ES2346326T3 - Construccion acidos nucleicos que contiene genoma longitud completa del virus hepatitis c humana; celula replicante genoma longitud completa virus recombinante que tiene construccion acidos nucleicos transferida al anterior y procedimiento construir particulas viricas hepatitis c. - Google Patents

Construccion acidos nucleicos que contiene genoma longitud completa del virus hepatitis c humana; celula replicante genoma longitud completa virus recombinante que tiene construccion acidos nucleicos transferida al anterior y procedimiento construir particulas viricas hepatitis c. Download PDF

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Abstract

Un replicón de ARN, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una región 5' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 1, una secuencia de codificación de una proteína núcleo que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2, una secuencia de codificación de la proteína E1 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 3, una secuencia de codificación de la proteína E2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 4, una secuencia de codificación de la proteína NS2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 5, una secuencia de codificación de la proteína NS3 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 6, una secuencia de codificación de la proteína NS4A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 7, una secuencia de codificación de la proteína NS4B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 8, una secuencia de codificación de la proteína NS5A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 9, una secuencia de codificación de la proteína NS5B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 10, una región 3' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 11, al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y al menos una secuencia IRES, en el que dicho al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y dicha al menos una secuencia IRES se colocan entre la región 5' no traducida y la secuencia de codificación de la proteína núcleo en este orden en la dirección 5' a 3', en el que dicho replicón de ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.

Description

Construcción de ácidos nucleicos que contiene el genoma de longitud completa del virus de la hepatitis C humana; célula replicante del genoma de longitud completa de virus recombinante que tiene la construcción de ácidos nucleicos transferida al anterior y procedimiento para construir partículas víricas de la hepatitis C.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un replicón de ARN que comprende una secuencia de nucleótidos específica, al menos un gen marcador y/o al menos un gen indicador seleccionables, un procedimiento para producir una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus para cribar una sustancia contra el virus de la hepatitis C, una vacuna de la hepatitis C, un procedimiento para producir una vacuna de la hepatitis C, un procedimiento in vitro para producir partículas del virus de la hepatitis C y el uso de las partículas del virus de la hepatitis C producidas.
Antecedentes de la técnica
El virus de la hepatitis C (VHC) pertenece a la familia Flaviviridae y es un virus que tiene un genoma de ARN de sentido directo (+) de cadena única y es conocido por producir la hepatitis C.
El VHC produce hepatitis crónica por infección persistente. Actualmente, la principal causa de hepatitis crónica observada mundialmente es la infección persistente por VHC. En la actualidad, alrededor del 50% de individuos con infección persistente desarrolla hepatitis crónica. La hepatitis crónica en aproximadamente un 20% de estos pacientes evoluciona a cirrosis hepática en el curso de 10 a 20 años, y algunos de estos pacientes experimentan adicionalmente condiciones patológicas letales avanzadas tales como cáncer hepático.
La hepatitis C se trata actualmente principalmente mediante terapia usando interferón-\alpha o interferón-\beta, o una terapia que usa una combinación de interferón-\alpha y ribavirina, un derivado nucleósido de purina. Sin embargo incluso cuando se llevan a cabo estas terapias, se observan efectos terapéuticos en solo un 60% de los pacientes tratados. Cuando cesan las terapias después que se observan los efectos, se recrudece la enfermedad en más de la mitad de los pacientes.
Es una importante meta desarrollar agentes terapéuticos o agentes profilácticos eficaces contra la hepatitis C. La tasa de incidencia de la hepatitis C, que produce finalmente graves consecuencias, es elevada en países industriales, y no está actualmente disponible un tratamiento causal. Por tanto, se desea el desarrollo de terapias específicas de VHC y terapias de vacunas. Un objetivo para el desarrollo de un agente dirigido contra el VHC puede ser la supresión de la replicación de VHC o la supresión de la infección de las células con VHC.
Recientemente, se han preparado sistemas de replicones de ARN subgenómico de VHC, en forma de ARN replicable autónomamente derivado de VHC (véanse, los Documentos de Patente 1,2 y 3, los Documentos No de Patente 1-4). En los sistemas de replicones de ARN subgenómico de VHC, el replicón de ARN de VHC en el que se eliminan y sustituyen los genes estructurales del genoma de VHC con un gen marcador seleccionable de fármaco, se prepara e introduce en células cultivadas, y por tanto, el replicón de ARN se replica autónomamente en las células. Usando estos sistemas llega a ser posible analizar el mecanismo de replicación de VHC. Sin embargo, este es un sistema experimental en el que únicamente se evalúa la replicación del ARN vírico en el proceso de la proliferación y la replicación del virus VHC, y no se puede analizar el proceso de formación de las partículas del virus VHC en las células infectadas y la liberación extracelular de la infección en otras células.
En la actualidad, se puede evaluar únicamente el proceso de formación de partículas del virus VHC y la liberación extracelular así como la infección en otras células en los sistemas experimentales que usan animales tales como chimpancés (Documento No de Patente 5). Sin embargo, los sistemas experimentales que usan organismos vivos tales como animales son complicados y muy difíciles de analizar. Por tanto, con el fin de analizar el proceso de formación de partículas del virus VHC y la liberación extracelular, así como la infección en otras células, y para producir un agente dirigido contra VHC que tendrá el mecanismo de acción de inhibir este proceso, es necesario establecer un sistema experimental muy simplificado que reproduzca este proceso, es decir, un sistema de producción de partículas del virus VHC en sistemas experimentales de cultivo celular.
Adicionalmente, una vez que se pueden proporcionar de manera estable partículas del virus VHC usando el sistema de cultivo celular, es posible atenuar el virus o producir virus VHC no infeccioso usando técnicas de biología molecular, y se pueden usar éstas en vacunas.
Documento de Patente 1: Publicación de patente japonesa (kokai) Nº 2001-17187
Documento de Patente 2: Solicitud de Patente Internacional PCT/JP03/15038
Documento de Patente 3: Solicitud de Patente japonesa Nº 2003-329082
Documento No de Patente 1: Lohmann y col., Science, (1999) 285, p. 110-113
Documento No de Patente 2: Blight y col., Science, (2000) 290, p 1972-1974
Documento No de Patente 3: Friebe y col., J. Virol., (2001) 75(24): p. 12047-12057
Documento No de Patente 4: Ikeda y col., Science, (1977) 277, p. 2997-3006
Documento No de Patente 5: Kolykhalov y col., Science, (1977) 277, p. 570-574
Documento No de Patente 6: Kato y col., Gastroenterology, (2003) 125, p. 1808-1817
Documento No de Patente 7: Yanagi y col., Proc. Natl. Acad. Sci., (1997) 96(16): p. 8738-8743
Documento No de Patente 8: Okamoto y col., J. Gen. Virol. (1991) 73, p. 2697-26704
Documento No de Patente 9: Aoyagi y col., J. Clin. Microbiol., (1999) 37(6); p. 1802-1808
Divulgación de la invención
El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para replicar eficazmente el ARN que contiene las secuencias genómicas del VHC de longitud completa y un procedimiento para producir partículas del virus VHC que contengan el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa en un sistema de cultivo celular. El objetivo de la presente invención no se ha conseguido nunca hasta el momento.
Como resultado de intensos estudios para conseguir el anterior objeto, los presentes inventores han desarrollado un procedimiento para producir partículas del virus VHC en un sistema de cultivo celular. Esto es, la presente invención proporciona un replicón de ARN de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 y 3. En las reivindicaciones 4 a 13 se definen las materias sujeto de la presente invención.
[1]
Un replicón de ARN, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una región 5' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 1, una secuencia de codificación de una proteína núcleo que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2, una secuencia de codificación de la proteína E1 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 3, una secuencia de codificación de la proteína E2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 4, una secuencia de codificación de la proteína NS2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 5, una secuencia de codificación de la proteína NS3 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 6, una secuencia de codificación de la proteína NS4A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 7, una secuencia de codificación de la proteína NS4B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 8, una secuencia de codificación de la proteína NS5A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 9, una secuencia de codificación de la proteína NS5B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 10, una región 3' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 11, al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y al menos una secuencia IRES, en el que dicho al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y dicha al menos una secuencia IRES se colocan entre la región 5' no traducida y la secuencia de codificación de la proteína núcleo en este orden en la dirección 5' a 3', en el que dicho replicón de ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus,
[2]
En el replicón de ARN de acuerdo con [1], la secuencia de nucleótidos comprende la región 5' no traducida, el al menos un gen marcador seleccionable y/o el al menos un gen indicador, y la al menos una secuencia IRES, y la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NS5A, la secuencia de codificación de la proteína NS5B, y la región 3' no traducida en este orden en la dirección 5' a 3'.
\quad
En un ejemplo de un replicón de ARN, el ARN genómico del virus de la hepatitis C de genotipo 2a es un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 12.
[3]
El replicón de ARN de acuerdo con [1], que comprende el ARN (a) o (b) siguiente:
(a)
un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 13; o
(b)
un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 13 mediante delección, sustitución o adición de 1 a 100 nucleótidos, en el que dicho replicón de ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.
[4]
un procedimiento para producir una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, que comprende introducir el replicón de ARN de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3] en una célula.
\quad
Para este procedimiento la célula es preferiblemente una célula proliferativa. Para este procedimiento la célula es también o preferiblemente de otra manera una célula eucariota.
[5]
Una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, que comprende el replicón d ARN de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3].
[6]
La célula de acuerdo con [5], en la que la célula es una células derivada de hígado humano, una célula derivada de cuello uterino humano o una célula derivad de riñón fetal humano.
[7]
La célula de acuerdo con [5], en la que la célula es una célula Huh7, una célula hepG2, una célula IMY-N9, una célula HeLa o una célula 293.
[8]
Un procedimiento para producir una partícula del virus de la hepatitis C, que comprende cultivar la célula de acuerdo con uno cualquiera de [5] a [7] para dejar a la célula producir la partícula de virus.
[9]
Una partícula de virus de la hepatitis C que comprende el replicón de ARN de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3].
[10]
Un procedimiento par cribar una sustancia dirigida contra el virus de la hepatitis C, que comprende cultivar, en presencia de una sustancia de ensayo, al menos una seleccionada entre el grupo constituido por (a) y (b) siguientes:
(a)
la célula de acuerdo con [5] a [7], y
(b)
la partícula de virus de la hepatitis C de acuerdo con [9] y la célula permisiva al virus de la hepatitis C;
\quad
y detectar el replicón de ARN o las partículas de virus en el cultivo resultante.
[11]
Una vacuna de la hepatitis C, que comprende la partícula del virus de la hepatitis C de acuerdo con [9] o una pare de la misma.
[12]
Un procedimiento para producir una vacuna de la hepatitis C de acuerdo con [9] o una parte de la misma como un antígeno.
[13]
Uso del replicón de ARN de acuerdo con uno cualquiera [1] a [3] en la producción de partículas del virus de la hepatitis C en células cultivadas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una vista esquemática que muestra los procedimientos para construir una plantilla de ADN para preparar el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa. La parte superior de la Figura 1 muestra la estructura de un clon del plásmido pJFH1, que se produce insertando el genoma del VHC de longitud completa en la dirección 3' del promotor T7. La parte inferior de la Figura 1 muestra la estructura del clon del plásmido pFGREP-JFH1 de acuerdo con la invención, que comprende la secuencia genómica del VHC de longitud completa, en la que se inserta un fragmento de ADN que contiene el gen de resistencia a la neomicina y el IRES de EMCV en la dirección 3' del promotor T7 de pJFH1 y en la región 5' no traducida. Los términos que se muestran en la figura son como sigue. T7: promotor T7 del ARN, 5' UTR: región 5' no traducida, C: proteína núcleo, E1, E2: proteínas de la envoltura. NS2, NS3, NS4A, NS4B, 4A, 4B: proteínas no estructurales. 3' UTR: región 3' no traducida AgeI, PmeI, XbaI: emplazamientos de restricción de los enzimas de restricción AgeI, PmeI y XbaI. GDD: El emplazamiento del motivo GDD de los aminoácidos que corresponde al centro activo de la proteína NS5B. neo: el gen resistente a la neomicina. IRES de EMCV: emplazamiento de entrada ribosómica interna del virus de la encefalomiocarditis;
La Figura 2 es una fotografía que muestra el resultado de un análisis de transferencia Northern que muestra la replicación de rJFH-1 en células Huh7 en las que se ha introducido rJFH-1, el ARN genómico del VHC de longitud completa;
La Figura 3 muestra el resultado de la cuantificación de la proteína núcleo de VHC en el medio de cultivo. El círculo abierto representa las células en las que se ha introducido rJFH1, y el círculo cerrado representa las células en las que se ha introducido rJFH1/GND;
La Figura 4 es una gráfica que muestra las cantidades de proteína núcleo de VHC y en ARN genómico de VHC de longitud completa, y los pesos específicos de cada una de las fracciones que se recogieron mediante fraccionamiento del sobrenadante del cultivo de las células Huh7 introducidas en rJFH1 mediante el gradiente de densidad de la sacarosa. El círculo cerrado, el círculo abierto y el círculo sombreado representan la proteína del núcleo de VHC, el ARN genómico del VHC de longitud completa y el peso específico, respectivamente;
La Figura 5 es un fotografía que muestra la formación de colonias de células Huh7 en las que se transfectó rFGREP-JFH1, el replicón de ARN de VHC de longitud completa;
La Figura 6 es una fotografía que muestra la replicación del replicón de ARN del VHC de longitud completa en el clon de célula replicante del ARN del replicón de VHC de longitud completa, que se ha establecido transfectando rFGREP-JFH1 en células Huh7;
La Figura 7 es una fotografía que muestra el resultado de la amplificación de la PCR usando el ADN genómico de la células huésped como plantilla y los cebadores específicos para el gen resistente a la neomicina, para confirmar la integración del gen de resistencia a la neomicina en el ADN genómico. M: marcador de tamaño del ADN, P: control positivo, N: células Huh7;
La Figura 8 es una fotografía que muestra el resultado de un análisis de transferencia Western que demuestra la expresión de la proteína núcleo en células Huh7 en las que se ha introducido rFGREP-JFH1, el replicón de ARN del VHC de longitud completa;
La Figura 9 es una fotografía que muestra el resultado de un análisis de transferencia Western que demuestra la expresión de la proteína NS3 en células Huh7 en las que se ha introducido rFGREP-JFH1, el replicón de ARN del VHC de longitud completa;
La Figura 10 es una fotografía que muestra el resultado de un análisis de transferencia Western que demuestra la expresión de la proteína NS5A en células Huh7 en las que se ha introducido tFGREP-JFH1, el replicón de ARN del VHC de longitud completa;
La Figura 11 es una gráfica que muestra las cantidades de proteína núcleo de VHC y del replicón de ARN del VHC de longitud completa, y los pesos específicos para cada una de las fracciones que se recogieron mediante fraccionamiento del sobrenadante del cultivo de células Huh7 introducido en rFGREP-JFH1 mediante el gradiente de densidad de la sacarosa. El círculo cerrado, el círculo abierto y el círculo sombreado representan la proteína núcleo del VHC, el replicón de ARN del VHC de longitud completa y el peso específico, respectivamente; y
La Figura 12 es una fotografía que muestra la formación de colonias de células Huh7 en las que se han añadido partículas de virus en el sobrenadante del cultivo de la célula replicante del replicón de ARN del VHC de longitud completa.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se explica en detalle como sigue.
1. Replicón de ARN del VHC de longitud completa
El genoma del virus de la hepatitis C (VHC) es un ARN de sentido directo (+) de cadena única que comprende aproximadamente 9600 nucleótidos. Este ARN genómico comprende la región 5' no traducida (denotada también como 5' NTR o 5' UTR), una región traducida compuesta por una región estructural y una región no estructural, y la región 3' no traducida (denotada también como 3' NTR o 3' UTR). Las proteínas estructurales de VHC están codificadas en la región estructural y una pluralidad de proteínas no estructurales está codificadas en la región no estructural.
Dichas proteínas estructurales de VHC (núcleo, E1 y E2) y no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B) se generan en primer lugar traduciendo la región traducida en una poliproteína continua única y a continuación, liberando ésta mediante escisión restringida de la poliproteína por las proteasas. Entre estas proteínas estructurales y proteínas no estructurales (esto es, proteínas víricas de VHC), el núcleo es una proteína núcleo, E1 y E2 son proteínas de la envoltura. Las proteínas no estructurales son proteínas implicadas en la propia replicación vírica, y se sabe que NS2 tiene actividad metaloproteasa, y se sabe que NS3 tiene actividad serina proteasa (en un tercio del N terminal lateral) y actividad helicasa (en dos tercios del C terminal lateral). Además NS4A es un cofactor para la actividad de la proteasa de NS3, y se ha informado que NS5B tiene actividad ARN polimerasa dependiente de ARN.
Los presentes inventores construyeron un replicón de ARN que tenía capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus, usando el ARN genómico.
La capacidad de replicación autónoma que tiene el ARN, que se ha producido modificando el ARN genómico de VHC se denomina "ARN del replicón" o "replicón de ARN" en el presente documento. En la presente memoria, el replicón de ARN derivado de VHC puede denominarse también replicón de ARN de VHC. El replicón de ARN de la presente invención que comprende el ARN genómico del VHC de longitud completa se denomina "replicón de ARN del VHC de longitud completa" en el presente documento. El replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención tiene capacidad de producir partículas de virus.
El replicón de ARN del VHC de longitud completa en la presente invención, el virus de la hepatitis C es un virus de la hepatitis C de genotipo 2a. En la presente invención, "el virus de la hepatitis C de genotipo 2a" o el "genotipo 2a de VJC" significa un virus de la hepatitis identificado como el genotipo 2a de acuerdo con la clasificación internacional de Simmonds y col. (véase Simmons, P. y col, Hepatology, (1994) 10, p. 1321-1324) En la presente invención, "genotipo 2a del virus de la hepatitis C" o "genotipo 2a de VHC" incluye no solo el virus que tiene el ARN genómico del VHC que se produce naturalmente sino también el virus que tiene un ARN genómico en el que la secuencia genómica del VHC que se produce naturalmente está modificada artificialmente. Un ejemplo particular del genotipo 2a de VHC incluye la cepa JFH-1 (véase la Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 2002-171978).
En la presente memoria, "el ARN genómico del virus de la hepatitis C" significa el ARN que comprende la secuencia de nucleótidos de la región completa del genoma de ARN de sentido directo (+) de cadena única del virus de la hepatitis C, el ARN genómico del virus de la hepatitis C de genotipo 2a es, pero sin limitarse a, preferiblemente al ARN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 12.
Un ejemplo de replicón de ARN del VHC de longitud completa es un replicón de ARN que comprende la secuencia de nucleótidos que comprende una región 5' no traducida, una secuencia de codificación de la proteína núcleo, una secuencia de codificación de la proteína E1, una secuencia de codificación de la proteína E2, una secuencia de codificación de la proteína NS2, una secuencia de codificación de la proteína NS3, una secuencia de codificación de la proteína NS4A, una secuencia de codificación de la proteína NS4B, una secuencia de codificación de la proteína NS5A, una secuencia de codificación de la proteína NS5B, y una región 3' no traducida, al menos un gen marcador seleccionable o gen indicador, y al menos una secuencia IRES.
Preferiblemente, el replicón de ARN del VHC de longitud completa de acuerdo con la presente invención comprende: la región 5' no traducida, al menos un gen marcador seleccionable o gen indicador, al menos una secuencia IRES, la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NS5A, la secuencia de codificación de la proteína NS5B, y la región 3' no traducida, en este orden en la dirección 5' a 3'.
En la memoria de la presente solicitud, "región 5' no traducida" (5' NTR o 5' UTR), "secuencia de codificación de la proteína núcleo" (región núcleo o región C), "secuencia de codificación de la proteína E1" (región E1), "secuencia de codificación de la proteína E2" (región E2), "secuencia de codificación de la proteína NS2" (región NS2), "secuencia de codificación de la proteína NS3" (región NS3), "secuencia de codificación de la proteína NS4A" (región NS4A), "secuencia de codificación de la proteína NS4B" (región NS4B), "secuencia de codificación de la proteína NS5A" (región NS5A), "secuencia de codificación de la proteína NS5B" (región NS5B) y "región 3' no traducida" (3' NTR o 3' UTR), y otras regiones o emplazamientos específicos tal como se definen basándose en el ARN genómico de longitud completa (SEC DE ID Nº: 12) comprenden la región completa del genoma de la cepa JFH-1 (Publicación de Patente Japonesa (kokai) Nº 2002-17978), que es un virus VHC de genotipo 2a.
Una región o emplazamiento parcial en el genoma del virus de la hepatitis C (VHC) de acuerdo con la presente invención, se define basándose en las secuencias que se muestran en las SE DE ID N^{os}: 1-11 que son secuencias parciales de nucleótidos del ARN genómico de la cepa JFH-1 (SEC DE ID Nº: 12). La "región 5' no traducida" del ARN genómico de longitud completa de la cepa JFH-1 (derivada del clon JFH-1; SEC DE ID Nº: 12) comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 1. La "secuencia de codificación de la proteína núcleo" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2. La "secuencia de codificación de la proteína E1" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID nº: 3. La "secuencia de codificación de la proteína E2" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 4. La "secuencia de codificación de la proteína NS2" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 5. La "secuencia de codificación de la proteína NS3" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 6. La "secuencia de codificación de la proteína NS4A" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 7. La "secuencia de codificación de la proteína NS4B" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 8. La "secuencia de codificación de la proteína NS5A" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 9. La "secuencia de codificación de la proteína NS5B" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 10. La "región 3' no traducida" comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 11.
Se puede definir por ejemplo, una región o emplazamiento de la secuencia de ARN derivada de VHC mediante los números de nucleótidos en el interior de las secuencias de nucleótidos de las SEC DE ID N^{os} 1-12 que se determinan mediante la alineación de la secuencia de ARN y de las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC DE ID N^{os} 1-12. En la alineación, puede estar presente un hueco, adición, delección, sustitución y similar.
De acuerdo con la presente invención, la región 5' no traducida, la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NS5A, la secuencia de codificación de la proteína NS5B, y la región 3' no traducida, que están contenidas en el replicón de ARN del VHC de longitud completa, comprende preferiblemente las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC DE ID N^{os} 1-11, respectivamente.
Un ejemplo de replicón de ARN del VHC de longitud completa es un replicón de ARN que comprende las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEC DE ID N^{os} 1-11, al menos un gen marcador y/o gen indicador, y al menos una secuencia IRES.
"Gen marcador seleccionable" en la presente invención significa un gen que confiere capacidad de selección a una célula de tal manera que se puede seleccionar únicamente la célula que expresa el gen. Los ejemplos de gen marcador seleccionable preferidos en la presente invención incluyen un gen de resistencia a la neomicina, un gen de la timidina quinasa, un gen de resistencia a la kanamicina, un gen de resistencia a la piritiamina, un gen de la adenilil transferasa, un gen de resistencia a la Zeocina y un gen de resistencia a la puromicina. Se prefieren el gen de resistencia a la neomicina y el gen de la timidina quinasa, y se prefiere más el gen de resistencia a la neomicina. Sin embargo, el gen marcador seleccionable en la presente invención no se limita a estos genes.
Además, en la presente invención, "gen indicador" significa un gen marcador que codifica un producto génico que puede actuar como un indicador de la expresión del gen. Los ejemplos generales de gen indicador incluyen genes estructurales de enzimas que catalizan la reacción de emisión de luz o la reacción de color. Los ejemplos preferidos del gen indicador en la presente invención incluyen el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa derivado del transposón Tn9, el gen de la \beta-glucuronidasa o el gen de la \beta-galactosidasa derivado de Escherichia coli, el gen de la luciferasa, un gen de la proteína fluorescente verde, el gen de la aecuorina de medusa, y el gen de la fosfatasa alcalina placental segregada (SEAP). Sin embargo, el gen indicador en la presente invención no se limita a estos genes.
Tanto uno únicamente como ambos del anterior gen seleccionable y gen indicador puede estar contenido en un replicón de ARN de longitud completa. Pueden estar presentes uno o más de los genes marcadores seleccionables o genes indicadores en un replicón de ARN del VHC de longitud completa.
En la presente invención, "secuencia IRES" significa un emplazamiento interno de entrada al ribosoma que permite que se inicie la traducción mediante la unión de los ribosomas dentro del interior del ARN. Los ejemplos preferidos de secuencia IRES en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, IRES de EMCV (el el emplazamiento interno de entrada al ribosoma del virus de la encefalomiocarditis), el IRES de FMDV y el IRES DE VHC. Se prefieren más el IRES de EMCV y el IRES de VHC, y la secuencia más preferida es el IRES de EMCV.
Una forma de realización aún más preferida de un replicón de ARN del VHC de longitud completa de acuerdo con la presente invención es un ARN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 13. Además, un replicón de ARN que comprende una secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID nº: 13 mediante delección, sustitución o adición de 1-10, preferiblemente 1-30, más preferiblemente 1-10, aún más preferiblemente 1-6, y los más preferible uno a algunos (2-5) nucleótidos en la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 13 y que tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus, es una forma de realización del replicón de ARN del VHC de longitud completa y está incluida también en el alcance de la presente invención.
El replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención puede contener también un ARN que codifica un gen extraño opcional que se va a expresar en el interior de una célula en la que se introduce el replicón de ARN de longitud completa, El ARN que codifica el gen extraño, puede estar también unido en la dirección 3' de la región 5' no traducida o unido en la dirección 5' o en la dirección 3' de un gen marcador o un gen indicador seleccionable, o unido en la dirección 5' de la región 3' no traducida. Se puede insertar el ARN que codifica el gen extraño en cualquier emplazamiento entre la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NS5A y la secuencia de codificación de la proteína NS5B.
El replicón de ARN del VHC de longitud completa que contiene el ARN que codifica el gen extraño puede expresar un producto génico codificado por el gen extraño cuando se traduce en el interior de una célula en la que se introduce el ARN. De esta manera, el replicón de ARN del VHC de longitud completa que contiene el ARN que codifica el gen extraño se puede usar también apropiadamente para producir un producto génico del gen extraño en el interior de una célula.
El replicón de ARN del VHC de longitud completa de acuerdo con la presente invención puede contener adicionalmente una ribozima. Una ribozima se une en la dirección 3' de un gen marcador y/o un gen marcador seleccionables de tal manera que el gen marcador y/o el gen marcador seleccionables se pueden cortar mediante la actividad de autoescisión de una ribozima a partir de la secuencia IRES, la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NS5A y la secuencia de codificación de la proteína NS5B, y la región 3' no traducida.
En el replicón de ARN del VHC de longitud completa de acuerdo con la presente invención, el gen marcador y/o el gen indicador seleccionables anteriormente descritos, las proteínas víricas que codifican las secuencias, y el gen extraño, la ribozima o similar, se unen de tal manera que se traducen a partir del ARN del replicón de VHC de longitud completa en el marco de lectura correcto. Entre estas secuencias, las proteínas codificadas por le replicón de ARN de longitud completa se conectan preferiblemente a cada uno de los otros emplazamientos de escisión mediante la proteasa y similares, de tal manera que, las proteínas se traducen o expresan como una poliproteína, seguido por la escisión mediante la proteasa en cada proteína.
La presente invención es también útil para proporcionar un vector de ADN, preferiblemente un vector de expresión, que codifica el replicón de ARN de la presente invención.
En la presente invención "capacidad de replicación autónoma" del ARN significa que el ARN es capaz de crecer autónomamente cuando se introduce en la célula. Se puede confirmar la capacidad de replicación autónoma del ARN mediante el siguiente procedimiento aunque no está limitada. Se transfectan células Huh7 con el ARN de interés y se cultivan. Se extrae el ARN a partir de las células cultivadas resultantes y se somete a hibridación de transferencia Northern usando una sonda capaz de detectar específicamente el ARN introducido. La detección del ARN de interés confirma la replicación autónoma. Se ilustran ejemplos del procedimiento particular para confirmar la capacidad de replicación autónoma en las descripciones acerca del ensayo de capacidad de formación de colonias, confirmación de la expresión de la proteína del VHC, detección del replicón de ARN y similares en los Ejemplos de la presente memoria.
Además, en la presente invención, "capacidad de producción de partículas de virus" del ARN significa que se generan partículas de virus en una célula cuando se introduce el ARN en la célula (por ejemplo, células cultivadas tales como células Huh7). Se puede confirmar la capacidad de producción de las partículas de virus, por ejemplo, aplicando la detección mediante el procedimiento de la PCR-RT usando cebadores específicos para el ARN en el sobrenadante del cultivo de las células en las que se ha introducido el ARN. Se puede confirmar esto también sometiendo el sobrenadante del cultivo al procedimiento del gradiente de densidad de la sacarosa para separar las partículas de virus y detectar la proteína del VHC. Se ilustran ejemplos del procedimiento particular en las descripciones acerca del ensayo de la capacidad de formación de colonias, confirmación de la expresión de la proteína del VHC, detección del replicón de ARN y similares en los Ejemplos de la presente memoria.
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2. Preparación del replicón de ARN del VHC de longitud completa
Las personas expertas en la técnica pueden preparar el replicón d ARN del VHC de longitud completa de acuerdo con la presente invención usando técnicas de ingeniería genética. El replicón de ARN del VHC de longitud completa se prepara usando la cepa JFH-1 como virus de la hepatitis C de genotipo 2a mediante el siguiente procedimiento.
En primer lugar, se reconstruyó de manera rutinaria el ADN que correspondía a la región completa del ARN genómico de la cepa JFH-1 (SEC DE ID Nº: 12, se registró esta secuencia en un banco de datos internacional de ADN con el nº de acceso AB047639) y se insertó en la dirección 3' de un promotor de ARN con el fin de preparar un clon de ADN. Tal como se usa en el presente documento, "ADN que corresponde a ARN" significa un ADN que tiene una secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos del ARN sustituyendo U (uracilo) con T (timina). El promotor de ARN anterior está contenido preferiblemente en un clon de plásmido. Un ejemplo del promotor de ARN preferido no se limita, pero incluye el promotor de ARN T7, el promotor de ARN SP6 y el promotor de ARN SP3, y se prefiere particularmente el promotor de ARN T7.
A continuación, el gen marcador y/o el gen indicador seleccionables, y el ADN que codifica la secuencia IRES se insertan en el clon de ADN descrito anteriormente. El gen marcador y/o el gen indicador seleccionables en la dirección 3' de la región no traducida 5' y la secuencia IRES adicionalmente en la dirección 3'.
Posteriormente, usando el clon de ADN preparado tal como anteriormente como plantilla, se sintetizó el ARN usando ARN polimerasa. Se puede iniciar la síntesis del ARN mediante un procedimiento normalizado a partir de la región 5' no traducida. Cuando el clon de ADN es un clon de plásmido, se puede sintetizar el ARN usando el fragmento de ADN escindido del clon de plásmido con un enzima de restricción, tal como una plantilla. Adicionalmente, es preferible que el término 3' del ARN que se va a sintetizar tenga la misma secuencia que el término de la región 3' no traducida del ARN genómico vírico, y no se añadan o eliminen otras secuencias. El ARN sintetizado de esta manera es el replicón de ARN del VHC de longitud completa de acuerdo con la presente invención.
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3. Preparación de partículas de VHC
Se puede obtener una célula recombinante que puede replicar el replicón de ARN del VHC de longitud, preferiblemente replicar continuamente (es decir, que tiene una capacidad de replicación del replicón de ARN), introduciendo el replicón de ARN del VHC de longitud completa descrito anteriormente preparado tal como se ha descrito anteriormente en una célula. En esta memoria, una célula recombinante que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa se denomina como "célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa".
La célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa puede producir partículas de virus. Las partículas de virus producidas contienen el replicón de ARN del VHC de longitud completa en un armazón compuesto por las proteínas del virus VHC. De esta manera, las partículas de virus producidas por la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención son partículas de VHC. Esto es, en la presente invención, se pueden preparar partículas de VHC en un sistema de cultivo celular cultivando las células que replican el replicón de ARN del VHC de longitud completa. Preferiblemente, se pueden obtener las partículas de VHC cultivando las células que replican el replicón de ARN del VHC de longitud completa y recogiendo las partículas de virus generadas en el cultivo (preferiblemente el sobrenadante del cultivo).
Como alternativa comparativa, se pueden producir partículas de VHC por una célula recombinante que se obtiene introduciendo el ARN genómico del VHC de longitud completa en una célula. El ARN genómico del VHC de longitud completa se replica con eficacia elevada en la célula, en la que se introduce el ARN genómico del VHC de longitud completa de la presente invención (el ARN genómico del VHC de longitud completa derivado del clon JFH-1). En esta memoria, una célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa se denomina "célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa". Las células que replican el ARN genómico del VHC de longitud completa pueden producir partículas de virus. Las partículas de virus producidas por las células que replican el ARN genómico del VHC de longitud completa contienen el ARN genómico del VHC de longitud completa en un armazón compuesto por las proteínas del virus VHC. De esta manera, las partículas de virus producidas por la célula en la que se introduce el ARN genómico del VHC de longitud completa de la presente invención son partículas de VHC, No está limitado pero se prefiere que se puedan preparar partículas de VHC en un sistema de cultivo celular cultivando la célula en la que se introduce el ARN genómico del VHC de longitud completa derivado del clon JFH-1. Por ejemplo, se pueden obtener partículas de VHC cultivando las células en las que se introduce el ARN genómico del VHC de longitud completa y recogiendo las partículas de virus generadas en el cultivo (preferiblemente el sobrenadante del cultivo).
Para una célula en la que se ha introducido el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa, descrito anteriormente, se puede usar cualquier célula, siempre que se pueda subcultivar. Dicha célula es preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula humana, y aún más preferiblemente una célula derivada de hígado, una célula derivada de cuello uterino humano o una célula derivada de riñón fetal humano. Se pueden usar preferiblemente células proliferativas que incluyen líneas de célula cancerosas, líneas de citoblastos y células similares, y se usan más preferiblemente células Huh7, células HepG2, células HeLa y células 293 y similares. Para estas células, se pueden usar células comercialmente disponibles, se pueden obtener estas células de depositarios de células, o se pueden usar también líneas celulares establecidas de cualquier célula (por ejemplo, células cancerosas o citoblastos).
Se puede conseguir la introducción del replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico de longitud completa en la células usando cualquier técnica conocida por las personas expertas en la técnica. Los ejemplos de dicho procedimiento de introducción incluyen electroporación, procedimiento del cañón de partículas, procedimiento de lipofección, procedimiento del fosfato de calcio, procedimiento de microinyección, procedimiento de DEAE Sefarosa y similares. Se prefiere particularmente el procedimiento que usa la electroporación.
Se puede introducir el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa solo, o se puede introducir tras mezclarse con otros ácidos nucleicos. Para variar la cantidad del replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa, manteniendo a l vez la cantidad de ARN que se va a introducir, se mezcla con el ARN celular total extraído de las células, en las cuales se introduce el ARN, para llevar la cantidad total de ARN hasta un determinado nivel, y a continuación se usa la mezcla para la introducción en las células. Se puede determinar la cantidad de replicón de ARN que se va a usar para introducir en las células de acuerdo con el procedimiento de introducción empleado, y está preferiblemente entre 1 picogramo y 100 microgramos, y más preferiblemente entre 10 picogramos y 10 microgramos.
Se pueden seleccionar las células que replican el replicón de ARN del VHC de longitud completa utilizando la expresión del gen marcador o del gen indicador seleccionables en el interior del replicón de ARN del VHC de longitud completa. Específicamente, se pueden cultivar, por ejemplo, dichas células sometidas al tratamiento de introducción celular del replicón de ARN del VHC de longitud completa en un medio, en el que se pueden seleccionar las células debido a la expresión del gen marcador seleccionable. Alternativamente, tras cultivar las células sometidas al tratamiento de introducción celular del replicón de ARN del VHC de longitud completa, se puede detectar la expresión del gen indicador (por ejemplo, la proteína fluorescente).
Como ejemplo, cuando el replicón de ARN del VHC de longitud completa contiene un gen de resistencia a la neomicina como gen marcador seleccionable, las células sometidas al procedimiento de electroporación con el replicón de ARN del VHC de longitud completa, se siembran en una placa de cultivo. Tras cultivar 12 a 72 horas, preferiblemente 16 a 48 horas, se añade G418 (neomicina) a la placa de cultivo a una concentración de 0,05 miligramos/mililitro a 3,0 miligramos/mililitro. Se cultivan las células en continuo durante preferiblemente 10 días a 40 días y más preferiblemente 14 días a 28 días tras la siembra, cambiando a la vez el medio de cultivo dos veces a la semana, y se pueden seleccionar las células que están replicando el replicón de ARN del VHC de longitud completa como una colonia tiñendo las células viables con cristal violeta.
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Se pueden clonar las células a partir de la colonia formada mediante un procedimiento normalizado. El clon celular obtenido de esta manera que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa se denomina en esta memoria como "clon celular que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa". La célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención incluye el clon celular que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa.
Para la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa, se puede confirmar la replicación real del replicón de ARN del VHC de longitud completa en la célula o el clon celular detectando el replicón de ARN del VHC de longitud completa, confirmando que el gen marcador o indicador seleccionable del replicón de ARN del VHC de longitud completa no se integra en el ADN genómico del huésped y detectando además las proteínas del VHC.
Las personas expertas en la técnica pueden detectar el replicón de ARN del VHC de longitud completa que se ha replicado de acuerdo con cualquier procedimiento conocido de detección del ARN. Por ejemplo, se puede detectar el replicón de ARN del VHC de longitud completa en el ARN total extraído de la célula mediante el procedimiento de hibridación Northern usando como sonda un fragmento de ADN específico del replicón de ARN del VHC de longitud completa.
Además, se puede confirmar la ausencia de un gen marcador o gen indicador seleccionable integrado en el replicón de ARN del VHC de longitud completa en el ADN genómico del huésped mediante, pero sin limitarse a, por ejemplo, llevando a cabo la PCR del ADN genómico extraído de la célula para amplificar al menos una parte del gen marcador o el gen indicador seleccionable, y a continuación confirmando la ausencia del producto amplificado. Debido a que se considera que en la célula, para la cual se confirma el producto amplificado, se puede haber integrado el gen marcador o el gen indicador seleccionable en el genoma del huésped, es posible que el replicón de ARN del VHC de longitud completa no se replique por sí mismo. En este caso, se puede confirmar adicionalmente la replicación del ARN del VHC de longitud completa detectando las proteínas del VHC tal como se describe a continuación.
Se puede detectar una proteína del VHC, por ejemplo, haciendo reaccionar un anticuerpo frente a l proteína del VHC que se va a expresar a partir del replicón de ARN del VHC de longitud completa con las proteínas celulares extraídas. Las personas expertas en la técnica pueden llevar a cabo este procedimiento mediante cualquier procedimiento de detección conocido. Específicamente, se puede detectar la proteína del VHC mediante, por ejemplo, transferencia de una muestra de proteína extraída de la célula sobre una membrana de nitrocelulosa, haciendo reaccionar el anticuerpo dirigido contra la proteína del VHC (por ejemplo, un anticuerpo o antisuero específico contra NS3 recogido de un paciente con hepatitis C) con la membrana de nitrocelulosa y detectando el anticuerpo contra la proteína del VHC. Si se detecta la proteína del VHC entre las proteínas celulares extraídas, se puede concluir que esta célula replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa y expresa la proteína del VHC.
Las personas expertas en la técnica pueden confirmar la capacidad de producción de partículas de virus de las células que replican el replicón de ARN del VHC de longitud completa o de las células que replican el ARN genómico del VHC de longitud completa mediante cualquier procedimiento conocido de detección. Por ejemplo, el sobrenadante del cultivo de células que se sospecha que producen las partículas de virus se fracciona mediante el gradiente de densidad de la sacarosa, y se determinan la densidad de la fracción, la concentración de la proteína núcleo del VHC, y la cantidad del replicón de ARN del VHC de longitud completa para cada fracción. Como resultado, si el pico de la proteína núcleo coincide con el del replicón de ARN del VHC de longitud completa, y la densidad de la fracción que muestra los picos detectados (por ejemplo, 1,18-1,20 mg) es más pequeña que la densidad de la fracción equivalente que la obtenida mediante el fraccionamiento del sobrenadante del cultivo tratado con NP40 al 25% (polioxietileno (9) octilfenil éter) se puede considerar que las células tienen una capacidad de producción de partículas de virus.
Se pueden detectar las partículas de virus VHC liberadas en el sobrenadante del cultivo, usando, por ejemplo, frente a la proteína núcleo, la proteína E1 o la proteína E2. También, se puede detectar la presencia de partículas de virus indirectamente, amplificando y detectando el replicón de ARN del VHC de longitud completa en el sobrenadante del cultivo mediante el procedimiento de la PCR-RT usando cebadores específicos.
4. Infección de otra célula con las partículas del VHC de la presente invención
Las partículas del virus del VHC de la presente invención tienen capacidad para infectar una célula (preferiblemente una célula permisiva a VHC). La presente invención es también útil para proporcionar un procedimiento para producir una célula infectada por el virus de la hepatitis C que comprende cultivar la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa o la célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa, e infectar otra célula (preferiblemente una célula permisiva a VHC) con partículas de virus en el cultivo obtenido de esta manera (preferiblemente, el sobrenadante del cultivo) En la presente invención, célula permisiva a VHC significa una célula que es susceptible a VHC, y es preferiblemente, pero sin limitarse a, célula hepática o una célula de linaje linfoide. En particular, la célula hepática incluye un hepatocito primario, célula Huh7, célula HepG2, célula IMY-N9, célula HeLa, célula 203 y similares. La célula de linaje linfoide incluye, pero sin limitarse a, célula Molt4, célula HPB-Ma, célula Daudi y similar.
Cuando una célula (por ejemplo, una célula permisiva a VHC) se infecta con partículas de VHC producidas por la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención, el replicón de ARN del VHC de longitud completa se replica y se forman también partículas de virus en la célula infectada. Debido a que la célula infectada con partículas de virus generadas en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa expresa el gen marcador y/o el gen indicador seleccionables, se puede seleccionar y/o detectarse la célula infectada utilizando la expresión. Infectando una célula con partículas de virus generadas en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención, se replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa y además se pueden producir partículas de virus.
Más adicionalmente al infectar una célula (por ejemplo una célula permisiva a VHC9 con partículas de VHC generadas en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención, se replica el ARN genómico del VHC de longitud completa y se forman también partículas de virus en la célula infectada. Al infectar una célula con las partículas de virus generadas en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención, se replica el ARN genómico del VHC de longitud completa en la célula y además, se pueden producir partículas de virus.
Las partículas de virus VHC generadas en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa o en la célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa pueden infectar animales permisivos a VHC y similares e inducir hepatitis producida por el VHC anterior.
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5. Otras formas de realización de la presente invención
El replicón de ARN del VHC de longitud completa se replica con una eficacia elevada en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de la presente invención. También se replica el ARN genómico del VHC de longitud completa con una eficacia elevada en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención. De esta manera, se puede producir el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa con una eficacia elevada usando la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención o la célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa.
En la presente invención, se puede producir el replicón de ARN del VHC de longitud completa cultivando la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa, extrayendo ARN del cultivo (células cultivadas y/o medio de cultivo), sometiendo al ARN al procedimiento de electroforesis, y aislando y purificando el replicón de ARN del VHC de longitud completa. Se puede producir también el ARN genómico del VHC de longitud completa usando la célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa mediante procedimiento similar. El ARN producido de dicha manera comprende la secuencia genómica de longitud completa del virus de la hepatitis C. En este caso la secuencia genómica de longitud completa del virus de la hepatitis C está interrumpida por el gen marcador y/o el gen indicador seleccionables y la secuencia IRES. Mediante el procedimiento que se proporciona para producir el ARN que comprende la secuencia genómica de longitud completa del virus de la hepatitis C, se vuelve posible un análisis más detallado del genoma del virus de la hepatitis C.
Además, se puede usar adecuadamente la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa o la célula o la célula que replica el ARN genómico e longitud completa para producir proteína de VHC. Las personas expertas en la técnica pueden producir proteína de VHC mediante cualquier procedimiento conocido. Por ejemplo, se puede producir proteína de VHC introduciendo el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa en una célula, cultivando la célula recombinante y recogiendo las proteínas del cultivo obtenido de esta manera (células cultivadas y/o medio de cultivo) mediante procedimiento conocido.
Además, las partículas del virus VHC de la presente invención pueden poseer hepatotropismo. De esta manera, se puede producir un vector de virus hepatotrópico usando el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención. Este vector de virus se usa adecuadamente para la terapia génica. En la presente invención, se puede introducir un gen extraño en una célula, replicarse en la célula y expresarse, integrando un ARN que codifica el gen extraño en el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa e introduciendo el ARN integrado en la célula. Además. Además, al preparar un ARN en el que se sustituyen la secuencia de codificación de la proteína E1 y/o la secuencia de codificación de la proteína E2 del replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa con una secuencia de codificación del armazón de la proteína externa del virus derivado de otras especies biológicas, se vuelve posible infectar el ARN de diversas especie biológicas En este caso también, se integra un gen extraño en el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa y se puede usar éste como un vector de virus hepatotrópico para expresar el gen extraño en hepatocitos.
La presente invención es también útil para proporcionar un procedimiento para producir un vector de virus que trasporta un gen extraño, comprendiendo insertar un ARN que codifica el gen extraño en el ARN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 12, introduciendo éste en una célula y cultivando la célula para producir partículas de virus.
La presente invención proporciona una vacuna de la hepatitis C que comprende partículas del VHC de la presente invención o una parte de las mismas y un procedimiento para producir la vacuna de la hepatitis C que comprende partículas de VHC de la presente invención o una parte de la mismas.
En particular, se pueden usar partículas de VHC preparadas como anteriormente directamente como una vacuna o se pueden usar después de atenuar o inactivar mediante el procedimiento conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener una disolución madre de vacuna de VHC purificando las partículas de VHC usando cromatografía en columna, filtración, centrifugación y similares. Se puede preparar una vacuna de VHC viva atenuada o una vacuna de VHC inactivada a partir de esta disolución madre de vacuna de VHC. Se puede llevar a cabo la inactivación del virus haciendo reaccionar un agente de inactivación tal como formalina, \beta-propiolactona, glutardialdehído, y similar con el virus, añadiendo y mezclando a, por ejemplo, la suspensión de virus (Appaiahgari y col., Vaccine, (2004) 22(27-28), p. 3669-3675).
Para la producción de la vacuna de la presente invención, es posible usar el replicón de ARN del VHC en el que está atenuada o perdida la patogenicidad mediante una mutación introducida usando la técnica públicamente
conocida.
Se prepara la vacuna de la presente invención para la administración como una disolución o suspensión. Es también posible que se prepare en forma de material sólido adecuado para disolver o suspender en líquido. Se puede emulsionar la preparación o encapsularla en el liposoma. El componente inmunógeno activo tal como las partículas de VHC se mezcla a menudo con un excipiente que es farmacéuticamente aceptable y apropiado para el ingrediente activo. Un excipiente adecuado incluye, por ejemplo, agua, solución salina fisiológica, dextrosa, glicerol, etanol y sus mezclas. Además, si se desea, la vacuna puede contener una pequeña cantidad de agente auxiliar (por ejemplo, humidificador o emulsificador), tampón del pH y/o adyuvante para potenciar la eficacia de la vacuna los ejemplos de adyuvantes eficaces incluyen, pero no se limitan a las siguientes sustancias: hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP11637, nor-MDP), N-acetil muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alnina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP19835A, denominado como MTP-PE) y RIBI. RIBI contiene tres componentes extraídos de bacterias, esto es, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (HPL + TDN + CWS) en emulsión de escualeno/Tween® 80 al 2%. Se puede determinar la eficacia de un adyuvante midiendo la cantidad de anticuerpo contra las partículas d VHC inmunógenas que se producen administrando la vacuna compuesta por partículas de VHC.
La presente vacuna se administra normalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección tal como inyección subcutánea o intramuscular. Otras formas de dosificación adecuadas para las diferentes rutas de administración incluyen supositorios y, en algún caso, la formulación oral.
Si se desea, se pueden añadir uno o más de los anteriores compuestos que tienen actividad adyuvante a la vacuna de VHC. Los adyuvantes son factores de estimulación no específicos para este sistema inmune y potencian la respuesta inmune a la vacuna de VHC en el huésped. Los ejemplos particulares de adyuvantes conocidos en esta técnica incluyen el adyuvante de Freund completo, el adyuvante de Freund incompleto, vitamina E, polímero en bloque no iónico, muramildipéptido, saponina, aceite mineral, aceite vegetal y carbopol. Los adyuvantes especialmente adecuados para la aplicación a la membrana mucosal incluyen, por ejemplo, toxina lábil al calor de E. coli (LT) y toxina del cólera (CT). Otros adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio u óxido de aluminio, emulsión de aceite (por ejemplo, Bayol (Marca Comercial Registrada) o Marcol 52 (Marca Comercial Registrada)), saponina o vitamina E solubilizada. En la forma de realización preferida, la vacuna de la presente invención contiene un adyuvante.
Con respecto a los ejemplos, para las inyecciones que se van a administrar subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosamente, los ejemplos particulares de vehículos y diluyentes farmacéuticamente aceptables, que se pueden incluir en la vacuna de VHC de la presente invención incluyen estabilizantes, carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, materiales que contienen proteínas tales como albúmina de suero bovino o leche desnatada, y tampones (por ejemplo, tampón fosfato).
Los ligantes u vehículos convencionales usados para un supositorio incluyen, por ejemplo, polialquilenglicol o triglicéridos. Se puede formular el supositorio a partir de una mezcla que contiene el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 50%, preferiblemente 1% a 20%. Una formulación oral puede contener normalmente los excipientes usados. Dichos excipientes incluyen, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares de calidad farmacéutica.
Se puede producir la vacuna de la presente invención en formas de dosificación de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación mantenida y que contienen el ingrediente activo (partículas de virus o un parte de las mismas) a un 10-95%, preferiblemente 25-70%.
La vacuna de la presente invención se administra mediante el procedimiento adecuado para las formas de dosificación y en la cantidad efectiva para la prevención y/o el tratamiento. La cantidad de dosificación está en el intervalo entre 0,01 \mug a 100.000 \mug y este es dependiente del paciente que se va a tratar, la capacidad de formación de anticuerpos en el sistema inmune del paciente, y el nivel deseado de protección. Es también dependiente de la ruta de administración tal como subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa y similar.
Se puede administrar esta vacuna mediante un programa de administración único o preferiblemente mediante un programa de administración complejo. En el programa de administración complejo, se llevan a cabo 1-10 administraciones individuales al comienzo de la administración, seguido por la administración a los intervalos requeridos para mantener y/o potenciar la respuesta inmune. Por ejemplo, se puede proporcionar otro tipo de administración como segunda administración 1.4 meses más. Si es necesario, se puede continuar la administración algunos meses más. El régimen de administración se determina, al menos parcialmente, de acuerdo con las necesidades del paciente individual y es dependiente del juicio del profesional médico.
Además, se puede administrar simultáneamente la vacuna que contiene las partículas de VHC inmunógenas con otro agente del control inmune (por ejemplo, inmunoglobulina).
Se puede usar la vacuna de partículas de VHC preventivamente frente a una posible nueva infección de VHC administrándola a individuos sanos par inducir la respuesta inmune al VHC. Se puede usar también la vacuna de partículas de VHC como vacuna terapéutica para eliminar el VHC administrándola a pacientes infectados con VHC e induciendo una fuerte respuesta inmune al VHC en el cuerpo.
Se puede usar la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa o la célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa o la célula infectada con el virus de la hepatitis C, que se infecta con partículas de virus generadas en estas células, como un sistema de ensayo para cribar una sustancia (sustancia contra el virus de la hepatitis C) que promueve o inhibe, por ejemplo, la replicación del virus de la hepatitis C, la reconstrucción de las partícula del virus y la liberación de las partículas del virus. En particular, por ejemplo, se puede cribar la sustancia que promueve o inhibe el crecimiento del virus de la hepatitis C determinando si la sustancia de ensayo promueve o inhibe la replicación del replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa, o la formación o la liberación de las partículas de virus, cultivando estas células en presencia del replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa en la preparación de ARN extraído de las células descritas anteriormente. Se puede llevar a cabo la detección de las partículas de virus en el cultivo/principalmente del sobrenadante del cultivo) midiendo la cantidad, la relación o la presencia de la proteína de VHC en el sobrenadante del cultivo.
Además, se puede investigar si la inmunoglobulina purificada a partir del suero de un paciente infectado con VHC puede evitar la infección con partículas de VHC de la presente invención, detectando las partículas de virus en este cultivo En este ensayo, se pueden usar sueros de ratones, ratas, conejos y similares, que se han inmunizado con las partículas del virus VHC de la presente invención. Se puede utilizar la inmunización por una parte de la proteína de VHC, el gen del VHC y similar. Se puede llevar a cabo este ensayo con otras sustancias preventivas de la infección de una manera similar.
Los anticuerpos que se generan contra las partículas del virus VHC de la presente invención incluyen anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. Cuando se prefiere el anticuerpo policlonal, se inmunizan mamíferos seleccionados (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, oveja, caballo y similares) con las partículas del VHC de la presente invención como primera etapa. Se recogen los sueros de los animales inmunizados y se procesan mediante procedimiento conocido. Si los sueros que contienen los anticuerpos policlonales con los epítopos de VHC contienen anticuerpos de otros antígenos, s pueden purificar estos sueros mediante cromatografía de inmunoafinidad. Se conocen en la técnica lo procedimientos para generar antisueros policlonales y los procedimientos para el tratamiento de éstos. Se pueden aislar anticuerpos policlonales de mamíferos ya infectados con VHC.
Las personas expertas en la técnica pueden producir fácilmente anticuerpos monoclonales de epítopos de VHC Se conoce el procedimiento común para producir el hibridoma que genera anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, se pueden usar los procedimientos descritos en Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc.).
Se pueden producir líneas celulares que generen anticuerpos monoclonales mediante fusión celular, o mediante otro procedimiento tal como transformación directa de linfocitos B con ADN génico tumoral o transducción con el virus de Epstein-Barr. Los anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales obtenidos mediante estos procedimientos son útiles para el diagnóstico, tratamiento y prevención del VHC.
Los anticuerpos producidos usando las partículas del VHC de la presente invención se administran con un solubilizante, aditivo, estabilizante, tampón y similar farmacéuticamente aceptable. Se puede escoger cualquier ruta de administración, pero se prefieren las administraciones subcutánea, intradérmica e intramuscular y se prefiere más la administración intravenosa.
Se pueden usar las partículas de VHC, generadas en la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención o la célula que replica el ARN genómico del VHC de longitud completa y la célula permisiva al VHC como un sistema de ensayo para cribar una sustancia que pueda estimular o inhibir la unión del VHC a las células. En particular, se pueden cribar, por ejemplo, sustancias que pueden promover o inhibir el crecimiento del virus de la hepatitis C cultivando la partículas del VHC generadas en la células que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención junto con la célula permisiva a VHC en presencia de una sustancia de ensayo, detectando el replicón de ARN del VHC de longitud completa o las partículas del virus en el cultivo del virus y determinando si esta sustancia promueve o inhibe la replicación del replicón de ARN o la formación de las partículas de virus.
Se pueden llevar a cabo dichas detecciones del replicón de ARN del VHC de longitud completa o del ARN genómico del VHC de longitud completa o de las partículas de virus de acuerdo con la técnica descrita anteriormente o los siguientes Ejemplos. Se puede usar el sistema de ensayo descrito anteriormente para la producción y evaluación de los agentes preventivos, terapéuticos o diagnósticos de la infección por el virus de la hepatitis C.
En particular, los ejemplos de la utilización del sistema de ensayo de la presente invención descrito anteriormente incluyen los siguientes:
(1)
Cribar una sustancia que inhiba el crecimiento y la infección de VHC
\quad
Las sustancias que inhiben el crecimiento y la infección de VHC incluyen, por ejemplo, compuestos orgánicos que afectan el crecimiento y la infección de VHC directa o indirectamente, oligonucleótidos de sentido contrario o similares que afectan el crecimiento de VHC o la traducción de la proteína de VHC directa o indirectamente hibridándolos con la secuencia diana en el genoma de VHC o su cadena complementaria.
(2)
Evaluación de diversas sustancias que tienen actividad antivírica en el cultivo celular.
\quad
Las diversas sustancias anteriormente mencionadas incluyen sustancias obtenidas mediante diseño racional de fármacos o cribado de alto rendimiento (por ejemplo, enzima purificada y aislada).
(3)
Identificación de una nueva diana para el tratamiento de pacientes infectados con VHC
\quad
Se pueden usar, por ejemplo la célula que replica el replicón de ARN del VHC de longitud completa o las células que replican el ARN genómico del VHC de longitud completa para identificar una proteína celular del huésped que puede jugar un importante papel para el crecimiento del VHC.
(4)
Evaluación de la capacidad del VHC para adquirir resistencia a fármacos y similares, e identificación de la mutación relacionada con la resistencia.
(5)
Producción de proteína del virus como un antígeno utilizable para el desarrollo, la producción y la evaluación de agentes diagnósticos y terapéuticos para la infección del virus de la hepatitis C.
(6)
Producción de proteína del virus como un antígeno utilizable para el desarrollo, la producción y la evaluación de la vacuna para la infección del virus de la hepatitis C y producción de un VHC atenuado.
(7)
Producción de anticuerpos monoclonales o policlonales para el diagnóstico y tratamiento de la infección del virus de la hepatitis C.
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La presente invención se describirá más específicamente basándose en los siguientes ejemplos y dibujos. Sin embargo, el alcance técnico de la presente invención no se limita a estos ejemplos.
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Ejemplo 1 Preparación del replicón de ARN del VHC de longitud completa derivado del ARN genómico del VHC de longitud completa (A) Construcción del vector de expresión
Se construyeron ADN plásmidos en los que los ADN (clon JFH-1) que contenían el ADNc genómico de longitud completa de la cepa JFH-1 del virus de la hepatitis C (genotipo 2a) que se había aislado de un paciente con insuficiencia hepática fulminante se insertaron en la dirección 3' de la secuencia del promotor de ARN T7 en plásmidos
pUC19.
En particular, los fragmentos de la PCR-RT obtenidos amplificando el ARN vírico de la cepa JFH-1 se clonaron en vectores pGEM T EASY (Promega) para obtener los plásmidos pGEM1-258, pGEM44-486, pGEM317-849, pGEM617-1323, pGEM1141-2367, pGEM2285-3509, pGEM3471-4665, pGEM4547-5970, pGEM5883-7003, pGEM6950-8035, pGEM7984-8892, pGEM8680-9283, pGEM9231-9634 y pGEM9594-9678 (Véase documento no de patente 6). Los ADNc derivados del ARN genómico vírico contenidos en dichos plásmidos se ligaron conjuntamente usando el procedimiento de la PCR y los enzimas de restricción para clonar el ARNc genómico vírico. Se insertó la secuencia del promotor de ARN T7R en la dirección 5' del ADNc genómico vírico de longitud completa. A partir de ahora en el presente documento, el ADN plásmido construido de esta manera se denomina como pJFH1 (parte superior de la Fig. 1). Se ha descrito anteriormente la preparación del clon JFH-1 en el Documento de Patente 1 y el Documento No de Patente 3. Adicionalmente, se registró la secuencia de nucleótidos del ADNc de longitud completa del clon JFH-1 en un banco de datos internacional de ADN (DDBJ/EMBL/GenBank) con nº de Acceso AB047639.
A continuación se construyó el ADN plásmido pFGREP-JFH1 el EMCV-IRES (emplazamiento de entrada interno al ribosoma del virus de la encefalomiocarditis) y el gen resistente a la neomicina (neo; denominado también como gen de la neomicina fosfotransferasa) entre la región 5' no traducida y la región núcleo del ADN plásmido pJFH1 (parte inferior de la Figura 1). Este procedimiento de construcción estaba de acuerdo con la publicación anterior (Documento No de Patente 4). Adicionalmente, se prepararon los clones de los plásmidos mutantes pJFH1/GND y PFGREP-JFH1/GND introduciendo que cambió el motivo de aminoácidos GDD, que corresponde al centro activo de la ARN polimerasa codificado por la región NS5B en pJFH1 y pFGREP-JFH1, a GND. Debido a que la secuencia de aminoácidos del emplazamiento activo de la proteína NS5B codificada por los clones mutantes pJFH1/GND y pFGREP-JFH1/GND cambió, la proteína NS5B activa que se necesita para replicar el replicón de ARN no se puede expresar a partir de los clones mutantes.
Adicionalmente, se preparó pFGREP-JFH1/Luc como un vector de expresión introducido en un gen indicador mediante la inserción del gen de la luciferasa entre el emplazamiento MIuI de 415º a 420º y el emplazamiento PmeI de 2075º a 2028º de pFGREP-JFH1 para sustituir el gen resistente a la neomicina de pFGREP_JFH1 con el gen de la luciferasa. También, un mutante PFGREP-JFH1/Luc/GND, en el que el motivo GDD del centro activo de la ARN polimerasa de NS5b se cambió a GND, se preparó mutando G a 10933º de pFGREP-JFH1/Luc a A.
Se preparó pFGREP-JFH1/EGFP, en el que el gen resistente a la neomicina de pFGREP-JFH1 se sustituyó con el gen de la proteína fluorescente verde, insertando el gen de la proteína fluorescente verde entre el emplazamiento mutante MIuI de 415º a 420º y el emplazamiento PmeI de 1142º a 1149º de pFGREP-JFH1. También se preparó un mutante pFGREP-JFH1/EGP/GND, en el que el motivo GDD del centro activo de la ARN polimerasa de NS5b se cambió a GND, mutando G a 1000º de pFGREP-JFH1/EGFP a A.
Se preparó pFGREP-JFH1/EGFP, insertando el gen de la fosfatasa alcalina placental secretora entre el emplazamiento MIuI de 415º a 420º y el emplazamiento PmeI de 1982º a 1989º de pFGREP-JFH1 para sustituir el gen resistente a la neomicina de pFGREP-JFH1 con el gen de la fosfatasa alcalina placental secretora. También, se preparó un mutante PFGREP-JFH1/SEAP/GND, en el que el motivo GDD del centro activo de la ARN polimerasa de NS5b se cambión a GND, mutando G a 10840º de pFGREP-JFH1/SEAP a A.
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(B) preparación del ARN genómico del VHC de longitud completa y del replicón de ARN del VHC de longitud completa
Se digirieron los vectores de expresión construidos como anteriormente, pJFH1, PJFHI/GND, pGREP-JFH1 y pFGREP-JFH1/GND con el enzima de restricción XbaI para preparar las plantillas de ADN para la síntesis del ARN genómico del VHC de longitud completa y el replicón de ARN del VHC de longitud completa. Posteriormente, se trataron 10-20 \mug de cada fragmento XbaI con 20 U de Nucleasa de Judía Mungo en 50 \mul de disolución de reacción incubando a 30ºC durante 30 min. La Nucleasa de Judía Mungo es una enzima que cataliza la reacción que implica digerir selectivamente partes de la cadena única del ADN de doble cadena. Normalmente, si se sintetiza el ARN usando los fragmentos XbaI anteriores como plantillas, se sintetizan replicones de ARN que tienen 4 bases extra de CUGA, que es una parte del emplazamiento de reconocimiento XbaI, en el término 3'. Por tanto, en este ejemplo, se eliminaron 4 bases de CUGA procedentes de los fragmentos XbaI tratando los fragmentos XbaI con Nucleasa de Judía Mungo. Posteriormente, la disolución de después del tratamiento de Nucleasa de Judía Mungo que contenía los fragmentos XbaI se sometió al tratamiento normalizado de eliminación de la proteína para obtener los fragmentos XbaI purificados sin las 4 bases, CUGA, como plantilla de ADN que se va a usar a continuación.
A continuación, se sintetizó el ARN in vitro a partir de esta plantilla de ADN usando ARN polimerasa T7. Se usó un MEGAscript (Ambion Co.) para la síntesis del ARN, se hicieron reaccionar 20 \mul de la mezcla de reacción que contenían 0,5-1,0 microgramos de la plantilla de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de la síntesis del ARN, se añadió DNasa (2 U) a l mezcla de reacción y se hizo reaccionar a 37ºC durante 15 minutos, y a continuación se extrajo el ARN con tratamiento de ácido-fenol para eliminar la plantilla de ADN. Se sintetizaron los ARN de esta manera a partir de las anteriores plantillas de ADN derivadas de pJFH1, pJFH1/GND, pFGREP-JFH1 y pFGREP-JFH1/GND se denominaron como rJFH1, rJFH1/GND, rFGREP-JFH1 y rFGREP-JFH1/GND, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de estos ARN se muestran en la SEC DE ID Nº: 12, 13, 14, y 15 para rJFH1, rJFH1/GND, rFGREP-JFH1 y rFGREP-JFH1/GND, respectivamente. rJFH1 es un ejemplo de los ARN genómicos del VHC de longitud completa que tienen la misma estructura de la secuencia que el genoma del VHC de longitud completa de la cepa JFH-1. rFGREP-JFH1 es un ejemplo del replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención.
Posteriormente, rFGR-JFH1/Luc (SEC DE ID Nº: 21), rFGR-JFH1/Luc/GND (SEC DE ID Nº: 22), rFGR-JFH1/
EGFP (SEC DE ID Nº: 23), rFGR-JFH1/EGFP/GND (SEC DE ID Nº: 24), rFGR-JFH1/SEAP (SEC DE ID Nº: 25) y rFGR-JFH1/SEAP/GND (SEC DE ID Nº: 26), que fueron replicones de ARN del VHC, se produjeron usando como plantilla las vectores de expresión preparados como anteriormente, pFGREP-JFH1/Luc, pFGREP-JFH1/Luc/GND, pFGREP-JFH1/EGFP, pFGREP-JFH1/EGFP/GND, pFGR-JFH1/SEAP y pFGR-JFH1/SEAP/GND, respectivamente.
Ejemplo 2 Replicación del ARN genómico del VHC de longitud completa en células y generación de las partículas de virus (C) Replicación del ARN genómico del VHC de longitud completa en células y generación de las partículas de virus
Se mezclaron diversas cantidades del ARN genómico del VHC de longitud completa (rJFHI o rFHJ1/GND) como anteriormente con el ARN total extraído de células Huh7 para llevar la cantidad de ARN hasta 10 \mug. Posteriormente, el ARN mezclado se introdujo en células Huh7 mediante el procedimiento de electroporación. Se sembraron células Huh7 sometidas al tratamiento de electroporación en placas de cultivo. Tras incubar durante 12, 24, 48 y 72 horas, se recogieron las células, se extrajo el ARN y se analizó mediante el procedimiento de transferencia Northern. Se llevó a cabo el análisis de transferencia Northern de acuerdo con Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, J. Sambrook, E. F. Fristch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). En particular, se sometió el ARN extraído de las células tras la incubación a electroforesis desnaturalizante en gel de agarosa y se transfirió el ARN a una membrana de nylon cargada positivamente después de la electroforesis. Se hibridó una sonda de ADN o ARN marcada con ^{32}P, preparada a partir de pJFH1 con el ARN anteriormente mencionado transferido sobre la membrana. Se lavó la membrana y se expuso a una película para detectar las bandas de ARN específicas del ARN genómico del VHC de longitud completa del clon JFH-1.
Tal como se muestra en la Figura 2, cuando se transfectó rJFH1/GND en las células, se confirmó una banda del ARN introducido como una señal débil a las 4 horas después de la transfección, pero la señal se fue debilitando con el paso del tiempo y la señal procedente de la banda fue casi indetectable a las 24 h después de la transfección. En contraste, cuando se transfectó rJFH1, la intensidad de la señal de la banda del ARN introducido se debilitó en un primer momento como fue el caso de rJFH1/GND entre las 4-12 horas después de la transfección, pero se confirmó una clara señal de la banda de ARN después de 24 horas de la transfección. La señal confirmada era específica del ARN genómico del VHC. Esto es, se consideró que algún ARN genómico del VHC de longitud completa introducido se replicó y creció. No se observó replicación de rJFH1/GND, en la que se mutó el motivo activo de NS5B, esto es, el enzima del ARN replicativo, indicando que la actividad de NS5B es importante para la replicación del ARN genómico del VHC de longitud completa. Además, se llevaron a cabo los mismos experimentos para el ARN genómico de longitud completa derivado del virus de la hepatitis C tal como la cepa H77 (Documento No de Patente 7), la cepa J6 (Documento No de Patente 8) y la cepa JCH1 que los presentes inventores aislaron de la hepatitis crónica (Documento No de Patente 6), todos los cuales se han aislado anteriormente, pero no se confirmó la replicación del ARN genómico del VHC de longitud completa de estas cepas.
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(D) Detección de partículas del virus VHC en el medio de cultivo del cultivo celular transfectado
Se sembraron células Huh7 tratadas mediante electroporación tal como se ha descrito anteriormente en placas de cultivo y se cultivaron durante 12, 24, 48 y 72 horas y a continuación se evaluó la proteína núcleo del VHC en el sobrenadante del cultivo. Se llevó a cabo la evaluación de acuerdo con el ensayo IRMA del antígeno Ortho del VHC (Documento No de Patente 9). Tal como se muestra en la Figura 3, se detectó la proteína núcleo en el sobrenadante del cultivo 48 y 72 horas después de la transfección con rJFH1. Para examinar si esta proteína núcleo se segregaba como partículas de virus, se fraccionó el medio de cultivo 72 horas después de la transfección con rJFH1 mediante el gradiente de densidad de la sacarosa. En un tubo de centrífuga, se distribuyeron en capas 2 ml de disolución de sacarosa al 60% (p/p) (disuelta en Tris 50 mM pH 7,5/ NaCl 1 M/EDTA 1 mM), 1 ml de disolución de sacarosa al 50%, 1 ml de disolución de sacarosa al 40%, 1 ml de disolución al 30%, 1 ml de disolución de sacarosa al 20% y 1 ml de disolución de sacarosa al 10% y se superpusieron a la anterior 4 ml del sobrenadante del cultivo de la muestra. Se centrifugó ésta en un rotor SW41 de Beckman Ti a 400.000 RPM, a 4ºC durante 16 horas. Tras la centrifugación, se recogió ésta en fracciones de 0,5 ml cada una procedentes de la parte inferior del tubo. Se determinaron la densidad, la concentración de la proteína núcleo del VHC y la cantidad del ARN genómico del VHC de longitud completa en cada fracción. Se llevó a cabo la detección del ARN genómico del VHC de longitud completa con un procedimiento de PCR-RT cuantitativo detectando el ARN de la región 5' no traducida del ARN genómico del VHC de longitud completa, de acuerdo con Takeuchi T, Katsume A, Tanaka T, Abe A, Inoue K, Tsukiyama-Kohara K, Kawaguchi R, Tanaka S, Kohara M, "Real-Time detection system for quantification of Hepatitis C virus genome", Gastroenterology 116: 636-642 (1999). En particular, se amplificó mediante la PCR el ARN genómico del VHC de longitud completa contenido en el ARN extraído de la célula, usando cebadores sintéticos, R6-130-S17: 5'-CGGGAGAGCCATAGTGG-3' (SEC DE ID Nº: 16), R6-290-R19: 5'-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3' (SEC DE ID Nº: 17 y Sonda TaqMan: R6-148-S21FT, 5'-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3' (SEC DE ID Nº: 18) y el kit de la PCR del ARN EZ rTth, y a continuación se detectó mediante el sistema detector de secuencias ABI Prism 7700.
Tal como se muestra en la Figura 4, el pico de la proteína núcleo coincidió con el del ARN genómico del VHC de longitud completa en la fracción 11. La densidad de esta fracción fue aproximadamente de 1,18 mg/ml y esto indicó un peo específico más bajo que el del conjugado de la proteína núcleo y del ácido nucleico informado hasta el momento. Además, cuando se llevó a cabo un fraccionamiento similar después de tratar el sobrenadante del cultivo con NP40 al 0,25%, los picos de la proteína núcleo y del ARN genómico del VHC de longitud completa cambiaron a un peso específico de aproximadamente 1,28 mg/ml. Estos es, se consideró que el tratamiento con NP40 arrastró la membrana superficial, que contenía lípidos y a continuación tuvo un peso específico inferior, procedente de las partículas de núcleo que dan como resultado partículas de virus comprendidas solo por ácido nucleico y proteína núcleo, y por tanto, aumentó el peso específico. Los anteriores resultado mostraron que el ARN genómico del VHC de longitud completa se replicó en la célula transfectando rJFH1 en células Huh7 y, como resultado, se formaron partículas de virus y se segregaron en el sobrenadante del cultivo.
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Ejemplo 3 (E) Preparación de la célula que replica el replicón d ARN del VHC de longitud completa y establecimiento de los clones celulares
Se prepararon las células que replicaban de replicón de ARN del VHC de longitud completa transfectando rFGREP-JFH1 y rFGREPJFH1/GND, que se prepararon en el Ejemplo 1, en células Huh7 tal como se ha descrito en el Ejemplo 2, y a continuación se realizó un intento de establecer clones de células que replicaban el replicón de ARN del VHC de longitud completa.
En primer lugar, tras transfectar rFGREP-JFH1 y rFGREP-JFH1/GND respectivamente en células Huh7, se sembraron las células en placas de cultivo Tras cultivar 16-24 horas, se añadió G418 a diversas concentraciones Se continuó el cultivo aunque cambiando el medio dos veces a la semana. Tras cultivar durante 21 días, se tiñeron las células sobrevivientes con cristal violeta Se recontaron las colonias teñidas, y se calculó el número de colonias resultantes por peso d ARN usado para la transfección se continuó también el cultivo en alguna de las placas de cultivo para clonar colonias de las células sobrevivientes. Se extrajeron el ARN, el ADN genómico y las proteínas, respectivamente, de las células clonadas, y a continuación se investigaron la detección del replicón de ARN del VHC de longitud completa, la integración del gen resistente a la neomicina en el ADN genómico y la expresión d la proteína de VHC. Se muestran estos resultados a continuación en detalle.
(F) Capacidad de formación de colonias
Los resultados de la transfección anterior indicaron que la capacidad de formación de colonias por 1 \mug de replicón de ARN usado para la transfección fue de 368 UFC (Unidad Formadora de Colonias)/\mug de ARN, para las célula Huh7 transfectadas con rFGREP-JFH1, a una concentración de G418 de 1,0 mg/ml (la parte izquierda de la Figura 5). En contraste, no se observó formación de colonias para las células Huh7 transfectadas con rFGREP-JFH1/GND (la parte derecha de la Figura 5). Esto indica que la capacidad de formación de colonias de las células Huh7 transfectadas con el replicón de ARN de rFGREP-JFH1 depende de la actividad de NS5B (ARN polimerasa) que se expresa a partir de rFGREP-JFH1. Esto es, se consideró que en las células formadoras de colonias, llegó a ser posible el crecimiento de las células como resultado del mantenimiento de la resistencia a G418 debido a la expresión continua del gen resistente a la neomicina producida por la replicación autónoma del replicón de ARN de rFGREP_JFH1 por medio de la acción de NS5B expresado a partir de rFGREP-JFH1.
(G) Detección del replicón de ARN del VHC de longitud completa en clones celulares establecidos
Se extrajo el ARN total mediante el procedimiento de extracción con ácido-fenol de los clones celulares que replicaban e replicón de ARN del VHC de longitud completa, que se ha establecido transfectando rFGREP-JFH1, en célula HUh7 de acuerdo con la sección (E) anterior Posteriormente, se evaluó este ARN total mediante el procedimiento de transferencia Northern. En el procedimiento, se usó una sonda específica de pFGREP-JFH1. Como controles, se extrajo el ARN total de las células Huh7 no transfectadas de una manera similar (en la Figura 6, se muestra como "Huh7") se usaron una muestra sintetizada in vitro que contenía 10^{7} copias de replicón de ARN adicionalmente al ARN extraído de las células Huh7 (en la Figura 6, se muestra como "10^{7}"), y una muestra sintetizada in vitro que contenía 10^{8} copias del replicón de ARN adicionalmente al ARN total extraído de las células Huh7 (en la Figura 6, se muestra como "10^{8}"). En la Figura 6, 1-4 indica los números de clones celulares.
Como resultado, se detectó el ARN que tenía el tamaño similar a rFGREP-JFH1 con una sonda específica de rFGREP-JFH1 (Figura 6). A partir de este resultado, se confirmó que el replicón de ARN del rFGREP-JFH1 transfectado se replicaba y crecía en el clon celular. Se demostró también que hubo diferencia en la cantidad de replicón de ARN entre los clones celulares. Tal como se muestra en la Figura 6, por ejemplo, la cantidad de replicón de ARN en el clon 2 fue inferior a la de otros clones.
(H) Confirmación de la presencia o ausencia de la integración del gen de resistencia a la neomicina en el ADN genómico
Se llevó a cabo la amplificación mediante la PCR de los clones celulares 1-8 obtenidos de acuerdo con (E) (se muestran como FG-JFH1/2-1 y FGR-JFH1/2-8 en la Figura 7), usando cebadores específicos del gen de resistencia a la neomicina (cebador de sentido directo, NEO-S3: 5'-AACAAGATGGATTGCACGCA-3' (SEC DE ID Nº: 19), cebador de sentido contrario, NEO-R: 5'-GCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3' (SEC DE ID Nº: 20)) y el ADN genómico celular del huésped extraído de cada uno de los clones celulares como plantilla, con el fin de confirmar que la resistencia de cada uno de los clones celulares frente a G418 no era debida a la integración del gen de resistencia a la neomicina el genoma celular del huésped Como resultado, tal como se muestra en la Figura 7, no se observó que los clones positivos mostraran la amplificación del gen de la resistencia a la neomicina.
El resultado de (H) confirmó que el replicón de ARN del VHC de longitud completa se replicaba en los clones celulares establecidos mediante transfección del replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención.
(I) Detección de la proteína de VHC
Se extrajeron las proteína mediante un procedimiento normalizado a partir de os clones celulares establecidos mediante la transfección de rFGREP-JFH1, y a continuación se analizaron mediante SDS-PAGE y el procedimiento de transferencia Western Los clones celulares examinados en este caso fueron los mismos que los usados en la sección (G) anterior. El extracto celular obtenido mediante transfección transitoria del ARN genómico del VHC de longitud completa preparado en células Huh7 se usó como control positivo (se muestra como JFH1 en las Figuras 8, 9 y 10). El extracto celular procedente del clon obtenido transfectando el replicón de ARN subgenómico del VHC (SGR_JFH1) se usó como control negativo de la proteína núcleo y como control positivo de las proteínas NS3 y NS5a (se muestra como SGR-JFH1 en las Figuras 8, 9 y 10). Se usó el extracto celular de las células Huh7 no transfectadas como control negativo de todas las proteínas (se muestra como Huh7 en las Figuras 8, 9 y 10). Se transfirieron las muestras de proteína extraídas de cada clon celular sobre membranas PVDF (Immobilon-P, Millipore), y a continuación se detectaron la proteína núcleo y la proteína NS3 codificadas por el replicón de ARN del VHC de longitud completa del anterior usando un anticuerpo específico contra el núcleo y un anticuerpo específico contra NS3 (proporcionado amablemente por el Dr. Moradpour; Wolk B, y col. J. Virology, 2000, 74: 2293-2304). Tal como se muestra en las Figuras 8 y 9, se detectaron para cada proteína los clones celulares 1-4 que se establecieron transfectando la proteína rFGREP-JFH1, del mismo tamaño que la del control positivo. Debido a que no se detectaron ni la proteína del núcleo ni la proteína NS3 para las células Huh7 no transfectadas, se confirmó en los clones celulares 1-4 que se había transfectado el replicón de ARN del VHC de longitud completa, replicado autónomamente y que se expresaban la proteína núcleo y la proteína NS3.
Adicionalmente, para cada clon celular, para el cual se ha confirmado la expresión de la proteína NS3 tal como se ha descrito anteriormente, se confirmó también la expresión de la proteína NS5A a partir del replicón de ARN del VHC de longitud completa usando como anticuerpo un suero procedente de un paciente con hepatitis C (Figura
10).
A partir de los resultados de (H) e (I) descritos anteriormente, se confirmó que en los clones celulares, que se han establecido transfectando el replicón de ARN del VHC de longitud completa, el replicón de ARN del VHC de longitud completa se replicaba y que se expresaban también las proteínas víricas.
(1) Producción de partículas de virus en células que replican el replicón de ARN del VHC de longitud completa
Se transfectó rFGREP-JFH1 en células Huh7 de acuerdo con la sección (E) anterior, se establecieron los clones celulares 2 y 3 (FGR-JFH1/2-3) que replicaban el replicón de ARN del VHC de longitud completa, y a continuación se recuperaron sus sobrenadantes de los cultivos. Se evaluaron las partículas del virus VHC en los sobrenadantes de los cultivos de acuerdo con un procedimiento similar a (D) descrito anteriormente. En la Figura 11 se muestra el resultado. En la Figura 11, un círculo sombreado representa el peso específico (g/ml) de cada fracción. Un círculo cerrado representa una cantidad de la proteína núcleo (fmol/l). Un círculo abierto representa un título del replicón de ARN del VHC de longitud completa (x 0,1 copias/ml).
Tal como se muestra en la Figura 11, el pico de la proteína núcleo coincidió con el del replicón de ARN del VHC de longitud completa en las fracciones que tenían pesos específicos de aproximadamente 1,18-1,20 mg/ml. Se encontró también un pequeño pico en la fracción más ligera. A partir de los anteriores resultados se demuestra que el replicón de ARN del VHC de longitud completa se replicó en células Huh7 transfectadas con rFGREP-JFH11, y se formaron y segregaron partículas de virus en el sobrenadante del cultivo del mismo.
Ejemplo 4 (K) Experimento de infección con partículas de virus en el sobrenadante del cultivo
Se infectaron células Huh7 con partículas de virus en el sobrenadante del cultivo añadiendo cada sobrenadante del cultivo de clones celulares 1-8 usados en (H) (es decir, FGR-JFH1/2-1, FGR-JFH1/2-2, FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-4, FGR-JFH1/2-5, FGR-JFH1/2-6, FGR-JFH1/2-7, FGR-JFH1/2-8) a las células Huh7. Al día siguiente, se añadió G418 a 0,3 mg/ml a los medio de cultivo de las células Huh7 infectadas, y se cultivaron adicionalmente las célula Huh7 durante 21 días. Tras la finalización del cultivo, se fijaron las células y se tiñeron con cristal violeta. Se observo formación de colonias par las células infectadas con los sobrenadantes del cultivo de FGR-JFH1/2-3, FGR-JFH1/2-5 y FGR-JFH1/2-6, respectivamente. Por otra parte, no se observó formación de colonias para las células infectadas con el sobrenadante del cultivo de SGR-JFH1/4-1, usándose como control células de replicón subgenómico (descritas en el Documento No de patente 6). La Figura 12 muestra una fotografía de una placa de cultivo teñida tras cultivar durante 21 días con los 4 ml u 8 ml añadidos del sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/2-3 o SGR-JFH1/4-1. Se encontraron tres y nueve colonias en la placa en la que se han sembrado las células mezcladas con 4 ml y 8 ml del sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/2-3. Sin embargo, no se observaron colonias en la placa, en la que se han sembrado las células mezcladas con el sobrenadante del cultivo de SFR-JFH1/4-1.
Posteriormente, se clonaron las colonias formadas mediante infección con el virus de la hepatitis C usando el sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/2-3 y FGR-JFH1/2-5, respectivamente. Se establecieron tres clones de FGR-JFH1/C2-3-11, FGR-JFH1/C2-3-12 y FGR-JFH1/C2-3-13 a partir de la placa de cultivo infectada con el sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/2-3, y se establecieron 2 clones de FGR-JFH1/C2-5-11 y FGR-JFH1/C2-5-12 a partir de la placa de cultivo infectada con el sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/C2-5.
Cuando se infectaron células Huh7 con el sobrenadante del cultivo de cada clon celular de FGR-JFH1/C2-3-11, FGR-JFH1/C2-3-12, FGR-JFH1/C2-3-13, FGR-JFH1/C2-5-11 y FGR-JFH1/C2-5-12, se observó formación de colonias en las placas de cultivo infectadas con el sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/C2-3-12 y JFH1/C2-5-12, respectivamente. A partir de las células infectadas con el sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/C2-3-12, se establecieron 2 clones adicionales de FGR-JFH1/C2-3-12-1 y de FGR-JFH1/C2-3-12-2. A partir de las células infectadas con el sobrenadante del cultivo de FGR-JFH1/C2-5-12, se establecieron 2 clones adicionales de FGR-JFH1/C2-5-12-1 y FGR-JFH1/C2-5-12-2.
Se extrajeron el ARN, la proteína y el ADN genómico de estos clones celulares que se habían establecido a partir de células infectadas con el sobrenadante del cultivo de las células que replicaban el replicón de ARN del VHC de longitud completa. El examen para la integración del gen resistente a la neomicina en el ADN genómico de estos clones celulares mediante la PCR usando el ADN genómico como plantilla dio como resultado negativo en todos. Además, el replicón de ARN del VHC de longitud completa que se replicaba en las células podría detectarse mediante la PCR cuantitativa usando ARN como plantilla. Más adicionalmente, podría detectarse la proteína núcleo en el sobrenadante del cultivo. Estos resultados indican que las partículas del virus que contienen el replicón de ARN del VHC de longitud completa que se producen mediante las células que replican el replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención pueden infectar otra célula.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, se pueden preparar partículas del virus VHC en un sistema de cultivo celular. Usando el replicón de ARN de la presente invención, se puede producir eficazmente el ARN que contiene el ARN genómico del VHC de longitud completa en un sistema de cultivo celular. Además, usando las células, en las que se ha introducido el replicón de ARN del VHC de longitud completa de acuerdo con la presente invención o el ARN genómico del VHC de longitud completa, se pueden replicar el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa, y se pueden producir partículas del virus VHC de la presente invención de manera continua en l sistema de cultivo celular. Las células en las que se introduce el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa, se pueden usar también como un sistema de ensayo para cribar diversas sustancias que influencian el proceso de replicación del VHC, la formación de partículas de virus y la liberación extracelular de partículas de virus. El replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención y el ARN genómico del VHC de longitud completa, y las partículas de virus de la presente invención son también útiles como vector vírico para un gen extraño. Se pueden incluir las partículas de virus de la presente invención, o una parte de las mismas en una vacuna como antígeno de la vacuna contra el virus de la hepatitis C. Además, el sistema, en el que las partículas de virus de la presente invención y otras células que se cultivan conjuntamente, se pueden utilizar como un sistema de ensayo para cribar diversas sustancias que tienen influencia en la infección de las células con partículas de virus. El replicón de ARN del VHC de longitud completa de la presente invención o el ARN genómico del VHC de longitud completa es útil como plantilla que permite una reproducción sencilla de la secuencia del genoma del VHC de longitud completa.
Texto libre del listado de secuencias
La SEC DE ID Nº: 1 representa la secuencia de la región 5' no traducida del ARN genómico del VHC derivada del clon FJH-1.
La SEC DE ID Nº: 2 representa la secuencia de codificación de la proteína núcleo del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 3 representa la secuencia de codificación de la proteína E1 del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 4 representa la secuencia de codificación de la proteína E2 del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 5 representa la secuencia de codificación de la proteína NS2 del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 6 representa la secuencia de codificación de la proteína NS3 del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 7 representa la secuencia de codificación de la proteína NS4A del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 8 representa la secuencia de codificación de la proteína NS4B del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 9 representa la secuencia de codificación de la proteína NS5A del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 10 representa la secuencia de codificación de la proteína NS5B del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 11 representa la secuencia de la región 3' no traducida del ARN genómico del VHC derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 12 representa la secuencia del ARN genómico del VHC de longitud completa derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 13 representa la secuencia del replicón de ARN que comprende el ARN genómico del VHC de longitud completa derivada del clon JFH-1.
La SEC DE ID Nº: 14 representa la secuencia del ARN genómico del VHC de longitud completa derivada del clon JFH-1 en el que el motivo de aminoácidos GDD se ha mutado en GND.
La SEC DE ID Nº: 15 representa la secuencia del replicón de ARN que comprende el ARN genómico del VHC de longitud completa derivada del clon JFH-1 en el que el motivo de aminoácidos GDD se h mutado en GND.
LAS SEC DE ID N^{os}: 16-20 representan las secuencias de los cebadores.
La SEC DE ID Nº: 21 representa la secuencia del replicón de ARN derivada de un vector de expresión oFGREP-JFH1/Luc.
La SEC DE ID Nº: 22 representa la secuencia del replicón de ARN derivada de un vector de expresión pFGREP-JFH1/Luc/GND.
La SEC DE ID Nº: 23 representa la secuencia del replicón de ARN derivada de un vector de expresión pFGREP-JFH1/EGFP.
La SEC DE ID Nº: 24 representa la secuencia del replicón de ARN derivada de un vector de expresión pFGREP-JFH1/EGFP/GND.
La SEC DE ID Nº: 25 representa la secuencia del replicón de ARN derivada de un vector de expresión pFGREP_JFH1/SEAP.
LA SEC DE ID Nº: 26 representa la secuencia del replicón d ARN derivada de un vector de expresión pFGREP-JFH1/SEAP/GND.
<110> Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research Toray Industries Inc.
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<120> Construcción de ácido nucleico que contiene el genoma de longitud completa del virus de la hepatitis C humana, células replicantes del genoma del virus recombinante de longitud completa que tienen la construcción de ácido nucleico transferida al anterior y procedimiento para producir partículas del virus de la hepatitis C
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<130> PH-2372-PCT
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<140> PCT/JP2005/003232
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<141> 21-02-2005
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<150> JP 2004-045489
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<151> 20-02-2004
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<160> 26
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 340
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<212> ARN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<220>
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<223> región 5' no traducida del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
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<220>
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<223> Inventor: Wakita, Takaji
\hskip1cm Inventor: Kato, Takanobu
\hskip1cm Inventor: Date, Tomoko
\hskip1cm Inventor: Miyamoto, Michiko
\hskip1cm Inventor: Tanabe, Junichi
\hskip1cm Inventor: Sone, Saburo
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 573
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<212> ARN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<223> secuencia de codificación de la proteína núcleo del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
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<400> 2
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<212> ARN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<223> secuencia de codificación de la proteína E1 del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 1290
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<212> ARN
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<213> Virus de la hepatitis C
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<223> secuencia de codificación de la proteína E2 del ARN genómico derivado del clon JFH-1
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<213> Virus de la hepatitis C
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<223> secuencia de codificación de la proteína NS2 del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del con JFH-1
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 1893
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de codificación de la proteína NS3 del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
6
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de codificación de la proteína NS4A del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 783
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de codificación de la proteína NS4B del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1398
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de codificación de la proteína NS5A del ARN genómico de virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de codificación del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
11
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región 3' no traducida del ARN genómico del virus de la hepatitis C derivado del clon JFH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
13 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9707
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la hepatitis C
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARN genómico del virus de la hepatitis C de longitud completa derivado del clon JFH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
14
15
16
17
18
19
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: replicón de ARN que comprende el ARN genómico del virus de la hepatitis C de longitud completa derivado del clon JFH-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
21
22
23
24
25
26
27
28 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: ARN genómico del virus de la hepatitis C de longitud completa derivado del clon JFH-1, en el que el motivo GDD de aminoácidos se ha mutado en GND
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
29
30
31
32
33
34
35 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9707
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial; replicón de ARN que comprende el ARN genómico del virus de la hepatitis C de longitud completa derivado del clon JFH-1, en el que un motivo GDD de aminoácidos se ha mutado en GND
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
36
37
38
39
40
41 
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<210> 16
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<211> 17
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 16
\hskip1cm42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11969
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: replicón de ARN derivado del vector de expresión rFGR-JFH1/Luc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
47
48
49
50
51
52
53
54 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
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<211> 11969
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
<220
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: replicón de ARN derivado del vector de expresión rFGR-JFH1/Luc/GND
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
55
56
57
58
59
60
61
62 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11036
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: replicón de ARN derivado del vector de expresión rFGR-JFH1/EGP
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
63
64
65
66
67
68
69 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11036
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: replicón de ARN derivado del vector de expresión fFGR-JFH1/EGFP/GND
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
70
71
72
73
74
75
76
77 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11876
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: replicón de ARN derivado del vector de expresión rFGR-JFH1/SEAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
78
79
80
81
82
83
84
85 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11876
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: replicón d ARN derivado del vector de expresión rFGR-JFH1/SEAP/GND
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
86
87
88
89
90
91
92
93

Claims (13)

1. Un replicón de ARN, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una región 5' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 1, una secuencia de codificación de una proteína núcleo que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2, una secuencia de codificación de la proteína E1 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 3, una secuencia de codificación de la proteína E2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 4, una secuencia de codificación de la proteína NS2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 5, una secuencia de codificación de la proteína NS3 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 6, una secuencia de codificación de la proteína NS4A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 7, una secuencia de codificación de la proteína NS4B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 8, una secuencia de codificación de la proteína NS5A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 9, una secuencia de codificación de la proteína NS5B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 10, una región 3' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 11, al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y al menos una secuencia IRES, en el que dicho al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y dicha al menos una secuencia IRES se colocan entre la región 5' no traducida y la secuencia de codificación de la proteína núcleo en este orden en la dirección 5' a 3', en el que dicho replicón de ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.
2. El replicón de ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos comprende la región 5' no traducida, el al menos un gen marcador seleccionable y/o el al menos un gen indicador, y la al menos una secuencia IRES, y la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NS5A, la secuencia de codificación de la proteína NS5B, y la región 3' no traducida en este orden en la dirección 5' a 3'.
3. El replicón de ARN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el ARN (a) o (b) siguiente:
(a)
un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 13; o
(b)
un ARN que comprende una secuencia de nucleótidos derivada de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 13 mediante delección, sustitución o adición de 1 a 100 nucleótidos, en el que dicho replicón de ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.
4. Un procedimiento para producir una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, que comprende introducir el replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de de las reivindicaciones 1 a 3 en una célula.
5. Una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, que comprende el replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. La célula de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula es una célula derivada de hígado humano, una célula derivada de cuello uterino humano o una célula derivada de riñón fetal humano.
7. La célula de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula es una célula Huh7, una célula HepG2, una célula IMY-N9, una célula HeLa o una célula 293.
8. Un procedimiento para producir una partícula de virus de la hepatitis C, que comprende cultivar la célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para permitir a la célula producir la partícula de virus.
9. Una partícula de virus de la hepatitis C que comprende el replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
10. Un procedimiento para cribar una sustancia contra el virus de la hepatitis C, que comprende cultivar, en presencia de una sustancia de ensayo, al menos una seleccionada entre el grupo constituido por (a), y (b) siguientes:
(a)
la célula de acuerdo con la reivindicación 5 a 7, y
(b)
la partícula de virus de la hepatitis C de acuerdo con la reivindicación 9 y la célula permisiva al virus de la hepatitis C;
y detectar el replicón de ARN o las partículas de virus en el cultivo resultante.
11. Una vacuna de la hepatitis C, que comprende la partícula de virus de la hepatitis C de acuerdo con la reivindicación 9 o una parte de la misma.
12. Un procedimiento para producir una vacuna de la hepatitis C usando la partícula de virus de la hepatitis C de acuerdo con la reivindicación 9 o una parte de la misma como un antígeno.
13. Uso del replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la producción de partículas de virus de la hepatitis C en células cultivadas.
ES05719575T 2004-02-20 2005-02-21 Construccion acidos nucleicos que contiene genoma longitud completa del virus hepatitis c humana; celula replicante genoma longitud completa virus recombinante que tiene construccion acidos nucleicos transferida al anterior y procedimiento construir particulas viricas hepatitis c. Active ES2346326T3 (es)

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