CN104622856A - 用于治疗自闭症的方法和组合物 - Google Patents

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保罗·塔拉雷
安德鲁·W·齐默尔曼
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Abstract

本发明涉及包括羟基脲的组合物的用途。具体地，本发明提供了包括羟基脲的组合物在制备用于治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的药物中的用途；其中所述组合物用于以有效量施用于诊断患有自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的受试者；以及所述受试者的所述细胞在所述组合物的所述施用之后被允许恢复到基本上等同于施用所述组合物前所述细胞中存在的状态的内稳态。还提供了一种用于确定化合物在治疗自闭症或一种或多种自闭症相关的疾患中的效力的方法。本发明还提供了包括羟基脲的在受试者的至少一个细胞中引起普遍性细胞应激反应的组合物在制备用于治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的药物中的用途。

Description

用于治疗自闭症的方法和组合物
本申请是申请日为2012年10月31日，申请号为201280065167.5，发明名称为“用于治疗自闭症的方法和组合物”的申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年11月11日提交的美国临时专利申请号61/558,486、2011年11月10日提交的美国临时专利申请号61/558,094、以及2011年10月31日提交的美国临时专利申请号61/553,509的优先权，所述申请以其整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明根据由约翰霍普金斯麦库西克内森遗传医学研究所和公共卫生署(Johns Hopkins McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine andPublic Health Service)授予的GM077456、HD10981和HD20961在政府的支持下完成。政府在本发明中具有某些权利。
背景
自闭症(autism)是目前被归入广泛发育性疾患(PervasiveDevelopmental Disorders,PDD)范围内的五大疾患之一，广泛发育性疾患是一类以发育的几个区域中的严重和广泛的损害为特征的神经疾患。自闭症是通常在前两年的生活中出现并影响大脑行使功能的复杂的发育性残疾，影响社交互动和沟通能力的发展。在自闭症谱系(autism spectrum)上，儿童和成人均通常显示语言和非语言沟通、社交互动、和休闲或游戏活动方面的困难。自闭症不分种族、民族或社会边界，并能影响任何家庭和任何孩子。
来自美国疾病控制和预防中心(U.S.Centers for Disease Control andPrevention,CDC)的自闭症统计鉴定约88分之1的美国儿童在自闭症谱系上-40年内的盛行率(prevalence)中增长了10倍。仔细研究表明，这种增长仅部分地通过改进的诊断和意识被解释。研究还表明，自闭症在男孩中比在女孩中更常见，为女孩中的4至5倍。据估计，在美国每54名男孩中的1名和252分之1的女孩被诊断患有自闭症。
尽管自闭症谱系疾患(ASD)的基因研究方面有进展，直接治疗ASD中潜在异常的细胞机制仍不可能。遗传相关性最多仅与～20％的ASD患者相关。这表明大量的临床异质性，其可能由于多重细胞机制。ASD中一些临床和实验室发现结果表明，不同类型的细胞功能障碍，包括神经炎症(Vargas等人，2005)、氧化应激(James等人，2009)、和线粒体异常(Weissman等人，2008)、以及异常突触可塑性和连通度(connectivity)(Weng等人，2010)，涉及很多相关的、相互作用的代谢途径。
目前用于治疗自闭症和自闭症谱系疾患的药物和治疗是针对症状的；不存在这些药物改善核心特征(例如，社交反应(social responsiveness))或影响神经发育轨迹的证据。因此，尽管加强努力，但是没有可用的用于治疗或预防自闭症的有效方法。
所需要的是基于机制的策略、其靶向固有细胞应激反应并调节导致自闭症和自闭症谱系疾患症状的代谢缺陷。
概述
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含在受试者的至少一个细胞中诱导普遍性细胞应激反应(general cellular stress response)的化合物；并允许受试者的被治疗或被影响的细胞恢复到施用化合物之前存在的细胞内稳态(cellular homeostasis)。组合物可包括药物组合物、天然产物组合物、医疗食品、营养补充剂、或包含赋形剂、稀释剂、酶、辅因子、及递送媒介物添加剂的组合物。用本文公开的化合物治疗受试者包括通过被治疗和/或被影响的细胞恢复至与治疗前被治疗的细胞的状态基本上相似的状态，本文称为恢复到细胞内稳态。在作为整体的被治疗的受试者中，受试者的自闭症或自闭症谱系疾患的症状和状态通过此治疗被降低，从而使受试者具有减弱的、或较少的自闭症或自闭症谱系疾患的属性。
本文公开了一种治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含在所述受试者的至少一个细胞中诱导普遍性细胞应激反应的化合物；以及允许所述受试者的所述细胞恢复到基本上等同于施用所述化合物前所述细胞中存在的状态的内稳态。
在一些实施方案中，其中在所述受试者的至少一个细胞中，应激蛋白质组可被刺激。
在一些实施方案中，其中在所述受试者的至少一个细胞中，增加的一氧化氮产生可被测量。
在一些实施方案中，其中在所述受试者的至少一个细胞中，应激感知细胞器自所述组合物的所述施用之前的量可增加。优选地，其中应激感知细胞器可以是线粒体。优选地，其中应激感知细胞器可以是过氧化物酶体。
在一些实施方案中，其中普遍性细胞应激反应可包括以下的至少一种：线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖、应激蛋白质组的激活、基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：包括热休克和解折叠蛋白质的基因、自噬反应的基因、抗氧化反应的基因、和c-jun-N-末端激酶途径的基因。优选地，其中热休克蛋白质的基因可包括热休克蛋白质40、热休克蛋白质70、和/或热休克蛋白质90家族成员。优选地，其中解折叠蛋白质基因可包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、蛋白质激酶RNA-样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1(IRE1)、及激活转录因子6。优选地，其中所述自噬反应的基因可包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。优选地，其中抗氧化反应的基因可包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的表达。
在一些实施方案中，其中所述受试者的所述至少一个细胞可位于所述受试者的脑中。
在一些实施方案中，其中所述组合物可包括羟基脲。
在一些实施方案中，其中所述组合物可包括莱菔硫烷。
在一些实施方案中，其中所述组合物可包括莱菔硫烷衍生物、二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物、莱菔硫烷的类似物、或其一种或多种的组合。
在一些实施方案中，其中所述组合物可包括以下的至少一种：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷、或类似物、衍生物或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。
在一些实施方案中，其中所述组合物可包括如由下式表示的结构所示的化合物：
或其亚组或药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，其中所述组合物可以是药物组合物、医疗食品或膳食补充剂。
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者的至少一个细胞施用有效量的组合物，所述组合物包含在受试者的至少一个细胞中诱导普遍性细胞应激反应的化合物；并允许细胞恢复到施用化合物之前存在的内稳态。组合物可包括药物组合物、天然产物组合物、医疗食品、营养补充剂、或包含赋形剂、稀释剂、酶、辅因子、及递送媒介物添加剂的组合物。
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者施用有效量的调节行为症状的可测量效果的组合物。组合物可包括药物组合物、天然产物组合物、医疗食品、营养补充剂、或包含赋形剂、稀释剂、酶、辅因子、及递送媒介物添加剂的组合物。
在一些实施方案中，其中有效量的所述组合物的施用可调节受治疗的所述受试者的社交反应。
在一些实施方案中，其中有效量的所述组合物的施用可诱导所述人的至少一个细胞中的普遍性细胞应激反应。
在一些实施方案中，其中有效量的所述组合物的施用可调节行为症状的可测量效果。
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者施用有效量的调节受治疗的受试者的社交反应的组合物。组合物可包括药物组合物、天然产物组合物、医疗食品、营养补充剂、或包含赋形剂、稀释剂、酶、辅因子、及递送媒介物添加剂的组合物。
本文公开了治疗一种或多种自闭症谱系疾患的方法，所述方法包括向诊断患有一种或多种自闭症谱系疾患的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含在人的至少一个细胞中诱导普遍性细胞应激反应的化合物。组合物可包括药物组合物、天然产物组合物、医疗食品、营养补充剂、或包含赋形剂、稀释剂、酶、辅因子、及递送媒介物添加剂的组合物。
本文公开了治疗一种或多种自闭症谱系疾患的方法，所述方法包括向诊断患有一种或多种自闭症谱系疾患的受试者施用有效量的调节行为症状的可测量效果的组合物。组合物可包括药物组合物、天然产物组合物、医疗食品、营养补充剂、或包含赋形剂、稀释剂、酶、辅因子、及递送媒介物添加剂的组合物。
在一些实施方案中，其中有效量的所述组合物的施用可调节受治疗的所述受试者的社交反应。
在一些实施方案中，其中有效量的所述组合物的施用可诱导所述人的至少一个细胞中的普遍性细胞应激反应。
在一些实施方案中，其中有效量的所述组合物的施用可调节行为症状的可测量效果。
本文公开了治疗一种或多种自闭症谱系疾患的方法，所述方法包括向诊断患有一种或多种自闭症谱系疾患的受试者施用有效量的调节受治疗的受试者的社交反应的组合物。组合物可包括药物组合物、天然产物组合物、医疗食品、营养补充剂、或包含赋形剂、稀释剂、酶、辅因子、及递送媒介物添加剂的组合物。
本文公开了用于确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的方法，所述方法包括向第一细胞施用有效量的待被测试的化合物、比较第一细胞的反应与用诱导普遍化的应激反应(generalized stressresponse)的化合物治疗的相同细胞的反应、以及确定测试的化合物是否诱导细胞中的普遍性细胞应激反应。
在一些实施方案中，其中所述细胞可以是正常人成纤维细胞。
在一些实施方案中，其中所述细胞可以是XALD成纤维细胞。
在一些实施方案中，其中所述细胞可以是K562细胞。
在一些实施方案中，其中所述接触可发生在体外。
在一些实施方案中，其中所述接触可发生在体内。
本文公开了用于治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的医疗食品。
本文公开了用于治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的膳食或营养补充剂。
本文公开了可用于组合物中以治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的来源于天然或合成来源的化合物。
附图简述
被并入并构成本说明书的一部分的附图，阐述了本发明的几个方面并与以下描述一起用于解释本发明的原理。
图1显示XALD和K562细胞中的有益反应涉及线粒体功能的药理学诱导。
图2显示通过4PBA、HU、TSA、或SFN诱导的线粒体生物发生(mitochondrial biogenesis)是JNK-依赖性的。
图3显示通过4PBA、HU、TSA、或SFN处理诱导了热休克反应(heatshock response)。
图4显示通过用4PBA、HU、TSA、或SFN处理激活解折叠蛋白反应(unfolded protein response)。
图5显示通过用4PBA、HU、TSA、或SFN处理诱导了自噬和抗氧化反应(autophagy and the antioxidant response)。
图6显示HU和SFN未抑制I类和II类组蛋白脱乙酰酶活性。
图7显示通过4BPA、HU、TSA、和SFN在脊髓性肌萎缩成纤维细胞中诱导线粒体生物发生。
图8显示通过SFN诱导的FL-SMN和SMN的表达依赖于JNK途径、自噬、线粒体生物发生、和SIRT1活性。
图9显示生物化学SIRT1活性并非是通过4BPA、HU、TSA、和SFN诱导应激蛋白质组所需的。
描述
A.自闭症和自闭症谱系疾患
自闭症谱系疾患(ASD)和自闭症两者均是指一组复杂的脑发育疾患的一般术语。这些疾患的特点为社交互动、语言和非语言沟通以及重复性行为方面的不同程度的困难。这些疾患包括，但不限于，自闭症疾患、Rett综合征、儿童期崩解性疾患、待分类的广泛性发育疾患(PervasiveDevelopmental Disorder-Not Otherwise Specified，PDD-NOS)和阿斯伯格综合征(Asperger syndrome)。ASD可与智力残疾、动作协调困难、以及注意力和身体健康问题如睡眠和胃肠道功能紊乱有关。一些患有ASD的人擅长视觉技巧、音乐、数学和艺术。(参见，例如，Wiggins等人2011，在此通过引入以其整体并入本文，并且其显示患有ASD的青少年具有默认网络的后中心(posterior hub of the default network)和右额上回之间的较弱的连通度)。虽然不希望受任何特定理论的约束，人们认为，自闭症谱系疾患可起因于多种影响相关的代谢途径的非致命的遗传性疾患和表观遗传效应。
诸如自组织映射(SOM)，以创建用于每个参与者的参考以计算连通度。我们使用由SOM算法鉴定的个体化静息态集群以证实先前ASD组中较弱的后-前(posterior-anterior)连通度的发现结果，及检查ASD和对照组中的年龄相关的变化。39名患有ASD的青少年和41名对照进行10分钟、睁眼、静息态功能MRI扫描。此外，相比ASD组，对照具有随着年龄的增长连通度中较大的增加。这些发现结果表明，SOM是用于计算临床群体中连接度的互补方法。此外，相比对照，患有ASD的青少年具有不同的默认网络的发育轨迹。
在发热发作期间，38％(Miles 2010)至83％(Curran等人，2007)的自闭症儿童的行为短暂地改善。减少的刻板行为和不恰当的言语方面的改善是最显著的。改善与发热的程度或疾病的严重程度不相关(Curran等人，2007，通过该引用以其整体被并入)。发热刺激HSP，其对CNS中多种细胞过程，包括突触传递是重要的(Stetler等人，2010)。
细胞应激蛋白质组是参与应答各种应激源诸如发热、辐照和缺氧途径一系列相互作用蛋白(a complex of interacting proteins)，并行使功能以再建立内稳态。应激反应途径不是应激源特异性的，并包括细胞器生物发生、MAPK信号传导、抗氧化剂产生、热休克蛋白、解折叠蛋白反应、和自噬(Stetler等人，2010)。
B.组合物
i)硫代葡糖酸盐(glucosinolate)
本发明包括用于治疗自闭症和自闭症谱系疾患的方法和组合物，所述组合物包含硫代葡糖酸盐。虽然不希望受任何特定理论的约束，但人们目前认为，十字花科植物的益处是其异硫氰酸盐及其前体分子硫代葡糖酸盐的含量。硫代葡糖酸盐通过酶诸如硫葡糖苷酶例如黑芥子酶被转化为异硫氰酸盐。通常，在植物细胞中，黑芥子酶和硫代葡糖酸盐在细胞中被分开，且如果细胞被破坏，例如通过昆虫捕食，随着区室化丢失，黑芥子酶或其它类似地起作用的酶与硫代葡糖酸盐接触，然后将其转化为异硫氰酸盐。黑芥子酶，EC 3.2.1.147，CAS编号9025-38-1，被本领域技术人员已知为转化前体分子如硫代葡糖酸盐为更具活性的化合物如异硫氰酸盐如莱菔硫烷的起类似作用的酶。
本发明包括用于治疗自闭症和自闭症谱系疾患的方法和组合物，所述组合物包含一种或多种酶、和/或一种或多种类型的酶、及任选的代谢途径中的辅因子或其它酶。本发明涉及的酶，在本文称为本发明的酶，包括但不限于，黑芥子酶、硫葡糖苷酶、谷胱甘肽转移酶、NAD(P)H：醌还原酶(QR)和葡萄糖醛酸基转移酶，它们具有类似的活性或在相关的途径中。例如，如本领域已知的，在水的存在下，黑芥子酶裂解来自硫代葡糖酸盐的葡萄糖基团。剩余的分子随后转化为硫氰酸盐、异硫氰酸盐或腈；这些是作为植物防御的活性物质。取决于不同的生理条件诸如pH和某些辅因子的存在，硫代葡糖酸盐通过黑芥子酶或本发明的其它酶或起类似作用的酶的水解可产生各种产物。已经观察到反应共享初始步骤。首先，通过黑芥子酶裂解β-葡糖硫苷连键(β-thioglucoside linkage)，释放D-葡萄糖。所得的糖苷配基经历自发的洛森状重排(Lossen-like rearrangement)，释放硫酸盐。取决于反应发生所处的生理条件，机制中的最后一步经受最大的变化。在中性pH时，主要产物是异硫氰酸盐。在酸性条件(pH<3)下，并且在亚铁离子或环硫特化蛋白(epithiospecifer protein)的存在下，反而腈的形成是有利的。
提取天然产物作为化合物诸如莱菔硫烷的来源的方法，包括相对于通过化学合成方法制备的那些，从植物来源诸如从植物来源诸如十字花科蔬菜提取的方法，包括但不限于蔬菜在冷水中匀浆、冻干、用乙腈提取所得粉末、过滤和蒸发浓缩。从植物中提取化合物的其它方法是本领域已知的，并涵盖在本发明中，且可以包括，例如，提取种子和芽以制备本发明的化合物，例如由美国专利号5,725,895所教导的，其全部内容被并入本文。用于提取天然产物，特别从十字花科植物提取天然产物的已知方法，包括包含沸水萃取所需化合物的提取方法。
虽然不希望受任何特定理论的约束，但是目前人们认为，硫代葡糖酸盐是无活性的前体分子，其然后通过酶转化成有活性的形式，例如异硫氰酸盐诸如莱菔硫烷(其在本文可被称为更具活性的化合物，因为该化合物在特定的分析中比其前体分子的活性更为活跃)。本发明的组合物包括一种或多种前体化合物，诸如硫代葡糖酸盐，和/或可包括多种活性分子例如通过针对硫代葡糖酸盐的酶活性所制造的产物，例如莱菔硫烷，或一种或多种前体化合物和一种或多种活性化合物两者，且还可任选地包括使用前体化合物或更具活性的化合物作为底物的一种或多种酶，和/或此类酶的辅因子。目前人们认为，在人类中，食物中的硫代葡糖酸盐通过肠道微生物至少部分地转化至异硫氰酸盐。例如，本发明的组合物可包含一种或多种前体化合物，诸如硫代葡糖酸盐，用于治疗自闭症和自闭症谱系疾患。组合物还可包含一种或多种酶，其中在组合物中所提供的化合物是一种或多种酶的底物分子。组合物可以在单一的递送媒介物提供，或可以在两种或多种递送媒介物中被提供，其可被同时地、顺序地提供，或以其它施用方法提供。
ii)十字花科植物来源
适于在本文所公开的方法和组合物中使用的植物来源可以是十字花科植物的任何部分，包括但不限于细胞、种子、芽(sprout)、叶、茎(stalk)、根、花和其它植物结构。本发明涉及的植物来源包括，但不限于，来自十字花科例如芸苔族(Brassiceae)并包括芸苔亚族(Brassicinae)的植物。例如，植物来源可以是除了其它的以外选自以下的品种的组的甘蓝(Brassicaoleracea)：羽衣甘蓝(acephala)(羽衣甘蓝(kale)、羽衣甘蓝(collards)、甘蓝(wild cabbage)、曲羽衣甘蓝(curly kale))、髓茎甘蓝(medullosa)(髓茎甘蓝(marrowstem kale))、千头羽衣甘蓝(ramosa)(千头羽衣甘蓝(thousand headkale))、芥兰(alboglabra)(中国甘蓝(Chinese Kale))、花椰菜(botrytis)(菜花(cauliflower)、花茎甘蓝(sprouting broccoli))、葡萄牙羽衣甘蓝(costata)(葡萄牙甘蓝(Portuguese kale))、抱子甘蓝(gemmifera)(球芽甘蓝(Brusselssprouts))、球茎甘蓝(gongylodes)(球茎甘蓝(kohlrabi))、花茎甘蓝(italica)(西兰花(broccoli))、泽西羽衣甘蓝(palmifolia)(泽西羽衣甘蓝(Jersey kale))、皱叶卷心菜(sabauda)(皱叶甘蓝(savoy cabbage))、甘蓝种萨贝利卡变种(sabellica)(羽衣甘蓝(collards))、以及甘蓝种西兰夏变种(selensia)(羽衣甘蓝(borecole))。
被用于本文公开的方法和组合物的有用的西兰花品种是传奇(Saga)、得西科(DeCicco)、埃佛勒斯(Everest)、翠绿城(Emerald City)、帕克曼(Packman)、海防舰(Corvet)、花花公子早期(Dandy Early)、皇帝(Emperor)、水手(Mariner)、绿彗星(Green Comet)、格林福莱特(GreenValiant)、亚卡叠(Arcadia)、卡拉布利斯卡拉维尔(Calabrese Caravel)、强斯勒(Chancellor)、希特新(Citation)、克鲁伊斯(Cruiser)、早紫发芽红箭(Early Purple Sprouting Red Arrow)、优利卡(Eureka)、埃克塞斯尔(Excelsior)、盖利昂(Galleon)、金加(Ginga)、哥里亚斯(Goliath)、格林杜克(Green Duke)、格林贝尔特(Greenbelt)、意大利发芽(ItalianSprouting)、晚紫发芽(Late Purple Sprouting)、晚冬发芽白星(Late WinterSprouting White Star)、雷金德(Legend)、利普里强(Leprechaun)、马拉森(Marathon)、马利娜(Mariner)、密纳利特(Minaret(Romanesco))、帕拉宫(Paragon)、爱国者(Patriot)、普利姆克落普(Premium Crop)、拉品(Rapine(Spring Raab))、罗萨林德(Rosalind)、萨雷德(Salade(Fall Raab))、萨姆莱(Samurai)、秀根(Shogun)、斯普林特(Sprinter)、苏丹(Sultan)、台壳(Taiko)、和特莱谢(Trixie)。然而，许多其它西兰花品种是适用的。
被用于本文公开的方法和组合物的有用的菜花品种是阿佛达(Alverda)、亚美金(Amazing)、安德斯(Andes)、布干迪葵因(BurgundyQueen)、堪迪恰姆(Candid Charm)、卡许美尔(Cashmere)、克里斯马怀特(Christmas White)、多密南特(Dominant)、埃尔比(Elby)、特早雪球(ExtraEarly Snowball)、复利蒙特(Fremont)、因克莱(Incline)、密克维密特曼(Milkyway Minuteman)、拉许摩尔(Rushmore)、S-207、色拉诺(Serrano)、斯拉内华达(Sierra Nevada)、斯利亚(Siria)、斯诺克郎(Snow Crown)、斯诺福雷克(Snow Flake)、斯诺格雷斯(Snow Grace)、斯诺布雷德(Snowbred)、苏莱德(Solide)、台番(Taipan)、外类特葵因(Violet Queen)、怀特巴隆(White Baron)、怀特比肖普(White Bishop)、怀特肯特萨(WhiteContessa)、怀特克落那(White Corona)、怀特德福(White Dove)、怀特福莱士(White Flash)、怀特福克斯((White Fox)、怀特耐特(White Knight)、怀特莱特(White Light)、怀特葵因(White Queen)、怀特洛克(White Rock)、怀特塞而斯(White Sails)、怀特萨姆(White Summer)、怀特脱普(WhiteTop)、优肯(Yukon)。然而，许多其它菜花品种是适用的。
iii)莱菔硫烷
本发明的组合物包含莱菔硫烷，一种有机硫化合物(1-异硫氰酰基-4R-(甲基亚磺酰基)丁烷)，本领域已知的衍生物如二硫代氨基甲酸酯/盐(dithiocarbamate)衍生物和本文公开的其它衍生物，和本领域已知的和/或本文所公开的类似物。莱菔硫烷是一种毒物兴奋药物(hormetic drug)，虽然不希望受任何特定理论的约束，其被认为诱导了普遍性“细胞保护性”反应。莱菔硫烷是许多植物的活性成分，并且例如，可从西兰花芽(broccoli sprout)中提取，或可通过化学合成方法制备。莱菔硫烷可以从冻干的、冷冻干燥的3日龄的西兰花芽提取物获得。西兰花芽在世界各地被非常大量的个体广泛地消费，没有任何不良作用的报道。人体实验研究也未显示由施用莱菔硫烷的任何显著的不良作用。
莱菔硫烷穿过血脑屏障。研究已经证明莱菔硫烷针对脑、外周神经系统、和神经细胞的生物利用率。小鼠和大鼠的各种品系(strain)中的研究已经证明在多种施用途径后莱菔硫烷(及其二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物)在脑中的积累(Zhao等人，2005和Clarke等人，2011，两者都通过此引用以其整体被并入)。
虽然不希望受任何特定理论的约束，人们认为莱菔硫烷可提供针对氧化和炎性应激的保护，例如针对氧化损伤、热休克保护细胞的系统的干扰、以及由蛋白质错误折叠引起的干扰的保护。这些保护机制被认为是通过转录因子Nrf2所介导的，其经由Keapl/Nrf2/ARE调节系统控制人类基因组的基因的表达。该系统可在许多组织包括脑中通过莱菔硫烷被上调。(参见，例如Baird等人，2011，其通过该引用以其整体被并入)。
数据表明，莱菔硫烷处理后，诱导了小鼠中热休克蛋白和泛素26s蛋白酶体亚基(subunit)(Hu等人，2008)。热休克因子1(HSF1)及HSP 27的表达通过莱菔硫烷被扩增。在HeLa细胞中，莱菔硫烷上调HSP70和HSP90。其它研究已经发现，Keapl-Nrf2途径可被涉及(Baird等人，2011)。
本领域熟悉莱菔硫烷类似物，其包括，但不限于以下：6-异硫氰酰基-2-己酮、外-2-乙酰基-6-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-异硫氰酰基-6-甲基磺酰基降冰片烷、6-异硫氰酰基-2-己醇、1-异硫氰酰基-4-二甲基膦酰基丁烷、外-2-(1’-羟基乙基)-5-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-乙酰基-5-异硫氰酰基降冰片烷、1-异硫氰酰基-5-甲基磺酰基戊烷、顺-3-(甲基磺酰基)环己基甲基异硫氰酸酯和反-(甲基磺酰基)环己基甲基异硫氰酸酯。
iv)本发明的化合物
本发明的组合物可包含本文公开的一种或多种化合物，例如，组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类和II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、及非组蛋白脱乙酰酶抑制剂的化合物，如羟基脲、莱菔硫烷和/或其衍生物和类似物。本发明的组合物可包含调节细胞的普遍性细胞应激反应的一种或多种方面的化合物。目前人们认为，一种或多种途径可参与调节细胞的普遍性细胞应激反应，并且本发明涵盖如本文所述并如本领域通常理解的上调细胞的普遍性细胞应激反应的化合物，包括但不限于本文公开的那些。
例如，在一个方面，组合物包括4-苯基丁酸酯/盐(4-phenylbutyrate)。在一个方面，组合物包括丁酸钠。在一个方面，组合物包括羟基脲。在一个方面，组合物包括莱菔硫烷。在一个方面，组合物包括莱菔硫烷的衍生物。在一个方面，组合物包括莱菔硫烷的类似物。在一个方面，组合物包括曲古抑菌素A。在一个方面，组合物包括本文所公开的化合物的组合，例如包括以下的一种或多种的组合：羟基脲、莱菔硫烷、4-苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、和/或曲古抑菌素A。例如，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐(phenylbutyrate)和丁酸钠的组合。在一个方面，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含羟基脲、苯基丁酸酯/盐、丁酸钠的组合。在一个方面，组合物包括包含羟基脲和莱菔硫烷的组合。在一个方面，组合物包括包含羟基脲和莱菔硫烷的如已知的和/或本文所公开的衍生物或类似物的组合。在一个方面，组合物包括包含羟基脲、莱菔硫烷、苯基丁酸酯/盐、丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含莱菔硫烷、苯基丁酸酯/盐、丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含莱菔硫烷衍生物或类似物，以及以下的一种或多种的组合：苯基丁酸酯/盐、丁酸钠和曲古抑菌素A。
本发明的组合物可包括如由下式表示的结构所示的化合物：
或其亚组(subgroup)或药学上可接受的盐。
v)调节普遍性细胞应激反应的化合物
本发明包括用于治疗自闭症和自闭症谱系疾患的方法和组合物，所述组合物包括调节普遍性细胞应激反应、调节例如热休克因子和热休克蛋白的转录和表达的化合物。热休克蛋白(HSP)参与感知和修复DNA损伤，且在许多途径中行使分子伴侣的功能。热休克因子(HSF)是HSP的转录调节因子，其在细胞和生物体中作为应激整合因子(integrator)以保持内稳态，且在进化上是保守的(Akerfelt等人，2010)。
本发明的方法包括施用有效量的本文所公开的化合物，如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和非HDAC抑制剂，如羟基脲或莱菔硫烷，以调节普遍性细胞应激反应，如调节与普遍性细胞应激反应相关的核酸和肽和蛋白质的水平和量，包括线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖、应激蛋白质组的激活，基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：包括热休克和解折叠蛋白质的基因、自噬反应的基因、抗氧化反应的基因、和c-jun-N-末端激酶途径的基因。
本发明的调节细胞中普遍性应激反应的组合物可包括如由下式表示的结构所示的化合物：
或其亚组或药学上可接受的盐。
本发明的组合物可包括本文所公开的被配制为医疗食品的化合物。本发明的组合物包括包含本文公开的化合物和本领域技术人员已知的用于制备医疗食品的组分的医疗食品。医疗食品是专门配制并预期用于疾病如自闭症和/或自闭症谱系疾患的膳食管理的食品，其具有通过单独的正常膳食不能够满足的特殊营养需求(distinctive nutritional requirement)。在一个方面，疾病是例如自闭症。在一个方面，疾病是例如一种或多种自闭症谱系疾患。如由FDA在孤儿药品法案(Orphan Drug Act)(21U.S.C.360ee(b)(3))第5节所定义的，术语“医疗食品”被定义为“被配制以在医师的监督下消费或肠内施用并预期用于疾病或病症的特殊膳食管理的食品，基于公认的科学原理，由医疗评估建立了所述疾病或病症的特殊营养需求。”
vi)医疗食品
医疗食品由于专门的膳食用途与更广泛类别的食品不同，并与具有健康声明的传统食品不同。为了被认为是医疗食品，该产品必须在最低限度：(i)是用于口服(oral ingestion)或管饲(鼻胃管)的食品、(ii)被标记用于存在特殊营养需求的专门的医疗疾患、疾病或病症的膳食管理、及(iii)预期在医务监督下使用。在一个方面，存在特殊营养需求的疾病是，例如，自闭症。在一个方面，存在特殊营养需求的疾病是，例如，一种或多种自闭症谱系疾患。
本文公开了用于治疗自闭症的医疗食品。本文公开了用于治疗一种或多种自闭症谱系疾患的医疗食品。
本发明的组合物包括包含本文公开的一种或多种化合物、调节普遍性细胞应激反应的一种或多种化合物、一种或多种组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、和或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂的医疗食品。例如，在一个方面，医疗食品包括4-苯基丁酸酯/盐。在一个方面，医疗食品包括丁酸钠。在一个方面，医疗食品包括曲古抑菌素A。在一个方面，医疗食品包括4-苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、和/或曲古抑菌素A的组合。例如，医疗食品包括包含苯基丁酸酯/盐和丁酸钠的组合。在一个方面，医疗食品包括包含苯基丁酸酯/盐和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，医疗食品包括包含丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，医疗食品包括包含苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、及曲古抑菌素A的组合。在一个方面，医疗食品包括羟基脲。在一个方面，医疗食品包括一种或多种II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在一个方面，医疗食品包括莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物。在一个方面，医疗食品包括莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。
在一个方面，医疗食品包括以下的至少一种：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、莱菔硫烷衍生物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，医疗食品包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、莱菔硫烷衍生物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物的组合。在一个方面，医疗食品包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂诸如例如I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、和以下的一种或多种的组合：4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷、莱菔硫烷衍生物、或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，医疗食品包括4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、和莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物的组合。
在一个方面，医疗食品包括一种或多种十字花科种子或芽，或来自一种或多种十字花科芽的提取物。
在治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，医疗食品包括如由下式表示的结构所示的化合物：
或其亚组或药学上可接受的盐。
在治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，莱菔硫烷类似物是6-异硫氰酰基-2-己酮、外-2-乙酰基-6-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-异硫氰酰基-6-甲基磺酰基降冰片烷、6-异硫氰酰基-2-己醇、1-异硫氰酰基-4-二甲基膦酰基丁烷、外-2-(1’-羟基乙基)-5-异硫氰酰基降冰片烷、外-2-乙酰基-5-异硫氰酰基降冰片烷、1-异硫氰酰基-5-甲基磺酰基戊烷、顺-3-(甲基磺酰基)环己基甲基异硫氰酸酯和反-(甲基磺酰基)环己基甲基异硫氰酸酯。
在治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，医疗食品包括赋形剂或稀释剂。
在一个方面，公开的医疗食品包括导致以下的一种或多种化合物：(i)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
在一个方面，本文公开的医疗食品包括本发明的化合物和组合物，且任选地包括以本发明的化合物为底物的酶。医疗食品组合物可以在适于施用途径的递送媒介物例如胶囊、局部乳膏、鼻喷雾剂、可注射溶液、锭剂、小袋(sachet)中被受试者摄入，且此类组合物可被单独施用或与其它组分的组合物组合施用。例如，组合物可包括在一种递送媒介物中的本发明的化合物，其与包含本发明的酶组合物的第二组合物同时或顺序地施用。如本文所用的酶组合物可包括一种或多种公开的酶，用于改变前体分子以产生更具活性的化合物，且可以包括转换途径中的辅因子、辅酶、和/或其它酶。
vii)膳食补充剂
本发明包括用于治疗自闭症和自闭症谱系疾患的方法和组合物，所述组合物包含本文公开的被配制成膳食或营养补充剂的化合物。膳食补充剂，也称为食品补充剂或营养补充剂，是预期补充膳食和提供化合物诸如本文公开的那些或诸如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸或氨基酸的制品(preparation)，所述化合物在正常的膳食来源中可能是缺少的，或在人们的膳食中可能未以足够的量被消耗。一些国家将膳食补充剂定义为食品，而在其它国家，它们被定义为药品或天然保健品。膳食补充剂可在适于施用的递送媒介物中被提供，或可被添加进食品、液体、固体、饮品、水、或受试者可食用或饮用的其它可摄取的或营养组合物中。
本文公开了用于治疗自闭症的膳食补充剂。本文公开了用于治疗一种或多种自闭症谱系疾患的膳食补充剂。
本发明的组合物包括包含本文公开的一种或多种化合物、调节普遍性细胞应激反应的一种或多种化合物、一种或多种组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、和或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂的膳食补充剂。在一个方面，膳食补充剂包括一种或多种I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。例如，在一个方面，膳食补充剂包括4-苯基丁酸酯/盐。在一个方面，膳食补充剂包括丁酸钠。在一个方面，膳食补充剂包括曲古抑菌素A。在一个方面，膳食补充剂包括4-苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、和/或曲古抑菌素A的组合。例如，膳食补充剂包括包含苯基丁酸酯/盐和丁酸钠的组合。在一个方面，膳食补充剂包括包含苯基丁酸酯/盐和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，膳食补充剂包括包含丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，膳食补充剂包括包含苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，膳食补充剂包括羟基脲。在一个方面，膳食补充剂包括一种或多种II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在一个方面，膳食补充剂包括莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物或衍生物。在一个方面，膳食补充剂包括莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。
在一个方面，膳食补充剂包括以下的至少一种：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，膳食补充剂包括以下的组合：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，膳食补充剂包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂诸如例如I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂，和以下的一种或多种的组合：4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷、或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，膳食补充剂包括4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、和莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物的组合。
本发明的组合物包括膳食补充剂，所述膳食补充剂包括如由下式表示的结构所示的化合物：
或其亚组或药学上可接受的盐。
在治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，膳食补充剂包括常规用于配制膳食补充剂的赋形剂或稀释剂、或其它组分。
在一个方面，公开的膳食补充剂包括一种或多种十字花科芽、或来自一种或多种十字花科植物来源的提取物。
在一个方面，公开的膳食补充剂包括导致以下的一种或多种化合物：(i)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
在一个方面，本文公开的膳食补充剂包括本发明的化合物和组合物，且任选地包括改变本发明的化合物的酶组合物。膳食补充剂组合物可在适于施用途径的递送媒介物例如胶囊、局部乳膏、鼻喷雾剂、可注射溶液、锭剂、小袋中被受试者摄入，且此类组合物可被单独施用或与其它组分的组合物组合施用。例如，在一种方法中，一种组合物可包括在一种递送媒介物中的本发明的化合物，其与包括本发明的酶组合物的第二组合物同时或顺序地施用。
B.治疗自闭症的方法
本文公开了治疗自闭症的方法。
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者施用有效量的药物组合物，其中组合物包括在受试者的至少一个细胞中诱导普遍性细胞应激反应的化合物；并允许受试者恢复到施用化合物之前存在的内稳态。
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者的至少一个细胞施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括在受试者的至少一个细胞中诱导普遍性细胞应激反应的化合物；并允许细胞恢复到施用化合物之前存在的内稳态。
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者施用有效量的调节行为症状的可测量效果的药物组合物。
本文公开了治疗自闭症的方法，所述方法包括向诊断患有自闭症的受试者施用有效量的调节被治疗的受试者的社交反应的药物组合物。本领域技术人员熟悉患有自闭症或自闭症谱系疾患的受试者的社交反应，如在Constantino等人,2003(J Autism Devel Disorders,33:427-433，其讨论了社交反应量表或SRS-良好验证的自闭症特征的测量)中讨论的。
在治疗自闭症的公开的方法中，受试者是男性或女性。在一个方面，受试者未指示特定的年龄或性别。因此，预期覆盖成人和新生儿受试者，以及胎儿，无论男性还是女性。在一个方面，受试者是哺乳类。
在治疗自闭症的公开的方法中，改善行为症状包括以下的一种或多种：减少的(i)易怒、(ii)多动、(iii)刻板动作、和/或(iv)不恰当的言语。在一个方面，改善的行为症状包括包括减少的(i)易怒、(ii)多动、(iii)刻板动作、和/或(iv)不恰当的言语。在一个方面，改善的行为症状包括以下的两种或多种的组合：减少的(i)易怒、(ii)多动、(iii)刻板动作、和/或(iv)不恰当的言语。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的易怒和多动。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的易怒和刻板动作。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的易怒和不恰当的言语。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的多动和不恰当的言语。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的刻板动作和恰当的言语。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的易怒、多动和刻板动作。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的易怒、多动和不恰当的言语。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的易怒、刻板动作、和不恰当的言语。例如，在一个方面，改善的行为症状包括减少的多动、刻板动作、及不恰当的言语。如本领域技术人员已知的，自闭症和自闭症谱系疾患中的行为症状及其改善在Aman等人，1985中被讨论。
在治疗自闭症的公开的方法中，在受试者的至少一个细胞中，应激蛋白质组被刺激。在治疗自闭症的公开的方法中，在受试者的至少一个细胞中，增加的一氧化氮产生被测量。在治疗自闭症的公开的方法中，在受试者的至少一个细胞中，应激感知细胞器(stress-sensing organelle)自施用组合物之前的量增加。应激感知细胞器可以是线粒体或过氧化物酶体。在一个方面，应激感知细胞器是线粒体。在一个方面，应激感知细胞器是过氧化物酶体。
在治疗自闭症的公开的方法中，治疗自闭症的公开的方法的普遍性细胞应激反应包括以下的至少一种：(1)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，普遍性细胞应激反应包括下列各项的一种以上：(1)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
例如，在一个方面，组合包括线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖。在一个方面，组合包括线粒体生物发生和应激蛋白质组的激活。在一个方面，组合包括线粒体生物发生以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖和应激蛋白质组的激活。
在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖和应激蛋白质组的激活。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖、基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖、应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
在治疗自闭症的公开的方法中，热休克蛋白的基因可以是热休克蛋白40、70、和/或90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白70家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40和70家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40和90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白70和90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40、热休克蛋白70、和热休克蛋白90家族成员的基因。
在治疗自闭症的公开的方法中，解折叠蛋白质基因可以包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、蛋白质激酶RNA-样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1(inositol requiring1，IRE1)、和/或激活转录因子6，在一个方面，解折叠蛋白质基因是葡萄糖调节蛋白78(BIP)。在一个方面，解折叠蛋白质基因是PERK。在一个方面，解折叠蛋白质基因是需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因是转录因子6。
在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、蛋白质激酶RNA-样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1(IRE1)、和/或激活转录因子6的组合。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和PERK。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和激活转录因子6，在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括PERK和需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括PERK和激活转录因子6。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、PERK、和需肌醇酶1(IRE1)。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、PERK、和激活转录因子6的组合。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、需肌醇酶1(IRE1)、和激活转录因子6的组合。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括PERK、需肌醇酶1(IRE1)、和激活转录因子6的组合。
在治疗自闭症的公开的方法中，自噬反应基因可以包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)、和/或微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，自噬反应基因是beclin-1(BCN1)。在一个方面，自噬反应基因是自噬蛋白质5(ATG5)。在一个方面，自噬反应基因是微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，自噬反应基因包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)、和/或微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)的组合。在一个方面，组合包括beclin-1(BCN1)和自噬蛋白质5(ATG5)。在一个方面，组合包括beclin-1(BCN1)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，组合包括自噬蛋白质5(ATG5)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。
在治疗自闭症的公开的方法中，抗氧化反应基因可包括核因子红细胞2-样2(nuclear factor erythriod 2-like 2,NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和超氧化物歧化酶2(SOD2)的表达。在一个方面，抗氧化反应基因是核因子红细胞2-样2(NFE2L2)。在一个方面，抗氧化反应基因是血红素加氧酶1(HMOX1)。在一个方面，抗氧化反应基因是超氧化物歧化酶2(SOD2)。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和/或超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)和血红素加氧酶1(HMOX1)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括血红素加氧酶1(HMOX1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。
在治疗自闭症的公开的方法中，受试者的至少一个细胞位于受试者的脑中。在一个方面，受试者的至少一个细胞不是在受试者的脑中。在一个方面，普遍性应激反应发生在受试者的所有细胞中，但程度不同。在一个方面，细胞展示的普遍性应激反应的程度取决于具体的组织和细胞类型。例如，在一个方面，由于高能量需求和线粒体活性，受试者脑中的细胞是敏感的。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括一种或多种组蛋白脱乙酰酶抑制剂。在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括一种或多种I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。例如，在一个方面，组合物包括4-苯基丁酸酯/盐。在一个方面，组合物包括丁酸钠。在一个方面，组合物包括曲古抑菌素A。在一个方面，组合物包括4-苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、和/或曲古抑菌素A的组合。例如，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐和丁酸钠的组合。在一个方面，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐、丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括羟基脲。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括一种或多种II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括莱菔硫烷或莱菔硫烷衍生物或类似物，或其组合。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括以下的至少一种：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，组合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物的组合。在一个方面，组合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂诸如例如，I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂，和以下的一种或多种的组合：4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，组合物包括4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、和莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物的组合。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物包括如由下式表示的结构所示的化合物：
或其亚组或药学上可接受的盐。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物还包括药物赋形剂或稀释剂，或在用于组合物的适当施用的递送媒介物中使用的制剂的组分。
在治疗自闭症的公开的方法中，组合物被口服地、局部地、通过注射、血管内、皮下、肌内、经鼻、或通过其它已知的施用途径施用。在治疗自闭症的公开的方法中，组合物被一次或多次施用。例如，在一个方面，组合物每天至少一次被施用。在一个方面，组合物被连续地施用。在一个方面，组合物被间歇施用。在一个方面，施用可被重复，例如，每天一次、或每天两次或多次、或每周一次、或每周两次或多次、或每隔一周、或每月一次、或每月一次或多次、或每隔一天、或每隔一周、或每过一月、或每隔一年，等等。
治疗自闭症的公开的方法还可以包括评价受试者的神经系统疾病或神经系统疾患诸如例如，自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的进展。临床医生(例如医师)或研究者可以在预定的时间评价受试者。例如，在一个方面，采集人类受试者的数据可以周期性地执行，其中预定的时间以定期间隔发生，例如针对受试者生命的每3个月、6个月、9个月、或每年、每隔一年、每5年、每10年。在一个方面，预定的时间不需要是周期性的。对于另一个实例，在一个方面，采集非人类受试者的数据可在定期间隔隔开的预定时间周期性地进行，诸如针对非人类受试者生命的每周、每隔一周、每月、每隔一个月、每3个月、每6个月、每9个月、每年、每隔一年。
C.治疗自闭症谱系疾患的方法
本文公开了治疗一种或多种自闭症谱系疾患的方法。
本文公开了治疗一种或多种自闭症谱系疾患的方法，所述方法包括向诊断患有一种或多种自闭症谱系疾患的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包括在人的至少一个细胞中诱导普遍性细胞应激反应的化合物。
本文公开了治疗一种或多种自闭症谱系疾患的方法，所述方法包括向诊断患有一种或多种自闭症谱系疾患的受试者施用有效量的调节行为症状的可测量效果的药物组合物。
本文公开了治疗一种或多种自闭症谱系疾患的方法，所述方法包括向诊断患有一种或多种自闭症谱系疾患的受试者施用有效量的调节被治疗的受试者的社交反应的药物组合物。本领域技术人员熟悉患有自闭症或自闭症谱系疾患的受试者的社交反应，如在Constantino等人,2003(J AutismDevel Disorders,33:427-433，其讨论了社交反应量表或SRS-良好验证的自闭症特征的测量)中讨论的。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，受试者是男性或女性。在一个方面，受试者未指示特定的年龄或性别。因此，预期覆盖成人和新生儿受试者，以及胎儿，无论男性还是女性。在一个方面，受试者是哺乳类。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，在受试者的至少一个细胞中，应激蛋白质组被刺激。在治疗自闭症的公开的方法中，在受试者的至少一个细胞中，增加的一氧化氮产生被测量。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，在受试者的至少一个细胞中，应激感知细胞器自施用组合物之前的量增加。应激感知细胞器可以是线粒体或过氧化物酶体。在一个方面，应激感知细胞器是线粒体。在一个方面，应激感知细胞器是过氧化物酶体。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，治疗自闭症的公开的方法的普遍性细胞应激反应包括以下的至少一种：(1)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，普遍性细胞应激反应包括下列各项的一种以上：(1)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
例如，在一个方面，组合包括线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖。在一个方面，组合包括线粒体生物发生和应激蛋白质组的激活。在一个方面，组合包括线粒体生物发生以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖和应激蛋白质组的激活。
在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖和应激蛋白质组的激活。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖、基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖、应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，热休克蛋白的基因可以是热休克蛋白40、70、和/或90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白70家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40和70家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40和90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白70和90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40、热休克蛋白70、和热休克蛋白90家族成员的基因。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、蛋白质激酶RNA-样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1(IRE1)、和/或激活转录因子6。在一个方面，解折叠蛋白质基因是葡萄糖调节蛋白78(BIP)。在一个方面，解折叠蛋白质基因是PERK。在一个方面，解折叠蛋白质基因是需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因是转录因子6。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、蛋白质激酶RNA-样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1(IRE1)、和/或激活转录因子6的组合。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和PERK。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和激活转录因子6。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括PERK和需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括PERK和激活转录因子6。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、PERK、和需肌醇酶1(IRE1)。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、PERK、和激活转录因子6的组合。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、需肌醇酶1(IRE1)、和激活转录因子6的组合。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括PERK、需肌醇酶1(IRE1)、和激活转录因子6的组合。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，自噬反应基因包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)、和/或微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，自噬反应基因是beclin-1(BCN1)。在一个方面，自噬反应基因是自噬蛋白质5(ATG5)。在一个方面，自噬反应基因是微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，自噬反应基因包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)、和/或微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)的组合。在一个方面，组合包括beclin-1(BCN1)和自噬蛋白质5(ATG5)。在一个方面，组合包括beclin-1(BCN1)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，组合包括自噬蛋白质5(ATG5)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和超氧化物歧化酶2(SOD2)的表达。在一个方面，抗氧化反应基因是核因子红细胞2-样2(NFE2L2)。在一个方面，抗氧化反应基因是血红素加氧酶1(HMOX1)。在一个方面，抗氧化反应基因是超氧化物歧化酶2(SOD2)。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和/或超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)和血红素加氧酶1(HMOX1)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括血红素加氧酶1(HMOX1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，受试者的至少一个细胞位于受试者的脑中。在一个方面，受试者的至少一个细胞不是在受试者的脑中。在一个方面，普遍性应激反应发生在受试者的所有细胞中，但程度不同。在一个方面，细胞展示的普遍性应激反应的程度取决于具体的组织和细胞类型。例如，在一个方面，由于高能量需求和线粒体活性，受试者脑中的细胞是特别敏感的。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物包括一种或多种I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。例如，在一个方面，组合物包括4-苯基丁酸酯/盐。在一个方面，组合物包括丁酸钠。在一个方面，组合物包括曲古抑菌素A。在一个方面，组合物包括4-苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、和/或曲古抑菌素A的组合。例如，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐和丁酸钠的组合。在一个方面，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，组合物包括包含苯基丁酸酯/盐、丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物包括羟基脲。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物包括一种或多种II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物包括莱菔硫烷或莱菔硫烷衍生物或类似物。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物包括莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物包括以下的至少一种：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，组合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物的组合。在一个方面，组合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂诸如例如，I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂，和以下的一种或多种的组合：4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷、或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，组合物包括4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、和莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物的组合。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物包括如由下式表示的结构所示的化合物：
或其亚组或药学上可接受的盐。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物还包括药物赋形剂或稀释剂，或在用于组合物的适当施用的递送媒介物中使用的制剂的组分。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物被口服地、局部地、通过注射、经鼻、或通过其它已知的施用途径施用。
在治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法中，组合物被一次或多次施用。例如，在一个方面，组合物每天至少一次被施用。在一个方面，组合物被连续地施用。在一个方面，组合物被间歇施用。在一个方面，施用可被重复，例如，每天一次、或每天两次或多次、或每周一次、或每周两次或多次、或每隔一周、或每月一次、或每月一次或多次、或每隔一天、或每隔一周、或每过一月、或每隔一年，等等。
治疗一种或多种自闭症谱系疾患的公开的方法还可以包括评价受试者的神经系统疾病或神经系统疾患诸如例如，自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的进展。临床医生(例如医师)或研究者可以在预定的时间评价受试者。例如，在一个方面，采集人类受试者的数据可以周期性地执行，其中预定的时间以定期间隔发生，例如针对受试者生命的每3个月、6个月、9个月、或每年、每隔一年、每5年、每10年。在一个方面，预定的时间不需要是周期性的。对于另一个实例，在一个方面，采集非人类受试者的数据可在定期间隔隔开的预定的时间周期性地进行，诸如针对非人类受试者生命的每周、每隔一周、每月、每隔一个月、每3个月、每6个月、每9个月、每年、每隔一年。
D.确定化合物效力的方法
本文公开了确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的方法，所述方法包括向第一细胞施用有效量的待被测试的化合物、比较第一细胞的反应与用诱导普遍性应激反应的化合物处理的相同细胞的反应、以及确定测试的化合物是否在细胞中诱导普遍性细胞应激反应。在一个方面，细胞是正常人成纤维细胞。在一个方面，细胞是XALD成纤维细胞。在一个方面，细胞是K562细胞。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，细胞来自受试者。在一个方面，受试者是男性或女性。在一个方面，受试者未指示特定的年龄或性别。因此，预期覆盖成人和新生儿受试者，以及胎儿，无论男性还是女性。在一个方面，受试者是哺乳类。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，刺激第一细胞的应激蛋白质组。在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，测量第一细胞中增加的一氧化氮产生。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，第一细胞中的应激感知细胞器自施用该化合物之前的量增加。应激感知细胞器可以是线粒体或过氧化物酶体。在一个方面，应激感知细胞器是线粒体。在一个方面，应激感知细胞器是过氧化物酶体。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，普遍性细胞应激反应包括以下的至少一种：(1)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，普遍性细胞应激反应包括以下的一种以上：(1)线粒体生物发生、(2)过氧化物酶体增殖、(3)应激蛋白质组的激活、或(4)基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
例如，在一个方面，组合包括线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖。在一个方面，组合包括线粒体生物发生和应激蛋白质组的激活。在一个方面，组合包括线粒体生物发生以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖和应激蛋白质组的激活。
在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖和应激蛋白质组的激活。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖、基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括线粒体生物发生、应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。在一个方面，组合包括过氧化物酶体增殖、应激蛋白质组的激活以及基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：(a)包括热休克和解折叠蛋白质的基因、(b)自噬反应的基因、(c)抗氧化反应的基因、以及(d)c-jun-N-末端激酶途径的基因。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，热休克蛋白的基因可以是热休克蛋白40、70、和/或90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白70家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40和70家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40和90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白70和90家族成员的基因。在一个方面，热休克蛋白的基因包括热休克蛋白40、热休克蛋白70、和热休克蛋白90家族成员的基因。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、蛋白质激酶RNA-样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1(IRE1)、和/或激活转录因子6。在一个方面，解折叠蛋白质基因是葡萄糖调节蛋白78(BIP)。在一个方面，解折叠蛋白质基因是PERK。在一个方面，解折叠蛋白质基因是需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因是转录因子6。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、蛋白质激酶RNA-样内质网激酶(PERK)、需肌醇酶1(IRE1)、和/或激活转录因子6的组合。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和PERK。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)和激活转录因子6。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括PERK和需肌醇酶1(IRE1)。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括PERK和激活转录因子6。在一个方面，解折叠蛋白质基因的组合包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、PERK、和需肌醇酶1(IRE1)。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、PERK、和激活转录因子6的组合。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、需肌醇酶1(IRE1)、和激活转录因子6的组合。在治疗自闭症的公开的方法的一个方面，解折叠蛋白质基因包括PERK、需肌醇酶1(IRE1)、和激活转录因子6的组合。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，自噬反应基因包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)、和/或微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，自噬反应基因是beclin-1(BCN1)。在一个方面，自噬反应基因是自噬蛋白质5(ATG5)。在一个方面，自噬反应基因是微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，自噬反应基因包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)、和/或微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)的组合。在一个方面，组合包括beclin-1(BCN1)和自噬蛋白质5(ATG5)。在一个方面，组合包括beclin-1(BCN1)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。在一个方面，组合包括自噬蛋白质5(ATG5)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和超氧化物歧化酶2(SOD2)的表达。在一个方面，抗氧化反应基因是核因子红细胞2-样2(NFE2L2)。在一个方面，抗氧化反应基因是血红素加氧酶1(HMOX1)。在一个方面，抗氧化反应基因是超氧化物歧化酶2(SOD2)。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和/或超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)和血红素加氧酶1(HMOX1)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括血红素加氧酶1(HMOX1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。在一个方面，抗氧化反应基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)、和超氧化物歧化酶2(SOD2)的组合的表达。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，第一细胞是脑细胞。在一个方面，第一细胞不是脑细胞。在一个方面，普遍性应激反应发生在受试者的所有细胞中，但程度不同。在一个方面，细胞展示的普遍性应激反应的程度取决于具体的组织和细胞类型。例如，在一个方面，由于高能量需求和线粒体活性，脑细胞是特别敏感的。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，化合物包括I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。例如，在一个方面，化合物包括4-苯基丁酸酯/盐。在一个方面，化合物包括丁酸钠。在一个方面，化合物包括曲古抑菌素A。在一个方面，化合物包括4-苯基丁酸酯/盐、丁酸钠、和/或曲古抑菌素A的组合。例如，化合物包括包含苯基丁酸酯/盐和丁酸钠的组合。在一个方面，化合物包括包含苯基丁酸酯/盐和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，化合物包括包含丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。在一个方面，化合物包括包含苯基丁酸酯/盐、丁酸钠和曲古抑菌素A的组合。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，化合物包括羟基脲。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，化合物包括一种或多种II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，化合物包括莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，化合物包括莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。
在确定化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，化合物包括以下的至少一种：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，组合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物的组合。在一个方面，化合物包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂诸如例如，I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂，和以下的一种或多种的组合：4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物、或莱菔硫烷二硫代氨基甲酸酯/盐代谢物。在一个方面，化合物包括4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、和莱菔硫烷或莱菔硫烷类似物的组合。
在确定测试化合物在治疗自闭症或自闭症相关的疾患中的效力的公开的方法中，被测试的化合物与之相比以确定在测定中的细胞中的效力或变化的比较化合物，如由下式表示的结构所示：
或其亚组或药学上可接受的盐。
化合物可以在体外条件下或在体内条件下被测试。
E.定义
如说明书及所附权利要求中所用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。
如本文所用的词“或”是指特定列表中的任意一个成员，并且也包括该列表成员的任意组合。
范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当此范围被表示时，另外的方面包括从一个特定值和/或至其它特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，将被理解的是，该特定值形成另外的方面。还将被理解的是，每个范围的端点在涉及其它端点，且独立于其它端点二者是有意义的。还被理解的是，本文公开的一些值，并且每个值在本文除了该值本身之外还被公开为“约”该特定值。例如，如果值“10”被公开，那么“约10”也被公开。还被理解的是，两个特定单位之间的每个单位也被公开。例如，如果10和15被公开，那么11、12、13、和14也被公开。
如本文所用的，十字花科芽是种子萌发后发育的早期阶段的植株或幼苗。十字花科种子被置于其萌发和生长所处的环境中。种子萌发后直到且包括2-叶期可收获十字花科芽。
如本文所用的，术语“受试者”是指施用的靶，例如，动物。因此，本文公开的方法的受试者可以是脊椎动物，例如哺乳类、鱼类、鸟类、爬行类或两栖类。可选地，本文公开的方法的受试者可以是人类、非人类灵长类、马、猪、兔、狗、绵羊(sheep)、山羊(goat)、牛(cow)、猫、豚鼠或啮齿类。该术语并不指示特定的年龄或性别。因此，预期覆盖成人和新生儿受试者，以及胎儿，无论男性还是女性。在一个方面，受试者是哺乳类。受试者还可以是转基因、非人类动物，包括但不限于转基因小鼠或转基因大鼠。
患者是指患有疾病或疾患的受试者。术语“患者”包括人类和兽医的受试者。在公开的方法的一些方面，在施用步骤之前，受试者已经被诊断有治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的需要。
如本文所用的，术语“类似物”是指具有源自母体化合物(例如，本文所公开的化合物)的结构的化合物，且其结构与本文公开的那些足够相似，并且基于该相似性，将被本领域技术人员预期以展示如要求保护的化合物的相同或类似的活性和效用，或作为前体以诱导如要求保护的化合物的相同或类似的活性和效用。
如本文所用的，“同源物(homolog)”或“同源物(homologue)”是指与特定已知序列具有同源性的多肽或核酸。特别公开了本文公开的与规定的或已知的序列具有至少40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的核酸和多肽的变体。本领域技术人员容易了解如何确定两个蛋白质或核酸的同源性。例如，可在比对两条序列之后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。被理解的是，定义本文所公开的基因和蛋白质的任何变体、修饰或衍生物的一种方式是通过根据与特定已知序列的同源性定义变体、修饰和衍生物。
如本文所用的，术语“治疗”是指受试者或患者的医疗管理，预期治愈、改善、稳定、或预防疾病、病理病症或疾患诸如例如，自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患。该术语包括积极治疗，即特别地针对疾病、病理病症或疾患的改善的治疗，且还包括病因治疗，即针对去除相关疾病、病理病症、或疾患的病因的治疗。此外，该术语包括姑息性治疗，即旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理病症或疾患的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分地或完全地抑制相关疾病、病理病症或疾患的发展的治疗；以及支持性治疗，即被用于补充另一种特定疗法、旨在改善相关疾病、病理病症或疾患的治疗。在多个方面，该术语覆盖受试者包括哺乳类(例如，人)的任何治疗，并且包括：(i)预防疾病在可易患该疾病但还未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(ii)抑制疾病，即，阻止其发展；或(iii)缓解疾病，即，促使疾病消退。在一个方面中，疾病、病理病症或疾患是自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患。
如本文所用的，术语“有效量(effective amount)”和“有效的量(amounteffective)”是指足以实现期望的结果，或对非期望的病症产生作用的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现期望的治疗结果，或对非期望的症状产生作用，但一般不足以引起不良副作用的量。针对任何特定患者的特定治疗有效剂量水平，将取决于多种因素，包括待治疗的疾患和疾患的严重程度；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；使用的特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；与采用的特定化合物组合或并行(coincidental)使用的药物，以及在医学领域众所周知的类似的因素。例如，以低于实现期望治疗效果需要的水平的化合物的剂量开始，并逐渐增加剂量直到实现期望效果充分地在本领域的技术之内。如果需要，有效日剂量可以分成多个剂量用于施用的目的。因此，单次剂量组合物可以包含此量或其约数，以组成日剂量。在出现任何禁忌症的情况下，剂量可由个人医师调整。剂量可以变化，并且可以以每日一种或多种剂量施用被施用，持续一天或几天。在文献中可以发现用于给定类别的药物产品的适当剂量的指导。在另外的多个方面，制品可以以“预防有效量”；即，用于预防疾病或病症的有效的量被施用。
如本文所用的，术语“有效量”和“有效的量”是指足以实现期望的结果，或对非期望的病症产生作用的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现期望的治疗结果，或对非期望的症状产生作用，但一般不足以引起不良副作用的量。针对任何特定患者的特定治疗有效剂量水平，将取决于多种因素，包括待治疗的疾患和疾患的严重程度；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间；施用途径；使用的特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；与采用的特定化合物组合或并行使用的药物，以及在医学领域众所周知的类似的因素。
除非另有明确声明，否则不以任何方式预期本文列出的任何方法或方面被理解为需要以特定的顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求没有在权利要求书或说明书中特定声明将步骤限于特定的顺序的情况下，不以任何方式在任何方面预期推断顺序。这适用于对任何可能的非明示基础的解释，包括关于步骤或操作流程的排列的逻辑事项、从语法组织或标点得出一般含义、或在说明书中描述的多方面的数目或类型。
如本文所用的，氨基酸的缩写是用于氨基酸的常规的单字母代码，并表示如下：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸盐/酯，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸。
如本文所用的，“肽”是指任何肽、寡肽、多肽、基因产物、表达产物、或蛋白质。例如，肽可以是酶。肽包括连续的氨基酸。多肽涵盖天然存在的或合成的分子，并且可以包含除20种基因编码的氨基酸之外的修饰的氨基酸。多肽可以通过天然过程如翻译后加工被修饰，或通过本领域熟知的化学修饰技术被修饰。修饰可以发生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定的多肽的几个位点。
通常，基因/核酸或肽的生物活性或生物作用是指由被认为是基因/核酸或肽的天然存在形式的基因/核酸或肽展示或执行的任何功能，如在体内(即，在基因/核酸或肽的天然生理环境中)或体外(即，在实验室条件下)测量或观察到的。
如本文所用的术语“酶”是指催化其它物质的化学反应而在反应完成时自身未被破坏或改变的任何肽。通常，具有酶活性的肽催化从一种或多种底物形成一种或多种产物。此类肽可以具有任何类型的酶活性，包括但不限于，与酶诸如本文公开的那些相关的一种酶活性或多种酶活性。
术语“药学上可接受的”描述了非生物上或其它方面不期望的材料，即，不会引起不可接受水平的不期望的生物作用或以有害的方式相互作用的材料。如本文所用的，术语“药学上可接受的载体”指的是无菌的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳状液、以及用于在临使用之前重新配制成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。可例如通过使用包被材料如卵磷脂、通过在分散液的情况下保持要求的颗粒尺寸、和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。这些组合物还可以包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。预防微生物的作用可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等来确保。包括等渗剂，例如糖、氯化钠等等也可以是期望。可注射药物形式的延长吸收可通过包括延缓吸收的剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。可注射的贮存形式(depot form)是通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物的微胶囊基质制成。取决于药物与聚合物的比和使用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。贮存可注射制剂也可以通过将药物包裹(entrap)在与体组织相容的脂质体或微乳液中制备。可注射制剂可以被灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤或通过在临使用前可被溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物的形式中掺入灭菌剂。合适的惰性载体可以包括糖，如乳糖。理想地，按颗粒重量计的至少95％的活性成分具有在0.01至10微米范围内的有效粒径。
如本文所用的，“EC50”，预期指用于生物过程或过程的组分包括蛋白质、亚基、细胞器、核糖核蛋白等的50％增强或激活所需的物质(例如，化合物或药物)的浓度或剂量。EC50也指体内50％增强或激活所需的物质的浓度或剂量，如本文其它地方进一步定义的。可选地，EC50可以指激发基线和最大反应之间的一半反应的化合物的浓度或剂量。反应可以在方便和适用于目的生物反应的体外或体内系统中测量。例如，反应可使用培养的脑细胞体外测量或在具有分离的脑细胞的离体器官培养系统中测量。可选地，反应可使用合适的研究模型诸如啮齿类包括小鼠和大鼠，在体内测量。视情况而定，反应可以在转基因或基因敲除的小鼠或大鼠中测量，其中一种或多种基因视情况而定已被引入或敲除，以复制疾病过程。
如本文所用的，“IC50”预期指用于生物过程或过程的组分包括蛋白质、亚基、细胞器、核糖核蛋白等的50％抑制或减少所需的物质(例如，化合物或药物)的浓度或剂量。IC50也指体内50％抑制或减少所需的物质的浓度或剂量，如本文其它地方进一步定义的。可选地，IC50也可以指物质的半最大(50％)抑制浓度(IC)或抑制剂量。反应可以在方便和适用于目的生物反应的体外或体内系统中测量。例如，反应可以使用培养的脑细胞体外测量或在具有分离的脑细胞的离体器官培养系统中测量。可选地，反应可使用合适的研究模型诸如啮齿类包括小鼠和大鼠，在体内测量。视情况而定，反应可以在转基因或基因敲除的小鼠或大鼠中测量，其中一种或多种基因视情况而定已被引入或敲除，以复制疾病过程。
细胞可以从商业来源例如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)获得，并且可以是原核的或真核的。细胞可以以液体培养基培养的方式生长或生长在组织培养平板上。生长条件将取决于所用的特定细胞，且这些条件将是本领域技术人员已知的。宿主细胞的转染和生长在Maniatis等人中被描述。
遍及该详细描述的说明书和权利要求书，词“包括(comprise)”和该词的变化形式，如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，是指“包括但不限于”，并且不预期排除例如其它添加剂、组分、整数或步骤。“示例性的”表示“一个实例”且不预期表达优选的或理想的实施方案的暗示。“诸如(such as)”不以限制性的意义使用，而是用于说明性的目的。
如本文所用的，术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以或可以不发生，并且本说明书包括其中所述事件或情况发生的实例和其中其不发生的实例。
如本文所用的，术语“转化”和“转染”是指将核酸如表达载体引入受体细胞(recipient cell)，包括将核酸引入所述细胞的染色体DNA。本领域熟悉用于实现将核酸引入受体细胞的各种组合物、方法、技术等。本领域熟悉用于真核和原核细胞两者的此类组合物、方法、技术等。本领域熟悉将核酸引入受体细胞内以及在受体细胞内表达的优化的此类组合物、方法、技术等。
如本文所用的术语“接触”是指使公开的化合物与细胞、靶受体、基因、肽或其它生物实体，以该化合物可影响靶(例如，受体、转录因子、细胞等)的活性的方式，直接地；即，通过与靶本身相互作用，或间接地；即，通过与靶活性依赖的另一分子、辅因子、因子或蛋白质相互作用在一起。
如本文所用的，术语“测定(determining)”可以指测量或确定例如核苷酸或转录本或多肽的表达和/或活性水平中的数量或量或变化。例如，测定本文所用的样品中公开的转录本或多肽的量可参照技术人员将采取以测量或确定样品中的转录本或多肽的一些量化值的步骤。本领域熟悉测量公开的核苷酸、转录本、多肽等的量的方法。
如本文所用的，术语“水平”指的是样品例如来自受试者的样品中靶分子的量。分子的量可通过本领域已知的任何方法测定，并将部分地取决于分子(即，基因、mRNA、cDNA、蛋白质、酶，等)的性质。本领域熟悉用于核苷酸(例如，基因、cDNA、mRNA等)以及蛋白质、多肽、酶等的定量方法。被理解的是，样品中的分子的量或水平不需要按绝对值计算来测定，但可以以相对值计算来测定(例如，当与对照或假处理样品或未处理的样品比较时)。
“调节”是指通过增加或减少的改变。如本文所用的，“调节因子”可以指可以增加或减少基因或基因产物如肽的表达水平或活性水平的组合物。表达或活性的调节不必是完全的。例如，表达或活性可被调节如与其中基因或基因产物的表达或活性未被组合物调节的对照细胞相比的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或其间的任何百分数。
如本文所用的，术语“诊断”是指已经受技术人员例如医师的身体检查，并发现患有可通过本文公开的化合物、组合物、或方法被诊断或治疗或改善或检测或减轻的病症。例如，“诊断患有自闭症”或“诊断患有一种或多种自闭症谱系疾患”是指已经受技术人员例如医师的身体检查，并发现患有可通过缓解或改善自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的化合物或组合物被诊断或治疗的病症。
如本文所用的，短语“鉴定为具有疾患的治疗需要(identified to be inneed of treatment for a disorder)”或类似的，是指基于疾患的治疗的需要选择受试者。例如，受试者可由技术人员基于较早的诊断被鉴定为具有疾患(例如，自闭症或自闭症谱系)的治疗需要，并且其后经受疾患的治疗。预期的是，鉴定可在一个方面由与作出诊断的人不同的人进行。还预期的是，在另外的方面，施用可通过随后进行施用的人来进行。
如本文所用的，术语“施用(administering)”和“施用(administration)”是指向受试者提供包括公开的组合物的公开的组合物或药物制品的任何方法。此类方法是本领域技术人员众所周知的，且包括但不限于，心脏内施用、心肌内施用、口服施用、经皮施用、吸入施用、鼻腔施用、局部施用、阴道内施用、眼部施用、耳内施用、脑内施用、直肠施用、舌下施用、含服施用和肠胃外施用，包括注射诸如静脉内施用、动脉内施用、肌内施用和皮下施用。施用可以是连续的或间歇性的。施用可被重复，例如，每天一次、或每天两次或多次、或每周一次、或每周两次或多次、或每隔一周、或每月一次、或每月一次或多次、或每隔一天、或每隔一周、或每过一月、或每隔一年，等等。在多个方面，制品可在治疗上被施用；也就是说，被施用以治疗现有疾病或病症。在另外的多个方面，制品可被预防性施用；也就是说，被施用以预防疾病或病症。
公开了可被用于制备本发明的组合物的组分以及待被用于本文公开的方法的组合物本身。这些和其它材料在本文公开，并且被理解的是，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组、等等时，尽管这些化合物的每个不同的个体和集体组合和排列的特定引用不能明确地公开，但是每一种情况在本文都被特定涉及并描述。例如，如果特定化合物被公开并论述，并且论述了可对一些分子包括化合物作出的一些修饰，那么特定涉及化合物和可能的修饰的每一个(each and every)组合和排列，除非特定地有相反的指示。因此，如果公开一类分子A、B和C，以及一类分子D、E、和F，并且公开了组合分子的实例A-D，那么即使没有单独地列举每一种情况，每一种情况被单独地和集体地涉及，意味着组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、和C-F被认为是公开的。同样，这些的任何子集或组合也被公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组将被认为是公开的。这个概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于，在制造和使用本发明的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可被进行的多个另外的步骤，被理解的是，这些另外的步骤的每一个都可以以与本发明的方法的任何特定的实施方案或实施方案的组合一起被执行。
本发明通过参考本发明的以下详细描述和其中包括的实施例可以更容易地被理解。
本文提到的所有出版物都通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。本文所讨论的出版物仅针对它们在本申请的申请日之前的公开内容被提供。本文的任何内容都不得被解释为承认，本发明没有由于在先发明而先于此类出版物的资格。另外，本文提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，这可能需要独立的确认。
F.实验
由于每个小分子都可在多样化的孟德尔疾患(Mendelian disorder)和复杂的疾患中产生类似的结果，这些小分子可能诱导共同的细胞效果。这些分子包括两种(2)组蛋白脱乙酰酶抑制剂，4-苯基丁酸酯/盐和曲古抑菌素A，以及两种(2)不具有直接的组蛋白脱乙酰酶抑制剂活性的小分子，羟基脲和莱菔硫烷。在某些情况下，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)的治疗效果是由于与致病基因有关的基因表达的增加。在神经系统疾患X连锁的肾上腺脑白质营养不良(XALD)中，曲古抑菌素A造成的极长链脂肪酸(very long chain fatty acid)水平的潜在有益的减少不是由于补偿基因表达的增加。相反，4-苯基丁酸酯/盐的减少，伴随着关键应激感知细胞器，即线粒体和过氧化物酶体的增殖的增加。这些研究检查了4-苯基丁酸酯/盐、曲古抑菌素A、羟基脲、和莱菔硫烷是否共享共同的细胞反应，其包括诱导线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖、应激蛋白质组的激活，它们统称为适应性细胞存活反应(adaptive cell survival response)。
本文描述的研究已经鉴定了进化上保守的应激蛋白质组的激活和线粒体生物发生作为针对小分子疗法的共同细胞反应。这一系列的反应可以是多种疾病的治疗作用的共同基础。这个新的治疗靶的调节可以扩大可治疗的疾病的范围，且可被用于优化不直接靶向致病基因异常的治疗小分子或剂。
i)材料与方法
a.细胞培养
原代人成纤维细胞、HeLa细胞(ATCC#CCL-2，来自Hal Dietz博士,Johns Hopkins University,Baltimore,MD的惠赠)，及K562细胞(ATCC#CCL-243)分别生长在低限量Eagle培养基(minimal Eagle medium)(MEM；Mediatech,Manassas,VA)、补充10mM HEPES和1mM丙酮酸钠的RPMI培养基(Mediatech)、或RPMI中，并且补充有10％胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)。除非另有说明，以5mM 4PBA(1mM用于JNK抑制研究)、600μΜ HU、200nM TSA、或5μΜ SFN处理成纤维细胞(70-95％汇合)。K562细胞用1.2mM SB或100μΜ HU处理。所有药物均获自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。滴定每种细胞类型的每种药物的浓度以允许100％的生存力，并以最低限度影响生长率。处理的持续时间根据实验而不同，如图例中所示的。
b.HDAC活性测定
按照制造商的方案(K331；Biovision,Mountain View,CA)，使用100-200μg的HeLa或成纤维细胞裂解物，一式三份地进行比色HDAC活性测定。
c.间接免疫荧光
如Watkins等人，1995中描述的，使用4％甲醛、1％Triton X-100、一抗抗-ATP5B(Millipore,Billerica,MA)或抗-ABCD3(Invitrogen,Carlsbad,CA)、以及二抗缀合FITC的绵羊抗-小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)或缀合若丹明的山羊抗-兔IgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)进行。
d.细胞内蛋白质印迹分析
原代人成纤维细胞用抗-ATP5B、DRAQ5(Cell Signaling Technologies,Danvers,MA；一种用于对细胞数目进行标准化的细胞DNA染料)，和二抗IRDye 800CW驴抗-小鼠IgG(Li-cor Biosciences,Lincoln,NE)的免疫染色与以上描述的间接免疫荧光相同，并且一式两份进行。成像和定量使用Odyssey成像仪(Li-cor Biosciences)进行。
e.抑制研究
抗霉素A(10ng/mL)、LY294002、PD98059、RO-31-8425、SB203580、SP600125、和L-NAME获自Sigma。化合物C来自EMD Biosciences(Darmstadt,Germany)。人成纤维细胞以每种抑制剂处理。随后，45-75min后，加入4PBA、HU、TSA或SFN中的任一种。以这些小分子中的一种处理后染色细胞4至6天。作为溶解在DMSO中的抑制剂的对照，成纤维细胞以等量的不存在抑制剂的DMSO处理。
f.实时PCR分析(RT-PCR)
按照制造商的方案，使用Superscript III或Thermoscript逆转录酶(Invitrogen)合成DNA酶I处理的cDNA。PCR反应使用Quantitech SYBRgreen PCR mix(Qiagen,Valencia,CA)在Roche Lightcycler 3.5(Basel,Switzerland)或Bio-Rad iCycler(Hercules,CA)上一式两份进行。GeNorm软件使用下列参考基因β2-微球蛋白、甘油醛-6-磷酸、肌动蛋白、和/或真核延伸因子1A中的至少两种的相对量计算每个样品的标准化因子(Vandesompele等人，2002)。用于本文所述的各种实验的引物在下面列出。
SEQ ID NO： 引物名称 引物序列(5’至3’)
1 MAP3K4F CCCAGAAACTTGGACTGGAA
2 MAP3K4R CCCAGCGCTAAGAGTAAACG
3 cJun-ex1F CAGGTGGCACAGCTTAAACA
4 cJun-ex1R TGAGTTGGCACCCACTGTTA
5 PGClαF AGCTGCTGAAGAGGCAAGAG
6 PGClαR CTCCAGGAAAAGCAAAGCTG
7 PGClβ-ex12F TGAAGCCATGGATTTTGACA
8 PGClβ-ex12R TATTGGAAGGGCCTTGTCTG
9 NRF1-ex11F TATCAGACAGCGCAGTCACC
10 NRF1-ex11R CAATGTCACCACCTCCACAG
11 NRF2-ex15F GGCAGCTGGTTTTATTGGAA
12 NRF2-ex 15R ACAGTTTCACGTCCCCACTC
13 TFAM-ex7 GCACAGGAAACCAGTTAGG
14 TFAM-ex7R ATCTGGGTTTTCCAAAGCAA
15 ATF4-ex2F AGATGACCTGGAAACCATGC
16 ATF4-ex2R GTGTCATCCAACGTGGTCAG
17 XBP1-ex6F ACTGCCTGGAGGATAGCAGA
18 XBP1-ex6R ACCTTGGACTGCTGGATGTC
19 BiP-ex8F AATGACCAGAATCGCCTGAC
20 BiP-ex8R CGCTCCTTGAGCTTTTTGTC
21 HSF1F CCGCTCCACAGAGATACACA
22 HSF1R GTCTTGTCCGTCCATCCACT
SEQ ID NO： 引物名称 引物序列(5’至3’)
23 ATF6F GCAGAACCTCAGCCACTTTC
24 ATF6R ACCGAGGAGACGAGACTGAA
25 HSP90AA1F GGCAGAGGCTGATAAGAACG
26 HSP90AA1R AGACAGGAGCGCAGTTTCAT
27 HSPA1AF CCGAGAAGGACGAGTTTGAG
28 HSPA1AR CTGGTACAGTCCGCTGATGA
29 DNAJC3F GATATTTTGCCCAGCAGGAA
30 DNAJC3R TTTGTCTCCCGTTTTGGAAC
31 NFE2L2F-intron ACACGGTCCACAGCTCATC
32 NFE2L2R-intron TCTTGCCTCCAAAGTATGTCAA
33 HMOX1-ex5F TCCGATGGGTCCTTACACTC
34 HMOX1-ex5R TAAGGAAGCCAGCCAAGAGA
35 SOD2-ex2F CCCTGGAACCTCACATCAAC
36 SOD2-ex3R CGTTAGGGCTGAGGTTTGTC
37 B-actinF ACGTTGCTATCCAGGCTGTGCTAT
38 B-actinR CGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT
39 EEF1AF TTGCCGCCAGAACACAG
40 EEF1AR ACTTGCCCGAATCTACGTGT
41 B2MF TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT
42 B2MR TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT
43 CHOP*F GGAGCTGGAAGCCTGGTATG
44 CHOP*R GCTCTGGGAGGTGCTTGT
45 Beclin1F(BCN1) CAAGATCCTGGACCGTGTCA
46 Bcclin1R(BCN1) TGGCCATTTCTGTGGACATCA
47 AP5LF-intron TGCAGAAGAAAATGGATTTCG
48 APG5LR-intron ACTGTCCATCTGCAGCCAC
49 FL-SMNF GCGATGATTCTGACATTTGG
50 FL-SMNR AATGAAGCCACAGCTTTATCA
51 Total SMNF ATAATTCCCCCACCACCTC
52 Total SMNR CACCTTCCTTCTTTTTGATTTTGTC
g.蛋白质印迹分析
在哺乳动物蛋白质提取试剂(m-PER；Thermo Scientific,Rockford,IL)加上1x蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)和1x Halt磷酸酶抑制剂(ThermoScientific)中收集细胞裂解物。使用下列抗体进行变性的SDS-PAGE和免疫印迹分析：来自Santa Cruz Biotechnology的磷酸化的JNK和β-肌动蛋白，来自Cell Signaling的HSP70、HSP90、BIP、磷酸化的eIF2a和XBP1，APG8(Abgent,San Diego,CA)，和SOD2(Stressgen,Ann Arbor,MI)。使用Fuji Intelligent Dark box II,FUJI LAS-1000Lite软件和Image Gaugev4.22软件(Tokyo,Japan)进行定量。
h.脂肪酸β-氧化
通过测量其降解1-14C-标记的脂肪酸为水溶性产物的能力测定XALD成纤维细胞中的脂肪酸β-氧化活性，如McGuiness等人，2003中描述的。
i.流式细胞术
在37℃，将K562细胞与50nM Mitotracker Green FM、300nMMitotracker Deep Red 633(Invitrogen)、或作为阴性对照的PBS孵育15min，或使用Caltag Fix和Perm试剂(Invitrogen)按照制造商的说明用抗-Pexl4染色。将染色的细胞悬浮于0.5mL的1％多聚甲醛/PBS中，并经受流式细胞术分析(FACScan machine,Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。
j.血红蛋白的测量
K562细胞被悬浮于1.1mL培养基和240μL的DAF中[工作液50μL2,7二氨基芴(DAF)储液(50μg DAF于5mL 90％冰醋酸中)、50μL30％过氧化氢、及2.5ml 200mM Tris-HCl，pH 7.0]。使用血球计数器对DAF染色的血红蛋白化的细胞(hemoglobinized cell)评分。
k.Mitotracker染色
于37℃在CO2培养箱中，以2.5mM 4PBA、300mM HU、100nM TSA、或2.5mM SFN处理SMA I型(GM00232)成纤维细胞5天，以在预热的MEM培养基中的25nM Mitotracker Red CMXROS(Invitrogen)活染(live stain)15min。染色的细胞用预热的MEM洗涤，用PBS洗涤并去除过量的PBS。在显微镜以X80检查细胞。
l.SIRT1活性测定
基于荧光的SIRT1活性测定按照制造商的方案一式三份进行(10010401；Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI,USA)。每个小分子的百分比显影剂干扰都低于3％。每小分子的百分比荧光团干扰都低于9％。可接受的干扰值为≤10％。
m.统计分析
除非另有说明，对每个技术进行三次或多次独立实验，并且计算和绘制平均值的标准误差(SEM)。单尾学生t-检验用于计算p-值。P-值≤0.05被认为显著。
ii)应激蛋白酶体的激活
许多小分子作为一系列孟德尔遗传性疾患和复杂的遗传性疾患的潜在治疗剂被研究。针对小分子的筛选通常靶向与特定疾患相关的或涉及特定疾患的特定的细胞途径。然而，具有不同的已知作用机制包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)和那些不抑制组蛋白脱乙酰酶的小分子的多种小分子，在各种各样的异质性疾病模型中产生相似的有利结果，其中不同的蛋白质种类、不同的细胞类型和不同的分子途径受到影响(表1)。
表1.各种疾病模型中多样化小分子的相似的治疗反应。
I类和II类的HDACi，4-苯基丁酸酯/盐(4PBA)和曲古抑菌素A(TSA)，已被广泛研究。在某些情况下，HDACi治疗的有益作用是由于与主要致病基因相关的基因或补偿主要致病基因的基因的表达的增加(Kemp等人，1998；Gardian等人，2005)。
神经系统疾病，X-连锁的肾上腺脑白质营养不良(XALD)的研究表明，HDACi和其它小分子的观察到的治疗重叠是由于普遍性细胞功能的调节，而不是补偿性靶的直接靶向。4PBA和TSA两者的治疗都使人XALD成纤维细胞和ALD(Abcdl-/Y)小鼠模型体内的极长链脂肪酸(VLCFA)的异常高水平(McGuinness等人，2003)得以正常化。4PBA，而不是TSA，增加了ABCD2的表达，ABCD2的功能与有缺陷的过氧化物酶体基因ABCD1的功能重叠(Li等人，2002)。因此，在所有实例中ABCD2的诱导与VLCFA水平的降低不直接相关。然而，XALD成纤维细胞的4PBA治疗还增加了线粒体和过氧化物酶体的生物发生，其是细胞解毒和应激感知所需的细胞器(Kemp等人，1998；McGuinness等人，2003)。通过4PBA治疗诱导过氧化物酶体增殖依赖于过氧化物酶体生物发生因子11-α(PEX11α)(Li等人，2002)。ΡΕΧ11β是组成性的过氧化物酶体丰度必需的，而PEX11α不是。相反，PEX11α响应外部刺激或应激诱导过氧化物酶体增殖(Schrader等人，1998)。因此，监测了通过小分子诱导的普遍化的细胞应激反应()，也被称为适应性细胞存活反应(Kultz 2003)。调节普遍性细胞反应的治疗相关性可解释小分子如何能够引发在一系列疾病中观察到的各种作用(例如，表1，其中可改善的疾病(amenable disease)在细胞水平上展示轻微缺陷，无论临床表型的严重程度)。
细胞应激反应，其从古生菌至真核生物为保守的，通过使细胞适应其环境保护免受损伤并促进生存能力(Kultz 2003)。该反应调节分子伴侣和以下蛋白质的活性：(i)影响还原-氧化调节的蛋白质、(ii)感知和修复DNA损伤的蛋白质、(iii)参与蛋白质降解的蛋白质、及(iv)参与脂肪酸、脂质和能量代谢的蛋白质。这些适应性存活途径的刺激针对各种应激源重新调整细胞，并且通过诱导热休克反应(HSR)、解折叠蛋白反应(UPR)、自噬反应、抗氧化反应、以及线粒体和过氧化物酶体生物发生恢复细胞内稳态。UPR和自噬的激活、应激反应的proteostatic组分、和线粒体能量学的调节可以缓解神经退行性疾病和衰老性疾患的症状，并延长模式生物体的寿命(Ong等人，2010；Powers等人，2009；Durieux等人，2011)。本实验表明，应激蛋白质组的联合激活和随后的内稳态的重建对宽广范围的疾病是有益的(表1)。
评价了具有重叠的治疗益处但具有不同的已知功能的4种小分子(见表1)，对诱导适应性细胞存活反应的潜力。以下这些小分子的主要的已知作用模式列于表2：4PBA、TSA、羟基脲(HU)、和莱菔硫烷(SFN)。这些研究表明，以最低限度影响细胞增殖的浓度，这4种药物增加了正常的和XALD人成纤维细胞二者以及人K562红白血病细胞中的线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖。这4种药物小分子诱导组成细胞保护性应激蛋白质组的主要途径。因此，这些药物小分子或剂的治疗效果是由于适应性细胞存活反应的刺激和细胞内稳态的重建。这些共同的细胞反应的鉴定允许筛选更多临床有效的分子，将目前可治疗的疾病库扩展至包括那些具有未知的遗传病因的疾病，并缩短了一些疾病的治疗时间。
表2.小分子和作用模式
小分子 已知作用模式 临床使用
4-苯基丁酸酯/盐 组蛋白脱乙酰酶抑制剂 是，口服
曲古抑菌素A 组蛋白脱乙酰酶抑制剂 否
羟基脲 核糖核苷酸还原酶抑制剂 是，口服
莱菔硫烷 II期解毒酶诱导物 是，临床试验(口服)
a.线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖的小分子诱导
对来自健康个体、XALD患者、及患有过氧化物酶体生物发生疾患的患者的成纤维细胞的4PBA处理使线粒体质量(mass)和过氧化物酶体增殖增加了2-至3-倍(Kemp等人，1998；McGuinness等人，2003；Wei等人，2000)。其它小分子，包括HU、TSA、和SFN，表现出与4PBA的治疗重叠(表1)。为了拓宽线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖的小分子诱导的检查，将正常人成纤维细胞用4PBA、HU、TSA、或SFN处理4到5天。滴定药物浓度以允许100％的生存力和最低限度地影响细胞增殖。线粒体生物发生和过氧化物酶体的生物发生两者被监测。线粒体膜蛋白ATP合酶β亚基(ATP5B)和70kD过氧化物酶体膜蛋白(ABCD3)的免疫荧光染色显示，线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖分别通过4种小分子或剂的药物诱导的增加(图1A)。图1A显示线粒体膜蛋白ATP5B(上)和过氧化物酶体膜蛋白ABCD3(下)的免疫荧光染色。正常人成纤维细胞以每种药物处理4到5天。(400x放大倍数)。这鉴定了线粒体生物发生和过氧化物酶体增殖作为对用这些小分子治疗的共同细胞反应。
b.4PBA在XALD细胞中的有益作用需要增加的线粒体功能
4PBA诱导的过氧化物酶体VLCFAβ-氧化(降解)依赖于线粒体长链脂肪酸(LCFA)β-氧化(McGuinness等人，2003)。为了确定4PBA诱导的过氧化物酶体VLCFAβ-氧化是否依赖于线粒体功能，以抗霉素A(AA)化学抑制线粒体功能。抗霉素A(AA)是细胞色素c还原酶抑制剂，其抑制线粒体电子传递链、线粒体生物发生，并因此，抑制细胞呼吸(Ranganathan等人，2009)。被滴定以最低限度地影响LCFA和VLCFAβ-氧化的基础水平的AA的浓度，没有表现出任何可观察的细胞毒性，且没有影响细胞增殖。用4PBA处理XALD成纤维细胞(1)诱导LCFA和VLCFAβ-氧化(图1B)和(2)增加了二氧化碳释放(Heinzer等人，2003)。图1B显示了VLCFA分析。在存在或不存在细胞色素c还原酶抑制剂抗霉素A(AA)的情况下用4PBA处理XALD成纤维细胞5天，并测量LCFA(C16:0)的β-氧化水平和VLCFA(C24:0)水平。然而，在AA的存在下，4PBA诱导的线粒体LCFAβ-氧化被抑制。该抑制伴随地阻断过氧化物酶体VLCFAβ-氧化的诱导。因此，通过4PBA处理的过氧化物酶体VLCFA水平的药理学减少不仅依赖于线粒体LCFAβ-氧化，而且更通常地依赖于增加的线粒体能量产生。
c.丁酸钠和羟基脲在B-血红蛋白病模型中的有益作用需要诱导线粒体生物发生
β-血红蛋白病诸如镰状细胞病(SCD)和β-地中海贫血的临床严重程度，通过增加含HbF的细胞(F-细胞)的数目被改善。含HbF的细胞数目的增加提高了总HbF水平(Perrine 2008)。在以下一些情况中丁酸钠(SB，4PBA的类似物)和HU增加HbF水平：在SCD和β-地中海贫血患者中、在K562细胞中、及在源自CD34+的造血干细胞中(Keefer等人，2006)。为了进一步评价在与神经系统疾病XALD不相关的疾病模型中线粒体和过氧化物酶体生物发生的诱导的药理学共性，在K562细胞中检查了这些反应。K562细胞是产生HbF并通常被用作诱导F-细胞产生的模型的红白血病细胞系。
K562细胞以SB和HU处理4到10天。流式细胞术分析表明，SB和HU两者均显著增加线粒体质量、产生HbF细胞的数目、和过氧化物酶体增殖(图1C、1D和1E)。图1C、1D和1E显示来自以SB、HU处理K562细胞，或以PBS处理K562细胞作为对照(CON)的结果。(N≥3，除非另有说明)。
为了确定通过SB或HU处理诱导线粒体生物发生是否是诱导产生HbF的细胞产生必要的，在存在或不存在AA的情况下以SB或HU处理K562细胞。被再次滴定以最低限度地影响产生HbF细胞的基础水平的AA浓度，没有表现出任何可观察的细胞毒性，并且没有影响细胞增殖。通过SB或HU处理诱导线粒体生物发生和诱导产生HbF的细胞被AA显著抑制(图1C-1D)。图1C显示了线粒体质量的流式细胞术分析。使用或不使用AA的药物处理2至4天后，使用线粒体染料(stain)Mitotracker测量线粒体质量。显示了倍数变化(药物处理/对照)。图1D显示了产生HbF的细胞产生的分析。使用或不使用AA的药物处理4天后，细胞用DAF染色。产生HbF的细胞(DAF染色的细胞)的相对数目被绘图。图1E显示了过氧化物酶体增殖的流式细胞术分析。药物处理8至10天后，用针对过氧化物酶体膜蛋白PEX14的抗体和FITC标记的二抗测量过氧化物酶体增殖。显示了倍数变化(药物处理/对照)。在图1C、1D和1E中，*表示药物处理的和对照样品之间的测量的统计学显著的增加，或药物处理和在AA的存在下药物处理的样品之间的测量的统计学显著的降低(p≤0.05)(条＝SEM)。该发现结果表明有益作用(即提高的HbF水平)依赖诱导的线粒体生物发生。因此，在SCD中观察到的治疗作用可能涉及通过SB或HU药理诱导线粒体生物发生。
d.线粒体生物发生的药理诱导依赖于JNK途径
线粒体生物发生被激活转录因子过氧化物酶体增殖物激活的受体γ共激活因子-1α和β(分别为PGC1和PGC1β)的多种信号传导途径刺激(Lee等人，2005)。为了确定通过这些小分子诱导线粒体生物发生是否需要共同的激酶级联或内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的激活，用(i)每种诱导药物及(ii)eNOS抑制剂或多种特异性激酶抑制剂处理XALD成纤维细胞(表3)。
表3.测试的激酶和内皮型一氧化氮合酶抑制剂。
4PBA、HU、TSA、和SFN增加XALD成纤维细胞中的线粒体生物发生(图2A，顶行)。途径包括p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外信号调节激酶、MAPK激酶1和2、一磷酸腺苷激酶、蛋白激酶C、磷酸肌醇-3-激酶、和eNOS途径的抑制，对药物诱导的线粒体生物发生没有影响。通过在处理的XALD中的免疫荧光染色和通过在正常人成纤维细胞中的定量细胞内蛋白质印迹分析(quantitative in-cell westernanalyse)表明，仅另外被称为c-jun N-末端激酶(JNK)途径的应激活化蛋白激酶(SAPK)途径的SP600125-抑制(Bennett等人，2001)具有降低的线粒体生物发生的药理诱导。(图2A-B)。在图2A-B中，使用了JNK抑制剂SP600125(10μΜ+inh)。图2A显示了线粒体膜蛋白ATP5B的免疫荧光染色。XALD成纤维细胞在具有或不具有SP600125的情况下以每种药物处理4天(400x放大倍数)。图2B显示了线粒体生物发生的药理诱导的定量。正常人成纤维细胞在具有或不具有SP600125的情况下以4种小分子的每一种处理6天。使用抗-ATP5B进行定量细胞内蛋白质印迹分析。
如通过ATP5B染色的增加所示的，单独的4PBA、HU、TSA、或SFN处理显著增加线粒体质量。在正常人成纤维细胞中，当与未处理的细胞相比时，以4PBA处理的线粒体质量显著增加2.4倍、以HU处理增加1.8倍、以TSA处理增加2.5倍、及以SFN处理增加2.2倍。以每种药物和JNK抑制剂处理的细胞的线粒体质量与未处理的细胞的线粒体质量没有显著不同。
在K562细胞中，JNK抑制剂SP600125(Bennett等人，2001)还阻断HU-诱导的线粒体生物发生，且因此阻断产生HbF的细胞的产生(图2C-D)。图2C-D显示了线粒体生物发生和含HbF的细胞的产生的抑制。K562细胞在存在或不存在SP600125的情况下用HU处理了4天，或用PBS处理作为对照(CON)。图2C显示了线粒体质量(如图1C中所绘制的)，且图2D显示了产生HbF的细胞的相对数目分别通过以Mitotracker和DAF染色被确定(n＝2)。在完全有活性的造血干细胞中，HU刺激的F-细胞的产生类似地依赖于JNK途径。JNK途径由外部应激源和刺激源诸如热休克、渗透休克、和紫外线辐照激活(Yang等人，2003)。因此，这些数据表明，相同的细胞保护性途径参与通过4PBA、HU、TSA、和SFN处理的线粒体生物发生的药理诱导。
JNK途径的激活导致转录因子JUN经由磷酸化的激活。PGC1α和PGC1β维持线粒体的基础水平。PGClα还诱导生理应激诸如适应性产热、耐力运动、或禁食期间的线粒体生物发生(Kultz 2005)。以4PBA、HU、或TSA处理6小时后，JUN转录本水平显著增加。以4种小分子的每一种处理48小时或更长时间后，PGC1α和PGC1β转录本水平显著增加(图2E)。SFN处理后，JUN转录本水平没有一致地变化。图2E显示了通过RT-PCR的JUN和线粒体转录因子PGC1α和PGC1β的mRNA表达。相比未处理的正常人成纤维细胞，计算了每个处理的相对基因表达，并示出了倍数变化(药物处理/未处理)。SFN处理后的PGC1α和PGC1β水平的测量一式两份地进行两次。
然而，以每种药物包括SFN处理24小时内，JNK磷酸化增加(图2F)。因此，JNK途径被激活，并且在4PBA、HU、TSA、或SFN处理之后，线粒体转录因子的丰度增加。图2F显示了JNK磷酸化(46kDa)的免疫印迹分析。正常人成纤维细胞在不同时间点被处理。处理在收集之前指定的时间开始。三次或多次独立实验的最大蛋白质表达的平均值(24小时内)显示为倍数变化(药物处理/未处理)。肌动蛋白(43kDa)为上样对照。M表示标志物泳道(对于4PBA和TSA处理的样品为0.05≤p≤0.10)。*表示药物处理和未处理或对照样品之间测量的统计学显著增加，或药物处理和在存在SP600125的情况下的药物处理的样品之间测量的统计学显著降低(P≤0.05)(除非另有说明，n≥3次独立实验)(条＝SEM)。
e.适应性细胞存活反应的小分子激活
在三种不同的细胞类型(正常人成纤维细胞、XALD成纤维细胞、及K562细胞)中，应激激活的JNK途径的抑制阻断了线粒体生物发生的小分子诱导。线粒体生物发生是XALD细胞中VLCFA的减少和K562细胞中HbF水平的增加的必要反应。线粒体参与针对应激的细胞适应，表明对这些药物小分子或剂的共同细胞反应可能是应激蛋白质组的刺激。HSR、UPR、自噬反应、和抗氧化反应的关键组分的表达在转录、翻译、和/或翻译后水平上被监测。这些反应已知响应多种细胞应激源被瞬时激活。每个组分的诱导程度可取决于细胞的代谢状态(例如，汇合、细胞传代次数)而不同(Kultz 2003；Lallemand等人,1998；Westerheide等人,2009)。由于这些反应的瞬时性质，每个途径的一些组分在24小时处理内的不同时间点被监测。至少两种正常人成纤维细胞系在三次或多次独立实验中被测试。处理2小时、6小时、或18小时后，mRNA表达的增加发生。还将24小时的时间范围内蛋白质表达的最大增加的平均值与未处理的样品比较。每种途径的激活通过每种途径的一种或多种组分的增加被评价。
f.热休克反应的小分子激活
HSR的诱导是适应性细胞存活反应的标志(Fedoroff 2006)。为了评价其激活，监测了热休克蛋白(HSP)40、HSP 70、和HSP 90家族成员的表达。4PBA、TSA、或SFN增加了HSP 70kDa蛋白质1A(HSPA1A)的转录。所有4种小分子或剂都增加了DNAJ HSP40同源亚家族C成员3(DNAJC3)的转录和HSP 90kDa A类成员1(class A member 1)(HSP90AA1；图3A)的转录。图3A显示了HSR基因的mRNA表达的RT-PCR分析。处理了正常人成纤维细胞并测量HSPA1A(HSP70)、DNAJC3(HSP40)、和HSP90AA1(HSP90)的mRNA表达，并绘于图2E中。SFN DNAJC3测量的P值是0.10。在检查的时间点，HSPA1A转录本表达不受HU处理刺激。
然而，所有4种小分子或剂显著增加了总HSP70和HSP90蛋白质水平(图3B)。HSR mRNA和蛋白表达的药理诱导与温和的热休克引起的相似(Clark等人，2009)。因此，HSR被4PBA、HU、TSA、或SFN处理激活。图3B显示了HSP表达的免疫印迹分析。正常人成纤维细胞在24小时内的不同时间点被处理，并且HSP70(70kDa)和HSP90(90kDa)的最大蛋白质表达的平均值绘于图2F中。肌动蛋白(43kDa)被用作上样对照。(UT＝未处理的细胞；*统计学显著(p≤0.05)；条＝n≥3次独立实验的SEM)。
g.解折叠蛋白反应的小分子激活
评价的UPR标志物包括中心UPR调节因子葡萄糖调节蛋白78(BIP)，及三种ER跨膜受体激活之后被刺激的其它组分：PKR-样ER激酶(PERK)、需肌醇酶1(IRE1)、及激活转录因子6(Fedoroff 2006)。延伸起始因子2α(eIF2α)通过PERK磷酸化，减弱了总体翻译，并诱导激活转录因子4(ATF4)。CHOP促进PERK的再激活。XBP1mRNA当UPR激活时通过IRE1的核酸内切酶活性被非常规地剪接。以4PBA、HU、TSA、或SFN处理后，BIP表达在转录和翻译水平上显著增加(图4A-4B)。以这些小分子的处理还增加了ATF4和CHOP mRNA的表达(图4A)、适度地增加了eIF2α的磷酸化(图4B)、并增加了XBP1蛋白质的总量和剪接的XBP1蛋白质的量(图4C)。
图4A显示了UPR基因的mRNA表达的RT-PCR分析。正常人成纤维细胞以如所示的药物处理。测量了UPR基因ATF4、CHOP、和BIP的表达，如图2E中描述的。图4B显示了UPR蛋白质表达的免疫印迹分析。正常人成纤维细胞在不同时间点被处理，并且BIP(78kDa)和磷酸化的eIF2α(38kDa)的最大蛋白质表达的平均值绘于图2F中。肌动蛋白(43kDa)被用作上样对照，并且是与图2F相同的印迹。UT表示未处理的细胞。M表示标志物泳道。图4C显示了XBPl剪接。正常人成纤维细胞被处理。XBP1的未剪接的形式(XBPl-us；33kDa)和激活的和剪接的形式(XBPl-s；54kDa)的表达通过免疫印迹来分析。由于导致较大羧基末端结构域的不规范的mRNA剪接，BP1-s是比XBP1-us大的蛋白质。对于每个处理，XBP1-s与XBP1-us的百分比(percentage of XBP1-sto XBP1-us)增加，如显示的(24小时时间点)。XBP1-s的最大表达的平均值(24小时内)绘于图2F中。肌动蛋白用作上样对照。(TSA处理的值的P＝0.08；*统计学显著(p≤0.05)；条＝n≥3次独立实验的SEM)。
因此，所有三个UPR分支的促存活能力通过这些小分子的处理在转录、转录后、翻译、和翻译后水平上被激活。
h.自噬的小分子激活
不利的生长条件增加了细胞的能量需求，其继而刺激自噬的分解代谢过程，以促进将受损的和多余的蛋白质和受损的细胞器用于细胞营养(Martinet等人，2009)。为了监测自噬的激活，检查了三个典型的自噬标志物的表达。三个典型的自噬标志物是：(i)beclin-1(BCN1)、(ii)自噬蛋白5(ATG5)、以及(iii)微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)。自噬体形成通过BCN1经由JNK1的磷酸化信号传导，并依赖于ATG5和ATG12的缀合和APG8的裂解(LC3-I)和磷脂酰乙醇胺脂化(LC3-II)。以4PBA、TSA、或SFN的处理增加了BCN1和ATG5mRNA水平(图5A)。图5A显示了自噬基因的mRNA表达的RT-PCR分析。如指示的处理正常人成纤维细胞。测量了BCN1和ATG5的表达，如在图2E中描述的。TSA处理后，在两次独立实验中一式两份地测量ATG5mRNA水平。ATG5HU处理的样品的p值是0.10。BCN1HU和SFN样品的p值分别为0.23和0.06。
HU处理后，ATG5mRNA水平也增加了，但BCN1mRNA水平在处理的6小时内无可重现变化。以这些小分子的每一种的处理，都显著增加了LC3-II与LC3-I的比例，一种自噬激活的标志(图5B)。图5B显示了自噬蛋白APG8的裂解和脂化的免疫印迹分析。正常人成纤维细胞被处理4小时-24小时，且APG8的裂解和脂化形式APG8LC-II(13kDa)与APG8LC3-I(17kDa)的最大比例的平均值绘于图2F中。显示了24小时的时间点。肌动蛋白(43kDa)被用作上样对照。UT表示未处理的细胞。因此，以4种小分子的每一种的处理激活了自噬途径。
i.抗氧化反应的小分子激活
抗氧化反应通过中和活性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)的作用使细胞解毒并调节还原-氧化(氧化还原反应(redox))内稳态。ROS和RNS是适应性细胞存活反应的第二信使(Fedoroff 2006)。检查了三个关键组分的表达—(i)核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、(ii)血红素加氧酶1(HMOX1)、和(iii)超氧化物歧化酶2(SOD2)。结合抗氧化反应元件的转录因子NFE2L2，参与了由SFN提供的化学保护性反应(Myzak等人，2004)。在以4PBA、HU、TSA或SFN的处理后，NFE2L2和SOD2的mRNA水平增加(图5C)。图5C显示了抗氧化基因的mRNA表达的RT-PCR分析。处理正常人成纤维细胞18小时。测量了NFE2L2、HMOX1和SOD2的表达，如在图2E中描述的。NFE2L2HU测量的p值为0.11。
以HU、TSA、或SFN的处理显著增加了HMOX1mRNA水平，且以4PBA的处理显著降低了HMOX1mRNA水平。SOD2蛋白质水平也显著增加(图5D)。图5D显示了SOD2蛋白质表达的免疫印迹分析。处理正常人成纤维细胞2到5天。相比UT细胞，将每个处理的SOD2(26kDa)的相对表达绘于图2F中。肌动蛋白(43kDa)被用作上样对照。(*统计学显著(p≤0.05)；除非另有说明，条＝n≥3次独立实验的SEM)。因此，通过这些小分子的每一种的处理在转录和翻译水平诱导了细胞抗氧化防御机制。
j.HU和SFN不抑制I类和II类HDAC
这些小分子激活应激蛋白质组并在不同的疾病模型中共享相似的细胞反应。两种小分子，4PBA和TSA，直接在体外抑制组蛋白脱乙酰酶活性(Jung 2001)。是否抑制I类和II类HDAC活性是共享的生化功能，其可以解释检查的所有4种小分子的作用。使用来自HeLa细胞和原代人成纤维细胞的裂解物，进行HDAC活性的体外比色测定。使用每种小分子的两个浓度。第一浓度是用于处理本文报道的实验中的原代人成纤维细胞，其最低限度影响生长。第二浓度是第一浓度的10倍，并且在细胞培养物中是致死的。当相比未处理的HeLa细胞和人成纤维细胞裂解物时，4PBA和TSA显著降低HDAC活性(图6A-B)。然而，HU及SFN的浓度均未降低裂解物中I类或II类HDAC活性。在图6中，使用来自如所示的两种细胞系的提取物测量HDAC活性。(*P≤0.00009；配对t检验；条＝n≥3次独立实验的SEM)。
证明了SFN处理整个细胞后组蛋白乙酰化的生理增加，其可反映基因表达的变化而不是通过SFN直接生化抑制HDAC酶活性的结果[Myzak等人，2004]。尽管HDAC活性通过4PBA或TSA处理的抑制可诱导应激蛋白质组，HU和SFN诱导了独立于直接HDAC抑制的应激蛋白质组。
k.SFN在脊髓性肌萎缩细胞中的有益作用依赖于JNK途径、自噬、线粒体生物发生和SIRT1活性
为了确定药物诱导的应激途径中的哪些对这些小分子的治疗作用是必要的，检查了它们在脊髓性肌萎缩成纤维细胞中的作用。百分之九十五的脊髓性肌萎缩患者具有端粒SMN1(chr5q13)基因的纯合性缺失，或在外显子7或8处的基因转换(gene conversion)(Lefebvre等人,1995)。然而，患者具有着丝粒SMN1假基因SMN2的一个或多个拷贝。与SMN1相比，SMN2具有外显子剪接增强子内的C至T的转换，其导致外显子7(SMND7)的跳跃和被降解的不稳定蛋白(Sumner等人,2003；Lorson等人,1998)。只有15-30％的SMN2转录本包括外显子7并且是全长(FL-SMN)。由于脊髓性肌萎缩患者的临床严重程度与FL-SMN转录本和SMN蛋白质的水平呈负相关，增加FL-SMN与SMN蛋白质产生的治疗策略提供了希望。
如果这3种小分子和SFN共享共同的治疗机理，SFN处理也应增加FL-SMN mRNA和SMN蛋白质表达。为了确定以这4种小分子处理的共同作用是否是诱导应激蛋白质组，以下被检查：(i)通过这4种小分子诱导脊髓性肌萎缩成纤维细胞中的线粒体生物发生、(ii)SFN处理对脊髓性肌萎缩中FL-SMN mRNA和SMN蛋白质的表达的作用、和(iii)多种应激途径的抑制剂阻断FL-SMN mRNA和SMN蛋白质表达的诱导的能力。
类似于X-连锁的肾上腺脑白质营养不良成纤维细胞、K562细胞和正常人成纤维细胞的处理，以4种小分子的每一种处理脊髓性肌萎缩成纤维细胞增加了线粒体生物发生，如通过细胞渗透的线粒体选择性染料Mitotracker染色监测的(图7)。图7显示了脊髓性肌萎缩成纤维细胞中的线粒体生物发生被4PBA、HU、TSA或SFN处理诱导。使用MitotrackerRed CMXROS针对线粒体免疫荧光染色。脊髓性肌萎缩成纤维细胞以2.5mM 4PBA、300mM HU、100nM TSA或2.5mM的SFN处理5天(x80放大倍数)。
相比总SMN转录(FL-SMN加SMND7)，SFN处理显著增加了两种脊髓性肌萎缩I型细胞系(GM09677两拷贝SMN2和GM00232一拷贝SMN2)和一种脊髓性肌萎缩III型细胞系(96-2906四拷贝SMN2；图8A)中的FL-SMN mRNA的表达(Sumner等人，2003)。具有较大数目的SMN2基因拷贝的细胞系更好地响应处理。
图8显示了通过SFN诱导FL-SMN mRNA的表达及SMN蛋白质的表达依赖于JNK途径、自噬、线粒体生物发生和SIRT1活性。例如，图8A显示了相比总SMN转录本的表达，FL-SMN mRNA的表达的RT-PCR分析。I型和III型脊髓性肌萎缩(SMA I或SMA III)成纤维细胞用SFN处理指定的时间。相比未处理的细胞系(标准化为1)FL-SMN/总SMN转录本的比的相对倍数增加被绘图。细胞系从左至右为GM09677、GM00232和2906。N≥2次独立实验。
图8B显示了FL-SMN和总SMN mRNA的表达的RT-PCR分析。脊髓性肌萎缩成纤维细胞在具有或没有12.5mM SP600125(JNK抑制剂)、2.5mM 3-甲基腺嘌呤(自噬抑制剂，APG)、5mg/ml抗霉素A(线粒体抑制剂，MITO)或3mM sirtinol(SIRT1抑制剂)的情况下，以单独的1.5mM SFN处理51小时(SMA I，GM09677)或以0.5mM SFN处理8小时(SMA III，2906)。SFN处理后，相比GAPDH或总SMN表达，FL-SMN表达的倍数增加，以及相比GAPDH表达，总SMN表达的倍数增加被绘图。将未处理的值标准化为1并由水平线表示。(每个细胞系n＝1，一式两份进行)
图8C显示了SMN蛋白质表达的免疫印迹分析。脊髓性肌萎缩I型(SMA I；GM09677，n＝7)或III型(SMA III；2906，n＝2)成纤维细胞分别以1.5mM SFN或0.5-2mM SFN处理48-72小时。SMN蛋白质(39kDa)的相对表达的平均值被绘图。肌动蛋白(43kDa)被用作上样对照。
图8D显示了应激途径抑制剂对SMN蛋白质表达的作用的总结。脊髓性肌萎缩I型(SMA I；GM09677)成纤维细胞在存在或不存在10mMSP600125(JNK抑制剂)、1mM 3-甲基腺嘌呤(APG抑制剂)、2-4mg/ml抗霉素A(MITO抑制剂)或2mM sirtinol(SIRT1抑制剂)的情况下，以300mM HU(n＝1)或1.5mM SFN(n≥3)处理48h。使用肌动蛋白作为上样对照，通过定量免疫印迹分析测量SMN蛋白质表达。SMN蛋白质表达中的倍数增加被绘图，并用数值表示在图下方的表中。未处理的值被标准化为1(*P≤0.05；条＝SEM)。
SFN处理后，当标准化至GAPDH转录本水平或总SMN转录本水平时，FL-SMN转录本的相对表达增加(图8B)。然而，当处理后标准化为GAPDH转录本水平时，总SMN转录本水平保持不变。因此，SFN处理通过增强外显子7的包括而不是增加从SMN2基因的整体转录表达，增加FL-SMN转录本的量。
在X-连锁的肾上腺脑白质营养不良成纤维细胞中，4PBA造成的极长链脂肪酸水平的减少依赖于线粒体生物发生的诱导，且在K562细胞中，通过HU诱导的HbF产生依赖于JNK途径与线粒体功能(图1B和1D和图2D)。为了确定哪些应激途径对FL-SMN产生的增加是必需的，将脊髓性肌萎缩成纤维细胞用SFN与JNK途径抑制剂SP600125(Bennett等人，2001)、自噬途径抑制剂3-甲基腺嘌呤(Seglen等人，1982)、线粒体抑制剂抗霉素A(Ranganathan等人，2009)、或SIRT1活性抑制剂sirtinol(Grozinger等人，2001)共处理。每一种抑制剂的浓度都未影响细胞生长或生存力。SIRT1，NAD+-依赖的脱乙酰酶，已知调节细胞应激反应、细胞代谢和细胞存活(Salminen等人，2009)。特别地，SIRT1抑制降低HSR基因的诱导(Westerheide等人，2009)；SIRT1活性增强SOD2表达(Anastasiou等人，2006)；SIRT1负调控雷帕霉素引发自噬的哺乳动物靶(Haigis等人，2010)；且SIRT1通过应激反应转录因子PGC1a激活线粒体生物发生(Yu等人，2009)。酵母直向同源物Sir2对通过4PBA或HU诱导酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的线粒体生物发生是必需的(Cha 2010)。以4PBA、HU、TSA或SFN处理正常人成纤维细胞后SIRT1蛋白质表达无明显变化。然而，SIRT1可通过多种翻译后改变被激活。因此，通过抑制研究评价了SIRT1在这些药物的治疗作用中的潜在参与。生化阻断JΝΚ途径、自噬途径、线粒体生物发生的诱导和SIRT1活性阻止了SFN处理的脊髓性肌萎缩成纤维细胞中FL-SMN转录本水平的增加，显示这些途径的每一个对SFN处理的治疗反应的必要性和潜在一致作用(图8B)。
为了进一步证明，这些不同的应激途径的诱导对研究中的小分子的治疗作用是必需的，在存在或不存在应激途径抑制剂的情况下的SFN或HU处理后，总SMN蛋白质表达的表达被监测。处理48-72小时后，SFN增加了脊髓性肌萎缩I型成纤维细胞中SMN蛋白质表达1.57倍，且增加了脊髓性肌萎缩III型成纤维细胞中SMN蛋白质表达1.64倍(图8C)。在分开的实验中，HU或SFN处理分别增加SMN蛋白质表达1.4和1.46倍(图8D)。SMN蛋白质表达中药理学诱导的增加被多种应激途径抑制剂显著降低，表明了通过HU和SFN两者增加SMN蛋白质表达依赖于JNK途径、自噬、线粒体生物发生和SIRT1的激活(图8D)。在使用的浓度下，应激途径抑制剂对SMN蛋白质表达的基础水平没有影响。与未处理的细胞相比，SFN处理的脊髓性肌萎缩细胞中FL-SMN表达和SMN蛋白质表达的增加的幅度，与4PBA、HU或TSA处理后在SMA成纤维细胞中观察到的相似(Andreassi等人，2004；Grzeschik等人，2005；Avila等人，2007)。由于SFN诱导FL-SMN转录本表达和SMN蛋白质表达依赖于JNK途径、自噬途径、线粒体生物发生和SIRT1，应激蛋白质组的激活的治疗潜力可能需要各种应激途径中的每一种的一致作用。
l.SIRT1激活不是4PBA、HU、TSA和SFN作用的共同机制
为了确定SIRT1激活是否是所研究的小分子的共同生化活性，以每种药物两种浓度进行了基于荧光的体外SIRT1活性测定：用于处理此处报道的实验中的正常原代人成纤维细胞的浓度(低)，和该浓度10倍的浓度，其在细胞培养物中是致死的(高)。HU和TSA对SIRT1活性无影响，而4PBA(50mM；高)和SFN(5和50mM)分别显著抑制SIRT1活性54％、14％和40％(图9)。这是基于非细胞的测定，并因此，难以确定4PBA和SFN对体内SIRT1活性的影响。无论如何，尽管SIRT1激活可在细胞应激反应的诱导中起作用(Anastasiou等人，2006)，SIRT1的直接生化激活或抑制对通过所有4种小分子的适应性细胞存活反应的共同药理诱导不是必要的。
图9显示了生化SIRT1激活对通过4PBA、HU、TSA和SFN诱导应激蛋白质组不是必需的。SIRT1活性测定。SIRT1活性通过将乙酰化的赖氨酸底物与人重组SIRT1、协同底物NAD+和指示浓度的每种小分子一起孵育被测量。将SIRT1的抑制百分比绘图。(条＝为一式三份测量的SEM；*P≤0.05；配对t-检验)。
总的来说，本文中所呈现的数据表明，不具有已知的重叠分子功能的药物小分子或剂诱导线粒体和过氧化物酶体生物发生和适应性细胞存活反应(HSR、UPR、自噬、和抗氧化反应)的标志性组分的转录和翻译。在不良细胞条件下，线粒体诱导重建内稳态的内源性适应性细胞存活反应(轻度应激)或细胞凋亡(重度应激)(Lee等人，2005)。本文研究的小分子表现出双相或毒物兴奋剂量反应(hormetic dose response)(Calabrese等人，2010)。以本文所用的低剂量，4种小分子激活应激蛋白质组和产生有益作用；且以较高的剂量，4种小分子是细胞毒性的。线粒体生物发生的药理诱导与对增加的细胞应激的代谢适应所需的能量消耗的显著增加是一致的。
本文展示的结果证明XALD细胞和HbF诱导模型K562细胞中的线粒体生物发生的药理诱导的治疗重要性。4PBA处理的XALD成纤维细胞中VLCFA水平的减少，和HU处理的K562细胞中产生HbF的细胞数目的增加，依赖于应激激活的JNK信号传导级联和随后线粒体生物发生的诱导。因为小分子具有不同的已知功能(表2)和不同的化学结构，但引起类似的分子反应，这些数据通常表明，具有不同功能的小分子可激活适应性细胞存活反应并引起类似的治疗反应。
改善疾病病理和独立于改变特定基因突变的有益的治疗作用得到了良好的证明。实例包括TSA治疗杜氏肌营养不良模型、氯沙坦治疗Marfan综合征患者、及4PBA、HU、或TSA治疗脊髓性肌萎缩模型(Lunn等人,2008；Minetti等人,2006；Habashi等人,2006)。此类实例提供了来自间接干预的校正性生物反应的良好阐述。
适应性存活途径的治疗作用已经在一系列疾病中观察到。热休克蛋白的过表达或药理诱导(i)校正溶酶体贮积症Niemann-Pick患者细胞系中的缺陷、(ii)改善脊髓延髓肌肉萎缩症(SBMA)小鼠模型的表型、以及(iii)减少神经系统疾患亨廷顿氏病研究中的蛋白质的聚集(Evans等人，2010)。UPR蛋白质XBP1和ATF6的诱导保护免受缺血再灌注损伤(Toth等人，2007)。自噬的药理诱导或自噬蛋白的过表达保护免受缺血再灌注损伤、改善突变的蛋白质清除、并在减少亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、脊髓小脑性共济失调、和SBMA的细胞和动物模型中的蛋白质毒性(Martinet等人，2009；Madeo等人，2009)。抗氧化和4PBA处理改善了糖尿病小鼠模型中的胰岛素敏感性和葡萄糖稳态(Ozcan等人，2006；Liu等人，2009)。4PBA诱导的线粒体生物发生可有助于使葡萄糖水平正常化，因为线粒体功能障碍是胰岛素耐受性的关键因素。4PBA诱导的SOD2的表达增加了ALS中的神经保护作用(Petri等人，2006)。通过4PBA处理诱导的改善的线粒体膜电位和增加的过氧化物酶体增殖，促进了阿尔茨海默研究中神经元的完整性(Santos等人，2005)。虽然4PBA、HU、TSA、和SFN处理诱导了检查的所有4种适应性存活途径，所有途经的诱导可能不是每一个反应性疾病中的治疗结果必需的。
适应性细胞存活反应的诱导和随后细胞内稳态的重建解释了为什么这些不同的药物小分子或剂在如此多样的疾病模型中产生相似的治疗效果(表1)。响应这些小分子的疾病具有轻度细胞异常，即，细胞是有活力的，即使它们次佳功能可导致严重的临床表现。适应性细胞存活反应的药理增强和随后细胞内稳态的重建有益地改变了疾病相关的代谢应激、促进细胞生存力、并改善一些温和的细胞遗传异常，而不用直接靶向致病基因。例如，SOD1转基因ALS小鼠模型中自噬的增强清除了蛋白质聚集体，并显著增加寿命(Madeo等人，2009)。此外，TSA处理的Abcdl-/-成纤维细胞独立于Abcd1或Abcd2的表达使VLCFA的β-氧化水平得以标准化(McGuiness等人，2003)。这种间接的治疗方法提供了药理调节内源性细胞机制，特别是应激蛋白质组和线粒体功能的适应性能力的优势，以补偿代谢异常并改善细胞功能。这为其具体基因异常是未知的疾病，包括许多复杂疾患的治疗提供了基本原理，并可缩短一些目前非可治疗的疾病的治疗时间。
本文公开的4种小分子可以经由其已知的生化活性、或经由细胞内未表征的分子间相互作用激活应激蛋白质组。例如，在K562细胞中，SB和TSA处理而不是HU处理后ROS的产生增加F-细胞产生(Hsiao等人，2006)。该结果表明，F-细胞的产生受不同途径的刺激。鉴定对于下游目的治疗作用必需的细胞反应，即，线粒体生物发生，可有助于筛选具有最佳临床作用的小分子。
这里研究的小分子通过对疾病结果的作用被鉴定。通过这些小分子建立适应性细胞存活反应的治疗潜力，提供了用于鉴定具有较低毒性的更有效的小分子的靶。先天性细胞存活程序的开发可改善具有轻度细胞表型的一系列疾患中的疾病症状，而不靶向每一种单独的疾病的特定分子或信号传导途径。可改善的疾病，不仅包括具有线粒体或过氧化物酶体缺陷、增加的氧化应激、或蛋白质构象或运输缺陷的疾病，而且包括老化疾患和具有未知遗传病因及轻度细胞表型的复杂疾病。靶向内稳态调节的治疗可对医学具有深刻的影响。
iii)通过莱菔硫烷刺激HSP
莱菔硫烷刺激几种遗传性疾患中的HSP和线粒体生物发生。本文提供的数据表明，莱菔硫烷诱导保护细胞免受轻度代谢紊乱的已知的细胞应激反应途径和热休克蛋白。响应低剂量的莱菔硫烷的应激蛋白质组包括对氧化还原调控、DNA损伤感知和修复、分子伴侣、脂肪酸和脂类代谢以及能量代谢的影响。
莱菔硫烷以及相关的HDAC和非HDAC抑制剂是诱导普遍性“细胞保护性”反应的毒物兴奋药物，如在许多神经系统疾病中证明的。细胞修复作用与报道的在暴露于高剂量的相同药物之后发生的细胞和遗传损伤形成鲜明对比。
莱菔硫烷诱导保护细胞免受轻度代谢紊乱的已知的细胞应激反应途径和热休克蛋白。对低剂量的莱菔硫烷的应激蛋白质组响应包括对氧化还原调节、DNA损伤感知和修复、分子伴侣、脂肪酸和脂类代谢以及能量代谢的作用(Keefer等人，2006)。本文呈现的数据显示了莱菔硫烷对热休克反应的作用。在暴露于5微摩尔(μΜ)莱菔硫烷之后，正常人成纤维细胞中的热休克蛋白基因的mRNA表达显著增加(3-7倍)。受影响的热休克蛋白是：HSP40、USP70、和USP90。
在以单一剂量的莱菔硫烷(90mg/kg)通过管饲法处理之后的3-和12-小时的时间点，诱导了小鼠肝中的热休克蛋白和泛素/26S蛋白酶体亚基(Hu等人，2005)。在HeLa细胞和COS1细胞中，莱菔硫烷增强蛋白酶体的活性。莱菔硫烷还通过激活热休克因子1(HSF1)增加Hsp27的基因表达，热休克因子1(HSF1)是调节热休克蛋白的表达的主要转录因子(Gan等人，2010，其在此通过引入被整体并入本文)。在HeLa细胞中，莱菔硫烷处理引起HSF1从其负调因子Hsp90和Hsp70的解离，随后为该转录因子的核转位。在萤光素酶报告物系统中，莱菔硫烷激活HSF1-介导的报告物的转录，以及内源性HSF1靶基因Hsp70和Hsp27的表达。
通过莱菔硫烷激活HSF1的机制目前尚不清楚。然而，HSF1被亲电体，诸如醌甲基化物雷公藤红素、过氧化氢、甲萘醌、三氧化二砷、15-脱氧-PGJ2、和4-羟基壬烯醛激活。莱菔硫烷直接修饰HSF1的特定半胱氨酸残基，从而改变HSF1与其负调节因子Hsp90和Hsp70的结合和/或转录因子的三聚以及结合DNA的能力是可能的。另一个有趣的可能性是，莱菔硫烷通过其抑制细胞质非组蛋白脱乙酰酶HDAC6的活性的能力并因此增强Hsp90的乙酰化(Gibbs等，2009)，可抑制其与HSF1的缀合。
iv)体外莱菔硫烷研究
如本文所述的，体外研究表明，莱菔硫烷(SF)刺激构成适应性细胞应激反应的代谢途径。相比未处理的细胞，线粒体和过氧化物酶体生物发生增加2-至3-倍。此外，JΝΚ途径被激活且线粒体转录因子的浓度增加2-至4-倍。
热休克反应(HSR)的诱导是适应性细胞存活反应的标志。莱菔硫烷(SF)将HSP70的转录增加7倍，且将HSP40和HSP90两者的转录增加3倍。SF将总HSP70和HSP90蛋白水平增加3到4倍。HSR mRNA和蛋白质表达的药理诱导类似于由轻度热休克造成的。莱菔硫烷处理在转录、转录后、翻译、和翻译后水平上激活所有UPR三个分支的促存活能力。中心UPR调节因子葡萄糖调节蛋白78(BIP)在转录和翻译水平增加2-3倍。SF处理还将ATF4和CHOP mRNA表达增加4-5倍，适度增加了eIF2α磷酸化，并将XBP1蛋白质的总量和剪接的XBP1蛋白质的量增加3-4倍。
SF处理后，检查了3种典型的自噬标志物beclin-1(BCN1)、自噬蛋白5(ATG5)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)的表达。BCN1和ATG5mRNA水平分别增加了5倍和3倍，且自噬激活的标志LC3-II对LC3-I的比例显著增加。在转录和翻译水平上诱导了细胞抗氧化防御机制。还增加了三个关键组分的表达：核因子红细胞2-样2(NFE2L2)为3倍、血红素加氧酶1(HMOX1)为6倍、以及超氧化物歧化酶2(SOD2)为4倍。结合抗氧化反应元件的转录因子NFE2L2，已知参与由莱菔硫烷提供的化学保护性反应。
v)自闭症中发热、细胞应激、和羟基脲的作用
自闭症是临床异质性疾患，其由各种非致命性遗传疾患及影响相关代谢途径的表观遗传效应引起。这些途径中的一些响应细胞应激反应的药理刺激。以其多种形式为基础的遗传和环境因子是激烈研究的焦点。尽管潜在的细胞机制是异质性的且关于毒性和受干扰的内稳态可被认为是边缘的，尤其是这些机制的联合作用，产生严重的临床结果。例如，发生在～38％的患有自闭症的儿童的发热期间的快速起效和短暂的行为改进可通过基因表达、细胞生理学、神经传递、或信号处理中的潜在变化被解释。
此外，数据表明，由于慢性缺氧，镰状细胞病(SCD)可能是婴儿期针对自闭症的发展保护性的(即，SCD与自闭症负相关)。发热和SCD两者可激活应激反应，其通过增强参与内稳态的细胞代谢途径改善细胞存活。应激蛋白质组的诱导涉及维持分子完整性的一些相互联系的途径。
最后，羟基脲(HU)是抗肿瘤剂，其显著改善患有镰状细胞病(SCD)的儿童和成人的生活质量。HU还被报道改善患有SCD的儿童的认知功能。(Puffer等人，2007)。HU已在年龄范围从婴儿到青春期的儿童中被测试毒性，且被FDA批准用于患有SCD的成人。此外，由于增加的胎儿血红蛋白的表达，HU有效地治疗SCD。特别地，其减少中风的发生率、改善认知功能并正经受在患有SCD的婴儿中的临床试验。
HU是核糖核苷酸还原酶和非组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，其穿越血-脑屏障。HU具有毒物兴奋作用：虽然在高剂量时有毒，在低剂量时，HU刺激普遍性细胞应激反应的表达和基因表达(如应激蛋白质组)。本文所示的数据表明，HU诱导保护细胞免受轻度代谢紊乱的已知的细胞应激途径。对低剂量HU的应激蛋白质组响应包括对氧化还原调控、DNA损伤感知和修复、分子伴侣、脂肪酸和脂类代谢以及能量代谢的作用。(Keefer等人，2006)。HU以及相关的HDAC和非HDAC抑制剂是其诱导普遍性“细胞保护性”反应的毒物兴奋药物，如在SCD以及X-连锁的肾上腺脑白质营养不良(ALD)(Wei等人，2000；McGuinness等人，2001)、脆性X综合征、和脊髓性肌萎缩(SMA)(Liang等人，2006)中证明的。细胞修复作用与报道的在暴露于高剂量的相同药物之后发生的细胞和遗传损伤形成鲜明对比。
因此，HU可能补偿自闭症中一些异常的细胞功能，例如，线粒体功能障碍(Weissman等人，2008)、氧化应激(James等人，2009)和神经免疫病理学(Vargas等人，2005)。通过低剂量的HU刺激应激蛋白质组可能会导致患有良好表征的自闭症的青少年和成人中改善的临床功能。
在患有自闭症的青少年和成人中施用羟基脲(HU)在旨在确保安全性和获得有效性数据的研究中被评价。基于其对应激蛋白质组的体外作用并基于在发热期间患有自闭症的人的改善(例如，社交反应)的临床观察结果选择HU。(Curran等人，2007)。
本研究的混合设计包括双掩蔽、安慰剂对照、及随机化以增强早期结果数据的稳健性。实验的目的如下：(1)确定以指定剂量范围内施用的HU的治疗是否安全(即，毒性)；(2)确定以指定剂量范围内施用的HU的治疗是否被自闭症男性青少年和成人良好耐受(即，副作用和不良事件)；(3)确定是否存在关于行为症状的可测量效果的证据；(4)确定是否存在以下的证据：在指定范围内的治疗具有影响自闭症最无能的核心特征，社交反应的可观察活性；及(5)确定建议的机制被关键的细胞标志物支持(即，原理的证明)。
45位男性青少年(13-18岁)和成人(19-30岁)被随机分配以接受HU(n＝30，以2个月递增间隔：10、15和20mg/kg/天)或安慰剂(n＝15)。使用ADI-R、社交反应量表(儿童和成人形式)、临床总体印象量表(CGI)和自闭症行为量表(ABC)评价定量的自闭症特征。在每个剂量递增之前及在研究结束时，进行ADI当前状态算法、SRS、CGI和ABC。以定期的间隔进行医学检查和实验室监测，以观察预想外的毒性迹象，以及安全监测员(safety monitor)应用的停止规则。针对每个受试者使用单独的趋势，数据的统计分析被用于描述研究样品。由于自闭症的药物研究中的安慰剂作用常常是显著的，本研究的治疗持续时间和严格盲法足以克服这种影响。
数据表明，HU和相关药物激活来自多种遗传性疾患诸如脆性X综合征、ALD和SMA、以及SCD的培养物中的细胞修复，所述多种遗传性疾患在病因上以及临床上是多样化的。
vi)羟基脲对自闭症中一氧化氮的作用
自闭症是临床异质性疾患，且以其多种形式为基础的遗传和环境因子是激烈研究的焦点。尽管潜在的细胞机制是异质性的，且关于毒性和受干扰的内稳态可被认为是边缘的，尤其是这些机制的联合作用，产生严重的临床结果。
显著改善患有镰状细胞病(SCD)的儿童和成人的生活质量的抗肿瘤剂羟基脲(HU)，也已被报道改善患有SCD的儿童的认知功能。(Puffer等人，2007)。HU已在年龄范围从婴儿到青春期的儿童中被测试毒性，且被FDA批准用于患有SCD的成人。HU是核糖核苷酸还原酶和非组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，其穿越血-脑屏障。HU具有毒物兴奋作用：虽然在高剂量时有毒，在低剂量时，其刺激普遍性细胞应激反应的表达和基因表达(例如，SCD中胎儿血红蛋白的产生)。
在自闭症中，低表达的基因的增强和一氧化氮(NO)对大脑的可用性两者响应HU处理而发生。HU刺激NO的产生(Lou等人，2009)，并在确保突触可塑性和单突触柱状组织(metasynaptic columnarorganization)中的神经发育中起作用(Gustafsson等人，2004年；Guix等人，2005)。HU通过刺激温和的细胞应激在细胞水平刺激自闭症中发热的作用。
羟基脲是核糖核苷酸还原酶和非组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，其穿越血-脑屏障。HU具有毒物兴奋作用：虽然在高剂量时有毒，在低剂量时，其刺激基因表达(例如，SCD中胎儿血红蛋白的产生)。对低剂量HU的应激蛋白质组响应包括对氧化还原调控、DNA损伤感知和修复、分子伴侣、脂肪酸和脂类代谢以及能量代谢的作用。(Keefer等人，2006)。HU以及相关的HDAC和非HDAC抑制剂是诱导普遍性细胞保护性反应的毒物兴奋药物，如在SCD以及X-连锁的肾上腺脑白质营养不良中证明的(Wei等人，2000；McGuinness等人，2001)。细胞修复作用与报道的在暴露于高剂量的相同药物之后发生的细胞和遗传损伤形成鲜明对比。
评价自闭症中HU的作用以确保安全性和有效性(Piantadosi等人，2005)。混合的研究设计包括双掩蔽、安慰剂对照、及随机化以增强早期结果数据的稳健性。实验的目的如下：(1)以指定的剂量范围内施用的HU治疗是否安全(即，毒性)；(2)以指定的剂量范围内施用的HU治疗是否被自闭症男性青少年和成人良好耐受(即，副作用和不良事件)；(3)是否存在关于行为症状的可测量效果的证据；(4)是否存在以下证据：在指定范围内的治疗具有影响自闭症核心特征，社交反应的可观察活性；及(5)细胞生物标志物的水平是否支持建议的机制(即，原理的证明)。
男性青少年(n＝15，年龄13-18岁)和成人(n＝30，年龄19-30)被随机分配以接受HU(以2个月递增间隔：10、15和30mg/天)或安慰剂。使用ADI-R、社交反应量表(儿童和成人形式)(Constantino等人，2005)、临床总体印象量表(CGI)和自闭症行为量表(ABC)评价定量自闭症特征。在每个剂量递增之前及在研究结束时，进行ADI当前状态算法、SRS、CGI和ABC。以定期的间隔进行医学检查和实验室监测，以观察毒性迹象，以及安全监测员应用的停止规则。针对每个受试者使用单独的趋势，数据的统计分析被用于描述研究样品。由于自闭症的药物研究中的安慰剂作用常常是显著的，本研究的治疗持续时间和严格盲法足以克服这种影响。
通过低剂量的HU刺激应激蛋白质组和增加的NO产生导致患有良好表征的自闭症的青少年和成人中改善的临床功能。HU补偿了自闭症中一些异常细胞功能，例如，线粒体功能障碍(Weissman等人，2008)、氧化应激(James等人，2009)和神经免疫病理学(Vargas等人，2005)。
数据表明，HU和相关的药物激活来自多种罕见的遗传性疾患及SCD的培养物中的细胞修复，所述多种罕见的遗传性疾患及SCD在病因上和临床上是多样化的。
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Claims (15)

1.包括羟基脲的组合物在制备用于治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的药物中的用途。
2.包括羟基脲的组合物在制备用于治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的药物中的用途，
其中所述组合物用于以有效量施用于诊断患有自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的受试者；以及
所述受试者的所述细胞在所述组合物的所述施用之后被允许恢复到基本上等同于施用所述组合物前所述细胞中存在的状态的内稳态。
3.根据权利要求2所述的用途，其中在所述受试者的至少一个细胞中，应激蛋白质组被刺激和/或增加的一氧化氮产生被检测到和/或应激感知细胞器自所述组合物的所述施用之前的量增加。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述应激感知细胞器是线粒体。
5.根据权利要求3所述的用途，其中所述应激感知细胞器是过氧化物酶体。
6.根据权利要求2所述的用途，其中普遍性细胞应激反应包括以下的至少一种：线粒体生物发生、过氧化物酶体增殖、应激蛋白质组的激活、基因和由以下编码的蛋白质的转录和/或翻译：包括热休克和解折叠蛋白质的基因、自噬反应的基因、抗氧化反应的基因、和c-jun-N-末端激酶途径的基因。
7.根据权利要求6所述的用途，其中热休克蛋白质的基因包括热休克蛋白质40、热休克蛋白质70、和/或热休克蛋白质90家族成员；解折叠蛋白质的基因包括葡萄糖调节蛋白78(BIP)、PERK、需肌醇酶1(IRE1)、及激活转录因子6；自噬反应的基因包括beclin-1(BCN1)、自噬蛋白质5(ATG5)和微管相关蛋白1轻链3(LC3或APG8)；且抗氧化反应的基因包括核因子红细胞2-样2(NFE2L2)、血红素加氧酶1(HMOX1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的表达。
8.根据权利要求2所述的用途，其中所述受试者的所述至少一个细胞位于所述受试者的脑中。
9.根据权利要求2所述的用途，其中所述受试者的所述至少一个细胞不是位于所述受试者的脑中。
10.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述组合物包括以下的至少一种：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、I类组蛋白脱乙酰酶抑制剂、或II类组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
11.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述组合物是药物组合物、医疗食品、食品、饮品、或膳食补充剂。
12.一种用于确定化合物在治疗自闭症或一种或多种自闭症相关的疾患中的效力的方法，所述方法包括：
将第一细胞与有效量的测试化合物接触，
比较所述第一细胞的反应与任选地相同的第二细胞的反应，所述第二细胞与羟基脲相接触，以及
确定所述测试化合物是否诱导细胞中的普遍性细胞应激反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞是正常人成纤维细胞、XALD成纤维细胞、或K562细胞。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述接触发生在体外或体内。
15.包括羟基脲的在受试者的至少一个细胞中引起普遍性细胞应激反应的组合物在制备用于治疗自闭症或一种或多种自闭症谱系疾患的药物中的用途。
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