JP5855006B2 - C型肝炎ウイルス遺伝子 - Google Patents
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Description
特許文献2の実施例に記載した方法によりTPF1/4B株の遺伝子を取得し、解析した。すなわち、以下の操作を行った。
劇症肝炎患者の急性期に採取した血清250μLより、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche diagnostics corporation)を用い、メーカーの推奨する方法に従い、RNAを精製した。
精製したRNAにXR58Rプライマーを加え、SuperSucript II reverse transcriptase (Invitrogen社)により、メーカーの推奨する方法に従い、42℃、1時間逆転写反応を行わせ、cDNAを得た。得られた反応液にRNaseH(Invitrogen)を加え、37℃、30分反応させ、RNAを分解した。この反応液を、HC-LongA1プライマーと1b9405Rプライマー及びTakara LA Taq DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、9分間からなる30回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行い、cDNAを増幅した。更に、得られた反応液の一部を、HC85FとHC9302Rプライマーを用いてPCRを行い、HCV cDNAを増幅した。
増幅したDNA断片は、0.7%アガロースゲルを用い電気泳動によって分離し、QIAquick gel purification kit (QIAGEN社)を用い、メーカーの推奨する方法に従って、DNA断片を回収した。回収したDNA断片は、pGEM-T easyベクター(Promega社)と連結反応させ、そのプラスミドによりDH5α株を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体を選択し、2YT培地を用いて培養した。培養した菌体からWizard Plus SV Miniprep DNA Purification Systemを用いプラスミドを精製した。
HCV cDNAの塩基配列は、HCVの遺伝子型1bの塩基配列に基づいて設計したプライマー(配列番号17〜39)を用い、決定した。CEQ DTCS Quick Start Kit(ベックマン・コールター)を用い、メーカーの推奨する方法に従い、反応を行い、CEQ2000 XL DNA analysis system (Software version 4.0.0、ベックマン・コールター)により解析した。得られたデータをSequencher (Version 4.1.2、Gene Codes Corporation)により解析した。得られたHCVクローンをpTPF1-0193と命名した。
更に、前記の(A)の工程で得られたRNAより、5’RACE法により、5’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version2.0 (Invitrogen社)のキットを用い、添付の指示書に従って、実施した。
前記の(A)の工程で得られたRNAより、3’RACE法により、3’非翻訳領域の末端のcDNAを取得した。まず、患者のRNAにPoly(A) Tailing Kit(Ambion)を用いて、添付の指示書に従い、Poly(A)を付加した。XR58Rプライマーの代わりにdT-Adpプライマーを、1st PCRのプライマーとして3UTR-1Fプライマー及びAdpプライマーを、2nd PCRのプライマーとしてXR58F及びAdpプライマーを用いた以外は、前記工程(B)〜(D)の操作を繰り返した。得られたHCV cDNAクローンを pTPF1-8994と命名した。
XR58R(配列番号5):5'-tcatgcggct cacggacctt tcacagctag-3'
HC-LongA1(配列番号6):5'-atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat-3'
1b9405R(配列番号7):5'-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3'
HC85F(配列番号8):5'-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3'
HC9302R(配列番号9):5'-tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t-3'
Chiba-as(配列番号10):5'-tgcacggtct acgagacct-3'
KY78(配列番号11):5'-ctcgcaagca ccctatcagc cagt-3'
KM2(配列番号12):5'-aggcattgag cgggtttat-3'
dT-Adp(配列番号13):5'-ctagactcga gtcgacatcg tttttttttt tttttttt-3'
3UTR-1F(配列番号14):5'-atcttagccc tagtcacggc-3'
Adp(配列番号15):5'-ctagactcga gtcgacatcg-3'
XR58F(配列番号16):5'-ctagctgtaa aggtccgtga gccgcatga-3'
M13 Primer M3(配列番号17):5'-gtaaaacgac ggccagt-3'
M13 Primer RV(配列番号18):5'-caggaaacag ctatgac-3'
104(配列番号19):5'-aggaagactt ccgagcggtc-3'
HC841S(配列番号20):5'-ggaacttgcc cggttgctct ttctctatct tc-3'
E1(配列番号21):5'-attccatggt ggggaactgg gctaa-3'
HC2069S(配列番号22):5'-taacaatacc ttgacctgcc ccacggactg-3'
HC2430S(配列番号23):5'-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtacgg-3'
HC2461AS(配列番号24):5'-gaccctacac cgtacaggta-3'
HC2769S(配列番号25):5'-ttggaccggg agatggctgc atcgtg-3'
HC3632F(配列番号26):5'-cacccaaatg tacaccaatg t-3'
HC3928S(配列番号27):5'-tacccgttga gtctatggaa ac-3'
HC4016AS(配列番号28):5'-cacttggaat gtctgcggta-3'
HC4498S(配列番号29):5'-agggggggag gcatctcatt ttctg-3'
HC4888F(配列番号30):5'-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta-3'
HC5381F(配列番号31):5'-ggtcattgtg ggcaggatca t-3'
HC5692S(配列番号32):5'-ctgcctggaa accccgcgat-3'
HC5858F(配列番号33):5'-tggcagcata ggccttggga aggt-3'
HC6315F(配列番号34):5'-aagacctggc tccagtccaa g-3'
5A-1(配列番号35):5'-ttccatgctc accgacccct c-3'
HC7090S(配列番号36):5'-gtggagtcag agaataaggt-3'
HC7743F(配列番号37):5'-cagaagaagg tcacctttga c-3'
HC8192S(配列番号38):5'-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3'
HC8939F(配列番号39):5'-ctacggggcc tgttactcca ttgaac-3'
C型肝炎ウイルスTPF1株の全長のポリヌクレオチドを、pBluescriptIISK(+)のT7RNAプロモーター配列の下流に挿入した(以下、pTPF1と称する)。
1.HCV NS2 protease領域内への変異導入
pTPF1/4B遺伝子を鋳型として、AgeIプライマー5'-accggtgagtacaccggaattgccaggacg-3'(配列番号40)およびFseIプライマー5'-atttgggtgattgggcccttcgggccggcc-3'(配列番号41)の存在下で、Takara LA Taq DNA polymerase(宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、4分間からなる20回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を行うことにより、TPF1/4BゲノムのNS2 protease領域近傍を増幅した。
1において作製したアミノ酸変異を有するpTPF1−M及び変異を引き起こす配列を有しないpTPF1/4Bを制限酵素XbaIで切断したものを鋳型に、Megascript T7 kit(Ambion)またはAmpliScribe T7−Flash transcription kit(Epicentre)を用いてRNAを合成した。メーカーの推奨する方法にてRNAを精製した。
2において培養上清中に分泌されたコア抗原およびHCV RNAがウイルス粒子を形成し、in vitroにおいて再感染可能か検討した。具体的には、pTPF1−MおよびpTPF1/4B遺伝子より合成された完全長HCV RNAをHuh7細胞にトランスフェクションし、経時的に培養上清を回収した。回収した培養上清は、15,000rpmで10分間遠心後、フィルター濾過(0.45μm、Millipore)を行い破砕した細胞等を除去した。
ヒト肝がん細胞(Huh7、JCRB0403)を限界希釈法によりモノクローン化し、ALS32細胞を新規に樹立した。ALS32細胞におけるpTPF1-Mの増殖性能について、エレクトロポレーション法を用い評価を行った。
4において培養上清中に分泌されたコア抗原およびHCV RNAがウイルス粒子を形成し、in vitroにおいて再感染可能か検討した。具体的には、pTPF1−M遺伝子より合成された完全長HCV RNAをALS32細胞及びHuh7細胞/JCRB0403にトランスフェクションし、経時的に培養上清を回収した。回収した培養上清は、15,000rpmで10分間遠心後、フィルター濾過(0.45μm、Millipore)を行い破砕した細胞等を除去した。
Claims (8)
- C型肝炎ウイルスの遺伝子であって、それがコードする979番目のアミノ酸がトレオニンであり、1804番目のアミノ酸がロイシンであり、1966番目のアミノ酸がリジンであり、前記遺伝子がコードするアミノ酸配列が配列番号2に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列と95%以上の配列同一性を有し、複製能及び感染能を有するC型肝炎ウイルスを構成するアミノ酸配列であるC型肝炎ウイルス遺伝子。
- 前記遺伝子がコードするアミノ酸配列が配列番号2に示されるアミノ酸配列である請求項1記載の遺伝子。
- その塩基配列が、配列番号1に示される塩基配列(ただしtはuでもよい)又は該配列と90%以上の配列同一性を有する塩基配列である請求項1記載の遺伝子。
- その塩基配列が、配列番号1に示される塩基配列(ただしtはuでもよい)である請求項3記載の遺伝子。
- 遺伝子型が1b型である請求項1〜4のいずれか1項に記載の遺伝子。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子を持つRNAレプリコン。
- 請求項6記載のRNAレプリコンが感染し、C型肝炎ウイルスを複製する細胞。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺伝子を持つC型肝炎ウイルス粒子。
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