JPH09117287A - Ｇｂ型肝炎ウィルス組換蛋白質およびその使用 - Google Patents

Ｇｂ型肝炎ウィルス組換蛋白質およびその使用

Info

Publication number
JPH09117287A
JPH09117287A JP8146313A JP14631396A JPH09117287A JP H09117287 A JPH09117287 A JP H09117287A JP 8146313 A JP8146313 A JP 8146313A JP 14631396 A JP14631396 A JP 14631396A JP H09117287 A JPH09117287 A JP H09117287A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hgbv
antibody
polypeptide
sequence
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP8146313A
Other languages
English (en)
Inventor
Tami J Pilot-Matias
タミ・ジエイ・パイロツト−マテイアス
Thomas P Leary
トーマス・ピー・リアリー
John N Simons
ジヨン・エヌ・シモンズ
Robert J Carrick
ロバート・ジエイ・カーリツク
Teresa K Surowy
テレサ・ケイ・サロウイ
Suresh M Desai
シユレシユ・エム・デサイ
George J Dawson
ジヨージ・ジエイ・ドウソン
Anthony S Muerhoff
アントニー・エス・ミユアホフ
Isa K Mushahwar
アイサ・ケイ・マツシヤーワー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of JPH09117287A publication Critical patent/JPH09117287A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C12Q1/707—Specific hybridization probes for hepatitis non-A, non-B Hepatitis, excluding hepatitis D
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 各種の診断用途および治療用途に有用な組換産生された
ＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）アミノ酸配列、ＨＧＢ
Ｖアミノ酸配列を使用するためのキット、およびＨＧＢ
Ｖに特異的に結合する抗体につき開示する。さらに、Ｈ
ＧＢＶ組換産生アミノ酸配列からのポリクローナルもし
くはモノクローナル抗体の産生方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は一般に人間にて肝
炎を引き起こす「ＧＢ型ウィルス」と現在呼ばれる１群
の感染性ウィルス因子に関するものであり、より詳細に
はこの群のウィルスから得られるポリヌクレオチド、そ
れにコードされるポリペプチド、これらポリペプチドに
特異的に結合する抗体などの物質、並びにこれら物質を
用いる診断剤およびワクチンに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】肝炎は血液製剤の輸液、器官移植および
血液透析の際に、ドナーからレシピエントへと伝染する
最も重要な病気の１種である。さらに、これは汚染食品
および水の摂取を介し或いはヒトとヒトとの接触によっ
ても伝染しうる。ウィルス性肝炎は異なるウィルス遺伝
子および複製モードを有する１群のウィルス因子を包含
することが知られ、異なる伝染経路を介し異なる程度の
肝臓損傷を伴う肝炎を生ぜしめる。ある種の場合、急性
ウィルス肝炎は黄疸、肝軟化およびたとえばアスパルテ
ート トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニン トラ
ンスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびイソサイトレート デ
ヒドロゲナーゼ（ＩＳＤ）のような肝臓トランスアミナ
ーゼの上昇レベルをのような、明確な患者の徴候により
臨床的に診断される。他の場合、急性ウィルス肝炎は臨
床的に不明瞭である。肝炎のウィルス因子はＡ型肝炎ウ
ィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型
肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、δ型肝炎ウィルス（ＨＤ
Ｖ）、Ｅ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）、エプスタイン・バ
ールウィルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウィルス
（ＣＭＶ）を包含する。
【０００３】ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の有無で献
血を選別する１９６０年代の後半当時利用しえた特異的
な血清学的分析は、血液レシピエントにおける輸液後の
肝炎（ＰＴＨ）の発生を減少させるのに成功したが、Ｐ
ＴＨはなお相当な割合で発生し続けている［Ｈ．Ｊ．ア
ルター等、アニュアル・インターナショナル・メジス
ン、第７７巻、第６９１〜６９９頁（１９７２）；Ｈ．
Ｊ．アルター等、ランセットｉｉ、第８３８〜８４１頁
（１９７５）］。研究者等は、人間にて肝炎を引き起こ
すことが従来知られていたウィルス（ＨＡＶ、ＨＢＶ、
ＣＭＶおよびＥＢＶ）に露呈がなくとも、ウィルス性肝
炎を引き起こすような「非Ａ、非Ｂ型肝炎」（ＮＡＮＢ
Ｈ）と称する新規な作用因子につき探求し始めた［たと
えばＳ．Ｍ．ファインストーン等、ニュー・イングラン
ド・ジャーナル・メジスン、第２９２巻、第７６７〜７
７０頁（１９７５）；匿名の編集者、ランセットｉｉ、
第６４〜６５頁（１９７５）；Ｆ．Ｂ．ホリンガー、
Ｂ．Ｎ．フィールズおよびＤ．Ｍ．ナイペ等、バイロロ
ジー、ラベン・プレス社、ニューヨーク、第２２３９〜
２２７３頁（１９９０）参照］。
【０００４】複数の疫学的および実験室的証明による
と、静脈内薬物使用者における急性ＮＡＮＢＨの多発；
ＮＡＮＢＨ輸液後に発生する患者の明確な潜伏期間；ク
ロスチャレンジのチンバンジー実験の結果；感染チンバ
ンジーの超構造的肝臓病理学；およびクロロホルムに対
する推定因子の異なる耐性を含め、２種以上の経口伝染
ＮＡＮＢ剤の存在を示唆している［Ｊ．Ｌ．ディーンス
ターク、ガストロエンテロロジー、第８５巻、第４３９
〜４６２頁（１９８３）；Ｊ．Ｌ．ディーンスターク、
ガストロエンテロロジー、第８５巻、第７４３〜７６８
頁（１９８３）；Ｆ．Ｂ．ホリンガー等、ジャーナル・
インフェクシャス・ディジーズ、第１４２巻、第４００
〜４０７頁（１９８０）；Ｄ．Ｗ．ブラッドレー、Ｆ．
チサリー編、アドバンシス・イン・ヘパチチス・リサー
チ、メイソン、ニューヨーク、第２６８〜２８０頁（１
９８４）；並びにＤ．Ｗ．ブラッドレー等、ジャーナル
・インフェクシャス・ディジーズ、第１４８巻、第２５
４〜２６５頁（１９８３）］。
【０００５】急性肝炎を発症した外科医から得られた血
清試料は、タマリンザル（サグイヌス・スペシース）に
接種すると肝炎を誘発することが示された。４匹のタマ
リンザルのうち４匹とも接種後の数週間以内に肝臓酵素
の上昇を発生し、この外科医の血清における因子がタマ
リンザルにて肝炎を引き起こしうることを示唆してい
る。各種の非ヒト霊長動物における一連の継代接種はこ
の肝炎が伝染性因子により引き起こされたことを示し、
濾過試験はこの因子がウィルス性であることを示唆し
た。外科医およびタマリンザルにおけるこれら肝炎の病
例の原因となる伝染性因子を「ＧＢ因子」と称した
［Ｆ．ダインハルト等、ジャーナル・エキスペリメンタ
ル・メジスン、第１２５巻、第６７３〜６８８頁（１９
６７）；Ｆ．ダインハルト等、ジャーナル・エキスペリ
メンタル・メジスン、上記；Ｅ．テーバー等、ジャーナ
ル・メジカル・バイロロジー、第５巻、第１０３〜１０
８頁（１９８０）；Ｒ．Ｏ．ウィッチントン等、非ヒト
霊長類におけるウィルス性および免疫学的疾病、アラン
Ｒ．リス社、ニューヨーク、第２２１〜２２４頁（１９
８３）］。
【０００６】ＧＢ因子はヒトにてＮＡＮＢＨを引き起こ
す因子であると共に、ＧＢ因子は各種の実験室で検討さ
れた既知のＮＡＮＢＨ因子とは異なることも示唆された
が、ＧＢ因子に関する明確もしくは結論的な検討は知ら
れておらず、ウィルス性因子は発見も分子的特性化もな
されていない［Ｆ．ダインハルト等、アメリカン・ジャ
ーナル・メジカル・サイエンス、第２７０巻、第７３〜
８０頁（１９７５）；並びにＪ．Ｌ．ディーンスターク
等、ネイチャー、第２６４巻、第２６０〜２６１頁（１
９７６）］。さらにＥ．テーバー等、ジャーナル・メジ
カル・バイロロジー、上記；Ｅ．テーバー等、ジャーナ
ル・インフェクシャス・ディジーズ、第１４０巻、第７
９４〜７９７頁（１９７９）；Ｒ．Ｏ．ウィッチントン
等、上記、；並びにＰ．カラヤニス等、ヘパトロジー、
第９巻、第１８６〜１９２頁（１９８９）をも参照。
【０００７】初期研究が示したところでは、ＧＢ因子は
如何なる公知のヒト肝炎ウィルスとも異なっていた
［Ｓ．Ｍ．ファインストーン等、サイエンス、第１８２
巻、第１０２６〜１０２８頁（１９７３）；Ｐ．Ｊ．プ
ロボスト等、プロシーディング・ソサエティ・エキスペ
リメンタル・バイオロジカル・メジスン、第１４８巻、
第５３２〜５３９頁（１９７５）；Ｊ．Ｌ．メルニッ
ク、インターバイロロジー、第１８巻、第１０５〜１０
６頁（１９８２）；Ａ．Ｗ．ホルムス等、ネイチャー、
第２４３巻、第４１９〜４２０頁（１９７３）；並びに
Ｆ．ダインハルト等、アメリカン・ジャーナル・メジカ
ル・サイエンス、上記］。しかしながら、ＧＢ因子がヒ
トにて肝炎感染を引き起こすウィルスであるか或いはＧ
Ｂ血清により活性化される潜伏タマリンザル ウィルス
であって活性化されると容易に他のタマリンザルに容易
に感染して肝炎を誘発するかどうかに関し、多くの疑問
が提起された。さらにＧＢ陽性血清を接種したマルモセ
ットザルにも臨床的肝炎を発生しないものが少数あり
（５２匹のうち４匹、すなわち７．６％）、これら動物
が自然免疫性であって、ＧＢ因子がマルモセットザル
ウィルスであることを示唆する［Ｗ．Ｐ．パークス等、
ジャーナル・インフェクシャス・ディジーズ、第１２
０、第５３９〜５４７頁（１９６９）；Ｗ．Ｐ．パーク
ス等、ジャーナル・インフェクシャス・ディジーズ、第
１２０、第５４８〜５５９頁（１９６９）］。形態学的
研究も同等であって、１つの報告における免疫電子顕微
鏡検査が示したところでは２０〜２２ｎｍの寸法分布を
有すると共にパルボウィルスの球状構造に類似した免疫
複合体をＧＢ因子が形成し、他の研究の報告によればＧ
Ｂ陽性タマリンザルの肝臓ホモゲナイズ物から得られた
免疫電子顕微鏡データは２０面体の対称性をもった３４
〜３６ｎｍの凝集体が検出されたことを示し、これはＧ
Ｂ因子がカリチ類似ウィルスであることを示唆する［た
とえばＪ．Ｄ．アルメイダ等、ネイチャー、第２６１、
第６０８〜６０９頁（１９７６）；Ｊ．Ｌ．ディーンス
ターク等、ネイチャー、上記参照］。
【０００８】２種の肝炎発生ウィルスが最近発見され報
告されている：すなわち主として非経口伝染を介して発
生するＨＣＶ、および腸内伝染するＨＥＶである［たと
えばＱ．Ｌ．チュー等、サイエンス、第２４４巻、第３
５９〜３６２頁（１９８９）；Ｇ．クオ等、サイエン
ス、第２４４巻、第３６２〜３６４頁（１９８９）；ヨ
ーロッパ公開公報第０ ３１８ ２１６号（１９８９年
５月３１日付け公開）；Ｇ．Ｒ．レイス等、サイエン
ス、第２４７巻、第１３３５〜１３３９頁（１９９０）
参照］。ＨＣＶはＮＡＮＢＨ因子に起因する大部分のＰ
ＴＨの原因であり、急性ＮＡＮＢＨの多くの病例は輸液
によるものではない［匿名の編集者、ランセント、第３
３５巻、第１４３１〜１４３２頁（１９９０）；Ｊ．
Ｌ．ディーンスターク、ガストロエンテロロジー、第９
９巻、第１１７７〜１１８０頁（１９９０）；並びに
Ｍ．Ｊ．アルター等、ＪＡＭＡ、第２６４巻、第２２３
１〜２２３５頁（１９９０）］。
【０００９】ドナー試料におけるＨＣＶ抗体の検出によ
り血液供給系におけるＮＡＮＢＨ感染血液の７０〜８０
％は排除されたが、ＨＣＶの発見および検出は肝炎の伝
染を完全には防止していない［Ｈ．アルター等、ニュー
・イングランド・ジャーナル・メジスン、第３２１巻、
第１４９４〜１５００頁（１９８９）］。最近の刊行物
は、他の肝炎因子がＰＴＨの原因となりうるか或いはＰ
ＴＨに関連しない後天的な急性および／または慢性肝炎
であるかどうか疑問視している。たとえば１９８８年か
ら１９９０年までフランスにて行われた臨床調査にて監
視された１８１名の患者のうち、研究者は全部で１８例
のＰＴＨを認めた。これら１８名の患者のうち１３名は
抗−ＨＣＶ抗体、ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶおよびＨＣＶ核酸
につき陰性であった。ＰＴＨを引き起こす非Ａ型、非Ｂ
型、非Ｃ型因子の潜在的重要性に関し著者等は推測する
［Ｖ．チアス等、ジャーナル・ヘパトロジー、第１８
巻、第３４〜３９頁（１９９３）］。さらに、１９８５
年から１９８８年までドイツにて行われた他の研究で監
視された１，４７６名の患者のうち、２２例の報告され
たＰＴＨの病例はＨＢＶもしくはＨＣＶでの感染とは無
関係であった［Ｔ．ピータース等、ジャーナル・メジカ
ル・バイロロジー、第３９巻、第１３９〜１４５頁（１
９９３）］。
【００１０】肝炎を引き起こす１群の新規かつ独特なウ
ィルスから得られコードする、ここに開示した組換抗原
のような物質を同定すると共に提供し、さらにこれら物
質を用いる診断剤およびワクチンを提供することが有利
であろう。この種の材料は急性および／または慢性ウィ
ルス肝炎を医学界が一層正確に診断する能力を著しく向
上させると共に、これら血液および器官供与における非
Ａ型、非Ｂ型および非Ｃ型肝炎を検出することにより一
層安全な血液および器官の供給を可能にするであろう。
【００１１】
【発明の要点】本発明は、アミノ酸配列もしくはその断
片からなり、前記配列が正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とし、
前記ゲノムがポリ蛋白質をコードする開放読み枠（ＯＲ
Ｆ）を有し、前記ポリ蛋白質がＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ
−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群から選択されるアミ
ノ酸配列に対し少なくとも３５％の同一性を有するアミ
ノ酸配列を含む組換ポリペプチドを提供し、前記組換ポ
リペプチドはｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／
Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦ
Ｖ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃ
ＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミド
から産生されるものである。さらに少なくとも１種のＧ
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）エピトープに向けられる
抗体も提供され、ここで該抗体は組換ポリペプチドで個
体を免疫化した結果産生されるもので、前記組換ポリペ
プチドはｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２
−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−
ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ
６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから
産生される。抗体はポリクローナルもしくはモノクロー
ナルである。
【００１２】さらに本発明は少なくとも１種のＧＢ型肝
炎ウィルス（ＨＧＢＶ）ポリペプチドもしくはその断片
を含む融合ポリペプチドをも提供し、ここで該融合ポリ
ペプチドはｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ
２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ
−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧ
Ｐ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドか
ら産生される。
【００１３】さらに、試験試料におけるＧＢ型肝炎ウィ
ルス（ＨＧＢＶ）抗原もしくは抗体の存否を判定するた
めの分析キットも提供され、これはＨＧＢＶ抗原に存在
する少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを有する組換
ポリペプチドを含有した容器を備え、前記ポリペプチド
は正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とし、前記ゲノムはポリ蛋白
質をコードする開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ
蛋白質はＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−
Ｃよりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なく
とも３５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むと共に
ｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３
６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／
ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−
Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生さ
れる。この分析キットのポリペプチドは固相に付着させ
ることができる。さらに、ポリペプチドは測定可能なシ
グナルを発生するシグナル発生化合物と結合させること
もできる。該シグナル発生化合物は酵素、蛍光性化合物
または化学発光性化合物よりなる群から選択される。試
験試料におけるＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）抗原も
しくは抗体の存否を判定するための他の分析キットも提
供され、このキットはＨＧＢＶ抗原に特異的に結合する
抗体を含有した容器を備え、前記抗原はＨＧＢＶの配列
に対し少なくとも約６０％の配列類似性を有する配列に
よりコードされるＨＧＢＶエピトープを含み、前記抗体
はｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３
６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／
ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−
Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生さ
れた組換ポリペプチドで個体を免疫化した結果産生され
る。抗体は固相に付着させることができる。さらに抗体
は、測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物
を含む指示薬と接合させることもできる。このシグナル
発生化合物は酵素、蛍光性化合物または化学発光性化合
物よりなる群から選択される。
【００１４】本発明によれば、少なくとも１種のＧＢ型
肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）エピトープを含有するポリペ
プチドの産生方法も提供され、この方法は正鎖ＲＮＡゲ
ノムを特徴とするポリペプチドをコードする配列を含ん
だ発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養
し、前記ゲノムはポリ蛋白質をコードする開放読み枠
（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋白質はＨＧＢＶ−Ａ、Ｈ
ＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群から選択され
るアミノ酸配列に対し少なくとも３５％の同一性を有す
るアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドはｓＳｉｎＲ
ｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ
−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣ
ＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりな
る群から選択されるプラスミドから産生される。
【００１５】さらに本発明はＨＧＢＶ含有が疑われる試
験試料におけるＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）抗原の
検出方法をも提供し、この方法は試験試料を少なくとも
１種のＨＧＢＶ抗原に特異的に結合する抗体もしくはそ
の断片と抗体／抗原複合体を形成させるのに充分な時間
および条件にて接触させると共に、抗体を含有する前記
複合体を検出することからなり、ここで前記抗体はｓＳ
ｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐ
ＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ
３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２
Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生された
組換ポリペプチドで個体を免疫化した結果産生される。
該抗体はモノクローナルもしくはポリクローナルのいず
れかであって、固相に付着させることができる。複合体
は、測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物
を含む指示薬に接合させることもできる。シグナル発生
化合物は酵素、蛍光性化合物または化学発光性化合物よ
りなる群から選択される。
【００１６】ＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）抗体含有
が疑われる試験試料にて前記抗体を検出する方法も提供
され、この方法は試験試料を組換ポリペプチドと接触さ
せ、このポリペプチドは正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする
アミノ酸配列もしくはその断片を含む少なくとも１種の
ＨＧＢＶエピトープを含有し、前記ゲノムはポリ蛋白質
をコードする開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋
白質はＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃ
よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくと
も３５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記接
触を抗原／抗体複合体を形成させるのに充分な時間およ
び条件にて行い；さらにプローブポリペプチドを含有す
る前記複合体を検出し、前記ポリペプチドはｓＳｉｎＲ
ｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ
−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣ
ＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりな
る群から選択されたプラスミドから産生される。プロー
ブポリペプチドは固相に付着させることができる。この
固相はビーズ、マイクロタイターウエル、試験管の壁
部、ニトロセルロースストリップ、磁性ビーズおよび非
磁性ビーズよりなる群から選択される。複合体は、測定
可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物を含む指
示薬に接合させることができる。シグナル発生化合物は
酵素、蛍光性化合物または化学発光性化合物よりなる群
から選択される。
【００１７】さらに本発明は、薬理有効量の免疫原性Ｈ
ＧＢＶ組換ポリペプチドもしくはその断片からなり、前
記ポリペプチドが正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とし、前記ゲ
ノムがポリ蛋白質をコードする開放読み枠（ＯＲＦ）を
有し、前記ポリ蛋白質がＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂお
よびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群から選択されるアミノ酸配
列に対し少なくとも３５％の同一性を有するアミノ酸配
列を含む、医薬上許容しうる賦形薬におけるＧＢ型肝炎
ウィルス（ＨＧＢＶ）感染を処置するためのワクチンを
も提供し、前記ポリペプチドはｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ
５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２
−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３
１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択
されるプラスミドから産生されるものである。
【００１８】さらにＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）に
対する抗体の産生方法も提供され、ここで免疫反応を生
ぜしめるのに充分な量にて少なくとも１種のＨＧＢＶエ
ピトープを含む分離された免疫原性組換ポリペプチドも
しくはその断片を個人に投与し、前記ポリペプチドはｓ
ＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、
ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ
３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２
Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生される
ものである。
【００１９】さらにＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）か
ら得られる組換ポリペプチドもしくはその断片を含み、
前記ポリペプチドもしくはその断片がＨＧＢＶの少なく
とも１種のエピトープをコードすると共に正鎖ＲＮＡゲ
ノムを特徴とし、前記ゲノムがポリ蛋白質をコードする
開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋白質がＨＧＢ
Ｖ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群か
ら選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも３５％の同
一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが
ｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３
６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／
ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−
Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生さ
れることを特徴とする診断試薬も提供される。
【００２０】さらに本発明はＨＧＢＶ感染した患者から
のＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）の除去を判定する方
法をも提供し、この方法は前記患者から得られた試験試
料を組換ポリペプチドと接触させ、前記ポリペプチドは
正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするアミノ酸配列もしくはそ
の断片からなる少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを
含み、前記ゲノムはポリ蛋白質をコードする開放読み枠
（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋白質はＨＧＢＶ−Ａ、Ｈ
ＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群から選択され
るアミノ酸配列に対し少なくとも３５％の同一性を有す
るＨＧＢＶ Ｅ２のアミノ酸配列を含み、前記接触を抗
原／抗体複合体を形成させるのに充分な時間および条件
にて行い、前記ポリペプチドはｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ
５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２
−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３
１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択
されるプラスミドから産生され；前記複合体を検出し、
前記複合体の存在があれば前記患者から前記ＨＧＢＶウ
ィルスが除去されたことを示すことを特徴とする。この
組換ポリペプチドは固相に付着させることができ、固相
はビーズ、マイクロタイターウエル、試験管の壁部、ニ
トロセルロースストリップ、磁性ビーズおよび非磁性ビ
ーズよりなる群から選択することができる。複合体は、
測定可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物を含
む指示薬に接合させることもできる。シグナル発生化合
物は酵素、蛍光性化合物または化学発光性化合物よりな
る群から選択される。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明は、総合して「ＧＢ型肝炎
ウィルス」、すなわち「ＨＧＢＶ」と称する新たに確認
された非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型および非Ｅ型の
肝炎発生因子の病因因子の特性化に関する。本発明はＨ
ＧＢＶ病因因子の存否の判定方法、並びにＨＧＢＶによ
る個体（ヒトもしくはタマリンザル）からの感染血清、
血漿もしくは肝臓ホモゲナイズ物より生じた前記病因因
子の核酸を得て従来分離されていないウィルス因子のゲ
ノムから得られた新規な合成抗原を検出する方法、およ
び非感染個体になく感染個体にのみ見られる産生物を産
生するクローンの選択方法を提供する。
【００２２】ＨＧＢＶゲノム内にコードされるＨＧＢＶ
抗原のポリペプチド配列が判明すれば、診断試験におけ
る標準もしくは試薬として或いはワクチンの成分として
有用であるポリペプチドの産生を可能にする。これらポ
リペプチド配列内に含まれた少なくとも１種のエピトー
プに向けられるここに開示した少なくとも１種の組換抗
原を動物に接種した結果として産生されたモノクローナ
ルおよびポリクローナル抗体は、診断試験および治療剤
につき有用であると共に抗ウィルス剤のスクリーニング
およびＨＧＢＶ剤の分離にも有用である。
【００２３】本発明の１面によれば、ＨＧＢＶのエピト
ープをコードする組換ポリペプチド；上記組換ポリペプ
チドを含有する組換ベクター；およびこれらベクターに
より形質転換された宿主細胞が提供される。これら組換
ポリペプチドは単独でまたは組合せて或いはＨＧＢＶの
エピトープを示す他の物質と一緒に使用することができ
る。
【００２４】本発明の他面において、ＨＧＢＶゲノムか
ら或いはＨＧＢＶ ｃＤＮＡから得られたＤＮＡの開放
読み枠（ＯＲＦ）を有する組換発現系が提供され、ここ
でＯＲＦは所望宿主、組換発現系で形質転換された細
胞、および形質転換細胞により産生されたポリペプチド
に適合しうる制御配列に作用可能なように結合する。
【００２５】他面において本発明は、少なくとも１種の
組換ＨＧＢＶポリペプチド、すなわちＨＧＢＶゲノムか
ら或いはＨＧＢＶ ｃＤＮＡから得られた配列を含む少
なくとも１種の組換ポリペプチド；ＨＧＢＶエピトープ
からなる少なくとも１種の組換ポリペプチド；およびＨ
ＧＢＶポリペプチドからなる少なくとも１種の融合ポリ
ペプチドを包含する。
【００２６】さらに本発明は、ＨＧＢＶの少なくとも１
種のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体
の産生方法；少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープに特
異的に結合するポリクローナル抗体の精製製剤；並びに
診断、予防および治療用途を含むこれら抗体の使用方法
をも提供する。
【００２７】さらに本発明の他面において、前記配列が
真核性宿主およびＨＧＢＶエピトープで産生された際に
粒子を形成しうるアミノ酸配列をもった非ＨＧＢＶポリ
ペプチドからなるＨＧＢＶ感染に対し免疫化する粒子も
提供される。
【００２８】ＨＧＢＶのためのポリヌクレオチドプロー
ブも提供される。
【００２９】さらに本発明は、ＨＧＢＶから得られた抗
原もしくは抗体の存否および／または量を検出すべく使
用しうる試薬を含有したキットを提供し、これら試薬は
約３〜５個もしくはそれ以上のアミノ酸よりなるＨＧＢ
Ｖからのアミノ酸配列を含有する組換抗原を適する容器
内に含み、さらに検出すべきＨＧＢＶ抗原に向けられる
抗体を含むＨＧＢＶ抗原の存否および／または量を検出
するための試薬を適する容器内に含む。さらに以下に説
明するように、各種の分析方式に関する他のキットも本
発明により提供される。
【００３０】他面において本発明は、固相に付着させた
少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープからなるポリペプ
チドおよび固相に付着させたＨＧＢＶエピトープに対す
る抗体を包含する。さらにＨＧＢＶエピトープを含有す
るポリペプチドの産生方法も包含され、この方法はＨＧ
ＢＶエピトープを含有したポリペプチドをコードする配
列を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を
該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するこ
とからなり、さらにこの方法により産生されたＨＧＢＶ
エピトープを含有するポリペプチドも包含される。
【００３１】さらに本発明は、本発明により提供される
組換ポリペプチドを用いる分析、並びにこの分析にてシ
グナル発生化合物を用いうる各種の方式におけるここに
説明した抗体をも提供する。検出の手段を提供するシグ
ナル発生化合物を利用しない分析についても提供され
る。記載した分析は全て一般に抗原もしくは抗体のいず
れか或いはその両者を検出し、試験試料を少なくとも１
種のここで提供された試薬と接触させて少なくとも１種
の抗原／抗体複合体を生成させ、この複合体の存在を検
出することを含む。これら分析につき以下詳細に説明す
る。
【００３２】ＨＧＢＶエピトープを含有する免疫原性ペ
プチドからなるＨＧＢＶ感染を処置するためのワクチ
ン、またはＨＧＢＶの失活製剤またはＨＧＢＶの弱毒化
製剤またはＨＧＢＶエピトープを発現する組換ワクチン
の使用および／または合成ペプチドの使用も本発明に包
含される。有効なワクチンはこれら免疫原性ペプチド
（たとえば少なくとも１種の組換抗原が同時にもしくは
異なる時点で投与されるここに開示されたもの、合成ペ
プチドおよび天然ウィルス抗原から選択される組換抗原
のカクテル）の組合せ物を使用することができ、これら
の幾種かは単独で使用することができ或いは他の免疫原
性エピトープを後の時点で補充することもできる。さら
に本発明にはＨＧＢＶに対する抗体の産生方法も包含さ
れ、この方法は接種された個体に免疫反応を生ぜしめる
のに充分な量にてＨＧＢＶエピトープを含有する分離さ
れた免疫原性ポリペプチドを個体に投与することからな
っている。
【００３３】ここで用いる「ＧＢ型肝炎ウィルス」、す
なわち「ＨＧＢＶ」という用語は総合して人間に非Ａ
型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型肝炎を引き起こす
ウィルス種、並びにそれらから得られた弱毒化菌株また
は欠損阻害性粒子を意味する。これは汚染食品、飲料水
などにより伝染した急性ウィルス肝炎；ヒトとヒトとの
接触による伝染（性的伝染、呼吸および非経口ルートを
含む）または静脈内薬物使用により伝染したＨＧＢＶに
基づく肝炎を包含する。ここに説明する方法はＨＧＢＶ
に罹患した個体の同定を可能にする。個別的にＨＧＢＶ
分離物は特に「ＨＧＢＶ−Ａ」、「ＨＧＢＶ−Ｂ」およ
び「ＨＧＢＶ−Ｃ」と呼ばれる。ここに記載するＨＧＢ
ＶゲノムはＲＮＡで構成される。ＨＧＢＶのヌクレオチ
ド配列および推定アミノ酸配列の分析結果は、この群の
ウィルスがフラビリデー科におけると同様なゲノム構成
を有することを示す。限定はしないが主としてゲノム構
成の類似性に基づき、ウィルス分類学国際委員会はこの
科が３種の属、すなわちフラビウィルス属、ペスチウィ
ルス属およびＣ型肝炎群で構成されると推奨している。
アミノ酸レベルにおける類似性の検査が示すところで
は、ＧＢ型肝炎ウィルスサブクローンは低いが或る程度
Ｃ型肝炎ウィルスと配列類似性を有する。ここに示した
情報は他のＨＧＢＶ菌株の分類を行うにも充分である。
【００３４】数種類の証拠は、ＨＧＢＶ−ＣがＨＣＶの
遺伝子型でないことを示す。第１に、ＨＧＢ−Ｃ配列を
含有する血清をＨＣＶ抗体の存否につき試験した。ＨＣ
Ｖに露呈され或いは感染した個体の通常の検出法は、Ｈ
ＣＶ−１からの３個もしくはそれ以上の領域から得られ
た抗原を用いる抗体試験に依存する。これら試験はＨＣ
Ｖの既知の遺伝子型に対する抗体の検出を可能にする
［たとえばサカモト等、ジャーナル・ジェネチック・バ
イロロジー、第７５巻、第１７６１〜１７６８頁（１９
９４）およびスタイバー等、ジャーナル・ジェネチック
・バイロロジー、第７４巻、第１０９３〜１１０２頁
（１９９３）参照］。ＨＣＶ−特異性ＥＬＩＳＡは８例
のうち６例にてＧＢ−Ｃ配列を含有する血清を検出でき
なかった。第２に、ＨＣＶ抗体につき血清陰性であった
数種のヒト血清は高感度ＲＴ−ＰＣＲ分析によりＨＣＶ
ゲノムＲＮＡにつき陽性であることが示されている［ス
ギタニ、ランセット、第３３９巻、第１０１８〜１０１
９頁（１９９２）］。この分析は、ＨＧＢ−Ｃ配列を含
有する８種の血清のうち７種にてＨＣＶ ＲＮＡを検出
できなかった（表Ａ）。したがって、ＨＧＢＶ−Ｃは血
清学的分析および分子的分析の両者に基づきＨＣＶの遺
伝子型でない。
【００３５】ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＣＶ−１
およびフラビビリデーの他の員子の相同性領域ヘリカー
ゼ領域内のＨＧＢＶ−Ｃにおける推定翻訳生成物を歩合
整合し、整合配列を系統発生分析したところでは、ＨＧ
ＢＶ−Ｃが任意のＨＣＶ群の員子よりもＨＧＢＶ−Ａに
対し一層近縁であることを示唆する。ＨＧＢＶ−Ｃおよ
びＨＧＢＶ−Ａの配列は０．４２の進化間隔を示すが、
０．９２の進化間隔を示すＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ｂ
との間隔ほど広くない。したがってＨＧＢＶ−Ａおよび
ＨＧＢＶ−ＣはＧＢ型ウィルスの１サブ群の員子であ
り、ＧＢＶ−Ｂはそれ自身のサブ群の員子であると考え
られる。各種のＨＣＶ分離物からのヘリカーゼ配列の系
統発生分析はこれらが拡散度がずっと低い群を形成する
ことを示し、０．２０の最大進化間隔を示す。ＨＣＶ群
とＨＧＢＶ群との比較は、各群からの任意の２配列間に
おける最小進化間隔でも０．６９を示す。上記に示した
間隔値は系統発生トリーを示すべく使用した。これらウ
ィルス間の比較的高度の拡散は、ＧＢウィルスが単にＣ
型肝炎群における種類またはサブ種類でないことを示唆
する。寧ろ、これらはそれ自身の系統群を構成する。Ｈ
ＣＶウィルスゲノムの小部分から得られた配列情報を用
いる系統発生分析は、新たな分離物を遺伝子型群に割付
けるための許容しうる方法であることが示されている
［シモンズ等、ヘパトロジー、第１９巻、第１３２１〜
１３２４頁（１９９４）］。最近の分析において、代表
的ＨＣＶ分離物からのヘリカーゼ遺伝子内における１１
０アミノ酸配列を使用して、これらをそれぞれ各遺伝子
型に適切に分類している［シモンズ等、ジャーナル・ジ
ェネチック・バイロロジー、第７５巻、第１０５３〜１
０６１頁（１９９４）］。したがって恐らく、示した進
化間隔はＧＢウィルスとＣ型肝炎ウィルスとの間の高度
の拡散性を正確に反映する。
【００３６】アミノ酸配列の「類似性」および／または
「同一性」を決定する技術は当業界で周知されており、
たとえばアミノ酸配列を直接に決定すると共にこれをこ
こに示された配列と比較すること；推定ＨＧＢＶのゲノ
ム物質のヌクレオチド配列を決定すること（一般にｃＤ
ＮＡ中間体を介する）；およびここでコードされたアミ
ノ酸配列を決定すると共に対応領域を比較することを包
含する。一般に「同一性」という用語は、ＨＧＢＶのヌ
クレオチド配列と他の菌株のヌクレオチド配列との或い
はＨＧＢＶのアミノ酸配列と他の菌株のアミノ酸配列と
の各ゲノムにおける適正位置での正確な整合を意味す
る。さらに、一般に「類似性」という用語はＨＧＢＶの
アミノ酸配列と他の菌株のアミノ酸配列との適正位置に
おける正確な整合を意味し、ここでアミノ酸は同一であ
るか或いはたとえば電荷もしくは疎水性のような類似し
た化学的および／または物理的性質を有する。ウィスコ
ンシン・シーケンス・アナリシス・パッケージ、バージ
ョン８（ジェネチックス・コンピュータ・グループ社、
マジソン、ウィスコンシン州、５３７１１から入手）の
プログラム、たとえばＧＡＰプログラムは、２種のポリ
ヌクレオチド配列間または２種のポリペプチド配列間に
おける同一性および類似性の両者を計算することができ
る。２種の配列間の同一性および類似性を計算するため
の他のプログラムも当業界にて公知である。
【００３７】さらにＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂもしく
はＨＧＢＶ−Ｃの菌株を同定する際に次のパラメータを
単独で或いは組合せて用いることができる。ＨＧＢＶ−
Ａ、ＨＧＢＶ−ＢもしくはＨＧＢＶ−Ｃと、これらＧＢ
型肝炎ウィルスの１種との間のゲノムの全体的ヌクレオ
チド配列の同一性は約４５％もしくはそれ以上であると
予想される。何故なら、現在ではＨＧＢＶ菌株は好まし
くは約６０％もしくはそれ以上、より好ましくは約８０
％もしくはそれ以上で遺伝子的に関連すると思われるか
らである。
【００３８】さらに、アミノ酸レベルにおけるＨＧＢＶ
−ＡとＨＧＢＶ−Ａの１菌株との間のゲノムの全体的な
配列同一性は約３５％もしくはそれ以上であると予想さ
れる。何故なら、現在ではＨＧＢＶ菌株は好ましくは４
０もしくはそれ以上、より好ましくは約６０％もしくは
それ以上、特に好ましくは約８０％もしくはそれ以上で
遺伝的に関連すると思われるからである。さらに少なく
とも約１３ヌクレオチドの対応する隣接配列も存在し、
これらは２つ以上の隣接配列の組合せで存在することが
できる。さらに、アミノ酸レベルにおけるＨＧＢＶ−Ｂ
とＨＧＢＶ−Ｂの１菌株との間のゲノムの全体的な配列
同一性は約３５％もしくはそれ以上であると予想され
る。何故なら、現在ではＨＧＢＶ菌株は好ましくは約４
０％もしくはそれ以上、より好ましくは約６０％もしく
はそれ以上、さらに好ましくは約８０％もしくはそれ以
上で遺伝的に関連すると思われるからである。さらに少
なくとも約１３ヌクレオチドの対応する隣接配列も存在
し、これらは２つ以上の隣接配列の組合せで存在するこ
とができる。さらにアミノ酸レベルにおけるＨＧＢＶ−
ＣとＨＧＢＶ−Ｃの菌株との間のゲノムの全体的な配列
同一性は約３５％もしくはそれ以上であると予想され
る。何故なら、現在ではＨＧＢＶ菌株は好ましくは約４
０％もしくはそれ以上、より好ましくは約６０％もしく
はそれ以上、さらに好ましくは約８０％もしくはそれ以
上で遺伝的に関連すると思われるからである。さらに少
なくとも約１３ヌクレオチドの対応する隣接配列も存在
し、これらは２つ以上の隣接配列の組合せで存在するこ
とができる。
【００３９】ここに説明した組成および方法は、ＨＧＢ
Ｖおよびその可能な菌株の増殖、同定、検出および分離
を可能にする。さらに、これらは可能な異なるＨＧＢＶ
の菌株につき診断剤およびワクチンの製造を可能にし、
抗ウィルス剤のスクリーニング法に用途を有する。この
情報は、ウィルス分類学者がこれら種類内に入る他の菌
株を同定しうるのに充分である。ＨＧＢＶはここに包含
される配列をコードすると思われる。これら配列の存在
に関する分析方法は当業界にて公知であり、たとえばリ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）およびハイブリッド化のような増幅法を包含す
る。さらに、これら配列は免疫原性ウィルスエピトープ
を見出しうる開放読み枠を有する。このエピトープは他
の既知の肝炎発生ウィルスと比較してＨＧＢＶにつき独
特である。このエピトープの独特性はＨＧＢＶとの免疫
学的反応性およびＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝
炎ウィルスに対する免疫学的反応性の欠如により決定す
ることができる。免疫学的反応性の決定方法は当業界に
て公知であり、たとえば放射免疫分析（ＲＩＡ）、酵素
結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）、血球凝集（ＨＡ）、
蛍光分極免疫分析（ＦＰＩＡ）を包含し、適する技術の
幾つかの例をここで説明する。
【００４０】所定の配列（たとえばＨＧＢＶ ｃＤＮ
Ａ）またはＨＧＢＶゲノム「から得られる」ポリヌクレ
オチドとは、少なくとも約６ヌクレオチドの配列、好ま
しくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少
なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、さらに好ましくは
少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの配列で構成さ
れ、所定のヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわ
ちこの領域に類似または相補的である）ポリヌクレオチ
ド配列を意味する。好ましくはポリヌクレオチドが得ら
れる領域の配列は、ＨＧＢＶゲノムに対し独特である配
列に類似し或いは相補的である。配列がＨＧＢＶゲノム
に独特である配列に対し相補的または類似であるかない
かは当業者に知られた技術により決定することができ
る。たとえばデータバンクにおける配列との比較を、所
定配列の独特性を決定する方法として使用することがで
きる。配列が得られる領域は限定はしないが、特定エピ
トープをコードする領域、並びに非翻訳領域および／ま
たは非転写領域を包含する。
【００４１】ポリヌクレオチドは必ずしもＨＧＢＶのヌ
クレオチド配列から物理的に得られたものでなくてもよ
く、限定はしないがポリヌクレオチドが得られる領域に
おける塩基の配列によって与えられる情報に基づく化学
合成、複製または逆転写もしくは転写を包含する任意の
方法で生ぜしめることができる。さらに所定配列の領域
に対応する各領域の組合せを、所定用途に一致するよう
当業界で知られた方法にて改変することもできる。
【００４２】所定の核酸配列から或いはＨＧＢＶゲノム
から得られた「ポリペプチド」または「アミノ酸」配列
とは、配列内またはその１部でコードされたポリペプチ
ドの配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
意味し、ここで前記部分は少なくとも３〜５個のアミノ
酸、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、
さらに好ましくは１５〜２０個のアミノ酸で構成され、
或いは配列内でコードされたポリペプチドで免疫学的に
同定できるものである。
【００４３】ここで用いる「組換ポリペプチド」という
用語は、そのオリジンまたは操作により天然またはライ
ブラリの形態で関連しかつ／または天然で連結している
以外のポリヌクレオチドに連結されたポリペプチドの全
体または１部と関連しない少なくともゲノム、半合成も
しくは合成オリジンのポリペプチドを意味する。組換ポ
リペプチドまたは誘導ポリペプチドは必ずしもＨＧＢＶ
の所定の核酸配列から或いはＨＧＢＶゲノムから翻訳さ
れない。さらに、これは化学合成または組換発現系の発
現または突然変異ＨＧＢＶからの分離を包含する任意の
方法で生ぜしめることもできる。
【００４４】ここで用いる「合成ペプチド」という用語
は任意の長さのアミノ酸のポリマー型を意味し、これら
は当業者に周知された方法により化学合成することがで
きる。これら合成ペプチドは各種の用途に有用である。
【００４５】ここで用いる「ポリヌクレオチド」という
用語は任意の長さのポリマー型のヌクレオチドを意味
し、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド
のいずれかである。この用語は分子の一次構造のみを意
味する。したがって、この用語は二本鎖および一本鎖Ｄ
ＮＡを包含し、さらに二本鎖および一本鎖ＲＮＡをも包
含する。さらに、これはメチル化および／またはキャッ
ピングによる改変、さらにポリヌクレオチドの未改変型
を包含する。
【００４６】「ｃＤＮＡに対応する配列を含むＨＧＢ
Ｖ」という表現は、ＨＧＢＶが所定ＤＮＡにおける配列
に類似し或いは相補的であるポリヌクレオチド配列を含
むことを意味する。ｃＤＮＡに対する類似性もしくは相
補性の程度は約５０％もしくはそれ以上、好ましくは少
なくとも約７０％、一層好ましくは少なくとも約９０％
である。対応する配列は少なくとも約７０ヌクレオチ
ド、好ましくは少なくとも約８０ヌクレオチド、さらに
好ましくは少なくとも約９０ヌクレオチドの長さであ
る。ＨＧＢＶとｃＤＮＡとの間の対応性は当業界で知ら
れた方法により決定することができ、たとえば配列決定
された物質と示されたｃＤＮＡとの直接的比較または一
本鎖ヌクレアーゼでのハイブリッド化および切断により
生ずる断片の寸法決定を包含する。
【００４７】「精製ウィルスポリヌクレオチド」という
用語はＨＧＢＶゲノムまたはその断片を意味し、これは
ウィルスポリヌクレオチドが本来関連するポリヌクレオ
チドを殆ど含まず、すなわち約５０％未満、好ましくは
約７０％未満、特に好ましくは約９０％未満のポリペプ
チドを含有する。ウィルスポリヌクレオチドを精製する
技術は当業界で周知され、たとえばケイオトロピック剤
での粒子の破壊、並びにイオン交換クロマトグラフィ
ー、親和性クロマトグラフィーによるポリヌクレオチド
およびポリペプチドの分離、さらに密度による沈降を包
含する。すなわち「精製ウィルスポリペプチド」という
用語は、ウィルスポリペプチドが本来関連する細胞成分
を実質的に含まない、すなわち約５０％未満、好ましく
は約７０％未満、特に好ましくは約９０％未満の細胞成
分を含有するＨＧＢＶポリペプチドまたはその断片を意
味する。
【００４８】ここで用いる「ポリペプチド」はアミノ酸
の分子鎖を示し、産生物の特定長さを意味しない。すな
わちペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白質がポリペプ
チドの規定内に包含される。しかしながら、この用語は
ポリペプチドの発現後の改変、たとえばグリコシル化、
アセチル化、ホスホリル化などを意味することを意図し
ない。
【００４９】「組換宿主細胞」、「宿主細胞」、「細
胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、および単細胞とし
て培養された微生物もしくは高等真核性細胞系を示す他
の用語は組換ベクターまたは他の転移ＤＮＡのレシピエ
ントとして使用しうる或いは使用されている細胞を意味
し、トランスフェクトされたオリジナル細胞のオリジナ
ル後代を包含する。
【００５０】ここで用いる「レプリコン」という用語は
たとえばプラスミド、染色体もしくはウィルスののよう
な任意の遺伝子要素を意味し、これは細胞内のポリヌク
レオチド複製の自律単位として作用する。
【００５１】「ベクター」は他のポリヌクレオチドセグ
メントが付着してたとえば付着セグメントの複製および
／または発現をもたらすレプリコンである。
【００５２】「制御配列」という用語は、これらが結合
するコード配列の発現を行うのに必要なポリヌクレオチ
ド配列を意味する。この種の制御配列の性質は宿主生物
に応じて異なる。原核生物において、この種の制御配列
は一般にプロモータとリボソーム結合部位とターミネー
タとを含む。真核生物においては、この種の制御配列は
一般にプロモータとターミネータと或る場合にはエンハ
ンサとを含む。したがって「制御配列」という用語はそ
の存在が発現に必要である最少の全成分を包含すること
を意図し、さらにその存在が有利である他の成分、たと
えばリーダー配列をも包含する。
【００５３】「作用できるように結合」という用語は、
上記の各成分がその目的に応じて機能しうるような関係
にある状況を意味する。たとえばコード配列に「作用で
きるように結合」した制御配列は、コード配列の発現が
制御配列に適合する条件下で達成されるように結合す
る。
【００５４】「開放読み枠」、すなわち「ＯＲＦ」とい
う用語はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列の領域を意味する。この領域はコード配列の１部また
は全コード配列を示すことができる。
【００５５】「コード配列」は、ｍＲＮＡに転写されか
つ／または適する調整配列の制御下に置かれるとポリペ
プチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コー
ド配列の境界は５′−末端における翻訳開始コドンおよ
び３′末端における翻訳停止コドンにより決定される。
コード配列は限定はしないがｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび
組換ポリヌクレオチド配列を包含する。
【００５６】「免疫学的に同定しうる」という表現は、
所定のポリペプチド（一般にＨＧＢＶ蛋白質）にも存在
すると共にこれらポリペプチドに対し独特であるエピト
ープおよびポリペプチドの存在を意味する。免疫学的同
一性は抗体結合および／または結合の競合により判定す
ることができる。これら技術は当業者に公知であり、本
書でも説明する。さらにエピトープの独特性は、エピト
ープをコードするポリヌクレオチド配列の既知のデータ
バンク（たとえばジェンバンク）のコンピュータ探索に
より或いは他の公知蛋白質とのアミノ酸配列比較により
決定することもできる。
【００５７】ここで用いる「エピトープ」という用語は
ポリペプチドの抗原決定子を意味する。恐らくエピトー
プはそのエピトープに特有の空間配置にて３個のアミノ
酸で構成することができる。一般にエピトープは少なく
とも５個のこの種のアミノ酸で構成され、より一般的に
は少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。空間
配置の解析方法は当業界にて公知であり、たとえばＸ線
結晶学および二次元核磁気共鳴を包含する。
【００５８】ポリペプチドは、ポリペプチド内に含まれ
る特定エピトープの抗体認識に基づき抗体に結合する際
に抗体に対し「免疫学的に反応性」である。免疫学的反
応性は抗体結合により、詳細には抗体結合の速度分析に
より或いは抗体が指向するエピトープを含んだ既知ポリ
ペプチドを競合剤として使用する結合の競合により決定
することができる。ポリペプチドが抗体に対し免疫学的
に反応性であるかどうかを決定する方法は当業界にて公
知である。
【００５９】ここで用いる「ＨＧＢＶエピトープを含有
する免疫原性ポリペプチド」という表現は天然に生ずる
ＨＧＢＶポリペフチドまたはその断片、並びにたとえば
化学合成または組換生物におけるポリペプチドの発現な
ど他の手段により作成されたポリペプチドを意味する。
【００６０】「形質転換」という用語は宿主細胞への外
来性リペプチドの挿入を意味し、挿入に用いる方法とは
無関係である。たとえば直接的取込、トランスダクショ
ンまたはｆ−交合が包含される。外来性ポリヌクレオチ
ドは非一体化ベクター、たとえばプラスミドとして維持
することができ、或いは宿主ゲノムに一体化させること
もできる。
【００６１】「処置」という用語は予防および／または
治療を意味する。
【００６２】ここで用いる「個体」という用語は脊椎動
物、特に哺乳動物の種類を意味し、限定はしないが家畜
動物、スポーツ動物、霊長動物およびヒトを包含し、よ
り詳細にはこの用語はタマリンザルおよびヒトを意味す
る。
【００６３】ここで用いる「プラス鎖」（または「プラ
ス」）という用語は、ポリペプチドをコードする配列を
有する核酸を意味する。「マイナス鎖」（または「マイ
ナス」）という用語は、「プラス」鎖の配列に相補的で
ある配列を持った核酸を意味する。
【００６４】ウィルスの「正鎖ゲノム」は、ゲノムがＲ
ＮＡもしくはＤＮＡのいずれであっても一本鎖であって
ウィルスポリペプチドをコードすることを意味する。
【００６５】「試験試料」という用語は、分析物の原料
（たとえば対象とする抗体または対象とする抗原）であ
る個体の人体の成分を意味する。これら成分は当業界で
周知されている。これら試験試料はここに説明する本発
明の方法により試験しうる生物学的試料を包含し、たと
えば全血、血清、血漿、脳髄液、尿、リンパ液、並びに
呼吸器、腸管および尿生殖器官の各種の外的分泌物、
涙、唾液、乳、白血球、骨髄腫などのヒトおよび動物の
体液；たとえば細胞培養上澄液のような生物学的液体；
固定組織試料；並びに固定細胞試料を包含する。
【００６６】上記したように組換抗原を作成した後、組
換抗原を用いてここに説明した独特な分析を開発し、抗
原またはＨＧＢＶに対する抗体の存在を検出することが
できる。これら組成物を用いて、当業者により所望され
るＨＧＢＶの免疫学的エピトープに対し特異的に結合す
る特定組換抗原につきモノクローナルおよび／またはポ
リクローナル抗体を開発することもできる。さらに、本
発明の少なくとも１種の組換抗原を用いて当業界で知ら
れた方法にしたがいワクチンを開発することも考えられ
る。
【００６７】分析に用いる試薬は、たとえば小瓶または
瓶のような１個もしくはそれ以上の容器を備えた試験キ
ットとして提供しうると考えられ、各容器はたとえばモ
ノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のカクテル
或いは分析に使用する組換抗原のような別々の試薬を含
有する。たとえば緩衝液、対照など当業者に知られた他
の成分もこの種の試験キットに含ませることができる。
【００６８】ここで用いる「分析物」という用語は試験
試料に存在しうる検出すべき物質である。分析物は、天
然に存在する特異的結合員子（たとえば抗体）が存在す
る任意の物質または特異的結合員子を作成しうる任意の
物質とすることができる。すなわち、分析物は分析にて
１種もしくはそれ以上の特異的結合員子に結合しうる物
質である。さらに「分析物」は抗原性物質、ハプテン、
抗体およびその組合せを包含する。特異的結合対の員子
として、分析物は天然産の特異的結合相手（対）によ
り、たとえばビタミンＢ１２を決定するための特異的結
合対の員子として固有のファクター蛋白質を使用し或い
は葉酸を決定すべくフォレート結合蛋白質を使用し或い
は炭水化物を決定すべく特異的結合対の員子としてレク
チンを使用することにより検出することができる。分析
物は蛋白質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチド標的な
どを包含する。
【００６９】本発明は特異的結合員子を用いる分析を提
供する。ここで用いる「特異的結合員子」という用語は
特異的結合対の１員子である。すなわち分子の一方が化
学的もしくは物理的手段を介し第２の分子に特異的に結
合する２種の異なる分子である。したがって、一般的な
免疫分析における抗原および抗体の特異的結合に加え、
他の特異的結合対としてビオチンおよびアビジン、炭水
化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、イフェ
クタおよびリセプタ分子、補因子および酵素、酵素阻止
剤および酵素などを包含する。さらに特異的結合対はオ
リジナル特異的結合員子の類似体である員子、たとえば
分析物類似体をも包含しうる。免疫反応性の特異的結合
員子は抗原、抗原断片、抗体および抗体断片（モノクロ
ーナルおよびポリクローナルの両者）、さらにその複合
体（組換ＤＮＡ分子により生成されるものを含む）を包
含する。ここで用いる「ハプテン」という用語は、抗体
に結合しうるがキャリヤ蛋白質に結合しない限り抗体形
成しえない部分抗原または非蛋白質結合員子を意味す
る。
【００７０】ここで用いる「捕捉試薬」という用語は、
サンドイッチ分析におけるような分析物、競合分析にお
けるような指示薬もしくは分析物または間接的分析にお
けるようなそれ自身で分析物に対し特異的である補助特
異的結合員子のいずれかにつき特異的である未標識の特
異的結合員子を意味する。捕捉試薬は、分析を実施する
前または分析の実施中に固相に直接的もしくは間接的に
結合させて試験試料からの固定化複合体の分離を可能に
する。
【００７１】「指示薬」は「シグナル発生化合物」（ラ
ベル）を含み、ＨＧＢＶの特定結合員子に結合（付着）
した外的手段により検出しうる測定可能なシグナルを発
生することができる。ここで用いる「特異的結合員子」
とは特異的結合対の員子を意味する。すなわち分子の一
方が化学的もしくは物理的手段により第２の分子に特異
的に結合する２種の異なる分子である。ＨＧＢＶの特異
的結合対の抗体員子である他、指示薬はさらに任意の特
異的結合対の員子とすることもでき、これはハプテン−
抗ハプテン系、たとえばビオチンもしくは抗−ビオチ
ン、アビジンもしくはビオチン、炭水化物もしくはレク
チン、相補的ヌクレオチド配列、イフェクタもしくはリ
セプタ分子、酵素補因子および酵素、酵素阻止剤もしく
は酵素などを包含する。免疫反応性の特異的結合員子は
抗体、抗原またはサンドイッチ分析におけるようなＨＧ
ＢＶに対し或いは競合分析におけるような捕捉試薬に対
し或いは間接分析におけるような補助特異的結合員子に
対し結合しうる抗体／抗原複合体とすることができる。
【００７２】考えられる各種の「シグナル発生化合物」
（ラベル）はクロモゲン、触媒（たとえば酵素）、発光
性化合物（たとえばフルオレセンおよびローダミン）、
化学発光性化合物（たとえばジオキセタン、アクリジニ
ウム、フェナンスリジニウムおよびルミノール）、放射
性元素、並びに直視標識を包含する。酵素の例はアルカ
リホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−
ガラクトシダーゼなどを包含する。特定ラベルの選択は
臨界的でなく、それ自身で或いは１種もしくはそれ以上
の他の物質と組合せてシグナルを発生することができ
る。
【００７３】「固相」（「固体支持体」）は当業者に公
知であって反応皿のウエルや試験管の壁部、ポリスチレ
ンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリップ、
膜、微粒子、たとえばラテックス粒子、羊（もしくは他
の動物）の赤血球、デュラサイトなどを包含する。「固
相」は臨界的でなく、当業者により選択することができ
る。たとえばラテックス粒子、微粒子、磁性もしくは非
磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイ
ターウエルの壁部、ガラスもしくはシリコーンチップ、
羊（もしくは他の適する動物）の赤血球およびデュラサ
イトは全て適する例である。固相にペプチドを固定化す
るのに適する方法はイオン性、疎水性、共有的などの相
互作用を包含する。ここで用いる「固相」は、不溶性で
あり或いはその後の反応により不溶性にしうる任意の物
質を意味する。固相は、捕捉試薬を吸引および固定化す
る固有の能力に基づき選択することができる。或いは固
相は、捕捉試薬を吸引および固定化する能力を持った他
のリセプタを保持することもできる。他のリセプタは、
捕捉試薬自身に対し或いは捕捉試薬に結合した帯電物質
に対し反対帯電した帯電物質を包含する。さらに他の代
案として、リセプタ分子は固相に固定化され（付着し）
かつ特異的結合反応を介し捕捉試薬を固定化する能力を
持った任意の特異的結合員子とすることもできる。リセ
プタ分子は分析の実施前または分析の実施中に固相物質
に対する捕捉試薬の間接的結合を可能にする。したがっ
て固相はプラスチック、誘導化プラスチック、磁性もし
くは非磁性金属、試験管のガラスもしくは珪素表面、マ
イクロタイターウエル、シート、微粒子、チップ、羊
（または他の適する動物）の赤血球、デュラサイト、並
びに当業者に知られた他の構成とすることができる。
【００７４】本発明の範囲内において、固相は検出抗体
によりアクセスするのに充分な多孔性を有すると共に抗
原を結合するに適した表面親和性を有する、任意の適す
る多孔質材料で構成することも考えられる。一般に微孔
質構造が好適であり、水和状態におけるゲル構造を持っ
た物質も使用することができる。これら物質は全て適す
る形状、たとえばフィルム、シートもしくはプレートと
して使用することができ、或いは適する不活性キャリ
ヤ、たとえば紙、ガラス、プラスチックフィルムもしく
は布地に対し被覆または結合もしくは積層することがで
きる。
【００７５】各種の固相を用いる他の具体例も考えら
れ、本発明の範囲内である。たとえば米国特許出願第１
５０，２７８号（ヨーロッパ公開公報第０３２６１００
号）および米国特許出願第３７５，０２９号（ヨーロッ
パ公開公報第０４０６４７３号）に記載された負帯電ポ
リマーとの固定化しうる反応複合体を固定化するイオン
捕捉法を本発明に用いて迅速溶液相免疫化学反応を行う
ことができる。固定化しうる免疫複合体は、負帯電ポリ
−アニオン／免疫複合体と予め処理された正帯電の多孔
質マトリックスとの間のイオン相互作用により反応混合
物の残部から分離して、たとえばヨーロッパ公開公報第
０２７３，１１５号に対応する同時出願の米国特許出願
第９２１，９７９号に記載された化学発光性シグナル測
定で説明されたものを含め上記の各種のシグナル発生系
を用いて検出される。
【００７６】さらに本発明の方法は、固相が微粒子（磁
性もしくは非磁性）からなる自動化および半自動化シス
テムを含め微粒子技術を用いるシステムで使用するにも
適している。この種のシステムはそれぞれ公開ＥＰＯ出
願０４２５６３３号および０４２４６３４号に対応する
米国特許出願第４２５，６５１号および４２５，６４３
号に記載されたシステムを包含する。
【００７７】免疫分析のための走査型プローブ顕微鏡測
定（ＳＰＭ）の使用も本発明のモノクローナル抗体に容
易に適しうる技術である。走査型プローブ顕微鏡測定、
特に原子力顕微鏡測定において、捕捉相（たとえば本発
明のモノクローナル抗体の少なくとも１種）を固相に付
着し、走査型プローブ顕微鏡測定を用いて固相の表面に
存在しうる抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネ
リング顕微鏡測定の使用によれば、一般に抗原／抗体複
合体を検出する多くの免疫分析システムでは用いねばな
らないラベルが不要になる。特異的結合反応を監視する
ＳＰＭの使用は多くの方法で行いうる。１具体例におい
て、特異的結合相手の１員（本発明のモノクローナル抗
体である分析物特異性物質）を走査に適する表面に付着
させる。分析物特異性物質の付着はプラスチックもしく
は金属表面の固相からなる試験片への吸着とすることが
でき、当業者に知られた方法にしたがう。或いは試験片
に対する特異的結合相手（分析物特異性物質）の共有付
着を用いることもでき、試験片は誘導化プラスチック、
金属、珪素もしくはガラスの固相で構成される。共有付
着法は当業者に公知であって、特異的結合相手を試験片
に不可逆的に結合させる各種の手段を包含する。試験片
が珪素もしくはガラスであれば、表面を特異的結合相手
の付着前に活性化させねばならない。さらにポリ電解質
の相互作用を用いて特異的結合相手を１９８８年１月２
９日付け出願の米国特許出願第１５０，２７８号および
１９８９年７月７日付け出願の米国特許出願第３７５，
０２９号に記載された技術および化学により試験片の表
面に固定化することもできる。付着の好適方法は共有法
である。特異的結合員子の付着の後、表面をさらにたと
えば血清、蛋白質または他の封鎖剤などの物質で処理し
て非特異的結合を最小化させることができる。さらに表
面を製造の箇所または分析目的に対する適性を確認しよ
うとする使用時点で走査することも可能である。走査法
は試験片の特異的結合特性を変化させないと思われる。
【００７８】「サンドイッチ」免疫分析およびプローブ
分析を包含する各種の他の分析方式を用いることもでき
る。たとえば本発明のモノクローナル抗体を各種の分析
システムで用いて、必要に応じ試験試料におけるＨＧＢ
Ｖ蛋白質の存在を決定することができる。得られるこれ
らモノクローナル抗体の断片も使用することができる。
たとえば第１の分析方式においては、固相に被覆された
ポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＧＢＶ抗
体もしくはその断片またはこれら抗体の組合せ物をＨＧ
ＢＶ蛋白質を含有しうる試験試料と接触させて混合物を
形成させる。この混合物を抗原／抗体複合体を形成させ
るのに充分な時間および条件にて培養する。次いでＨＧ
ＢＶ領域に特異的に結合するモノクローナルもしくはポ
リクローナル抗体またはその断片、或いはシグナル発生
化合物を接合させたこれら抗体の組合せ物を含む指示薬
を抗原／抗体複合体と接触させて第２混合物を形成させ
る。次いで、この第２混合物を抗体／抗原／抗体複合体
を形成させるのに充分な時間および条件にて培養する。
試験試料中に存在して固相に捕捉されたＨＧＢＶ抗原の
存在は、必要に応じシグナル発生化合物により発生する
測定可能なシグナルを検出して決定される。試験試料に
存在するＨＧＢＶ抗原の量は発生シグナルに比例する。
【００７９】或いは固体支持体に結合するポリクローナ
ルもしくはモノクローナル抗−ＨＧＢＶ抗体もしくはそ
の断片またはこれら抗体の組合せ物と、試験試料と、Ｈ
ＧＢＶ抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくは
ポリクローナル抗体もしくはその断片またはシグナル発
生化合物を接合させたこれら抗体の組合せ物からなる指
示薬とを接触させて混合物を形成させる。この混合物を
抗体／抗原／抗体複合体を形成させるのに充分な時間お
よび条件にて培養する。必要に応じ試験試料中に存在す
ると共に固相に捕捉されたＨＧＢＶ蛋白質の存在を、シ
グナル発生化合物により発生した測定可能なシグナルを
検出して決定する。試験試料中に存在するＨＧＢＶ蛋白
質の量は発生シグナルに比例する。
【００８０】他の代案分析方式においては、本発明の少
なくとも２種のモノクローナル抗体の一方または組合せ
をＨＧＢＶ蛋白質に対する抗体の検出につき競合プロー
ブとして使用することができる。たとえば、ここに開示
した組換抗原のようなＨＧＢＶ蛋白質を単独で或いは組
合せて固相上に被覆することができる。次いでＨＧＢＶ
抗原に対する抗体を含有すると疑われる試験試料を、シ
グナル発生化合物を含む指示薬および本発明による少な
くとも１種のモノクローナル抗体と共に、試験試料と指
示薬との固相に対する或いは指示薬の固相に対する抗原
／抗体複合体を形成するのに充分な時間および条件にて
培養する。固相に対するモノクローナル抗体の結合の減
少を定量測定することができる。陰性が確認されている
ＮＡＮＢ、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型肝炎の試験試料から
発生したシグナルと比較してシグナルが測定可能に減少
していれば、試験試料における抗−ＨＧＢＶ抗体の存在
を示す。
【００８１】さらに他の検出法においては、本発明のモ
ノクローナルもしくはポリクローナル抗体のそれぞれを
固定組織セクション並びに固定細胞にて免疫組織化学分
析によりＨＧＢＶ抗原の検出に用いることができる。こ
れら抗体を直接標識する（フルオレセン、コロイド金、
西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
など）或いは二次標識抗−スペシース抗体（ここに例示
する各種のラベル）を用いて標識することにより当該疾
病の組織病理を追跡する細胞化学分析も本発明の範囲内
である。
【００８２】さらにこれらモノクローナル抗体をＣＮＢ
ｒ活性化セファローズのようなマトリックスに結合させ
て、細胞培養物またはたとえば血液もしくは肝臓のよう
な生物学的組織からの特異的ＨＧＢＶ蛋白質の親和性精
製につき用いることができ、たとえば組換および天然の
ウィルスＨＧＢＶ抗原および蛋白質を精製することがで
きる。
【００８３】本発明のモノクローナル抗体は、さらに治
療用途または他の同様な用途につきキメラ抗体を発生さ
せるべく使用することもできる。
【００８４】モノクローナル抗体またはその断片は、Ｈ
ＧＢＶ抗原を検出すべく個々に与えることができる。こ
こに提供されるモノクローナル抗体（およびその断片）
の組合せ物を本発明の少なくとも１種の抗−ＨＧＢＶ抗
体の混合物もしくは「カクテル」における成分として、
それぞれ異なる結合特異性を有する他のＨＧＢＶ領域に
対する抗体と共に使用することもできる。たとえば、こ
のカクテルはＨＧＢＶ蛋白質に向けられる本発明のモノ
クローナル抗体およびＨＧＢＶゲノムの他の抗原決定子
に対する他のモノクローナル抗体を包含する。
【００８５】本分析方式に使用しうるポリクローナル抗
体もしくはその断片は、この分析に使用される特異的Ｈ
ＧＢＶ領域もしくは他のＨＧＢＶ蛋白質に特異的に結合
せねばならない。好適に使用されるポリクローナル抗体
は哺乳動物起源のものである。すなわちヒト、ヤギ、ウ
サギもしくはヒツジの抗−ＨＧＢＶポリクローナル抗体
を使用することができる。特に好ましくはポリクローナ
ル抗体はウサギポリクローナル抗−ＨＧＢＶ抗体であ
る。分析に使用するポリクローナル抗体は単独で或いは
ポリクローナル抗体のカクテルとして使用することがで
きる。分析方式に使用するカクテルは異なるＨＧＢＶ特
異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル
抗体のいずれかで構成されるので、これらはＨＧＢＶ感
染の診断、評価および予知、並びにＨＧＢＶ蛋白質の分
化および特異性の研究に有用である。
【００８６】本発明の範囲内においてＨＧＢＶ群のウィ
ルスを組換抗原の使用または合成ペプチドもしくは天然
ペプチドの使用により分析にて検出することができると
考えられ、これらは全てのＨＧＢＶウィルスに共通した
アミノ酸配列を有する。さらにＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ
−Ｂ、ＨＧＢＶ−Ｃまたは他のＨＧＢＶウィルスとは異
なるエピトープを同定する異なる合成、組換もしくは天
然ペプチドを分析方式に使用することも本発明の範囲内
である。後者の場合、これらは１種の固相に被覆するこ
とができ、或いはそれぞれ別々のペプチドを別々の固
相、たとえば微粒子に被覆し、次いでこれらを合してそ
の後に分析に使用しうるペプチドの混合物を形成するこ
ともできる。この種の分析方式の改変は当業者に公知で
あり、以下に説明する。
【００８７】他の分析方式において、ＨＧＢＶに対する
抗体および／または抗原の存在は次のように同時的分析
で検出することができる。試験試料を第１分析物の捕捉
試薬（この捕捉試薬は固相に付着した第１分析物に対し
特異的な第１結合員子を含む）および第２分析物の捕捉
試薬（この捕捉試薬は第２固相に付着した第２分析物の
第１結合員子を含む）と同時に接触させて混合物を形成
させる。この混合物を捕捉試薬／第１分析物および捕捉
試薬／第２分析物の複合体を形成するのに充分な時間お
よび条件にて培養する。次いで、これら形成された複合
体を、シグナル発生化合物で標識された第１分析物に対
し特異的な結合対の員子を含む指示薬およびシグナル発
生化合物で標識された第２分析物に対し特異的な結合対
の員子を含む指示薬と接触させて第２混合物を形成させ
る。この第２混合物を捕捉試薬／第１分析物／指示薬複
合体および捕捉試薬／第２分析物／指示薬複合体を形成
するのに充分な時間および条件にて培養する。１種もし
くはそれ以上の分析物の存在は、いずれか一方もしくは
両方の固相に形成された複合体に関し発生したシグナル
を試験試料における１種もしくはそれ以上の分析物の存
在の指標として検出することにより決定する。この分析
方式においてはヒト発現系から得られた組換抗原を用い
ることができ、さらに上記哺乳動物発現系から得られた
蛋白質より産生されるモノクローナル抗体も使用するこ
とができる。この種の分析系はヨーロッパ公開公報第０
４７３０６５号に対応する「１種もしくはそれ以上の分
析物を検出するための同時的分析」と題する米国特許出
願第０７／５７４，８２１号に一層詳細に記載されてい
る。
【００８８】さらに他の分析方式においては、ここに開
示した組換抗原を用いて試験試料における抗−ＨＧＢＶ
の存在を検出することができる。たとえば、試験試料を
少なくとも１種の組換蛋白質を付着させた固相と共に培
養する。これらを抗原／抗体複合体を生成するのに充分
な時間および条件にて反応させる。培養の後、抗原／抗
体複合体を検出する。選択分析系に応じた指示薬を用い
て、検出を容易化させることができる。他の分析方式に
おいては、試験試料をここに説明したように産生された
組換蛋白質を付着させた固相と接触させ、さらに好まし
くは指示薬で標識されている蛋白質に対し特異的なモノ
クローナル抗体もしくはポリクローナル抗体と接触させ
る。抗体／抗原／抗体複合体が形成するのに充分な時間
および条件にて培養した後、固相を遊離相から分離する
と共にラベルを固相もしくは遊離相のいずれかでＨＧＢ
Ｖ抗体の存在の指標として検出する。ここに開示した組
換抗原を用いる他の分析方式も考えられる。その中に
は、試験試料を第１原料からの少なくとも１種の抗原を
付着させた固相と接触させ、この固相および試験試料を
抗原／抗体複合体を形成するのに充分な時間および条件
にて培養し、次いで固相を標識抗原と接触させることを
含み、この抗原は第１原料とは異なる第２原料から得ら
れる。たとえば第１原料（たとえばイー・コリ）から得
られる組換蛋白質を固相における捕捉抗原として使用
し、試験試料を作成された固相に添加し、異なる原料
（すなわち非イー・コリ）から得られた組換蛋白質を指
示薬の１部として使用する。同様に、固相における組換
抗原と指示薬相における合成ペプチドとの組合せ物も可
能である。捕捉抗原としての第１原料から得られたＨＧ
ＢＶに対し特異的な抗原と異なる第２原料から得られた
ＨＧＢＶに対し特異的な抗原とを用いる任意の分析方式
も考えられる。すなわち組換抗原の各種の組合せ、並び
に合成ペプチド、精製ウィルス蛋白質などの使用も本発
明の範囲内である。これらおよび他の分析については本
出願人による米国特許第５，２５４，４５８号（参考の
ためここに引用する）に記載されている。
【００８９】他の分析系は、特異的抗体とウィルス蛋白
質（ペプチドなど）との間の接触によりウィルスゲノム
（もしくはその断片）を収容するＨＧＢＶウィルス粒子
もしくはサブウィルス粒子を特異的に結合する抗体（ポ
リクローナル、モノクローナルもしくは天然）を使用す
る。次いで、この捕捉された粒子をたとえばＬＣＲもし
くはＰＣＲのような方法により分析して、ウィルスゲノ
ムが試験試料に存在するかどうか決定することができ
る。本発明の方法により分析しうる試験試料は血液、肝
臓、啖、尿、糞、唾液などを包含する。この種の抗原捕
捉増幅法を用いる利点は、試験試料におけるウィルスゲ
ノムを特異的抗体の使用により他の分子から分離しうる
点である。この種の方法は米国特許出願第０８／１４
１，４２９号に記載されている。
【００９０】本発明は固相の使用を主として開示する
が、たとえば本発明の抗体、蛋白質およびペプチドのよ
うな試薬を非固相分析系で用いることも考えられる。こ
れら分析系は当業者に公知であり、本発明の範囲内であ
ると考えられる。
【００９１】材料および方法 一般的技術 分子生物学、微生物学、組換ＤＮＡおよび免疫学の分野
における慣用かつ周知の技術および方法を、特記しない
限り本発明の実施に用いる。この種の技術は刊行物に説
明かつ詳述されている［たとえばＪ．サムブルック等、
モレキュラ・クローニング：ラボラトリー・マニュア
ル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・プレス
社、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９
８９）；Ｄ．Ｎ．グロバー編、ＤＮＡクローニング、第
Ｉ巻および第II巻（１９８５）；Ｍ．Ｊ．ゲイト編、オ
リゴヌクレオチド合成、（１９８４）；Ｂ．Ｄ．ヘイム
ス等編、核酸ハイブリッド化、（１９８４）；Ｂ．Ｄ．
ヘイムス等編、転写および翻訳、（１９８４）；Ｒ．
Ｉ．フレッシュネー編、アニマル・セル・カルチャー、
（１９８６）；固定化細胞および酵素、ＩＲＬプレス社
（１９８６）；Ｂ．パーバル、プラクチカル・ガイド・
ツー・モレキュラ・クローニング、（１９８４）；シリ
ーズ、メソッズ・イン・エンザイモロジー、アカデミッ
ク・プレス社、オーランド・フロリダ；Ｊ．Ｈ．ミラー
等編、ジーン・トランスファー・ベクター・フォー・マ
マリアン・セルス、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．
Ｙ．（１９８７）；ウー等編、メソッズ・イン・エンザ
イモロジー、第１５４巻および第１５５巻、マイヤー等
編、イミュノロジカル・メソッズ・イン・セル・アンド
・モレキュラ・バイオロジー、アカデミック・プレス
社、ロンドン（１９８７）；スコープス、蛋白質精製：
原理および実際、第２版、スプリンガー・フェアラー
ク、Ｎ．Ｙ．；並びにＤ．ウェアー等編、ハンドブック
・オブ・エキスペリメンタル・イミュノロジー、第Ｉ〜
IV巻（１９８６）；Ｎ．リシチシン等、サイエンス、第
２５９巻、第９４６〜９５１頁（１９９３）］。
【００９２】本発明の試薬および方法は、ここに説明す
るように改変された代表的な差異分析により分離され
た、ＨＧＢＶ感染個体（タマリンザルもしくはヒト）の
血漿、血清もしくは肝臓ホモゲナイズ物に存在する１群
の近縁なヌクレオチド配列について可能である。この群
のヌクレオチド配列はヒトもしくはタマリンザルに由来
しない。何故なら、これは未感染個体からのヒトもしく
はタマリンザルのゲノムＤＮＡにハイブリダイズせず、
この群の配列のヌクレオチドはＨＧＢＶで感染した個体
の肝臓（もしくは肝臓ホモゲナイズ物）、血漿もしくは
血清にしか存在せず、さらにこの配列はＧｅｎＢａｎｋ
（登録商標）に存在しないからである。さらに、この群
の配列はＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶおよびＨＥＶ
ゲノムに含まれる配列に対し核酸レベルにて顕著な同一
性を示さず、翻訳生成物においても顕著でない低レベル
の同一性を示すに過ぎない。ＨＧＢＶ感染したヒトから
の感染性血清、血漿もしくは肝臓ホモゲナイズ物がこれ
らポリヌクレオチド配列を有するのに対し、非感染ヒト
からの血清、血漿もしくは肝臓ホモゲナイズ物はこれら
配列を含まない。これらポリヌクレオチド配列による感
染肝臓のノーザン・ブロット分析は、これらがウィルス
ゲノムと類似する寸法の大型ＲＮＡ転写物から得られる
ことを示す。ＨＧＢＶ感染ヒトからの血清、血漿もしく
は肝臓ホモゲナイズ物はこのポリペプチドに結合する抗
体を含むのに対し、非感染ヒトからの血清、血漿もしく
は肝臓ホモゲナイズ物はこのポリペプチドに対する抗体
を含まない。これら抗体は急性の非−Ａ型、非−Ｂ型、
非−Ｃ型、非−Ｄ型および非−Ｅ型感染の後の個体で誘
発される。これら基準により配列はウィルス性配列であ
ると思われ、このウィルスは非−Ａ型、非−Ｂ型、非−
Ｃ型、非−Ｄ型および非−Ｅ型肝炎を引き起こし或いは
これに関連する。
【００９３】ここに開示する組換抗原はＨＧＢＶ感染に
基づく非−Ａ型、非−Ｂ型、非−Ｃ型、非−Ｄ型、非−
Ｅ型肝炎の診断、並びに血液ドナー、供与血液、血液製
剤および個体を感染につきスクリーニングするのに有用
である。これら配列から得られる群のポリペプチドおよ
びこれらペプチドに向けられる抗体もＨＧＢＶ病因作用
因子の分離および同定に有用である。たとえば核酸配列
から得られるポリペプチドに含有されたＨＧＢＶエピト
ープに向けられる抗体を使用し、親和性クロマトグラフ
ィーに基づきウィルスを分離することができる。或い
は、これら抗体を用いて他の技術により分離されたウィ
ルス粒子を同定することもできる。分離されたウィルス
粒子におけるウィルス抗原およびゲノム物質を次いでさ
らに特性化することができる。
【００９４】ＨＧＢＶゲノムの配列決定から、並びにＨ
ＧＢＶ抗原の特性化およびゲノムの特性化から得られた
情報は他のプローブおよびポリペプチドの設計および合
成を可能にし、その抗体をＨＧＢＶ誘発の非−Ａ型、非
−Ｂ型、非−Ｃ型、非−Ｄ型、非−Ｅ型肝炎の診断、予
防および治療に並びに感染血液および血液関連製品のス
クリーニングに使用することができる。
【００９５】菌株の寄託 ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリから複製した菌株（クロー
ン２、４、１０、１６、１８、２３および５０）をブタ
ペスト条約の規定にしたがい１９９４年２月１０日付け
でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、パ
ークローン・ドライブ１２３０１、ロックビル、メリー
ランド２０８５２に寄託し、寄託日から３０年間または
最後の分譲要請の後５年間または米国特許の権利期間の
いずれか長い期間にわたり保管される。これら寄託物お
よびここに開示した他の寄託物質は便宜のみのため供与
され、ここに示した教示に鑑み本発明を実施することは
要求されない。全ての寄託物質におけるＨＧＢＶ ｃＤ
ＮＡ配列を参考のためここに引用する。各プラスミドは
次のＡＴＣＣ受託番号に一致する：クローン２はＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．６９５５６に一致し、クローン４はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９５５７に一致し、クローン１０はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９５５８に一致し、クローン１６はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９５５９に一致し、クローン１８はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９５６０に一致し、クローン２３はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９５６１に一致し、クローン５０はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９５６２に一致する。
【００９６】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリから複製した
菌株（クローン１１、１３、４８および１１９）はブタ
ペスト条約の規定にしたがい１９９４年４月２９日付け
でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、パ
ークローン・ドライブ１２３０１、ロックビル、メリー
ランド２０８５２に寄託し、寄託日から３０年間または
最後の分譲要請の後５年間または米国特許の権利期間の
いずれか長い期間にわたり保管される。これら寄託物お
よびここに記載した他の寄託物質は便宜のみのため供与
され、ここに示した教示に鑑み本発明を実施することは
要求されない。全ての寄託物質におけるＨＧＢＶ ｃＤ
ＮＡ配列を参考のためここに引用する。各プラスミドは
次のＡＴＣＣ受託番号に一致する：クローン１１はＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．６９６１３に一致し、クローン１３はＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．６９６１１に一致し、クローン４８はＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．６９６１０に一致し、クローン１１９はＡ
ＴＣＣ Ｎｏ．６９６１２に一致する。
【００９７】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリからの他の菌
株（クローン４−Ｂ１．１、６６−３Ａ１．４９、７０
−３Ａ１．３７および７８−１Ｃ１．１７）はブタペス
ト条約の規定にしたがい１９９４年７月２８日付けでア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、パーク
ローン・ドライブ１２３０１、ロックビル、メリーラン
ド２０８５２に寄託し、寄託日から３０年間または最後
の分譲要請の後５年間または米国特許の権利期間のいず
れか長い期間にわたり保管される。これら寄託物および
ここに記載した他の寄託物質は便宜のみのため供与さ
れ、ここに示した教示に鑑み本発明を実施することは要
求されない。全ての寄託物質におけるＨＧＢＶ ｃＤＮ
Ａ配列を参考のためここに引用する。これらプラスミド
は次のＡＴＣＣ受託番号に一致する：クローン４−Ｂ
１．１はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９６６６に一致し、クロー
ン６６−３Ａ１．４９はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９６６５に
一致し、クローン７０−３Ａ１．３７はＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．６９６６４に一致し、クローン７８−１Ｃ１．１７
はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９６６３に一致する。
【００９８】クローンｐＨＧＢＶ−ＣクローンＮｏ．１
をブタペスト条約の規定にしたがい１９９４年１１月８
日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン、パークローン・ドライブ１２３０１、ロックビル、
メリーランド２０８５２に寄託し、寄託日から３０年間
または最後の分譲要請の後５年間または米国特許の権利
期間のいずれか長い期間にわたり保管される。これら寄
託物およびここに記載した他の寄託物質は便宜のみのた
め供与され、ここに示した教示に鑑み本発明を実施する
ことは要求されない。ｐＨＧＢＶ−ＣクローンＮｏ．１
はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９７１１に一致する。全ての寄託
物質におけるＨＧＢＶ ｃＤＮＡ配列を参考のためここ
に引用する。
【００９９】ウィルス性ポリペプチドおよび断片の作成 核酸配列が知られると、いずれのストランドでコードさ
れたポリペプチドの抗原活性領域をコードする発現ベク
ターの作成も可能となる。これら抗原活性領域は、たと
えばウィルス粒子の複製および／または構築に必要なポ
リヌクレオチド結合蛋白質、ポリヌクレオチド ポリメ
ラーゼおよび他のウィルス蛋白質を包含するウィルスの
非構造領域の他に、たとえばエンベロプ（コート）もし
くはコア抗原を包含するウィルスの構造領域から得るこ
とができる。所望のポリペプチドをコードする断片は慣
用の制限消化を用い或いは合成法によってゲノムクロー
ンまたはｃＤＮＡクローンから得られ、たとえばβ−ガ
ラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）もしくは超酸化物ディス
ムターゼ（ＳＯＤ）またはＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ
（ＣＫＳ）のような融合配列の部分を含みうるベクター
に結合させる。ＳＯＤの融合配列を有するポリペプチド
の産生につき有用である方法およびベクターは１９８６
年１０月１日付け公開のＥＰＯ−０１９６０５６号に記
載されており、ＣＫＳについては１９８９年９月１３日
付け公開のＥＰＯ公開第０３３１９６１号に記載されて
いる。開放読み枠を有する核酸配列の任意所望の部分を
いずれかのセンスストランドとして、たとえば成熟もし
くは融合蛋白質のような組換蛋白質として得ることがで
きる。或いは、ＨＧＢＶゲノムもしくはｃＤＮＡでコー
ドされたポリペプチドを化学合成により与えることもで
きる。
【０１００】ここに開示する組換抗原を産生させるのに
有用な他の発現システムはλｐＬベクター系を用いる。
この発現系は次の特徴を有する：（１）強力なλｐＬプ
ロモータ、（２）強力な３−フレーム翻訳ターミネータ
ｒｒｎＢｔ１、および（３）ＡＴＧコドンにおける翻訳
開始、利用可能なＮｃｏＩ制限部位内に位置するリボソ
ーム結合部位から８塩基対。
【０１０１】所望ポリペプチドをコードする核酸配列
を、融合型でも成熟型でも或いは分泌を可能にするシグ
ナル配列を持っても持たなくても、任意便利な宿主に適
する発現ベクターに結合させることができる。当業界で
は組換蛋白質を生成させるべく真核性および原核性の両
宿主系とも用いられており、これらの幾種かをここに示
す。次いでポリペプチドを溶菌細胞から或いは培養培地
から分離して所定用途に必要な程度まで精製する。精製
は当業界で知られた技術によって行うことができ、特に
塩分別、イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、親和
性クロマトグラフィー、遠心分離などを包含する。この
種のポリペプチドは診断試薬として或いは受動免疫治療
につき使用することができる。さらに、これらポリペプ
チドに対する抗体はＨＧＢＶ粒子を分離すると共に同定
するのに有用である。さらにＨＧＢＶ抗原をＨＧＢＶビ
リオンから分離することもできる。これらビリオンは、
ＨＧＢＶ感染細胞にて組織培養で増殖させ或いは感染個
体で増殖させることができる。
【０１０２】抗原ポリペプチドの作成および固相との接
合 ポリペプチドの抗原領域もしくは断片は一般に比較的小
さく、一般に約８〜１０アミノ酸もしくはそれ以下の長
さである。５アミノ酸程度に小さい断片でも抗原領域を
特性化することがある。これらセグメントはＨＧＢＶ抗
原の領域に相当する。ＨＧＢＶゲノム配列もしくはｃＤ
ＮＡ配列を基礎として用い、ＨＧＢＶポリペプチドの短
セグメントをコードする核酸配列を融合蛋白質または分
離ポリペプチドのいずれかとして組換発現させることが
できる。これら短アミノ酸配列は化学合成によって得る
こともできる。化学合成された小ポリペプチドは合成ポ
リペプチドが正確に構成されて正確なエピトープを与え
るが小さ過ぎて抗原性にならない場合は、適するキャリ
ヤ分子に結合させることができる。結合法は当業界にて
公知であり、限定はしないがＮ−スクシニミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およ
びスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）の使用
を包含する。スルフヒドリル基を欠如したポリペプチド
では、システイン残基を加えて改変することができる。
これら試薬は、それら自身と一方の蛋白質におけるペプ
チドシステイン残基との間でジスルフィド結合を、およ
び他方のリジンもしくは他の遊離アミノ基におけるε−
アミノを介するアミド結合を、それぞれ形成する。種々
のこれらジスルフィド／アミド−形成剤が知られてい
る。他の二官能性カップリング剤はジスルフィド結合で
なくチオエステルを形成する。これらチオエーテル形成
剤の多くは市販されており、当業者に公知である。カル
ボキシル基は、これらをスクシニミドもしくは１−ヒド
ロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と合
して活性化することができる。それ自身では宿主に対し
有害な抗体の産生を誘発しないものであれば、任意のキ
ャリヤを使用することができる。適するキャリヤは蛋白
質、多糖類、たとえばラテックス官能化セファロース、
アガロース、セルロース、セルロースビーズ、高分子ア
ミノ酸、たとえばポリグルタミン酸、ポリリジン、アミ
ノ酸コポリマーおよび特に不活性ウィルス粒子を包含す
る。蛋白基質の例は血清アルブミン、キーホール・リン
ペット・ヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロ
ブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド、並びに当業
者に知られた他の蛋白質を包含する。
【０１０３】ＨＧＢＶエピトープを有するハイブリッド
粒子イミュノゲンの作成 ＨＧＢＶエピトープの免疫原性は、これらエピトープを
粒子形成性蛋白質と融合した或いは構築した哺乳動物も
しくは酵母系（たとえばＨＢＶ表面抗原と結合した系）
で作成して増大させることもできる。ＨＧＢＶエピトー
プが粒子形成蛋白質をコード化する配列に直接結合した
構成物は、ＨＧＢＶエピトープに対し免疫原性であるハ
イブリッドを産生する。さらに、作成されたベクターは
全てＨＧＢＶに対し特異性のエピトープを含み、異なる
程度の免疫原性を有する。ＨＧＢＶ配列を含む粒子形成
蛋白質から構成された粒子はＨＧＢＶおよびＨＢＶに対
し免疫原性である。
【０１０４】Ｂ型肝炎表面抗原は、Ｓ．セレビシエおよ
び哺乳動物細胞にて形成されると共に粒子まで構築され
ることが確認されている。これら粒子の形成はモノマー
サブ単位の免疫原性を増大させると報告されている
［Ｐ．バレンズエラ等、ネイチャー、第２９８巻、第３
３４頁（１９８２）；Ｐ．バレンズエラ等、Ｉ．ミルマ
ン等編、ヘパチチスＢ、プレナム・プレス社、第２２５
〜２３６頁（１９８４）］。各構成物はＨＢｓＡｇの免
疫優性エピトープを包含する。この種の構成物は酵母に
て発現可能と報告されており、酵母発現につき非相同ウ
ィルス配列を含むハイブリッドも開示されている［たと
えばＥＰＯ １７４，４４４号およびＥＰＯ１７４，２
６１号参照］。さらに、これら構成物はたとえば支那ハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞で発
現しうると報告されている［ミッシェル等、ウィルス肝
炎に関する国際シンポジウム（１９８４）］。ＨＧＢＶ
において、粒子形成蛋白質コード配列の部分はＨＧＢＶ
エピトープをコードするコドンで置換することができ
る。この置換において、酵母もしくは哺乳動物にて免疫
原性粒子を形成する単位の凝集を仲介するのに必要とさ
れない領域を削除して、ＨＧＢＶエピトープとの競合の
可能性のある追加ＨＧＢＶ抗原部位を除去することがで
きる。
【０１０５】ワクチン作成 ワクチンを、ＨＧＢＶ核酸配列から或いはこれらが対応
するＨＧＢＶゲノムから得られた１種もしくはそれ以上
の免疫原性ポリペプチドもしくは核酸から作成すること
ができる。これらワクチンはＨＧＢＶのエピトープを含
む組換ポリペプチドで構成することができる。これらポ
リペプチドは細菌、酵母または哺乳動物細胞で発現させ
ることができ、或いはウィルス調製物から分離すること
もできる。さらに、各種の構造蛋白質はＨＧＢＶのエピ
トープを含んで保護性の抗−ＨＧＢＶ抗体をもたらすこ
とも予想される。したがって、これらワクチンを作成す
る際に合成ペプチドを用いることもできる。たとえばＨ
ＧＢＶの少なくとも１個のエピトープを有するポリペプ
チドを単独で或いは組合せてＨＧＢＶワクチンに使用す
ることができる。さらに非構造蛋白質および構造蛋白質
は、これらが中和性抗体の産生をもたらさない場合に
も、ウィルス病原性に対し保護を与えることも考えられ
る。
【０１０６】上記を考慮し、ＨＧＢＶに対する多価ワク
チンは１種もしくはそれ以上の構造蛋白質および／また
は１種もしくはそれ以上の非構造蛋白質で構成すること
ができる。これらワクチンは、たとえば組換ＨＧＢＶポ
リペプチドおよび／またはビリオンから分離されたポリ
ペプチドおよび／または合成ペプチドで構成することが
できる。これら免疫原性エピトープは組合せ物として、
すなわち組換蛋白質、合成ペプチドおよび／またはビリ
オンから分離されたポリペプチドの混合物として使用す
ることができる。これらは同一時点または異なる時点で
投与することができる。さらに、ワクチンにて不活化Ｈ
ＧＢＶを使用することも可能である。この種の不活化は
ウィルス溶菌物の作成とすることができ、或いは肝炎類
似ウィルスの失活をもたらすことが当業界で知られた他
の手段、たとえば有機溶剤もしくは洗剤での処理または
ホルマリンでの処理とすることができる。弱毒化したＨ
ＧＢＶ株調製物も本発明に開示される。ＨＧＢＶにおけ
る或る種の蛋白質は他の公知のウィルスと交差反応しう
ることも考えられ、したがって共有エピトープがＨＧＢ
Ｖと他のウィルスとの間に存在し、次いでこれら病原因
子によりもたらされる１つもしくはそれ以上の障害に対
し保護抗体をもたらす。この知見に基づき多目的ワクチ
ンを設計しうると考えられる。
【０１０７】少なくとも１種の免疫原性ペプチドを活性
成分として含有するワクチンの作成は当業者に公知であ
る。典型的には、この種のワクチンは注射剤（液状溶液
もしくは懸濁液）として作成され、注射前に液体で溶液
もしくは懸濁液化するに適する固体形態も作成すること
ができる。この製剤を乳化させることができ、或いは蛋
白質をリポソーム内にカプセル化することもできる。活
性の免疫原性成分はしばしば、活性成分に対し適合性で
ある薬理学上許容しうる賦形薬と混合される。適する賦
形薬は限定はしないが水、塩水、デキストロース、グリ
セリン、エタノールなどを包含する。これら賦形薬の種
々の量の組合せ物も使用することができる。さらにワク
チンは少量の補助物質、たとえば湿潤剤もしくは乳化
剤、ｐＨ緩衝剤および／またはワクチンの効果を向上さ
せるアジュバントを含有することもできる。たとえば、
この種のアジュバントは水酸化アルミニウム、Ｎ−アセ
チル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン
（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ
−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８
７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称する）、Ｎ−アセチルムラミ
ル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニ
ン−２−（１′，２′−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン
（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称する）お
よび２％スクアレン／ツイーン８０（登録商標）エマル
ジョンにおけるＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を
包含する。アジュバントの効果は、各種のアジュバント
で構成されるワクチンにてポリペプチドを投与して生ず
るＨＧＢＶ抗原配列を含む免疫原性ポリペプチドに対し
指向される抗体の量を測定して決定することができる。
【０１０８】一般にワクチンは静脈注射または筋肉内注
射により投与される。他の投与方式に適する他の処方物
は座薬および或る場合には経口処方物を包含する。座薬
の場合、慣用の結合剤およびキャリヤは限定はしないが
ポリアルキレングリコールもしくはトリグセリドを包含
する。この種の座薬は約０．５〜約１０％、好ましくは
約１〜約２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形
成することができる。経口処方物はたとえば一般的に用
いられる賦形薬、たとえば医薬級のマニトール、乳糖、
澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリ
ン、セルロース、炭酸マグネシウムなどを包含する。こ
れら組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐
放性処方物もしくは粉末の形態とすることができ、約１
０〜約９５％（好ましくは約２５〜約７０％）の活性成
分を含有する。
【０１０９】ワクチンに使用される蛋白質は中性型また
は塩型としてワクチンに混入することができる。たとえ
ば酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成）のような
医薬上許容しうる塩、およびたとえば塩酸もしくは燐酸
のような無機酸またはたとえば酢酸、蓚酸、酒石酸、マ
レイン酸のような有機酸により形成される塩、並びに当
業者に知られた他の塩がある。遊離カルボキシル基で形
成される塩はたとえばナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウムもしくは第二鉄の水酸化物など無機塩
基から誘導することもでき、さらにたとえばイソプロピ
ルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノ
ール、ヒスチジンプロカインおよび当業者に知れた他の
有機塩基から得ることもできる。
【０１１０】ワクチンは、投与処方に適する方法で予防
および／または治療効果を示すような量にて投与され
る。投与すべき量は一般に１回の投与当り抗原約５〜約
２５０μｇの範囲であって、投与すべき患者、抗体を合
成すべき患者の免疫系の能力、および求める保護程度に
依存する。投与するのに要する活性成分の正確な量は医
師の判断に依存し、各患者ごとに定められる。ワクチン
は１回または多数回の投与スケジュールで与えることが
できる。多数回投与はワクチン処理の主たる過程を１〜
１０回の別々の投与で行い、次いで免疫反応を維持およ
び／または強化するのに要する時間間隔でさらに投与
し、たとえば第２投与につき１〜４か月にて、個体によ
ってはその後に数か月おいて投与する。投与方式は少な
くとも部分的に個体のニーズにより決定され、医師の判
断に依存する。免疫原性ＨＧＢＶ抗原を含有するワクチ
ンは他の免疫調整剤、たとえば免疫グロブリンと組合せ
て投与することも考えられる。
【０１１１】ＨＧＢＶエピトープに対する抗体の作成 ここに記載したように作成した免疫原性ペプチドを用い
て、ポリクローナルもしくはモノクローナルのいずれか
の抗体を産生させる。ポリクローナル抗体を作成する場
合は、選択された哺乳動物（たとえばマウス、ウサギ、
ヤギ、ウマなど）を少なくとも１個のＨＧＢＶエピトー
プを有する免疫原性ポリペプチドで免疫処理する。免疫
処理動物からの血清を適する培養期間の後に集め、公知
の手順で処理する。ＨＧＢＶエピトープに対するポリク
ローナル抗体を含有した血清が他の抗原に対する抗体も
含有する場合は、これらポリクローナル抗体をたとえば
免疫親和性クロマトグラフィーにより精製することがで
きる。ポリクローナル抗体を産生および処理する技術は
当業界にて公知であり、特にマイヤーおよびウォーカー
編、細胞および分子生物学における免疫化学法、アカデ
ミック・プレス社、ロンドン（１９８７）に記載されて
いる。ポリクローナル抗体は、以前にＨＧＢＶに感染し
た哺乳動物から得ることもできる。ＨＧＢＶで感染した
個体の血清からＨＧＢＶエピトープに対する抗体を親和
性クロマトグラフィーにより精製する方法の例について
もここに示す。
【０１１２】ＨＧＢＶエピトープに向けられるモノクロ
ーナル抗体も当業者は産生させることができる。この種
の抗体を産生させる一般的な方法は周知であって、たと
えばコーラーおよびミルスタイン、ネイチャー、第２５
６巻、第４９４頁（１９７５）に記載され、さらにＪ．
Ｇ．Ｒ．ハレル編、モノクローナル・ハイブリドーマ・
アンチボディース：テクニーク・アンド・アプリケーシ
ョンス、ＣＲＣプレス社、ボコ・ラトン、ＦＬ（１９８
２）に検討されており、さらにＬ．Ｔ．ミムス等、バイ
ロロジー、第１７６巻、第６０４〜６１９頁（１９９
０）に教示されている。不死性抗体産生細胞系を細胞融
合により形成させることができ、さらにたとえば癌性Ｄ
ＮＡでのＢリンパ球の直接的な形質転換またはエプスタ
イン・バールウィルスでのトランスフェクションなど他
の技術により形成させることができる［Ｍ．シュライエ
ル等、ハイブリドーマ・テクニークス、スコープス（１
９８０）、プロテイン・ピューリフィケーション、プリ
ンシプルス・アンド・プラクティス、第２版、スプリン
ガー・フェアラーク、ニューヨーク（１９８４）；ハン
マーリング等、モノクローナル・アンチボディース・ア
ンド・Ｔ−セル・ハイブリドーマ（１９８１）；ケネッ
ト等、モノクローナル・アンチボディース（１９８０）
参照］。モノクローナル抗体の使用および技術の例は米
国特許出願第７４８，２９２号；第７４８，５６３号；
第６１０，１７５号；第６４８，４７３号；第６４８，
４７７号；および第６４８，４７５号に開示されてい
る。
【０１１３】このように発生させたＨＧＢＶエピトープ
に向けられるモノクローナルおよびポリクローナル抗体
は診断および予防用途に有用であり、さらに中和性であ
るものは受動免疫療法に有用である。特にモノクローナ
ル抗体は抗−イジオタイプ抗体を産生させるべく使用す
ることができる。これら抗−イジオタイプ抗体は、保護
を所望する感染因子の抗原の「内部イメージ」を有する
免疫グロブリンである［たとえばＡ．ニソノフ等、クリ
ニカル・イミュノロジカル・イミュノパソロジー、第２
１巻、第３９７〜４０６頁（１９８１）およびドリース
マン等、ジャーナル・インフェクシャス・ディジーズ、
第１５１巻、第７６１頁（１９８５）参照］。この種の
イジオタイプ抗体を生ぜしめる技術は当業界にて公知で
あり、たとえばグリッチ等、ネイチャー、第３１６巻、
第７４頁（１９８５）；マクナマラ等、サイエンス、第
２２６巻、第１３２５頁（１９８４）；およびウィトデ
ハーグ等、ジャーナル・イミュノロジー、第１３４巻、
第１２２５頁（１９８５）］に例示されている。これら
抗−イジオタイプ抗体はＨＧＢＶ感染の処置およびＨＧ
ＢＶ抗原の免疫原性領域の解明にも有用である。
【０１１４】免疫分析および診断キット ＨＧＢＶ抗体を含有する血清と免疫学的に反応するポリ
ペプチドおよびその複合体、並びにこれらポリペプチド
におけるＨＧＢＶ特異性エピトープに対し生じた抗体
は、いずれもＨＧＢＶ抗体の存在（すなわち生物試験試
料におけるウィルスおよび／またはウィルス抗原の存
在）を検出する免疫分析に有用である。これら免疫分析
の設計は改変可能であり、各種の免疫分析が当業界にて
公知である。また、各種の免疫分析を本明細書に開示す
る。免疫分析は１種のウィルス抗原、たとえばクローン
含有ＨＧＢＶ核酸配列から或いはこれらクローンにおけ
るＨＧＢＶ核酸配列から得られた複合核酸配列から或い
はこれらクローンにおける核酸配列が得られるＨＧＢＶ
ゲノムから得られたポリペプチドを用いることができ
る。或いは、免疫分析はこれら原料から得られるウィル
ス抗原の組合せを用いることもできる。たとえば同一の
ウィルス抗原に向けられるモノクローナル抗体または異
なるウィルス抗原に向けられるポリクローナル抗体を使
用することができる。分析は限定はしないが競合、直接
反応またはサンドイッチ型分析に基づくものを包含す
る。分析は固相を用いることができ、或いは固相を用い
ない免疫分析もしくは免疫沈澱もしくは他の任意の方法
によって行うことができる。シグナル発生化合物として
ラベルを用いる分析およびこれらラベルの例をここに説
明する。さらにシグナルはビオチンおよびアビジン、酵
素ラベルまたはビオチン抗−ビオチン系、たとえば米国
特許出願第６０８，８４９号；第０７０，６４７号；第
４１８，９８１号；および第６８７，７８５号に記載さ
れて当業界で知られたものを用いて増幅することもでき
る。ＨＧＢＶの免疫優性領域からのエピトープを含む組
換ポリペプチドは、感染個体の生物試験試料におけるウ
ィルス抗体の検出に有用である。さらにＧＢＶ抗体は非
急性感染と急性感染を識別するにも有用であると考えら
れる。免疫診断に適すると共に好適試薬を含有するキッ
トは、ＨＧＢＶエピトープまたはＨＧＢＶエピトープに
向けられる抗体を含有する本発明のポリペプチドを含む
適する物質を分析の実施に必要な残余の試薬および物
質、並びに適する分析指針と一緒に適する容器内に包装
して作成される。
【０１１５】ここに詳述した組換蛋白質を用いる分析方
式は適宜設計することができ、ここではＣＫＳ−融合蛋
白質につき説明および詳述するが、本発明の範囲内にて
たとえばｐＬ、超酸化物ジスムターゼ（ＳＯＤ）などの
他の発現系を本発明に用いて免疫分析における抗原、抗
体産生のための免疫原などを含め各種の方法に使用しう
る融合蛋白質を生ぜしめることも考えられる。ヒト試験
試料における特定分析物（たとえばウィルスのような感
染性因子）に対する抗体の存在を検出する分析方式にお
いては、ヒト試験試料を少なくとも１種の組換蛋白質
（ポリペプチド）で被覆された固相と接触させると共に
培養する。抗体が試験試料に存在する場合は抗原ポリペ
プチドとの複合体を形成して固相に固定される。複合体
が形成した後、未結合物質および試薬を固相の洗浄によ
って除去する。複合体を指示薬と反応させると共に第２
複合体を形成させるのに充分な時間および条件にて培養
する。ＣＫＳ組換ポリペプチドに対する試験試料におけ
る抗体の存在は発生シグナルを検出して判定する。切捨
て値より高いシグナルが発生すると、試験試料に存在す
る分析物に対する抗体の存在を示唆する。たとえば酵素
のような指示薬を用いる場合、多くは抗体の存在量は発
生シグナルに比例する。試験試料の種類に応じ、適する
緩衝剤で希釈し、濃縮し或いは何ら処理せずに（「その
まま」）固相と接触させる。たとえば一般に、予め希釈
された血清もしくは血漿試料またはたとえば尿のような
濃厚試料を試験して抗体の存在および／または存在量を
決定するのが好適である。
【０１１６】さらに、上記分析方式にて２種以上の組換
蛋白質を用いて特定の感染因子に対する抗体の存在につ
き試験することもでき、これには試験する感染因子のウ
ィルスゲノムの各種抗原エピトープに対するＣＫＳ融合
蛋白質を用いる。たとえば特定ウィルス抗原領域内のエ
ピトープおよびウィルスゲノムからの他の抗原領域より
得られるエピトープを含有する組換ポリペプチドを用い
て、向上した感度を有すると共に恐らく１個のエピトー
プからのポリペプチドを用いるよりも高い特異性を示す
分析法を与えるのが好ましい。この種の分析法は確認分
析として用いることができる。この特定分析方式におい
ては、既知量の試験試料を（ａ）少なくとも１種の組換
蛋白質で被覆された既知量の少なくとも１種の固体支持
体と組換蛋白質／抗体複合体を形成するのに充分な時間
および条件にて接触させる。これら複合体を既知量の適
する指示薬と、反応を生ぜしめるのに適する時間および
条件にて接触させ、得られた発生シグナルを陰性試験試
料と比較して試験試料における分析物に対する抗体の存
在を判定する。さらに、たとえば微粒子のような或る種
の固相を用いる場合、分析に使用される各組換蛋白質を
別の微粒子に付着させることができ、これら微粒子の混
合物を各分析につき最適化しうる各種の被覆微粒子と合
して作成することができる。
【０１１７】上記分析方式の改変は、いずれかの分析物
に対する抗体の存在を検出するための同一もしくは異な
る固相に付着した異なる分析物のＣＫＳ−組換蛋白質の
組込み（たとえば感染因子の存在を検出するため、或る
種の異なる感染因子の抗原領域につき特異的なＣＫＳ−
組換蛋白質により同一もしくは異なる固相にて被覆され
た１種の感染因子の抗原領域につき特異性のＣＫＳ−組
換蛋白質）を包含する。
【０１１８】さらに他の分析方式において、抗原エピト
ープを含有するＣＫＳ組換蛋白質はたとえば中和分析の
ような競合分析に有用である。中和分析を行うには、た
とえばウィルスのような感染因子の抗原領域エピトープ
を示す組換ポリペプチドを溶解させると共に試料希釈剤
と０．５〜５０．０μｇ／ｍＬの最終濃度まで混合す
る。希釈もしくは未希釈の既知量の試験試料（好ましく
は１０μＬ）を反応ウエルに添加し、次いで組換ポリペ
プチドを含有する４００μＬの試料希釈剤を添加する。
所望に応じ混合物を約１５分間〜２時間にわたり予備培
養することができる。次いで、ここに説明したＣＫＳ−
組換蛋白質で被覆された固相を反応ウエルに添加し、約
４０℃にて１時間培養する。洗浄の後、既知量の指示
薬、たとえば２５０μＬのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
−ヒトＩｇＧを接合希釈剤にて添加し、４０℃にて１時
間培養する。洗浄の後、たとえば上記したような酵素接
合体を用いる場合は、たとえばＯＰＤ基質のような酵素
基質を添加して室温にて３０分間培養する。たとえば１
Ｎ硫酸のような停止試薬を反応ウエルに添加して反応を
停止させる。吸光度を４９２ｎｍにて測定する。特定ポ
リペプチドに対する抗体を含有した試験試料は、溶液中
のこれら抗体に対するペプチドの競合結合によりシグナ
ル発生が減少する。競合結合の比率は、組換ポリペプチ
ドの存在下における試料の吸光値を組換ポリペプチドの
不存在下で分析した試料の吸光値と同じ希釈率で比較し
て計算することができる。すなわち、組換蛋白質の存在
下における試料と組換蛋白質の不存在下における試料と
の間の発生シグナルにおける差が抗体の存否を判定すべ
く使用される尺度である。
【０１１９】他の分析方式においては組換蛋白質を免疫
ドット・ブロット分析系で用いることができる。免疫ド
ット・ブロット分析系はニトロセルロース固体支持体に
列として設置された精製組換ポリペプチドのパネルを使
用する。作成された固体支持体を試料と接触させて特異
的固体（特異的結合員子）を組換蛋白質（他の特異性結
合員子）に捕捉させることにより特異的結合員対を形成
させる。捕捉抗体を指示薬との反応により検出する。好
ましくは結合特異反応は、１９８８年８月２日付け出願
の米国特許出願第０７／２２７，４０８号に記載された
計器反射光学装置を用いて定量される。関連する米国特
許出願第０７／２２７，５８６号および第０７／２２
７，５９０号（これら両者は１９８８年８月２日付け出
願）はさらに免疫ドット分析を行うのに有用な特定方法
および装置を記載しており、米国特許第５，０７５，０
７７号（１９８８年８月２日付け出願の米国特許出願第
０７／２２７，２７２号）も同じ出願人によるものであ
って参考のためここに引用する。要約するに、ニトロセ
ルロース系の試験カートリッジを多重の抗原ポリペプチ
ドで処理する。各ポリペプチドは試験カートリッジにお
ける特定反応帯域に含まれる。全抗原ポリペプチドがニ
トロセルロースに設置された後、ニトロセルロースにお
ける過剰の結合部位を封鎖する。次いで試験カートリッ
ジを試験試料と接触させて、試験試料が適する抗体を含
有すれば各反応帯域にて各抗原ポリペプチドが反応する
ようにする。反応の後、試験カートリッジを洗浄し、全
ての抗原−抗体反応を適する周知の試薬により確認す
る。ここに挙げた特許および特許出願に記載されたよう
に、全過程は自動化することが推奨される。免疫ドット
・ブロット分析を行うための方法および装置に関連する
上記各出願の開示内容を参考のためここに引用する。
【０１２０】ＣＫＳ融合蛋白質（組換抗原）を次のよう
に第１および第２固体支持体を用いる分析に使用して、
試験試料における分析物の特定抗原に対する抗体を検出
することができる。この分析方式において、たとえばＣ
ＫＳ組換抗原を用いる場合、第１量の試験試料を分析物
に特異的なＣＫＳ組換蛋白質で被覆された第１固体支持
体と組換蛋白質／分析物抗体複合体を形成するのに充分
な時間および条件にて接触させる。次いで複合体を組換
抗原に対し特異的な指示薬と接触させる。指示薬を検出
して、試験試料における組換蛋白質に対する抗体の存在
を判定する。これに続き、同じ分析物の異なる抗原決定
子の存在を、第２量の試験試料を第２抗体に特異的なＣ
ＫＳ組換蛋白質で被覆された第２固体支持体と組換蛋白
質／第２抗体複合体を形成するのに充分な時間および条
件にて接触させることにより判定する。複合体を、この
複合体の抗体に対し特異的な第２指示薬と接触させる。
シグナルを検出して試験試料における抗体の存在を判定
し、いずれかの分析物組換蛋白質または両者に対する抗
体の存在があれば試験試料における抗−分析物の存在を
示す。さらに固体支持体を同時的に試験することも考え
られる。
【０１２１】ハプテンの使用は当業界にて公知であり、
ＣＫＳ融合蛋白質を用いる分析にハプテンを使用して分
析の性能を向上させることも考えられる。
【０１２２】ＨＧＢＶ用の抗−ウィルス因子のスクリー
ニング ＨＧＢＶのための細胞培養物および動物モデル系が入手
できると、ＨＧＢＶ複製を抑制する抗−ウィルス剤のス
クリーニングが可能となり、特に細胞増殖および取扱を
優先的に可能にすると共にウィルス複製を抑制する抗−
ウィルス剤のスクリーニングを可能にする。これらスク
リーニング法は当業界にて公知である。一般に、抗−ウ
ィルス剤はウィルス複製を支持する細胞培養系にてウィ
ルス複製の防止に対する作用および／次いで感染性もし
くはウィルス病理性の抑制および低レベルの毒性につき
動物モデル系で種々の濃度にて試験する。ＨＧＢＶ抗原
を検出するためここに示した方法および組成物は抗ウィ
ルス剤のスクリーニングにつき有用である。何故なら、
これらは細胞プラーク分析もしくはＩＤ50分析よりも感
受性のウィルス複製に対する薬剤作用を検出する手段を
与えるからである。抗−ＨＧＢＶ抗体を使用して、ここ
に記載した免疫分析により細胞培養物におけるＨＧＢＶ
抗原を同定および定量化することができる。さらに、競
合分析により感染細胞培養物におけるＨＧＢＶ抗原を定
量することが望ましいので、ＨＧＢＶ核酸配列内でコー
ドされるポリペプチドはこれら分析につき有用である。
一般にＨＧＢＶゲノムもしくはｃＤＮＡから得られた組
換ポリペプチドを標識し、この標識されたポリペプチド
のＨＧＢＶポリペプチドに対する結合の細胞培養系で産
生された抗原に基づく抑制を監視する。これら方法は特
に、ＨＧＢＶが細胞死滅をもたらさずに細胞系で複製し
うる場合に有用である。
【０１２３】宿主および発現制御配列 以下の説明は当業界にて公知であるが、ウィルスからゲ
ノムを抽出し、ゲノムライブラリを作成すると共にプロ
ーブし、クローンを配列決定し、発現ベクターを作成
し、細胞を形質転換させ、免疫学的分析を実施し、さら
に細胞を培養増殖させるため使用する一般的技術をここ
に説明する。
【０１２４】所定の宿主に適合しうる適する制御配列を
使用する場合、原核性および真核性の両宿主細胞とも所
望のコード化配列の発現に使用することができる。原核
性宿主としてはイー・コリが最も頻繁に使用される。原
核性宿主の発現制御配列は、必要に応じオペレータ部分
を有するプロモータおよびリボソーム結合部位を含む。
原核性宿主に適合しうる転移ベクターは一般に、アンピ
シリンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロン
を含んだプラスミドｐＢＲ３２２および同じく抗生物質
耐性マーカーを付与する配列を含んだ各種のｐＵＣベク
ターから得られる。これらマーカーを用いて選択により
有利な形質転換体を得ることができる。一般に使用され
る原核性制御配列はβ−ラクタマーゼ（ペニシリナー
ゼ）、乳糖プロモータ系［チャン等、ネイチャー、第１
９８巻、第１０５６頁（１９７７）］、トリプトファン
プロモータ系［ゲデル等、ヌクレイック・アシッド・リ
サーチ、第８巻、第４０５７頁（１９８０）に記載］お
よびλ系ｐＬプロモータおよびＮ遺伝子リボソーム結合
部位［シマタケ等、ネイチャー、第２９２巻、第１２８
頁（１９８１）およびハイブリッドＴａｃプロモータ
［デボア等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ
ー・サイエンス、ＵＳＡ、第２９２巻、第１２８頁（１
９８３）］を包含し、ｔｒｐおよびｌａｃＵＶ５プロモ
ータの配列から得られる。上記の系は特にイー・コリに
対し適合性である。しかしながら、所望に応じ、対応の
制御配列を有するたとえばバチルスもしくはシュードモ
ナスの菌株のような他の原核性宿主も使用することがで
きる。
【０１２５】真核性宿主は培養系における酵母および哺
乳動物細胞を包含する。サッカロミセス・セレビシエお
よびサッカロミセス・カールスベルゲンシスが最も一般
的に使用される酵母宿主であり、便利な真菌宿主であ
る。酵母適合性ベクターは、自己栄養要求性突然変異体
にプロトロフィーを付与し或いは野生型菌株にて重金属
に対し耐性を付与することにより有利な形質転換体の選
択を可能にするマーカーを有する。酵母適合性ベクター
は２μｍの複製原点［ブローチ等、メソッズ・エンザイ
モロジー、第１０１巻、第３０７頁（１９８３）に記
載］、ＣＥＮ３とＡＲＳ１との組合せ、または複製を確
認する他の手段、たとえば宿主細胞ゲノム中への適する
断片の組込をもたらす配列を使用する。酵母ベクターの
ための制御配列は当業界にて公知であり、グリコール分
解酵素の合成のためのプロモータ、たとえば３−ホスホ
フィセレートキナーゼのプロモータを包含する［たとえ
ばヘッス等、ジャーナル・アドバンスト・エンザイム・
レギュレーション、第７巻、第１４９頁（１９６８）、
ホーランド等、バイオケミストリー、第１７巻、第４９
００頁（１９７８）およびヒッツェマン、ジャーナル・
バイオロジカル・ケミストリー、第２５５巻、第２０７
３頁（１９８０）参照］。たとえばホーランド、ジャー
ナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２５６巻、第
１３８５頁（１９８１）により報告されたエノラーゼ遺
伝子から得られるようなターミネータも包含される。特
に有用な制御配列はグリセロアルデヒド−３−ホスフェ
ート デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモータまた
はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）調節性プロモ
ータ、ＧＡＰＤＨからも得られるターミネータおよび分
泌が望ましければ酵母α因子からのリーダー配列を含む
ものであると考えられる。さらに、作用可能なように結
合する転写制御領域および転写開始領域は、天然には野
生型生物では関連しないものである。
【０１２６】発現用の宿主として入手しうる哺乳動物細
胞系は当業界にて公知であり、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから入手しうる多くの不死細胞
系を包含する。これらはヘラ細胞、支那ハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞、幼児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞な
どを包含する。哺乳動物細胞の適するプロモータも当業
界にて公知であり、ウィルスプロモータ、たとえばサル
ウィルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳ
Ｖ）、アデノウィルス（ＡＤＶ）、牛乳頭腫ウィルス
（ＢＰＶ）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）からのウ
ィルスプロモータを包含する。哺乳動物細胞はさらにタ
ーミネータ配列およびポリＡ付加配列を必要とする。発
現を増大させるエンハンサー配列も含ませることがで
き、さらに遺伝子の増幅をもたらす配列も望ましい。こ
れら配列は当業界にて公知である。哺乳動物細胞にて複
製するのに適するベクターはウィルスレプリコンまたは
非−Ａ型、非−Ｂ型、非−Ｃ型、非−Ｄ型、非−Ｅ型エ
ピトープをコードする適する配列を宿主ゲノムに一体化
させる配列を包含する。ＨＣＶのための哺乳動物発現系
の例は１９９２年１月３１日付け出願の米国特許出願第
０７／８３０，０２４号に記載されている。
【０１２７】バキュロウィルス発現系 市販入手しうるバキュロウィルス発現系は、組換蛋白質
を多量に産生すべく広範に入手しうる。バキュロウィル
ス系はグリコシル化蛋白質の高レベル発現を可能にする
点で細菌発現系よりも有利であるが、これら改変は天然
グリコシル化と同一でない。これら系における発現は目
的遺伝子を転移ベクターにクローン化させて行われ、遺
伝子は強力なウィルスプロモータ、一般にオートグラフ
ァ・カリホルニカ核ポリヘドロシスウィルス（ＡｃＮＰ
Ｖ）のポリヘドリンプロモータの制御下におかれる。次
いで転移ベクターをバキュロウィルスゲノムＤＮＡと共
に適する昆虫細胞ラインに同時トランスフェクトさせ
る。転移ベクターとウィルスゲノムＤＮＡとの間の組換
から生ずる感染性ウィルスを次いで分離する。組換ウィ
ルスの選択は、トランスフェクション用の市販バキュロ
ウィルスゲノムＤＮＡにより著しく容易化される。この
種の１つの系、すなわちバキュロゴールド（登録商標）
［ファルミンゲン、サンジエゴ、ＣＡ］は致命的欠失を
有する線状化バキュロウィルスゲノムＤＮＡであり、し
たがってゲノムＤＮＡは欠失を同時トランスフェクトさ
れたポリヘドリン系バキュロウィルス転移ベクターによ
り補充しない限りトランスフェクト細胞にて感染性ウィ
ルス粒子を作成しえない。
【０１２８】細胞培養上澄液中への組換蛋白質の分泌を
指令するため、分泌蛋白質シグナル配列と興味ある蛋白
質との間で融合蛋白質を作成しうる市販の転移ベクター
を入手することができる。この種の１種のベクター、す
なわちｐＡｃＧＰ６７Ａ（ファルミンゲン社）はｇｐ６
７のシグナル配列、すなわちＡｃＮＰＶの最も豊富なエ
ンベロプ蛋白質を用いる。ｇｐ６７シグナル配列は組換
蛋白質を細胞分泌経路に指向させる。このようにして、
シグナルペプチドは、ｇｐ６７の場合と同様に小胞体に
存在する細胞プロテアーゼにより除去される。得られる
組換蛋白質は、アミノ末端に存在する３個のｇｐ６７ア
ミノ酸と共に細胞培養上澄液に分泌される。
【０１２９】形質転換 形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する任意
公知の方法とすることができ、ウィルスにポリヌクレオ
チドを封入すると共に宿主細胞をウィルスで形質導入
し、ポリヌクレオチドを直接吸収することを含む。選択
される形質転換法は、形質転換させるべき宿主に依存す
る。直接的吸収による細菌の形質転換は一般に塩化カル
シウムもしくはルビジウムでの処理を用いる［コーヘ
ン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイ
エンス、ＵＳＡ、第６９巻、第２１１０頁（１９７
２）］。直接的吸収による酵母の形質転換は、グラハム
等、バイロロジー、第５２巻、第５２６頁（１９７８）
の燐酸カルシウム沈澱法またはその改変を用いて行うこ
とができる。
【０１３０】ベクター作成 ベクター作成は当業界で公知の方法を用いる。一般に、
部位特異性ＤＮＡ切断を行い、これには適する制限酵素
により一般にこれら市販酵素の製造業者により指定され
た条件下で処理する。一般に、約１μｇのプラスミドも
しくはＤＮＡ配列を約２０μＬの緩衝溶液における１〜
１０単位の酵素により３７℃で１〜２時間培養して切断
する。制限酵素と共に培養した後、蛋白質をフェノール
／クロロホルム抽出により除去し、ＤＮＡをエタノール
での沈澱により回収する。切断された断片を、ポリアク
リルアミドもしくはアガロースゲル電気泳動法を用いて
当業者に知られた方法にしたがい分離することができ
る。
【０１３１】粘着性末端切断断片は、混合物に存在する
適するデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴ
Ｐ）の存在下にイー・コリＤＮＡポリメラーゼ１（クレ
ノウ）を用いて平滑化させることができる。さらにＳ１
ヌクレアーゼでの処理を用いて、一本鎖ＤＮＡ部分の加
水分解をもたらすこともできる。
【０１３２】標準的緩衝剤および温度条件を用いると共
にＴ４ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを用いて結合を行
う。粘着性末端結合は平滑末端よりも少ないＡＴＰおよ
び少ないリガーゼしか必要としない。ベクター断片を結
合混合物の１部として使用する場合は、しばしばベクタ
ー断片を細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）もしく
は牛腸アルカリホスファターゼで処理して５′−ホスフ
ェートを除去し、これによりベクターの再結合を防止す
る。或いは、望ましくない断片を制限酵素切断して結合
を防止することもできる。結合混合物を適するクローン
化宿主（たとえばイー・コリ）に形質転換させ、有利な
形質転換体を抗生物質耐性を含む方法により選択するこ
とができ、次いで正確な構成につきスクリーニングする
ことができる。
【０１３３】構成の証明および配列決定 標準的なベクター作成につき、結合混合物をイー・コリ
菌株ＸＬ−１ブルーまたは他の適する宿主に形質転換さ
せ、有利な形質転換体を抗生物質耐性または他のマーカ
ーにより選択する。次いで形質転換体からのプラスミド
をクレウェル等、プロシーディング・ナショナル・アカ
デミー・サイエンス、ＵＳＡ、第６２巻、第１１５９頁
（１９６９）の方法にしたがい、一般にクレウェル等、
ジャーナル・バクテリオロジー、第１１０巻、第６６７
頁（１９７２）に報告されたクロラムフェニコール増幅
にしたがって作成する。ＤＮＡを分離すると共に一般に
制限酵素分析および／または配列決定により分析する。
配列決定はサンガー等、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７４巻、第５４
６３頁（１９７７）の周知のジデオキシ法［メッシング
等、ヌクレイック・アシッド・リサーチ、第９巻、第３
０９頁（１９８１）にさらに記載］またはマキサム等、
メソッズ・イン・エンザイモロジー、第６５巻、第４９
９頁（１９８０）に記載された方法により行うことがで
きる。しばしばＧＣリッチ領域で観察されるバンド圧縮
を伴う問題はバー等、バイオテクニークス、第４巻、第
４２８頁（１９８６）に報告された方法にしたがいＴ−
デアゾグアノシンの使用によって解消される。
【０１３４】酵素結合免疫吸着分析 酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）を用いて抗原もし
くは抗体の濃度を測定することができる。この方法は抗
原もしくは抗体のいずれかに対する酵素ラベルの結合に
依存し、定量ラベル（測定可能な発生シグナル）として
結合酵素活性（発生シグナル）を使用する。ラベルとし
て酵素を用いる方法をここに説明し、この種の酵素ラベ
ルの例をも説明する。
【０１３５】
【実施例】以下、限定はしないが本発明の思想および範
囲を例示する意味で実施例により本発明をさらに説明す
る。
【０１３６】実施例 ＨＧＢＶの伝染性に関する初期の検討は、参考のためこ
こに全て引用した米国特許出願第０８／２８３，３１４
号、米国特許出願第０８／２４２，６５４号および米国
特許出願第０８／１９６，０３０号に記載されたように
行われている。他の感染性の検討については、これら３
件の先行特許出願および１９９４年１１月２３日付け出
願の米国特許出願第０８／３４４，１８５号および０８
／３４４，１９０号（これらも参考のためここに引用し
た）に開示されている。これら先行特許出願はＨＧＢＶ
クローン配列の延長を説明する例を開示している（ＨＧ
ＢＶ配列の発生、ＨＧＢＶにおける２種のＨＣＶ様ウィ
ルスの存在に関する証明、ＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ
−Ｂが２種の異なるＲＮＡ種類および異なるウィルスを
示す証明、並びにＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ−Ｂがフ
ラビビリデーに属する証明）。さらに免疫原性ＨＧＢＶ
ポリペプチドの発現および検出のためのＣＫＳベースの
発現ベクター系を詳述する実施例、組換蛋白質およびそ
の精製法を用いると共にポリスチレンビーズ被覆法を含
む血清学的研究、ＨＧＢＶに対する抗体を検出するため
のＥＬＩＳＡ法、並びにヒトおよびタマリンザルを含む
感染個体からの血清におけるＨＧＢＶ由来ＲＮＡの検出
を説明する実施例、さらにヒト集団におけるＨＧＢＶへ
の露呈に関する証明、たとえば使用した実験法、切捨て
値決定、補充試験、低危険性試料で得られる血清学的デ
ータ、世界の各国で肝炎につき「危険」と考えられる個
体から得られた試験試料、および試験から得られた血清
学的結果の統計的有意性を詳述する例も開示され；さら
にヒト集団におけるＨＧＢＶへの露呈に関する証明を与
える追加試験、たとえば用いた実験法、切捨て値決定、
補助試験、低危険性試料で得られる血清学的データ、肝
炎につき「危険」である個体から得られる血清学的デー
タ、および血清学的結果の統計的有意性を詳述する他の
例；さらにヒトにおけるＧＢ関連ウィルスの同定を示す
他の例を詳述すると共に、その同定に対する化学的理
由、ＨＧＢＶ−ＣのＮＳ３−様領域の詳細なクローン
化、長さ５１６３ｂｐのヌクレオチド配列、ＧＢ−Ｃが
外因性であるとの結論を導く科学的実験、ＧＢ−Ｃが追
加ヒト血清試料で検出されうる実験、ＨＧＢＶ−Ｃ配列
を延長させるべく使用するＰＣＲ操作技術を詳述する実
験につき示し、これらは全て核酸配列および５１６３ｂ
ｐの６−フレーム翻訳として示される。これら配列は１
９９４年１１月２３日付け出願の米国特許出願第０８／
３４４，１９０号（参考のためここに引用した）に示さ
れている。この配列はＡＴＣＣに寄託されて１９９４年
１１月８日付けでＡＴＣＣ Ｎｏ．６９７１１に一致す
るクローンｐＨＧＢ−ＣクローンＮｏ．１から得られ、
米国特許出願第０８／３４４，１９０号に記載された通
りである。これら配列は米国特許出願第０８／３４４，
１９０号に配列番号７６およびその６種の可能な読み枠
として同定された。１９９５年１月３０日付け出願の米
国特許出願第０８／３７７，５５７号（参考のために先
に引用した）は５１６３ｂｐ配列を８０８７ｂｐの長さ
まで延長させ、８０８７ｂｐ配列の３種の前向き読み枠
の翻訳をも与えた。米国特許出願第０８／４２４，５５
０号（参考のため先に引用した）はＨＧＢＶ−Ｃの８０
８７ｂｐを９０３４ｂｐまで延長すると共に、ＨＧＢＶ
−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃに関する追加の
血清学的データをも与えた。これら特許出願に対応する
ＰＣＴ出願、すなわちＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１１８は
１９９５年８月１８日付けで公開された。米国特許出願
第０８／４１７，６２９号はＨＧＢＶ−Ｃ配列８８ｂｐ
を延長させ、すなわちこの配列を９１２２ｂｐまで延長
し、さらに西アフリカにおける抗体検出およびＰＣＲ結
果を補正すると共に血液ドナー志願者、静注薬剤使用者
および非−Ａ〜Ｅ肝炎個体におけるＰＣＲ結果を要約す
ることにより、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧ
ＢＶ−Ｃの血清学的データを更新した。
【０１３７】実施例１． 免疫原性ＨＧＢＶ−Ｃポリペ
プチドのＣＫＳ系発現および検出 米国特許出願第０８／４２４，５５０号の例１８（表２
１）に記載された実験から得られたＨＧＢＶ−Ｃ配列
を、表１および米国特許出願第０８／４２４，５５０号
の表２２に示された制限酵素を用い、米国特許出願第０
８／４２４，５５０号の例１３に記載されかつ当業界で
知られた手順にしたがいＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２０
０、ｐＪＯ２０１およびｐＪＯ２０２中へクローン化さ
せた。さらに、Ｃ．３／２およびＣ．８／１２と称する
２種の追加ＰＣＲクローンも発現させた（図１）。要約
するに、プライマー配列番号２９および配列番号３０の
相補体を用いてＰＣＲ生産物Ｃ．３／２を発生させ、プ
ライマー配列番号３１および配列番号３２の相補体を用
いてＰＣＲ生産物Ｃ．８／１２を発生させ、これには米
国特許出願第０８／４２４，５５０号の例９に記載され
かつ当業界で知られた手順にしたがった。ＰＣＲ産生物
を上記したようにＰＴ７ブルーにクローン化させ、次い
で表１および米国特許出願第０８／４２４，５５０号の
表２２にも挙げられた制限酵素で遊離させ、公知の標準
法にしたがい米国特許出願第０８／４２４，５５０号の
例１３に記載されたようにｐＪＯ２００、ｐＪＯ２０１
およびｐＪＯ２０２にクローン化させた。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】１．７、４．１もしくは２．１７ＥＬＩＳ
Ａ（米国特許出願第０８／４２４，５５０号の例１５お
よび１６参照）により、ＣＫＳ／ＨＧＢＶ−Ａもしくは
ＣＫＳ／ＨＧＢＶ−Ｂ融合蛋白質の１種もしくはそれ以
上に対する抗体の存在を示した２種のヒト血清を、ウエ
スタン・ブロット分析用として選択した。これら血清の
一方（２４０Ｄ）は非Ａ〜Ｅ型肝炎を有する個体（エジ
プト）からのものであり、他方（Ｇ８〜８１）はＨＧＢ
Ｖに露呈した「危険性」を有する西アフリカからのもの
とした（米国特許出願第０８／４２４，５５０号の例１
５参照）。ＣＫＳ／ＨＧＢＶ−Ｃ融合蛋白質を発現させ
ると共に、米国特許出願第０８／４２４，５５０号の例
１３に記載されかつ当業界で知られたようにニトロセル
ロースシートに移行させた。これらブロットを米国特許
出願第０８／４２４，５５０号の例１３に記載されかつ
当業界で知られたように予備封鎖し、１０％イー・コリ
溶菌物と６ｍｇ／ｍＬのＸＬ１−ブルー／ＣＫＳ溶解物
とを含有する封鎖用緩衝液における１：１００の希釈ヒ
ト血清試料と共に１晩培養した。これらブロットをＴＢ
Ｓで２回洗浄し、ＨＲＰＯ−接合ヤギ抗−ヒトＩｇＧと
反応させ、米国特許出願第０８／４２４，５５０号の例
１３に示されたように展開させた。結果を表１および米
国特許出願第０８／４２４，５５０号の表２２に示す。
【０１４０】ＨＧＢＶ−Ｃ蛋白質の数種は２種の血清の
いずれかまたは他方と反応性を示し、上記方法（米国特
許出願第０８／４２４，５５０号の例２０参照）にした
がうＥＬＩＳＡ分析で使用するため３種（Ｃ．１、Ｃ．
６およびＣ．７）を選択した。すなわちＨＧＢＶ−Ａお
よびＨＧＢＶ−Ｂ蛋白質に対し反応性であると同定され
た試料はさらにＨＧＢＶ−Ｃ蛋白質に対する反応性をも
示した。３種のＨＧＢＶウィルスからの複数蛋白質に対
する反応性は、各ウィルス間の共有エピトープから生ず
る交差反応性に基づくものと思われる。或いは、これは
複数ウィルスによる感染の結果であると思われ、または
他の未同定因子に基づくと思われる。
【０１４１】実施例２． 免疫反応性ＨＧＢＶ−Ｃ蛋白
質のエピトープ マッピング ここに参考のため引用した米国特許出願第０８／４２
４，５５０号の例１９に同定された反応性断片ＧＢ−
Ｃ、Ｃ．１、Ｃ．５、Ｃ．６、Ｃ．７およびＣ．８／１
２は、ＨＧＢＶ−Ｃ大型開放読み枠（配列番号３３）の
領域の残基８７６〜２３３５にまたがる（図１参照）。
ＨＧＢＶ−Ｃのこの領域を含む１４個の重なるＰＣＲ断
片を発生させ、抗原領域を位置決定した。ＨＧＢＶ−Ｃ
ＰＣＲ産生物を、最初にＧＢ−Ｃを同定すべく用いた
西アフリカ試料から得られたｃＤＮＡより発生させた
（米国特許出願第０８／４２４，５５０号の例１８参
照）。核酸抽出およびｃＤＮＡ反応を上記したように行
った。全ＰＣＲは１μＭのプライマーを３５〜４０サイ
クルにつき用いた（９４℃、２０〜３０秒；５０〜５５
℃、３０秒；７２℃、３０〜１２０秒）。各クローンの
プライマーを表２に示す。各プライマーは５′末端に付
加された制限部位を有し、ＰＣＲ産生物の完全な切断を
確保すべく、６個のヌクレオチドが先についたｐＪＯ２
０１複数クローン化部位へのクローン化を容易にした。
これら産生物を米国特許出願第０８／４２４，５５０号
の例１３に記載したようにｐＪＯ２０１にクローン化さ
せた。プライマーに組みこんだ制限部位およびＨＧＢＶ
−Ｃポリ蛋白質内のコード化蛋白質の位置を表２に示
す。
【０１４２】新たなＣＫＳ／ＨＧＢＶ−Ｃ融合蛋白質を
発現する培養物を増殖させ、蛋白質を米国特許出願第０
８／４２４，５５０号の例１３に記載されたように当業
界で知られた標準法にしたがいニトロセルロースに移行
させた。これら蛋白質を米国特許出願第０８／４２４，
５５０号の例１９に記載された２種のヒト血清と反応さ
せたが、ただし異なる採血日（すなわち先に用いたもの
の１０日後に採血）をエジプト２４０血清につき用い
た。ＨＧＢＶ−ＣにつきＰＣＲ陽性と判明した追加血清
（Ｍ４７）をも蛋白質と反応させた。蛋白質とこれら血
清との反応性をも表２に示す。ＰＣＲ断片Ｃ．１９、
Ｃ．２４、Ｃ．２８、Ｃ．２９およびＣ．３０は血清の
少なくとも１種に対する反応性を示した。断片Ｃ．２８
は３種全ての血清に対し反応性であった。断片Ｃ．１９
はＨＧＢＶ−Ｃ大型開放読み枠（配列番号３３）のＣ．
１反応性領域が残基１０７３〜１１９０にあることを示
し、断片Ｃ．２４は配列番号３３のＣ．６反応性領域が
残基１６１３〜１７２１にあることを示す。断片Ｃ．２
８、Ｃ．２９およびＣ．３０は配列番号３３の残基２０
４６〜２３７８にまたがり全て反応性であって、この領
域における少なくとも２個のエピトープの存在を示す。
断片ＧＢ−ＣおよびＣ．５はＧ８−８１血清に対し或る
程度の反応を示したが、これら領域におけるエピトープ
マッピング断片はいずれも反応性を示さなかった。恐
らく、新たな断片はエピトープを分裂させて、エピトー
プが完全には新たな構成物のいずれでも示されないよう
にしたと思われる。或いは大型蛋白質で見られた反応性
は完全には小型産生物によって示されない或る種の構成
エピトープに基づくと思われる。
【０１４３】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリから複製され
た菌株（クローン１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および
３０）をブタペスト条約の規定にしたがい１９９５年１
０月１０日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション、パークローン・ドライブ１２３０１、ロッ
クビル、メリーランド２０８５２に寄託し、寄託日から
３０年間または最後の分譲要請の後５年間または米国特
許の権利期間のいずれか長い期間にわたり保管される。
寄託物および他のここに寄託した寄託物質は便宜のみの
ため供与され、ここに示した教示に鑑み本発明を実施す
ることは要求されない。全ての寄託物質におけるＨＧＢ
Ｖ ｃＤＮＡ配列を参考のためここに引用する。各プラ
スミドは次のＡＴＣＣ受託番号に一致する：クローン１
７（Ｃ．１７）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９１０に一致
し：クローン１８（Ｃ．１８）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９
９１１に一致し；クローン１９（Ｃ．１９）はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９９１２に一致し：クローン２０（Ｃ．２
０）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９１３に一致し；クローン
２１（Ｃ．２１）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９１４に一致
し：クローン２２（Ｃ．２２）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９
９１５に一致し；クローン２３（Ｃ．２３）はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９９１６に一致し：クローン２４（Ｃ．２
４）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９１７に一致し；クローン
２５（Ｃ．２５）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９１８に一致
し：クローン２６（Ｃ．２６）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９
９１９に一致し；クローン２７（Ｃ．２７）はＡＴＣＣ
Ｎｏ．６９９２０に一致し：クローン２８（Ｃ．２
８）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９２１に一致し；クローン
２９（Ｃ．２９）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９９２２に一致
し：クローン３０（Ｃ．３０）はＡＴＣＣ Ｎｏ．６９
９２３に一致する。
【０１４４】実施例３． 永久細胞系におけるＧＢＶ−
Ｃポリペプチドの発現 Ａ． ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２発現プラスミドの作成 参考のため先に引用した１９９５年６月７日付け米国特
許出願第０８／４７８，０７３号に記載された、プラス
ミド５７７を永久細胞系にて分泌抗原、特にＣ型肝炎Ｅ
２蛋白質の発現につき作成した。このプラスミドは次の
ＤＮＡセグメントを含有する：（ａ）細菌β−ラクタマ
ーゼおよびＤＮＡ複製起点を有するｐＢＲ３２２の２．
３Ｋｂ断片；（ｂ）ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモ
ータおよびポリ−Ａ付加シグナルの制御下でネオマイシ
ン耐性遺伝子の発現を指令する１．８Ｋｂカセット；
（ｃ）ＳＶ−４０プロモータおよびポリ−Ａ付加シグナ
ルの制御下でジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子の
発現を指令する１．９Ｋｂカセット；（ｄ）シミアンウ
ィルス４０Ｔ−Ａｇプロモータおよび転写エンハンサ
ー、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原エンハンサ−Ｉに続くポ
リ−Ａ付加シグナルを与える、単純疱疹ウィルス−１ゲ
ノムの断片の制御下で改変Ｃ型肝炎ウィルスＥ２蛋白に
融合したウサギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の発現
を指令するカセット；および（ｅ）このプラスミドでは
機能しないシミアンウィルス４０ゲノム後期領域の残部
０．７Ｋｂ断片。
【０１４５】プラスミド５７７を図２にグラフで示す。
図２におけるプラスミドは番号１〜１３のセクションを
有する一連の構築断片として示され、下表３に記載す
る。表３における各セクションの受託番号はＧｅｎＢａ
ｎｋ（登録商標）受託番号を意味する。プラスミドを作
成する際には僅かな配列変化が生じ、又は生じていたこ
とがあり得ることに注目されたい。ベクターの各セグメ
ントは全て分子生物学の当業者に知られた標準法により
構築した。
【０１４６】
【表２】
【０１４７】分泌可能なＧＢＶ−Ｃ蛋白質を発現するた
めのプラスミドは、プラスミド５７７におけるＣ型肝炎
ウィルスＥ２蛋白質コード配列をＧＢＶ−Ｃからのもの
で置換して次のように作成した。ＧＢＶ−Ｃ挿入物は全
て、ここに参考のため引用した米国特許出願第０８／５
８０，０３８号に記載されたＧＢＶ−Ｃ遺伝子型１配
列、すなわち配列番号３４からのものとした。ＸｂａＩ
によるプラスミド５７７の切断はＣ型肝炎ウィルスＥ２
遺伝子断片を放出した。得られたプラスミド骨格はウサ
ギ免疫グロブリン重鎖シグナル配列の下流へのＧＢＶ−
Ｃ遺伝子産生物の挿入を可能にし、発現蛋白質を細胞の
分泌経路に指向させる。ＧＢＶ−Ｃ断片は全て、標準法
を用いるＰＣＲにより発生させた。第１ＰＣＲ断片は配
列番号３５のａａ２２１から５５６までＧＢＶ−Ｃ Ｅ
２遺伝子の３３６アミノ酸セグメントをコードした。セ
ンスＰＣＲプライマー配列（配列番号３６）にはＸｂａ
Ｉ部位がコードされ、その直後に１２ヌクレオチド配列
が存在し、これはアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ（「ＳＮＥＬ」）、すなわちヒトプロウロキナ
ーゼのアミノ末端配列をコードした。アミノ酸配列ＳＮ
ＥＬは蛋白質のＮ−末端としてシグナルプロテアーゼ処
理と効率的分泌と培養液における最終産生物の安定性と
を促進すべく意図した。この１２ヌクレオチド配列の直
後に、該プライマーはＧＢＶ−Ｃの残基２２１で開始す
るアミノ酸をコードする鋳型配列に対し相補的なヌクレ
オチドを含有した。アンチセンスＰＣＲプライマー（配
列番号３７）はＧＢＶ−Ｃの残基５５６にて終るアミノ
酸をコードする鋳型配列に対し相同の配列を含有し、次
いで２個の停止コドンとクローン化目的のＸｂａＩ部位
とが存在した。ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質をこの位置で切
断して分泌を促進した。ＰＣＲはパーキン・エルマー・
シータスから得られたジーン・アンプ（登録商標）試薬
を用い、実質的に供給業者の指針にしたがって行った。
ＰＣＲプライマーを０．５μＭの最終濃度にて使用し
た。ＰＣＲを１００μＬ反応におけるプラスミド鋳型に
て３５サイクル（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７
２℃、９０秒）につき行い、次いで７２℃で１０分間の
延長サイクルを行った。
【０１４８】３種の追加ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２コード化プラ
スミドを上記と同じセンス プラスマーを用いて作成し
たが、３種の異なるアンチセンス プライマー（配列番
号３８、３９および４０）と同じプラスミド鋳型と同じ
ＰＣＲ条件とを用いた。これらＰＣＲ断片はＧＢＶ−Ｃ
Ｅ２の３１５、２８９および２２２アミノ酸セグメン
トをコードし、そのそれぞれは配列番号３５のアミノ酸
残基２２１で開始する。３３６アミノ酸ＧＢＶ−Ｃ Ｅ
２蛋白質の場合と同様に、切断部位は分泌を促進するよ
う選択した。アンチセンス プライマー配列番号３８お
よび３９（それぞれ３１５および２８９アミノ酸構成物
を作成すべく用いた）はそれぞれ８個のアミノ酸Ａｓｐ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓを停止コドンの直前にコードする配列を組込ん
だ。この配列内にはアンチ−ＦＬＡＧ Ｍ２と称するモ
ノクローナル抗体（ＭＡｂ）の認識部位が存在する（イ
ーストマン・コダック社；ニュー・ハーベン、ＣＴ）。
これはＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質産生物の分析および精製
に役立てるため組込んだ。
【０１４９】Ｂ． ジヒドロフォレート レダクターゼ
欠損支那ハムスター卵巣細胞のトランスフェクション 上記プラスミドをＣＨＯ／ｄｈｆｒ- 細胞（ＤＸＢ−１
１１）［ウリアシオ等、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス、第７７巻、第４４５１〜４
４６６頁（１９８０）］にトランスフェクトさせた。こ
れら細胞は、カチオン性リポソーム媒介法［Ｐ．Ｌ．フ
ェルグナー等、プロシーディング・ナショナル・アカデ
ミー・サイエンス、第８４巻、第７４１３〜７４１７頁
（１９８７）］を用い次のようにしてアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション［ＡＴＣＣ］パークロー
ン・ドライブ１２３０１、ロックビル、ＭＤ２０８５２
から入手しうる（受託Ｎｏ．ＣＲＬ９０９６）。ＣＨＯ
／ｄｈｆｒ- 細胞を、１０％胎児牛血清とＬ−グルタミ
ン（１ｍＭ）とが補充されたハムスＦ−１２培地で培養
し、フラスコ１本当り５〜８×１０5 細胞の密度にて２
５ｃｍ2 フラスコに新たに接種した。これら細胞を６０
〜８０％融合までトランスフェクションのため増殖させ
た。２０μｇのプラスミドＤＮＡを１．５ｍＬのオプチ
−ＭＥＭ Ｉ培地に添加し、１００μＬのリポフェクチ
ン試薬（ギブコ−ＢＲＬ社；グランド・アイランド、Ｎ
Ｙ）を第２の１．５ｍＬのオプチ−ＭＥＭ Ｉ培地に添
加した。これら２種の溶液を混合し、室温にて２０分間
培養した。培地を細胞から除去し、細胞を５ｍＬのオプ
チ−ＭＥＭ Ｉ培地で３回洗浄した。オプチ−ＭＥＭＩ
リポフェクチン−プラスミドＤＮＡ溶液を次いで細胞上
に載せた。細胞を３７℃にて３時間培養し、その後にオ
プチ−ＭＥＭ ＩリポフェクチンＤＮＡ溶液を培地で置
換してさらに２４時間後に以下のように選択した。
【０１５０】Ｃ． 選択および増幅 トランスフェクションの１日後、細胞を１：３で継代接
種（ｐａｓｓａｇｅ）し、ｄｈｆｒ／Ｇ４１８選択培地
（以下「Ｆ−１２マイナス培地Ｇ」）で培養した。選択
培地はＬ−グルタミンを含むがヒポキサンチン、チミジ
ンおよびグリシンを含まないハムスＦ−１２（ＪＲＨバ
イオサイエンス社、レネクサ、カンサス州）および１ｍ
Ｌ当り３００μｇのＧ４１８（ギブコ−ＢＲＬ社；グラ
ンド・アイランド、ＮＹ）とした。２５ｃｍ2 当り５ｍ
Ｌの培地容積と表面積との比を維持した。
【０１５１】ジヒドロフォレート レダクターゼ［リン
ゴールド等、ジャーナル・モレキュラ・アプライド・ジ
ェネチックス、第１巻、第１６５〜１７４頁（１９８
１）］及びアミノグリコシド ホスホトランスフェラー
ゼ［Ｐ．Ｊ．サウザンおよびＰ．Ｊ．ベルグ、モレキュ
ラ・アプライド・ジェネチックス、第１巻、第３２７〜
３４１頁（１９８１）］の存在を示すコロニーが、Ｆ−
１２マイナス培地Ｇと共にトランスフェクト細胞を培養
して４〜５日後に出現した。約２週間後、ＤＨＦＲ／Ｇ
４１８細胞はＦ−１２マイナス培地Ｇでの継代接種およ
び連続維持を可能にするよう充分拡大した。
【０１５２】トランスフェクトＧＢＶ−Ｃ Ｅ２遺伝子
のそれぞれの増幅は、メトトレキセートでのＤＨＦ
Ｒ+ 、Ｇ４１８+ 細胞の段階的選択により達成された
［Ｒ．シムケ、セル、第３７巻、第７０５〜７１３頁
（１９８４）に解説］。細胞を、１５０ｎＭのメトトレ
キセート（ＭＴＸ）（シグマ社；セントルイス、ＭＯ）
を含有するＦ−１２マイナス培地Ｇで約２週間にわたり
耐性コロニーが出現するまで培養した。さらに遺伝子増
幅は、５μＭのＭＴＸでの１５０ｎＭ適応細胞の選択に
より達成された。この適応過程も数週間を要した。５μ
ＭのＭＴＸ適応細胞を全ての抗原産生につき使用した。
【０１５３】Ｄ． 細胞系の保管および貯蔵 培養細胞およびその選択または増幅過程にかける細胞に
はＦ−１２マイナス培地Ｇ、１５０ｎｍのＭＴＸを含む
Ｆ−１２マイナス培地Ｇまたは５μＭのＭＴＸを含むＦ
−１２マイナス培地Ｇを毎週３回供給した。細胞を１：
４にて１５ｍＬの上記培地を含む７５ｃｍ2 フラスコに
接種し、標準法を用いて３７℃および５％ＣＯ2 で培養
した。低温貯蔵を１．８ｍＬのＦ−１２マイナス培地
Ｇ、１５０ｎｍのＭＴＸを含むＦ−１２マイナス培地ま
たは５μＭのＭＴＸを含むＦ−１２マイナス培地Ｇに２
〜４×１０-6細胞を懸濁させて行い、これは細胞系の選
択および増幅の段階に依存し、培地はさらに５％ＤＭＳ
Ｏ（シグマ社；セントルイス、ＭＯ）をも含有した。細
胞を−８０℃にて２４時間にわたり低温貯蔵し、次いで
−１３５℃にて永久貯蔵した。
【０１５４】Ｅ． ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２抗原産生 ５μＭのＭＴＸが補充されたＦ−１２マイナス培地Ｇ
を、融合したばかりの単層の上に３７℃にて１２〜２４
時間にわたり５％ＣＯ2 下で載せた。次いで増殖培地を
除去し、細胞をダルベッコ燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）
（カルシウムおよびマグネシウムを含む）［ギブコ−Ｂ
ＲＬ社、グランド・アイランド、ＮＹ］で３回洗浄し
て、存在すると思われる残留培地／血清を除去した。次
いで細胞をＶＡＳカスタム培地［ＪＲＨバイオサイエン
ス社；レネクサ、ＫＳから入手しうるＬ−グルタミンを
含み、ＨＥＰＥＳを含むがフェノールレッドを含まない
ＶＡＳカスタム処方、製品Ｎｏ．５２−０８６７８Ｐ）
で３７℃および５％ＣＯ2 にて１時間培養した。次いで
細胞にＶＡＳをＴ２５ｃｍ2 フラスコ１本当り５ｍＬに
て載せた（より大きいフラスコもしくはローラ瓶につい
ては比例的に大とした）。収穫物１につき培地を培養の
７日間後に除去し、次いで凍結させて収穫物２、３およ
び４と共に精製を待機した。単層にＶＡＳを７日より多
い３種の収穫物につき載せた。培養物を毎日観察して細
胞状態を決定した。
【０１５５】Ｆ． ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２抗原発現の分析 ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３３６アミノ酸構成物を発現する細
胞からのＶＡＳ上澄液の１部を当業界で知られた標準法
および試薬を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（レムリ不連続ゲル）によ
り分析して、蛋白質発現レベルとヒトおよびウサギ抗−
血清に対する反応性とを評価した。或る場合には、最初
に上澄液を１０キロダルトン（ｋＤａ）ＭＷＣＯを有す
るアミコン濃縮装置（アミコン社、ビバリー、ＭＡ）を
用いる限外濾過により濃縮した。電気泳動の後、蛋白質
を電気泳動によりポリ弗化ビニリデン膜に移し、米国特
許出願第０８／４２４，５５０号の例１３に記載されか
つ当業界で知られた免疫ブロットにより分析した。約５
４ｋＤａの免疫反応性バンドは数種の血清に対し反応性
であることが判明し、これら血清は次のものを包含す
る：（１）予めイー・コリ由来のＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白
質により或いは配列がＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質内に見ら
れるペプチドにより免疫化された８羽のウサギからの血
清；（２）予め他のＧＢＶ−Ｃ由来の組換蛋白質に対し
血清陰性を確かめた２種のＧＢＶ−ＣＥ２ ＲＴ−ＰＣ
Ｒ陽性ヒト血清；（３）予めＧＢＶ−Ｃ由来の組換蛋白
質に対し血清陽性と判定された２種のＧＢＶ−Ｃ ＲＴ
−ＰＣＲ陽性ヒト血清；（４）予め他のＧＢＶ−Ｃ由来
の組換蛋白質に対し血清陽性と判定された３種のＲＴ−
ＰＣＲ陰性ヒト血清；並びに（５）予め他のＧＢＶ−Ｃ
由来の組換蛋白質に対し血清陰性と判定された４種のＲ
Ｔ−ＰＣＲ陰性ヒト血清。Ｎ−グリカナーゼ（ゲンザイ
ム社、ケンブリッジ、ＭＡ）によるこの５４ｋＤａ蛋白
質の脱グリコシル化を、０．５％のＳＤＳと５０ｍＭの
β−メルカプトエタノールと５０ｍＭのＥＤＴＡとの存
在下に変性後に行った。脱グリコシル化は、０．１７％
のＳＤＳと１６．７ｍＭのβ−メルカプトエタノールと
１６．７ｍＭのＥＤＴＡと１．２７％のノニデットＰ４
０と０．９単位のＮ−グリカナーゼとを蛋白質１ｍｇ当
りに含有するｐＨ７．５の緩衝液にて３７℃で６０時間
にわたり行った。免疫ブロットは、免疫反応性バンドが
３７キロダルトンまで移行することを示し、これは非グ
リコシル化ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３３６蛋白質の予想寸法
である。
【０１５６】Ｇ． ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２抗原の精製 ＣＨＯ／Ｅ２−３１５の蛋白質精製を次のように行っ
た。蛋白質を精製するため、収穫物からのＶＡＳ培地を
１５００×ｇにて１５分間にわたる遠心分離により或い
は０．４５μｍの酢酸セルロース膜での濾過により清澄
化し、次いで１０ｋＤａ分子量で切り捨てるアミコン濃
縮装置（アミコン社、ビバリー、ＭＡ）を用いる限外濾
過により１００×まで濃縮した。
【０１５７】Ｃ−末端に８個のアミノ酸ＦＬＡＧ配列
（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ）を有するＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３１５ア
ミノ酸構成物の精製を、ヒドラジド結合によりアガロー
スに共有接合した抗−ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体
からなる親和性マトリックス（イーストマン・コダック
社、ニュー・ハーベン、ＣＴ）を用いる免疫親和性クロ
マトグラフィーにより行った。親和性精製に先立ち、ロ
ーラー瓶からの保存ＶＡＳ培地収穫物における蛋白質を
５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の
緩衝液にセファデックスＧ−２５（ファルマシア・バイ
オテク社、ウプスラ、スエーデン）カラムにより交換し
た。この緩衝液における蛋白質を抗−ＦＬＡＧ Ｍ２抗
体親和性カラムに施し、非結合性蛋白質を５０ｍＭのト
リスと１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）でのカラム
の洗浄により溶出させ、結合蛋白質を過剰のＦＬＡＧペ
プチド（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ
７．５）を用いてカラムに対する抗−ＦＬＡＧ Ｍ２モ
ノクローナル抗体の抗原結合部位のモル数にわたり溶出
させた。図７は、精製のクーマシー・ブリリアント・ブ
ルーＲ−２５０染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示
す。この過程は１工程にて、ＦＬＡＧペプチド−溶出蛋
白質のクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０染
色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの走査型密度測定によ
りＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３１５蛋白質が均質であると判定
した。免疫分析で使用するため、溶出に用いたＦＬＡＧ
ペプチドをＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３１５精製ストックから
セファデックスＧ−２５（ファルマシア・バイオテク
社、ウプスラ、スエーデン）を用いるゲル濾過によって
除去した。
【０１５８】ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３３６アミノ酸構成物
の精製は一連のカラムを用いて行い、これは次の種類の
クロマトグラフィーの２つもしくはそれ以上を含んだ：
カチオン交換、アニオン交換、レクチン親和性、疎水性
相互作用。
【０１５９】実施例４． シンドビスおよびセムリキ
フォレストウィルス ベクター系を用いるＧＢＶ−Ｃポ
リペプチドの一時的発現 Ａ． 分泌ベクターの作成 アルファウィルスベクターにおける蛋白質の一時的発現
に関する２種の系が現在市販されている。シンドビス
ウィルス系（インビトロゲン社、サンジエゴ、ＣＡ）お
よびセムリキ フォレストウィルス（ＳＦＶ）系（ギブ
コ／ＢＲＬ社；グランド・アイランド、ＮＹ）は各種の
真核性細胞系にて蛋白質の高発現レベルを可能にする。
両者の場合とも、興味ある遺伝子をプラスミド中に挿入
して、ウィルスサブゲノムプロモータの制御下にする。
このプラスミドを用いてゲノム長さのＲＮＡ転写物をイ
ンビトロで作成する。次いで、このＲＮＡを真核性細胞
系にトランスフェクトすることができ、細胞内に入った
際このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡとして作用し、興
味ある挿入遺伝子からの蛋白質の翻訳を指令する。この
サブゲノムＲＮＡは細胞内の最も豊富なｍＲＮＡとなる
ため、大部分の細胞翻訳機能を補充して高レベルの目的
蛋白質の産生をもたらす。これら２種の系の一層詳細な
説明についてはリルジェストロームおよびガロフ、バイ
オ／テクノロジー、第９巻、第１３５６〜１３６１頁
（１９９１）およびブレデンビーク等、ジャーナル・バ
イロロジー、第６７巻、第６４３９〜６４４６頁（１９
９３）参照。
【０１６０】通常分泌されない蛋白質の分泌を指令する
目的で、ヒトリゾチーム分泌シグナルをコードするカセ
ットをシンドビス発現プラスミド（ｐＳｉｎＲｅｐ５）
およびＳＦＶ発現プラスミド（ｐＳＦＶ１）の両者に挿
入した。ｐＳｉｎＲｅｐ５については、２種のオリゴヌ
クレオチドが発生させ（配列番号４１および４２）、ア
ニールするとデュープレックスがＸｂａＩ部位にクロー
ン化するのに適するオーバーハングを各端部に有した。
次いで、このオリゴヌクレオチド デュープレックスを
ＸｂａＩ−切断ｐＳｉｎＲｅｐ５に結合させた。得られ
たプラスミドｐＳｉｎＲｅｐ−ｓｓをＸｂａＩで切断し
た際、上流側はＸｂａＩ認識部位における１個の塩基が
突然変異しているため切断されなかった。これは下流Ｘ
ｂａＩ部位における遺伝子のクローン化を可能にして、
挿入遺伝子によりコードされる第１アミノ酸がリゾチー
ムシグナル配列によりコードされるシグナルペプチダー
ゼ切断部位の直後となるようにした。かくしてリゾチー
ムシグナル配列は、挿入遺伝子によりコードされた蛋白
質を細胞分泌経路に指向させた。同様な手法を用いてシ
グナル配列をｐＳＦＶ１に挿入したが、ただしクローン
化部位はＢａｍＨＩとした。この構成物につき使用した
オリゴヌクレオチドは配列番号４３および４４であり、
得られたプラスミドをｐＳＦＶ−ｓｓと命名した。
【０１６１】Ｂ． シンドビス構成物 上記方法にしたがい、構造蛋白質および非構造蛋白質の
両者をコードする多数のＧＢＶ−Ｃ配列をｐＳｉｎＲｅ
ｐ５もしくはｐＳｉｎＲｅｐ−ｓｓに挿入した。これら
は表４に示した通りである。これら配列を２種のＧＢＶ
−Ｃ分離物のそれぞれから得た：配列番号３４は米国特
許出願第０８／５８０，０３８号に記載したプロトタイ
プＧＢＶ−Ｃ配列であって、上記米国出願に記載された
解析に基づきＧＢＶ−Ｃ遺伝子型１に属する。配列番号
４５は上記米国出願に記載された解析に基づきＧＢＶ−
Ｃ遺伝子型３に属する。この系で発現された４種の断片
は実施例３で上記したと同じＧＢＶ−Ｃ Ｅ２構成物で
あった（Ｅ２−２２２、Ｅ２−２８９、Ｅ２−３１５お
よびＥ２−３３６と命名）。これらＥ２構成物をＮ−末
端で切断してＥ２シグナル配列を削除すると共に、Ｃ−
末端で種々の程度に切断して分泌を阻害しうるような推
定の膜固定ドメインおよび他の疎水性領域を削除した。
Ｅ２−２８９およびＥ２−３１５は、上記したようにＣ
−末端に抗−ＦＬＡＧ認識配列を有する。これら４種を
全てｐＳｉｎＲｅｐ−ｓｓに挿入した。さらにＥ２構成
物（ＧＢＶ−Ｃ遺伝子型３分離物から）を発生させ、こ
れはＥ２−３３６と同じ３′末端を有したが、Ｎ−末端
にＧＢＶ−Ｃの１６アミノ酸残基をさらに有した。これ
ら残基は推定ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２シグナル配列を示す。Ｅ
２−３５２と命名したこの断片をｐＳｉｎＲｅｐ５にク
ローン化させて、推定ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２シグナル配列に
より指令される分泌を可能にした。Ｅ１−１６８と命名
した同様に遺伝子型３分離物からのＧＢＶ−Ｃ Ｅ１断
片をもｐＳｉｎＲｅｐ５に挿入した。これは配列番号４
６のアミノ酸残基１２〜１７９を含み、５′末端に推定
Ｅ１シグナル配列を有すると共に、Ｅ１蛋白質の疎水性
推定膜固定ドメインの直ぐ上流にて３′末端で終結す
る。さらに２種の構成物をｐＳｉｎＲｅｐ５における非
分泌蛋白質として発現させるべく増幅させた。これらは
非構造蛋白質の２種、すなわちＧＢＶ−ＣからのＮＳ３
およびＮＳ５Ａを示す。ＮＳ３断片（ＧＢＶ−Ｃ遺伝子
型１分離物から）は配列番号３５のアミノ酸残基９１２
〜１５６６を含み、ＮＳ５Ａ断片（ＧＢＶ−Ｃ遺伝型３
分離物から）は配列番号４６の残基１８７７〜２２９０
を含んだ。
【０１６２】ｐＳｉｎＲｅｐ５に挿入された全構成物、
すなわちリゾチーム分泌シグナルを用いない構成物につ
きセンスＰＣＲプライマーは、ＧＢＶ−Ｃ配列の直ぐ上
流にリボソーム結合部位配列と開始コドンメチオニンと
を含んだ。ＮＳ５Ａ以外の全構成物に関するプライマー
はシンドビスベクター中へクローン化するためのＸｂａ
Ｉ部位を有した。ＮＳ５Ａ構成物のためのプライマーは
ＧＢＶ−ＣのＮＳ５Ａ領域内のＸｂａＩ部位に基づきＡ
ｖｒII部位を有した。ＡｖｒIIによる切断で発生したオ
ーバーハングはＸｂａＩ部位へのクローン化に対し適合
した。これらＰＣＲは、パーキン・エルマー・シータス
社から得られて実質的に供給業者の指針にしたがうジー
ンアンプ（登録商標）試薬を用いて行った。ＰＣＲプラ
イマーを１μＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲは５０μＬ
の反応物にてプラスミドもしくはｃＤＮＡ鋳型につき２
５〜４０サイクル（９４℃、２０秒；５０℃、３０秒；
７２℃、１〜２分）にわたり行い、次いで７２℃で１０
分間の延長サイクルを行った。次いで全ＰＣＲ生成物を
ＸｂａＩ（またはＮＳ５ＡについてはＡｖｒII）で切断
し、ＸｂａＩ−切断されかつ脱ホスホリル化されたｐＳ
ｉｎＲｅｐ５もしくはｐＳｉｎＲｅｐ−ｓｓに結合さ
せ、次いで標準法によりイー・コリに形質転換させた。
全挿入物をキット（Ｔ７シクエナーゼ ７−デアザ−ｄ
ＧＴＰ ＤＮＡ配列決定キット、アメルシャム・ライフ
・サイエンス社、アーリントン・ハイツ、ＩＬ）を用い
るジデオキシヌクレオチド連鎖停止技術（サンガー等、
上記）に続くマュニアル・ゲル電気泳動を用い或いはＡ
ＢＩプリズム・ダイ・ターミネータ・サイクル配列決定
レディー反応キットおよびＡＢＩ３７３自動化配列決定
装置（パーキン・エルマー社、フォスター・シティー、
ＣＡ）を用いて配列決定した。
【０１６３】Ｃ． ＳＦＶ構成物 下表５はＳＦＶベクター中へクローン化するため発生さ
せた断片を示す。全てはＧＢＶ−Ｃ遺伝子型１分離物
（配列番号３４）からのものとした。Ｅ２−２２２、Ｅ
２−３３６、Ｅ２−３５２、Ｅ１−１６８、ＮＳ３およ
びＮＳ５Ａの各断片はシンドビスベクターにつき上記し
たものと同一であったが、ただしこれらを得たＧＢＶ−
Ｃの分離物を例外とする。さらに２種のクローンをこの
系で発現させるべく発生させた。Ｅ１−１４９はＥ１−
１６８と同一であるが、ただし５′末端における１９残
基の推定Ｅ１分泌シグナルをコードする配列を除去し、
断片をｐＳＦＶ−ｓｓにクローン化させてリゾチームシ
グナル配列を用いた。他方のＥ１−Ｅ２−ＮＳ２／３は
Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２の全部とＮＳ３の５′の1/3 とを含
む大型断片である。この断片はＥ１およびＥ２の同時発
現と適する処理と相互作用とを指令すると予想された。
【０１６４】
【表３】
【０１６５】ｐＳＦＶ１およびｐＳＦＶ−ｓｓに挿入さ
れた全構成物に関するＰＣＲプライマーはクローン化の
ためのＢｇｌII部位を有した。ＢｇｌIIオーバーハング
はベクターのＢａｍＨＩ部位にクローン化するのに適
し、ＢａｍＨＩ部位が存在したが増幅ＧＢＶ−Ｃ配列内
にＢｇｌII部位が存在しなかったため使用した。ＰＣＲ
をシンドビス断片につき上記したように行った。次いで
全ＰＣＲ生成物をＢｇ１IIで切断し、ＢａｍＨＩ切断さ
れた脱ホスホリル化ｐＳＦＶ１もしくはｐＳＦＶ−ｓｓ
に結合させ、さらに標準法を用いてイー・コリに形質転
換させた。全挿入物を上記のように配列決定した。
【０１６６】Ｄ． ＲＮＡ合成 ＲＮＡをインビトロ合成するに先立ち、シンドビスおよ
びＳＦＶプラスミドのそれぞれを挿入断片の下流におけ
る制限部位にて線状化させた。シンドビス構成物はＮｏ
ｔＩで線状化させたのに対し、ＳＦＶ構成物はＳｐｅＩ
で線状化させた。切断の後、ＤＮＡをフェノール−クロ
ロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）で
抽出し、エタノールで沈澱させ、次いでＤＥＰＣ処理水
に再懸濁させた。ＲＮＡを製造業者により指示されたよ
うにインビトロスクリプトＣＡＰＳＰ６インビトロ転写
キット（インビトロゲン社、サンジエゴ、ＣＡ）を用い
て合成した。合成されたＲＮＡを約５ｍｇずつに分割
し、さらに処理することなく−７０℃で貯蔵した。
【０１６７】Ｅ． 細胞培養 細胞系ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）をアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）、ロックビル、ＭＤから入手した。これら細胞を、
２ｍＭのグルタミンと１０％のトリプトース ホスフェ
ートブロスと５％のＦＣＳと１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１
００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンとを含
むグラスゴウ・ミニマム・エッセンシャル培地よりなる
増殖培地（ギブコ−ＢＲＬ社、グランド・アイランド、
ＮＹ）にて３７℃および５％ＣＯ2で培養した。培養物
を３日もしくは４日間隔にて融合時点で通常通り分割し
た。トランスフェクトするため、細胞を８５０ｃｍ2 の
ローラー瓶に移植し、５０％融合まで増殖させた。細胞
パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）もしくはトランスフェク
ションのため、増殖培地を除去すると共にカルシウムお
よびマグネシウムを含まないダルベッコ・ホスフェート
緩衝塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（ギブコ−ＢＲＬ社、グランド
・アイランド、ＮＹ）で３回洗浄することにより細胞を
収穫した。次いで細胞にトリプシンＥＤＴＡ（ギブコ−
ＢＲＬ社、グランド・アイランド、ＮＹ）を５分間にわ
たり載せ、トリプシンおよび細胞の懸濁物を瓶からデカ
ントした。細胞懸濁物におけるトリプシンを１０％増殖
培地で中和し、懸濁物を低速度で遠心分離して細胞をペ
レット化させた。バッセージのため細胞を増殖培地に再
懸濁させ、２５ｃｍ2 ：増殖培地５ｍＬ（表面積／容積
比）にて容器に接種した。
【０１６８】Ｆ． トランスフェクション 細胞を対数期中期まで増殖させ、上記培養容器から収穫
した。細胞密度を、カルシウムおよびマグネシウムを含
まないＤ−ＰＢＳにて３回洗浄した後に０．８ｍＬ中１
×１０7 細胞の最終カウント数に調整した。これら細胞
を室温に３０分以内にわたり保持した後、エレクトロポ
レーションした。約５〜１０ｍｇのＲＮＡを０．８ｍＬ
の細胞懸濁物に添加し、次いで直ちにエレクトロポレー
トした。エレクトロポレーションは１２５０ボルト、２
５μＦにて３回のマニュアルパルスでビオラド・ジーン
・パルサーおよび４ｃｍのジーン・パルサー・キュベッ
ト（ハーキュリース、ＣＡ）により行った。トランスフ
ェクションの後、細胞をエレクトロポレーション キュ
ベット内で室温にて５分間にわたり静置させた。次いで
細胞を増殖培地に移し、培養容器に接種した。トランス
フェクション効率は、Ｌａｃ−Ｚ陽性比較プラスミドｐ
ＳＦＶ３−ｌａｃＺもしくはｐＳｉｎＲｅｐ／ｌａｃＺ
から得られたＲＮＡおよびギブコ−ＢＲＬ社により供給
／説明されたβ−ガラクトシダーゼ分析試薬を用い、９
５〜１００％であると観察された。
【０１６９】Ｇ． トランスフェクト細胞の代謝標識 トランスフェクションの後、細胞を２ｍＭのグルタミン
と１０％のトリプトース ホスフェートブロスと５％の
ＦＣＳと１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１００Ｕ／ｍＬのペニ
シリン／ストレプトマイシンとを含むグラスゴウ・ミニ
マム・エッセンシャル培地（ギブコ−ＢＲＬ社、グラン
ド・アイランド、ＮＹ）にて３７℃および５％ＣＯ2 で
５時間にわたり培養容器に堅固に付着させた。次いで増
殖培地を除去し、細胞をカルシウムおよびマグネシウム
を含むＤ−ＰＢＳにて３回洗浄した。次いで細胞にＭＥ
Ｍ選択−アミンキット（ギブコ−ＢＲＬ社、グランド・
アイランド、ＮＹ）で作成されたシスチンを含まないミ
ニマム・エッセンシャル培地（ＭＥＭマイナス）を載せ
た。２５ｃｍ2 対２ｍＬの培養容器の表面積／容積比を
維持した。放射能標識［35Ｓ］システイン（アメルシャ
ム・ライフ・サイエンシス社、アーリントン・ハイツ、
ＩＬ）を１ｍＬ当り７５ｍＣｉの最終濃度まで添加し、
細胞を３７℃および５％ＣＯ2 にて培養後、細胞および
上澄液を収穫した。上澄液を収穫して低速度で遠心分離
することにより非付着性細胞をペレット化させた。次い
で清澄化した上澄液を直ちに分析した。付着性細胞をカ
ルシウムおよびマグネシウムを含むＤ−ＰＢＳで３回洗
浄し、溶菌緩衝液（１％ノニデットＰ−４０、５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ）を載
せた。２５ｃｍ2 対２５０ｍＬの溶菌緩衝液の表面積／
容積比を維持した。溶菌を濡れた氷上で１０分間行っ
た。次いで溶菌物を培養容器から収穫して直ちに分析し
た。
【０１７０】Ｈ． 蛋白質発現の分析 標識された細胞溶菌物もしくは上澄液の１部を標準法お
よび試薬（レムリ不連続ゲル）を用いるＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により
分析して蛋白質発現レベルを評価した。或る場合には、
上澄液を先ず最初にミクロコンフィルタ装置（アミコン
社、ビバリー、ＭＡ）で限外濾過することにより濃縮し
て、均等数の細胞からの溶菌物および上澄液を分析し
た。電気泳動の後、ゲルを１０％酢酸／４０％メタノー
ルで固定し、乾燥させ、次いでモレキュラ・ダイナミッ
クス・ホスホルイメージャー（サニーベール、ＣＡ）に
より展開し、或いはゲルにおける蛋白質を電気泳動的に
ニトロセルロースに移し、実施例１に記載したように免
疫ブロットにより分析した。
【０１７１】放射性免疫沈澱を標識細胞溶菌物および上
澄液につき次のように行った。先ず最初に溶菌物もしく
は上澄液をパンソルビン細胞（カルバイオケム社、ラヨ
ラ、ＣＡ）と共に４℃にて１時間にわたり予備培養し
た。１０，０００×ｇにて１５分間にわたり遠心分離し
た後、予備吸着した上澄液もしくは溶菌物の１部を検査
すべき２〜８ｍＬの各血清と混合し、氷上で２〜４時間
にわたり培養した。蛋白質Ａアガロースビーズを添加
し、チューブを揺動しながら４℃にて１時間培養した。
蛋白質Ａアガロースビーズをペレット化させ、溶菌緩衝
液（０．２％ＮＰ４０、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、０．２％ＳＤＳを含有
する溶菌緩衝液で１回、５００ｍＭのＮａＣｌを含有す
る溶菌緩衝液で１回、最後にＨ2 Ｏで１回洗浄した。こ
れらビーズをレムリ試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス、
ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、５％２−
メルカプトエタノールおよび０．１ｍｇ／ｍＬブロモフ
ェノール・ブルー）に再懸濁させ、９０℃にて５分間加
熱した。上澄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、固定し、乾
燥させ、次いで上記したように露光させた。
【０１７２】Ｉ． シンドビスおよびＳＦＶ−発現ＧＢ
Ｖ−Ｃ Ｅ２蛋白質に対する免疫反応性 シンドビス系で発現されたＧＢＶ−Ｃ蛋白質に関する免
疫ブロットおよびＲＩＰＡにより得られた結果は次の通
りであった：ｐＳｉｎ−ｓｓ／Ｅ２−２２２、ｐＳｉｎ
−ｓｓ／Ｅ２−３１５およびｐＳｉｎ−ｓｓ／Ｅ２−３
３６から発現されたＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質を細胞溶菌
物および上澄液（細胞からの分泌を示す）にて、実施例
３に記載されたウサギ抗−ＧＢＶ−Ｃペプチドおよびイ
ー・コリ組換ポリペプチド血清を用いる免疫ブロットに
よる分析と同様に検出した。ｐＳｉｎ−ｓｓ／Ｅ２−２
８９から発現されたＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質は細胞溶菌
物でのみ検出され、上澄液には検出されなかった。
【０１７３】ＳＦＶ系で発現されたＧＢＶ−Ｃ蛋白質に
関する免疫ブロットおよびＲＩＰＡにより得られた結果
を下記に要約する：ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−２２２およ
びｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６から発現されたＧＢＶ
−Ｃ Ｅ２蛋白質は、実施例３に記載したウサギ抗−Ｇ
ＢＶ−ＣＥ２ペプチド血清およびウサギ抗−イー・コリ
ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２組換蛋白質血清を用いる免疫ブロット
により分析されるように、細胞溶菌物および上澄液（細
胞からの分泌を示す）で検出された。ＲＩＰＡは、ウサ
ギ抗−イー・コリＧＢＶ−Ｃ Ｅ２組換蛋白質血清と各
種のヒト血清とを用い、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６
上澄液および溶菌物につき行った。この構成物から発現
されたＧＢＶ−ＣＥ２蛋白質は溶菌物と上澄液との両者
にて免疫後のウサギ血清で検出されたが、免疫前の血清
では検出されなかった。さらに、これは溶菌物および上
澄液にてイー・コリ由来ＧＢＶ−Ｃ蛋白質に対し血清陰
性であることが判明している２種のＧＢＶ−ＣＲＴ−Ｐ
ＣＲ陽性ヒト血清でも検出され（米国特許出願第０８／
４２４，５５０号に記載したＥＬＩＳＡにより試験）、
さらにイー・コリ由来ＧＢＶ−Ｃ蛋白質に対し免疫反応
性であると判明した４種のＧＢＶ−Ｃ ＲＴ−ＰＣＲ陰
性ヒト血清でも検出された。
【０１７４】２７名のＧＢＶ−Ｃ ＲＴ−ＰＣＲ陰性の
静脈薬物使用者からの血清をＲＩＰＡにてｐＳＦＶ−ｓ
ｓ／Ｅ２−３３６上澄液を用いて試験し、２７名全てが
Ｅ２蛋白質に対し反応性であった。この集団はＣ型肝炎
ウィルス（９９％）およびＢ型肝炎ウィルス（７５％）
に対する抗体の血清プリバレンスにより証明されるよう
に非経口伝染した因子に対する露呈の極めて高い危険性
にあることが知られる。Ｃ型肝炎ウィルスの試験をＨＣ
Ｖ ＥＩＡ第２発生分析で行い、確認試験を合成ペプチ
ドにより行い、さらにＢ型肝炎コア抗原に対する抗体を
コルザイム（登録商標）試験で決定した（全て本出願人
から入手）。ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質に対する抗体の血
清プリバレンスレベルは、これら他の非経口伝染した肝
炎因子に関し、この集団にてＧＢＶ−Ｃに対し同様レベ
ルの露呈を示した。
【０１７５】ＲＩＰＡをｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６
上澄液につき輸液前にＧＢＶ−Ｃに対し全てＰＣＲ陰性
であった７名の患者からの一連の採血を用いておこなっ
た。ＧＢＶ−Ｃを含有する血液を輸血した後、これら７
名の患者のそれぞれは肝臓酵素の上昇を発生し、ＲＴ−
ＰＣＲにより検出してＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ陽性となっ
た。この試験からのＰＣＲおよびＲＩＰＡの結果を表６
に要約する。図６は患者２からのＲＩＰＡ結果を示す
（表６）。
【０１７６】
【表４】
【０１７７】
【表５】
【０１７８】
【表６】
【０１７９】
【表７】
【０１８０】Ｊ． 結果 ７名の患者のうち６名（患者１〜６）は試験期間にわた
りＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質に対し免疫反応性を発生した
が、これら患者のうち１名のみ（患者６）がその最終採
決日にＧＢＶ−Ｃ ＲＴ−ＰＣＲ陰性であった。患者６
および７は試料入手の最終日にまだＧＢＶ−Ｃ ＲＴ−
ＰＣＲ陽性であり、患者７はＧＢＶ−ＣＥ２蛋白質に対
する免疫反応性を示さなかった。
【０１８１】これらの結果は或る種のフラビウィルスお
よびペスチウィルスを包含する他のウィルスにつき見ら
れているようにＧＢＶ−Ｃ Ｅ２エンベロプ蛋白質で見
られる中和性エピトープが存在しうることを示し、これ
は感染のウィルス血症段階が終結しているこを示唆す
る。Ｅ２蛋白質に対する抗体の存在は、ＧＢＶ−Ｃ感染
からの良好な回復指標であると思われる。さらに、この
蛋白質はＧＢＶ−Ｃへの露呈に対し保護するワクチンに
なり得る。さらにワクチンを使用して慢性感染患者を処
置することにより、ウィルス除去に役立てることができ
る。さらに、この蛋白質に対する抗−血清を有する抗体
の使用は、ウィルスを除去したり或いはＥ２蛋白質を有
する細胞を除去するのに充分な免疫反応を持たないＧＢ
Ｖ−Ｃで感染した患者につき効果的な処置となりうる。
この種の細胞は組織損傷または発癌に対しても関与しう
る。
【０１８２】実施例５． ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３１５に
対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ Ａ． ポリスチレンビーズ被覆法 先の実施例にて記したようにＣＨＯ細胞で発現されたＧ
ＢＶ−Ｃ Ｅ２−３１５をポリスチレン被覆ビーズで抗
原性につき評価し、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳ
Ａ）をＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に対する抗体を検出すべく行っ
た。最初の試験にて、１／４インチのポリスチレンビー
ズを精製蛋白質で被覆し（１ロット当り約６０個のビー
ズ）、次いでＥＬＩＳＡ試験（下記する）で評価した。
要約するに、洗浄ビーズをシンチレーション瓶に添加す
ると共にビーズ（ビーズ１個当り約０．２３３ｍＬ）を
ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質を含有する緩衝溶液に浸漬して
ポリスチレンビーズを精製蛋白質で被覆した。ＧＢＶ−
Ｃ Ｅ２蛋白質は１２５μｇ／ｍＬの蛋白質濃度を有す
るはずである。この蛋白質をビーズ被覆緩衝液（０．１
Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中へ２及び４μｇ／ｍ
Ｌにて希釈した。次いで小瓶を４０℃の保温器内の回転
装置に２時間置き、その後に液体を吸引すると共にビー
ズを燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ６．８で３回洗浄
した。次いでビーズを０．１％トリトン Ｘ−１００
（登録商標）で４０℃にて１時間処理し、ＰＢＳで３回
洗浄した。次いでビーズを５％牛血清アルブミンでオー
バーコートし、撹拌しながら４０℃にて１時間培養し
た。さらにＰＢＳで洗浄した後、ビーズを５％蔗糖で２
０分間にわたり室温にてオーバーコートし、液体を吸引
した。最後にビーズを風乾し、次いでＧＢＶ−Ｃ Ｅ２
に対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡを展開すべく
用いた。
【０１８３】Ｂ． ＨＧＢＶに対する抗体を検出するた
めのＥＬＩＳＡ方式 間接的分析方式をＥＬＩＳＡにつき用いた。要約する
に、試験する試料（血清もしくは血漿）を試料希釈剤
（本出願人から入手）で希釈し、ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２抗原
被覆固相（ビーズ）（これはＣＨＯ細胞で増殖したＧＢ
Ｖ−Ｃ Ｅ２蛋白質抗原を有する）と上記したように反
応させた。洗浄工程の後、ビーズをヒト免疫グロブリン
に向けられる西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）
標識された抗体と反応させて、固相に結合したヒト抗体
を検出した。切捨て値より高いシグナルを発生した試料
を反応性と判定する。ＥＬＩＳＡに関する詳細をさらに
下記する。
【０１８４】ＥＬＩＳＡのための方式は、ＧＢＶ−Ｃ
Ｅ２抗原被覆された固相（上記したようにＣＨＯ細胞で
作成すると共に上記したようにビーズに被覆）を試料希
釈剤（動物血清と非イオン型洗剤とを含有する本出願人
から入手しうる緩衝溶液）で予備希釈されたヒト血清と
接触させることを含む。この試料希釈剤は、固相に対す
る免疫グロブリンの非特異的結合から得られるバックグ
ランド信号を減少させると共に抗原被覆固相に対する特
異性抗体の結合を増大させるよう処方した。詳細には、
１０μＬのヒト血清を１５０μＬの試料希釈剤で希釈し
て回動させた。１０μＬのこの予備希釈試料を次いで反
応皿のウエルに添加し、次いで２００μＬの試料希釈剤
と抗原被覆ポリスチレンビーズとを添加した。次いで反
応皿をダイナミック・インキュベーター（本出願人）に
て室温で絶えず撹拌するよう設定しながら培養した。１
時間の培養の後、液体を吸引し、ビーズを含有するウエ
ルを蒸留水で３回洗浄した（洗浄１回当り５ｍＬ）。次
いで結合希釈剤（動物血清と非イオン型洗剤とを含有す
る本出願人から入手しうる緩衝溶液）で希釈された２０
０μＬのＨＲＰＯ−標識ヤギ抗−ヒト免疫グロブリン
（キルケガード・アンド・ペリー社、ガイサースブル
グ、ＭＤ）を各ウエルに添加し、反応皿を再び上記した
ように１時間培養した。次いで液体を吸引し、ビーズを
含有するウエルを上記と同様に蒸留水で３回洗浄した。
複合化した抗原と結合免疫グロブリンとを含有するビー
ズをウエルから取り出し、各ビーズを試験管に入れ、
０．０２％Ｈ2 Ｏ2 を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．５）における０．３％ｏ−フェニレンジアミン・
２ＨＣｌの溶液（本出願人から入手）の３００μＬと反
応させた。室温にて３０分間培養した後、反応を１Ｎ
Ｈ2 ＳＯ4 の添加により停止させた。４９２ｎｍにおけ
る吸光度を分光光度計で測定した。発生した色は試験試
料に存在する抗体の量に正比例した。
【０１８５】ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ＥＬＩＳＡが有用であ
るかどうか決定すべく小パネルを試験した。ＧＢＶ−Ｃ
ＲＮＡにつきＲＴ−ＰＣＲにより陰性でありかつＧＢ
Ｖ−Ｃ Ｅ２蛋白質以外の蛋白質を用いる他のＥＬＩＳ
Ａで試験してＧＢＶ−Ｃ蛋白質につき陰性であると予備
スクリーニングされたドナー志願からの血清を陰性比較
として用いた。陽性比較は、ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ｐＳＦ
Ｖ−ｓｓ／Ｅ２−３３６蛋白質（実施例３ｉに記載）に
関するウエスタン・ブロット（実施例３Ｆに記載）によ
り或いはＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＲＩＰＡによりＧＢＶ−Ｃ
Ｅ２に対する抗体を有すると同定された試料を含ん
だ。これら最初に被覆されたビーズで得られた結果は、
推定の陰性比較につき低い吸光値が得られると共に、Ｇ
ＢＶ−ＣＥ２に対する抗体を有すると思われる試料につ
き高い吸光値が認められたことを示す。次いでさらに実
験を行った。
【０１８６】Ｃ． 遊離ＦＬＡＧペプチドからのＧＢＶ
−Ｃ Ｅ２蛋白質の分離 ビーズを被覆すべく使用したＧＢＶ−Ｃ Ｅ２−３１５
精製蛋白質の最初の調製物も、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２親和
性カラムから溶出すべく使用した遊離ＦＬＡＧペプチド
を含有すると思われた。ＦＬＡＧペプチドが固相を被覆
するＧＢＶ−ＣＥ２蛋白質の能力を阻害しうるという可
能性が存在するので、蛋白質を規模拡大ビーズ被覆法に
つきさらに精製して遊離ＦＬＡＧを除去した。これを上
記セファデックスＧ−２５（登録商標）を用いて行っ
た。
【０１８７】Ｄ． ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ＥＬＩＳＡの有
用性 ビーズ被覆を、上記と同じ手順を用いて５００個のビー
ズまで規模拡大した。Ｅ２−３１５蛋白質で被覆された
５００個のビーズを上記したように作成し、上記したよ
うにＥＬＩＳＡ試験に用いた。結果は次の通りであっ
た。
【０１８８】１． 献血志願者 ＧＢＶ−Ｃへの露呈につき「低い危険性」を有すると思
われる１００名の献血志願者の集団を、ＧＢＶ−Ｃ Ｅ
２ ＥＬＩＳＡを用いてＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に対する抗体
につき試験した。［これら試料は、血清が既知のヘパト
トロピック剤（Ｂ型肝炎ウィルス［ＨＢＶ］、Ｃ型肝炎
ウィルス［ＨＣＶ］）での活性感染の証明につき適する
試験（Ｂ型肝炎表面抗原試験、抗−ＨＣＶ試験、本出願
人から入手）を用いて陰性であるとスクリーニングされ
たので低い危険性であると考えられ、正常な血清アラニ
ン アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを有す
るとスクリーニングされ、これは活性肝臓病の証拠がな
いことを示唆する］。試験した１００種の試料のうち３
種の試料が比較的高い吸光値を有し、ＧＢＶ−ＣＥ２に
対する抗体を含有すると考えられた。他の９７種の試料
は比較的低い吸光値を有し、血清陰性個体の典型的性質
を示すと思われた。９７種の陰性試料の集団平均値を計
算すると共に標準偏差を決定して予備切捨て値を決定し
た（図３）。切捨て値は、集団平均値と集団平均値から
の７つの標準偏差との合計として決定した。この切捨て
値を用いると、献血志願者の３名はＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に
対する抗体につき陽性であった。一般に、切捨て値は
７．５の試料／陰性比較比（Ｓ／Ｎ）に対応する。
【０１８９】２． ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ陽性輸血レシピ
エント 輸血を介しＧＢＶ−Ｃに露呈された７名の個体から一連
の試料を得た。全ての場合、各個体は輸血に先立つＲＴ
−ＰＣＲによりＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡにつき陰性であり、
少なくとも１名のＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ陽性血液ドナーか
らの血液を輸血した後にＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡ陽性となっ
た。ＰＣＲ反応性およびＥＬＩＳＡ値を示す典型的特性
を図４に示す。この個体（表６にて患者Ｎｏ．１）はＧ
ＢＶ−Ｃに露呈する前および露呈後の１０日目にはＧＢ
Ｖ−Ｃ ＲＮＡにつきＰＣＲ陰性であった。ＧＢＶ−Ｃ
ＲＮＡを露出後の１８日、３３日、４６日、１０４
日、１１７日および１５４日目に検出した。ＧＢＶ−Ｃ
Ｅ２に対する抗体は露出後の１１７日目にＳＦＶベク
ター（上記実施例３ｊに記載）を介し発生したＧＢＶ−
Ｃ Ｅ２−３３６蛋白質に対し初めて検出され、その後
の全ての試料（露出後の１５４日、１８４日、２０７日
および２８４日）で検出され続けた。ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２
ＥＬＩＳＡは露出後の１５４日、１８４日、２０７日
および２８４日目にＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に対する抗体を検
出した。これらデータはＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に対する抗体
がウィルス除去に関連することを示唆し、さらにＧＢＶ
−Ｃ Ｅ２に対する抗体が存在すれば個体のウィルス血
症が短時間で解消することを示唆する。第２の個体から
得られた第２の特性の例を図５に示す。この個体（表６
における患者Ｎｏ．７）は輸血前にはＧＢＶ−Ｃ ＲＮ
Ａにつき陰性であったが、１６日目にＧＢＶ−Ｃ ＲＮ
Ａ陽性となり、その後の全試料（露出後の４４日、８５
日、１２７日、１６１日および２６５日目）ではＰＣＲ
陽性に留まった。ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＰＡのいずれ
によっても抗体反応は認められなかった。これらデータ
は、ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に対する抗体を血流からＧＢＶ−
Ｃウィルスを除去するために発生させねばならないとい
う仮説を裏付ける。
【０１９０】３． 他の血清 数種の異なる分類の個体をＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に対する抗
体につき試験した。これらデータを表７に示す。上記で
認められたように、１００名の血液ドナー志願者のうち
３名のみがＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ＥＬＩＳＡ試験にて抗体
陽性であった。しかしながら、これとは明確に異なり、
ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡにつき陰性であった２５名の静脈薬
物使用者（ＩＶＤＵ）のうち２５名がＥＬＩＳＡにて抗
体陽性であった。これらデータは、ＩＶＤＵが実際にＧ
ＢＶ−Ｃへの露呈につき「高い危険性」を有すると結論
される個体の集団を示すことを意味する。予備試験が示
したところでは、ＧＢＶ−Ｃ ＲＮＡはＩＶＤＵの約１
５％にて検出することができる。ＰＣＲデータと抗体デ
ータとを組合せて、試験の範囲内でこの１団からのＩＶ
ＤＵの１００％がＧＢＶ−Ｃに露呈されたことを示す。
さらに、ＧＢＶ−ＣＲＮＡ陰性であった２０名の西アフ
リカ人のうち４名がＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ＥＬＩＳＡにて
抗体陽性であった。［予備データが示したところでは、
ＧＢＶ−ＣＲＮＡが西アフリカ住民の１０〜１５％で検
出され、これら抗体の結果はＧＢＶ−Ｃへの露呈がＧＢ
Ｖ−Ｃ ＲＮＡ試験だけで認められる場合よりも実際に
はずっと高いことを示す］。さらに、異なる患者分類
（ＩＶＤＵ、西アフリカ人、非Ａ〜Ｅ型肝炎患者）から
の５０名のＰＣＲ陽性個体のうち、僅か７名（１４．０
％）がＧＢＶ−Ｃに対し抗体陽性であった。これらデー
タは、ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２に対する抗体がＧＢＶ−Ｃ感染
から回復する或いは回復した個体にて一層容易に検出さ
れうることを示した先の試験をさらに裏付ける。
【０１９１】
【表８】
【０１９２】実施例６． バキュロウィルス ベクター
系を用いるＧＢＶ−Ｃポリペプチドの発現 Ａ． バキュロウィルス転移ベクター作成 ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２蛋白質を発現させるための転移ベクタ
ーを作成し、これにはｐＡｃＧＰ６７ＡをＢａｍＨＩお
よびＰｓｔＩの両制限エンドヌクレアーゼで制限した。
適合性ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ末端を有するＧＢＶ−
Ｃ Ｅ２遺伝子断片を、ＧＢＶ−Ｃの１部を含有するプ
ラスミド鋳型を用いて上記ＰＣＲにより発生させた。ベ
クター構築は当業界で知られた標準法により行い、ｐＡ
ｃＧＰ６７Ａ／Ｅ２Ｃと称した。この断片はＧＢＶ−Ｃ
Ｅ２遺伝子の３３６アミノ酸セグメント（配列番号３
５のアミノ酸２２１〜５５６）をコードした。センスＰ
ＣＲプライマー配列（配列番号６８）内にはＢａｍＨＩ
部位含まれ、その直後にＧＢＶ−Ｃの残基２２１で開始
するアミノ酸をコードする鋳型配列に対応したヌクレオ
チドが存在する。アンチセンスＰＣＲプライマー（配列
番号６９）は、ＧＢＶ−Ｃの残基５５６で終るアミノ酸
をコードする鋳型配列に対し相補的なヌクレオチドを含
み、次いで８個のアミノ酸Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（上記アンチ−
ＦＬＡＧ認識部位参照）と２個の停止コドンとクローン
化ベクターに適合性のＰｓｔＩ制限酵素部位とをコード
する配列が存在した。
【０１９３】Ｂ．組換バキュロウィルスのトランスフェ
クションおよび増幅 上記転移ベクターを、バキュロゴールド（登録商標）ト
ランスフェクションキット（ファルミンゲン社）を用い
て振とうフラスコ適合Ｓｆ９細胞（ギブコ−ＢＲＬ社、
グランド・アイランド、ＮＹから入手）にトランスフェ
クトした。要約するに、Ｓｆ−９００II ＳＦＭ培地
（ギブコ−ＢＲＬ社）における１×１０6 ／ｍＬまで希
釈された３ｍＬのＳｆ９細胞をＴ２５細胞培養フラスコ
に分注した。室温にて１０分間にわたり付着させた後、
培地を除去し、１ｍＬの緩衝液Ａ（上記バキュロゴール
ド（登録商標）トランスフェクション キットから）を
添加した。４μｇのｐＡｃＧＰ６７Ａ／Ｅ２Ｃを０．５
μｇのバキュロゴールドＤＮＡおよび１ｍＬの緩衝液Ｂ
［バキュロゴールド（登録商標）トランスフェクション
キットから］と混合した。室温にて５分間の後、ＤＮ
Ａ混合物を緩衝液ＡにおけるＳｆ９細胞に滴下した。培
養物を２８℃にて４時間培養し、この時点で沈殿物を除
去し、細胞をＳｆ−９００II ＳＦＭで洗浄し、３ｍＬ
の新鮮な培地で２８℃にて培養した。４日後、０．５ｍ
Ｌのトランスフェクトされた細胞上澄液をＳｆ９細胞に
添加して組換ウィルスの濃度を増大させた。ウィルスＣ
ＰＥを観察し、細胞および細胞上澄液の両者につき組換
蛋白質の発現が成功したかを評価した。細胞および細胞
上澄液の両者ともカルボキシル末端に付加された８アミ
ノ酸ＦＬＡＧペプチドに対し反応性である抗−ＦＬＡＧ
バイオＭ２モノクローナル抗体（イーストマン・コダ
ック社、ニュー・ハーベン、ＣＴ）に対し免疫反応性で
ある約４０〜５０ｋＤのバンドを含んだ。さらにこのバ
ンドはイー・コリ由来ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２抗原またはＧＢ
Ｖ−Ｃ Ｅ２内の配列に対応するアミノ酸配列「ＱＧＡ
ＰＡＳＶＬＧＳＲＰＦＥ」（配列番号７０）を有する合
成ペプチド「ＧＥ２−１」で免疫化されたウサギからの
血清に対し反応性であった。組換ウィルスを当業者に知
られた方法によりアガロース・オーバーレイの下でＳｆ
９細胞にてプラーク精製した。プラーク純粋ウィルスを
分離し、上記したようにＳｆ９細胞で拡大させ、そこか
ら高力価の保存物を作成した（インビトロゲン、サンジ
エゴ、ＣＡ）。測定を標準法を用いてＳｆ９細胞にて行
い、保存物を４℃で貯蔵した。ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２の分析
および精製は上記したように行った。
【０１９４】Ｄ． 細胞系の保管および貯蔵 培養で維持され或いは感染目的に使用されるＳｆ９細胞
を毎週２回、Ｓｆ−９００II ＳＦＭ培地に継代接種し
た。細胞を２５０ｍＬの振とうフラスコにて３〜４×１
０5 ／ｍＬ（容積１００ｍＬ）まで希釈し、１５０ｒｐ
ｍで回転する振とうプラットフォームにて２８℃で培養
した。低温貯蔵は、１×１０7 細胞を１０％ＦＢＳ（シ
グマ・ケミカル社、セントルイス、ＭＯ）と７．５％の
ＤＭＳＯ（シグマ社）とが補充された１．０ｍＬのＳｆ
９００II ＳＦＭ培地に再懸濁すると共に−８０℃で２
４〜４６時間にわたり低温貯蔵して行った。永久貯蔵は
液体窒素で行った。
【０１９５】ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリから複製され
た菌株をブタペスト条約の規定にしたがい１９９６年５
月３１日付けでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、パークローン・ドライブ１２３０１、ロック
ビル、メリーランド２０８５２に寄託し、寄託日から３
０年間または最後の分譲要請の後５年間または米国特許
の権利期間のいずれか長い期間にわたり保管される。こ
こに記載した寄託物および他の寄託物質は便宜のみのた
め供与され、ここに示した教示に鑑み本発明を実施する
ことは要求されない。全寄託物質におけるＨＧＢＶ ｃ
ＤＮＡ配列を参考のためここに引用する。これらプラス
ミドは次のＡＴＣＣ寄託番号に一致する：クローンｐＳ
ｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５ＡはＡＴＣＣ Ｎｏ．９８０７３
に一致し；クローンｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６はＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＣＲＬ−１２１１１に一致し；クローンｐＳＦ
Ｖ−ｓｓ／Ｅ２−３３６はＡＴＣＣ Ｎｏ．９８０７０
に一致し；クローンｐＳＦＶ１／Ｎ５３はＡＴＣＣ Ｎ
ｏ．９８０７１に一致し；クローンｐＣＨＯ／Ｅ２−３
１５はＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１２１１０に一致し；
クローンｐＡｃＧＰ６７Ａ−Ｅ２ＣはＡＴＣＣ Ｎｏ．
９８０７２に一致する。
【０１９６】本発明は、付記した特許請求の範囲のみに
よって規定されるものと意図される。
【０１９７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０１９８】
【化１】
【０１９９】 配列番号：２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２００】
【化２】
【０２０１】 配列番号：３ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２０２】
【化３】
【０２０３】 配列番号：４ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２０４】
【化４】
【０２０５】 配列番号：５ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２０６】
【化５】
【０２０７】 配列番号：６ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２０８】
【化６】
【０２０９】 配列番号：７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２１０】
【化７】
【０２１１】 配列番号：８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２１２】
【化８】
【０２１３】 配列番号：９ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２１４】
【化９】
【０２１５】 配列番号：１０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２１６】
【化１０】
【０２１７】 配列番号：１１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２１８】
【化１１】
【０２１９】 配列番号：１２ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２２０】
【化１２】
【０２２１】 配列番号：１３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２２２】
【化１３】
【０２２３】 配列番号：１４ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２２４】
【化１４】
【０２２５】 配列番号：１５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２２６】
【化１５】
【０２２７】 配列番号：１６ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２２８】
【化１６】
【０２２９】 配列番号：１７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２３０】
【化１７】
【０２３１】 配列番号：１８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２３２】
【化１８】
【０２３３】 配列番号：１９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２３４】
【化１９】
【０２３５】 配列番号：２０ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２３６】
【化２０】
【０２３７】 配列番号：２１ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２３８】
【化２１】
【０２３９】 配列番号：２２ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２４０】
【化２２】
【０２４１】 配列番号：２３ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２４２】
【化２３】
【０２４３】 配列番号：２４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２４４】
【化２４】
【０２４５】 配列番号：２５ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２４６】
【化２５】
【０２４７】 配列番号：２６ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２４８】
【化２６】
【０２４９】 配列番号：２７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２５０】
【化２７】
【０２５１】 配列番号：２８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２５２】
【化２８】
【０２５３】 配列番号：２９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２５４】
【化２９】
【０２５５】 配列番号：３０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２５６】
【化３０】
【０２５７】 配列番号：３１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２５８】
【化３１】
【０２５９】 配列番号：３２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２６０】
【化３２】
【０２６１】 配列番号：３３ 配列の長さ：２９０５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０２６２】
【化３３】
【０２６３】
【化３４】
【０２６４】
【化３５】
【０２６５】
【化３６】
【０２６６】
【化３７】
【０２６７】
【化３８】
【０２６８】
【化３９】
【０２６９】
【化４０】
【０２７０】
【化４１】
【０２７１】
【化４２】
【０２７２】 配列番号：３４ 配列の長さ：９１２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２７３】
【化４３】
【０２７４】
【化４４】
【０２７５】
【化４５】
【０２７６】
【化４６】
【０２７７】
【化４７】
【０２７８】
【化４８】
【０２７９】 配列番号：３５ 配列の長さ：２８６０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０２８０】
【化４９】
【０２８１】
【化５０】
【０２８２】
【化５１】
【０２８３】
【化５２】
【０２８４】
【化５３】
【０２８５】
【化５４】
【０２８６】
【化５５】
【０２８７】
【化５６】
【０２８８】
【化５７】
【０２８９】
【化５８】
【０２９０】 配列番号：３６ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２９１】
【化５９】
【０２９２】 配列番号：３７ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２９３】
【化６０】
【０２９４】 配列番号：３８ 配列の長さ：５９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２９５】
【化６１】
【０２９６】 配列番号：３９ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２９７】
【化６２】
【０２９８】 配列番号：４０ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０２９９】
【化６３】
【０３００】 配列番号：４１ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３０１】
【化６４】
【０３０２】 配列番号：４２ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３０３】
【化６５】
【０３０４】 配列番号：４３ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３０５】
【化６６】
【０３０６】 配列番号：４４ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３０７】
【化６７】
【０３０８】 配列番号：４５ 配列の長さ：９０１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３０９】
【化６８】
【０３１０】
【化６９】
【０３１１】
【化７０】
【０３１２】
【化７１】
【０３１３】
【化７２】
【０３１４】
【化７３】
【０３１５】 配列番号：４６ 配列の長さ：２８４１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３１６】
【化７４】
【０３１７】
【化７５】
【０３１８】
【化７６】
【０３１９】
【化７７】
【０３２０】
【化７８】
【０３２１】
【化７９】
【０３２２】
【化８０】
【０３２３】
【化８１】
【０３２４】
【化８２】
【０３２５】
【化８３】
【０３２６】 配列番号：４７ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３２７】
【化８４】
【０３２８】 配列番号：４８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３２９】
【化８５】
【０３３０】 配列番号：４９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３３１】
【化８６】
【０３３２】 配列番号：５０ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３３３】
【化８７】
【０３３４】 配列番号：５１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３３５】
【化８８】
【０３３６】 配列番号：５２ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３３７】
【化８９】
【０３３８】 配列番号：５３ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３３９】
【化９０】
【０３４０】 配列番号：５４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３４１】
【化９１】
【０３４２】 配列番号：５５ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３４３】
【化９２】
【０３４４】 配列番号：５６ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３４５】
【化９３】
【０３４６】 配列番号：５７ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３４７】
【化９４】
【０３４８】 配列番号：５８ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３４９】
【化９５】
【０３５０】 配列番号：５９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３５１】
【化９６】
【０３５２】 配列番号：６０ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３５３】
【化９７】
【０３５４】 配列番号：６１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３５５】
【化９８】
【０３５６】 配列番号：６２ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３５７】
【化９９】
【０３５８】 配列番号：６３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３５９】
【化１００】
【０３６０】 配列番号：６４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３６１】
【化１０１】
【０３６２】 配列番号：６５ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３６３】
【化１０２】
【０３６４】 配列番号：６６ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３６５】
【化１０３】
【０３６６】 配列番号：６７ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３６７】
【化１０４】
【０３６８】 配列番号：６８ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３６９】
【化１０５】
【０３７０】 配列番号：６９ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列
【０３７１】
【化１０６】
【０３７２】 配列番号：７０ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３７３】
【化１０７】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＧＢＶ−Ｃ大型開放読み枠（配列番号：３
３）および発現されたＰＣＲ産生物の略図。
【図２】プラスミド５７７の略図。
【図３】予備的切捨て値を決定するための分布を示す１
００名の血液ドナー志願者の抗−ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２反応
性の図。
【図４】ＧＢＶ−Ｃで急性感染した個体の血清プロフィ
ルを示す図（ここでＥＬＩＳＡＳ／Ｎは露呈後の日数に
対しプロットし、露呈後の日数に対応するＰＣＲおよび
ＲＩＰＡ反応性をも示す）。
【図５】ＧＢＶ−Ｃで急性感染した個体の血清プロフィ
ルの図（ここでＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｎは露呈後の日数に対
しプロットし、露呈後の日数に対応するＰＣＲおよびＲ
ＩＰＡ反応性をも示す）。
【図６】ＧＢＶ−Ｃで感染した他の個体のＲＩＰＡ結果
を示す写真。
【図７】ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ３１５蛋白質のクーマシー
・ブリリアント・ブルーＲ−２５０染色ＳＤＳポリアク
リルアミドゲルを示す図［ここでＭは分子量マーカーを
示し、ＳＭは出発物質（ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ３１５感染
細胞からの濃縮清澄ＶＡＳ媒体）を示し、非結合性フラ
クションは抗−ＦＬＡＧ抗体親和性カラムに結合しなか
った蛋白質を意味し、ＧＢＶ−Ｃ Ｅ２ ３１５はＦＬ
ＡＧペプチドとの競合により抗−ＦＬＡＧ Ｍ２抗体親
和性カラムから溶出された蛋白質を意味し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥおよびクーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２
５０での染色は当業界で知られた標準法および試薬を用
いて行った］。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/536 Ｃ 33/536 Ｄ Ｅ 33/569 Ｚ 33/569 33/576 Ｚ 33/576 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/29 ＡＤＹ // Ａ６１Ｋ 39/29 ＡＤＹ 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 トーマス・ピー・リアリー アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノウシヤ、ワンハンレツドセブンス・ア ベニユー・6820 (72)発明者 ジヨン・エヌ・シモンズ アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イズレイク、ノース・アリゲニー・ロー ド・738 (72)発明者 ロバート・ジエイ・カーリツク アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノウシヤ、フオース・アベニユー・9925 (72)発明者 テレサ・ケイ・サロウイ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノウシヤ、サード・アベニユー・6803 (72)発明者 シユレシユ・エム・デサイ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、エイミー・レーン・1408 (72)発明者 ジヨージ・ジエイ・ドウソン アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ テイビル、サウス・ダイモンド・ロード・ 914 (72)発明者 アントニー・エス・ミユアホフ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、 ケノウシヤ、シツクステイーエイトス・プ レイス・611 (72)発明者 アイサ・ケイ・マツシヤーワー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イズレイク、アーバー・ブールバード・ 18790

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アミノ酸配列もしくはその断片からな
    り、前記配列が正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とし、前記ゲノ
    ムがポリ蛋白質をコードする開放読み枠（ＯＲＦ）を有
    し、前記ポリ蛋白質がＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂおよ
    びＨＧＢＶ−Ｃよりなる群から選択されるアミノ酸配列
    に対し少なくとも３５％の同一性を有するアミノ酸配列
    を含む組換ポリペプチドであって、前記組換ポリペプチ
    ドがｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３
    ３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ
    ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７
    −Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生
    される組換ポリペプチド。
  2. 【請求項２】 少なくとも１種のＧＢ型肝炎ウィルス
    （ＨＧＢＶ）エピトープに対し指向する抗体において、
    前記抗体が組換ポリペプチドで個体を免疫化した結果産
    生され、前記組換ポリペプチドがｓＳｉｎＲｅｐ５／Ｎ
    Ｓ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ
    ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−
    ３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選
    択されるプラスミドから産生される抗体。
  3. 【請求項３】 抗体がポリクローナルである請求項２に
    記載の抗体。
  4. 【請求項４】 抗体がモノクローナルである請求項２に
    記載の抗体。
  5. 【請求項５】 少なくとも１種のＧＢ型肝炎ウィルス
    （ＨＧＢＶ）ポリペプチドもしくはその断片を含む融合
    ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドがｓＳｉ
    ｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳ
    ＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、
    ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよ
    りなる群から選択されるプラスミドから産生される融合
    ポリペプチド。
  6. 【請求項６】 試験試料におけるＧＢ型肝炎ウィルス
    （ＨＧＢＶ）抗原もしくは抗体の存在を決定するための
    分析キットにおいて、ＨＧＢＶ抗原に存在する少なくと
    も１種のＨＧＢＶエピトープを有する組換ポリペプチド
    を含有した容器を備え、前記ポリペプチドが正鎖ＲＮＡ
    ゲノムを特徴とし、前記ゲノムがポリ蛋白質をコードす
    る開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋白質がＨＧ
    ＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群
    から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも３５％の
    同一性を有するアミノ酸配列を含むと共にｓＳｉｎＲｅ
    ｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−
    ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨ
    ＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる
    群から選択されるプラスミドから産生される分析キッ
    ト。
  7. 【請求項７】 ポリペプチドが、固相に付着されている
    請求項６に記載の分析キット。
  8. 【請求項８】 ポリペプチドが測定可能なシグナルを発
    生するシグナル発生化合物に接合されている請求項６に
    記載の分析キット。
  9. 【請求項９】 シグナル発生化合物が酵素、蛍光性化合
    物または化学発光性化合物よりなる群から選択される請
    求項８に記載の分析キット。
  10. 【請求項１０】 試験試料おけるＧＢ型肝炎ウィルス
    （ＨＧＢＶ）抗原もしくは抗体の存在を決定するための
    分析キットであって、ＨＧＢＶ抗原に特異的に結合する
    抗体を含有した容器を備え、前記抗原がＨＧＢＶの配列
    に対し少なくとも約６０％の配列類似性を有する配列に
    よりコードされるＨＧＢＶエピトープを含み、前記抗体
    がｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３
    ６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／
    ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−
    Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生さ
    れた組換ポリペプチドで個体を免疫化した結果産生され
    る分析キット。
  11. 【請求項１１】 抗体が固相に付着されている請求項１
    ０に記載の分析キット。
  12. 【請求項１２】 抗体が、測定可能なシグナルを発生す
    るシグナル発生化合物を含む指示薬に接合されている請
    求項１０に記載の分析キット。
  13. 【請求項１３】 シグナル発生化合物が酵素、蛍光性化
    合物または化学発光性化合物よりなる群から選択される
    請求項１２に記載の分析キット。
  14. 【請求項１４】 少なくとも１種のＧＢ型肝炎ウィルス
    （ＨＧＢＶ）エピトープを含有するポリペプチドの産生
    方法において、正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするポリペプ
    チドをコードする配列を含んだ発現ベクターにより形質
    転換された宿主細胞を培養し、前記ゲノムがポリ蛋白質
    をコードする開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋
    白質がＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃ
    よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少なくと
    も３５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポ
    リペプチドがｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／
    Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦ
    Ｖ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃ
    ＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミド
    から産生されるポリペプチドの産生方法。
  15. 【請求項１５】 ＨＧＢＶを含有すると疑われる試験試
    料にてＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）抗原を検出する
    方法において： ａ． 試験試料を、少なくとも１種のＨＧＢＶ抗原に特
    異的に結合する抗体もしくはその断片と、抗体／抗原複
    合体を形成させるのに充分な時間および条件下にて接触
    させ； ｂ． 抗体を含有する前記複合体を検出し、前記抗体が
    ｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３
    ６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／
    ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−
    Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生さ
    れた組換ポリペプチドで個体を免疫化した結果産生され
    ることを特徴とするＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）抗
    原の検出方法。
  16. 【請求項１６】 抗体が固相に付着されている請求項１
    ５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 抗体がモノクローナル抗体もしくはポ
    リクローナル抗体である請求項１５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 複合体が、測定可能なシグナルを発生
    するシグナル発生化合物を含む指示薬に接合されている
    請求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 シグナル発生化合物が酵素、蛍光性化
    合物または化学発光性化合物よりなる群から選択される
    請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）抗体
    を含有すると疑われる試験試料にて前記抗体を検出する
    方法において： ａ． 試験試料を組換ポリペプチドと接触させ、前記ポ
    リペプチドが正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするアミノ酸配
    列もしくはその断片からなる少なくとも１種のＨＧＢＶ
    エピトープを含み、前記ゲノムがポリ蛋白質をコードす
    る開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋白質がＨＧ
    ＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群
    から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも３５％の
    同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記接触を抗原／
    抗体複合体を形成させるのに充分な時間および条件にて
    行い； ｂ． プローブポリペプチドを含有する前記複合体を検
    出し、前記ポリペプチドがｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５
    Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−
    ３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１
    ５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択さ
    れるプラスミドから産生されることを特徴とするＧＢ型
    肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）抗体の検出方法。
  21. 【請求項２１】 プローブポリペプチドが固相に付着さ
    れている請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 固相がビーズ、マイクロタイターウエ
    ル、試験管の壁部、ニトロセルロースストリップ、磁性
    ビーズおよび非磁性ビーズよりなる群から選択される請
    求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 複合体が、測定可能なシグナルを発生
    するシグナル発生化合物を含む指示薬に接合されている
    請求項２１に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 シグナル発生化合物が酵素、蛍光性化
    合物または化学発光性化合物よりなる群から選択される
    請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 薬理有効量の免疫原性ＨＧＢＶ組換ポ
    リペプチドもしくはその断片からなり、前記ポリペプチ
    ドが正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とし、前記ゲノムがポリ蛋
    白質をコードする開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポ
    リ蛋白質がＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ
    −Ｃよりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し少な
    くとも３５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、医
    薬上許容しうる賦形薬におけるＧＢ型肝炎ウィルス（Ｈ
    ＧＢＶ）感染を処置するためのワクチンであって、前記
    ポリペプチドがｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ
    ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳ
    ＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡ
    ｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミ
    ドから産生されるワクチン。
  26. 【請求項２６】 ＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）に対
    する抗体の産生方法において、免疫反応を生ぜしめるの
    に充分な量にて少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを
    含む分離された免疫原性組換ポリペプチドを個人に投与
    し、前記ポリペプチドがｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、
    ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３
    ６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５お
    よびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択される
    プラスミドから産生されることを特徴とする抗体の産生
    方法。
  27. 【請求項２７】 ＧＢ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ）から
    得られた組換ポリペプチドもしくはその断片を含み、前
    記ポリペプチドもしくはその断片がＨＧＢＶの少なくと
    も１種のエピトープをコードすると共に正鎖ＲＮＡゲノ
    ムを特徴とし、前記ゲノムがポリ蛋白質をコードする開
    放読み枠（ＯＲＦ）を有し、前記ポリ蛋白質がＨＧＢＶ
    −Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＧＢＶ−Ｃよりなる群から
    選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも３５％の同一
    性を有するアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドがｓ
    ＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ２−３３６、
    ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ−ｓｓ／ＮＳ
    ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧＰ６７−Ｅ２
    Ｃよりなる群から選択されるプラスミドから産生される
    診断試薬。
  28. 【請求項２８】 ＨＧＢＶ感染患者からのＧＢ型肝炎ウ
    ィルス（ＨＧＢＶ）の除去を判定する方法において： ａ． 前記患者から得られた試験試料を組換ポリペプチ
    ドと接触させ、前記ポリペプチドが正鎖ＲＮＡゲノムを
    特徴とするアミノ酸配列もしくはその断片からなる少な
    くとも１種のＨＧＢＶエピトープを含み、前記ゲノムが
    ポリ蛋白質をコードする開放読み枠（ＯＲＦ）を有し、
    前記ポリ蛋白質がＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨ
    ＧＢＶ−Ｃよりなる群から選択されるアミノ酸配列に対
    し少なくとも３５％の同一性を有するＨＧＢＶ Ｅ２の
    アミノ酸配列を含み、前記接触を抗原／抗体複合体を形
    成させるのに充分な時間および条件にて行い、前記ポリ
    ペプチドがｓＳｉｎＲｅｐ５／ＮＳ５Ａ、ｐＣＨＯ／Ｅ
    ２−３３６、ｐＳＦＶ−ｓｓ／Ｅ２−３３６、ｓＳＦＶ
    −ｓｓ／ＮＳ３、ｐＣＨＯＥ２−３１５およびｐＡｃＧ
    Ｐ６７−Ｅ２Ｃよりなる群から選択されるプラスミドか
    ら産生され； ｂ． 前記複合体を検出し、前記複合体の存在があれば
    前記患者から前記ＨＧＢＶウィルスが除去されたことを
    示すことを特徴とするＧＢ型肝炎ウィルスの除去の判定
    方法。
  29. 【請求項２９】 組換ポリペプチドが固相に付着されて
    いる請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 固相がビーズ、マイクロタイターウエ
    ル、試験管の壁部、ニトロセルロースストリップ、磁性
    ビーズおよび非磁性ビーズよりなる群から選択される請
    求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 複合体が、測定可能なシグナルを発生
    するシグナル発生化合物を含む指示薬に接合されている
    請求項２８に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 シグナル発生化合物が酵素、蛍光性化
    合物または化学発光性化合物よりなる群から選択される
    請求項３１に記載の方法。
JP8146313A 1995-06-07 1996-06-07 Ｇｂ型肝炎ウィルス組換蛋白質およびその使用 Pending JPH09117287A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US480995 1990-02-16
US48099595A 1995-06-07 1995-06-07
US629463 1996-04-19
US08/629,463 US6156495A (en) 1994-02-14 1996-04-19 Hepatitis GB virus recombinant proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH09117287A true JPH09117287A (ja) 1997-05-06

Family

ID=27046789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8146313A Pending JPH09117287A (ja) 1995-06-07 1996-06-07 Ｇｂ型肝炎ウィルス組換蛋白質およびその使用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US6156495A (ja)
EP (1) EP0747482A3 (ja)
JP (1) JPH09117287A (ja)
CA (1) CA2178537A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10501816B2 (en) 2014-06-27 2019-12-10 Abbott Laboratories Compositions and methods for detecting human pegivirus 2 (HPgV-2)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19613406A1 (de) * 1996-04-03 1997-10-09 Boehringer Mannheim Gmbh Expression von HGV-Antigenen und deren Verwendung
US5766916A (en) * 1996-04-24 1998-06-16 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis G virus protease
AU2001249928A1 (en) * 2000-04-06 2001-10-23 University Of Iowa Research Foundation Full-length gb virus c (hepatitis g virus) rna transcripts are infectious in primary cd4 positive t cells and methods of treating hiv
US7101683B2 (en) 2001-06-26 2006-09-05 Abbott Laboratories Methods for the simultaneous detection of HCV antigens and HCV antibodies
WO2003069340A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Millipore Corporation Diluent, methods of manufacture and use
AU2003287216A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-13 Sarah George Gb virus c and methods of treating viral infections
US20040152070A1 (en) * 2003-02-04 2004-08-05 Shah Dinesh O. Method of detection of HCV antibodies in combination assay or sole antibody assay
WO2004108159A2 (en) * 2003-06-05 2004-12-16 The University Of Iowa Research Foundation Gb virus c (hepatitis g virus) for the treatment of hiv
WO2005090570A1 (en) * 2004-03-24 2005-09-29 Supratek Pharma Inc. Therapeutic compositions and methods for treating diseases that involve angiogenesis
WO2006088664A2 (en) * 2005-02-17 2006-08-24 The University Of Iowa Research Foundation Flavivirus ns5a proteins for the treatment of hiv
WO2013142167A1 (en) * 2012-03-20 2013-09-26 The University Of Iowa Research Foundation Gb virus c (hepatitis g virus) e2 glycoprotein as an immunomodulatory agent
CN114137203A (zh) * 2021-10-21 2022-03-04 广州万孚生物技术股份有限公司 抗原与碱性磷酸酶结合物的制备方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4743535A (en) * 1984-11-07 1988-05-10 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
IE62868B1 (en) * 1987-11-18 1995-03-08 Chiron Corp Hepatitis C virus
JPH04501203A (ja) * 1988-07-06 1992-03-05 ジェネラブズ　インコーポレイティド 後―輸血性，非―ａ，非―ｂ型肝炎ウィルス及び抗原
JP2696116B2 (ja) * 1988-09-30 1998-01-14 財団法人阪大微生物病研究会 非ａ非ｂ肝炎患者の血清と抗原抗体反応するペプチド、及び該ペプチドをコードするｄｎａ
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
ES2198514T3 (es) * 1991-08-27 2004-02-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Cebadores y sondas para la deteccion de la hepatitis c.
US5576302A (en) * 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
WO1994018217A1 (en) * 1993-02-03 1994-08-18 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
ES2256837T3 (es) * 1992-09-28 2006-07-16 Chiron Corporation Procedimientos y composiciones para el control de la traduccion de las proteinas del vch.
EP0715725B1 (en) * 1993-08-24 1998-02-04 Akzo Nobel N.V. Ophthalmic lenses
WO1995021922A2 (en) * 1994-02-14 1995-08-17 Abbott Laboratories Non-a, non-b, non-c, non-d, non-e hepatitis reagents and methods for their use
AU2549195A (en) * 1994-05-20 1995-12-18 Genelabs Technologies, Inc. Non-A/non-B/non-C/non-D/non-E hepatitis agents and molecular cloning thereof
US5824507A (en) * 1994-05-20 1998-10-20 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis G virus and molecular cloning thereof
AU2594195A (en) * 1994-05-20 1995-12-18 Genelabs Technologies, Inc. Detection of viral antigens coded by reverse-reading frames
WO1995032291A2 (en) * 1994-05-20 1995-11-30 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis g virus and molecular cloning thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10501816B2 (en) 2014-06-27 2019-12-10 Abbott Laboratories Compositions and methods for detecting human pegivirus 2 (HPgV-2)

Also Published As

Publication number Publication date
US6156495A (en) 2000-12-05
CA2178537A1 (en) 1996-12-08
EP0747482A2 (en) 1996-12-11
EP0747482A3 (en) 1997-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2662358B2 (ja) Ｎａｎｂｖの診断用薬
US6303292B1 (en) Immunoreactive polypeptide compositions
CA2065287C (en) New hcv isolates
JP4021493B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルス様粒子の合成および精製
US5885768A (en) Hepatitis E virus peptide antigen and antibodies
JPH08509201A (ja) Ｅ型肝炎ウィルスワクチン及びその接種方法
Favorov et al. Enzyme immunoassay for the detection of antibody to hepatitis E virus based on synthetic peptides
EP0741787B1 (en) Mammalian expression systems for hepatitis c virus envelope genes
JPH10503642A (ja) Ｇ型肝炎ウイルスおよびその分子クローニング
US6153378A (en) Diagnosis of, and vaccination against, a positive stranded RNA virus using an isolated, unprocessed polypeptide encoded by a substantially complete genome of such virus
JPH09117287A (ja) Ｇｂ型肝炎ウィルス組換蛋白質およびその使用
JP3061258B2 (ja) 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法
JP2008520210A (ja) Ｈｃｖｆタンパク質及びその使用
US5843450A (en) Hepatitis GB Virus synthetic peptides and uses thereof
JP4390293B2 (ja) Ｅ型肝炎のパキスタン株組換えタンパク質および診断法およびワクチンにおけるそれらの使用
JP3848663B2 (ja) 非ａ非ｂ非ｃ非ｄ非ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法
MXPA97009271A (en) Diagnosis of, and vaccination against, in positive thread rna virus using an isolated polypeptide, do not process