JPH08509201A

JPH08509201A - Ｅ型肝炎ウィルスワクチン及びその接種方法

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Publication number: JPH08509201A
Application number: JP5512714A
Authority: JP
Inventors: レイズ・グレゴリー・アール; ブラッドリー・ダニエル・ダブリュー; トゥ・ジュニアー‐シン; パーディ・マイケル・エイ; タム・アルバート・ダブリュー; クラフチンスキー・クージストフ・ゼット
Original assignee: ジェネラブス・テクノロジーズ・インコーポレイテッド; ザ・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サーヴィスィズ
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-19
Publication date: 1996-10-01
Anticipated expiration: 2021-02-15
Also published as: DK0623169T3; WO1993014208A3; EP0623169B1; ES2196008T3; US20030143241A1; US5770689A; CA2125701A1; DE69332820D1; ATE236255T1; DE69332820T2; US6455492B1; EP0623169A1; JP3746291B2; JP2006036795A; WO1993014208A2

Abstract

(57)【要約】Ｅ型肝炎ウィルス感染を防ぐのに有効な抗原及び抗体ワクチン組成物を記載する。抗原組成物は、ＨＥＶゲノムの第二開放型読み枠（２）によってコード化されたカプシドたん白質のカルボキシル末端域に相当するペプチドを含有する、この組成物はワクチン接種後、ＨＥＶ感染を防ぐのに有効である抗体組成物を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｅ型肝炎ウィルスワクチン及びその接種方法本出願は、1990年4月5日出願された米国特許出願第07/505,888号明細書の一部継続出願であり、これは1989年10月13日に出願された米国特許出願第420,921号明細書の一部継続出願であり、これは1989年6月16日に出願された米国特許第367 ,486号明細書の一部継続出願であり、これは1989年4月11日に出願された米国特許第336,672号明細書の一部継続出願であり、これは1988年6月17日に出願された米国特許第208,997号明細書の一部継続出願である。これらのすべてを、参考資料として記載する。１．発明の分野本発明は、Ｅ型肝炎ウィルスとも呼ばれる腸内で伝達される非Ａ／非Ｂ型肝炎ウィルス剤に関連する抗原及び抗体ワクチン組成物及びワクチン接種方法に関する。２．参考資料アランカレ（Arankalle），V.A.，等、The Lancet，550（3月12日，1988）．ブラッドレイ（Bradley），D.W.，等、J Gen．Virol.，69:1 （1988）． Bradley，D.W．等、Proc．Nat．Acad．Sci.，米国，84:6277（198 7）．ディークマン（Dieckmann），C.L.，等、J．Biol．Chem．260:1513（1985）．エングレマン（Engleman），E.G.，等、eds.，“ヒトハイブリドーマ及びモノクロナール抗体”（Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies），Plenum Press，1985．グラベレ（Gravelle），C.R．等、J．Infedt．Diseases，131:167（1975）．ケーン（Kane），M.A.，等、JAMA，252:3140（1984）．クーロー（Khuroo），M.S.，Am．J．Med.，48:818（1980）． Khuroo，M.S.，等、Am．J．Med.，68:818（1983）．ランフォード（Lanford），R.E.，等、In Vitro Cellular and Devel Biol，25 （2）:174（1989）．ラリック（Larrick），J.W．及びFry，K.，“ヒト抗体ハイブリッド”（Huam Antibod 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．３．発明の背景腸内で伝達される非-Ａ／非-Ｂ型肝炎ウィルス剤（ET-NANB,，Ｅ型肝炎ウィルス又はＨＥＶとしても呼ばれる）は、アジア、アフリカ、ヨーロッパ、メキシコ、及びインド亜大陸に於ていくつもの伝染性及び散発性症例中で肝炎の原因として報告されている。ウィルスは接近した身体接触によっても広がるが、感染は大便で汚染された水も通常原因となる。ウィルスは慢性感染を生じないと考えられる。ＨＥＶに関するウィルス病因学は、ためられた大便分離物による自然な感染によって説明されている。免疫電子顕微鏡法（ＩＥＭ）試験によれば、感染者から得られた大便中に直径27−34nmを有するウィルス粒子が確認されている。ウィルス粒子は、地理的に異なる地域の感染者から得られた血清中で抗体と反応する。このことは単一ウィルス剤又はウィルスクラスが世界じゅうで観察されるＨＥＶ肝炎の大部分に関与していることを示唆する。抗体反応は、腸管外で伝達されるＮＡＮＢウィルス（肝炎Ｃウィルス又はＨＣＶとしても知られている）で感染されたヒトから得られた血清中にみられ、２つのＮＡＮＢ型の間で異なる特異性を示す。血清学的相違に加えて、２つのタイプのＮＡＮＢ感染は、明らかな臨床上の相違を示す。ＨＥＶは、特徴的に急性感染であり、しばしば熱及び関節炎、及び門脈炎症及び肝バイオプシー検体中に胆汁の停滞を伴う（アランカレ（Arankalle ）．この症状は通常６週間以内で解消する。これに反してＨＣＶは、症例の約50％で慢性感染を生じる。熱及び関節炎はめったに観察されず、そして炎症は、主に実質分布（Parenchymal distribution）を有する（クーロー（Khuroo）1980）。ＨＥＶの進行は、一般に健康人で一様でない、そして感染した人々の大部分はＨＣＶで観察される慢性後遺症を有することなく回復する。しかしこの疾病の１つの特有の伝染性特徴は、妊婦に観察される、著しく高い死亡数である。これは多くの研究でほぼ10−20％であると報告されている。この発見は、多くの伝染病学の研究で観察されているが、現在説明されていないままである。これがウィルス病原性を招くかどうかは、ウィルスと免疫抑制された（妊娠）ホストの相互間で死にいたる影響、又は感受性栄養失調母集団の衰弱させられた胎児の健康への影響によって明らかにされねばならない。２つのウィルス剤も霊長目動物のホスト罹病性に基づいて区別することができる。ＨＣＶでなくＨＥＶをマカクザル（Cynornolgus monokeys）に伝染することができる。ＨＣＶをＨＥＶよりもチンパンジーに容易に伝染することができる（ Bradley，1987）。初期の分野の特許出願に、ＨＥＶクローン及びＨＥＶゲノム配列全体の配列が記載されている。ＨＥＶクローンから、ＨＥＶゲノムコード化域から導かれる組換え型ペプチドを産出する。４．発明の要約１つの目的によれば、本発明はＥ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）に対してヒトを免疫化するためのペプチドワクチン組成物に関する。この組成物は、薬理学的に容認されるキャリヤー及びＨＥＶゲノムの第二開放型読み枠によってコード化された推定上のカプシドたん白質のＣ-末端42アミノ酸を含有するペプチドを含有する。ペプチドは、次の配列の１つによって同定されるアミノ酸配列を含有するのが好ましい：（i）配列ＩＤ No．13 （ii）配列ＩＤ No．14 （iii）内部で一致している、配列ＩＤ No．13と14の間の変異、（iv）配列ＩＤ No．15 （v）配列ＩＤ No．16 （vi）内部で一致している、配列ＩＤ No．15と16の間の変異、（vii）配列ＩＤ No．17 （viii）配列ＩＤ No．18、（ix）内部で一致している、配列ＩＤ No．17と18の間の変異、（x）配列ＩＤ No．19 （xl）配列ＩＤ No．20、及び（xii）内部で一致している、配列ＩＤ No．19と20の間の変異。この目的に関連して、本発明は腸管外注射、たとえば筋肉内又は静脈内注射によって上記ペプチドワクチン組成物を患者に投与することによって、ＨＥＶによるヒトへの感染を防ぐ方法に関する。他の目的によれば、Ｅ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）感染を中和するのに有効な抗体ワクチン組成物に関し、これは培養された第一ヒト肝細胞（Primary human he patocyte）のＨＥＶ感染を遮断するこの組成物の能力によって証明される。抗体組成物は、上記（i）-（xii）配列の１つを含有するペプチドと、及び好ましくは配列（i）-（iii）及び（iv-vi）に対応するペプチドと免疫反応する抗体を含有する。この目的に関連して、本発明は、腸管外注射によって上記抗体組成物を患者に投与して、ヒトへのＨＥＶ感染を予防又は治療する方法に関する。本発明のこれらの及び他の目的及び特徴は、次の本発明の詳細な説明が添付図面と共に説明される場合により十分に明らかとなる。図面の簡単な説明図１は、ＨＥＶゲノム、ゲノム中の開放型読み枠、及びペプチド406.3−2,ＧS 3、及びtrpＥ−Ｃ２に関する近似のコード域を示す；図２Ａ及び２Ｂは、trpＥ−Ｃ２ＨＥＶ抗原（２Ａ）又はミヨバンコントロール（２Ｂ）で前もって免疫化された動物中でビルマ-株ＨＥＶ大便サンプルでマカクザルに感染させた後に観察される血液ＡＬＴレベルを示す；図３Ａ及び３Ｂは、trpＥ−Ｃ２ＨＥＶ抗原（３Ａ）又はミヨバンコントロール（３Ｂ）で前もって免疫化された動物中でメキシコ-株ＨＥＶ大便サンプルでマカクザルに感染させた後に観察される血液ＡＬＴレベルを示す；図４は、非-感染ヒト第一肝細胞から得られたＰＣＲ-増幅されたＲＮＡのサザンブロット（レーン４）及び3時間ないし11日へ時間を増加してＨＥＶで感染させた第一肝細胞（レーン5-11）を示す；図５は、伝染性ウィルスを正常の前もって免疫されたウサギ血清と共に（レーン１及び３）又はＨＥＶ抗原ＨＥＶ406.3−2（Ｂ）（レーン２）及びＨＥＶ４06 .4−2（Ｍ）（レーン４）に対するウサギ抗血清と共に前もって培養するＨＥＶ- 感染したヒト第一肝細胞から得られたＰＣＲ-増幅されたＲＮＡのサザンブロットを示す；図６は、正常ヒト血清（レーン１）及び一連の異なるＨＥＶ-陽性免疫血清の１つ（レーン2-12）と共に前もって培養されたＨＥＶ-感染されたヒト第一肝細胞から得られたＰＣＲ-増幅されたＲＮＡのザザンブロットを示す；図７は、ＨＥＶのビルマ株（上部ライン）及びメキシコ株（下部ライン）に関するＨＥＶＯＲＦ２及びＯＲＦ３のヌクレオチド配列を示す；図８は、ＨＥＶのビルマ株（上部ライン）及びメキシコ株（下部ライン）に関するＯＲＦ３ペプチドのアミノ酸配列を示す；及び図９は、ＨＥＶのビルマ株（上部ライン）及びメキシコ株（下部ライン）に関するＯＲＦ２たん白質のアミノ酸配列を示す。発明の詳細な説明Ｉ定義下記の言葉は、ここで次の意味を有する：１．“腸内で伝達される非-Ａ／非Ｂ型肝炎ウィルス剤”、“Ｅ型肝炎ウィルス ”、又は“ＨＥＶ”は、ウィルスタイプ、又はウィルスクラスを意味し、これは（i）水中感染肝炎を生じ、（ii）マカクザルに伝染することができ、（iii）Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）及びＤ型肝炎ウィルスを血清学的に区別し、そして（iv）ＡＴＣＣ寄託 No.67717によって同定される大腸菌ＢＢ４中に運ばれるプラスミドpＴＺＫＦ1（ＥＴ1.1）中に挿入される1.33Kb cＤＮＡと相同である。２．２種の核酸フラグメントはManiatis等、前記文献、第320頁−第323頁に記載されたハイブリダゼーション条件下で相互にハイブリッド化することができる場合、これらは相同である。しかしながら、次の洗浄条件：２×ＳＣＣ、0.1 ％ＳＤＳ、室温で２回、夫々30分間；次いで２×ＳＣＣ、室温で２回、夫々10分間を使用して相同配列が、多くても約25−30％塩基対誤対合を含有することを同定することができる。相同核酸鎖は15−25％塩基対誤対合を含有するのが好ましく、さらに好ましくは5−15％塩基対誤対合を含有する。これらの相同性度合を、従来よく知られている様に、遺伝子ライブラリー（又は遺伝子材料の他の起源）からクローンの同定のためにより一層結合しない洗浄条件を使用することによって選択することができる。３．２種のアミノ酸配列又は２種のヌクレオチド（２つのヌクレオチド配列間の相同性に対する別の同定に於て）はかなり相同（この言葉はこの明細書中で使用されるのが好ましい）であり、それはこれらが、突然変異ギャップマトリックス及びギャップペナルティ−６又はそれ以上を有するプログラムALIGNを用いて共線スコア＞５（標準偏差単位で）を有する場合である。デイホフ（Dayhoff），M .O.，“Atlas of Protein Sequence and Structure”（1972）、第5巻、Nationa l Biochemical Researeh Foundation，第101頁−第110頁、及びこの巻の増補２、第１頁−第10頁参照。２種の配列（又はその一部、好ましくは長さが少なくとも30個のアミノ酸）は相同であるのがより好ましく、それはそのアミノ酸が上記 ALIGNプログラムを用いて最適に一列に並べられる時50％より大きい又は50％で同一である。４．ＤＮＡフラグメントが、ウィルス剤ゲノムの領域として同一又は実質上同一の塩基対配列を有する場合、これをＨＥＶウィルス剤から導く。５．たん白質が、ET-NANBウィルス剤から導かれるＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントの開放型読みの枠によってコード化される場合、ＨＥＶウィルス剤から導かれる。６．アミノ酸配列で約70％より大きく相同である２種又はそれ以上の公知のペプチド配列に於て、第三配列中の夫々のアミノ酸が公知配列中で少なくとも１種のアミノ酸と同一である場合、第三アミノ酸配列は公知配列と内部で一致している。 II．ＨＥＶ抗原ワクチン筋肉内注射（i.m.）によって、ＨＥＶ感染を防ぐのに有効なＨＥＶ抗原ワクチンを製造及び使用する方法を、この欄に記載する。Ａ．ＨＥＶ遺伝子配列ＨＥＶゲノムクローン、及び種々のＨＥＶ鎖に対する全ＨＥＶゲノムに対応する配列が、公表された方法（タム（Tam）、ヤーブロー（Yabough））に従って及び上記特許出願中に記載されている様に得られる。簡単に、公知のＨＥＶ感染を有するマカクザルの胆汁から単離されたＲＮＡをＣＤＮＡフラグメントとしてクローン化し、フラグメントライブラリーとなし、ライブラリーを判別ハイブリダゼーションによって感染及び非感染胆汁ソースから放射能標識されたＣＤＮＡＳに選別する。同定されたクローン中のＨＥＶフラグメントのクローン化領域の塩基対配列を標準配列法によって決定する。図１に関して、陽性-センス極性のほぼ7.5キロベース（Kb）一本鎖及びポリアルデニル化ＲＮＡゲノムを有するウィルスである。３種の開放型読み枠（ＯＲＦs）は、ＲＮＡ-指向ＲＮＡポリメラーゼのドメイン及びヘリカーゼでポリペプチドをコード化するＯＲＦ１、ウィルス推定上のカプシドたん白質をコード化するＯＲＦ２、及びＯＲＦ３としてＨＥＶに指定する。ＨＥＶのゲノム組織化は、その非構造遺伝子を５'末端で、そして構造遺伝子を３'末端で指定する。サイズがほぼ2.0Kbと3.7Kbの２種のサブゲノムポリアデニル化転写体を感染された肝臓中で検出し、その３'末端で7.7Kb- 完全な長さのゲノム転写体を用いて共終結（co-tarminated）する。ＨＥＶのゲノム組織化及び発現計画は、ＲＮＡウィルスの新しい分類又は恐らくカリシウィルス科内の別個の属に対する原型ヒト病原体であろうと示唆される。図７に示される遺伝及びペプチド配列は、ＨＥＶのビルマ（B）（上部ライン）及びメキシコ（M）株（下部ライン）のORF-2及びORF-3領域に対応する。中央のラインに示される塩基は、保存ヌクレオチドを示す。比較で使用される番号づけシステムはビルマ配列に基づく。ビルマ配列はSEQ ID No.１を有し、メキシコ配列はSEQ ID No.２を有する。ORF2に対応する領域は、夫々ビルマ株及びメキシコ株に対してSEQ ID No.３及び４を有する。406.3−2に対応する領域は、夫々ビルマ株及びメキシコ株に対してSEQ ID No.５及び６を有する。SG3に対応する領域は、夫々ビルマ株及びメキシコ株に対してSEQ ID No.７及び８を有する。C2に対応する領域は、夫々ビルマ株メキシコ株に対してSEQ ID No.９及び10を有する。 406.4−2に対応する領域は、夫々ビルマ株及びメキシコ株に対してSEQ ID No.11 及び12を有する。Ｂ．組換えペプチド抗原ＨＥＶのビルマ株及びメキシコ株の第三及び第二開放型読み枠に対応するアミノ酸配列を、夫々図８及び９に示す。示された配列リストは次の通りである： SEQ ID No.13及び14は、夫々ペプチド406.3−2（B）及び406.3−2（M）に対するアミノ酸配列に対応する。夫々のペプチドは、ORF2配列（図９）中に示されている様に、ORF2によってコード化されたカプシドたん白質のＣ-末端領域中の42 アミノ酸ペプチドである。 SEQ ID No.15及び16は、夫々ペプチドSG3（B）及びSG3（M）に対するアミノ酸配列に対応する。夫々のペプチドは、ＨＥＶカプシドのカルボキシル324アミノ酸を含有する。 SEQ ID No.17及び18は、夫々ペプチドC2（B）及びC2（M）に対するアミノ酸配列に対応する。夫々はＨＥＶたん白質のカルボキシルアミノ酸を含有する。 SEQ ID No.19及び20は、夫々ビルマ株及びメキシコ株ORF2によってコード化された完全な推定上のカプシドたん白質に対するアミノ酸配列に対応する。 SEQ ID No.21及び22は、夫々406.4−2（B）及び406.4−2（M）に対するアミノ酸配列に対応する（図８）。これらはORF3によってコード化された33アミノ酸配列である。ＨＥＶ抗原の種々の株から得られた上記特定化された配列と内部で一致している配列も予想される。これらは配列ID No.13、配列ID No.14及び配列ID No.13と 14の間の内部で一致する変異、配列ID No.15、配列ID No.16、及び配列ID No.15 と16の間の内部で一致する変異、配列ID No.17、配列ID No.18；及び配列ID No. 17と18の間の内部で一致する変異、配列ID No.19、配列ID No.20；配列ID No.19 と20の間の内部で一致する変異を含有する。たとえばＨＥＶ406.3−2抗原は、ビルマ（B）株及びメキシコ（M）株に対する下記の配列相同性を有する。配列比較中の単一ドットは、確認される高-確率又は“中立”アミノ酸置換を示す。空白は非-中立置換を示す。これらの２つの配列と内部で一致する配列は、次の配列の１つを有する：（式中X/Yはアミノ酸Ｘ又はアミノ酸Ｙのどちらかを示す。）ビルマ株及びメキシコ株に対する、長さ124アミノ酸のORF3アミノ酸配列は、1 24アミノ酸中で87.1％同一性を有する。オーバーラップの659アミノ酸を有する、ORF2アミノ酸配列は、659アミノ酸中で93.O％同一性を有する。 406.3−2（M）ペプチドを製造するために、例３に記載されたラムダgt11 406. 3−2をグルタチオンS-トランスフエラーゼベクターpGEXにサブクローン化し、例 3及びTam参考文献中に詳述した様に、3-2（M）抗原を発現する。 406.3−2（B）抗原を、pBET1プラスミドのＰＣＲ増幅による上記のビルマSEQI D No.5のＰＣＲ増幅によって製造することができる。このプラスミドは、ビルマ株ＨＥＶ配列に対するORF2及びORF3にわたる2.3Kb挿入を含有する。プラスミドをNco I部位を含有する５'プライマー及びBan HI部位を含有する３'プライマー（サカイ）を用いて、ＰＣＲ増幅によって増幅する。増幅されたフラグメントを pGEXベクターのNco I/Bam HI部位中に挿入し、例３に記載した様に大腸菌発現系中で発現させる。 SG3（B）ペプチドを、ＨＥＶ（B）の完全なORF2及びORF3領域を含有するgt10 ファージBET1クローンプラスミドを用いて、５'Eco RI-Nco I及び３'Bam HIリンカーでSEQ ID No.7配列を先ず増幅して製造する。増幅されたフラグメントを、製造業者の指示に従ってブルースクリプト^TMベクター（ストラタジーン、サンジェゴ、カルファルニア）のEco RI/Bam HI部位に挿入する。ベクター増殖及び収穫の後、クローン化挿入物をNco I及びBam HIの消化によって遊離し、ゲルを精製する。精製されたフラグメントを、pGEXベクターのNco I/Bam HI部位中に挿入し、例３に記載した様に大腸菌発現系中で発現させる。SG3（M）ペプチドを、SEQ ID No. 7の代わりにSEQ ID No.8を用いて、同様に製造することができる。 C2（B）ペプチドを、例５中に記載した様に製造する。簡単に、gt10ファージB ETIプラスミドにEco RIを取込み、SEQ ID No.10 C2配列を遊離し、このフラグメントをpATH10trpE融合ベクター中に挿入し、組換え融合たん白質が大腸菌ホスト中で発現する。 C2（M）ペプチドを、実質上上述の様に、Eco RI部位を含有する５'プライマー及びBam HI部位を含有する３'プライマーを用いて、SEQ ID No.10のＰＣＲ増幅によって製造することができる。増幅されたフラグメントをpGEXベクターのEco RI/Bam HI部位に挿入し、例３に記載した様に大腸菌発現系中で発現させる。カプシドたん白質（B）を、Nco I部位を含有する５'プライマー及びBam HI部位を含有する３'プライマーを用いてgt10BET1プラスミドから、SEQ ID No.3のＰＣＲ増幅によって上述の様に実質上製造する。増幅されたフラグメントをpGEXベクターのNco I/Bam HI部位に挿入し、例３に記載した様に、大腸菌発現系中で発現する。カプシドたん白質（M）を同様に製造する。 406.4−2（M）ペプチドを製造するために、例３に記載したラムダgt11 406.4 −2をグルタチオンS-トランスフェラーゼベクターpGEXにサブクローン化し、例３に詳述様に3−2（M）抗原を発現する。 406.4−2（B）抗原を、Nco I部位を含有する５'プライマー及びBam HI部位を含有する３'プライマーを用いてＰＣＲ増幅によって上記のビルマSEQ ID No.11 のＰＣＲ増幅によって製造することができる。増幅されたフラグメントをpGEXベクターのNco I/Bam HI部位に挿入し、例3に記載した様に大腸菌発現系中で発現する。選択された部分を含有する他のＨＥＶペプチド、好ましくは406.3−2配列を含有するＨＥＶカプシドたん白質のＣ-末端部分を、上記ＨＥＶゲノム-挿入プラスミドを用いて、上記及び例３及び５に詳述した様に、所望の配列の増幅及び適する発現ベクターへクローン化することで同様に製造することができることが分る。組換えペプチドを製造するのに使用されるコード化配列を、上記及び他の文献（Tam）で詳述されたクローン化ベクターから又は合成ヌクレオチド合成から、ＰＣＲスライス法を用いて導き、公知方法に従ってオリゴヌクレオチドフラグメントをヌクレオチド配列形成に参加させる。Ｃ．成熟カプシドたん白質ＨＥＶペプチド抗原は、霊長類の肝臓から、好ましくはヒト又はマカクザルの肝臓から得られた第一肝細胞中で増殖された精製ＨＥＶウィルスからも得られる。培養のための第一霊長類肝細胞を製造方法及び培養中に長期間肝-特異的機能を保存するのに有効な培養地条件を、下記例１でヒト肝細胞に関して詳述する。培養増殖の３日後、細胞に、例２に詳述する様に、ＨＥＶ-感染されたマカクザル大便プールの集団接種で感染させる（第４の経路）。細胞中に場殖するＨＥＶウィルスの存在及びレベルを、間接的な免疫蛍光法によって測定することができる。たとえば第一細胞がマカクザルである場合、その細胞をヒトＨＥＶ抗-血清で免疫反応させ、次いでウサギ抗-ヒトIgG抗体と免疫反応させる。あるいは、ＨＥＶウィルスを、例２に詳述する様に開始cDNA形成を伴う選択的増幅法、及びＰＣＲ増幅によるＨＥＶ cDNA配列のＰＣＲ増幅によって検出し、測定することができる。ウィルス粒子を、培養培地中でＨＥＶ感染されたヒト肝細胞から、限外濾過によって30％ショ糖クッションを介してウィルスをペレット化することによって単離することができる。所望ならばペレット状ウィルスを10 −40％ショ糖傾斜を介してゾーン遠心法によって更に精製することができる。可溶性培養-培地成分からウィルス粒子を分離する他の方法を使用することができる。たとえば澄明化された培養培地をサイズ-排除（size-exclusion）マトリックスに通し、サイズ排除にて可溶性成分を分離する。あるいは、澄明化された培養培地を、ウィルス粒子を保持するが溶質（非-粒子の）培養培地成分を通すことができる10−20nmの細孔サイズを有する限外濾過膜に通すことができる。本発明は、完全なＨＥＶカプシドたん白質中でグリコシル化及び他のポスト- 翻訳変化が可能である。ウィルス粒子からのカプシド単離を、標準法、たとえばイオン交換及びサイズ-排除クロマトグラフィー及びHPLC精製によって、ウィルス粒子を溶解媒体、たとえば非-イオン界面活性剤溶液中で溶解した後に実施することができる。たん白質を、たとえば抗-ＨＥＶ抗血清から精製された抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。Ｄ．ワクチン組成物の製造上記の組換え又は完全なＨＥＶカプシド又はカプシドフラグメントペプチド（ＨＥＶカプシド抗原）を、公知方法に従ってワクチン組成物に挿入し、注射される抗原の抗原性を増加する。ある組成物中、ＨＥＶ抗原をキャリヤーたん白質、たとえばキーホールカサガイヘモシアニンに共有結合し、溶液の形で又はアジュバントと組合せた形で注射する。その代わりにＨＥＶ抗原を融合たん白質の一部として製造する場合、たん白質の非-ＨＥＶ部分は、キャリヤーたん白質として役立つ。誘導された又は融合のたん白質を薬学的に容認されるキャリヤー、たとえば溶液又はアジュバント、たとえば加工ミヨウバン中に入れる。その代わりに遊離のペプチドそれ自体、たとえばＨＥＶ C2ペプチドをミヨウバン中で生成するか又はアジュバントなしで使用する。適するアジュバント化ワクチンは、約1mgペプチド抗原/mgミヨウバンの好ましい抗原濃度を有し、注射１本につきミヨウバン80mgを越えてはならない。 III．抗原ワクチン法他の目的で、本発明は、患者に本発明のワクチン組成物を腸管外注射、たとえば筋肉内又は静脈内注射によって投与することによってＥ型肝炎ウィルスによるヒトへの感染を防ぐ方法に関する。上記方法に使用するための好ましいワクチン組成物は、ＨＥＶ抗原が次の配列によって同定されるペプチド中に配列を含有するワクチン組成物である：配列ID No.13、配列ID No.14、及び配列ID No.13と14の間の内部で一致する変異；配列ID No.15；配列ID No.16；及び配列ID No.15と16の間の内部で一致する変異；配列ID No.17、配列ID No.18；及び配列ID No.17と18の間の内部で一致する変異、配列ID No.19、配列ID No.20；配列ID No.19と20の間の内部で一致する変異。抗原ワクチン組成物を一連の接種で、たとえば４週間間隔で２−３本の筋肉内注射で投与する。例７中に詳述される方法で、マカクザルに変換されたミヨウバンアジュバント中に生成された又はアジュバント不含のC2融合たん白質trpE-C2 （B）を筋肉内注射する。動物４匹に、１ケ月の間隔で２本の注射としてミヨウバンとtrpE-C2（B）抗原を与える。別の動物２匹に同じ接種スケジュールでミヨウバンのみを与える。動物のどれも二次注射後４週間で抗-ＨＥＶ血清抗体の存在を示さない。これは非融合C2ＨＥＶ抗原を用いるウエスタンブロッティングによって又は別の蛍光抗体遮断検定法によって判別される。この段階で、実験動物４匹のうちの２匹に非-アジュバント化された、不溶性t rpE-C2ペプチド抗原の三次接種を行う。４週間後、この動物は、ウエスタンブロットによって明らかなように抗ＨＥＶ抗体を示す。これらの結果は、trpE-C2抗原はミヨウバンの不在下に投与した時により一層効果的であり、恐らくこれはミヨウバン共-沈殿処理の間の抗原のミヨウバン-変性のためであろうと考えられる。最後の接種１ケ月後、動物をＨＥＶに対して高い感染性であることを前もって示す三次-排泄ヒト大便の静脈内注射によって又はメキシコ-株ヒトＨＥＶ大便サンプルによって攻撃する。接種後の選択された間隔で、動物から得られた血清を使用し、壊死及び肝細胞分解としてＡＬＴ（アラニントランスフエラーゼ）レベルを測定する。肝バイオプシーサンプルも直接免疫検定法（ＦＡ）によってＨＥＶ抗原の存在を検定する。図２ＡはTrpE-C2の三次投薬量が与えられた動物のうちの１匹でビルマ株ＨＥＶウィルスによって感染後の肝ＡＬＴレベル期間に於ける変化を示す。観察される様に、感染後、7¹/₂週間で増加するＡＬＴレベルの形跡はない。肝バイオプシーサンプルもＨＥＶ抗原の形跡を示さない。図２Ｂは、ビルマ株ＨＥＶで静脈内感染されたコントロール動物（ミヨウバンのみ注射）のＨＥＶ（B）感染後に測定されるＡＬＴレベルを示す。増加されたＡＬＴレベルは、ワクチン防御の不在下に期待される感染のレベルを示す。ＨＥＶ抗原は肝バイオプシーサンプル中にも検出される。類似の結果がtrpE-C2ミヨウバン組成物の２本の注射を与えるが、三次ミヨウバン不含ワクチン接種を与えない動物中に上記の様に観察される。図３Ａは、trpE-C2の三次投薬量を与えられた動物のうちの１匹中で、メキシコ株ＨＥＶウィルスで感染後、肝ＡＬＴレベルに於ける変化を示す。再び32日目に増加するＡＬＴレベルの形跡はない（32日目にこれに関係なく動物が死亡する。）肝バイオプシーもＨＥＶの最小の形跡を示す。この結果は、あるＨＥＶ株に対して向けられる抗原ワクチンが、他のＨＥＶ株に対して防御免疫を与えることができるを実証する。図３Ｂは、ＨＥＶのメキシコ株で静脈内感染されたコントロール動物（ミヨウバンだけの注射）のＨＥＶ感染後に測定されるＡＬＴレベルを示す。高いレベルの感染（ＡＬＴ活性）が観察される。同様な結果が、trpE-C2 ミヨウバン組成物の２本の注射を与えるが、三次ミヨウバン不含ワクチン接種を与えない動物中に上述の様に観察される。報告されたワクチン接種の詳細を、例５中に記載する。 IV．ワクチン組成物もう１つの目的で、本発明は、中和ＨＥＶ感染に有効な抗体ワクチン組成物に関し、これは培養されたＨＥＶ-感染性第一肝細胞中でＨＥＶ感染を遮断するその組成物の能力によって証明される。２つの典型的な第一細胞はヒト及びマカクザル細胞である。組成物中の抗体は、配列の１つ：配列ID No.13；配列ID No.14、及び配列ID N o.13と14の間の内部で一致する変異；を含有するペプチドと免疫反応するのが好ましい。下記の様に、406.3−2抗原（M）に対して製造された抗体は、ヒト第一肝細胞中でＨＥＶ感染を遮断するのに有効である。 SEQ ID No.13又は14のカルボキシ末端を含有するより大きいカプシドペプチド又はたん白質と免疫反応する抗体も好ましい。これらは、特に配列ID No.15；配列ID No1；及び配列ID No.15と16の間の内部で一致する変異を含有する。下記の様にヒト第一肝細胞のＨＥＶ感染を防ぐのに有効であるヒト血清はこれらの配列で規定されたSG3ペプチドと免疫反応する。配列ID No.17、配列ID No.18；及び配列ID No.17と18の間の内部で一致する変異によって規定されるtrpE-C2と免疫反応する抗体も好ましく、配列ID No.19、配列ID No.20；配列ID No.19と20の間の内部で一致する変異によって規定されるような完全なカプシドたん白質と免疫反応する抗体も同様である。たとえばウサギ又はヤギの様な適する動物を上記の特定化されたＨＥＶ抗原の１つで免疫化することによって製造される抗血清から、抗体がポリクロナール抗体として得られる。あるいは、ポリクロナール抗体がヒト又は他の霊長目動物ＨＥＶ抗血清から得られる。抗血清から得られる抗ＨＥＶポリクロナール抗体を標準法に従って、たとえば部分的に精製された血清IgG分画を得るのによく行われる様に精製する又は一部精製する（たとえばAntibodies：A Iaboratory Manua l，1988，コールドスプリングスハーバー研究所参照）。あるいは抗-ＨＥＶ抗体を、上記カプシド抗原の１つで誘導された固形支持体を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製された形で得られる。他の実施態様に於て、抗体はハイブリドーマセルラインによって分泌されたモノクロナール抗体である。ハイブリドーマセルラインを製造するために、免疫された動物、好ましくはマウス又はヒトからのリンパ球を、確立した方法（たとえばエンゲルマン、ゾラ）に従って適する不滅化融合パートナーで不滅化する。あるいはヒトモノクロナール抗体を、培養されたリンパ球から得られた軽い及び重いヒト抗-ＨＥＶIgG遺伝子を、適する発現ベクターに挿入する、組換え法によって産生し、これを使用して適するホストを共-感染（co-infect）する。ヒトリンパ球から軽い及び重いヒト抗-ＨＥＶIgGを得る及びクローン化する方法、及び共-感染されたホスト細胞中でクローン化遺伝子を発現させる方法は、公知である（larrick）。抗-ＨＥＶ抗体を、一般に筋肉内、皮下又は静脈内経路による、適する注射用溶液に処方し、ワクチン組成物となす。Ｂ．抗体-406.3−2抗体の中和活性上述の様に製造された抗体の中和可能性を実証するために、406.3−2（B）抗原に対する抗体を、培養されたヒト第一肝細胞中でＨＥＶ感染を遮断するその能力に関してテストする。第一肝細胞を、公表された処理に従って及び例１に詳述する様に、製造し、培養する。特有の培養条件は、特殊な肝細胞機能を損失することなく培養の間長期の細胞増殖を可能にし、これは例１に記載する様に最初の培養後数ケ月までに肝 -特異性たん白質、たとえば血清アルブミンを産生し、分泌する、細胞の連続能力によって明らかである。培養された細胞に、正常のヒト血清又はマカクザル大便調製物を接種する。細胞中でＨＥＶ感染を実証するために一組のＨＥＶＲＮＡの存在に関する感染後１−11日目で一組の逆転写酵素を用いてcDNA'sを生じること及びポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によってＨＥＶ-特異cDNAを増幅することを調べる。増幅されたフラグメントは、長さ551塩基対を有すると予想される。図４は、増幅されたＨＥＶ配列を検出するためのＨＥＶ ORF2放射能標識されたプローブを用いて増幅された材料のサザンブロットを示す。結果を図４中に示す。レーン１−３はコントロールである。レーン４は正常（非-感染）血清を接種された細胞から得られる全部増幅された材料である。レーン５−11は夫々犬大便サンプルで感染３時間後、１日後、３日後、５日後、７日後、11日後の増幅された材料を示す。結果は、ＨＥＶが最初の感染１日後以内にヒト第一肝細胞中で増殖することを示す（レーン６）。５日後感染までＨＥＶ複製のレベルで時間-依存増加かあり（レーン７及び８）、これはその後減少する（レーン９−11）。非感染第一細胞から単離された全細胞ＲＮＡ中にＨＥＶの形跡はない。抗原ペプチド406.3−2（B）及び406.4−2（M）及び406.4−2（B）に対するウサギ抗血清を製造する。上述の様に、406.3−2ペプチドは、ＨＥＶカプシドたん白質のカルボキシ末端域から、及び406.4−2ペプチドはＨＥＶ ORF3によってコード化されたペプチドから由来する。ＨＥＶ抗原の１種に対する前免疫ウサギ血清又はウサギ抗血清を犬大便接種原に１：20希釈で加え、抗体をウィルス調製物と共に培養する。次いで抗体-処理された大便サンプルを使用して、ヒト第一肝細胞を感染する。14日後、細胞をＨＥＶ感染に関して、RT/PCR/サザンブロット法によって調べるが、448塩基対増幅されたフラグメントを生じると予想されるプライマーを使用する。結果を図５に示す。この図４レーン中で１及び３は、ヒト前免疫血清と共に前もって培養された犬大便サンプルで感染された細胞から得られた増幅ＲＮＡを示す。図中の448塩基対バンドはＨＥＶ感染を示す。第二レーンは、抗-406.3−2（ B）ウサギ抗血清にさらされた細胞に相当し、ＨＥＶ感染のほぼ完全な不在を示す。レーン４は、抗406.4−2（M）ウサギ抗血清にさらされた細胞からの、増幅された材料を示す。抗体は、ＨＥＶ感染に対してほとんど又は全く防御効果を示さない。Ｃ．中和ＨＥＶ抗血清本発明に従って、中和抗体の他の起源は、ヒトＨＥＶ抗血清であり、これは上記406.3−2抗原及びSG3抗原への免疫特異反応によって特徴づけられる。ヒトＨＥＶ抗血清の中和抗体特徴を調べるために、ヒト抗血清のパネルを、実質的に上述した様に培養された肝細胞のＨＥＶ感染を遮断する能力に関してテストする。10種のＨＥＶ陽性ヒト抗血清を下記表１に示し、この血清はインド、パキスタン、及びメキシコでＨＥＶ感染した患者から由来する。簡単に、培養された細胞を、正常のプール血清又はＨＥＶ抗血清で処理されたザメル（Samel）（ビルマ株）で処理されたＨＥＶ-陽性犬大便にさらし、ＰＣＲ増幅及びＨＥＶ放射能標識されたプローブを用いるサザンブロットによってＨＥＶ-特異核酸配列の存在についてテストする。サザンブロットを図６中に示す。1 2種の血清サンプルのレーン番号を下記表１中に括弧で示す。図６から及び表１から明らかな様に、中和ＨＥＶに有効な抗血清は、インド10（レーン２）、インド18（レーン13）、インド210（レーン15）、インド265（レーン８）、パキスタン143（レーン９）、及びパキスタン336（レーン10）である。しかし他のヒト血清は、ＨＥＶ感染を中和するその能力で極めて小さい効果（レーン11、メキシコ 387C）又は全く効果のない（レーン４、インド29；レーン６、インド242；レーン７、インド259；レーン12、メキシコ387C〔IgG〕）ことを示す。陰性コントロールとして、正常ヒト血清プールは、全くＨＥＶに対する中和活性を示さない。数種のヒト抗血清を上述の406.3−3（M）、406.4−2（M）及び406.4−2（B）に対するそのIgG及びIgM免疫反応性に関してテストする。IgM抗体との反応は早期-相感染しがちであり、一方IgGとの免疫反応性は、感染の早期及び後期段階両方を示す。反応をELISAテストで測定する。その結果を表２Ａ及び２Ｂ中に示す。そこで“＋”表示は、陽性反応を示す；表中の番号は示される特異組換えたん白質に対するIgGの希釈力価を示す。表からのデータは、中和可能なこれらのヒト抗血清がIgG ELISAによってＨＥＶ3−2（M）エピトープに対する抗体に陽性であることを示す。インド29は、ＨＥＶ3−2（M）に対するIgGに陽性でなく、ＨＥＶ感染を中和しない（レーン４）。インド242及びインド259はＨＥＶ406.3−2（M）に対するIgGに陽性であるが、これらは早期段階ＨＥＶ感染を示すＨＥＶ406.3−2（M）に対するIgMにも陽性である。したがってこれらの特別なサンプル中で、誘発されたＨＥＶ3−2（M）に対するIg（G）のレベルは、第一ヒト肝細胞のＨＥＶ感染を中和するのに十分である。ＨＥＶ3−2エピトープに対する免疫反応性とＨＥＶ-感染したヒトの血清の中和活性との関連を更に調べるために、ウエスタンブロッテイングをこれらのヒト血清サンプル上で行い、表３に示される結果が得られる。この表中から明らかな様に、インド18、インド265及びＨＥＶ感染を中和することが前もって示される、特にインド210は、ウエスタンブロッティング分析でＨＥＶ406.3−2（M）に対して免疫反応性であり、その免疫反応性はその中和抗体と関連する。ＨＥＶ406.3−2（M）へのこれらの血清の特異的免疫反応性に関する確認として、ウエスタン分析は、ＨＥＶビルマ株のORF-2の329カルボキシ-末端アミノ酸（ヌクレオチド6146-7129）を含有する、融合たん白質SG3（B）に対して行われる。ＨＥＶ406.3−2（M）及びSG3〔又はＨＥＶ406.3−2（B）〕に対するこれらの血清の免疫反応性は完全につり合う（表３）。かくて中和抗体の適する起源を提供するヒトＨＥＶ抗血清は、（a）406.3− 2抗原、及び（b）SG3抗原との免疫反応性によって特徴づけられるものであり、両方の抗原はウエスタンブロット中での免疫反応性によって明らかである。すなわちそこではこれらの抗原がさらされて得られる立体配置中にあるからである。更に一般的に、好ましい本発明のワクチン組成物は、406.3-2抗原性ペプチド及びSG3抗原性ペプチドに対する免疫特異性抗体を含有する。ワクチン組成物は、腸管外注射のための適するキャリヤー中に免疫特異的抗体を含有する。抗体ワクチン組成物を、本発明の他の目的に従ってヒトに於けるＨＥＶ感染の予防又は治療に使用する。本発明の種々の方法及び組成物を示す例を以下に示すが、これによって本発明は限定されない。材料酵素：DNA_seＩ及びアルカリホスファターゼがベーリンガーマンハイムバイオケミカルス（BMB，インディアナポリス、IN）から得られる。E_co RI、E_co RIメチラーゼ、DNAリガーゼ、及びポリメラーゼＩがニューイングランドバイオラボス（NEB，ベベリーMA）；RN_aseAがシグマ（セントルイス、MO）から得られる。他の試剤；ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、S-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファターゼ（BCIP）、S-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-B-D-ガラクトピラノシド（Xgal）及びイソプロピルB-D-チオガラクトピラノサイド（IPTG）がシグマから得られる。 CDNA合成キット及び無作為なプライミング標識キットは、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルス（BMB，インディアナポリス，IN）から入手できる。例１ヒト第一肝細胞の培養Ａ．肝細胞の単離肝細胞を、スタンフォード大学医療センターから得られたヒト肝臓から単離する。肝臓をその場で潅流するか又は研究所で潅流用くさびとして摘出する。最初の潅流を10分間、60m/分で、10mMHEPES（pH7.4）及び0.5mM〔エチレンビス（オキシエチレンニトリロ〕-テトラ酢酸で補足されたCa⁺⁺-，Mg⁺⁺-不含ハンクスのバランスのとれた塩溶液を用いて行う。潅流を更に20分間、10mM HEPES（pH7.4 ）及び100U/mlコラゲナーゼ（タイプＩ、シグマケミカル社、セントルイス、 MO）で補足されたウィリアムス培地E（WME）を用いて続ける。潅流後、肝臓のうを微細な鉗子を用いて除き、肝細胞をコラゲナーゼ溶液中で穏やかに振とうして除去する。肝細胞懸濁液を、数枚のカーゼ層を通して濾過し、10％胎児ウシ血清（FBS）を含有するWMWの等容量と混合する。肝細胞を、50Xgで５分間遠心分離して沈降させ、５％ＦＢＳを含有するＷＭＥ中に再懸濁する。肝細胞を沈降させ、更に２回同一方法で同一方法で再懸濁する。最終細胞調製物を、トリパンブルーを用いて生存率を調べる前に数枚のカーゼ層を通じて濾過する。細胞に、コラーゲンで前- 被覆された60mmプリマリア（Primaria）プレート（ファルコン）につき密度2×10⁶細胞で塗布する（コラボラティブリサーチ）。培養を37℃で５％CO₂中で３時間培養し、付着させ、その後毎48時間ごと培地を血清不含処方に変える。血清一不含処方は、上記の様に増殖ファクター、ホルモン、10mM HEPES（pH7.4）、100μg/mlグルタミシンで補足されたWME-ベース培地である（ランホード）。Ｂ．肝臓-特異性たん白質の検出ヒト肝細胞培養を、種々の時間の間血清不含培地中で保ち、〔³⁵S〕-メチオニンで24時間標識する。培地を１mM PMSF、１mM EDTA及び１％NP40を含有するように調整する。種々のプラズマたん白質に特異的な抗体は、たん白質A-アガロースビーズに結合し、ビーズをPBSで洗滌し、標識された培地のアリコートを、抗体- ビーズサンプレックスと共に16時間、４℃で培養する。ビーズを１％NP40を含有する緩衝液で３回洗滌し、免疫沈殿したたん白質を２％SDSおよび２％2-メルカプトエタノールを含有するゲル電気泳動サンプルで溶離する。サンプルを傾斜SD S-PAGE（4ないし15％）及びオートラジオグラフィーによって分析する。例２第一ヒト肝細胞の試験管内ＨＥＶ感染Ａ．ヒト肝細胞のＨＥＶ感染ＨＥＶ-感染されたマカクザル＃73大便プール（第四経路）を、第一ヒト肝細胞の感染用接種原として使用する。接種原の種々の量を血清不含培地（SFM）１m l中に希釈し、３時間の培養期間で培養液に加える。次いでこの溶液を新鮮なSFM 2mlで補足し、混合物全体を一晩培養する。次の日、細胞単層を、３回WME（10Mm HEP ES，pH7.4）で洗滌し、その後２日間隔で変わる新鮮なSFMに変える。Ｂ．免疫蛍光染色法第一マカクザル肝細胞を単離し、上記の様にコラーゲン被覆されたカバーリップ（Coverlip）で組織培養プレート中に塗布する。カバーリップ上の細胞に、ＨＥＶ-感染されたマカクザル＃73大便プールか又はＮＩＨ正常ヒト血清で、最初の塗布３日後に感染させる。感染を２時間続ける。カバーリップ上の細胞を、90％アセトン中で室温で１分間固定する。次いでカバーリップを空気乾燥する。カバーリップを、１時間PBS中の１％カギ血清中で遮断し、PBSで３回洗滌し、ＨＥＶ組換えたん白質1L6，4−2及び6-1-4に対するウサギ抗血清の混合物と室温で３時間培養する。カバーリップを再びPBSで3回洗滌し、PBS-1％ヤギ血清中に希釈されたフルオレセインイソチオシアナート複合（FITC）ヤギ抗-ウサギIgG（H＋L）（Zymed）と30分間反応させる。カバーリップをPBSで３回洗滌し、空気乾燥した後、FITCグリセロール溶液で量を増加して、蛍光顕微鏡下に調べる。Ｃ．逆転写／ポリメラーゼ鎖反応（RT/PCR）第一マカクザル肝細胞のＨＥＶ感染をRT/PCR検定法によって評価する。cDNA合成及びPCRに対するプライマーは、完全な長さのＨＥＶ cDNAのヌクレオチド配列に基づく（A．タム等）。プライマーＨＥＶ3.2SF1（nt 6578-6597）及びＨＥＶ3 .2SF2（nt 6650-6668）は、ウィルスゲノムのORF2域からセンス極性であり、そしてＨＥＶ3.2SR1（nt 7108-7127）及びＨＥＶ3.2SR2（nt 7078-7097）は領域内でアンチセンスプライマーである。シエカー（Sherker）等の方法に従って一工程グアニジウム処理又はHE−感染上澄みを用いてＨＥＶ-感染細胞から全細胞ＲＮＡの抽出後、ＲＮＡサンプルのアリコートを、95℃で５分間熱−変性し、室温で５分間、次いで42℃で60分間逆転写を行う。この際RNasin（プロメガ）20単位、夫々デオキシリボヌチレオチド１mM（パーキン-エルマーセトス）の濃度で１ ×ＰＣＲ緩衝液（パーキン-エルマーセトス）、及びＨＥ3.2SR1プライマー2.5μ Mを含有する反応容量20μl中に、反応あたり200単位のMMLV- 逆転写酵素（ＢＲＬ）及びＨＥＶ3.2SR1プライマー2.5μMを使用する。次いで反応混合物を、95℃ で５分間熱処理し、MMLV-逆転写酵素を変性する。 cDNA合成生成物10マイクロリットルを、ＰＣＲのために50μlの最終容量でＨＥＶ3.2SF1プライマー0.5μM、Taq DNAポリメラーゼ1.25単位（Ampli Taq，パーキン-エルマーセトス）、及び１×PCR緩衝液と共に使用し、鉱油50μlで薄くおおい、PCR40サイクルをパーキン‐エルマーサーモサイクラー中で行う（95℃×１分；52℃×２分；72℃×30秒）。第一ランドRCR生成物10マイクロリットルを、内部PCRプライマーＨＥＶ3.2SF2及びＨＥＶ3.2SR2を含有する全容量59μl中でもう40サイクルの組み込まれたPCRを行う（95℃×１分；55℃×２分；72℃×30秒）。第一及び第二-ラウンドRCR生成物をアガロース電気泳動に付し、エチジウムブロマイド染色及びUV光線下に写真をとる。その結果を図４に示し、上述の様に表わされる。サザン転移を行い、フィルターをプライマー（nt6782-6997）を除いて〔³²P-dCTP〕‐標識された内部試料HEVORF2-7でバイブリット化し、オートラジオグラフィーを行う。例３ 406.3-3及び406.4-2抗原の製造 TZKF１プラスミド（ET1.1）、ATCC寄託番号67717をEco RIで消化し、1.33KbＨＥＶ挿入を遊離し、これを線状プラスミドからゲル電気泳動によって精製する。精製フラグメントを、標準消化緩衝液（0.5MトリスHCl，pH7.5；1mg/ml BSA；10 mM MnCl2）中に懸濁し、約１mg/mlの濃度となし、DNAseＩを用いて室温で約５分間消化する。この反応条件は、先立っての換算法から決定される。この方法で、主に100-300塩基対フラグメントを製造するのに必要な培養時間が決定される。材料をエタノール沈殿の前にフエノール／クロロホルムで抽出する。消化混合物中のフラグメントを二本鎖末端化し、EcoRエリンカーと連結する。生じるフラグメントを1.2％アガロースゲル上でPhi X 174/Hae III及びラムダ/H ind IIIサイズマーカーを使用して電気泳動（5-10v/cm）で分析する。100-300bp 分画をNA45ストリップ（シライヒヤー（Schleicher）及びシュエル（Schuell））上で溶離し、次いでこれを1.5mlマイクロチューブ中に溶離液（1M NaCl，50mM アルギニン、pH9.0）を入れ、67℃で30−60分間培養する。溶離されたDNAをフエノール／クロロホルム抽出し、次いでエタノール２容量で沈殿させる。ペレットを、TE20 ml（0.01MトリスHCl，pH7.5，0.001M EDTA）中に再懸濁する。Ｂ．発現ベクター中でクローニングラムダgtllファージベクター（ヒュー）が、プロメガバイオテク（PromegaBio tec）（マジソン、WI）から得られる。このクローニングベクターは、ベータガラクトシダーゼ翻訳終結コドンかち上流に特有のEco RIクローニング部位53塩基対を有する。コード配列５）から直接に又はcDNAの増幅後に与えられる、上記ゲノムフラグメントを、Eco RI-切断gtll 0.5−1.0mg、上記サイズのフラグメント 0.3−3ml、リゲージョン緩衝液（上記）0.5ml、リガーゼ（200単位）0.5ml及び5 mlまで蒸留水を混合してEco RI部位に導入する。混合物を14℃で一晩培養し、標準法（Maniatis、第256頁-第268頁）に従って、試験内でパッケージングする。パーケージングされたファージを使用し、ケビンムーア博士から得た大腸菌株 KM392に感染する。あるいはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC ＃ 37197）から得られる大腸菌株Y1090を使用することができる。感染された微生物を塗布し、生じるコロニーをX-golの存在下に標準X-galサブスレートプラーク試験法（Maniatis）を用いてベーターガラクトシダーゼ活性（クリアープラーク）の損失を調べる。ファージプラークの約50％は、ベーターガラクトシダーゼ酵素活性の損失を示す（組換え体）。Ｃ．ＨＥＶ組換えたん白質のスクリーニングＨＥＶ回復期抗血清が、メキシコ、ボルネオ、パキスタン、ソマリア、及びビルマで記録されるＨＥＶ発生の間感染した患者から得られる。血清はET-NANB肝炎の数人の他の患者のそれぞれから得た大便試料中でVLPsと免疫反応する。上記のファージストック約104pfuを感染下大腸菌KM392細胞のローン（Lawn）を150mmプレート上に広げ、培養し、５−８時間、37℃で逆向きにする。（inven ted）ローンをニトロセルロースシートでおおい、プラークから紙へ発現したＨＥＶ組換えたん白質の転移を生じさせる。プレート及びフィルターを対応するプレート及びフィルター位置に合わせるために表示する。フィルターを２回、TBST緩衝液（10mMトリス、pH8.0、150mM NaCl、0.05％トウーン20）中で洗滌し、AIB（１％ゼラチンを有するTBST緩衝液）AIBで遮断し、抗血清（AIB中で１：50に希釈される、12−15ml／プレート）の添加後、一晩培養する。シートを２回TBST中で洗滌し、次いで酵素-標識された抗-ヒト抗体と接触させ、抗血清によって確認される抗原を含有するフィルター部位で標識された抗体を付着する。最終洗滌の後、フィルターをアルカリ性ホスファターゼ緩衝液（ 100mトリス、9.5、100mM NaCl、5mM MgCl2）５ml中でBCIP（４℃で保たれた50mg /mlストック液）16mlと混合されたNBT（４℃で保たれた50mg/mlストック液）33m lを含有する基質培地中に展開する。紫色が抗原産生のポイントを表わし、抗血清によって確認される。Ｄ．スクリーニングプレート化前段階で測定された抗原産生域を約100-200pfuで82mmプレート上にくり返す。５−８時間培養を開始し、NBT-BCIP展開による上記段階をＨＥＶ抗体と反応することができる抗原を分泌するファージをプラーク精製するためにくり返す。同定されたプラークを取り出し、ファージ緩衝液中に溶離する（Maniatis、第443頁）。選択される２種のサブクローンは、上記配列の406.3-2及び406.4-2クローンである。これらの配列を、メキシコの大便から由来する増幅cDNAライブラリーから単離する。この欄で示す技術を用いて、これらのクローンによって発現したポリペプチドを、世界じゅうから得られる、多くの種々のヒトＨＥＶ陽性血清に対する免疫反応性についてテストする。下記表４中に示すように、８種の血清は、40 6.4-2によって発現するポリペプチドと免疫反応し、６種の血清は、406.3-2クローンによって発現するポリペプチドと免疫反応する。比較のために、表には種々のヒト血清と非構造ペプチドY2との反応性を示す。血清のただ１つがこのクローンによって発現するポリペプチドと反応する。非免疫反応性は、gtllベクターの正常発現生成物に対して見られない。ここでY2は、ＨＥＶゲノムの第一開放型読み枠からのＨＥＶ配列157塩基対配列によってコード化された配列を示す。Ｅ．406.3-2抗原を産生上記の406.3-2gtllプラスミドをEco RIで消化し、５'フラグメント末端でNco Ｉ部位を及び３'フラグメント末端でBam HI部位を加えるリンカーの存在下で遊離されたＨＥＶフラグメントを増幅する。増幅された材料をNco I及びBam HIで消化し、製造業者の指示に従ってグルタチオン-S-トランスフエラーゼベクターp GEX発現ベクターのNco I/Bam HI中に挿入する。 pGEXプラスミドを使用して、大腸菌ホスト細胞を形質転換し、pGEXベクターで十分に形質転換された細胞を、抗-ＨＥＶヒト抗血清を用いて免疫蛍光法によって同定する。Ｆ．406.4-2抗原を産生上記406.4-2gtllプラスミドをEco RIで有し消化し、遊離されたＨＥＶフラグメントをPCRによって増幅し、増幅されたフラグメントを上記pGEX発現ベクターのNco I/Bam HI部位に挿入する。406.4-2のペプチド発現は、406.3-2融合ペプチドに対して示した発現と類似する。Ｇ．抗体を製造上記の様に製造された、406.3-2（M）及び406.4-2（M）融合たん白質を使用して、標準処理に従ってウサギを免疫し、ＨＥＶ-特異性抗血清を発生する。例４抗3.2（M）抗体の中和活性Ａ．試験管内感染第一ヒト肝細胞がＨＥＶ感染及び複製を許すことを証明するために、細胞を正常ヒト血清（NIH正常ヒト血清プール）か又はＨＥＶ感染されたマカクザル大便調製物（犬＃73）にさらす。感染40日後に、全細胞RNAを逆転写（RT）／ポリメラーゼ鎖反応（PCR）試験のために調製し、第一ヒト肝細胞の感染能力をＨＥＶで評価する。結果は、第一ヒト肝細胞がＨＥＶ増殖を援助できることを示す（図４）。定量PCRをあてはめられないが、ＨＥＶ-感染された第一ヒト肝炎細胞から単離された全細胞RNAは、³²P-dCTP標識されたＨＥＶ-特異的プローブでのハイブリダゼーションの範囲によって予想される様に、高いレベルのウィルス複製を示す（レーン５）。正常ヒト血清プールで処理された第一ヒト肝細胞から単離された全細胞RNA中にＨＥＶの形跡はない。RT/PCR試験に関する陰性コントロールとして、キャリヤーオーバー又は交差-汚染は検出されない（レーン１，２及び３）本来のＨＥＶ-感染マカクザル大便（犬＃73）をPT/PCR試験での陽性コントロールとして使用する。Ｂ．抗体の中和活性抗3-2（M）、-4-2-（M）の中和活性を調べるために、夫々のウサギ抗血清を、第一ヒト肝細胞のＨＥＶ感染用ウィルス接種原を用いて最終希釈１：20で使用する。希釈された抗体及びウィルス接種原を培養細胞の感染前に一緒に培養する。ウサギ抗-3-2-（M）は、ＨＥＶ感染に対する中和活性の高いレベルを示す（図５、レーン２対レーン１）。極めて僅かな中和活性は、ウサギ抗体-4-2（M）中に観察される（レーン４対レーン３）。この結果は、ＨＥＶ3-2（M）、しかしＨＥＮ4-2（M）又は4-2（B）ではない組換えたん白質がＨＥＶ感染に対する保護抗体を誘発することができる中和エピトープをコード化することを示唆する。メキシコクローン3-2（M）及びビルマクローン3-2（B）がアミノIIIレベルで90.5％相同性（ヌクレオチトルベルで79.8％）を共有するという事実は、3-2（M）に対して集められた抗体が感染の許された細胞からメキシコ又はビルマ株のＨＥＶを交差-中和又は交差-保護しなければならないことを示唆する。例５ＨＥＶに対するワクチン保護Ａ．trpE-C2ペプチドの製造ＨＥＶの1.8Kb3’末端部分に対応して2.3Kbインサートを含有するpBET1プラスミドを記載する（Tam）。プラスミドをEco RIで消化し、約600bp及び1400bpのサイズを有する２種のＨＥＶフラグメントを遊離し、そのうち1210bpはコード化配列を含有する。より大きいフラグメントを、電気泳動によって精製し、pATH10tr p Ｅ融合ベクターのEco RIに挿入する。このベクターはT.J.ケルナー（Koerner ）等から得られる（Department of Microbiology，UCLA）。組換えベクターを使用して、大腸菌DH52F'ホストを形質転換する。 pATHC2からの組換えtyp E-C2融合たん白質を、デークマン（Dieckmann）等の処理の変化によって単離する。pATHC2プラスミドを含有する微生物を、トリプトファンを含有する増殖培地中に一晩増殖する。一晩培養物２mlを新たな増殖培地 100ml中で培養し、37℃で更に４時間増殖する。微生物ブロースをトリプトファン不含の新たな増殖培地１ｌに加え、30℃で1.5時間増殖させる。インドールアクリルIII（1mg/ml）10mlを加え、増殖を更に５〜10時間30℃で続ける。微生物細胞を遠心分離によって集める。細胞ペレットをリゾチームを含有する低張溶液中に再懸濁し、微生物細胞壁を分解する。塩化ナトリウム及び界面活性剤NP-40 を、懸濁液に加え、細胞の高張溶菌を生じる。溶菌された細胞溶液を高波処理する。溶液を遠心分離する。生じるたん白質ペレットをダウンス（dounce）ホモジナイザーを用いて10mMトリスpH7.5約50ml中に再懸濁する。溶液中のたん白質約7 5％はtrp E-C2たん白質から成る。Ｂ．ワクチンの製造加工ミヨウバンアジュバンドを、標準法に従って製造する。簡単に10％ミヨウバン懸濁液を1N NaOHでpH6.6に滴定し、次いで４℃で一晩撹拌する。懸濁液を、低速度の遠心分離によって澄明化し、上澄みをデカンテーションする。0.9％NaC l＋1：20,000ホルマリンの少量を夫々のペレットに加え、渦によって懸濁する。抗原ワクチン組成物を製造するために、上記のtrp E-C2たん白質を0.9％ NaCl 溶液中で所望の最終抗原濃度に加える。非-アジュバンド化された不溶性trpE-C2ペプチドをＡ欄に上述した様に製造する。Ｃ．ワクチン接種 8901，8903，8910，9902，及び9904で示される６匹のマカクザルを、ワチクン接種調査に使用する。サル、8901，及び8902，8903、及び8910の４匹をミヨウバンアジュバンド化されたtrp E-C2組成物（C2ペプチドの約50μgを含有する）1.0 mlで静脈内注射して免疫化する。他の２匹の動物にはアジュバンドのみを与える。１ケ月後、６匹の動物に最初と同様に二次ワクチン接種をする。二次ワクチン接種４週間後、動物から得られた血清を、融合していないC2たん白質を用いてウエスタンブロッティングによって抗-ＨＥＶ抗体に関してテストする。この段階で、動物8901及び8902の夫々に、非-アジュバント化、不活性trp -E-C2組成物（夫々約80μg trpE-C2ペプチドの全IV投薬量）によって三次ワクチン接種を行い、両方の動物はウエスタンブロッティングによって４週間後抗HEV を示す。動物8901，8903，及び9002は、前もって高い感染を示す10％第三経路犬大便（ビルマ株）夫１mlでIVを攻撃する。動物80902，8910、及び9004は、証明された感染性ヒト大便、単離物＃14、１mlでIVを攻撃する。この大便は犬で厳しい疾患を及びチンパンジーに穏やかな疾患を生じることが知られている。結果を上述した図２Ａ、２Ｂ、及び３Ａ、及び３Ｂに示す。本発明を特別な実施態様、方法、構成及び使用に関して記載したが、種々の変更及び変換を本発明から離れずに行うことができることは当業者にとって明らかなことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者レイズ・グレゴリー・アールアメリカ合衆国、テキサス州、77380 ザ・ウッドランズ、レッド・セイブル・ポイント、25 (72)発明者ブラッドリー・ダニエル・ダブリューアメリカ合衆国、ジョージア州、30244 ローレンスヴィル、ケリー・コート、2938 (72)発明者トゥ・ジュニアー‐シンアメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94014 デリー・シティ、ウインチェスター・ストリート、430 (72)発明者パーディ・マイケル・エイアメリカ合衆国、ジョージア州、30345- 4224 アトランタ、ナンバーエス１、ノースイースト・イクスプレスウェイ、エヌ・イー、2825 (72)発明者タム・アルバート・ダブリューアメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94122 サン・フランシスコ、テンス・アヴニュー、1871 (72)発明者クラフチンスキー・クージストフ・ゼットアメリカ合衆国、ジョージア州、30084 タッカー、ワイルドフラワー・レイン、 4091

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトにＥ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）に対する免疫を与えるのに使用されるワクチン組成物に於て、薬理学的に容認されるキャリヤー中で、ＨＥＶゲノムの第二開放型読み枠によってコード化されたカプシドたん白質のＣ-末端42アミノ酸を含有するペプチドを有する、上記ワクチン組成物。２．ペプチドは、次の配列の１つ：（i）配列 ID No．13、（ii）配列 ID No．14及び（iii）内部で一致している、配列 ID No．13と14の間の変異によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲１記載の組成物。３．ペプチドは、次の配列の１つ：（i）配列 ID No．15、（ii）配列 ID No．16及び（iii）内部で一致している、配列 ID No．15と16の間の変異によって同定されるアミノ酸配列を含む、請求の範囲１記載の組成物。４．ペプチドは、次の配列の１つ：（i）配列 ID No．17、（ii）配列 ID No．18及び（iii）内部で一致している、配列 ID No．17と18の間の変異によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲１記載の組成物。５．ペプチドは、次の配列の１つ：（i）配列 ID No．19、（ii）配列 ID No．20及び（iii）内部で一致している、配列 ID No．19と20の間の変異によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲１記載の組成物。６．ペプチド抗原をキャリヤーたん白質に共有結合する、請求の範囲１記載の組成物。７．請求の範囲１記載のワクチン組成物を、筋肉内注射によって患者に投与することから成る、Ｅ型肝炎ウィルスのヒトへの感染を阻害する方法。８．ワクチン組成物中のペプチドは、次の配列の１つ：（i）配列 ID No．13、（ii）配列 ID No．14、（iii）内部で一致している、配列 ID No．13と14の間の変異、（iv）配列 ID No．15、（v）配列 ID No．16、（vi）内部で一致している、配列 ID No．15と16の間の変異、（Vii）配列 ID No．17、（viii）配列 ID No．18、（ix）内部で一致している、配列 ID No．17と18の間の変異、（x）配列 ID No．19、（xi）配列 ID No．20、及び（xii）内部で一致している、配列 ID No．19と20の間の変異によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲６記載の方法。９．ワクチン組成物中のペプチドは、次の配列の１つ：（Vii）配列 ID No．17、（viii）配列 ID No．18、及び（ix）内部で一致している、配列 ID No．17と18の間の変異によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲８記載の方法。 10．ワクチン中のペプチドは、配列 ID No．17によって同定されるアミノ酸配列を含有する、請求の範囲９記載の方法。 11．Ｅ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）感染を中和することができる抗体を含有するワクチン組成物であって、その作用は培養された第一ヒト肝細胞のＨＥＶ感染を遮断するその組成物の能力によって実証される、上記ワクチン組成物。 12．次の配列の１つ：（i）配列 ID No．13、（ii）配列 ID No．14、（iii）内部で一致している、配列 ID No．13と14の間の変異、（iv）配列 ID No．15、（v）配列 ID No．16、（vi）内部で一致している、配列 ID No．15と16の間の変異、（Vii）配列 ID No．17、（viii）配列 ID No．18、（ix）内部で一致している、配列 ID No．17と18の間の変異、（x）配列 ID No．19、（xi）配列 ID No．20、及び（xii）内部で一致している、配列 ID No．19と20の間の変異を含有するペプチドと免疫反応する抗体を含有する、請求の範囲11記載のワクチン組成物。 13．組成物中の抗体は、（i）配列 ID No．13、（ii）配列 ID No．14、又は（iii）内部で一致している、配列 ID No．13と14の間の変異、及び（iv）配列 ID No．15、（v）配列 ID No．16、又は（vi）内部で一致している、配列 ID No．15と16の間の変異によって同定される配列を含有するペプチドと免疫反応する、請求の範囲12記載の組成物。 14．患者に請求の範囲11記載のワクチン組成物を、腸管外注射によって投与することから成る、ヒトへのＨＥＶ感染を防ぐ又はこの感染を治療する方法。 15．抗体組成物は、次の配列の１つ：（vii）配列 ID No．17、（viii）配列 ID No．18、及び（ix）内部で一致している、配列 ID No．17と18の間の変異によって同定されるアミノ酸配列を含有するペプチドに対して免疫反応する抗体を含有する、請求の範囲14記載の方法。 16．抗体組成物は、次の配列の１つ：（i）配列 ID No．13、（ii）配列 ID No．14、又は（iii）内部で一致している、配列 ID No．13と14の間の変異、及び（iv）配列 ID No．15、（v）配列 ID No．16、（vi）内部で一致している、配列 ID No．15と16の間の変異を含有するペプチドと免疫反応する抗体を含有する、請求の範囲15記載の方法。 17．組成物中の抗体は、配列 ID No．15によって同定される配列を含有するペプチドと免疫反応する、請求の範囲16記載の方法。