JP4931591B2 - 自律複製能を有する改変されたヒトc型肝炎ウイルスゲノムrna - Google Patents
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Description
(a) 配列番号11に示す塩基配列からなるRNA、又は
(b) 配列番号11に示す塩基配列において1又は複数個、好ましくは100個、より好ましくは50個、さらに好ましくは10個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるRNAを含み、自律複製能及びC型肝炎ウイルス粒子産生能を有する、改変されたC型肝炎ウイルスゲノムRNAを挙げることができる。
本発明は、カラムクロマトグラフィ及び/又は密度勾配遠心を用いてHCV粒子を精製することにより工業的に医薬に用いることが可能な精製度をもつHCV粒子を得ることができる。その際に用いるカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィから選ばれるひとつ又は複数のクロマトグラフィであり、密度勾配遠心を、塩化セシウム、ショ糖及び糖重合体のより選ばれるひとつ又は複数の溶質を含んだ溶媒を用いて行うことによりHCVを精製することができる。
1.改変されたキメラC型肝炎ウイルスゲノムRNA
C型肝炎ウイルス(HCV)のゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる(+)鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5'非翻訳領域(5'NTR又は5'UTRとも表記する)、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び3'非翻訳領域(3'NTR又は3'UTRとも表記する)からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。
上記のようにして作製されるHCVゲノムRNA複製細胞は、HCVウイルス粒子をin vitroで産生することができる。すなわち、本発明のHCVゲノムRNA複製細胞を適当な培地で培養し、その培養物(好ましくは培養液)中から産生されたウイルス粒子を採取することにより、HCV粒子を簡単に取得することができる。
本発明の方法で産生されるHCVウイルス粒子は、細胞(好ましくはHCV感受性細胞)への感染能を有する。本発明は、HCVゲノムRNA複製細胞を培養し、得られた培養物(好ましくは、培養液)中のウイルス粒子を他の細胞(好ましくはHCV感受性細胞)に感染させることを含む、C型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法も提供する。ここで、HCV感受性細胞とは、HCVに対し感染性を有する細胞であり、好ましくは肝臓細胞又はリンパ球系細胞であるが、これらに限定されるものでは無い。具体的には、肝臓細胞としては初代肝臓細胞や、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、203細胞などが挙げられ、リンパ球系細胞としてはMolt4細胞や、HPB-Ma細胞、Daudi細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。
HCV粒子を精製するにあたり、そのウイルスを含む溶液はHCV感染患者由来血液ならびに、HCV感染培養細胞ならびに組換え遺伝子技術によりHCV粒子を産生する細胞の培養液及び細胞破砕液のいずれか一つ又は複数を由来としてよい。
本発明のHCVゲノムRNA複製細胞では、HCVゲノムRNAが高効率で複製される。従って、本発明のHCVゲノムRNA複製細胞を用いて、HCVゲノムRNAを高効率で製造することができる。
本発明では、HCVゲノムRNA複製細胞を培養し、培養物(培養細胞及び/又は培養液)からRNAを抽出し、それを電気泳動法により、分離されたHCVゲノムRNAを単離精製することによって、HCVゲノムRNAを製造することができる。このようにして製造されるRNAは、HCVのゲノム配列を含む。HCVのゲノム配列を含むRNAの製造方法が提供されることにより、HCVゲノムに関してより詳細な分析が可能となる。
(1) HCVの増殖及び感染を抑制する物質の探索
HCVの増殖及び感染を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にHCVの増殖及び感染に影響を及ぼす有機化合物、あるいはHCVゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりHCVの増殖若しくはHCVタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
(2) 細胞培養中で抗ウイルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、合理的ドラッグデザイン又はハイスループットスクリーニングを用いて得られた物質(例えば単離精製された酵素)等が挙げられる。
(3) HCVに感染した患者の治療のための、新規攻撃標的の同定
例えばHCVウイルス複製のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質を同定するために、本発明に係るHCVゲノムRNA複製細胞を使用することができる。
(4) HCVウイルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異の同定
(5) C型肝炎ウイルス感染の診断薬又は治療薬の開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質の製造
(6) C型肝炎ウイルス感染のワクチンの開発、製造及び評価のために使用可能な抗原としてのウイルスタンパク質及び弱毒化HCVの製造
1.発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したC型肝炎ウイルスJFH1株(遺伝子型2a)のウイルスゲノム全領域に対応するDNAを、該ウイルス株の全長ゲノムcDNAを含むJFH1クローン(Kato, T., et al, J. Med. Virol. 64 (2001) p334-339)から取得して、pUC19プラスミドに挿入したT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入した。具体的には、JFH1株のウイルスRNAを増幅したRT-PCR断片をpGEM-T EASY vector (Promega)にクローニングしてpGEM1-258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEM1141-2367, pGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, pGEM5883-7003, pGEM6950-8035, pGEM7984-8892, pGEM8680-9283, pGEM9231-9634, and pGEM9594-9678 の各プラスミドDNAを得た(Kato, T. et al., Gastroenterology , 125 (2003) p.1808-1817)。この各プラスミドに含まれるウイルスゲノムのcDNAをPCR法及び制限酵素を用いて連結し、全長ゲノムcDNAをクローニングし、上流にT7R RNAプロモーター配列を挿入し、JFH1クローン(pJFH1)を得た(図1)。なお、pJFH1の全長cDNA配列は、国際DNAデータバンク(DDBJ/EMBL/GenBank)にアクセッション番号:AB047639として登録されている。
RNA合成に用いる鋳型DNAを作製するために、上記のとおり構築したpJFH1、pJFH1/GND pJFH1/ΔE1-E2、pJ6CF、pJCH1及び、pJCH1/NS5B(jfh1)を、それぞれ制限酵素XbaIで切断した。次いで、これらのXbaI切断断片のそれぞれ10から20μgを、Mung Bean Nuclease 20U(トータル反応液量 50μl)とともに30℃で30分間インキュベートした。Mung Bean Nucleaseは、二本鎖DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記XbaI切断断片をそのまま鋳型として用いてRNA合成を行うと、XbaIの認識配列の一部であるCUAGの4塩基が3'末端に余分に付加されたレプリコンRNAが合成されてしまう。そこで本実施例では、XbaI切断断片をMung Bean Nucleaseで処理することにより、XbaI切断断片からCTAGの4塩基を除去した。この後、XbaI切断断片を含むMung Bean Nuclease処理後の溶液について、常法に従ったタンパク質除去処理により、CTAGの4塩基が除去されたXbaI切断断片を精製し、これを鋳型DNAとした。
1.細胞内におけるHCVゲノム複製とウイルス粒子産生
上記の合成全長HCVゲノムRNA(rJFH1、rJFH1/GND)のそれぞれについて、RNA総量が10μgとなるように調製した。次いでその混合RNAをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。エレクトロポレーション処理を行ったHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、12時間、24時間、48時間、72時間培養した後に、細胞を回収して、細胞からRNAを抽出して、ノーザンブロット法により解析した。ノーザンブロット解析は、Molecular Cloning, A laboratory Manual, 2nd edition, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis著、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) の記載に従って行った。細胞から抽出したRNAを変性アガロース電気泳動に供し、泳動終了後に該RNAをポジティブチャージナイロン膜に転写した。pJFH1から作製した32PラベルしたDNA又はRNAプローブを、前記のとおり膜に転写したRNAに対しハイブリダイゼーションさせ、次いでその膜を洗浄し、それをフィルムに感光させることにより、HCVゲノム特異的なRNAバンドを検出した。
rJFH1あるいは、rJFH1/GND RNAをトランスフェクションした細胞から常法により、経時的にタンパク質を抽出して、SDS-PAGE及びウエスタンブロット法により解析した。解析にあたって、NS3、NS5A、Coreあるいは、E2遺伝子を含む発現プラスミドDNAをHuh7細胞にトランジエントにトランスフェクションして得られた細胞抽出液を陽性対照(NS3タンパク質)とした。さらに、トランスフェクションしていないHuh7細胞から抽出したタンパク質を陰性対照とした。それぞれの細胞クローンから抽出したタンパク質試料をPVDF膜(Immobilon-P, Millipore社製)にブロッティングし、抗NS3特異的抗体(Dr. Moradpourより分与されたもの; Wolk B, et al, J. Virology. 2000; 74: 2293-2304)、抗NS5A特異的抗体(JFH1のNS5A領域を発現ベクターに挿入して、ネズミでDNA免疫法を用いて作製した)、抗Core特異的抗体(クローン2H9抗体)、抗E2特異的抗体(JFH1 E2領域のGTTTVGGAVARSTN(配列番号4)とCDLEDRDRSQLSPL(配列番号5)のペプチドを合成して、2つの合成ペプチドでウサギを免役して作製した)、を用いてJFH1 RNAにコードされているNS3、NS5A、Core及び、E2タンパク質を検出した。また、内在対照として、抗actin抗体を用いて、actinタンパク質を検出した。
以上の1及び2の結果から、rJFH1をトランスフェクションして樹立した細胞では、rJFH1が複製されていることが確認された。
rJFH1、rJFH1/GND、rJFH1/ΔE1-E2、rJ6CF及びrJCH1をエレクトロポレーションによって細胞導入をおこなったHuh7細胞を培養ディッシュに播種し、2時間、12時間、24時間、48時間、72時間培養した後の培養液中のHCV Coreタンパク質を測定した。測定はオーソHCV抗原IRMAテストを用いて行った(Aoyagi et al., J. Clin. Microbiol., 37(1999) p.1802-1808)。
上記の実施例で培養液中に放出されるCoreタンパク質がウイルス粒子として分泌されているかどうかを解析するため、rJFH1をトランスフェクションして6日後の培養液をしょ糖密度勾配により分画した。60%(重量/重量)しょ糖溶液(50mM Tris pH7.5/0.1M NaCl/1mM EDTAに溶解)2ml、50 %しょ糖溶液1ml、40 %しょ糖溶液1ml、30 %しょ糖溶液1ml、20 %しょ糖溶液1ml、10 %しょ糖溶液1mlを遠心チューブに重層し、さらにサンプルの培養上清を4ml重層した。これをベックマンローターS W41Tiで400,000RPM、4℃、16時間遠心し、遠心終了後遠心チューブの底から0.5mlずつ分画回収した。各分画の密度、HCVコア蛋白濃度、HCVRNAコピー数を定量した。レプリコンRNAの定量的RT-PCRによる検出は、Takeuchiらの方法(Takeuchi T. et al., Gastroenterology 116: 636-642 (1999))に従いHCV RNAの5'非翻訳領域のRNAを検出することにより行った。具体的には、細胞から抽出したRNAに含まれるレプリコンRNAを、以下の合成プライマーとEZ rTth RNA PCR kit(Applied Biosystems)を用いてPCR増幅し、ABI Prism 7700 sequence detector system(Applied Biosystems)により検出した。
R6-290-R19:5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’(配列番号7)
TaqMan Probe, R6-148-S21FT:5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’(配列番号8)
rJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたHCV粒子に感染性があるかどうかについて検討した。rJFH1あるいは、rJFH1/ΔE1-E2をHuh7細胞にトランスフェクションして3日後に培養上清を回収した。回収した培養液を遠心して遠心上清を回収して、さらに0.45μmのフィルターで濾過した。この培養液存在下で、RNAをトランスフェクションしていないHuh7を培養して48時間後に細胞を抗Core抗体あるいは、抗NS5A抗体で蛍光免疫染色した。図6Aに示すように、rJFH1をHuh7細胞へトランスフェクションして得た培養液存在下で培養した細胞においては、細胞内にCoreタンパク質及び、NS5Aタンパク質の発現を認めた。一方、JFH1/ΔE1-E2をHuh7細胞へトランスフェクションして得た培養液存在下で培養した細胞においては、細胞内にCoreタンパク質及び、NS5Aタンパク質の発現を認めなかった(データは示さない)。
rJCH1/NS5B(jfh1)をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中にHCV粒子が分泌されるかどうか、また分泌されたHCV粒子に感染性があるかどうかについて検討した。rJCH1/NS5B(jfh1)をHuh7細胞にトランスフェクションして6日後の培養液を5.に記述した方法で濃縮後、この培養液存在下で、RNAをトランスフェクションしていないHuh7を培養して、経時的に細胞内のHCV RNA量を定量したところ、培養開始後12時間後から経時的に細胞内のHCV RNA量が増加していた(図7A)。さらに、RNAをトランスフェクションしていないHuh7を15mmカバースリップ上で培養して、濃縮した培養液存在下で培養48時間後に細胞を抗Core抗体で免疫染色して、Core抗体染色陽性、すなわち、感染細胞を数えたところ、図7Bに示すように感染細胞が確認された。これらの結果から、rJCH1/NS5B(jfh1)をHuh7細胞へトランスフェクションすることにより、培養液中に分泌されたHCV粒子は感染能力を獲得し、さらに感染細胞中でHCV RNAを増幅して、新たなHCV粒子を生産する能力を有することが示された。
1.Con1/C-NS2/JFH-1を用いたHCVウイルス粒子の作製
HCV遺伝子型1bのCon-1株とJFH-1のNS5B部分を含むキメラHCV RNAをHuh7細胞にトランスフェクションすることにより培養液中にHCV粒子が分泌されるか、また分泌されたHCV粒子に感染性があるかどうかについて検討した。
(1) 発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離したC型肝炎ウイルスであるJFH-1株(遺伝子型2a)のゲノム全長cDNAを含むDNA(JFH-1クローン:配列番号9)を、pUC19プラスミド中でT7 RNAプロモーター配列の下流に挿入したプラスミドDNAを作製した。
JFH1株は、HCV2a型由来のHCVであるが、HCV1b型由来のTH株(Wakita et al., J.Biol.Chem., (1994) 269, p.14205-14210, 及びMoradpour et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 246, p.920-924)を用いて、キメラHCVベクターを作製した。上記で作製した、pFGREP-JFH1の、コア、E1、E2、p7の部分をTH株由来のコア、E1、E2、p7に置換したキメラHCV、pFGREP-TH/JFH1を作製した。
全長キメラHCVレプリコンRNA合成に用いる鋳型DNAを作製するために、上記のとおり構築した発現ベクターpFGREP-TH/JFH1を、制限酵素XbaIで切断した。次いで、これらのXbaI切断断片ついて、10〜20μgを50μlの反応液中に含有させ、Mung Bean Nuclease 20 Uを用いて30℃で30分間インキュベートすることにより、さらに処理した。Mung Bean Nucleaseは、二本鎖DNA中の一本鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記XbaI切断断片をそのまま鋳型として用いてRNA合成を行うと、XbaIの認識配列の一部であるCUAGの4塩基が3'末端に余分に付加されたレプリコンRNAが合成されてしまう。そこで本実施例では、XbaI切断断片をMung Bean Nucleaseで処理することにより、XbaI切断断片からCTAGの4塩基を除去した。この後、XbaI切断断片を含むMung Bean Nuclease処理後の溶液について、通常法に従ったタンパク質除去処理により、CTAGの4塩基が除去されたXbaI切断断片を精製して、これを鋳型DNAとした。
(1) 全長キメラHCVゲノムRNAの細胞内への導入
上記の通り合成した全長キメラHCVゲノムRNA(rFGREP-TH/JFH1)を、様々な量で、Huh7細胞から抽出したトータル細胞性RNAと混合して、RNA総量が10μgとなるように調製した。次いでその混合RNAをエレクトロポレーション法によりHuh7細胞に導入した。16時間から24時間培養した後にG418を様々な濃度で添加した。週に2回培養液を交換しながら培養を継続した。21日間培養した後、クリスタルバイオレットで生存細胞を染色した。染色されるコロニー数を計測し、トランスフェクションしたRNA重量あたりに得られたコロニー数を計算した。また、一部の培養ディッシュでは生存細胞のコロニーをクローン化して培養を継続した。クローン化された細胞からRNA、ゲノムDNA、タンパク質をそれぞれ抽出した後、全長キメラHCVレプリコンRNAの検出、ネオマイシン耐性遺伝子のゲノムDNAへの組み込みの有無、HCVタンパク質の発現を検討した。これらの結果の詳細は下記に示す。
上記のトランスフェクションの結果、G418濃度が1.0 mg/mlの場合でも、細胞のコロニー形成が認められた。このことは、rFGREP-TH/JFH1レプリコンRNAをトランスフェクションしたHuh7細胞のコロニー形成能は、rFGREP-TH/JFH1レプリコンRNAが自律複製することによって、ネオマイシン耐性遺伝子が持続的に発現されG418耐性が維持される結果、細胞増殖が可能になったものと考えられた。
培養上清中のキメラHCVウイルス粒子の感染実験
rFGREP-TH/JFH1をHuh7細胞へトランスフェクションし、樹立した全長キメラHCVレプリコンRNA複製細胞クローンの培養上清を回収して、その培養上清をさらに、感染をさせていないHuh7細胞に添加して、培養上清中のウイルス粒子をHuh7細胞に感染させた。感染翌日に感染させたHuh7細胞の培養液にG418を0.3mg/ml添加し、さらに21日間培養した。培養終了後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色したところ、rFGREP-TH/JFH1をトランスフェクションして得られた全長キメラHCVレプリコンRNA複製細胞クローンの培養上清を用いて感染させた細胞についてコロニー形成が観察された。このことは、rFGREP-TH/JFH1をトランスフェクションして得られた全長キメラHCVレプリコンRNA複製細胞クローンから感染性のHCVが産生されていることを示しており、更に、そのHCVは新たな細胞への感染性を保持していることを示している。
(1)ゲル濾過
図11にゲル濾過クロマトグラフィによるHCV粒子の各フラクションでの分布を示す。用いたゲル担体はセファクリル(登録商標)S300、S400及びS500である。カラムクロマトグラフィに用いたHCV粒子を含む溶液をそれぞれのゲル担体を含むカラムクロマトグラフィを利用して精製した。精製する際に緩衝液は、10 mM トリス塩酸塩、1 mM エチレンジアミン四酢酸及び 100 mM 塩化ナトリウム(pH 8.0)を用いた。その結果、セファクリル(登録商標)S−300ではHCV粒子はVoid画分と呼ばれる素通り画分に得られた。従って、セファクリル(登録商標)S−300を用いることにより分子量が小さなタンパク質と分離し、溶液の塩濃度の変更ができる。その際、HCVコアタンパク質/全タンパク質量の比率はカラム精製前のHCV粒子と比較して3.78となりHCV粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。一方、セファクリル(登録商標)S−400及びS−500ではHCV粒子は分子量に従って溶出される画分にあることから他の分子量のタンパク質と分離することができる。
図12にイオン交換クロマトグラフィによるHCV粒子の各フラクションでの分布を示した。用いたゲル担体は、SP Sepharose HP(登録商標)及びQ Sepharose HP(登録商標)である。
SP Sepharose HP(登録商標)を用いたカラムでは、50 mM クエン酸緩衝液(pH 6.2)でカラムを平衡化した。分画分子量100,000から500,000の限外濾過膜を用いて濃縮し50 mM クエン酸緩衝液(pH 6.2)で希釈したHCV粒子を含む溶液をカラムに添加後、50 mM クエン酸緩衝液(pH 6.2)をカラム容量の10倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ0.1M NaCl、0.3M NaCl又は、1 M NaClを加えた50 mM クエン酸緩衝液(pH 6.2)をカラム容量の3倍程度順番に流した。その後、1 M NaClを加えた50mM クエン酸緩衝液(pH 6.2)をカラム容量の5倍程度流した(1M NaClW分画)。その結果、HCV粒子は0.1M NaClを加えた50 mM クエン酸緩衝液(pH 6.2)画分に溶出した。
図13にレクチンアフィニティークロマトグラフィーによるHCV粒子の各フラクションでの分布を示した。レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、RCA−120、ConA、LCA及びWGAがそれぞれ結合した担体を利用した。
ConA、LCA及びWGAアフィニティークロマトグラフィでは、リン酸緩衝生理食塩水でカラムを平衡化した。分画分子量100,000から500,000の限外濾過膜を用いて濃縮しリン酸緩衝生理食塩水で希釈したHCV粒子を含む溶液をカラムに添加後、リン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の10倍程度カラムに流した。次いで、0.35 M ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の3倍程度流した。その後、0.5 Mラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水をカラム容量の5倍程度流した。その結果、LCA及びConAアフィニティークロマトグラフィでは担体への特異的結合はなかった。WGAアフィニティークロマトグラフィでは、HCV粒子は0.35 M ラクトースを加えたリン酸緩衝生理食塩水画分へ溶出した。
上記実施例を参考にカラムクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせてHCV粒子の精製を行った。
まずQ Sepharose HP(登録商標)を用いてHCV粒子の精製を行った。50 mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)でカラムを平衡化した。分画分子量100,000から500,000の限外濾過膜を用いて濃縮し50 mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)で希釈したHCV粒子を含む溶液をカラムに添加後、50 mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)をカラム容量の10倍程度カラムに流した。次いで、それぞれ0.1M NaCl、0.3M NaCl又は、1 M NaClを加えた50 mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)をカラム容量の3倍程度順番に流した。その後、1 M NaClを加えた50mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)をカラム容量の5倍程度流した(1M NaClW分画)。図16Aに示すように0.3 M NaClを加えた50 mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)、1 M NaClを加えた50 mM Tris−HCl緩衝液(pH 8.0)分画及び1M NaClW分画にHCV粒子は溶出した。HCV粒子を含んだ分画を収集したところHCVコアタンパク質/全タンパク質量の比率はカラム精製前のHCV粒子と比較して2.29となりHCV粒子の占める全タンパク質にたいする割合が上昇した。
配列番号2:JFH1のNS5Bタンパク質コード配列(cDNA配列)
配列番号3:JFH1のNS5Bタンパク質
配列番号4:JFH1 E2領域を基に設計した合成ペプチド
配列番号5:JFH1 E2領域を基に設計した合成ペプチド
配列番号6:プライマー(R6-130-S17)
配列番号7:プライマー(R6-290-R19)
配列番号8:TaqManプローブ(R6-148-S21FT)
配列番号9:HCV JFH1株(JFH-1クローン)の全長ゲノムRNA
配列番号10:HCV TH株の5’非翻訳領域からNS3領域の一部を含む部分ゲノムRNA(1-3748)
配列番号11:HCV JFH1株(JFH-1クローン)のゲノムRNAとHCV TH株のゲノムRNAから構成されたキメラHCVゲノムRNA
Claims (28)
- 2種以上のC型肝炎ウイルス株のゲノムRNAからなり、
遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス株の5'非翻訳領域と、
遺伝子型1bのC型肝炎ウイルス株の、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列及びp7タンパク質コード配列と、
遺伝子型1b又は2aのC型肝炎ウイルス株のNS2タンパク質コード配列と、
配列番号1で示されるJFH1株のNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質をコードするRNA部分配列と、
遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス株の3'非翻訳領域と、
を含み、自律複製能を有する、改変されたC型肝炎ウイルスゲノムRNA。 - 2種以上のC型肝炎ウイルス株のゲノムRNAからなり、5'非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、配列番号2で示されるJFH1株のNS5Bタンパク質コード配列及び3'非翻訳領域を含み、自律複製能を有する、改変されたC型肝炎ウイルスゲノムRNAであり、
前記2種以上のC型肝炎ウイルス株は、遺伝子型2a又は1bのC型肝炎ウイルス株である、改変されたC型肝炎ウイルスゲノムRNA。 - 前記遺伝子型2aのC型肝炎ウイルス株はJFH1株である、請求項1又は2記載のC型肝炎ウイルスゲノムRNA。
- 前記遺伝子型1bのウイルス株は、HCV-con1株、HCV-TH株、HCV-J株、HCV-JT及びHCV-BK株から選ばれるC型肝炎ウイルス株である、請求項1〜3のいずれか1項記載のC型肝炎ウイルスゲノムRNA。
- JFH1株の5'非翻訳領域と、HCV-con1株のcoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列及びNS2タンパク質コード配列と、JFH1株のNS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質をコードする配列と、JFH1株の3'非翻訳領域と、を5'から3'方向へこの順番で配置してなる塩基配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のC型肝炎ウイルスゲノムRNA。
- JFH1株の5'非翻訳領域と、HCV-TH株のcoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列及びp7タンパク質コード配列と、JFH1株のNS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5Bタンパク質をコードする配列と、JFH1株の3'非翻訳領域と、を5'から3'方向へこの順番で配置してなる塩基配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載のC型肝炎ウイルスゲノムRNA。
- 配列番号11に示される塩基配列を含み、自律複製能を有する、改変されたC型肝炎ウイルスゲノムRNA。
- JCH株のゲノムの1〜3866番の領域とJFH1株のゲノムの3867〜9678番の領域とが連結された塩基配列を含み、自律複製能を有する、改変されたC型肝炎ウイルスゲノムRNA。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のC型肝炎ウイルスゲノムRNAを含む、肝細胞指向性ウイルスベクター。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のC型肝炎ウイルスゲノムRNAを導入され、該C型肝炎ウイルスゲノムRNAを複製しかつウイルス粒子を産生しうる細胞。
- 請求項10記載の細胞を培養した培養物中から得られるC型肝炎ウイルス粒子。
- 請求項11記載のC型肝炎ウイルス粒子を含有する液体又は細胞破砕物から、カラムクロマトグラフィ及び/又は密度勾配遠心を組み合わせることによりC型肝炎ウイルス粒子を精製する方法。
- 前記記載のカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィである請求項12の方法。
- 前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、陰イオンクロマトグラフィ及び陽イオンクロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のゲル濾過クロマトグラフィがSepahcryl−S300(登録商標)、Sepahcryl−S400(登録商標)又はSephacryl−S500(登録商標)から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のアフィニティークロマトグラフィが硫酸化セルロファイン、ヘパリン及びレクチンの中から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィである請求項13の方法。
- 前記記載のクロマトグラフィが硫酸セルロファインクロマトグラフィである請求項13の方法。
- 前記記載の密度勾配遠心が、塩化セシウム、ショ糖及び糖の重合体より選ばれる一つ以上の溶質を用いて行われる請求項12の方法。
- 前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマトグラフィ、硫酸セルロファインクロマトグラフィ、及びショ糖密度勾配遠心をそれぞれ一回以上任意の順番で組み合わせた請求項12の方法。
- 請求項11記載のC型肝炎ウイルス粒子を含有する液体あるいは細胞破砕液から、カラムクロマトグラフィ及び密度勾配遠心を組み合わせるC型肝炎ウイルス粒子の精製方法により得られたC型肝炎ウイルス粒子。
- 前記記載のカラムクロマトグラフィが、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ及びアフィニティークロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィで精製された請求項18のC型肝炎ウイルス粒子。
- 前記記載のイオン交換クロマトグラフィが、陰イオンクロマトグラフィ及び陽イオンクロマトグラフィの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のゲル濾過クロマトグラフィがSepahcryl−S300(登録商標)、Sepahcryl−S400(登録商標)又はSephacryl−S500(登録商標)から選ばれる樹脂を利用した一つ以上のクロマトグラフィであり、前記記載のアフィニティークロマトグラフィが硫酸化セルロファイン、ヘパリン及びレクチンの中から選ばれる一つ以上のクロマトグラフィにより精製された請求項19のC型肝炎ウイルス粒子。
- 前記記載のクロマトグラフィが硫酸セルロファインクロマトグラフィで精製された請求項18のC型肝炎ウイルス粒子。
- 前記記載の密度勾配遠心が、塩化セシウム、ショ糖及び糖の重合体より選ばれる一つ以上の溶質を用いて精製された請求項18のC型肝炎ウイルス粒子。
- 前記記載の精製方法で陰イオン交換クロマトグラフィ、硫酸セルロファインクロマトグラフィ及びショ糖密度勾配遠心を組み合わせて精製された請求項18のC型肝炎ウイルス粒子。
- 請求項11及び18〜23のいずれか1項記載のC型肝炎ウイルス粒子が感染したC型肝炎ウイルス感染細胞。
- 請求項10記載の細胞を培養し、培養物中からウイルス粒子を回収することを特徴とする、C型肝炎ウイルス粒子の製造方法。
- 請求項10記載の細胞を培養し、培養物中のウイルス粒子を他の細胞に感染させることを特徴とする、C型肝炎ウイルス感染細胞の製造方法。
- 被験物質の存在下で請求項10又は請求項24記載の細胞を培養し、培養物中のC型肝炎ウイルスRNA又はウイルス粒子を検出することにより、該被験物質の抗C型肝炎ウイルス効果を評価することを特徴とする、抗C型肝炎ウイルス物質のスクリーニング方法。
- 外来遺伝子をコードするRNAを請求項1〜8のいずれか1項記載のC型肝炎ウイルスゲノムRNA中に挿入し、これを目的とする細胞中に導入して複製又は発現させることを特徴とする、細胞内で外来遺伝子を複製及び/又は発現させる方法。
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