센스 돌연변이를 포함하는 개재된 핵산 서열은 적어도 45개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
추가의 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 다운스트림 형광 단백질의 형광은 업스트림 및 다운스트림 형광 단백질 둘 다를 발현하는 세포에서만 측정된다.
다른 추가의 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법은 업스트림 및 다운스트림 형광 단백질 둘 다를 발현하는 세포를 검출하거나 분류하는 단계를 포함한다.
다른 추가의 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 적어도 약 7 내지 25%의 증가는, 후보 마크롤라이드가 임상 용도를 위한 적합한 리드-쓰루라는 것을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계는 형광 활성화 세포 분류기(FACS)에 의해 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법은 작제물을 포함하고 후보 마크롤라이드와 접촉한 세포와 넌센스 돌연변이를 갖지 않는 대조군 작제물을 포함하는 세포 사이의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준을 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법이 있고, 상기 마크롤라이드는 항생제 마크롤라이드이다.
현재 개시된 대상의 또 다른 양상에서, 하기 단계 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 포함하는 넌센스 돌연변이로부터 생기거나 이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법이 제공된다:
(ⅰ) 하기 a. 내지 f.를 포함하는 방법에 의해 상기 질환의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드를 선택하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드를 상기 대상체에게 투여하는 단계:
a. 상기 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 유전자에서 적어도 하나의 넌센스 돌연변이를 확인하는 단계;
b. (a)의 상기 확인된 돌연변이에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 단편 및 GFP 및 BFP로부터 선택된 2개의 명확한 형광 단백질을 코딩하는 2개의 핵산 서열에 의해 플랭킹된 이의 둘러싼 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물을 제공하는 단계로서, 단편 및 2개의 명확한 형광 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 제공하는 단계;
c. (b)의 작제물을 숙주 세포로 도입하는 단계; 및
d. (b)의 작제물을 포함하는 숙주 세포를 후보 리드-쓰루 마크롤라이드와 접촉시키는 단계; 및
e. 형광 단백질 둘 다를 포함하는 리드-쓰루 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계;
f. 형광 단백질 둘 다를 함유하는 리드-쓰루 폴리펩타이드의 존재는 상기 후보 리드-쓰루 마크롤라이드가 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드라는 것을 나타낸다.
몇몇 실시형태에서, 정확한 돌연변이(들)를 확인하기 위해 유전적 시험을 겪은 시험하고자 하는 대상체, 대상체는 대상체가 본 발명의 조성물에 의한 치료에 순응할 것이라는 것을 검증하기 위해 특정한 질환과 관련된 유전자에서 보유된다. 특정한 유전자에서 특이적 돌연변이를 확인하기 위한 유전적 시험은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 시험은 대개 본 명세서에 기재된 유전적 질환의 진단에 사용된다.
특정 질환 및 이의 관련 돌연변이에 대한 정보는 과학 문헌에서 이용 가능하다. 이러한 정보는 예를 들어 하기를 포함하는 데이터베이스에서 또한 발견될 수 있다:
- www.biobase-international.com/product/hgmd or at: www.hgmd.org/.에서 입수 가능한 HGMD(등록상표) 인간 유전자 돌연변이 데이터베이스.
- OrphaNet: www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php.에서 입수 가능한 희귀 질환 및 희귀 약물에 대한 정보에 대한 유럽 레퍼런스 포탈(European reference portal).
- www.ncbi.nlm.nih.gov/omim에서 입수 가능한 OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man.
상기 및 다른 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 마크롤라이드는 항생제 마크롤라이드일 수 있다.
활성제는 다른 활성제 또는 다른 치료 방법과 조합되어 병용 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 마크롤라이드의 조합이 투여된다.
용어 " 생물학적 샘플 "은 이의 광의로 사용된다. 동물(및 인간)을 포함하는 임의의 공급원으로부터 얻은 시편 또는 배양물을 포함하고 유체(예를 들어, 혈액 및 림프), 고형 및 조직을 포괄하는 것으로 이해된다.
따라서, 이의 양상의 또 다른 것에 의해, 현재 개시된 대상은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 하나의 추가적인 치료학적 유효 물질과 조합된 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 적어도 하나의 추가적인 치료학적 유효 물질은 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료(항박테리아제 중 임의의 하나)할 수 있고/있거나, 상기 마크롤라이드 항생제의 치료 효과를 증대시킬 수 있는 물질이다. 상기 적어도 하나의 추가적인 치료학적 유효 물질은 준최적 용량 또는 치료학적 용량일 수 있는 적합한 용량으로 투여된다. 상기 마크롤라이드 항생제 및 상기 적어도 하나의 추가적인 치료학적 유효 물질은 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로 및 추가적으로, 상기 마크롤라이드 항생제 및 상기 적어도 하나의 추가적인 치료학적 유효 물질은 상이한 순서로 및/또는 상이한 투여 경로로 상이한 시간 간격 동안 투여 사이의 상이한 간격으로 상이한 시점에 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 " 적어도 하나의 추가적인 치료제 " 또는 " 적어도 하나의 추가적인 치료학적 유효 물질 "은 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료에 효과적인 것으로 공지된 임의의 치료제일 수 있다. 예를 들어, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 몇 개 열거하자면 DNA 크로마틴 압축을 억제함으로써 SMN2 전사 증대를 촉진시키는 히스톤 디아세틸라제 저해제(HDACi), 스캐빈저 mRNA 디캡핑(decapping) 효소인 RG3039, 엑손 스키핑제(skipping agent), RNA 기반 치료제, 스플라이스 조절제일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물 및 방법은 조기 중지 코돈을 억제하거나 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도할 수 있는 치료학적 유효량의 마크롤라이드 화합물을 이용한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 억제 " 또는 " 억제하는 "은, 조기 중지 돌연변이 또는 조기 중지 코돈과 관련하여 사용될 때, 중지 코돈의 리드-쓰루의 과정을 의미한다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 " 치료학적 유효량 "은 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하기에 충분한 본 발명의 마크롤라이드 또는 항생제 마크롤라이드의 양을 포함한다.
" 치료학적 유효량 "은 화합물, 질환 및 이의 상태 또는 중증도, 치료하고자 하는 포유동물의 연령, 체중, 다른 의학 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 하나 이상의 과거 또는 현재의 의학, 수술 또는 방사선 치료 중재에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 중지 코돈의 유형에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 치료학적 유효량의 결정은 본 발명의 분야 내에 당업자의 능력 내에 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 정의되고 사용되는 바와 같은 용어 " 치료학적 유효량 "은 비전신으로, 예를 들어 CNS 또는 척추강내로 직접 투여될 때 리드-쓰루를 유도하는 데 효과적인 활성제(항생제 마크롤라이드)의 양을 의미하도록 취해져야 하고, 이의 전신 수준은 살균성 이하 수준이다. 비전신으로 투여되는 치료학적 유효량은 전신으로 투여되는 종래의 살균/항생제 용량의 10배, 50배, 100배, 200배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650 내지 700배, 750배, 800배 또는 900배 및 심지어 더 높을 수 있다. 용어 " 살균성 " " 항생제 "는 본 명세서에서 동의어로 사용되고 상호 교환된다.
예를 들어, 하기 본 명세서에 표시된 바대로, 아지쓰로마이신의 투여는 주사당 1.5 내지 15㎎의 용량이어서, 10 내지 100㎍/㎖의 CSF 유체의 수준을 발생시킬 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 용어 "치료를 필요로 하는 환자"는 본 명세서에 정의된 바와 같은 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 겪는 대상체를 의미한다.
몇몇 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 환자는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 이러한 키트는 본 발명의 방법을 실행하도록 사용될 수 있다. 이러한 키트는 본 발명의 핵산 이외에 대조군 작제물을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 개시된 방법을 실행하기 위한 장비, 예컨대 관, 플레이트, 피펫 등을 포함할 수 있다.
개시된 대상의 모든 양상 및 실시형태에서, 항생제 마크롤라이드 또는 이를 포함하는 조성물은 또한 적합한 전달 장치, 구체적으로 약물-장치 조합으로 포함될 수 있다. 전달 약물-장치 조합의 예는 삼투 펌프이다. 전달 약물-장치 조합은 코팅된 이식형 의학 장치일 수 있어서, 치료학적 유효 용량의 항생제 마크롤라이드 또는 이를 포함하는 조성물은 환자에 연속하여 전달된다. 약물-장치 조합은 또한 활성제를 정기적으로 방출하도록 설계될 수 있다. 이러한 약물-장치 조합에 의해, 항생제 마크롤라이드 또는 이를 포함하는 조성물은 조절된 속도의 삼투 과정에 의해 전달될 수 있다. 이러한 시스템은 반투과성 막을 조절하는 속도로 삼투성 활성제를 코팅함으로써 작제될 수 있다. 이 막은 활성제가 전달되는 임계 크기의 오리피스(orifice)를 포함할 수 있다. 활성제 항생제 마크롤라이드는, 수성 유체와 접촉한 후, 막의 유체 투과성 및 코어 제제의 삼투압에 의해 결정된 속도로 물을 흡수한다. 이는 막에서의 전달 오리피스로부터 제어된 속도로 분배하고자 하는 활성제의 포화 용액을 형성시킨다. 적합한 표적 부위에서, 예를 들어 환자의 CSN에서 이식하고자 하는 삼투 펌프는 이식형일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 " 약 "은, 측정 가능한 값, 예컨대 양, 시간 기간을 언급할 때, 기재된 값의 .±.10%, 더 바람직하게는 .±.5%, 훨씬 더 바람직하게는 .±.1%, 더더욱 더 바람직하게는 .±.0.1%의 변동을 포함하는 것으로 의도되고, 이러한 변동은 개시된 방법을 실행하는 데 적절하다.
하기 실시예는 본 발명의 소정의 실시형태를 더 완전히 예시하도록 제시된다. 이것은 그러나 어떠한 방식으로든 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당해 분야의 당업자는 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에 개시된 원칙의 많은 변형 및 변화를 용이하게 고안할 수 있다.
실시예
실험 절차
플라스미드 작제
청색 형광 단백질(BFP)를 AGA GG TAC CGA GTG AGC AAG GGC GAG GAG(본 명세서에서 서열 번호 1이라 칭해짐)의 핵산 서열을 갖는 프라이머 KpnI 정방향 및 핵산 AGA GGA TCC GAT CCG GTG GAT CCC GGG CCC(본 명세서에서 서열 번호 2라 칭해짐)을 갖는 BamHI 역방향을 사용하여 pEBFP2-C1 플라스미드로부터 증폭시켰다.
PCR 생성물을 GFP-C2-BFP 벡터를 생성하기 위해 KpnI 및 BamHI 제한 효소를 사용하여 pEGFP-C2 플라스미드에 결찰하였다. 다음에, 시험을 위해 원하는 유전자(야생형 및 돌연변이된 서열 둘 다)를 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 XhoI 및 HindIII로 분해된 GFP-C2-BFP에 삽입하여, 오픈 리딩 프레임을 유지시켰다. 플라스미드 GFP-C2-BFP는 도 1a에 도식적으로 제시되어 있다. 특히, 도 1c-1은 GFP와 BFP 사이에 삽입된 야생형 서열을 갖는 플라스미드 GFP-C2-BFP를 도식적으로 제시하고, 도 1c-2는 GFP와 BFP 사이에 삽입된 중지 코돈을 포함하는 돌연변이된 서열을 갖는 플라스미드 GFP-C2-BFP를 도식적으로 제시한다.
리드-쓰루 검정
6웰에 플레이팅된 HEK293T 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 폴리에틸렌이민 "맥스(MAX)" 형질감염 시약(폴리사이언시스 인크.(Polysciences Inc.))을 사용하여 2㎍ 플라스미드로 형질감염시켰다. 각각의 실험의 경우, (야생형 서열로서 또는 돌연변이된 서열로서) 특정 질환과 관련된 유전자의 단편을 함유하는 GFP-C2-BFP 벡터를 사용하였다.
형질감염 24시간 후, 형질감염된 세포를 항생제 마크롤라이드에 의한 치료로 처리하였다. 세포를 하기 기재된 바대로 상이한 기간 동안 상이한 농도의 항생제 마크롤라이드 에리쓰로마이신(시그마(Sigma))으로 처리하였다. 처리 후, 세포를 웰로부터 긁어내고, PBS(시그마)로 세척하고, FACS 분석을 위해 PBS 중에 재현탁시켰다. FACS 분석을 제조업자의 지시에 따라 칼루자(Kaluza)(등록상표) 플로우 분석 소프트웨어 - 벡만 쿨터(Beckman Coulter)를 사용하여 수행하였다. 세포 중 몇몇을 펠렛화하고 용해시키고 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 처리하였다.
실시예 1
플라스미드 작제물 및 이의 사전 평가
상기 기재된 바대로 제조된 GFP-C2-BFP에 기초한 플라스미드 작제물의 기본 특징은 도 1a에 제시되어 있다. 도 1a에 도시된 바대로, "WT"는 야생형 서열을 나타내고, "mut"는 돌연변이된 서열(본 명세서에서 또한 조기 중지 코돈이라 칭하는 넌센스 돌연변이를 포함)을 의미한다. 상기 기재된 바대로, 이 작제물을 포유동물 세포(즉, HEK293T)로 형질감염시키고 다양한 기간 동안 상이한 마크롤라이드 농도로 처리하였다. 도 1b는 GFP-C2-BFP 작제물로 형질감염된 세포의 예시적인 면역형광 사진을 나타낸다.
도 1c-1에 도식적으로 제시된 바대로, 플라스미드 작제물이 "야생형"(wt) 핵산 서열을 보유할 때, 즉 중지 코돈이 녹색 형광 단백질(GFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)에 의해 플랭킹된 핵산 서열에 존재하지 않을 때, GFP 및 BFP를 포함하는 인프레임 융합 단백질은 플라스미드 작제물로 형질감염된 세포에서 번역되었다. GFP 및 BFP의 형광 수준은 이후 형광 활성화 세포 분류 유세포 분석기(FACS)를 사용하여 결정되었다.
그러나, 도 1c-2에 입증된 바대로, 플라스미드 작제물이 돌연변이된 핵산 서열("mut")을 포함할 때, 즉 중지 코돈이 GFP 및 BFP에 의해 플랭킹된 핵산 서열에 존재할 때(본 명세서에서 또한 "넌센스" 돌연변이라 칭함), GFP를 포함한 작제물의 오직 일부가 플라스미드 작제물로 형질감염된 세포에서 번역되었다.
상기 작제물로 형질감염된 세포의 예시적인 FACS 분석은 상기 기재된 작제물에 상응하게 도 1c-1 및 도 1c-2의 하부 패널에 제시되어 있다. 도 1c-3의 하부 패널에서 입증된 바대로, 돌연변이된 핵산 서열을 포함하는 플라스미드 작제물로 형질감염된 세포가 마크롤라이드(예를 들어, 마크롤라이드 에리쓰로마이신)의 존재 하에 항온처리될 때, GFP 및 BFP 둘 다를 포함하는 융합 단백질의 번역이 복원되었다. 도 1c-3, 하부 패널에 입증된 바대로, 형광은 항생제 마크롤라이드 에리쓰로마이신의 존재에서 가능한 리드-쓰루의 결과로서 중간 하부 패널에 예시된 형광과 비교하여 약간 이동된다.
넌센스 돌연변이을 보유하는 플라스미드 작제물로 형질감염된 세포에 대해 얻어지고 상이한 농도의 에리쓰로마이신(0, 300, 500 및 700㎍/㎖)의 존재 하에 24시간 동안 항온처리된 FACS 데이터의 오버레이 예시는 도 1d에 도시되어 있다. 중간 값의 이동은 리드-쓰루의 정도를 나타낸다.
실시예 2
마크롤라이드를 사용한 운동실조 모세혈관확장증 돌연변이된(ATM) 서열을 포함하는 플라스미드 작제물의 리드-쓰루의 평가
하기 부문에 기재된 바대로, 에리쓰로마이신은 운동실조 모세혈관확장증 돌연변이된(ATM) 단백질을 코딩하는 유전자에서 발견된 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도할 수 있다.
ATM 단백질을 코딩하는 유전자에서 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 에리쓰로마이신의 능력은 상기 기재된 바대로 GFP-C2-BFP에 기초한 돌연변이된 및 야생형 플라스미드 작제물을 작제함으로써 평가되었고, 여기서 하기 서열은 각각 GFP와 BFP 사이에 삽입되었다: ATM 돌연변이된 핵산 서열: aaa ttt aag cgc ctg att Tga gat cct gaa aca att aaa cat, 서열 번호 3(돌연변이된 뉴클레오타이드는 볼드체 활자로 표시됨)이라 칭해짐 및 ATM 야생형 핵산 서열: aaa ttt aag cgc ctg att Cga gat cct gaa aca att aaa cat, 서열 번호 4라 칭해짐. 서열은 제한 효소 인식 서열(비도시)을 추가로 포함하였다.
플라스미드를 상기 기재된 바대로 작제하고 HEK293T 세포로 형질감염시켰다. ATM 돌연변이된 유전자로 형질감염된 세포를 24, 36 또는 48시간 동안 300, 500 또는 700㎍/㎖의 에리쓰로마이신으로 처리하거나, 처리하지 않았다("0" 에리쓰로마이신). 각각의 그룹의 경우, BFP의 중간 형광 강도(MFI)를 계산하였다. BFP 판독을 GFP 발현 세포로부터 오직 수집하였다.
ATM 단백질(ATM 돌연변이)를 코딩하는 유전자에서의 조기 중지 코돈의 리드-쓰루에 대한 상이한 에리쓰로마이신 용량 및 다양한 배양 기간의 효과가 도 2에 제시되어 있고, 이는 에리쓰로마이신이 ATM 단백질을 코딩하는 유전자에서 발견된 조기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
WT 결과는 이것이 극도로 높고 분석에 무관하므로 생략되었다. 상이한 용량의 각각의 판독의 중앙 값은 정규화되고, 무처리 결과("0" 에리쓰로마이신)에 대해 제시되었다.
실시예 3
마크롤라이드를 사용한 ATM 단백질 복원
이 실험에서, WT 세포와 비교하여 이형접합 넌센스 돌연변이 C5515->T(코리엘(Coriell), #GM11264)를 보유한 운동실조 모세혈관확장증(A-T) 환자로부터 얻은 B 림프구를 (도 3A에 도시된) 300㎍/㎖ 농도 또는 더 낮은 농도(도 3B에 도시된 바대로 에리쓰로마이신의 경우 100㎍/㎖)에서의 항생제 마크롤라이드 겐타마이신, 에리쓰로마이신 또는 아지쓰로마이신의 존재 하에 7일 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 수확하고 특이적 항-ATM 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 분석으로 처리하였다. 밴드 강도는 티나 소프트웨어를 사용하여 도 3B에 도시된 결과에 대해 분석되고 도 3C에 도시되어 있다.
도 3D는 7일 동안 100 또는 300㎍/㎖에서 에리쓰로마이신(E)의 존재 하에 항온처리된 동형접합 A-T 돌연변이체 C103->T 및 WT 세포(둘 다 이스라엘의 텔 아비브 대학(Tel Aviv University)의 요시 실로(Yosi Shilo) 교수의 관대한 선물임)를 나타낸다. 이후, 세포를 수확하고 특이적 항-ATM 항체를 사용하여 SDS-PAGE 분석으로 처리하였다.
실시예 4
마크롤라이드를 사용한 기능성 ATM 단백질의 복원의 검정
ATM 단백질의 발현은 FLAG 에피토프를 갖는 이의 C' 말단에서 태그화된 ATM 단백질(돌연변이된 또는 야생형)을 코딩하는 플라스미드를 사용하여 적합한 포유동물 세포에서 기능성 검정에서 또한 평가되었다.
돌연변이된 ATM 단백질은 부위 지정 돌연변이유발(스트라타젠(STRATAGENE))을 이용하여 얻어져, 질환 야기 넌센스 돌연변이는 공지된 부위에서 ATM 유전자에서 삽입된다. 중지 코돈 리드-쓰루 물질, 및 임의로 프로모터 활성화 및 (NMD) 화합물에 의한 처리 후, 이 플라스미드로 형질감염된 세포는 ATM 유전자, 예를 들어 방사선 저항의 활성에 대해 검사된다. 추가적인 기능성 시험이 또한 수행된다.
실시예 5
어셔 증후군 및 레트 증후군
희귀 질환 어셔 증후군 및 레트 증후군과 관련된 유전자에서 추가적인 3개의 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루에 대한 상이한 용량의 에리쓰로마이신의 영향을 시험하기 위해 하기 실험을 수행하였다. 모든 이 질환이 적어도 부분적으로 넌센스 돌연변이에 의해 발생하였다.
이 실험을 위해, GFP와 BFP 사이에 삽입된 하기 서열을 포함하는 GFP-C2-BFP 플라스미드가 상기 기재된 바대로 제조되었다. 간단히 말하면, 플라스미드는 하기와 같이 작제되었다:
(1) 서열 번호 5로 표시되는 핵산 서열: tat ctc tat gat gtg ctg cga atg tac cac cag acc atg gac를 포함하는 어셔 증후군과 관련된 카데린-23 유전자(CDH23)의 단편의 야생형 서열을 포함하는 플라스미드;
(2) 서열 번호 6으로 표시되는 핵산 서열: tat ctc tat gat gtg ctg Tga atg tac cac cag acc atg gac를 포함하는 카데린-23 유전자의 상기 단편의 돌연변이된 서열을 포함하는 플라스미드;
(3) 서열 번호 7로 표시되는 핵산 서열: aga ggg agc ccc tcc cgg　 cga gag cag aaa cca cct aag aag를 포함하는 레트 증후군과 관련된 MECP2 유전자의 단편의 야생형 서열을 포함하는 플라스미드;
(4) 서열 번호 8로 표시되는 핵산 서열: aga ggg agc ccc tcc cgg　 Tga gag cag aaa cca cct aag aag를 포함하는 MECP2 유전자의 상기 단편의 돌연변이된 서열을 포함하는 플라스미드.
상기 기재된 바대로, 플라스미드는 제한 효소 인식 서열(비도시)을 추가로 포함하였다.
또한, 상기 기재된 바대로 ATM과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 삽입체를 포함하는 GFP-C2-BFP 플라스미드는 또한 이 실험에서 시험되었다. 플라스미드가 상기 기재된 바대로 작제되고 세포로 형질감염되었다. 돌연변이된 유전자 단편을 포함하는 플라스미드로 형질감염된 세포를 24 또는 48시간 동안 300, 500 또는 700㎍/㎖의 에리쓰로마이신으로 처리하거나, 처리하지 않았다("0" 에리쓰로마이신). 각각의 그룹의 경우, BFP의 중간 형광 강도(MFI)를 FACS 분석을 이용하여 모니터링하고 계산하였다. 4개의 질병에 상응하는 넌센스 돌연변이된 서열의 리드-쓰루에 대한 에리쓰로마이신의 영향이 도 4에 제시되어 있다(도 4a는 24시간 배양에 관한 것이고, 도 4b는 48시간 배양에 관한 것임). 실시예 3과 유사하게, 결과는 "비처리" 결과에 대해 정규화 값으로서 제시되어 있다.
도 4에 도시된 바대로, BFP의 형광 강도(MFI)는 24시간 또는 48시간의 배양 후(각각 도 4a 및 도 4b) 에리쓰로마이신의 존재에서 증가하여, GFP 및 BFP를 포함하는 완전한 융합 단백질의 리드-쓰루를 촉진하는 에리쓰로마이신의 능력을 나타냈다.
상기 기재된 FACS 분석 이외에, 형질감염된 세포를 용해시키고 α-GFP 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 검정으로 처리하였다. 도 5는 ATM 및 상기 기재된 어셔 증후군과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 삽입체를 포함하는 플라스미드로 형질감염된 세포에 대해 수행된 웨스턴 블롯 검정에서 얻어진 결과를 제시한다.
도 5에서 입증된 바대로, 55킬로달톤(kDa)에 상응하는 "WT" 밴드는 시험된 단백질의 짧은 서열을 플랭킹하는 GFP 및 BFP 둘 다를 포함하는 전장 융합 단백질을 나타낸다. 현저하게, 도 5에서 볼 수 있는 것처럼, 에리쓰로마이신 처리 시, 유사한 크기의 밴드가 또한 돌연변이된 서열("ATM mut" 및 "Usher mut")에 대해 나타났다.
도 5에서 명확히 볼 수 있는 것처럼, 전장 융합 단백질에 상응하는 고분자 크기의 밴드는 오직 전체 단백질(GFP 단독)의 분획이어서, 적절한 수율의 리드-쓰루를 제시한다. 이 단백질 발현 결과는 마크롤라이드 에리쓰로마이신이 리드-쓰루 넌센스 질환 야기 돌연변이일 수 있다는 것을 확인시켜준다.
실시예 6
마크롤라이드를 사용한 섬유아세포에서의 메틸-CpG 결합 단백질-2(MeCP2) 단백질 복원
MeCP2 단백질 발현을 레트 증후군 섬유아세포에서 평가하였다. 넌센스 돌연변이 880C>T(즉, R294X)를 함유하는 레트 증후군 섬유아세포(쉐바 병원(Sheba hospital)의 벤-제브(Ben-Zeev) 박사로부터의 관대한 선물임)를 널리 확립된 아미노글리코사이드 겐타마이신(G418)과 비교하여 에리쓰로마이신 또는 아지쓰로마이신으로 7일 동안 처리하였다.
도 6에서 명확히 볼 수 있는 것처럼, MeCP2는 비처리 세포(여기서, 아지쓰로마이신의 존재 하에 약간 더 많은 MeCP2가 발현됨)와 비교하여 가변 수준으로 상기 화합물의 존재에서만 발현되었다. 도 6에 도시된 바대로, 아지쓰로마이신의 용량 반응 분석은 심지어 10㎍/㎖의 적은 용량에서 높은 발현을 나타냈다. 이 관찰은 추정상 낮은 용량이 중지 코돈 돌연변이로부터 생긴 레트 증후군을 겪는 환자에 투여된다는 것을 제시한다.
실시예 7
MeCP2 핵 국재화
MeCP2 단백질의 복원이 마크롤라이드의 존재 하에 입증된 후, 발현된 MeCP2 단백질의 기능성 활성이 레트 증후군 환자로부터 얻은 섬유아세포에서 평가되었다.
야생형 섬유아세포에서 MeCP2에 지향된 항체에 의한 염색(상부 패널) 및 핵의 dapi 염색(하부 패널)을 나타내는 도 7a에 입증된 바대로, 단백질 MeCP2는 핵에서 국재화된다.
흥미롭게도, 도 7b 및 도 7c에서 입증된 바대로, 마크롤라이드의 존재 하의 배양 후, 단백질 MeCP2는 세포 핵에 재국재화되어(MeCP2에 지향된 항체 및 dapi 둘 다에 의해 염색된 세포를 나타내는 화살표로 표시된 바대로), 전사 인자로서의 이의 기능을 제시한다. 핵 염색의 백분율의 정량화인 도 7d에서 볼 수 있는 것처럼, 아지쓰로마이신의 영향이 다시 시험된 화합물 중에 가장 높아서, 세포 중 50-60%에 영향을 미친다.
종합하면, 이 결과는 에리쓰로마이신 및 아지쓰로마이신이 MeCP2 단백질의 리드-쓰루 번역이 가능하게 하여, 이것이 핵에 국재화되면서, 아마도 기능성인 적절히 높은 수준의 MeCP2를 성취한다는 것을 나타낸다.
실시예 8
추가적인 모델을 이용한 레트 증후군에서의 기능성 단백질의 복원의 검증
레트 증후군(RTT)에서, 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2) 유전자에서의 돌연변이는 대부분의 사례의 원인이고, 여기서 Y141, R168, Q170, R198, R255, R256, R270 및 R294를 포함하는 상이한 돌연변이가 공지되어 있다.
RTT와 관련된 중지 코돈의 리드-쓰루에서의 물질의 영향을 평가하기 위해, 하기 실험실내 실험을 이용하였다:
1. 예를 들어, 상기 R294X에 대해 예시된 바대로 상기 돌연변이 중 적어도 하나를 보유하는 RTT 환자로부터 취한 섬유아세포의 웨스턴 블롯 분석. 분석은 핵 추출물을 이용하여 마크롤라이드로부터 처리된 섬유아세포에 대해 비처리된 섬유아세포를 비교한다. 웨스턴 블롯 검정을 MECP2(코리엘 세포 리포지터리 스톡 16497호)의 R255X 넌센스 돌연변이를 발현하는 레트 길(Rett girl)로부터 유래한 림프구 세포주에서 또한 수행하였다.
2. MECP2 RNA 수준이 결정되었고, 처리된 RTT 섬유아세포와 비처리된 것 사이에 비교하였다.
3. MECP2 표적 유전자, 즉 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)의 발현이 측정되었고, 처리된 RTT 섬유아세포와 비처리된 것 사이에 비교되었다.
또한, RTT와 관련된 중지 코돈의 리드-쓰루에서의 물질의 영향이 또한 동물 모델, 예를 들어 Mecp2R168X 넉-인(Knock-in) 마우스를 사용하여 평가되었고, 이것은 MECP2 유전자에서 R168X 돌연변이를 보유하는 레트 증후군에 대한 모델이다. 이 마우스로부터 취한 섬유아세포는 MECP2의 수준 및 세포이하 국재화에 대해 검사되었다.
실시예 9
마크롤라이드를 사용한 전장 SMN2 단백질의 복원
상기 기재된 바대로, 척수성 근위축증(SMA)은 SMN1(생존 운동 뉴런 1) 유전자에서 돌연변이에 의해 발생한 유전적 질환이다. SMN2는 엑손 스플라이싱 인핸서를 파괴시키는 엑손 7 내에 침묵, 단일 뉴클레오타이드 이행에 의해서만 분화된 SMN1의 거의 동일한 카피이다. 대부분의 SMN2 단백질 생성물, 즉 Δ7-SMN은 기능장애성이고 불안정하고, SMN2 유전자로부터 생성된 소량의 기능성 단백질은 SMA 환자에서 SMN1의 손실을 완전히 보상할 수 없다.
전장 SMN2(FL-SMN2)의 발현을 유도하는 마크롤라이드의 능력은 하기 기재된 바대로 척수성 근위축증 섬유아세포에서 평가되었다. 리드-쓰루 가능성을 실험하기 위해, SMN1 결핍 섬유아세포(SMN2 유전자의 1개(+/-) 또는 2개(+/+)의 카피를 함유)를 에리쓰로마이신 또는 아지쓰로마이신으로 7일 동안 처리하였다. 세포를 또한 양성 대조군으로서 아미노글리코사이드 겐타마이신으로 처리하였다.
도 8a에서 명확히 입증된 바대로, 평가된 화합물, 즉 에리쓰로마이신, 아지쓰로마이신 및 양성 대조군 겐타마이신의 모두의 존재 하에, 전장 SMN2 단백질(32kDa, FL-SMN2)은 섬유아세포의 유형 둘 다에서 발현되었다.
현저하게, SMN2 유전자의 하나의 대립유전자가 도 8b((SMN2+/+) 섬유아세포로 수행된 상응하는 실험의 결과를 나타냄)와 비교하여 도 8a에서 관찰된 바대로 또한 돌연변이(SMN2+/-)될 때 전장 SMN2의 발현은 감소하였다.
아지쓰로마이신은 기원 둘 다(즉, SMN1-/-; SMN2+/- 및 SMN1-/-; SMN2+/+)로부터 섬유아세포에서 약간 더 높은 FL-SMN2 수준을 입증하였다. 더욱이, 용량 반응 분석은 역상관을 나타내어, 감소하는 용량에서의 리드-쓰루의 증가를 나타내고, 가장 높은 발현은 10㎍/㎖의 낮은 용량의 아지쓰로마이신에서 얻어진다. 이 관찰은 환자의 투여에 대해 추정상 낮은 용량을 제시한다.
주목할 만한 것은 상기 화합물이 500㎍/㎖의 높은 용량에서 사용될 때에도 8c 및 도 8d에 입증된 바대로 겐타마이신 또는 에리쓰로마이신의 존재 하의 섬유아세포 세포의 배양이 비관련 단백질의 발현에 영향을 미치지 않는다는 것이다.
또한, 상기 화합물을 이용한 처리는 도 8e에 입증된 바대로 검정 조건 하에 세포의 생존율이 대략 90%로 있으면서 해롭지 않았다.
따라서, 상기 결과는 에리쓰로마이신 및 아지쓰로마이신이 FL-SMN 단백질의 리드-쓰루 번역을 허용한다는 것을 나타낸다.
실시예 10
동물 모델에서 마크롤라이드를 사용한 SMN 활성의 복원
전장 SM2의 번역이 마크롤라이드를 사용하여 환자의 섬유아세포를 유도할 수 있다는 관찰 이후, 전장 SM2의 번역을 유도하는 마크롤라이드 아지쓰로마이신의 능력은 또한 상기 기재된 바대로 마우스에서 평가되었다.
내인성 Smn1이 결핍된 마우스는 생육 가능하지 않다. 이 배아 치사율을 피하고 중간 SMA 표현형을 갖는 동물을 생성하기 위한 노력으로, 인간 SMN2 전이유전자를 Smn1 -/- 배경에 첨가하여(Smn1 -/- ; SMN2 +/+ ), 출생 후 첫주에 질환에 걸린 동물를 발생시켰다. 이 모델(Smn1 -/- ; SMN2 +/+ ; SMN2Δ7 +/+ )로의 인간 SMN2 전이유전자 결핍 엑손 7의 추가의 첨가는 상기 기재된 바대로 신경근 접합부(NMJ) 신경제거와 관련된 진행성 근육 약화를 나타내는 약 14일의 평균 수명을 갖는 동물을 발생시켰다.
제1 단계로서, 아지쓰로마이신의 약동학을 평가하였다. 아지쓰로마이신을 독성 연구를 수행하기 위해 (하기 기재된 바대로) 낮은 용량 및 높은 용량에서 SMA 마우스의 CNS로 직접 투여하였다. 연구는 출생 후 (PND) 3일 또는 5일에 투여된 3개의 마우스 그룹(비히클, 낮은 및 높은 아지쓰로마이신 용량)을 포함한다. 각각의 그룹은 2개로 나눠진 25-30마리의 동물을 포함한다. 이후, 아지쓰로마이신이 10㎍/㎖에서 효과적이고 마우스에서의 뇌척수액(CSF)의 용적이 대략 35㎕이므로, 1 및 10㎍/마우스가 각각 낮은 및 높은 용량으로서 투여될 것이다.
제2 단계로서, 아지쓰로마이신의 약동학이 마우스 생존율, 직립 반사를 포함하는 근육 능력, 튜브 시험 스코어, 중력 주성 등의 매개변수를 모니터링함으로써 평가되었고, 연구 종점은 2의 시점에서 종료를 포함한다: 열망하는 수명의 절반 동안 PND 9에서 반의 그룹, 및 마우스가 이의 기능적인 사망 종점에 있는/가까울 때 PND 14에서의 다른 그룹.
측정된 추가적인 매개변수는 뇌, 신장 척수 및 골격근을 포함하는 수확된 조직에서의 아지쓰로마이신 및 SMN2 함량이다. 관련 조직의 조직학이 또한 수행되었다.
실시예 11
다른 화합물과 조합된 마크롤라이드를 사용한 SMN 활성의 복원
상기 입증된 바대로, 아지쓰로마이신은 SMN2 발현의 번역 수준에서 활성이고, 즉 아지쓰로마이신은 중지 코돈을 보유한 SMN2 메신저 RNA의 리드-쓰루 번역에 의해 SMN2 유전자로부터 SMN 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 전사적 및 전사후인 2의 다른 수준이 하기 본 명세서에 기재된 바대로 아지쓰로마이신 및 추가적인 화합물의 조합에 의한 치료에 대한 표적이다.
구체적으로, 하기 물질이 마크롤라이드와 조합되어 임상 연구에서 사용하기 위해 선택된다:
(1) 전사를 유도할 수 있는 물질 - SMN2 프리-mRNA가 SMNΔ7을 우선적으로 생성하지만, 전사의 전반적 증가는 전장 및 SMNΔ7 mRNA를 증가시켜, 더 높은 수준의 전장 SMN2(SMN2-FL)를 발생시킬 것이다.
예를 들어, 히스톤 데아세틸라제 저해제(HDACi)는 DNA 크로마틴 압축을 억제함으로써 SMN2 전사 증대를 촉진시킨다. 스캐빈저 mRNA 디캡핑 효소(DcpS, mRNA의 5' 캡 매개 분해에 관여하는 효소) 저해제(레플리겐(Repligen)/화이자(Pfizer))인 RG3039인 퀴나졸린 유도체에 의한 프로모터 증대. RG3039의 경구 투여가 SMA 마우스에서 SMN의 용량 의존적 증가를 발생시키고 약 20 내지 30%로 생존을 연장시키는 것으로 보고되었다(19). RG3039인 퀴나졸린 유도체는 따라서 SMN2-FL 수준을 증가시키기 위해 아지쓰로마이신과 조합되어 사용된다.
(2) 전사후 변형(스플라이싱)을 유도할 수 있는 물질 - 즉 대부분의 SMN2 유래 전사체로부터 SMN 엑손 7을 절제한 대안적인 스플라이싱 사건을 억제함으로써 SMN2로부터 SMN-FL/SMNΔ7 비율을 증가시키는 물질.
이를 위해, 안티센스 ASO-10-27 분자를 사용한다(ISIS/바이오겐(Biogen)/겐자임(Genzyme(겐자임)). 안티센스 ASO-10-27은 SMA의 마일드 마우스 모델에서 귀 및 꼬리 괴사를 보정하고 ICV 주사 후 16 내지 26일로부터 중증 SMA 마우스에서 평균 생존을 연장시키는 것으로 보고되었다(20).
실시예 12
어셔 증후군(USH)에서의 기능성 단백질의 복원
모든 USH 사례의 대략 12%는 넌센스 돌연변이로부터 생긴다. 예시적인 넌센스 돌연변이는 스캐폴드 단백질 하르모닌을 코딩하는 USH1C 유전자에서의 R31X이다.
USH와 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 항생제 마크롤라이드의 능력은 하기 실험에 의해 평가되었다:
1. 야생형 또는 R31X 돌연변이체 하르모닌으로 형질감염된 HEK293T 세포의 면역형광 및 웨스턴 블롯 분석. R31X 돌연변이체로 형질감염된 세포는 마크롤라이드로 처리되었다. 하르모닌의 과발현이 측정되고 마크롤라이드 처리의 존재 및 부재의 WT 발현 세포와 R31X 돌연변이체를 발현하는 세포 사이에 비교되었다.
2. 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)-풀 다운 검정. 회수된 하르모닌의 단백질 기능을 시험하기 위해, USH2a 아이소폼 b7의 세포질 꼬리에서의 하르모닌 PDZ1 도메인과 PBM(PDZ 결합 모티프) 사이의 특이적 상호작용을 측정하였다.
3. 액틴 필라멘트 번들링. 액틴 필라멘트 번들링을 유도하는 하르모닌의 능력을 시험하였다.
4. 망막 검정, 외식편. 레드-형광 단백질(RFP)에 융합된 돌연변이된 하르모닌을 함유하는 작제물을 마우스의 망막 이식편에 전기천공으로 도입하였다. 마크롤라이드에 의한 처리를 가하고, RFP 발현의 분석을 형광 현미경검사에 의해 수행하였다.
실시예 13
헐러 증후군과 관련된 기능성 알파-l-이두로니다제 유전자 생성물의 복원
알파-l-이두로니다제(IDUA) 유전자에서 Q70X 및 W402X 넌센스 돌연변이인 헐러 증후군을 갖는 환자에서 발견된 2개의 가장 흔한 돌연변이는 유럽 혈통의 약 70%의 환자에서 존재한다.
헐러 증후군과 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 항생제 마크롤라이드의 능력은 하기 실험에 의해 평가되었다:
1. 치료 하에 리드-쓰루에 대해 시험하는, 망상적혈구에서의 알파-l-이두로니다제의 WT 및 돌연변이된 cDNA의 발현. 전사/번역 시스템(프로메가)에 커플링된 래빗 망상적혈구 용해물을 사용.
2. IDUA 유전자 돌연변이를 갖는 건강한 대상체 및 환자로부터 1차 인간 피부 섬유아세포 세포를 얻음. 하기 검정에서 섬유아세포 세포를 사용한다.
3. 특이적 항체를 사용한 면역정량화 검정 및 웨스턴 블롯 분석.
4. 형광원 기질, 4-메틸움벨리페릴-α-L-이두로나이드(글리코신쓰(Glycosynth), 영국 체셔주); 4-메틸-움벨리페론 이두로나이드(FMU)(칼바이오켐(Calbiochem) 또는 골드 바이오테크(Gold Biotech))를 사용하여 α-l-이두로니다제 활성을 측정함. 분해된 유리 FMU 분자의 형광을 측정한다.
5. 거대분자의 방사선 라벨링에 의해, 또는 블리스캔(Blyscan) 키트(바이오컬러 엘티디.(Biocolor Ltd.), 영국)에 의한 황산화 GAG 정량화를 이용하여 글라이코스-아미노글라이칸(GAG) 축적(활성)을 측정함.
6. 라이소트래커 레드(LysoTracker Red)(모레큘러 프로브스(molecular probes))를 사용한 세포의 염색에 의해 일반 리소좀 풍부도를 검출함.
7. 동형접합 Idua-W392X 및 WT 마우스로부터 유래한 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 사용한 조직 배양 검정.
8. CHO-K1(Q70, W402): 돌연변이된 IDUA 유전자를 발현하는 CHO-K1 세포는 특이적으로 인간 α-l-이두로니다제를 검출하는 면역 포획 검정에 의해 측정 가능한 α-l-이두로니다제 활성을 함유하지 않는다. 반대로, 전장 야생형 IDUA의 CHO-K1 발현은 클로닝된 세포주에서 α-l-이두로니다제 활성의 1㎎당 30nmol/분 초과로 생성되는 것으로 발견되었다.
헐러 증후군과 관련된 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 항생제 마크롤라이드의 능력은 하기 기재된 바대로 동물 모델을 이용하여 또한 평가되었다.
이두라-W392X 돌연변이를 보유한 MPS I-H의 넉인 마우스 모델(knock-in mouse model)을 사용하였다. MPS I-H 환자에서 흔히 발견되는 IDUA-W402X 돌연변이에 상응하는 이 돌연변이체 대립유전자에 대한 마우스 동형접합은 인간 MPS I-H 질환에 매우 닮은 표현형을 나타내는 것으로 발견되었다. 조직 및 뇨 GAG 수준을 측정하였다.
구체적인 실시형태의 상기 설명은 다른 사림이 현재의 지식을 적용함으로써 부당한 실험 없이 일반 개념을 벗어남이 없이 이러한 구체적인 실시형태를 다양한 분야에 대해 용이하게 변경하고/하거나 채택할 수 있는 본 발명의 일반 성질을 이렇게 충분히 나타내고, 따라서, 이러한 채택 및 변경은 개시된 실시형태의 등가물의 의미 및 범위 내에 이해되어야 하고 이해되도록 의도된다. 본 명세서에서 사용된 어법 또는 전문용어는 설명의 목적을 위하고 제한이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 다양한 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 물질 및 단계는 본 발명을 벗어남이 없이 다양한 대안적인 형태를 취할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Ramot at Tel-Aviv University Ltd. <120> AGENTS FOR TREATING GENETIC DISEASES RESULTING FROM NONSENSE MUTATIONS, AND METHODS FOR IDENTIFYING THE SAME <130> WO2014/102778 <140> PCT/IL2013/051058 <141> 2013-12-24 <150> US 61/745,651 <151> 2012-12-24 <150> US 61/762,900 <151> 2013-02-10 <160> 11 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KpnI forward primer <400> 1 agaggtaccg agtgagcaag ggcgaggag 29 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BamHI reverse primer <400> 2 agaggatccg atccggtgga tcccgggccc 30 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaatttaagc gcctgatttg agatcctgaa acaattaaac at 42 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aaatttaagc gcctgattcg agatcctgaa acaattaaac at 42 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tatctctatg atgtgctgcg aatgtaccac cagaccatgg ac 42 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tatctctatg atgtgctgtg aatgtaccac cagaccatgg ac 42 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 agagggagcc cctcccggcg agagcagaaa ccacctaaga ag 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 agagggagcc cctcccggtg agagcagaaa ccacctaaga ag 42 <210> 9 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> green fluorescence protein <400> 9 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 10 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blue fluorescent protein <400> 10 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgagcca cggcgtccag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaacttcaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg cgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacagccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 <210> 11 <211> 1536 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 agaagccccg ggcggcggaa gtcgtcactc ttaagaaggg acggggcccc acgctgcgca 60 cccgcgggtt tgctatggcg atgagcagcg gcggcagtgg tggcggcgtc ccggagcagg 120 aggattccgt gctgttccgg cgcggcacag gccagagcga tgattctgac atttgggatg 180 atacagcact gataaaagca tatgataaag ctgtggcttc atttaagcat gctctaaaga 240 atggtgacat ttgtgaaact tcgggtaaac caaaaaccac acctaaaaga aaacctgcta 300 agaagaataa aagccaaaag aagaatactg cagcttcctt acaacagtgg aaagttgggg 360 acaaatgttc tgccatttgg tcagaagacg gttgcattta cccagctacc attgcttcaa 420 ttgattttaa gagagaaacc tgtgttgtgg tttacactgg atatggaaat agagaggagc 480 aaaatctgtc cgatctactt tccccaatct gtgaagtagc taataatata gaacaaaatg 540 ctcaagagaa tgaaaatgaa agccaagttt caacagatga aagtgagaac tccaggtctc 600 ctggaaataa atcagataac atcaagccca aatctgctcc atggaactct tttctccctc 660 caccaccccc catgccaggg ccaagactgg gaccaggaaa gccaggtcta aaattcaatg 720 gcccaccacc gccaccgcca ccaccaccac cccacttact atcatgctgg ctgcctccat 780 ttccttctgg accaccaata attcccccac cacctcccat atgtccagat tctcttgatg 840 atgctgatgc tttgggaagt atgttaattt catggtacat gagtggctat catactggct 900 attatatggg ttttagacaa aatcaaaaag aaggaaggtg ctcacattcc ttaaattaag 960 gagaaatgct ggcatagagc agcactaaat gacaccacta aagaaacgat cagacagatc 1020 tggaatgtga agcgttatag aagataactg gcctcatttc ttcaaaatat caagtgttgg 1080 gaaagaaaaa aggaagtgga atgggtaact cttcttgatt aaaagttatg taataaccaa 1140 atgcaatgtg aaatatttta ctggactcta ttttgaaaaa ccatctgtaa aagactgagg 1200 tgggggtggg aggccagcac ggtggtgagg cagttgagaa aatttgaatg tggattagat 1260 tttgaatgat attggataat tattggtaat tttatgagct gtgagaaggg tgttgtagtt 1320 tataaaagac tgtcttaatt tgcatactta agcatttagg aatgaagtgt tagagtgtct 1380 taaaatgttt caaatggttt aacaaaatgt atgtgaggcg tatgtggcaa aatgttacag 1440 aatctaactg gtggacatgg ctgttcattg tactgttttt ttctatcttc tatatgttta 1500 aaagtatata ataaaaatat ttaatttttt tttaaa 1536

Claims (60)

  1. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드(macrolide)를 포함하는 조성물.
  2. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료의 를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 비전신으로 투여되는 것인 조성물.
  3. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료의 를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루(read-through)를 유도하는 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
    a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하고 상기 업스트림 핵산 서열과 상기 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 핵산 서열, 다운스트림 핵산 서열 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
    상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타내는 것인 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 CNS(central nervous system)에 직접 투여되는 것인 조성물.
  6. 세포내(inter-culluar) 또는 세포이하(subcellular) 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하여, 적어도 하나의 넌센스 돌연변이로부터 생긴 비기능성 형태의 상기 세포내 또는 세포이하 단백질의 생성과 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 적어도 하나의 증상 또는 병증을 치료하는 데 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포내 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 적어도 7%의 기능성 단백질의 생성인 것인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 세포내 기능성 단백질의 생성을 적어도 부분적으로 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 약 7% 내지 약 25%의 기능성 단백질의 생성인 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 마크롤라이드는 에리쓰로마이신, 아지쓰로마이신 및 크랄리쓰로마이신 또는 이들의 적어도 2종의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 및 두개내로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로로 투여되는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내로 투여되는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환은 척수성 근위축증(Spinal Muscular Atrophy), 모세혈관확장 운동실조(Ataxia-telangiectasia), 레트 증후군(Rett syndrome), 어셔 증후군(Usher syndrome), 페록시좀 생물발생 장애(peroxisome biogenesis disorder), 활성화 결핍증(Activator Deficiency)/GM2 갱글리오사이드 축적증(GM2 Gangliosidosis), 알파 만노스 축적증(Alpha-mannosidosis), 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 콜레스테릴 에스터 저장 질환(Cholesteryl ester storage disease), 만성 헥소사미니디아제 A 결핍증(Chronic Hexosaminidase A Deficiency), 시스틴증(Cystinosis), 다논 질병(Danon disease), 파브리병(Fabry disease), 파버병(Farber disease), 푸코시드축적증(Fucosidosis), 갈락토시알리도시스(Galactosialidosis), 고쉐병(Gaucher Disease), GM1 갱글리오사이드 축적증, I-세포 질환(I-Cell disease)/뮤코리피드증(Mucolipidosis) II, 소아 유리 시알산 저장 질환/ISSD(Infantile Free Sialic Acid Storage Disease), 연소기 헥소사미니디아제 A 결핍증(Juvenile Hexosaminidase A Deficiency), 크라베병(Krabbe disease), 리소솜 산 리파제 결핍증(Lysosomal acid lipase deficiency), 이염성 백질이영양증(Metachromatic Leukodystrophy), 뮤코다당증 질병(Mucopolysaccharidoses disorder), 다종 술파타제 결핍증(Multiple sulfatase deficiency), 니만 픽병(Niemann-Pick Disease), 신경성 지방갈색소증(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses), 폼피병(Pompe disease)/글리코겐 저장 질환 II형(Glycogen storage disease type II), 농축 이골증(Pycnodysostosis), 샌드호프병(Sandhoff disease)/성인 발병/GM2 갱글리오사이드 축적증, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 유아, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 연소기, 쉰들러병(Schindler disease), 살라병(Salla disease)/시알산 저장 질환, 테이 삭스(Tay-Sachs)/GM2 갱글리오사이드 축적증, 여성 질환, 척수소뇌변성증(Spinocerebellar ataxia), 샤를부아-사기네이(Charlevoix-Saguenay)의 보통염색체 열성 경직성 운동실조(Autosomal recessive spastic ataxia), 간헐성 운동실조(Episodic ataxia: Ea), 보통염색체 열성 소뇌성 운동실조(autosomal recessive cerebellar ataxia: ARCA), 파킨슨병(Parkinson's disease), 타우병증(taupathy), 프로그로이드 증후군(Progroid syndrome), 베르너 증후군(Werner syndrome), 말초신경병증(Polyneuropathy), 청력 손실(hearing loss), 운동실조(ataxia), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa) 및 백내장(cataract)(PHARC), 샤리코-마리-투스(Charcot-Marie-Tooth: CMT), 프리온병(Prion disease), 유아 신경원성 세로이드 리포푸신증(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis), 뉴로세르핀 봉입체(neuroserpin inclusion body)에 의한 가족성 뇌증(familial encephalopathy), 대리어병 질환(Darier's disease), 판상증(Laminopathy), 에머리-드레이퓨즈 근위축증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy), 지대형근 근위축증 1B형(limb girdle muscular dystrophy type 1B), 듀니건형 가족성 부분 지방영양이상증(Dunnigan-type familial partial lipodystrophy), 바라퀘-시몬스 증후군(Barraquer-Simons syndrome), 부쉬케-올렌도프 증후군(Buschke-Ollendorff syndrome), 듀니건형의 가족성 부분 지방영양이상증(FPLD), 백질이영양증(Leukodystrophy), 탈수초, 성인 발병, 상염색체 우성(ADLD), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  13. 척수성 근위축증의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증(SMA)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 전장 SMN2의 생성을 증가시키는 것인 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 조성물은 비전신으로 투여되는 것인 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
    a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된, 상기 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈을 포함하는 SMN2 유전자의 단편에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 핵산 서열, 다운스트림 핵산 서열 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
    상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타내는 것인 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 CNS에 직접 투여되는 것인 조성물.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 및 두개내로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로로 투여되는 것인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내로 투여되는 것인 조성물.
  21. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료 방법.
  22. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 비전신으로 투여되는 것인, 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료 방법.
  23. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 비전신으로 투여되고, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것인, 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
    a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하는 핵산 서열을 포함하고 상기 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 핵산 서열, 다운스트림 핵산 서열 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
    상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타내는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 조성물은 치료학적 유효 용량으로 CNS에 직접 투여되는 것인 방법.
  26. 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질의 적어도 부분 생성을 복원하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하여, 적어도 하나의 넌센스 돌연변이로부터 생긴 비기능성 형태의 상기 세포내 또는 세포이하 단백질의 생성과 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 적어도 하나의 증상 또는 병증을 치료하는 단계를 포함하는 것인, 세포내 또는 세포이하 기능성 단백질의 적어도 부분 생성을 복원하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포내 기능성 단백질의 적어도 부분 생성을 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 적어도 7%의 기능성 단백질의 생성인 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 세포내 기능성 단백질의 적어도 부분 생성을 복원하는 것은 생성된 전체 단백질 중 약 7% 내지 약 25%의 기능성 단백질의 생성인 것인 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 마크롤라이드는 에리쓰로마이신, 아지쓰로마이신 및 크랄리쓰로마이신 또는 이들의 적어도 2종의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 및 두개내로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로로 투여되는 것인 방법.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내로 투여되는 것인 방법.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환은 척수성 근위축증, 모세혈관확장 운동실조, 레트 증후군, 어셔 증후군, 페록시좀 생물발생 장애, 헐러 증후군(Hurler syndrome), 리소좀 저장 질환, 활성화 결핍증/GM2 갱글리오사이드 축적증, 알파 만노스 축적증, 아스파르틸-글루코사민뇨증, 콜레스테릴 에스터 저장 질환, 만성 헥소사미니디아제 A 결핍증, 시스틴증, 다논 질병, 파브리병, 파버병, 푸코시드축적증, 갈락토시알리도시스, 고쉐병, GM1 갱글리오사이드 축적증, I-세포 질환/뮤코리피드증 II, 소아 유리 시알산 저장 질환/ISSD, 연소기 헥소사미니디아제 A 결핍증, 크라베병, 리소솜 산 리파제 결핍증, 이염성 백질이영양증, 뮤코다당증 질병, 다종 술파타제 결핍증, 니만 픽병, 신경성 지방갈색소증, 폼피병/글리코겐 저장 질환 II형, 농축 이골증, 샌드호프병/성인 발병/GM2 갱글리오사이드 축적증, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 유아, 샌드호프병/GM2 갱글리오사이드 축적증 - 연소기, 쉰들러병, 살라병/시알산 저장 질환, 테이 삭스/GM2 갱글리오사이드 축적증, 여성 질환, 척수소뇌변성증, 샤를부아-사기네이의 보통염색체 열성 경직성 운동실조, 간헐성 운동실조(Ea), 보통염색체 열성 소뇌성 운동실조(ARCA), 파킨슨병, 타우병증, 프로그로이드 증후군, 베르너 증후군, 말초신경병증, 청력 손실, 운동실조, 망막색소변성증 및 백내장(PHARC), 샤리코-마리-투스(CMT), 프리온병, 유아 신경원성 세로이드 리포푸신증, 뉴로세르핀 봉입체에 의한 가족성 뇌증, 대리어병 질환, 판상증, 에머리-드레이퓨즈 근위축증, 지대형근 근위축증 1B형, 듀니건형 가족성 부분 지방영양이상증, 바라퀘-시몬스 증후군, 부쉬케-올렌도프 증후군, 듀니건형의 가족성 부분 지방영양이상증(FPLD), 백질이영양증, 탈수초, 성인 발병, 상염색체 우성(ADLD), 펠리제우스-메르츠바하병, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  33. 척수성 근위축증(SMA)의 치료를 필요로 하는 환자에서 척수성 근위축증을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 전장 SMN2의 생성을 증가시키는 것인 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 조성물은 비전신으로 투여되는 것인 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드는,
    a. 후보 항생제 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 상기 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된, 상기 SMN2 유전자에 존재하는 중지 코돈을 포함하는 SMN2 유전자의 단편에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 핵산 서열, 다운스트림 핵산 서열 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 확인되고;
    상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 항생제 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 항생제 마크롤라이드가 상기 중지 코돈의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타내는 것인 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 CNS에 직접 투여되는 것인 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내, 신경내, 대뇌내, 뇌실내 및 두개내로 이루어진 군으로부터 선택된 투여 경로로 투여되는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 척추강내로 투여되는 것인 방법.
  41. 핵산 작제물로서,
    a. 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 제1 핵산 서열;
    b. 청색 형광 단백질(BFP)을 코딩하는 제2 핵산 서열; 및
    c. 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열 사이에 개재된 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 제3 핵산 서열로서, 넌센스 돌연변이를 포함하는 상기 제3 핵산 서열을 포함하되;
    상기 제1 핵산 서열, 제2 핵산 서열 및 제3 핵산 서열은 단일 오픈 리딩 프레임(ORF)에서 인프레임으로 연결된 것인 핵산 작제물.
  42. 제41항에 있어서, GFP는 BFP에 업스트림인 것인 핵산 작제물.
  43. 제41항에 있어서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열과 제3 핵산 서열 사이에 개재된 하나 이상의 링커 핵산 서열을 더 포함하는 핵산 작제물.
  44. 제41항의 핵산 작제물을 포함하는 벡터.
  45. 제41항의 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포.
  46. 제44항의 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인 것인 숙주 세포.
  48. 제47항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 것인 숙주 세포.
  49. 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 마크롤라이드를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은,
    a. 후보 마크롤라이드를, (ⅰ) GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 업스트림 핵산 서열; (ⅱ) 업스트림 형광 단백질과 다르고 GFP 및 BFP로부터 선택된 형광 단백질을 코딩하는 다운스트림 핵산 서열; 및 (ⅲ) 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 넌센스 돌연변이를 포함하고 상기 업스트림 핵산 서열과 다운스트림 핵산 서열 사이에 개재된 핵산 서열을 포함하는 핵산 작제물을 포함하는 세포의 집단과 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 핵산 서열, 다운스트림 핵산 서열 및 개재된 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인 단계; 및
    b. 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광을 측정하는 단계를 포함하되;
    c. 상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 증가는, 상기 후보 마크롤라이드가 상기 넌센스 돌연변이의 리드-쓰루를 유도하는 것을 나타내는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 업스트림 형광 단백질은 GFP이고, 상기 다운스트림 형광 단백질은 BFP인 것인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 넌센스 돌연변이를 포함하는 개재된 핵산 서열은 적어도 45개의 뉴클레오타이드를 갖는 것인 방법.
  52. 제49항에 있어서, 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광은 상기 업스트림 형광 단백질 및 다운스트림 형광 단백질 둘 다를 발현하는 세포에서만 측정되는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 업스트림 및 다운스트림 형광 단백질 둘 다를 발현하는 세포를 검출하거나 분류하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 제49항에 있어서, 상기 핵산 작제물을 포함하면서 상기 후보 마크롤라이드와 접촉하지 않은 세포와 비교하여 상기 후보 마크롤라이드와 접촉한 상기 핵산 작제물을 포함하는 세포에서의 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준의 적어도 약 7 내지 25%의 증가는, 상기 후보 마크롤라이드가 임상 용도를 위한 적합한 리드-쓰루라는 것을 나타내는 것인 방법.
  55. 제49항에 있어서, 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광의 측정은 형광 활성화 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter: FACS)에 의해 수행되는 것인 방법.
  56. 제49항에 있어서, 상기 작제물을 포함하면서 상기 후보 마크롤라이드와 접촉하는 세포와 넌센스 돌연변이가 없는 대조군 작제물을 포함하는 세포 사이의 상기 다운스트림 형광 단백질의 형광 수준을 비교하는 단계를 더 포함하는 방법.
  57. 제49항에 있어서, 상기 마크롤라이드는 항생제 마크롤라이드인 것인 방법.
  58. 넌센스 돌연변이로부터 생기거나 이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법으로서,
    (ⅰ) 하기 a. 내지 f.를 포함하는 방법에 의해 상기 질환의 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드를 선택하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 넌센스 돌연변이로부터 생기거나 이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환을 치료하는 방법:
    a. 상기 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환과 관련된 유전자에서 적어도 하나의 넌센스 돌연변이를 확인하는 단계;
    b. (a)의 상기 확인된 돌연변이에 상응하는 적어도 45개의 뉴클레오타이드의 단편 및 GFP 및 BFP로부터 선택된 2개의 명확한 형광 단백질을 코딩하는 2개의 핵산 서열에 의해 플랭킹된(flanked) 이의 둘러싼 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물을 제공하는 단계로서, 상기 단편 및 상기 2개의 명확한 형광 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 단일 ORF에서 인프레임으로 연결된 것인, 상기 제공하는 단계;
    c. 상기 (b)의 작제물을 숙주 세포로 도입하는 단계; 및
    d. 상기 (b)의 작제물을 포함하는 숙주 세포를 후보 리드-쓰루 마크롤라이드와 접촉시키는 단계; 및
    e. 형광 단백질 둘 다를 포함하는 리드-쓰루 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계;
    f. 형광 단백질 둘 다를 함유하는 리드-쓰루 폴리펩타이드의 존재는 상기 후보 리드-쓰루 마크롤라이드가 넌센스 돌연변이 리드-쓰루 마크롤라이드라는 것을 나타낸다.
  59. 제58항에 있어서, 상기 마크롤라이드는 항생제 마크롤라이드인 것인 방법.
  60. 넌센스 돌연변이와 관련된 유전적 신경퇴행성 또는 신경발달성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 상기 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 적어도 하나의 추가적인 치료학적으로 효과적인 물질과 조합된 적어도 1종의 항생제 마크롤라이드를 포함하는 조성물.
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