CN102888413B - Hcv基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供丙型肝炎病毒基因、来自该基因的复制子RNA、导入了复制子RNA的复制子复制细胞、以及使用了该复制子复制细胞的药物的筛选方法。通过将含有下述(A)、(B)、(C)、(D)或(E)的多核苷酸的复制子RNA、或含有编码丙型肝炎病毒的多蛋白氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸以及编码NS4B蛋白的多核苷酸的基因型1b的复制子RNA导入细胞中，可以制作复制子复制细胞，利用该复制子复制细胞可以进行药物的筛选。所述(A)～(E)的多核苷酸为：(A)包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多核苷酸；(B)包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多核苷酸；(C)编码包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(D)编码包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(E)包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸。

Description

HCV基因
本申请是原案申请日为2008年4月28日、原案申请号为200880013943.0(国际申请号为PCT/JP2008/058215)、发明名称为“HCV基因”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及丙型肝炎病毒(以下有时称作“HCV”)基因、来自该基因的复制子RNA、导入了复制子RNA的复制子复制细胞、以及使用了该复制子复制细胞的药物的筛选方法。
背景技术
HCV是丙型慢性肝炎的致病因子，根据WHO的统计，推测全球有1.7亿感染者。HCV是分类为黄病毒科、黄病毒属的病毒，认为其经由血液或血液成分而感染，在肝脏中增殖。虽然HCV感染者在感染初期仅出现较轻微的症状，但往往会转为慢性，经过一定期间的无症候性期后，发展为慢性肝炎。而且，随着长期感染，病情向肝硬化发展，往往会发展为肝癌。认为肝癌中有95％与肝炎病毒有关，而其中的80％是由HCV感染引起的。
在丙型慢性肝炎的治疗中广泛使用干扰素。近年来，通过改良干扰素的剂型、以及改善干扰素与利巴韦林联用疗法等给药方法，HCV从体内被驱除、治愈的比例也逐渐增加。但通过给予干扰素而得到的治愈率才50％左右，认为存在多种对干扰素治疗显示出抵抗性的HCV。因此，人们希望开发对干扰素抵抗性病毒具有治疗效果的药物。
在上述药物的开发中，药物的筛选系统是必需的。虽然有人报道了使HCV在试管内感染来自人或猴的细胞并使其增殖，但上述增殖系统的感染效率、增殖效率均低，无法用作药物的筛选系统。
最近，脇田等人从丙型重症肝炎患者体内分离出基因型2a的HCV基因(专利文献1)。在试管内(体外)由上述分离的JFH1株合成全长RNA，并导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中时，可以得到在细胞内自主复制的复制子RNA。并且，确认感染性微粒被排放到导入有复制子RNA的细胞的培养上清中(非专利文献1)。因此，通过将JFH1株的复制子RNA导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中，并将得到的感染性微粒再次与来自人肝癌的细胞进行培养，可以建立再感染增殖系统。通过使用该再感染增殖系统，开始了抗HCV药物的筛选。
但是，JFH1株为基因型2a的HCV，是干扰素感受性的HCV。因此，不具有对干扰素显示出抵抗性的HCV基因区，也无法特定在规定干扰素抵抗性的区域发挥作用的宿主侧的因子。因此，有可能无法筛选对干扰素抵抗性的HCV有效的药物。
最近，Lemon等人报道了将基因型1a的H77株的复制子RNA导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中的感染增殖系统(非专利文献2)。但是，虽然使由导入了该复制子RNA的细胞的培养上清得到的病毒颗粒再次感染来自人肝癌的细胞，但与上述JFH1株的感染性颗粒相比，感染效价低约400倍，由此认为H77株的复制子RNA释放了失去感染性的病毒颗粒。因此认为：可在试管内复制的H77株的RNA复制子失去了产生感染性颗粒的功能，并未保持本来的HCV的增殖功能。
因此，使用了该H77的复制子RNA的感染增殖系统的筛选系统有可能无法筛选对在机体内具有增殖功能的HCV有效的药物。
如上所述，由于HCV不存在高效率的试管内培养系统，所以难以进行对HCV治疗有用的药物的筛选。例如，对于目前广泛用于HCV治疗的干扰素，是以患者为受试体开发和改良了直接疗法，对患者造成很大的负担。上述脇田和Lemon所报道的复制子RNA虽然可以筛选一部分药物，但这些复制子RNA存在上述问题，认为其无法筛选可广泛用于HCV治疗的药物。
专利文献1：日本特开2002-171978号公报
非专利文献1：Nature Medicine，(美国)2005年，第11卷，第791～796页
非专利文献2：Proceeding of the National Academy of Science of theUnited State of America，2006年，第103卷，第2310～2315页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明人等为了得到可广泛用于HCV治疗的药物，对HCV的高效率增殖系统、特别是对具有基因型1b型的基因、呈干扰素抵抗性、可产生感染性颗粒的试管内增殖系统进行了深入研究。首先，从重症化肝炎患者的血清中分离出全长HCV基因，确定了具有9594碱基的核苷酸序列的SEQ ID NO：1的全核苷酸序列。由该HCV基因制作复制子RNA，并将其导入来自人肝癌的细胞中时，确认该复制子RNA在细胞内自主增殖，可以进行RNA的复制。进一步发现：通过向该复制子RNA的NS4B蛋白区导入2个氨基酸序列的突变，RNA的复制效率显著提高，许多病毒颗粒被释放到培养上清中。之后，通过将该HCV颗粒再次与来自人肝癌的细胞进行培养，可以建立再感染增殖系统。进一步发现：使用了该复制子复制细胞和感染性颗粒的再感染增殖系统作为HCV治疗用药物的筛选系统、特别是作为对干扰素抵抗性病毒的药物的筛选系统是有用的。
本发明基于上述知识而完成。
解决课题的方法
因此，本发明涉及丙型肝炎病毒基因，该基因含有选自下述(A)～(F)的多核苷酸：
(A)包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(B)包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(C)包含SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(D)编码包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(E)编码包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及
(F)编码包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。
在本发明的丙型肝炎病毒基因的优选方式中，所述丙型肝炎病毒基因为：包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：61或SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列的多核苷酸。
另外，本发明涉及基因型1b的丙型肝炎病毒基因，该基因含有编码丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸和编码NS4B蛋白的多核苷酸。
本发明还涉及DNA，该DNA包括在包含上述丙型肝炎病毒基因的核苷酸序列中尿苷置换成胸腺嘧啶的核苷酸序列的单链DNA。
本发明还涉及多肽，该多肽包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列。
并且，本发明还涉及丙型肝炎病毒多蛋白，其中NS4B区的肽为包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的多肽。
本发明还涉及丙型肝炎病毒蛋白，该蛋白为选自包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：62或SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列中第1位～第191位氨基酸序列的核心蛋白、包含第192位～第383位氨基酸序列的E1蛋白、包含第384位～第746位氨基酸序列的E2蛋白、包含第747位～第809位氨基酸序列的P7蛋白、包含第810位～第1026位氨基酸序列的NS2蛋白、包含第1027位～第1657位氨基酸序列的NS3蛋白、包含第1658位～第1711位氨基酸序列的NS4A蛋白、包含第1712位～第1972位氨基酸序列的NS4B蛋白、包含第1973位～第2419位氨基酸序列的NS5A蛋白、包含第2420位～第3010位氨基酸序列的NS5B蛋白中的至少一种。
本发明还涉及复制子RNA，该复制子RNA包括选自下述(A)～(G)的多核苷酸：
(A)包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(B)包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(C)包含SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(D)编码包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(E)编码包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(F)编码包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；以及
(G)包含与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸。
另外，本发明涉及基因型1b的复制子RNA，该复制子RNA包括：编码丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸；以及编码NS4B蛋白的多核苷酸。
在本发明的复制子RNA的优选方式中，所述复制子RNA包括：(A)丙型肝炎病毒的5’非翻译区的第1位～第341位的多核苷酸、编码丙型肝炎病毒的多蛋白中第1027位～第3010位多肽的多核苷酸、以及3’非翻译区的多核苷酸；或
(B)5’非翻译区的第1位～第341位的多核苷酸、编码包含3010个氨基酸的丙型肝炎病毒的多蛋白的多核苷酸、以及3’非翻译区的多核苷酸。
在本发明的复制子RNA的优选方式中，所述复制子RNA为干扰素抵抗性。
在本发明的复制子RNA的另一优选方式中，所述复制子RNA包括：
(A)包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；
(B)包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；
(C)包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；
(D)包含SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；
(E)包含SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列的多核苷酸和包含SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的多核苷酸；
(F)包含相对于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列为90％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸和包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸；
(G)包含相对于SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列为90％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、和包含与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸；
(H)包含相对于SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列为90％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、和包含与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸；
(I)包含相对于SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列为90％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、和包含与SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸；或
(J)包含相对于SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列为90％以上的同源性的核苷酸序列的多核苷酸、和包含与SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸。
在本发明的复制子的另一优选方式中，上述复制子RNA为：包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列的多核苷酸；或包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸。
并且，在本发明的复制子的另一优选方式中，所述复制子包括至少一个选择标记基因或报道基因和至少一个IRES序列。
本发明还涉及编码上述复制子RNA的DNA。
本发明还涉及包含上述DNA的载体。
本发明还涉及复制子复制细胞，该复制子复制细胞是通过将选自上述复制子RNA、上述DNA和上述载体的至少一种导入到细胞中而制作的。
在本发明的复制子复制细胞的优选方式中，上述细胞为来自肝细胞的细胞，优选上述来自肝细胞的细胞为Huh-7细胞。
本发明还涉及复制子RNA，该复制子RNA由上述复制子复制细胞产生。
并且，本发明涉及丙型肝炎病毒蛋白，该蛋白为选自由上述复制子复制细胞产生的CORE、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B中的至少一种。
本发明还涉及丙型肝炎病毒颗粒，该颗粒由复制子复制细胞产生。
本发明还涉及筛选方法，其是筛选控制丙型肝炎病毒感染的物质的方法，该方法包括：使上述复制子复制细胞与上述物质接触的步骤；以及分析复制子RNA的增加度的步骤。
在本发明的筛选方法的优选方式中，上述分析复制子RNA增加度是指检测复制子RNA或丙型肝炎病毒蛋白。
在本说明书中，“复制子RNA”是指根据病毒RNA制作的、在细胞内具有自主复制能力的RNA，只要能够引起RNA的复制，可以包括能够产生病毒颗粒的物质，也可以包括不能产生病毒颗粒的物质。
在本说明书中，“干扰素抵抗性”是指在试管内和机体内通过给予干扰素，HCV的复制或增殖没有被显著抑制。
发明效果
利用本发明的HCV基因，可以在试管内分析能够在机体内复制的HCV基因。通过利用该HCV基因，可以制作本发明的RNA复制子。并且，利用导入了上述RNA复制子的复制子复制细胞，可以进行抗HCV药物的筛选。由本发明的HCV基因制作的复制子RNA是基因型1b的干扰素抵抗性的RNA复制子。另外，可以由导入了该复制子RNA的复制子复制细胞产生感染性病毒颗粒。因此，可以提供与基因型1b且为干扰素抵抗性的HCV在机体内的增殖机理相同的试管内模型。而且，通过利用该HCV的增殖模型，可以进行可抑制肝炎重症化的药物的筛选和药品的开发。
附图简述
图1显示通过将本发明的复制子RNA导入到细胞中而产生核心蛋白。通过电穿孔将pTPF1和pTPF1/4B导入Huh-7细胞中，于4、24、48和72小时后测定培养上清中核心蛋白的浓度。
图2显示由本发明的复制子复制细胞产生的感染颗粒对细胞的再感染。感染后，于4、24、48、72和96小时后测定培养上清中核心蛋白的浓度。
图3显示使用本发明的筛选方法，环孢菌素A对核心蛋白的产生的抑制效果。在添加环孢菌素A和作为对照的未添加环孢菌素A的情况下导入复制子RNA，于4、24、48和72小时后测定培养上清中核心蛋白的浓度。
图4显示通过将本发明的复制子RNA导入到细胞中而产生核心蛋白。通过电穿孔将pAHC1和pAHC/4Bm导入Huh-7细胞中，于4、24、48和72小时后测定培养上清中核心蛋白的浓度。
实施发明的最佳方式
以下阐述本发明的最佳方式，但本发明并不限于该方式。
本发明的丙型肝炎病毒基因只要是属于基因型1b的HCV基因即可，对其没有限定，但优选包括本发明的编码NS4B蛋白的多核苷酸。另外，优选显示干扰素抵抗性的HCV基因。
HCV基因根据其核苷酸序列，至少可以分为6种基因型。其中属于基因型1的HCV进一步分为基因型1a和基因型1b。具体而言，基因型1b的基因型包括具有多核苷酸的HCV，所述多核苷酸包含相对于SEQ ID NO：5或7的核苷酸序列显示出90％以上的同源性的核苷酸序列。
作为本发明的NS4B蛋白，可以列举出：包含SEQ ID NO：6、SEQID NO：8或SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的多肽。丙型肝炎病毒基因在5’非翻译区(5’UTR)与3’非翻译区(3’UTR)之间包含编码病毒的结构蛋白-核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和非结构蛋白-P7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的区域。丙型肝炎病毒基因感染后在宿主细胞内发挥mRNA的功能，合成一长约3000个氨基酸的多蛋白。之后，被宿主的信号肽酶、信号肽肽酶和HCV基因组所编码的蛋白酶切断，产生上述3种结构蛋白和7种非结构蛋白。
上述10种HCV蛋白中，认为NS4B蛋白与NS3～NS5B的其他非结构蛋白形成复合体，再与宿主蛋白一起形成RNA复制复合体，进行基因组RNA的复制，在病毒的复制中发挥重要作用。编码于由重症肝炎患者取得的HCV基因的NS4B区的、包含本发明的SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽(以下称作TPF1-NS4B多肽)、包含SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列的多肽(以下称作TPF1-突变NS4B多肽)和包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的多肽(以下有时称作AHC1-突变NS4B多肽)、特别是TPF1-突变NS4B多肽和AHC1-突变NS4B多肽参与HCV基因的复制，显示出显著效果。
因此，本发明的丙型肝炎病毒基因优选包括编码TPF1-NS4B多肽或TPF1-突变NS4B多肽的多核苷酸，更优选包括包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多核苷酸(以下称作TPF1-NS4B多核苷酸)，最优选包括包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多核苷酸(TPF1-突变NS4B多核苷酸)或包含SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列的多核苷酸(AHC1-突变NS4B多核苷酸)。但本发明的丙型肝炎病毒基因只要参与HCV基因的复制并显示出显著效果即可，并不限于这些，可以列举如：含有多核苷酸的丙型肝炎病毒基因，所述多核苷酸包含相对于SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、更进一步优选为99％以上的同源性的核苷酸序列。
对本发明的丙型肝炎病毒基因没有限定，只要包括NS4B区的多核苷酸即可，可以包括含有HCV的部分多核苷酸的部分丙型肝炎病毒基因和包含全长HCV多核苷酸的丙型肝炎病毒基因。作为HCV的部分多核苷酸，可以列举如：包含SEQ ID NO：1、3、10、61或63中的任意核苷酸序列部分的核苷酸，具体可以列举：5’UTR(第1位～第341位的核苷酸序列)、核心(第342位～第914位的核苷酸序列)、E1区(第915位～第1490位的核苷酸序列)、E2区(第1491位～第2579位的核苷酸序列)、P7区(第2580位～第2768位的核苷酸序列)、NS2区(第2769位～第3419位的核苷酸序列)、NS3区(第3420位～第5312位的核苷酸序列)、NS4A区(第5313位～第5474位的核苷酸序列)、NS4B区(第5475位～第6257位的核苷酸序列)、NS5A区(第6258位～第7598位的核苷酸序列)、NS5B区(第7599位～第9371位的核苷酸序列)、3’非翻译区(第9372位～第9594位的核苷酸序列)的部分多核苷酸。另外，作为包含全长HCV多核苷酸的丙型肝炎病毒基因，可以列举出：包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列的丙型肝炎病毒基因。
本发明的丙型肝炎病毒基因包括从重症肝炎患者体内分离的丙型肝炎病毒基因。重症肝炎是指肝炎中症状出现后8周以内呈现II度以上的脑症和凝血酶原时间为40％以下，分为10日以内出现脑症的急性型和10日以后出现脑症的亚急性型。
本发明的丙型肝炎病毒基因的克隆可如下进行。采用酸性异硫氰酸胍·苯酚·氯仿法(例如ISOGEN-LS、日本ジ-ン公司制备)等，由重症丙型肝炎患者的血清制备总RNA。通过使用3’UTR特异性引物和小鼠白血病病毒逆转录酶(Superscript II、Life technologies公司制备)的逆转录反应，由总RNA合成cDNA。
通过使用5’UTR～3’UTR的特异性引物的PCR[PCR Protocols，Academic Press(1990)]来扩增所合成的HCV的cDNA。将所扩增的HCV基因克隆到pGEM-T EASY载体(Promega公司制备)中，确定核苷酸序列。
HCV基因的两末端可以通过使用5’UTR特异性引物的5’-RACE和使用3’UTR特异性引物的3’-RACE[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998(1988)]而得到。将得到的cDNA片段连起来，可以获得全长HCV基因。
对本发明的DNA没有限定，只要是相当于作为RNA的上述丙型肝炎病毒基因的DNA即可，可以列举如：利用逆转录酶由丙型肝炎病毒基因合成的单链cDNA以及包含该单链cDNA和其互补链的双链DNA。
本发明的多肽只要是编码于包含SEQ ID NO：1、3、10、61或63所示的核苷酸序列的多核苷酸中的多肽、或者是包括丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的多肽即可，对其区域及长度没有特别限定，但优选为包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的多肽。
本发明的丙型肝炎病毒蛋白可以包括：包含SEQ ID NO：2、4、11、62或64所示的氨基酸序列中第1位～第191位的氨基酸序列的核心蛋白、包含第192位～第383位的氨基酸序列的E1蛋白、包含第384位～第746位的氨基酸序列的E2蛋白、包含第747位～第809位的氨基酸序列的P7蛋白、包含第810位～第1026位的氨基酸序列的NS2蛋白、包含第1027位～第1657位的氨基酸序列的NS3蛋白、包含第1658位～第1711位的氨基酸序列的NS4A蛋白、包含第1712位～第1972位的氨基酸序列的NS4B蛋白、包含第1973位～第2419位的氨基酸序列的NS5A蛋白、或包含第2420位～第3010位的氨基酸序列的NS5B蛋白。
本发明的复制子RNA只要是含有包含基因型1b的核苷酸序列的多核苷酸、在细胞内具有自主复制能力的RNA即可，没有特别限定。作为参与HCV的复制子RNA复制的核苷酸区，可以特别列举出：5’UTR、3’UTR和编码非结构蛋白-NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的核苷酸区，在本发明的复制子RNA中，上述所有区都很重要，但在提高复制效率方面，编码NS4B蛋白的区是最重要的。特别是作为NS4B蛋白，优选作为包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的多肽的TPF1-NS4B多肽，更优选作为包含SEQID NO：8所示的氨基酸序列的多肽的TPF1-突变NS4B多肽、或者作为包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的多肽的AHC1-突变NS4B多肽。
因此，本发明的复制子RNA优选包括编码TPF1-NS4B多肽的多核苷酸、特别是包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的多核苷酸(TPF1-NS4B多核苷酸)的复制子RNA，更优选包括编码TPF1-突变NS4B多肽的多核苷酸、特别是包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的多核苷酸(TPF1-突变NS4B多核苷酸)、或编码AHC1-突变NS4B多肽的多核苷酸、特别是包含SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列的多核苷酸(AHC1-突变NS4B多核苷酸)的复制子RNA。但本发明的复制子RNA并不限于上述包括NS4B区的多核苷酸的复制子RNA，还包括含有下述多核苷酸的复制子RNA，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列的同源性优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、最优选为99％以上的核苷酸序列。
TPF1-突变NS4B多核苷酸(SEQ ID NO：7)是指TPF1-NS4B多核苷酸(SEQ ID NO：5)的第278位的A置换成U、第763位的G被置换成A的多核苷酸。另外，TPF1-突变NS4B多肽(SEQ ID NO：8)是指TPF1-NS4B多肽(SEQ ID NO：6)的第93位的谷氨酰胺(Q)置换成亮氨酸(L)、第255位的谷氨酸(E)被置换成赖氨酸(K)的多肽。
作为本发明的丙型肝炎病毒基因和复制子RNA的一个实施方式，可以包括编码丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸。
第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的位置是指在包含3010个氨基酸的基因型1b的丙型肝炎病毒基因中的位置。
第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸是NS4B蛋白中所含的氨基酸，迄今为止含有上述氨基酸的NS4B蛋白还未见报道。因此，含有上述氨基酸的HCV多蛋白、含有编码上述氨基酸的多核苷酸的RNA复制子也未见报道。
对基因型1b的丙型肝炎病毒基因的核苷酸序列没有特别限定，例如包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列。
本发明的复制子RNA的结构只要可以在细胞内复制即可，对其没有限定，可以列举出：包括丙型肝炎病毒的全长RNA的复制子RNA、或包括一部分RNA的亚基因组复制子RNA。例如，亚基因组复制子RNA可以包括：5’非翻译区(以下有时称作5’UTR)、3’非翻译区(以下有时称作3’UTR)和编码非结构蛋白-NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白、NS5B蛋白的核苷酸区，优选可以包括：包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列中第1位～第341位的核苷酸序列的多核苷酸、以及包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列中第3420位～第9594位的核苷酸序列的多核苷酸。
在基因型1b的丙型肝炎病毒基因中，5’UTR通常包含341核苷酸，至于复制子RNA中所含的5’UTR，对其核苷酸序列没有限定，但优选包括其全长序列。就3’UTR而言，对其长度根据病毒株而不同，但通常包含41核苷酸的可变区、长度根据株而不同的多U区和98核苷酸的3’X区，至于复制子RNA中所含的3’UTR，其核苷酸序列及长度没有限定，但优选包括该株中的全长3’UTR。
本发明的复制子RNA除了包括全长RNA和亚基因组RNA以外，还可以包括筛选标记基因、报道基因或IRES序列，上述复制子RNA可以列举如：包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：68中记载的多核苷酸的复制子RNA。
作为筛选标记基因，可以列举如：抗生素耐性基因。在本发明中，优选的筛选标记基因的例子有：新霉素耐性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素耐性基因、吡啶硫胺素耐性基因、腺苷酰转移酶基因、Zeocin耐性基因、嘌呤霉素耐性基因等，但优选新霉素耐性基因、胸苷激酶基因，最优选新霉素耐性基因。但本发明中的筛选标记基因并不限于这些。
作为报道基因，可以列举如：催化发光反应或显色反应的酶的结构基因。在本发明中，优选的报道基因的例子有：来自转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自大肠杆菌的β葡糖醛酸酶或β半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色萤光蛋白基因、来自水母的水母素(イクリオン，Aequorin)基因、分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因等。但本发明中的报道基因并不限于这些。
对IRES序列没有限定，可以列举如：EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合部位)、FMDV IRES、HCV IRES等，但更优选EMCV IRES和HCV IRES，最优选EMCV IRES。
本发明的复制子RNA优选为干扰素抵抗性。利用干扰素对HCV患者进行治疗时，干扰素是否有效，这要考虑例如病毒侧的因素和宿主侧的因素。病毒侧的因素可以列举出：对干扰素显示抵抗性的HCV基因区，但本发明的复制子RNA优选包括对干扰素显示抵抗性的HCV基因区的复制子RNA。对干扰素显示抵抗性的HCV基因区没有特别限定，可以列举如：被认为是NS5A区的IFN感受性指标的ISDR区。
本发明的复制子RNA优选包括基因型1b的核苷酸序列的多核苷酸的复制子RNA，可以列举如：含有包含与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列的同源性为90％以上的核苷酸序列的多核苷酸的RNA复制子。
对本发明的DNA没有限定，只要是直链状DNA的形态、且编码上述复制子RNA的DNA即可，例如还可以包括：用于产生复制子RNA的RNA启动子。
本发明的复制子RNA可以采用任意的基因工程学方法来制作。虽然没有限定，但复制子RNA例如可以利用以下方法进行制作。
利用常规方法将编码上述复制子RNA的DNA插入克隆载体中，制作DNA克隆。将该DNA插入RNA启动子的下游，制作可以产生复制子RNA的DNA克隆。优选上述RNA启动子为质粒克隆中所含的RNA启动子。对RNA启动子没有限定，可以列举出：T7RNA启动子、SP6RNA启动子、SP3RNA启动子，特别优选T7RNA启动子。
对插入DNA的载体没有特别限定，可以列举如：质粒载体、直链状双链DNA载体、以及腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体等病毒载体，但优选为质粒载体。
本发明的复制子RNA可以由上述插入有DNA的载体来制作。以DNA克隆为模板，利用RNA聚合酶合成RNA。RNA的合成可以利用常规方法从5’非翻译区开始。当模板DNA为质粒克隆时，还可以通过限制酶从该质粒克隆切出连接在RNA启动子下游的上述DNA区，使用其DNA片段作为模板来合成RNA。需要说明的是，优选所合成的RNA的3’末端与病毒基因组RNA的3’非翻译区一致，优选不添加其他序列也不删除其他序列。例如，在本发明的全长复制子RNA的一个优选方式中，将其插入到在5’UTR的上游具有T7RNA启动子、在3’UTR末端具有限制酶XbaI部位的载体中，经XbaI消化后，利用T7RNA聚合酶可以合成HCV基因组RNA。
本发明的复制子复制细胞可以通过将上述RNA复制子导入到任意的细胞中来制作。对导入复制子RNA的细胞没有特别限定，优选来自人肝脏的细胞、来自小鼠肝脏的细胞或来自猴肝脏的细胞，特别可以列举出：来自人肝癌的细胞-Huh7细胞、HepG2细胞或Hep3B细胞、或者IMY-N9细胞、HeLa细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞或293细胞。向细胞内导入复制子RNA可以利用任意的转染法来进行。上述导入法可以列举如：电穿孔法、粒子枪法、脂质转染法，但特别优选电穿孔法。
为了进行细胞内导入而使用含有选择标记基因或报道基因的复制子RNA时，利用选择标记基因或报道基因的表达，可以选择导入有该复制子RNA并持续进行复制的细胞。例如，当复制子RNA中含有新霉素耐性基因作为选择标记基因时，将转染了该复制子RNA的细胞播种在培养皿中，按0.05毫克/毫升～3.0毫克/毫升的浓度添加G418(新霉素)。之后，每周交换2次培养液继续培养，自播种时起2～3周后可以看到集落。
本发明的复制子复制细胞产生复制子RNA、丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒颗粒。因此，使用复制子复制细胞，可以产生复制子RNA、丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒颗粒。
在复制子复制细胞中复制的复制子RNA可以通过任意的RNA提取法从细胞内提取出来。从细胞中提取的RNA通过再次导入到细胞中，可以发挥复制子RNA的功能。本发明的丙型肝炎病毒蛋白可以使用分泌在细胞内或培养上清中的蛋白。所产生的丙型肝炎病毒蛋白可以通过公知的方法进行提取、纯化。另外，由复制子复制细胞产生的丙型肝炎病毒颗粒可以使用分泌在细胞内和培养上清中的病毒颗粒。本发明的丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒颗粒通过在复制子RNA中加入改变，以修饰RNA、病毒蛋白或病毒颗粒、降低病原性，从而还可用作疫苗。
通过使用上述复制子复制细胞，可以筛选控制丙型肝炎病毒感染的物质。“控制丙型肝炎病毒的感染”是指例如控制HCV RNA的复制(例如促进或抑制)、控制由RNA向蛋白质的翻译(例如促进或抑制)。
具体而言，使试验物质与复制子复制细胞接触，并分析复制子RNA的增加度，从而可以进行试验物质的筛选。复制子RNA的增加度是指复制子RNA的复制速度或量的变化。具体而言，通过检测或测定复制子细胞中的复制子RNA的量，并与对照的没有和被检物质接触的复制子复制细胞的复制子RNA的量进行比较，可以筛选被检物质。另外，通过检测或测定细胞中或上清中的丙型肝炎病毒蛋白的量，并与对照的没有和被检物质接触的复制子复制细胞的量进行比较，也可以筛选被检物质。对筛选中可以检测或测定的丙型肝炎病毒蛋白没有特别限定，但优选为核心蛋白，还可以使用市售的试剂盒来测定核心蛋白。另外，通过使筛选方法自动化，还可适应于高通量筛选(High-throughput Screening)方法。
并且，本发明的筛选方法作为评价所筛选的药物的效果的方法也有效。必需按照该筛选方法进行药物评价时，该筛选方法还可用作制造药物的方法。
《作用》
虽然关于包括编码丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸的丙型肝炎病毒基因和复制子RNA并未完全阐明，但可作如下推论。但是，本发明并不限于以下的说明。
本发明人等使用编码其他3010个氨基酸的基因型1b的株代替后述的实施例9中使用的AHC1株，重复实施例9的操作，得到了与实施例9相同的结果。但是，作为具有NS4B蛋白以外的适应突变的亚基因组复制子，得到了下述复制子：碱基数第5308位的T突变为C，且3010个HCV多蛋白的第1656位的氨基酸由V(缬氨酸)突变为A(丙氨酸)的复制子；和除上述突变外，碱基数第6846位的A突变为G，且3010个HCV多蛋白的第2169位的氨基酸由T(酪氨酸)突变为A(丙氨酸)的复制子。
根据由TPF1株、AHC1株和上述基因型1b的株得到的实验结果，可以考虑以下情况。包括编码第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸的基因型1b的复制子RNA与不含该核苷酸的复制子RNA相比，RNA的复制效率提高。即，基因型1b的丙型肝炎病毒的复制子RNA通过具有上述两个适应突变，使RNA的复制效率提高。
通过使用上述的具有NS4B蛋白中的两个上述适应突变的复制子RNA，并转染到细胞中，确实可以得到复制子复制细胞。由该复制子复制细胞得到的复制子RNA除了NS4B蛋白中的两个上述适应突变之外，有时还导入有一个以上的其他适应突变。即，除了NS4B蛋白中的两个上述适应突变之外，有时通过导入一个以上的其他适应突变，复制子RNA的复制效率也会提高。
作为上述NS4B蛋白中的两个上述适应突变以外的适应突变，包括已知的适应突变和未知的适应突变。作为已知的适应突变，有人报道了表1所示的突变。
[表1]
实施例
《实施例1：重症丙型肝炎病毒全长基因的分离和解析》
(A)从血清中提取RNA
使用High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche diagnosticscorporation)，按照生产商推荐的方法，从在重症肝炎患者的急性期采取的250μL血清中纯化RNA。
(B)cDNA的合成和通过PCR进行的cDNA的扩增
向已纯化的RNA中加入XR58R引物，利用SuperSucript II逆转录酶(Invitrogen公司)，按照生产商推荐的方法进行42℃、1小时的逆转录反应，得到cDNA。向所得反应液中加入RNaseH(Invitrogen)，使之在37℃下反应30分钟，分解RNA。使用HC-LongA1引物、1b9405R引物和Takara LA Taq DNA聚合酶(宝酒造)，对上述反应液进行聚合酶链反应(PCR)(以94℃、20秒、68℃、9分钟为一次热循环反应，重复进行30次热循环反应)，扩增cDNA。再使用HC85F和HC9302R引物，对所得的一部分反应液进行PCR，扩增HCV cDNA。
(C)cDNA的克隆
已扩增的DNA片段用0.7％琼脂糖凝胶通过电泳进行分离，使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN公司)，按照生产商推荐的方法回收DNA片段。使回收的DNA片段与pGEM-T easy载体(Promega公司)发生连接反应，利用该质粒转化DH5α株。选择氨苄青霉素耐性转化体，用2YT培养基进行培养。使用Wizard Plus SV Miniprep DNA纯化系统从培养的菌体中纯化质粒。
(D)核苷酸序列的确定
HCV cDNA的核苷酸序列使用根据HCV的基因型1b的核苷酸序列设计的引物来确定。使用CEQ DTCS Quick Start试剂盒(ベツクマン·コ一ルタ一)，按照生产商推荐的方法进行反应，利用CEQ2000XLDNA分析系统(软件4.0.0版、ベツクマン·コ一ルタ一)进行分析。利用Sequencher(4.1.2版、Gene Codes Corporation)分析所得的数据。将得到的HCV克隆命名为pTPF1-0193。
(E)5’非翻译区的cDNA的获得和核苷酸序列的确定
再利用5’RACE法，由上述步骤(A)中得到的RNA获得5’非翻译区的末端cDNA。使用用于cDNA Ends快速扩增的5’RACE系统(System for Rapid Amplification of cDNA Ends)，2.0版(InVitrogen公司)试剂盒，按照附录的说明书进行实施。
用于cDNA合成的反义引物使用Chiba-as。使用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)来合成cDNA，并用S.N.A.P柱进行纯化，之后对cDNA进行TdT-tailing反应，添加dCTP。利用试剂盒中附带的5’RACE精简的锚定引物(Abridged Anchor Primer)和KY78引物，使用TakaraLA Taq DNA聚合酶(宝酒造)进行第一次PCR。以一部分该PCR产物为模板，利用试剂盒中附带的UTP引物和KM2引物，使用Takara LATaq DNA聚合酶(宝酒造)进行第二次PCR，得到PCR产物。将该PCR产物克隆到pGEM-T easy载体中，按照上述步骤(D)来确定核苷酸序列。将所得的包括SEQ ID NO：1中第1位～第709位的HCV cDNA克隆命名为pTPF1-0007。
(F)3’非翻译区的cDNA的获得和核苷酸序列的确定
利用3’RACE法，由上述步骤(A)中得到的RNA获得3’非翻译区的末端cDNA。首先，使用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)，按照附录说明书向患者的RNA中添加Poly(A)。除了使用dT-Adp引物代替XR58R引物、使用3UTR-1F引物和Adp引物作为第一PCR的引物、以及使用XR58F和Adp引物作为第二PCR的引物以外，重复上述步骤(B)～(D)的操作。将得到的HCV cDNA克隆命名为pTPF1-8994。
将得到的HCV株命名为TPF1株。TPF1株是全长为9594碱基的HCV，其核苷酸序列见SEQ ID NO：1。所得TPF1株的多核苷酸在其342位～9374位之间具有编码一长3010个氨基酸的翻译区。TPF1株的多蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：2。
以下显示用于克隆和确定核苷酸序列的引物。
XR58R(SEQ ID NO：12)：5’-tcatgcggct cacggacctt tcacagctag-3’
HClongA1(SEQ ID NO：13)：5’-atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat-3’
1b9405R(SEQ ID NO：14)：5′-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3’
HC85F(SEQ ID NO：15)：5′-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3’
HC9302R(SEQ ID NO：16)：5’-tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t-3’
chiba-as(SEQ ID NO：17)：5′-tgcacggtct acgagacct-3’
KY78(SEQ ID NO：18)：5’-ctcgcaagca ccctatcagc cagt-3’
KM2(SEQ ID NO：19)：5’-aggcattgag cgggtttat-3’
dT-Adp(SEQ ID NO：20)：5’-ctagactcga gtcgacatcg tttttttttt tttttttt-3’
3UTR-1F(SEQ ID NO：21)：5’-atcttagccc tagtcacggc-3’
Adp(SEQ ID NO：22)：5’-ctagactcga gtcgacatcg-3’
XR58F(SEQ ID NO：23)：5’-ctagctgtaa aggtccgtga gccgcatga-3’
M13Primer M3(SEQ ID NO：24)：5’-gtaaaacgac ggccagt-3’
M13Primer RV(SEQ ID NO：25)：5’-caggaaacag ctatgac-3’
104(SEQ ID NO：26)：5’-aggaagactt ccgagcggtc-3’
HC841S(SEQ ID NO：27)：5’-ggaacttgcc cggttgctct ttctctatct tc-3’
E1(SEQ ID NO：28)：5’-attccatggt ggggaactgg gctaa-3’
HC2069S(SEQ ID NO：29)：5’-taacaatacc ttgacctgcc ccacggactg-3’
HC2430S(SEQ ID NO：30)：5’-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtacgg-3’
HC2461AS(SEQ ID NO：31)：5’-gaccctacac cgtacaggta-3’
HC2769S(SEQ ID NO：32)：5’-ttggaccggg agatggctgc atcgtg-3’
HC3632F(SEQ ID NO：33)：5’-cacccaaatg tacaccaatg t-3’
HC3928S(SEQ ID NO：34)：5’-tacccgttga gtctatggaa ac-3’
HC4016AS(SEQ ID NO：35)：5’-cacttggaat gtctgcggta-3’
HC4498S(SEQ ID NO：36)：5’-agggggggag gcatctcatt ttctg-3’
HC4888F(SEQ ID NO：37)：5’-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta-3’
HC5381F(SEQ ID NO：38)：5’-ggtcattgtg ggcaggatca t-3’
HC5692S(SEQ ID NO：39)：5’-ctgcctggaa accccgcgat-3’
HC5858F(SEQ ID NO：40)：5’-tggcagcata ggccttggga aggt-3’
HC6315F(SEQ ID NO：41)：5’-aagacctggc tccagtccaa g-3’
5A-1(SEQ ID NO：42)：5’-ttccatgctc accgacccct c-3’
HC7090S(SEQ ID NO：43)：5’-gtggagtcag agaataaggt-3’
HC7743F(SEQ ID NO：44)：5’-cagaagaagg tcacctttgac-3’
HC8192S(SEQ ID NO：45)：5’-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3’
HC8939F(SEQ ID NO：46)：5’-ctacggggcc tgttactcca ttgaac-3’
《实施例2：亚基因组RNA复制子的制作》
将丙型肝炎病毒TPF1株的全长多核苷酸插入pBluescriptIISK(+)的T7RNA启动子序列的下游(以下称作pTPF1)。
接下来，将pTPF1的编码结构蛋白的区和编码非结构蛋白的区的一部分替换成新霉素耐性基因(新霉素磷酸转移酶、NPT-II)和EMCV-IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合部位)，建立质粒DNApRepTPF1。其建立顺序遵照已经报道的顺序(Lohmann等，Science，(1999)285，第110～113页)。
具体而言，首先将pTPF1用限制酶AgeI和BsrGI切断，在该切断部位连接插入以下片段：将来自pTPF1的5’UTR～核心区的序列和来自pcDNA3.1(+)的新霉素耐性基因通过PCR扩增进行扩增，并用限制酶AgeI和PmeI切断而得到的片段；以及将EMCV-IRES～NS3区的序列通过PCR扩增进行结合，并用限制酶PmeI和BsrGI切断而得到的片段。以将该质粒DNA pRepTPF1用XbaI切断的产物为模板，使用Megascript T7试剂盒(Ambion)来合成RNA。按照生产商推荐的方法纯化RNA。
向Dulbecco’s改进的Eagle培养基(D-MEM，IWAKI)中加入10％胎牛血清(FBS)，并加入青霉素和链霉素，使分别达到50U/mL和50μg/mL的浓度，以所得培养基作为培养液，添加5％二氧化碳，在37℃下培养人肝癌细胞(Huh7、JCRB0403)。将形成融合之前的细胞通过胰蛋白酶、EDTA处理，从培养皿上剥离，并再悬浮于添加了血清的培养基中，从而使胰蛋白酶失活。用PBS清洗2次，之后再悬浮于添加有1.25％DMSO的Cytomix(120mM氯化钾、10mM磷酸钾、5mM氯化镁、25mM HEPES、0.15mM氯化钙、2mM EGTA、pH7.6)中，之后移入间隔为0.4cm的电穿孔小槽中。
将适量的RNA加入到细胞中，之后在冰上充分冷却5分钟。使用电穿孔仪(Bio-Rad)，以960uF、250V施加脉冲。立即再悬浮于8mL培养基中，将一部分播种在皿中。培养一定时间后，以1mg/mL的浓度向培养皿中添加G418(新霉素)。之后，每间隔4天交换培养液一次继续培养。自播种时起培养约20天后，从培养皿中克隆存活细胞的集落，继续培养。通过克隆上述集落，可以建立pRepTPF1复制子RNA自主复制的细胞。至于复制子RNA是否进行复制，这要通过定量RT-PCR法分析细胞性RNA中所含的复制复制子RNA的拷贝数来确定。
负链的定量方法
复制子RNA发生自主复制，这要根据细胞中是否可以检测到HCV RNA的5’UTR区的负链来研究。负链的特异性定量法按照与日本特愿平08-187097号公报中记载的负链RNA的特异性检测法相同的方法来进行。
将以pRepTPF-1为模板、在体外合成的RNA通过电穿孔导入到细胞中，由该细胞可以检测出显著量的负链，确认到在细胞内复制子RNA进行了自主复制。
《实施例3：适应突变的分析》
按照实施例2，将以pRepTPF1为模板、在体外合成的RNA转染到Huh7细胞中，由此建立复制子RNA复制细胞株。使用ISOGEN(日本ジ一ン)，按照生产商推荐的条件，从上述复制细胞株中提取细胞内RNA。
按照与实施例1中由TPF1获得基因的步骤相同的步骤，由上述细胞内RNA扩增几乎遍及复制子RNA的全区的DNA。具体而言，以提取的细胞内RNA为模板，利用SuperSucript II逆转录酶(Invitrogen)和XR58R引物，合成与复制子RNA相符的cDNA。
使用上述cDNA中的一部分，在EMCV-S1引物：5’-tgcacatgctctacatgtgt ttagtcgagg-3’(SEQ ID NO：60)和HC9405R引物的存在下，使用Takara LA Taq DNA聚合酶(宝酒造)，进行聚合酶链反应(PCR)(以94℃、20秒、68℃、6分钟为一次热循环反应，重复进行30次热循环反应)，从而进行HCV cDNA的扩增。确定克隆到pGEM-T easy载体中的克隆的序列时，确认碱基数第5752位的A置换成T、第6237位的G置换成A。其结果，相当于SEQ ID NO：2的氨基酸序号1804的氨基酸由Q(谷氨酰胺)突变为L(亮氨酸)、相当于氨基酸序号1966的氨基酸由E(谷氨酸)突变为K(赖氨酸)。
接下来，就上述氨基酸置换对复制子RNA的复制造成的影响进行研究。首先，使用Quick Mutagenesis试剂盒(Stratagene)，按照生产商推荐的方法，将氨基酸序号1804(Q→L)和氨基酸序号1906(E→K)的适应突变导入实施例2中制作的HCV RNA复制子pRepTPF1中。将导入了该氨基酸置换的复制子RNA命名为pRep4B。
将不具有引起突变的核苷酸序列的pRepTPF1和具有氨基酸突变的pRep4B的质粒DNA用XbaI切断，以所得产物为模板，使用Megascript T7试剂盒(Ambion)来合成RNA。按照生产商推荐的方法纯化RNA。将纯化的各RNA转染到Huh7细胞中，在G418的存在下培养约20天，用结晶紫对存活细胞进行了染色。计测被染色的集落数，计算转染的每1μg复制子RNA量的集落数。
转染1μg RepTPF1 RNA时，选择1个G418耐性集落，而转染1μg Rep4B RNA时，选择104个集落。即，认为引起复制子RNA中的氨基酸突变的碱基突变在Huh7细胞中是提高复制子RNA的复制效率的适应突变。
《实施例4：适应突变对HCV RNA复制的效果》
将实施例2中制作的完全长HCV DNA pTPF1用限制酶SfiI切断，在其切断部位连接插入将pRep4B用限制酶SfiI切断的片段，从而制作插入有适应突变的完全长HCV DNA pTPF1/4B。
将由插入有该适应突变的pTPF1/4B合成的完全长HCV RNA在Huh7细胞中的复制效率与pTPF1的情形进行比较。具体而言，利用与实施例2相同的方法在体外合成完全长HCV RNA，并转染到Huh7细胞中。将进行了转染的细胞立即再悬浮于10mL培养基中，以每孔1mL的量向12孔平板的各孔(直径为22.1mm)中播种，开始培养。于4小时、24小时、48小时和72小时回收培养上清。将回收的培养上清以2krpm的转速离心10分钟，回收上清。使用HCV核心抗原试剂盒(富士レビオ、ルミパルス)测定100μL的上清。
如图1所示，在导入有适应突变的pTPF1/4B的上清中，核心抗原的测定值在每一点均高于不具有适应突变的对照pTPF1的情形。这表明：通过将本发明的适应突变导入到完全长HCV RNA复制子中，HCV RNA复制子在细胞内高效率地进行复制，并将核心蛋白分泌到上清中。这显示出与在肝脏中复制的结构相同的全长型基因组可以在体外进行复制。
特别是在本发明的TPF1-NS4B多肽中，认为通过将编码具有上述适应突变的TPF1-突变NS4B多肽的多核苷酸用于复制子RNA，RNA的复制效率得以提高。
《实施例5：可以再感染的HCV颗粒的建立》
在实施例4中，分泌在培养上清中的核心抗原形成病毒颗粒，研究该病毒颗粒在体外能否再感染。具体而言，将由pTPF1/FL4B合成的完全长HCV RNA转染到Huh7细胞中，培养72小时后回收培养上清。将回收的培养上清以2krpm的转速离心10分钟，之后进行滤器过滤(0.45μm、Millipore)，除去破碎的细胞等。
使进行了滤器过滤的上清与在12孔平板(直径为22.1μm)中培养的Huh7细胞在4℃的低温条件下反应3小时。反应后添加5％二氧化碳，移入37℃的培养器内进行培养。于4小时、24小时、48小时、72小时和96小时用1mM EDTA-PBS剥离细胞，通过离心分离进行回收。将沉淀细胞溶解于50μL RIPA缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP40，0.1％脱氧胆酸盐，0.1％SDScomplete protease inhibitor cocktail(蛋白酶抑制剂)(Roche diagnosticscorporation))中，通过以10krpm的转速离心5分钟来回收上清。使用HCV核心抗原试剂盒(富士レビオ、ルミパルス)测定5μL的上清。
如图2所示，在经pTPF1/4B的培养上清处理的细胞内核心抗原在4小时～24小时曾经一度减少，之后从48小时起开始上升，96小时后仍在增加。这表明：在本发明的完全长HCV RNA在细胞中复制而释放的培养上清中，含有新型的可感染Huh7细胞的病毒颗粒。
《实施例6：由干扰素感受性急性肝炎患者获得丙型肝炎病毒全长基因》
尝试着从用干扰素治疗见效的急性肝炎患者的血清中获得丙型肝炎病毒全长基因。使用RNA提取试剂ISOGEN-LS(日本ジ一ン)，按照附录说明书从患者血清中提取RNA。
利用与实施例1中由TPF1获得全长基因的方法相同的方法，从上述RNA中获得第85位～第9302位的HCV基因。将其克隆到pGEM-T easy载体中，在确定其序列时，发现该基因是属于基因型1b的典型的全长基因。
接着，确定3’非翻译区的核酸序列。向提取的2.5μL RNA中加入5pmole(0.5μL)引物8913F，在70℃下保持3分钟，之后在冰中骤冷。向其中加入2μL 5 x First-Strand Buffer、1μL 0.1M的DTT、0.5μL20mM的dNTP、20单位RNase Inhibitor(宝酒造)、0.5μL SuperSucriptII逆转录酶(Invitrogen)，再加入经焦碳酸二乙酯处理过的灭菌水，使总量达到10μL。使该混合液在42℃下反应60分钟。为了破坏RNA，加入12U RNaseH(宝酒造、60U/μL)，在37℃下保持30分钟，之后在72℃下失活3分钟，用作cDNA。
使用引物8913F和RP2，按照与上述相同的方法对2μL的该cDNA进行PCR。使用一部分该PCR产物，利用8939F和R1的引物进行第二次PCR，得到约600碱基的PCR产物。将该PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，确定其序列。
一方的HCV cDNA的5’末端如下分离，并确定其序列。使用HCLongH1、HC705R和Takara EX Taq DNA聚合酶(宝酒造)，对上述的一部分经RNaseH处理过的cDNA反应液进行PCR(以94℃、20秒、55℃、30秒、72℃、1分钟为一次热循环反应，重复进行35次热循环反应)，从而使已经报道的相当于HCV cDNA的第1位～709位的片段扩增。将该PCR产物克隆到pGEM-T easy载体中，确定其序列。
通过以上操作获得全病毒基因组序列，将其命名为AHC1株。所得AHC1株的全长为9594碱基长，所确定的全病毒基因组的核苷酸序列在其342位～9374位之间具有编码一长3010个氨基酸的翻译区。其核苷酸序列见SEQ ID NO：10、氨基酸序列见SEQ ID NO：11。
以下显示用于克隆和基因解析的引物。
XR58R(SEQ ID NO：12)：5’-tcatgcggct cacggacctt tcacagctag-3’
HClongA1(SEQ ID NO：13)：5’-atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat-3’
1b9405R(SEQ ID NO：14)：5′-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3’
HC85F(SEQ ID NO：15)：5′-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3’
HC9302R(SEQ ID NO：16)：5’-tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t-3’
HC8913F(SEQ ID NO：47)：5’-cttgaaaaag ccctggattg tcagat-3’
HC8939F(SEQ ID NO：46)：5’-ctacggggcc tgttactcca ttgaac-3’
R1(SEQ ID NO：48)：5’-acatgatctg cagagaggcc agtatcagca ctctc-3
HClongH1(SEQ ID NO：49)：5′-gccagccccc tgatgggggc gacactccac c-3’
HC705R(SEQ ID NO：50)：5′-agccgcatgt aagggtatcg atgac-3”
RP2(SEQ ID NO：51)：5’-acatgatctg cagagaggcc-3’
M13PrimerM3(SEQ ID NO：24)：5’-gtaaaacgac ggccagt-3’
M13PrimerRV(SEQ ID NO：25)：5’-caggaaacag ctatgac-3’
HC161S(SEQ ID NO：52)：5’-gagtacaccggaattgccaggacgaccggg-3’
104(SEQ ID NO：26)：5’-aggaagactt ccgagcggtc-3’
HC841S(SEQ ID NO：27)：5’-ggaacttgcc cggttgctct ttctctatct tc-3’
HC1405S(SEQ ID NO：53)：5’-attccatggt ggggaactgg gccaa-3’
E1(SEQ ID NO：28)：5’-attccatggt ggggaactgg gctaa-3’
HC2006AS(SEQ ID NO：54)：5’-catccatgtg cagccgaacc aatt-3’
HC2199AS(SEQ ID NO：55)：5’-aggggtagtg ccaaagcctg tatgggtagt-3’
HC2430S(SEQ ID NO：30)：5’-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtacgg-3’
HC2769S(SEQ ID NO：32)：5’-ttggaccggg agatggctgc atcgtg-3’
HC3111AS(SEQ ID NO：56)：5’-ataatgaccc ccggcgactt tccgcactaa c-3’
HC3591AS(SEQ ID NO：57)：5’-catggtagac agtccagcac-3’
HC4016AS(SEQ ID NO：35)：5’-cacttggaat gtctgcggta-3’
HC4498S(SEQ ID NO：36)：5’-agggggggag gcatctcatt ttctg-3’
HC4888F(SEQ ID NO：37)：5’-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta-3’
1b5290AS(SEQ ID NO：58)：5’-gacatgcatg tcatgatgta tttg-3’
HC5950AS(SEQ ID NO：59)：5’-ctcatgacct taaaggccac-3’
HC5858F(SEQ ID NO：40)：5’-tggcagcata ggccttggga aggt-3’
HC6315F(SEQ ID NO：41)：5’-aagacctggc tccagtccaa g-3’
5A-1(SEQ ID NO：42)：5’-ttccatgctc accgacccct c-3’
HC7090AS(SEQ ID NO：43)：5’-accttattct ctgactccac-3’
HC7743F(SEQ ID NO：44)：5’-cagaagaagg tcacctttgac-3’
HC8192S(SEQ ID NO：45)：5’-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3’
《实施例7：干扰素抑制HCV RNA复制子的复制》
使用完全长HCV RNA复制子，尝试着评价干扰素对HCV复制的抑制作用。在评价干扰素的抑制作用中使用的完全长HCV RNA，使用了实施例4中可在Huh7细胞中高效率复制的pTPF1/4B和实施例6中获得的AHC1与pTPF1/4B的嵌合体。嵌合载体如下制作：将完全长HCV DNA pTPF1用限制酶AgeI和BsrGI切断，在其切断部位连接插入将AHC1用限制酶AgeI和BsrGI切断的片段，从而制作插入有AHC1的结构蛋白区的HCV DNA pTPF1/AHC1_AgeBsr。
利用与实施例2相同的方法，合成pTPF1/4B和pTPF1/AHC1_AgeBsr的完全长HCV RNA，并转染到Huh7细胞中。将进行了转染的细胞立即再悬浮于15mL培养基中，以每孔1mL的量向12孔平板的各孔中(直径22.1mm)播种，开始培养。
培养开始24小时后，与溶解有各种浓度(0.1IU/mL～300IU/mL)的干扰素的培养基交换。再培养24小时后，用1mM EDTA-PBS剥离细胞，通过离心分离进行回收。将沉淀细胞溶解于50μL RIPA缓冲液(20mM Tris-HC1(pH7.5)，150mM NaC1，1mM EDTA，1％NP40，0.1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS complete protease inhibitor cocktail(Rochediagnostics corporation))中，通过以10krpm的转速离心5分钟来回收上清。使用HCV核心抗原试剂盒(富士レビオ、ルミパルス)测定5μL的上清。
通过曲线算出细胞内的抗原量相对于对照(干扰素未添加区)显示出50％的核心抗原量的干扰素浓度，作为IC50。结果见表2。
[表2]
上述试验结果显示：pTPF1/4B为干扰素抵抗性，而一方的pTPF1/AHC1_AgeBsr为干扰素感受性。由此认为：本发明的完全长HCV RNA复制子是干扰素抵抗性的RNA复制子，对开发显示出干扰素抵抗性的丙型肝炎病毒的治疗药有用。
《实施例8：环孢菌素A抑制HCV RNA复制子的复制》
尝试着评价环孢菌素A对HCV RNA复制子复制的抑制作用。评价中使用了pTPF1/4B。利用与实施例2相同的方法，对Huh7细胞进行转染，播种在12孔平板中。培养4小时后，交换为溶解有1μg环孢菌素A的培养基。
交换为含有环孢菌素A的培养基后，对于培养24小时、48小时和72小时后的细胞，利用与实施例7相同的方法，使用HCV核心抗原试剂盒(富士レビオ、ルミパルス)测定细胞内的HCV核心抗原量。
如图3所示，确认到环孢菌素A(CsA)添加区在转染后4小时达到最大值，之后减少。而对照(CsA未添加区)在4小时～24小时间曾经一度减少，之后从48小时起开始上升，72小时后仍在增加。由此确认了CsA具有抗丙型肝炎病毒活性。这表明：本发明的完全长HCVRNA可以用作迄今为止报道的丙型肝炎治疗药的试验系统(筛选方法)。其还可用作用于筛选对HCV的复制和/或HCV蛋白的翻译产生影响的各种物质的试验系统。
《实施例9：TPF1株的NS4B蛋白中的适应突变的效果》
研究由使用了TPF1株的RNA复制子得到的NS4B蛋白中的两个氨基酸的适应突变对其他基因型1b的HCV基因中的复制子RNA的复制的影响。
按照向实施例6中得到的AHC1株的3010个氨基酸的NS4B区蛋白中导入适应突变的方式，向核苷酸中导入突变。具体而言，使用Quick Mutagenesis试剂盒(Stratagene)，按照生产商推荐的方法导入核苷酸的突变，使第1804位的氨基酸由Q(谷氨酰胺)向L(亮氨酸)突变、使第1966位的氨基酸由E(谷氨酸)向K(赖氨酸)突变。所得克隆的RNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：61、氨基酸序列见SEQ ID NO：62。
除了使用所得的导入有突变的适应突变AHC1株的全长多核苷酸以外，重复实施例2的操作，获得具有适应突变的质粒DNApRepAHC1/4B。以将该pRepAHC1/4B用限制酶XbaI切断的产物为模板，获得RepAHC1/4B复制子RNA，并转染到人肝癌细胞(Huh7、JCRB0403)中，建立RepAHC1/4B复制子RNA自主复制的细胞株。
使用未导入适应突变的AHC1株的全长多核苷酸作为对照，重复相同的操作时，可以建立复制子RNA自主复制的细胞株，但效率为RepAHC1/4B复制子的约千分之一。由此可知：通过向基因型1b的HCV基因中导入编码NS4b蛋白的2个适应突变的核苷酸的突变，复制子RNA高效率地进行自主复制。
接下来，除了使用所得细胞株以外，重复实施例3的操作，确定复制的复制子RNA的核苷酸序列。其结果，碱基数第3685位的C突变为T、对应于SEQ ID NO：11的氨基酸序号1115的氨基酸由P(脯氨酸)突变为L(亮氨酸)。将该突变导入上述pRepAHC1/4B中，得到质粒pRepAHC1/4Bm。将由pRepAHC1/4B得到的复制子RNA即RepAHC1/4B和由pRepAHC1/4Bm得到的复制子RNA即RepAHC1/4Bm转染到Huh7中，计算得到的集落数。RepAHC1/4B的核苷酸序列见SEQ ID NO：67，RepAHC1/4Bm的核苷酸序列见SEQ IDNO：68。
转染1μg的RepAHC1/4B RNA时，选择约10E3个G418耐性集落，而转染1μg的RepAHC1/4Bm RNA时，选择约10E6个集落。由此可知：除了NS4B蛋白中的上述两个适应突变外，通过导入一个以上的其他适应突变，复制子RNA的复制效率得以提高。
接下来，作为完全长HCV DNA，除了使用pAHC1代替pTPF1、以及使用pRepAHC1/4Bm代替pRep4B以外，重复实施例4的操作，制作完全长HCV DNA即pAHC1和pAHC1/4Bm，将由pAHC1制作的复制子RNA即AHC1和由pAHC1/4Bm制作的复制子RNA即AHC1/4Bm转染到Huh7细胞中，之后测定培养上清中的核心抗原量。结果见图4。
如图4所示，转染了具有适应突变的AHC1/4Bm的复制子RNA的细胞，其24小时、48小时和72小时后的培养上清中的核心抗原测定值高于对照的转染了AHC1的细胞的培养上清中的核心抗原测定值。需要说明的是，作为复制子RNA的AHC1/4Bm的核苷酸序列见SEQ ID NO：63、所编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：64。
产业实用性
本发明的复制子RNA，通过将其导入细胞内，可以进行自主复制，产生丙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒蛋白和感染性颗粒。以导入了该复制子RNA的复制子复制细胞作为丙型肝炎病毒感染的试管内模型，反映出HCV在机体内的增殖机制，可以将该复制子复制细胞用于HCV治疗药的筛选方法。并且，上述筛选方法除了用于筛选HCV治疗药以外，还可在治疗药的制造步骤中用于品质管理，可以用作药品的制造方法。
以上，虽然按照特定方式说明了本发明，但本领域技术人员自明的变形或改良也包含在本发明的范围内。

Claims (24)

1.丙型肝炎病毒基因，该基因包括选自下述的多核苷酸：
(B) 由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(C) 由SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(E) 编码由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；以及
(F) 编码由SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。
2.权利要求1所述的丙型肝炎病毒基因，该基因为由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 61、或SEQ ID NO: 63所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。
3.基因型1b的丙型肝炎病毒基因，该基因包括编码丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸和编码NS4B蛋白的多核苷酸，其中上述编码NS4B蛋白的多核苷酸选自下述的多核苷酸：
(B) 由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(C) 由SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(E) 编码由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；以及
(F) 编码由SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。
4.DNA，该DNA包括在上述权利要求1~3中任一项所述的丙型肝炎病毒基因的核苷酸序列中由尿苷置换成胸腺嘧啶的核苷酸序列组成的单链DNA。
5.多肽，该多肽由SEQ ID NO: 8、或SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列组成。
6.丙型肝炎病毒多蛋白，其中NS4B区的肽为由SEQ ID NO: 8、或SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列组成的多肽。
7.丙型肝炎病毒多蛋白，该蛋白的构成为：由SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 62、或SEQ ID NO: 64所示的氨基酸序列中第1位~第191位氨基酸序列组成的核心蛋白、由第192位~第383位氨基酸序列组成的E1蛋白、由第384位~第746位氨基酸序列组成的E2蛋白、由第747位~第809位氨基酸序列组成的P7蛋白、由第810位~第1026位氨基酸序列组成的NS2蛋白、由第1027位~第1657位氨基酸序列组成的NS3蛋白、由第1658位~第1711位氨基酸序列组成的NS4A蛋白、由第1712位~第1972位氨基酸序列组成的NS4B蛋白、由第1973位~第2419位氨基酸序列组成的NS5A蛋白、由第2420位~第3010位氨基酸序列组成的NS5B蛋白。
8.复制子RNA，该复制子RNA包括选自下述的多核苷酸：
(B) 由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(C) 由SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(E) 编码由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；以及
(F) 编码由SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。
9.基因型1b的复制子RNA，该复制子RNA包括：编码丙型肝炎病毒的多蛋白的氨基酸序列中第1804位的亮氨酸和第1966位的赖氨酸的核苷酸和编码NS4B蛋白的多核苷酸，其中上述编码NS4B蛋白的多核苷酸选自下述的多核苷酸：
(B) 由SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(C) 由SEQ ID NO: 65所示的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(E) 编码由SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸；以及
(F) 编码由SEQ ID NO: 66所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸。
10.权利要求8或9所述的复制子RNA，该复制子RNA为：
(A) 包含丙型肝炎病毒的5’非翻译区的第1位~第341位的多核苷酸、编码丙型肝炎病毒的多蛋白中第1027位~第3010位多肽的多核苷酸、以及3’非翻译区的多核苷酸；或者
(B) 由5’非翻译区的第1位~第341位的多核苷酸、编码由3010个氨基酸组成的丙型肝炎病毒的多蛋白的多核苷酸、以及3’非翻译区的多核苷酸构成。
11.权利要求8或9所述的复制子RNA，该复制子RNA为干扰素抵抗性。
12.权利要求8或9所述的复制子RNA，该复制子RNA包括：
(B) 由SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列组成的多核苷酸、以及由SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列组成的多核苷酸；
(D) 由SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列组成的多核苷酸、以及由SEQ ID NO: 61所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列组成的多核苷酸；或者
(E) 由SEQ ID NO: 63所示的核苷酸序列中第1位~第341位的核苷酸序列组成的多核苷酸、以及由SEQ ID NO: 63所示的核苷酸序列中第3420位~第9594位的核苷酸序列组成的多核苷酸。
13.权利要求8或9所述的复制子RNA，其中上述复制子RNA为：由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 61、或SEQ ID NO: 63所示的核苷酸序列组成的多核苷酸。
14.权利要求8或9所述的复制子RNA，该复制子RNA包括至少一个选择标记基因或报道基因和至少一个IRES序列。
15.DNA，该DNA编码权利要求8或9所述的复制子RNA。
16.载体，该载体包括权利要求15所述的DNA。
17.复制子复制细胞，该复制子复制细胞是通过将选自权利要求8或9所述的复制子RNA、权利要求15所述的DNA和权利要求16所述的载体的至少一种导入到细胞中而制作的。
18.权利要求17所述的复制子复制细胞，其中上述细胞为来自肝细胞的细胞。
19.权利要求18所述的复制子复制细胞，其中上述来自肝细胞的细胞为Huh-7细胞。
20.复制子RNA，该复制子RNA是由权利要求17所述的复制子复制细胞产生的。
21.丙型肝炎病毒蛋白，该蛋白为由权利要求17所述的复制子复制细胞产生的NS4B。
22.丙型肝炎病毒颗粒，该颗粒是由权利要求17所述的复制子复制细胞产生的。
23.筛选方法，该筛选方法是筛选控制丙型肝炎病毒感染的物质的方法，该方法包括：使权利要求17所述的复制子复制细胞与上述物质接触的步骤；以及分析复制子RNA的增加度的步骤。
24.权利要求23所述的筛选方法，其中上述分析复制子RNA增加度是指检测复制子RNA或丙型肝炎病毒蛋白。
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