CN103261411B

CN103261411B - 丙型肝炎病毒基因

Info

Publication number: CN103261411B
Application number: CN201180048782.0A
Authority: CN
Inventors: 森健一; 槙升; 深井浩未
Original assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Current assignee: Advanced Life Science Institute Inc
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2011-10-07
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2031-10-07
Also published as: CA2813675A1; AU2011313158B2; JPWO2012046836A1; WO2012046836A1; JP5855006B2; AU2011313158A1; US20130189779A1; EP2626426A1; US8981073B2; CN103261411A; EP2626426A4

Abstract

本发明公开了一种与公知的基因型1b的HCV基因相比复制效率高、且再感染效率高的HCV基因以及携带该基因的RNA复制子、感染了该RNA复制子并复制HCV的细胞和HCV颗粒。一种丙型肝炎病毒基因，其所编码的第979位氨基酸为苏氨酸、第1804位氨基酸为亮氨酸、第1966位氨基酸为赖氨酸。本发明提供一种HCV基因，与可以在体外增殖的公知的基因型1b的HCV基因相比，该HCV基因的复制效率高、且再感染效率高。

Description

丙型肝炎病毒基因

技术领域

本发明涉及丙型肝炎病毒(以下有时称作“HCV”)基因、携带该基因的RNA复制子、感染该RNA复制子并复制HCV的细胞和HCV颗粒。

背景技术

HCV是慢性丙型肝炎的致病因子，根据WHO的统计，推测全球有1.7亿感染者。HCV是被分类为黄病毒科、黄病毒属的病毒，认为其经由血液或血液成分而感染，并在肝脏中增殖。HCV感染者在感染初期只出现比较轻微的症状，但往往会转变成慢性，经过一定期间的无症候性期后，成为慢性肝炎。而且，随着感染的长期化，症状进一步恶化成肝硬化，并往往发展为肝癌。认为95%的肝癌与肝炎病毒有关，而其中80%是由HCV感染引起的。

在慢性丙型肝炎的治疗中，广泛使用干扰素。近年来，由于干扰素剂型的改良、或干扰素与利巴韦林的联用疗法等给药方法的改善，HCV从体内被驱除，治愈的比例也逐渐增加。但是，干扰素给药的治愈率只有5成左右，认为存在多种对干扰素治疗显示出耐药性的HCV。因此，人们希望开发对干扰素耐药性的病毒具有疗效的药物。

在上述药物的开发中，药物的筛选系统是必需的。有人报道了：在试管内使来自人或猴的细胞感染HCV并增殖，但这样的增殖系统，其感染效率、增殖效率均低，无法用作药物的筛选系统。

胁田等人从重症丙型肝炎患者体内分离出基因型2a的HCV基因(专利文献1)。在试管内(体外)由该分离的JFH1株合成全长RNA、并将其导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中时，可以得到在细胞内进行自主复制的复制子RNA。而且，确认感染性颗粒被释放到导入有复制子RNA的细胞培养上清中(非专利文献1)。因此，通过将JFH1株的复制子RNA导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中，并将所得的感染性颗粒再次与来自人肝癌的细胞进行培养，可以构建再感染增殖系统。通过使用该再感染增殖系统，抗HCV的药物的筛选开始进行。

但是，JFH1株是基因型2a的HCV，是干扰素敏感性HCV。因此，不具有对干扰素显示出耐药性的HCV基因区，也无法特定作用于规定干扰素耐药性的区域的宿主侧的因子。因此，有可能无法筛选对干扰素耐药性HCV具有效果的药物。

另外，Lemon等人报道了：将基因型1a的H77株的复制子RNA导入来自人肝癌的细胞(Huh7细胞)中得到的感染增殖系统(非专利文献2)。但是，虽然使来自人肝癌的细胞再次感染由导入了该复制子RNA的细胞的培养上清得到的病毒颗粒，但与上述的JFH1株的感染性颗粒相比，感染效价低400倍，因此认为H77株的复制子RNA释放出丧失了感染性的病毒颗粒。因此，认为可以在试管内进行复制的H77株的复制子RNA丧失了产生感染性颗粒的功能，未保留原有的HCV的增殖功能。因此，使用了该H77株的复制子RNA的感染增殖系统的筛选系统有可能无法筛选对在生物体内具有增殖功能的HCV有效的药物。

如上所述，虽然胁田和Lemon报道的复制子RNA可以筛选一部分药物，但这些复制子RNA存在上述问题，认为它们无法筛选可广泛用于HCV治疗的药物。

另外，为了得到可以广泛用于HCV治疗的药物，本发明人还开发了pTPF1/4B作为HCV的有效率的增殖系统、即具有基因型1b型的基因、呈干扰素耐药性、且可以产生感染性颗粒的试管内增殖系统(专利文献2)。但是，该培养系统在实用性上存在以下问题：在来自人肝癌的细胞即Huh7细胞中，细胞内的自主增殖、RNA的自身复制、培养上清中的病毒颗粒的分泌效率均差。另外，非专利文献3中报道了：在NS2区的C末端侧存在与感染性有关的重要区域。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2002-171978号公报；

专利文献2：WO 2008/136470；

非专利文献1：Nature Medicine，2005年，第11卷，第791-796页；

非专利文献2：Proceeding of the National Academy of Science of the United State of America，2006年，第103卷，第2310-2315页；

非专利文献3：Journal of Virology，2009年，第83卷，第12702-12713页。

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，本发明人发现：作为显示出干扰素耐药性的来自重症丙型肝炎患者的HCV基因，在NS4B蛋白区具有两个氨基酸突变的TPF1/4B复制子RNA，其复制效率高、且在培养上清中释放出感染性颗粒(专利文献2)。但是，为了在用于更有效率地进行药物探索的高通量筛选系统中应用，要求获得复制效率更高、且再感染效率高的改良型HCV基因。

因此，本发明的目的在于提供：与专利文献2中记载的公知的HCV基因相比，复制效率高、且再感染效率高的HCV基因。另外，本发明的目的还在于提供：携带上述本发明的基因的RNA复制子、感染该RNA复制子并复制HCV的细胞和HCV颗粒。

解决课题的方法

本发明人进行了深入研究，结果发现：在专利文献2记载的TPF1/4B株的基因中，通过使NS2区的第170位的氨基酸即Met突变成Thr，复制效率和再感染效率显著提高，从而完成了本发明。

即，本发明提供丙型肝炎病毒基因，其是丙型肝炎病毒的基因，该基因所编码的第979位氨基酸为苏氨酸、第1804位氨基酸为亮氨酸，第1966位氨基酸为赖氨酸。本发明还提供：携带上述本发明的基因的RNA复制子。而且，本发明还提供细胞，该细胞感染了上述本发明的RNA复制子并复制丙型肝炎病毒。而且，本发明还提供：携带上述本发明的基因的丙型肝炎病毒颗粒。

发明效果

根据本发明，首次提供与可以在体外增殖的专利文献2记载的公知HCV基因相比，复制效率高、且再感染效率高的HCV基因。通过使用本发明的HCV基因，可以在体外分析在生物体内进行复制的HCV基因组。通过利用该HCV基因组，可以构建在患者肝脏内复制、并使肝炎加重的感染细胞模型。通过利用该模型，可以进行抑制、阻碍肝炎加重的药品的开发和筛选。

附图说明

图1是同时显示通过电穿孔将下述实施例中制作的携带本发明的HCV基因(pTPF1-M)的RNA复制子导入细胞中时电穿孔后的时间与培养上清中的核心抗原的浓度的关系、和有关专利文献2中记载的HCV基因(pTPF1/4B)的结果的图；

图2是同时显示通过电穿孔将下述实施例中制作的携带本发明的HCV基因(pTPF1-M)的RNA复制子导入细胞中时电穿孔后的时间与分泌到培养上清中的HCV RNA浓度的关系、和有关专利文献2中记载的HCV基因(pTPF1/4B)的结果的图；

图3是同时显示通过电穿孔将下述实施例中制作的携带本发明的HCV基因(pTPF1-M)的RNA复制子导入细胞中时培养时间与该培养期间的培养上清中病毒感染效价的关系、和有关专利文献2中记载的HCV基因(pTPF1/4B)的结果的图；

图4是显示使用电穿孔仪导入了下述实施例中制作的携带本发明的HCV基因(pTPF1-M)的pTPF1-M RNA后的ALS32细胞和Huh7细胞中的核心抗原的测定值的经时性变化的图；

图5是显示导入了下述实施例中制作的携带本发明的HCV基因(pTPF1-M)的pTPF1-M RNA后的ALS32细胞和Huh7细胞分泌到培养上清中的HCV RNA量的经时性变化的图；

图6是显示用由导入了下述实施例中制作的携带本发明的HCV基因(pTPF1-M)的pTPF1-M RNA后的ALS32细胞和Huh7细胞分泌到培养上清中的HCV RNA形成的病毒颗粒分别感染ALS32细胞和Huh7细胞时，回收感染中使用的培养上清的时间与病毒感染效价的关系的图。

具体实施方式

如上所述，本发明的HCV基因的特征在于：其所编码的第979位氨基酸为苏氨酸、第1804位氨基酸为亮氨酸、第1966位氨基酸为赖氨酸。其中，第1804位氨基酸为亮氨酸、第1966位氨基酸为赖氨酸，这是专利文献2中记载的TPF1/4B株的基因所具有的特征，通过这两个突变，可以在体外进行HCV的自身复制，因此可以在体外进行HCV的培养。本发明的HCV具有TPF1/4B株的特征性的这两个突变，而且与TPF1/4B株的基因相比在NS2区具有1个突变。即，HCV基因所编码的氨基酸序列的第979位(NS2区的第170位)是苏氨酸(在TPF1/4B株中为甲硫氨酸)。只提取其NS2区后的核苷酸序列和其所编码的氨基酸序列均见SEQ ID NO: 3，只提取其氨基酸序列后的序列见SEQ ID NO: 4。

下述实施例中得到的HCV基因的核苷酸序列和其所编码的氨基酸序列均见SEQ ID NO: 1。只提取SEQ ID NO: 1中的氨基酸序列后的序列见SEQ ID NO: 2。本发明中规定的上述氨基酸编号是以SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列为基准的编号，由于SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列除上述突变部分以外由与普通的1b型HCV的氨基酸序列相同的3010个氨基酸构成，因此与普通的1b型HCV的氨基酸序列中的编号相同。氨基酸数不是3010时，使用用于计算序列同源性的众所周知的软件(后述)，将序列与SEQ ID NO: 2的氨基酸序列比对使一致的氨基酸数达到最大，从而可以容易地特定其氨基酸序列中本发明所规定的上述3个氨基酸的位点。此时，如此特定的位点的氨基酸必需是上述的3个氨基酸。需要说明的是，在SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或其他公知的1b型HCV基因中，5’UTR由第1位～第341位的核苷酸序列构成，核心由第342位～第914位的核苷酸序列构成，E1区由第915位～第1490位的核苷酸序列构成，E2区由第1491位～第2579位的核苷酸序列构成，P7区由第2580位～第2768位的核苷酸序列构成，NS2区由第2769位～第3419位的核苷酸序列构成，NS3区由第3420位～第5312位的核苷酸序列构成，NS4A区由第5313位～第5474位的核苷酸序列构成，NS4B区由第5475位～第6257位的核苷酸序列构成，NS5A区由第6258位～第7598位的核苷酸序列构成，NS5B区由第7599位～第9371位的核苷酸序列构成，3’非翻译区由第9372位～第9594位的核苷酸序列构成。因此，本发明的基因所具有的突变位点中，第1804位氨基酸为NS4B区的第93位氨基酸，第1966位氨基酸为NS4B区的第255位氨基酸。

本发明的HCV基因不仅包含由RNA构成的HCV基因，还包含由DNA构成的HCV基因。当为由RNA构成的HCV基因时，SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3中所示的核苷酸序列中的t变成u。因此，在本说明书和权利要求书中，言及到核苷酸序列的SEQ ID NO所示的核苷酸序列解释为：还显示出t为u的核苷酸序列。

需要说明的是，已知HCV基因中存在各种变体，由此可知：即使是相对于SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有少数突变的核苷酸序列，也可以构成具有复制能力和感染能力的丙型肝炎病毒，其所编码的氨基酸序列具有上述的3个氨基酸、而且构成具有复制能力和感染能力的丙型肝炎病毒的基因包含在本发明的范围中。即，编码与SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有95%以上、优选99%以上的序列同源性、且构成具有复制能力和感染能力的丙型肝炎病毒的氨基酸序列(其中，第979位氨基酸为苏氨酸，第1804位氨基酸为亮氨酸，第1966位氨基酸为赖氨酸)的基因包含在本发明的范围中。此处，序列同源性是指，将2个氨基酸序列进行排列使一致的氨基酸残基数达到最大(根据需要插入缺口)，用一致的氨基酸残基数除以全长的序列的氨基酸残基(当2个序列间总氨基酸残基数不同时，是指长的氨基酸残基)数而得到的值。上述序列同源性的计算，可以使用BLAST或MacVector(10.5.1版、MacVector)等基因分析软件等众所周知的软件容易地进行。需要说明的是，当用于新药筛选时，优选与天然中实际存在的HCV尽可能接近的HCV，因此除本发明的特征性的上述3个氨基酸突变以外的突变优选为天然的HCV所具有的突变。另外，其核苷酸序列优选SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列(其中，t可以是u)或与该核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选99%以上的序列同源性的核苷酸序列。另外，关于是否具有复制能力和感染能力，这可以通过用HCV感染Huh7细胞等肝脏细胞株，根据在细胞的培养上清中能否检测到HCV来进行判定，具体方法记载在下述实施例中。

具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的HCV基因为1b型。1b型呈干扰素耐性，因此作为新药筛选的对象较为重要。因此，本发明的HCV基因优选为1b型。人们对HCV的基因型已进行了充分的研究，基因分型的方法例如记载在冈本等人(Virology 1992年，第188卷，第331-341页)或Simmonds等人(Journal of General Virology，1993年，第74卷，第2391-2399页)的文献中。本领域技术人员可以容易地进行HCV的基因分型。

本发明的HCV基因可以如下制备：利用众所周知的位点特异性诱变法等，向公知的HCV基因、优选公知的1b型HCV基因中导入突变，使其所编码的氨基酸序列具有上述的3个氨基酸，即可制得。如上所述，由于专利文献2中记载的TPF1/4B株具有NS4B区的2个突变，因此在使用TPF1/4B株作为起始基因时，通过向其中导入NS2区的1个突变，可以制备本发明的HCV基因。位点特异性诱变法众所周知，用于该方法的试剂盒也有市售，因此可以容易地进行。关于突变的导入，例如通过使用特异性引物进行PCR(PCR Protocols, Academic Press(1990))，可以向NS2区内导入氨基酸取代(参照下述实施例)。例如，将基因克隆到pGEM-T easy载体(Promega公司制)中，使用自动测序仪可以确定核苷酸序列。另外，将具有该氨基酸取代的HCV基因用限制酶AgeI和FseI切断，之后与用相同的限制酶切断的pTPF1/4B连接，从而可以获得本发明的在NS2区内具有突变的全长HCV基因(参照下述实施例)。以其他的HCV基因作为起始基因时，必需再导入NS4B区的2个突变，但利用位点特异性诱变法等同样可以容易地导入。需要说明的是，HCV基因可以通过从肝炎患者的血液中回收HCV颗粒、并利用常规方法提取RNA而获得。

上述的携带本发明的HCV基因的本发明的复制子RNA(也称作RNA复制子)，可以利用任意的基因步骤学方法来制作。对制作方法没有限定，例如可以利用下述方法制作复制子RNA。

利用常规方法将编码上述复制子RNA的DNA插入克隆载体中，制作DNA克隆。将该DNA插入RNA启动子的下游，制作可以产生复制子RNA的DNA克隆。上述RNA启动子优选为质粒克隆中所含的启动子。对RNA启动子没有限定，可以列举T7 RNA启动子、SP6 RNA启动子、SP3 RNA启动子，特别优选T7 RNA启动子。

对插入DNA的载体没有特别限定，例如可以列举：质粒载体、直链状双链DNA载体以及腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体等病毒载体，但优选为质粒载体。

本发明的复制子RNA可以由插入有上述DNA的载体来制作。以DNA克隆为模板，利用RNA聚合酶合成RNA。RNA合成可以利用常规方法从5’非翻译区开始。当模板DNA为质粒克隆时，还可以通过限制酶从其质粒克隆中切出与RNA启动子下游相连的上述DNA区，使用其DNA片段作为模板，合成RNA。需要说明的是，优选所合成的RNA的3’末端与病毒基因组RNA的3’非翻译区一致，优选不添加或不删除其他的序列。例如，作为本发明的全长复制子RNA的一个优选方案，可以将其插入在5’UTR的上流具有T7RNA启动子、在3’UTR末端具有限制酶XbaI位点的载体中，经XbaI消化后，利用T7RNA聚合酶合成HCV 基因组RNA。

本发明的复制子复制细胞，可以通过将上述的RNA复制子导入任意的细胞中来制作。对导入复制子RNA的细胞没有特别限定，优选来自人肝脏的细胞、来自小鼠肝脏的细胞、或来自猴肝脏的细胞，特别可以列举：来自人肝癌的细胞即Huh7细胞、HepG2细胞、或Hep3B细胞、或IMY-N9细胞、HeLa细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、或293细胞，特别优选来自人肝癌的细胞即Huh7细胞、HepG2细胞、或Hep3B细胞。另外，通过将复制子RNA导入利用有限稀释法等将上述细胞、优选来自人肝癌的细胞单克隆化而得到的细胞中，可以产生大量的复制子RNA，因此优选。例如，如下述实施例中具体说明的那样，将RNA复制子导入通过有限稀释法(培养基为含有10%FBS的D-MEM培养基)将来自人肝癌的细胞即Huh7细胞单克隆化而确立的细胞即ALS32细胞中时，与导入到亲本细胞的Huh7细胞中时相比，产生非常多的复制子RNA。向细胞内导入复制子RNA可以通过任意的转染法来进行。作为上述导入方法，例如可以列举电穿孔、基因枪法、脂质转染法，但特别优选电穿孔的方法。

为了进行细胞内导入而使用含有选择标志物基因或报道基因的复制子RNA时，可以利用选择标志物基因或报道基因的表达来选择导入有该复制子RNA并持续地进行复制的细胞。例如，当复制子RNA中包含新霉素耐性基因作为选择标志物基因时，将转染了该复制子RNA的细胞接种在培养皿中，以0.05毫克/毫升～3.0毫克/毫升的浓度添加G418(新霉素)。之后，每周交换两次培养液，同时继续进行培养，自接种时起2～3周后可以看见菌落。

本发明的复制子复制细胞产生复制子RNA、丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒颗粒。因此，使用复制子复制细胞，可以产生复制子RNA、丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒颗粒。

复制子复制细胞中所复制的复制子RNA，可以通过任意的RNA提取法从细胞内提取出来。将从细胞中提取的RNA再次导入细胞中，从而可以使其发挥复制子RNA的功能。作为此时的细胞，可以使用上述的来自人肝癌的细胞即Huh7细胞、HepG2细胞、或Hep3B细胞、或IMY-N9细胞、HeLa细胞、CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、或293细胞，进一步优选来自人肝癌的细胞即Huh7细胞、HepG2细胞、或Hep3B细胞，特别优选通过有限稀释法等将上述来自人肝癌的细胞单克隆化而得到的细胞、即复制子RNA的复制能力较亲本细胞有所提高的细胞(实施例记载的ALS32细胞等)。本发明的丙型肝炎病毒蛋白可以使用分泌到细胞内或培养上清中的病毒蛋白。所产生的丙型肝炎病毒蛋白可以按照公知的方法进行提取、纯化。另外，由复制子复制细胞产生的丙型肝炎病毒颗粒可以使用分泌到细胞内和培养上清中的病毒颗粒。本发明的丙型肝炎病毒蛋白和丙型肝炎病毒颗粒，通过在复制子RNA中加入修饰，对RNA、病毒蛋白或病毒颗粒进行修饰，减弱其病原性，从而还可以用作疫苗。

通过使用上述复制子复制细胞，可以筛选控制丙型肝炎病毒的感染的物质。“控制丙型肝炎病毒的感染”是指，例如控制(例如促进或抑制)HCV的RNA的复制、控制(例如促进或抑制)由RNA翻译成蛋白。

具体而言，使复制子复制细胞与试验物质接触，分析复制子RNA的增加度，从而可以进行试验物质的筛选。复制子RNA的增加度是指，复制子RNA的复制的速度或量的变化。具体而言，检测或测定复制子细胞中或上清中的复制子RNA的量，与未和对照的受试物质接触的复制子复制细胞的复制子RNA的量进行比较，从而可以筛选受试物质。另外，检测或测定细胞中或上清中的丙型肝炎病毒蛋白的量，与未和对照的受试物质接触的复制子复制细胞的丙型肝炎病毒蛋白的量进行比较，从而可以筛选受试物质。对筛选中可以检测或测定的丙型肝炎病毒蛋白没有特别限定，但优选为核心蛋白，还可以使用市售的试剂盒测定核心蛋白。另外，通过使筛选方法自动化，还可以适用于高通量筛选方法。

而且，本发明的筛选方法作为评价所筛选的药物的效果的方法也有效。必需通过该筛选方法进行药物的评价时，还可以将该方法用作制备药物的方法。

以下，根据实施例来更具体地说明本发明。不过，本发明并不受下述实施例的限定。

参考例 TPF1/4B株的基因的获得

利用专利文献2的实施例中记载的方法获得TPF1/4B株的基因并进行分析。即，进行以下操作。

(A) 从血清中提取RNA

使用高纯病毒核酸试剂盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit) (Roche diagnostics corporation)，按照制造商推荐的方法，从在重症肝炎患者的急性期采集的250μL血清中纯化RNA。

(B) cDNA的合成和通过PCR扩增cDNA

向已纯化的RNA中加入XR58R引物，使用SuperSucript II逆转录酶(SuperSucript II reverse transcriptase) (Invitrogen公司)，按照制造商推荐的方法，在42℃下进行1小时逆转录反应，得到cDNA。向所得的反应液中加入RNaseH(Invitrogen)，在37℃下反应30分钟，分解RNA。使用HC-LongA1引物和1b9405R引物以及Takara LA Taq DNA聚合酶(Takara LA Taq DNA polymerase) (宝酒造)，对该反应液进行30次由94℃、20秒、68℃、9分钟构成的热循环反应的聚合酶链反应(PCR)，扩增cDNA。再使用HC85F和HC9302R引物，对所得的一部分反应液进行PCR，扩增HCV cDNA。

(C) cDNA的克隆

使用0.7%的琼脂糖凝胶，通过电泳分离已扩增的DNA片段，再使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAquick gel purification kit) (QIAGEN公司)，按照制造商推荐的方法，回收DNA片段。使所回收的DNA片段与pGEM-T easy载体(Promega公司)进行连接反应，利用该质粒转化DH5α株。选择氨苄青霉素耐性转化体，使用2YT培养基进行培养。使用Wizard Plus SV Miniprep DNA纯化系统(Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System)，从已培养的菌体中纯化质粒。

(D) 核苷酸序列的确定

使用根据HCV的基因型1b的核苷酸序列设计的引物(SEQ ID NO: 17～SEQ ID NO: 39)，确定HCV cDNA的核苷酸序列。使用CEQ DTCS快速起始试剂盒(CEQ DTCS Quick Start Kit) (ベックマン?コールター)，按照制造商推荐的方法进行反应，利用CEQ2000 XL DNA分析系统(CEQ2000 XL DNA analysis system) (软件4.0.0版、ベックマン?コールター)进行分析。使用Sequencher(4.1.2版、Gene Codes Corporation)分析所得的数据。将得到的HCV克隆命名为pTPF1-0193。

(E) 5’非翻译区的cDNA的获得和核苷酸序列的确定

并且，利用5’RACE法，由上述步骤(A)中得到的RNA获得5’非翻译区的末端的cDNA。使用用于快速扩增cDNA末端的5’RACE系统 2.0版(Invitrogen公司)的试剂盒，按照附录的操作指南来实施。

用于cDNA合成的反义引物使用Chiba-as。利用SuperScript II逆转录酶(SuperScript II Reverse Transcriptase) (Invitrogen)合成cDNA，用S.N.A.P柱进行纯化，之后进行TdT-加尾反应，在cDNA上添加dCTP。利用试剂盒中附带的5’RACE Abridged锚定引物和KY78引物，使用Takara LA Taq DNA聚合酶(宝酒造)进行第1次PCR。以一部分该PCR产物为模板，利用试剂盒中附带的UTP引物和KM2引物，使用Takara LA Taq DNA聚合酶(宝酒造)进行第2次PCR，得到PCR产物。将该PCR产物克隆到pGEM-T easy载体中，按照上述步骤(D)确定核苷酸序列。将所得的包含SEQ ID NO: 1中的第1位~第709位的HCV cDNA克隆命名为pTPF1-0007。

(F) 3’非翻译区的cDNA的获得和核苷酸序列的确定

利用3’RACE法，由上述步骤(A)中得到的RNA获得3’非翻译区的末端cDNA。首先，使用Poly(A)加尾试剂盒(Poly(A) Tailing Kit) (Ambion)，按照附带的操作指南，在患者的RNA上添加Poly(A)。除了使用dT-Adp引物代替XR58R引物，并使用3UTR-1F引物和Adp引物作为第一PCR的引物、使用XR58F和Adp引物作为第二PCR的引物以外，重复进行上述步骤(B)～(D)的操作。将得到的HCV cDNA克隆命名为 pTPF1-8994。

将所得的HCV株命名为TPF1株。TPF1株是全长9594个核苷酸的HCV，其核苷酸序列见SEQ ID NO: 1(其中，第3277位的C为T，第5752位的T为A，第6237位的A为G)。所得的TPF1株的多核苷酸在其第342位至第9374位之间具有翻译区，该翻译区编码3010个连为一体(一つながり)的氨基酸。TPF1株的多蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO: 2(其中，氨基酸编号979的氨基酸T(苏氨酸)为M(甲硫氨酸)，氨基酸编号1804的氨基酸L(亮氨酸)为Q(谷氨酰胺)，氨基酸编号1966的氨基酸K(赖氨酸)为E(谷氨酸))。

以下显示用于克隆和确定核苷酸序列的引物：

XR58R(SEQ ID NO: 5)：5’-tcatgcggct cacggacctt tcacagctag-3’；

HC-LongA1(SEQ ID NO: 6)：5’-atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat-3’；

1b9405R(SEQ ID NO: 7)：5’-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3’；

HC85F(SEQ ID NO: 8)：5’-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3’；

HC9302R(SEQ ID NO: 9)：5’-tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t-3’；

Chiba-as(SEQ ID NO: 10)：5’-tgcacggtct acgagacct-3’；

KY78(SEQ ID NO: 11)：5’-ctcgcaagca ccctatcagc cagt-3’；

KM2(SEQ ID NO: 12)：5’-aggcattgag cgggtttat-3’；

dT-Adp(SEQ ID NO: 13)：5’-ctagactcga gtcgacatcg tttttttttt tttttttt-3’；

3UTR-1F(SEQ ID NO: 14)：5’-atcttagccc tagtcacggc-3’；

Adp(SEQ ID NO: 15)：5’-ctagactcga gtcgacatcg-3’；

XR58F(SEQ ID NO: 16)：5’-ctagctgtaa aggtccgtga gccgcatga-3’；

M13 Primer M3(SEQ ID NO: 17)：5’-gtaaaacgac ggccagt-3’；

M13 Primer RV(SEQ ID NO: 18)：5’-caggaaacag ctatgac-3’；

104(SEQ ID NO: 19)：5’-aggaagactt ccgagcggtc-3’；

HC841S(SEQ ID NO: 20)：5’-ggaacttgcc cggttgctct ttctctatct tc-3’；

E1(SEQ ID NO: 21)：5’-attccatggt ggggaactgg gctaa-3’；

HC2069S(SEQ ID NO: 22)：5’-taacaatacc ttgacctgcc ccacggactg-3’；

HC2430S(SEQ ID NO: 23)：5’-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtacgg-3’；

HC2461AS(SEQ ID NO: 24)：5’-gaccctacac cgtacaggta-3’；

HC2769S(SEQ ID NO: 25)：5’-ttggaccggg agatggctgc atcgtg-3’；

HC3632F(SEQ ID NO: 26)：5’-cacccaaatg tacaccaatg t-3’；

HC3928S(SEQ ID NO: 27)：5’-tacccgttga gtctatggaa ac-3’；

HC4016AS(SEQ ID NO: 28)：5’-cacttggaat gtctgcggta-3’；

HC4498S(SEQ ID NO: 29)：5’-agggggggag gcatctcatt ttctg-3’；

HC4888F(SEQ ID NO: 30)：5’-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta-3’；

HC5381F(SEQ ID NO: 31)：5’-ggtcattgtg ggcaggatca t-3’；

HC5692S(SEQ ID NO: 32)：5’-ctgcctggaa accccgcgat-3’；

HC5858F(SEQ ID NO: 33)：5’-tggcagcata ggccttggga aggt-3’；

HC6315F(SEQ ID NO: 34)：5’-aagacctggc tccagtccaa g-3’；

5A-1(SEQ ID NO: 35)：5’-ttccatgctc accgacccct c-3’；

HC7090S(SEQ ID NO: 36)：5’-gtggagtcag agaataaggt-3’；

HC7743F(SEQ ID NO: 37)：5’-cagaagaagg tcacctttga c-3’；

HC8192S(SEQ ID NO: 38)：5’-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3’；

HC8939F(SEQ ID NO: 39)：5’-ctacggggcc tgttactcca ttgaac-3’。

(G) 亚基因组RNA复制子的制作

将丙型肝炎病毒TPF1株的全长多核苷酸插入pBluescriptIISK(+)的T7RNA启动子序列的下游(以下，称作pTPF1)。

接下来，从pTPF1的编码结构蛋白的区和编码非结构蛋白的区即核心的一部分区域起，将NS2区与新霉素耐性基因(新霉素磷酸转移酶、NPT-II)和EMCV-IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点)调换，构建质粒DNA pRepTPF1。该构建步骤遵照现有的文献(Lohmann等人, Science, (1999) 285, 第ll0-113页)。

具体而言，首先，用限制酶AgeI和BsrGI切断pTPF1，在其切断位点连接插入下述片段，得到质粒DNA pRepTPF1。所述片段为：通过PCR扩增来扩增来自pTPF1的从5’UTR至核心区的序列和来自pcDNA3.1(+)的新霉素耐性基因、并用限制酶AgeI和PmeI切断而得到的片段；以及通过PCR扩增结合从EMCV-IRES至NS3区的序列、并用限制酶PmeI和BsrGI切断而得到的片段。

使用快速诱变试剂盒(Quick Mutagenesis Kit) (Stratagene)，按照制造商推荐的方法，向该质粒DNA pRepTPF1中导入SEQ ID NO: 1的相当于核苷酸序列第5752位的核酸从A取代成T、相当于第6237位的核酸从G取代成A的突变。其结果，SEQ ID NO: 2的相当于氨基酸编号1804的氨基酸从Q(谷氨酰胺)突变成L(亮氨酸)，相当于氨基酸编号1966的氨基酸从E(谷氨酸)突变成K(赖氨酸)。将导入了该氨基酸取代的质粒DNA命名为pRep4B。

将(F)中制作的包含全长HCV DNA的质粒DNA pTPF1用限制酶SfiI切断，在其切断位点连接插入用限制酶SfiI切断pRep4B而得到的片段，由此制作插入有适应突变的包含全长HCV DNA的质粒DNA即pTPF1/4B。将如此操作得到的HCV株作为TPF1/4B株。

实施例

1. 向HCV NS2蛋白酶区内导入突变

以pTPF1/4B基因为模板，在AgeI引物5’-accggtgagtacaccggaattg ccaggacg-3’(SEQ ID NO: 40)和FseI引物5’-atttgggtgattgggcccttcggg ccggcc-3’(SEQ ID NO: 41)的存在下，使用Takara LA Taq DNA聚合酶(宝酒造)，进行20次由94℃、20秒、68℃、4分钟构成的热循环反应的聚合酶链反应(PCR)，从而扩增TPF1/4B 基因组的NS2蛋白酶区的邻近区域。

已扩增的片段通过1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分离，使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN)，按照制造商推荐的方法回收DNA片段。按照制造商推荐的方法，使已回收的TPF1片段与pGEM-T easy载体(Promega)进行连接反应，利用该质粒转化DH5α株。通过在呈氨苄青霉素耐性、且加入了IPTG和X-gal的琼脂培养基上进行平板培养，选择形成白色菌落的转化体，之后在加入了氨苄青霉素使浓度达到100μg/ml的2YT培养基中进行培养。使用Wizard Plus SV Miniprep DNA纯化系统，从所培养的菌体中纯化质粒pTPF1-AgeFse。

关于插入在纯化质粒中的TPF1片段的序列，使用适合于载体和HCV序列的适当准备的引物，利用CEQ DTCS快速起始试剂盒(ベックマン?コルター)，按照制造商推荐的方法进行反应，使用CEQ2000 XL DNA分析系统(软件4.0.0版、ベックマン?コールター)进行分析。根据得到的数据，使用Sequencher (4.1.2版、Gene Codes Corporation)进行序列数据的统计、分析，确认pTPF1-AgeFse的核苷酸序列。

接下来，使用快速诱变试剂盒(Stratagene)，按照制造商推荐的方法，向上述制作的pTPF1-AgeFse中导入NS2蛋白酶的氨基酸编号170(从M突变成T)的突变。将导入了该氨基酸取代的质粒作为pTPF1-AgeFse/Npro。

再用限制酶AgeI和FseI切断pTPF1/4B，在其切断位点连接插入来自pTPF1-AgeFse/Npro的用限制酶AgeI和FseI切断而得到的片段。将该质粒作为pTPF1-M。

2. 氨基酸突变对HCV RNA复制的效果

将1中制作的具有氨基酸突变的pTPF1-M和不具有发生突变的序列的pTPF1/4B用限制酶XbaI切断，以所得产物为模板，使用Megascript T7试剂盒(Megascript T7 kit) (Ambion)或AmpliScribe T7-瞬间转录试剂盒(AmpliScribe T7-Flash transcription kit) (Epicentre)合成RNA。按照制造商推荐的方法纯化RNA。

关于人肝癌细胞(Huh7、JCRB0403)，以在Dulbecco’s改良Eagle培养基(D-MEM, IWAKI)中加入了10%胎牛血清(FBS)、且加入了青霉素和链霉素使分别达到50U/mL、50μg/mL而得到的培养基作为培养液，添加5%二氧化碳，在37℃下进行培养。将达到融合之前的细胞通过胰蛋白酶、EDTA处理从培养皿上剥离，再次悬浮于添加有血清的培养基中，从而使胰蛋白酶失活。用PBS清洗两次，之后再次悬浮于添加有1.25% DMSO的Cytomix(120mM的氯化钾、10mM的磷酸钾、5mM的氯化镁、25mM的HEPES、0.15mM的氯化钙、2mM的EGTA、pH7.6)中，之后移至缺口为0.4cm的电击杯(エレクトロポレーションキュベット)中。

将10μg的RNA加入到细胞中，之后在冰上充分冷却5分钟。使用电穿孔仪(Bio-Rad)，以960μF、250V施加脉冲。将已进行转染的细胞立即再次悬浮于10mL培养基中，以1mL/孔接种在12孔板(直径为22.1mm)上，开始进行培养。于4小时、24小时、48小时和72小时回收培养上清。将所回收的培养上清以2krpm的转速离心10分钟，回收上清。使用HCV核心抗原的试剂盒(富士レビオ、ルミパルス)测定100μL上清。

如图1所示，使用电穿孔仪将RNA导入细胞内的pTPF1-M和pTPF1/4B中的核心抗原的测定值在电穿孔后72小时达到最大，pTPF1-M的核心抗原的分泌量显示为pTPF1/4B的2.8倍。而且，分泌到该培养上清中的HCV RNA量与核心抗原一样，在电穿孔后72小时达到最大，pTPF1-M的HCV RNA量显示为pTPF1/4B的3倍(图2)。这显示：与pTPF1/4B基因相比，本发明的在NS2蛋白酶区内导入了突变的pTPF1-M基因在细胞中高效率地进行复制，并将核心抗原和HCV RNA分泌到上清中。表明pTPF1-M基因的复制效率较pTPF1/4B优异。

3. HCV颗粒对培养细胞的感染

在2中分泌到培养上清中的核心抗原和HCV RNA形成病毒颗粒，在体外研究其再次感染的可能性。具体而言，利用pTPF1-M和pTPF1/4B基因将所合成的全长HCV RNA转染到Huh7细胞中，经时性地回收培养上清。将所回收的培养上清以15,000rpm的转速离心10分钟，之后进行过滤器过滤(0.45μm、Millipore)，除去破碎的细胞等。

使已进行过滤器过滤的上清与在12孔板(直径22.1μm)上培养的幼稚Huh7细胞在37℃的条件下反应6小时。反应后，用PBS清洗细胞3次，加入新的增殖培养基，在添加有5%二氧化碳、37℃的培养箱内进行培养。关于病毒感染效价，利用免疫染色法使细胞内蓄积的核心抗原可视化，计数核心抗原阳性细胞数，从而以转化灶形成单元(FFU/mL)的形式表示培养上清中所含的感染性病毒颗粒的数目。

具体而言，使用甲醇固定感染后96小时的细胞，再使用2% BSA-PBS将固定后的细胞在室温下培养2小时，由此进行封闭。接着，添加作为一次抗体的抗核心单克隆抗体(1μg/mL)，之后在室温下培养1小时。充分清洗细胞，之后添加FITC标记二次抗体，在室温下培养1小时。对于HCV感染细胞，使用倒立型荧光显微镜计数细胞内的核心抗原阳性细胞数。

如图3所示，在NS2蛋白酶区内导入了突变的pTPF1-M中，确认到在导入HCV RNA后48小时的培养上清中释放出最多的感染性病毒颗粒(300 FFU/mL)。而在不具有氨基酸突变的pTPF1/4B中，虽然确认到在导入HCV RNA后48小时的培养上清中释放出最多的感染性病毒颗粒(75 FFU/mL)，但其值低至pTPF1-M的四分之一。由此显示：与导入了pTPF1/4B基因的细胞相比，导入了pTPF1-M基因的细胞释放出更多的感染性病毒颗粒。这表明：本发明的NS2蛋白酶区内的突变会改善病毒RNA的增殖效率和感染效率。

4. 单克隆化Huh7细胞中的病毒增殖

通过有限稀释法将人肝癌细胞(Huh7、JCRB0403)单克隆化，重新确立ALS32细胞。利用电穿孔法，对ALS32细胞中的pTPF1-M的增殖性能进行评价。

关于人肝癌细胞(Huh7、JCRB0403)，以在D-MEM中加入了10% FBS、并加入了青霉素和链霉素使分别达到50U/mL、50μg/mL而得到的培养基作为培养液，添加5%二氧化碳，在37℃下进行培养。将达到融合之前的细胞通过胰蛋白酶、EDTA处理从培养皿上剥离，之后再次悬浮于添加有血清的培养基中，从而使胰蛋白酶失活。测定细胞数后，使用增殖培养基进行调整，使96孔板的每孔中有1个细胞，将其接种在该板中。接种后继续培养约1个月，确立ALS32细胞。

对于ALS32细胞和Huh7细胞/JCRB0403，以在D-MEM中加入了10% FBS、并加入了青霉素和链霉素使分别达到50U/mL、50μg/mL而得到的培养基作为培养液，在添加5%二氧化碳、37℃下进行培养。将达到融合之前的细胞通过胰蛋白酶、EDTA处理从培养皿上剥离，之后再次悬浮于添加有血清的培养基中，从而使胰蛋白酶失活。用PBS清洗两次，之后再次悬浮于添加有1.25% DMSO的Cytomix中，然后将其移至缺口为0.4cm的电击杯中。

将实施例3中合成的10μg pTPF1-M RNA的RNA加入到ALS32细胞和Huh7细胞/JCRB0403中，之后在冰上充分冷却5分钟。使用电穿孔仪(Bio-Rad)，以960μF、250V施加脉冲。将已进行转染的细胞立即再次悬浮于10mL培养基中，以1mL/孔接种在12孔板(直径为22.1mm)上，开始进行培养。于24小时、48小时、72小时、96小时和120小时后回收培养上清。将所回收的培养上清以2krpm的转速离心10分钟，回收上清。使用HCV核心抗原试剂盒(富士レビオ、ルミパルス)测定该100μL上清。

如图4所示，使用电穿孔仪导入pTPF1-M RNA后的两种细胞中的核心抗原的测定值在电穿孔后72小时～96小时达到最大，ALS32细胞的核心抗原分泌量在电穿孔后72小时显示为Huh7细胞/JCRB0403的17.5倍。而且，分泌到这两种培养上清中的HCV RNA量在电穿孔后72小时达到最大，ALS32细胞的HCV RNA量显示为Huh7细胞/JCRB0403的13.4倍(图5)。这表明：在单克隆化的ALS32细胞中，与亲本细胞相比，本发明的在NS2蛋白酶区内导入了突变的pTPF1-M基因可以高效率地进行复制。

5. HCV颗粒对单克隆化培养细胞的感染

在4中分泌到培养上清中的核心抗原和HCV RNA形成病毒颗粒，在体外研究其再次感染的可能性。具体而言，利用pTPF1-M基因将所合成的全长HCV RNA转染到ALS32细胞和Huh7细胞/JCRB0403中，经时性地回收培养上清。将所回收的培养上清以15,000rpm的转速离心10分钟，之后进行过滤器过滤(0.45μm、Millipore)，除去破碎的细胞等。

使已进行过滤器过滤的来自ALS32细胞的培养上清和来自Huh7细胞的培养上清分别与在12孔板(直径为22.1μm)上培养得到的幼稚ALS32培养细胞和幼稚Huh7培养细胞在37℃的条件下反应6小时。反应后，用PBS清洗细胞3次，加入新的增殖培养基，在添加了5%二氧化碳、37℃的培养箱内进行培养。关于病毒感染效价，利用免疫染色法使细胞内蓄积的核心抗原可视化，计数核心抗原阳性细胞数，从而以转化灶形成单元(FFU/mL)的形式表示培养上清中所含的感染性病毒颗粒的数目。

具体而言，使用甲醇将感染后96小时的细胞固定，使用2% BSA-PBS将固定后的细胞在室温下培养2小时，由此进行封闭。接着，添加作为一次抗体的抗核心单克隆抗体(1μg/mL)，之后在室温下培养1小时。充分清洗细胞，之后添加FITC标记二次抗体，在室温下培养1小时。对于HCV感染细胞，使用倒立型荧光显微镜计数细胞内的核心抗原阳性细胞数。

如图6所示，使ALS32细胞感染由该细胞得到的病毒颗粒时，确认到在导入HCV RNA后96小时的培养上清中释放出最多的感染性病毒颗粒(1,500 FFU/mL)。而在Huh7细胞/JCRB0403中，虽然确认到在导入HCV RNA后48小时～72小时的培养上清中释放出最多的感染性病毒颗粒(250 FFU/mL)，但其值低至ALS32细胞的六分之一。由此显示：与作为亲本细胞的Huh7细胞/JCRB0403相比，单克隆化的ALS32细胞释放出更多的感染性病毒颗粒。这表明：通过使用Huh7细胞/JCRB0403的单克隆化细胞即ALS32细胞，NS2蛋白酶区内具有突变的病毒RNA的增殖效率和感染效率有所改善。

产业实用性

本发明的RNA复制子，通过将其导入细胞内而进行自主复制，与pTPF1/4B RNA相比，可以高效率地产生丙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒蛋白和感染性颗粒。导入有该复制子RNA的复制子复制细胞，其作为丙型肝炎病毒感染的试管内模型，反映出生物体内的HCV的增殖机制，可以在HCV治疗药的筛选方法中使用该复制子复制细胞。而且，上述筛选方法除了用于HCV治疗药的筛选以外，还可以在治疗药的制备步骤中用于品质管理，可以作为药品的制备方法来应用。

Claims

1.丙型肝炎病毒基因，其是丙型肝炎病毒的基因，该基因所编码的第979位氨基酸为苏氨酸、第1804位氨基酸为亮氨酸、第1966位氨基酸为赖氨酸，

上述基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的基因，其中，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，其中上述核苷酸序列中的t任选替换成u。

3.权利要求1或2所述的基因，该基因的基因型为1b型。

4.RNA复制子，该RNA复制子携带权利要求1～3中任一项所述的基因。

5.细胞，该细胞感染权利要求4所述的RNA复制子并复制丙型肝炎病毒。

6.丙型肝炎病毒颗粒，该丙型肝炎病毒颗粒携带权利要求1～3中任一项所述的基因。