JPH08509201A - E型肝炎ウィルスワクチン及びその接種方法 - Google Patents

E型肝炎ウィルスワクチン及びその接種方法

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Abstract

(57)【要約】 E型肝炎ウィルス感染を防ぐのに有効な抗原及び抗体ワクチン組成物を記載する。抗原組成物は、HEVゲノムの第二開放型読み枠(2)によってコード化されたカプシドたん白質のカルボキシル末端域に相当するペプチドを含有する、この組成物はワクチン接種後、HEV感染を防ぐのに有効である抗体組成物を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】 E型肝炎ウィルスワクチン及びその接種方法 本出願は、1990年4月5日出願された米国特許出願第07/505,888号明細書の一部 継続出願であり、これは1989年10月13日に出願された米国特許出願第420,921号 明細書の一部継続出願であり、これは1989年6月16日に出願された米国特許第367 ,486号明細書の一部継続出願であり、これは1989年4月11日に出願された米国特 許第336,672号明細書の一部継続出願であり、これは1988年6月17日に出願された 米国特許第208,997号明細書の一部継続出願である。これらのすべてを、参考資 料として記載する。 1.発明の分野 本発明は、E型肝炎ウィルスとも呼ばれる腸内で伝達される非A/非B型肝炎 ウィルス剤に関連する抗原及び抗体ワクチン組成物及びワクチン接種方法に関す る。 2.参考資料 アランカレ(Arankalle),V.A.,等、The Lancet,550(3月12日,1988). ブラッドレイ(Bradley),D.W.,等、J Gen.Virol.,69:1 (1988). Bradley,D.W.等、Proc.Nat.Acad.Sci.,米国,84:6277(198 7). ディークマン(Dieckmann),C.L.,等、J.Biol.Chem.260:1513(1985). エングレマン(Engleman),E.G.,等、eds.,“ヒトハイブリドーマ及びモノク ロナール抗体”(Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies) ,Plenum Press,1985. グラベレ(Gravelle),C.R.等、J.Infedt.Diseases,131:167(1975). ケーン(Kane),M.A.,等、JAMA,252:3140(1984). クーロー(Khuroo),M.S.,Am.J.Med.,48:818(1980). Khuroo,M.S.,等、Am.J.Med.,68:818(1983). ランフォード(Lanford),R.E.,等、In Vitro Cellular and Devel Biol,25 (2):174(1989). ラリック(Larrick),J.W.及びFry,K.,“ヒト抗体ハイブリッド”(Huam Antibod Hybrid),2:172(1991). マニアチス(Maniatis),T.,等、“分子クローニング:研究所マニュアル” (Molecular Cloning:A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory(1982). サイキ(Saiki),R.K.,等、“科学”239;487(1988) セト(Seto),B.,等Lancet,11:941(1984). スリーニバサン(Sreenivasan),M.A.,等、J.Gen.Virol.,65:1005(1984) . ターバー(Tabor),E.,等、J.Infect.Dis.,140:789(1979). タム(Tam),A.,等、ウィルス学,185:120(1991). ヤールブロー(Yarbough),P.O.,J.ウィルス学,65(11):5790(1991). ゾラ(Zola),H.,“モノクロナール抗体:技術のマニュアル”(Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques),CRC Press,Boca Raton,LA,1987 . 3.発明の背景 腸内で伝達される非-A/非-B型肝炎ウィルス剤(ET-NANB,,E型肝炎ウィル ス又はHEVとしても呼ばれる)は、アジア、アフリカ、ヨーロッパ、メキシコ 、及びインド亜大陸に於ていくつもの伝染性及び散発性症例中で肝炎の原因とし て報告されている。ウィルスは接近した身体接触によっても広がるが、感染は大 便で汚染された水も通常原因となる。ウィルスは慢性感染を生じないと考えられ る。 HEVに関するウィルス病因学は、ためられた大便分離物による自然な感染に よって説明されている。免疫電子顕微鏡法(IEM)試験によれば、感染者から 得られた大便中に直径27−34nmを有するウィルス粒子が確認されている。ウィル ス粒子は、地理的に異なる地域の感染者から得られた血清中で抗体と反応する。 このことは単一ウィルス剤又はウィルスクラスが世界じゅうで観察されるHEV 肝炎の大部分に関与していることを示唆する。抗体反応は、腸管外で伝達される NANBウィルス(肝炎Cウィルス又はHCVとしても知られている)で感染さ れたヒトから得られた血清中にみられ、2つのNANB型の間で異なる特異性を 示す。 血清学的相違に加えて、2つのタイプのNANB感染は、明らかな臨床上の相 違を示す。HEVは、特徴的に急性感染であり、しばしば熱及び関節炎、及び門 脈炎症及び肝バイオプシー検体中に胆汁の停滞を伴う(アランカレ(Arankalle ). この症状は通常6週間以内で解消する。これに反してHCVは、症例の約50%で 慢性感染を生じる。熱及び関節炎はめったに観察されず、そして炎症は、主に実 質分布(Parenchymal distribution)を有する(クーロー(Khuroo)1980)。 HEVの進行は、一般に健康人で一様でない、そして感染した人々の大部分は HCVで観察される慢性後遺症を有することなく回復する。しかしこの疾病の1 つの特有の伝染性特徴は、妊婦に観察される、著しく高い死亡数である。これは 多くの研究でほぼ10−20%であると報告されている。この発見は、多くの伝染病 学の研究で観察されているが、現在説明されていないままである。これがウィル ス病原性を招くかどうかは、ウィルスと免疫抑制された(妊娠)ホストの相互間 で死にいたる影響、又は感受性栄養失調母集団の衰弱させられた胎児の健康への 影響によって明らかにされねばならない。 2つのウィルス剤も霊長目動物のホスト罹病性に基づいて区別することができ る。HCVでなくHEVをマカクザル(Cynornolgus monokeys)に伝染すること ができる。HCVをHEVよりもチンパンジーに容易に伝染することができる( Bradley,1987)。 初期の分野の特許出願に、HEVクローン及びHEVゲノム配列全体の配列が 記載されている。HEVクローンから、HEVゲノムコード化域から導かれる組 換え型ペプチドを産出する。 4.発明の要約 1つの目的によれば、本発明はE型肝炎ウィルス(HEV)に対してヒトを免 疫化するためのペプチドワクチン組成物に関する。この組成物は、薬理学的に容 認されるキャリヤー及びHEVゲノムの第二開放型読み枠によってコード化され た推定上のカプシドたん白質のC-末端42アミノ酸を含有するペプチドを含有す る。ペプチドは、次の配列の1つによって同定されるアミノ酸配列を含有するの が好ましい: (i) 配列ID No.13 (ii) 配列ID No.14 (iii) 内部で一致している、配列ID No.13と14の間の変異、 (iv) 配列ID No.15 (v) 配列ID No.16 (vi) 内部で一致している、配列ID No.15と16の間の変異、 (vii) 配列ID No.17 (viii) 配列ID No.18、 (ix) 内部で一致している、配列ID No.17と18の間の変異、 (x) 配列ID No.19 (xl) 配列ID No.20、及び (xii) 内部で一致している、配列ID No.19と20の間の変異。 この目的に関連して、本発明は腸管外注射、たとえば筋肉内又は静脈内注射に よって上記ペプチドワクチン組成物を患者に投与することによって、HEVによ るヒトへの感染を防ぐ方法に関する。 他の目的によれば、E型肝炎ウィルス(HEV)感染を中和するのに有効な抗 体ワクチン組成物に関し、これは培養された第一ヒト肝細胞(Primary human he patocyte)のHEV感染を遮断するこの組成物の能力によって証明される。 抗体組成物は、上記(i)-(xii)配列の1つを含有するペプチドと、及び好 ましくは配列(i)-(iii)及び(iv-vi)に対応するペプチドと免疫反応する抗 体を含有する。この目的に関連して、本発明は、腸管外注射によって上記抗体組 成物を患者に投与して、ヒトへのHEV感染を予防又は治療する方法に関する。 本発明のこれらの及び他の目的及び特徴は、次の本発明の詳細な説明が添付図 面と共に説明される場合により十分に明らかとなる。 図面の簡単な説明 図1は、HEVゲノム、ゲノム中の開放型読み枠、及びペプチド406.3−2,GS 3、及びtrpE−C2に関する近似のコード域を示す; 図2A及び2Bは、trpE−C2 HEV抗原(2A)又はミヨバンコントロ ール(2B)で前もって免疫化された動物中でビルマ-株HEV大便サンプルで マカクザルに感染させた後に観察される血液ALTレベルを示す; 図3A及び3Bは、trpE−C2HEV抗原(3A)又はミヨバンコントロー ル(3B)で前もって免疫化された動物中でメキシコ-株HEV大便サンプルで マカクザルに感染させた後に観察される血液ALTレベルを示す; 図4は、非-感染ヒト第一肝細胞から得られたPCR-増幅されたRNAのサザ ンブロット(レーン4)及び3時間ないし11日へ時間を増加してHEVで感染さ せた第一肝細胞(レーン5-11)を示す; 図5は、伝染性ウィルスを正常の前もって免疫されたウサギ血清と共に(レー ン1及び3)又はHEV抗原HEV406.3−2(B)(レーン2)及びHEV406 .4−2(M)(レーン4)に対するウサギ抗血清と共に前もって培養するHEV- 感染したヒト第一肝細胞から得られたPCR-増幅されたRNAのサザンブロッ トを示す; 図6は、正常ヒト血清(レーン1)及び一連の異なるHEV-陽性免疫血清の 1つ(レーン2-12)と共に前もって培養されたHEV-感染されたヒト第一肝細 胞から得られたPCR-増幅されたRNAのザザンブロットを示す; 図7は、HEVのビルマ株(上部ライン)及びメキシコ株(下部ライン)に関 するHEV ORF2及びORF3のヌクレオチド配列を示す; 図8は、HEVのビルマ株(上部ライン)及びメキシコ株(下部ライン)に関 するORF3ペプチドのアミノ酸配列を示す;及び 図9は、HEVのビルマ株(上部ライン)及びメキシコ株(下部ライン)に関 するORF2たん白質のアミノ酸配列を示す。 発明の詳細な説明 I 定義 下記の言葉は、ここで次の意味を有する: 1.“腸内で伝達される非-A/非 B型肝炎ウィルス剤”、“E型肝炎ウィルス ”、又は“HEV”は、ウィルスタイプ、又はウィルスクラスを意味し、これは (i)水中感染肝炎を生じ、(ii)マカクザルに伝染することができ、(iii)A 型肝炎ウィルス(HAV)、B型肝炎ウィルス(HBV)、C型肝炎ウィルス( HCV)及びD型肝炎ウィルスを血清学的に区別し、そして(iv)ATCC寄託 No.67717によって同定される大腸菌BB4中に運ばれるプラスミドpTZKF1( ET1.1)中に挿入される1.33Kb cDNAと相同である。 2.2種の核酸フラグメントはManiatis等、前記文献、第320頁−第323頁に記載 されたハイブリダゼーション条件下で相互にハイブリッド化することができ る場合、これらは相同である。しかしながら、次の洗浄条件:2×SCC、0.1 %SDS、室温で2回、夫々30分間;次いで2×SCC、室温で2回、夫々10分 間を使用して相同配列が、多くても約25−30%塩基対誤対合を含有することを同 定することができる。相同核酸鎖は15−25%塩基対誤対合を含有するのが好まし く、さらに好ましくは5−15%塩基対誤対合を含有する。これらの相同性度合を 、従来よく知られている様に、遺伝子ライブラリー(又は遺伝子材料の他の起源 )からクローンの同定のためにより一層結合しない洗浄条件を使用することによ って選択することができる。 3.2種のアミノ酸配列又は2種のヌクレオチド(2つのヌクレオチド配列間の 相同性に対する別の同定に於て)はかなり相同(この言葉はこの明細書中で使用 されるのが好ましい)であり、それはこれらが、突然変異ギャップマトリックス 及びギャップペナルティ−6又はそれ以上を有するプログラムALIGNを用いて共 線スコア>5(標準偏差単位で)を有する場合である。デイホフ(Dayhoff),M .O.,“Atlas of Protein Sequence and Structure”(1972)、第5巻、Nationa l Biochemical Researeh Foundation,第101頁−第110頁、及びこの巻の増補2 、第1頁−第10頁参照。2種の配列(又はその一部、好ましくは長さが少なくと も30個のアミノ酸)は相同であるのがより好ましく、それはそのアミノ酸が上記 ALIGNプログラムを用いて最適に一列に並べられる時50%より大きい又は50%で 同一である。 4.DNAフラグメントが、ウィルス剤ゲノムの領域として同一又は実質上同一 の塩基対配列を有する場合、これをHEVウィルス剤から導く。 5.たん白質が、ET-NANBウィルス剤から導かれるDNA又はRNAフラグメン トの開放型読みの枠によってコード化される場合、HEVウィルス剤から導かれ る。 6.アミノ酸配列で約70%より大きく相同である2種又はそれ以上の公知のペプ チド配列に於て、第三配列中の夫々のアミノ酸が公知配列中で少なくとも1種の アミノ酸と同一である場合、第三アミノ酸配列は公知配列と内部で一致している 。 II.HEV抗原ワクチン 筋肉内注射(i.m.)によって、HEV感染を防ぐのに有効なHEV抗原ワクチ ンを製造及び使用する方法を、この欄に記載する。 A.HEV遺伝子配列 HEVゲノムクローン、及び種々のHEV鎖に対する全HEVゲノムに対応す る配列が、公表された方法(タム(Tam)、ヤーブロー(Yabough))に従って及 び上記特許出願中に記載されている様に得られる。簡単に、公知のHEV感染を 有するマカクザルの胆汁から単離されたRNAをCDNAフラグメントとしてク ローン化し、フラグメントライブラリーとなし、ライブラリーを判別ハイブリダ ゼーションによって感染及び非感染胆汁ソースから放射能標識されたCDNAS に選別する。 同定されたクローン中のHEVフラグメントのクローン化領域の塩基対配列を 標準配列法によって決定する。図1に関して、陽性-センス極性のほぼ7.5キロベ ース(Kb)一本鎖及びポリアルデニル化RNAゲノムを有するウィルスである。 3種の開放型読み枠(ORFs)は、RNA-指向RNAポリメラーゼのドメイン 及びヘリカーゼでポリペプチドをコード化するORF1、ウィルス推定上のカプ シドたん白質をコード化するORF2、及びORF3としてHEVに指定する。 HEVのゲノム組織化は、その非構造遺伝子を5'末端で、そして構造遺伝子 を3'末端で指定する。サイズがほぼ2.0Kbと3.7Kbの2種のサブゲノムポリアデ ニル化転写体を感染された肝臓中で検出し、その3'末端で7.7Kb- 完全な長さの ゲノム転写体を用いて共終結(co-tarminated)する。HEVのゲノム組織化及 び発現計画は、RNAウィルスの新しい分類又は恐らくカリシウィルス科内の別 個の属に対する原型ヒト病原体であろうと示唆される。 図7に示される遺伝及びペプチド配列は、HEVのビルマ(B)(上部ライン )及びメキシコ(M)株(下部ライン)のORF-2及びORF-3領域に対応する。中央 のラインに示される塩基は、保存ヌクレオチドを示す。比較で使用される番号づ けシステムはビルマ配列に基づく。ビルマ配列はSEQ ID No.1を有し、メキシコ 配列はSEQ ID No.2を有する。ORF2に対応する領域は、夫々ビルマ株及びメキシ コ株に対してSEQ ID No.3及び4を有する。406.3−2に対応する領域は、夫々ビ ルマ株及びメキシコ株に対してSEQ ID No.5及び6を有する。SG3に対応する領 域 は、夫々ビルマ株及びメキシコ株に対してSEQ ID No.7及び8を有する。C2に対 応する領域は、夫々ビルマ株メキシコ株に対してSEQ ID No.9及び10を有する。 406.4−2に対応する領域は、夫々ビルマ株及びメキシコ株に対してSEQ ID No.11 及び12を有する。 B.組換えペプチド抗原 HEVのビルマ株及びメキシコ株の第三及び第二開放型読み枠に対応するアミ ノ酸配列を、夫々図8及び9に示す。示された配列リストは次の通りである: SEQ ID No.13及び14は、夫々ペプチド406.3−2(B)及び406.3−2(M)に対す るアミノ酸配列に対応する。夫々のペプチドは、ORF2配列(図9)中に示されて いる様に、ORF2によってコード化されたカプシドたん白質のC-末端領域中の42 アミノ酸ペプチドである。 SEQ ID No.15及び16は、夫々ペプチドSG3(B)及びSG3(M)に対するアミノ酸 配列に対応する。夫々のペプチドは、HEVカプシドのカルボキシル324アミノ 酸を含有する。 SEQ ID No.17及び18は、夫々ペプチドC2(B)及びC2(M)に対するアミノ酸配 列に対応する。夫々はHEVたん白質のカルボキシルアミノ酸を含有する。 SEQ ID No.19及び20は、夫々ビルマ株及びメキシコ株ORF2によってコード化さ れた完全な推定上のカプシドたん白質に対するアミノ酸配列に対応する。 SEQ ID No.21及び22は、夫々406.4−2(B)及び406.4−2(M)に対するアミノ 酸配列に対応する(図8)。これらはORF3によってコード化された33アミノ酸配 列である。 HEV抗原の種々の株から得られた上記特定化された配列と内部で一致してい る配列も予想される。これらは配列ID No.13、配列ID No.14及び配列ID No.13と 14の間の内部で一致する変異、配列ID No.15、配列ID No.16、及び配列ID No.15 と16の間の内部で一致する変異、配列ID No.17、配列ID No.18;及び配列ID No. 17と18の間の内部で一致する変異、配列ID No.19、配列ID No.20;配列ID No.19 と20の間の内部で一致する変異を含有する。 たとえばHEV406.3−2抗原は、ビルマ(B)株及びメキシコ(M)株に対する 下記の配列相同性を有する。配列比較中の単一ドットは、確認される高-確率又 は“中立”アミノ酸置換を示す。空白は非-中立置換を示す。 これらの2つの配列と内部で一致する配列は、次の配列の1つを有する: (式中X/Yはアミノ酸X又はアミノ酸Yのどちらかを示す。) ビルマ株及びメキシコ株に対する、長さ124アミノ酸のORF3アミノ酸配列は、1 24アミノ酸中で87.1%同一性を有する。オーバーラップの659アミノ酸を有する 、ORF2アミノ酸配列は、659アミノ酸中で93.O%同一性を有する。 406.3−2(M)ペプチドを製造するために、例3に記載されたラムダgt11 406. 3−2をグルタチオンS-トランスフエラーゼベクターpGEXにサブクローン化し、例 3及びTam参考文献中に詳述した様に、3-2(M)抗原を発現する。 406.3−2(B)抗原を、pBET1プラスミドのPCR増幅による上記のビルマSEQI D No.5のPCR増幅によって製造することができる。このプラスミドは、ビルマ 株HEV配列に対するORF2及びORF3にわたる2.3Kb挿入を含有する。プラスミド をNco I部位を含有する5'プライマー及びBan HI部位を含有する3'プライマー (サカイ)を用いて、PCR増幅によって増幅する。増幅されたフラグメントを pGEXベクターのNco I/Bam HI部位中に挿入し、例3に記載した様に大腸菌発現系 中で発現させる。 SG3(B)ペプチドを、HEV(B)の完全なORF2及びORF3領域を含有するgt10 ファージBET1クローンプラスミドを用いて、5'Eco RI-Nco I及び3'Bam HIリン カーでSEQ ID No.7配列を先ず増幅して製造する。増幅されたフラグメントを、 製造業者の指示に従ってブルースクリプトTMベクター(ストラタジーン、サンジ ェゴ、カルファルニア)のEco RI/Bam HI部位に挿入する。ベクター増殖及び収 穫の後、クローン化挿入物をNco I及びBam HIの消化によって遊離し、ゲルを精 製する。精製されたフラグメントを、pGEXベクターのNco I/Bam HI部位中に挿入 し、例3 に記載した様に大腸菌発現系中で発現させる。SG3(M)ペプチドを、SEQ ID No. 7の代わりにSEQ ID No.8を用いて、同様に製造することができる。 C2(B)ペプチドを、例5中に記載した様に製造する。簡単に、gt10ファージB ETIプラスミドにEco RIを取込み、SEQ ID No.10 C2配列を遊離し、このフラグメ ントをpATH10trpE融合ベクター中に挿入し、組換え融合たん白質が大腸菌ホスト 中で発現する。 C2(M)ペプチドを、実質上上述の様に、Eco RI部位を含有する5'プライマー 及びBam HI部位を含有する3'プライマーを用いて、SEQ ID No.10のPCR増幅 によって製造することができる。増幅されたフラグメントをpGEXベクターのEco RI/Bam HI部位に挿入し、例3に記載した様に大腸菌発現系中で発現させる。 カプシドたん白質(B)を、Nco I部位を含有する5'プライマー及びBam HI部 位を含有する3'プライマーを用いてgt10BET1プラスミドから、SEQ ID No.3のP CR増幅によって上述の様に実質上製造する。増幅されたフラグメントをpGEXベ クターのNco I/Bam HI部位に挿入し、例3に記載した様に、大腸菌発現系中で発 現する。カプシドたん白質(M)を同様に製造する。 406.4−2(M)ペプチドを製造するために、例3に記載したラムダgt11 406.4 −2をグルタチオンS-トランスフェラーゼベクターpGEXにサブクローン化し、例 3に詳述様に3−2(M)抗原を発現する。 406.4−2(B)抗原を、Nco I部位を含有する5'プライマー及びBam HI部位を 含有する3'プライマーを用いてPCR増幅によって上記のビルマSEQ ID No.11 のPCR増幅によって製造することができる。増幅されたフラグメントをpGEXベ クターのNco I/Bam HI部位に挿入し、例3に記載した様に大腸菌発現系中で発現 する。 選択された部分を含有する他のHEVペプチド、好ましくは406.3−2配列を含 有するHEVカプシドたん白質のC-末端部分を、上記HEVゲノム-挿入プラス ミドを用いて、上記及び例3及び5に詳述した様に、所望の配列の増幅及び適す る発現ベクターへクローン化することで同様に製造することができることが分る 。 組換えペプチドを製造するのに使用されるコード化配列を、上記及び他の文献 (Tam)で詳述されたクローン化ベクターから又は合成ヌクレオチド合成から、 PCRスライス法を用いて導き、公知方法に従ってオリゴヌクレオチドフラグメ ントをヌクレオチド配列形成に参加させる。 C.成熟カプシドたん白質 HEVペプチド抗原は、霊長類の肝臓から、好ましくはヒト又はマカクザルの 肝臓から得られた第一肝細胞中で増殖された精製HEVウィルスからも得られる 。培養のための第一霊長類肝細胞を製造方法及び培養中に長期間肝-特異的機能 を保存するのに有効な培養地条件を、下記例1でヒト肝細胞に関して詳述する。 培養増殖の3日後、細胞に、例2に詳述する様に、HEV-感染されたマカク ザル大便プールの集団接種で感染させる(第4の経路)。細胞中に場殖するHE Vウィルスの存在及びレベルを、間接的な免疫蛍光法によって測定することがで きる。たとえば第一細胞がマカクザルである場合、その細胞をヒトHEV抗-血 清で免疫反応させ、次いでウサギ抗-ヒトIgG抗体と免疫反応させる。 あるいは、HEVウィルスを、例2に詳述する様に開始cDNA形成を伴う選択的 増幅法、及びPCR増幅によるHEV cDNA配列のPCR増幅によって検出し、 測定することができる。ウィルス粒子を、培養培地中でHEV感染されたヒト肝 細胞から、限外濾過によって30%ショ糖クッションを介してウィルスをペレット 化することによって単離することができる。所望ならばペレット状ウィルスを10 −40%ショ糖傾斜を介してゾーン遠心法によって更に精製することができる。 可溶性培養-培地成分からウィルス粒子を分離する他の方法を使用することが できる。たとえば澄明化された培養培地をサイズ-排除(size-exclusion)マト リックスに通し、サイズ排除にて可溶性成分を分離する。 あるいは、澄明化された培養培地を、ウィルス粒子を保持するが溶質(非-粒 子の)培養培地成分を通すことができる10−20nmの細孔サイズを有する限外濾過 膜に通すことができる。 本発明は、完全なHEVカプシドたん白質中でグリコシル化及び他のポスト- 翻訳変化が可能である。ウィルス粒子からのカプシド単離を、標準法、たとえば イオン交換及びサイズ-排除クロマトグラフィー及びHPLC精製によって、ウィル ス粒子を溶解媒体、たとえば非-イオン界面活性剤溶液中で溶解した後に実施す ることができる。たん白質を、たとえば抗-HEV抗血清から精製された抗体を 使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。 D.ワクチン組成物の製造 上記の組換え又は完全なHEVカプシド又はカプシドフラグメントペプチド( HEVカプシド抗原)を、公知方法に従ってワクチン組成物に挿入し、注射され る抗原の抗原性を増加する。 ある組成物中、HEV抗原をキャリヤーたん白質、たとえばキーホールカサガ イヘモシアニンに共有結合し、溶液の形で又はアジュバントと組合せた形で注射 する。その代わりにHEV抗原を融合たん白質の一部として製造する場合、たん 白質の非-HEV部分は、キャリヤーたん白質として役立つ。誘導された又は融 合のたん白質を薬学的に容認されるキャリヤー、たとえば溶液又はアジュバント 、たとえば加工ミヨウバン中に入れる。 その代わりに遊離のペプチドそれ自体、たとえばHEV C2ペプチドをミヨウ バン中で生成するか又はアジュバントなしで使用する。適するアジュバント化ワ クチンは、約1mgペプチド抗原/mgミヨウバンの好ましい抗原濃度を有し、注射1 本につきミヨウバン80mgを越えてはならない。 III.抗原ワクチン法 他の目的で、本発明は、患者に本発明のワクチン組成物を腸管外注射、たとえ ば筋肉内又は静脈内注射によって投与することによってE型肝炎ウィルスによる ヒトへの感染を防ぐ方法に関する。上記方法に使用するための好ましいワクチン 組成物は、HEV抗原が次の配列によって同定されるペプチド中に配列を含有す るワクチン組成物である: 配列ID No.13、配列ID No.14、及び配列ID No.13と14の間の内部で一致する変異 ;配列ID No.15;配列ID No.16;及び配列ID No.15と16の間の内部で一致する変 異;配列ID No.17、配列ID No.18;及び配列ID No.17と18の間の内部で一致する 変異、配列ID No.19、配列ID No.20;配列ID No.19と20の間の内部で一致する変 異。 抗原ワクチン組成物を一連の接種で、たとえば4週間間隔で2−3本の筋肉内 注射で投与する。例7中に詳述される方法で、マカクザルに変換されたミヨウバ ンアジュバント中に生成された又はアジュバント不含のC2融合たん白質trpE-C2 (B)を筋肉内注射する。動物4匹に、1ケ月の間隔で2本の注射としてミヨウ バンとtrpE-C2(B)抗原を与える。別の動物2匹に同じ接種スケジュールでミヨ ウバンのみを与える。動物のどれも二次注射後4週間で抗-HEV血清抗体の存 在を示さない。これは非融合C2HEV抗原を用いるウエスタンブロッティングに よって又は別の蛍光抗体遮断検定法によって判別される。 この段階で、実験動物4匹のうちの2匹に非-アジュバント化された、不溶性t rpE-C2ペプチド抗原の三次接種を行う。4週間後、この動物は、ウエスタンブロ ットによって明らかなように抗HEV抗体を示す。これらの結果は、trpE-C2抗 原はミヨウバンの不在下に投与した時により一層効果的であり、恐らくこれはミ ヨウバン共-沈殿処理の間の抗原のミヨウバン-変性のためであろうと考えられる 。 最後の接種1ケ月後、動物をHEVに対して高い感染性であることを前もって 示す三次-排泄ヒト大便の静脈内注射によって又はメキシコ-株ヒトHEV大便サ ンプルによって攻撃する。接種後の選択された間隔で、動物から得られた血清を 使用し、壊死及び肝細胞分解としてALT(アラニントランスフエラーゼ)レベ ルを測定する。肝バイオプシーサンプルも直接免疫検定法(FA)によってHE V抗原の存在を検定する。 図2AはTrpE-C2の三次投薬量が与えられた動物のうちの1匹でビルマ株HE Vウィルスによって感染後の肝ALTレベル期間に於ける変化を示す。観察され る様に、感染後、71/2週間で増加するALTレベルの形跡はない。肝バイオプシ ーサンプルもHEV抗原の形跡を示さない。 図2Bは、ビルマ株HEVで静脈内感染されたコントロール動物(ミヨウバン のみ注射)のHEV(B)感染後に測定されるALTレベルを示す。増加された ALTレベルは、ワクチン防御の不在下に期待される感染のレベルを示す。HE V抗原は肝バイオプシーサンプル中にも検出される。類似の結果がtrpE-C2ミヨ ウバン組成物の2本の注射を与えるが、三次ミヨウバン不含ワクチン接種を与え ない動物中に上記の様に観察される。 図3Aは、trpE-C2の三次投薬量を与えられた動物のうちの1匹中で、メキシ コ株HEVウィルスで感染後、肝ALTレベルに於ける変化を示す。再び32日目 に増加するALTレベルの形跡はない(32日目にこれに関係なく動物が死亡する 。)肝バイオプシーもHEVの最小の形跡を示す。この結果は、あるHEV株に 対して向けられる抗原ワクチンが、他のHEV株に対して防御免疫を与えること ができるを実証する。 図3Bは、HEVのメキシコ株で静脈内感染されたコントロール動物(ミヨウ バンだけの注射)のHEV感染後に測定されるALTレベルを示す。高いレベル の感染(ALT活性)が観察される。同様な結果が、trpE-C2 ミヨウバン組成物 の2本の注射を与えるが、三次ミヨウバン不含ワクチン接種を与えない動物中に 上述の様に観察される。 報告されたワクチン接種の詳細を、例5中に記載する。 IV.ワクチン組成物 もう1つの目的で、本発明は、中和HEV感染に有効な抗体ワクチン組成物に 関し、これは培養されたHEV-感染性第一肝細胞中でHEV感染を遮断するそ の組成物の能力によって証明される。2つの典型的な第一細胞はヒト及びマカク ザル細胞である。 組成物中の抗体は、配列の1つ:配列ID No.13;配列ID No.14、及び配列ID N o.13と14の間の内部で一致する変異;を含有するペプチドと免疫反応するのが好 ましい。下記の様に、406.3−2抗原(M)に対して製造された抗体は、ヒト第一 肝細胞中でHEV感染を遮断するのに有効である。 SEQ ID No.13又は14のカルボキシ末端を含有するより大きいカプシドペプチド 又はたん白質と免疫反応する抗体も好ましい。これらは、特に配列ID No.15;配 列ID No1;及び配列ID No.15と16の間の内部で一致する変異を含有する。下記の 様にヒト第一肝細胞のHEV感染を防ぐのに有効であるヒト血清はこれらの配列 で規定されたSG3ペプチドと免疫反応する。 配列ID No.17、配列ID No.18;及び配列ID No.17と18の間の内部で一致する変 異によって規定されるtrpE-C2と免疫反応する抗体も好ましく、配列ID No.19、 配列ID No.20;配列ID No.19と20の間の内部で一致する変異によって規定される ような完全なカプシドたん白質と免疫反応する抗体も同様である。 たとえばウサギ又はヤギの様な適する動物を上記の特定化されたHEV抗原の 1つで免疫化することによって製造される抗血清から、抗体がポリクロナール抗 体として得られる。あるいは、ポリクロナール抗体がヒト又は他の霊長目動物H EV抗血清から得られる。抗血清から得られる抗 HEVポリクロナール抗体を 標準法に従って、たとえば部分的に精製された血清IgG分画を得るのによく行わ れる様に精製する又は一部精製する(たとえばAntibodies:A Iaboratory Manua l,1988,コールドスプリングスハーバー研究所参照)。あるいは抗-HEV抗体 を、上記カプシド抗原の1つで誘導された固形支持体を用いてアフィニティーク ロマトグラフィーによって精製された形で得られる。 他の実施態様に於て、抗体はハイブリドーマセルラインによって分泌されたモ ノクロナール抗体である。ハイブリドーマセルラインを製造するために、免疫さ れた動物、好ましくはマウス又はヒトからのリンパ球を、確立した方法(たとえ ばエンゲルマン、ゾラ)に従って適する不滅化融合パートナーで不滅化する。 あるいはヒトモノクロナール抗体を、培養されたリンパ球から得られた軽い及 び重いヒト抗-HEVIgG遺伝子を、適する発現ベクターに挿入する、組換え法に よって産生し、これを使用して適するホストを共-感染(co-infect)する。ヒト リンパ球から軽い及び重いヒト抗-HEVIgGを得る及びクローン化する方法、及 び共-感染されたホスト細胞中でクローン化遺伝子を発現させる方法は、公知で ある(larrick)。 抗-HEV抗体を、一般に筋肉内、皮下又は静脈内経路による、適する注射用 溶液に処方し、ワクチン組成物となす。 B.抗体-406.3−2抗体の中和活性 上述の様に製造された抗体の中和可能性を実証するために、406.3−2(B)抗 原に対する抗体を、培養されたヒト第一肝細胞中でHEV感染を遮断するその能 力に関してテストする。 第一肝細胞を、公表された処理に従って及び例1に詳述する様に、製造し、培 養する。特有の培養条件は、特殊な肝細胞機能を損失することなく培養の間長期 の細胞増殖を可能にし、これは例1に記載する様に最初の培養後数ケ月までに肝 -特異性たん白質、たとえば血清アルブミンを産生し、分泌する、細胞の連続能 力によって明らかである。 培養された細胞に、正常のヒト血清又はマカクザル大便調製物を接種する。細 胞中でHEV感染を実証するために一組のHEV RNAの存在に関する感染後 1−11日目で一組の逆転写酵素を用いてcDNA'sを生じること及びポリメラーゼ鎖 反応(PCR)によってHEV-特異cDNAを増幅することを調べる。増幅された フラグメントは、長さ551塩基対を有すると予想される。図4は、増幅されたH EV配列を検出するためのHEV ORF2放射能標識されたプローブを用いて増幅 された材料のサザンブロットを示す。 結果を図4中に示す。レーン1−3はコントロールである。レーン4は正常( 非-感染)血清を接種された細胞から得られる全部増幅された材料である。レー ン5−11は夫々犬大便サンプルで感染3時間後、1日後、3日後、5日後、7日 後、11日後の増幅された材料を示す。結果は、HEVが最初の感染1日後以内に ヒト第一肝細胞中で増殖することを示す(レーン6)。5日後感染までHEV複 製のレベルで時間-依存増加かあり(レーン7及び8)、これはその後減少する (レーン9−11)。非感染第一細胞から単離された全細胞RNA中にHEVの形 跡はない。 抗原ペプチド406.3−2(B)及び406.4−2(M)及び406.4−2(B)に対するウ サギ抗血清を製造する。上述の様に、406.3−2ペプチドは、HEVカプシドたん 白質のカルボキシ末端域から、及び406.4−2ペプチドはHEV ORF3によってコ ード化されたペプチドから由来する。HEV抗原の1種に対する前免疫ウサギ血 清又はウサギ抗血清を犬大便接種原に1:20希釈で加え、抗体をウィルス調製物 と共に培養する。次いで抗体-処理された大便サンプルを使用して、ヒト第一肝 細胞を感染する。14日後、細胞をHEV感染に関して、RT/PCR/サザンブロット 法によって調べるが、448塩基対増幅されたフラグメントを生じると予想される プライマーを使用する。 結果を図5に示す。この図4レーン中で1及び3は、ヒト前免疫血清と共に前 もって培養された犬大便サンプルで感染された細胞から得られた増幅RNAを示 す。図中の448塩基対バンドはHEV感染を示す。第二レーンは、抗-406.3−2( B)ウサギ抗血清にさらされた細胞に相当し、HEV感染のほぼ完全な不在を示 す。レーン4は、抗406.4−2(M)ウサギ抗血清にさらされた細胞からの、増幅 された材料を示す。抗体は、HEV感染に対してほとんど又は全く防御効果を示 さない。 C.中和HEV抗血清 本発明に従って、中和抗体の他の起源は、ヒトHEV抗血清であり、これは上 記406.3−2抗原及びSG3抗原への免疫特異反応によって特徴づけられる。 ヒトHEV抗血清の中和抗体特徴を調べるために、ヒト抗血清のパネルを、実 質的に上述した様に培養された肝細胞のHEV感染を遮断する能力に関してテス トする。10種のHEV陽性ヒト抗血清を下記表1に示し、この血清はインド、パ キスタン、及びメキシコでHEV感染した患者から由来する。 簡単に、培養された細胞を、正常のプール血清又はHEV抗血清で処理された ザメル(Samel)(ビルマ株)で処理されたHEV-陽性犬大便にさらし、PCR 増幅及びHEV放射能標識されたプローブを用いるサザンブロットによってHE V-特異核酸配列の存在についてテストする。サザンブロットを図6中に示す。1 2種の血清サンプルのレーン番号を下記表1中に括弧で示す。図6から及び表1 から明らかな様に、中和HEVに有効な抗血清は、インド10(レーン2)、イン ド18(レーン13)、インド210(レーン15)、インド265(レーン8)、パキスタ ン143(レーン9)、及びパキスタン336(レーン10)である。しかし他のヒト血 清は、HEV感染を中和するその能力で極めて小さい効果(レーン11、メキシコ 387C)又は全く効果のない(レーン4、インド29;レーン6、インド242;レー ン7、インド259;レーン12、メキシコ387C〔IgG〕)ことを示す。陰性コントロ ールとして、正常ヒト血清プールは、全くHEVに対する中和活性を示さない。 数種のヒト抗血清を上述の406.3−3(M)、406.4−2(M)及び406.4−2(B) に対するそのIgG及びIgM免疫反応性に関してテストする。IgM抗体との反応は早 期-相感染しがちであり、一方IgGとの免疫反応性は、感染の早期及び後期段階両 方を示す。反応をELISAテストで測定する。その結果を表2A及び2B中に示す 。 そこで“+”表示は、陽性反応を示す;表中の番号は示される特異組換えたん白 質に対するIgGの希釈力価を示す。 表からのデータは、中和可能なこれらのヒト抗血清がIgG ELISAによってHE V3−2(M)エピトープに対する抗体に陽性であることを示す。インド29は、H EV3−2(M)に対するIgGに陽性でなく、HEV感染を中和しない(レーン4) 。 インド242及びインド259はHEV406.3−2(M)に対するIgGに陽性であるが、 これらは早期段階HEV感染を示すHEV406.3−2(M)に対するIgMにも陽性で ある。したがってこれらの特別なサンプル中で、誘発されたHEV3−2(M)に 対するIg(G)のレベルは、第一ヒト肝細胞のHEV感染を中和するのに十分で ある。 HEV3−2エピトープに対する免疫反応性とHEV-感染したヒトの血清の中 和活性との関連を更に調べるために、ウエスタンブロッテイングをこれらのヒト 血清サンプル上で行い、表3に示される結果が得られる。この表中から明らかな 様に、インド18、インド265及びHEV感染を中和することが前もって示される 、特にインド210は、ウエスタンブロッティング分析でHEV406.3−2(M)に対 して免疫反応性であり、その免疫反応性はその中和抗体と関連する。 HEV406.3−2(M)へのこれらの血清の特異的免疫反応性に関する確認とし て、ウエスタン分析は、HEVビルマ株のORF-2の329カルボキシ-末端アミノ酸 (ヌクレオチド6146-7129)を含有する、融合たん白質SG3(B)に対して行われ る。HEV406.3−2(M)及びSG3〔又はHEV406.3−2(B)〕に対するこれら の血清の免疫反応性は完全につり合う(表3)。 かくて中和抗体の適する起源を 提供するヒトHEV抗血清は、(a)406.3− 2抗原、及び(b)SG3抗原との免疫反応性によって特徴づけられるものであり、 両方の抗原はウエスタンブロット中での免疫反応性によって明らかである。すな わ ちそこではこれらの抗原がさらされて得られる立体配置中にあるからである。 更に一般的に、好ましい本発明のワクチン組成物は、406.3-2抗原性ペプチド 及びSG3抗原性ペプチドに対する免疫特異性抗体を含有する。ワクチン組成物は 、腸管外注射のための適するキャリヤー中に免疫特異的抗体を含有する。 抗体ワクチン組成物を、本発明の他の目的に従ってヒトに於けるHEV感染の 予防又は治療に使用する。 本発明の種々の方法及び組成物を示す例を以下に示すが、これによって本発明 は限定されない。材料 酵素:DNAseI及びアルカリホスファターゼがベーリンガーマンハイム バイ オケミカルス(BMB,インディアナポリス、IN)から得られる。Eco RI、Eco RIメ チラーゼ、DNAリガーゼ、及びポリメラーゼIがニューイングランド バイオラ ボス(NEB,ベベリーMA);RNaseAがシグマ(セントルイス、MO)から得られる 。 他の試剤;ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、S-ブロモ-4-クロロ-3-イン ドリルホスファターゼ(BCIP)、S-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-B-D-ガラク トピラノシド(Xgal)及びイソプロピルB-D-チオガラクトピラノサイド(IPTG) がシグマから得られる。 CDNA合成キット及び無作為なプライミング標識キットは、ベーリンガーマンハ イムバイオケミカルス(BMB,インディアナポリス,IN)から入手できる。 例1 ヒト第一肝細胞の培養 A.肝細胞の単離 肝細胞を、スタンフォード大学医療センターから得られたヒト肝臓から単離す る。肝臓をその場で潅流するか又は研究所で潅流用くさびとして摘出する。最初 の潅流を10分間、60m/分で、10mMHEPES(pH7.4)及び0.5mM〔エチレンビス(オ キシエチレンニトリロ〕-テトラ酢酸で補足されたCa++-,Mg++-不含ハンクスの バランスのとれた塩溶液を用いて行う。潅流を更に20分間、10mM HEPES(pH7.4 )及び100U/mlコラゲナーゼ(タイプI、シグマケミカル社、セントルイス、 MO)で補足されたウィリアムス培地E(WME)を用いて続ける。潅流後、肝臓のう を微細な鉗子を用いて除き、肝細胞をコラゲナーゼ溶液中で穏やかに振とうして 除去する。肝細胞懸濁液を、数枚のカーゼ層を通して濾過し、10%胎児ウシ血清 (FBS)を含有するWMWの等容量と混合する。肝細胞を、50Xgで5分間遠心分離し て沈降させ、5%FBSを含有するWME中に再懸濁する。肝細胞を沈降させ、 更に2回同一方法で同一方法で再懸濁する。最終細胞調製物を、トリパンブルー を用いて生存率を調べる前に数枚のカーゼ層を通じて濾過する。細胞に、コラー ゲンで前- 被覆された60mmプリマリア(Primaria)プレート(ファルコン)につ き密度2×106細胞で塗布する(コラボラティブリサーチ)。 培養を37℃で5%CO2中で3時間培養し、付着させ、その後毎48時間ごと培地 を血清不含処方に変える。血清一不含処方は、上記の様に増殖ファクター、ホル モン、10mM HEPES(pH7.4)、100μg/mlグルタミシンで補足されたWME-ベース培 地である(ランホード)。 B.肝臓-特異性たん白質の検出 ヒト肝細胞培養を、種々の時間の間血清不含培地中で保ち、〔35S〕-メチオニ ンで24時間標識する。培地を1mM PMSF、1mM EDTA及び1%NP40を含有するよう に調整する。種々のプラズマたん白質に特異的な抗体は、たん白質A-アガロース ビーズに結合し、ビーズをPBSで洗滌し、標識された培地のアリコートを、抗体- ビーズサンプレックスと共に16時間、4℃で培養する。ビーズを1%NP40を含有 する緩衝液で3回洗滌し、免疫沈殿したたん白質を2%SDSおよび2%2-メルカ プトエタノールを含有するゲル電気泳動サンプルで溶離する。サンプルを傾斜SD S-PAGE(4ないし15%)及びオートラジオグラフィーによって分析する。 例2 第一ヒト肝細胞の試験管内HEV感染 A.ヒト肝細胞のHEV感染 HEV-感染されたマカクザル#73大便プール(第四経路)を、第一ヒト肝細 胞の感染用接種原として使用する。接種原の種々の量を血清不含培地(SFM)1m l中に希釈し、3時間の培養期間で培養液に加える。次いでこの溶液を新鮮なSFM 2mlで補足し、混合物全体を一晩培養する。次の日、細胞単層を、3回WME(10Mm HEP ES,pH7.4)で洗滌し、その後2日間隔で変わる新鮮なSFMに変える。 B.免疫蛍光染色法 第一マカクザル肝細胞を単離し、上記の様にコラーゲン被覆されたカバーリッ プ(Coverlip)で組織培養プレート中に塗布する。カバーリップ上の細胞に、H EV-感染されたマカクザル#73大便プールか又はNIH正常ヒト血清で、最初 の塗布3日後に感染させる。感染を2時間続ける。 カバーリップ上の細胞を、90%アセトン中で室温で1分間固定する。次いでカ バーリップを空気乾燥する。カバーリップを、1時間PBS中の1%カギ血清中で 遮断し、PBSで3回洗滌し、HEV組換えたん白質1L6,4−2及び6-1-4に対する ウサギ抗血清の混合物と室温で3時間培養する。カバーリップを再びPBSで3回洗 滌し、PBS-1%ヤギ血清中に希釈されたフルオレセインイソチオシアナート複合 (FITC)ヤギ抗-ウサギIgG(H+L)(Zymed)と30分間反応させる。カバーリッ プをPBSで3回洗滌し、空気乾燥した後、FITCグリセロール溶液で量を増加して 、蛍光顕微鏡下に調べる。 C.逆転写/ポリメラーゼ鎖反応(RT/PCR) 第一マカクザル肝細胞のHEV感染をRT/PCR検定法によって評価する。cDNA合 成及びPCRに対するプライマーは、完全な長さのHEV cDNAのヌクレオチド配列 に基づく(A.タム等)。プライマーHEV3.2SF1(nt 6578-6597)及びHEV3 .2SF2(nt 6650-6668)は、ウィルスゲノムのORF2域からセンス極性であり、そ してHEV3.2SR1(nt 7108-7127)及びHEV3.2SR2(nt 7078-7097)は領域内 でアンチセンスプライマーである。シエカー(Sherker)等の方法に従って一工 程グアニジウム処理又はHE−感染上澄みを用いてHEV-感染細胞から全細胞R NAの抽出後、RNAサンプルのアリコートを、95℃で5分間熱−変性し、室温 で5分間、次いで42℃で60分間逆転写を行う。この際RNasin(プロメガ)20単位 、夫々デオキシリボヌチレオチド1mM(パーキン-エルマーセトス)の濃度で1 ×PCR緩衝液(パーキン-エルマーセトス)、及びHE3.2SR1プライマー2.5μ Mを含有する反応容量20μl中に、反応あたり200単位のMMLV- 逆転写酵素(BR L)及びHEV3.2SR1プライマー2.5μMを使用する。次いで反応混合物を、95℃ で5分間熱処理し、MMLV-逆転写酵素を変性する。 cDNA合成生成物10マイクロリットルを、PCRのために50μlの最終容量でH EV3.2SF1プライマー0.5μM、Taq DNAポリメラーゼ1.25単位(Ampli Taq,パー キン-エルマーセトス)、及び1×PCR緩衝液と共に使用し、鉱油50μlで薄くお おい、PCR40サイクルをパーキン‐エルマーサーモサイクラー中で行う(95℃×1 分;52℃×2分;72℃×30秒)。第一ランドRCR生成物10マイクロリットルを、 内部PCRプライマーHEV3.2SF2及びHEV3.2SR2を含有する全容量59μl中でも う40サイクルの組み込まれたPCRを行う(95℃×1分;55℃×2分;72℃×30秒 )。 第一及び第二-ラウンドRCR生成物をアガロース電気泳動に付し、エチジウムブ ロマイド染色及びUV光線下に写真をとる。その結果を図4に示し、上述の様に表 わされる。サザン転移を行い、フィルターをプライマー(nt6782-6997)を除い て〔32P-dCTP〕‐標識された内部試料HEVORF2-7でバイブリット化し、オートラ ジオグラフィーを行う。 例3 406.3-3及び406.4-2抗原の製造 TZKF1プラスミド(ET1.1)、ATCC寄託番号67717をEco RIで消化し、1.33KbH EV挿入を遊離し、これを線状プラスミドからゲル電気泳動によって精製する。 精製フラグメントを、標準消化緩衝液(0.5MトリスHCl,pH7.5;1mg/ml BSA;10 mM MnCl2)中に懸濁し、約1mg/mlの濃度となし、DNAseIを用いて室温で約5分 間消化する。この反応条件は、先立っての換算法から決定される。この方法で、 主に100-300塩基対フラグメントを製造するのに必要な培養時間が決定される。 材料をエタノール沈殿の前にフエノール/クロロホルムで抽出する。 消化混合物中のフラグメントを二本鎖末端化し、EcoRエリンカーと連結する。 生じるフラグメントを1.2%アガロースゲル上でPhi X 174/Hae III及びラムダ/H ind IIIサイズマーカーを使用して電気泳動(5-10v/cm)で分析する。100-300bp 分画をNA45ストリップ(シライヒヤー(Schleicher)及びシュエル(Schuell) )上で溶離し、次いでこれを1.5mlマイクロチューブ中に溶離液(1M NaCl,50mM アルギニン、pH9.0)を入れ、67℃で30−60分間培養する。溶離されたDNAをフエ ノール/クロロホルム抽出し、次いでエタノール2容量で沈殿させる。ペレット を、TE20 ml(0.01MトリスHCl,pH7.5,0.001M EDTA)中に再懸濁する。 B.発現ベクター中でクローニング ラムダgtllファージベクター(ヒュー)が、プロメガバイオテク(PromegaBio tec)(マジソン、WI)から得られる。このクローニングベクターは、ベータガ ラクトシダーゼ翻訳終結コドンかち上流に特有のEco RIクローニング部位53塩基 対を有する。コード配列5)から直接に又はcDNAの増幅後に与えられる、上記ゲ ノムフラグメントを、Eco RI-切断gtll 0.5−1.0mg、上記サイズのフラグメント 0.3−3ml、リゲージョン緩衝液(上記)0.5ml、リガーゼ(200単位)0.5ml及び5 mlまで蒸留水を混合してEco RI部位に導入する。混合物を14℃で一晩培養し、標 準法(Maniatis、第256頁-第268頁)に従って、試験内でパッケージングする。 パーケージングされたファージを使用し、ケビンムーア博士から得た大腸菌株 KM392に感染する。あるいはアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC # 37197)から得られる大腸菌株Y1090を使用することができる。感染された微生物 を塗布し、生じるコロニーをX-golの存在下に標準X-galサブスレートプラーク試 験法(Maniatis)を用いてベーターガラクトシダーゼ活性(クリアープラーク) の損失を調べる。ファージプラークの約50%は、ベーターガラクトシダーゼ酵素 活性の損失を示す(組換え体)。 C.HEV組換えたん白質のスクリーニング HEV回復期抗血清が、メキシコ、ボルネオ、パキスタン、ソマリア、及びビ ルマで記録されるHEV発生の間感染した患者から得られる。血清はET-NANB肝 炎の数人の他の患者のそれぞれから得た大便試料中でVLPsと免疫反応する。 上記のファージストック約104pfuを感染下大腸菌KM392細胞のローン(Lawn) を150mmプレート上に広げ、培養し、5−8時間、37℃で逆向きにする。(inven ted)ローンをニトロセルロースシートでおおい、プラークから紙へ発現したH EV組換えたん白質の転移を生じさせる。プレート及びフィルターを対応するプ レート及びフィルター位置に合わせるために表示する。 フィルターを2回、TBST緩衝液(10mMトリス、pH8.0、150mM NaCl、0.05%ト ウーン20)中で洗滌し、AIB(1%ゼラチンを有するTBST緩衝液)AIBで遮断し、 抗 血清(AIB中で1:50に希釈される、12−15ml/プレート)の添加後、一晩培養 する。シートを2回TBST中で洗滌し、次いで酵素-標識された抗-ヒト抗体と接触 させ、抗血清によって確認される抗原を含有するフィルター部位で標識された抗 体を付着する。最終洗滌の後、フィルターをアルカリ性ホスファターゼ緩衝液( 100mトリス、9.5、100mM NaCl、5mM MgCl2)5ml中でBCIP(4℃で保たれた50mg /mlストック液)16mlと混合されたNBT(4℃で保たれた50mg/mlストック液)33m lを含有する基質培地中に展開する。紫色が抗原産生のポイントを表わし、抗血 清によって確認される。 D.スクリーニングプレート化 前段階で測定された抗原産生域を約100-200pfuで82mmプレート上にくり返す。 5−8時間培養を開始し、NBT-BCIP展開による上記段階をHEV抗体と反応する ことができる抗原を分泌するファージをプラーク精製するためにくり返す。同定 されたプラークを取り出し、ファージ緩衝液中に溶離する(Maniatis、第443頁 )。 選択される2種のサブクローンは、上記配列の406.3-2及び406.4-2クローンで ある。これらの配列を、メキシコの大便から由来する増幅cDNAライブラリーから 単離する。この欄で示す技術を用いて、これらのクローンによって発現したポリ ペプチドを、世界じゅうから得られる、多くの種々のヒトHEV陽性血清に対す る免疫反応性についてテストする。下記表4中に示すように、8種の血清は、40 6.4-2によって発現するポリペプチドと免疫反応し、6種の血清は、406.3-2クロ ーンによって発現するポリペプチドと免疫反応する。 比較のために、表には種々のヒト血清と非構造ペプチドY2との反応性を示す。 血清のただ1つがこのクローンによって発現するポリペプチドと反応する。非免 疫反応性は、gtllベクターの正常発現生成物に対して見られない。 ここでY2は、HEVゲノムの第一開放型読み枠からのHEV配列157塩基対配 列によってコード化された配列を示す。 E.406.3-2抗原を産生 上記の406.3-2gtllプラスミドをEco RIで消化し、5'フラグメント末端でNco I部位を及び3'フラグメント末端でBam HI部位を加えるリンカーの存在下で遊 離されたHEVフラグメントを増幅する。増幅された材料をNco I及びBam HIで 消化し、製造業者の指示に従ってグルタチオン-S-トランスフエラーゼベクターp GEX発現ベクターのNco I/Bam HI中に挿入する。 pGEXプラスミドを使用して、大腸菌ホスト細胞を形質転換し、pGEXベクターで 十分に形質転換された細胞を、抗-HEVヒト抗血清を用いて免疫蛍光法によっ て同定する。 F.406.4-2抗原を産生 上記406.4-2gtllプラスミドをEco RIで有し消化し、遊離されたHEVフラグ メントをPCRによって増幅し、増幅されたフラグメントを上記pGEX発現ベクター のNco I/Bam HI部位に挿入する。406.4-2のペプチド発現は、406.3-2融合ペプチ ドに対して示した発現と類似する。 G.抗体を製造 上記の様に製造された、406.3-2(M)及び406.4-2(M)融合たん白質を使用し て、標準処理に従ってウサギを免疫し、HEV-特異性抗血清を発生する。 例4 抗3.2(M)抗体の中和活性 A.試験管内感染 第一ヒト肝細胞がHEV感染及び複製を許すことを証明するために、細胞を正 常ヒト血清(NIH正常ヒト血清プール)か又はHEV感染されたマカクザル大便 調製物(犬#73)にさらす。感染40日後に、全細胞RNAを逆転写(RT)/ポリメ ラーゼ鎖反応(PCR)試験のために調製し、第一ヒト肝細胞の感染能力をHEV で評価する。結果は、第一ヒト肝細胞がHEV増殖を援助できることを示す(図 4)。 定量PCRをあてはめられないが、HEV-感染された第一ヒト肝炎細胞から単離 された全細胞RNAは、32P-dCTP標識されたHEV-特異的プローブでのハイブリダ ゼーションの範囲によって予想される様に、高いレベルのウィルス複製を示す( レーン5)。正常ヒト血清プールで処理された第一ヒト肝細胞から単離された全 細胞RNA中にHEVの形跡はない。RT/PCR試験に関する陰性コントロールとして 、キャリヤーオーバー又は交差-汚染は検出されない(レーン1,2及び3)本 来のHEV-感染マカクザル大便(犬#73)をPT/PCR試験での陽性コントロール として使用する。 B.抗体の中和活性 抗3-2(M)、-4-2-(M)の中和活性を調べるために、夫々のウサギ抗血清を、 第一ヒト肝細胞のHEV感染用ウィルス接種原を用いて最終希釈1:20で使用す る。希釈された抗体及びウィルス接種原を培養細胞の感染前に一緒に培養する。 ウサギ抗-3-2-(M)は、HEV感染に対する中和活性の高いレベルを示す(図5 、レーン2対レーン1)。極めて僅かな中和活性は、ウサギ抗体-4-2(M)中に 観察される(レーン4対レーン3)。 この結果は、HEV3-2(M)、しかしHEN4-2(M)又は4-2(B)ではない組 換えたん白質がHEV感染に対する保護抗体を誘発することができる中和エピト ープをコード化することを示唆する。メキシコクローン3-2(M)及びビルマクロ ーン3-2(B)がアミノIIIレベルで90.5%相同性(ヌクレオチトルベルで79.8% )を共有するという事実は、3-2(M)に対して集められた抗体が感染の許された 細胞からメキシコ又はビルマ株のHEVを交差-中和又は交差-保護しなければな らないことを示唆する。 例5 HEVに対するワクチン保護 A.trpE-C2ペプチドの製造 HEVの1.8Kb3’末端部分に対応して2.3Kbインサートを含有するpBET1プラス ミドを記載する(Tam)。プラスミドをEco RIで消化し、約600bp及び1400bpのサ イズを有する2種のHEVフラグメントを遊離し、そのうち1210bpはコード化配 列を含有する。より大きいフラグメントを、電気泳動によって精製し、pATH10tr p E融合ベクターのEco RIに挿入する。このベクターはT.J.ケルナー(Koerner )等から得られる(Department of Microbiology,UCLA)。組換えベクターを使 用して、大腸菌DH52F'ホストを形質転換する。 pATHC2からの組換えtyp E-C2融合たん白質を、デークマン(Dieckmann)等の 処理の変化によって単離する。pATHC2プラスミドを含有する微生物を、トリプト ファンを含有する増殖培地中に一晩増殖する。一晩培養物2mlを新たな増殖培地 100ml中で培養し、37℃で更に4時間増殖する。微生物ブロースをトリプトファ ン不含の新たな増殖培地1lに加え、30℃で1.5時間増殖させる。インドールア クリルIII(1mg/ml)10mlを加え、増殖を更に5〜10時間30℃で続ける。微生物 細胞を遠心分離によって集める。細胞ペレットをリゾチームを含有する低張溶液 中に再懸濁し、微生物細胞壁を分解する。塩化ナトリウム及び界面活性剤NP-40 を、懸濁液に加え、細胞の高張溶菌を生じる。溶菌された細胞溶液を高波処理す る。溶液を遠心分離する。生じるたん白質ペレットをダウンス(dounce)ホモジ ナイザーを用いて10mMトリスpH7.5約50ml中に再懸濁する。溶液中のたん白質約7 5%はtrp E-C2たん白質から成る。 B.ワクチンの製造 加工ミヨウバンアジュバンドを、標準法に従って製造する。簡単に10%ミヨウ バン懸濁液を1N NaOHでpH6.6に滴定し、次いで4℃で一晩撹拌する。懸濁液を、 低速度の遠心分離によって澄明化し、上澄みをデカンテーションする。0.9%NaC l+1:20,000ホルマリンの少量を夫々のペレットに加え、渦によって懸濁する。 抗原ワクチン組成物を製造するために、上記のtrp E-C2たん白質を0.9% NaCl 溶液中で所望の最終抗原濃度に加える。 非-アジュバンド化された不溶性trpE-C2ペプチドをA欄に上述した様に製造す る。 C.ワクチン接種 8901,8903,8910,9902,及び9904で示される6匹のマカクザルを、ワチクン 接種調査に使用する。サル、8901,及び8902,8903、及び8910の4匹をミヨウバ ンアジュバンド化されたtrp E-C2組成物(C2ペプチドの約50μgを含有する)1.0 mlで静脈内注射して免疫化する。他の2匹の動物にはアジュバンドのみを与える 。1ケ月後、6匹の動物に最初と同様に二次ワクチン接種をする。 二次ワクチン接種4週間後、動物から得られた血清を、融合していないC2たん 白質を用いてウエスタンブロッティングによって抗-HEV抗体に関してテスト する。この段階で、動物8901及び8902の夫々に、非-アジュバント化、不活性trp -E-C2組成物(夫々約80μg trpE-C2ペプチドの全IV投薬量)によって三次ワクチ ン接種を行い、両方の動物はウエスタンブロッティングによって4週間後抗HEV を示す。 動物8901,8903,及び9002は、前もって高い感染を示す10%第三経路犬大便( ビルマ株)夫1mlでIVを攻撃する。動物80902,8910、及び9004は、証明された 感染性ヒト大便、単離物#14、1mlでIVを攻撃する。この大便は犬で厳しい疾患 を及びチンパンジーに穏やかな疾患を生じることが知られている。結果を上述し た図2A、2B、及び3A、及び3Bに示す。 本発明を特別な実施態様、方法、構成及び使用に関して記載したが、種々の変 更及び変換を本発明から離れずに行うことができることは当業者にとって明らか なことである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),CA,JP,KR (72)発明者 レイズ・グレゴリー・アール アメリカ合衆国、テキサス州、77380 ザ・ウッドランズ、レッド・セイブル・ポ イント、25 (72)発明者 ブラッドリー・ダニエル・ダブリュー アメリカ合衆国、ジョージア州、30244 ローレンスヴィル、ケリー・コート、2938 (72)発明者 トゥ・ジュニアー‐シン アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94014 デリー・シティ、ウインチェスタ ー・ストリート、430 (72)発明者 パーディ・マイケル・エイ アメリカ合衆国、ジョージア州、30345- 4224 アトランタ、ナンバーエス1、ノー スイースト・イクスプレスウェイ、エヌ・ イー、2825 (72)発明者 タム・アルバート・ダブリュー アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94122 サン・フランシスコ、テンス・ア ヴニュー、1871 (72)発明者 クラフチンスキー・クージストフ・ゼット アメリカ合衆国、ジョージア州、30084 タッカー、ワイルドフラワー・レイン、 4091

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.ヒトにE型肝炎ウィルス(HEV)に対する免疫を与えるのに使用されるワ クチン組成物に於て、薬理学的に容認されるキャリヤー中で、HEVゲノムの第 二開放型読み枠によってコード化されたカプシドたん白質のC-末端42アミノ酸 を含有するペプチドを有する、上記ワクチン組成物。 2.ペプチドは、次の配列の1つ: (i) 配列 ID No.13、 (ii) 配列 ID No.14及び (iii) 内部で一致している、配列 ID No.13と14の間の変異 によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲1記載の組成物。 3.ペプチドは、次の配列の1つ: (i) 配列 ID No.15、 (ii) 配列 ID No.16及び (iii) 内部で一致している、配列 ID No.15と16の間の変異 によって同定されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲1記載の組成物。 4.ペプチドは、次の配列の1つ: (i) 配列 ID No.17、 (ii) 配列 ID No.18及び (iii) 内部で一致している、配列 ID No.17と18の間の変異 によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲1記載の組成物。 5.ペプチドは、次の配列の1つ: (i) 配列 ID No.19、 (ii) 配列 ID No.20及び (iii) 内部で一致している、配列 ID No.19と20の間の変異 によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲1記載の組成物。 6.ペプチド抗原をキャリヤーたん白質に共有結合する、請求の範囲1記載の組 成物。 7.請求の範囲1記載のワクチン組成物を、筋肉内注射によって患者に投与する ことから成る、E型肝炎ウィルスのヒトへの感染を阻害する方法。 8.ワクチン組成物中のペプチドは、次の配列の1つ: (i) 配列 ID No.13、 (ii) 配列 ID No.14、 (iii) 内部で一致している、配列 ID No.13と14の間の変異、 (iv) 配列 ID No.15、 (v) 配列 ID No.16、 (vi) 内部で一致している、配列 ID No.15と16の間の変異、 (Vii) 配列 ID No.17、 (viii) 配列 ID No.18、 (ix) 内部で一致している、配列 ID No.17と18の間の変異、 (x) 配列 ID No.19、 (xi) 配列 ID No.20、及び (xii) 内部で一致している、配列 ID No.19と20の間の変異 によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲6記載の方法。 9.ワクチン組成物中のペプチドは、次の配列の1つ: (Vii) 配列 ID No.17、 (viii) 配列 ID No.18、及び (ix) 内部で一致している、配列 ID No.17と18の間の変異 によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲8記載の方法。 10.ワクチン中のペプチドは、配列 ID No.17によって同定されるアミノ酸配列 を含有する、請求の範囲9記載の方法。 11.E型肝炎ウィルス(HEV)感染を中和することができる抗体を含有するワ クチン組成物であって、その作用は培養された第一ヒト肝細胞のHEV感染を遮 断するその組成物の能力によって実証される、上記ワクチン組成物。 12.次の配列の1つ: (i) 配列 ID No.13、 (ii) 配列 ID No.14、 (iii) 内部で一致している、配列 ID No.13と14の間の変異、 (iv) 配列 ID No.15、 (v) 配列 ID No.16、 (vi) 内部で一致している、配列 ID No.15と16の間の変異、 (Vii) 配列 ID No.17、 (viii) 配列 ID No.18、 (ix) 内部で一致している、配列 ID No.17と18の間の変異、 (x) 配列 ID No.19、 (xi) 配列 ID No.20、及び (xii) 内部で一致している、配列 ID No.19と20の間の変異 を含有するペプチドと免疫反応する抗体を含有する、請求の範囲11記載のワク チン組成物。 13.組成物中の抗体は、 (i) 配列 ID No.13、 (ii) 配列 ID No.14、又は (iii) 内部で一致している、配列 ID No.13と14の間の変異、及び (iv) 配列 ID No.15、 (v) 配列 ID No.16、又は (vi) 内部で一致している、配列 ID No.15と16の間の変異 によって同定される配列を含有するペプチドと免疫反応する、請求の範囲12記 載の組成物。 14.患者に請求の範囲11記載のワクチン組成物を、腸管外注射によって投与する ことから成る、ヒトへのHEV感染を防ぐ又はこの感染を治療する方法。 15.抗体組成物は、次の配列の1つ: (vii) 配列 ID No.17、 (viii) 配列 ID No.18、及び (ix) 内部で一致している、配列 ID No.17と18の間の変異 によって同定されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して免疫反応する抗 体を含有する、請求の範囲14記載の方法。 16.抗体組成物は、次の配列の1つ: (i) 配列 ID No.13、 (ii) 配列 ID No.14、又は (iii) 内部で一致している、配列 ID No.13と14の間の変異、及び (iv) 配列 ID No.15、 (v) 配列 ID No.16、 (vi) 内部で一致している、配列 ID No.15と16の間の変異 を含有するペプチドと免疫反応する抗体を含有する、請求の範囲15記載の方法 。 17.組成物中の抗体は、配列 ID No.15によって同定される配列を含有するペプ チドと免疫反応する、請求の範囲16記載の方法。
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