WO2010038789A1 - Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質２に結合する抗体及びそれを用いたｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の同定方法 - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質２に結合する抗体及びそれを用いたｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の同定方法 Download PDF

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genotype
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脇田隆字
赤澤悠子
中村紀子
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東レ株式会社
国立感染症研究所長が代表する日本国
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    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that binds to envelope protein 2 of hepatitis C virus and a method for identifying the genotype of hepatitis C virus using the same.
  • Hepatitis C virus (Hepatitis C virus; HCV) is a major causative virus for non-A non-B hepatitis, and is mainly transmitted through blood transfusion and sexual contact (Non-patent Document 1).
  • the number of HCV holders in Japan is estimated to be over 2 million including those who do not show symptoms of hepatitis (virus carriers), and over 170 million in the world.
  • the main reasons for the increase in the number of HCV holders are that the chronicity of hepatitis due to HCV infection is as high as 70 to 80%, and there is no effective antiviral agent other than interferon.
  • hepatitis C More than half of the patients with chronic hepatitis C are almost surely going to worsen and are known to progress to cirrhosis and liver cancer, so hepatitis C is a serious infection with a poor prognosis. It can be said that there is. For this reason, research on the treatment of hepatitis C and detection of HCV is medically important, and the development of new therapeutic methods and therapeutic agents is desired.
  • HCV is an RNA virus having about 9.6 kb + strand single-stranded RNA as a genome, and this genome contains 10 types of viral proteins (Core, E1) with host-derived signal peptidase and HCV-derived protease after translation. , E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B). HCV is classified into 10 or more genotypes (for example, 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, and 3b) by systematic analysis of the base sequence of the genome (Non-Patent Documents 1 to 4).
  • Non-Patent Documents 5 and 6 Non-Patent Documents 5 and 6).
  • Non-patent Document 7 it has been found that there is a difference in the strength of the antiviral action of interferon between HCV of genotype 2a and HCV of genotype 2b where the effect of interferon is recognized relatively well. It has been suggested that a stronger action is observed on HCV genotype 2a than HCV type 2b (Non-patent Document 7).
  • Non-patent Document 1 As a diagnostic method for HCV, anti-HCV antibody that recognizes NS4 region (C100-3 antigen) of non-structural region of HCV is present in the serum of hepatitis C patients at a ratio of 70 to 80%.
  • An HCV antibody test that detects anti-HCV antibodies in serum using three antigens is known (Non-patent Document 1).
  • a second generation antibody assay system in which C100-3 antigen, core antigen and NS3 region antigen are combined to increase detection sensitivity, and further, a third generation antibody assay including NS5 region antigen is included. Systems have been developed and HCV antibody testing using these assay systems has been used (Non-patent Document 8).
  • Non-patent Document 9 an HCV core antigen test (Non-patent Document 9) that directly measures the amount of HCV core protein in serum, or a nucleic acid amplification test that checks the presence or absence of the HCV genome by PCR ( There is Nucleic acid Amplification Test (NAT) (Non-Patent Document 10).
  • NAT Nucleic acid Amplification Test
  • the core protein as a target molecule exists inside the HCV particles, it is necessary to use SDS to break the envelope and release the core protein.
  • the detection sensitivity may be affected by denaturing the core protein or releasing substances that inhibit the antigen-antibody reaction.
  • RNA in the serum of the subject is used as a target molecule, so the preservation and stability of the test sample are lacking, and there are various problems and cautions in using the RT-PCR method.
  • RNA which is the target molecule
  • RNA is transcribed into DNA and PCR is performed, it becomes false negative due to RNA degradation or inactivation / inhibition of reverse transcriptase, or false positive due to cross-contamination to the reaction system. .
  • the present invention relates to an antibody that binds to an envelope on the surface of HCV and can be used to identify HCV genotypes having genotypes of 1a, 1b, and 2a, and a method for identifying HCV genotype using these antibodies. It is intended to provide.
  • the present inventors have intensively studied and obtained a hybridoma that produces a monoclonal antibody using the HCV envelope protein 2 having a genotype of 2a as an antigen, from which a HCV genotype 2a is obtained. Binds specifically to only the envelope protein 2 of HCV, binds only to the envelope protein 2 of both HCV genotypes 2a and 1b, and binds to both the envelope protein 2 of HCV genotypes 2a, 1b and 1a And the present invention has been completed.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to HCV envelope protein 2 of genotype 2a and does not immunologically react to HCV envelope protein 2 of genotype 1a.
  • the antibody is preferably an antibody that recognizes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing as an epitope.
  • an antibody produced by a hybridoma cell line having a receipt number of FERM ABP-11181 is used. It can be illustrated.
  • the above antibody specifically binds to HCV envelope protein 2 of genotype 2a, and has immunology to HCV envelope protein 2 of genotype 1a and HCV envelope protein 2 of genotype 1b. It is preferable that the antibody does not react.
  • the antibody is more preferably an antibody that recognizes the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 3 in the sequence listing as an epitope.
  • a hybridoma having a receipt number of FERM ABP-11180 or FERM ABP-11179 Examples include antibodies produced by cell lines.
  • the antibody is preferably an antibody that specifically binds to envelope protein 2 of the J6CF strain and does not immunologically react with envelope protein 2 of the JFH1 strain.
  • examples include an antibody that recognizes the amino acid sequence described in 4 as an epitope, and an antibody that is produced by a hybridoma cell line having a receipt number of FERM ABP-11183.
  • the present invention binds to an antibody produced by a hybridoma cell line having a receipt number of FERM ABP-11181, and any of antibodies produced by a hybridoma cell line having a receipt number of FERM ABP-11180 and FERM ABP-11179.
  • the HCV genotype that does not bind to NFV is identified as 1b, binds to an antibody produced by a hybridoma cell line with the receipt number FERM ABP-11181, and the receipt numbers are FERM ABP-11180 and FERM ABP-11179.
  • HCV genotype that binds to an antibody produced by a hybridoma cell line is identified as 2a, binds to an antibody produced by a hybridoma cell line with the receipt number FERM ABP-11182, and the receipt number is FERM ABP - 1181, FERM ABP-11180 and identified as 1a genotype of HCV that do not bind to any of antibodies produced by the hybridoma cell line is FERM ABP-11179, provides methods for identifying a genotype of HCV.
  • hepatitis C patients infected with HCV genotypes 1a or 1b whose therapeutic effect by interferon therapy cannot be expected can be reduced, and an opportunity to select a new treatment method can be provided.
  • FIG. 1 It is a schematic diagram of the precursor protein of HCV. The black square indicates the transmembrane region. It is a schematic diagram of a fusion protein of 3 ⁇ FLAG protein and antigen E2 protein. It is a schematic diagram of a fusion protein of an antigen E2 protein and a human immunoglobulin Fc domain. It is the figure which showed the result of SDS-PAGE of each fraction of the refinement
  • FIG. 3 shows the binding of each monoclonal antibody to various Eenoproteins of HCV of various genotypes / strains and antibody subtypes. Intensity of antibody binding to antigen E2 protein is indicated by ⁇ to +++.
  • 8D10-3 binds to HCV antigen E2 protein of genotypes 1a, 1b and 2a, 1G2-32 and 2F2-7 bind to antigen E2 protein of genotype 2a, and 4E8-8 has genotypes 1b and 2a.
  • M1E12-1 is a monoclonal antibody that binds to the antigen E2 protein of the JFH1 strain
  • 9A5-4 is a monoclonal antibody that binds to the antigen E2 protein of the JFH1 strain and the H77 strain.
  • the antibody of the present invention specifically binds to envelope protein 2 (hereinafter referred to as E2 protein) of HCV (hereinafter referred to as HCV2a) whose genotype is 2a, and E2 protein of HCV (hereinafter referred to as HCV1a) whose genotype is 1a
  • E2 protein envelope protein 2
  • HCV1a E2 protein of HCV
  • HCV1b an antibody that does not immunologically react with both E2 protein of HCV1a and E2 protein of HCV whose genotype is 1b
  • HCV1b an antibody that does not immunologically react with both E2 protein of HCV1a and E2 protein of HCV whose genotype is 1b
  • the above antibody immunizes an animal with an antigen protein consisting of a region not containing the transmembrane region (also referred to as a transmembrane domain) of the HCV E2 protein (also referred to as a transmembrane domain) as an antigen, and a monoclonal antibody against the E2 protein
  • E2 protein is one of functional viral proteins generated by cleavage of HCV precursor protein by a host cell-derived signal peptidase and two proteases encoded by HCV itself, and is HCV2a.
  • methionine located at the N-terminus of the precursor protein is the first amino acid, it is a protein located at the 384th to 750th (367 amino acids).
  • the region from amino acids 722 to 750 of the E2 protein is a transmembrane domain (Cocquerel et al., J. Virol., 2000, 74, pp. 3623-3633).
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a precursor protein of HCV.
  • Antigen to immunize animals to obtain the above-mentioned antibody is a protein consisting of a region not including the transmembrane region of E2 protein of HCV2a (hereinafter referred to as antigen E2 protein)
  • antigen E2 protein a protein consisting of a region not including the transmembrane region of E2 protein of HCV2a
  • antigen E2 protein a protein consisting of a region not including the transmembrane region of E2 protein of HCV2a
  • antigen E2 protein a protein consisting of a region not including the transmembrane region of E2 protein of HCV2a
  • a protein consisting of the 384th to 720th amino acids of the precursor protein of HCV2a (for example, SEQ ID NO: 5) may be selected.
  • the 530th to 562nd amino acids of the precursor protein may be selected. It is preferable to select a protein comprising the amino acid sequence consisting of the amino acid sequence consisting of the 465th to 484th amino acids, the amino acid sequence consisting of the 559th amino acid to the 584th amino acid of the precursor protein, and the 683th It is more preferable to select a protein containing one or more amino acid sequences consisting of the group consisting of the amino acid sequence consisting of the amino acid sequence from the amino acid sequence to the 719th amino acid sequence.
  • the 530th to 562nd amino acids (more preferably, the 531st to 549th amino acids, more preferably the 531st amino acid of the precursor protein of HCV2a (for example, SEQ ID NO: 5).
  • Peptide having a peptide length of 10 to 19 amino acids (more preferably 10 amino acids), and the 465th to 484th amino acids of the precursor protein may be selected.
  • An amino acid (more preferably, the 465th to 477th amino acids, still more preferably the 468th to 477th amino acids), and the length of the peptide is 10 to 13 amino acids (more preferably 10 amino acids)
  • a certain peptide, amino acid from the 559th to the 584th amino acid of the precursor protein (more preferably, A peptide or precursor containing 564th to 576th amino acids, more preferably 567th to 576th amino acids) and having a peptide length of 10 to 13 amino acids (more preferably 10 amino acids)
  • the 683th to 719th amino acids of the body protein preferably, the 704th to 719th amino acids, more preferably the 709th to 719th amino acids
  • the length of the peptide is 10 to It is more preferable to select a peptide having 19 amino acids (more preferably, 10 amino acids).
  • the base sequence of the genome of HCV2a has already been clarified in several virus strains (Yanagi et al., Virology, 1999, 262, p. 250-263), and is available from GenBank.
  • GenBank accession number disclosing the genome sequence of the JFH1 strain that is HCV2a is AB047639
  • GenBank accession number disclosing the genome sequence of the J6CF strain is AF177036.
  • antigen E2 peptide selected as described above can be directly chemically synthesized based on the amino acid sequence information of the precursor protein of HCV2a. For example, if a peptide synthesizer is used, An antigen that can be used for immunization of animals can be easily prepared in large quantities.
  • antigen E2 protein selected as described above was obtained by synthesizing a DNA fragment encoding the antigen E2 protein based on the nucleotide sequence information of the region encoding the precursor protein of HCV2a. If the antigen E2 protein is translated in cells from the obtained DNA fragment, a large amount of antigen that can be used for immunization of animals can be prepared. This will be specifically described below.
  • the antigen E2 protein can be produced in each cell by constructing an expression vector incorporating a DNA fragment encoding the antigen E2 protein and transducing, for example, mammalian cells, insect cells, yeast, E. coli, etc. However, it is preferably secreted and expressed in mammalian cells.
  • the DNA fragment encoding the antigen E2 peptide may be ligated downstream of the signal peptide sequence so that the frame of the codon matches, and a stop codon may be added to the 3 'end and inserted into the expression vector.
  • mammalian cells that secrete and express the antigen E2 protein include COS-1, COS-7, Vero, CV-1, CHO (hereinafter, CHO, dhfr gene-deficient CHO, hamster cell BHK, rat GH3, rat melanoma) Derived cells PC12, mouse L cells, mouse C127 cells, mouse myeloma cells SP2 / 0, NSO, NS-1, mouse lymphoma cells EL4, mouse fibroblasts NIH3T3, 10T1 / 2, mouse myoblasts C2C12, mouse stromal cells PA6 , ST2, OP9, Tst-4, human megakaryocyte CMK, human T cell Jurkat, human renal epithelial cell 293, human liver cancer cell Huh7, HepG2, IMY-N9, human osteosarcoma cell MG-63, human FL cell , White fat cells, egg cells, ES cells Kill.
  • COS-1 COS-7
  • Vero CHO
  • DNA encoding the protein can be inserted and used under the control of a promoter.
  • promoters that can be used for recombinant expression of antigen E2 protein in mammalian cells include, for example, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, actin promoter, EF-1 ⁇ (longation factor-1 ⁇ ) promoter, ubiquitin Examples thereof include promoters and PGK (phosphoglycerate kinase) promoters.
  • Expression vectors for secreting and expressing the antigen E2 protein in mammalian cells include, for example, pSecTag / FRT / V5-His (Invitrogen), p3 ⁇ FLAG-CMV-9 (Sigma), p3 ⁇ FLAG-CMV13 ( Sigma), pFUSE-Fc2 (In vivoGen) and pTriEx-7 (Novagen).
  • the signal peptide sequence incorporated in the expression vector is preferably a signal peptide of preprotrypsin, and vectors having a signal peptide sequence of preprotrypsin are p3 ⁇ FLAG-CMV-9 (Sigma), p3 ⁇ FLAG-CMV. -13 (Sigma).
  • a signal peptide since a signal peptide is removed when the protein containing a signal peptide is expressed in a mammalian cell, a signal peptide does not become a problem when using antigen E2 protein.
  • the target antigen E2 protein When secreting and expressing the antigen E2 protein in mammalian cells, the target antigen E2 protein is expressed as a fusion protein with a labeled protein (eg, Tag), and an antibody or a molecule that specifically binds to the labeled protein is used.
  • a labeled protein eg, Tag
  • labeled proteins include FLAG peptide, 3 ⁇ FLAG peptide, HA peptide, 3 ⁇ HA peptide, myc peptide, 6 ⁇ His peptide, GST polypeptide, MBP polypeptide, PDZ domain polypeptide, alkaline phosphatase, immunoglobulin Fc domain
  • Examples include avidin. FLAG peptides, HA peptides and immunoglobulin Fc domains are suitable as labeled proteins used for the preparation of the antigen E2 protein, and immunoglobulin Fc domains are more suitable.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a fusion protein of antigen E2 protein and 3 ⁇ FLAG protein
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a fusion protein of antigen E2 protein and immunoglobulin Fc domain.
  • immunoglobulin Fc domain those derived from human, monkey, mouse, rat, rabbit, hamster, and chicken can be used, and those derived from human are preferred.
  • the immunoglobulin heavy chain class constituting the immunoglobulin Fc domain may be any of IgM, IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4.
  • the amino acid sequence of human immunoglobulin has been reported by Edelman et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1969, 63, p. 78-85).
  • the nucleotide sequence information of human immunoglobulin heavy chain cDNA is available from GenBank (heavy chain accession number: BX640627, etc.). Based on the obtained nucleotide sequence, a PCR primer was designed to produce human spleen cells.
  • the cDNA of immunoglobulin Fc domain can be cloned by PCR using the cDNA library or human genomic DNA as a template.
  • the HCV E2 protein and immunoglobulin Fc domain can be linked directly, but may be linked by inserting a peptide serving as a linker.
  • peptides serving as linkers include Ser-Gly, Asp-Pro, Asp-Pro-Glu, Gly-Asp-Pro-Glu, Gly-Gly-Gly-Ser, and (Gly-Gly-Gly-Ser) ⁇ 3. Can be mentioned.
  • insect cells such as Sf21, Sf9, and High Five TM are transformed with an expression vector using a polyhedrin (polyhedron) promoter, p10 promoter, or the like. It may be introduced to express the antigen E2 protein or the fusion protein of the antigen E2 protein and the labeled protein.
  • a polyhedrin polyhedron promoter, p10 promoter, or the like. It may be introduced to express the antigen E2 protein or the fusion protein of the antigen E2 protein and the labeled protein.
  • yeast When secreting and expressing the antigen E2 protein in yeast, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia pastoris, Transduction with an expression vector using heat shock protein protein promoter, MF ⁇ 1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, etc., and antigen E2 protein or fusion protein of antigen E2 protein and labeled protein May be expressed.
  • yeast for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia pastoris, Transduction with an expression vector using heat shock protein protein promoter, MF ⁇ 1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, etc.
  • antigen E2 protein or fusion protein of antigen E2 protein and labeled protein May be expressed.
  • the antigen E2 protein is secreted and expressed in E. coli, for example, XL1-Blue strain, BL-21 strain, JM107 strain, TB1 strain, JM109 strain, C600 strain, HB101 strain, etc.
  • the antigen E2 protein or the fusion protein of the antigen E2 protein and the labeled protein may be expressed by transformation using an expression vector using a PL promoter, T7 promoter, tac promoter or the like.
  • Examples of the method for transducing an expression vector for secreting and expressing the antigen E2 protein in mammalian cells and insect cells include lipofection method, calcium phosphate method, electroporation method, DEAE-dextran method, and microinjection method. More specifically, Molecular Cloning 3rd. Ed. 16.1-16.62 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001).
  • the method for introducing an expression vector into E. coli is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into E. coli.
  • a method using calcium ions Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1972, 69, p. 2110 to 2114
  • electroporation method and the like can be mentioned.
  • the method for introducing an expression vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • an electroporation method (Becker et al., Methods. Enzymol., 1990, 194, pp. 182-187). ), Spheroplast method (Hinn et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1978, 75, p. 1929-1933), lithium acetate method (Itoh et al., J. Bacteriol., 1983, 153). Volume, p.163 to 168).
  • Culture of the transduced cells may be carried out by a method known per se.
  • a medium for culturing mammalian cells include MEM medium and DMEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • RPMI 1640 medium 199 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 1950, Vol. 73, p. 1) and the like, and the pH is preferably about 6-8.
  • serum-free medium CD-CHO, 293 SFM-II, and Hybridoma-SFM (all of which are Invitrogen) can be used, and serum and supplements may be added as necessary.
  • the cells may be cultured at 30 to 40 ° C. for 15 to 60 hours, and aeration and agitation are preferably performed as necessary.
  • the culture medium is centrifuged to remove cells, and the antigen E2 protein or a fusion protein of the antigen E2 protein and the labeled protein can be purified from the obtained culture supernatant.
  • Purification of the antigen E2 protein or the fusion protein of the antigen E2 protein and the labeled protein may be performed according to a protein separation and purification method known to those skilled in the art. For example, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. It can be isolated and purified by combining.
  • the antigen E2 protein in the culture medium can be easily purified by using a heparin column or a lectin column.
  • an anti-FLAG antibody column is used with 6 ⁇ His peptide.
  • a nickel column, a zinc column and a cobalt column are used in the case of a fusion protein.
  • a protein A column and a protein G column are used in the case of a fusion protein with an immunoglobulin Fc domain.
  • an anti-HA antibody column is used for a chimeric protein having an HA peptide. If used, it can be purified more efficiently.
  • Purified antigen E2 protein or fusion protein of antigen E2 protein and labeled protein can be detected by Coomassie brilliant blue staining or silver staining after fractionation by SDS-PAGE.
  • an antibody against the fused labeled protein Can also be detected by Western blotting.
  • the animal to be immunized may be any non-human animal having spleen cells capable of producing hybridoma cells. Examples thereof include mice, rats, hamsters, rabbits and chickens, and mice can be used more preferably.
  • Boosting can be achieved by administering only the antigen E2 peptide or antigen E2 protein intravenously or intraperitoneally, and blood or spleen cells may be collected on days 3 to 10 (preferably day 4).
  • serum obtained from the collected blood can be used as a polyclonal antibody as long as the antibody titer is measured and the antigen of interest is specifically recognized.
  • adjuvants examples include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, a mixture of aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine, Titer Max Gold (Vaxel) or GERBU adjuvant (GERBU Biotechnik).
  • the antibody titer in the blood is measured from the fundus venous plexus or tail vein of the immunized animal, and the obtained blood is checked for the presence or absence of an antibody that reacts with the antigen E2 peptide or antigen E2 by enzyme immunoassay (EIA) Find it out.
  • EIA enzyme immunoassay
  • myeloma cells used for cell fusion include mouse-derived cell lines P3-X63Ag8-U1 (P3-U1), SP2 / 0-Ag14 (SP2 / 0), and P3-X63-Ag8653 (653). ), P3-X63-Ag8 (X63), P3 / NS1 / 1-Ag4-1 (NS1), etc., and these cell lines are available from RIKEN BioResource Center, ATCC (American Type Culture Collection) or ECACC (ECACC). It is available from the European Collection of Cell Cultures.
  • spleen cells For cell fusion between spleen cells and myeloma cells, after washing both cells, spleen cells are mixed with myeloma cell 1 at a ratio of 1 to 10, and polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 is used as a fusion promoter.
  • polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 is used as a fusion promoter.
  • polyvinyl alcohol may be added, or a commercially available cell fusion device using electrical stimulation (for example, electroporation) may be used.
  • the fused cells are suspended in a medium and washed, and then cloned by a limiting dilution method or a colony formation method in a methylcellulose medium.
  • a limiting dilution method for example, after diluting to 10 3 to 10 7 cells / mL, seeding and culturing on a 96-well cell culture microplate at 10 2 to 10 6 cells / well. The method of doing can be illustrated.
  • HAT supplement to the culture medium for cloning hybridoma cells so that only the desired fused cells can be selectively obtained.
  • a method described in the 19th year, the method described in the 80th and the 18th year. Obtain and clone.
  • Screening of hybridoma cells Screening of the target hybridoma cells can be performed, for example, by the EIA method described below.
  • an antigen E2 peptide or antigen E2 protein is immobilized (immobilized) on a carrier, an antibody produced by each cloned hybridoma cell is added, and sufficient time is formed to form an antibody / antigen complex.
  • the reaction is carried out at 4 to 37 ° C.
  • a secondary antibody that is labeled with an enzyme, a dye, a radioisotope, or the like and that can specifically bind to the antibody portion of the formed antibody / antigen complex is contacted with the formed antibody / antigen complex, and then the antibody The reaction is carried out at 4 to 37 ° C. for a time sufficient to form a / antigen / secondary antibody complex.
  • the antibody having the desired characteristics is detected by detecting the presence of the antibody / antigen / secondary antibody complex formed using the enzyme, dye or radioisotope signal labeled on the secondary antibody as an indicator. It will be judged whether or not.
  • the hybridoma cells selected by the above method can be acclimated to a serum-free medium, for example, Hybridoma-SFM (Invitrogen), and a monoclonal antibody can be prepared from the supernatant cultured in the serum-free medium.
  • a serum-free medium for example, Hybridoma-SFM (Invitrogen)
  • a monoclonal antibody can be prepared from the supernatant cultured in the serum-free medium.
  • a flask, a petri dish, a spinner culture bottle, a roller bottle, or a high-density culture flask CELLine (Becton Dickinson) can be used.
  • monoclonal antibodies When preparing a large amount of monoclonal antibody, for example, 0.5 mL of pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) is injected into the peritoneal cavity of a 6-8 week old nude mouse or SCID mouse. Monoclonal antibodies can be prepared from ascites obtained by administering and rearing for 2 weeks, then administering 5 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 7 cells / hybridoma cell intraperitoneally and rearing for 10 to 21 days.
  • pristane 2,6,10,14-tetramethylpentadecane
  • the cells and their debris are removed by centrifugation, salting out with 40-50% saturated ammonium sulfate, caprylic acid precipitation method, DEAE-Sepharose column, Protein A-column, Protein G-column, IgG or IgM fractions can be recovered as a purified monoclonal antibody by combining purification means such as HiTrap IgM Purification HP-column (GE Healthcare), mannan binding protein-column (Pierce) and gel filtration column alone or in combination. Available.
  • purification means such as HiTrap IgM Purification HP-column (GE Healthcare), mannan binding protein-column (Pierce) and gel filtration column alone or in combination. Available.
  • the synthesized peptide is immobilized on a plate and reacted with a purified antibody.
  • a labeled secondary antibody is added and allowed to stand, and its binding ability is measured by enzyme immunoassay (ELISA) or radioimmunoassay (RIA).
  • the epitope cannot be determined by this method.
  • the epitope of the monoclonal antibody is a conformational epitope, and the antibody may recognize the three-dimensional structure of the antigen.
  • Examples of antibodies that specifically bind to E2 protein of HCV2a and do not immunologically react with E2 protein of HCV1a include antibodies that recognize the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing as an epitope.
  • a specific example of the antibody is an antibody produced by a hybridoma cell line having a receipt number of FERM ABP-11181.
  • an antibody that specifically binds to the E2 protein of HCV2a and does not immunologically react with both the E2 protein of HCV1a and the E2 protein of HCV1b the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or 3 in the sequence listing is used as an epitope.
  • Specific examples of antibodies that can be recognized include antibodies produced by hybridoma cell lines having a receipt number of FERM ABP-11180 or FERM ABP-11179.
  • an antibody that specifically binds to envelope protein 2 of J6CF strain of HCV2a and does not immunologically react with envelope protein 2 of JFH1 strain the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is recognized as an epitope.
  • Specific examples of the antibody include an antibody produced by a hybridoma cell line having a receipt number of FERM ABP-11183. This antibody can be used to identify the J6CF strain because it can distinguish the J6CF strain from the HCV genotype 2a.
  • the hybridoma cell lines whose receipt numbers are FERM ABP-11181, FERM ABP-11180, FERM ABP-11179, FERM ABP-11183, and FERM ABP-11182 are the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, which is an international depositary authority. It is deposited at the Patent Biological Depositary Center (postal code 305-8666, 1-1-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) (deposit date: September 19, 2008) and is available.
  • accession number FERM P-21676 (reception number FERM AP-21676), FERM P-21676 (reception number FERM AP-21676), FERM P-21675 (reception number FERM AP-21675), FERM, respectively.
  • P-21679 (receipt number FERM AP-21679), FERM P-21678 (receipt number FERM AP-21678) was originally deposited in the same depository in Japan (date of receipt of the original deposit: September 19, 2008) ) Has been transferred to an international deposit under the Budapest Treaty.
  • the HCV genotype identification method of the present invention binds to an antibody produced by a hybridoma cell line having a receipt number of FERM ABP-11181, and hybridoma cells having a receipt number of FERM ABP-11180 and FERM ABP-11179.
  • HCV genotype that does not bind to any of the antibodies produced by the strain is identified as 1b, binds to an antibody produced by a hybridoma cell line with the receipt number FERM ABP-11181, and the receipt number is FERM ABP -11180 and the HCV genotype that binds to the antibody produced by the hybridoma cell line FERM ABP-11179 are identified as 2a, and the antibody produced by the hybridoma cell line whose receipt number is FERM ABP-11182 Combine and Ryo number is characterized in that identified as FERM ABP-11181, FERM ABP-11180 and 1a genotype of HCV that do not bind to any of antibodies produced by the hybridoma cell line is FERM ABP-11179.
  • HCV whose genotype is unknown binds to an antibody produced by a hybridoma cell line having the receipt number FERM ABP-11181, FERM ABP-11180, FERM ABP-11179, or FERM ABP-11182
  • Any assay system that can detect the presence or absence of an antibody reaction can be used without particular limitation, and examples thereof include the immunoassay and Western blot method described below.
  • test sample containing HCV whose genotype is unknown is brought into contact with a carrier or plate on which the above antibody to be examined for binding is immobilized as a primary antibody, and sufficient time to form an antibody / antigen complex.
  • the reaction is carried out at 4 to 37 ° C.
  • a secondary antibody that is labeled with an enzyme, a dye, a radioisotope, or the like and nonspecifically binds to HCV is brought into contact with the antibody / antigen complex, and the antibody / antigen / secondary antibody complex is contacted. For 4 hours at a temperature of 4 to 37 ° C.
  • the presence / absence of the formed antibody / antigen / secondary antibody complex is detected, and the presence / absence of binding to the antibody is determined. do it.
  • test sample containing HCV whose genotype is unknown is spotted on a membrane such as a nitrocellulose membrane or a PVDF membrane, and the protein contained in the test sample is immobilized.
  • the membrane is soaked in 5% skim milk, 1% BSA solution or a commercially available blocking agent, blocked, thoroughly washed with a buffer solution, and then examined for the presence of binding labeled with an enzyme, dye, radioisotope or the like.
  • the membrane is transferred to a buffer containing the antibody and allowed to react at 4 to 37 ° C. for a time sufficient to form an antibody / antigen complex.
  • the membrane is thoroughly washed, and an enzyme, a dye or a radioisotope signal labeled on the antibody to be examined for the presence or absence of binding is detected to determine the presence or absence of binding to the antibody.
  • Example 1 Preparation of a vector for expressing a fusion protein in which a labeled protein is added to the antigen E2 protein of each HCV strain (1) Fusion protein in which a 3 ⁇ FLAG tag is added to the antigen E2 protein derived from the J6CF strain of HCV2a Construction of Vector for Expressing Antigen E2 protein derived from J6CF strain of HCV2a, that is, a protein consisting of a region not including the transmembrane region of E2 protein of J6CF strain of HCV2a was prepared as shown below.
  • Genomic RNA of J6CF strain of HCV2a (GenBank accession number: AF177036) is used as a template, and the 384th position when the N-terminal start methionine of the precursor protein of J6CF strain (SEQ ID NO: 5) is first.
  • a gene encoding a protein consisting of the region corresponding to the 720th region was converted to J6E2dTM-s (SEQ ID NO: 6: CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG) and J6E2dTM-as (SEQ ID NO: 7: GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT) using the Advantage GC2 PCR kit (Takara Bio Inc.). Amplified by PCR using primers.
  • CMV-3XFLAGJ6E2dTM was obtained as a vector expressing the antigen E2 protein to which 3 ⁇ FLAG tag was added (hereinafter referred to as 3 ⁇ FLAG-J6E2dTM protein).
  • the amplified DNA fragment was cloned into pCR-TOPO (Invitrogen), and the nucleotide sequences of the three clones were analyzed.
  • a gene fragment encoding the antigen E2 protein was excised by digestion with HindIII and BamHI from a clone having an insert of the correct nucleotide sequence, and the HindIII site and BamHI downstream of the signal peptide sequence of p3 ⁇ FLAG-CMV-13 (Sigma).
  • the reading frame (reading frame) was inserted between the sites (ie, in frame), and this vector was named CMV-13-J6E2.
  • CMV-13-J6E2 was digested with SacI and BamHI, and DNA fragments encoding the signal peptide sequence and the antigen E2 protein were separated by agarose gel electrophoresis and purified by GeneElute (Sigma).
  • JFE2Fc-s SEQ ID NO: 10: CACAAGCTTGGCACCACCACCACCGTTGGAG
  • JFE2Fc-as SEQ ID NO: 11: ACAGGATCCTCCCATCGAACGACGTATTTTGTG
  • the amplified DNA fragment was cloned into pCR-TOPO (Invitrogen), and the nucleotide sequences of the three clones were analyzed.
  • a gene fragment encoding the antigen E2 protein was excised by digestion with HindIII and BamHI from a clone having an insert of the correct nucleotide sequence, and the HindIII site and BamHI downstream of the signal peptide sequence of p3 ⁇ FLAG-CMV-13 (Sigma). The reading frame was inserted between the parts. This vector was named CMV-13-JFH1E2.
  • CMV-13-JFH1E2 was digested with SacI and BamHI, and DNA fragments encoding the signal peptide sequence and the antigen E2 protein were separated by agarose gel electrophoresis and purified by GeneElute (Sigma).
  • each DNA fragment encoding the signal peptide sequence and the antigen E2 protein is inserted between the SacI site and the BamHI site of CDM-mIL7R-Ig so as to match the reading frame.
  • a vector CDM-JFH1E2Fc expressing the added antigen E2 protein (hereinafter, JFH1E2-Fc protein) was obtained.
  • a vector for expressing a fusion protein obtained by adding an Fc protein of human IgG to an antigen E2 protein derived from the TH strain of HCV1b First, cDNA of the genomic RNA of the TH strain of HCV1b (International Publication WO2006 / 022422) As a template, a gene encoding a protein consisting of a region corresponding to the 384th to 717th regions where the N-terminal start methionine of the precursor protein of the TH strain is the first is an Advantage GC2 PCR kit (Takara Bio Inc.).
  • THE2Fc-s SEQ ID NO: 12: CAAAGCTTGCGACCTACGTGACGGGGGGGTCG
  • THE2Fc-as SEQ ID NO: 13: CCTCTAGATTATGGATCCCATTTGATTGCATAGGAGACAACCG
  • the amplified DNA fragment was cloned into pCR-TOPO (Invitrogen), and the nucleotide sequences of the three clones were analyzed.
  • a gene fragment encoding the antigen E2 protein was excised by digestion with HindIII and BamHI from a clone having an insert of the correct nucleotide sequence, and the HindIII site and BamHI downstream of the signal peptide sequence of p3 ⁇ FLAG-CMV-13 (Sigma). The reading frame was inserted between the parts. This vector was named CMV-13-THE2.
  • CMV-13-THE2 was digested with SacI and BamHI, and the DNA fragments encoding the signal peptide sequence and the antigen E2 protein were separated by agarose gel electrophoresis and purified with GeneElute (Sigma).
  • a vector for expressing a fusion protein obtained by adding a human IgG Fc protein to the antigen E2 protein derived from the HCV1b Con1 strain First, cDNA of Gen1 RNA of the HCV1b Con1 strain (GenBank accession number: AJ238799) As a template, a gene encoding a protein comprising a region corresponding to the 384th to 716th regions when the N-terminal start methionine of the precursor protein of the Con1 strain is the first is used as an Advantage GC2 PCR kit (Takara).
  • Con1E2Fc-s SEQ ID NO: 14: CAAAGCTTGGAACCTATGTGACAGGGGGGACGAT
  • Con1E2Fc-as SEQ ID NO: 15: CCTCTAGATTATGGATCCCATTTGATTGCAAAGGAGACACAAC
  • the amplified DNA fragment was cloned into pCR-TOPO (Invitrogen), and the nucleotide sequences of the three clones were analyzed.
  • a gene fragment encoding the antigen E2 protein was excised by digestion with HindIII and BamHI from a clone having an insert of the correct nucleotide sequence, and the HindIII site and BamHI downstream of the signal peptide sequence of p3 ⁇ FLAG-CMV-13 (Sigma).
  • This vector was named CMV-13-Con1E2 and inserted so that the reading frame fits between the sites.
  • CMV-13-Con1E2 was digested with SacI and BamHI, and DNA fragments encoding the signal peptide sequence and the antigen E2 protein were separated by agarose gel electrophoresis and purified with GeneElute (Sigma).
  • a vector for expressing a fusion protein in which a human IgG Fc protein is added to the antigen E2 protein derived from the J1 strain of HCV1b First, cDNA of Genomic RNA derived from the J1 strain of HCV1b (GenBank accession number: D89815) ) As a template, a gene encoding a protein consisting of the region corresponding to the 384th to 716th regions in the case where the N-terminal initiation methionine of the precursor protein of the J1 strain is the first is the Advantage GC2 PCR kit (Takara).
  • J1E2Fc-s SEQ ID NO: 16: CAAAGCTTCATACCCGCGTGACGGGGGGGGTGC
  • J1E2Fc-as SEQ ID NO: 17: CCTCTAGATTATGGATCCCACTTGATGGCAATGGAGACGACC
  • the amplified DNA fragment was cloned into pCR-TOPO (Invitrogen), and the nucleotide sequences of the three clones were analyzed.
  • a gene fragment encoding the antigen E2 protein was digested with HindIII and BamHI from a clone having an insert of the correct nucleotide sequence, cut out, and HindIII site and BamHI downstream of the signal peptide sequence of p3 ⁇ FLAG-CMV-13 (Sigma).
  • This vector was named CMV-13-J1E2 and inserted so that the reading frame fits between the sites.
  • CMV-13-J1E2 was digested with Tth111I, blunted with T4 DNA polymerase and then digested with BamHI, and the DNA fragments encoding the signal peptide sequence and the antigen E2 protein were separated by agarose gel electrophoresis. And purified with GeneElute (Sigma).
  • CDM-mILR7R-Ig was digested with BamHI and XbaI, and a DNA fragment containing a sequence encoding the human immunoglobulin Fc domain was excised, and pcDL-SR ⁇ 296 (Takebe et al., Proc Natil Acad Sci. USA, 1987, 84 SR ⁇ IgG1Fc was prepared by inserting it downstream of the promoter region of the volume, pages 7388-7392).
  • J1E2-Fc protein A vector SR ⁇ -J1E2Fc expressing (hereinafter referred to as J1E2-Fc protein) was obtained.
  • a vector for expressing a fusion protein obtained by adding an Fc protein of human IgG to an antigen E2 protein derived from the H77 strain of HCV1a First, cDNA of Genomic RNA of the H77 strain of HCV1a (GenBank accession number: AF011751) As a template, a gene encoding a protein consisting of the region corresponding to the 384th to 716th regions in the case where the N-terminal initiation methionine of the precursor protein of the H77 strain is the first is used as an Advantage GC2 PCR kit (Takara Bio).
  • H77E2Fc-s (SEQ ID NO: 18: CAAAGCTTGAAACCCACGTCACCGGGGGAAA) and H77E2Fc-as (SEQ ID NO: 19: CCTCTAGATTATGGATCCCACTTAATGGCCCAGGACGCGAT) were used as primers for amplification by PCR.
  • the amplified DNA fragment was cloned into pCR-TOPO (Invitrogen), and the nucleotide sequences of the three clones were analyzed.
  • the vector was named CMV-13-XhoH77E2 after inserting the reading frame between the HindIII site and the XbaI site downstream of the signal peptide sequence of p3xFLAG-CMV-13Xho.
  • CMV-13-XhoH77E2 was digested with XhoI and BamHI, the DNA fragment encoding the signal peptide sequence and the antigen E2 protein was separated by agarose gel electrophoresis, and purified by GeneElute (Sigma).
  • Example 2 Expression of fusion protein in which labeled protein is added to antigen E2 protein CMV-3XFLAGJ6E2dTM, CDM-J6E2Fc, CDM-JFH1E2Fc, CDM-THE2Fc, CDM-Con1E2Fc, SR ⁇ -J1E2Fc and SR ⁇ - produced in Example 1 H77E2Fc was introduced into monkey kidney-derived COS1 cells as follows to express each fusion protein.
  • COS1 cells were subcultured in RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (Invitrogen), 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, and the split ratio was doubled the day before gene introduction. Then, it was seeded in a 150 cm 2 culture flask (Corning Coaster) and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • RPMI 1640 medium Invitrogen
  • 10% fetal bovine serum Invitrogen
  • 100 U / ml penicillin 100 ⁇ g / ml streptomycin
  • DEAE dextran GE Healthcare
  • chloroquine Sigma
  • the DEAE dextran-DNA mixture was removed by aspiration, washed once with 10 ml of PBS, and Hybridoma-SFM medium (Invitrogen) was added at 50 ml / flask, at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 . Cultured for 4 days. Thereafter, the culture supernatant was collected in a 50 ml centrifuge tube (Corning Coaster), centrifuged at 2500 rpm for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was filtered with a 0.2 ⁇ m filtration filter (Whatman).
  • Example 3 Purification of fusion protein in which labeled protein is added to antigen E2 protein
  • the culture supernatant of a cell into which CMV-3 ⁇ FLAG-J6E2dTM has been introduced was prepared using anti-FLAG M2 agarose (Sigma) as follows. Purified.
  • the anti-FLAG M2 agarose was washed twice with 10 ml of TBS (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) and adjusted to 1 ml / fraction with 0.1 M Glycine-HCl (pH 3.5). Six fractions (anti-FLAG antibody column elution fractions 1 to 6) were eluted. Immediately after elution, 1M Tris-HCl (pH 9.5) was added to restore neutrality. 20 ⁇ l of each fraction was fractionated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reduction and stained with Coomassie Brilliant Blue. As a result, it was confirmed that the antigen E2 protein derived from the J6CF strain and the 3 ⁇ FLAG tag fusion protein (3 ⁇ FLAG-J6E2dTM protein) were purified (FIG. 4).
  • Prosep-A (a carrier to which Protein-A is bound) The product was purified as follows using Millipore Corporation.
  • Example 4 Immunization of mice with antigen E2 protein of J6CF strain of HCV2a 0.3 ml PBS solution containing 10 ⁇ g of 3 ⁇ FLAG-J6E2dTM protein and 0.3 ml Freund's complete adjuvant were mixed to prepare an emulsion did. Half of the emulsion was inoculated subcutaneously into 7 week old Balb / c mice (female).
  • mice Two weeks later, 0.3 ml of a PBS solution containing 10 ⁇ g of 3 ⁇ FLAG-J6E2dTM protein and 0.3 ml of Freund's incomplete adjuvant were mixed to prepare an emulsion. Half of the emulsion was administered subcutaneously to mice. Two weeks later, 0.15 ml of a PBS solution containing 10 ⁇ g of 3 ⁇ FLAG-J6E2dTM protein was intraperitoneally administered to the mice. Spleen cells were prepared from the mice after 3 days.
  • mice After 2, 4, and 6 weeks, similarly, 0.3 ml of PBS solution containing 20 ⁇ g of J6E2-Fc protein and 0.3 ml of Alum were mixed to prepare a dosing solution, and the total amount of the emulsion was administered to the abdominal cavity of mice. did. Two more months later, 0.3 ml of PBS solution containing 20 ⁇ g of J6E2-Fc protein was administered intraperitoneally to the mice. Spleen cells were prepared from the mice after 3 days.
  • spleen cells were prepared from mice administered with 3 ⁇ FLAG-J6E2dTM protein or J6E2-Fc protein, and washed three times with serum-free DMEM.
  • SP2 / 0 cells and mouse spleen cells were placed in a 50 ml centrifuge tube at a ratio of 1: 5, centrifuged at 1,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was completely aspirated and removed. Thereafter, the centrifuge tube was tapped to loosen the pellet, and 1 ml of 50% polyethylene glycol-1500 solution (Roche) warmed at 37 ° C. was added over 1 minute, and the reaction was continued at 37 ° C. for 1 minute. .
  • the cell suspension thus obtained was seeded in each well of a 96-well plate at 100 ⁇ l / well, cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, and the next day, 2 times HAT (Invitrogen), 15% 100 ⁇ l of DMEM containing FCS, 10% hybridoma cloning factor was added to each well, followed by culturing at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator.
  • Example 6 After culturing for 10 to 14 days, the culture supernatant of each well was collected, and an antibody recognizing the antigen E2 protein contained in the culture supernatant was screened as shown in Example 6.
  • Hybridoma cells were screened by immobilizing antigen E2 protein on a plate and antigen E2 in which antibodies in the culture supernatant of hybridoma cells were immobilized on the plate. Whether or not it binds to a protein was evaluated by EIA.
  • the above solid-phased plate was washed 4 times with PBS containing 0.1% Tween 20 (Sigma), and 50 ⁇ l of the supernatant sample of each hybridoma cell obtained in Example 5 was placed in each well. They were added one by one and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was washed 4 times with PBS containing 0.1% Tween 20, and then diluted with PBS containing 0.1% Tween 20 to an HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (GE Healthcare) in each well. 50 ⁇ l was added to each and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed 4 times with PBS containing 0.1% Tween 20, and developed with a peroxidase coloring kit (Sumitomo Bakelite). The absorbance at 450 nm was measured, and positive clones were selected.
  • 11 clones could be selected from the 980 wells screened for hybridoma cells prepared from mice administered with 3 ⁇ FLAG-J6E2dTM protein. Those clones were cloned by limiting dilution, and hybridoma cell lines 1G2-32, 2F2-7, 2F3-7, 4E8-8, 5D4-6, 9G3-2, 9A5-4 having good growth and antibody productivity were obtained. 9C4-2, 8D10-3 and 10G4-1 were obtained.
  • Hybridoma SFM Invitrogen
  • the culture solution was collected in a centrifuge tube and centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes.
  • the culture supernatant was added to Prosep-G (Millipore) and washed with 30 bed volumes of PBS, followed by elution of 6 fractions with 1 bed volume of 0.1 M glycine-HCl (pH 3.0).
  • 1M Tris-HCl pH 9.5 was added to restore neutrality.
  • each fraction was fractionated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis under reducing and non-reducing conditions, and the presence or absence of protein was confirmed by staining with Coomassie Brilliant Blue.
  • the IgG fractions were pooled and desalted by dialysis with PBS or gel filtration to prepare antibody samples.
  • Example 7 HCV Genotype Specificity of Monoclonal Antibody against Antigen E2 Protein
  • Monoclonal antibodies produced by each hybridoma cell prepared by immunization with antigen E2 protein of J6CF strain of HCV2a are the J6CF strain of genotype 2a and It was examined whether it binds to E2 protein from JFH1 strain, TH strain of genotype 1b, E2 protein from J1 strain and Con1 strain, and E2 protein from H77 strain of genotype 1a.
  • Examples of the antigen include a J6E2-Fc protein, JFH1E2-Fc protein, THE2-Fc protein, J1E2-Fc protein, Con1E2 prepared in Examples 1 to 3, which are fusion proteins of the antigen E2 protein and the Fc domain of human immunoglobulin. -Using Fc protein and H77E2-Fc protein, these proteins were immobilized on a plate and used for evaluation as shown in Example 6.
  • each fusion protein is diluted with PBS to 1 ⁇ g / ml, added to each well of the immunoplate at 50 ⁇ l, and allowed to stand overnight at 4 ° C. to plate each fusion protein. To solid phase. The protein solution was removed and 200 ⁇ l of blocking one solution (Nacalai Tesque) prepared according to the attached manual was added to each well and blocked at room temperature for 2 hours.
  • blocking one solution Nacalai Tesque
  • the monoclonal antibody produced by each hybridoma cell was diluted with PBS to 1 ⁇ g / ml, and 50 ⁇ l was added to each well of the solid-phased plate, and reacted at room temperature for 1 hour. After completion of the reaction, the plate was washed 4 times with PBS containing 0.05% Tween 20, and then 50 ⁇ l of HRP-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 5,000 times with PBS containing 0.05% Tween 20 was added to each well. The reaction was allowed to proceed for 1 hour at room temperature. After completion of the reaction, the plate was washed 4 times with PBS containing 0.05% Tween 20, developed with a peroxidase coloring kit, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • FIG. 6 shows the binding of each monoclonal antibody to the antigen E2 protein of various HCV genotypes / strains. Absorbance values of less than 0.1 are shown as-, 0.1 or more and less than 0.25 as +, 0.25 or more and less than 0.4 as ++, 0.4 or more as ++, Represents. 8D10-3 binds to HCV antigen E2 protein of genotypes 1a, 1b, 2a, 1G2-32 and 2F2-7 bind to antigen E2 protein of genotype 2a, 4E8-8 has genotypes 1b and 2a It shows that the antibody binds to the antigen E2 protein. Furthermore, it has been shown that M1E12-1 is a monoclonal that binds to the antigen E2 protein of the J6CF strain.
  • the hybridoma cell (8D10-3) producing the monoclonal antibody 8D10-3 is designated as receipt number FERM ABP-11182
  • the hybridoma cell producing the monoclonal antibody 1G2-32 (1G2-32) is designated as receipt number FERM ABP-11179
  • the hybridoma cell (2F2-7) producing monoclonal antibody 2F2-7 is designated as accession number FERM ABP-11180
  • the hybridoma cell producing monoclonal antibody 4E8-8 (4E8-8) is designated as receipt number FERM ABP-11181.
  • the hybridoma cell (M1E12-1) that produces M1E12-1 has the receipt number FERM ABP-11183 on September 19, 2008. It has been deposited in the Organism Depositary Center (Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan Central 6, 1-1-1).
  • Example 8 Epitope analysis of monoclonal antibody Corresponding to the antigen E2 protein corresponding to the 384th to 720th positions when the first methionine at the N-terminus of the precursor protein (SEQ ID NO: 5) of the J6CF strain is first A peptide group (peptide numbers 1-110) consisting of amino acid sequences designed by shifting 10 consecutive amino acids by 3 amino acids from the N-terminal was synthesized. The N-terminus of each peptide was biotinylated and the C-terminus was glycinamide (commissioned to JPT).
  • the synthesized peptide was dissolved in DMSO and dissolved in PBS to 0.01 nmol / ⁇ l. 50 ⁇ l of this peptide solution was added to each well of a streptavidin-coated plate (Nunk), and reacted at room temperature for 2 hours. The peptide solution was discarded, and 200 ⁇ l of blocking one solution (Nacalai Tesque) prepared according to the attached manual was added to each well and blocked by allowing to stand at 4 ° C. overnight.
  • the blocking solution was discarded, washed 4 times with PBS containing 0.05% Tween 20, and 50 ⁇ l of each monoclonal antibody diluted to 1 ⁇ g / ml with PBS containing 0.05% Tween 20 was added to each well. The reaction was allowed for 5 hours. After completion of the reaction, the antibody solution is discarded, washed 4 times with PBS containing 0.05% Tween 20 and subsequently diluted with PBS containing 0.05% Tween 20 to an HRP-labeled anti-mouse IgG goat antibody (GE Healthcare). 50 ⁇ l / well was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the antibody solution was discarded and washed 5 times with PBS containing 0.05% Tween20. After washing, the peroxidase coloring kit was developed and the antibody bound to the peptide was detected by measuring the absorbance at 450 nm.
  • FIGS. 7A to E show the binding strength of each monoclonal antibody to the peptide group derived from the antigen E2 protein derived from the J6CF strain.
  • the measured value at OD450 nm value on the vertical axis of FIGS. 7A to 7E
  • the binding strength of the monoclonal antibody to the peptide is strong, indicating that the antibody specifically recognizes the peptide.
  • Each monoclonal antibody recognized some of the peptides derived from the antigen E2 protein of the J6CF strain.
  • the particularly strong epitope of the 8D10-3 monoclonal antibody was DRLGAPTYTW (SEQ ID NO: 20; peptide number 47), and GAPTYTWGEN (SEQ ID NO: 21; peptide number 48) overlapping with this peptide (FIG. 7A). From this, the epitope was considered to be at least 10 consecutive amino acid sequences in the amino acid sequence DRLGAPTYTWGEN (SEQ ID NO: 22). YPYRLWHYPC (SEQ ID NO: 23; Peptide No. 78) was also a weak epitope (FIG. 7A).
  • WGENETDVFL SEQ ID NO: 1; Peptide No. 50
  • NETDVFLLLNS SEQ ID NO: 24; Peptide No. 51
  • DVFLLLNSTRP SEQ ID NO: 25; Peptide
  • LLNSTRPPLG SEQ ID NO: 26; Peptide No. 53
  • the particularly strong epitope of the 2F2-7 monoclonal antibody was GWGALQYEDN (SEQ ID NO: 2; peptide number 29) (FIG. 7D).
  • FRVGWGALQY SEQ ID NO: 28; peptide number 28
  • overlapping with this peptide was a weak epitope (FIG. 7D). From this, the epitope was considered to be at least 10 consecutive amino acid sequences in the amino acid sequence FRVGWGALQYEDN (SEQ ID NO: 29).
  • the particularly strong epitopes of the 1G2-32 monoclonal antibody were KTCGAPPCRT (SEQ ID NO: 3; peptide number 61) and GAPPCRTRAD (SEQ ID NO: 30; peptide number 62) (FIG. 7B). From this, the epitope was considered to be an amino acid sequence of at least 10 consecutive amino acids in the amino acid sequence KTCGAPPCRTRAD (SEQ ID NO: 31).
  • epitopes of the M1E12-1 monoclonal antibody were NYTIFKIRMY (SEQ ID NO: 4; peptide number 82) and IFKIRMYVGG (SEQ ID NO: 32; peptide number 83) (FIG. 7E). From this, the epitope was considered to be at least 10 consecutive amino acid sequences in the amino acid sequence NYTIFKIRMYVGG (SEQ ID NO: 33).
  • Example 9 Detection of HCV envelope protein using monoclonal antibody Using monoclonal antibody prepared from the prepared hybridoma cells, antigen E2 protein derived from H77 strain of genotype 1a, J6CF strain and JFH1 strain of genotype 2a The ability to detect the antigen E2 protein and the antigen E2 protein derived from the genotype 1b TH strain, J1 strain and Con1 strain was examined using sandwich ELISA and Western blotting.
  • Sandwich ELISA Monoclonal antibody 1G2-32 was diluted with PBS to a concentration of 1 ⁇ g / ml, and 50 ⁇ l of this antibody solution was added to each well of an immunoplate (Nunk Co., Ltd.) and allowed to stand at room temperature for 2 hours to plate the antibody. To solid phase. The antibody solution was removed, and 200 ⁇ l of a blocking one solution (Nacalai Tesque) prepared according to the attached manual was added to each well and blocked by allowing to stand at room temperature for 2 hours.
  • a blocking one solution Nacalai Tesque
  • each fusion protein in which human immunoglobulin Fc domain is added to antigen E2 protein (JFH1E2-Fc protein, J6E2-Fc protein, THE2-Fc protein, Con1E2-Fc protein, J1E2-Fc protein and H77E2-Fc protein) was diluted with PBS, 50 ⁇ l was added to each well of the plate on which the above monoclonal antibody had been immobilized, and reacted at room temperature for 1.5 hours. After completion of the reaction, each well was washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween 20, and each well was added with biotinylated 8D10-3 monoclonal antibody diluted to 1 ⁇ g / ml with PBS containing 0.05% Tween 20.
  • the plate was washed 4 times with PBS containing 0.05% Tween 20 and developed with a peroxidase coloring kit (Sumitomo Bakelite), and the absorbance at 490 nm was measured. The result is shown in FIG.
  • FIG. 8 shows the detection sensitivity of antigen E2 protein of various genotypes / strains in sandwich ELISA using monoclonal antibodies 1G2-32 and 8D10-3.
  • the horizontal axis indicates the amount of the antigen E2 protein, and the vertical axis indicates the absorbance at 490 nm, that is, the amount of the detected antigen E2 protein.
  • sandwich ELISA using monoclonal antibodies 1G2-32 and 8D10-3 can detect only HCV antigen E2 protein of genotype 2a, but not antigen E2 protein of genotype 1a and 1b. ing.
  • Each sample was applied to a 4-20% gradient gel (Tefco), electrophoresed at a constant current of 40 mA, and blotted on a PVDF membrane at a constant current of 120 mA using a semi-dry blotting apparatus.
  • Tefco 4-20% gradient gel
  • the blotted PVDF membrane was blocked by immersing it in Block Ace (Snow Brand Milk Products) at room temperature for 1 hour, washed with TBS containing 0.1% Tween 20, and then diluted to 1 ⁇ g / mL with Can Get Signal (Toyobo) It was immersed in antibody 8D10-3 and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, the plate was washed with TBS containing 0.1% Tween 20 and subsequently immersed in HRP-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 5000 times with Can Get Signal, and reacted at room temperature for 1 hour. The band was washed with TBS containing 0.1% Tween 20, and a band was detected using an ECL kit (GE Healthcare).
  • Block Ace Snow Brand Milk Products
  • FIG. 9 shows the presence or absence of detection of antigen E2 protein of various genotypes / strains by Western blotting using monoclonal antibody 8D10-3.
  • Monoclonal antibody 8D10-3 was able to detect the antigen E2 protein of all six strains.
  • the antibody of the present invention makes it possible to easily and accurately identify the genotypes of HCV genotypes 1a, 1b and 2a, and the genotypes for which the therapeutic effect by interferon therapy cannot be expected is HCV of type 1a or 1b. It is possible to provide an opportunity for an infected hepatitis C patient to reduce side effects and to select a new treatment method.

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Abstract

　本発明は、遺伝子型が２ａであるＨＣＶのエンベロープタンパク質２に特異的に結合し、遺伝子型が１ａであるＨＣＶのエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない抗体を提供する。

Description

Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質２に結合する抗体及びそれを用いたＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型の同定方法
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質２に結合する抗体及びそれを用いたＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型の同定方法に関する。
　Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＣＶ）は非Ａ非Ｂ肝炎の主要な原因ウイルスであり、主に輸血及び性的接触を介して感染する（非特許文献１）。日本におけるＨＣＶの保有者は、肝炎の症状を示していない人（ウイルスキャリア）を含めると２００万人以上であり、世界では１億７０００万人以上であると推定されている。ＨＣＶの保有者が増加する主な原因は、ＨＣＶ感染による肝炎の慢性化率が７０～８０％と高いことや、インターフェロン以外に有効な抗ウイルス剤がないことである。
　Ｃ型慢性肝炎患者の半数以上の病態は、悪化の一途を辿ることがほぼ確実で、肝硬変や肝癌へと進行することが知られているため、Ｃ型肝炎は予後の悪い深刻な感染症であるといえる。このため、Ｃ型肝炎の治療及びＨＣＶの検出に関する研究は、医学的に重要であり、新たな治療法及び治療薬の開発が望まれている。
　ＨＣＶは、約９．６ｋｂの＋鎖の一本鎖ＲＮＡをゲノムとして有するＲＮＡウイルスであり、このゲノムには翻訳後に宿主由来のシグナルペプチダーゼやＨＣＶ由来のプロテアーゼで１０種類のウイルスタンパク質（Ｃｏｒｅ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ）に切断される前駆体タンパク質がコードされている。ＨＣＶは、ゲノムの塩基配列を系統解析することによって１０種類以上の遺伝子型（例えば、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ及び３ｂ）に分類されている（非特許文献１～４）。
　最近では、ＨＣＶの遺伝子型の違いによって、インターフェロンの効果に大きな差があることがわかってきており、インターフェロンの抗ウイルス作用は、遺伝子型が１ａ又は１ｂのＨＣＶに対して発揮されにくいことが明らかになっている（非特許文献５及び６）。
　さらに、インターフェロンの効果が比較的良好に認められる、遺伝子型２ａのＨＣＶと遺伝子型２ｂのＨＣＶの間においても、インターフェロンの抗ウイルス作用の強さには差があることがわかってきており、遺伝子型が２ｂのＨＣＶよりも遺伝子型が２ａのＨＣＶに対してより強い作用が認められることが示唆されている（非特許文献７）。
　ＨＣＶの診断方法としては、Ｃ型肝炎患者の血清中には７０～８０％の割合でＨＣＶの非構造領域のＮＳ４領域（Ｃ１００－３抗原）を認識する抗ＨＣＶ抗体が存在するため、Ｃ１００－３抗原を用いて血清中の抗ＨＣＶ抗体を検出するＨＣＶ抗体検査が知られている（非特許文献１）。また、その改良法としてＣ１００－３抗原、コア抗原及びＮＳ３領域の抗原を組み合わせて検出感度を上げた第二世代の抗体アッセイ系、さらには、ＮＳ５領域の抗原も含めた第三世代の抗体アッセイ系が開発され、これらのアッセイ系によるＨＣＶ抗体検査が利用されている（非特許文献８）。
　また、これらのＨＣＶ抗体検査以外にも、血清中のＨＣＶコアタンパク質の量を直接測定するＨＣＶコア抗原検査（非特許文献９）や、ＰＣＲ法によってＨＣＶのゲノムの有無を確認する核酸増幅検査（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔ:ＮＡＴ）（非特許文献１０）がある。
　しかしながら、ＨＣＶ抗体検査では、過去にＨＣＶ感染があった被検者の場合には、Ｃ型肝炎が完治している場合であっても陽性と判定されることは避けられず、さらに、抗ＨＣＶ抗体が血液中で検出されるには感染後１～３ヶ月の期間を要するため、この時期に検査を行った場合には、ＨＣＶが検出されずに陰性と判断されてしまうという問題点がある。
　また、ＨＣＶコア抗原検査では、標的分子であるコアタンパク質がＨＣＶ粒子の内部に存在するため、ＳＤＳを使用してエンベロープを壊してコアタンパク質を遊離させる処理が必要となり、ＳＤＳの処理時間によっては、コアタンパク質を変性させたり、抗原抗体反応を阻害する物質が遊離したりして、検出感度に影響を与えることがある。
　さらに、ＨＣＶ抗体検査及びＨＣＶコア抗原検査では、ＨＣＶ陽性であると判断された場合であっても、ＨＣＶの遺伝子型までは同定できないのが現状であり、インターフェロン療法を行うには、核酸増幅検査等のさらなる検査を行ってＨＣＶの遺伝子型を同定する必要がある。すなわち、ＨＣＶの遺伝子型によってインターフェロンの抗ウイルス作用が大きく異なり、特に、遺伝子型が１ａ及び１ｂの場合には、有効な抗ウイルス作用が認められず、逆にインターフェロンの副作用によって患者を苦しめることになるからである。
　一方、核酸増幅検査では、被験者の血清中のＲＮＡを標的分子とするため、検査試料の保存性と安定性とに欠け、ＲＴ－ＰＣＲ法を利用する点でもさまざまな課題と注意点がある。例えば、標的分子であるＲＮＡをＤＮＡに転写してＰＣＲを行うため、ＲＮＡの分解や逆転写酵素の失活・阻害によって擬陰性となったり、反応系へのクロスコンタミネーションによって擬陽性となったりする。このため、タンパク質を標的分子とするＨＣＶ抗体検査やＨＣＶコア抗原検査と比較して、精度の面で劣るとされている。
Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年、２４４巻、ｐ．３５９～３６２ Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９４年、１０巻、ｐ．１３２１～１３２４ Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｊ.　Ｇｅｎ.　Ｖｉｒｏｌ.、１９９２年、７３巻、ｐ．７３～６７９ Ｍｏｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ.　Ｂｉｏｐｈｙｓ.　Ｒｅｓ.　Ｃｏｍｍｕｎ.、１９９２年、１８３巻、ｐ．３３４～３４２ Ｆｒｉｅｄら、Ｎ.　Ｅｎｇｌ.　Ｊ.Ｍｅｄ.、２００２年、３４７巻、ｐ.９７５～９８２ Ｌｕｓｉｄａら、Ｊ.　Ｃｌｉｎ.　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.、２００１年、３９巻、ｐ．３８５８～３８６４ Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９９年、３０巻、ｐ．１０４５～１０５３ Ａｕｃｅｌｌａら、Ｂｌｏｏｄ　Ｐｕｒｉｆ．、２０００年、１８巻、ｐ．１１０～１１４ Ｆａｂｒｉｚｉら、　Ｊ.　Ｃｌｉｎ.　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.、２００５年、４３巻、ｐ．４１４～４２０ Ｖｅｌａｔｉら、Ｅｕｒｏ　Ｓｅｒｖｅｉｌｌ．、２００５年、１０巻、ｐ．１２～１４
　そこで本発明は、ＨＣＶの表面にあるエンベロープに結合し、遺伝子型が１ａ、１ｂ及び２ａであるＨＣＶの遺伝子型の同定に利用できる抗体及びこれらの抗体を用いたＨＣＶの遺伝子型の同定方法を提供することを目的としている。
　上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ね、遺伝子型が２ａのＨＣＶのエンベロープタンパク質２を抗原とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、その中から、ＨＣＶの遺伝子型２ａのエンベロープタンパク質２のみに特異的に結合する抗体、ＨＣＶの遺伝子型２ａ及び１ｂのエンベロープタンパク質２の双方のみに結合する抗体並びにＨＣＶの遺伝子型２ａ、１ｂ及び１ａのエンベロープタンパク質２のいずれにも結合する抗体を見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、遺伝子型が２ａであるＨＣＶのエンベロープタンパク質２に特異的に結合し、遺伝子型が１ａであるＨＣＶのエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない抗体を提供する。
　上記抗体は、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体であることが好ましく、このような抗体として、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体を例示できる。
　また上記抗体は、遺伝子型が２ａであるＨＣＶのエンベロープタンパク質２に特異的に結合し、遺伝子型が１ａであるＨＣＶのエンベロープタンパク質２及び遺伝子型が１ｂであるＨＣＶのエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない抗体であることが好ましい。
　上記抗体は、配列表の配列番号２又は３記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体であることがより好ましく、このような抗体として、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０又はＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体を例示できる。
　さらに上記抗体は、Ｊ６ＣＦ株のエンベロープタンパク質２に特異的に結合し、ＪＦＨ１株のエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない抗体であることが好ましく、このような抗体として、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体、さらには、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８３であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体、を例示できる。
　また本発明は、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０及びＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体のいずれにも結合しないＨＣＶの遺伝子型を１ｂであると同定し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０及びＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合するＨＣＶの遺伝子型を２ａであると同定し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８２であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０及びＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体のいずれにも結合しないＨＣＶの遺伝子型を１ａであると同定する、ＨＣＶの遺伝子型の同定方法を提供する。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第2008-254338号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、遺伝子型が１ａ、１ｂ及び２ａであるＨＣＶの遺伝子型を簡易かつ精度よく同定することを可能にし、インターフェロン療法に適したＣ型肝炎患者を効率的に選別できる。特に、インターフェロン療法による治療効果が望めない遺伝子型が１ａ又は１ｂ型のＨＣＶに感染したＣ型肝炎患者に対して、副作用を軽減するとともに新たな治療方法を選択する機会を与えることができる。
ＨＣＶの前駆タンパク質の模式図である。黒の四角は膜貫通領域を示す。 ３×ＦＬＡＧタンパク質と抗原Ｅ２タンパク質の融合タンパク質の模式図である。 抗原Ｅ２タンパク質とヒト免疫グロブリンＦｃドメインとの融合タンパク質の模式図である。 ３×ＦＬＡＧＪ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質の精製工程の各画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示した図である。３ＸＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭのＣＯＳ１細胞での発現と精製が示されている。溶出画分に３×ＦＬＡＧＪ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質が検出された。図中の電気泳動写真の各レーンは以下の通り：１．分子量マーカー、２．培養上清、３．抗ＦＬＡＧ抗体カラムＶｏｉｄ画分、４．抗ＦＬＡＧ抗体カラム溶出画分１、５．抗ＦＬＡＧ抗体カラム溶出画分２、６．抗ＦＬＡＧ抗体カラム溶出画分３、７．抗ＦＬＡＧ抗体カラム溶出画分４、８．分子量マーカー。 Ｊ６Ｅ２－Ｆｃ、ＪＦＨ１Ｅ２－Ｆｃ、ＴＨＥ２－Ｆｃ、Ｃｏｎ１Ｅ２－Ｆｃ、Ｊ１Ｅ２－Ｆｃ及びＨ７７Ｅ２－Ｆｃタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示した図である。各種Ｅ２Ｆｃタンパク質は、還元下では、約９７ｋＤａであることを示す。精製された各ＨＣＶ株由来の抗原Ｅ２タンパク質とヒト免疫グロブリンＦｃドメインとの融合タンパク質が示されている。図中の電気泳動写真の各レーンは以下の通り：１．分子量マーカー、２．Ｊ６Ｅ２－Ｆｃ、３．ＪＦＨ１Ｅ２－Ｆｃ、４．ＴＨＥ２－Ｆｃ、５．Ｃｏｎ１Ｅ２－Ｆｃ、６．Ｊ１Ｅ２－Ｆｃ、７．Ｈ７７Ｅ２－Ｆｃ、８．分子量マーカー。 各モノクローナル抗体の種々の遺伝子型／株のＨＣＶのＥ２タンパク質への結合性及び抗体サブタイプを示した図である。抗体が抗原Ｅ２タンパク質に結合する強度を－から＋＋＋で示している。－：　ＯＤ４５０ｎｍ＜０．１、＋：　０．１≦ＯＤ４５０ｎｍ＜０．２５、＋＋：　０．２５≦ＯＤ４５０ｎｍ＜０．４、＋＋＋：　０．４≦ＯＤ４５０ｎｍ。８Ｄ１０－３は遺伝子型１ａ、１ｂ及び２ａのＨＣＶの抗原Ｅ２タンパク質に結合し、１Ｇ２－３２及び２Ｆ２－７は遺伝子型２ａの抗原Ｅ２タンパク質に結合し、４Ｅ８－８は遺伝子型１ｂと２ａの抗原Ｅ２タンパク質に結合する抗体であることを示し、Ｍ１Ｅ１２－１はＪＦＨ１株の抗原Ｅ２タンパク質に、９Ａ５－４はＪＦＨ１株とＨ７７株の抗原Ｅ２タンパク質に結合するモノクローナルであることを示している。 ８Ｄ１０－３モノクローナル抗体（図７Ａ）、１Ｇ２－３２モノクローナル抗体（図７Ｂ）、４Ｅ８－８モノクローナル抗体（図７Ｃ）、２Ｆ２－７モノクローナル抗体（図７Ｄ）及びＭ１Ｅ１２－１モノクローナル抗体（図７Ｅ）のＪ６ＣＦ株のＨＣＶの抗原Ｅ２タンパク質由来のアミノ酸配列を有するペプチドに対する結合強度を示した図である。 モノクローナル抗体１Ｇ２－３２及び８Ｄ１０－３を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおける種々の遺伝子型のＨＣＶ／ＨＣＶ株由来の抗原Ｅ２タンパク質の検出感度を示した図である。図中、黒丸はＪ６Ｅ２－Ｆｃ、白抜き丸はＪＦＨ１Ｅ２－Ｆｃ、黒四角はＴＨＥ２－Ｆｃ、白抜き四角はＣｏｎ１Ｅ２－Ｆｃ、黒菱形はＪ１Ｅ２－Ｆｃ、白抜き菱形はＨ７７Ｅ２－Ｆｃを表す。 モノクローナル抗体８Ｄ１０－３を用いたウェスタンブロット法における種々の遺伝子型／株のＨＣＶＥ２タンパク質の検出の有無を示した図である。
　以下、本発明を実施するための好ましい実施形態について説明する。
　本発明の抗体は、遺伝子型が２ａであるＨＣＶ（以下、ＨＣＶ２ａ）のエンベロープタンパク質２（以下、Ｅ２タンパク質）に特異的に結合し、遺伝子型が１ａであるＨＣＶ（以下、ＨＣＶ１ａ）のＥ２タンパク質には免疫学的に反応しないことを特徴としており、ＨＣＶ１ａのＥ２タンパク質及び遺伝子型が１ｂであるＨＣＶ（以下、ＨＣＶ１ｂ）のＥ２タンパク質の双方に免疫学的に反応しない抗体がより好ましい実施形態である。
　上記抗体は、ＨＣＶのＥ２タンパク質の膜貫通領域（膜貫通ドメインとも呼ぶ）を含まない領域からなる抗原タンパク質又は該タンパク質の一部からなるペプチドを抗原として動物に免疫し、Ｅ２タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製して、ＨＣＶ２ａのＥ２タンパク質に特異的に結合し、ＨＣＶ１ａ遺伝のＥ２タンパク質には免疫学的に反応しない抗体、さらには、ＨＣＶ１ａのＥ２タンパク質及びＨＣＶ１ｂのＥ２タンパク質の双方に免疫学的に反応しない抗体、を産生するハイブリドーマをスクリーニングすれば調製できる。
　ここで、Ｅ２タンパク質は、ＨＣＶの前駆体タンパク質が宿主細胞由来のシグナルペプチダーゼとＨＣＶ自身がコードしている２種類のプロテアーゼによって開裂することによって生じる機能的ウイルスタンパク質の１つであり、ＨＣＶ２ａであるＪ６ＣＦ株を例に挙げると、前駆体タンパク質のＮ末端に位置するメチオニンを１番目のアミノ酸とした場合に、第３８４番目～第７５０番目に位置するタンパク質（３６７アミノ酸）である。Ｅ２タンパク質の第７２２番目～第７５０番目のアミノ酸の領域は、膜貫通ドメインである（Ｃｏｃｑｕｅｒｅｌら、Ｊ.　Ｖｉｒｏｌ.、２０００年、７４巻、ｐ．３６２３～３６３３）。図１は、ＨＣＶの前駆体タンパク質の模式図である。
　以下に、上記抗体を得るための手法について、順次説明する。
１）抗原となるＥ２タンパク質由来のタンパク質又はペプチドの選定
　上記抗体を得るために動物に免疫する抗原としては、ＨＣＶ２ａのＥ２タンパク質の膜貫通領域を含まない領域からなるタンパク質（以下、抗原Ｅ２タンパク質）又は該タンパク質の一部からなるペプチド（抗原Ｅ２ペプチド）を利用できるが、抗原Ｅ２ペプチドの場合は、遺伝子型が２ａ以外のＨＣＶのＥ２タンパク質に対してホモロジーの低い領域からなることが必要である。
　抗原Ｅ２タンパク質としては、ＨＣＶ２ａの前駆体タンパク質（例えば配列番号５）の第３８４番目～第７２０番目のアミノ酸からなるタンパク質を選定すればよいが、前駆体タンパク質の第５３０番目～第５６２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むタンパク質を選定することが好ましく、前駆体タンパク質の第４６５番目～第４８４番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列、第５５９番目のアミノ酸～第５８４番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列及び第６８３番目～第７１９番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列、からなる群からなる１以上のアミノ酸配列を含むタンパク質を選定することがより好ましい。
　また、抗原Ｅ２ペプチドとしては、ＨＣＶ２ａの前駆体タンパク質（例えば配列番号５）の第５３０番目～第５６２番目のアミノ酸（より好ましくは、第５３１番目～第５４９番目のアミノ酸、さらに好ましくは、第５３１番目～第５４０番目のアミノ酸）を含み、ペプチドの長さが１０～１９アミノ酸（より好ましくは、１０アミノ酸）であるペプチドを選定すればよいが、前駆体タンパク質の第４６５番目～第４８４番目のアミノ酸（より好ましくは、第４６５番目～第４７７番目のアミノ酸、さらに好ましくは第４６８番目～第４７７番目のアミノ酸）を含み、ペプチドの長さが１０～１３アミノ酸（より好ましくは、１０アミノ酸）であるペプチド、前駆体タンパク質の第５５９番目～第５８４番目のアミノ酸（より好ましくは、第５６４番目～第５７６番目のアミノ酸、さらに好ましくは、第５６７番目～第５７６番目のアミノ酸）を含み、ペプチドの長さが１０～１３アミノ酸（より好ましくは、１０アミノ酸）であるペプチド、又は、前駆体タンパク質の第６８３番目～第７１９番目のアミノ酸（好ましくは、第７０４番目～第７１９番目のアミノ酸、より好ましくは、第７０９番目～第７１９番目のアミノ酸）を含み、ペプチドの長さが１０～１９アミノ酸（より好ましくは、１０アミノ酸）であるペプチド、を選定することがより好ましい。
　なお、ＨＣＶ２ａのゲノムの塩基配列は、既にいくつものウイルス株で明らかとなっており（Ｙａｎａｇｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９年、２６２巻、ｐ．２５０～２６３）、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。例えば、ＨＣＶ２ａであるＪＦＨ１株のゲノムの塩基配列を開示するＧｅｎＢａｎｋ　アクセッション番号は、ＡＢ０４７６３９であり、Ｊ６ＣＦ株のゲノムの塩基配列を開示するＧｅｎＢａｎｋ　アクセッション番号は、ＡＦ１７７０３６である。
２）抗原Ｅ２ペプチドの調製
　上記のように選定された抗原Ｅ２ペプチドは、ＨＣＶ２ａの前駆体タンパク質をアミノ酸配列情報に基づいて、直接、化学合成することができ、例えば、ペプチド合成機を使用すれば、動物への免疫に使用可能な抗原を容易に大量調製できる。
３）抗原Ｅ２タンパク質の調製
　上記のように選定された抗原Ｅ２タンパク質は、ＨＣＶ２ａの前駆体タンパク質をコードする領域の塩基配列情報に基づいて、抗原Ｅ２タンパク質をコードするＤＮＡ断片を合成し、得られたＤＮＡ断片から抗原Ｅ２タンパク質を細胞で翻訳させれば、動物への免疫に使用可能な抗原を大量に調製できる。以下、具体的に説明する。
　抗原Ｅ２タンパク質は、抗原Ｅ２タンパク質をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた発現ベクターを構築し、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母、大腸菌等に形質導入することによって、各細胞で生産させることができるが、哺乳動物細胞で分泌発現させることが好ましい。この場合、抗原Ｅ２ペプチドをコードするＤＮＡ断片を、シグナルペプチド配列の下流にコドンのフレームが合うように連結し、その３’末端に停止コドンを付加して発現ベクターに挿入すればよい。
　抗原Ｅ２タンパク質を分泌発現させる哺乳動物細胞としては、例えば、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、Ｖｅｒｏ、ＣＶ－１、ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ、ハムスター細胞ＢＨＫ、ラットＧＨ３、ラット褐色腫由来細胞ＰＣ１２、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０、ＮＳＯ、ＮＳ－１、マウスリンパ腫細胞ＥＬ４、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、１０Ｔ１／２、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２、マウスストローマ細胞ＰＡ６、ＳＴ２、ＯＰ９、Ｔｓｔ－４、ヒト巨核芽球細胞ＣＭＫ、ヒトＴ細胞Ｊｕｒｋａｔ、ヒト腎上皮細胞２９３、ヒト肝臓ガン細胞Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、ＩＭＹ－Ｎ９、ヒト骨肉腫細胞ＭＧ－６３、ヒトＦＬ細胞、白色脂肪細胞、卵細胞、ＥＳ細胞を挙げることができる。
　細胞で抗原Ｅ２タンパク質を組換え発現させるためにプロモーターの制御下に当該タンパク質をコードするＤＮＡを挿入して用いることができる。哺乳動物細胞で抗原Ｅ２タンパク質を組換え発現させるために使用可能なプロモーターとしては、例えば、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ－１α（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ－１α）プロモーター、ユビキチンプロモーター、ＰＧＫ（ホスフォグリセリン酸キナーゼ）プロモーターを挙げることができる。
　抗原Ｅ２タンパク質を哺乳動物細胞で分泌発現させるための発現ベクターとしては、例えば、ｐＳｅｃＴａｇ／ＦＲＴ／Ｖ５－Ｈｉｓ（インビトロジェン社）、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－９（シグマ社）、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ１３（シグマ社）、ｐＦＵＳＥ－Ｆｃ２（インビボジェン社）及びｐＴｒｉＥｘ－７（ノバジェン社）を挙げることができる。発現ベクターに組み込まれているシグナルペプチド配列としては、プレプロトリプシンのシグナルペプチドが好ましく、プレプロトリプシンのシグナルペプチド配列を有するベクターとしては、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－９（シグマ社）、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３（シグマ社）を例示できる。なお、シグナルペプチドを含むタンパク質が哺乳動物細胞で発現されるとシグナルペプチドは除去されるため、抗原Ｅ２タンパク質を使用する際にシグナルペプチドが問題となることはない。
　抗原Ｅ２タンパク質を哺乳動物細胞で分泌発現させる際には、目的とする抗原Ｅ２タンパク質を標識タンパク質（例えば、Ｔａｇ）との融合タンパク質として発現させ、標識タンパク質に対する抗体や特異的に結合する分子を利用して、抗原Ｅ２タンパク質の検出や精製を行うことができる。標識タンパク質としては、ＦＬＡＧペプチド、３×ＦＬＡＧペプチド、ＨＡペプチド、３×ＨＡペプチド、ｍｙｃペプチド、６×Ｈisペプチド、ＧＳＴポリペプチド、ＭＢＰポリペプチド、ＰＤＺドメインポリペプチド、アルカリフォスファターゼ、免疫グロブリンＦｃドメイン、アビジン等を挙げられる。抗原Ｅ２タンパク質の調製に使用する標識タンパク質としては、ＦＬＡＧペプチド、ＨＡペプチド及び免疫グロブリンＦｃドメインが適しており、免疫グロブリンＦｃドメインがより適している。
　図２は、抗原Ｅ２タンパク質と３×ＦＬＡＧタンパク質との融合タンパク質の模式図であり、図３は、抗原Ｅ２タンパク質と免疫グロブリンＦｃドメインとの融合タンパク質の模式図である。
　免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ由来のものが使用でき、ヒト由来のものが好適である。なお、免疫グロブリンＦｃドメインを構成する免疫グロブリンの重鎖のクラスは、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の何れであっても良い。
　ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列は、Ｅｄｅｌｍａｎらにより報告されている（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃi．　ＵＳＡ、１９６９年、６３巻、ｐ．７８～８５）。また、ヒト免疫グロブリンの重鎖のｃＤＮＡの塩基配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能であり（重鎖のアクセッション番号：ＢＸ６４０６２７等）、入手した塩基配列に基づいてＰＣＲプライマーを設計し、ヒト脾臓細胞のｃＤＮＡライブラリーやヒトゲノミックＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行えば、免疫グロブリンＦｃドメインのｃＤＮＡをクローニングできる。
　ＨＣＶのＥ２タンパク質と免疫グロブリンＦｃドメインとの連結部位は直接連結することができるが、リンカーとなるペプチドを挿入して連結してもよい。リンカーとなるペプチドとしては、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ａｓｐ－Ｐｒｏ、Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ、Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ及び（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）×３等が挙げられる。
　なお、昆虫細胞に抗原Ｅ２タンパク質を分泌発現させる場合には、例えば、Ｓｆ２１、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ等の昆虫細胞に、ポリヘドリン（多角体）プロモーター、ｐ１０プロモーター等を使用した発現ベクターを用いて形質導入して、抗原Ｅ２タンパク質又は抗原Ｅ２タンパク質と標識タンパク質の融合タンパク質を発現させればよい。
　また、酵母に抗原Ｅ２タンパク質を分泌発現させる場合には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス(Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ)に、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を使用した発現ベクターを用いて形質導入して、抗原Ｅ２タンパク質又は抗原Ｅ２タンパク質と標識タンパク質の融合タンパク質を発現させればよい。
　大腸菌に抗原Ｅ２タンパク質を分泌発現させる場合には、例えば、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ株、ＢＬ－２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＨＢ１０１株等の大腸菌株に、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター等を使用した発現ベクターを用いて形質転換して、抗原Ｅ２タンパク質又は抗原Ｅ２タンパク質と標識タンパク質の融合タンパク質を発現させればよい。
　哺乳動物細胞及び昆虫細胞に抗原Ｅ２タンパク質を分泌発現させるための発現ベクターを形質導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。より具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　３ｒｄ．　Ｅｄ．の１６．１－１６．６２（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、２００１年）に記載の方法に従って行なうことができる。
　大腸菌への発現ベクターの導入方法は、大腸菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ，　１９７２年、６９巻、ｐ．２１１０～２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
　酵母への発現ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９０年、１９４巻、ｐ．１８２～１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ、１９７８年、７５巻、ｐ．１９２９～１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈら、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９８３年、１５３巻、ｐ．１６３～１６８）等が挙げられる。
　形質導入された細胞の培養はそれ自体公知の方法で行えばよいが、哺乳動物細胞を培養する培地としては、例えば、約５～２０％の胎児牛血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９５０年、７３巻、ｐ．１）等が用いられ、ｐＨは約６～８であるのが好ましい。無血清培地としては、ＣＤ－ＣＨＯ、２９３　ＳＦＭ－ＩＩ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（いずれもインビトロジェン社）を使用でき、必要に応じて血清やサプリメントを添加してもよい。細胞の培養は、３０～４０℃で１５～６０時間行えばよく、必要に応じて通気や撹拌をすることが好ましい。
　細胞培養が終了した後は、培養液を遠心分離等により細胞を除去し、得られた培養上清から抗原Ｅ２タンパク質又は抗原Ｅ２タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質を精製することができる。抗原Ｅ２タンパク質又は抗原Ｅ２タンパク質と標識タンパク質の融合タンパク質の精製は、当業者に公知のタンパク質分離精製手法に従って行えばよく、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を組み合わせることによって単離精製できる。
　例えば、培養液中の抗原Ｅ２タンパク質は、ヘパリンカラム、レクチンカラムを使用すれば容易に精製できるが、３×ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質の場合は、抗ＦＬＡＧ抗体カラムを、６×Ｈｉｓペプチドとの融合タンパク質の場合は、ニッケルカラム、亜鉛カラム、コバルトカラムを、免疫グロブリンＦｃドメインとの融合タンパク質の場合は、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが、ＨＡペプチドを持つキメラタンパク質は、抗ＨＡ抗体カラムを使用すればより効率的に精製できる。
　精製された抗原Ｅ２タンパク質又は抗原Ｅ２タンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分画後にクマシーブリリアントブルー染色又は銀染色で検出できるが、融合タンパク質の場合は融合させた標識タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロット法で検出することもできる。
４）抗原Ｅ２ペプチド又は抗原Ｅ２タンパク質を用いた免疫
　ＨＣＶ２ａのＥ２タンパク質に特異的に結合し、ＨＣＶ１ａのＥ２タンパク質には免疫学的に反応しない抗体、より好ましくは、ＨＣＶ１ａのＥ２タンパク質及びＨＣＶ１ｂのＥ２タンパク質の双方に免疫学的に反応しない抗体を得るには、上記の抗原Ｅ２ペプチド又は抗原Ｅ２タンパク質を用いて動物を免疫して、ポリクローナル抗体を取得したり、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする必要がある。
　免疫する動物としては、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能な脾細胞を有する非ヒト動物であればよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリが挙げられるが、マウスがより好ましく使用できる。
　免疫の方法としては、例えば、４～１０週令のマウスの皮下又は腹腔内に、アジュバントとともに上記の抗原Ｅ２ペプチド又は抗原Ｅ２タンパク質を数回投与し、血中抗体価の上昇が確認された後に抗原Ｅ２ペプチド又は抗原Ｅ２タンパク質のみを静脈内又は腹腔内に投与することによりブーストし、３～１０日目（好適には４日目）に、血液又は脾臓細胞を採取すればよい。この場合、採取した血液から得られる血清は、抗体価を測定し、目的とする抗原を特異的に認識するものであればポリクローナル抗体として利用できる。
　アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンの混合物、Ｔｉｔｅｒ　Ｍａｘ　Ｇｏｌｄ（Ｖａｘｅｌ社）又はＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社）等を例示できる。
　血中抗体価の測定は、免疫した動物の眼底静脈叢又は尾静脈より採血し、得られた血液中に抗原Ｅ２ペプチド又は抗原Ｅ２タンパク質に反応する抗体が有無を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で調べればよい。
５）ハイブリドーマ細胞の作製
　血中抗体価の上昇が確認され、ブーストを行った後３～１０日目に採取した免疫動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と細胞融合させれば、自律増殖能を持ったハイブリドーマ細胞を作製することができ、目的の特異性をもった抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体を大量に調製することができる。
　細胞融合に使用する骨髄腫細胞としては、例えば、マウス由来の株化細胞であるＰ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）、Ｐ３／ＮＳ１／１－Ａｇ４－１（ＮＳ１）等を使用でき、これらの細胞株は、理化学研究所バイオリソースセンター、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）又はＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手可能である。
　脾細胞と骨髄腫細胞との細胞融合は、両細胞を洗浄した後、骨髄腫細胞１に対し脾細胞を１～１０の割合で混合し、融合促進剤として、平均分子量１０００～６０００のポリエチレングリコール又はポリビニールアルコールを加えたり、電気刺激（例えば、エレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて行えばよい。
　細胞融合のための処理が完了した後は、融合細胞を培地に懸濁して洗浄し、限界希釈法又はメチルセルロース培地中でのコロニー形成法によってクローニングを行うこととなる。ここで、限界希釈法としては、例えば、１０３～１０７ 細胞／ｍＬとなるよう希釈後、９６ウェルの細胞培養用マイクロプレートに１０２～１０６ 細胞／ウェルとなるように播種して培養する方法が例示できる。
　ハイブリドーマ細胞のクローニングを行う際の培養培地には、目的とする融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴサプリメントを添加することが好ましい。より詳細には、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年）やＳｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０年）に記載された方法に従って、目的とするハイブリドーマ細胞を取得し、クローニングすればよい。
６）ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
　目的とするハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、例えば、以下に記載するＥＩＡ法により行うことができる。
　具体的には、まず、抗原Ｅ２ペプチド又は抗原Ｅ２タンパク質を担体に固定（固相化）し、クローニングした各ハイブリドーマ細胞が産生する抗体を加え、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間、４～３７℃の条件で反応させる。
　次に、酵素、色素又はラジオアイソトープ等で標識され、形成された抗体／抗原複合体の抗体部分に特異的に結合可能な二次抗体を、形成された抗体／抗原複合体に接触させ、抗体／抗原／二次抗体複合体を形成するのに十分な時間、４～３７℃の条件で反応させる。
　最後に、二次抗体に標識されている酵素、色素又はラジオアイソトープのシグナルを指標に、形成された抗体／抗原／二次抗体複合体の有無を検出し、目的とする特性を有する抗体であるか否かを判断することとなる。
７）モノクローナル抗体の調製
　上記の方法により選択されたハイブリドーマ細胞を無血清培地、例えば、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（インビトロジェン社）に馴化させ、無血清培地にて培養した上清からモノクローナル抗体を調製できる。培養には、フラスコ、シャーレ、スピナーカルチャーボトル、ローラーボトルあるいは高密度培養フラスコＣＥＬＬｉｎｅ（ベクトンデッキンソン社）を使用することができる。
　また、大量にモノクローナル抗体を調製する場合には、例えば、６～８週令のヌードマウス又はＳＣＩＤマウスの腹腔内に、０．５ｍＬのプリスタン（２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン）を投与し、２週間飼育した後に５×１０６～２×１０７細胞／匹のハイブリドーマ細胞を腹腔内に投与し、１０～２１日間飼育することによって得られる腹水からモノクローナル抗体を調製できる。
　回収した腹水からは、遠心分離することによって細胞やその破砕物が除去され、４０～５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラム、プロテインＧ－カラム、ＨｉＴｒａｐ　ＩｇＭ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＨＰ－カラム（ＧＥヘルスケア社）、ｍａｎｎａｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－カラム（ピアス社）及びゲル濾過カラム等の精製手段を単独又は組み合わせることによって、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分が回収され、精製モノクローナル抗体として利用できる。
８）モノクローナル抗体のエピトープ解析
　モノクローナル抗体の線形エピトープを解析するには抗原Ｅ２タンパク質中の８～１２個の連続するアミノ酸を１から数アミノ酸ずつずらして設計したアミノ酸配列からなるペプチドを合成し、これを抗原として、モノクローナル抗体がどのペプチドに結合するかを調べ、抗体のエピトープを決定することができる。
　具体的には、合成したペプチドをプレートに固相化し、精製抗体と反応させる。標識した二次抗体を加えて静置し、その結合能を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定する。
　なお、本方法により、エピトープが決定できない場合もあるが、このような場合は、モノクローナル抗体のエピトープはコンフォメーションエピトープであり、その抗体は抗原の立体構造を認識する可能性が考えられる。
　ＨＣＶ２ａのＥ２タンパク質に特異的に結合し、ＨＣＶ１ａのＥ２タンパク質には免疫学的に反応しないことを特徴とする抗体としては、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体を例示でき、その具体的な抗体として、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体を例示できる。
　また、ＨＣＶ２ａのＥ２タンパク質に特異的に結合し、ＨＣＶ１ａのＥ２タンパク質及びＨＣＶ１ｂのＥ２タンパク質の双方に免疫学的に反応しない抗体としては、配列表の配列番号２又は３記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体を例示でき、その具体的な抗体として、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０又はＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体を例示できる。
　さらに、ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株のエンベロープタンパク質２に特異的に結合し、ＪＦＨ１株のエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない抗体としては、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体を例示でき、その具体的な抗体として、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８３であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体を例示できる。この抗体は、遺伝子型が２ａのＨＣＶの中から、Ｊ６ＣＦ株を識別することができるため、Ｊ６ＣＦ株の同定に利用できる。
　なお、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８３及びＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８２である上記ハイブリドーマ細胞株は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５－８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託されており（寄託日：２００８年９月１９日）、入手可能である。これらの細胞株は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１６７７（受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１６７７）、ＦＥＲＭ　Ｐ－２１６７６（受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１６７６）、ＦＥＲＭ　Ｐ－２１６７５（受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１６７５）、ＦＥＲＭ　Ｐ－２１６７９（受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１６７９）、ＦＥＲＭ　Ｐ－２１６７８（受領番号ＦＥＲＭ　ＡＰ－２１６７８）として同寄託機関に国内寄託されていた原寄託（原受託についての受領日：２００８年９月１９日）がブダペスト条約に基づく国際寄託に移管されたものである。
　また本発明のＨＣＶの遺伝子型の同定方法は、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０及びＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体のいずれにも結合しないＨＣＶの遺伝子型を１ｂであると同定し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０及びＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合するＨＣＶの遺伝子型を２ａであると同定し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８２であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合し、受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０及びＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体のいずれにも結合しないＨＣＶの遺伝子型を１ａであると同定することを特徴としている。
　受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０、ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９又はＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８２であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に、遺伝子型が不明であるＨＣＶが結合するか否かは、抗原抗体反応の有無を検出できるアッセイ系であれば特に限定はなく利用できるが、例えば、以下に記載するイムノアッセイやウェスタンブロット法を例示できる。
（イムノアッセイ）
　まず、結合の有無を調べる上記抗体を一次抗体として固相化した担体又はプレートに、遺伝子型が不明であるＨＣＶを含む試験サンプルを接触させ、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間、４～３７℃の条件で反応させる。
　次に、酵素、色素又はラジオアイソトープ等で標識された、ＨＣＶに対して遺伝子型非特異的に結合する二次抗体を、抗体／抗原複合体に接触させ、抗体／抗原／２次抗体複合体を形成するのに十分な時間、４～３７℃の条件で反応させる。
　最後に、２次抗体に標識されている酵素、色素又はラジオアイソトープのシグナルを指標に、形成された抗体／抗原／２次抗体複合体の有無を検出し、上記抗体との結合の有無を判断すればよい。
（ウェスタンブロット法）
　まず、遺伝子型が不明であるＨＣＶを含む試験サンプルをニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜等のメンブレンにスポットし、試験サンプルに含まれるタンパク質を固相化する。
　次に、５％スキムミルク、１％ＢＳＡ溶液又は市販のブロッキング剤にメンブレンを浸してブロッキングし、十分に緩衝液で洗浄した後に、酵素、色素又はラジオアイソトープ等で標識された結合の有無を調べる上記抗体を含む緩衝液にメンブレンを移し、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間、４～３７℃の条件で反応させる。
　その後、メンブレンを十分に洗浄し、結合の有無を調べる上記抗体に標識された酵素、色素又はラジオアイソトープのシグナルを検出し、上記抗体との結合の有無を判断すればよい。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
（実施例１）各ＨＣＶ株の抗原Ｅ２タンパク質に標識タンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの作製
（１）ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株由来の抗原Ｅ２タンパク質に３×ＦＬＡＧタグを付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
　ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株由来の抗原Ｅ２タンパク質、すなわち、ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株のＥ２タンパク質の膜貫通領域を含まない領域からなるタンパク質、は以下に示すようにして調製した。
　まず、ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１７７０３６）を鋳型として、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質（配列番号５）のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目～第７２０番目に相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ２　ＰＣＲキット（タカラバイオ社）で、Ｊ６Ｅ２ｄＴＭ－ｓ（配列番号６：CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG）及びＪ６Ｅ２ｄＴＭ－ａｓ（配列番号７：GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅した。
　次に、増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）中にクローニングし、３つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－９（シグマ社）のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位間に読み枠が合うように挿入し、３×ＦＬＡＧタグが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質）を発現するベクターをＣＭＶ－３ＸＦＬＡＧＪ６Ｅ２ｄＴＭを得た。
（２）ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株由来の抗原Ｅ２タンパク質にヒトＩｇＧのＦｃタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
　まず、ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ１７７０３６）を鋳型として、Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質（配列番号５）のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目～第７２０番目に相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ２　ＰＣＲキット（タカラバイオ社）で、Ｊ６Ｅ２Ｆｃ－ｓ（配列番号８：CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG）及びＪ６Ｅ２Ｆｃ－ａｓ（配列番号９：ACAGGATCCCATCGGACGATGTATTTTGTG）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅した。
　次に、増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）中にクローニングし、３つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３（シグマ社）のシグナルペプチド配列の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に読み枠（読みとりフレーム）が合うように（すなわちイン・フレームで）挿入し、このベクターをＣＭＶ－１３－Ｊ６Ｅ２と名付けた。
　引き続き、ＣＭＶ－１３－Ｊ６Ｅ２をＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化し、シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（シグマ社）で精製した。
　その後、マウスＩＬ－７受容体－ヒト免疫グロブリンＦｃドメインからなるキメラタンパク質を発現するベクターＣＤＭ－ｍＩＬ７Ｒ－Ｉｇ（Ｓｕｄｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ.　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１９９３年、９０巻、ｐ．９１２５～９１２９）のＳａｃＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に、上記シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするそれぞれのＤＮＡ断片を読み枠が合うように挿入して、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、Ｊ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質）を発現するベクターＣＤＭ－Ｊ６Ｅ２Ｆｃを得た。
（３）ＨＣＶ２ａのＪＦＨ１株由来の抗原Ｅ２タンパク質にヒトＩｇＧのＦｃタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
　まず、ＨＣＶ２ａのＪＦＨ１株のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０４７６３９）を鋳型として、ＪＦＨ１株の前駆体タンパク質のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目～第７２１番目に相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ２　ＰＣＲキット（タカラバイオ社）で、ＪＦＥ２Ｆｃ－ｓ（配列番号１０:CACAAGCTTGGCACCACCACCGTTGGAG）及びＪＦＥ２Ｆｃ－ａｓ（配列番号１１:ACAGGATCCTCCCATCGAACGACGTATTTTGTG）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅した。
　次に、増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）中にクローニングし、３つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３（シグマ社）のシグナルペプチド配列の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に読み枠が合うよう挿入した。このベクターをＣＭＶ－１３－ＪＦＨ１Ｅ２と名付けた。
　引き続き、ＣＭＶ－１３－ＪＦＨ１Ｅ２をＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化し、シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（シグマ社）で精製した。
　その後、ＣＤＭ－ｍＩＬ７Ｒ－ＩｇのＳａｃＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に、上記シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするそれぞれのＤＮＡ断片を読み枠が合うように挿入して、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、ＪＦＨ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質）を発現するベクターＣＤＭ－ＪＦＨ１Ｅ２Ｆｃを得た。
（４）ＨＣＶ１ｂのＴＨ株由来の抗原Ｅ２タンパク質にヒトＩｇＧのＦｃタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
　まず、ＨＣＶ１ｂのＴＨ株のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（国際公開ＷＯ２００６／０２２４２２）を鋳型として、ＴＨ株の前駆体タンパク質のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目～第７１７番目に相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ２　ＰＣＲキット（タカラバイオ社）で、ＴＨＥ２Ｆｃ－ｓ（配列番号１２：CAAAGCTTGCGACCTACGTGACGGGGGGGTCG）及びＴＨＥ２Ｆｃ－ａｓ（配列番号１３：CCTCTAGATTATGGATCCCATTTGATTGCATAGGAGACAACCG）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅した。
　次に、増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）中にクローニングし、３つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３（シグマ社）のシグナルペプチド配列の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に読み枠が合うよう挿入した。このベクターをＣＭＶ－１３－ＴＨＥ２と名付けた。
　引き続き、ＣＭＶ－１３－ＴＨＥ２をＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化し、シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（シグマ社）で精製した。
　その後、ＣＤＭ－ｍＩＬ７Ｒ－ＩｇのＳａｃＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に、上記シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするそれぞれのＤＮＡ断片を読み枠が合うよう挿入して、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、ＴＨＥ２－Ｆｃタンパク質）を発現するベクターＣＤＭ－ＴＨＥ２Ｆｃを得た。
（５）ＨＣＶ１ｂのＣｏｎ１株由来の抗原Ｅ２タンパク質にヒトＩｇＧのＦｃタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
　まず、ＨＣＶ１ｂのＣｏｎ１株のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＪ２３８７９９）を鋳型として、Ｃｏｎ１株の前駆体タンパク質のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目～第７１６番目に相当する領域化からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ２　ＰＣＲキット（タカラバイオ社）で、Ｃｏｎ１Ｅ２Ｆｃ－ｓ（配列番号１４：CAAAGCTTGGAACCTATGTGACAGGGGGGACGAT）及びＣｏｎ１Ｅ２Ｆｃ－ａｓ（配列番号１５：CCTCTAGATTATGGATCCCATTTGATTGCAAAGGAGACAAC）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅した。
　次に、増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）中にクローニングし、３つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３（シグマ社）のシグナルペプチド配列の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に読み枠が合うよう挿入し、このベクターをＣＭＶ－１３－Ｃｏｎ１Ｅ２と名付けた。
　引き続き、ＣＭＶ－１３－Ｃｏｎ１Ｅ２をＳａｃＩとＢａｍＨＩで消化し、シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（シグマ社）で精製した。
　その後、ＣＤＭ－ｍＩＬ７Ｒ－ＩｇのＳａｃＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に、上記シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするそれぞれのＤＮＡ断片を読み枠が合うよう挿入して、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、Ｃｏｎ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質）を発現するベクターＣＤＭ－Ｃｏｎ１Ｅ２Ｆｃを得た。
（６）ＨＣＶ１ｂのＪ１株由来の抗原Ｅ２タンパク質にヒトＩｇＧのＦｃタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
　まず、ＨＣＶ１ｂのＪ１株由来のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｄ８９８１５）を鋳型として、Ｊ１株の前駆体タンパク質のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目～第７１６番目に相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ２　ＰＣＲキット（タカラバイオ社）で、Ｊ１Ｅ２Ｆｃ－ｓ（配列番号１６：CAAAGCTTCATACCCGCGTGACGGGGGGGGTGC）及びＪ１Ｅ２Ｆｃ－ａｓ（配列番号１７：CCTCTAGATTATGGATCCCACTTGATGGCAATGGAGACGACC）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅した。
　次に、増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）中にクローニングし、３つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３(シグマ社)のシグナルペプチド配列の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に読み枠が合うよう挿入し、このベクターをＣＭＶ－１３－Ｊ１Ｅ２と名付けた。
　引き続き、ＣＭＶ－１３－Ｊ１Ｅ２をＴｔｈ１１１Ｉで消化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端とした後にＢａｍＨＩで消化し、シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするＤＮＡ断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（シグマ社）で精製した。
　その後、ＣＤＭ－ｍＩＬＲ７Ｒ－ＩｇをＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化して、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインをコードする配列を含むＤＮＡ断片を切り出し、ｐｃＤＬ－ＳＲα２９６（Ｔａｋｅｂｅら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｉｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ.　ＵＳＡ、１９８７年、８４巻、ｐ．７３８８～７３９２）のプロモーター領域の下流に挿入し、ＳＲαＩｇＧ１Ｆｃを作製した。さらに、ＳＲαＩｇＧ１ＦｃのＥｃｏＲＶ部位とＢａｍＨＩ部位間に、上記シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするそれぞれのＤＮＡ断片を読み枠が合うよう挿入し、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、Ｊ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質）を発現するベクターＳＲα－Ｊ１Ｅ２Ｆｃを得た。
（７）ＨＣＶ１ａのＨ７７株由来の抗原Ｅ２タンパク質にヒトＩｇＧのＦｃタンパク質を付加した融合タンパク質を発現させるためのベクターの構築
　まず、ＨＣＶ１ａのＨ７７株のゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０１１７５１）を鋳型として、Ｈ７７株の前駆体タンパク質のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合における第３８４番目～第７１６番目に相当する領域からなるタンパク質をコードする遺伝子を、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＧＣ２　ＰＣＲキット（タカラバイオ社）で、Ｈ７７Ｅ２Ｆｃ－ｓ（配列番号１８：CAAAGCTTGAAACCCACGTCACCGGGGGAAA）及びＨ７７Ｅ２Ｆｃ－ａｓ（配列番号１９：CCTCTAGATTATGGATCCCACTTAATGGCCCAGGACGCGAT）をプライマーに用いてＰＣＲ法で増幅した。
　次に、増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）中にクローニングし、３つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンから、抗原Ｅ２タンパク質をコードする遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化して切り出し、ｐ３×ＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３(シグマ社)のＳａｃＩ部位をＸｈｏＩ部位に変換したベクター、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１３Ｘｈｏのシグナルペプチド配列の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位間に読み枠が合うよう挿入し、このベクターをＣＭＶ－１３－ＸｈｏＨ７７Ｅ２と名付けた。
　引き続き、ＣＭＶ－１３－ＸｈｏＨ７７Ｅ２をＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化し、シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ（シグマ社）で精製した。
　その後、上記５）で作製したＳＲα－ＩｇＧ１ＦｃのＸｈｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位間に、上記シグナルペプチド配列と抗原Ｅ２タンパク質とをコードするそれぞれのＤＮＡ断片を読み枠が合うよう挿入して、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインが付加された抗原Ｅ２タンパク質（以下、Ｈ７７Ｅ２－Ｆｃタンパク質）を発現するベクターＳＲα－Ｈ７７Ｅ２Ｆｃを得た。
（実施例２）抗原Ｅ２タンパク質に標識タンパク質を付加した融合タンパク質の発現
　実施例１で作製したＣＭＶ－３ＸＦＬＡＧＪ６Ｅ２ｄＴＭ、ＣＤＭ－Ｊ６Ｅ２Ｆｃ、ＣＤＭ－ＪＦＨ１Ｅ２Ｆｃ、ＣＤＭ－ＴＨＥ２Ｆｃ、ＣＤＭ－Ｃｏｎ１Ｅ２Ｆｃ、ＳＲα－Ｊ１Ｅ２Ｆｃ及びＳＲα－Ｈ７７Ｅ２Ｆｃを、以下のようにしてサル腎臓由来ＣＯＳ１細胞に導入して各融合タンパク質を発現させた。
　まず、１０％ウシ胎児血清（インビトロジェン社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）でＣＯＳ１細胞を継代培養し、遺伝子導入の前日に、２倍のスプリットレシオで、１５０ｃｍ２培養フラスコ（コーニングコースター社）に播き、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。
　その後、ＲＰＭＩ１６４０培地に終濃度がそれぞれ４００μｇ／ｍｌ、１００μＭとなるようにＤＥＡＥデキストラン（ＧＥヘルスケア社）とクロロキン（シグマ社）とを加え、１３ｍｌ当たり０．１μｇ／μｌの濃度で上記発現ベクター（ＣＭＶ－３×ＦＬＡＧＪ６Ｅ２ｄＴＭ、ＣＤＭ－Ｊ６Ｅ２Ｆｃ、ＣＤＭ－ＪＦＨ１Ｅ２Ｆｃ、ＣＤＭ－ＴＨＥ２Ｆｃ、ＣＤＭ－Ｃｏｎ１Ｅ２Ｆｃ、ＳＲα－Ｊ１Ｅ２Ｆｃ又はＳＲα－Ｈ７７Ｅ２Ｆｃ）を５０μｇ加えて３～４日間培養した。
　その後、培養したＣＯＳ１細胞の上清を吸引除去し、１０ｍｌのＰＢＳ（－）（ニッスイ製薬社）を添加し、再度、ＰＢＳ（－）を吸引除去することにより細胞を洗浄し、引き続き、ＤＥＡＥデキストラン－ＤＮＡ混合液を１３ｍｌ／１５０ｃｍ２フラスコで加えて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で静置した。
　４時間後、ＤＥＡＥデキストラン－ＤＮＡ混合液を吸引除去し、１０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社）を５０ｍｌ／フラスコにて加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４日間培養した。その後、培養上清を５０ｍｌの遠心管（コーニングコースター社）に回収し、２５００ｒｐｍ、３０分、４℃で遠心分離し、その上清を０．２μｍの濾過フィルター（ワットマン社）で濾過した。
（実施例３）抗原Ｅ２タンパク質に標識タンパク質を付加した融合タンパク質の精製
　ＣＭＶ－３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭを導入した細胞の培養上清は、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２アガロース（シグマ社）を用いて以下のように精製した。
　まず、５００ｍｌの培養上清に対し、１ｍｌの抗ＦＬＡＧ　Ｍ２アガロースを添加し、スピナーボトルで撹拌しながら、４℃で２時間反応させた。２時間後、上清と抗ＦＬＡＧ　Ｍ２アガロースの混合液をエコノカラム（バイオラド社）に移し、Ｖｏｉｄ画分を除去し、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２アガロースを回収した。
　次に、抗ＦＬＡＧ　Ｍ２アガロースを１０ｍｌのＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で１ｍｌ／画分となるように６画分（抗ＦＬＡＧ抗体カラム溶出画分１～６）を溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を添加し、中性に戻した。各画分の２０μｌ分を還元下にてＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、クマシーブリリアントブルーにて染色した。その結果、Ｊ６ＣＦ株由来の抗原Ｅ２タンパク質と３×ＦＬＡＧタグの融合タンパク質（３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質）が精製されていることが確認された（図４）。
　ＣＤＭ－Ｊ６Ｅ２Ｆｃ、ＣＤＭ－ＪＦＨ１Ｅ２Ｆｃ、ＣＤＭ－ＴＨＥ２Ｆｃ、ＣＤＭ－Ｃｏｎ１Ｅ２Ｆｃ、ＳＲα－Ｊ１Ｅ２Ｆｃ又はＳＲα－Ｈ７７Ｅ２Ｆｃを導入したそれぞれの細胞の培養上清については、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａを結合させた担体であるＰｒｏｓｅｐ－Ａ（ミリポア社）を用いて以下のように精製した。
　まず、１ｍｌのＰｒｏｓｅｐ－Ａをエコノカラムに充填し、５００ｍｌの培養上清を流速１～１．５ｍＬ／ｍｉｎで通過させた後、２０ｍｌのＰＢＳ（－）で洗浄した。
　次に、０．１Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）で１ｍｌ／画分となるように５画分溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を添加し、中性に戻した。各画分の２０μｌ分を還元下にてＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、クマシーブリリアントブルーにて染色した。その結果、各ＨＣＶ株由来の抗原Ｅ２タンパク質とヒト免疫グロブリンＦｃドメインとの融合タンパク質が精製され、還元下の分子量は、約９７ｋＤａであることが示された（図５）。
（実施例４）ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株の抗原Ｅ２タンパク質のマウスへの免疫
　１０μｇの３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質を含む０．３ｍｌのＰＢＳ溶液と０．３ｍｌのフロイントの完全アジュバントを混合し、エマルジョンを調製した。そのエマルジョンの半量を７週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）の皮下に接種した。
　２週間後、１０μｇの３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質を含む０．３ｍｌのＰＢＳ溶液と０．３ｍｌのフロイントの不完全アジュバントを混合し、エマルジョンを調製した。そのエマルジョンの半量をマウスの皮下に投与した。さらに２週間後、１０μｇの３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質を含む０．１５ｍｌのＰＢＳ溶液をマウスの腹腔内に投与した。３日後にマウスから脾臓細胞を調製した。
　また別の実験として、２０μｇのＪ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を含む０．３ｍｌのＰＢＳ溶液と０．３ｍＬのＡｌｕｍ　（ピアース社）とを混合し、投与液を調製した。そのエマルジョンの全量を７週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（雌）の腹腔に接種した。
　２、４、６週間後、同様に２０μｇのＪ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を含む０．３ｍｌのＰＢＳ溶液と０．３ｍＬのＡｌｕｍとを混合し投与液を調製し、そのエマルジョンの全量をマウスの腹腔に投与した。さらに２ヶ月後、２０μｇのＪ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を含む０．３ｍｌのＰＢＳ溶液をマウスの腹腔内に投与した。３日後にマウスから脾臓細胞を調製した。
（実施例５）ハイブリドーマ細胞の作製
　まず、マウス骨髄腫細胞株であるＳＰ２／０（ＥＣＡＣＣより入手）を５５μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％の牛胎児血清（ＦＣＳ；インビトロジェン社）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン社）にて培養し、対数増殖期のＳＰ２／０細胞を得た。その細胞を、血清を含まないＤＭＥＭにて３回洗浄した。
　次に、３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質又はＪ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を投与したマウスより脾細胞を調製し、血清を含まないＤＭＥＭにて３回洗浄した。ＳＰ２／０細胞とマウス脾細胞とを１：５の比率になるように５０ｍｌの遠心チューブに入れ、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を完全に吸引して除去した。その後、遠心チューブをタッピングしてペレットをほぐし、そこに３７℃にて温めておいた５０％ポリエチレングリコール－１５００溶液（ロシュ社）を１分間かけて１ｍｌ加え、３７℃で１分間反応を続けた。
　引き続き、上記の遠心チューブに１ｍｌの血清不含ＤＭＥＭを１分間かけて加え、再度、１ｍｌの血清不含ＤＭＥＭを１分間かけて加え、最後に７ｍｌの血清不含ＤＭＥＭを３分間かけて加えることにより、エチレングリコール溶液を希釈した。その後、上記の遠心チューブを１，０００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞を回収し、１×１０６個／ｍｌとなるように５５μＭの２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１５％のＦＣＳ及び１０％ハイブリドーマクローニング因子（バイオベリス社）を含有するＤＭＥＭに細胞を懸濁した。
　こうして得られた細胞懸濁液は、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養し、翌日、２倍濃度のＨＡＴ（インビトロジェン社）、１５％ＦＣＳ、１０％ハイブリドーマクローニング因子を含むＤＭＥＭを各ウェルに１００μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで引き続き培養した。
　１０～１４日間の培養を行った後、各ウェルの培養上清を回収し、培養上清中に含まれる抗原Ｅ２タンパク質を認識する抗体を実施例６に示すようにスクリーニングした。
（実施例６）抗原Ｅ２タンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニング
　ハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、抗原Ｅ２タンパク質をプレートに固定し、ハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗体がプレートに固定した抗原Ｅ２タンパク質に結合するかどうかをＥＩＡにて評価することによって行った。
（１）抗原Ｅ２タンパク質の固相化プレートの作製
　３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質又はＪ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈して、イムノプレート（ヌンク社）の各ウェルに５０μｌずつ添加し、４℃にて一晩静置することによってタンパク質をプレートに固相化した。各ウェルからタンパク質溶液を除き、添付マニュアルに従って調製したブロッキング・ワン溶液（ナカライテスク社）を各ウェルに２００μｌずつ添加し、室温で２時間ブロッキングした。
（２）ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
　ブロッキングした上記の固相化プレートをハイブリドーマ細胞の培養上清中の抗Ｅ２タンパク質抗体のスクリーニングに使用した。その際、３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質を投与したマウスから作製したハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体のスクリーニングにはＪ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を固相化したプレートを、Ｊ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を投与したマウスから作製したハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体のスクリーニングには３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質を固相化したプレートを使用した。
　具体的には、上記の固相化したプレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（シグマ社）を含むＰＢＳで４回洗浄し、実施例５で得られた各ハイブリドーマ細胞の上清サンプルを各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社）を各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、ペルオキシダーゼ発色キット（住友ベークライト社）を用いて発色させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、陽性クローンを選抜した。
　その結果、３×ＦＬＡＧ－Ｊ６Ｅ２ｄＴＭタンパク質を投与したマウスから作製したハイブリドーマ細胞については、スクリーニングした９８０ウェル中、１１クローンを選択できた。それらのクローンを限界希釈法にてクローニングし、増殖性と抗体産生性の良いハイブリドーマ細胞株１Ｇ２－３２、２Ｆ２－７、２Ｆ３－７、４Ｅ８－８、５Ｄ４－６、９Ｇ３－２、９Ａ５－４、９Ｃ４－２、８Ｄ１０－３、１０Ｇ４－１を得た。
　一方、Ｊ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質を投与したマウスから作製したハイブリドーマ細胞については、スクリーニングした２０６４ウェル中、１０クローンを選択できた。これらのクローンを限界希釈法にてクローニングし増殖性と抗体産生性の良いハイブリドーマ細胞株Ｍ１Ｅ１２－１を得た。
（３）アイソタイプ及びサブタイプの解析
　得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブタイプの解析は、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｋｉｔ（ピアース社）を用いて、添付マニュアルに従って行った。その結果、各クローンの抗体のサブタイプは図６中に示した通りであり、イムノグロブリン軽鎖については全てκ鎖であった。
（４）ＩｇＧ抗体の精製
　得られた各ハイブリドーマ細胞は、培養培地中のＦＣＳ濃度を段階的に減少させていくことによって最終的に無血清培養に馴化させた。
　無血清培地　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ（インビトロジェン社）にて、各ハイブリドーマ細胞をコンフルエントになるまで培養した後、培養液を遠沈管に回収し、１５００　ｒｐｍで５分間遠心した。培養上清をＰｒｏｓｅｐ－Ｇ（ミリポア社）に添加し、３０ベッドボリュームのＰＢＳで洗浄し、続いて１ベッドボリュームの０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）にて６画分溶出した。溶出後、直ちに１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を添加し、中性に戻した。各画分の２０μｌ分を還元下及び非還元下にてＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供して分画し、クマシーブリリアントブルーにて染色することによってタンパク質の有無を確認した。ＩｇＧ画分をプールしてＰＢＳにて透析又はゲル濾過にて脱塩し抗体サンプルとした。
（実施例７）抗原Ｅ２タンパク質に対するモノクローナル抗体のＨＣＶの遺伝子型特異性について
　ＨＣＶ２ａのＪ６ＣＦ株の抗原Ｅ２タンパク質で免疫して作製した各ハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体が、遺伝子型２ａのＪ６ＣＦ株及びＪＦＨ１株由来のＥ２タンパク質、遺伝子型１ｂのＴＨ株、Ｊ１株及びＣｏｎ１株由来のＥ２タンパク質、遺伝子型１ａのＨ７７株由来のＥ２タンパク質に結合するかどうかについて検討した。
　抗原としては、抗原Ｅ２タンパク質とヒト免疫グロブリンのＦｃドメインとの融合タンパク質である、実施例１～３で作製したＪ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質、ＪＦＨ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質、ＴＨＥ２－Ｆｃタンパク質、Ｊ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質、Ｃｏｎ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質及びＨ７７Ｅ２－Ｆｃタンパク質を用い、実施例６に示したようにこれらのタンパク質をプレートに固相化して評価に用いた。
　具体的には、上記の各融合タンパク質を１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈してイムノプレートの各ウェルに５０μｌずつ添加し、４℃にて一晩静置することによって各融合タンパク質をプレートに固相化した。タンパク質溶液を除き、添付マニュアルに従って調製したブロッキング・ワン溶液（ナカライテスク社）を各ウェルに２００μｌずつ添加し、室温で２時間ブロッキングした。
　次に、各ハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体をＰＢＳで１μｇ／ｍｌとなるように希釈して、上記の固相化したプレートの各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、ペルオキシダーゼ発色キットを用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　図６は、各モノクローナル抗体の種々のＨＣＶの遺伝子型／株の抗原Ｅ２タンパク質への結合性を示している。吸光度の数値が０．１未満を－、０．１以上０．２５未満を＋、０．２５以上０．４未満を＋＋、０．４以上を＋＋＋として示し、抗原Ｅ２タンパク質に結合する強度を表している。８Ｄ１０－３は遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａのＨＣＶの抗原Ｅ２タンパク質に結合し、１Ｇ２－３２及び２Ｆ２－７は遺伝子型２ａの抗原Ｅ２タンパク質に結合し、４Ｅ８－８は遺伝子型１ｂと２ａの抗原Ｅ２タンパク質に結合する抗体であることを示している。さらに、Ｍ１Ｅ１２－１はＪ６ＣＦ株の抗原Ｅ２タンパク質に結合するモノクローナルであることを示している。
　これらの結果は、上記のモノクローナル抗体のセットを用いることにより、遺伝子型やＨＣＶ株の同定に使用できることを示している。
　また、モノクローナル抗体８Ｄ１０－３を生産するハイブリドーマ細胞（８Ｄ１０－３）は受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８２として、モノクローナル抗体１Ｇ２－３２を生産するハイブリドーマ細胞（１Ｇ２－３２）は受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９として、モノクローナル抗体２Ｆ２－７を生産するハイブリドーマ細胞（２Ｆ２－７）は受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０として、モノクローナル抗体４Ｅ８－８を生産するハイブリドーマ細胞（４Ｅ８－８）は受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１として、モノクローナル抗体Ｍ１Ｅ１２－１を生産するハイブリドーマ細胞（Ｍ１Ｅ１２－１）は受領番号ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８３として、２００８年９月１９日付で、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託されている。
（実施例８）モノクローナル抗体のエピトープ解析
　Ｊ６ＣＦ株の前駆体タンパク質（配列番号５）のＮ末端の開始メチオニンを１番目とした場合に第３８４番目～第７２０番目までに相当する抗原Ｅ２タンパク質に相当するアミノ酸について、１０個の連続するアミノ酸をＮ末端から３アミノ酸ずつずらして設計したアミノ酸配列からなるペプチド群（ペプチド番号１～１１０）を合成した。各ペプチドのＮ末端はビオチン化し、Ｃ末端はグリシンアミドとした（ＪＰＴ社に合成委託）。
　合成したペプチドをＤＭＳＯに溶解し、ＰＢＳに０．０１ｎｍｏｌ／μｌとなるように溶解した。このペプチド溶液をストレプトアビジンコーティングプレート（ヌンク社）の各ウェルに５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。ペプチド溶液を捨て、添付マニュアルに従って調製したブロッキング・ワン溶液（ナカライテスク社）を各ウェルに２００μｌずつ添加し、４℃で一晩静置することによってブロッキングした。
　その後、ブロッキング溶液を捨て、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　含有ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈した各モノクローナル抗体を各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温にて１．５時間反応させた。反応終了後、抗体溶液を捨て、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　含有ＰＢＳで４回洗浄し、続いて０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＧＥヘルスケア）を５０μｌ／ウェル加え、室温にて１時間反応させた。反応後、抗体溶液を捨て、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０　含有ＰＢＳで５回洗浄した。洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キット発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することによってペプチドに結合した抗体を検出した。
　図７Ａ～Ｅは、Ｊ６ＣＦ株由来の抗原Ｅ２タンパク質由来のペプチド群に対する各モノクローナル抗体の結合強度を示したものである。ＯＤ４５０ｎｍでの測定値（図７Ａ～Ｅの縦軸の値）が高い場合には、そのペプチドに対するモノクローナル抗体の結合強度が強く、その抗体が当該ペプチドを特異的に認識することが示される。各モノクローナル抗体は、Ｊ６ＣＦ株の抗原Ｅ２タンパク質由来のペプチドのいくつかを認識した。
　８Ｄ１０－３モノクローナル抗体の特に強いエピトープは、ＤＲＬＧＡＰＴＹＴＷ（配列番号２０；ペプチド番号４７）であり、このペプチドとオーバーラップしているＧＡＰＴＹＴＷＧＥＮ（配列番号２１；ペプチド番号４８）であった（図７Ａ）。このことから、エピトープは、アミノ酸配ＤＲＬＧＡＰＴＹＴＷＧＥＮ（配列番号２２）中の少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列であると考えられた。また、ＹＰＹＲＬＷＨＹＰＣ（配列番号２３；ペプチド番号７８）も弱いエピトープであった（図７Ａ）。
　４Ｅ８－８モノクローナル抗体の特に強いエピトープは、ＷＧＥＮＥＴＤＶＦＬ（配列番号１；ペプチド番号５０）であり、このペプチドとオーバーラップしているＮＥＴＤＶＦＬＬＮＳ（配列番号２４；ペプチド番号５１）、ＤＶＦＬＬＮＳＴＲＰ（配列番号２５；ペプチド番号５２）及びＬＬＮＳＴＲＰＰＬＧ（配列番号２６；ペプチド番号５３）は弱いエピトープであった（図７Ｃ）。このことから、エピトープはＷＧＥＮＥＴＤＶＦＬＬＮＳＴＲＰＰＬＧ（配列番号２７）中の少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列であると考えられた。
　２Ｆ２－７モノクローナル抗体の特に強いエピトープは、ＧＷＧＡＬＱＹＥＤＮ（配列番号２；ペプチド番号２９）であった（図７Ｄ）。このペプチドとオーバーラップしているＦＲＶＧＷＧＡＬＱＹ（配列番号２８；ペプチド番号２８）は弱いエピトープであった（図７Ｄ）。このことから、エピトープは、アミノ酸配ＦＲＶＧＷＧＡＬＱＹＥＤＮ（配列番号２９）中の少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列であると考えられた。
　１Ｇ２－３２モノクローナル抗体の特に強いエピトープは、ＫＴＣＧＡＰＰＣＲＴ（配列番号３；ペプチド番号６１）及びＧＡＰＰＣＲＴＲＡＤ（配列番号３０；ペプチド番号６２）であった（図７Ｂ）。このことから、エピトープは、アミノ酸配ＫＴＣＧＡＰＰＣＲＴＲＡＤ中（配列番号３１）の少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列であると考えられた。
　Ｍ１Ｅ１２－１モノクローナル抗体の特に強いエピトープは、ＮＹＴＩＦＫＩＲＭＹ（配列番号４；ペプチド番号８２）及びＩＦＫＩＲＭＹＶＧＧ（配列番号３２；ペプチド番号８３）であった（図７Ｅ）。このことから、エピトープは、アミノ酸配ＮＹＴＩＦＫＩＲＭＹＶＧＧ（配列番号３３）中の少なくとも１０個の連続するアミノ酸配列であると考えられた。
（実施例９）モノクローナル抗体を用いたＨＣＶエンベロープタンパク質の検出
　作製したハイブリドーマ細胞から調製したモノクローナル抗体を用いて、遺伝子型１ａのＨ７７株由来の抗原Ｅ２タンパク質、遺伝子型２ａのＪ６ＣＦ株及びＪＦＨ１株由来の抗原Ｅ２タンパク質、遺伝子型１ｂのＴＨ株、Ｊ１株及びＣｏｎ１株由来の抗原Ｅ２タンパク質を検出できるかどうかについて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法及びウェスタンブロット法を用いて検討した。
（１）サンドイッチＥＬＩＳＡ
　モノクローナル抗体１Ｇ２－３２を１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈し、この抗体溶液をイムノプレート（ヌンク社）の各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温にて２時間静置することによって抗体をプレートに固相化した。抗体溶液を除き、添付マニュアルに従って調製したブロッキング・ワン溶液（ナカライテスク社）を各ウェルに２００μｌずつ添加し、室温にて２時間静置することによってブロッキングした。
　次に、抗原Ｅ２タンパク質にヒト免疫グロブリンＦｃドメインが付加された各融タンパク質（ＪＦＨ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質、Ｊ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質、ＴＨＥ２－Ｆｃタンパク質、Ｃｏｎ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質、Ｊ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質及びＨ７７Ｅ２－Ｆｃタンパク質）をＰＢＳで希釈して、上記のモノクローナル抗体を固相化したプレートの各ウェルに５０μｌ加え、室温で１．５時間反応させた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルに、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１μｇ／ｍｌとなるように希釈したビオチン化８Ｄ１０－３モノクローナル抗体を各ウェルに５０μｌ加え、室温にて２時間反応させた。反応後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５，０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ストレプトアビジン（ＧＥヘルスケア社）を５０μｌ加え、室温で１．５時間反応させた。
　反応後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、ペルオキシダーゼ発色キット（住友ベークライト社）を用いて発色させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図８に示す。
　図８は、モノクローナル抗体１Ｇ２－３２及び８Ｄ１０－３を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおける種々の遺伝子型／株の抗原Ｅ２タンパク質の検出感度を示している。横軸は抗原Ｅ２タンパク質の量を示し、縦軸は４９０ｎｍの吸光度、すなわち検出された抗原Ｅ２タンパク質の量を示している。モノクローナル抗体１Ｇ２－３２及び８Ｄ１０－３を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡでは、遺伝子型２ａのＨＣＶの抗原Ｅ２タンパク質のみを検出することが可能であり、遺伝子型１ａと１ｂの抗原Ｅ２タンパク質は検出されないことを示している。これらの結果は、本発明で得られた抗体のセットを用いることにより、ＨＣＶの遺伝子型や株を同定できることを示している。
（２）ウェスタンブロット法
　抗原Ｅ２タンパク質にヒト免疫グロブリンＦｃドメインが付加された各融タンパク質（ＪＦＨ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質、Ｊ６Ｅ２－Ｆｃタンパク質、ＴＨＥ２－Ｆｃタンパク質、Ｃｏｎ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質、Ｊ１Ｅ２－Ｆｃタンパク質及びＨ７７Ｅ２－Ｆｃタンパク質）の０．１～０．３μｇに、５分の１容量の５×ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ　（０．３１２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５％　ＳＤＳ、５０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０５％　ＢＰＢ、５％　２－ＭＥ）を加え、１００℃で５分間処理したものをサンプルとした。各サンプルを４～２０％グラジエントゲル（テフコ社）にアプライし、４０ｍＡ定電流で電気泳動後、セミドライ型ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜に１２０ｍＡ定電流でブロッティングした。
　ブロッティング後のＰＶＤＦ膜をブロックエース（雪印乳業）に室温にて１時間浸すことによってブロッキングし、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで洗浄後、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ（東洋紡）で１μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体８Ｄ１０－３に浸して室温にて１時間反応させた。反応後、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで洗浄し、続いてＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体に浸して室温にて１時間反応させた。０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで洗浄し、ＥＣＬキット（ＧＥヘルスケア社）を使用してバンドを検出した。
　図９は、モノクローナル抗体８Ｄ１０－３を用いたウェスタンブロット法における種々の遺伝子型／株の抗原Ｅ２タンパク質の検出の有無を示している。モノクローナル抗体８Ｄ１０－３は、６種の株全ての抗原Ｅ２タンパク質を検出することができた。
　本発明の抗体は、遺伝子型が１ａ、１ｂ及び２ａであるＨＣＶの遺伝子型を簡易かつ精度よく同定することを可能にし、インターフェロン療法による治療効果が望めない遺伝子型が１ａ又は１ｂ型のＨＣＶに感染したＣ型肝炎患者に対して、副作用を軽減するとともに新たな治療方法を選択する機会を与えることができる。

Claims (12)

  1. 　遺伝子型が２ａであるＣ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質２に特異的に結合し、遺伝子型が１ａであるＣ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない抗体。
  2. 　配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する、請求項１記載の抗体。
  3. 　受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８１であるハイブリドーマ細胞株により生産される、請求項１又は２記載の抗体。
  4. 　さらに、遺伝子型が１ｂであるＣ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない、請求項１記載の抗体。
  5. 　配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する、請求項４記載の抗体。
  6. 　配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する、請求項４記載の抗体。
  7. 　受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８０であるハイブリドーマ細胞株により生産される、請求項４又は５記載の抗体。
  8. 　受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１７９であるハイブリドーマ細胞株により生産される、請求項４又は６記載の抗体。
  9. 　Ｊ６ＣＦ株のエンベロープタンパク質２に特異的に結合し、ＪＦＨ１株のエンベロープタンパク質２には免疫学的に反応しない、請求項４記載の抗体。
  10. 　配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列をエピトープとして認識する、請求項９記載の抗体。
  11. 　受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８３であるハイブリドーマ細胞株により生産される、請求項９又は１０記載の抗体。
  12. 　請求項３記載の抗体に結合し、請求項７及び８記載の抗体のいずれにも結合しないＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型を１ｂであると同定し、
    　請求項３記載の抗体に結合し、請求項７及び８記載の抗体に結合するＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型を２ａであると同定し、
    　受領番号がＦＥＲＭ　ＡＢＰ－１１１８２であるハイブリドーマ細胞株により生産される抗体に結合し、請求項３、７及び８記載の抗体のいずれにも結合しないＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型を１ａであると同定する、
    Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型の同定方法。
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