WO2006022422A1 - 自律複製能を有する改変されたヒトｃ型肝炎ウイルスゲノムrna - Google Patents

自律複製能を有する改変されたヒトｃ型肝炎ウイルスゲノムrna Download PDF

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Takaji Wakita
Takanobu Kato
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Michiko Miyamoto
Ralf Bartenschlager
Jun-Ichi Tanabe
Saburo Sone
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Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention relates to a method for autonomous replication of various genotypes of human hepatitis C virus (HCV) in a cultured cell system, a modified HCV genomic RNA, and the HCV genomic RNA replicating cell.
  • HCV human hepatitis C virus
  • hepatitis C virus is classified into a number of types by genotype or serotype.
  • HCV is genotype la, genotype lb, genotype 2a, genotype 2b, genotype 3a It is classified into 6 types of gene type 3b (Non-patent Document 1), and each of these types is further classified into several subtypes.
  • Non-patent Document 1 the base sequences of the entire genome of a plurality of HCV genotypes have also been determined (Patent Document 1, and Non-Patent Documents 2 to 4).
  • HCV causes chronic hepatitis by persistent infection.
  • HCV chronic hepatitis
  • the main cause of chronic hepatitis recognized worldwide is persistent infection with HCV.
  • about 50% of those with persistent infections develop chronic hepatitis, of which about 20% have transitioned to cirrhosis after 10 to 20 years, and some of them are fatal, such as liver cancer.
  • Progress to disease state is a condition in which chronic hepatitis by persistent infection.
  • the current main treatment for hepatitis C is interferon 1 !, interferon 1 i3, and interferon 1 alpha combined with ribavirin, a purine 1 nucleoside derivative.
  • interferon 1 ! interferon 1 i3, and interferon 1 alpha combined with ribavirin, a purine 1 nucleoside derivative.
  • the therapeutic effect of interferon is known to be related to the genotype of HCV and is less effective for gene type lb and more effective for genotype 2a (Non-Patent Document 5).
  • HCV subgenomic RNA revlikon has been produced as RNA having autonomous replication ability derived from HCV (Patent Documents 2 and 3, and Non-Patent Documents 7 to 9). It became possible to analyze the replication mechanism.
  • These HCV subgenomic RNA replicons are obtained by replacing the structural protein present downstream of the HCV IRES in the 5 ′ untranslated region of the HCV genomic RNA with the neomycin resistance gene and EMCV-IRES linked downstream thereof.
  • This RNA levicon was proved to replicate autonomously in Huh7 cells when introduced into human hepatoma cell Huli7 and cultured in the presence of neomycin.
  • some HCV subgenomic RNA replicons replicate autonomously not only in Huh7 but also in cells such as human cervical cancer cell HeLa and human hepatoma cell HepG2 (Patent Document 3).
  • RNA levicon is an experimental system that can evaluate only viral RNA replication during the growth and replication process of HCV virus. Formation and release of HCV virus particles inside infected cells and to new cells. The process of infection cannot be assessed.
  • Non-patent Document 10 Non-patent Document 10
  • an experimental system using an animal body as it is is difficult to analyze and extremely difficult to analyze. Therefore, the formation and release of HCV virus particles inside infected cells and new cells
  • a highly simplified experimental system that can reproduce these processes that is, a cultured cell system. It is necessary to construct a replication system for HCV virus particles.
  • HCV virus particles can be supplied by cultured cell systems, the virus can be attenuated or non-infectious HCV virus can be produced using molecular biological techniques and used in vaccines. You can also.
  • HCV has different protein sequences depending on the genotype, the antigenicity of HCV also varies from genotype to genotype. In fact, the existence of various genotypes is a major obstacle to the production of HCV vaccines (Non-patent Document 11). Therefore, stable production of HCV virus particles of each genotype using a cultured cell system is desirable for efficient HCV vaccine production.
  • HCV is a 55-65 nm spherical particle and is known to exist in the blood of patients with HCV infection.
  • Known methods for purifying HCV present in human serum include affinity chromatography using lectin (Non-patent Document 12) and chromatography using heparin (Non-patent Document 13).
  • these methods can only purify less than 1 mL of virus at a concentration of about 1 M copy / mL, so that they do not lead to industrial use at all.
  • Patent Documents 4, 5, and 6 A number of methods for purifying virus particles other than HCV have been invented so far (for example, Patent Documents 4, 5, and 6). However, as you can see from these documents, the nature of the virus particles varies and provides no useful information on how to best purify human hepatitis C virus. Further, Patent Document 7 discloses that human hepatitis A virus, which is the same hepatitis virus, can be purified by removing DNA by anion exchange chromatography. However, even with the hepatitis virus, type A is a virus with DNA as a gene, and type C is a virus with RNA as a gene. Don't give helpful information. In order to use human hepatitis C virus particles industrially for vaccines in the future Since it is necessary to purify a large amount and highly, development of a purification method is awaited.
  • An object of the present invention is to provide a method for replicating and amplifying hepatitis C virus of various genotypes in a cultured cell system.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems, and modified the combination of genomic RNA of HCV JFH1 strain having autonomous replication ability and genomic RNA of HCV strain not having autonomous replication ability in vitro.
  • Hepatitis C virus genomic RNA was produced and found to be capable of autonomous replication in cultured cell lines.
  • the invention described above allows autonomous replication of HCV genomic RNA that does not have autonomous replication ability in vitro in a cultured cell system by introducing a genome from the NS3 protein coding sequence of the JFH1 strain to the 3 ′ end. It was found that RNA can be modified.
  • the present invention comprises 5 'untranslated region, core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, p7 protein coding sequence, NS2 protein coding sequence of two or more types of hepatitis C virus genomic RNA, A modified hepatitis C virus genomic RNA consisting of the NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B protein code sequences of the JFH1 strain, and a base sequence that includes a 3 'untranslated region, and has autonomous replication ability About.
  • NS5B protein coding sequence shown in SEQ ID NO: 1 RNA partial sequence encoding NS3, NS4, NS5A and NS5B proteins of JFH1 strain (Genbank Accession No.
  • a modified hepatitis C virus genomic RNA is provided, which is substituted with the i sequence in which T of the sequence shown in DNA sequence 3867-9678 of AB047639 is replaced with U, and has autonomous replication ability.
  • the NS5B protein coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA is replaced with the NS5B protein coding sequence of JFH1 strain represented by SEQ ID NO: 2, and has a modified C type having autonomous replication ability Provide hepatitis virus genomic RNA.
  • the virus strains with genotype lb are HCV-conl strain and HCV-TH strain.
  • HCV-J strain, HCV-JT and HCV-BK strains, and genotype 2a virus strains include HCV-J6 strain, HCV-JFH1 strain, and HCV-JCH1 strain. .
  • the modified hepatitis C virus genomic RNA of the present invention may further comprise at least one selectable marker gene and / or at least one reporter gene and at least one IRES sequence.
  • the present invention also provides a cell into which the modified hepatitis C virus genomic RNA of the present invention is introduced, which can replicate the hepatitis C virus genomic RNA and produce virus particles.
  • the host cell is preferably a proliferative cell, and particularly a eukaryotic cell such as a human liver-derived cell such as a Huh7 cell, HepG2 cell, IMY-N9 cell, HeLa cell, or 293 cell, human Cervical cells or human fetal kidney cells are preferred.
  • the present invention also provides a method for producing hepatitis C virus particles, wherein the cells are cultured, and virus particles are recovered from the culture, and hepatitis C virus particles produced by the method are also provided. .
  • the present invention also includes a method for producing a hepatitis C virus-infected cell, characterized by culturing the cell and infecting other cells with virus particles in the culture, and hepatitis C produced by the method.
  • Virus-infected cells are also provided.
  • HCV particles having a degree of purification that can be industrially used in medicine can be obtained by purifying HCV particles using column chromatography and Z or density gradient centrifugation.
  • the column chromatography used here is one or more chromatographies selected from ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, and affinity chromatography, and density gradient centrifugation is performed using cesium chloride, sucrose, and sugar polymer.
  • HCV can be purified by using a solvent containing one or more solutes selected from the above.
  • the present invention also provides a screening method for anti-hepatitis C virus substances using the cells of the present invention or hepatitis C virus-infected cells.
  • the method comprises culturing the cell of the present invention or a hepatitis C virus-infected cell in the presence of a test substance, and detecting hepatitis C virus RNA or virus particles in the culture, thereby anti-C of the test substance. It is characterized by evaluating hepatitis B virus effect.
  • the present invention also provides the hepatitis C virus particle of the present invention or a part thereof as an antigen. And used to provide a method for producing a hepatitis C vaccine.
  • the present invention is characterized in that RNA encoding a foreign gene is inserted into the modified hepatitis C virus genomic RNA of the present invention and introduced into a target cell for replication or expression.
  • a method for replicating and / or expressing a foreign gene in a cell, and a hepatocyte-directed viral vector containing the modified hepatitis C virus genomic RNA of the present invention are provided.
  • infectious HCV virus particles can be produced using a cultured cell system. Furthermore, even in HCV strains that do not have autonomous replication ability isolated from patients, replace the NS3B region with JFH1 viral genomic RNA at the 3 'side of the NS3 region, or replace NS5B region with NS5B of JFH1. Thus, autonomous replication can be performed in in vitro. Therefore, HCV strain virus particles of various genotypes can be produced in a cultured cell system, which is useful for studying HCV infection processes, screening systems for various substances that affect HCV infection, and manufacturing HCV vaccines. It is.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the procedure for constructing a truncated DNA for producing the HCV genomic RNA of the present invention, and shows the structure of the plasmid clone pJFHl produced by inserting the full-length HCV genome downstream of the T7 promoter.
  • T7 T7 RNA promotion
  • 5 'UTR 5' untranslated region
  • C Core protein
  • El E2: Envelope protein
  • NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B Nonstructural proteins.
  • 3 'UTR 3' untranslated region.
  • Age I, Pme L Xba I cleavage sites for restriction enzymes
  • GDD NS5B protein activity The amino acid motif GDD position corresponding to the center.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of Northern blot analysis showing rJFHl replication in Huh7 cells into which rJFHl, an HCV genomic RNA, was introduced.
  • Figure 3 shows the detection results for HCV Core protein, NS3 protein, NS5A protein, and E2 protein in the medium.
  • Fig. 4 shows the results of core protein release over time into the medium of cells into which HCV genomic MA has been introduced.
  • Figure 5 shows the culture supernatant of Huli7 cells into which rJFHl has been introduced using a sucrose density gradient. It is a graph which shows the amount of HCVCore protein and HCV genomic RNA in each fractionated fraction. Black circles indicate HCV Core (core) protein, and open circles indicate HCV genomic RNA.
  • Fig. 5A shows the results for untreated, Fig. 5B for RNase treatment, Fig. 5C for NP40 treatment, and Fig. 5D for rJFHl-introduced Huh7 cells treated with NP40 + RNase.
  • Figure 6 relates to the infectivity of virus particles secreted into the culture medium of rJFHl-introduced Huh7 cells. Fig.
  • FIG. 6A is a photograph showing the results of immunostaining with anti-Core antibody (left) and anti-NS5A antibody (right).
  • FIG. 6B is a graph showing the number of anti-Core antibody staining positive cells.
  • FIG. 6C is a graph showing changes in the amount of HCV RNA in cells (left) and supernatant (right) over time. .
  • FIG. 7 relates to the infectivity of virus particles secreted into the culture solution of rJCHl / NS5B (j fhl) -introduced Huh7 cells.
  • FIG. 7A is a graph of HCV RNA amplification in naive Huh7 cells of virus particles secreted into the culture medium of KHl / NS5B (j fhl) -introduced Huh cells.
  • FIG. 7B is a graph showing the number of anti-core antibody staining positive cells.
  • FIG. 8 shows the structure of a TH / JFH1 chimeric levicon.
  • Figure 9 shows the result of colony formation by rTH / JFHl chimeric levicon RNA transfection.
  • Fig. 10 shows the results of colony formation due to infection of the TH / JFH1 chimeric levicon culture supernatant.
  • Figure 11 shows the effluent profile in gel filtration chromatography.
  • the vertical axis represents the absorbance at a wavelength of 4900 nm.
  • S—3 0 0, S ⁇ 4 0 0 and S — 5 0 0 are respectively Sep h acry (registered trademark) S—3 0 0, S—4 0 0 and S—5 0 0.
  • the horizontal axis indicates the amount of solution eluted from the column.
  • Figure 12 shows the effluent profile for ion exchange chromatography.
  • the vertical axis shows the amount of core protein of HCV particles.
  • Figure 13 shows the outflow profile in the lectin affinity mouthmatography.
  • the vertical axis shows the amount of core protein of HCV particles.
  • Figure 14 shows the efflux profile of heparin and sulfate cell mouth fines. The vertical axis indicates the absorbance at a wavelength of 49 nm.
  • Figure 15 shows the spill profile for the Blue Diaphragm mouthmatography. The vertical axis shows the amount of core protein of HCV particles.
  • Figure 16 shows a purification profile combining column chromatography and sucrose density gradient centrifugation. The vertical axis shows the amount of core protein of HCV particles. In the sucrose density gradient centrifugation, the density of each fraction solution is shown on the vertical axis along with the amount of HCV core protein.
  • the genome of hepatitis C virus is a (+) single-stranded RNA consisting of approximately 9600 nucleotides.
  • This genomic RNA consists of a 5 'untranslated region (also referred to as 5' NTR or 5 'UTR), a translated region composed of a structural region and a non-structural region, and a 3' untranslated region (3 'NTR or 3' (Also referred to as UTR).
  • the structural region encodes a structural protein of HCV
  • the nonstructural region encodes a plurality of nonstructural proteins.
  • HCV structural proteins core, El, and E2
  • nonstructural proteins NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B
  • core is the core protein
  • E1 and E2 are envelope proteins.
  • Nonstructural proteins are proteins involved in virus replication.
  • NS2 is a metaprotease activity
  • NS3 is a serine protease activity (1/3 of the N-terminal side) and a helicase activity (C-terminal). It is known to have 2/3 of the side.
  • NS4A is a cofactor for NS3 protease activity
  • NS5B is an RNA It has also been reported to have dependent RNA polymelase activity.
  • HCV genomic RNA that does not have autonomous replication ability is not limited to these known virus types, and does not have all autonomous replication ability, that is, has the ability to release infectious particles outside the cell. Not include HCV genomic RNA.
  • RNA has “autonomous replication ability” or “autonomous replication” means that when HCV genomic RNA is introduced into a cell, the HCV genomic RNA self-propagates, That means it has the ability to release infectious particles out of the cell.
  • RNA containing HCV genomic RNA having the above-described cultured cell line autonomous replication ability is referred to as “replicon RNA” or “RNA replicon”.
  • the levicon RNA of the present invention containing the full length of the levicon RNA is referred to as “full length HCV replicon RNA”.
  • the full length HCV replicon RNA of the present invention has the ability to produce virus particles.
  • the modified hepatitis C virus genomic RNA of the present invention is a full-length HCV replicon RNA.
  • the modified hepatitis C virus genomic RNA comprises two or more types of hepatitis C virus genomic RNA, 5 ′ untranslated region, core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, p7 It consists of a protein coding sequence, NS2 protein coding sequence, and NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B protein coding sequences of JFH1 strain, and a base sequence containing a 3 ′ untranslated region, and has autonomous replication ability.
  • the present invention provides, as one embodiment, a genomic sequence from NS3 protein coding sequence of C-type hepatitis virus genomic RNA to 3 'end NS5B protein coding sequence shown in SEQ ID NO: 1 NS3 of JFH1 strain , NS4, NS5A, and NS5B protein-encoding RNA partial sequences (RNA sequences obtained by substituting T for U in the DNA sequence 3867-9678 of Genbank Accession No. AB047639) and have autonomous replication ability Have a modified C Contains hepatitis B virus genomic RNA.
  • the NS5B protein coding sequence of hepatitis C virus genomic RNA is replaced with the NS5B protein coding sequence of the JFH1 strain represented by SEQ ID NO: 2, and a modified C having autonomous replication ability Provides hepatitis C virus genomic RNA.
  • a modified hepatitis C virus genome consisting of the NS3, NS4A, NS4B, NS5A, and NS5B protein code sequences of the JFH1 strain, and a base sequence containing a 3 ′ untranslated region, and has autonomous replication ability Contains RNA.
  • the modified hepatitis C virus genomic RNA may further comprise at least one selection marker gene and Z or at least one reporter gene and at least one IRES sequence.
  • autonomous replication ability is achieved by combining an HCV strain that has autonomous replication ability in a cultured cell system and an HCV strain that does not have autonomous replication ability in a cultured cell system.
  • HCV strains that you do not have can be altered to ones that can replicate autonomously.
  • a virus strain with low autonomous replication efficiency can be altered to a virus strain with high replication efficiency.
  • HCV strains include HCV-1 strain, HCV-H strain, HCV- ⁇ strain, etc. for la type
  • lb type includes HCV-conl strain
  • HCV-TH strain HCV-J strain
  • HCV- JT strain HCV-BK strain
  • 2a type includes HCV-J6 strain
  • JFH-1 strain KH 1 strain
  • 2b type includes HC-J8 strain
  • 3a type includes E-bl strain, etc. It has been.
  • the structure of these viruses basically consists of 5'-UTR, core ⁇ El, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, 3'-UTR (see above).
  • HCV2a type JFH1 strain and other strains other than JFH-1 strain for example, HCV-1 strain, HCV-H strain, HCV- ⁇ strain, HCV-conl Strain, HCV-TH strain (Waki ta et al., J. Biol.
  • the region 3 'from the NS3 region in the HCV genomic RNA of JFH1 strain which is hepatitis C virus, was replaced with JFH1 viral genomic RNA.
  • NS5B protein code sequences can be listed as HCV genomic RNAs replaced or inserted with NS5B protein coding sequences in other HCV genomic RNAs.
  • HCV genomic RNA can be modified into HCV genomic RNA capable of autonomous replication.
  • RNA sequence part encoding NS3 to NS4, NS5A, NS5B protein of Con-1 clone (rei) (EMBL Accession No. AJ238799) of HCV genotype lb which is HCV genomic RNA
  • HCV genomic RNA is NS3 to NS4 of JFH1 strain
  • By replacing it with an RNA sequence it becomes possible to modify the HCV genomic RNA into an HCV genomic RNA capable of autonomous replication.
  • a full-length replicon using the gene of Con-1 clone has autonomous replication ability but does not form HCV particles (see Pietschmann et al, Jouranl of Virology, (2002) 76, p. 4008-4021).
  • RNA sequence part encoding NS3 to NS4, NS5A, NS5B protein with the RNA sequence encoding NS3 to NS4, NS5A, NS5B protein of JFH1 strain, Particles are formed. That is, according to the method of the present invention, it becomes possible to turn a hepatitis C virus genomic RNA that has autonomous replication ability but cannot form particles into a modified hepatitis C virus genomic RNA that can form particles. .
  • NS5B is important to give autonomous replication ability and particle production ability, because NS5B mutation in the RNA sequence part of JFH1 strain eliminates HCV genomic RNA growth and HCV particle production stops. It is clear that.
  • HCV genomic RNA having no autonomous replication ability is not limited to these known virus types, and includes HCV genomic RNA having no autonomous replication ability.
  • the NS5B protein coding sequence according to the present specification is a coding sequence of NS5B protein (SEQ ID NO: 3) derived from the JFH1 strain, and has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 3 a coding sequence of NS5B protein derived from the JFH1 strain, and has the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence that can hybridize with the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 under stringent conditions is used in the present invention.
  • the stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is 300-2000 mM and the temperature is 40-75 ° C, preferably the sodium concentration is 600-900 mM and the temperature is 65 ° C.
  • the HCV genomic RNA according to the present invention has an RNA sequence part encoding NS3 to NS4, NS5A, NS5B proteins in the JFH1 HCV genomic RNA, or has an NS5B protein coding sequence.
  • the HCV genomic RNA of the present invention comprises 5 ′ untranslated region, core protein coding sequence, E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, NS2 protein on the genomic RNA of hepatitis C virus strain.
  • RNA comprising a coding sequence, NS3 protein coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, NS5B protein coding sequence, and 3 ′ untranslated region, and NS3 to NS4, NS5A and NS5B protein-encoding RNA, which is an RNA sequence part encoding NS3 to NS4, NS5A and NS5B proteins derived from JFHl HCV genomic RNA introduced exogenously .
  • NS5B protein coding sequence is RNA that is NS5B protein coding sequence derived from exogenously introduced JFHl HCV genomic RNA.
  • 5 ′ untranslated region (5 ′ NTR or 5 ′ UTR)”, “core protein coding sequence (core region or C region)”, ⁇ 1 protein coding sequence (E1 region) ”,“ E2 Protein coding sequence (E2 region), N2 protein coding sequence (NS2 region), NS3 protein coding sequence (NS3 region), NS4A protein coding sequence (NS4A region), NS4B protein coding sequence (NS4B region) ”,“ NS5A protein coding sequence (NS5A region) ”,“ NS5B protein coding sequence (NS5B region) ”, and“ 3 ′ untranslated region (3 ′ NTR or 3 ′ UTR) ”, and other specifics
  • This region or site is already known in various genotypes.
  • Each region or site for an unknown HCV strain can be easily determined by aligning the known full-length genomic RNA sequence of HCV and the full-length genomic RNA sequence of the HCV strain.
  • selective selection gene means a gene capable of imparting selectivity to a cell such that only the cell in which the gene is expressed is selected.
  • a common example of a selectable marker gene is an antibiotic resistance gene.
  • selection marker genes suitable in the present invention include neomycin resistance gene, thymidine kinase gene, kanamycin resistance gene, pyrithiamine resistance gene, adenylyltransferase gene, zeocin resistance gene, puromycin resistance gene, and the like. Neomycin resistance gene, thymidine kinase gene is preferred, A syn-resistance gene is further preferred.
  • the selection marker gene in the present invention is not limited to these.
  • the “reporter gene” means a marker gene that encodes a gene product that serves as an index of gene expression.
  • a common example of the Ribo Yuichi gene is the structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction.
  • Examples of reporter genes that are suitable in the present invention include chloramphenicol luciferyl transferase gene derived from transposon Tn9, jS dalcuronidase or jS galactosidase gene derived from E. coli, luciferase gene, green fluorescent protein gene, jellyfish-derived gene Ecolin gene, secretory placental alkaline phosphatase (SEAP) gene, and the like.
  • the reporter gene in the present invention is not limited to these.
  • One of the above selection marker genes and the reporter gene may be included in the levicon RNA, or both may be included.
  • One selective selection gene or reporter gene may be contained in the modified hepatitis C virus genomic RNA, or may be contained in two or more.
  • the HCV genomic RNA according to the present invention may further contain RNA that codes any foreign gene that is desired to be expressed in the cell into which the entire HCV genomic RNA is introduced. It may be linked downstream of the untranslated region or may be linked upstream of the 3 ′ untranslated region.
  • core protein code sequence E1 protein coding sequence, E2 protein coding sequence, NS2 protein coding sequence, NS3 protein coding sequence, NS4A protein coding sequence, NS4B protein coding sequence, NS5A protein coding sequence, and NS5B protein It may be inserted between any of the protein coding sequences.
  • HCV genomic RNA containing RNA encoding a foreign gene can express the gene product encoded by the foreign gene when translated in the introduced cell. Therefore, HCV genomic RNA containing RNA encoding a foreign gene can also be suitably used for the purpose of generating a gene product of a foreign gene in a cell.
  • the virus tongue as described above is used.
  • the sequence encoding the protein and the foreign gene are ligated so that they are translated from the HCV genomic RNA in the correct reading frame.
  • Proteins encoded by HCV genomic RNA are translated and expressed as a series of polypeptides, then cleaved into individual proteins by proteases and linked together via protease cleavage sites, etc. It is preferable to make it.
  • HCV genomic RNA containing the RNA sequence part encoding the NS3 to NS4, NS5A, NS5B proteins of the JFH1 strain produced in this way is introduced into an appropriate host cell.
  • Recombinant cells capable of autonomous autonomous replication that is, having the ability to replicate HCV genomic RNA
  • a recombinant cell capable of replicating HCV genomic RNA containing an RNA sequence part encoding NS3 to NS4, NS5A, NS5B proteins of JFH1 strain is referred to as "HCV genomic RNA replicating cell”.
  • Host cells for “HCV genomic RNA replicating cells” are not particularly limited as long as they can be subcultured, but are preferably eukaryotic cells, more preferably human cells, and human liver-derived cells. More preferably, it is a cell, a human cervix-derived cell, or a human fetal kidney-derived cell.
  • the cells are preferably proliferative cells including cancer cell lines and stem cell lines, and particularly preferably Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, or 293 cells. These cells may be commercially available, may be obtained from a cell depository, or may be cells established from any cell (for example, cancer cells or stem cells). Good.
  • Introduction of HCV genomic RNA into a host cell can be performed using any known technique.
  • Examples of such an introduction method include an electroboration method, a particle gun method, a lipofusion method, a calcium phosphate method, a microinjection method, a DEAE sepharose method, and the like, and a method using electroporation is particularly preferable.
  • HCV genomic RNA may be introduced singly or mixed with other nucleic acids. If you want to change the amount of HCV genome A introduced while keeping the amount of RNA to be introduced constant, mix the desired amount of HCV genomic RNA with the total cellular RNA extracted from the cells to be introduced. age, It may be used for intracellular introduction.
  • the amount of HCV genomic RNA used for intracellular introduction may be determined according to the introduction method used, but preferably 1 picogram to 100 micrograms, more preferably 10 picograms to 10 micrograms. To do.
  • HCV genomic RNA replicating cells can be performed according to any known RNA detection method. For example, for the total RNA extracted from cells, the introduced HCV genome Northern hybridization using a DNA fragment specific for RNA as a probe, or RT-PCR using primers specific to the introduced HCV genomic RNA can be used.
  • HCV protein is detected in the protein extracted from “HCV genomic RNA replicating cells”, it can be determined that the cells are replicating HCV genomic RNA.
  • Detection of HCV protein can be performed according to any known protein detection method.
  • an antibody against HCV protein to be expressed from the introduced HCV genomic RNA is reacted with the protein extracted from the cell.
  • a protein sample extracted from cells is blotted onto a nitrocellulose membrane, and anti-HCV protein antibody (for example, anti-NS3 specific antibody or anti-HC3 collected from a patient with hepatitis C). Serum) and then detecting the anti-HCV protein antibody.
  • the ability of HCV genomic RNA to replicate autonomously is, for example, transfection of target RNA into Huli7 cells, culturing the Huh7 cells, and extracted from the cells in the resulting culture.
  • the RNA can be confirmed by performing Northern plot hybridization using a probe that can specifically detect the introduced RNA.
  • Specific operations for confirming the autonomous replication ability are exemplified in the description of HCV protein expression confirmation, detection of HCV genomic RNA, and the like described in Examples of the present specification.
  • HCV genomic RNA replicating cells produced as described above are HCV viruses.
  • Particles can be produced in vitro. That is, HCV particles can be easily obtained by culturing the HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention in an appropriate medium and collecting virus particles produced from the culture (preferably culture medium). .
  • HCV genomic RNA replicating cells to produce virus particles can be confirmed using any known virus detection method.
  • the culture solution of cells that seem to produce virus particles was fractionated using a sucrose density gradient, and the density, HCV core protein concentration, and amount of HCV genomic RNA in each fraction were measured.
  • the density of the fraction in which the peaks of the protein and HCV genomic RNA match and the peak is detected is 0.25% NP40 (polyoxyethylene (9) octylphenyl ether [Polyoxyethylene (9) Oc tylp enyl Ether])), the density of the fraction is less than that of the same fraction (eg, 1.15 to 1.22 mg). It can be determined that it has.
  • HCV virus particles released into the culture medium can also be detected using, for example, an antibody against the core protein, E1 protein, or E2 protein. It is also possible to indirectly detect the presence of HCV virus particles by amplifying and detecting HCV genomic RNA contained in HCV virus particles in the culture medium by a method using specific primers. .
  • the HCV virus particles produced by the method of the present invention have the ability to infect cells (preferably HCV sensitive cells).
  • the present invention comprises culturing HCV genomic RNA replicating cells, and infecting other cells (preferably HCV sensitive cells) with virus particles in the obtained culture (preferably culture medium), hepatitis C
  • HCV-sensitive cells are cells having infectivity to HCV, and preferably liver cells or lymphocyte cells, but are not limited thereto. Specific examples of liver cells include primary liver cells, Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells, and 203 cells.
  • Lymphoid cells include Molt4 cells and HPB_Ma Examples thereof include, but are not limited to, cells and Daud i cells.
  • cells for example, HCV sensitive cells
  • HCV genomic RNA is replicated in the infected cells, and virus particles are formed.
  • virus particles By infecting cells with virus particles produced in the HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention, HCV genomic RNA is replicated in the cells, and virus particles can be further produced.
  • HCV viral particles produced in the HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention can infect animals that can be infected with HCV viruses such as chimpanzees and cause HCV-derived hepatitis.
  • the virus-containing solution is one or more of blood from HCV-infected patients, cultured cells of HCV-infected cells, and cells that produce HCV particles by recombinant gene technology and cell lysates. May come from.
  • the solution from which the residue has been removed can be concentrated to about 10 to 100 times using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 100, 0 0 to 5 0 0 and 0 0 0.
  • the solution containing HCV from which residues have been removed can be purified by combining the chromatography and Z or density gradient centrifugation described below in any order or independently.
  • Gel filtration chromatography is a quatographic support that preferably uses a cross-linked polymer of allyldextran and ⁇ , ⁇ '-methylenebisacrylamide as a gel matrix, and more preferably, Sephacry 1 (registered trademark) S — 300,.
  • Sephacry 1 registered trademark
  • HCV particles can be purified using Sepharose (registered trademark) or the like, and preferably SP Sepharose (registered trademark) as a cation exchange resin.
  • Affinity mouth-matography can purify HCV particles by using as a carrier a resin to which a substrate selected from heparin, sulfated cell mouth fine, lectin, and various dyes is preferably used as a ligand. it can. More preferably, Hi Trap He parin HP (registered trademark), Hi Trap B lue HP (registered trademark), Hi Trap B enz am idi ne FF (registered trademark), sulfated cell mouth fine,
  • HCV particles can be purified using a carrier in which LCA, ConA, RCA-120 and WGA are bound. Most preferably, HCV particles are purified using sulfated cell mouth fine as a carrier, and the ratio between the total protein content in the solution and the RNAcopy number of HCV is more than 30 times more precise before and after purification. It was made.
  • solutes that form density gradients preferably use cesium chloride, sucrose, Nycoden (registered trademark), and sugar polymers such as Ficoll (registered trademark) and Percoll (registered trademark). It can. More preferably, sucrose can be used.
  • sucrose can be used.
  • water or a buffer solution such as phosphate buffer solution, Tris buffer solution, acetate buffer solution, or glycine buffer solution can be preferably used.
  • the temperature during the purification is preferably 0 to 40 ° C, more preferably 0 to 25. C, most preferably 0 to 10 ° C.
  • the centrifugal force during purification by density gradient centrifugation is preferably 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 9 g, more preferably 5 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 , and most preferably 5 ⁇ 10.
  • purification methods such as are 4 ⁇ 5 X 10 5.
  • density gradient centrifugation and column chromatography may be combined in any order, but preferably a combination using density gradient centrifugation after purification by multiple column chromatography, and Preferably, the anion exchange column is followed by the affinity port
  • This is a combination of purifying fractions containing HCV particles obtained by using Matrixography using a density gradient centrifuge, and most preferably containing HCV particles obtained by a column using Q-Sepharose (registered trademark).
  • Q-Sepharose registered trademark
  • This is a combination of purifying fractions containing HCV particles obtained by further purifying the fraction using a column using sulfate cell mouth fine by density gradient centrifugation.
  • HCV genomic RNA is replicated with high efficiency. Therefore, HCV genomic RNA can be produced with high efficiency using the HCV genomic RNA replicating cells of the present invention.
  • HCV genomic RNA replicating cells are cultured, RNA is extracted from the culture (cultured cells and / or culture medium), and the isolated HCV genomic RNA is isolated and purified by electrophoresis. Can produce HCV genomic RNA.
  • the RNA thus produced contains the genomic sequence of HCV.
  • HCV genomic RNA replicating cells of the present invention can be suitably used for producing HCV proteins.
  • HCV protein can be produced by any known method.
  • HCV genomic RNA is introduced into a cell to produce a recombinant cell, the recombinant cell is cultured, and the resulting culture (culture The protein may be recovered from the cells and / or culture medium) by a conventional method.
  • HCV viral particles can be hepatocyte-directed. Therefore, a hepatocyte-directed viral vector can be produced using the HCV genomic RNA of the present invention.
  • This virus vector is preferably used for gene therapy.
  • an RNA encoding a foreign gene is incorporated into HCV genomic RNA, and the RNA is introduced into the cell to introduce the foreign gene into the cell. It can replicate in the vesicle and be further expressed.
  • the E1 protein coding sequence in the HCV genomic RNA, and the Z or E2 protein coding sequence are converted to the outer shell protein of viruses from other species, and then introduced into the cell to introduce the virus particles. By making it, it is possible to infect cells of various species with the RNA.
  • a foreign gene is further incorporated into the HCV genomic RNA, and the foreign gene is used as a cell-directed viral vector for expression in various cells depending on the directivity of the recombinant viral coat protein. Can be used.
  • the present invention provides a viral vector containing a foreign gene, which comprises inserting RNA encoding a foreign gene into HCV genomic RNA, introducing it into a cell, and culturing the cell to produce virus particles. It also relates to the method of manufacturing.
  • the present invention is directed to a hepatitis C vaccine or a HCV particle or a part thereof according to the present invention using an antigen, or a particle or a part thereof produced by recombination of a viral coat protein to change cell directivity. It also provides methods for producing vaccines against viruses used to recombine outer shell proteins.
  • HCV infection neutralizing antibodies are prepared using the HCV particles according to the present invention or a part thereof as an antigen, or using a particle or a part thereof produced by recombination of a virus outer shell protein to change cell directivity as an antigen. You can also
  • HCV-infected cells infected with the HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention or virus particles produced in those cells are, for example, substances that promote or suppress HCV replication, virus particle reconstruction, or virus particle release. It can also be used as a test system for screening (anti-C hepatitis virus substance). Specifically, for example, the cells are cultured in the presence of a test substance, and HCV genomic RNA or virus particles in the resulting culture are detected, and the test substance is a replica of levicon RNA or HCV genomic RNA or a virus. By determining whether to promote or inhibit the formation or release of particles, substances that promote or inhibit the growth of hepatitis C virus can be screened.
  • the detection of HCV genomic RNA in the culture is
  • the amount of HCV genomic RNA in the extracted RNA may be determined by measuring the amount, ratio, or presence.
  • Detection of virus particles in the culture may be to detect the amount, ratio or presence or absence of HCV protein contained in the culture solution.
  • HCV particles produced in the HCV genomic RNA-replicating cells of the present invention and HCV-sensitive cells can also be used as a test system for screening substances that promote or suppress the binding of HCV to cells. it can.
  • HCV-sensitive cells are cultured with HCV particles produced in the HCV genomic RNA replicating cells of the present invention in the presence of a test substance, and HCV genomic RNA or virus particles are detected in the resulting culture. Then, by determining whether or not the test substance promotes or suppresses HCV genomic RNA replication or virus particle formation, a substance that promotes or suppresses the growth of hepatitis C virus can be screened.
  • Such detection of HCV genomic RNA or virus particles can be performed according to the method described above or the examples described later.
  • the above test system can also be used for the production or evaluation of preventive, therapeutic or diagnostic agents for hepatitis C virus infection.
  • Substances that inhibit HCV growth and infection include, for example, organic compounds that directly or indirectly affect HCV growth and infection, or HCV by hybridizing to the target sequence of the HCV genome or its complementary strand. And antisense oligonucleotides that directly or indirectly affect the growth of HCV or the translation of HCV protein.
  • Examples of the various substances include substances obtained by using rational drug design or high-throughput screening (eg, isolated and purified enzymes).
  • HCV genomic RNA replicating cells can be used.
  • the RT-PCR fragment obtained by amplifying the virus RNA of JFH1 strain was cloned into pGEM-T EASY vec tor (Promega) and pGEMl-258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEMl 141-
  • the plasmid DNAs of 2367, PGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, pGEM5883-7003, PGEM6950-8035, pGEM7984-8892, pGEM8680-9283, pGEM9231-9634, and PGEM9594-9678 were obtained (Kato, T.
  • NS5B region base sequence: SEQ ID NO: 2, amino acid sequence: SEQ ID NO: 3
  • an amino acid motif GDD corresponding to the active center of RNA polymerase encoded by the region is mutated to GND was introduced to create a mutant plasmid clone pJFHl / GND.
  • the pJFHl / GND mutation mutant has a mutation in the amino acid sequence of the active site of NS5B protein coded to it, so that it can express the active NS5B protein necessary for replicating HCV RNA. Can not.
  • pJFHl / ⁇ ⁇ E2 was constructed by deleting the E2 region from the E1 region of JFH1.
  • the full length HCV cDNA of J6CF strain (GenBank Accession No. AF177036) and KH1 (Kato, T., et al, J. Med. Virol. 64 (2001) p334-339) different from JFH1 PJ6CF and pJCHl inserted into the downstream of the T7 RNA promoter sequence inserted into the plasmid were prepared.
  • PJCH1 / NS5B (j fhl) was prepared by replacing the NS5B coding region of pJCHl with NS5B of JFH1.
  • pJFHK pJFHl / GND JFHl / AEl-E2 pJ6CF, pJCHl and pJCHl / NS5B (j fhl) constructed as described above were each digested with the restriction enzyme Xbal.
  • 10 to 10 of each of these Xbal cleaved fragments were incubated with Mimg Bean Nuclease 20U (total reaction volume 50/21) at 30 ° C for 30 minutes.
  • Mimg Bean Nuclease is an enzyme that catalyzes a reaction that selectively degrades single-stranded parts in double-stranded DNA.
  • RNA synthesis is performed using the above Xbal cleaved fragment as it is as a cage, a levulincon RNA in which 4 bases of CUGA, which is a part of the Xbal recognition sequence, are added to the 3 'end is synthesized. Therefore, in this example, the Xbal fragment was treated with Mung Bean Nuclease to remove 4 bases of CUGA from the Xbal fragment. After this, the Mbal Bean Nuclease-treated solution containing the Xbal fragment was purified by protein removal according to a conventional method to purify the Xbal fragment from which the four bases of CUGA had been removed, and this was used as a truncated DNA.
  • RNA was synthesized in vitro from this cage DNA.
  • MEGAscript from Ambion was used, and reaction solution 20 1 containing vertical MA 0.5 to 1. was reacted at 37 ° C for 3 to 16 hours.
  • DNAse (2U) was added to the reaction solution and reacted at 37 ° C for 15 minutes, and then RNA extraction with acidic phenol was performed to remove vertical DNA.
  • HCV RNA synthesized from the above-mentioned caged DNA derived from pJFHl and pJFHl / GND was converted into rJFHK rJFHl / GND, r-fraction / ⁇ ⁇ E2, rJ6CF, rJCHl, and rJCHl / NS5B (j ihl ).
  • RNAs are rJFHl, RNA prepared by using the GenBank Accession No. AB047639 DNA as a saddle type, JFH1 / GND, GenBank Accession No. AB047639, with the 8618th G substituted by A as a saddle type
  • the prepared RNA, rJFHl / ⁇ E1-E2 was prepared by using the DNA sequence 989-2041 of GenBank Accession No. AB047639 as a truncated 1) 1 ⁇ , 1 "; [6? Is 66118 & 111 ⁇ 633 101 ⁇ 0.
  • RNA prepared from the DNA of AF 177036 as a saddle, rJCHl is RNA prepared from the DNA of GenBank Access ion No.
  • rJCHl / NS5B (j flil) is the DNA from GenBank Accessions No. AB047640 It is possible to confirm the nucleotide sequence of RNA that was produced by ligating DNA from the sequence ⁇ 3866 and the DNA sequence 3867-9678 of GenBank Accession No. AB047639 using the restriction enzyme Avrl l site. it can.
  • Example 2 HCV genome RNA replication cells and virus particle production in cells 1. HCV genome replication and virus particle production in cells
  • RNA was introduced into Huh7 cells by the electroporation method. After electroporation treatment of Huh7 cells in a culture dish and culturing for 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, the cells are collected, RNA is extracted from the cells, and the Northern plot method is used. Analyzed. Northern blot analysis was performed according to the description of the Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) by Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2nd edition ion, J. Saibrook, EF Fritsch, T. Maniat is. It was.
  • RNA extracted from the cells was subjected to denatured agarose electrophoresis, and after completion of the electrophoresis, the RNA was transferred to a positively charged nylon membrane.
  • the 32P-labeled DNA or RNA probe prepared from pJFHl is hybridized to the RNA transferred to the membrane as described above, and then the membrane is The HCV genome-specific RNA band was detected by washing and exposing it to film.
  • the introduced RNA band could be confirmed as a weak signal after 4 hours of transfusion, but the signal attenuated over time, and 24 hours Later, almost no band signal could be confirmed.
  • Proteins were extracted over time from cells transfected with rJFHl or rJFHl / GND RNA by conventional methods, and analyzed by SDS-PAGE and Western blotting.
  • the cell extract obtained by transiently transfecting expression plasmid DNA containing NS3, NS5A, Core or E2 gene into Huh7 cells was used as a positive control (NS3 protein).
  • protein extracted from non-transfected Huh7 cells served as a negative control. What is the protein sample extracted from each cell clone? ⁇ 0 Membrane (1 ⁇ 0 1011-?, Manufactured by Millipore) blotted and anti-NS3-specific antibody (distributed by Dr.
  • anti-NS5A specific antibody (the NS5A region of JFH1 was inserted into an expression vector and prepared using DNA immunization in mice), anti-Core specific antibody (clone 2H9 antibody), anti E2-specific antibody (JFH1 E2 region) GTTTVGGAVARSTN (SEQ ID NO: 4) and CDLEDRDRSQLSPL (SEQ ID NO: 5) peptides were synthesized using two synthetic peptides to immunize Usagi), and NS3 and NS5A encoded by JFH1 RNA using , Core and E2 proteins were detected.
  • an anti-actin antibody was used to detect an actin protein.
  • NS3, NS5A, Core and E2 proteins can be detected 24 hours after transfection, and the expression level increases over time. Was confirmed.
  • NS3, NS5A, Core, and E2 proteins are not detected in cells transfected with rJFHl / GND or in non-transfected Huh7 cells, and ⁇ transfected rJFHl replicates autonomously. These proteins were found to be expressed.
  • rJFHK rJFHl / GND, rJFHl / ⁇ ⁇ ⁇ E2, rJ6CF and rKHl were seeded in culture dishes with Huh7 cells transfected with electroporation for 2 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours
  • the HCV Core protein in the culture solution after culturing was measured. The measurement was performed using the HCV antigen IRMA test (Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37 (1999) p. 1802-1808).
  • the core protein was detected in the culture solution 48 to 72 hours after rJFHl transfection.
  • no HCV Core protein was detected in the culture medium of cells transfected with rJFHl / GND, rJ6CF and rJCHl, but a small amount was found in the culture medium of cells transfected with rJFHl / ⁇ ⁇ -E2.
  • HCV Core protein was detected.
  • rJFHl / GND, rJ6CF and rJCHl cannot replicate autonomously in Huh7 cells, and rJFHl and rJFHl / ⁇ E1-E2 can replicate autonomously in Huli7 cells. Therefore, autonomous replication of the introduced HCV RNA is indispensable for the release of the Core protein, and a stable and large amount of It was shown that El and E2 are required to release Core protein out of the cell.
  • sucrose solution dissolved in 50 mM Tris pH7.5 / 0.1M NaCl / lniM EDTA 2 ml, 50% sucrose solution lml, 40% sucrose solution lml, 30% sucrose solution lml, 20% sucrose solution lml, 1ml of 10% sucrose solution was overlaid on a centrifuge tube, and 4ml of the sample culture supernatant was overlaid.
  • replicon RNA contained in RNA extracted from cells is PCR amplified using the following synthetic primer and EZ rTth RNA PCR kit (Applied Biosystems), and then ABI Prism 7700 seauence detector system (Applied Biosystems) Detected.
  • R6-130-S17 5'-CGGGAGAGCCATAGTGG-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • TaqMan Probe R6-148-S21FT: 5 '-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (SEQ ID NO: 8)
  • the peaks of Core protein and HCV RNA matched at 1.17 mg / nil fraction.
  • the density of this fraction was about 1.17 mg / ml, which was a lighter specific gravity than previously reported core protein / nucleic acid conjugates. If the core protein and HCV RNA present in the 1.17 mg / ml fraction form an HCV particle structure, it is considered resistant to nucleases. Therefore, after transfection of JFH1, the culture solution after 6 days was treated with 10 g / ml RNAse A for 20 minutes, and then sucrose density Fractionated by gradient.
  • HCV RNA was degraded, and the peaks of Core protein and HCV RNA were detected in the 1.17 mg / ml fraction as in the case of RNase A untreated. That is, it was confirmed that the Core protein and HCV RNA present in the 1.17 ing / ml fraction formed an HCV particle-like structure.
  • HCV RNA can be detected in cells and in the culture medium even if the same study is performed using the culture medium obtained by transfecting rJFHl / ⁇ ⁇ 1- ⁇ 2 into Huh7 cells. There wasn't.
  • the HCV particles secreted into the culture medium have the ability to infect, and further amplify HCV RNA in the infected cells to generate new HCV It has been confirmed that it has the ability to produce particles.
  • rJCHl / NS5B (j fhl) By transfecting rJCHl / NS5B (j fhl) to Huli7 cells, whether or not HCV particles are secreted into the culture medium and the secreted HCV particles are sensitive. It was examined whether there was dyeing.
  • rJCHl / NS5B (jfl) 3 ⁇ 4 After transfection into Hu 7 cells, concentrate the culture solution 6 days later using the method described in 5. Then, in the presence of this culture solution, add Huli7 that has not been transfected with RNA. After culturing and quantifying the amount of HCV RNA in the cells over time, the amount of HCV RNA in the cells increased over time from 12 hours after the start of culture (FIG. 7A;).
  • Huh7 without RNA transfection was cultured on a 15-mni cover slip, and the cells were immunostained with anti-core antibody 48 hours after culturing in the presence of the concentrated culture medium. When the infected cells were counted, the infected cells were confirmed as shown in Fig. 7B. From these results, by transfecting rJCHl / NS5B (jfl) into Huli7 cells, HCV particles secreted in the culture medium acquire infectivity and further amplify HCV RNA in the infected cells. Have been shown to have the ability to produce new HCV particles.
  • HCV genotypes lb Con-1 strain and chimeric HCV RNA containing NS5B part of JFH-1 are transferred to Huh7 cells to secrete HCV particles in the culture medium or secreted HC V We examined whether the particles were infectious.
  • the sequence of gene numbers 1 to 1026 of the HCV genotype lb Con-1 strain was ligated downstream of the 5 'UTR of JFH-1 strain, Downstream of this, we constructed a construct in which the region from 1031 to 3030 (NS3 to NS5b) of the JFH-1 strain was linked, and further, the 3 'UTR of the JFH-1 strain was linked downstream of it.
  • rConl / C-NS2 / JFH-1 chimeric HCV RNA was prepared by the method described in Example 1, 2 and RNA was transfected into Huh7 by the method described in Example 2, 1. .
  • the RT-PCR fragment obtained by amplifying the virus RNA of JFH-1 strain was cloned into pGEM-T EASY vec tor (Promega) and pGEM 258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323,
  • the plasmid DNAs of pGEMl 141-2367, GEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, PGEM5883-7003, pGEM6950-8035, pGEM7984-8892, PGEM8680-9283, pGEM9231-9634 and pGEM9594-9678 were obtained (Kato et al., Gas t roenterology, (2003) 125: ⁇ .
  • the cDNAs derived from viral genomic RNA contained in each plasmid were joined together using PCR and restriction enzymes, and the full-length viral genomic cDNA was cloned. A T7R RNA promoter sequence was inserted upstream of the full-length viral genome.
  • the plasmid DNA constructed in this way is hereinafter referred to as pJFHl.
  • the preparation of the above JFH-1 clone is described in JP-A No. 2002-171978 and Kato et al. (Kato et al,, J. Med. Vi rol., (2001) 64 (3):. 334-339). It has been done.
  • the base sequence of the full-length cDNA of JFH-1 clone is registered under the accession number: AB047639 of the International MA Design Bank (DDBJ / EMBL / GenBank). Yes.
  • EMCV-IRES encephalomyocarditis virus internal ribosome binding site
  • neomycin resistance gene neo; neomycin phosphotransferase gene
  • the JFH1 strain is an HCV derived from the HCV2a type, but the TH strain derived from the HCVlb type (Waki ta et al., J. Biol. Chem., (1994) 269, p. 14205-14210, and Moradpour et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 246, p. 920-924) was used to prepare a chimeric HCV vector.
  • Genomic RNA ( ⁇ 3748) is shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively.
  • “5 ′ untranslated region” is 1 to 340
  • “core protein coding sequence” is 341 to 913
  • “E1 protein coding sequence” is 914 -1489
  • “E2 protein coding sequence” is 1490-2590
  • “NS2 protein coding sequence” is 2780-3430
  • “NS3 protein coding sequence” is 3431-5323
  • “NS4A protein coding sequence” is 5324- 5486
  • “NS4B protein coding sequence” corresponds to 5487-6268
  • “NS5A protein coding sequence” corresponds to 6269-7663
  • “NS5B protein coding sequence” corresponds to 7664-9442.
  • the expression vector PFGREP-TH / JFH1 constructed as described above was cleaved with the restriction enzyme Xbal. Then, 10-20 zg of these Xbal cleaved fragments were contained in 50 1 reaction solution, and 30 minutes at 30 using Mimg Bean Nuc lease 20 U. Further processing was done by incubating.
  • Mimg Bean Nuc lease is an enzyme that catalyzes a reaction that selectively degrades a single-stranded portion of double-stranded DNA.
  • RNA synthesis is performed using the above Xbal cleaved fragment as it is as a cage, a levicon RNA is synthesized in which 4 bases of CUGA, which is part of the Xbal recognition sequence, are added to the 3 'end. Therefore, in this example, the 4 bases of CUGA were removed from the Xbal cleavage fragment by treating the Xbal cleavage fragment with Mimg Bean Nuclease. After this, the Mbal Bean Nuc lease-treated solution containing the Xbal fragment was purified by purifying the Xbal fragment from which 4 bases of CUGA had been removed by protein removal according to the usual method. did.
  • RNA was synthesized in vitro from this caged DNA using T7 RNA polymerase.
  • a MEGAscript from Ambion was used for this RNA synthesis.
  • RNA synthesized from the above-mentioned caged DNA derived from pFGREP-TH / JFH1 in this way was named rFGREP-TH / JFH1.
  • the base sequence of the chimeric HCV genomic RNA in this rFGREP-TH / JFH is shown in SEQ ID NO: 11.
  • rFGREP-TH / JFH1 is an example of the full-length chimeric HCV replicon RNA in the present invention.
  • Full length chimeric HCV genomic RNA (rFGREP-TH / JFHl) synthesized as described above was mixed with total cellular RNA extracted from Huh7 cells in various amounts to prepare a total RNA amount of 10. Subsequently, the mixed RNA was introduced into Huh7 cells by the electroporation method. G418 was added at various concentrations after 16 to 24 hours of culture. The culture was continued twice a week while changing the culture medium. After culturing for 21 days, viable cells were stained with crystal violet. Count the number of colonies stained and transfer RNA The number of colonies obtained per weight was calculated. In some culture dishes, the colonies of viable cells were cloned and the culture was continued.
  • rFGREP-TH / JFHl was transfected into Huh7 cells, and the culture supernatant of the established full-length chimeric HCV replicon RNA-replicating cell clone was recovered, and the culture supernatant was further added to uninfected Huh7 cells. Then, virus particles in the culture supernatant were infected to Huh7 cells. On the day after infection, 0.3 mg / ml of G418 was added to the culture solution of Huh7 cells infected, and further cultured for 21 days.
  • Figure 11 shows the distribution of HCV particles in each fraction by gel filtration chromatography.
  • the gel carriers used are Cefacryl® S 300, S 400 and S 500.
  • the solution containing HC V particles used for column chromatography was purified using column chromatography containing each gel carrier. In the purification, 10 mM Tris hydrochloride, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid and 100 mM sodium chloride (pH 8.0) were used as buffers.
  • Cefacryl® S-300 HCV particles were obtained in a flow-through fraction called “Void fraction”.
  • Cefacryl registered trademark
  • Cefacryl® S-400 and S-500 can be separated from other molecular weight proteins because HC V particles are in the fraction eluted according to molecular weight.
  • Figure 12 shows the distribution of HCV particles in each fraction by ion exchange chromatography.
  • the gel carriers used are SPSepharose HP (registered trademark) and QsepharoseHP (registered trademark).
  • the column was equilibrated with 50 mM citrate buffer (pH 6.2). Fractionation After adding a solution containing HCV particles concentrated with an ultrafiltration membrane with a molecular weight of 100,000 to 500,000 and diluted with 50 mM citrate buffer (pH 6.2) to the column, 50 mM A citrate buffer (pH 6.2) was applied to the column about 10 times the column volume. Next, 50 mM citrate buffer (PH 6.2) supplemented with 0.1 M NaCl, 0.3 M NaCl, or 1 M NaCl, respectively, was flowed in order about 3 times the column volume.
  • the column was equilibrated with 50 mM Tris—HC 1 buffer (pH 8.0). Add a solution containing HCV particles concentrated with an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off from 100,000 to 500,000 and diluted with 50 mM Tris-HC 1 buffer (pH 8.0) to the column. Thereafter, 50 mM Tris—HC 1 buffer (pH 8.0) was applied to the column about 10 times the column volume. Next, add 50 mM Tris—HC 1 buffer (pH 8.0) containing 0.1 M NaCl, 0.3 MN aCl, or 1 M NaCl, respectively, in order of about 3 times the column volume. Washed away.
  • Figure 13 shows the distribution of HCV particles in each fraction obtained by lectin affinity chromatography.
  • the lectin affinity chromatography used a carrier in which RCA-120, ConA, LCA and WGA were bound.
  • phosphate buffered saline For Con A, L CA, and WGA affinity mouthmatography, the column was equilibrated with phosphate buffered saline. A solution containing HCV particles, concentrated using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut-off of 10,000 to 500,000 and diluted with phosphate buffered saline, was added to the column, and then phosphate buffered saline. Was passed through the column about 10 times the column volume. Next, phosphate buffered saline supplemented with 0.35 M lactose was passed through about 3 times the column volume. Thereafter, phosphate buffered saline supplemented with 0.5 M lactose was flowed about 5 times the column volume.
  • phosphate buffered saline For RC A- 1 20 affinity mouthmatography, the column was equilibrated with phosphate buffered saline. A solution containing HCV particles concentrated with an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off from 100, 00 to 50 00, 00 and diluted with phosphate buffered saline is added to the column, and then phosphate buffered saline Was passed through the column about 10 times the column volume. Next, phosphate buffered saline with 0.38 M lactose added was passed through about 3 times the column volume. Thereafter, phosphate buffered saline containing 0.38 M lactose was flowed about 5 times the column volume.
  • the column was equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). After adding a solution containing HCV particles concentrated with an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off from 100,000 to 500,000 and diluted with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to the column, phosphate Buffer solution (pH 7.0) was passed through the column about 10 times the column volume. Next, 20 mM phosphate buffer (PH 7.0) supplemented with 0.1 M, 0.3 M, 0.5 M, or 1 M NaCI was flowed in order about three times the column volume. Thereafter, 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to which 1 M NaCl was added was allowed to flow about 5 times the column volume.
  • 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to which 1 M NaCl was added was allowed to flow about 5 times the column volume.
  • a carrier in which C ib a clon B l ue F 3 G—A was bound to agarose particles was used for the column.
  • the column was equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0). After adding a solution containing HCV particles concentrated with an ultrafiltration membrane with a molecular weight cut off from 100,000 to 500,000 and diluted with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to the column, phosphate Buffered saline was passed through the column about 10 times the column volume. Subsequently, 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to which 1 M or 2 M NaCl was added was flowed in order about 3 times the column volume.
  • HCV particles were purified by combining column chromatography and sucrose density gradient centrifugation with reference to the above examples.
  • HCV particles were purified using QS epharose HP (registered trademark).
  • the column was equilibrated with 50 mM Tris—HC 1 buffer (pH 8.0).
  • 50 mM Tris-HC 1 buffer (pH 8.0) was applied to the column about 10 times the column volume.
  • HCV particles were purified using sulfated cellulophine chromatography.
  • the column was equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0).
  • the fraction containing HCV particles purified using QS epharose HP_ (registered trademark) was concentrated using an ultrafiltration membrane with a fractional molecular weight of 1 0, 0 0 0 to 5 0 0, 0 0 0 2
  • a solution containing HCV particles diluted with 0 mM phosphate buffer (PH 7.0) was added to the column, and then phosphate buffer (PH 7.0) was passed through the column about 10 times the column volume.
  • HCV particles were gathered around a specific gravity of about 1.2. I took it. In the collected fraction, the ratio of the total amount of HCV core protein Z protein was 1.69 compared to the HCV particles before column purification, and the ratio of HCV particles to the total protein increased.
  • the fraction containing HCV particles purified by sucrose density gradient centrifugation was purified to about 120 times the ratio of the total amount of HCV core protein Z compared to before the start of purification.
  • the final fraction contained 10 9 copies / mL of HCV particles.
  • virus particles of HCV strains of various genotypes can be produced in a cultured cell system. That is, for HCV strains that do not have autonomous replication capacity in vitro, such as HCV strains isolated from patients, the RNA sequence part encoding NS3 to NS4, NS5A, and NS5B proteins can be transferred from NS3 to NS4, NS5A of JFH1. By substituting the NS5B protein for the RNA sequence part that codes, HCV particles can be produced by autonomous replication in a cultured cell system.
  • the HCV particles purified by the present invention can be directly used as a vaccine for medical use.
  • the HCV genomic RNA and virus particles provided by the present invention can also be used as a viral vector for foreign genes.
  • the method of the present invention can also be used as a research system for HCV infection processes and as a screening system for various substances that affect the HCV infection process. Sequence listing free text ⁇
  • SEQ ID NO: 1 RNA partial sequence (cDNA sequence) encoding NS3, NS4, NS5A, and NS5B proteins of JFH1 strain
  • SEQ ID NO: 4 Synthetic peptide designed based on JFH1 E2 region
  • SEQ ID NO: 5 Synthetic peptide designed based on JFH1 E2 region
  • SEQ ID NO: 6 Primer (R6- 130- S17)
  • SEQ ID NO: 7 Primer (R6-290-R19)
  • SEQ ID NO: 8 Ta Man probe (R6-148-S21FT)
  • SEQ ID NO: 9 Full length genomic RNA of HCV JFH1 strain (JFH-1 clone)
  • SEQ ID NO: 10 Partial genomic RNA containing a part of NS3 region from 5 'untranslated region of HCVTH strain (1-3748)
  • SEQ ID NO: 11 Chimeric HCV genomic RNA composed of genomic RNA of HGV JFH1 strain (JFH-1 clone) and genomic RNA of HCV TH strain

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Abstract

　本発明は、２種以上のＣ型肝炎ウイルスのゲノムRNAの、5'非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列、及び3'非翻訳領域を含む塩基配列からなり、かつ自律複製能を有する、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAを提供する。特に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムRNAのNS3からNS4、NS5A、NS5Bタンパク質をコードするRNA配列部分を、配列番号１で示されるJFH1株のNS3、NS4、NS5A、及びNS5Bタンパク質をコードするRNA部分配列に置換することにより、自律複製能を獲得した、改変されたＣ型肝炎ウイルスゲノムRNAに関する。

Description

明 細 書 自律複製能を有する改変されたヒト C型肝炎ウィルスゲノム RNA 技 術 分 野
本発明は、 各種遺伝子型のヒト C型肝炎ウィルス （HCV) を培養細胞系で 自律複製させる方法と、 そのための改変 HCV ゲノム RNA、 及び該 HCVゲノ ム RNA複製細胞に関する。 背 景 技 術
近年の研究により、 C型肝炎ウィルスは遺伝子型又は血清型により多数 の型に分類されることが分かってきた。 現在主流の HCV遺伝子型分類法で ある、 Si腿 onds らによる HCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、 HCV は遺伝子型 la、 遺伝子型 lb、 遺伝子型 2a、 遺伝子型 2b、 遺伝子型 3a、 遺 伝子型 3bの 6タイプに分類され （非特許文献 1 )、 さらにそれら各タイプ がいくつかのサブタイプに分類される。 そして、 HCV の複数の遺伝子型に ついてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている （特許文献 1、 及び 非特許文献 2〜 4 )。
HCV は持続的に感染することにより慢性肝炎を引き起こす。 現在、 世界 的規模で認められる慢性肝炎の主たる原因が HCV持続感染である 、。 実際、 持続感染者の 5 0 %程度が慢性肝炎を発症し、 そのうち約 2 0 %の患者が 1 0年〜 2 0年を経て肝硬変に移行し、 さらにその一部は肝癌といった致 死的な病態へと進展する。
C型肝炎に対する現在の主な治療は、 インターフェロン一 0!、 インター フエロン一 i3、 及びインターフェロン一 αとプリン一ヌクレオシド誘導体 であるリバビリンとの併用療法により行われている。 しかしながら、 これ らの治療を行っても、全治療者の約 6 0 %に治療効果が認められるだけで、 効果が出た後.に治療を中止すると半分以上の患者が再燃する。 インターフ ェロンの治療効果は、 HCV の遺伝子型と関連することが知られており、 遺 伝子型 lbに対しては効果が低く、 遺伝子型 2aに対してはより効果が高い と言われている （非特許文献 5 )。 また、 遺伝子型により、 HCV が有するプ 口テア一ゼの基質特異性が異なり、遺伝子型 l b の NS3プロテア一ゼを用 いて開発した阻害薬は、 他の遺伝子型の NS3プロテアーゼについては、 そ の阻害活性が 5 0倍以上悪くなる （非特許文献 6 )。 従って、 効率の良い HCV 治療薬を開発するためには、 HCV の各遺伝子型での反応性を確認しな がら、 開発を行う必要がある。
最近になって、 HCV由来の自律複製能を有する RNAとして、 HCVサブゲノ ム RNAレブリコンが作製されたことにより （特許文献 2、 3、 及び非特許 文献 7〜 9 )、培養細胞を用いて HCVの複製機構を解析することが可能とな つた。 これらの HCVサブゲノム RNAレブリコンは、 HCVゲノム RNAの 5'非 翻訳領域中の HCV IRESの下流に存在する構造タンパク質を、ネオマイシン 耐性遺伝子及びその下流に連結した EMCV- IRESによって置換したものであ る。 この RNAレブリコンは、 ヒト肝癌細胞 Huli7に導入してネオマイシン存 在下で培養することにより、 Huh7細胞内で自律複製することが証明された。 さらに一部の HCVサブゲノム RNAレブリコンは、 Huh7に限らずヒト子宮頸 部癌細胞 HeLa、 ヒト肝癌細胞 HepG2などの細胞内でも自律複製することが 証明された （特許文献 3 )。
しかしながら、 このような HCVの細胞内 RNA複製系は、 未だ限られた遺 伝子型についてのもの、というよりはむしろ、限られた HCV株のゲノム RNA を用いたものしか作製されていない。 従って、 数多くの遺伝子型が存在す る HCVについて、 開発した HCV治療薬の遺伝子型の違いによる治療効果の 違いを検討することは極めて困難である。 また、 RNA レブリコンは、 HCV ウィルスの増殖複製過程における、 ウィルス RNA複製のみ評価可能な実験 系であり、 HCV ウィルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、 さ らに新たな細胞への感染という過程を評価することはできない。
現在、 HCV ウィルス粒子の形成と細胞外への放出、 さらに新たな細胞へ の感染という過程を評価する方法は、 チンパンジーなどの動物を用いた実 験系に限られる （非特許文献 1 0 )。 しかしながら、 動物という生体をその まま用いた実験系は、 操作が煩雑で解析が極めて困難である。従って、 HCV ウィルス粒子の感染細胞内での形成と細胞外への放出、 さらに新たな細胞 への感染という過程の解析や、 これらの過程の阻害を作用メカニズムとし た抗 HCV薬の開発には、 これらの過程を再現できる極めて単純化された実 験系、 すなわち、 培養細胞系を用いた HCVウィルス粒子の複製系を構築す る必要がある。
. また、培養細胞系による安定した HCV ウィルス粒子の供給が可能になれ ば、 ウィルスを弱毒化したり、 分子生物学的手法を用いて非感染性の HCV ウィルスを作製して、 ワクチンに利用することもできる。 しかしながら、 HCVは遺伝子型によりタンパク質の配列が異なるため、 HCVの抗原性も遺伝 子型ごとに異なる。 実際、 多様な遺伝子型の存在は HCVワクチンの生産に おける大きな障害となっている （非特許文献 1 1 )。 従って、 効率の良い HCVワクチンの生産のためにも、 培養細胞系による、 各遺伝子型の HCV ゥ ィルス粒子の安定した生産が望まれる。
HCVは、 55〜65 nmの球状粒子であり H C V感染患者の血中に存在するこ とが知られている。 ヒト血清中に存在する H C Vを精製する方法として、 レクチンを用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィ （非特許文献 1 2 ) 及 びへパリンを用いたクロマトグラフィ（非特許文献 1 3 )が知られている。 しかし、 これらの方法では、 およそ 1 Mコピー/ mL程度の濃度で 1 mLに満 たない量のウィルスしか精製できないことから、 工業的な利用には全く結 びつかない。
HCV 以外でウィルス粒子を精製する方法が現在までに複数発明されてい る （例えば特許文献 4、 5、 及び 6 )。 しかし、 これらの文献をみてわかる ようにウィルス粒子の性質は様々であり、 ヒト C型肝炎ウィルスの精製に 至適である方法についてなんら参考になる情報を与えない。 また、 同じ肝 炎ウィルスであるヒト A型肝炎ウィルスについて特許文献 7において、 陰 イオン交換クロマトグラフィにより D N Aを除去することによりヒト A型 肝炎ウィルスを精製することができることを開示している。 しかし、 肝炎 ウィルスであっても A型は D N Aを遺伝子としてもつウィルスであり、 C 型は R N Aを.遺伝子としてもつウィルスであることからもわかるように全 く類似点はなく、精製する方法についてなんら参考になる情報を与えない。 今後、 ヒト C型肝炎ウィルス粒子をワクチンなどに工業的に用いるために は大量かつ高度に精製する必要があることから、 精製方法の開発が待たれ ている。
[特許文献 1]
特開 2 0 0 2— 1 7 1 9 7 8号公報
· [特許文献 2]
特開 2 0 0 1— 1 7 1 8 7号公報
[特許文献 3]
WO 2 0 04/1 041 9 8A 1
[特許文献 4]
特許 3 3 1 3 1 1 7号
[特許文献 5]
特表 2 0 0 2— 5 0 3484号
[特許文献 6 ]
特表 2 0 0 0— 5 1 0 6 8 2号
[特許文献 7]
特公平 6-48980
[非特許文献 1 ]
Si匪 onds, P. et al. , Hepatology, 10 (1994) pl321-1324
[非特許文献 2] .
Choo, Q. L et al. , Science, 244 (1989) p359-362, - [非特許文献 3]
Okamoto, H et al. , J. Gen. Virol., 73 (1992) p673-679
[非特許文献 4]
Mori, S. et al Bioc em. Biophis. Res. Co匪 un. 183 (1992) p334-342) [非特許文献 5]
Yoshioka, K. et al., Hepatology, 16 (1992) p293-299
[非特許文献 6 ]
Thibeault, D. et al., J.Virol., 78 (2004) p7352-7359 t
[非特許文献 Ί ]
Blight et al., Science, 290 (2000) pl972-1974 [非特許文献 8 ]
Friebe et al., J. Virol. , 75 (2001) pl2047-12057
[非特許文献 9 ]
Kato, T. et al. , Gastroenterology , 125 (2003) pl808-1817
+ [非特許文献 1 0]
Kolykhalov et al., Science, 277 (1997) p570-574
[非特許文献 1 1 ]
Farci, P.， et al. , Semin Liver Dis 20 (2000) pl03-126
[非特許文献 1 2]
Virology, 196 (1993) p354-357
[非特許文献 1 3]
Journal of General Virology 86 (2005) p677-685 発 明 の 開 示
本発明の課題は、 各種遺伝子型の C型肝炎ウィルスを培養細胞系で複製 増幅するための方法を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、 自律複製能を有 する HCV JFH1株のゲノム RNAと、 in vitroで自律複製能を有しない HCV 株のゲノム RNAとを組み合わせた改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNA を作製し、 これが培養細胞系で自律複製可能なことを見出した。 具体的に は前記発明は、 JFH1株の NS3タンパク質コード配列から 3' 末端までのゲ ノムを導入することにより、 in vitroで自律複製能を有しない HCVゲノム RNAを培養細胞系で自律複製可能な RNAに改変しうることを見出した。 すなわち、 本発明は、 2種以上の C型肝炎ウィルスのゲノム RNAの、 5' 非翻訳領域、 core タンパク質コード配列、 E1 タンパク質コード配列、 E2 タンパク質コード配列、 p7タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード 配列、 ならびに JFH1株の NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5Bの各タンパク質コ ード配列、 及び 3'非翻訳領域を含む塩基配列からなり、 かつ自律複製能を 有する、 改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAに関する。
具体的には、 本発明は 1つの実施形態として、 C型肝炎ウィルスゲノム RNAの NS3タンパク質コード配列から 3'末端までのゲノム配列 NS5Bタンパ ク質コード配列が配列番号 1に示される JFH1株の NS3、 NS4、 NS5A、 及び NS5B タンパク質をコードする RNA 部分配列 （Genbank Access ion No. AB047639の DNA配列 3867-9678で示される配列の Tを Uに置換した i 配 列） に置換され、 かつ自律複製能を有する、 改変された C型肝炎ウィルス ゲノム RNAを提供する。
さらに別な実施形態として、 C型肝炎ウィルスゲノム RNAの NS5Bタンパ ク質コード配列が配列番号 2で示される JFH1株の NS5Bタンパク質コード 配列に置換され、 かつ自律複製能を有する、 改変された C型肝炎ウィルス ゲノム RNAを提供する。
2種以上の C型肝炎ウィルスとしては、 遺伝子型 lb及び遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスを用いることが好ましレ^遺伝子型 lbのウィルス株とし ては、 HCV-conl株、 HCV- TH株、 HCV- J株、 HCV- JT及び HCV- BK株を挙げる ことができ、 また遺伝子型 2aのウィルス株としては、 HCV - J6株、 HCV-JFH1 株、 及び HCV-JCH1株を挙げることができる。
本発明の改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAは、 さらに、 少なくと も 1つの選択マーカ一遺伝子及びノ又は少なくとも 1つのリポーター遺伝 子と、 少なくとも 1つの IRES配列とを含んでいてもよい。
この場合、 前記 5'非翻訳領域、 少なくとも 1つの選択マーカー遺伝子及 び 又は少なくとも 1つのリポーター遺伝子、少なくとも 1つの IRES配列、 coreタンパク質コード配列、 E1 タンパク質コード配列、 E2タンパク質コ ード配列、 p7タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3夕 ンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード 配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列、 及び 3' 非翻訳領域は、 5'から 3'方向へこの順番で改変された C型肝炎ウィルスゲ ノム RNAに含まれる。
本明細書では、 この改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAの一例とし て、
(a) 配列番号 11に示す塩基配列からなる RNA、 又は
(b) 配列番号 11に示す塩基配列において 1又は複数個、好ましくは 1 0 0 個、 より好ましくは 5 0個、 さらに好ましくは 1 0個の塩基が欠失、 置換 又は付加された塩基配列からなる RNAを含み、 自律複製能及び C型肝炎ゥ ィルス粒子産生能を有する、 改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAを挙 げることができる。
本発明はまた、 本発明の改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAを導入 され、 該 C型肝炎ウィルスゲノム RNAを複製しかつウィルス粒子を産生し うる細胞を提供する。 ここで、 宿主細胞は増殖性細胞であることが好まし く、 特に、 真核細胞、 例えば、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY- N9細胞、 HeLa 細胞、 又は 293細胞等のヒト肝由来細胞、 ヒト子宮頸由来細胞、 又はヒト 胎児腎由来細胞が好ましい。
本発明は、 前記細胞を培養し、 培養物中からウィルス粒子を回収するこ とを特徴とする、 C型肝炎ウィルス粒子の製造方法、 及び該方法によって 製造される C型肝炎ウィルス粒子も提供する。
本発明はまた、 前記細胞を培養し、 培養物中のウィルス粒子を他の細胞 に感染させることを特徴とする、 C型肝炎ウィルス感染細胞の製造方法、 及び該方法によって製造される C型肝炎ウィルス感染細胞も提供する。 本発明は、 カラムクロマトグラフィ及び Z又は密度勾配遠心を用いて HCV 粒子を精製することにより工業的に医薬に用いることが可能な精製度をも つ HCV粒子を得ることができる。 その際に用いるカラムクロマトグラフィ が、 イオン交換クロマトグラフィ、 ゲル濾過クロマトグラフィ.、 及びァフ ィニティ一クロマトグラフィから選ばれるひとつ又は複数のクロマトダラ フィであり、 密度勾配遠心を、 塩化セシウム、 ショ糖及び糖重合体のより 選ばれるひとつ又は複数の溶質を含んだ溶媒を用いて行うことにより HCV を精製することができる。
本発明は、 本発明の細胞や C型肝炎ウィルス感染細胞を利用した抗 C型 肝炎ウィルス物質のスクリーニング方法も提供する。 該方法は、 被験物質 の存在下で本発明の細胞又は C型肝炎ウィルス感染細胞を培養し、 培養物 中の C型肝炎ウィルス RNA又はウィルス粒子を検出することにより、 該被 験物質の抗 C型肝炎ウィルス効果を評価することを特徴とする。
また本発明は、 本発明の C型肝炎ウィルス粒子又はその一部分を抗原と して使用して、 C型肝炎ワクチンを製造する方法を提供する。
さらに本発明は、 外来遺伝子をコードする RNAを本発明の改変された C 型肝炎ウィルスゲノム RNA中に挿入し、 これを目的とする細胞中に導入し て複製又は発現させることを特徴とする、 細胞中で外来遺伝子を複製及び '/又は発現する方法、 並びに、 本発明の改変された C型肝炎ウィルスゲノ ム RNAを含む肝細胞指向性ウィルスベクターを提供する。
本発明によれば、 培養細胞系を用いて、 感染性を有する HCVウィルス粒 子を作製することができる。 さらに、 患者から分離した自律複製能を有さ ない HCV株においても、その NS3領域より 3 ' 側の領域を JFH1のウィルス ゲノム RNAに置換することにより、 あるいは NS5B 領域を JFH1の NS5Bに 置換することにより、 in vi t ro で自律複製させることができる。 従って、 種々の遺伝子型の HCV株のウィルス粒子を培養細胞系により作製すること ができ、 HCV感染過程の研究、 HCV感染に影響を及ぼす各種物質のスクリー ニング系、 及び HCVワクチンの製造等に有用である。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の HCVゲノム RNAを作製するための铸型 DNAの構築手順 を示す概略図で、 T7プロモーターの下流に全長 HCVゲノムを挿入して作製 したプラスミドクローン pJFHlの構造を示す。 図中の記号は以下のとおり である。 T7 : T7 RNAプロモー夕一、 5' UTR : 5'非翻訳領域、 C : Coreタンパ ク質、 El、 E2 : エンベロープタンパク質。 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5B : 非構造タンパク質。 3' UTR: 3'非翻訳領域。 Age I、 Pme L Xba I： 制 限酵素 Age I、 Pme I及び Xba Iの切断部位。 GDD : NS5Bタンパク質の活性 中心に相当するアミノ酸モチーフ GDDの位置。
図 2は、 HCVゲノム RNAである rJFHlを導入した Huh7細胞における rJFHl の複製を示すノーザンブロット解析の結果を示す写真である。
図 3は、 培地中の HCV Coreタンパク質、 NS3タンパク質、 NS5Aタンパク 質、 E2タンパク質の検出結果を示す。
図 4は、 HCVゲノム MAを導入した細胞の培地中への経時的な Coreタン パク質の放出結果を示す。
図 5は、 rJFHlを導入した Huli7細胞の培養上清をショ糖密度勾配により 分画した各画分における、 HCVCoreタンパク質と HCVゲノム RNA量を示す グラフである。黒塗りの円は HCV Core (core)タンパク質、白抜きの円は HCV ゲノム RNAを示す。 図 5 Aは未処理、 図 5 Bは RNase処理、 図 5 Cは NP40 処理、 図 5 Dは NP40+RNase処理した rJFHl導入 Huh7細胞の結果を示す。 + 図 6は、 rJFHl導入 Huh7細胞の培養液中に分泌されたウィルス粒子の感 染性に関する。 図 6 Aは、 抗 Core抗体 （左）、 抗 NS5A抗体 （右） による免 疫染色の結果を示す写真である。図 6 Bは、抗 Core抗体染色陽性細胞の数 を示すグラフである。 図 6 Cは、 細胞内 （左） 及び上清 （右） における HCV RNA量の経時的変化を示すグラフである。 .
図 7は、 rJCHl/NS5B (j fhl)導入 Huh7細胞の培養液中に分泌されたウィル ス粒子の感染性に関する。図 7 Aは、 KHl/NS5B (j fhl)導入 Huh細胞の培養 液中に分泌されたウィルス粒子のナイーブな Huh7細胞中での HCV RNAの増 幅についてのグラフである。図 7 Bは、抗 Core抗体染色陽性細胞の数を示 すグラフである。
図 8は、 TH/JFH1キメラレブリコンの構造を示す。
図 9は、 rTH/JFHlキメラレブリコン RNA トランスフエクシヨンによるコ ロニ一形成をみた結果である。
図 1 0は、 TH/JFH1 キメラレブリコン培養上清感染によるコロニー形成 をみた結果である。
図 1 1は、ゲル濾過クロマトグラフィにおける流出プロファイルを示す。 縦軸は波長 4 9 0 n mでの吸光度を示している。 S— 3 0 0、 S - 4 0 0 及び S _ 5 0 0はそれぞれ S e p h a c r y l (登録商標） S— 3 0 0、 S— 4 0 0及び S— 5 0 0である。 また、 横軸はカラムからの溶出した溶 液量を示している。
図 1 2は、 イオン交換クロマトグラフィにおける流出プロファイルを示 す。 縦軸は HCV粒子のコアタンパク質の量を示している。
図 1 3は、 レクチンァフィ二ティーク口マトグラフィにおける流出プロ ファイルを示す。 縦軸は HCV粒子のコアタンパク質の量を示している。 図 1 4は、 へパリン及び硫酸セル口ファインおける流出プロファイルを 示す。 縦軸は波長 4 9 0 n mでの吸光度を示している。 図 15は、 ブルーダイァフィ二テイク口マトグラフィにおける流出プロ ファイルを示す。 縦軸は HCV粒子のコアタンパク質の量を示している。 図 16は、 カラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わ せた精製プロファイルを示す。 縦軸は HCV粒子のコアタンパク質の量を示 している。 また、 ショ糖密度勾配遠心では HCVのコアタンパク質の量とと もに各フラクション溶液の密度が縦軸に示されている。 本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2 0 04— 243 9 7 5号、 特願 2 0 04— 2 9 0 8 0 1号、 特願 2 0 0 5— 6 9 5 2 7号、 及び特願 2 0 0 5 - 6 9 7 2 5号の明細書に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
1. 改変されたキメラ C型肝炎ウィルスゲノム RNA
C型肝炎ウィルス （HCV) のゲノムは、 約 9600ヌクレオチドからなる（+) 鎖の一本鎖 RNAである。このゲノム RNAは、 5 '非翻訳領域（ 5 ' NTR又は 5 ' UTR とも表記する）、 構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、 及び 3'非翻訳領域 （3'NTR又は 3'UTRとも表記する） からなる。 その構造領域 には HCVの構造タンパク質がコードされており、 非構造領域には複数の非 構造タンパク質がコードされている。
このような HCVの構造タンパク質 （core、 El、 及び E2) と非構造タンパ ク質 （NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A, 及び NS5B) は、 翻訳領域から一続き のポリプロテインとして翻訳された後、 プロテアーゼによる限定分解を受 けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（す なわち、 HCVのウィルスタンパク質） のうち、 coreはコアタンパク質であ り、 E1及び E2はエンベロープタンパク質である。 非構造タンパク質はゥ ィルス自身の複製に関与するタンパク質であり、. NS2 はメタ口プロテア一 ゼ活性、 NS3 はセリンプロテアーゼ活性 （N末端側の 3分の 1) とへリカ —ゼ活性 （C末端側の 3分の 2) を有することが知られている。 さらに、 NS4Aは NS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、 NS5Bは RNA 依存 RNAポリ.メラ一ゼ活性を有することも報告されている。
現在、 HCV の遺伝子型としては、 少なくとも 1型から 6型まで知られて おり、 HCV はその配列から、 S immonds ら (Simmonds, P. et al, Hepatology, (1994) 10, p. 1321-1324 を参照） による国際分類に従って各種遺伝子型 (HCVla, HCVlb, HCV2a、 HCV2b 等） に分類されている。 本発明において、 自律複製能を有しない HCVゲノム RNAは、 これらの既知のウィルス型に限 定されず、 全ての自律複製能を有しない、 つまり感染性粒子を細胞外に放 出する能力を有しない HCVゲノム RNAを含むものとする。 なお、 本発明に おいて RNAが「自律複製能を有する」あるいは「自律的に複製する」 とは、 HCV ゲノム RNAを細胞中に導入したときに、その HCV ゲノム RNAが自己増 殖すること、 つまり感染性粒子を細胞外に放出する能力を有することを意 味する。
本明細書では、 上記のような培養細胞系自律複製能を有する HCVゲノム RNAを含む RNAを、 「レプリコン RNA」 又は 「RNAレプリコン」 と称する。 本明細書では、 レブリコン RNAの全長を含む本発明のレブリコン RNA 、 「全長 HCVレプリコン RNA」と呼ぶ。本発明の全長 HCVレプリコン RNAは、 ウィルス粒子産生能を有する。 また、 本発明の改変された C型肝炎ウィル スゲノム RNAは、 全長 HCVレブリコン RNAである。
本発明にかかる改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAは、 2種以上の C型肝炎ウィルスのゲノム RNAの、 5'非翻訳領域、 coreタンパク質コード 配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 p7タンパク 質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、ならびに JFH1株の NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5Bの各タンパク質コード配列、 及び 3'非翻訳領域を含む塩 基配列からなり、 かつ自律複製能を有する、 改変された C型肝炎ウィルス ゲノム RNAを含む。 具体的には、 本発明は 1つの実施形態として、 C型肝 炎ウィルスゲノム RNAの NS3タンパク質コード配列から 3'末端までのゲノ ム配列 NS5Bタンパク質コード配列が配列番号 1に示される JFH1株の NS3、 NS4、 NS5A、 及び NS5B タンパク質をコードする RNA 部分配列 （Genbank Access ion No. AB047639の DNA配列 3867-9678で示される配列の Tを Uに 置換した RNA配列） に置換され、 かつ自律複製能を有する、 改変された C 型肝炎ウィルスゲノム RNAを含む。
また別の実施形態として、 C型肝炎ウィルスゲノム RNAの NS5B夕ンパク 質コード配列が配列番号 2で示される JFH1株の NS5Bタンパク質コード配 列に置換され、 かつ自律複製能を有する、 改変された C型肝炎ウィルスゲ ノム RNAを提供する。
好適には、 遺伝子型 lb及び遺伝子型 2aの C型肝炎ウィルスを用いた、 5'非翻訳領域、 coreタンパク質コード配列、 E1タンパク質コード配列、 E2 タンパク質コード配列、 p7タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード 配列、 ならびに JFH1株の NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 NS5Bの各タンパク質コ ード配列、 及び 3'非翻訳領域を含む塩基配列からなり、 かつ自律複製能を 有する、 改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAを含む。
前記の改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAは、 さらに、 少なくとも 1つの選択マ一カー遺伝子及び Z又は少なくとも 1つのリポーター遺伝子 と、 少なくとも 1つの IRES配列とを含んでいてもよい。
本発明では、 2種以上の C型肝炎ウィルスとして、 培養細胞系で自律複 製能を有する HCV株と培養細胞系で自律複製能を有しない HCV株とを組み 合わせることにより、 自律複製能を有しない HCV株を自律複製可能なもの に改変することができる。 あるいは、 自律複製効率が低いウィルス株を複 製効率の高いウィルス株に改変することができる。
HCV株としては、 具体的には、 la型には HCV- 1株、 HCV- H株、 HCV- Π株 など、 lb型には、 HCV- conl株、 HCV - TH株、 HCV - J株、 HCV- JT株、 HCV-BK 株など、 2a型には HCV-J6株、 JFH- 1株、 KH 1株など、 2b型には HC- J8株、 3a型には E-bl株などが知られている。 これらのウィルスの構造は、 基本 的には、 5' - UTR から、 coreゝ El、 E2、 p7、 NS2、 NS3、 NS4a、 NS4b、 NS5a、 NS5b、 3' - UTRからなる （前掲）。 上記各 HCV株の各領域の塩基配列も明ら かになつており、 例えば、 TH株の全長配列上、 core、 El、 E2、 p7、 NS2の 領域は明らかになつている。 また、 HCV- JT株では、 core、 El、 E2、 p7、 NS2 の領域が明らかになつている。 本発明に係るレブリコン RNAの 1つの実施 形態として、 HCV2a型の JFH1株と、 JFH- 1株を除く他の株、 例えば、 HCV - 1株、 HCV- H 株、 HCV- Π 株、 HCV- conl 株、 HCV- TH 株 （Waki ta et al. , J. Biol. Cliem. , (1994) 269, p. 14205-14210, 及び Moradpour e t al. , Biochem. B iophys. Res. Commun. , (1998) 246, p. 920-924) , HCV - J株、 HCV-JT株、 HCV- BK株、 HCV- J6株、 ； TCH l株、 HC-J8株、 E- bl株を用いたキ メラ HCVレブリコン RNAを挙げることができる。
· さらに、 本発明の改変された HCVゲノム RNAの好適な実施形態として、 C型肝炎ウィルスである JFH1株の HCV ゲノム RNA 中の NS3領域より 3 ' 側の領域を JFH1のウィルスゲノム RNAに置換した、 あるいは NS5Bタンパ ク質コ一ド配列を他の HCVゲノム RNA中の NS5Bタンパク質コード配列に置 換もしくは揷入された HCVゲノム RNAを挙げることができる。 例えば、 in vi tro において、 複製する事が出来ないことが知られている、 HCV ゲノム RNAである JCH1 (ref) の NS3領域より 3 ' 側の領域を： IFH1のウィルスゲ ノム RNAに置換することにより、 HCVゲノム RNA を自律複製し得る HCVゲ ノム RNA に改変することが可能となる。
また HCVゲノム RNAである HCV遺伝子型 lbの Con- 1クローン（rei) (EMBL Access ion No. AJ238799) の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコード する RNA配列部分を、 JFH1株の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコ ードする RNA配列に置換することにより、 又は HCV遺伝子型 lbの Con - 1 クローン（rei)の NS5Bタンパク質をコードする RNA配列部分のみを、 JFH1 株の NS5Bタンパク質をコードする RNA配列に置換することにより HCVゲノ ム RNAを自律複製し得る HCVゲノム RNAに改変する事が可能となる。
Con- 1 クローンの遺伝子を利用した全長レブリコンは、 自律複製能はあ るが、 HCV 粒子形成しない（Pietschmann e t al, Jouranl of Vi rology, (2002) 76, p. 4008- 4021を参照）。 しかしながら、 本発明の実施例に示す ように、. NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコードする RNA配列部分 を、 JFH1株の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコードする RNA配列 に置換することにより粒子が形成される。すなわち、本発明の方法により、' 自律複製能はあっても粒子形成不可能な C型肝炎ウィルスゲノム RNAを粒 子形成が可能な改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAにすることが可能 となる。
また、 TH株や H株のように自律複製能をもつレブリコンを作製できな い HCVにおいてもが、 本発明の実施例に示すよう fc JFH-1株とのキメラ遺 伝子を作製することにより粒子が形成された。 従って、 自律複製能しない HCVゲノム RNAから粒子形成が可能な改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNAにすることが可能となる。
· さらに、 JFH1株の RNA配列部分のうち、 NS5Bに変異をいれることにより HCVのゲノム RNAの増殖が無くなり HCVの粒子産生がなくなることから、 自律複製能及び粒子産生能を与えるのに NS5B が重要であることは明白で ある。
現在、 HCV はその配列から、 S immonds ら （Simmonds, P. e t al.， Hepatology, (1994) 10, p l321-1324 を参照） による国際分類に従って各 種遺伝子型 （HCVla、 HCVlb, HCV2a、 HCV2b等） に分類されている。 本発明 において、 自律複製能のない HCVゲノム RNAは、 これらの既知のウィルス 型に限定されず、 全ての自律複製能をもたない HCVゲノム RNAを含むもの とする。
本明細書に係る、 NS5Bタンパク質コード配列は JFH1株由来の NS5Bタン パク質 （配列番号 3 ) のコード配列であって、 配列番号 2に示される塩基 配列を有する。 しかしながら、 配列番号 2に示す塩基配列とストリンジェ ン卜な条件下でハイブリダィズしうる塩基配列も、それが NS5Bタンパク質 として機能するアミノ酸（例えば、 保存的置換を含む NS5Bタンパク質） を コードする限り、 本発明の NS5Bタンパク質コード配列に包含される。 なお、 ストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が 300-2000mMで温度が 40- 75°C、 好ましくはナトリゥム濃度が 600- 900mMで 温度が 65°Cの条件をいう。当業者であれば、 Mol ecular Cloning (Sambrook, J. et al. , Mol ecul ar Cloning : a Laboratory Manual 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyl ine Dr ive P l ainview, NY (1989) ) 等 を参照することにより、前記のような NS5Bホモログを容易に取得すること ができる。
本発明に係る HCVゲノム RNAは、 JFH1 HCVゲノム RNA 中の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコードする RNA配列部分を有する、 あるいは NS5B タンパク質コード配列を有する。 一つの実施形態において、 本発明の HCVゲノム RNAは、 C型肝炎ウィル ス株のゲノム RNA上の 5'非翻訳領域、 coreタンパク質コード配列、 E1夕 ンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配 列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパ ク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 NS5Bタンパク質コード配列、 及び 3'非翻訳領域を含む塩基配列からなる RNAであって、 かつ、 前記 NS3 から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコードする RNA.配列部分が外来性に導 入された JFHl HCVゲノム RNA 由来の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク 質をコードする RNA配列部分である RNAである。好ましくは NS5Bタンパク 質コード配列が、 外来性に導入された JFHl HCV ゲノム RNA 由来の NS5B タンパク質コード配列である RNAである。
本願明細書において、 「5'非翻訳領域 （5' NTR又は 5' UTR)」、 「coreタン パク質コード配列（core領域又は C領域）」、 ΓΕ1タンパク質コード配列（E1 領域）」、 「E2タンパク質.コード配列 （E2領域）」、 「N2タンパク質コード配 列 （NS2領域）」、 「NS3タンパク質コード配列 （NS3領域)」、 「NS4Aタンパク 質コード配列 （NS4A領域）」、 「NS4Bタンパク質コード配列 （NS4B領域）」、 「NS5Aタンパク質コード配列 （NS5A領域）」、 「NS5Bタンパク質コード配列 (NS5B領域）」、 及び 「3'非翻訳領域 （3' NTR又は 3' UTR)」、 並びにその他 の特定の領域若しくは部位は、 種々の遺伝子型において既に公知である。 未知の HCV株についての上記各領域若しくは部位は、 既知の HCVの全長ゲ ノム RNA配列と当該 HCV株の全長ゲノム RNA配列をァライメントすること により、 容易に決定することができる。
本発明において 「選択マ一力一遺伝子」 とは、 その遺伝子が発現された 細胞だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子 を意味する。 選択マーカ一遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝 子が挙げられる。本発明において好適な選択マーカ一遺伝子の例としては、 ネオマイシン耐性遺伝子、 チミジンキナ一ゼ遺伝子、 カナマイシン耐性遺 伝子、 ピリチアミン耐性遺伝子、 アデ二リルトランスフェラーゼ遺伝子、 ゼォシン耐性遺伝子、 ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、 ネオマイシン耐性遺伝子、 チミジンキナ一ゼ遺伝子が好ましく、 ネオマイ シン耐性遺伝子がさらに好ましい。 但し本発明における選択マーカー遺伝 子はこれらに限定されるものではない。
また本発明において 「リポーター遺伝子」 とは、 その遺伝子発現の指標 となる遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。 リボー夕一遺 伝子の一般的な例としては、 発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺 伝子が挙げられる。本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、 トランスポゾン Tn9由来のクロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ ーゼ遺伝子、 大腸菌由来の jSダルクロニダーゼ若しくは jSガラクトシダー ゼ遺伝子、 ルシフェラーゼ遺伝子、 緑色蛍光タンパク質遺伝子、 クラゲ由 来のェクオリン遺伝子、 分泌型胎盤アルカリフォスファターゼ （SEAP) 遺 伝子等が挙げられる。 但し本発明におけるリポーター遺伝子はこれらに限 定されるものではない。
上記の選択マーカ一遺伝子ゃリポー夕一遺伝子は、 レブリコン RNA中に どちらか一方のみが含まれていてもよいし、 両方が含まれていてもよい。 選択マ一力一遺伝子又はリポーター遺伝子は、 改変された C型肝炎ウィル スゲノム RNAに 1つ含まれていてもよいし、 2つ以上含まれていてもよい。 本発明に係る HCVゲノム RNAは、 その全 HCVゲノム RNAを導入する細胞 内で発現させたい任意の外来遺伝子をコ一ドする RNAをさらに含んでもよ レ^ 外来遺伝子をコードする RNAは、 5'非翻訳領域の下流に連結してもよ いし、 3'非翻訳領域の上流に連結してもよい。 また、 coreタンパク質コー ド配列、 E1タンパク質コード配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパ ク質コ一ド配列、 NS3タンパク質コード配列、 NS4Aタンパク質コード配列、 NS4Bタンパク質コード配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 及び NS5Bタン パク質コード配列のいずれかの間に挿入してもよい。
外来遺伝子をコードする RNAを含む HCVゲノム RNAは、 導入された細胞 内で翻訳される際に、 該外来遺伝子にコードされる遺伝子産物を発現する ことができる。 従って外来遺伝子をコードする RNAを含む HCVゲノム RNA は、 外来遺伝子の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする場合 にも、 好適に使用することができる。
本発明に係る HCVゲノム RNAにおいては、 上述したようなウィルスタン パク質をコードする配列、 並びに外来遺伝子等が、 HCVゲノム RNAから正 しい読み枠で翻訳されるように連結される。 HCVゲノム RNAにコードされ るタンパク質は、 一続きのポリべプチドとして翻訳され発現された後でプ 口テアーゼによって各タンパク質へと切断され、 遊離するように、 プロテ ァーゼ切断部位等を介して互いに連結させることが好ましい。
こうして作製された JFH1株の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコ ―ドする RNA配列部分を含む HCVゲノム RNAを.、 適当な宿主細胞に導入す れば、 HCVゲノム RNAを自律複製、好ましくは持続的に自律複製できる （す なわち、 HCVゲノム RNAの複製能を有する） 組換え細胞を得ることができ る。 以下、 本明細書において、 JFH1株の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパ ク質をコードする RNA配列部分を含む HCVゲノム RNAの複製能を有する組 換え細胞を 「HCVゲノム RNA複製細胞」 と称することとする。
. 「HCVゲノム RNA複製細胞」 のための宿主細胞は、 継代培養可能な細胞 であれば特に限定されないが、 真核細胞であることが好ましく、 ヒト細胞 であることがより好ましく、 ヒト肝由来細胞、 ヒト子宮頸由来細胞、 又は ヒト胎児腎由来細胞であることがさらに好ましい。 また、 細胞としては、 癌細胞株や幹細胞株などを含む増殖性細胞が好ましく、 Huh7 細胞、 HepG2 細胞、 IMY- N9細胞、 HeLa細胞、 又は 293細胞等が特に好ましい。 これらの 細胞は、 市販のものを利用してもよいし、 細胞寄託機関から入手して使用 してもよいし、 任意の細胞 （例えば癌細胞又は幹細胞） から株化した細胞 を使用してもよい。
HCVゲノム RNAの宿主細胞内への導入は、 公知の任意の技術を使用して 行うことができる。 そのような導入法としては、 例えば、 エレクトロボレ —シヨン、 パーティクルガン法、 リポフエクシヨン法、 リン酸カルシウム 法、マイクロインジェクション法、 DEAEセファロース法等が挙げられるが、 エレクトロポレーションによる方法が特に好ましい。
HCVゲノム RNAは、 単独で導入してもよいし、 他の核酸と混合させたも のを導入してもよい。 導入する RNA量を一定にしながら HCVゲノム Aの 導入量を変更したい場合には、 所望の導入量の HCVゲノム RNAを、 導入す る細胞から抽出したトータル細胞性 RNAと混合して一定の RNA総量とし、 それを細胞内導入に用いればよい。 細胞内導入に用いる HCVゲノム RNAの 量は、 使用する導入法に応じて決めればよいが、 好ましくは 1ピコグラム 〜 1 0 0マイクログラム、 より好ましくは 1 0ピコグラム〜 1 0マイクロ グラムの量を使用する。
■ 「HCVゲノム RNA複製細胞」 中での HCVゲノム RNAの複製の確認は、 公 知の任意の RNA検出法に従って行うことができ、 例えば、 細胞から抽出し たトータル RNAについて、導入された HCVゲノム RNAに対して特異的な DNA 断片をプローブとして用いるノーザンハイブリダィゼーション法、 あるい は導入した HCV ゲノム RNAに特異的なプライマーを用いた RT- PCR法を用 いることができる。
さらに、 「HCVゲノム RNA複製細胞」 から抽出したタンパク質中から HCV タンパク質が検出されれば、 その細胞は、 HCVゲノム RNAを複製している ものと判断することができる。 HCV タンパク質の検出は、 公知の任意の夕 ンパク質検出法に従って行うことができ、 例えば、 導入された HCVゲノム RNAから発現されるべき HCVタンパク質に対する抗体を、 細胞から抽出し たタンパク質と反応させることによって行うことができる。 より具体的に は、 例えば、 細胞から抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にブ ロッテイングし、 それに対して抗 HCVタンパク質抗体 （例えば、 抗 NS3特 異的抗体、 又は C型肝炎患者から採取した抗血清） を反応させ、 さらにそ の抗 HCVタンパク質抗体を検出することによって行うことができる。
限定するものではないが、 HCV ゲノム RNAの自律複製能は、 例えば、 対 象とする RNAを Huli7細胞中にトランスフエクシヨンし、 その Huh7細胞を 培養し、得られる培養物中の細胞から抽出した RNAについて、導入した RNA を特異的に検出可能なプローブを用いたノーザンプロットハイプリダイゼ —シヨンを行うことにより、 確認することができる。 自律複製能を確認す るための具体的な操作は、 本明細書の実施例に記載された HCVタンパク質 の発現確認、 HCVゲノム RNAの検出等の記載に例示される。
2 . HCV粒子の作製
上記のようにして作製される HCVゲノム RNA複製細胞は、 HCVウィルス 粒子を in vi troで産生することができる。 すなわち、 本発明の HCVゲノム RNA複製細胞を適当な培地で培養し、 その培養物 （好ましくは培養液） 中 から産生されたウィルス粒子を採取することにより、 HCV 粒子を簡単に取 得することができる。
HCVゲノム RNA複製細胞のウィルス粒子産生能は、 公知の任意のウィル ス検出法を用いて確認することができる。 例えば、 ウィルス粒子を産生し ていると思われる細胞の培養液をショ糖密度勾配により分画し、 各分画の 密度、 HCVコアタンパク質濃度、及び HCVゲノム RNAの量を測定した結果、 HCVコアタンパク質と HCVゲノム RNAのピークが一致し、 しかもそのピ一 クが検出される画分の密度が、 培養上清を 0. 25 % NP40 (ポリオキシェチ レン（9)ォクチルフエ二ルエーテル [Polyoxyethylene (9) Oc tylp enyl Ether] ) で処理してから分画した場合の同画分の密度と比較して軽い （例 えば、 1. 15〜1. 22 mg) 場合には、 該細胞はウィルス粒子産生能を有すると 判定することができる。
培養液中に放出された HCVウィルス粒子は、 例えば、 coreタンパク質、 E1タンパク質、 又は E2タンパク質に対する抗体を用いて検出することも できる。また、培養液中の HCV ウイルス粒子が含有する HCVゲノム RNAを、 特異的プライマーを用いた 法により増幅して検出することによつ て、 HCVウィルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。
3 . 本発明の HCV粒子の他の細胞への感染
本発明の方法で産生される HCVウィルス粒子は、 細胞 （好ましくは HCV 感受性細胞） への感染能を有する。 本発明は、 HCVゲノム RNA複製細胞を 培養し、 得られた培養物 （好ましくは、 培養液） 中のウィルス粒子を他の 細胞 （好ましくは HCV感受性細胞） に感染させることを含む、 C型肝炎ゥ ィルス感染細胞の製造方法も提供する。 ここで、 HCV感受性細胞とは、 HCV に対し感染性を有する細胞であり、 好ましくは肝臓細胞又はリンパ球系細 胞であるが、 .これらに限定されるものでは無い。 具体的には、 肝臓細胞と しては初代肝臓細胞や、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY- N9細胞、 HeLa細胞、 203細胞などが挙げられ、 リンパ球系細胞としては Mol t4細胞や、 HPB_Ma 細胞、 Daud i細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。 本発明の HCVゲノム RNA複製細胞において産生された HCV粒子を細胞（例 えば、 HCV感受性細胞） に感染させると、 その感染細胞中では HCVゲノム RNAが複製され、 さらにウィルス粒子が形成される。 本発明の HCVゲノム RNA複製細胞において産生されたウィルス粒子を細胞に感染させることに より、 HCVゲノム RNAが細胞内で複製され、 ウィルス粒子をさらに製造す ることができる。
本発明の HCVゲノム RNA複製細胞において産生された HCVウィルス粒子 は、 チンパンジーなどの HCV ウィルスに感染しうる動物に感染して、 HCV 由来の肝炎を引き起こすことができる。
4 . HCV粒子の精製
HCV粒子を精製するにあたり、 そのウィルスを含む溶液は HCV感染患者 由来血液ならびに、 HCV感染培養細胞ならびに組換え遺伝子技術により HCV 粒子を産生する細胞の培養液及び細胞破砕液のいずれか一つ又は複数を由 来としてよい。
HCV ウィルスを含む溶液を遠心及び/もしくはフィルターなどを用いて 細胞及び細胞の残渣を除去した。 残渣を除去した溶液は、 分画分子量 1 0 0， 0 0 0から 5 0 0， 0 0 0の限外濾過膜を用いて 1 0から 1 0 0倍程 度に濃縮することもできる。
残渣を除去した HCVを含んだ溶液は、 以下に記載するクロマトグラフィ 及び Zもしくは密度勾配遠心を任意の順番に組み合わせてもしくは単独で 精製することができる。 以下に代表的なクロマトグラフィゃ密度勾配遠心 の方法について記載するが、 本発明はそれに限られるものではない。
ゲル濾過クロマトグラフィは、 好ましくはァリルデキストランと Ν， Ν' - メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマーをゲルマトリックスとするク 口マトグラフィ担体で、 さらに好ましくは S e p h a c r y 1 (登録商標） S — 3 0 0、 . S — 4 0 0及び S — 5 0 0からなるクロマトグラフィを用い ることにより、 HCV粒子の精製を行うことができる。
イオン交換クロマトグラフィは、 陰イオン交換樹脂として好ましくは Q S e ph a r o s e (登録商標） など、 及び陽イオン交換樹脂として好ま しくは SP S e ph a r o s e (登録商標） などをもちいて HCV粒子の 精製を行うことができる。
ァフィ二テイク口マトグラフィは、リガンドとして好ましくはへパリン、 硫酸化セル口ファイン、 レクチン、 及び様々な色素から選ばれる基質を結 合させた樹脂を担体として用いて、 HCV粒子の精製を行うことができる。 さらに好ましくは、 H i T r a p He p a r i n HP (登録商標）、 H i T r a p B l ue HP (登録商標）、 H i Tr ap B e n z am i d i ne F F (登録商標）、 硫酸化セル口ファイン、 ならびに L C A、 C onA、 RCA— 120及ぴ WGAが結合した担体を利用して、 HCV粒子 を精製することができる。 最も好ましくは、 硫酸化セル口ファインを担体 として利用して HCV粒子を精製することであり、 精製前と精製後で溶液中 の総タンパク質量と HCVの RNAcopy数の比率としてなんと 30倍以上も精 製されていた。
密度勾 E遠心による精製は、 密度勾配を形成する溶質として好ましくは 塩化セシウム、 スクロース、 ナイコデンッ （登録商標） ならびに、 フィコ ール （登録商標） 及びパーコール （登録商標） といった糖重合体を用いる ことができる。 さらに好ましくは、 スクロースを用いることができる。 ま た、 用いる溶媒として好ましくは水もしくは、 リン酸緩衝液、 トリス緩衝 液、 酢酸緩衝液、 又はグリシン緩衝液といった緩衝液を用いることができ る。
精製を行う際の温度が好ましくは 0〜40°Cであり、 さらに好ましくは 0〜25。Cであり、 最も好ましくは 0〜 10°Cである。
密度勾配遠心による精製を行う際の遠心力が、 好ましくは 1 X 104〜 1 X 109 gであり、 さらに好ましくは 5 X 104〜 1 X 107であり、 最 も好ましくは 5 X 104〜5 X 105であるような精製方法。
精製方法の組み合わせは、 密度勾配遠心とカラムクロマ卜グラフィはど のような順番にどのように組み合わせても良いが、 好ましくは複数のカラ ムクロマトグラフィにより精製した後に密度勾配遠心を用いる組み合わせ であり、 更に好ましくは陰イオン交換カラムに次いでァフィ二ティーク口 マトグラフィ.を用いて得られた HCV粒子を含むフラクションを密度勾配遠 心を用いて精製する組み合わせであり、 最も好ましくは Q— S e p h a r o s e (登録商標） を用いたカラムにより得られた HCV粒子を含むフラク シヨンを硫酸セル口ファインを用いたカラムを用いて更に精製して得られ た HCV粒子を含むフラクションを密度勾配遠心により精製する組み合わせ である。 なおカラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心の工程の間に透析 や限外濾過を用いることにより HCV粒子を含む溶液の溶質の置換及び/又 は HCV粒子の濃縮を行うことができる。 5 . 本発明の他の実施形態
本発明の HCVゲノム RNA複製細胞では、 HCVゲノム RNAが高効率で複製 される。 従って、 本発明の HCVゲノム RNA複製細胞を用いて、 HCVゲノム RNAを高効率で製造することができる。
本発明でば、 HCVゲノム RNA複製細胞を培養し、 培養物 （培養細胞及び /又は培養液） から RNAを抽出し、 それを電気泳動法により、 分離された HCVゲノム RNAを単離精製することによって、 HCVゲノム RNAを製造するこ とができる。このようにして製造される RNAは、 HCVのゲノム配列を含む。 HCVのゲノム配列を含む の製造方法が提供されることにより、HCVゲノ ムに関してより詳細な分析が可能となる。
さらに本発明の HCVゲノム RNA複製細胞は、 HCVタンパク質を製造する ために好適に使用することができる。 HCV タンパク質の製造は、 公知の任 意の方法によって行えばよいが、 例えば、 HCVゲノム RNAを細胞に導入し て組換え細胞を作製し、 該組換え細胞を培養し、 得られる培養物 （培養細 胞及び/又は培養液） から常法によりタンパク質を回収することによって 行えばよい。
HCV ウィルス粒子は、 肝細胞指向性を有しうる。 そのため本発明の HCV ゲノム RNAを使用して、 肝細胞指向性ウィルスベクタ一を製造することが できる。 このウィルスベクタ一は、 遺伝子治療用に好適に用いられる。 本 発明では、 外来遺伝子をコードする RNAを HCVゲノム RNAに組み込み、 そ の RNAを細胞に導入することにより、 該外来遺伝子を細胞中に導入し、 細 胞内で複製させ、 さらに発現させることができる。
さらに、 HCVゲノム RNA中の E1 タンパク質コード配列、 及び Z又は E2 タンパク質コード配列を、 他の生物種由来のウィルスの外殻タンパク質に 変換した RNAを作製し、 細胞内に導入して、 ウィルス粒子を作製すること により、 その RNAを様々な生物種の細胞に感染させることも可能となる。 この場合にも、 HCVゲノム RNAにさらに外来遺伝子を組み込んで、それを、 該外来遺伝子を組み換えたウィルス外殻タンパク質の指向性に依存して、 各種細胞で発現させるための細胞指向性ウィルスベクターとして使用する ことができる。
本発明は、 HCVゲノム RNAに外来遺伝子をコードする RNAを挿入し、 そ れを細胞に導入し、 その細胞を培養してウィルス粒子を産生させることを 含む、外来遺伝子を含有するウィルスベクタ一を製造する方法にも関する。 本発明は、 本発明に係る HCV粒子又はその一部分を抗原として、 あるい は細胞指向性を変えるためにウィルス外殻タンパク質を組み換えて作製し た粒子又はその一部分を抗原として、 C型肝炎ワクチンあるいは、 外殻夕 ンパク質を組み換えるに使用したウィルスに対するワクチンを製造する方 法も提供する。さらに本発明に係る HCV粒子又はその一部分を抗原として、 あるいは細胞指向性を変えるためにウィルス外殻タンパク質を組み換えて 作製した粒子又はその一部分を抗原として利用して HCVの感染中和抗体を 作成することもできる。
本発明の HCVゲノム RNA複製細胞、 又はそれらの細胞において産生され るウィルス粒子を感染させた HCV感染細胞は、 例えば HCVの複製、 ウィル ス粒子の再構築、 ウィルス粒子の放出を促進又は抑制する物質 （抗 C型肝 炎ウィルス物質） をスクリーニングするための試験系として使用すること もできる。 具体的には、 例えば、 被験物質の存在下でそれらの細胞を培養 し、 得られる培養物中の HCVゲノム RNA又はウィルス粒子を検出し、 その 被験物質がレブリコン RNA若しくは HCVゲノム RNAの複製又はウィルス粒 子の形成若しくは放出を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、 C型肝炎ウィルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニングするこ とができる。 この場合、 培養物中の HCVゲノム RNAの検出は、 上記細胞か ら抽出した RNA中の HCVゲノム RNAの量、 割合若しくは有無を測定するこ とによるものであってよい。 培養物 （主として培養液） 中のウィルス粒子 の検出は、 培養液中に含まれる HCVタンパク質の量、 割合若しくは有無を 検出するものであってよい。
' 本発明の HCVゲノム RNA複製細胞において産生された HCV粒子と HCV感 受性細胞とを、 HCV の細胞への結合を促進又は抑制する物質をスクリー二 ングするための試験系として使用することもできる。 具体的には例えば、 被験物質の存在下で、 本発明の HCVゲノム RNA複製細胞において産生され た HCV粒子とともに HCV感受性細胞を培養し、 得られる培養物中の HCVゲ ノム RNA又はウィルス粒子を検出し、 その被験物質が HCVゲノム RNAの複 製又はウィルス粒子の形成を促進又は抑制するかどうかを判定することに より、 C型肝炎ウィルスの増殖を促進又は抑制する物質をスクリーニング することができる。
このような HCVゲノム RNA又はウィルス粒子の検出は、 上述の手法又は 後述の実施例に従って行うことができる。 上記試験系は、 C型肝炎ウィル ス感染の予防剤、 治療剤若しくは診断剤の製造又は評価のためにも使用す ることができる。
具体的には、 本発明の上記試験系の利用例としては以下が挙げられる。
(1) HCVの増殖及び感染を抑制する物質の探索
HCV の増殖及び感染を抑制する物質としては、 例えば、 直接的若しくは 間接的に HCVの増殖及び感染に影響を及ぼす有機化合物、 あるいは HCVゲ ノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイプリダイズすることにより HCV の増殖若しくは HCVタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼす アンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
(2) 細胞培養中で抗ウィルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、 合理的ドラッグデザィン又はハイスループット スクリーニングを用いて得られた物質 （例えば単離精製された酵素） 等が 挙げられる。
(3) HCVに感染した患者の治療のための、 新規攻撃標的の同定
例えば HCVウィルス複製のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパ ク質を同定するために、 本発明に係る HCVゲノム RNA複製細胞を使用する ことができる。
(4) HCV ウィルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる 変異の同定
(5) C型肝炎ウィルス感染の診断薬又は治療薬の開発、 製造及び評価のた めに使用可能な抗原としてのウィルスタンパク質の製造
(6) C型肝炎ウィルス感染のワクチンの開発、 製造及び評価のために使用 可能な抗原としてのウィルスタンパク質及び弱毒化 HCVの製造 実 施 例
本発明を、 以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。 但し、 本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
[実施例 1 ] HCVゲノム RNAの作製
1 . 発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離した C型肝炎ウィルス JFH1株 （遺伝子型 2a) のウィルスゲノム全領域に対応する DNA を、 該ウィルス株の全長ゲノム cDNAを含む JFH1クロ一ン （Kato， T.， e t al, J. Med. Vi rol. 64 (2001) P334-339) から取得して、 PUC 19プラスミドに挿入した T7 RNAプロモー夕 一配列の下流に挿入した。 具体的には、 JFH1株のウィルス RNAを増幅した RT-PCR 断片を pGEM - T EASY vec tor (Promega) にクローニングして pGEMl-258, pGEM44- 486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEMl 141-2367, PGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, pGEM5883-7003, PGEM6950-8035, pGEM7984-8892, pGEM8680-9283, pGEM9231-9634, and PGEM9594-9678 の各プラス ミ ド DNA を得た （ Kato, T. e t al. , Gas t roent erol ogy , 125 (2003) ρ· 1808- 1817)。 この各プラスミドに含ま れるウィルスゲノムの cDNAを PCR法及び制限酵素を用いて連結し、全長ゲ ノム cDNAをクロ一ニングし、 上流に T7R RNAプロモーター配列を挿入し、 JFH1クローン （pJFHl) を得た （図 1 )。 なお、 pJFHlの全長 cDNA配列は、 国際 MA デ一夕バンク （DDBJ/EMBL/GenBank) にァクセッション番号： AB047639として登録されている。 次に、 pJFHl中の NS5B領域 （塩基配列：配列番号 2、 アミノ酸配列：配 列番号 3) について、 該領域にコードされる RNAポリメラーゼの活性中心 に相当するアミノ酸モチーフ GDDを GNDに変異させる突然変異を導入して、 突然変異プラスミドクローン pJFHl/GNDを作製した。 なお pJFHl/GND突然 変異クローンは、それにコ一ドされている NS5Bタンパク質の活性部位のァ ミノ酸配列が変異しているため、 HCV RNAを複製するために必要な活性 NS5B タンパク質を発現することができない。
次に、 JFH1の E1領域から E2領域を欠損させた pJFHl/ΔΕ卜 E2作製した。 また、 JFH1株とは異なる J6CF株 （GenBank Accession No. AF177036) 及 び、 KH1 (Kato, T.， et al, J. Med. Virol. 64 (2001) p334-339) の全 長 HCV cDNAを PIIC19プラスミドに挿入した T7 RNAプロモーター配列の下 流に挿入した、 pJ6CF及び pJCHlを作製した。 さらに、 pJCHlの NS5Bをコ —ドする領域を JFH1の NS5Bに置き換えた、 PJCH1/NS5B (j fhl)を作製した。 2. HCVゲノム RNAの作製
RNA 合成に用いる銬型 DNA を作製するために、 上記のとおり構築した pJFHK pJFHl/GND JFHl/AEl-E2, pJ6CF 、 pJCHl及び、 pJCHl/NS5B (j fhl) を、 それぞれ制限酵素 Xbalで切断した。 次いで、 これらの Xbal切断断片 のそれぞれ 10から を、 Mimg Bean Nuclease 20U (トータル反応液量 50/21) とともに 30°Cで 30分間インキュベートした。 Mung Bean Nuclease は、 二本鎖 DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素で ある。通常、上記 Xbal切断断片をそのまま铸型として用いて RNA合成を行 うと、 Xbalの認識配列の一部である CUGAの 4塩基が 3'末端に余分に付加 されたレブリコン RNAが合成されてしまう。 そこで本実施例では、 Xbal切 断断片を Mung Bean Nucleaseで処理することにより、 Xbal切断断片から CUGAの 4塩基を除去した。この後、 Xbal切断断片を含む Mung Bean Nuclease 処理後の溶液について、 常法に従ったタンパク質除去処理により、 CUGAの 4塩基が除去された Xbal切断断片を精製し、 これを鍀型 DNAとした。
次に、 この铸型 DNAから、 RNAを in vitro合成した。 RNA合成は Ambion 社の MEGAscriptを使用し、 銬型 MAを 0.5から 1. 含む反応液 20 1 を 37°Cで 3時間から 16時間反応させた。 RNA合成終了後、 反応溶液に DNAse (2U) を添加して、 37°Cで 15分間反 応させた後、 さらに酸性フエノールによる RNA抽出を行って、 铸型 DNAを 除去した。 このようにして pJFHl及び、 pJFHl/GNDに由来する上述の铸型 DNAから合成した HCV RNAを、それぞれ rJFHK rJFHl/GND、 r画/ Δ Ε卜 E2、 rJ6CF、 rJCHl及び、 rJCHl/NS5B (j ihl)と命名した。
これらの HCV RNAは、 rJFHlは GenBank Access ion No. AB047639の DNA を錶型として作製した RNA、 JFH1/GNDは GenBank Access i on No. AB047639 の 8618番目の Gを Aに置換した MAを铸型として作製した RNA、 rJFHl/Δ E1-E2は GenBank Access ion No. AB047639の DNA配列 989-2041を欠失し た1) を铸型として作製した1^ 、1"；[ 6 ？は66118&111^ 633 101^0. AF 177036 の DNAを铸型として作製した RNA、 rJCHlは GenBank Access ion No. AB047640 の DNAを铸型として作製した RNA、 rJCHl/NS5B (j flil)は GenBank Acces s ion No. AB047640の DNA配列卜 3866と GenBank Access ion No. AB047639の DNA 配列 3867- 9678の配列を制限酵素 Avrl lサイトを利用して、連結させた DNA を铸型として作製した RNAとして、その塩基配列を確認することができる。
[実施例 2 ] 細胞内における HCVゲノム RNA複製細胞とウィルス粒子産生 1 . 細胞内における HCVゲノム複製とウィルス粒子産生
上記の合成全長 HCV ゲノム RNA (rJFHL rJFHl/GND) のそれぞれについ て、 RNA総量が 10 gとなるように調製した。 次いでその混合 RNAをエレ クトロポレーシヨン法により Huh7細胞に導入した。エレクトロポレーショ ン処理を行った Huh7細胞を培養ディッシュに播種し、 12時間、 24時間、 48時間、 72時間培養した後に、 細胞を回収して、 細胞から RNAを抽出し て、 ノーザンプロット法により解析した。 ノ一ザンブロッ ト解析は、 Mol ecu lar Cloning, A l aboratory Manual, 2nd ed i t ion, J. Saibrook, E. F. Fri t sch, T. Maniat i s著、 Cold Spr ing Harbor Laboratory Press (1989) の記載に従って行った。 細胞から抽出した RNAを変性ァガロース電気泳動 に供し、泳動終了後に該 RNAをポジティブチャージナイロン膜に転写した。 pJFHlから作製した 32Pラベルした DNA又は RNAプローブを、 前記のとお り膜に転写した RNAに対しハイブリダィゼーシヨンさせ、 次いでその膜を 洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、 HCVゲノム特異的な RNA バンドを検出した。
図 2に示すように、 JFH1/GNDをトランスフエクシヨンした場合、 トラン スフエクシヨン 4時間後において、 導入した RNAバンドは弱いシグナルと して確認できたが、 時間の経過とともにシグナルは減弱し、 24時間後には ほとんどバンドのシグナルが確認できなかった。
一方、 rJFHlをトランスフエクシヨンした場合、 卜ランスフエクシヨン 4 時間から 12時間後では、導入した RNAバンドのシグナルの強さは JFH1/GND を導入した場合とほぼ同じでいったん減弱したが、 24時間以降にははつき りとした RNAバンドのシグナルが確認できた。 このシグナルは HCVに特異 的なものであった。 つまり導入した rJFHl RMの一部が複製増殖したもの と考えられた。 RNA 複製酵素である NS5B の活性モチーフを変異させた rJFHl/GNDでは複製はみられず、 NS5Bの活性が HCVの全長 RNAの複製に重 要であることが確認された。 また、 発明者らが慢性肝炎から分離した JCH1 株 （Kato, T. et al, J. Med. Vi rol. 69 (2001) p334-339) において、 同 様の実験をおこなったが、 これらの株では HCV RNA の複製は全く確認でき なかった。
2 . HCVタンパク質の検出
rJFHl あるいは、 rJFHl/GND RNA をトランスフエクシヨンした細胞から 常法により、 経時的にタンパク質を抽出して、 SDS- PAGE及びウエスタンブ ロット法により解析した。 解析にあたって、 NS3、 NS5A、 Core あるいは、 E2遺伝子を含む発現プラスミド DNAを Huh7細胞にトランジェントにトラ ンスフエクシヨンして得られた細胞抽出液を陽性対照 （NS3 タンパク質） とした。 さらに、 トランスフエクシヨンしていない Huh7細胞から抽出した タンパク質を陰性対照とした。 それぞれの細胞クローンから抽出したタン パク質試料を？¥0 膜 （1匪0 1011- ? , Mi l l ipore社製） にブロッテイン グし、抗 NS3特異的抗体（Dr. Moradpour より分与されたもの； Wolk B, e t al, J. Vi rology. 2000 ; 74 : 2293- 2304)、抗 NS5A特異的抗体（JFH1 の NS5A 領域を発現ベクターに挿入して、ネズミで DNA 免疫法を用いて作製した）、 抗 Core特異的抗体 （クローン 2H9 抗体）、 抗 E2 特異的抗体 （JFH1 E2 領 域の GTTTVGGAVARSTN (配列番号 4 ) と CDLEDRDRSQLSPL (配列番号 5 ) の ペプチドを合成して、 2つの合成べプチドでゥサギを免役して作製した）、 を用いて JFH1 RNAにコードされている NS3、 NS5A、 Core 及び、 E2 タンパ ク質を検出した。また、内在対照として、抗 ac t in 抗体を用いて、 ac t in 夕 ンパク質を検出した。
図 3に示されるとおり、 rJFHl をトランスフエクシヨンした細胞におい ては、 トランスフエクシヨンの 24時間後から NS3、 NS5A, Core 及び、 E2 タンパク質が検出でき、経時的に発現量が増加していることが確認された。 一方、 rJFHl/GND をトランスフエクシヨンした細胞あるいは、 トランスフ ェクシヨンしていない Huh7細胞で NS3、 NS5A、 Core 及び、 E2タンパク質 が検出されず、 卜ランスフエクシヨンされた rJFHlが自律複製することに より，これらのタンパク質が発現されていることが判明した。
以上の 1及び 2の結果から、 rJFHl をトランスフエクシヨンして樹立し た細胞では、 rJFHlが複製されていることが確認された。
3 . トランスフエクシヨン細胞培養液中における HCV Coreタンパク質の検 出
rJFHK rJFHl/GND, rJFHl/Δ Ε卜 E2、 rJ6CF 及び rKHlをエレクトロポレ —シヨンによって細胞導入をおこなった Huh7 細胞を培養ディッシュに播 種し、 2時間、 12時間、 24時間、 48時間、 72時間培養した後の培養液中 の HCV Coreタンパク質を測定した。 測定はォ一ソ HCV抗原 IRMAテストを 用 いて行っ た （ Aoyagi et al. , J. C l in. Microb iol. , 37 (1999) p. 1802-1808)。
図 4に示すとおり、 rJFHl をトランスフエクシヨンして 48時間から 72 時間後の培養液中にコアタンパク質が検出された。一方、 rJFHl/GND、 rJ6CF 及び rJCHlをトランスフエクシヨンした細胞の培養液中には HCV Coreタン パク質は検出されず、 rJFHl/Δ ΕΙ- E2 をトランスフエクシヨンした細胞の 培養液中には少量の HCV Coreタンパク質が検出された。 rJFHl/GND、 rJ6CF 及び rJCHl は Huh7細胞中では自律複製ができず、 rJFHl 及び、 rJFHl/Δ E1-E2は Huli7細胞中で自律複製ができる。よって、 Coreタンパク質の放出 には、 導入した HCV RNAの自律複製が必須であり、 かつ、 安定して多量の Coreタンパク質を細胞外に放出させるには El及び、 E2が必要であること が示された。
4. トランスフエクシヨン細胞培養液中における HCV粒子の検出
上記の実施例で培養液中に放出される Core タンパク質がウィルス粒子 として分泌されているかどうかを解析するため、 rJFHl をトランスフエク シヨンして 6日後の培養液をしよ糖密度勾配により分画した。 60% (重量/ 重量） しょ糖溶液（50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/lniM EDTAに溶解） 2ml、 50 % しょ糖溶液 lml、 40 %しょ糖溶液 lml、 30 %しょ糖溶液 lml、 20 %しょ糖溶 液 lml、 10 %しょ糖溶液 1ml を遠心チューブに重層し、 さらにサンプルの 培養上清を 4ml重層した。これをベックマンローター S W41Tiで 400， 000RPM, 4°C、 16時間遠心し、 遠心終了後遠心チューブの底から 0.5mlずつ分画回 収した。 各分画の密度、 HCVコア蛋白濃度、 HCVRNAコピー数を定量した。 レブリコン RNA の定量的 RT-PCR による検出は、 Takeuchi らの方法 (Takeuchi T. et al. , Gastroenterology 116: 636-642 (1999)) に従い HCV RNAの 5 '非翻訳領域の RNAを検出することにより行った。具体的には、 細胞から抽出した RNAに含まれるレプリコン RNAを、 以下の合成プライマ —と EZ rTth RNA PCR kit (Applied Biosystems) を用いて PCR増幅し、 ABI Prism 7700 seauence detector system (Applied Biosystems) により 検出した。
R6-130-S17： 5 ' -CGGGAGAGCCATAGTGG-3' (配列番号 6 )
6-290-R19： 5' -AGTACCACAAGGCCTTTCG-3' (配列番号 7 )
TaqMan Probe, R6-148-S21FT： 5' -CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3 ' (配列番号 8)
図 5 Aに示すように、 1.17 mg/nil のフラクションで Coreタンパク質と HCV RNAのピークが一致した。 このフラクションの密度は約 1.17 mg/mlで あり、これまで報告されている Coreタンパク質と核酸の結合物よりも軽い 比重であった。 もし、 1.17 mg/ml のフラクションに存在する Coreタンパ ク質と HCV RNAが HCV粒子構造を形成しているとすれば、 ヌクレアーゼに 耐性であると考えられる。 そこで次に、 JFH1をトランスフエクシヨンして 6日後の培養液を 10 g/mlの RNAse A で 20分間処理した後にしょ糖密度 勾配により分画した。
その結果、 図 5 Bに示すように HCV RNAは分解され、 RNase A 未処理の 場合と同じように、 1. 17 mg/mlのフラクションに Coreタンパク質と HCV RNA のピークが検出された。 すなわち、 1. 17 ing/mlのフラクションに存在する Coreタンパク質と HCV RNAは HCV粒子様構造を形成していることが確認さ れた。
さらに、 培養液を 0. 25 NP40で処理した後に同様の分画を行うと、 Core タンパク質と HCV RNAのピークは比重約 1. 28mg/mlへとシフトした （図 5 C )。 さらに、 0. 25% NP40 処理と同時に RNase A 処理を行うと、 HCV RNA のピークが消失した （図 5 D )。 つまり、 脂質を含み比重の軽い表面膜が NP40によりウィルス粒子から剥離して、 ウィルス様構造を保持していない 核酸と Coreタンパク質のみの Core粒子となり、 比重が重くなつたものと 考えられた。
以上の結果から、 rJFHlを Huh7細胞へトランスフエクションすることに よりウィルス RNAが複製し、 さらにウィルス粒子が形成され、 培養液中に 分泌されたことが確認された。
5 . 培養液中のウィルス粒子の感染実験
rJFHlを Huh7細胞へトランスフエクシヨンすることにより、培養液中に 分泌された HCV粒子に感染性があるかどうかについて検討した。 rJFHl あ る は、 rJFHl/Δ Ε卜 E2を Huh7細胞にトランスフエクシヨンして 3 日後に 培養上清を回収した。 回収した培養液を遠心して遠心上清を回収して、 さ らに 0. 45 mのフィルターで濾過した。 この培養液存在下で、 RNAをトラ ンスフエクシヨンしていない Huh7 を培養して 48時間後に細胞を抗 Core 抗体あるいは、 抗 NS5A抗体で蛍光免疫染色した。 図 6 Aに示すように、 rJFHlを Huli7細胞へトランスフエクションして得た培養液存在下で培養し た細胞においては、 細胞内に Coreタンパク質及び、 NS5Aタンパク質の発 現を認めた。 一方、 ； TFHl/Δ ΕΙ- E2 を Huh7細胞へトランスフエクシヨンし て得た培養夜存在下で培養した細胞においては、 細胞内に Core タンパク 質及び、 NS5Aタンパク質の発現を認めなかった （データは示さない）。 次いで、 JFH1を rHuh7細胞にトランスフエクシヨンして 3日後に培養上 清を回収して、 限外濾過膜（cut of f lxlO^ Da) を用いて 30倍に濃縮した。 濃縮した HCV粒子を含む培養液 I OO Iで RNAをトランスフエクシヨンして いない Huh7を 15 匪カバ一スリップ上で培養して、 48時間後に細胞を抗 Core抗体で免疫染色して、 Core抗体染色陽性、 すなわち、 感染細胞を数え たところ、 図 6 Bに示すように 394. 0 土 26. 5 個の感染細胞が確認された (全細胞中約 0. 51%)。 そこで、 この感染が rJFHl を Huh7細胞へトランス フエクシヨンすることにより、 培養液中に分泌された HCV粒子によるもの であるかどうかを確認した。 すなわち、 感染に用いる培養液を UV処理、 あ るいは、 RNA のトランスフエクシヨンの過程を行わずに調製した培養液を 用いて、 トランスフエクシヨンしていない Huh7を 15 匪カバースリップ上 で培養して、 48時間後に細胞を抗 Core抗体で免疫染色して感染細胞を数 えた。 その結果、 UV処理では感染細胞数が激減し、 RNAのトランスフエク シヨンの過程を行わずに調製した培養液では感染細胞が確認されなかった。 さらに、 感染させた HCV粒子が細胞内で RNA増幅して、 新たな HCV粒子 を培養液中に放出するかどうかを検討した。 rJFHlを Huh7細胞へトランス フエクシヨンして 48時間後の培養液を濃縮した HCV粒子を含む培養液 100 1で RNAを卜ランスフエクションしていない Huh7を培養して、経日的に 細胞及び、 培養液を回収して、 RNA を回収して、 上述した方法で HCV RNA 量を定量した。 結果は、 図 6 Cに示すよう、 細胞内で HCV RNAは一定量増 幅しており、上清においては経日的に HCV RNA量が増加した。一方、 rJFHl/ Δ Ε1-Ε2を Huh7細胞へトランスフエクシヨンして得た培養液を用いて、 同 様の検討を行っても、 細胞内及び、 培養液中で HCV RNAを検出することは できなかった。
これらの結果から、 rJFHlを Huh7細胞へトランスフエクシヨンすること により、 培養液中に分泌された HCV粒子は感染する能力を有し、 さらに感 染細胞中で HCV RNAを増幅して、 新たな HCV粒子を生産する能力を有する ことが確認された。
6 . rJCHl/NS5B (j fhl)を用いた HCV ウィルス粒子の作製
rJCHl/NS5B (j fhl)を Huli7細胞へトランスフエクシヨンすることにより、 培養液中に HCV粒子が分泌されるかどうか、また分泌された HCV 粒子に感 染性があるかどうかについて検討した。 rJCHl/NS5B (j f l) ¾: Hu 7 細胞に トランスフエクシヨンして 6日後の培養液を 5 .に記述した方法で濃縮後、 この培養液存在下で、 RNAをトランスフエクションしていない Huli7を培養 して、 経時的に細胞内の HCV RNA量を定量したところ、 培養開始後 12時間 後から経時的に細胞内の HCV RNA量が増加していた（図 7 A；)。 さらに、 RNA をトランスフエクションしていない Huh7を 15mniカバ一スリップ上で培養 して、 濃縮した培養液存在下で培養 48時間後に細胞を抗 Core抗体で免疫 染色して、 Core抗体染色陽性、 すなわち、 感染細胞を数えたところ、 図 7 B に示すよう に感染細胞が確認された。 これらの結果か ら、 rJCHl/NS5B (j f l)を Huli7細胞へトランスフエクシヨンすることにより、培 養液中に分泌された HCV粒子は感染能力を獲得し、さらに感染細胞中で HCV RNAを増幅して、新たな HCV粒子を生産する能力を有することが示された。 従って、 患者から分離した HCV株のように、 in vi t roで自律複製能を有 さない株についても、 その株の NS5B領域を rJFHlの NS5Bに置換すること により、 培養細胞系で自律複製し、 HCV粒子を産生させることができた。
[実施例 3 ]
1 . Conl/C- NS2/JFH- 1を用いた HCVウィルス粒子の作製
HCV遺伝子型 lbの Con- 1株と JFH-1の NS5B部分を含むキメラ HCV RNA を Huh7細胞にトランスフエクシヨンすることにより培養液中に HCV粒子が分 泌されるか、 また分泌された HC V粒子に感染性があるかどうかについて検 討した。
JFH-1 株の 5 ' UTR の下流に HCV遺伝子型 lbの Con- 1株の遺伝子番号 1から 1026 の配列 （Con 1 株の Core、 El、 E2、 p7 及び、 NS2 領域） を 連結して、その下流に、 JFH - 1 株の 1031から 3030 の領域（NS3 から NS5b) を連結させ、 さらにその下流に JFH- 1 株の 3 ' UTR を連結させたコンスト ラクトを作製した。 このコンストラクトを用いて、 実施例 1の 2に記した 方法で、 rConl/ C- NS2/JFH-1 キメラ HCV RNA を作製し、 実施例 2の 1に 記す方法で Huh7 に RNA をトランスフエクシヨンした。 Huh7 細胞に HCV RNA をトランスフエクシヨンして経時的に、 上清中のコアタンパクを測定 したところ、.約 48時間以降から、 上清中にコアタンパクが検出され、 細胞 上清中に HCV粒子が産生されていることが確認出来た。 次に、 その上清を 限外濾過により 20倍に濃縮後、 濃縮液を、 Huh7細胞に添加した。 培養 48 時間後に、 細胞を、 ゥサギ抗 NS3抗体により細胞を染色した。
■ その結果、 mock及び rJFH- 1/Δ ΕΕ卜 E2では、 抗 NS3抗体陽性細胞は認め られなかったが、 rJFH- 1及び rConl/C - NS2眉 - 1では、 抗 NS3抗体陽性細 胞が検出された。 以上の結果から、 rConl/C- NS2/JFH-1は JFH-1 同様に感 染性 HCV粒子を産生出来ることが確認できた。 [実施例 4 ] 全長キメラ HCVゲノム RNA由来の全長キメラ HCVレブリコン RNAの作製
( 1 ) 発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離した c型肝炎ウィルスである jra- 1株 （遺伝子 型 2a) のゲノム全長 cDNAを含む DNA (JFH-1クローン：配列番号 9 ) を、 pUC 19プラスミド中で T7 RNAプロモー夕一配列の下流に挿入したプラスミ ド DMを作製した。
具体的には、 JFH- 1株のウィルス RNAを増幅した RT- PCR断片を pGEM-T EASY vec tor (Promega)にクロ一ニングして pGEM 258、 pGEM44- 486、 pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEMl 141-2367, GEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970 、 PGEM5883-7003 、 pGEM6950-8035 、 pGEM7984-8892 、 PGEM8680-9283, pGEM9231- 9634及び pGEM9594- 9678の各プラスミド DNAを 得た (Kato e t al. , Gas t roenterology, (2003) 125 : ρ. 1808- 1817)。 各プ ラスミドに含まれるウィルスゲノム RNA由来の cDNAを PCR法及び制限酵素 を用いてつなぎ合わせて、全長のウィルスゲノム cDNAをクロ一ニングした。 全長のウィルスゲノムの上流に T7R RNAプロモータ一配列を揷入した。 こ のようにして構築されたプラスミド DNAを、以下、 pJFHl と称する。なお、 上記 JFH- 1 クローンの作製については、 特開 2002-171978号及び Kato ら (Kato e t al, , J. Med. Vi rol. , (2001) 64 (3)： . 334-339) に記載されて いる。 また JFH- 1クローンの全長 cDNAの塩基配列は、国際 MAデ一夕バン ク （DDBJ/EMBL/GenBank) のァクセッション番号： AB047639 に登録されて いる。
次に、プラスミド DNAである pJFHlの 5'非翻訳領域と core領域の間に、 EMCV-IRES (脳心筋炎ウィルスの内部リボゾーム結合部位）及びネオマイシ ン耐性遺伝子（neo；ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ遺伝子とも称 する） を挿入して、 プラスミド DNAである pFGREP-JFHlを構築した。 この 構築手順は、 Ikeda ら ( Ikeda et al. , J. Vi rol. , (2002) 76 (6)： p. 2997-3006) に従った。
( 2 ) キメラ発現ベクターの構築
JFH1株は、 HCV2a型由来の HCVであるが、 HCVlb型由来の TH株 （Waki ta et al. , J. Biol. Chem. , (1994) 269, p. 14205-14210, 及び Moradpour e t al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , (1998) 246, p. 920-924) を用いて、 キ メラ HCVベクターを作製した。 上記で作製した、 pFGREP- JFH1の、 コア、 El、 E2、 p7の部分を TH株由来のコア、 El、 E2、 p7に置換したキメラ HCV、 pFGREP-TH/JFHlを作製した。
なお、 本明細書では、 前記 JFH1株 （JFH- 1クローン由来） の全長及びキ メラに用いた TH株の部分 RNA配列 （HCV TH株の 5 ' 非翻訳領域から NS3 領域の一部を含む部分ゲノム RNA (卜 3748) ) をそれぞれ配列表の配列番号 9及び 10に示す。 前記 JFH- 1株の全長ゲノム RNA配列 （配列番号 9 ) 中、 「5'非翻訳領域」は 1〜340番、 「coreタンパク質コード配列」は 341〜913 番、 「E1タンパク質コード配列」 は 914〜1489番、 「E2タンパク質コード配 列」は 1490〜2590 番、「NS2タンパク質コード配列」は 2780〜3430番、「NS3 タンパク質コード配列」 は 3431〜5323番、 「NS4Aタンパク質コード配列」 は 5324〜5486番、 「NS4Bタンパク質コード配列」 は 5487〜6268番、 「NS5A タンパク質コード配列」 は 6269〜7663番、 「NS5Bタンパク質コード配列」 は 7664〜9442番に該当する。
( 3 ) 全長キメラ HCVレブリコン RNAの作製
全長キメラ HCVレブリコン RNA合成に用いる錶型 DNAを作製するために、 上記のとおり構築した発現べクタ一 PFGREP- TH/JFH1 を、 制限酵素 Xbalで 切断した。 次いで、 これらの Xbal切断断片ついて、 10〜20 z gを 50 1の 反応液中に含有させ、 Mimg Bean Nuc lease 20 Uを用いて 30でで 30分間 インキュベートすることにより、さらに処理した。 Mimg Bean Nuc leaseは、 二本鎖 DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。 通常、 上記 Xbal切断断片をそのまま鎵型として用いて RNA合成を行うと、 Xbalの認識配列の一部である CUGAの 4塩基が 3'末端に余分に付加された レブリコン RNAが合成されてしまう。 そこで本実施例では、 Xbal切断断片 を Mimg Bean Nuc l easeで処理することにより、 Xbal切断断片から CUGAの 4塩基を除去した。 この後、 Xbal切断断片を含む Mung Bean Nuc lease処理 後の溶液について、 通常法に従ったタンパク質除去処理により、 CUGAの 4 塩基が除去された Xbal切断断片を精製して、 これを铸型 DNAとした。
次に、 この鐯型 DNAから、 T7 RNAポリメラーゼを用いて RNAを in vi t ro 合成した。 この RNA合成には Ambion社の MEGAscr iptを用いた。 鐯型 DNA を 0. 5〜1. O i g含む反応液 20 1を製造業者の使用説明書に従って反応さ せた。
RNA合成終了後、 反応溶液に DNase (2U) を添加して 37 で 15分間反応 させた後、 さらに酸性フエノールによる RNA抽出を行って、 铸型 DNAを除 去した。このようにして pFGREP-TH/ JFH 1に由来する上述の铸型 DNAから合 成した RNAを、 rFGREP- TH/JFH1と命名した。 この rFGREP - TH/ JFH中のキメ ラ HCVゲノム RNAの塩基配列を配列番号 11に示す。 rFGREP- TH/JFH1は、 本発明における全長キメラ HCVレプリコン RNAの一例である。
[実施例 5 ] 全長キメラ HCVレプリコン RNA複製細胞の作製及び細胞クロ —ンの樹立
( 1 ) 全長キメラ HCVゲノム RNAの細胞内への導入
上記の通り合成した全長キメラ HCVゲノム RNA (rFGREP-TH/JFHl) を、 様々な量で、 Huh7細胞から抽出したトータル細胞性 RNAと混合して、 RNA 総量が 1 0 となるように調製した。 次いでその混合 RNAをエレクトロ ポレーシヨン法により Huh7細胞に導入した。 1 6時間から 24時間培養し た後に G418を様々な濃度で添加した。週に 2回培養液を交換しながら培養 を継続した。 21 日間培養した後、 クリスタルバイオレットで生存細胞を染 色した。 染色されるコロニー数を計測し、 トランスフエクシヨンした RNA 重量あたりに得られたコロニー数を計算した。 また、 一部の培養ディッシ ュでは生存細胞のコロニーをクローン化して培養を継続した。 クローン化 された細胞から RNA、 ゲノム DNA、 タンパク質をそれぞれ抽出した後、 全長 キメラ HCVレブリコン RNAの検出、 ネオマイシン耐性遺伝子のゲノム DNA への組み込みの有無、 HCV タンパク質の発現を検討した。 これらの結果の 詳細は下記に示す。
( 2 ) コロニー形成能
上記のトランスフエクシヨンの結果、 G418濃度が 1. O mg/mlの場合でも、 細胞のコロニー形成が認められた。 このことは、 rFGREP- TH/JFH1レプリコ ン RNA をトランスフエクシヨンした Huh7 細胞のコロニー形成能は、 rFGREP-TH/JFHlレブリコン RNAが自律複製することによって、ネオマイシ ン耐性遺伝子が持続的に発現され G418耐性が維持される結果、細胞増殖が 可能になったものと考えられた。 · [実施例 6 ] 培養上清中のキメラ H C Vウィルスの感染
培養上清中のキメラ H C Vウィルス粒子の感染実験
rFGREP-TH/JFHl を Huh7細胞へトランスフエクシヨンし、 樹立した全長 キメラ HCVレブリコン RNA複製細胞クローンの培養上清を回収して、 その 培養上清をさらに、感染をさせていない Huh7細胞に添加して、培養上清中 のウィルス粒子を Huh7細胞に感染させた。 感染翌日に感染させた Huh7細 胞の培養液に G418を 0. 3mg/ml添加し、 さらに 2 1日間培養した。 培養終 了後に細胞を固定し、 クリスタルバイオレッ トで染色したところ、 rFGREP-TH/JFHlをトランスフエクシヨンして得られた全長キメラ HCVレプ リコン RNA複製細胞クローンの培養上清を用いて感染させた細胞について コロニ一形成が観察された。 このことは、 rFGREP- TH/JFH1をトランスフエ クシヨンして得られた全長キメラ HCVレブリコン RNA複製細胞クローンか ら感染性の HCVが産生されていることを示しており、 更に、 その HCVは新 たな細胞への感染性を保持していることを示している。 [実施例 7 ] H C V粒子の精製 (1) ゲル濾過
図 1 1にゲル濾過クロマトグラフィによる HCV粒子の各フラクション での分布を示す。 用いたゲル担体はセフアクリル （登録商標） S 30 0、 S 400及び S 500である。 カラムクロマトグラフィに用いた HC V粒 子を含む溶液をそれぞれのゲル担体を含むカラムクロマトグラフィを利用 して精製した。精製する際に緩衝液は、 1 0 mM トリス塩酸塩、 1 m M エチレンジァミン四酢酸及び 1 00 mM 塩化ナトリウム （pH 8. 0) を用いた。 その結果、 セフアクリル （登録商標） S— 300では HCV粒子は Vo i d画分と呼ばれる素通り画分に得られた。 従って、 セ フアクリル （登録商標） S— 300を用いることにより分子量が小さな夕 ンパク質と分離し、 溶液の塩濃度の変更ができる。 その際、 HCVコア夕 ンパク質/全タンパク質量の比率はカラム精製前の HCV粒子と比較して 3. 78となり HCV粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇し た。 一方、 セフアクリル （登録商標） S— 400及び S - 500では HC V粒子は分子量に従って溶出される画分にあることから他の分子量のタン パク質と分離することができる。
(2) イオン交換クロマトグラフィ
図 1 2にイオン交換クロマトグラフィによる HCV粒子の各フラクショ ンでの分布を示した。 用いたゲル担体は、 S P S e p h a r o s e H P (登録商標） 及び Q S e p h a r o s e HP (登録商標） である。
S P S e p h a r o s e HP (登録商標） を用いたカラムでは、 5 0 mM クェン酸緩衝液 （pH 6. 2) でカラムを平衡化した。 分画 分子量 1 00, 000から 500， 000の限外濾過膜を用いて濃縮し 5 0 mM クェン酸緩衝液 （pH 6. 2) で希釈した H C V粒子を含む 溶液をカラムに添加後、 50 mM クェン酸緩衝液 （pH 6. 2 ) を カラム容量の 1 0倍程度カラムに流した。 次いで、 それぞれ 0. 1M N aC l、 0. 3 M NaC l又は、 1 M Na C lを加えた 50 mM クェン酸緩衝液 （PH 6. 2) をカラム容量の 3倍程度順番に流した。 その後、 1 M N a C 1を加えた 5 OmM クェン酸緩衝液（pH 6. 2 ) をカラム容量の 5倍程度流した （1 M Na C 1 W分画）。 その結果、 HCV粒子は0.1M Na C Iを加えた 50 mM クェン酸緩衝液（p H 6. 2) 画分に溶出した。
Q S e p h a r o s e HP (登録商標） では、 50 mM T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0) でカラムを平衡化した。 分画分子量 1 00， 000から 500, 0 00の限外濾過膜を用いて濃縮し 50 mM T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0) で希釈した HCV粒子を含む溶 液をカラムに添加後、 50 mM T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0) をカラム容量の 1 0倍程度カラムに流した。 次いで、 それぞれ 0. 1 M NaC l、 0. 3 M N a C 1又は、 1 M Na C lを加えた 50 mM T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0 ) をカラム容量の 3倍程度 順番に流した。 その後、 1 M Na C lを加えた 50mM T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0) をカラム容量の 5倍程度流した （ll^ N a C 1 W分画）。 その結果， HC V粒子は 0. 3 M N a C lを加えた 5 0 mM T r i s— HC 1緩衝液 （p H 8. 0) 画分に溶出した。 そ の際、 HCVコアタンパク質ノ全タンパク質量の比率はカラム精製前の H CV粒子と比較して 2. 32となり HCV粒子の占める全タンパク質にた いする割合が上昇した。
(3) ァフィ二ティ一クロマトグラフィ
図 1 3にレクチンァフィ二ティ一クロマトグラフィ一による HCV粒子 の各フラクションでの分布を示した。 レクチンァフィ二ティークロマトグ ラフィ一は、 RCA— 1 20、 C o nA、 L C A及び WG Aがそれぞれ結 合した担体を利用した。
C o nA、 L CA及び WGAァフィ二ティーク口マトグラフィでは、 リ ン酸緩衝生理食塩水でカラムを平衡化した。 分画分子量 1 0 0， 000か ら 500， 000の限外濾過膜を用いて濃縮しリン酸緩衝生理食塩水で希 釈した HCV粒子を含む溶液をカラムに添加後、 リン酸緩衝生理食塩水を カラム容量の 1 0倍程度カラムに流した。 次いで、 0. 3 5 M ラクト ースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の 3倍程度流した。 その 後、 0. 5 Mラクト一スを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の 5倍程度流した。 その結果、 L CA及ぴ C o nAァフィ二ティーク口マト グラフィでは担体への特異的結合はなかった。 WGAァフィ二ティーク口 マトグラフィでは、 HCV粒子は 0. 35 M ラクトースを加えたリン 酸緩衝生理食塩水画分へ溶出した。
RC A- 1 20ァフィ二ティ一ク口マトグラフィでは、 リン酸緩衝生理 食塩水でカラムを平衡化した。 分画分子量 1 00， 0 00から 50 0, 0 00の限外濾過膜を用いて濃縮しリン酸緩衝生理食塩水で希釈した HCV 粒子を含む溶液をカラムに添加後、 リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の 1 0倍程度カラムに流した。 次いで、 0. 3 8 M ラクト一スを加えた リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の 3倍程度流した。 その後、 0. 3 8 Mラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の 5倍程度流し た。 RCA- 120ァフィ二ティーク口マトグラフィでは、 HCV粒子は 0.38 M ラクト一スを加えたリン酸緩衝生理食塩水画分へ溶出した。 図 14にへパリン、 硫酸セル口ファインによる HCV粒子の各フラクシ ョンでの分布を示した。
それぞれのクロマトグラフィでは、 20 mM リン酸緩衝液（pH 7. 0) でカラムを平衡化した。 分画分子量 1 00， 000から 500， 00 0の限外濾過膜を用いて濃縮し 20 mM リン酸緩衝液（pH 7. 0) で希釈した HCV粒子を含む溶液をカラムに添加後、 リン酸緩衝液 （pH 7. 0) をカラム容量の 10倍程度カラムに流した。次いで、 0. 1 M、 0. 3 M、 0. 5 M、 もしくは 1 M Na C I を加えた 20 mM リン酸緩衝液 （PH 7. 0) をカラム容量の 3倍程度順番に流した。 そ の後、 1 M NaC lを加えた 20 mM リン酸緩衝液 （pH 7. 0) をカラム容量の 5倍程度流した。 その結果、 へパリンァフィ二ティー クロマトグラフィでは 0. 3 M N a C lを加えた 20 mM リン酸 緩衝液 （pH 7. 0) 画分へ溶出した。 その際、 HCVコアタンパク質 Z全タンパク質量の比率はカラム精製前の HCV粒子と比較して 0. 36 となり HCV粒子の占める全タンパク質にたいする割合が低下した。 硫酸 セル口ファインァフィ二ティ一クロマトグラフィでは、 HC V粒子は 0. 1 M N a C 1を加えた 20 mM リン酸緩衝液 （ p H 7. 0 ) 画 分へ溶出した。 図 1 5にブルーダイァフィ二ティークロマトグラフィ一による HCV粒 子の各フラクションでの分布を示した。
ブルーダイァフィ二ティークロマ卜グラフィでは、 C i b a c r o n B l u e F 3 G— Aをァガロース粒子に結合した担体をカラムに利用し た。 20 mM リン酸緩衝液 （pH 7. 0) でカラムを平衡化した。 分画分子量 1 00， 000から 500， 000の限外濾過膜を用いて濃縮 し 20 mM リン酸緩衝液 （pH 7. 0) で希釈した HCV粒子を含 む溶液をカラムに添加後、 リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の 1 0倍程 度カラムに流した。次いで、 1 M又は 2 M Na C lを加えた 20 m M リン酸緩衝液（pH 7. 0)をカラム容量の 3倍程度順番に流した。 その後、 2 M Na C lを加えた 20 mM リン酸緩衝液（pH 7. 0) をカラム容量の 5倍程度流した。 その結果， HCV粒子はカラム非結 合画分に溶出した。 その際、 HCVコアタンパク質 Z全タンパク質量の比 率はカラム精製前の HCV粒子と比較して 3. 3 3となり HC V粒子の占 める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
(4) ショ糖密度勾配遠心
上記実施例を参考にカラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を 組み合わせて H C V粒子の精製を行った。
まず Q S e p h a r o s e HP (登録商標） を用いて HCV粒子の 精製を行った。 50 mM T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0) で カラムを平衡化した。 分画分子量 1 00， 000から 500, 000の限 外濾過膜を用いて濃縮し 50 mM T r i s— HC 1緩衝液（pH 8. 0) で希釈した HCV粒子を含む溶液をカラムに添加後、 50 mM T r i s—HC 1緩衝液 （pH 8. 0 ) をカラム容量の 1 0倍程度カラム に流した。 次いで、 それぞれ 0. 1M N a C 0. 3 M NaC l又 は、 1 M NaC lを加えた 50 mM T r i s— H C 1緩衝液 （ p H 8. 0) をカラム容量の 3倍程度順番に流した。 その後、 1 M N &(31を加ぇ.た50111^： T r i s— HC 1緩衝液 （pH 8. 0) を力 ラム容量の 5倍程度流した（1M N a C 1 W分画）。図 1 6 Aに示すよう に 0.3 M Na C lを加えた 50 mM T r i s— H C 1緩衝液（ p H 8. 0)、 1 M N a C 1を加えた ·5 0 mM T r i s — HC 1緩 衝液 （pH 8. 0 ) 分画及び 1 M N a C 1 W分画に HCV粒子は溶出 した。 HCV粒子を含んだ分画を収集したところ HCVコアタンパク質 Z 全タンパク質量の比率はカラム精製前の HCV粒子と比較して 2. 2 9と なり HCV粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
次に、 硫酸セルロフアインクロマトグラフィを用いて HCV粒子の精製 を行った。 それぞれのクロマトグラフィでは、 2 0 mM リン酸緩衝液 (pH 7. 0) でカラムを平衡化した。 Q S e p h a r o s e HP _ (登録商標） を用いて精製した HCV粒子を含んだ分画を分画分子量 1 0 0， 0 0 0から 5 0 0 , 0 0 0の限外濾過膜を用いて濃縮し 2 0 mM リ ン酸緩衝液 （PH 7. 0) で希釈した HCV粒子を含む溶液をカラムに 添加後、 リン酸緩衝液 （P H 7. 0) をカラム容量の 1 0倍程度カラム に流した。 次いで、 0. 2 5 M又は 1 M N a C lを加えた 2 0 m M リン酸緩衝液（p H 7. 0 )をカラム容量の 3倍程度順番に流した。 その後、 1 M N a C lを加えた 2 0 mM リン酸緩衝液（pH 7 - 0) をカラム容量の 5倍程度流した。 図 1 6 Bを示すように 1 M N a C 1を加えた 2 0 mM リン酸緩衝液 （pH 7. 0 ) に HCV粒子は 主に溶出した。 1 M N a C lを加えた 2 0 mM リン酸緩衝液 （p H 7. 0) において HCVコアタンパク質 Z全タンパク質量の比率はカラム 精製前の HC V粒子と比較して 3 1. 4となり HCV粒子の占める全タン パク質にたいする割合が上昇した。
さらに、 ショ糖密度勾配遠心を用いて精製を行った。 硫酸セルロフアイ ンクロマトグラフィを用いた 1 M N a C lを加えた 2 0 mM リン 酸緩衝液 （pH 7. 0) 分画を分画分子量 1 0 0， 0 0 0から 5 0 0， 0 0 0の限外濾過膜を用いて濃縮し TEN緩衝液 （1 0 mM トリス塩 酸緩衝液（pH 8. 0)、 0. 1 M 塩化ナトリウム、 1 mM ェ チレンジァミン四酢酸 （p H 8. 0 )) で希釈した。 HCV粒子を含んだ 溶液を、 6 0.%、 5 0 %、 4 0 %、 3 0 %, 2 0 %及び 1 0 %ショ糖溶液 を積層した上に重層し、 3 9 0 k X g、 1 8時間、 4°Cで遠心をした。 ほ ぼ比重が 1. 2のあたりに HCV粒子が集まっていたので、 その分画を採 取した。 採取した分画において、 HCVコアタンパク質 Z全タンパク質量 の比率はカラム精製前の HCV粒子と比較して 1. 6 9となり HCV粒子 の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
ショ糖密度勾配遠心により精製された HCV粒子を含んだ分画は、 精製 を開始する前と比較すると HCVコアタンパク質 Z全タンパク質量の比率 は 1 2 0倍程度まで精製された。 最終的な分画に HCV粒子は 1 09 c o p i e s /mL含まれていた。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考 として本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、種々の遺伝子型の HCV 株のウィルス粒子を培養細胞系で 生産することができる。 すなわち、 患者から分離した HCV株のように、 in vitroで自律複製能を有さない HCV株についても、その NS3から NS4、NS5A、 NS5Bタンパク質をコードする RNA配列部分を JFH1の NS3から NS4、 NS5A、 NS5Bタンパク質をコ一ドする RNA配列部分に置換することにより、培養細 胞系で自律的に複製させ、 HCV粒子を産生させることができる。 本発明に より精製された HCV粒子は、 そのまま医療用途のワクチンとして利用す ることができる。 本発明で提供される HCVゲノム RNAやウィルス粒子は、 外来遺伝子のウィルスベクタ一としても利用できる。 また、 本発明の方法 は、 HCVの感染過程の研究や、 HCVの感染過程に影響を及ぼす各種物質のス クリーニング系としても利用できる。 配列表フリーテキス卜
配列番号 1： JFH1株の NS3、 NS4、 NS5A、 及び NS5Bタンパク質をコードす る RNA部分配列 （cDNA配列）
配列番号 ： JFH1の NS5Bタンパク質コード配列 （cDNA配列）
配列番号 3： JFH1の NS5Bタンパク質
配列番号 4 : JFH1 E2 領域を基に設計した合成ペプチド 配列番号 5 :.JFH1 E2 領域を基に設計した合成ペプチド 配列番号 6： プライマー （R6- 130- S17)
配列番号 7 : プライマー （R6- 290- R19)
配列番号 8： Ta Manプローブ (R6-148-S21FT)
配列番号 9 : HCV JFH1株 （JFH-1クローン） の全長ゲノム RNA
配列番号 10： HCVTH株の 5' 非翻訳領域から NS3領域の一部を含む部分ゲ ノム RNA (1-3748)
配列番号 11： HGV JFH1株 （JFH-1クローン） のゲノム RNAと HCV TH株の ゲノム RNAから構成されたキメラ HCVゲノム RNA

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 2種以上の C型肝炎ウィルスのゲノム RNAからなり、5'非翻訳領域、 coreタンパク質コード配列、 E1 タンパク質コード配列、 p7タンパク質コ 一ド配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 配列番 号 1で示される JFH1株の NS3、 NS4、 NS5A、 及ぴ NS5Bタンパク質をコード する RNA部分配列、 ならびに 3'非翻訳領域を含み、 かつ自律複製能を有す る、 改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNA。
2 . 2種以上の C型肝炎ウィルスのゲノム RNAからなり、 5'非翻訳領域、 coreタンパク質コード配列、 E1 タンパク質コード配列、 p7タンパク質コ 一ド配列、 E2タンパク質コード配列、 NS2タンパク質コード配列、 NS3 タ ンパク質コ一ド配列、 NS4Aタンパク質コ一ド配列、 NS4Bタンパク質コード 配列、 NS5Aタンパク質コード配列、 配列番号 2で示される JFH1株の NS5B タンパク質コード配列、 及び 3'非翻訳領域を含み、 かつ自律複製能を有す る、 改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNA。
3 . C型肝炎ウィルス株が遺伝子型 la、 遺伝子型 lb、 遺伝子型 2a、 遺 伝子型 2b、 遺伝子型 3a、 及び遺伝子型 3bのウィルス株から選ばれるもの である、 請求項 1又は 2記載の改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNA。
4 . C型肝炎ウィルス株が遺伝子型 lb及び遺伝子型 2aのウィルス株か ら選ばれるものである、 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の改変された C 型肝炎ウィルスゲノム RNA。
5 . 遺伝子型 lbのウィルス株が、 HCV- conl株、 HCV- TH株、 HCV-J株、 HCV-JT及び HCV- BK株から選ばれるものである、 請求項 3又は 4記載の改 変された C型肝炎ウィルスゲノム RNA。
6 . 遺伝子型 2aのウィルス株が、 HCV- J6株、 HCV-JFH1株、及ぴ HCV- JCH1 株から選ばれるものである、 請求項 3〜 5のいずれか 1項記載の改変され た C型肝炎ウィルスゲノム RNA。
7. 請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の改変された C型肝炎ウィルスゲ ノム KNAを含む、 肝細胞指向性ウィルスベクター。
8.. 請求項 1〜 6のいずれか 1項記載の改変された C型肝炎ウィルスゲ ノム RNAを導入され、 該 C型肝炎ウィルスゲノム RNAを複製しかつウィル ス粒子を産生しうる細胞。
9. 請求項 8記載の細胞を培養し、 培養物中から得られる C型肝炎ウイ ルス粒子。
10. 請求項 9記載の HCVを含有する液体又は、 細胞破砕物を、 カラムク 口マトグラフィ及び Z又は密度勾配遠心を組み合わせることにより HCV 粒子を精製する方法。
1 1. 前記記載のカラムクロマトグラフィが、 イオン交換クロマトグラフ ィ、 ゲル濾過クロマトグラフィ、 及びァフィ二ティ一クロマトグラフィの 中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィである請求項 10の方法。
12. 前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、 陰イオンクロマ卜ダラ フィ及び陽イオンクロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマト グラフィであり、 前記記載のゲル濾過クロマトグラフィが S e p a h c r y 1 - S 300 (登録商標）、 S e p ah c r y l— S 400 (登録商標） 又は S e ph a c r y l -S 500 (登録商標） から選ばれる樹脂を利用 した一つ以上のクロマトグラフィであり、 前記記載のァフィ二ティーク口 マトグラフィ.が硫酸化セル口ファイン、 へパリン及びレクチンの中から選 ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマ卜グラフィである請求項 11の方 法。
13. 前記記載のクロマトグラフィが硫酸セル口ファインクロマトグラフ ィである請求項 1 1の方法。
14. 前記記載の密度勾配遠心が、 塩化セシウム、 ショ糖及び糖の重合体 より選ばれる一つ以上の溶質を用いて行われる請求項 1 0の方法。
1 5. 前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマトグラフィ、 硫酸セル口 ファインクロマトグラフィ、 及びショ糖密度勾配遠心をそれぞれ一回以上 任意の順番で組み合わせた請求項 1 0の方法。
16. 請求項 9記載 HCV粒子を含有する液体あるいは細胞破砕液を、 力 ラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心を組み合わせる H C V粒子の精製 方法により得られた H C V粒子。
1 7. 前記記載のカラムクロマトグラフィが、 イオン交換クロマトグラフ ィ、 ゲル濾過クロマトグラフィ、 及びァフィ二ティークロマ卜グラフィの 中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィで精製された請求項 1 6の H C V粒子。
1 8. 前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、 陰イオンクロマトダラ フィ及び陽イオンク口マトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマト グラフィであり、 前記記載のゲル濾過クロマトグラフィが S e p a h c r y 1 - S 300 (登録商標）、 S e p a h c r y l -S 400 (登録商標） 又は S e p h a c r y l— S 500 (登録商標） から選ばれる樹脂を利用 した一つ以上のクロマトグラフィであり、 前記記載のァフィ二ティーク口 マトグラフィが硫酸化セル口ファイン、 へパリン及びレクチンの中から選 ばれる一つ以上のクロマトグラフィにより精製された請求項 1 6の HC V 粒子。
1 9. 前記記載のクロマトグラフィが硫酸セル口ファインクロマトグラフ ィで精製された請求項 1 6の HCV粒子。
20. 前記記載の密度勾配遠心が、 塩化セシウム、 ショ糖及び糖の重合体 より選ばれる一つ以上の溶質を用いて精製された請求項 1 6の HCV粒子。
2 1. 前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマ卜グラフィ、 硫酸セル口 ファインクロマ卜グラフィ、 及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせて精製 された請求項 1 6の HCV粒子。
22. 請求項 8記載の C型肝炎ウィルス粒子又はその一部分を抗原とし て使用して得られうる C型肝炎ワクチン及び 又は中和抗体。
2 3.. 請求項 8記載の C型肝炎ウィルス粒子が感染した C型肝炎ウィル ス感染細胞。
24. 請求項 8記載の細胞を培養し、 培養物中からウィルス粒子を回収 することを特徴とする、 C型肝炎ウィルス感染細胞の製造方法。
2 5. 請求項 8記載の細胞を培養し、 培養物中のウィルス粒子を他の細 胞に感染させることを特徴とする、 C型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法。
26. 被験物質の存在下で請求項 8又は請求項 2 3記載の細胞を培養し、 培養物中の C型肝炎ウィルス RNA又はウィルス粒子を検出することにより、 該被験物質の抗 C型肝炎ウィルス効果を評価することを特徴とする、 抗 C 型肝炎ウィルス物質のスクリーニング方法。
2 7. 請求項 22記載の C型肝炎ワクチン及び 又は中和抗体を製造す る方法。
2 8 . 外来遺伝子をコードする RNAを請求項 1〜 6のいずれか 1項記載 の改変された C型肝炎ウィルスゲノム RNA中に挿入し、 これを目的とする 細胞中に導入して複製又は発現させることを特徴とする、 細胞内で外来遺 伝子を複製及び/又は発現させる方法。
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