IT201600117469A1 - Metodo di diagnostica rapida per la sindrome di rett - Google Patents
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Description
METODO DI DIAGNOSTICA RAPIDA PER LA SINDROME DI RETT
CAMPO DELL’INVENZIONE
L'invenzione di seguito descritta ha come oggetto un metodo diagnostico rapido e di facile applicabilità da utilizzare per la Sindrome di Rett. Tale metodo si basa sull'identificazione di markers molecolari correlati con l'alterazione del processo di autofagia cellulare (qui per la prima volta descritta nei pazienti con Sindrome di Rett) sia in cellule nucleate che non nucleate (i globuli rossi). Il metodo descritto può essere usato per la diagnosi rapida e precoce della patologia, ad esempio, mediante l'utilizzo di soli 5 µL di sangue.
BACKGROUND DELL'INVENZIONE
Il corretto bilanciamento tra la biosintesi e la degradazione dei vari componenti cellulari è fondamentale per l’omeostasi cellulare. L'autofagia è un processo di degradazione attraverso il quale componenti intracellulari vengono inglobati in vescicole rivestite da una doppia membrana lipidica (autofagosoma) e digeriti enzimaticamente all’interno dei lisosomi (1-2). I substrati di questo processo, sono vari e comprendono proteine a lunga emivita, organelli intracellulari non funzionanti, aggregati proteici e lipidici e patogeni. I prodotti della degradazione vengono poi rilasciati nel citosol e successivamente utilizzati per la formazione di macromolecole e/o per la generazione dei substrati energetici necessari per il mantenimento della omeostasi cellulare (3-4). Oltre al suo ruolo fondamentale nel processo di adattamento allo stress, molti recenti studi attribuiscono all'autofagia un ruolo fondamentale nel normale processo di invecchiamento cellulare (5-6). E' inoltre ampiamente documentato il ruolo svolto da questo processo sia nella maturazione assonale che nel corso della arborizzazione dendritica nel sistema nervoso centrale. Inoltre, alterazioni del processo autofagico sembrano essere coinvolte in numerosi processi patologici, dal cancro, alle miopatie, ai disordini metabolici ed infine nelle malattie neurodegenerative (7).
Per lungo tempo l'autofagia è stato considerato un processo non selettivo di degradazione; tuttavia oggi essa è considerata un processo altamente specifico di eliminazione di componenti indesiderati, che prevede l’utilizzo di un macchinario molecolare altamente selettivo e solo in parte identificato Più di trenta proteine correlate all’autofagia (Atg-related proteins) sono stati identificate nell’ultima decade.
La Sindrome di Rett (RTT) è un disordine X-linked del neurosviluppo che affligge circa 1:10.000 bambini. Dopo i primi mesi di vita, i bambini sviluppano una progressiva perdita delle capacità di articolare il linguaggio, delle capacità cognitive, di interazione con l'ambiente circostante ed un progressivo deficit motorio (9). Inizialmente tale patologia venne classificata come un disordine correlato all'autismo ma attualmente è considerata un disordine sistemico con alterazioni in tutti gli organi e gli apparati (10). La maggior parte dei pazienti reca mutazioni nella proteina denominata Methyl-CpG-binding protein-2 (MeCP2) (11), mentre solo un ridotto numero di soggetti presenta mutazioni in altre proteine quali CDKL5 e FOXG-1 (12-13). MeCP2 è un repressore trascrizionale il cui ruolo esatto è ancora da definire, lasciando ancora sconosciute le basi patologiche della malattia.
Recentemente nei pazienti affetti da RTT è stata osservata una progressiva riduzione delle difese antiossidanti associata ad un incremento dei marker dello stress ossidativo (14-16). Inoltre studi recenti hanno messo in evidenza una alterazione della morfologia dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico e la presenza, nelle cellule nucleate, di corpi multivescicolari e di aggregati di proteine poliubiquitinate (17). Tuttavia non è ancora chiaro come le suddette alterazioni possano correlarsi con l'alterazione del pathway dei ROS (Reactive Oxygen Species) e con l'alterazione dei due principali processi catabolici cellulari, il sistema ubiquitina-proteasoma e l'autofagia. Inoltre, non sono stati ancora identificati in maniera univoca markers biologici che possano essere utilizzati nella diagnosi e nel follow up della patologia. In questo contesto, studi in vitro rivelano che nelle cellule di pazienti Rett vi è un consistente incremento dell'espressione delle subunità del proteasoma ed in generale una alterazione della proteostasi cellulare (18). Inoltre studi in vitro dimostrano che nei tessuti dei pazienti si osserva un accumulo di organelli intracellulari malfunzionanti (19) con le cellule che mostrano generalmente una ritardata progressione del ciclo cellulare (20).
Sfortunatamente nessuna strategia terapeutica è ad oggi disponibile per a RTT ed anche la diagnosi è particolarmente costosa e lunga, dal momento che si basa sulla analisi della sequenza di DNA. DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE
Allo scopo di identificare nuovi marker diagnostici della RTT, abbiamo analizzato in dettaglio l'alterazione dei due principali pathway di proteostasi cellulari: il sistema ubiquitina-proteasoma e l'autofagia.
I nostri studi ci hanno permesso di identificare, per la prima volta, una alterazione nel pathway della autofagia nei pazienti Rett. Visto che l'ultimo step di maturazione dei reticolociti nei globuli rossi è rappresentato dalla rimozione dei mitocondri e dei ribosomi mediante autofagia, abbiamo dunque indagato l'eventuale presenza di questi organelli nei globuli rossi maturi dei pazienti RTT. I risultati di questo studio hanno evidenziato la presenza nei globuli rossi sia di mitocondri e di ribosomi, sia intatti che parzialmente degradati, sia di loro proteine di membrana.
Tale evidenza è stata utilizzata per mettere a punto un sistema rapido ed economico per la diagnosi della patologia attraverso l'analisi dei globuli rossi. Ulteriori indagini condotte sui fibroblasti primari hanno evidenziato, inoltre, la presenza della medesima alterazione confermando che l'alterazione delle proteine coinvolte nel processo autofagico non è limitata alle cellule non nucleate. I dati ottenuti e mostrati in questa domanda di brevetto sono relativi ad uno studio condotto analizzando i globuli rossi provenienti da pazienti Rett (n=18) e individui sani dello stesso genere ed età (n=13).
Concludendo, la presente invenzione si basa sull'identificazione in campioni provenienti da pazienti di RTT di composti intracellulari che derivano da un alterato processo di autofagia cellulare, utili quindi come markers della malattia, ed ha, pertanto, come oggetto un metodo per la diagnosi della sindrome di RTT comprendente la determinazione dei livelli di uno o più di tali composti intracellulari correlati ad un processo di autofagia cellulare alterato. E’ utile ricordare che ad oggi circa 30 geni sono stati identificati come correlati con l’attività autofagica delle cellule umane e sono stati denominati “autophagy-related genes (Atg)”. Le proteine codificate da questi geni Atg includono chinasi, fosfatasi ed enzimi, che legano ed idrolizzano la guanosina trifosfato (GTPasi). Una prima lista non esaustiva di tali proteine, che secondo l’invenzione, pertanto, rientrano nella definizione di “composti intracellulari correlati ad un processo di autofagia cellulare alterato” insieme a loro frammenti, domini e/o sub-domini, include:
ULK1 (Gene ID: 8408), ULK2 (Gene ID: 9706), Atg2A (Gene ID: 23130), Atg2B (Gene ID: 55102), Atg3 (Gene ID: 64422), Atg4A (Gene ID: 115201), Atg4B (Gene ID: 23192), Atg4C (Gene ID: 84938), Atg4D (Gene ID: 84971), Atg5 (Gene ID: 9474), Beclin-1, (Gene ID: 8678), Atg7 (Gene ID: 10533), MAP1LC3A (Gene ID: 84557), MAP1LC3B (Gene ID: 81631), MAP1LC3C (Gene ID: 440738), GABARAP (Gene ID: 11337 ), Atg9A (Gene ID: 79065), Atg9 B (Gene ID: 285973), Atg10 (Gene ID: 83734), Atg12 (Gene ID: 9140), Atg13 (Gene ID: 9776), Atg14 (Gene ID: 22863), Atg16L1 (Gene ID: 55054), Atg16L2 (Gene ID: 89849), RB1CC1 (Gene ID: 9821) e WIPI-1 (Gene ID: 55062) (vedi per esempio Kesidou E. et al., Neural Regeneration Res., 2013, 882492275-2283).
Inoltre, secondo un ulteriore aspetto dell’invenzione, la definizione “composti intracellulari correlati ad un processo di autofagia cellulare alterato” comprende molecole mitocondriali (complessi enzimatici della catena respiratoria mitocondriale (Complesso I NADH deidrogenasi (Gene ID: 29078), Complesso II succinato deidrogenasi (Gene ID: 6391), Complesso III citocromo c riduttasi (Gene ID: 29796) e Complesso IV citocromo c ossidasi (Gene ID: 84701)) e ulteriori molecole che sono espresse esclusivamente all’interno dell’organulo in questione, quali la Sirtuina-3 (Gene ID: 23410), come pure molecole ribosomiali, ad esempio la proteina S19 (Gene ID: 6223) rappresenta un marker selettivo per i ribosomi), in quanto largamente rappresentate all’interno del globulo rosso del paziente RTT, inoltre la proteina p62 (Gene ID: 8878), PSMA3 (Gene ID: 5684), p25 (frammento di PARP, Gene ID: 142) e loro frammenti, domini e/o sub-domini.
E’ importante sottolineare come, sebbene le molecole specificamente contenute nei mitocondri siano molto numerose, quelle sopra riportate corrispondono a quelle maggiormente espresse rappresentando, di fatto, un target ideale per la facile rilevabilità tramite metodologie di biologia molecolare tradizionale.
Se tali composti intracellulari sono proteine, la loro determinazione avviene ad esempio tramite Western blotting o immunofissazione, cioè identificando una determinata proteina in una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici.
Anticorpi commerciali attualmente disponibili, quali ad esempio quelli diretti verso le proteine codificate da detti geni Atg, le molecole mitocondriali e ribosomiali sopra menzionate, sono in grado di riconoscere le molecole di interesse. Esempi di tali anticorpi sono:
anti-Sirtuina 3 (Abcam, ab866761), anti-COX-IV (Proteintech, 11242 – 1 – AP), anti-LC3b-I (Cell signaling, 2775), anti-S19 (generosamente donato dal prof. Loreni), anti-p62 (Genetex, GTX100685), anti-PSMA3 (Proteintech, 1187-1-AP), e anti-p25 (Abcam, ab32064).
Se tali composti intracellulari sono DNA, la loro determinazione avviene ad esempio tramite Southern blotting, mentre, se i composti intracellulari sono RNA, la determinazione avviene ad esempio tramite Northern blotting.
Inoltre, è stata identificata e caratterizzata una alterazione del flusso autofagico nei fibroblasti isolati da pazienti Rett, rispetto a quanto osservato in linee isolate da pazienti sani. In particolare, abbiamo verificato che, sia in condizioni di privazione di nutrienti sia in seguito a stimolazione con rapamicina (dati non inseriti nel presente testo), i fibroblasti Rett presentano un blocco del flusso autofagico: infatti, mentre il processo di lipidazione di LC3b-I (o MAP1LC3B) ad LC3b-II sembra essere normale, la degradazione lisosomiale è quasi completamente bloccata, come testimoniato dall'assenza dell'incremento nel contenuto di LC3b-II a seguito della somministrazione di clorochina (i.e. un inibitore delle proteasi lisosomiali) alle cellule da pazienti Rett. Inoltre, nelle cellule Rett, in condizioni di stress da nutrienti, la degradazione di p62/SQSTM1 e delle particelle di proteasoma sembra essere alterata.
In conseguenza di questa alterazione, ed in condizioni di deprivazione di nutrienti (infatti, già a due ore dalla coltivazione possono essere osservati frammenti della forma cleaved di PARP e la forma attivata della caspasi 3) i fibroblasti Rett attivano precocemente l’apoptosi. In conseguenza di questa alterazione del pathway della autofagia, abbiamo analizzato i globuli rossi dei pazienti Rett per verificare la presenza di quegli organelli intraeritrocitari (o di parti di essi) che vengono normalmente rimossi nel processo di maturazione dei globuli rossi.
Il più semplice metodo diagnostico di seguito proposto, si basa sull'analisi in Western blotting di piccole quantità di sangue o di campione prelevato dalle cellule somatiche (i.e.5 µL).
Per frammenti, domini, sub-domini di proteine si intende una sequenza amminoacidica proveniente dai composti intracellulari correlati ad un processo di autofagia cellulare alterato prima descritti, cioè da mitocondri, ribosomi od altri organelli intracellulari coinvolti nei processi di autofagia. Gli anticorpi sono molecole prodotte dal sistema immunitario e possono essere prodotti artificialmente sia in vitro che in vivo mediante metodiche diverse che utilizzano sistemi eucariotici o procariotici.
Di seguito l'invenzione sarà descritta in dettaglio con l'ausilio di esempi e figure sotto riportati. DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1
In Figura 1 è riportato un blot rappresentativo degli esperimenti condotti dove sono visibili 3 campioni prelevati da pazienti Rett e tre da individui sani (Healthy).
5 μl di sangue fresco sono stati lisati in 25mM Hepes, 0,1% SDS, 1% NP-40, 1mM EDTA e di seguito denaturati 10 minuti a 100 C. I campioni sono stati poi analizzati mediante Western blotting e marcati con anticorpi anti-Sirtuina 3 e anti-GAPDH. Come controllo interno i filtri sono marcati con un anticorpo contro GAPDH. La Figura 1 rivela la presenza di una banda corrispondente alla Sirtuina 3 nei pazienti Rett, ma non nei controlli sani.
Figura 2
La Figura 2 riporta l’analisi in Western blotting di fibroblasti Rett e di controllo (Ctrl) coltivati sia in condizioni standard in terreno DMEM sia nel terreno deprivato di nutrienti (Starvation) per 2 ore in presenza e in assenza di 20 µM CQ (il pannello in alto). I fibroblasti sono stati prelevati dai pazienti dopo approvazione della procedura dal comitato etico locale. La nitrocellulosa è stata marcata con un anticorpo anti-LC3b-I e anti-GAPDH. In Figura 2 sono riportati due casi rappresentativi dell'analisi (Case 1 e Case 2) di quattro linee di fibroblasti diverse. L'analisi densitometrica delle bande è stata eseguita mediante il software ImageJ (il pannello in basso). I risultati derivano da 4 esperimenti indipendenti (± S.E). * significativamente differente dal controllo (p <0.05, one-way ANOVA, seguito dal test di Tukey, n=12).
Figura 3
(A) Analisi in Western Blotting di substrati dell'autofagia quali p62/SQSTM1, PSMA3 e di marker dell'apoptosi quali il frammento p25 di PARP. Fibroblasti di controllo (pannello di sinistra) e Rett (pannello di destra) sono stati coltivati in terreno standard cioè DMEM supplementato con il 10% di siero o in assenza di nutrienti per 2 e 4 ore.
(B) L'analisi densitometrica è stata condotta per quantificare l'incremento di p62 rispetto alla βtubulina (pannello di sinistra) di PSMA3 rispetto a GAPDH (pannello di destra). * valori significativamente differenti dal controllo (p <0.05, one-way ANOVA, seguito dal test di Tukey, n=15).
La diminuzione di p62 (a 4 ore dalla stimolazione) e di PSMA3 (già visibile a 2 ore dalla stimolazione) riscontrabile nei fibroblasti di controllo è indice di un regolare flusso autofagico. Al contrario nessuna significativa degradazione di p62 e PSMA3 è osservata nei fibroblasti Rett. L'incremento della forma cleaved di PARP dopo 4 ore di stimolazione indica che i fibroblasti Rett vanno incontro a morte per apoptosi in condizioni di deprivazione (Starvation) di nutrienti, limitando in questo modo la possibilità di studiare il blocco della autofagia oltre questo arco di tempo.
Figura 4
(A) Fibroblasti di controllo (Healthy) (pannello in alto) e Rett (pannello in basso) sono stati coltivati in terreno DMEM supplementato con il 10% di siero (Resting) e in assenza di nutrienti (Starvation) in presenza e in assenza di 20μM CQ per 2 ore. Il pattern di colorazione di LC3b-I è stato analizzato in immunofluorescenza. I nuclei sono stati marcati con Hoechst dye-blu. Tutte le immagini sono state acquisite a 20x e sono riportate in Figura 4A in bianco e nero (versione a colori disponibile su richiesta)
(B) Percentuale di cellule contate in 10 differenti campi che presentano positività per LC3b-I, rilevata dalla presenza di almeno 10 dots (strutture puntiformi) per cellula. I valori si riferiscono alle cellule stressate per 2 ore in assenza di clorochina (pannello centrale). Tale esperimento è stato condotto su due delle linee cellulari disponibili.
L'assenza del processo di autofagia in condizioni basali (pannello di sinistra) nei fibroblasti di controllo permette di quantificare facilmente l'incremento del processo autofagico in condizioni di stress. Al contrario, nei fibroblasti Rett si nota una colorazione diffusa che testimonia l'alterazione del processo di formazione degli autofagosomi in condizioni di stress (pannello centrale). Il trattamento con clorochina non modifica il pattern di LC3b-I nei fibroblasti Rett (pannello di destra), mentre causa come atteso un incremento della positività ad LC3b-I nei fibroblasti di controllo.
Figura 5
Immagini di Microscopia Elettronica di globuli rossi di individui di controllo (Healthy) (in alto) e di pazienti Rett (in basso): i mitocondri sono stati osservati nei pazienti Rett. Le immagini sono state acquisite a differenti ingrandimenti dal 20.000 al 60.000x.
Nei globuli rossi dei pazienti Rett si osserva la presenza di mitocondri integri o parzialmente digeriti, alcuni dei quali mostrano inoltre una struttura “a manubrio”. Inoltre in alcune cellule, è possibile osservare numerose strutture elettrondense con un diametro tra 20 e 30 nm, che corrispondono esattamente alle dimensioni dei ribosomi.
Figura 6
Globuli rossi di individui di controllo (Healthy) e pazienti Rett sono stati incubati in presenza dell'anticorpo anti-19S specifico per i ribosomi. Le immagini sono state acquisite a 40x. La presenza dei ribosomi nei pazienti Rett è evidenziata da un pattern di colorazione verde diffusa che risulta assente nei campioni di controllo. Le immagini sono qui riportate in bianco e nero, la versione a colore è disponibile su richiesta.
Figura 7
Cellule del sangue prelevate da pazienti di controllo (Healthy) e Rett sono state marcate indirettamente con un anticorpo anti-CD71 e anti-COX-IV. La popolazione cellulare è stata considerata positiva in seguito a comparazione con l'autofluorescenza osservata in presenza del solo anticorpo secondario. Le cellule del sangue sono state marcate con 100 nM MitoTracker® (MT) green (100 nM). Le differenze tra i vari gruppi sono state considerate statisticamente significative per p<0.05, test one-way ANOVA, seguito dal Tukey’s test, n = 15).
Lista delle abbreviazioni
BSA: Albumina di siero bovina;
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium;
EDTA: acido etilendiamminotetraacetico;
FACS: Fluorescence-activated cell sorting
Hepes: acido 4-2-idrossietil-1-piperazinil-etansolfonico;
PSB: Tampone fosfato salino; e
SDS: sodio dodecilsolfato.
ESEMPI
Esempio 1-Figura 1
Identificazione di proteine mitocondriali nei lisati di globuli rossi mediante Western blotting.
Il seguente esperimento mette in evidenza come la metodica del Western blotting possa essere applicata per l'identificazione facile e rapida dell'alterazione dell'autofagia nei pazienti Rett.5 μl di sangue fresco sono stati lisati in 25mM Hepes, 0,1% SDS, 1% NP-40, 1mM EDTA e di seguito denaturati 10 minuti a 100 °C. I campioni sono stati poi analizzati mediante Western Blotting e marcati con anticorpi anti-Sirtuina 3 (Abcam, ab866761) (Gene ID 23410) e anti-GAPDH (BioLegend MMs-580S) (Gene ID 2597). In Figura 1 è riportato un blot rappresentativo degli esperimenti condotti dove sono visibili 3 campioni prelevati da pazienti Rett e tre da individui di controllo.
Come controllo interno i filtri sono marcati con un anticorpo contro GAPDH. La Figura 1 rivela la presenza di una banda corrispondente alla Sirtuina 3 nei pazienti Rett, ma non nei controlli sani.
Esempio 2-Figura 2
Alterazione del flusso autofagico e ridotta vitalità dei fibroblasti in condizioni di deprivazione di nutrienti.
Un approccio alternativo per rivelare i meccanismi molecolari alla base del processo autofagico è l'isolamento di fibroblasti primari mediante biopsia cutanea e la coltivazione degli stessi in vitro. Sebbene complessivamente la procedura sia lunga, costosa e limitata dal basso numero di pazienti disponibili, rappresenta il solo modo disponibile per studiare tale alterazione in cellule nucleate umane. In particolare, in questo modo è possibile valutare la coniugazione di LC3b-I (o MAP1LC3B) al PE (i.e. fosfatidiletanolammina (Cell Signalling 2775)) (LC3b-I Gene ID: 81631). Di seguito il processo sarà chiamato lipidazione di LC3b-I per formare LC3b-II (che, nonostante il suo più alto peso molecolare, mostra una maggiore mobilità elettroforetica dovuta alla più alta idrofobicità) in condizioni di deprivazione di nutrienti in presenza di inibitori delle proteasi lisosomiali. LC3b-II è esposto sulla superficie interna ed esterna dell'autofagosoma in formazione ed è degradato dalle proteasi lisosomiali. L'utilizzo di un inibitore lisosomiale (clorochina, in presenza del quale si osserva un incremento del contenuto di LC3b-II in seguito all'attivazione dell'autofagia, determinato dall'incremento del processo di lipidazione di LC3b-I e dal blocco della degradazione) è utile per prevenire errori nell'analisi, dal momento che il processo di lipidazione di LC3b-I avviene anche in altri compartimenti cellulari che non sono coinvolti nella biogenesi dell'autofagosoma.
I fibroblasti sono stati prelevati dai pazienti dopo approvazione della procedura dal comitato etico locale.
I fibroblasti furono coltivati sia in un terreno di crescita standard (DMEM supplementato con il 10% FBS) o nel terreno specifico per la crescita in condizioni di deprivazione di nutrienti (25 mM<Hepes, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl>2<, 5 mM Glucosio, 5 mM MgCl>2<and 1% BSA, pH 7.4),>utilizzato per indurre l'autofagia in presenza e in assenza di 20µM clorochina (CQ), un potente inibitore della acidificazione lisosomiale e pertanto della attivazione enzimatica. Dopo la stimolazione le cellule furono lisate, furono raccolti i pellet e, allo scopo di esaminare il contenuto di LC3b-II, i campioni furono analizzati mediante Western blotting in condizioni denaturanti e riducenti. La nitrocellulosa è stata marcata con un anticorpo anti-LC3b-I e anti-GAPDH. In Figura 2 sono riportati due casi rappresentativi dell'analisi di quattro linee di fibroblasti diverse. L'analisi densitometrica delle bande riportata in Figura 2B è stata eseguita mediante il software ImageJ (il pannello in basso). I risultati derivano da 4 esperimenti independenti (± S.E). *, significativamente differente dal controllo (p <0.05, one-way ANOVA, seguito dal test di Tukey, n=12).
Come si può notare dai risultati riportati in Figura 2, in condizioni di crescita regolare, con l'eccezione di una delle quattro linee cellulari, nel caso dei fibroblasti sia sani sia RTT (Case 1 Figura 2A), LC3b-I era presente, mentre LC3b-II era assente (Case 2 Figura 2). In presenza di 20 µM CQ, una banda corrispondente a LC3b-II era visibile solo nel caso dei fibroblasti sani. In condizioni di stress invece e in assenza di CQ, LC3b-II era aumentato sia nei fibroblasti sani che RTT, indicando che il processo di lipidazione di LC3b-I avesse avuto luogo regolarmente. Tuttavia, in presenza di 20µM CQ, un maggiore incremento nel contenuto di LC3b-II (circa 2,5 di incremento rispetto alla quantità di LC3b-II presente nelle cellule stressate in assenza di CQ, Fig.2 pannello in basso) era evidenziabile nei fibroblasti di controllo, ma non in quelli Rett, confermando l'alterazione della autofagia.
Esempio 3-Figura 3
Ridotta degradazione di p62/SQSTM1 e del proteasoma nei fibroblasti Rett in condizioni di stress.
Per rafforzare ulteriormente i dati descritti nel paragrafo precedente, è stato valutato il processo di degradazione di due substrati dell'autofagia in condizioni di stress da deprivazione di nutrienti sia nei fibroblasti Rett che in quelli di controllo. La contemporanea analisi in presenza di clorochina non è stata necessaria, dal momento che tali substrati sono selettivamente inglobati nell'autofagosoma e degradati dai lisosomi. Pertanto, una riduzione nel contento di queste proteine è un indice molecolare del corretto funzionamento della autofagia. A differenza di quanto descritto precedentemente per LC3b-II e per l'analisi della biogenesi dell'autofagosoma, per monitorare la degradazione di questi substrati è stato necessario seguire il processo per tempi prolungati. In dettaglio, p62/SQSTM1 (Gene ID: 8878) è un marker della corretta clearance degli aggregati intracellulari di proteine poli-ubiquitinate. La proteina p62 sembrerebbe fare da ponte tra gli aggreggati di poliubiquitine ed LC3b-II, mediando in questo modo il loro intrappolamento nell'autofagosoma dove verranno poi degradati. Il proteasoma ed in particolare la particella 20S (la parte cataliticamente attiva del 26S) è uno dei primi substrati della autofagia, essendo degradata proprio nelle prime fasi dopo l'induzione del processo autofagico. Di conseguenza, una valutazione semi-quantitativa del contenuto di una delle 28 subunità che compongono il 20S (come PSMA3 che è stata valutata nel presente studio) (Gene ID: 5684) è un ulteriore metodo utile per monitorare l'autofagia. I risultati del Western blotting di Figura 3A hanno evidenziano una riduzione di questi substrati nei fibroblasti di controllo in seguito a coltivazione nel terreno da stress per 2 e 4 ore; nei fibroblasti Rett e nelle medesime condizioni sperimentali tale decremento è invece risultato molto ridotto. Questa alterazione era maggiormente apprezzabile dopo normalizzazione (i.e. β-tubulin per p62 e GAPDH per PSMA3) (per p62 Genetex: GTX100685) (per PSMA3 Proteintech: 11887 – 1 – AP) (Figure 3B). I filtri del medesimo esperimento furono marcati per p25, il frammento di PARP (Gene ID: 142) (Abcam: ab32064), che indica l'induzione di apoptosi nei fibroblasti Rett a seguito di una prolungata incubazione nel terreno da stress (cioè 4 ore).
In particolare, la diminuzione di p62 (a 4 ore dalla stimolazione) e di PSMA3 (già visibile a 2 ore dalla stimolazione) riscontrabile nei fibroblasti di controllo è indice di un regolare flusso autofagico. Al contrario nessuna significativa degradazione di p62 e PSMA3 è osservata nei fibroblasti Rett. L'incremento della forma cleaved di PARP dopo 4 ore di stimolazione indica che i fibroblasti Rett vanno incontro a morte per apoptosi in condizioni di deprivazione di nutrienti, limitando in questo modo la possibilità di studiare il blocco della autofagia oltre questo arco di tempo.
Esempio 4-Figura 4
Difettiva generazione dell'autofagosoma nei fibroblasti Rett in condizioni di deprivazione di nutrienti
Per rafforzare ulteriormente i dati descritti nelle precedenti sezioni, è stata condotta un analisi in immunofluorescenza per valutare la presenza di vescicole positive ad LC3b-I nei fibroblasti di controllo e Rett coltivati nel terreno senza nutrienti (cioè 2 ore) in presenza e in assenza di CQ. Le cellule furono seminate nel numero di 5x10<4>/piastra and trattate per indurre l'autofagia come indicato precedentemente. Al termine del trattamento le cellule furono lavate in PBS e fissate con il 4% di paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente. Dopo, le cellule furono lavate due volte in PBS ed incubate in PBS 0,03% Triton+3% BSA per 30 min a temperatura ambiente. Successivamente, le cellule furono lavate due volte con PBS ed incubate con l’anticorpo anti-LC3b-I (indicato nel paragrafo precedente - Cell Signaling 2775) over night a 4C°. Il giorno seguente, dopo due cicli di lavaggio in PBS (15 minuti ciascuno a temperatura ambiente), le cellule furono incubate con anticorpo secondario (Bio-Rad, anti-IgG HRP-conjugated) per 1 ora a temperatura ambiente. Infine, dopo due lavaggi in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente, furono montati i vetrini copriogetto e furono acquisite le immagini con un microscopio a fluorescenza. Il numero dei dots (strutture puntiformi) positivi per LC3b-I fu quantificato contando in 10 aeree diverse il numero di cellule che mostravano almeno 10 dot. La Figura 4A indica che in condizioni di coltivazione standard non c'è stata una apprezzabile induzione di autofagia. A seguito dell'attivazione della autofagia, invece, i fibroblasti sani mostravano un marcato incremento alla positività ad LC3b-I, che indica la presenza di autofagosomi maturi, mentre nessuna struttura positiva era osservabile nei fibroblasti Rett. Allo stesso modo, quando 20 µM CQ fu somministrata ai fibroblasti stressati, un accumulo di LC3b-I era evidente nelle cellule di controllo, mentre una colorazione uniforme e diffusa era evidente nei fibroblasti Rett, indicando l'assenza di autofagosomi in formazione.
Come si nota dai risultati riportati in Figura 4, l'assenza del processo di autofagia in condizioni basali (pannello di sinistra) nei fibroblasti di controllo permette di quantificare facilmente l'incremento del processo autofagico in condizioni di stress. Al contrario, nei fibroblasti Rett si nota una colorazione diffusa che testimonia l'alterazione del processo di formazione degli autofagosomi in condizioni di stress (pannello centrale). Il trattamento con clorochina non modifica il pattern di LC3b-I nei fibroblasti Rett (pannello di destra), mentre causa come atteso un incremento della positività ad LC3b-I nei fibroblasti di controllo.
Tutti i dati indicano che le cellule Rett presentano una alterazione nel processo di formazione dell'autofagosoma e che la lipidazione di LC3b-I che si verifica nel terreno da stress (Figura 4) si verifica in siti ectopici e non contribuisce alla formazione dell'autofagosoma.
Nella Figura 4B e’ invece riportato il valore relativo al numero di cellule che presentassero almeno 10 strutture “dot-like” sia nel caso dei fibroblasti sani che RTT.
Esempio 5-Figura 5
Identificazione di mitocondri e ribosomi nei globuli rossi di pazienti Rett mediante microscopia elettronica.
L'autofagia è un pathway proteolitico che media il processo di eliminazione degli organelli durante il processo maturativo che porta alla formazione dei globuli rossi maturi dai reticolociti. Di conseguenza sulla base dei dati riportati in precedenza, abbiamo verificato se il difetto sistemico dell'autofagia descritto nei pazienti Rett, potesse determinare la presenza di tracce di questi organelli nei globuli rossi che, come già detto, mostrano alterazioni di membrana e un accumulo di ROS. A tale scopo è stata condotta una indagine di microscopia elettronica sui globuli rossi Rett e di controllo. La Figura 5 riporta le immagini di microscopia elettronica di globuli rossi di individui di controllo (in alto) e di pazienti Rett (in basso): i mitocondri sono stati osservati nei pazienti Rett. Le immagini sono state acquisite a differenti ingrandimenti dal 20.000 al 60.000x.
Nei globuli rossi dei pazienti Rett si osservava la presenza di mitocondri integri o parzialmente digeriti, alcuni dei quali mostravano inoltre una struttura “a manubrio”. Inoltre in alcune cellule, era possibile osservare numerose strutture elettrondense con un diametro tra 20 e 30 nm, che corrispondono esattamente alle dimensioni dei ribosomi. A tal proposito, si menziona che negli ultimi stadi del processo di maturazione dei reticolociti i ribosomi non sono più raggruppati come poliribosomi, ma appaiono come particelle singole (27).
Esempio 6-Figura 6-7
Identificazione di mitocondri e ribosomi nei globuli rossi di pazienti Rett mediante immunofluorescenza
Campioni di sangue periferico prelevato da pazienti Rett ed individui di controllo furono raccolti in provette contenenti 2mM EDTA e centrifugati a 3.500 rpm per 5 minuti. Successivamente le cellule furono lavate per quattro volte con PBS 1x in presenza di 2 mM EDTA e poi centrifugate per 2 minuti a 3.000 rpm a 4 C°. Le cellule furono poi risospese in PBS 1x, 2 Mm EDTA e 20% siero (rapporto 5 μl cellule: 200 μl buffer). 200 μl di questo campione furono picchiettati su dei vetrini funzionalizzati con polilisina (10 min, 500 rpm). Le cellule furono poi fissate con 4% paraformaldeide ed incubate per 30 minuti a temperatura ambiente, successivamente furono lavate per quattro volte con 0,1% Tween™-PBS (T-PBS). Dopo, le cellule furono permeabilizzate con 0,1% Triton™-PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine i vetrini furono lavati per quattro volte con 0,1% T-PBS ed incubati a temperatura ambiente per 30 minuti in soluzione al 50% PBS -50% High Contrast Diluent (Inova Diagnostics, Inc., San Diego). I vetrini dopo lavaggio con 0,1% T-PBS, furono incubati overnight a 4°C con i seguenti anticorpi: COX-IV (Gene ID: 84701) (Proteintech: 11242 – 1 – AP), CD71 (Gene ID 7037) (Genetex: 102596) ed un anticorpo monoclonale specifico per la subunità 19S del ribosoma (generosamente donato dal prof. Loreni (28). Il giorno seguente, le cellule furono lavate con 0,1% T-PBS ed in seguito incubate con un anticorpo secondario specifico per 1 ora a temperatura ambiente. Al termine della incubazione le cellule furono nuovamente lavate e furono montati i vetrini copriogetto. Le immagini furono acquisite ad un ingrandimento di 100x mediante procedura di immersione ad olio.
Le immagini riportate in Figura 6 sono relative a globuli rossi di individui di controllo e di pazienti Rett. Come emerge dalle immagini in fluorescenza, esclusivamente nei pazienti Rett, è stato possibile visualizzare la presenza di strutture positive per COX-IV (di colore rosso) in circa il 30% delle cellule esaminate. Inoltre ad un ingrandimento di 40x, mediante l'uso di un anticorpo diretto contro la subunità 19S del ribosoma, nelle cellule Rett si visualizzava una colorazione verde diffusa in tutta la cellula, che risultava assente nei campioni di controllo.
Un risultato simile è stato ottenuto mediante l'analisi tramite lo strumento FACS. L'analisi citofluorimetrica fu effettuata utilizzando un anticorpo anti-CD71 (che marca il recettore della trasferrina) e anti-COXIV. CD71 è un marker dei reticolociti ed è assente nelle cellule mature: tale analisi evidenzia la presenza di un più basso numero di cellule CD71<+>nei campioni di controllo rispetti ai pazienti Rett (1,34% vs 1,03)(Figure 7). Nei pazienti di controllo era visibile una scarsa popolazione COX-IV<+>(0,56%), mentre la medesima popolazione era molto più abbondante nei globuli rossi dei pazienti Rett (1,15%). Tali risultati sono stati ulteriormente confermati da una indagine mediante MitoTracker® (MT)che ha rivelato la presenza di un incremento di più di due volte di cellule (Figure 7) MT<+>nei pazienti Rett rispetto a quelli di controllo.
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Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la diagnosi in vitro della sindrome di Rett comprendente la determinazione in un campione dei livelli di uno o più composti intracellulari, che derivano da un alterato processo di autofagia cellulare.
- 2. Metodo secondo al rivendicazione 1, in cui il composto intracellulare, che deriva da un alterato processo di autofagia cellulare, è scelto nel gruppo comprendente: ULK1, ULK2, Atg2A, Atg2B, Atg3, Atg4A, Atg4B, Atg4C, Atg4D, Atg5, Beclin-1, Atg7, MAP1LC3A, MAP1LC3B (o LCRb-I), MAP1LC3C, GABARAP, Atg9A, Atg9 B, Atg10, Atg12, Atg13, Atg14, Atg16L1, Atg16L2, RB1CC, WIPI-1 e loro frammenti, domini e sub-domini.
- 3. Metodo secondo al rivendicazione 1, in cui il composto intracellulare, che deriva da un alterato processo di autofagia cellulare, è scelto nel gruppo comprendente: Complesso I NADH deidrogenasi, Complesso II succinato deidrogenasi, Complesso III citocromo c riduttasi, Complesso IV citocromo c ossidasi, Sirtuina-3, proteina S19, proteina p62, PSMA3, p25 e loro frammenti, domini e sub-domini.
- 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazione da 1 a 3, in cui la determinazione di tali composti intracellulari avviene tramite Western blotting o immunofissazione, mediante il riconoscimento da parte di anticorpi specifici.
- 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui l’anticorpo è scelto nel gruppo comprendente anti-Sirtuina 3, anti-COX-IV, anti-LC3b-I, anti-S19, anti-p62, anti-PSMA3 e anti-p25.
- 6. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazione da 1 a 5, in cui il campione è un campione di sangue o di un altro tessuto precedentemente prelevato da un organismo vivente.
- 7. Uso di composti intracellulari, che derivano da un alterato processo di autofagia cellulare, come markers in un metodo per la diagnosi in vitro della sindrome di Rett.
- 8. Uso secondo la rivendicazione 7, in cui i composti intracellulari, che derivano da un alterato processo di autofagia cellulare, sono quelli indicati nella rivendicazione 2 e/o 3.
- 9. Uso di uno o più anticorpi, che legano specificamente i composti intracellulari, che derivano da un alterato processo di autofagia cellulare, in un kit per la diagnosi in vitro della sindrome di Rett.
- 10. Uso secondo la rivendicazione 9, in cui gli anticorpi sono quelli indicati nella rivendicazione 5.
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